ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール類の製造方法
【課題】ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール類の製造方法を提供する。
【解決手段】アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンに、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する酵素または（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形質転換体、またはその処理物を作用させ、ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを製造することからなる。
【解決手段】アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンに、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する酵素または（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する酵素をコードするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形質転換体、またはその処理物を作用させ、ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを製造することからなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール類を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールは、種々の医薬品等の中間体として有用である（特許文献１〜６等）。その製造方法に関しては、特許文献１には、４−ジベンジルアミノシクロヘキサノンにメチルマグネシウムブロミドを反応させることで、４−ジベンジルアミノ−１−メチルシクロヘキサノールをトランス：シス＝２：３の混合物として得て、トランス体を酸化アルミニウムカラムで分離し、続いて水素添加反応を施すことで製造したことが記載されている。
【化１】
【０００３】
しかしながら、これまでに生化学的手法を用いたｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの製造方法は報告されていない。
【０００４】
【特許文献１】特表平１０−５０５０７８号公報
【特許文献２】国際公開第９９／３８８６７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００１／０３０７４５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００３／０３５６３８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００４／０９４４０４号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００５／００９９６６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、トランス：シスの生成比を向上させて高収率で安価に工業的に製造しうるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール類の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、種々の酵素を用いてアミノ基転移反応を行った結果、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６株が生産する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼが高いＥ／Ｚ比でｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを極めて効率良く生成することを見出し、本発明を完成するに至った。生成したｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールのＥ／Ｚ比は６以上であった。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下を含む。
〔１〕アミノ基供与体の存在下、下記式（１）で表される４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンに、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素を含む酵素活性物質を作用させ、下記式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを製造する方法であって、
該酵素活性物質が、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを合成する、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する、方法；
【化２】
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｂ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｃ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ。
〔２〕前記酵素活性物質が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物に由来する酵素活性物質であることを特徴とする〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａであることを特徴とする〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記酵素活性物質が、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素をコードするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形質転換体、またはその処理物であって、
該酵素は、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを合成する、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する、〔１〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｂ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｃ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ。
〔５〕アミノ基供与体が、フェニルエチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、Ｌ−アラニン、イソプロピルアミンおよび２−アミノペンタンからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕下記の工程を含む、下記一般式（４）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法；
（ｉ）請求項１〜５のいずれかに記載の方法により、下記式（１）で表される４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンから下記式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを製造する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールに、下記一般式（３）で表される化合物を反応させて、下記一般式（４）で表される化合物を得る工程；
【化３】
（式中、環Ａはベンゼン環又は単環性芳香族複素環を表し、該ベンゼン環及び該単環性芳香族複素環は、ハロゲン原子、ニトロ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいカルバモイル及びシアノより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよく；
Ｗは単結合、又は１もしくは２個のアルキルで置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキレンを表し；
ｎは０、１、２、３又は４を表し；
Ｒ１は水素原子、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいフェニル又は置換されていてもよい複素環式基を表し；
Ｒ２は水素原子又はアルキルを表し；
Ｘは脱離基を表し；
ＺはＣＨ又はＮを表す。）。
【０００８】
〔発明の実施の形態〕
本発明は、アミノ基供与体の存在下、式（１）で表される４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノン（「化合物（１）」ということがある。）に、（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素を含む酵素活性物質を作用させ、式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール（「化合物（２）」ということがある。）を製造する方法を提供するものである。該酵素活性物質は、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを合成する、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する。
【化４】
【０００９】
また、本発明は、下記の工程を含む、下記一般式（４）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法を提供するものである。
（ｉ）前記の方法により、式（１）で表される４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンから式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを製造する工程；および、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールに、下記一般式（３）で表される化合物（「化合物（３）」ということがある。）を反応させて、下記一般式（４）で表される化合物（「化合物（４）」ということがある。）を得る工程。
【化５】
【００１０】
式中、環Ａはベンゼン環又は単環性芳香族複素環を表し、該ベンゼン環及び該単環性芳香族複素環は、ハロゲン原子、ニトロ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいカルバモイル及びシアノより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよく；
Ｗは単結合、又は１もしくは２個のアルキルで置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキレンを表し；
ｎは０、１、２、３又は４を表し；
Ｒ１は水素原子、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいフェニル又は置換されていてもよい複素環式基を表し；
Ｒ２は水素原子又はアルキルを表し；
Ｘは脱離基を表し；
ＺはＣＨ又はＮを表す。
【００１１】
「アルキル」としては、例えば直鎖又は分岐鎖のＣ１〜Ｃ６アルキルが挙げられ、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。好ましいアルキルとしては、Ｃ１〜Ｃ４アルキルが挙げられる。
【００１２】
「アルコキシ」としては、例えば直鎖又は分岐鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシが挙げられ、具体的にはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ等が挙げられる。好ましいアルコキシとしては、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシが挙げられる。
【００１３】
「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙がられ、好ましくはフッ素原子、塩素原子が挙げられる。
【００１４】
「アルケニル」としては、例えば直鎖又は分岐鎖のＣ２〜Ｃ７アルケニルが挙げられ、具体的にはビニル、アリル、３−ブテニル、２−ペンテニル、３−ヘキセニル等が挙げられる。好ましいアルケニルとしては、Ｃ２〜Ｃ５アルケニルが挙げられる。
【００１５】
「アルキニル」としては、例えば直鎖又は分岐鎖のＣ２〜Ｃ７アルキニルが挙げられ、具体的にはエチニル、プロパルギル、３−ブチニル、２−ペンチニル、３−ヘキシニル等が挙げられる。好ましいアルキニルとしては、Ｃ２〜Ｃ５アルキニルが挙げられる。
【００１６】
「アルカノイル」としては、例えば直鎖又は分岐鎖のＣ２〜Ｃ７アルカノイルが挙げられ、具体的にはアセチル、プロピオニル、ブチニル、イソブチニル、ペンタノイル、ヘキサノイル等が挙げられる。好ましいアルカノイルとしては、Ｃ２〜Ｃ５アルカノイルが挙げられる
【００１７】
「シクロアルキル」としては、例えばＣ３〜Ｃ８シクロアルキルが挙げられ、好ましくはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルが挙げられる。
【００１８】
「複素環式基」としては、例えば、一部又は全部が飽和していてもよい、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる１〜３個の異項原子を含む、単環性、二環性又は三環性の複素環式基が挙げられる。好ましくは、５又は６員環の単環性の複素環式基が挙げられ、具体的には、フリル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、チエニル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、テトラゾリル、ピロリル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ピペリジニル、ピラゾリル、ピペラジニル、モルホリニル、イミダゾリル、トリアゾリル、イミダゾリニル、ピラゾリニル等が挙げられる。
【００１９】
「単環性芳香族複素環」としては、例えば、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる１〜３個の異項原子を含む単環性芳香族複素環が挙げられる。また、「単環性芳香族複素環」としては、例えば、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる１〜３個の異項原子を含む単環性芳香族複素環が挙げられ、例えば、５又は６員の単環性芳香族複素環が挙げられる。単環性芳香族複素環の具体例としては、チオフェン、フラン、フラザン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、オキサジアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン等が挙げられる。好ましい単環性芳香族複素環としては、チオフェン、フランが挙げられる。
【００２０】
環Ａ上の置換基が「置換されていてもよいアルキル」である場合、該アルキル上の置換基としては、例えば、ハロゲン原子、水酸基、アミノ等が挙げられる。該アルキルは、上記置換基を１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。置換アルキルの具体例としては、ヒドロキシメチル、トリフルオロメチル、アミノメチル、クロロエチル等が挙げられる。
【００２１】
環Ａ上の置換基が「置換されていてもよいアルコキシ」である場合、該アルコキシ上の置換基としては、例えば、水酸基、アミノ等が挙げられる。該アルコキシは、上記置換基を１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。
【００２２】
環Ａ上の置換基が「置換されていてもよいアミノ」である場合、該アミノ上の置換基としては、例えば、アルキル（該アルキルは、アルコキシ、アミノ及びカルボキシより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよい）、アルカノイル等が挙げられる。該アミノは、例えば上記置換基を、１又は２個有していてもよく、置換基数が２個の場合、各置換基は同一又は異なってもよい。
【００２３】
環Ａ上の置換基が「置換されていてもよいカルバモイル」である場合、該カルバモイル上の置換基としては、例えば、アルキル等が挙げられる。該カルバモイルは、上記置換基を１又は２個有していてもよく、置換基数が２個の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。
【００２４】
環Ａ上の置換基としては、好ましくは、ハロゲン原子、ニトロ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアミノ及びシアノが挙げられる。特に好ましくはハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ等が挙げられ、その具体例としては、フッ素原子、塩素原子、メチル、メトキシ等が挙げられる。
【００２５】
Ｒ１が「置換されていてもよいアルキル」である場合、該アルキル上の置換基としては、例えば、アルキニル、シアノ、アルコキシ、水酸基、アミノ（該アミノは、アルキル、アルカノイル及びアルキルスルホニルより成る群から選ばれる１又は２個の基で置換されてもよい）、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル（該カルバモイルは、１又は２個のアルキルで置換されてもよい）、フェニル、ナフチル等が挙げられる。該アルキルは、例えば上記置換基を、１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。好ましい置換基としては、シアノ、アルコキシ、水酸基、アミノ、カルボキシ、アルキル置換されていてもよいカルバモイル、フェニル等が挙げられる。
【００２６】
Ｒ１が「置換されていてもよいシクロアルキル」である場合、該シクロアルキル上の置換基としては、例えば、（１）水酸基、（２）アルコキシ（該アルコキシは、１〜３個のアルコキシで置換されてもよい）、（３）アミノ〔該アミノは、次の(i)〜(v)より成る群から選ばれる同一又は異なる１又は２個の基で置換されてもよい：(i)アルキル、(ii)アルカノイル、(iii)アルコキシカルボニル、(iv)カルバモイル（該カルバモイルは、１又は２個のアルキルで置換されてもよい）、及び(v)アルキルスルホニル〕、（４）カルボキシ、（５）アルキル〔該アルキルは、水酸基、アルコキシ及びアミノより成る群から選ばれる基で置換されてもよい〕、（６）アルキル置換されていてもよいカルバモイル等が挙げられる。該シクロアルキルは、例えば上記置換基を１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。
【００２７】
Ｒ１が「置換されていてもよいフェニル」である場合、該フェニル上の置換基としては、例えば、（１）ハロゲン原子、（２）ニトロ、（３）アルキル（該アルキルは、ハロゲン原子、水酸基、アミノ、カルボキシ及びフェニルスルホニルより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよい）、（４）アルケニル、（５）シアノ、（６）水酸基、（７）アルコキシ（該アルコキシは、ハロゲン原子、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、フェニル及びモルホリニルカルボニルより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよい）、（８）アミノ〔該アミノは、次の（ｉ）〜（ｉｖ）より成る群から選ばれる同一又は異なる１又は２個の基で置換されてもよい：（ｉ）アルキル、（ｉｉ）アルカノイル、（ｉｉｉ）カルバモイル（該カルバモイルは、アルキル及びシクロアルキルより成る群から選ばれる同一又は異なる１又は２個の基で置換されてもよい）、及び（ｉｖ）アルキルスルホニル〕、（９）アルカノイル、（１０）カルボキシ、（１１）アルコキシカルボニル、（１２）カルバモイル〔該カルバモイルは、次の（ｉ）及び（ｉｉ）より成る群から選ばれる同一又は異なる１又は２個の基で置換されてもよい：（ｉ）アルキル（該アルキルは、１〜３個の水酸基で置換されてもよい）、及び（ｉｉ）シクロアルキル〕、（１３）アルキルチオ、（１４）アルキルスルフィニル、（１５）アルキルスルホニル、（１６）フェニル、（１７）テトラゾリル、（１８）複素環式基置換カルボニル（該複素環式基は、アルキル及びアルコキシカルボニルより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよい）等が挙げられる。Ｒ１が置換されてもよいフェニルである場合、該フェニルは、例えば上記置換基を、１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。好ましい置換基としては、（１）ハロゲン原子、（２）アルキル（該アルキルは、ハロゲン原子、水酸基、アミノ、カルボキシ及びフェニルスルホニルより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよい）、（３）シアノ、（４）アルコキシ（該アルコキシは、ハロゲン原子、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、フェニル及びモルホリニルカルボニルより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよい）等が挙げられる。置換基の置換位置としては、置換しうる位置であればいずれでもよく、特に好ましい位置としては２位が挙げられる。
【００２８】
Ｒ１が「複素環式基置換カルボニルで置換されたフェニル」である場合、該複素環式基としては前記の複素環式基が挙げられ、好ましくは、５又は６員環の単環性含窒素脂肪族複素環式基が挙げられる。具体例としては、ピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル等が挙げられる。
【００２９】
Ｒ１が「置換されていてもよい複素環式基」である場合、該複素環式基としては前記の複素環式基が挙げられ、好ましくは、５又は６員環の単環性の複素環式基が挙げられる。具体例としては、フリル、テトラヒドロフリル、チエニル、チアゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピラゾリル、テトラゾリル、テトラヒドロピラニル等が挙げられ、特に好ましくは、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル等が挙げられる。また、該複素環式基上の置換基としては、例えば、ハロゲン原子、ニトロ、アルキル（該アルキルは、水酸基、アルコキシ、アルキル置換されていてもよいカルバモイル及びカルボキシより成る群から選ばれる基で置換されていてもよい）、シアノ、水酸基、アミノ、アルカノイル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル（該カルバモイルは、１又は２個のアルキルで置換されていてもよい）、アルキルスルホニル、フェニル等が挙げられる。該複素環式基は、例えば上記置換基を１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。
【００３０】
「脱離基」としては、ハロゲン原子、置換されていてもよいアリールスルフィニル、置換されていてもよいアルキルスルフィニル、置換されていてもよいアリールスルホニル、置換されていてもよいアルキルスルホニル、置換されていてもよいアリールスルホニルオキシ、置換されていてもよいアルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいチオアルコキシ等が挙げられる（"Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ"， ５ｔｈ ｅｄ．，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ，ｐ．８６４−８６５，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００１年）。好ましい脱離基としては、ハロゲン原子、置換されていてもよいアリールスルフィニル、置換されていてもよいアルキルスルフィニル、置換されていてもよいアリールスルホニル、又は置換されていてもよいアルキルスルホニル等が挙げられる。「置換されていてもよいアリールスルフィニル」、「置換されていてもよいアリールスルホニル」及び「置換されていてもよいアリールスルホニルオキシ」における置換基としては、例えばハロゲン原子、アルキル、アルコキシ等が挙げられる。「置換されていてもよいアルキルスルフィニル」、「置換されていてもよいアルキルスルホニル」、「置換されていてもよいアルキルスルホニルオキシ」、「置換されていてもよいアルコキシ」及び「置換されていてもよいチオアルコキシ」における置換基としては、例えばハロゲン原子等が挙げられる。特に好ましい脱離基としては、塩素原子、メチルスルフィニル、メチルスルホニル等が挙げられる。
【００３１】
「薬学的に許容される塩」は、化合物（４）と、医薬品の製造に使用可能である酸または塩基とを接触させることにより製造される。当該塩には、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トシル酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩、または、カルボキシ等の置換基を有する場合には塩基との塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩またはカルシウム塩の如きアルカリ土類金属塩）が含まれる。
当該薬学的に許容される塩には、化合物（４）またはその薬学的に許容される塩の、水和物もしくは溶媒和物を含む。
【００３２】
本発明に係る製造方法により化合物がフリー体として得られる場合、当該化合物が形成していてもよい塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物の状態に、常法に従って変換することができる。
【００３３】
化合物（４）におけるｎとＲ１の好ましい組合せとしては、例えば、（１）ｎが０であって、Ｒ１が置換されていてもよいアルキルであるもの、（２）ｎが１であって、Ｒ１が置換されていてもよいシクロアルキルであるもの、（３）ｎが１であって、Ｒ１が置換されていてもよいフェニルであるもの、（４）ｎが１であって、Ｒ１が置換されていてもよい複素環式基であるもの、（５）ｎが０であって、Ｒ１が置換されていてもよいシクロアルキルであるもの、及び（６）ｎが０であって、Ｒ１が置換されていてもよい複素環式基であるもの等が挙げられる。特に好ましくは、（１）ｎが０であって、Ｒ１が置換されていてもよいアルキルであるもの、（２）ｎが１であって、Ｒ１が置換されていてもよいフェニルであるもの、（３）ｎが０であって、Ｒ１が置換されていてもよいシクロアルキルであるもの、及び（４）ｎが０であって、Ｒ１が置換されていてもよい複素環式基であるもの等が挙げられる。さらに好ましくは、（１）ｎが０であって、Ｒ１が水酸基で置換されてもよいＣ１〜Ｃ４アルキルであるもの、（２）ｎが１であって、Ｒ１がフェニル（該フェニルは、シアノ、フッ素原子、塩素原子及びメチルより成る群から選ばれる基で置換されていてもよい）であるもの、（３）ｎが０であり、Ｒ８がＣ３〜Ｃ４シクロアルキルであるもの、及び（４）ｎが０であり、Ｒ８がテトラヒドロピラニルであるもの等が挙げられる。
【００３４】
酵素活性物質
本発明における酵素活性物質は、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素を含み、かつ、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを生成しうるものであれば、任意の酵素活性物質を用いることができる。
【００３５】
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｂ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｃ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ。
【００３６】
このような本発明で用いることのできる酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した分子量が約５１０００、ゲルろ過によって測定した分子量が約１５００００である。
また、至適ｐＨは６．５−９である。リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた活性測定によれば、至適温度は５５℃〜６５℃であり、この温度範囲で８０％以上の酵素活性を示す。最適温度は６０℃である。このように比較的高温領域において反応を実施できるので、工業的にも効率的であるという利点がある。
【００３７】
なお、本発明においてｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールとは、少なくともＥ／Ｚ比が１以上、好ましくは２以上、より好ましくは５以上のｔｒａｎｓ異性体過剰を指す。Ｅ／Ｚ比は高ければ、高いほうが好ましく、上限値に特に制限はなく、好ましくはＥ対のみである。
【００３８】
本発明において、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼは、１級アミン若しくは２級アミンをアミノドナーとして、アルデヒド若しくはケトンにアミノ基を転移し、対応する１級若しくは２級アミンを生成する反応を触媒する酵素である。
【００３９】
（Ｓ）−アミントランスアミナーゼによるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール生成活性は、以下のような方法で測定できる。すなわち、１００ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、４０ｇ／Ｌ ４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノン、１．２５Ｍ（±）−ｓｅｃ−ブチルアミン、および酵素活性物質を含む反応液中で、３０℃で反応させ、生成するｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを分析することにより、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を測定することができる。
【００４０】
本発明における好ましい酵素活性物質は、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンを基質として、Ｅ／Ｚ比が少なくとも１以上のｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを生成することができる酵素活性物質であって、前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの酵素を含めばよく、本発明に用いる酵素の由来に特に制限はない。
【００４１】
このうち、本発明における好ましい酵素活性物質は、たとえばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物から得ることができる。より具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ由来の、さらに具体的にはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６株由来の（Ｓ）−アミントランスアミナーゼが挙げられる。
【００４２】
その他、種々の生物に由来する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼも、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンを基質として、Ｅ／Ｚ比が少なくとも１以上のｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを生成するする活性を有する、前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの酵素である限り利用することができる。
【００４３】
本発明において、酵素活性物質とは、前記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素を含み、該酵素の精製酵素のみならず、該酵素を含む微生物菌体、植物、その培養細胞、形質転換体、またはその処理物が含まれる。
【００４４】
前記処理物とは、生物細胞に対して、物理処理、生化学的処理、あるいは化学的処理等を行った産物を指す。生物細胞は、当該酵素の遺伝子を発現可能に保持する形質転換体も含まれる。
また処理物を得るための物理処理には、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、あるいは磨砕処理等が含まれる。
また生化学的処理とは、具体的にはリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理を示すことができる。
更に、化学的処理としては、界面活性剤、トルエン、キシレン、またはアセトンなどの有機溶媒との接触処理などが挙げられる。
このような処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどは処理物に含まれる。
【００４５】
酵素活性物質として利用できる精製酵素は、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６株から公知の方法によって単離することができる。あるいは酵素活性物質として形質転換体を利用することもできる。
まず（Ｓ）−アミントランスアミナーゼをコードする遺伝子を取得し、遺伝子組換え技術を用いて同種もしくは異種の宿主中で発現可能に保持させた形質転換体を得ることができる。この形質転換体は、そのままで、あるいは処理物として酵素活性物質とすることができる。更にこの形質転換体を培養して、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼを取得することもできる。本発明に用いることができる（Ｓ）−アミントランスアミナーゼをコードする遺伝子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏａｎｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６株からクローニングされた。
【００４６】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏａｎｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６株は本願出願人によって、下記のとおり寄託されている。
（ａ） 寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
あて名：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８）
（ｂ） 寄託日：２００５年９月２１日
（ｃ） 受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１３９
【００４７】
これらの塩基配列情報に基づいて、目的とする遺伝子を当該生物から取得することができる。遺伝子の取得には、ＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングが用いられる。また、ＤＮＡ合成によって遺伝子の全長を化学的に合成することもできる。
【００４８】
更に上記塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来する(S)-アミントランスアミナーゼ遺伝子を取得することもできる。たとえば、上記塩基配列もしくはその一部の配列をプローブとして他の生物から調製したＤＮＡや環境中のＤＮＡ（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ＤＮＡ）に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行なうことにより、種々の生物由来の（Ｓ）−アミントランスアミナーゼを単離することができる。
【００４９】
ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載された塩基配列から選択された塩基配列を有するＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｉｃａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いたマニュアルに記載の条件（ｗａｓｈ：４２℃、０．５ｘＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）や０．２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間洗浄する条件において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。プローブＤＮＡを構成する塩基配列は、前記塩基配列から任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択することができる。
【００５０】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３−６．４）、「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １： Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）、特にＳｅｃｔｉｏｎ２．１０）等を参照することができる。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドのホモログには、上述のように、配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【００５２】
また、上記塩基配列情報に基づいて、ホモロジーの高い領域からＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。このようなプライマーを用い、染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なえば、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼをコードする遺伝子を種々の生物から単離することもできる。
【００５３】
本発明の方法においては、天然型の酵素のみならず、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからＥ／Ｚ比が少なくとも１以上のｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを生成する活性を有する限り、天然型酵素のアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸配列からなる酵素を用いることも可能である。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７ （１９８２）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８ （１９８３）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄＥｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）， ＰＣＲ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２００（１９９１））などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、蛋白質の構造を改変することができる。また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもあり、人工的にアミノ酸を変異した酵素のみならず、自然界においてアミノ酸が変異した酵素も本発明の方法において用いることができる。
【００５４】
さらに、本発明で用いることのできるポリヌクレオチドのホモログとしては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。このような欠失を含むポリヌクレオチドには、配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質の「一部分」をコードするポリヌクレオチドが包含される。
【００５５】
タンパク質においてアミノ酸残基を置換する場合、特に、側鎖の化学的性質が類似したアミノ酸による置換、いわゆる保存的なアミノ酸置換を行うことが好ましい。アミノ酸は、それらの側鎖の化学的性質に従い、例えば、次のように分類される：
(1)中性疎水性側鎖(アラニン、トリプトファン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、ロイシン)；
(2)中性極性側鎖(アスパラギン、グリシン、グルタミン、システイン、セリン、チロシン、トレオニン)；
(3)塩基性側鎖（アルギニン、ヒスチジン、リシン）；
(4)酸性側鎖(アスパラギン酸、グルタミン酸)；
(5)脂肪族側鎖(アラニン、イソロイシン、グリシン、バリン、ロイシン)；
(6)脂肪族水酸基側鎖（セリン、トレオニン）；
(7)アミン含有側鎖(アスパラギン、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、リシン)；
(8)芳香族側鎖(チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン)；および
(9)硫黄含有側鎖(システイン、メチオニン)。
【００５６】
すなわち、これらの各群を構成するアミノ酸残基の相互の置換を、保存的置換と言う。本発明において、「１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加」するアミノ酸の数や場所は、タンパク質が前記（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する限り、制限されない。変異が許容されるアミノ酸残基の数は、典型的には全アミノ酸の１０％以内、好ましくは全アミノ酸の５％、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。より具体的には、配列番号：２のアミノ酸配列において、通常５０以内、たとえば２０以内、より好ましくは５以内のアミノ酸残基の変異は、許容される。
【００５７】
タンパク質が、前記の元のタンパク質の生物学的活性を維持している限り、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失・置換・付加及び/または挿入は許容される。ここで、生物学的活性の維持とは、元の酵素が触媒する少なくとも一つの反応を触媒する能力が維持されることを言う。「活性の維持」には、同じ活性レベルのみならず、より高い活性も含まれる。また、活性のレベルが低下する場合であっても、実質的に同等の活性であれば、活性の維持に含まれる。実質的に同等とは、元の活性に対して、たとえば５０％〜１００％、通常７０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９０、あるいは９５〜１００％の活性をいう。本発明におけるタンパク質の生物学的活性、すなわち前記（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性の評価方法は既に述べた。
【００５８】
また、本発明の方法においては、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼのアミノ酸配列にホモロジーを有する蛋白質をコードする遺伝子も、その産物である酵素がアミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを生成する活性を有する限り、本発明に利用することができる。ホモロジー検索には、たとえば以下に示すデータベースを用いることができる。
【００５９】
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベース
ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベース
ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベース
【００６０】
ＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍやＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍなどのホモロジー検索用のプログラムも公知である。更に、上記データベースをこれらのプログラムを用いて検索するサービスも、インターネット上で提供されている。この種のサービスを利用して、本発明に用いる蛋白質を見出すこともできる。
【００６１】
本発明に用いる（Ｓ）−アミントランスアミナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏａｎｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６由来の（Ｓ）−アミントランスアミナーゼのアミノ酸配列と、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、さらに特に好ましくは９９％以上のホモロジーを有する蛋白質が好ましい。ここでいうホモロジーとは、たとえば、ＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍを用いたＩｄｅｎｔｉｔｙの相同性の値を示す。
【００６２】
本発明における好ましい酵素活性物質として、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼをコードする遺伝子を遺伝子組換え技術により同種もしくは異種の宿主中で発現させた形質転換体、もしくはその処理物を示すことができる。
【００６３】
本発明において（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ遺伝子を発現させるために、形質転換の対象となる生物は、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターにより形質転換され、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。
【００６４】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行なうことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラー・クローニング、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。微生物中などにおいて、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．４３，７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ ８，４２３−４８８（１９９２）、などに詳細に記述されている。
【００６５】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。形質転換体の培養、および形質転換体からの（Ｓ）−アミントランスアミナーゼの精製は、当業者に公知の方法により行なうことができる。
【００６６】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００６７】
単一のベクターに（Ｓ）−アミントランスアミナーゼを導入したプラスミドは、例えばｐＳＥ４２０Ｄ（特開２０００−１８９１７０）に各遺伝子をタンデムに連結して取得することができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏａｎｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６由来の（Ｓ）−アミントランスアミナーゼが導入されたプラスミドｐＳＵＰＣＡＴ１は、実施例中に示した。
【００６８】
ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの製造方法
本発明のｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの製造方法を構成する酵素反応は、前記酵素活性物質を、アミノ基供与体、および基質である４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンを含む反応溶液と接触させることにより、実施することができる。さらに得られたｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを回収することができる。
【００６９】
具体的には、水性媒体中、水性媒体と水可溶性の有機溶媒との混合系、あるいは水不溶性の溶媒との二相系中において行なうことができる。
水性媒体としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などの中性付近に緩衝能を有する緩衝液が挙げられる。あるいは酸とアルカリを用いて反応中のpH変化を好ましい範囲にとどめることが可能であれば、緩衝液を特に使う必要はない。
水不溶性の有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、キシレン、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、イソオクタン、メチルイソブチルケトン、メチル−ｔ−ブチルエーテル、ｎ−ブタノールなどを用いることができる。
水可溶性の溶媒としては、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の有機溶媒が挙げられる。
【００７０】
二相系では、酵素活性物質は、そのまま、あるいは水や緩衝液の溶液として供給される。基質化合物を水、緩衝液またはエタノール等の水溶性溶媒に溶解させて反応系に供給することもできる。この場合は、酵素活性物質とともに単一相の反応系を構成することになる。その他、本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行なうことも可能である。なお、酵素活性物質と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されない。反応溶液とは、基質を酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。
【００７１】
本発明の（Ｓ）−アミントランスアミナーゼによる酵素反応は、以下の条件で行なうことができる。
・基質濃度：好ましくは０．０１−３０％、さらに好ましくは０．１−２０％、より好ましくは１．０−１０％（％は、溶媒に対する質量割合を示す。）
・反応温度：好ましくは４−６０℃、さらに好ましくは１０−５０℃、より好ましくは２５−４０℃
・ｐＨ：好ましくは４−１０、さらに好ましくは５．５−９．５、より好ましくは６．５−８．５
【００７２】
基質である、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンは、既知の方法（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９（５−６），７４５−５４； １９８９）に従って容易に合成することが可能である。また、基質は反応開始時に一括して添加するか、あるいは連続的もしくは非連続的に添加することができる。
【００７３】
反応系には必要に応じてピリドキサール−５'−リン酸０．００１ｍＭ−１０ｍＭ、好ましくは０．００２−１ｍＭ、より好ましくは０．０１−０．１ｍＭ添加することができる。
【００７４】
アミノ基供与体となる化合物は、例えば、フェニルエチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、Ｌ−アラニン、イソプロピルアミン、２−アミノペンタンが挙げられる。
【００７５】
より具体的には、（±）−フェニルエチルアミン、（Ｓ）−フェニルエチルアミン、（Ｒ）−フェニルエチルアミン、（±）−ｓｅｃ−ブチルアミン、（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチルアミン、Ｌ−アラニン、イソプロピルアミンおよび２−アミノペンタンなどが挙げられる。このうち特に好ましいのは、（±）−フェニルエチルアミン、（Ｓ）−フェニルエチルアミン、（±）−ｓｅｃ−ブチルアミン、Ｌ−アラニン、イソプロピルアミンおよび２−アミノペンタンなどが挙げられる。
【００７６】
アミノ基供与体の添加量は、基質であるケトンに対して、モル比で例えば、好ましくは０．１−２０倍、さらに好ましくは０．５−１０倍、より好ましくは１−４倍の量を添加することができる。
【００７７】
本発明により反応液中で生成したｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの精製は、遠心分離や膜ろ過による菌体や蛋白質の除去、膜処理等による蛋白質の分離、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、メチル−ｔ−ブチルエーテル、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール、イソブタノール、ｎ−ペンタノール、ｓｅｃ−ペンタノール、ｔ−ペンタノール、イソペンタノールなどによる溶媒抽出、蒸留、酢酸エチル、酢酸ブチル、キシレン、トルエン、メシチレン、クロルベンゼン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、イソオクタン、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテルなどによる結晶化、等を適当に組み合わせることにより行なうことができる。あるいは、抽出溶媒液に塩酸を滴下することで生成する塩酸塩として回収することもできる。目的物は、必要によりシリカゲルカラムクロマトグラフィー、蒸留によりさらに精製することができる。
【００７８】
例えば、ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを含む反応液を遠心分離することにより菌体を除去し、限外ろ過などにより蛋白質を除去した後に、水酸化ナトリウムを加えてｐＨを１２以上にした後、ｎ−ブタノールを用いてｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを抽出する。さらに、ｎ−ブタノールを減圧下で留去した後、キシレン、トルエン、メシチレン等を用いて晶析することによりｔｒａｎｓ体を選択的に回収することができる。
【００７９】
化合物（４）またはその薬学的に許容される塩の製造方法
【化６】
【００８０】
式中、各記号は前記と同義である。化合物（２）は、前記方法により製造することができる。
【００８１】
化合物（３）は公知化合物であり、国際公開第２００３／０３５６３８号パンフレット又は国際公開第２００４／０９４４０４号パンフレットに従って製造される。
【００８２】
化合物（３）と化合物（２）とを反応させることによる化合物（４）の製造方法は、国際公開第２００３／０３５６３８号パンフレット及び国際公開第２００４／０９４４０４号パンフレットに記載されている。具体的には、化合物（３）と化合物（２）の反応は、溶媒中、塩基の存在下で実施することができる。溶媒としては、反応に悪影響を及ぼさない溶媒であればよく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、ジオキサン、ＴＨＦ、アセトニトリル、２−ブタノン、エチレングリコール、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−ブタノール、１−プロパノール、２−プロパノール等が挙げられ、好ましくはＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＮＭＰ、ジオキサン、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール等が挙げられる。塩基としては、生成する酸を中和できる塩基であればよく、例えば、３級アミン（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、１−エチルピペリジン、４−メチルモルホリン、トリフェニルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、２−ピコリン、２，６−ルチジン等）、立体障害の高い２級アミン（ジイソプロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン、ジ−ｔ−ブチルアミン等）、立体障害の高い１級アミン（ｔ−ブチルアミン等）、炭酸アルカリ（炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等）、炭酸水素アルカリ（炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等）、カリウム ｔ−ブトキシド等が挙げられ、好ましくは１−エチルピペリジン、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン、ジ−ｔ−ブチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ｔ−ブチルアミン等が挙げられる。本反応は、通常、０〜１５０℃で進行し、とりわけ８０〜１２０℃で好適に進行する。
【００８３】
ＺがＣＨである化合物（３）と化合物（２）との反応は、溶媒中、触媒、塩基、及び添加剤の存在下で実施することもできる（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６１，７２４０（１９９６）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，Ｖｏｌ．４４，１３７１（２００５））。溶媒としては、反応に悪影響を及ぼさない溶媒であればよく、例えば、トルエン、キシレン、ジメトキシエタン、ジオキサン等が挙げられる。触媒としては、例えば、酢酸パラジウム、ビス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム等が挙げられる。塩基としては、例えば、ナトリウム ｔ−ブトキシド、カリウム ｔ−ブトキシド、リチウム ｔ−ブトキシド、トリエチルアミン等が挙げられる。添加剤としては、２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル等が挙げられる。本反応は、３０〜１５０℃、とりわけ６０〜８０℃で好適に進行する。また、触媒として、ニッケル触媒、銅触媒等を使用することもできる（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６７，３０２９（２００２）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１９，６０５４（１９９７）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６７，３０２９（２００２）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，Ｖｏｌ．６２，４４３５（２００６））。
【００８４】
上記工程において、アミノ等の官能基を有する場合には、必要に応じて、有機合成化学の分野における慣用の方法により、官能基を保護して反応を行うことができ、反応後、保護基を脱保護して目的物を得ることができる。ここで、官能基の保護基としては、有機合成化学の分野で通常使用される保護基が挙げられる。具体的には、Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ， Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"３ｒｄ．ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９に記載の保護基が挙げられる。
【実施例】
【００８５】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００８６】
本発明における、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノン、ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム：Ｊ&Ｗ製ＨＰ−５（φ３ｍｍ×２．１ｍ）、カラム温度：５０℃→８℃／分→１５０℃→１５℃／分→２１０℃→３．５分保持、インジェクション温度：３００℃、ディテクター温度：２７５℃、キャリアガス：ヘリウム、検出：ＦＩＤ）により行なった。
【００８７】
４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールのＥ／Ｚ比の測定は、アミノ基解析用の２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ｂｅｔａ−Ｄ−グルコピラノシルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）で４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール誘導化した後、液体クロマトグラフィー（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製Ｌｕｎａ ５ｕ Ｃ１８、溶離液：２．５％ 酢酸水溶液を２５％アンモニア水でｐＨ４．０に合わせた液／メタノール＝５７／４３、カラム温度：４０℃、流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２２５ｎｍ）により行なった。
【００８８】
〔調製例１〕 シュードモナス・コルガータ １０Ｆ６株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６）の培養菌体の調製
シュードモナス・コルガータ １０Ｆ６株を下記の組成の培地（ｐＨ７．０）で２５℃、４０時間振盪培養し、遠心分離により菌体を得た。
３ｇ／Ｌグルコース、
１ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、
３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、
０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、
２ｇ／Ｌ 酵母エキス、
１０ｍＬ／Ｌ ミネラル溶液（１．５ｇ／Ｌ ニトリロ三酢酸、１．０６ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ２・５Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ ＫＩ、０．０２ｇ／Ｌ Ｎａ２Ｍｏ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（ＫＯＨ））、
１ｇ／Ｌ １−アミノペンタン
【００８９】
〔調製例２〕（Ｓ）−アミントランスアミナーゼの精製
調製例１により調製した菌体４０ｇを、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５ｍＭ ピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）を含む菌体破砕液に懸濁し、ガラスビーズにより菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清画分を無細胞抽出液とした。
無細胞抽出液を硫酸プロタミン処理によって核酸を除いた後、７０％飽和まで硫安を添加し、遠心分離により上清画分を除去し、得られた沈殿画分を回収した。この沈殿画分を３０％飽和硫安濃度となるように緩衝液１に懸濁した。緩衝液１の組成は次のとおりである。
緩衝液１：１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、
１ｍＭ ＤＴＴ、
０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、および
０．０５ｍＭ ＰＬＰ
次いで、３０％飽和硫安を含む緩衝液１で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（５．０×２３．５ｃｍ、アマシャム製）に酵素を吸着させた。同緩衝液で洗浄後、緩衝液１を用いて５ｍＬ／ｍｉｎで３０％飽和から０％硫安までグラジエント溶出し、活性画分を回収して濃縮後、緩衝液１で透析した。
【００９０】
次に、緩衝液１で平衡化したＭｏｎｏＳ ５／５０（アマシャム製）に酵素を吸着させた。同緩衝液で洗浄後、緩衝液１を用いて０．１ｍＬ／ｍｉｎで０Ｍから０．５Ｍ塩化ナトリウムまでグラジエント溶出し、活性画分を回収して濃縮後、緩衝液１で透析した。次に、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液１で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０（アマシャム製）に酵素液を供し、同緩衝液を用いて０．０５ｍＬ／ｍｉｎで溶出して得た活性画分を回収して濃縮後、ｐＨ７．０の緩衝液１で透析した。
【００９１】
次に、ｐＨ７．０の緩衝液１で平衡化したＭｏｎｏＱ ５／５０（アマシャム製）に酵素を吸着させた。同緩衝液で洗浄後、ｐＨ７．０の緩衝液１を用いて０．５ｍＬ／ｍｉｎで０Ｍから０．５Ｍ塩化ナトリウムまでグラジエント溶出し、活性画分を回収して濃縮後、緩衝液１で透析した。次に、２ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５ｍＭ ＰＬＰで平衡化したＨＣＡ−Ｃｏｌｕｍｎ Ａ−５０１０Ｇ（０．５ｃｍ×１０ｃｍ、製）に酵素を吸着させた。同緩衝液で洗浄後、３５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５ｍＭ ＰＬＰを用いて０．５ｍＬ／ｍｉｎで２ｍＭから３５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液までグラジエント溶出し、活性画分を回収して濃縮して精製酵素を得た。
精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果、単一バンドを示した。
精製の要約を表１に示した。各ステップにおいて得られた酵素液の（Ｓ）−フェニルエチルアミン：１−ベンジル−３−ピロリジノン アミントランスアミナーゼ活性は実施例３に記載の方法により行った。
（Ｓ）−アミントランスアミナーゼの精製
【００９２】
【表１】
【００９３】
〔調製例３〕（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性の測定
調製例２で得た酵素液を用いて本酵素の（Ｓ）−フェニルエチルアミン：１−ベンジル−３−ピロリジノン アミントランスアミナーゼ活性を測定した。１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ（Ｓ）−フェニルエチルアミン、１０ｍＭ １−ベンジル−３−ピロリジノン、０．０５ｍＭ ＰＬＰ、５ｍＭ ＤＴＴ及び酵素液を含む０．５ｍＬの反応液中３０℃で反応させた後、０．１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌで反応を停止した。得られた反応終了液に含まれる１−ベンジル−３−アミノピロリジンを以下に示す分析条件においてＨＰＬＣで定量した。この条件の下、１分間に１μｍｏｌの１−ベンジル−３−アミノピロリジンの生成を触媒する酵素量を１Ｕとした。
また、タンパク質は、Ｂｏｖｉｎｅ Ｐｌａｓｍａ Ａｌｂｕｍｉｎを標準タンパク質として、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により定量した。
カラム：Ｌｕｎａ ５ｕ Ｃ１８（２）（２．０ｍｍ×１５０ｍｍ）（フェノメネックス（ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）社）
溶離液：５０ｍＭ ＫＰＢ （ｐＨ ２．５）、５ｍＭ １−ｈｅｘａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ／ＣＨ３ＣＮ＝９１／９
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ
【００９４】
〔調製例４〕 （Ｓ）−アミントランスアミナーゼの分子量
精製酵素を、ＳＭＡＲＴ ＳｙｓｔｅｍにおいてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ３．２／３０（アマシャム製）を用い、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５ｍＭ ＰＬＰ、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む溶離液でゲル濾過を行った結果、分子量は約１５０，０００であった。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサブユニットの分子量を測定した結果、約５１，０００であった。
【００９５】
〔調製例５〕 （Ｓ）−アミントランスアミナーゼに対する温度の影響
調製例２で得た（Ｓ）−アミントランスアミナーゼをリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて２０℃から９０℃で実施例３に記載の方法により活性測定を行い図１に示した。本酵素の最適温度は、６０℃であり、５５℃から６５℃の範囲で８０％以上の活性を示した。
【００９６】
〔調製例６〕 （Ｓ）−アミントランスアミナーゼに対するｐＨの影響
調製例２で得た（Ｓ）−アミントランスアミナーゼを、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、リン酸１水素２カリウム−ＫＯＨ緩衝液を用いて調製例３に記載の方法によって酵素活性を測定した。結果を図２に示した。本酵素はｐＨ６．５からｐＨ９．０の範囲で８０％以上の活性を示した。
【００９７】
〔調製例７〕（（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ遺伝子を含む発現プラスミドｐＳＵＰＣＡＴ１の構築）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６に由来するタンパク質（配列番号：２）をコードする遺伝子（配列番号：１）の塩基配列をもとにセンスプライマーとしてＰＣＳＡＴ−ＡＴＧ１（配列番号：３）、アンチセンスプライマーとしてＰＣＳＡＴ−ＴＡＡ１（配列番号：４）を合成した。
【００９８】
ＰＣＲ反応は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６株から、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８，４３２１（１９８０）の方法に従ってゲノムＤＮＡを精製して得られたＰＣＲ産物１００ｎｇを鋳型として、２．５Ｕ ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＴｕｒｂｏ用緩衝液、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌのプライマーＰＣＳＡＴ−ＡＴＧ１、ＰＣＳＡＴ−ＴＡＡ１のセットを含む５０μＬの反応液で９４℃／３０秒、６４℃／３０秒、７２℃／１分３０秒、３０サイクルを行った。
【００９９】
アガロースゲル電気泳動により解析した結果、約１．４ｋｂあたりに特異的と思われるＰＣＲ産物が検出できた。得られたＤＮＡ断片をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ファルマシア製）により精製した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）にライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Ｆｌｅｘｉ−Ｐｒｅｐ（ファルマシア製）によりプラスミドを精製し、ｐＰＣＳＡＴとした。
【０１００】
精製したプラスミドを用いて、挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列の解析には、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（パーキンエルマー製）を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ３１０（パーキンエルマー製）により行った。
【０１０１】
配列番号：３ ＰＣＳＡＴ−ＡＴＧ１
ＣＡＡＡＣＡＴＧＴＡＣＧＡＧＣＡＡＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡ
配列番号：４ ＰＣＳＡＴ−ＴＡＡ１
ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＴＧ
【０１０２】
次に、ｐＰＣＳＡＴを制限酵素ＰｃｉＩ、ＸｂａＩで二重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ファルマシア製）により精製した。得られたＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で二重消化したｐＳＥ４２０ＤにＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換株をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Ｆｌｅｘｉ−Ｐｒｅｐ（ファルマシア製）によりプラスミドを精製しｐＳＵＰＣＡＴ１を得た。プラスミド構築の過程を図３に示した。
【０１０３】
〔実施例１〕（ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール生産酵素のスクリーニグ）
前記調製例７で得た、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６に由来する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼを発現するプラスミドｐＳＵＰＣＡＴ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリンを含む液体ＬＢ培地５ｍＬで終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。なお、ｐＳＵＰＣＡＴ１が発現した（Ｓ）−アミントランスアミナーゼをＰｃＳＡＴとした。
【０１０４】
培養後、遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）、４０ｇ／Ｌ（１００ｍＭ）４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノン、４００ｍＭ（±）−フェニルエチルアミン、４００ｍＭ（±）−ｓｅｃ−ブチルアミンおよび０．０５ｍＭピリドキサール−５’−リン酸を含む反応液０．５ｍＬに懸濁させた。反応は、密閉容器内でゆっくり撹拌しながら、終夜３０℃で反応させた。
【０１０５】
反応終了後、反応液中のｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの生成量を分析した結果、ＰｃＳＡＴは６．８ｇ／Ｌのｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを生成しており、Ｅ／Ｚ比は１０であった。
【０１０６】
〔実施例２〕（アミノ基供与体の比較）
ＰｃＳＡＴを発現するプラスミドｐＳＵＰＣＡＴ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリンを含む液体ＬＢ培地５ｍＬで終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
【０１０７】
培養後、遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）、４０ｇ／Ｌ（１００ｍＭ）４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノン、２００ ｍＭあるいは４００ｍＭの各種アミノ基供与体（表１）、および０．０５ｍＭピリドキサール−５’−リン酸を含む反応液０．５ｍＬに懸濁させた。３０℃で反応させた。
【０１０８】
反応終了後、反応液中のｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの生成量を分析した結果を表２に示した。
【０１０９】
［表２］：実施例２の反応結果
【０１１０】
〔実施例３〕（ＰｃＳＡＴによるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの製造）
ＰｃＳＡＴを発現するプラスミドｐＳＵＰＣＡＴ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリンを含む液体ＬＢ培地９００ｍＬで３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
【０１１１】
培養後、遠心分離により集菌して菌体を得た。この菌体を、４０ｇ／Ｌ（３１２ｍＭ）４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノン、１．２５Ｍ（±）−ｓｅｃ−ブチルアミンを含む反応液６００ｍＬ（ｐＨ ７．５）に懸濁した。反応条件は、表３に示した。
反応終了後、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンと４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの定量を行なった結果、反応液中にはｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールが３５．０ ｇ／Ｌ生成し、Ｅ／Ｚ比は、１３．０であった。
【０１１２】
［表３］：実施例３の反応条件
【０１１３】
反応後、遠心分離により菌体を除去し、限外ろ過膜により除タンパク質を行った後、エバポレーターにより水を留去した。濃縮後、ＮａＯＨを加えてｐＨ１２にした後、ｎ−ブタノールで抽出し、ｎ−ブタノールを留去した。留去残渣にトルエンを加えて加熱溶解させた後、冷却して析出した結晶をろ過乾燥することで、ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールが１４．５ｇ得られた。なお、ｃｉｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールは検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明によれば、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンに、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼを作用させることでｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの合成を効率良く行なうことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】（Ｓ）−アミントランスアミナーゼに対する温度の影響を示した図である。縦軸は至適温度における活性を１００とする相対活性（％）を、横軸は反応温度（℃）を示す。
【図２】（Ｓ）−アミントランスアミナーゼに対するｐＨの影響を示した図である。縦軸は至適ｐＨにおける活性を１００とする相対活性（％）を、横軸は反応液のｐＨを示す。図中、グラフのプロットはそれぞれ次の緩衝液の結果を示す。−△−：リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）−▲−：リン酸１水素２カリウム−ＫＯＨ緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ）−□−：トリス−塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）−○−：酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ＡｃＯＨ−ＮａＯＡｃ）
【図３】図３は、ｐＳＵＰＣＡＴ１の構築を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール類を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールは、種々の医薬品等の中間体として有用である（特許文献１〜６等）。その製造方法に関しては、特許文献１には、４−ジベンジルアミノシクロヘキサノンにメチルマグネシウムブロミドを反応させることで、４−ジベンジルアミノ−１−メチルシクロヘキサノールをトランス：シス＝２：３の混合物として得て、トランス体を酸化アルミニウムカラムで分離し、続いて水素添加反応を施すことで製造したことが記載されている。
【化１】
【０００３】
しかしながら、これまでに生化学的手法を用いたｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの製造方法は報告されていない。
【０００４】
【特許文献１】特表平１０−５０５０７８号公報
【特許文献２】国際公開第９９／３８８６７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００１／０３０７４５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００３／０３５６３８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００４／０９４４０４号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００５／００９９６６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、トランス：シスの生成比を向上させて高収率で安価に工業的に製造しうるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール類の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、種々の酵素を用いてアミノ基転移反応を行った結果、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６株が生産する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼが高いＥ／Ｚ比でｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを極めて効率良く生成することを見出し、本発明を完成するに至った。生成したｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールのＥ／Ｚ比は６以上であった。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下を含む。
〔１〕アミノ基供与体の存在下、下記式（１）で表される４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンに、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素を含む酵素活性物質を作用させ、下記式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを製造する方法であって、
該酵素活性物質が、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを合成する、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する、方法；
【化２】
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｂ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｃ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ。
〔２〕前記酵素活性物質が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物に由来する酵素活性物質であることを特徴とする〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａであることを特徴とする〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記酵素活性物質が、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素をコードするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形質転換体、またはその処理物であって、
該酵素は、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを合成する、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する、〔１〕に記載の方法；
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｂ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｃ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ。
〔５〕アミノ基供与体が、フェニルエチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、Ｌ−アラニン、イソプロピルアミンおよび２−アミノペンタンからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕下記の工程を含む、下記一般式（４）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法；
（ｉ）請求項１〜５のいずれかに記載の方法により、下記式（１）で表される４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンから下記式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを製造する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールに、下記一般式（３）で表される化合物を反応させて、下記一般式（４）で表される化合物を得る工程；
【化３】
（式中、環Ａはベンゼン環又は単環性芳香族複素環を表し、該ベンゼン環及び該単環性芳香族複素環は、ハロゲン原子、ニトロ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいカルバモイル及びシアノより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよく；
Ｗは単結合、又は１もしくは２個のアルキルで置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキレンを表し；
ｎは０、１、２、３又は４を表し；
Ｒ１は水素原子、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいフェニル又は置換されていてもよい複素環式基を表し；
Ｒ２は水素原子又はアルキルを表し；
Ｘは脱離基を表し；
ＺはＣＨ又はＮを表す。）。
【０００８】
〔発明の実施の形態〕
本発明は、アミノ基供与体の存在下、式（１）で表される４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノン（「化合物（１）」ということがある。）に、（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素を含む酵素活性物質を作用させ、式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール（「化合物（２）」ということがある。）を製造する方法を提供するものである。該酵素活性物質は、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを合成する、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する。
【化４】
【０００９】
また、本発明は、下記の工程を含む、下記一般式（４）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法を提供するものである。
（ｉ）前記の方法により、式（１）で表される４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンから式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを製造する工程；および、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールに、下記一般式（３）で表される化合物（「化合物（３）」ということがある。）を反応させて、下記一般式（４）で表される化合物（「化合物（４）」ということがある。）を得る工程。
【化５】
【００１０】
式中、環Ａはベンゼン環又は単環性芳香族複素環を表し、該ベンゼン環及び該単環性芳香族複素環は、ハロゲン原子、ニトロ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいカルバモイル及びシアノより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよく；
Ｗは単結合、又は１もしくは２個のアルキルで置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキレンを表し；
ｎは０、１、２、３又は４を表し；
Ｒ１は水素原子、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいフェニル又は置換されていてもよい複素環式基を表し；
Ｒ２は水素原子又はアルキルを表し；
Ｘは脱離基を表し；
ＺはＣＨ又はＮを表す。
【００１１】
「アルキル」としては、例えば直鎖又は分岐鎖のＣ１〜Ｃ６アルキルが挙げられ、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。好ましいアルキルとしては、Ｃ１〜Ｃ４アルキルが挙げられる。
【００１２】
「アルコキシ」としては、例えば直鎖又は分岐鎖のＣ１〜Ｃ６アルコキシが挙げられ、具体的にはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ等が挙げられる。好ましいアルコキシとしては、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシが挙げられる。
【００１３】
「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙がられ、好ましくはフッ素原子、塩素原子が挙げられる。
【００１４】
「アルケニル」としては、例えば直鎖又は分岐鎖のＣ２〜Ｃ７アルケニルが挙げられ、具体的にはビニル、アリル、３−ブテニル、２−ペンテニル、３−ヘキセニル等が挙げられる。好ましいアルケニルとしては、Ｃ２〜Ｃ５アルケニルが挙げられる。
【００１５】
「アルキニル」としては、例えば直鎖又は分岐鎖のＣ２〜Ｃ７アルキニルが挙げられ、具体的にはエチニル、プロパルギル、３−ブチニル、２−ペンチニル、３−ヘキシニル等が挙げられる。好ましいアルキニルとしては、Ｃ２〜Ｃ５アルキニルが挙げられる。
【００１６】
「アルカノイル」としては、例えば直鎖又は分岐鎖のＣ２〜Ｃ７アルカノイルが挙げられ、具体的にはアセチル、プロピオニル、ブチニル、イソブチニル、ペンタノイル、ヘキサノイル等が挙げられる。好ましいアルカノイルとしては、Ｃ２〜Ｃ５アルカノイルが挙げられる
【００１７】
「シクロアルキル」としては、例えばＣ３〜Ｃ８シクロアルキルが挙げられ、好ましくはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルが挙げられる。
【００１８】
「複素環式基」としては、例えば、一部又は全部が飽和していてもよい、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる１〜３個の異項原子を含む、単環性、二環性又は三環性の複素環式基が挙げられる。好ましくは、５又は６員環の単環性の複素環式基が挙げられ、具体的には、フリル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、チエニル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、テトラゾリル、ピロリル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ピペリジニル、ピラゾリル、ピペラジニル、モルホリニル、イミダゾリル、トリアゾリル、イミダゾリニル、ピラゾリニル等が挙げられる。
【００１９】
「単環性芳香族複素環」としては、例えば、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる１〜３個の異項原子を含む単環性芳香族複素環が挙げられる。また、「単環性芳香族複素環」としては、例えば、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる１〜３個の異項原子を含む単環性芳香族複素環が挙げられ、例えば、５又は６員の単環性芳香族複素環が挙げられる。単環性芳香族複素環の具体例としては、チオフェン、フラン、フラザン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、オキサジアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン等が挙げられる。好ましい単環性芳香族複素環としては、チオフェン、フランが挙げられる。
【００２０】
環Ａ上の置換基が「置換されていてもよいアルキル」である場合、該アルキル上の置換基としては、例えば、ハロゲン原子、水酸基、アミノ等が挙げられる。該アルキルは、上記置換基を１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。置換アルキルの具体例としては、ヒドロキシメチル、トリフルオロメチル、アミノメチル、クロロエチル等が挙げられる。
【００２１】
環Ａ上の置換基が「置換されていてもよいアルコキシ」である場合、該アルコキシ上の置換基としては、例えば、水酸基、アミノ等が挙げられる。該アルコキシは、上記置換基を１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。
【００２２】
環Ａ上の置換基が「置換されていてもよいアミノ」である場合、該アミノ上の置換基としては、例えば、アルキル（該アルキルは、アルコキシ、アミノ及びカルボキシより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよい）、アルカノイル等が挙げられる。該アミノは、例えば上記置換基を、１又は２個有していてもよく、置換基数が２個の場合、各置換基は同一又は異なってもよい。
【００２３】
環Ａ上の置換基が「置換されていてもよいカルバモイル」である場合、該カルバモイル上の置換基としては、例えば、アルキル等が挙げられる。該カルバモイルは、上記置換基を１又は２個有していてもよく、置換基数が２個の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。
【００２４】
環Ａ上の置換基としては、好ましくは、ハロゲン原子、ニトロ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアミノ及びシアノが挙げられる。特に好ましくはハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ等が挙げられ、その具体例としては、フッ素原子、塩素原子、メチル、メトキシ等が挙げられる。
【００２５】
Ｒ１が「置換されていてもよいアルキル」である場合、該アルキル上の置換基としては、例えば、アルキニル、シアノ、アルコキシ、水酸基、アミノ（該アミノは、アルキル、アルカノイル及びアルキルスルホニルより成る群から選ばれる１又は２個の基で置換されてもよい）、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル（該カルバモイルは、１又は２個のアルキルで置換されてもよい）、フェニル、ナフチル等が挙げられる。該アルキルは、例えば上記置換基を、１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。好ましい置換基としては、シアノ、アルコキシ、水酸基、アミノ、カルボキシ、アルキル置換されていてもよいカルバモイル、フェニル等が挙げられる。
【００２６】
Ｒ１が「置換されていてもよいシクロアルキル」である場合、該シクロアルキル上の置換基としては、例えば、（１）水酸基、（２）アルコキシ（該アルコキシは、１〜３個のアルコキシで置換されてもよい）、（３）アミノ〔該アミノは、次の(i)〜(v)より成る群から選ばれる同一又は異なる１又は２個の基で置換されてもよい：(i)アルキル、(ii)アルカノイル、(iii)アルコキシカルボニル、(iv)カルバモイル（該カルバモイルは、１又は２個のアルキルで置換されてもよい）、及び(v)アルキルスルホニル〕、（４）カルボキシ、（５）アルキル〔該アルキルは、水酸基、アルコキシ及びアミノより成る群から選ばれる基で置換されてもよい〕、（６）アルキル置換されていてもよいカルバモイル等が挙げられる。該シクロアルキルは、例えば上記置換基を１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。
【００２７】
Ｒ１が「置換されていてもよいフェニル」である場合、該フェニル上の置換基としては、例えば、（１）ハロゲン原子、（２）ニトロ、（３）アルキル（該アルキルは、ハロゲン原子、水酸基、アミノ、カルボキシ及びフェニルスルホニルより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよい）、（４）アルケニル、（５）シアノ、（６）水酸基、（７）アルコキシ（該アルコキシは、ハロゲン原子、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、フェニル及びモルホリニルカルボニルより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよい）、（８）アミノ〔該アミノは、次の（ｉ）〜（ｉｖ）より成る群から選ばれる同一又は異なる１又は２個の基で置換されてもよい：（ｉ）アルキル、（ｉｉ）アルカノイル、（ｉｉｉ）カルバモイル（該カルバモイルは、アルキル及びシクロアルキルより成る群から選ばれる同一又は異なる１又は２個の基で置換されてもよい）、及び（ｉｖ）アルキルスルホニル〕、（９）アルカノイル、（１０）カルボキシ、（１１）アルコキシカルボニル、（１２）カルバモイル〔該カルバモイルは、次の（ｉ）及び（ｉｉ）より成る群から選ばれる同一又は異なる１又は２個の基で置換されてもよい：（ｉ）アルキル（該アルキルは、１〜３個の水酸基で置換されてもよい）、及び（ｉｉ）シクロアルキル〕、（１３）アルキルチオ、（１４）アルキルスルフィニル、（１５）アルキルスルホニル、（１６）フェニル、（１７）テトラゾリル、（１８）複素環式基置換カルボニル（該複素環式基は、アルキル及びアルコキシカルボニルより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよい）等が挙げられる。Ｒ１が置換されてもよいフェニルである場合、該フェニルは、例えば上記置換基を、１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。好ましい置換基としては、（１）ハロゲン原子、（２）アルキル（該アルキルは、ハロゲン原子、水酸基、アミノ、カルボキシ及びフェニルスルホニルより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよい）、（３）シアノ、（４）アルコキシ（該アルコキシは、ハロゲン原子、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、フェニル及びモルホリニルカルボニルより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよい）等が挙げられる。置換基の置換位置としては、置換しうる位置であればいずれでもよく、特に好ましい位置としては２位が挙げられる。
【００２８】
Ｒ１が「複素環式基置換カルボニルで置換されたフェニル」である場合、該複素環式基としては前記の複素環式基が挙げられ、好ましくは、５又は６員環の単環性含窒素脂肪族複素環式基が挙げられる。具体例としては、ピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル等が挙げられる。
【００２９】
Ｒ１が「置換されていてもよい複素環式基」である場合、該複素環式基としては前記の複素環式基が挙げられ、好ましくは、５又は６員環の単環性の複素環式基が挙げられる。具体例としては、フリル、テトラヒドロフリル、チエニル、チアゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、ピラゾリル、テトラゾリル、テトラヒドロピラニル等が挙げられ、特に好ましくは、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル等が挙げられる。また、該複素環式基上の置換基としては、例えば、ハロゲン原子、ニトロ、アルキル（該アルキルは、水酸基、アルコキシ、アルキル置換されていてもよいカルバモイル及びカルボキシより成る群から選ばれる基で置換されていてもよい）、シアノ、水酸基、アミノ、アルカノイル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル（該カルバモイルは、１又は２個のアルキルで置換されていてもよい）、アルキルスルホニル、フェニル等が挙げられる。該複素環式基は、例えば上記置換基を１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一又は異なっていてもよい。
【００３０】
「脱離基」としては、ハロゲン原子、置換されていてもよいアリールスルフィニル、置換されていてもよいアルキルスルフィニル、置換されていてもよいアリールスルホニル、置換されていてもよいアルキルスルホニル、置換されていてもよいアリールスルホニルオキシ、置換されていてもよいアルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいチオアルコキシ等が挙げられる（"Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ"， ５ｔｈ ｅｄ．，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ，ｐ．８６４−８６５，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００１年）。好ましい脱離基としては、ハロゲン原子、置換されていてもよいアリールスルフィニル、置換されていてもよいアルキルスルフィニル、置換されていてもよいアリールスルホニル、又は置換されていてもよいアルキルスルホニル等が挙げられる。「置換されていてもよいアリールスルフィニル」、「置換されていてもよいアリールスルホニル」及び「置換されていてもよいアリールスルホニルオキシ」における置換基としては、例えばハロゲン原子、アルキル、アルコキシ等が挙げられる。「置換されていてもよいアルキルスルフィニル」、「置換されていてもよいアルキルスルホニル」、「置換されていてもよいアルキルスルホニルオキシ」、「置換されていてもよいアルコキシ」及び「置換されていてもよいチオアルコキシ」における置換基としては、例えばハロゲン原子等が挙げられる。特に好ましい脱離基としては、塩素原子、メチルスルフィニル、メチルスルホニル等が挙げられる。
【００３１】
「薬学的に許容される塩」は、化合物（４）と、医薬品の製造に使用可能である酸または塩基とを接触させることにより製造される。当該塩には、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トシル酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩、または、カルボキシ等の置換基を有する場合には塩基との塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩またはカルシウム塩の如きアルカリ土類金属塩）が含まれる。
当該薬学的に許容される塩には、化合物（４）またはその薬学的に許容される塩の、水和物もしくは溶媒和物を含む。
【００３２】
本発明に係る製造方法により化合物がフリー体として得られる場合、当該化合物が形成していてもよい塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物の状態に、常法に従って変換することができる。
【００３３】
化合物（４）におけるｎとＲ１の好ましい組合せとしては、例えば、（１）ｎが０であって、Ｒ１が置換されていてもよいアルキルであるもの、（２）ｎが１であって、Ｒ１が置換されていてもよいシクロアルキルであるもの、（３）ｎが１であって、Ｒ１が置換されていてもよいフェニルであるもの、（４）ｎが１であって、Ｒ１が置換されていてもよい複素環式基であるもの、（５）ｎが０であって、Ｒ１が置換されていてもよいシクロアルキルであるもの、及び（６）ｎが０であって、Ｒ１が置換されていてもよい複素環式基であるもの等が挙げられる。特に好ましくは、（１）ｎが０であって、Ｒ１が置換されていてもよいアルキルであるもの、（２）ｎが１であって、Ｒ１が置換されていてもよいフェニルであるもの、（３）ｎが０であって、Ｒ１が置換されていてもよいシクロアルキルであるもの、及び（４）ｎが０であって、Ｒ１が置換されていてもよい複素環式基であるもの等が挙げられる。さらに好ましくは、（１）ｎが０であって、Ｒ１が水酸基で置換されてもよいＣ１〜Ｃ４アルキルであるもの、（２）ｎが１であって、Ｒ１がフェニル（該フェニルは、シアノ、フッ素原子、塩素原子及びメチルより成る群から選ばれる基で置換されていてもよい）であるもの、（３）ｎが０であり、Ｒ８がＣ３〜Ｃ４シクロアルキルであるもの、及び（４）ｎが０であり、Ｒ８がテトラヒドロピラニルであるもの等が挙げられる。
【００３４】
酵素活性物質
本発明における酵素活性物質は、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素を含み、かつ、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを生成しうるものであれば、任意の酵素活性物質を用いることができる。
【００３５】
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｂ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｃ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ。
【００３６】
このような本発明で用いることのできる酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した分子量が約５１０００、ゲルろ過によって測定した分子量が約１５００００である。
また、至適ｐＨは６．５−９である。リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた活性測定によれば、至適温度は５５℃〜６５℃であり、この温度範囲で８０％以上の酵素活性を示す。最適温度は６０℃である。このように比較的高温領域において反応を実施できるので、工業的にも効率的であるという利点がある。
【００３７】
なお、本発明においてｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールとは、少なくともＥ／Ｚ比が１以上、好ましくは２以上、より好ましくは５以上のｔｒａｎｓ異性体過剰を指す。Ｅ／Ｚ比は高ければ、高いほうが好ましく、上限値に特に制限はなく、好ましくはＥ対のみである。
【００３８】
本発明において、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼは、１級アミン若しくは２級アミンをアミノドナーとして、アルデヒド若しくはケトンにアミノ基を転移し、対応する１級若しくは２級アミンを生成する反応を触媒する酵素である。
【００３９】
（Ｓ）−アミントランスアミナーゼによるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール生成活性は、以下のような方法で測定できる。すなわち、１００ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、４０ｇ／Ｌ ４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノン、１．２５Ｍ（±）−ｓｅｃ−ブチルアミン、および酵素活性物質を含む反応液中で、３０℃で反応させ、生成するｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを分析することにより、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を測定することができる。
【００４０】
本発明における好ましい酵素活性物質は、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンを基質として、Ｅ／Ｚ比が少なくとも１以上のｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを生成することができる酵素活性物質であって、前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの酵素を含めばよく、本発明に用いる酵素の由来に特に制限はない。
【００４１】
このうち、本発明における好ましい酵素活性物質は、たとえばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物から得ることができる。より具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ由来の、さらに具体的にはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６株由来の（Ｓ）−アミントランスアミナーゼが挙げられる。
【００４２】
その他、種々の生物に由来する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼも、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンを基質として、Ｅ／Ｚ比が少なくとも１以上のｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを生成するする活性を有する、前記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの酵素である限り利用することができる。
【００４３】
本発明において、酵素活性物質とは、前記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素を含み、該酵素の精製酵素のみならず、該酵素を含む微生物菌体、植物、その培養細胞、形質転換体、またはその処理物が含まれる。
【００４４】
前記処理物とは、生物細胞に対して、物理処理、生化学的処理、あるいは化学的処理等を行った産物を指す。生物細胞は、当該酵素の遺伝子を発現可能に保持する形質転換体も含まれる。
また処理物を得るための物理処理には、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、あるいは磨砕処理等が含まれる。
また生化学的処理とは、具体的にはリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理を示すことができる。
更に、化学的処理としては、界面活性剤、トルエン、キシレン、またはアセトンなどの有機溶媒との接触処理などが挙げられる。
このような処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどは処理物に含まれる。
【００４５】
酵素活性物質として利用できる精製酵素は、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６株から公知の方法によって単離することができる。あるいは酵素活性物質として形質転換体を利用することもできる。
まず（Ｓ）−アミントランスアミナーゼをコードする遺伝子を取得し、遺伝子組換え技術を用いて同種もしくは異種の宿主中で発現可能に保持させた形質転換体を得ることができる。この形質転換体は、そのままで、あるいは処理物として酵素活性物質とすることができる。更にこの形質転換体を培養して、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼを取得することもできる。本発明に用いることができる（Ｓ）−アミントランスアミナーゼをコードする遺伝子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏａｎｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６株からクローニングされた。
【００４６】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏａｎｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６株は本願出願人によって、下記のとおり寄託されている。
（ａ） 寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
あて名：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８）
（ｂ） 寄託日：２００５年９月２１日
（ｃ） 受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１３９
【００４７】
これらの塩基配列情報に基づいて、目的とする遺伝子を当該生物から取得することができる。遺伝子の取得には、ＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングが用いられる。また、ＤＮＡ合成によって遺伝子の全長を化学的に合成することもできる。
【００４８】
更に上記塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来する(S)-アミントランスアミナーゼ遺伝子を取得することもできる。たとえば、上記塩基配列もしくはその一部の配列をプローブとして他の生物から調製したＤＮＡや環境中のＤＮＡ（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ＤＮＡ）に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行なうことにより、種々の生物由来の（Ｓ）−アミントランスアミナーゼを単離することができる。
【００４９】
ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載された塩基配列から選択された塩基配列を有するＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｉｃａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いたマニュアルに記載の条件（ｗａｓｈ：４２℃、０．５ｘＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）や０．２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間洗浄する条件において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。プローブＤＮＡを構成する塩基配列は、前記塩基配列から任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択することができる。
【００５０】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３−６．４）、「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １： Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）、特にＳｅｃｔｉｏｎ２．１０）等を参照することができる。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドのホモログには、上述のように、配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【００５２】
また、上記塩基配列情報に基づいて、ホモロジーの高い領域からＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。このようなプライマーを用い、染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なえば、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼをコードする遺伝子を種々の生物から単離することもできる。
【００５３】
本発明の方法においては、天然型の酵素のみならず、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからＥ／Ｚ比が少なくとも１以上のｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを生成する活性を有する限り、天然型酵素のアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸配列からなる酵素を用いることも可能である。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７ （１９８２）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８ （１９８３）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄＥｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）， ＰＣＲ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２００（１９９１））などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、蛋白質の構造を改変することができる。また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもあり、人工的にアミノ酸を変異した酵素のみならず、自然界においてアミノ酸が変異した酵素も本発明の方法において用いることができる。
【００５４】
さらに、本発明で用いることのできるポリヌクレオチドのホモログとしては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。このような欠失を含むポリヌクレオチドには、配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質の「一部分」をコードするポリヌクレオチドが包含される。
【００５５】
タンパク質においてアミノ酸残基を置換する場合、特に、側鎖の化学的性質が類似したアミノ酸による置換、いわゆる保存的なアミノ酸置換を行うことが好ましい。アミノ酸は、それらの側鎖の化学的性質に従い、例えば、次のように分類される：
(1)中性疎水性側鎖(アラニン、トリプトファン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、ロイシン)；
(2)中性極性側鎖(アスパラギン、グリシン、グルタミン、システイン、セリン、チロシン、トレオニン)；
(3)塩基性側鎖（アルギニン、ヒスチジン、リシン）；
(4)酸性側鎖(アスパラギン酸、グルタミン酸)；
(5)脂肪族側鎖(アラニン、イソロイシン、グリシン、バリン、ロイシン)；
(6)脂肪族水酸基側鎖（セリン、トレオニン）；
(7)アミン含有側鎖(アスパラギン、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、リシン)；
(8)芳香族側鎖(チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン)；および
(9)硫黄含有側鎖(システイン、メチオニン)。
【００５６】
すなわち、これらの各群を構成するアミノ酸残基の相互の置換を、保存的置換と言う。本発明において、「１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加」するアミノ酸の数や場所は、タンパク質が前記（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する限り、制限されない。変異が許容されるアミノ酸残基の数は、典型的には全アミノ酸の１０％以内、好ましくは全アミノ酸の５％、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。より具体的には、配列番号：２のアミノ酸配列において、通常５０以内、たとえば２０以内、より好ましくは５以内のアミノ酸残基の変異は、許容される。
【００５７】
タンパク質が、前記の元のタンパク質の生物学的活性を維持している限り、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失・置換・付加及び/または挿入は許容される。ここで、生物学的活性の維持とは、元の酵素が触媒する少なくとも一つの反応を触媒する能力が維持されることを言う。「活性の維持」には、同じ活性レベルのみならず、より高い活性も含まれる。また、活性のレベルが低下する場合であっても、実質的に同等の活性であれば、活性の維持に含まれる。実質的に同等とは、元の活性に対して、たとえば５０％〜１００％、通常７０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９０、あるいは９５〜１００％の活性をいう。本発明におけるタンパク質の生物学的活性、すなわち前記（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性の評価方法は既に述べた。
【００５８】
また、本発明の方法においては、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼのアミノ酸配列にホモロジーを有する蛋白質をコードする遺伝子も、その産物である酵素がアミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを生成する活性を有する限り、本発明に利用することができる。ホモロジー検索には、たとえば以下に示すデータベースを用いることができる。
【００５９】
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベース
ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベース
ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベース
【００６０】
ＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍやＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍなどのホモロジー検索用のプログラムも公知である。更に、上記データベースをこれらのプログラムを用いて検索するサービスも、インターネット上で提供されている。この種のサービスを利用して、本発明に用いる蛋白質を見出すこともできる。
【００６１】
本発明に用いる（Ｓ）−アミントランスアミナーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏａｎｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６由来の（Ｓ）−アミントランスアミナーゼのアミノ酸配列と、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、さらに特に好ましくは９９％以上のホモロジーを有する蛋白質が好ましい。ここでいうホモロジーとは、たとえば、ＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍを用いたＩｄｅｎｔｉｔｙの相同性の値を示す。
【００６２】
本発明における好ましい酵素活性物質として、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼをコードする遺伝子を遺伝子組換え技術により同種もしくは異種の宿主中で発現させた形質転換体、もしくはその処理物を示すことができる。
【００６３】
本発明において（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ遺伝子を発現させるために、形質転換の対象となる生物は、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターにより形質転換され、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。
【００６４】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行なうことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラー・クローニング、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。微生物中などにおいて、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．４３，７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ ８，４２３−４８８（１９９２）、などに詳細に記述されている。
【００６５】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。形質転換体の培養、および形質転換体からの（Ｓ）−アミントランスアミナーゼの精製は、当業者に公知の方法により行なうことができる。
【００６６】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００６７】
単一のベクターに（Ｓ）−アミントランスアミナーゼを導入したプラスミドは、例えばｐＳＥ４２０Ｄ（特開２０００−１８９１７０）に各遺伝子をタンデムに連結して取得することができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏａｎｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６由来の（Ｓ）−アミントランスアミナーゼが導入されたプラスミドｐＳＵＰＣＡＴ１は、実施例中に示した。
【００６８】
ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの製造方法
本発明のｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの製造方法を構成する酵素反応は、前記酵素活性物質を、アミノ基供与体、および基質である４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンを含む反応溶液と接触させることにより、実施することができる。さらに得られたｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを回収することができる。
【００６９】
具体的には、水性媒体中、水性媒体と水可溶性の有機溶媒との混合系、あるいは水不溶性の溶媒との二相系中において行なうことができる。
水性媒体としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などの中性付近に緩衝能を有する緩衝液が挙げられる。あるいは酸とアルカリを用いて反応中のpH変化を好ましい範囲にとどめることが可能であれば、緩衝液を特に使う必要はない。
水不溶性の有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、キシレン、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、イソオクタン、メチルイソブチルケトン、メチル−ｔ−ブチルエーテル、ｎ−ブタノールなどを用いることができる。
水可溶性の溶媒としては、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の有機溶媒が挙げられる。
【００７０】
二相系では、酵素活性物質は、そのまま、あるいは水や緩衝液の溶液として供給される。基質化合物を水、緩衝液またはエタノール等の水溶性溶媒に溶解させて反応系に供給することもできる。この場合は、酵素活性物質とともに単一相の反応系を構成することになる。その他、本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行なうことも可能である。なお、酵素活性物質と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されない。反応溶液とは、基質を酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。
【００７１】
本発明の（Ｓ）−アミントランスアミナーゼによる酵素反応は、以下の条件で行なうことができる。
・基質濃度：好ましくは０．０１−３０％、さらに好ましくは０．１−２０％、より好ましくは１．０−１０％（％は、溶媒に対する質量割合を示す。）
・反応温度：好ましくは４−６０℃、さらに好ましくは１０−５０℃、より好ましくは２５−４０℃
・ｐＨ：好ましくは４−１０、さらに好ましくは５．５−９．５、より好ましくは６．５−８．５
【００７２】
基質である、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンは、既知の方法（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９（５−６），７４５−５４； １９８９）に従って容易に合成することが可能である。また、基質は反応開始時に一括して添加するか、あるいは連続的もしくは非連続的に添加することができる。
【００７３】
反応系には必要に応じてピリドキサール−５'−リン酸０．００１ｍＭ−１０ｍＭ、好ましくは０．００２−１ｍＭ、より好ましくは０．０１−０．１ｍＭ添加することができる。
【００７４】
アミノ基供与体となる化合物は、例えば、フェニルエチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、Ｌ−アラニン、イソプロピルアミン、２−アミノペンタンが挙げられる。
【００７５】
より具体的には、（±）−フェニルエチルアミン、（Ｓ）−フェニルエチルアミン、（Ｒ）−フェニルエチルアミン、（±）−ｓｅｃ−ブチルアミン、（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチルアミン、Ｌ−アラニン、イソプロピルアミンおよび２−アミノペンタンなどが挙げられる。このうち特に好ましいのは、（±）−フェニルエチルアミン、（Ｓ）−フェニルエチルアミン、（±）−ｓｅｃ−ブチルアミン、Ｌ−アラニン、イソプロピルアミンおよび２−アミノペンタンなどが挙げられる。
【００７６】
アミノ基供与体の添加量は、基質であるケトンに対して、モル比で例えば、好ましくは０．１−２０倍、さらに好ましくは０．５−１０倍、より好ましくは１−４倍の量を添加することができる。
【００７７】
本発明により反応液中で生成したｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの精製は、遠心分離や膜ろ過による菌体や蛋白質の除去、膜処理等による蛋白質の分離、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、メチル−ｔ−ブチルエーテル、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔ−ブタノール、イソブタノール、ｎ−ペンタノール、ｓｅｃ−ペンタノール、ｔ−ペンタノール、イソペンタノールなどによる溶媒抽出、蒸留、酢酸エチル、酢酸ブチル、キシレン、トルエン、メシチレン、クロルベンゼン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、イソオクタン、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテルなどによる結晶化、等を適当に組み合わせることにより行なうことができる。あるいは、抽出溶媒液に塩酸を滴下することで生成する塩酸塩として回収することもできる。目的物は、必要によりシリカゲルカラムクロマトグラフィー、蒸留によりさらに精製することができる。
【００７８】
例えば、ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを含む反応液を遠心分離することにより菌体を除去し、限外ろ過などにより蛋白質を除去した後に、水酸化ナトリウムを加えてｐＨを１２以上にした後、ｎ−ブタノールを用いてｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを抽出する。さらに、ｎ−ブタノールを減圧下で留去した後、キシレン、トルエン、メシチレン等を用いて晶析することによりｔｒａｎｓ体を選択的に回収することができる。
【００７９】
化合物（４）またはその薬学的に許容される塩の製造方法
【化６】
【００８０】
式中、各記号は前記と同義である。化合物（２）は、前記方法により製造することができる。
【００８１】
化合物（３）は公知化合物であり、国際公開第２００３／０３５６３８号パンフレット又は国際公開第２００４／０９４４０４号パンフレットに従って製造される。
【００８２】
化合物（３）と化合物（２）とを反応させることによる化合物（４）の製造方法は、国際公開第２００３／０３５６３８号パンフレット及び国際公開第２００４／０９４４０４号パンフレットに記載されている。具体的には、化合物（３）と化合物（２）の反応は、溶媒中、塩基の存在下で実施することができる。溶媒としては、反応に悪影響を及ぼさない溶媒であればよく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）、ジオキサン、ＴＨＦ、アセトニトリル、２−ブタノン、エチレングリコール、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−ブタノール、１−プロパノール、２−プロパノール等が挙げられ、好ましくはＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡ、ＮＭＰ、ジオキサン、１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール等が挙げられる。塩基としては、生成する酸を中和できる塩基であればよく、例えば、３級アミン（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、１−エチルピペリジン、４−メチルモルホリン、トリフェニルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、２−ピコリン、２，６−ルチジン等）、立体障害の高い２級アミン（ジイソプロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン、ジ−ｔ−ブチルアミン等）、立体障害の高い１級アミン（ｔ−ブチルアミン等）、炭酸アルカリ（炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等）、炭酸水素アルカリ（炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等）、カリウム ｔ−ブトキシド等が挙げられ、好ましくは１−エチルピペリジン、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン、ジ−ｔ−ブチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ｔ−ブチルアミン等が挙げられる。本反応は、通常、０〜１５０℃で進行し、とりわけ８０〜１２０℃で好適に進行する。
【００８３】
ＺがＣＨである化合物（３）と化合物（２）との反応は、溶媒中、触媒、塩基、及び添加剤の存在下で実施することもできる（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６１，７２４０（１９９６）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，Ｖｏｌ．４４，１３７１（２００５））。溶媒としては、反応に悪影響を及ぼさない溶媒であればよく、例えば、トルエン、キシレン、ジメトキシエタン、ジオキサン等が挙げられる。触媒としては、例えば、酢酸パラジウム、ビス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム等が挙げられる。塩基としては、例えば、ナトリウム ｔ−ブトキシド、カリウム ｔ−ブトキシド、リチウム ｔ−ブトキシド、トリエチルアミン等が挙げられる。添加剤としては、２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル等が挙げられる。本反応は、３０〜１５０℃、とりわけ６０〜８０℃で好適に進行する。また、触媒として、ニッケル触媒、銅触媒等を使用することもできる（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６７，３０２９（２００２）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１９，６０５４（１９９７）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６７，３０２９（２００２）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，Ｖｏｌ．６２，４４３５（２００６））。
【００８４】
上記工程において、アミノ等の官能基を有する場合には、必要に応じて、有機合成化学の分野における慣用の方法により、官能基を保護して反応を行うことができ、反応後、保護基を脱保護して目的物を得ることができる。ここで、官能基の保護基としては、有機合成化学の分野で通常使用される保護基が挙げられる。具体的には、Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ， Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"３ｒｄ．ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９に記載の保護基が挙げられる。
【実施例】
【００８５】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００８６】
本発明における、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノン、ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム：Ｊ&Ｗ製ＨＰ−５（φ３ｍｍ×２．１ｍ）、カラム温度：５０℃→８℃／分→１５０℃→１５℃／分→２１０℃→３．５分保持、インジェクション温度：３００℃、ディテクター温度：２７５℃、キャリアガス：ヘリウム、検出：ＦＩＤ）により行なった。
【００８７】
４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールのＥ／Ｚ比の測定は、アミノ基解析用の２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−ｂｅｔａ−Ｄ−グルコピラノシルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）で４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール誘導化した後、液体クロマトグラフィー（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製Ｌｕｎａ ５ｕ Ｃ１８、溶離液：２．５％ 酢酸水溶液を２５％アンモニア水でｐＨ４．０に合わせた液／メタノール＝５７／４３、カラム温度：４０℃、流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２２５ｎｍ）により行なった。
【００８８】
〔調製例１〕 シュードモナス・コルガータ １０Ｆ６株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６）の培養菌体の調製
シュードモナス・コルガータ １０Ｆ６株を下記の組成の培地（ｐＨ７．０）で２５℃、４０時間振盪培養し、遠心分離により菌体を得た。
３ｇ／Ｌグルコース、
１ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、
３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、
０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、
２ｇ／Ｌ 酵母エキス、
１０ｍＬ／Ｌ ミネラル溶液（１．５ｇ／Ｌ ニトリロ三酢酸、１．０６ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ２・５Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ ＫＩ、０．０２ｇ／Ｌ Ｎａ２Ｍｏ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、１ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（ＫＯＨ））、
１ｇ／Ｌ １−アミノペンタン
【００８９】
〔調製例２〕（Ｓ）−アミントランスアミナーゼの精製
調製例１により調製した菌体４０ｇを、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５ｍＭ ピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）を含む菌体破砕液に懸濁し、ガラスビーズにより菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清画分を無細胞抽出液とした。
無細胞抽出液を硫酸プロタミン処理によって核酸を除いた後、７０％飽和まで硫安を添加し、遠心分離により上清画分を除去し、得られた沈殿画分を回収した。この沈殿画分を３０％飽和硫安濃度となるように緩衝液１に懸濁した。緩衝液１の組成は次のとおりである。
緩衝液１：１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、
１ｍＭ ＤＴＴ、
０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、および
０．０５ｍＭ ＰＬＰ
次いで、３０％飽和硫安を含む緩衝液１で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（５．０×２３．５ｃｍ、アマシャム製）に酵素を吸着させた。同緩衝液で洗浄後、緩衝液１を用いて５ｍＬ／ｍｉｎで３０％飽和から０％硫安までグラジエント溶出し、活性画分を回収して濃縮後、緩衝液１で透析した。
【００９０】
次に、緩衝液１で平衡化したＭｏｎｏＳ ５／５０（アマシャム製）に酵素を吸着させた。同緩衝液で洗浄後、緩衝液１を用いて０．１ｍＬ／ｍｉｎで０Ｍから０．５Ｍ塩化ナトリウムまでグラジエント溶出し、活性画分を回収して濃縮後、緩衝液１で透析した。次に、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液１で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０（アマシャム製）に酵素液を供し、同緩衝液を用いて０．０５ｍＬ／ｍｉｎで溶出して得た活性画分を回収して濃縮後、ｐＨ７．０の緩衝液１で透析した。
【００９１】
次に、ｐＨ７．０の緩衝液１で平衡化したＭｏｎｏＱ ５／５０（アマシャム製）に酵素を吸着させた。同緩衝液で洗浄後、ｐＨ７．０の緩衝液１を用いて０．５ｍＬ／ｍｉｎで０Ｍから０．５Ｍ塩化ナトリウムまでグラジエント溶出し、活性画分を回収して濃縮後、緩衝液１で透析した。次に、２ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５ｍＭ ＰＬＰで平衡化したＨＣＡ−Ｃｏｌｕｍｎ Ａ−５０１０Ｇ（０．５ｃｍ×１０ｃｍ、製）に酵素を吸着させた。同緩衝液で洗浄後、３５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５ｍＭ ＰＬＰを用いて０．５ｍＬ／ｍｉｎで２ｍＭから３５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液までグラジエント溶出し、活性画分を回収して濃縮して精製酵素を得た。
精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果、単一バンドを示した。
精製の要約を表１に示した。各ステップにおいて得られた酵素液の（Ｓ）−フェニルエチルアミン：１−ベンジル−３−ピロリジノン アミントランスアミナーゼ活性は実施例３に記載の方法により行った。
（Ｓ）−アミントランスアミナーゼの精製
【００９２】
【表１】
【００９３】
〔調製例３〕（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性の測定
調製例２で得た酵素液を用いて本酵素の（Ｓ）−フェニルエチルアミン：１−ベンジル−３−ピロリジノン アミントランスアミナーゼ活性を測定した。１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ（Ｓ）−フェニルエチルアミン、１０ｍＭ １−ベンジル−３−ピロリジノン、０．０５ｍＭ ＰＬＰ、５ｍＭ ＤＴＴ及び酵素液を含む０．５ｍＬの反応液中３０℃で反応させた後、０．１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌで反応を停止した。得られた反応終了液に含まれる１−ベンジル−３−アミノピロリジンを以下に示す分析条件においてＨＰＬＣで定量した。この条件の下、１分間に１μｍｏｌの１−ベンジル−３−アミノピロリジンの生成を触媒する酵素量を１Ｕとした。
また、タンパク質は、Ｂｏｖｉｎｅ Ｐｌａｓｍａ Ａｌｂｕｍｉｎを標準タンパク質として、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により定量した。
カラム：Ｌｕｎａ ５ｕ Ｃ１８（２）（２．０ｍｍ×１５０ｍｍ）（フェノメネックス（ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）社）
溶離液：５０ｍＭ ＫＰＢ （ｐＨ ２．５）、５ｍＭ １−ｈｅｘａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ／ＣＨ３ＣＮ＝９１／９
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ
【００９４】
〔調製例４〕 （Ｓ）−アミントランスアミナーゼの分子量
精製酵素を、ＳＭＡＲＴ ＳｙｓｔｅｍにおいてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ３．２／３０（アマシャム製）を用い、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５ｍＭ ＰＬＰ、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む溶離液でゲル濾過を行った結果、分子量は約１５０，０００であった。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサブユニットの分子量を測定した結果、約５１，０００であった。
【００９５】
〔調製例５〕 （Ｓ）−アミントランスアミナーゼに対する温度の影響
調製例２で得た（Ｓ）−アミントランスアミナーゼをリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて２０℃から９０℃で実施例３に記載の方法により活性測定を行い図１に示した。本酵素の最適温度は、６０℃であり、５５℃から６５℃の範囲で８０％以上の活性を示した。
【００９６】
〔調製例６〕 （Ｓ）−アミントランスアミナーゼに対するｐＨの影響
調製例２で得た（Ｓ）−アミントランスアミナーゼを、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、リン酸１水素２カリウム−ＫＯＨ緩衝液を用いて調製例３に記載の方法によって酵素活性を測定した。結果を図２に示した。本酵素はｐＨ６．５からｐＨ９．０の範囲で８０％以上の活性を示した。
【００９７】
〔調製例７〕（（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ遺伝子を含む発現プラスミドｐＳＵＰＣＡＴ１の構築）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６に由来するタンパク質（配列番号：２）をコードする遺伝子（配列番号：１）の塩基配列をもとにセンスプライマーとしてＰＣＳＡＴ−ＡＴＧ１（配列番号：３）、アンチセンスプライマーとしてＰＣＳＡＴ−ＴＡＡ１（配列番号：４）を合成した。
【００９８】
ＰＣＲ反応は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６株から、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８，４３２１（１９８０）の方法に従ってゲノムＤＮＡを精製して得られたＰＣＲ産物１００ｎｇを鋳型として、２．５Ｕ ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＴｕｒｂｏ用緩衝液、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌのプライマーＰＣＳＡＴ−ＡＴＧ１、ＰＣＳＡＴ−ＴＡＡ１のセットを含む５０μＬの反応液で９４℃／３０秒、６４℃／３０秒、７２℃／１分３０秒、３０サイクルを行った。
【００９９】
アガロースゲル電気泳動により解析した結果、約１．４ｋｂあたりに特異的と思われるＰＣＲ産物が検出できた。得られたＤＮＡ断片をフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ファルマシア製）により精製した。得られたＤＮＡ断片を、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）にライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Ｆｌｅｘｉ−Ｐｒｅｐ（ファルマシア製）によりプラスミドを精製し、ｐＰＣＳＡＴとした。
【０１００】
精製したプラスミドを用いて、挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列の解析には、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（パーキンエルマー製）を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ３１０（パーキンエルマー製）により行った。
【０１０１】
配列番号：３ ＰＣＳＡＴ−ＡＴＧ１
ＣＡＡＡＣＡＴＧＴＡＣＧＡＧＣＡＡＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡ
配列番号：４ ＰＣＳＡＴ−ＴＡＡ１
ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＴＧ
【０１０２】
次に、ｐＰＣＳＡＴを制限酵素ＰｃｉＩ、ＸｂａＩで二重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｓｅｐｈａｇｌａｓ ＢａｎｄＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ファルマシア製）により精製した。得られたＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で二重消化したｐＳＥ４２０ＤにＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換株をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーをアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で培養し、Ｆｌｅｘｉ−Ｐｒｅｐ（ファルマシア製）によりプラスミドを精製しｐＳＵＰＣＡＴ１を得た。プラスミド構築の過程を図３に示した。
【０１０３】
〔実施例１〕（ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノール生産酵素のスクリーニグ）
前記調製例７で得た、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ １０Ｆ６に由来する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼを発現するプラスミドｐＳＵＰＣＡＴ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリンを含む液体ＬＢ培地５ｍＬで終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。なお、ｐＳＵＰＣＡＴ１が発現した（Ｓ）−アミントランスアミナーゼをＰｃＳＡＴとした。
【０１０４】
培養後、遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）、４０ｇ／Ｌ（１００ｍＭ）４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノン、４００ｍＭ（±）−フェニルエチルアミン、４００ｍＭ（±）−ｓｅｃ−ブチルアミンおよび０．０５ｍＭピリドキサール−５’−リン酸を含む反応液０．５ｍＬに懸濁させた。反応は、密閉容器内でゆっくり撹拌しながら、終夜３０℃で反応させた。
【０１０５】
反応終了後、反応液中のｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの生成量を分析した結果、ＰｃＳＡＴは６．８ｇ／Ｌのｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを生成しており、Ｅ／Ｚ比は１０であった。
【０１０６】
〔実施例２〕（アミノ基供与体の比較）
ＰｃＳＡＴを発現するプラスミドｐＳＵＰＣＡＴ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリンを含む液体ＬＢ培地５ｍＬで終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
【０１０７】
培養後、遠心分離により集菌し、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）、４０ｇ／Ｌ（１００ｍＭ）４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノン、２００ ｍＭあるいは４００ｍＭの各種アミノ基供与体（表１）、および０．０５ｍＭピリドキサール−５’−リン酸を含む反応液０．５ｍＬに懸濁させた。３０℃で反応させた。
【０１０８】
反応終了後、反応液中のｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの生成量を分析した結果を表２に示した。
【０１０９】
［表２］：実施例２の反応結果
【０１１０】
〔実施例３〕（ＰｃＳＡＴによるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの製造）
ＰｃＳＡＴを発現するプラスミドｐＳＵＰＣＡＴ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリンを含む液体ＬＢ培地９００ｍＬで３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
【０１１１】
培養後、遠心分離により集菌して菌体を得た。この菌体を、４０ｇ／Ｌ（３１２ｍＭ）４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノン、１．２５Ｍ（±）−ｓｅｃ−ブチルアミンを含む反応液６００ｍＬ（ｐＨ ７．５）に懸濁した。反応条件は、表３に示した。
反応終了後、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンと４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの定量を行なった結果、反応液中にはｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールが３５．０ ｇ／Ｌ生成し、Ｅ／Ｚ比は、１３．０であった。
【０１１２】
［表３］：実施例３の反応条件
【０１１３】
反応後、遠心分離により菌体を除去し、限外ろ過膜により除タンパク質を行った後、エバポレーターにより水を留去した。濃縮後、ＮａＯＨを加えてｐＨ１２にした後、ｎ−ブタノールで抽出し、ｎ−ブタノールを留去した。留去残渣にトルエンを加えて加熱溶解させた後、冷却して析出した結晶をろ過乾燥することで、ｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールが１４．５ｇ得られた。なお、ｃｉｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールは検出されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明によれば、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンに、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼを作用させることでｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールの合成を効率良く行なうことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】（Ｓ）−アミントランスアミナーゼに対する温度の影響を示した図である。縦軸は至適温度における活性を１００とする相対活性（％）を、横軸は反応温度（℃）を示す。
【図２】（Ｓ）−アミントランスアミナーゼに対するｐＨの影響を示した図である。縦軸は至適ｐＨにおける活性を１００とする相対活性（％）を、横軸は反応液のｐＨを示す。図中、グラフのプロットはそれぞれ次の緩衝液の結果を示す。−△−：リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）−▲−：リン酸１水素２カリウム−ＫＯＨ緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４−ＫＯＨ）−□−：トリス−塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）−○−：酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ＡｃＯＨ−ＮａＯＡｃ）
【図３】図３は、ｐＳＵＰＣＡＴ１の構築を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基供与体の存在下、下記式（１）で表される４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンに、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素を含む酵素活性物質を作用させ、下記式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを製造する方法であって、
該酵素活性物質が、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを合成する、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する、方法；
【化１】
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｂ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｃ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ。
【請求項２】
前記酵素活性物質が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物に由来する酵素活性物質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素活性物質が、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素をコードするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形質転換体、またはその処理物であって、
該酵素は、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを合成する、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する、請求項１に記載の方法；
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｂ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｃ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ。
【請求項５】
アミノ基供与体が、フェニルエチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、Ｌ−アラニン、イソプロピルアミンおよび２−アミノペンタンからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
下記の工程を含む、下記一般式（４）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法；
（ｉ）請求項１〜５のいずれかに記載の方法により、下記式（１）で表される４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンから下記式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを製造する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールに、下記一般式（３）で表される化合物を反応させて、下記一般式（４）で表される化合物を得る工程；
【化２】
（式中、環Ａはベンゼン環又は単環性芳香族複素環を表し、該ベンゼン環及び該単環性芳香族複素環は、ハロゲン原子、ニトロ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいカルバモイル及びシアノより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよく；
Ｗは単結合、又は１もしくは２個のアルキルで置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキレンを表し；
ｎは０、１、２、３又は４を表し；
Ｒ１は水素原子、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいフェニル又は置換されていてもよい複素環式基を表し；
Ｒ２は水素原子又はアルキルを表し；
Ｘは脱離基を表し；
ＺはＣＨ又はＮを表す。）。
【請求項１】
アミノ基供与体の存在下、下記式（１）で表される４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンに、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素を含む酵素活性物質を作用させ、下記式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを製造する方法であって、
該酵素活性物質が、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを合成する、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する、方法；
【化１】
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｂ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｃ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ。
【請求項２】
前記酵素活性物質が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物に由来する酵素活性物質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素活性物質が、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の酵素をコードするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形質転換体、またはその処理物であって、
該酵素は、アミノ基供与体の存在下、４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンからｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを合成する、（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ活性を有する、請求項１に記載の方法；
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｂ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｃ）配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ；
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する（Ｓ）−アミントランスアミナーゼ。
【請求項５】
アミノ基供与体が、フェニルエチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、Ｌ−アラニン、イソプロピルアミンおよび２−アミノペンタンからなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
下記の工程を含む、下記一般式（４）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法；
（ｉ）請求項１〜５のいずれかに記載の方法により、下記式（１）で表される４−ヒドロキシ−４−メチルシクロヘキサノンから下記式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールを製造する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた式（２）で表されるｔｒａｎｓ−４−アミノ−１−メチルシクロヘキサノールに、下記一般式（３）で表される化合物を反応させて、下記一般式（４）で表される化合物を得る工程；
【化２】
（式中、環Ａはベンゼン環又は単環性芳香族複素環を表し、該ベンゼン環及び該単環性芳香族複素環は、ハロゲン原子、ニトロ、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいアミノ、置換されていてもよいカルバモイル及びシアノより成る群から選ばれる同一又は異なる１〜３個の基で置換されてもよく；
Ｗは単結合、又は１もしくは２個のアルキルで置換されていてもよいＣ１〜Ｃ４アルキレンを表し；
ｎは０、１、２、３又は４を表し；
Ｒ１は水素原子、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいフェニル又は置換されていてもよい複素環式基を表し；
Ｒ２は水素原子又はアルキルを表し；
Ｘは脱離基を表し；
ＺはＣＨ又はＮを表す。）。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２２１６２（Ｐ２００９−２２１６２Ａ）
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８５１７６（Ｐ２００７−１８５１７６）
【出願日】平成１９年７月１７日（２００７．７．１７）
【出願人】（０００００２９０１）ダイセル化学工業株式会社 (1,236)
【出願人】（０００００２９５６）田辺三菱製薬株式会社 (225)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１７日（２００７．７．１７）
【出願人】（０００００２９０１）ダイセル化学工業株式会社 (1,236)
【出願人】（０００００２９５６）田辺三菱製薬株式会社 (225)
【Ｆターム（参考）】
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