ＷＴ１改変ペプチド
【課題】活性が高く、癌ワクチンとして有望なペプチド、及びその用途を提供する。
【解決手段】癌抑制遺伝子ＷＴ１産物に基づいて、Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu を含む、９〜３０個のアミノ酸からなる、癌抗原ペプチドを作製した。これを、抗原提示細胞とインビトロで接触させ、細胞を体内に戻して細胞性免疫を活性化し、癌細胞を破壊する細胞療法に使用する。
【解決手段】癌抑制遺伝子ＷＴ１産物に基づいて、Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu を含む、９〜３０個のアミノ酸からなる、癌抗原ペプチドを作製した。これを、抗原提示細胞とインビトロで接触させ、細胞を体内に戻して細胞性免疫を活性化し、癌細胞を破壊する細胞療法に使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｗｉｌｍｓ腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１の産物に基づく癌抗原に関する。この癌抗原は、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液の癌、又は固形癌、例えば胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等、並びにさらにはＷＴ１を発現するすべての癌に対する抗癌ワクチンとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
異物を排除するための免疫機構には、一般に、抗原を認識して抗原提示細胞として機能するマクロファージ、該マクロファージの抗原提示を認識して種々のリンホカインを産生して他のＴ−細胞等を活性化するヘルパーＴ−細胞、該リンホカインの作用により抗体産生細胞に分化するＢ−リンパ球等が関与する液性免疫と、抗原の提示を受けて分化したキラーＴ−細胞（細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）とも称する）が標的細胞を攻撃し破壊する細胞性免疫とがある。
【０００３】
現在のところ、癌の免疫は主として、キラーＴ−細胞が関与する細胞性免疫によるものと考えられている。キラーＴ−細胞による癌免疫においては、主要組織適合抗原（Major Histocompatibility Complex；MHC）クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ抗原、ヒトの場合はＨＬＡ抗原と呼ばれる）と癌抗原との複合体の形で提示された癌抗原を認識した前駆体Ｔ−細胞が分化増殖して生成したキラーＴ−細胞が癌細胞を攻撃し、破壊する。この際、癌細胞はＭＨＣクラスＩ抗原と癌抗原との複合体をその細胞表面に提示しており、これがキラーＴ−細胞の標的とされる（非特許文献１〜４）。
【０００４】
標的細胞である癌細胞上にＭＨＣクラスＩ抗原により提示される前記の癌抗原は、癌細胞内で合成された抗原蛋白質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成した約８〜１２個のアミノ酸から成るペプチドであると考えられている（非特許文献１〜４）。
【０００５】
現在、種々の癌について抗原蛋白質の検索が行われているが、癌特異抗原として証明されているものは少ない。
【０００６】
Wilms腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１(ＷＴ１遺伝子)は、Wilms腫瘍、無紅彩、泌尿生殖器異常、精神発達遅滞などを合併するＷＡＧＲ症候群の解析からWilms腫瘍の原因遺伝子の１つとして染色体１１ｐ１３から単離された（非特許文献５）ものであり、ゲノムＤＮＡは約５０kbで１０のエキソンから成り、そのｃＤＮＡは約３kbである。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示す通りである（非特許文献６）。
【０００７】
ＷＴ１遺伝子はヒト白血病で高発現しており、白血病細胞をＷＴ１アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制される（特許文献１）ことなどから、ＷＴ１遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。さらに、ＷＴ１遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現しており（特許文献２）、ＷＴ１遺伝子は白血病及び固形癌における新しい腫瘍マーカーであることが判明した。
【０００８】
特許文献３には、ＷＴ１遺伝子発現生成物の部分から成る幾つかの癌特異抗原ペプチドが記載されており、その内の有望なものとしてＤbと称し、次のアミノ酸配列：Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(配列番号：２)(本発明において「ＷＴ１ワイルドペプチド」と称する）が記載されている。
【０００９】
【特許文献１】特開平９−１０４６２９号公報
【特許文献２】特開平１１−３５４８４号公報
【特許文献３】ＷＯ ００／０６６０２号パンフレット
【非特許文献１】Cur. Opin, Immunol., 5, 709, 1993
【非特許文献２】Cur. Opin. Immunol., 5, 719, 1993
【非特許文献３】Cell, 82,13, 1995
【非特許文献４】Immunol. Rev., 146, 167, 1995
【非特許文献５】Gessler, M.ら、Nature, Vol. 343, p.774-778(1990)
【非特許文献６】Mol. Cell. Biol., 11, 1707, 1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明は、すでに知られている癌特異抗原ペプチドに比べてより活性の高く、癌ワクチンとして有望なペプチドを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、すでに知られている上記のアミノ酸配列（配列番号：２）の２番目のアミノ酸MetをTyrに変更したアミノ酸配列：Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(配列番号：３）を有するペプチド（「ＷＴ１改変ペプチド」と称する）がより高い活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
従って本発明は、次のアミノ酸配列：Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(配列番号：３）を含んで成り、９〜３０個のアミノ酸から成るペプチド（ＷＴ１改変ペプチド）を提供する。配列番号：３に示すアミノ酸配列を含む、９〜１２個のアミノ酸からなるポリペプチドが好ましく、配列番号：３に示すアミノ酸配列から成るペプチドがさらに好ましい。
【００１３】
本発明はさらに、上記のＷＴ１改変ペプチドを有効成分とする癌ワクチンを提供する。
【００１４】
本発明はさらに、上記のペプチドをコードするＤＮＡを有効成分とする、癌に対するＤＮＡワクチンを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、ＨＬＡ抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原）と上記ペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、ＨＬＡ抗原と上記ペプチドとの複合体を認識する細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のペプチドは、配列番号：３に示す９個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を含み、９〜３０個のアミノ酸から成るペプチドである。さらにＨＬＡ抗原に結合して提示されるという観点から、配列番号：３に示すアミノ酸配列を含み、アミノ酸９〜１２個から成るペプチドが好ましい。その際、ＨＬＡ抗原に結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）を有するペプチドが、より好ましい（J.Immunol., 152, p3913, 1994, Immunogenetics, 41:p178, 1995, J.Immunol., 155:p4307, 1994, J.Immunol., 155:p4749, 1995)。さらに、配列番号：３に示す９個のアミノ酸のアミノ酸配列から成るペプチドが最も好ましい。
【００１８】
なお、前記で「配列番号：３に示すアミノ酸配列を含むペプチド」とは、具体的には、例えば、配列番号：３に示すアミノ酸配列を含み、ＷＴ１（配列番号：１）上の該当位置（第２３５位〜第２４３位）、又はヒトＷＴ１（ＮＣＢＩデータベースAccession No．XPO12009）上の対応位置よりＮ末端方向及び／又はＣ末端方向に伸長したペプチドであって、かつ癌抗原ペプチドとしての活性を有するものが挙げられる。
【００１９】
本発明の癌抗原ペプチドの活性測定法としては、例えばJ. Immunol., 154, p2257, 1995に記載の方法が挙げられる。以下、本方法の概略につき、ＨＬＡの型がＨＬＡ−Ａ２４の場合を例にとり説明する。まず、ＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離する。次に、この末梢血リンパ球に対してin vitroで本発明のペプチドを添加して刺激することにより、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体の提示された抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）を誘導する。
【００２０】
当該ＣＴＬの誘導は、例えば、抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体に反応してＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（例えばIFN−γ）の量を、例えばELISA法によって測定することにより、調べることができる。また、51CrやEuropiumで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するCTLの傷害性を測定する方法（51Crリリースアッセイ、Int. J. Cancer. 58, p317, 1994、Europiumリリースアッセイ、J. Immunol., 154, p3991, 1995）によっても調べることができる。さらに、後述の実施例を参考にして行うこともできる。
【００２１】
本発明はまた前記抗原を有効成分とする癌ワクチンに関する。このワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液の癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防又は治療のために使用することができる。特にこのワクチンは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者に適用し得るものである。このワクチンは、経口投与、又は非経口投与、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与等により投与することができる。
【００２２】
さらに、本発明のワクチンの投与方法として、患者の末梢血から単核球を集め、その中から樹状細胞を取り出し、本発明のペプチドをパルスして患者に皮下投与などで患者に戻す方法も行われる。
【００２３】
本方法は、細胞療法、あるいはＤＣ（樹状細胞）療法とも呼ばれるものであり、詳しくは後述の「抗原提示細胞」の項を参照されたい。
【００２４】
ワクチンは、前記有効成分としての投与ペプチドのほかに、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバンド（Clin-Micobiol. Rev., 7,277-289, 1994）、例えば水酸化アルミニウムのごとき鉱物ゲル；リソレシチン、プルロニックポリオールのごとき界面活性剤；ポリアニオン；ペプチド；又は油乳濁液を含むことができる。あるいは、リポゾーム中へ混合し、又は多糖及び／又はワクチン中に配合される他の集合体を含むことができる。投与量は一般に、１日当り０．１μｇ〜１mg／kgである。
【００２５】
本発明ではまた、上記のポリペプチドワクチンをコードするＤＮＡもワクチン（ＤＮＡワクチン）として使用することができる。すなわち、本発明のＷＴ１改変ペプチドをコードする核酸を含有する核酸、好ましくはＤＮＡを、適切なベクター、好ましくは発現ベクターに挿入した後、動物に投与することにより、癌免疫を生じさせることができる。このようなＤＮＡワクチンの具体的手法については、ＷＯ００／０６６０２やJ. Immunol., 160, P1717, 1998などを参照されたい。
【００２６】
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と上記ペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞に関する。実施例において、本発明のペプチド刺激により強いcell Killing活性が認められているが、これは、末梢血単核球中に、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原（ＨＬＡ−Ａ２４抗原）との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）が誘導された結果に他ならない。このような、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞は、以下に述べるような細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
【００２７】
細胞療法において用いられる抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明のペプチドを体外でパルスして、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能なＨＬＡ抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。
【００２８】
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされる本発明のペプチドは、ペプチドの形態のみならず、当該ペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡの形態であっても良い。
【００２９】
本発明の抗原提示細胞の具体的な調製法としては、例えばCancer Immunol Immunother., 46：82, 1998、J. Immunol., 158, p1796, 1997、Cancer Rcs., 59, p1184, 1999などを参考にすることができる。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
【００３０】
また、前記抗原提示能を有する細胞に、本発明のペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、例えばDNAの場合はCancer Res,. 56：ｐ5672, 1996やJ. Immunol., 161：p5607, 1998 などを参考にして行うことができ、またＲＮＡの場合は、J. Exp. Med., 184：ｐ465, 1996などを参考にして行うことができる。
【００３１】
前記抗原提示細胞は、腫瘍の治療剤の有効成分とすることができる。その際、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。
【００３２】
本発明はさらに、ＨＬＡ抗原と上記ペプチドとの複合体を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に関する。本発明のＣＴＬは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。
【００３３】
すなわちメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J. Natl. Cancer. Inst,. 86：1159, 1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J. Exp. Med., 185：453, 1997）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のペプチドを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
【００３４】
このように本発明のＣＴＬは、腫瘍の治療剤の有効成分とすることができる。その際、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。
【００３５】
次に、実施例により、本発明のペプチドが癌抗原及び癌ワクチンとして有用なことを、明らかにする。
【００３６】
実施例１
ＨＬＡ−Ａ*２４０２を有するヒトの末梢血単核球を分離し、これを２４ウエルプレートに２×１０6細胞／ウエルの量で分配し、これにＷＴ１ワイルドペプチド又はＷＴ１改変ペプチドを２０μＭの濃度になるように添加し、１週間培養した。この際の培地として、４５％ＲＰＭＩ、４５％ＡＩＶ、１０％ＦＣＳ、１×非必須アミノ酸、ＳＭ／ＰＣＧを用いた。上記の培養の後、細胞を２×１０6細胞／ウエルに調製し、レスポンダー（responder）細胞とした。
【００３７】
他方、上記の同じＨＬＡ−Ａ*２４０２のヒトから、別途、末梢血単核球を分離し、前記それぞれ一方のペプチド２０μＭと共に４時間培養してペプチドパルスし、次に３０Gyの放射線照射した後、細胞を４×１０6細胞／ウエルに調製し、スチムレーター（stimulator）細胞とした。
【００３８】
上記のようにして調製したレスポンダー細胞とスチムレーター細胞を混合し、さらにＩＬ−２を５０Ｕ／mlの濃度で加えて１週間培養した。この結果、得られた細胞の状態は次の通りであった。
【００３９】
【表１】
【００４０】
次に、51Crリリース法に従ってKilling assayを行った（J.Immunol. 164:1873, 2000）。標的細胞として、Ｃ１Ｒ２４０２細胞、及び上記のペプチドでパルスしたＣ１Ｒ２４０２細胞を用い、これらのそれぞれの標的細胞（Ｔ）に、上記の通りにＷＴ１ワイルドペプチド又はＷＴ１改変ペプチドにより刺激した細胞（エフェクター細胞)(Ｅ）を、Ｅ：Ｔ比１、５又は２０において作用させ、細胞溶解を測定した。結果を図１に示す。この図から明らかな通り、ＷＴ１ワイルドペプチドにより刺激した細胞に比べてＷＴ１改変ペプチドで刺激した細胞の方が強いcell killing活性を示した。
【００４１】
実施例２
内因性（endogeneous）にＷＴ１抗原を発現する白血病細胞（標的細胞）に対する、ＷＴ１ワイルドペプチド又はＷＴ１改変ペプチドにより刺激したエフェクター細胞のcell killing活性を51Crリリース法により試験した。標的細胞としてＷＴ１＋／Ａ*２４０２＋細胞（＃１ＡＭＬ患者の白血病細胞）、ＷＴ１−／Ａ*２４０２＋細胞（＃２ＡＭＬ患者の白血病細胞）、ＷＴ１＋／Ａ*２４０２−細胞（＃３ＡＭＬ患者の白血病細胞）、及びＷＴ１−／Ａ*２４０２−細胞（＃４ＡＭＬ患者の白血病細胞）を用いた。
実施例１で調製したエフェクター細胞（Ｅ）と上記の標的細胞（Ｔ）とを、Ｅ／Ｔ比２０：１で混合し、４時間培養し、細胞溶解の程度を測定した。結果を図２に示す。
この図から明らかな通り、ＷＴ１ワイルドペプチド又はＷＴ１改変ペプチドにより刺激された細胞のいずれもＷＴ１＋／Ａ*２４０２細胞に対して細胞毒性活性を示したが、その活性はＷＴ１改変ペプチドの方が高かった。
【００４２】
実施例３
実施例1と同様の実験を別のＨＬＡ−Ａ*２４０２陽性の健常人の末梢血単核球から調製したエフェクター細胞を用いて試験した。結果を図３に示す。
この図から明らか通り、実施例1と同様にＷＴ1ワイルドペプチドにより刺激した細胞に比べてＷＴ1改変ペプチドにより刺激された細胞の方が強い細胞傷害活性を示した。
【００４３】
実施例４
WT１ワイルドペプチド又はWT１改変ペプチドで刺激したエフェクター細胞の内因性（endogeneous）にWT１抗原を発現する肺癌由来の癌細胞株（標的細胞）に対する細胞傷害活性を51Ｃｒリリース法に従って試験した。標的細胞としてRERF-LCAI（WT1＋／Ａ*２４０２＋）、ＬＣ１ｓｑ（WT1＋／Ａ*２４０２＋）、１１−１８（WT1−／Ａ*２４０２＋）、ＬＫ８７（WT1＋／Ａ*２４０２−）を用いた。
実施例1と同様な方法により調製したエフェクター細胞（Ｅ）と51Ｃｒで標識した上記の標的細胞（Ｔ）とを、実施例２と同様にＥ／Ｔ比20：1で混合して４時間培養し、細胞溶解の程度を測定した。結果を図４に示す。
この図から明らかな通り、ＷＴ1ワイルドペプチド又はＷＴ1改変ペプチドにより刺激された細胞のいずれもＷＴ1＋／Ａ*２４０２＋の標的細胞に対してのみ細胞傷害活性を示したが、その活性はＷＴ1改変ペプチドの方が高かった。
【００４４】
実施例５
WT１ワイルドペプチド又はWT１改変ペプチドで刺激したエフェクター細胞がＨＬＡクラスＩに拘束性のＣＤ８陽性キラー細胞であることを抗体を用いたブロッキングアッセイにより確かめた。抗体としては、抗ＨＬＡクラスＩ抗体、抗ＨＬＡクラスII抗体、抗ＣＤ８抗体を用いた。実施例1と同様な方法により調製したエフェクター細胞（Ｅ）、51Ｃｒで標識したＣ１Ｒ２４０２又はＷＴ1ワイルドペプチドをパルスしたＣ１Ｒ２４０２細胞を標的細胞（Ｔ）とし、Ｅ／Ｔ比２０：1で抗体とともに混合して４時間培養し、51Ｃｒリリース法に従って細胞溶解の程度を測定した。結果を図５に示す。
この図から明らかな通り、ＷＴ1ワイルドペプチド又はＷＴ1改変ペプチドにより刺激された細胞のいずれも抗ＨＬＡクラスＩ抗体及び抗ＣＤ８抗体により細胞傷害活性が阻害されており、細胞傷害活性を示す細胞は、ＨＬＡクラスＩに拘束性のＣＤ８陽性キラー細胞であることが示された。
【００４５】
実施例６
ＷＴ１改変ペプチドとＷＴ1ワイルドペプチドのＨＬＡ−Ａ*２４０２への結合親和性を調べた。Ｃ1ＲＡ２４０２細胞を酸緩衝液（１３１ｍＭ クエン酸、６６ｍＭリン酸ナトリウム、２９０ｍ osmol、ｐH３.３）で１分間処理した後、０.５％のウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ培養液を加えて中和した。細胞は、培養液で洗浄した後、２００ｎＭのβ２−マイクログロブリン（シグマ社）と０.５％のウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ培養液で２×１０6細胞／ｍｌの濃度に懸濁した。１５μｌの細胞懸濁液を各種濃度のＷＴ１ペプチドを含む５０μｌの培養液と混合し、室温で４時間インキュベートした。細胞は洗浄後、ＦＩＴＣで標識したＨＬＡ−Ａ２４に対するモノクローナル抗体（クローン名７Ａ１２）で染色し、フローサイトメーターＦＡＣＳでＨＬＡ−Ａ２４発現量を解析した。同様の操作をＨＬＡ-Ａ*２４０２に結合することが報告されているメラノーマ抗原のｐmel １５の抗原ペプチド（Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ）（配列番号：４）(Ｊ. Immunol., １５４：５９９４，１９９５) についても行い、これをスタンダードとして、文献（Immunogenetics, ５１：８１６，２０００）に記載の方法によりＷＴ1ペプチドの解離定数（Ｋｄ）を 算出した。結果を表2に示す。
【００４６】
【表２】
【００４７】
この表から明らかな通り、ＷＴ1改変ペプチドはＷＴ1ワイルドペプチドよりもＨＬＡ−Ａ*２４０２への結合親和性が強かった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
上記の結果から、本発明のペプチドは確かに癌抗原として機能し、癌細胞に対するキラーＴ−細胞（癌細胞傷害性Ｔ細胞）を誘導増殖させたことが立証された。従って、本発明の癌抗原ペプチドは、ＷＴ１遺伝子の発現の上昇を伴う白血病及び固形癌に対する癌ワクチンとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ＷＴ１ワイルドペプチド（配列番号：２）又は本発明のＷＴ１改変ペプチド（配列番号：３）により刺激されたエフェクター細胞（Ｅ）による、ペプチドでパルスされているか又はパルスされていないＣ１Ｒ２４０２標的（ターゲット）細胞（Ｔ）の殺細胞効果（比細胞溶解活性）を示すグラフである。図中、黒丸は、ワイルドペプチドによりパルスされたＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ１改変ペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示し、黒四角は、ワイルドペプチドによりパルスされたＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ１ワイルドペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示し、中空丸は、ワイルドペプチドによりパルスされていないＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ１改変ペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示し、そして中空四角は、ワイルドペプチドによりパルスされていないＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ１ワイルドペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示す。
【図２】図２は、ＷＴ１ワイルドペプチド又は本発明のＷＴ１改変ペプチドにより刺激されたエフェクター細胞による、内因性にＷＴ１抗原を発現している急性骨髄性白血病細胞又は発現していない急性骨髄性白血病細胞に対する細胞溶解活性を示すグラフである。
【図３】図３は、ＷＴ１ワイルドペプチド又は本発明のＷＴ１改変ペプチドにより刺激されたエフェクター細胞による、ペプチドをパルスされているか又はパルスされていないＣ1Ｒ２４０２標的細胞の殺細胞効果（比細胞溶解活性）を示すグラフである。図中、黒丸は、ワイルドペプチドによりパルスされたＣ１Ｒ２４０２細胞に対する、ＷＴ1改変ペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示し、黒四角は、ワイルドペプチドによりパルスされたＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ1ワイルドペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示し、中空丸は、ワイルドペプチドによりパルスされていないＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ１改変ペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示し、そして中空四角は、ワイルドペプチドによりパルスされていないＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ１ワイルドペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示す。
【図４】図４は、ＷＴ１ワイルドペプチド又は本発明のＷＴ1改変ペプチドにより刺激されたエフェクター細胞による、内因性にＷＴ１を発現している肺癌細胞株又は発現していない肺癌細胞株に対する細胞溶解活性を示すグラフである。
【図５】図５は、ＷＴ１ワイルドペプチド又は本発明のＷＴ１改変ペプチドにより刺激されたエフェクター細胞による、ワイルドペプチドをパルスされているＣ1Ｒ２４０２標的細胞の殺細胞効果（比細胞溶解活性）に対する抗ＨＬＡクラスＩ抗体、抗ＨＬＡクラスII抗体、抗ＣＤ８抗体の阻害効果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｗｉｌｍｓ腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１の産物に基づく癌抗原に関する。この癌抗原は、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液の癌、又は固形癌、例えば胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等、並びにさらにはＷＴ１を発現するすべての癌に対する抗癌ワクチンとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
異物を排除するための免疫機構には、一般に、抗原を認識して抗原提示細胞として機能するマクロファージ、該マクロファージの抗原提示を認識して種々のリンホカインを産生して他のＴ−細胞等を活性化するヘルパーＴ−細胞、該リンホカインの作用により抗体産生細胞に分化するＢ−リンパ球等が関与する液性免疫と、抗原の提示を受けて分化したキラーＴ−細胞（細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）とも称する）が標的細胞を攻撃し破壊する細胞性免疫とがある。
【０００３】
現在のところ、癌の免疫は主として、キラーＴ−細胞が関与する細胞性免疫によるものと考えられている。キラーＴ−細胞による癌免疫においては、主要組織適合抗原（Major Histocompatibility Complex；MHC）クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ抗原、ヒトの場合はＨＬＡ抗原と呼ばれる）と癌抗原との複合体の形で提示された癌抗原を認識した前駆体Ｔ−細胞が分化増殖して生成したキラーＴ−細胞が癌細胞を攻撃し、破壊する。この際、癌細胞はＭＨＣクラスＩ抗原と癌抗原との複合体をその細胞表面に提示しており、これがキラーＴ−細胞の標的とされる（非特許文献１〜４）。
【０００４】
標的細胞である癌細胞上にＭＨＣクラスＩ抗原により提示される前記の癌抗原は、癌細胞内で合成された抗原蛋白質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成した約８〜１２個のアミノ酸から成るペプチドであると考えられている（非特許文献１〜４）。
【０００５】
現在、種々の癌について抗原蛋白質の検索が行われているが、癌特異抗原として証明されているものは少ない。
【０００６】
Wilms腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１(ＷＴ１遺伝子)は、Wilms腫瘍、無紅彩、泌尿生殖器異常、精神発達遅滞などを合併するＷＡＧＲ症候群の解析からWilms腫瘍の原因遺伝子の１つとして染色体１１ｐ１３から単離された（非特許文献５）ものであり、ゲノムＤＮＡは約５０kbで１０のエキソンから成り、そのｃＤＮＡは約３kbである。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示す通りである（非特許文献６）。
【０００７】
ＷＴ１遺伝子はヒト白血病で高発現しており、白血病細胞をＷＴ１アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制される（特許文献１）ことなどから、ＷＴ１遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。さらに、ＷＴ１遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現しており（特許文献２）、ＷＴ１遺伝子は白血病及び固形癌における新しい腫瘍マーカーであることが判明した。
【０００８】
特許文献３には、ＷＴ１遺伝子発現生成物の部分から成る幾つかの癌特異抗原ペプチドが記載されており、その内の有望なものとしてＤbと称し、次のアミノ酸配列：Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(配列番号：２)(本発明において「ＷＴ１ワイルドペプチド」と称する）が記載されている。
【０００９】
【特許文献１】特開平９−１０４６２９号公報
【特許文献２】特開平１１−３５４８４号公報
【特許文献３】ＷＯ ００／０６６０２号パンフレット
【非特許文献１】Cur. Opin, Immunol., 5, 709, 1993
【非特許文献２】Cur. Opin. Immunol., 5, 719, 1993
【非特許文献３】Cell, 82,13, 1995
【非特許文献４】Immunol. Rev., 146, 167, 1995
【非特許文献５】Gessler, M.ら、Nature, Vol. 343, p.774-778(1990)
【非特許文献６】Mol. Cell. Biol., 11, 1707, 1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明は、すでに知られている癌特異抗原ペプチドに比べてより活性の高く、癌ワクチンとして有望なペプチドを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、すでに知られている上記のアミノ酸配列（配列番号：２）の２番目のアミノ酸MetをTyrに変更したアミノ酸配列：Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(配列番号：３）を有するペプチド（「ＷＴ１改変ペプチド」と称する）がより高い活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
従って本発明は、次のアミノ酸配列：Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(配列番号：３）を含んで成り、９〜３０個のアミノ酸から成るペプチド（ＷＴ１改変ペプチド）を提供する。配列番号：３に示すアミノ酸配列を含む、９〜１２個のアミノ酸からなるポリペプチドが好ましく、配列番号：３に示すアミノ酸配列から成るペプチドがさらに好ましい。
【００１３】
本発明はさらに、上記のＷＴ１改変ペプチドを有効成分とする癌ワクチンを提供する。
【００１４】
本発明はさらに、上記のペプチドをコードするＤＮＡを有効成分とする、癌に対するＤＮＡワクチンを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、ＨＬＡ抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原）と上記ペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、ＨＬＡ抗原と上記ペプチドとの複合体を認識する細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のペプチドは、配列番号：３に示す９個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を含み、９〜３０個のアミノ酸から成るペプチドである。さらにＨＬＡ抗原に結合して提示されるという観点から、配列番号：３に示すアミノ酸配列を含み、アミノ酸９〜１２個から成るペプチドが好ましい。その際、ＨＬＡ抗原に結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）を有するペプチドが、より好ましい（J.Immunol., 152, p3913, 1994, Immunogenetics, 41:p178, 1995, J.Immunol., 155:p4307, 1994, J.Immunol., 155:p4749, 1995)。さらに、配列番号：３に示す９個のアミノ酸のアミノ酸配列から成るペプチドが最も好ましい。
【００１８】
なお、前記で「配列番号：３に示すアミノ酸配列を含むペプチド」とは、具体的には、例えば、配列番号：３に示すアミノ酸配列を含み、ＷＴ１（配列番号：１）上の該当位置（第２３５位〜第２４３位）、又はヒトＷＴ１（ＮＣＢＩデータベースAccession No．XPO12009）上の対応位置よりＮ末端方向及び／又はＣ末端方向に伸長したペプチドであって、かつ癌抗原ペプチドとしての活性を有するものが挙げられる。
【００１９】
本発明の癌抗原ペプチドの活性測定法としては、例えばJ. Immunol., 154, p2257, 1995に記載の方法が挙げられる。以下、本方法の概略につき、ＨＬＡの型がＨＬＡ−Ａ２４の場合を例にとり説明する。まず、ＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離する。次に、この末梢血リンパ球に対してin vitroで本発明のペプチドを添加して刺激することにより、本発明のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体の提示された抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）を誘導する。
【００２０】
当該ＣＴＬの誘導は、例えば、抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体に反応してＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（例えばIFN−γ）の量を、例えばELISA法によって測定することにより、調べることができる。また、51CrやEuropiumで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するCTLの傷害性を測定する方法（51Crリリースアッセイ、Int. J. Cancer. 58, p317, 1994、Europiumリリースアッセイ、J. Immunol., 154, p3991, 1995）によっても調べることができる。さらに、後述の実施例を参考にして行うこともできる。
【００２１】
本発明はまた前記抗原を有効成分とする癌ワクチンに関する。このワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液の癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防又は治療のために使用することができる。特にこのワクチンは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者に適用し得るものである。このワクチンは、経口投与、又は非経口投与、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与等により投与することができる。
【００２２】
さらに、本発明のワクチンの投与方法として、患者の末梢血から単核球を集め、その中から樹状細胞を取り出し、本発明のペプチドをパルスして患者に皮下投与などで患者に戻す方法も行われる。
【００２３】
本方法は、細胞療法、あるいはＤＣ（樹状細胞）療法とも呼ばれるものであり、詳しくは後述の「抗原提示細胞」の項を参照されたい。
【００２４】
ワクチンは、前記有効成分としての投与ペプチドのほかに、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバンド（Clin-Micobiol. Rev., 7,277-289, 1994）、例えば水酸化アルミニウムのごとき鉱物ゲル；リソレシチン、プルロニックポリオールのごとき界面活性剤；ポリアニオン；ペプチド；又は油乳濁液を含むことができる。あるいは、リポゾーム中へ混合し、又は多糖及び／又はワクチン中に配合される他の集合体を含むことができる。投与量は一般に、１日当り０．１μｇ〜１mg／kgである。
【００２５】
本発明ではまた、上記のポリペプチドワクチンをコードするＤＮＡもワクチン（ＤＮＡワクチン）として使用することができる。すなわち、本発明のＷＴ１改変ペプチドをコードする核酸を含有する核酸、好ましくはＤＮＡを、適切なベクター、好ましくは発現ベクターに挿入した後、動物に投与することにより、癌免疫を生じさせることができる。このようなＤＮＡワクチンの具体的手法については、ＷＯ００／０６６０２やJ. Immunol., 160, P1717, 1998などを参照されたい。
【００２６】
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と上記ペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞に関する。実施例において、本発明のペプチド刺激により強いcell Killing活性が認められているが、これは、末梢血単核球中に、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原（ＨＬＡ−Ａ２４抗原）との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）が誘導された結果に他ならない。このような、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞は、以下に述べるような細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
【００２７】
細胞療法において用いられる抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明のペプチドを体外でパルスして、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能なＨＬＡ抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。
【００２８】
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされる本発明のペプチドは、ペプチドの形態のみならず、当該ペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡの形態であっても良い。
【００２９】
本発明の抗原提示細胞の具体的な調製法としては、例えばCancer Immunol Immunother., 46：82, 1998、J. Immunol., 158, p1796, 1997、Cancer Rcs., 59, p1184, 1999などを参考にすることができる。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
【００３０】
また、前記抗原提示能を有する細胞に、本発明のペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、例えばDNAの場合はCancer Res,. 56：ｐ5672, 1996やJ. Immunol., 161：p5607, 1998 などを参考にして行うことができ、またＲＮＡの場合は、J. Exp. Med., 184：ｐ465, 1996などを参考にして行うことができる。
【００３１】
前記抗原提示細胞は、腫瘍の治療剤の有効成分とすることができる。その際、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。
【００３２】
本発明はさらに、ＨＬＡ抗原と上記ペプチドとの複合体を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に関する。本発明のＣＴＬは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。
【００３３】
すなわちメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J. Natl. Cancer. Inst,. 86：1159, 1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J. Exp. Med., 185：453, 1997）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のペプチドを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
【００３４】
このように本発明のＣＴＬは、腫瘍の治療剤の有効成分とすることができる。その際、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。
【００３５】
次に、実施例により、本発明のペプチドが癌抗原及び癌ワクチンとして有用なことを、明らかにする。
【００３６】
実施例１
ＨＬＡ−Ａ*２４０２を有するヒトの末梢血単核球を分離し、これを２４ウエルプレートに２×１０6細胞／ウエルの量で分配し、これにＷＴ１ワイルドペプチド又はＷＴ１改変ペプチドを２０μＭの濃度になるように添加し、１週間培養した。この際の培地として、４５％ＲＰＭＩ、４５％ＡＩＶ、１０％ＦＣＳ、１×非必須アミノ酸、ＳＭ／ＰＣＧを用いた。上記の培養の後、細胞を２×１０6細胞／ウエルに調製し、レスポンダー（responder）細胞とした。
【００３７】
他方、上記の同じＨＬＡ−Ａ*２４０２のヒトから、別途、末梢血単核球を分離し、前記それぞれ一方のペプチド２０μＭと共に４時間培養してペプチドパルスし、次に３０Gyの放射線照射した後、細胞を４×１０6細胞／ウエルに調製し、スチムレーター（stimulator）細胞とした。
【００３８】
上記のようにして調製したレスポンダー細胞とスチムレーター細胞を混合し、さらにＩＬ−２を５０Ｕ／mlの濃度で加えて１週間培養した。この結果、得られた細胞の状態は次の通りであった。
【００３９】
【表１】
【００４０】
次に、51Crリリース法に従ってKilling assayを行った（J.Immunol. 164:1873, 2000）。標的細胞として、Ｃ１Ｒ２４０２細胞、及び上記のペプチドでパルスしたＣ１Ｒ２４０２細胞を用い、これらのそれぞれの標的細胞（Ｔ）に、上記の通りにＷＴ１ワイルドペプチド又はＷＴ１改変ペプチドにより刺激した細胞（エフェクター細胞)(Ｅ）を、Ｅ：Ｔ比１、５又は２０において作用させ、細胞溶解を測定した。結果を図１に示す。この図から明らかな通り、ＷＴ１ワイルドペプチドにより刺激した細胞に比べてＷＴ１改変ペプチドで刺激した細胞の方が強いcell killing活性を示した。
【００４１】
実施例２
内因性（endogeneous）にＷＴ１抗原を発現する白血病細胞（標的細胞）に対する、ＷＴ１ワイルドペプチド又はＷＴ１改変ペプチドにより刺激したエフェクター細胞のcell killing活性を51Crリリース法により試験した。標的細胞としてＷＴ１＋／Ａ*２４０２＋細胞（＃１ＡＭＬ患者の白血病細胞）、ＷＴ１−／Ａ*２４０２＋細胞（＃２ＡＭＬ患者の白血病細胞）、ＷＴ１＋／Ａ*２４０２−細胞（＃３ＡＭＬ患者の白血病細胞）、及びＷＴ１−／Ａ*２４０２−細胞（＃４ＡＭＬ患者の白血病細胞）を用いた。
実施例１で調製したエフェクター細胞（Ｅ）と上記の標的細胞（Ｔ）とを、Ｅ／Ｔ比２０：１で混合し、４時間培養し、細胞溶解の程度を測定した。結果を図２に示す。
この図から明らかな通り、ＷＴ１ワイルドペプチド又はＷＴ１改変ペプチドにより刺激された細胞のいずれもＷＴ１＋／Ａ*２４０２細胞に対して細胞毒性活性を示したが、その活性はＷＴ１改変ペプチドの方が高かった。
【００４２】
実施例３
実施例1と同様の実験を別のＨＬＡ−Ａ*２４０２陽性の健常人の末梢血単核球から調製したエフェクター細胞を用いて試験した。結果を図３に示す。
この図から明らか通り、実施例1と同様にＷＴ1ワイルドペプチドにより刺激した細胞に比べてＷＴ1改変ペプチドにより刺激された細胞の方が強い細胞傷害活性を示した。
【００４３】
実施例４
WT１ワイルドペプチド又はWT１改変ペプチドで刺激したエフェクター細胞の内因性（endogeneous）にWT１抗原を発現する肺癌由来の癌細胞株（標的細胞）に対する細胞傷害活性を51Ｃｒリリース法に従って試験した。標的細胞としてRERF-LCAI（WT1＋／Ａ*２４０２＋）、ＬＣ１ｓｑ（WT1＋／Ａ*２４０２＋）、１１−１８（WT1−／Ａ*２４０２＋）、ＬＫ８７（WT1＋／Ａ*２４０２−）を用いた。
実施例1と同様な方法により調製したエフェクター細胞（Ｅ）と51Ｃｒで標識した上記の標的細胞（Ｔ）とを、実施例２と同様にＥ／Ｔ比20：1で混合して４時間培養し、細胞溶解の程度を測定した。結果を図４に示す。
この図から明らかな通り、ＷＴ1ワイルドペプチド又はＷＴ1改変ペプチドにより刺激された細胞のいずれもＷＴ1＋／Ａ*２４０２＋の標的細胞に対してのみ細胞傷害活性を示したが、その活性はＷＴ1改変ペプチドの方が高かった。
【００４４】
実施例５
WT１ワイルドペプチド又はWT１改変ペプチドで刺激したエフェクター細胞がＨＬＡクラスＩに拘束性のＣＤ８陽性キラー細胞であることを抗体を用いたブロッキングアッセイにより確かめた。抗体としては、抗ＨＬＡクラスＩ抗体、抗ＨＬＡクラスII抗体、抗ＣＤ８抗体を用いた。実施例1と同様な方法により調製したエフェクター細胞（Ｅ）、51Ｃｒで標識したＣ１Ｒ２４０２又はＷＴ1ワイルドペプチドをパルスしたＣ１Ｒ２４０２細胞を標的細胞（Ｔ）とし、Ｅ／Ｔ比２０：1で抗体とともに混合して４時間培養し、51Ｃｒリリース法に従って細胞溶解の程度を測定した。結果を図５に示す。
この図から明らかな通り、ＷＴ1ワイルドペプチド又はＷＴ1改変ペプチドにより刺激された細胞のいずれも抗ＨＬＡクラスＩ抗体及び抗ＣＤ８抗体により細胞傷害活性が阻害されており、細胞傷害活性を示す細胞は、ＨＬＡクラスＩに拘束性のＣＤ８陽性キラー細胞であることが示された。
【００４５】
実施例６
ＷＴ１改変ペプチドとＷＴ1ワイルドペプチドのＨＬＡ−Ａ*２４０２への結合親和性を調べた。Ｃ1ＲＡ２４０２細胞を酸緩衝液（１３１ｍＭ クエン酸、６６ｍＭリン酸ナトリウム、２９０ｍ osmol、ｐH３.３）で１分間処理した後、０.５％のウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ培養液を加えて中和した。細胞は、培養液で洗浄した後、２００ｎＭのβ２−マイクログロブリン（シグマ社）と０.５％のウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ培養液で２×１０6細胞／ｍｌの濃度に懸濁した。１５μｌの細胞懸濁液を各種濃度のＷＴ１ペプチドを含む５０μｌの培養液と混合し、室温で４時間インキュベートした。細胞は洗浄後、ＦＩＴＣで標識したＨＬＡ−Ａ２４に対するモノクローナル抗体（クローン名７Ａ１２）で染色し、フローサイトメーターＦＡＣＳでＨＬＡ−Ａ２４発現量を解析した。同様の操作をＨＬＡ-Ａ*２４０２に結合することが報告されているメラノーマ抗原のｐmel １５の抗原ペプチド（Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ）（配列番号：４）(Ｊ. Immunol., １５４：５９９４，１９９５) についても行い、これをスタンダードとして、文献（Immunogenetics, ５１：８１６，２０００）に記載の方法によりＷＴ1ペプチドの解離定数（Ｋｄ）を 算出した。結果を表2に示す。
【００４６】
【表２】
【００４７】
この表から明らかな通り、ＷＴ1改変ペプチドはＷＴ1ワイルドペプチドよりもＨＬＡ−Ａ*２４０２への結合親和性が強かった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
上記の結果から、本発明のペプチドは確かに癌抗原として機能し、癌細胞に対するキラーＴ−細胞（癌細胞傷害性Ｔ細胞）を誘導増殖させたことが立証された。従って、本発明の癌抗原ペプチドは、ＷＴ１遺伝子の発現の上昇を伴う白血病及び固形癌に対する癌ワクチンとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ＷＴ１ワイルドペプチド（配列番号：２）又は本発明のＷＴ１改変ペプチド（配列番号：３）により刺激されたエフェクター細胞（Ｅ）による、ペプチドでパルスされているか又はパルスされていないＣ１Ｒ２４０２標的（ターゲット）細胞（Ｔ）の殺細胞効果（比細胞溶解活性）を示すグラフである。図中、黒丸は、ワイルドペプチドによりパルスされたＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ１改変ペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示し、黒四角は、ワイルドペプチドによりパルスされたＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ１ワイルドペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示し、中空丸は、ワイルドペプチドによりパルスされていないＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ１改変ペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示し、そして中空四角は、ワイルドペプチドによりパルスされていないＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ１ワイルドペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示す。
【図２】図２は、ＷＴ１ワイルドペプチド又は本発明のＷＴ１改変ペプチドにより刺激されたエフェクター細胞による、内因性にＷＴ１抗原を発現している急性骨髄性白血病細胞又は発現していない急性骨髄性白血病細胞に対する細胞溶解活性を示すグラフである。
【図３】図３は、ＷＴ１ワイルドペプチド又は本発明のＷＴ１改変ペプチドにより刺激されたエフェクター細胞による、ペプチドをパルスされているか又はパルスされていないＣ1Ｒ２４０２標的細胞の殺細胞効果（比細胞溶解活性）を示すグラフである。図中、黒丸は、ワイルドペプチドによりパルスされたＣ１Ｒ２４０２細胞に対する、ＷＴ1改変ペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示し、黒四角は、ワイルドペプチドによりパルスされたＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ1ワイルドペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示し、中空丸は、ワイルドペプチドによりパルスされていないＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ１改変ペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示し、そして中空四角は、ワイルドペプチドによりパルスされていないＣ１Ｒ２４０２標的細胞に対する、ＷＴ１ワイルドペプチドで刺激されたエフェクター細胞による細胞溶解効果を示す。
【図４】図４は、ＷＴ１ワイルドペプチド又は本発明のＷＴ1改変ペプチドにより刺激されたエフェクター細胞による、内因性にＷＴ１を発現している肺癌細胞株又は発現していない肺癌細胞株に対する細胞溶解活性を示すグラフである。
【図５】図５は、ＷＴ１ワイルドペプチド又は本発明のＷＴ１改変ペプチドにより刺激されたエフェクター細胞による、ワイルドペプチドをパルスされているＣ1Ｒ２４０２標的細胞の殺細胞効果（比細胞溶解活性）に対する抗ＨＬＡクラスＩ抗体、抗ＨＬＡクラスII抗体、抗ＣＤ８抗体の阻害効果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(配列番号：３)を含む９〜３０個のアミノ酸から成る癌抗原ペプチドと、抗原提示能を有する細胞とをインビトロで接触させる工程を含むことを特徴とする、抗原提示細胞の製造方法。
【請求項２】
癌抗原ペプチドが配列番号：３に示すアミノ酸配列を含む９〜１２個のアミノ酸から成るペプチドである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
癌抗原ペプチドが配列番号：３に示すアミノ酸配列から成るペプチドである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１】
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(配列番号：３)を含む９〜３０個のアミノ酸から成る癌抗原ペプチドと、抗原提示能を有する細胞とをインビトロで接触させる工程を含むことを特徴とする、抗原提示細胞の製造方法。
【請求項２】
癌抗原ペプチドが配列番号：３に示すアミノ酸配列を含む９〜１２個のアミノ酸から成るペプチドである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
癌抗原ペプチドが配列番号：３に示すアミノ酸配列から成るペプチドである、請求項１に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−３４２９６（Ｐ２００６−３４２９６Ａ）
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２２９１８０（Ｐ２００５−２２９１８０）
【出願日】平成１７年８月８日（２００５．８．８）
【分割の表示】特願２００２−５７７８７７（Ｐ２００２−５７７８７７）の分割
【原出願日】平成１４年３月２２日（２００２．３．２２）
【出願人】（５９５０９０３９２）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月８日（２００５．８．８）
【分割の表示】特願２００２−５７７８７７（Ｐ２００２−５７７８７７）の分割
【原出願日】平成１４年３月２２日（２００２．３．２２）
【出願人】（５９５０９０３９２）
【Ｆターム（参考）】
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