抗体の安定性を増加させるための組成物および方法
本発明は、抗体を含む薬剤組成物および抗体を配合する方法を含む。抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域は、特定の特性を有しうる。いくつかの態様において、抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変領域中に、Ｎ−グリカン部位を含んでもよい。組成物は、緩衝剤、および場合によって糖および／または塩を含んでもよい。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、米国仮出願第６０／６８３，４７５号、２００５年５月１９日出願の優先権を請求し、該文献は、本明細書において、その全体が援用される。
【０００２】
分野
本発明は、抗体を安定化させるための方法および組成物の分野にある。
背景
抗体を用いる多くの適用において、ある期間に渡って、物理的構造および生物学的活性が安定に維持されるように、抗体を配合することが望ましい。抗体の現在の使用には、多くの他の使用の中に、広い研究使用、ならびにヒト療法剤および診断剤としての使用が含まれる。抗体は、タンパク質の一種として、多くの類似性を共有するが、異なる抗体は、異なる物理的構造および生物学的活性を所持する。単一抗体の調製物は、例えば、グリコシル化、アミノ酸修飾、または三次構造における相違のため、不均一である可能性もある。本発明は、抗体の特定の群を安定化させるための組成物および方法、ならびにこうした組成物を用いて、多様な疾患を治療する方法に対して向けられる。
【０００３】
概要
本発明は、抗体を含む安定な組成物、および抗体を安定化させるための方法を含む。特定の態様において、組成物は、開示する抗体群の中から抗体を含んでもよく、そして組成物は、特定の範囲内のｐＨを有し、そして／または特定の緩衝剤、例えばヒスチジン、酢酸ナトリウム、またはクエン酸ナトリウムなどを含む。他の態様において、本発明は、複数の構造変異体を含むモノクローナル抗体の精製調製物、例えば、抗体の少なくとも２、３、４、または５の異なるアイソフォームを含む調製物を含む、組成物を提供する。本発明は、抗体、場合によって、複数の構造変異体を含むモノクローナル抗体の精製調製物を安定化させる方法をさらに含む。構造変異体は、抗体の可変領域に付着したＮ−グリカンの不均一シアル化によるアイソフォームであってもよい。構造変異体は、抗体に付着したグリカンいずれかの不均一シアル化によるアイソフォームであってもよい。
【０００４】
１つの側面において、本発明には、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．５のｐＨを有し、モノクローナル抗体の精製調製物およびヒスチジン、酢酸ナトリウム、またはクエン酸ナトリウムを含む、安定な薬剤組成物であって、抗体が、以下からなる特性群から選択される少なくとも１つの特性を有する、前記薬剤組成物が含まれる：（ａ）抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である重鎖可変領域を含む；（ｂ）抗体は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含む；（ｃ）抗体は、Ｎ−グリカン部位を含む重鎖可変領域を含む；（ｄ）抗体は、Ｎ−グリカン部位を含む軽鎖可変領域を含む；（ｅ）抗体は、（ｉ）配列番号３６におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３６のアミノ酸の少なくとも７つを含むアミノ酸配列；および（ｉｉ）配列番号３７を含むアミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含む；（ｆ）抗体は、（ｉ）配列番号４３；および（ｉｉ）配列番号４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む；（ｇ）抗体は、ヒト・ゲノムＶＨセグメント５−５１（配列番号５８）または５−ａ（配列番号５９）によってコードされるものと、少なくとも約８０％、８５％または９０％同一である重鎖可変領域を含む；ならびに（ｈ）抗体は、ヒト・ゲノムＶＬセグメントＶＫＩＩＩ／Ａ２７（配列番号６０）によってコードされるものと、少なくとも約８０％、８５％または９０％同一である軽鎖可変領域を含む。さらなる側面において、抗体は：配列番号３４を含むＣＤＲ１；配列番号３５を含むＣＤＲ２；および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含んでもよい。さらに別の側面において、抗体は：配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１；配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２；および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含んでもよい。いくつかの態様において、重鎖可変領域は、以下の配列を含んでもよい：配列番号３４におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３４のアミノ酸の少なくとも４つを含むＣＤＲ１；配列番号３５におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３５のアミノ酸の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、または１５を含むＣＤＲ２；配列番号３６または配列番号３７におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３６または配列番号３７のアミノ酸の少なくとも５、６、または７を含むＣＤＲ３。いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、以下の配列を含んでもよい：配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０のアミノ酸の少なくとも９、１０、または１１を含むＣＤＲ１；配列番号４１または配列番号４２におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸の少なくとも４、５、または６を含むＣＤＲ２；配列番号４３または配列番号４４におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号４３または配列番号４４のアミノ酸の少なくとも７、８、および９を含むＣＤＲ３。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ抗体、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であってもよい。組成物は、ソルビトールまたはスクロースなどの糖、および／または塩を含んでもよい。組成物のｐＨは、約５．７〜約６．３であってもよいし、または約６．０であってもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であってもよく、そしてインターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ−γ）に結合してもよい。
【０００５】
本発明は、モノクローナル抗体の精製調製物および緩衝剤を含む薬剤組成物であって、該組成物が約５．５〜約６．５のｐＨであり、そして該精製調製物が、抗体の少なくとも３つの異なるアイソフォームを含む、前記薬剤組成物を提供する。組成物のｐＨは、約５．７〜約６．３であってもよいし、または約６．０であってもよく、そして組成物は液体であってもよい。抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を含んでもよく、そして配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である重鎖可変領域を有してもよく、そして／または軽鎖可変領域は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である。抗体は：配列番号３４を含むＣＤＲ１、配列番号３５を含むＣＤＲ２、および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；ならびに／あるいは配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１、配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２、および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含んでもよい。緩衝剤は、ヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウムであってもよく、そして組成物は、糖、例えばソルビトールなど、炭水化物、および／または塩をさらに含んでもよい。抗体は、ＣＨＯ細胞中で産生されてもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体、場合によって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であってもよい。抗体は、インターフェロン・ガンマ、場合によって、ヒト・インターフェロン・ガンマに結合してもよい。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％または９５％が、単量体ピーク中にあってもよい。
【０００６】
さらに、本発明は、緩衝剤を含む組成物中に精製調製物を配合することを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を安定化させるための方法であって、該組成物が約５．５〜約６．５のｐＨを有し、そして該精製調製物が、抗体の少なくとも３つの異なるアイソフォームを含む、前記方法を提供する。抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を有してもよい。抗体の重鎖可変領域は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一であってもよく、そして／または抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一であってもよい。抗体は：配列番号３４を含むＣＤＲ１、配列番号３５を含むＣＤＲ２、および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；ならびに／あるいは配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１、配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２、および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含んでもよい。緩衝剤は、ヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウムであってもよい。組成物は、糖、例えばソルビトールなど、炭水化物、および／または塩をさらに含んでもよい。抗体は、ＣＨＯ細胞中で作製されてもよく、そしてＩｇＧ抗体、場合によって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であってもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であってもよい。組成物のｐＨは、約５．７〜約６．３、または約６．０であってもよい。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％または９５％が、単量体ピーク中にあってもよい。
【０００７】
別の態様において、本発明には、ヒスチジンおよびモノクローナル抗体の精製調製物を含む組成物であって、該精製調製物が、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして該組成物のｐＨが約５〜約７である、前記組成物が含まれる。あるいは、組成物は、酢酸ナトリウムおよびモノクローナル抗体の精製調製物を含んでもよく、該精製調製物は、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして該組成物のｐＨは約５〜約６である。抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を含んでもよく、そして配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０に、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である重鎖可変領域、および／または配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。抗体は：配列番号３４を含むＣＤＲ１、配列番号３５を含むＣＤＲ２、および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；ならびに／あるいは配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１、配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２、および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含んでもよい。組成物は、糖、例えばソルビトールなど、炭水化物、および／または塩をさらに含んでもよい。抗体は、ＣＨＯ細胞中で作製されてもよく、そしてＩｇＧ抗体、場合によって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であってもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であってもよい。組成物のｐＨは、約５．５〜約６．５、約５．７〜約６．３、または約６．０であってもよい。組成物は液体であってもよく、あるいは凍結または凍結乾燥されていてもよい。組成物は、糖、例えばソルビトールなど、炭水化物、および／または塩をさらに含んでもよい。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％または９５％が、単量体ピーク中にあってもよい。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ヒスチジンを含む組成物中に抗体を配合することを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を安定化させるための方法であって、該精製調製物が、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして該組成物のｐＨが約５〜約７である、前記方法を含む。あるいは、組成物は、酢酸ナトリウムおよびモノクローナル抗体の精製調製物を含んでもよく、該精製調製物は、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして該組成物のｐＨは約５〜約６である。組成物は、糖、例えばソルビトールなど、炭水化物、および／または塩をさらに含んでもよい。抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である重鎖可変領域、および／または配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。抗体は：配列番号３４を含むＣＤＲ１、配列番号３５を含むＣＤＲ２、および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；ならびに／あるいは配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１、配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２、および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含んでもよい。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％または９５％が、単量体ピーク中にあってもよい。
【０００９】
本発明にはまた、モノクローナル抗体の精製調製物およびヒスチジンを含む薬剤組成物も含まれ、該薬剤組成物は、約５〜約７のｐＨを有するか、または約６のｐＨを有する。精製調製物は、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含んでもよい。抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である重鎖可変領域、および／または配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。組成物はまた、ソルビトールも含んでもよい。
【００１０】
本発明にはさらに、モノクローナル抗体の精製調製物および酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、またはリン酸カリウムを含む薬剤組成物も含まれ、該薬剤組成物は、約５〜約６のｐＨを有するか、または約６のｐＨを有する。精製調製物は、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含んでもよい。抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である重鎖可変領域、および／または配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。組成物はまた、ソルビトールも含んでもよい。
【００１１】
本発明にはさらに、モノクローナル抗体の精製調製物およびクエン酸ナトリウムを含む薬剤組成物も含まれ、該薬剤組成物は、約６〜約７のｐＨを有するか、または約６のｐＨを有する。精製調製物は、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含んでもよい。抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である重鎖可変領域、および／または配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。組成物はまた、ソルビトールも含んでもよい。
【００１２】
別の側面において、本発明は、ヒト抗原に特異的に結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の精製調製物、ヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウム、および塩ならびに／あるいは糖を含む、安定な薬剤組成物であって、抗体がその重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を有する、前記組成物を提供する。別の態様において、本発明は、ヒト抗原に特異的に結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の精製調製物、緩衝剤、および塩ならびに／あるいは糖を含む、安定な薬剤組成物であって、該抗体がその重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカンを含み、そして該組成物のｐＨが約５．５〜約６．５である、前記薬剤組成物を提供する。場合によって、組成物のｐＨは、約５．７〜約６．３であってもよいし、または約６であってもよい。さらに、本発明は、ヒト抗原に特異的に結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の精製調製物、緩衝剤、例えばヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウム、および塩ならびに／あるいは糖を含む、安定な薬剤組成物であって、該抗体が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および／または配列番号３０と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である、前記薬剤組成物を含む。組成物のｐＨは、約５．５〜約６．５であってもよい。さらなる側面において、本発明には、ヒト抗原に特異的に結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の精製調製物、緩衝剤、例えばヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウム、および塩ならびに／あるいは糖を含む、安定な薬剤組成物であって、該抗体が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、および／または配列番号３１と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である、前記薬剤組成物が含まれる。組成物のｐＨは、約５．５〜約６．５であってもよい。場合によって、組成物のｐＨは、約５．７〜約６．３であってもよく、または約６であってもよい。組成物は、液体であってもよく、そしてその場合、あらかじめ凍結乾燥されていなくてもよい。あるいは、組成物を凍結乾燥してもよい。
【００１３】
本発明にはまた、抗体を安定化させるための方法であって：重鎖および／または軽鎖の可変領域中に、Ｎ−グリカン部位を有するモノクローナル抗体の精製調製物を選択し、そしてヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウムを含み、そして約５．５〜約６．５のｐＨを有する溶液中に、精製調製物を配合する工程を含む、前記方法も含まれる。溶液は、ソルビトールまたはスクロースなどの糖、および／または塩をさらに含んでもよい。溶液のｐＨは約６．０であってもよい。抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および／または配列番号３０と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含んでもよい。あるいは、またはさらに、抗体は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、および／または配列番号３１と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含んでもよい。
【００１４】
最後に、本発明は、モノクローナル抗体の複数の構造変異体を含む、ヒト抗原に結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の精製調製物を安定化させるための方法であって、構造変異体がＮ−グリカン部位の不均一なグリコシル化による、少なくとも２つ、３つ、または４つの構造変異体の混合物を選択し、そして約５〜約６．５のｐＨで、緩衝剤、例えばヒスチジン、リン酸、クエン酸、または酢酸、および糖ならびに／あるいは塩を含む組成物中に、混合物を配合する工程を含む、前記方法を提供する。組成物は、ソルビトールまたはスクロースをさらに含んでもよい。
配列リストの簡単な説明
表１
【００１５】
【表１Ａ】
【００１６】
【表１Ｂ】
【００１７】
【表１Ｃ】
【００１８】
【表１Ｄ】
【００１９】
詳細な説明
物理的構造および生物学的活性を安定化させるように、抗体を配合してもよい。抗体を安定化させる特に重要な側面は、抗体の凝集を阻害するかまたは防止することであり、これは、凝集した抗体が、単量体よりもより免疫原性でありうるためである。例えば、Ｈｅｒｍｅｌｉｎｇら（２００４）， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２１（６）：８９７−９０３を参照されたい。療法剤に対する免疫応答は、望ましくない副作用を生じるか、または抗体の有効性を減少させうる。本発明は、抗体配合のための組成物および方法、場合によって、例えばグリコシル化の相違のために不均一であるモノクローナル抗体の精製調製物配合のための組成物および方法を提供する。
【００２０】
抗体安定化のための重要なパラメーターには、抗体の純度および不均一性の度合い、ｐＨ、および緩衝剤が含まれる。組成物の他の特質、例えば塩、炭水化物および／または糖、アミノ酸、ならびに／あるいは多くの他の成分もまた、抗体安定性に影響を及ぼしうる。抗体濃度もまた、安定性に影響を及ぼしうる。異なる抗体は、組成物のいくつかの特質に対して感受性であり、そして他のものに感受性でない可能性もある。本発明は、モノクローナル抗体の精製調製物を安定化させるための方法、これらの抗体を含む安定組成物、およびこれらの組成物を用いて、特定の疾患を治療する方法に対して向けられる。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明の抗体は、「不均一」である。モノクローナル抗体の精製調製物は、抗体がモノクローナル抗体であり、そして精製調製物中の抗体分子の実質的にすべてが、同一のアミノ酸配列を有する場合であってさえ、複数の「構造変異体」を含むならば、本明細書に意味するように不均一である。不均一性は、他の可能性の中でも、例えば、不均一なグリコシル化、ジスルフィド結合形成の不均一性、および／またはタンパク質フォールディングの不均一性から生じうる。本明細書に意味する際、「構造変異体」の中に含まれないのは、Ｃ末端リジンまたは環状化Ｎ末端グルタミンを欠く変異体などの、異なるアミノ酸配列を持つ変異体である。例えば、Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅら（１９９７）， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌｙｓｉｓ １６：５９３−６０３を参照されたい。例えば、不均一モノクローナル抗体は、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメイン中の非常に保存されたＮ−グリカン部位以外の、Ｎ−グリカン部位またはＯ−グリカン部位を有するＩｇＧ抗体であってもよい。この保存されたＮ−グリカン部位は、実質的にシアル化されず、そして抗体のエフェクター機能に重要である。例えば、ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９７）， ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６−３２；ＴａｏおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９８９）． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２５９５−２６０１；Ｓｈｅｅｌｅｙら（１９９７）， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４７：１０２−１０を参照されたい。他のＮ−グリカン部位またはＯ−グリカン部位は、抗体アミノ酸配列中のどこに存在してもよく、場合によって、重鎖または軽鎖の可変領域中、あるいはＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３領域中に存在してもよく、そして多様な度合いにシアル化され、こうして異なる電荷を持つ異なる構造変異体を生じてもよい。こうした異なって荷電した変異体は、本明細書において、「アイソフォーム」と称される。あるいは、不均一抗体調製物は、異なってフォールディングされている構造変異体を含んでもよく、そして異なってフォールディングされた種は、カラム・クロマトグラフィーによって分離可能でありうる。いくつかの態様において、こうした異なってフォールディングされた変異体は、異なるジスルフィド結合パターンを有してもよく、そしてカラム・クロマトグラフィーによって分離可能でありうる。不均一抗体調製物は、均一調製物とは異なる安定特性を示す可能性もあり、そして単離構造変異体を含む、異なる均一調製物は、互いに異なる安定特性を示す可能性もある。したがって、ただ１つの構造変異体または構造変異体の組み合わせを含む組成物は、市販に適した安定組成物でありうる。
【００２２】
精製抗体調製物の観察される不均一性が、Ｎ−グリカン間の不均一なグリコシル化のためであるかどうかを決定するため、実施例１に記載するように、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）での消化を伴いおよび伴わずにの両方で、陽イオン交換クロマトグラフィーによって、抗体の精製調製物の試料を分析してもよい。ＰＮＧアーゼＦはタンパク質からＮ−グリカンを除去するため、未消化の試料中で観察される不均一性が、不均一なグリコシル化のためであるならば、Ｎ−グリカナーゼ消化した試料は、未消化の試料に比較した際、ほとんどまたはまったく不均一性を示さないと予期されるであろう。製造者、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（米国マサチューセッツ州）によって推奨されるように、ＰＮＧアーゼでの消化を本質的に行ってもよい。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓは、１０Ｘ Ｇ７反応緩衝液を供給し、そして１％ＮＰ−４０を加えた１Ｘ反応緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）中、３７℃で反応をインキュベーションすることを推奨する。Ｎ−グリカンを特異的に除去する他の酵素、例えばＮ−グリカナーゼもまた、これらの酵素に適した反応条件とともに使用可能である。
【００２３】
一次配列が抗体構造の重要な決定要因でありうる。いくつかの態様において、本発明の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および／または配列番号３０と、少なくとも約８０％、場合によって、少なくとも約８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一であってもよい。本発明の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、および／または配列番号３１と、少なくとも８０％、場合によって、少なくとも８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一であってもよい。同一性領域は、以下に定義するように、これらの配列比較のいずれかにおいて、長さが少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００アミノ酸であってもよい。さらに、本発明の抗体は、配列番号３６におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３６のアミノ酸の少なくとも７つを含むアミノ酸配列を有するか；または配列番号３７を含むアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ３を含んでもよい。
【００２４】
「抗体」は、本明細書に意味する際、抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域のすべてまたは部分を含む１以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質を指し、抗体は抗原に結合可能である。多くの天然存在抗体が、例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．， メリーランド州ベセスダ）に記載される。抗体は、抗原の生物学的活性を調節、すなわちアゴナイズまたはアンタゴナイズすることが可能でありうる。「抗体」には、以下に記載する、天然存在抗体が含まれ、２つの完全重鎖および２つの完全軽鎖を含有する抗体、ならびに、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片などの抗体断片、および天然存在抗体に見られる他のドメインを含まない、重鎖または軽鎖の単一の可変領域を含む抗体が含まれる。一本鎖、キメラ、ヒト化、ヒト、ポリクローナル、およびモノクローナル抗体が本明細書に意味するような抗体である。特定の態様において、抗体は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。さらなる態様において、抗体は、天然存在抗体の酵素的または化学的切断によって産生される。抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブクラスを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブクラスを含む）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥアイソタイプのものであってもよく、そしてカッパ型またはラムダ型軽鎖を含んでもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化抗体、ネズミ抗体、ウサギ抗体、ヒトコブラクダ（ｄｒｏｍｅｄａｒｙ）抗体、または任意の哺乳動物抗体であってもよい。
【００２５】
本発明の組成物および方法で用いる抗体は、いくつかの態様において、「モノクローナル抗体」である。本明細書に意味する際、「モノクローナル抗体」調製物は、大部分、同じアミノ酸配列を有する抗体を含有する。いくつかの例において、モノクローナル抗体の配列変動は、例えばアミノ酸修飾または切断を含む、翻訳後事象のために起こりうる。対照的に、例えば接種された動物由来の血液試料から精製可能なポリクローナル抗体調製物は、多くの異なるアミノ酸配列を持つ抗体を含む。モノクローナル抗体は、任意の適切な手段によって作製可能である。例えば、単一のアミノ酸配列を持つ抗体を生じるハイブリドーマ細胞株から、モノクローナル抗体を単離してもよい。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５）の方法によって、こうしたハイブリドーマ株を単離して、そしてｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれで培養してもよい。あるいは、モノクローナル抗体を以下のように産生してもよい。通常は抗体を産生しない宿主細胞株、例えば細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞株内に、抗体をコードする核酸を導入してもよい。細胞株が哺乳動物細胞株であるならば、該細胞株は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、あるいはＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓを含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫（例えばＮＳＯ、ＮＳ１）、ＰＣ１２、またはＷＩ３８細胞株であってもよい。抗体をコードする核酸を含有する細胞株を培養してもよく、そして培地または細胞から抗体を採取してもよい。
【００２６】
「モノクローナル抗体の精製調製物」は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも約８０％、場合によって、少なくとも約８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％が、単量体（以下に定義するようなもの）ピーク中にある、調製物を指す。ＳＥＣの方法は、実施例２および図３に説明される。実施例２で検出される単量体ピークは、２つの完全重鎖および２つの完全軽鎖を含む四量体抗体を含有する。しかし、他の種類の抗体（上に定義するようなもの）を含有する単量体ピークが、モノクローナル抗体の精製調製物が何であるかを定義する際に意図される。
【００２７】
「ｓｃＦｖ」は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、そして抗体の定常領域を含まない、一本鎖抗体である。いくつかの態様において、ｓｃＦｖはまた、重鎖および軽鎖の可変領域間に多様な長さのリンカーも含んでもよい。ｓｃＦｖを他のアミノ酸配列に融合させてもよいが、ｓｃＦｖと称されるタンパク質部分は、好ましくは、ＶＨ領域、ＶＬ領域、および場合によってこれらの配列を連結するリンカー以外の、いかなる実質的な量のアミノ酸配列も含まない。
【００２８】
抗体の「Ｆｃ領域」は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびにヒンジ領域（またはその一部）を含み、そしてＣＨ１ドメインまたはＶＨドメインを含まない、重鎖断片またはこうした断片の変異体である。例えば、Ｋｕｂｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第２版， ｐ．１１０−１１， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， ニューヨーク（１９９４）を参照されたい。Ｆｃ断片は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＡアイソタイプのものであってもよく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４または他のサブクラスが含まれる。
【００２９】
「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」は、Ｆｃ領域に融合したｓｃＦｖを含有する抗体である。
一般的に、大部分の哺乳動物由来の天然存在抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。重鎖は、３つまたは４つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含み、そしてＩｇＥおよびＩｇＭ抗体では、ＣＨ４ドメインもまた含む。重鎖は、１つの可変ドメイン、ＶＨドメインを含む。軽鎖は、１つの定常ドメイン、ＣＬドメイン、および１つの可変ドメイン、ＶＬ領域を含む。軽鎖可変領域は、ラムダ・ファミリーまたはカッパ・ファミリーのいずれかに属することも可能であり、これらのファミリーは、配列が関連する軽鎖の２群である。重鎖または軽鎖の可変ドメインは、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔら， １９９１， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．， メリーランド州ベセスダによって、フレームワーク領域１〜４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と称される；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ， １９８７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−１７もまた参照されたい）に包埋された、３つの相補性決定領域（超可変領域としても知られ、Ｋａｂａｔら、上記によって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とも称される、ＣＤＲ；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、上記；Ｃｈｏｔｈｉａら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８３もまた参照されたい）を含む。ＣＤＲおよびフレームワーク・セグメントは、多様な領域のアミノ末端から出発して、以下のように散在する：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。本発明の抗体は、ヒト、またはヒト・フレームワーク領域を有するヒト化抗体であってもよい。
【００３０】
抗体可変領域は、一般的に、一次アミノ酸配列によってそれと同定可能である。抗体可変領域のフレームワーク領域の一次配列は、門（ｐｈｙｌａ）に渡って普遍的に保存される、少数の残基を有する。さらに、多くの残基は、門に渡って、ならびに／あるいは種内および／または門内で、非常に保存されており、そして抗体内の多くの位は、通常、既知のアミノ酸群の１つによって占められる。Ｋａｂａｔら、上記を参照されたい。あるいは、またはさらに、配列は、予測される三次構造によって、抗体として認識可能である。グリーク・キーβバレルとして知られる構造を形成する９β鎖を含む、可変領域の三次構造は、非常によく保存され、そしてこの構造内のＣＤＲの位置もまた、非常に保存される。例えば、Ｂｏｒｋら， １９９４， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４２：３０９−２０；ＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ， １９８９， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４４：１−６３；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ， １９８８， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：３８１−４０５；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、上記；Ｋａｂａｔら、上記を参照されたい。
【００３１】
重鎖可変領域をコードするゲノム配列がマッピングされ、そして配列決定されてきている。例えば、ＣｏｏｋおよびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ（１９９５）， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １６（５）：２３７−４２を参照されたい。天然では、重鎖可変領域は、３つの別個の生殖系列ＤＮＡセグメント、ＶＨ、Ｄ、およびＪＨセグメントを含むＤＮＡによってコードされ、これらのセグメントは、抗体産生細胞において、ＤＮＡ再編成事象によって、一つになる。天然存在重鎖可変領域の長さの大部分は、ＶＨセグメントによってコードされ、このセグメントは、ヒト重鎖可変領域の総数約１０８アミノ酸のうち、およそ９４をコードする。したがって、既知のＶＨセグメントへの配列類似性に基づいて、生殖系列ＶＨセグメントの群を決定可能であり、そのうち１つは、部分的に、問題の特定の重鎖可変領域をコードする。いくつかの場合、配列類似性は、問題の抗体をコードするとして単一の生殖系列ＶＨセグメントを指し示しうる。およそ５１の機能性ヒト生殖系列ＶＨセグメントがあり、これらは、配列類似性によって、７つのファミリーに分類される。いくつかの態様において、本発明の抗体は、ファミリー５のヒト生殖系列ＶＨセグメント、場合によってＶＨセグメント５−５１または５−ａによってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、場合によって、少なくとも約８５％、９０％、９５％または９８％同一である。例えば、ＣｏｏｋおよびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ（１９９５）， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １６（５）：２３７−４２を参照されたい。あるいは、本発明の抗体は、ファミリー１、２、３、４、６、または７のヒト生殖系列ＶＨセグメントによってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、場合によって、少なくとも約８５％、９０％、９５％、または９８％同一であってもよい。
【００３２】
同様に、ヒト軽鎖可変領域をコードする天然存在ＤＮＡは、生殖系列ＶＬセグメントおよびＪＬセグメントを一つにする、抗体産生細胞中のＤＮＡ再編成事象から、通常生じる。ヒトＶＬおよびＪＬセグメントは、２つの遺伝子座に見られ、一方は染色体２上であり、そしてもう一方は染色体２２上であり、これらはそれぞれ、カッパ鎖およびラムダ鎖をコードする配列を含有する。配列類似性に基づいて、１０のファミリー（ＶＬ１〜ＶＬ１０）に属する、およそ３１の機能性ヒトＶλ遺伝子セグメント（ラムダ型軽鎖をコードするＶＬセグメントであるもの）がある。Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９６）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６４：２２０−３２。７つのファミリー、ＶＫＩ〜ＶＫＶＩＩに属する、約４０の機能性生殖系列ヒトＶκセグメント（カッパ型軽鎖をコードするＶＬセグメントであるもの）がある。本発明の抗体は、カッパまたはラムダ軽鎖を含んでもよく、場合によって、例えばＶＫＩＩＩ／Ａ２７などのＶＫＩＩＩファミリー中の生殖系列Ｖκセグメントによってコードされるアミノ酸配列に、少なくとも約８０％、場合によって少なくとも約８５％、９０％、９５％、または９８％同一である、軽鎖可変領域を含むものを含んでもよい。あるいは、軽鎖可変領域は、ＶＫＩ、ＶＫＩＩ、ＶＫＩＶ、ＶＫＶ、ＶＫＶＩ、またはＶＫＶＩＩファミリー中のＶκセグメントによってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９８％同一であってもよい。
【００３３】
本明細書に意味する際、「単量体」は、抗体を指す場合、１つより多いポリペプチド鎖を含んでもよい、１つの完全抗体である。例えば、多くの天然存在抗体の単量体は、２つの重鎖および２つの軽鎖、すなわち全部で４つのポリペプチド鎖からなる。さらに、いくつかの一本鎖抗体の単量体（１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖ）は、単一ポリペプチド鎖である。しかし、ｓｃＦｖは、重鎖および軽鎖の可変領域間のリンカーの長さのため、自発的に二量体化することも可能である。こうした場合、単量体は、二量体ｓｃＦｖ（またはディアボディ）であってもよい。同様に、２つの重鎖を含みそして軽鎖をまったく含まない、天然存在ヒトコブラクダ抗体の単量体（Ｍｕｌｄｅｒｍａｎｓら， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：２７７−３０２；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：２６２８５−９０）またはｓｃＦｖ−Ｆｃは二量体である。要するに、単量体は１つの完全抗体であり、抗体の部分であるすべての分子を含んで完全である。
【００３４】
「ヒト」抗体は、最終的にヒト供給源から得られる配列によってコードされる抗体である。例えば、ヒト血液から単離される抗体は、ヒト抗体である。不死化細胞とヒト抗体産生細胞の融合物である、ハイブリドーマ細胞株由来の抗体は、ヒト抗体である。さらに、抗体可変領域をコードするヒトＤＮＡのファージ・ライブラリーから単離された抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体には、ヒト抗体をコードする配列が、トランスジェニック動物中の抗体をコードする配列の少なくともいくつかを置換している、トランスジェニック動物によって産生されるヒト配列を持つ抗体もまた含まれ、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号および第６，０７５，１８１号に記載されるものがある。さらに、抗体をコードするヒト起源の核酸が導入されている、宿主細胞によって、ヒト抗体を産生してもよい。「ヒト」抗原は、ヒトに存在する分子であり、例えば他の可能性の中でも、ヒトで発現されるタンパク質、あるいはヒトで見られる糖または炭水化物である。
【００３５】
「ヒト化抗体」は、抗体の可変領域（単数または複数）のフレームワーク領域がヒト起源であり、そしてＣＤＲが別に由来する抗体である。ヒト化抗体は、例えば米国特許第５，６９３，７６１号に記載される。
【００３６】
抗体は、付着したＮまたはＯ連結グリカンを有してもよい。Ｏ連結グリカンは、全部ではないが、いくつかのセリンまたはスレオニン残基に付加される。どのセリンまたはスレオニンがグリコシル化されるかを予測するためのコンセンサス配列はないが、いくつかの予測因子が知られる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖａｒｋｉら監修， 第８章， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９９９）を参照されたい。Ｎ連結グリカンは、配列関係Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒに存在するアスパラギン残基に付加され、ここで、Ｘｘｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である。こうした配列は、本明細書において、Ｎ−グリカン部位またはＮ−グリコシル化部位と称される。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖａｒｋｉら監修， 第７章， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９９９）。Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列に続くプロリンは、アスパラギンがグリコシル化される頻度を実質的に減少させる。Ｇａｖｅｌおよびｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９９０）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ３（５）：４３３−４２。
【００３７】
Ｎ−グリカンは、複雑で、そして不均一な構造を有しうる。図１に示すように、Ｎ−グリカンは、例えば、枝（高マンノース・オリゴ糖と称される）を持たないか、あるいは２つ、３つ、または４つの枝を有してもよく、その各々が、シアル酸残基で終結してもまたはしなくてもよい。図１に示すもの以外の構造が可能である。枝の長さは多様であってもよい。例えば、単一の枝が、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびガラクトースを含む単位（ＬａｃＮＡｃ単位と称する）を２以上含んでも、または１つのＬａｃＮＡｃ単位のみを含んでもよい。図１Ｂ〜１Ｇを参照されたい。シアル酸残基は、一般的に負に荷電するため、異なる数のシアル酸残基を含む抗体は、例えば陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィーによって、電荷に基づいて分離可能である。また、等電点電気泳動ゲルを用いて、場合によってはキャピラリー電気泳動を用いて、こうした不均一性を検出してもよい。シアル酸残基の数が異なるため、異なる電荷を有する構造変異体を、本明細書において、「アイソフォーム」と称する。
【００３８】
すべてのクラスの天然存在抗体のＣＨ２ドメインは、Ｎ連結グリカン部位を含有することも可能であるし、そして通常、含有する。ＴａｏおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９８９）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２５９５−２６０１；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９７）， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＴＩＢＴＥＣＨ）１５：２６−３２；Ｒｉｏｔｔら， ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， 第３版， Ｍｏｓｂｙ， １９９３。しかし、シアル酸は、組換えＩｇＧ抗体上に、微量を超えて見出されることは稀であり、ＣＨ２ Ｎ−グリカン部位は、あるとしても稀にしかシアル化されないと示唆される。Ｈａｒｒｉｓら（２００４）， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ． ６２：１３７−５４。本発明の組成物および方法の抗体は、Ｆｃ領域中にＮ連結グリカン部位を有してもよい。さらに、本発明の組成物および方法で用いる抗体は、別の箇所、例えば可変ドメイン、場合によってＶＨおよび／またはＶＬドメイン中に、Ｎ連結グリカン部位を有してもよく、該抗体は、多様な度合いにシアル化されうる、付着した多様なＮ−グリカンを有してもよい。こうした可変領域グリコシル化は、抗原に対する結合親和性、抗体産生、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、および臓器ターゲティングに影響を及ぼしうる。Ｃｏｌｏｍａら（１９９９）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２：２１６２−７０；ＧａｌａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２：５４８９−９４。ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤアイソタイプの抗体は、一般的に、ＩｇＧ抗体よりも高くグリコシル化される。Ｒｉｏｔｔら、上記。したがって、これらのサブクラスのモノクローナル抗体の調製物は、シアル化の相違を含む、グリコシル化の相違のため、複数の構造変異体を含む可能性もある。
【００３９】
構造変異体が生じうる別の方式は、ジスルフィド結合の異なった形成を通じて生じる。天然存在抗体は、一般的に、ポリペプチド鎖内および鎖間の両方に、ジスルフィド結合を含有する。例えば、重鎖および軽鎖の各定常および可変ドメインは、鎖内ジスルフィド結合を形成可能な、非常に保存されたシステイン残基を含み、この各々は、約６０〜７０アミノ酸のループを囲む。さらに、鎖間ジスルフィド結合が、重鎖および軽鎖間、ならびに２つの重鎖間に存在可能である。大部分の天然存在抗体は、ヒンジ領域中のシステイン残基を介して、２つの重鎖間の１以上の鎖間ジスルフィド結合を有することも可能である。ジスルフィド結合は、システイン残基の多様な異なる対の間に形成可能であり、異なるパターンのジスルフィド結合を持つ構造変異体を生じさせる。異なるジスルフィド結合パターンを有するこれらの構造変異体は、例えば、イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または逆相ＨＰＬＣによって、互いから分離可能である。
【００４０】
本発明の抗体は、本明細書にその全体が援用される、米国特許出願公報第ＵＳ ２００５／０００４３５３ Ａ１号に詳細に記載されるものなどの、特定の物理的性質を有してもよい。この出願に記載される抗体の中には、番号１１１８、１１１８＊、１１１９、１１２１、および１１２１＊と称する５つの抗体がある。これらの抗体およびその部分の配列を、付随する配列表に開示し、そして配列表の配列の同一性を、表１に簡単に説明する。１つの側面において、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＡアイソタイプのものであってもよい。抗体がＩｇＧ抗体である場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であってもよい。本発明の抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および／または配列番号３０と、少なくとも８０％、場合によって、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である重鎖可変領域を含んでもよい。本発明の抗体は、配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、および／または配列番号３１と、少なくとも８０％、場合によって、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。別の側面において、本発明の抗体は、ＣＤＲの特定の配列を有してもよい。例えば、抗体は、以下のアミノ酸配列：（ａ）配列番号３６におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３６のアミノ酸の少なくとも７つを含むアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号３７を含むアミノ酸配列、のうちの１つを含む、重鎖ＣＤＲ３を有してもよい。
【００４１】
本明細書において、第一の配列が、例えば、配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号５６）の１０アミノ酸からなる場合、７アミノ酸が、第一の配列中のものと同一であり、そして該配列におけるのと同じ相対的位置に存在するならば、別の配列は、第一の配列におけるのと「同じ順序および間隔」の７アミノ酸を有する。例えば、配列ＲＡＡＡＡＶＳＳＳＹ（配列番号５７）は、ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号５６）におけるのと同じ順序および間隔の７アミノ酸を有する。対照的に、配列ＲＡＳＳＶＳＳＳＹ（配列番号５８）は、ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号５６）と比較して、内部欠失を含有し、欠失のどちらかの側に３アミノ酸および６アミノ酸があるため、これは、この配列に関しては当てはまらない。したがって、該配列は、第一の配列と同じ順序および間隔の最大６アミノ酸を有する。ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号５６）と同じ順序および間隔の７アミノ酸を有しうる最短のありうる配列は、例えば、長さ７アミノ酸のもの、例えばＳＱＳＶＳＳＳ（配列番号５９）である。
【００４２】
「同一性」は、核酸またはアミノ酸分子の対の間の比較を指す。配列同一性を決定するための方法が知られる。典型的な好ましいコンピュータプログラムは、遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）ウィスコンシンパッケージ、バージョン１０．０プログラム、「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら， １９８４， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７；ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ， １９８１，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２−４８９）である。「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメータには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、ならびにＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ．３５３−３５８， １９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５， １９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の匹敵する比較マトリックス；（２）アミノ酸配列の各ギャップに対する３０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに１のペナルティ、またはヌクレオチド配列の各ギャップに対する５０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに３のペナルティ；（３）末端ギャップに対するペナルティなし；および（４）長いギャップに対する最大ペナルティなし、が含まれる。ＧＡＰを用いて同一性を決定する際、長さの一部に渡って、またはすべてに渡って、２つの配列を並列させてもよい。この並列部分は、本明細書において、「同一性領域」と称される。
【００４３】
「実質的に類似の」ポリペプチドは、本明細書に意味する際、アミノ酸配列が互いに少なくとも約９０％同一であり、そして非改変ポリペプチドの生物学的活性を、望ましい方式で維持するかまたは改変する。
【００４４】
「組換えタンパク質」または「組換え抗体」は、宿主細胞によって天然には産生されない、該細胞によって産生されるタンパク質または抗体である。宿主細胞は、核酸を細胞内に導入する他の方法の中でも、組換えウイルスでのウイルス感染、トランスフェクション、形質転換、核酸でコーティングされた微粒子銃での照射、またはエレクトロポレーションなどの「遺伝子操作」法を用いた、宿主細胞内への、タンパク質または抗体の発現を可能にする核酸配列の導入の結果として、組換えタンパク質または抗体を産生する。
【００４５】
いくつかの態様において、抗体は、ＩＦＮ−γ、場合によってヒトＩＦＮ−γに特異的に結合可能である。抗体はまた、タンパク質であってもまたはなくてもよい、他の抗原にも結合してもよい。本発明の組成物に含有される抗体は、天然存在抗体と同一であってもまたは実質的に類似であってもよく、そして／または、組換えタンパク質であってもまたはそうでなくてもよい。場合によって、抗体が結合する抗原は、ヒト・ポリペプチド、その断片、または長さ少なくとも１０アミノ酸の実質的に類似のポリペプチドを含んでもよい。
【００４６】
一般的に、本発明の方法および組成物は、例えば以下のポリペプチドの１つのすべてまたは部分を含む、任意の分子に結合する抗体を安定化させるのに有用である：ｆｌｔ３リガンド（本明細書に援用される国際出願ＷＯ ９４／２８３９１に記載されるようなもの）、ＣＤ４０リガンド（本明細書に援用される米国特許第６，０８７，３２９号に記載されるようなもの）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、Ｔｅｋ、Ｔｅｋ−デルタ、Ｔｉｅ−２、レプチン、ＩＬ−２、アンジオポエチン−２（本明細書に援用される、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら（１９９７）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（５３２２）：５５−６０に記載されるようなもの）、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子のリガンド（ＲＡＮＫＬ、本明細書に援用される国際出願ＷＯ ０１／３６６３７に記載されるようなもの）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、本明細書に援用される国際出願ＷＯ ９７／０１６３３に記載されるようなもの）、胸腺間質由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、本明細書に援用されるオーストラリア特許第５８８８１９号に記載されるようなもの）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子（例えば、本明細書に援用される米国特許第６，２０４，３６３号に記載される）、上皮増殖因子、角化細胞増殖因子、巨核球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｔｅ）増殖および発生因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、インスリン様増殖因子類、副甲状腺ホルモン、αインターフェロン類、γインターフェロン、およびコンセンサス・インターフェロン類を含むインターフェロン類（どちらも本明細書に援用される、米国特許第４，６９５，６２３号および第４，８９７４７１号に記載されるものなど）、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、ＧＤＮＦを含むグリア細胞由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ １〜５）、ニューロトロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子類、リンホトキシン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、および細胞表面分子ＥＬＫおよびＨｅｋの多様なリガンド（ｅｐｈ関連キナーゼのリガンドまたはＬＥＲＫＳなど）。本発明の方法にしたがって産生可能なポリペプチドの説明は、例えば、すべて本明細書に援用される、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．ＩＩ（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ監修， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， マサチューセッツ州ケンブリッジ， １９９８）；Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙおよびＬｅｉｇｈ監修， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， ニューヨーク， １９９３）；およびＴｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ａ．Ｗ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， カリフォルニア州サンディエゴ， １９９１）に見出すことも可能である。
【００４７】
本発明の組成物または方法で用いる抗体が結合可能な他の抗原には、前述のポリペプチドいずれかの受容体、またはこうした受容体に対するアンタゴニストのアミノ酸配列のすべてまたは部分が含まれ、以下が含まれる：腫瘍壊死因子受容体の両方の型（どちらも本明細書に援用される、米国特許第５，３９５，７６０号および米国特許第５，６１０，２７９号に記載されるような、ｐ５５およびｐ７５と称するＴＮＦＲ、ＥＭＢＲＥＬ（登録商標）として市販されている融合タンパク質エタネルセプトを含む）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体（Ｉ型およびＩＩ型；すべて本明細書に援用される、欧州特許第０ ４６０ ８４６号、米国特許第４，９６８，６０７号、および米国特許第５，７６７，０６４号に記載される）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（本明細書に援用される米国特許第６，３３７，０７２号に記載されるものなど）、ＩＬ−１アンタゴニストまたは阻害剤（すべて本明細書に援用される、米国特許第５，９８１，７１３号、第６，０９６，７２８号、および第５，０７５，２２２号に記載されるものなど）、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体（どちらも本明細書に援用される、欧州特許第０ ３６７ ５６６号および米国特許第５，８５６，２９６号に記載されるようなもの）、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子の受容体、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ、どちらも本明細書に援用される、ＷＯ ０１／３６６３７および米国特許第６，２７１，３４９号に記載される）、破骨細胞形成抑制因子（例えば、本明細書に援用される米国特許第６，０１５，９３８号に記載される）、ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４を含む）、およびＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などの死のドメインを含む受容体。
【００４８】
本発明の組成物または方法で用いる抗体が結合可能な他の抗原は、分化抗原（ＣＤポリペプチドと称する）またはそのリガンドあるいはこれらのいずれかに実質的に類似のポリペプチドのアミノ酸配列のすべてまたは部分を含む。こうした抗原は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（本明細書に援用される、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ， Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ， Ｋｉｋｕｔａｎｉら監修，日本・神戸， １９９６）に開示される。類似のＣＤポリペプチドが、それに続くワークショップで開示されている。こうした抗原の例には、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそのリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド等）が含まれる。ＣＤ抗原のいくつかは、４１ＢＢおよびＯＸ４０もまた含むＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。リガンドはしばしば、４１ＢＢリガンドおよびＯＸリガンドもメンバーであるように、ＴＮＦファミリーのメンバーである。したがって、ＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーもまた、本発明の方法によって安定化される抗体が結合可能な抗原でありうる。
【００４９】
本発明の方法および組成物によって安定化される抗体はまた、酵素的に活性であるポリペプチドまたはそのリガンドにも結合可能である。例には、以下のポリペプチドまたはそのリガンド、あるいはこれらの１つに実質的に類似のポリペプチドの１つのすべてまたは部分を含むポリペプチドが含まれる：メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリン・ファミリーメンバー、多様なキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、組織プラスミノーゲン・アクチベーター、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン類、ＩＬ−２アンタゴニスト、アルファ−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−アルファ変換酵素、上述の酵素いずれかに対するリガンド、ならびに多数の他の酵素およびそのリガンド。
【００５０】
本発明の組成物および方法をさらに用いて、以下の抗原に結合する抗体を安定化させてもよい：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−βおよびその類似体（米国特許第５，２７２，０６４号および第５，１４９，７９２号に記載されるものなど）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体（本明細書に援用される米国特許第６，２３５，８８３ Ｂ１号に記載されるものを含む）、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞増殖因子、破骨細胞形成抑制因子リガンド、インターフェロン・ガンマ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１、およびｚＴＮＦ４としても知られるＢｌｙＳ；ＤｏおよびＣｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ（２００２）， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． １３（１）：１９−２５を参照されたい）、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現される遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸および／または膵臓癌患者の血清に上昇したレベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳癌、結腸癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、および／または腎臓癌細胞、ならびに／あるいは黒色腫、神経膠腫または神経芽腫細胞、腫瘍の壊死コア上に発現される癌関連エピトープまたはポリペプチド、インテグリン・アルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン類、ｃ−ＭＥＴ、ＭＥＴ、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリン（ｌｅｕｋｏｉｎｔｅｇｒｉｎ）、アドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（因子ＶＩＩａ組織因子の阻害剤）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原であるもの）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｙｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）。
【００５１】
本発明の方法および組成物によって安定化される抗体は：腫瘍抗原ｇｐ７２をターゲットとする抗体；ガングリオシドＧＤ３に対する抗体；ガングリオシドＧＤ２に対する抗体；またはこれらに実質的に類似の抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含む、抗イディオタイプ抗体であってもよい。
【００５２】
本発明の薬剤組成物は、抗体が、４℃で２年間貯蔵した後、出発時の物理的および化学的構造ならびに生物学的活性を本質的に保持するならば、本明細書に意味する際、「安定」であると見なされる。物理的構造および生物学的活性は、多くのありうるアッセイの中でも、例えば、実施例２に説明するように、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、Ａ５４９アッセイ、および／または蛍光発光によって、多様な方法で測定可能である。方法または組成物は、これらの方法の少なくとも１つによって測定した際に、出発物質の特性の実質的な保持を促進するならば、「安定化」させている。
【００５３】
フリーズドライ組成物である「凍結乾燥」薬剤組成物は、特定の濃度で特定の分子を含有し、そして／または特定のｐＨであると記載してもよい。本明細書に意味する際、これは、凍結乾燥組成物を、使用に推奨される希釈剤の量中に再懸濁した際に、該組成物が、記載する濃度で記載する分子を含有し、そして記載するｐＨを有することを意味する。
【００５４】
本発明の薬剤組成物は、少なくとも緩衝剤および抗体を、そして場合によって少なくとも１つの安定化化合物、例えば糖、炭水化物、塩、アミノ酸、または界面活性剤などを含む。当業者は、緩衝剤以外の構成要素が、しばしば、抗体を含む薬剤組成物内に含有されることを知っている。例えば、薬剤組成物はしばしば等張であり、すなわち細胞が浸されていても、細胞の浸透圧体積変化を引き起こさないような、溶質濃度を有する。等張組成物は、一般的に、約２５０〜約３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。多様な種類の溶質、例えば糖、多糖、炭水化物、または塩を用いて、溶液を等張にする、すなわち等張化することも可能である。
【００５５】
緩衝剤は、例えば、以下またはその塩のいずれであってもよい：コハク酸塩、ヒスチジン、酢酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、有機酸、Ｔｒｉｓ、ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、モノ−Ｔｒｉｓ、ピロリン酸、リン酸塩、プロピオン酸塩、カルボン酸、硫酸塩、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ＢＩＣＩＮＥ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、イミダゾール、アミノエタンスルホネートまたはその誘導体（ＴＥＳとしても知られるトリス（ヒドロキシメチル）−メチル−２−アミノエタンスルホネート、またはＭＥＳとしても知られる２−モルホリノエタンスルホン酸）、アミノプロパンスルホネートまたはその誘導体、シュウ酸、フマル酸、およびジエタノールアミン。上述の緩衝剤の塩には、とりわけ、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、および／またはカリウム塩が含まれてもよい。例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ヒスチジン、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウムが、本明細書に意図する緩衝剤の範囲内に含まれる。組成物のｐＨは、約３．５〜約９、場合によって約５〜約７、約５〜約６．５、約４．５〜約６．５、約４．５〜約５．５、約５．５〜約６．５、約５．７〜約６．５、約５．７〜約６．３、約５、または約６であってもよい。
【００５６】
緩衝剤濃度は、少なくとも約０．５ｍＭであり、そして約３００ｍＭを超えない。いくつかの態様において、緩衝剤濃度は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約５ｍＭ〜約１５ｍＭであってもよい。
【００５７】
本発明の組成物は、配合物を等張化するよう働きうるもの、他の可能性の中でも、塩、炭水化物、界面活性剤および／または糖を含んでもよい。典型的な塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウム塩が含まれ、例えば、とりわけ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムがある。少なくとも約１、５、または１０ｍＭであり、そして約３００、２００、１００、５０、または３０ｍＭを超えない濃度で、塩を用いてもよい。約５０ｍＭ〜約１７５ｍＭおよび約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度が意図される。
【００５８】
典型的な糖、多糖、および／または炭水化物には、とりわけ、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、糖酸、グルコース、フルクトース、マンノース、マルトース、マルトトリオース、ラクトース、ラクツロース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ラフィノース、とりわけ、デキストラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、またはセルロースなどの多糖が含まれる。こうした糖、多糖、および／または炭水化物を、例えば約０．００１％〜約２５％、約１％〜約２０％、または約１％〜約１０％を含む多様な濃度で用いてもよい。
【００５９】
典型的な界面活性剤には、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０を含むポリソルベート、ならびにポリアクスマー１８８を含むポリアクスマーが含まれる。これらを、約０．０００１％〜約０．１％、場合によって約０．００１％〜約０．０１％の濃度で用いてもよい。
【００６０】
抗体を含む薬剤組成物のｐＨおよび／または特定の緩衝剤は、抗体の安定性に影響を及ぼしうる。異なるｐＨおよび／または緩衝剤が、異なる抗体、あるいは異なる構造変異体または単一の抗体の構造変異体の組み合わせを安定化させうる。抗体の多様な物理的および生物学的特性を測定してもよい。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーは、抗体が、全長より小さい片に切断されているか、あるいは二量体またはより高次の凝集体に凝集しているかを決定可能である。逆相クロマトグラフィーもまた、抗体がより小さい断片に切断されているかどうかに関する情報を提供可能である。さらに、蛍光分光法によって、最大蛍光発光の波長（２つの波長間の比として表してもよい）を決定してもよい。この波長の変化は、抗体の二次または三次構造の変化を示しうる。ｐＨ変化は、異なる方式で、物理的構造の異なる側面に影響を及ぼしうる。さらに、生物学的活性に対する影響は、物理的構造に対する影響に対して、明らかな関連を示してもまたは示さなくてもよい。抗原への結合によって、例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて、細胞に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いて、生物学的活性を測定してもよい。
【００６１】
本質的にＦｉｓｈｗｉｌｄら， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４： ８４５−８５１に記載されるように、インターフェロン・ガンマへの特異的結合を測定してもよい。簡潔には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、約１〜２μｇ／ｍｌの濃度のＩＦＮ−γの溶液を約５０μｌ／ウェル用いて、マイクロタイタープレートをコーティングし、そしてＰＢＳ中の５％ニワトリ血清を用いてブロッキングしてもよい。次いで、プレートを、結合に関して試験中である抗体と、そして西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）・ペルオキシダーゼにコンジュゲート化した、試験中の抗体に結合するであろう抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ抗体は、ヒト全長ＩｇＧ１試験抗体に結合するであろう）と、連続してインキュベーションしてもよい。最後に、２，２’−アジノ−ビス［３−エチルベンゾチアゾリン（ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉａｚｏｌｅｎｅ）−６−スルホン酸］（ＡＢＴＳ）などの検出可能な西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ基質を添加し、そして４９０および４１５ｎｍで吸光度を測定してもよい。４９０ｎｍでの吸光度を４１５ｎｍのものから引く。生物学的活性、結合活性を有する抗体の量、または単量体型である抗体の量を最大にするｐＨおよび／または緩衝剤が望ましい。ＰＢＳ中の０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて、工程間で、プレートを徹底的に洗浄してもよい。抗原結合のためのこの周知のアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、ほぼいかなる抗原に対する結合に関しても試験可能である。
【００６２】
本発明の薬剤組成物は、液体、凍結乾燥、または凍結組成物であってもよい。液体または凍結組成物は、あらかじめ凍結乾燥されていてもまたはいなくてもよい。液体組成物は、凍結されていてもまたはいなくてもよい。
【００６３】
ＩＦＮ−γは、免疫機能のいくつかの側面の重要な陽性制御因子である。したがって、インターフェロン・ガンマの生物学的活性の阻害は、多様な自己免疫および／または炎症疾患に対抗する手段でありうる。生物学的活性を阻害可能な、多様なＩＦＮ−γ抗体が当該技術分野に知られる。米国特許出願第２００５／０００４３５３号および第２００３／００４９６４７号。こうした抗体は、多様な自己免疫および／または炎症疾患を治療する際に有用でありうる。例えば米国特許第６，０３６，９５６号、第６，３３３，０３２号、および第６，５５８，６６１号を参照されたい。
【００６４】
抗体を産生し、そして精製する多くの方法が当該技術分野に周知であり、そしてこれらのいずれを用いて、本発明の方法および組成物で用いる抗体を産生してもよい。典型的な方法は、例えば、米国特許出願第２００５／０００４３５３号に記載される。例えば、哺乳動物に抗原を接種し、そして血液から、抗原に対するポリクローナル抗体を採取することによって、本発明の方法および組成物で用いる抗体を産生してもよい。あるいは、接種した哺乳動物から脾臓細胞を採取し、そして不死化細胞に融合させて、モノクローナル抗体を産生しそして分泌するハイブリドーマ株を産生してもよい。抗原に結合する抗体を産生する株に関して、こうした株をスクリーニングしてもよい。さらに、抗体をコードする核酸を細菌中にクローニングしてもよい。いくつかの態様において、細菌によって抗体を産生させてもよい。あるいは、抗体をコードするＤＮＡを酵母、哺乳動物、植物、または昆虫細胞などの真核宿主細胞内に導入してもよいし、そして抗体を哺乳動物細胞によって産生させてもよい。細胞が哺乳動物細胞である場合、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓを含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫（例えばＮＳＯ、ＮＳ１）、ＰＣ１２、またはＷＩ３８細胞であってもよい。
【００６５】
タンパク質精製の技術分野に知られる多くの方法のいかなる１つまたは組み合わせによって、抗体を精製してもよい。例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ監修， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９０；Ｗｈｅｅｌｗｒｉｇｈｔ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｃａｌｅ ｕｐ ｏｆ Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， Ｈａｎｓｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９１；Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， 第３版， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １９９３；Ｇａｇｎｏｎ， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖａｌｉｄａｔｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， １９９６を参照されたい。１つの非常に一般的な抗体精製法は、プロテインＡクロマトグラフィーである。
【００６６】
本発明の組成物を、多様な障害の治療法として用いてもよい。例えば、インターフェロン・ガンマに結合する抗体を用いて、エリテマトーデス、ならびに多発性硬化症、関節リウマチ、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎を含む多様な自己免疫疾患、ならびにクローン病および潰瘍性結腸炎などの炎症性腸疾患を治療してもよい。米国特許第６，０３６，９５６号、第６，３３３，０３２号、および第６，５５８，６６１号を参照されたい。他の抗体の多くの他の使用が当該技術分野に知られ、例えば関節リウマチを治療するための抗ＴＮＦ受容体抗体の使用、または癌を治療するための抗ＥＧＦ受容体抗体の使用がある。抗体を用いて、例えば骨肉腫、膠芽細胞腫、神経膠腫、黒色腫、および髄膜腫、ならびに肺癌、乳癌、頭部および頸部癌、膀胱癌、卵巣癌、皮膚癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、腎細胞癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、および食道癌を含む癌を治療してもよい。本明細書において、「胃腸癌」は、胃癌、食道癌、膵臓癌、および結腸直腸癌を含む。本発明の方法を用いてやはり治療可能であるのは、血液学的癌である。
【００６７】
疾患の治療は、障害の少なくとも１つの症状の軽減、疾患の重症度の減少、あるいは治療している状態に続いて、ある程度の頻度で起こる、より深刻な疾患への進行の遅延または予防を含む。治療は、疾患が完全に治癒することを意味する必要はない。有用な療法剤は、疾患の重症度を減少させるか、疾患またはその治療に関連する症状（単数または複数）の重症度を減少させるか、あるいは治療している状態に続いて、ある程度の頻度で起こりうる、より深刻な疾患の開始を遅延させさえすればよい。本明細書に意味する際、当該技術分野に知られ、そして臨床設定において疾患重症度を評価するのに用いられる方法によって、疾患の重症度を評価してもよい。
【００６８】
いかなる適切な経路によって組成物を投与してもよい。これらを、例えば、皮下、静脈内、関節内、筋内、動脈内、腹腔内注射してもよいし、あるいは例えば関節または腫瘍などの体の罹患領域内に直接注射してもよい。注入によってまたはボーラス注射によって、組成物を投与してもよい。いくつかの態様において、鼻、直腸、胃、または膣投与など、粘膜を通じた吸収によって、あるいは吸入によって、組成物を投与してもよい。体腔に挿入される座薬として経皮投与してもよいし、または点眼剤として投与してもよい。あるいは、経口投与してもよい。
【００６９】
「療法的有効用量」、すなわち治療している状態を治療するのに有効であり得るいかなる投薬量、頻度、および期間で、本発明の組成物を投与してもよい。当業者は、これが、他の考慮の中でも、抗体の分子の性質、結合する抗原のｉｎ ｖｉｖｏ濃度、ならびに治療している障害の性質および重症度に応じることを理解するであろう。望ましい結果を達成するのに必要なだけ長く、治療を続けてもよい。他の可能な投薬量措置の中でも、単回投薬として、または１日多数回、毎日、１日おき、週２回、週３回、毎週、１週おき、毎月、１ヶ月おき、１０週ごと、および１２週ごとを含めて、周期的に投与される一連の投薬として、本発明の療法分子を投与してもよい。治療の周期性は、治療期間を通じて、一定であってもまたはなくてもよい。例えば、治療をまず、毎週間隔で行って、そして後に、１週おきに行ってもよい。数日、数週、数ヶ月、または数年の期間を有する治療が、本発明に含まれる。治療を中断し、そして次いで再開してもよい。最初の治療後、維持用量を投与してもよい。単独で、または他の治療、特にその疾患を治療するために通常投与される治療と組み合わせて、本発明の組成物を投与してもよい。
【００７０】
投薬量は、体重キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）として、または皮膚表面平方メートルあたりのミリグラム（ｍｇ／ｍ２）として、あるいは身長または体重に関わらず、固定した用量として、測定可能である。これらのすべては、当該技術分野において、標準的な投薬量単位である。ヒトの皮膚表面積は、標準的な公式を用いて、身長および体重から計算される。各投薬量は、例えば、約０．００１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜約５０ｍｇ／患者体重ｋｇ、約０．０１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜約５０ｍｇ／患者体重ｋｇ、約０．０２〜約５０ｍｇ／患者体重ｋｇであってもよい。場合によって、投薬量は、約０．０５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約１．０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【００７１】
当業者は、投与経路が、本発明の組成物の投薬量および濃度に影響を及ぼしうることを知っている。例えば、組成物を皮下投与する場合、投与可能な体積は、約５ｍｌ以下、場合によって約３、２、または１ｍｌ以下に限定されうる。したがって、組成物の濃度は、体積の限定によって影響を受ける可能性もある。他方で、組成物を静脈内注入する場合、より多くの体積を注射可能であり、そしてしたがって、組成物はより濃縮されていないことも可能である。
【００７２】
いくつかの態様において、本発明の組成物および方法は、抗体が、約５０ｍｇ／ｍｌ未満、場合によって約４５、４０、３５、３０、２５、１０、５、１、または０．１ｍｇ／ｍｌ未満またはそれに等しい濃度であることを必要とする。あるいは、またはさらに、本発明の組成物および方法は、抗体が、約０．０１、０．１、１、５、１０、または５０ｍｇ／ｍｌより大きいかまたはそれに等しい、場合によって、約７５ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、または２５０ｍｇ／ｍｌより大きいかまたはそれに等しい濃度であることを必要としうる。当業者は、特定の抗体のための特定の異なる投与経路には、より高いまたはより低い濃度の組成物が、より適切でありうることを知っている。さらに、抗体濃度は、抗体にはどの配合物が最適であるかに関して、影響を及ぼしうる。したがって、異なる濃度の同じ抗体に、異なる配合物が適している可能性もある。異なる抗体に必要な有効用量は、結合親和性、解離定数、および抗体が結合する抗原の存在量などの要因に応じて、非常に異なりうる。したがって、異なる濃度の抗体を有する組成物が、異なる場合で適切であろう。さらに、抗体を皮下投与する際、この方式で投与可能な容量は限定される。したがって、皮下投与される抗体組成物は、例えば静脈内注入によって投与される同じ抗体組成物より、より濃縮されていてもよい。
【００７３】
本発明を記載してきたが、以下の実施例を、例示の目的で提供し、そして限定の目的では提供しない。本明細書に引用するすべての参考文献は、その全体が本明細書に援用される。
【００７４】
実施例
実施例１：アイソフォームの精製
以下の実施例において、用いた抗体は、培養哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞）によって産生された２つの重鎖および２つの軽鎖を含む、ヒトＩＦＮ−γに対する全長ヒトＩｇＧ１抗体であり、そしてその重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１７および配列番号１８に開示する。重鎖アミノ酸配列は、ＶＨおよびＣＨ２領域中、それぞれ、配列番号１７のアミノ酸２８および２９７にＮ−グリカン部位を有した。本実施例において、分子あたり異なる数のシアル酸を有するアイソフォームを単離した。バルク抗体物質は、いくつかのカラム・クロマトグラフィー工程を用いて精製されており、そしてアイソフォームを含む多様な構造変異体が互いに分離されていない、ろ過精製バルク（本明細書において、ＦＰＢと称する）を指す。
【００７５】
培養哺乳動物細胞上清から、３つのカラム・クロマトグラフィー工程において、バルク抗体物質（ＦＰＢ）を精製し、そして電荷にしたがって分子を分離する弱陽イオン交換（ＣＥＸ）カラムに適用し、そして０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２を含有する可動相を用いて、溶出した。このカラムのプロフィールを図２に示す。異なる数のシアル酸残基を含有するアイソフォームを含む分画を収集し、そして濃縮した。同時に、分画を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５に緩衝液交換した。対応するＣＥＸ高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）プロフィールによって、最終濃縮アイソフォーム溶液各々の純度を決定し、該プロフィールは、主に、精製前のものに匹敵する溶出時間を持つ１つのＣＥＸピークを含有した。ＣＥＸ主ピークの面積を、２１５および２８０ｎｍ両方で検出される、いかなる少量のＣＥＸピークも含めたすべてのピーク下の総面積で割ることによって、純度パーセントを定量化した。各アイソフォーム溶液の典型的な純度は、９３％〜９６％であった。表２。各々の精製アイソフォーム溶液の吸光度を、２８０ｎｍで測定し、そして各アイソフォーム溶液の濃度を、ここから得た。表２（以下）は、純度パーセント、濃度、および各精製アイソフォーム溶液の総量、ならびに各アイソフォームが含む総ＦＰＢのパーセントを示す。この最後の数字は、陽イオン交換カラムで検出される各ピーク下の面積を、すべてのピーク下の面積の合計で割ることによって、計算される。表２に含めていないピーク−３、＋３、および＋４は、合わせて、総ＦＰＢの残った６％を構成する。
【００７６】
表２
【００７７】
【表２】
【００７８】
実施例２：異なるｐＨでのアイソフォームおよびＦＰＢの配合、ならびにその安定性の評価
以下の実験は、４℃および３７℃の両方で、多様なｐＨでの、精製アイソフォームおよびＦＰＢの安定性を比較する。ＦＰＢと一緒に、精製アイソフォームを各々、最終濃度１ｍｇ／ｍｌで、以下の緩衝液中に配合した：１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４；１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５；１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６；１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７；および１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８。すべての試料はまた、５％（ｗ／ｖ）ソルビトールも含有した。蒸発を防ぐために用いるｏ−リング・キャップ付きの無菌微量試験管中に等分する前に、０．２μｍ膜を通じてろ過することによって、すべての配合抗体溶液および対応するプラセボ、すなわち抗体を欠く配合溶液を滅菌した。各試料の総容量は、約３００μｌ〜３５０μｌであった。配合抗体溶液および対応するプラセボの１組を４℃でインキュベーションし、一方、別の組を３７℃でインキュベーションし、これらはどちらも静置条件下にあった。
【００７９】
他の技術の中でも、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、逆相ＨＰＬＣ、および蛍光分光法を用いて、０、２週、１ヶ月、および３ヶ月の時点で、各試料の生物物理的および生化学的安定性を評価した。分析超遠心分離（ＡＵＣ）を用いて、ＳＥＣによって検出されたＨＭＷ種のおよその分子量を決定した。ｐＨ５の配合物中で３ヶ月間インキュベーションしておいた試料に関して、生物活性を評価した。４℃および３７℃で貯蔵しておいた、各配合タンパク質溶液、ならびに各プラセボを、不溶性種および透明度に関して調べた。４℃または３７℃のいずれかで３ヵ月置いた後、抗体を含む試料および含まない試料両方が、すべて、無色透明を維持し、そして微粒子物質を含まなかった。
【００８０】
タンデムに連結した２つのＳＥＣカラムを用いると、ＳＥＣは、単量体（この場合、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する四量体抗体）、高分子量（ＨＭＷ）（例えば二量体および凝集体）、および低分子量（ＬＭＷ）種のレベルの定量化を提供した。各カラム試料は、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、２０μｇであった。多数の試料を流して、再現性を保証した。検出波長を、２１５および２８０ｎｍに設定した。ＳＥＣにおいて、大部分の試料では、大部分の物質は、単一の主要なピークとして溶出した。このピークは、単量体を含有する。この関連において、抗体がＩｇＧ抗体である場合、単量体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む四量体抗体であり、分子量は、およそ１５０，０００ダルトンであった。しかし、単量体主ピーク以外の４つの目立つピークが、３７℃でインキュベーションした配合物由来の試料の中で観察された。１０ｍＭリン酸ナトリウム、５％ソルビトール中、ｐＨ８に配合したＦＰＢおよび個々の異なる精製アイソフォームを含有し、３７℃で３ヶ月間貯蔵した試料のＳＥＣカラム・プロフィールを図３に示す。これらの試料はすべて、単量体を含有する顕著な主ピークを、そして２つのより高分子量のものに加えて、２つのより低分子量のピークを示した。２つの低分子量種をＬＭＷ１およびＬＭＷ２と称した。最高の高分子量種を凝集体と称し、そして次の溶出種を二量体（２つの四量体抗体を含む二量体を意味する）と称した。これらの命名は、分析超遠心分離（ＡＵＣ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した分子量に基づいた。ＡＵＣを用いて、非還元条件下で、ＳＥＣによって検出されたＨＭＷ種のおよその分子量を決定した。還元条件下での、すなわちジスルフィド結合が破壊される条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、ＨＭＷ種のサイズを評価した。
【００８１】
図４Ａ〜４Ｅは、各時点で、ＳＥＣによって測定されるような単量体として維持された総物質パーセントを示す。すべてのｐＨで、４℃でインキュベーションしたすべての試料において、ほとんどの物質は、少なくとも３ヶ月間、抗体単量体のままであった。しかし、３７℃で貯蔵した試料は、特にｐＨ５の試料中で、単量体種のかなりの損失を示した（図４Ｂ）。３７℃、ｐＨ５で貯蔵した、アイソフォーム・ピーク−２およびピーク０の物質は、他のいかなる試料よりも多くの単量体を損失し、そしてアイソフォーム・ピーク−２およびピーク０の試料は、試験した大部分の他のｐＨで、単量体パーセントに関して、より低いスコアの試料の中にあった。群として、そして個々に、３７℃、ｐＨ５の試料は、他のいかなるｐＨおよび温度でインキュベーションした試料より、はるかに多くの単量体損失を示した。群として、そして個々に、３７℃、ｐＨ６でインキュベーションした試料は、他のいかなる３７℃の試料よりも、より高い割合の単量体を含有した。図４Ａ〜４Ｅ。
【００８２】
これらの実験はまた、異なるアイソフォームおよびＦＰＢ間の相違も明らかにし、相違は、ｐＨ４および５の３７℃の試料で特に明らかであった。ＦＰＢは、一貫して、すべてのｐＨで、最高量の単量体を有する試料の中にあった。図４Ａ〜４Ｅ。ｐＨ４および５で、ＦＰＢは、いかなる精製アイソフォームより安定であり、アイソフォームの組み合わせは混合物を安定化することが示唆された。図４Ａ〜４Ｂ。ｐＨ７および８で、ＦＰＢは、一貫して、最も安定した精製アイソフォームと同程度に安定であり、そしてアイソフォーム−２、−１、＋１、および０より、より安定であり、これらのアイソフォームは、合わせて、ＦＰＢに含有される総抗体の約８５％を含む。図４Ｄ〜４Ｅ。ｐＨ６では、ＦＰＢおよびアイソフォーム＋２、＋１、および０は、ほぼ等しく安定であり、そしてアイソフォーム−１および−２は、わずかにより安定でなかった。図４Ｃ。ＦＰＢ中のアイソフォーム混合物中の各アイソフォームが、ＦＰＢにおいて、精製型における場合と同じ安定性を有するならば、ＦＰＢは、最も安定でないアイソフォームおよび最も安定なアイソフォームのものの間の安定性を有すると予期される。これは、いかなるｐＨでもあてはまらない。したがって、これらのデータは、ＦＰＢ中のアイソフォーム混合物が、安定化する影響を発揮することを意味すると解釈可能である。
【００８３】
図５は、高分子量種（水平線より上、ΣＨＭＷと表示）、すなわち二量体および凝集体、ならびに低分試料種（水平線より下、ΣＬＭＷと表示）、すなわちＬＭＷ１およびＬＭＷ２である、４℃（図５Ａ）および３７℃（図５Ｂ）でインキュベーションした試料の中のＳＥＣカラムプロフィール下の総面積の割合を示す。異なるｐＨで、４℃でインキュベーションした試料は同様である。にもかかわらず、４℃でインキュベーションしたＦＰＢ試料は、一貫して、すべてのｐＨに渡って、他の試料より低いレベルのＨＭＷ種を有し、そしてアイソフォーム・ピーク＋２試料は、一貫して、他の試料より高いレベルのＨＭＷ種を有する。３７℃でインキュベーションした試料は、互いに根本的に異なり、そしてｐＨ５の試料、特にアイソフォーム・ピーク０および−２の試料は、他のｐＨでインキュベーションした試料に比較して、実質的に非常に高い比率の二量体および凝集体を含有した。ｐＨ４、７、および８でインキュベーションした試料は、低い割合のＨＭＷ種を含有したが、ｐＨ６の試料は、３７℃の試料の中で、最低の割合のＨＭＷ種を含有した。さらに、３７℃でインキュベーションしたｐＨ７および８の試料は、他のｐＨの３７℃の試料より、わずかに多量のＬＭＷ１およびＬＭＷ２を有する。図５Ｂ。
【００８４】
図６は、３７℃でインキュベーションした試料の中で、二量体（図６Ａ）またはより高次の凝集体（図６Ｂ）であった、ＳＥＣカラム・プロフィール下の総面積の割合を示す。ｐＨ５でインキュベーションした試料は、他のｐＨでインキュベーションした試料より実質的により高い割合の二量体および凝集体を有した。ｐＨ５の試料の中で、アイソフォーム・ピーク−２およびピーク０の試料は、他の試料より高い割合の凝集体を含有した。ｐＨ４、７、および８でインキュベーションした試料は、低い割合の凝集体および二量体を含有したが、ｐＨ６の試料は、最低の割合の二量体および凝集体を含有した。したがって、図４〜６のデータは、３７℃でインキュベーションしたｐＨ６の試料が、他の３７℃の試料よりも少ない高分子量種を含有したことを示す。凝集体は、免疫原性であることが知られるため、凝集体の形成は、抗体配合物において、特に懸念される。Ｈｅｒｍｅｌｉｎｇら（２００４）， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２１（６）：８９７−９０３。
【００８５】
Ａｇｉｌａｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ−８カラム上で行う逆相ＨＰＬＣを用いて、抗体のフォールディングに関連しうる特性である疎水性に関連する、配合抗体の変化をさらに性質決定した。さらに、逆相クロマトグラフィーは、貯蔵中の抗体の切断を介して形成可能な親水性または疎水性ペプチドの形成を検出可能である。溶液ＢおよびＡの３０：７０の混合物中で、逆相カラムに装填し、そして３０％溶液Ｂから５０％溶液Ｂに進行する勾配中で溶出した。溶液Ａは、０．１２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、そして溶液Ｂは、６０％イソプロパノール、３０％アセトニトリル、０．１２％ＴＦＡであった。図７Ａおよび７Ｂは、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８、５％ソルビトール中、４℃（図７Ａ）および３７℃（図７Ｂ）で３ヶ月インキュベーションした試料からの逆相ＯＤ２１５カラム・プロフィール群を示す。３７℃の試料のカラム・プロフィール中の初期に、小さいピークが観察され、これはおそらく、抗体から切断された小さい親水性ペプチドである。このピークは、４℃の試料には存在しない。どちらの温度の物質の大部分も、単一ピークとして移動したが、ピークは、４℃の試料におけるより、３７℃の試料でより広い。図７。
【００８６】
図８は、主ピークの部分（図８Ａ）または初期に溶出する切断された種の部分（図８Ｂ）である、多様に示したｐＨでの３７℃の試料の逆相カラム・プロフィール下の総面積の割合を示す。試験した他のいかなるｐＨよりも、ｐＨ８で、より多くの切断された種が観察される。ｐＨ５〜ｐＨ７の試料は、最低の割合の切断種を有し、そして最高の割合の主ピーク中の物質を有する。アイソフォームおよびＦＰＢ間の相違は、ｐＨ８で最大である。最多の凝集体を生じたアイソフォーム・ピーク−２および０はまた、ｐＨ８で最多の親水性クリップを有する。ＦＰＢは、ｐＨ８で、アイソフォーム・ピーク−２および０より少ないクリップを有するが、アイソフォーム・ピーク−１、＋１、および＋２より多い。
【００８７】
蛍光分光法によって、各時点での試料の三次構造および二次構造の変化を評価した。０．１８ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで、対応する配合緩衝液で試料を希釈した。２３℃の試料チャンバーを用い、発光スキャンモードで操作する、Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの二元発光ビーム蛍光分光計から、固有の蛍光測定値を得た。励起波長２８０ｎｍで、３００〜４２５ｎｍの間、発光スキャンを行って、チロシンおよびトリプトファン残基による蛍光を評価した。励起波長２９３ｎｍでもまた発光スキャンを行い、主にトリプトファン残基による蛍光を評価した。
【００８８】
結果は、ゼロ時点のすべての試料に関して、３ヶ月の貯蔵後の、４℃のすべての試料に関して、そしてｐＨ６、７、および８の３７℃の試料に関して、最大蛍光発光の波長が３２６ｎｍであることを示した。しかし、ｐＨ４および５の３７℃の試料に関しては、最大蛍光発光の波長は３３８ｎｍであった。生データは提示しない。これらのデータを、３２６ｎｍおよび３３８ｎｍの発光の間の比として、図９に示す。結果は、３７℃でインキュベーションしたｐＨ４およびｐＨ５の試料では、３２６ｎｍ／３２８ｎｍの比が、約１以下であり、３７℃のｐＨ６、７、または８の試料におけるように、明らかに１より大きくはないように、発光スペクトルがシフトしたことを示す。データは、３７℃でインキュベーションしたｐＨ４および５の試料中の抗体の三次構造の変化を示す。検出された蛍光は、トリプトファンおよびチロシン残基によるため、データはまた、３７℃でインキュベーションしたｐＨ４および５の抗体試料において、これらのアミノ酸のより高い曝露も示す。
【００８９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に基づくアッセイを用いて、生物学的活性を評価した。このアッセイは、Ａ５４９肺細胞を利用する。Ａ５４９細胞の増殖は、ＩＦＮ−γによって阻害可能である。該アッセイは、細胞をＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥＴＭ（ＡｃｃｕＭｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．、イリノイ州シカゴ）で染色することによって、増殖を測定する。ＩＦＮ−γによる増殖の阻害を半分救済するのに必要な抗体の濃度（ＩＣ５０）を表３に示す。このアッセイは、本明細書に援用される米国特許出願第２００５／０００４３５３号により詳細に説明される。表３に示す温度で、ｐＨ５で３ヶ月間貯蔵した精製アイソフォームおよびＦＰＢの試料を試験した。
【００９０】
表３
【００９１】
【表３】
【００９２】
これらのデータは、上述の試料の物理的特性、およびここで測定するような生物学的活性の間に明らかな関連がないことを示す。３７℃、ｐＨ５で形成される二量体および凝集体がかなりの量であることを考慮すると、これらのデータは、二量体および凝集体の形成が、ここで測定するような生物学的機能に影響を及ぼさないことを示唆するようである。しかし、他の実験において、希釈が、ｐＨ５の試料に存在する可溶性凝集体および二量体の形成を少なくとも部分的に逆転させうることが立証されている。データ未提示。この実験を行うために、試料を希釈することから、この実験から、生物学的活性に対する、凝集体および二量体形成の影響に関していかなる結論付けを行うことも不可能である。要約すると、すべての試料は、少なくともここで試験した生物学的活性の側面において、生物学的に活性である。試料の免疫原性は評価しない。
【００９３】
ＳＥＣ、逆相、および蛍光発光データを合わせて解釈すると、結果は、ｐＨ６の貯蔵条件が、試験した他の条件よりも抗体の構造を保持することを示唆する。特に、蛍光発光データは、ｐＨ６、７、および８の条件が、ｐＨ４および５の条件に匹敵し、そしてこれらより優れていることを示す。逆相データは、ｐＨ５、６、および７の条件が、ｐＨ４および８の条件に匹敵し、そしてこれらより優れていることを示した。最後に、ＳＥＣのデータは、ｐＨ６の条件が、３７℃でのＦＰＢおよびすべての個々のアイソフォームに関して、最も好ましいことを示し、これにｐＨ４、７、および８の条件が続いた。ｐＨ５の条件において、凝集体および二量体の大部分が、３７℃で観察された。４℃でほぼ２年後、ここに記載する各配合物中のＦＰＢ試料のｐＨを測定すると、各配合物に関して、ｐＨが不変であることが示された。ｐＨ６、７、および８で配合し、そして３７℃で３ヶ月インキュベーションし、そしてその後、４℃でほぼ２１ヶ月貯蔵した試料もまた、不変のｐＨを有し、一方、ｐＨ４および５で配合して、同様に処理した試料は、ほぼ１ｐＨ単位の増加を受けた。データ未提示。ｐＨ４および５で配合した試料のｐＨの増加は、タンパク質分解および／または用いた緩衝剤の特定のロットの何らかの特性による可能性もある。
【００９４】
データはまた、ＦＰＢが、試験した各条件において、最も安定な個々のアイソフォームと同程度にまたはより安定であることも示す。図４Ａ〜４Ｅを参照されたい。個々のアイソフォームが、単離中で、そしてＦＰＢの構成要素としてインキュベーションされた際、同一の安定性を有するならば、ＦＰＢは、最も安定なアイソフォームおよび最も安定しないアイソフォームの間の中間の安定性であろうと予期される。これが当てはまらないという事実は、アイソフォームの組み合わせが、組成物を安定化させうることを示唆する。
【００９５】
実施例３：ソルビトールを含み、そして含まず、ある範囲のｐＨの多様な緩衝剤を用いた配合物
以下の実験を行って、上述のように、実施例１に記載する抗体の多様なアイソフォームを含有するＦＰＢを含有する組成物の安定性に対する、ｐＨの影響、および用いた特定の緩衝剤の影響の間を区別した。さらに、ソルビトールを含む試料および含まない試料を比較して、安定性に対するソルビトールの影響を決定した。１０ｍＭクエン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはヒスチジン中、４、５、６、７、または８のターゲットｐＨで、およそ１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に各試料を配合した。最終濃度および可能な限りターゲットｐＨに近いｐＨで、抗体以外のすべての構成要素を含む配合物溶液を作製した。濃縮溶液から、直接、配合溶液になるように、抗体調製物を、およそ２９倍希釈し、これは、いくつかの場合、ｐＨを実質的に変化させた。これは、試験したいくつかのｐＨが、いくつかの緩衝剤の緩衝範囲内でなかったため、驚くべきことではない。表４は、試料を記載し、そして抗体添加後の最終配合物の実際のｐＨを示す。ＮＡＮＯＤＲＯＰＴＭ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国デラウェア州ウィルミントン）を用いて、２８０ナノメートルの光学密度（ＯＤ２８０）を測定し、そして１．５μｇ／ｍｌ／ＯＤ２８０の吸光係数を用いて、タンパク質濃度を計算することによって、各完全配合物のタンパク質濃度を測定した。
【００９６】
４℃または３７℃の静置条件下で、試料をインキュベーションした。蒸発を防ぐために用いるｏ−リング・キャップ付きの無菌微量試験管中に等分する前に、０．２μｍ膜を通じてろ過することによって、すべての配合抗体溶液および対応するプラセボ、すなわち抗体を欠く配合溶液を滅菌した。各試料の総体積は、約６５０μｌであった。
【００９７】
表４：試料の説明
【００９８】
【表４Ａ】
【００９９】
【表４Ｂ】
【０１００】
実施例２に説明するように、ＳＥＣを用いて、貯蔵０、４、８、および１２週間後、安定性を評価した。図１３は、ソルビトールを含み（左のパネル）そして含まず（右のパネル）、ゼロ時点で、ＳＥＣによって測定するような、単量体パーセントを示す。図１３および続く図において、列挙するｐＨは、ターゲットｐＨであり、上に説明するように、いくつかの場合では、実際のｐＨ（表４に列挙するもの）とは幾分異なる。配合物のｐＨがターゲットｐＨから実質的に逸脱している場合のデータ点（すべてを含むターゲットｐＨ４以外）を図から省く。ソルビトールを含む配合物および含まない配合物のすべては、ゼロ時点では、同程度の単量体パーセント（およそ９８％）を有した。図１３。図１４は、ソルビトールの存在下（左のパネル）および非存在下（右のパネル）での、３７℃で１２週間後の単量体パーセントを示す。４のターゲットｐＨの試料は、一般的に、約９５％以下の単量体を有し、５のターゲットｐＨのクエン酸ナトリウム試料、ならびに７および８のターゲットｐＨのリン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム試料、ならびにターゲットｐＨ８のソルビトールを含まないヒスチジン試料も同様であった。ソルビトールを含む試料および含まない試料のデータは、一般的に同程度であるが、ソルビトールは、いくつかの例で保護効果を示した。３７℃で１２週間後、ソルビトールを加えた、ヒスチジン、酢酸ナトリウム、およびクエン酸ナトリウム中の最高の試料は、９７％に近い単量体を有し、一方、ソルビトールを加えたリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム中の最高の試料は、わずかにより少ない単量体パーセントを有した。図１４。４℃でインキュベーションした、試験した緩衝剤のいずれか１つに加えてソルビトールを含む試料は、１２週間後、単量体パーセントに本質的にまったく変化を示さなかった。データ未提示。
【０１０１】
ソルビトールを含みまたは含まず、ヒスチジンまたは酢酸ナトリウムを含有する試料に関して、ｐＨ６の試料が、３７℃で１２週間後、同じ緩衝剤中、同じ試料の間で、最高の単量体パーセントを有した。図１５および１６。ソルビトールとともに、リン酸カリウムを含有する試料に関しても同じことが当てはまった。図１８。残りの試料において（ソルビトールを含む、および含まない、クエン酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウム、ならびにソルビトールを含まないリン酸カリウム）、３７℃で１２週間後、ｐＨ６の試料が、最高で、そしてほぼ等しい単量体パーセントを持つ２つの試料の１つであった。図１７〜１９。したがって、ｐＨ６は、用いた緩衝剤に関わらず、抗体を安定化させるために最高のｐＨまたは２つの最高のｐＨの１つのいずれかであった。
【０１０２】
図２０は、３７℃で１２週間後の、ソルビトールを含み、そして含まずに試験した、緩衝剤およびｐＨのすべてに関する単量体パーセントを示す。これは、試験した緩衝剤すべてに関する単量体パーセントが、ｐＨ６では非常に近いが、他のｐＨではそうではなかったため、抗体の安定性が、約ｐＨ６以外のｐＨでは、用いた緩衝剤にはるかにより依存することを示す。これはまた、特にｐＨ８の試料において、ソルビトールの防御効果も明らかにする。しかし、異なる緩衝剤が異なるｐＨ範囲に渡って有効であった。例えば、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムは、ターゲットｐＨ５および６で最も有効であったが、ターゲットｐＨ７および８では、ヒスチジンおよびクエン酸よりもはるかに低い単量体パーセントを有した。ヒスチジンはターゲットｐＨ５〜７で有効であったが、ターゲットｐＨ６で最適であった。酢酸ナトリウムはターゲットｐＨ５〜６でよく働き、そしてクエン酸ナトリウムは、ターゲットｐＨ６〜７で最も有効であった。また、クエン酸ナトリウムは、他の緩衝剤に比較して、ターゲットｐＨ４で非常に低い単量体パーセントを有し、これは、クエン酸ナトリウム試料の実際のｐＨが、ターゲットｐＨ４の他のいずれの試料よりも、ｐＨ４により近い（そしてより酸性である）という事実を反映している可能性もある。クエン酸ナトリウムはまた、試験した剤すべてが、最大でもｐＨ５の０．２３ｐＨ単位以内のｐＨを有したにもかかわらず、ｐＨ５で試験したすべての緩衝剤のうち、最低の単量体パーセントも有した。
【０１０３】
図２１は、ソルビトールを含む試料および含まない試料に関して、ＳＥＣ（実施例２に説明するようなもの）によって決定した際の、低分子量種（ＬＭＷ１およびＬＭＷ２）のパーセントを示す。図２０と組み合わせて考えると、図２１は、単量体損失の大部分が、ソルビトールを含む試料および含まない試料中の低分子量種の形成によるものであることを示す。
【０１０４】
図２２は、３７℃で１２週間静置インキュベーションした後、ＳＥＣによって測定した際に二量体である総試料のパーセントを示す。ｐＨ７または８でインキュベーションした試料、特にリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム中の試料は、より高い二量体パーセントを有した。ソルビトールは、ｐＨ８で、ヒスチジン試料に対してわずかな防御効果を有した。したがって、二量体形成は、ｐＨ７または８のリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム中の試料で見られる単量体パーセントの減少のある程度を説明する。
【０１０５】
総合すると、これらのデータは、抗体が、多様な緩衝剤中、約ｐＨ６で比較的安定であることを示す。ソルビトールは、いくつかの条件下で、安定化効果を有する。３７℃でインキュベーションした試料中、単量体パーセントの損失の大部分は、低分子量種の形成のためであったが、ｐＨ７および８のいくつかの試料では、二量体形成もまた原因であった。３７℃で１２週間貯蔵した後のソルビトールを含むおよび含まないすべての試料のｐＨの測定は、ゼロ時点で測定したものとｐＨの変化を示さなかった。データ未提示。
【０１０６】
実施例４：安定性に関する精製アイソフォーム混合物の試験
異なる精製アイソフォーム（実施例１に記載）が異なる安定性を有することを、実施例２に示し、そしてＦＰＢ（すべてのアイソフォームを含有する）は、一般的に、精製アイソフォームのうち、最も安定なものと同程度に安定であった。この観察のありうる説明は、ＦＰＢ試料に存在するいくつかの要素が、個々のアイソフォームの単離中に取り除かれることである。これが正しいならば、ＦＰＢにおいて見られるものとほぼ同じ比のアイソフォーム混合物（以下の表５に記載するＩｓｏＢｕｌｋ混合物のようなもの）が、ＦＰＢより安定でないことが予期される。
【０１０７】
以下に記載する実験において、安定性に関して、精製アイソフォームの多様な組み合わせを試験した。さらに、ＦＰＢ（ＩｓｏＢｕｌｋと称する）に存在するのとほぼ同じ比のアイソフォーム−２、−１、０、１、および２の混合物を試験して、こうした混合物がＦＰＢと同様に振舞うかどうかを決定した。ＦＰＢは、ＩｓｏＢｕｌｋを作製するのに用いたものに加えて、３種、すなわち３、４、および−３を少量含有する。図２を参照されたい。表５は、試料を説明する。
【０１０８】
表５：試料の説明
【０１０９】
【表５Ａ】
【０１１０】
【表５Ｂ】
【０１１１】
図２３は、選択したｐＨで優れた緩衝能を持つ緩衝剤を加えた５％ソルビトールを含む配合物中で、４℃または３７℃で１２週間インキュベーションした後の、ｐＨ４〜８のＦＰＢ（左のパネル）とＩｓｏＢｕｌｋ（右のパネル）の比較を示す。実施例２に記載するように、ＳＥＣによって単量体パーセントを測定した。酢酸ナトリウムは、ｐＨ４および５で用いた緩衝剤であり、ｐＨ６ではヒスチジンを用い、そしてｐＨ７および８ではリン酸ナトリウムを用いた。４℃でインキュベーションしたＦＰＢおよびＩｓｏＢｕｌｋ試料（図２３、黒塗りの円）はどちらも、ゼロ時点の試料と実質的に同じであった。データ未提示。４℃でインキュベーションしたＩｓｏＢｕｌｋ試料はすべて、４℃でインキュベーションしたＦＰＢ試料に関して観察されたもの（約９９％）に比較して、わずかにより低い単量体パーセント（約９８％）を有した。３７℃でインキュベーションしたＦＰＢ試料は、ｐＨ４、５、および６で、ＩｓｏＢｕｌｋ試料よりわずかにより高い単量体パーセントを有し、そしてｐＨ７および８で顕著により高い単量体パーセントを有した。ＦＰＢ対ＩｓｏＢｕｌｋに関して、出発単量体パーセントおよびｐＨ４、５、または６、３７℃で１２週間後の単量体パーセントの間の相違は、ほぼ同じであった。したがって、ＦＰＢおよびＩｓｏＢｕｌｋは、ｐＨ４、５、または６でほぼ同等に安定である。このデータはまた、ＩｓｏＢｕｌｋが、ｐＨ７および８で、ＦＰＢより安定でないことも示す。したがって、少なくともｐＨ４〜６では、図４で観察された結果は、アイソフォーム精製中に、ＦＰＢ中の安定化要素が除去されたことによっては説明不能である。こうした説明は、ｐＨ７および８でのＦＰＢに比較したＩｓｏＢｕｌｋの安定性減少を潜在的に説明しうる。
【０１１２】
図２４および２５は、３７℃で８週間静置インキュベーションした後の、精製アイソフォームまたはアイソフォーム混合物を含有する個々の試料をＳＥＣ（上述のようなもの）によって測定した際の、純単量体パーセント損失を示す。５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５（図２４）中、または５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジンｐＨ６（図２５）中のいずれかに、試料を配合した。単一の精製アイソフォームを含有する試料は、単量体パーセントの最大の損失を有し、その後、２つの精製アイソフォームの混合物を含有する試料が続いた。これは、試験した配合物両方に当てはまった。図２４および２５。３以上のアイソフォーム混合物を含有する試料は、単量体パーセントにおけるの同程度の損失を有し、これは一般的に、単一アイソフォームまたは２つのアイソフォームの混合物に関して観察されるものより低かった。試験した２つの混合物の１つ（アイソフォーム２および−２）は、３以上のアイソフォームの混合物に匹敵した。これらのデータは、３以上のアイソフォームを含有する混合物が、より少ないアイソフォームを含有する混合物に比較して、安定化されていることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１Ａ〜１Ｇは、Ｎ−グリカン・コア構造（１Ａ）、ガラクトースを加えたＮ−アセチルグルコサミン（ＬａｃＮＡｃ）単位を１より多く含む枝がない、二シアル化二分岐Ｎ−グリカン（１Ｂ）、二シアル化三分岐Ｎ−グリカン（１Ｃ）、２つのＬａｃＮＡｃ単位を含む１つの枝を含む、二シアル化三分岐Ｎ−グリカン（１Ｄ）、四シアル化四分岐Ｎ−グリカン（１Ｅ）、２つのＬａｃＮＡｃ単位を含む１つの枝を含む、三シアル化四分岐Ｎ−グリカン（１Ｆ）、および２つのＬａｃＮＡｃ単位を含む２つの枝を含む、三シアル化四分岐Ｎ−グリカン（１Ｇ）の構造を示す図である。記号は、以下の糖残基を表す：黒塗りの正方形、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；白抜きの円、マンノース（Ｍａｎ）；白抜きのひし形、ガラクトース（Ｇａｌ）；黒塗りのひし形、シアル酸（Ｓｉａ）；および白抜きの三角形、フコース（Ｆｕｃ）。
【図２】図２は、重鎖可変領域中にＮ−グリカン部位を有する抗体の精製調製物を装填しておいた、陽イオン交換カラムからの、２８０ナノメートル（ＯＤ２８０）での光学密度を示す、溶出プロフィールを示す。少なくとも８つの異なる荷電変異体またはアイソフォームが検出された。
【図３】図３は、３７℃で３ヶ月貯蔵した後の、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８、５％ソルビトール中に配合した試料からの、一組の重ね合わせサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＯＤ２１５カラム・プロフィールを示す。
【図４Ａ】時間、貯蔵温度、およびｐＨの関数としての、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢに関する、非変性ＳＥＣによって検出した際の単量体型である総抗体のパーセントを示す。各パネルは、４℃（黒塗り記号）および３７℃（白抜き記号）両方の、ｐＨ４（図４Ａ）、ｐＨ５（図４Ｂ）、ｐＨ６（図４Ｃ）、ｐＨ７（図４Ｄ）、およびｐＨ８（図４Ｅ）に関する、０〜３ヶ月の時点での単量体パーセントを示す。試料を以下のように配合した：ｐＨ４、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ５、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ６、５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジン；ならびにｐＨ７および８、５％ソルビトール、１０ｍＭリン酸ナトリウム。
【図４Ｂ】時間、貯蔵温度、およびｐＨの関数としての、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢに関する、非変性ＳＥＣによって検出した際の単量体型である総抗体のパーセントを示す。各パネルは、４℃（黒塗り記号）および３７℃（白抜き記号）両方の、ｐＨ４（図４Ａ）、ｐＨ５（図４Ｂ）、ｐＨ６（図４Ｃ）、ｐＨ７（図４Ｄ）、およびｐＨ８（図４Ｅ）に関する、０〜３ヶ月の時点での単量体パーセントを示す。試料を以下のように配合した：ｐＨ４、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ５、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ６、５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジン；ならびにｐＨ７および８、５％ソルビトール、１０ｍＭリン酸ナトリウム。
【図４Ｃ】時間、貯蔵温度、およびｐＨの関数としての、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢに関する、非変性ＳＥＣによって検出した際の単量体型である総抗体のパーセントを示す。各パネルは、４℃（黒塗り記号）および３７℃（白抜き記号）両方の、ｐＨ４（図４Ａ）、ｐＨ５（図４Ｂ）、ｐＨ６（図４Ｃ）、ｐＨ７（図４Ｄ）、およびｐＨ８（図４Ｅ）に関する、０〜３ヶ月の時点での単量体パーセントを示す。試料を以下のように配合した：ｐＨ４、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ５、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ６、５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジン；ならびにｐＨ７および８、５％ソルビトール、１０ｍＭリン酸ナトリウム。
【図４Ｄ】時間、貯蔵温度、およびｐＨの関数としての、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢに関する、非変性ＳＥＣによって検出した際の単量体型である総抗体のパーセントを示す。各パネルは、４℃（黒塗り記号）および３７℃（白抜き記号）両方の、ｐＨ４（図４Ａ）、ｐＨ５（図４Ｂ）、ｐＨ６（図４Ｃ）、ｐＨ７（図４Ｄ）、およびｐＨ８（図４Ｅ）に関する、０〜３ヶ月の時点での単量体パーセントを示す。試料を以下のように配合した：ｐＨ４、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ５、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ６、５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジン；ならびにｐＨ７および８、５％ソルビトール、１０ｍＭリン酸ナトリウム。
【図４Ｅ】時間、貯蔵温度、およびｐＨの関数としての、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢに関する、非変性ＳＥＣによって検出した際の単量体型である総抗体のパーセントを示す。各パネルは、４℃（黒塗り記号）および３７℃（白抜き記号）両方の、ｐＨ４（図４Ａ）、ｐＨ５（図４Ｂ）、ｐＨ６（図４Ｃ）、ｐＨ７（図４Ｄ）、およびｐＨ８（図４Ｅ）に関する、０〜３ヶ月の時点での単量体パーセントを示す。試料を以下のように配合した：ｐＨ４、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ５、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ６、５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジン；ならびにｐＨ７および８、５％ソルビトール、１０ｍＭリン酸ナトリウム。
【図５Ａ】図５は、示すような多様なｐＨで、４℃（図５Ａ）および３７℃（図５Ｂ）での３ヶ月の貯蔵後に、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢ中で形成されている低分子量および高分子量（それぞれ、ＬＭＷおよびＨＭＷ）種のパーセントを示す。ＬＭＷおよびＨＭＷ種をＳＥＣによって検出した。図４におけるように試料を配合した。
【図５Ｂ】図５は、示すような多様なｐＨで、４℃（図５Ａ）および３７℃（図５Ｂ）での３ヶ月の貯蔵後に、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢ中で形成されている低分子量および高分子量（それぞれ、ＬＭＷおよびＨＭＷ）種のパーセントを示す。ＬＭＷおよびＨＭＷ種をＳＥＣによって検出した。図４におけるように試料を配合した。
【図６Ａ】図６は、示すような多様なｐＨで、３７℃での３ヶ月のインキュベーション後に、ＳＥＣによって検出した際の、二量体（図６Ａ）および凝集体（図６Ｂ）であった、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢ由来の物質中の抗体総量の比率を示す。図４におけるように試料を配合した。
【図６Ｂ】図６は、示すような多様なｐＨで、３７℃での３ヶ月のインキュベーション後に、ＳＥＣによって検出した際の、二量体（図６Ａ）および凝集体（図６Ｂ）であった、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢ由来の物質中の抗体総量の比率を示す。図４におけるように試料を配合した。
【図７Ａ】図７は、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５％ソルビトールを含有する配合物中の、ｐＨ８での４℃（図７Ａ）または３７℃（図７Ｂ）で３ヶ月貯蔵した、図中に示すような、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢ由来の物質の重ね合わせＯＤ２１５逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）カラム・プロフィールを示す。
【図７Ｂ】図７は、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５％ソルビトールを含有する配合物中の、ｐＨ８での４℃（図７Ａ）または３７℃（図７Ｂ）で３ヶ月貯蔵した、図中に示すような、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢ由来の物質の重ね合わせＯＤ２１５逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）カラム・プロフィールを示す。
【図８Ａ】図８は、示すような多様なｐＨで、３７℃でのインキュベーションの３ヶ月後の、図中に示すような、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢにおける、主ピーク中（図８Ａ）および親水性クリップ種中（図８Ｂ）の総抗体パーセントに対するｐＨの影響を示す。検出はＲＰＣによる。図４におけるように試料を配合した。
【図８Ｂ】図８は、示すような多様なｐＨで、３７℃でのインキュベーションの３ヶ月後の、図中に示すような、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢにおける、主ピーク中（図８Ａ）および親水性クリップ種中（図８Ｂ）の総抗体パーセントに対するｐＨの影響を示す。検出はＲＰＣによる。図４におけるように試料を配合した。
【図９】図９は、多様なｐＨで、３７℃でのインキュベーションの３ヶ月後の、図中に示すような、ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢの配合物に関する、３３８ｎｍでのものに比較した、発光波長３２６ｎｍでの固有の蛍光強度の比を示す。励起波長は２８０ｎｍである。図４におけるように試料を配合した。
【図１０】図１０は、ヒトＶＨセグメント５−５１によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１は、ヒトＶＨセグメント５−ａによってコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２は、ヒトＶκセグメントＶＫＩＩＩ／Ａ２７によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１３】図１３は、０時点で、５％ソルビトールを含む（左のパネル）または含まない（右のパネル）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム
【０１１４】
【化１】
【０１１５】
、ヒスチジン
【０１１６】
【化２】
【０１１７】
、リン酸カリウム
【０１１８】
【化３】
【０１１９】
、リン酸ナトリウム
【０１２０】
【化４】
【０１２１】
、またはクエン酸ナトリウム
【０１２２】
【化５】
【０１２３】
中の試料においてＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。ターゲットｐＨ４のすべての試料を示すが、いくつかはｐＨ４ではない。実施例３、表４を参照されたい。ターゲットｐＨから０．４ｐＨ単位以内にないすべての他の試料を省く。
【図１４】図１４は、５％ソルビトールを含む（左のパネル）または含まない（右のパネル）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム
【０１２４】
【化６】
【０１２５】
、ヒスチジン
【０１２６】
【化７】
【０１２７】
、リン酸カリウム
【０１２８】
【化８】
【０１２９】
、リン酸ナトリウム
【０１３０】
【化９】
【０１３１】
、またはクエン酸ナトリウム
【０１３２】
【化１０】
【０１３３】
中で３７℃で１２週間静置した後の試料において、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。ターゲットｐＨ４での試料以外、ターゲットｐＨから０．４ｐＨ単位以内にないすべての他の試料を省く。
【図１５】図１５は、５％ソルビトールを含む（左のパネル）または含まない（右のパネル）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム中の試料における、３７℃での、時間の関数としての、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。図中の試料名は表４（実施例３）におけるとおりである。ターゲットｐＨの０．４ｐＨ単位以内にない試料を省く。
【図１６】図１６は、５％ソルビトールを含む（左のパネル）または含まない（右のパネル）、１０ｍＭヒスチジン中の試料における、３７℃での、時間の関数としての、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。図中の試料名は表４（実施例３）におけるとおりである。
【図１７】図１７は、５％ソルビトールを含む（左のパネル）および含まない（右のパネル）、１０ｍＭクエン酸ナトリウム中の試料における、３７℃での、時間の関数としての、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。図中の試料名は表４（実施例３）におけるとおりである。ターゲットｐＨの０．４ｐＨ単位以内にない試料を省く。
【図１８】図１８は、５％ソルビトールを含む（左のパネル）および含まない（右のパネル）、１０ｍＭリン酸カリウム中の試料における、３７℃での、時間の関数としての、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。図中の試料名は表４（実施例３）におけるとおりである。
【図１９】図１９は、５％ソルビトールを含む（左のパネル）および含まない（右のパネル）、１０ｍＭリン酸ナトリウム中の試料における、３７℃での、時間の関数としての、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。図中の試料名は表４（実施例３）におけるとおりである。
【図２０】図２０は、ターゲットｐＨの関数としての、３７℃での静置インキュベーション１２週間後のＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。ターゲットｐＨ４のすべての試料を示すが、ターゲットｐＨから０．４ｐＨ単位より大きいすべての他の試料を省く。左のパネル中の試料は５％ソルビトールを含有し、そして右のパネル中の試料はソルビトールを含有しない。１０ｍＭの濃度で存在する異なる緩衝剤を、以下のように示す：
【０１３４】
【化１１】
【０１３５】
、酢酸ナトリウム；
【０１３６】
【化１２】
【０１３７】
、ヒスチジン；
【０１３８】
【化１３】
【０１３９】
、リン酸カリウム；
【０１４０】
【化１４】
【０１４１】
、リン酸ナトリウム；および
【０１４２】
【化１５】
【０１４３】
、クエン酸ナトリウム。ｙ軸のスケールは、左のパネルおよび右のパネルで異なる。
【図２１】図２１は、５％ソルビトールを含む試料（左のパネル）および含まない試料（右のパネル）中の、ターゲットｐＨの関数としての、３７℃での静置インキュベーション１２週間後の、ＳＥＣによって測定されるような、低分子量種、ＬＭＷ１およびＬＭＷ２のパーセントを示す。１０ｍＭの濃度で存在する異なる緩衝剤を、図２０の説明に記載するように示す。ターゲットｐＨから０．４ｐＨ単位より大きい、ターゲットｐＨ４のもの以外の試料を省く。
【図２２】図２２は、５％ソルビトールを含む試料（左のパネル）および含まない試料（右のパネル）中の、ターゲットｐＨの関数としての、３７℃での静置インキュベーション１２週間後の、ＳＥＣによって測定されるような、二量体パーセントを示す。１０ｍＭの濃度で存在する異なる緩衝剤を、以下のように示す：
【０１４４】
【化１６】
【０１４５】
、酢酸ナトリウム；
【０１４６】
【化１７】
【０１４７】
、ヒスチジン；
【０１４８】
【化１８】
【０１４９】
、リン酸カリウム；
【０１５０】
【化１９】
【０１５１】
、リン酸ナトリウム；および
【０１５２】
【化２０】
【０１５３】
、クエン酸ナトリウム。ターゲットｐＨから０．４ｐＨ単位より大きい、ターゲットｐＨ４のもの以外の試料を省く。図の下部に沿った線は、多様な試料の０時点での二量体パーセントに相当し、これらはすべて非常に類似であった。
【図２３】図２３は、４℃（黒塗りの円）または３７℃（白抜きの円）のいずれかで１２週間静置インキュベーションした後の、ＦＰＢ（左のパネル）またはＩｓｏＢｕｌｋ混合物（右のパネル、実施例４および表５に詳細に記載する）のいずれかを含有する試料に関する、ターゲットｐＨの関数としての、ＳＥＣによって測定されるような単量体パーセントを示す。すべての試料は、ソルビトールを含有した。ターゲットｐＨは、実際のｐＨに非常に近かった。ｐＨ４および５の試料を１０ｍＭ酢酸ナトリウム中で配合した。ｐＨ６の試料を１０ｍＭヒスチジン中で配合した。ｐＨ７および８の試料を１０ｍＭリン酸ナトリウム中で配合した。
【図２４】図２４は、示すように、単一精製アイソフォーム、あるいは２、３、４、５、または８の異なるアイソフォームの混合物のいずれかを含有する個々の試料に関する、３７℃での静置インキュベーション８週間後の、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントの純損失を示す。すべての試料を、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中に配合する。単一精製アイソフォームに関するデータは、実施例２に記載する実験に由来する。アイソフォーム混合物に関するデータは、実施例３および４に記載する実験に由来する。１つまたは２つのアイソフォームを含有する試料に関するデータ点の隣の数字は、どのアイソフォームが試料中に含まれるかを示す。３、４、および５つのアイソフォームを含有する試料は、それぞれ、Ａ５Ｓ（−１、−２、−３）、Ａ５Ｓ（１、２、３、４）、およびＡ５Ｓ（ＩｓｏＢｕｌｋ）である。これらは、実施例４および表５に記載される。８つのアイソフォームを含有する試料はＦＰＢである。
【図２５】図２５は、示すように、単一精製アイソフォーム、あるいは２、３、５、または８の異なるアイソフォームの混合物のいずれかを含有する個々の試料に関する、３７℃での静置インキュベーション８週間後の、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントの純損失を示す。すべての試料を、５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６中に配合する。単一精製アイソフォームに関するデータは、実施例２に記載する実験に由来する。混合物に関するデータは、実施例３および４に記載する実験に由来する。１つまたは２つのアイソフォームを含有する試料に関するデータ点の隣の数字は、どのアイソフォームが試料中に含まれるかを示す。３つおよび５つのアイソフォームを含有する試料は、それぞれ、Ｈ６Ｓ（−１、−２、−３）およびＨ６Ｓ（ＩｓｏＢｕｌｋ）である。これらは、実施例４および表５に記載される。８つのアイソフォームを含有する試料はＦＰＢである。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、米国仮出願第６０／６８３，４７５号、２００５年５月１９日出願の優先権を請求し、該文献は、本明細書において、その全体が援用される。
【０００２】
分野
本発明は、抗体を安定化させるための方法および組成物の分野にある。
背景
抗体を用いる多くの適用において、ある期間に渡って、物理的構造および生物学的活性が安定に維持されるように、抗体を配合することが望ましい。抗体の現在の使用には、多くの他の使用の中に、広い研究使用、ならびにヒト療法剤および診断剤としての使用が含まれる。抗体は、タンパク質の一種として、多くの類似性を共有するが、異なる抗体は、異なる物理的構造および生物学的活性を所持する。単一抗体の調製物は、例えば、グリコシル化、アミノ酸修飾、または三次構造における相違のため、不均一である可能性もある。本発明は、抗体の特定の群を安定化させるための組成物および方法、ならびにこうした組成物を用いて、多様な疾患を治療する方法に対して向けられる。
【０００３】
概要
本発明は、抗体を含む安定な組成物、および抗体を安定化させるための方法を含む。特定の態様において、組成物は、開示する抗体群の中から抗体を含んでもよく、そして組成物は、特定の範囲内のｐＨを有し、そして／または特定の緩衝剤、例えばヒスチジン、酢酸ナトリウム、またはクエン酸ナトリウムなどを含む。他の態様において、本発明は、複数の構造変異体を含むモノクローナル抗体の精製調製物、例えば、抗体の少なくとも２、３、４、または５の異なるアイソフォームを含む調製物を含む、組成物を提供する。本発明は、抗体、場合によって、複数の構造変異体を含むモノクローナル抗体の精製調製物を安定化させる方法をさらに含む。構造変異体は、抗体の可変領域に付着したＮ−グリカンの不均一シアル化によるアイソフォームであってもよい。構造変異体は、抗体に付着したグリカンいずれかの不均一シアル化によるアイソフォームであってもよい。
【０００４】
１つの側面において、本発明には、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．５のｐＨを有し、モノクローナル抗体の精製調製物およびヒスチジン、酢酸ナトリウム、またはクエン酸ナトリウムを含む、安定な薬剤組成物であって、抗体が、以下からなる特性群から選択される少なくとも１つの特性を有する、前記薬剤組成物が含まれる：（ａ）抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である重鎖可変領域を含む；（ｂ）抗体は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含む；（ｃ）抗体は、Ｎ−グリカン部位を含む重鎖可変領域を含む；（ｄ）抗体は、Ｎ−グリカン部位を含む軽鎖可変領域を含む；（ｅ）抗体は、（ｉ）配列番号３６におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３６のアミノ酸の少なくとも７つを含むアミノ酸配列；および（ｉｉ）配列番号３７を含むアミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含む；（ｆ）抗体は、（ｉ）配列番号４３；および（ｉｉ）配列番号４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む；（ｇ）抗体は、ヒト・ゲノムＶＨセグメント５−５１（配列番号５８）または５−ａ（配列番号５９）によってコードされるものと、少なくとも約８０％、８５％または９０％同一である重鎖可変領域を含む；ならびに（ｈ）抗体は、ヒト・ゲノムＶＬセグメントＶＫＩＩＩ／Ａ２７（配列番号６０）によってコードされるものと、少なくとも約８０％、８５％または９０％同一である軽鎖可変領域を含む。さらなる側面において、抗体は：配列番号３４を含むＣＤＲ１；配列番号３５を含むＣＤＲ２；および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含んでもよい。さらに別の側面において、抗体は：配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１；配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２；および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含んでもよい。いくつかの態様において、重鎖可変領域は、以下の配列を含んでもよい：配列番号３４におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３４のアミノ酸の少なくとも４つを含むＣＤＲ１；配列番号３５におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３５のアミノ酸の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、または１５を含むＣＤＲ２；配列番号３６または配列番号３７におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３６または配列番号３７のアミノ酸の少なくとも５、６、または７を含むＣＤＲ３。いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、以下の配列を含んでもよい：配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０のアミノ酸の少なくとも９、１０、または１１を含むＣＤＲ１；配列番号４１または配列番号４２におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸の少なくとも４、５、または６を含むＣＤＲ２；配列番号４３または配列番号４４におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号４３または配列番号４４のアミノ酸の少なくとも７、８、および９を含むＣＤＲ３。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ抗体、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であってもよい。組成物は、ソルビトールまたはスクロースなどの糖、および／または塩を含んでもよい。組成物のｐＨは、約５．７〜約６．３であってもよいし、または約６．０であってもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であってもよく、そしてインターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ−γ）に結合してもよい。
【０００５】
本発明は、モノクローナル抗体の精製調製物および緩衝剤を含む薬剤組成物であって、該組成物が約５．５〜約６．５のｐＨであり、そして該精製調製物が、抗体の少なくとも３つの異なるアイソフォームを含む、前記薬剤組成物を提供する。組成物のｐＨは、約５．７〜約６．３であってもよいし、または約６．０であってもよく、そして組成物は液体であってもよい。抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を含んでもよく、そして配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である重鎖可変領域を有してもよく、そして／または軽鎖可変領域は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である。抗体は：配列番号３４を含むＣＤＲ１、配列番号３５を含むＣＤＲ２、および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；ならびに／あるいは配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１、配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２、および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含んでもよい。緩衝剤は、ヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウムであってもよく、そして組成物は、糖、例えばソルビトールなど、炭水化物、および／または塩をさらに含んでもよい。抗体は、ＣＨＯ細胞中で産生されてもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体、場合によって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であってもよい。抗体は、インターフェロン・ガンマ、場合によって、ヒト・インターフェロン・ガンマに結合してもよい。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％または９５％が、単量体ピーク中にあってもよい。
【０００６】
さらに、本発明は、緩衝剤を含む組成物中に精製調製物を配合することを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を安定化させるための方法であって、該組成物が約５．５〜約６．５のｐＨを有し、そして該精製調製物が、抗体の少なくとも３つの異なるアイソフォームを含む、前記方法を提供する。抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を有してもよい。抗体の重鎖可変領域は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一であってもよく、そして／または抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一であってもよい。抗体は：配列番号３４を含むＣＤＲ１、配列番号３５を含むＣＤＲ２、および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；ならびに／あるいは配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１、配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２、および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含んでもよい。緩衝剤は、ヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウムであってもよい。組成物は、糖、例えばソルビトールなど、炭水化物、および／または塩をさらに含んでもよい。抗体は、ＣＨＯ細胞中で作製されてもよく、そしてＩｇＧ抗体、場合によって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であってもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であってもよい。組成物のｐＨは、約５．７〜約６．３、または約６．０であってもよい。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％または９５％が、単量体ピーク中にあってもよい。
【０００７】
別の態様において、本発明には、ヒスチジンおよびモノクローナル抗体の精製調製物を含む組成物であって、該精製調製物が、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして該組成物のｐＨが約５〜約７である、前記組成物が含まれる。あるいは、組成物は、酢酸ナトリウムおよびモノクローナル抗体の精製調製物を含んでもよく、該精製調製物は、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして該組成物のｐＨは約５〜約６である。抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を含んでもよく、そして配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０に、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である重鎖可変領域、および／または配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。抗体は：配列番号３４を含むＣＤＲ１、配列番号３５を含むＣＤＲ２、および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；ならびに／あるいは配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１、配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２、および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含んでもよい。組成物は、糖、例えばソルビトールなど、炭水化物、および／または塩をさらに含んでもよい。抗体は、ＣＨＯ細胞中で作製されてもよく、そしてＩｇＧ抗体、場合によって、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であってもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であってもよい。組成物のｐＨは、約５．５〜約６．５、約５．７〜約６．３、または約６．０であってもよい。組成物は液体であってもよく、あるいは凍結または凍結乾燥されていてもよい。組成物は、糖、例えばソルビトールなど、炭水化物、および／または塩をさらに含んでもよい。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％または９５％が、単量体ピーク中にあってもよい。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ヒスチジンを含む組成物中に抗体を配合することを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を安定化させるための方法であって、該精製調製物が、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして該組成物のｐＨが約５〜約７である、前記方法を含む。あるいは、組成物は、酢酸ナトリウムおよびモノクローナル抗体の精製調製物を含んでもよく、該精製調製物は、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして該組成物のｐＨは約５〜約６である。組成物は、糖、例えばソルビトールなど、炭水化物、および／または塩をさらに含んでもよい。抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である重鎖可変領域、および／または配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。抗体は：配列番号３４を含むＣＤＲ１、配列番号３５を含むＣＤＲ２、および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域；ならびに／あるいは配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１、配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２、および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含んでもよい。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％または９５％が、単量体ピーク中にあってもよい。
【０００９】
本発明にはまた、モノクローナル抗体の精製調製物およびヒスチジンを含む薬剤組成物も含まれ、該薬剤組成物は、約５〜約７のｐＨを有するか、または約６のｐＨを有する。精製調製物は、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含んでもよい。抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である重鎖可変領域、および／または配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。組成物はまた、ソルビトールも含んでもよい。
【００１０】
本発明にはさらに、モノクローナル抗体の精製調製物および酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、またはリン酸カリウムを含む薬剤組成物も含まれ、該薬剤組成物は、約５〜約６のｐＨを有するか、または約６のｐＨを有する。精製調製物は、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含んでもよい。抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である重鎖可変領域、および／または配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。組成物はまた、ソルビトールも含んでもよい。
【００１１】
本発明にはさらに、モノクローナル抗体の精製調製物およびクエン酸ナトリウムを含む薬剤組成物も含まれ、該薬剤組成物は、約６〜約７のｐＨを有するか、または約６のｐＨを有する。精製調製物は、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含んでもよい。抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である重鎖可変領域、および／または配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。組成物はまた、ソルビトールも含んでもよい。
【００１２】
別の側面において、本発明は、ヒト抗原に特異的に結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の精製調製物、ヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウム、および塩ならびに／あるいは糖を含む、安定な薬剤組成物であって、抗体がその重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を有する、前記組成物を提供する。別の態様において、本発明は、ヒト抗原に特異的に結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の精製調製物、緩衝剤、および塩ならびに／あるいは糖を含む、安定な薬剤組成物であって、該抗体がその重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカンを含み、そして該組成物のｐＨが約５．５〜約６．５である、前記薬剤組成物を提供する。場合によって、組成物のｐＨは、約５．７〜約６．３であってもよいし、または約６であってもよい。さらに、本発明は、ヒト抗原に特異的に結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の精製調製物、緩衝剤、例えばヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウム、および塩ならびに／あるいは糖を含む、安定な薬剤組成物であって、該抗体が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および／または配列番号３０と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である、前記薬剤組成物を含む。組成物のｐＨは、約５．５〜約６．５であってもよい。さらなる側面において、本発明には、ヒト抗原に特異的に結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の精製調製物、緩衝剤、例えばヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウム、および塩ならびに／あるいは糖を含む、安定な薬剤組成物であって、該抗体が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、および／または配列番号３１と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である、前記薬剤組成物が含まれる。組成物のｐＨは、約５．５〜約６．５であってもよい。場合によって、組成物のｐＨは、約５．７〜約６．３であってもよく、または約６であってもよい。組成物は、液体であってもよく、そしてその場合、あらかじめ凍結乾燥されていなくてもよい。あるいは、組成物を凍結乾燥してもよい。
【００１３】
本発明にはまた、抗体を安定化させるための方法であって：重鎖および／または軽鎖の可変領域中に、Ｎ−グリカン部位を有するモノクローナル抗体の精製調製物を選択し、そしてヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウムを含み、そして約５．５〜約６．５のｐＨを有する溶液中に、精製調製物を配合する工程を含む、前記方法も含まれる。溶液は、ソルビトールまたはスクロースなどの糖、および／または塩をさらに含んでもよい。溶液のｐＨは約６．０であってもよい。抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および／または配列番号３０と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含んでもよい。あるいは、またはさらに、抗体は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、および／または配列番号３１と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含んでもよい。
【００１４】
最後に、本発明は、モノクローナル抗体の複数の構造変異体を含む、ヒト抗原に結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の精製調製物を安定化させるための方法であって、構造変異体がＮ−グリカン部位の不均一なグリコシル化による、少なくとも２つ、３つ、または４つの構造変異体の混合物を選択し、そして約５〜約６．５のｐＨで、緩衝剤、例えばヒスチジン、リン酸、クエン酸、または酢酸、および糖ならびに／あるいは塩を含む組成物中に、混合物を配合する工程を含む、前記方法を提供する。組成物は、ソルビトールまたはスクロースをさらに含んでもよい。
配列リストの簡単な説明
表１
【００１５】
【表１Ａ】
【００１６】
【表１Ｂ】
【００１７】
【表１Ｃ】
【００１８】
【表１Ｄ】
【００１９】
詳細な説明
物理的構造および生物学的活性を安定化させるように、抗体を配合してもよい。抗体を安定化させる特に重要な側面は、抗体の凝集を阻害するかまたは防止することであり、これは、凝集した抗体が、単量体よりもより免疫原性でありうるためである。例えば、Ｈｅｒｍｅｌｉｎｇら（２００４）， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２１（６）：８９７−９０３を参照されたい。療法剤に対する免疫応答は、望ましくない副作用を生じるか、または抗体の有効性を減少させうる。本発明は、抗体配合のための組成物および方法、場合によって、例えばグリコシル化の相違のために不均一であるモノクローナル抗体の精製調製物配合のための組成物および方法を提供する。
【００２０】
抗体安定化のための重要なパラメーターには、抗体の純度および不均一性の度合い、ｐＨ、および緩衝剤が含まれる。組成物の他の特質、例えば塩、炭水化物および／または糖、アミノ酸、ならびに／あるいは多くの他の成分もまた、抗体安定性に影響を及ぼしうる。抗体濃度もまた、安定性に影響を及ぼしうる。異なる抗体は、組成物のいくつかの特質に対して感受性であり、そして他のものに感受性でない可能性もある。本発明は、モノクローナル抗体の精製調製物を安定化させるための方法、これらの抗体を含む安定組成物、およびこれらの組成物を用いて、特定の疾患を治療する方法に対して向けられる。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明の抗体は、「不均一」である。モノクローナル抗体の精製調製物は、抗体がモノクローナル抗体であり、そして精製調製物中の抗体分子の実質的にすべてが、同一のアミノ酸配列を有する場合であってさえ、複数の「構造変異体」を含むならば、本明細書に意味するように不均一である。不均一性は、他の可能性の中でも、例えば、不均一なグリコシル化、ジスルフィド結合形成の不均一性、および／またはタンパク質フォールディングの不均一性から生じうる。本明細書に意味する際、「構造変異体」の中に含まれないのは、Ｃ末端リジンまたは環状化Ｎ末端グルタミンを欠く変異体などの、異なるアミノ酸配列を持つ変異体である。例えば、Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅら（１９９７）， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ａｎａｌｙｓｉｓ １６：５９３−６０３を参照されたい。例えば、不均一モノクローナル抗体は、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメイン中の非常に保存されたＮ−グリカン部位以外の、Ｎ−グリカン部位またはＯ−グリカン部位を有するＩｇＧ抗体であってもよい。この保存されたＮ−グリカン部位は、実質的にシアル化されず、そして抗体のエフェクター機能に重要である。例えば、ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９７）， ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６−３２；ＴａｏおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９８９）． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２５９５−２６０１；Ｓｈｅｅｌｅｙら（１９９７）， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４７：１０２−１０を参照されたい。他のＮ−グリカン部位またはＯ−グリカン部位は、抗体アミノ酸配列中のどこに存在してもよく、場合によって、重鎖または軽鎖の可変領域中、あるいはＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３領域中に存在してもよく、そして多様な度合いにシアル化され、こうして異なる電荷を持つ異なる構造変異体を生じてもよい。こうした異なって荷電した変異体は、本明細書において、「アイソフォーム」と称される。あるいは、不均一抗体調製物は、異なってフォールディングされている構造変異体を含んでもよく、そして異なってフォールディングされた種は、カラム・クロマトグラフィーによって分離可能でありうる。いくつかの態様において、こうした異なってフォールディングされた変異体は、異なるジスルフィド結合パターンを有してもよく、そしてカラム・クロマトグラフィーによって分離可能でありうる。不均一抗体調製物は、均一調製物とは異なる安定特性を示す可能性もあり、そして単離構造変異体を含む、異なる均一調製物は、互いに異なる安定特性を示す可能性もある。したがって、ただ１つの構造変異体または構造変異体の組み合わせを含む組成物は、市販に適した安定組成物でありうる。
【００２２】
精製抗体調製物の観察される不均一性が、Ｎ−グリカン間の不均一なグリコシル化のためであるかどうかを決定するため、実施例１に記載するように、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）での消化を伴いおよび伴わずにの両方で、陽イオン交換クロマトグラフィーによって、抗体の精製調製物の試料を分析してもよい。ＰＮＧアーゼＦはタンパク質からＮ−グリカンを除去するため、未消化の試料中で観察される不均一性が、不均一なグリコシル化のためであるならば、Ｎ−グリカナーゼ消化した試料は、未消化の試料に比較した際、ほとんどまたはまったく不均一性を示さないと予期されるであろう。製造者、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（米国マサチューセッツ州）によって推奨されるように、ＰＮＧアーゼでの消化を本質的に行ってもよい。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓは、１０Ｘ Ｇ７反応緩衝液を供給し、そして１％ＮＰ−４０を加えた１Ｘ反応緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）中、３７℃で反応をインキュベーションすることを推奨する。Ｎ−グリカンを特異的に除去する他の酵素、例えばＮ−グリカナーゼもまた、これらの酵素に適した反応条件とともに使用可能である。
【００２３】
一次配列が抗体構造の重要な決定要因でありうる。いくつかの態様において、本発明の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および／または配列番号３０と、少なくとも約８０％、場合によって、少なくとも約８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一であってもよい。本発明の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、および／または配列番号３１と、少なくとも８０％、場合によって、少なくとも８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９８％、または１００％同一であってもよい。同一性領域は、以下に定義するように、これらの配列比較のいずれかにおいて、長さが少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００アミノ酸であってもよい。さらに、本発明の抗体は、配列番号３６におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３６のアミノ酸の少なくとも７つを含むアミノ酸配列を有するか；または配列番号３７を含むアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ３を含んでもよい。
【００２４】
「抗体」は、本明細書に意味する際、抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域のすべてまたは部分を含む１以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質を指し、抗体は抗原に結合可能である。多くの天然存在抗体が、例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．， メリーランド州ベセスダ）に記載される。抗体は、抗原の生物学的活性を調節、すなわちアゴナイズまたはアンタゴナイズすることが可能でありうる。「抗体」には、以下に記載する、天然存在抗体が含まれ、２つの完全重鎖および２つの完全軽鎖を含有する抗体、ならびに、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片などの抗体断片、および天然存在抗体に見られる他のドメインを含まない、重鎖または軽鎖の単一の可変領域を含む抗体が含まれる。一本鎖、キメラ、ヒト化、ヒト、ポリクローナル、およびモノクローナル抗体が本明細書に意味するような抗体である。特定の態様において、抗体は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。さらなる態様において、抗体は、天然存在抗体の酵素的または化学的切断によって産生される。抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブクラスを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブクラスを含む）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥアイソタイプのものであってもよく、そしてカッパ型またはラムダ型軽鎖を含んでもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化抗体、ネズミ抗体、ウサギ抗体、ヒトコブラクダ（ｄｒｏｍｅｄａｒｙ）抗体、または任意の哺乳動物抗体であってもよい。
【００２５】
本発明の組成物および方法で用いる抗体は、いくつかの態様において、「モノクローナル抗体」である。本明細書に意味する際、「モノクローナル抗体」調製物は、大部分、同じアミノ酸配列を有する抗体を含有する。いくつかの例において、モノクローナル抗体の配列変動は、例えばアミノ酸修飾または切断を含む、翻訳後事象のために起こりうる。対照的に、例えば接種された動物由来の血液試料から精製可能なポリクローナル抗体調製物は、多くの異なるアミノ酸配列を持つ抗体を含む。モノクローナル抗体は、任意の適切な手段によって作製可能である。例えば、単一のアミノ酸配列を持つ抗体を生じるハイブリドーマ細胞株から、モノクローナル抗体を単離してもよい。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５）の方法によって、こうしたハイブリドーマ株を単離して、そしてｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれで培養してもよい。あるいは、モノクローナル抗体を以下のように産生してもよい。通常は抗体を産生しない宿主細胞株、例えば細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞株内に、抗体をコードする核酸を導入してもよい。細胞株が哺乳動物細胞株であるならば、該細胞株は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、あるいはＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓを含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫（例えばＮＳＯ、ＮＳ１）、ＰＣ１２、またはＷＩ３８細胞株であってもよい。抗体をコードする核酸を含有する細胞株を培養してもよく、そして培地または細胞から抗体を採取してもよい。
【００２６】
「モノクローナル抗体の精製調製物」は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも約８０％、場合によって、少なくとも約８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、または９９％が、単量体（以下に定義するようなもの）ピーク中にある、調製物を指す。ＳＥＣの方法は、実施例２および図３に説明される。実施例２で検出される単量体ピークは、２つの完全重鎖および２つの完全軽鎖を含む四量体抗体を含有する。しかし、他の種類の抗体（上に定義するようなもの）を含有する単量体ピークが、モノクローナル抗体の精製調製物が何であるかを定義する際に意図される。
【００２７】
「ｓｃＦｖ」は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、そして抗体の定常領域を含まない、一本鎖抗体である。いくつかの態様において、ｓｃＦｖはまた、重鎖および軽鎖の可変領域間に多様な長さのリンカーも含んでもよい。ｓｃＦｖを他のアミノ酸配列に融合させてもよいが、ｓｃＦｖと称されるタンパク質部分は、好ましくは、ＶＨ領域、ＶＬ領域、および場合によってこれらの配列を連結するリンカー以外の、いかなる実質的な量のアミノ酸配列も含まない。
【００２８】
抗体の「Ｆｃ領域」は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびにヒンジ領域（またはその一部）を含み、そしてＣＨ１ドメインまたはＶＨドメインを含まない、重鎖断片またはこうした断片の変異体である。例えば、Ｋｕｂｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第２版， ｐ．１１０−１１， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， ニューヨーク（１９９４）を参照されたい。Ｆｃ断片は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＡアイソタイプのものであってもよく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４または他のサブクラスが含まれる。
【００２９】
「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」は、Ｆｃ領域に融合したｓｃＦｖを含有する抗体である。
一般的に、大部分の哺乳動物由来の天然存在抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。重鎖は、３つまたは４つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含み、そしてＩｇＥおよびＩｇＭ抗体では、ＣＨ４ドメインもまた含む。重鎖は、１つの可変ドメイン、ＶＨドメインを含む。軽鎖は、１つの定常ドメイン、ＣＬドメイン、および１つの可変ドメイン、ＶＬ領域を含む。軽鎖可変領域は、ラムダ・ファミリーまたはカッパ・ファミリーのいずれかに属することも可能であり、これらのファミリーは、配列が関連する軽鎖の２群である。重鎖または軽鎖の可変ドメインは、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔら， １９９１， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．， メリーランド州ベセスダによって、フレームワーク領域１〜４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と称される；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ， １９８７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−１７もまた参照されたい）に包埋された、３つの相補性決定領域（超可変領域としても知られ、Ｋａｂａｔら、上記によって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とも称される、ＣＤＲ；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、上記；Ｃｈｏｔｈｉａら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８３もまた参照されたい）を含む。ＣＤＲおよびフレームワーク・セグメントは、多様な領域のアミノ末端から出発して、以下のように散在する：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。本発明の抗体は、ヒト、またはヒト・フレームワーク領域を有するヒト化抗体であってもよい。
【００３０】
抗体可変領域は、一般的に、一次アミノ酸配列によってそれと同定可能である。抗体可変領域のフレームワーク領域の一次配列は、門（ｐｈｙｌａ）に渡って普遍的に保存される、少数の残基を有する。さらに、多くの残基は、門に渡って、ならびに／あるいは種内および／または門内で、非常に保存されており、そして抗体内の多くの位は、通常、既知のアミノ酸群の１つによって占められる。Ｋａｂａｔら、上記を参照されたい。あるいは、またはさらに、配列は、予測される三次構造によって、抗体として認識可能である。グリーク・キーβバレルとして知られる構造を形成する９β鎖を含む、可変領域の三次構造は、非常によく保存され、そしてこの構造内のＣＤＲの位置もまた、非常に保存される。例えば、Ｂｏｒｋら， １９９４， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４２：３０９−２０；ＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ， １９８９， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４４：１−６３；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ， １９８８， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：３８１−４０５；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、上記；Ｋａｂａｔら、上記を参照されたい。
【００３１】
重鎖可変領域をコードするゲノム配列がマッピングされ、そして配列決定されてきている。例えば、ＣｏｏｋおよびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ（１９９５）， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １６（５）：２３７−４２を参照されたい。天然では、重鎖可変領域は、３つの別個の生殖系列ＤＮＡセグメント、ＶＨ、Ｄ、およびＪＨセグメントを含むＤＮＡによってコードされ、これらのセグメントは、抗体産生細胞において、ＤＮＡ再編成事象によって、一つになる。天然存在重鎖可変領域の長さの大部分は、ＶＨセグメントによってコードされ、このセグメントは、ヒト重鎖可変領域の総数約１０８アミノ酸のうち、およそ９４をコードする。したがって、既知のＶＨセグメントへの配列類似性に基づいて、生殖系列ＶＨセグメントの群を決定可能であり、そのうち１つは、部分的に、問題の特定の重鎖可変領域をコードする。いくつかの場合、配列類似性は、問題の抗体をコードするとして単一の生殖系列ＶＨセグメントを指し示しうる。およそ５１の機能性ヒト生殖系列ＶＨセグメントがあり、これらは、配列類似性によって、７つのファミリーに分類される。いくつかの態様において、本発明の抗体は、ファミリー５のヒト生殖系列ＶＨセグメント、場合によってＶＨセグメント５−５１または５−ａによってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、場合によって、少なくとも約８５％、９０％、９５％または９８％同一である。例えば、ＣｏｏｋおよびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ（１９９５）， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １６（５）：２３７−４２を参照されたい。あるいは、本発明の抗体は、ファミリー１、２、３、４、６、または７のヒト生殖系列ＶＨセグメントによってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、場合によって、少なくとも約８５％、９０％、９５％、または９８％同一であってもよい。
【００３２】
同様に、ヒト軽鎖可変領域をコードする天然存在ＤＮＡは、生殖系列ＶＬセグメントおよびＪＬセグメントを一つにする、抗体産生細胞中のＤＮＡ再編成事象から、通常生じる。ヒトＶＬおよびＪＬセグメントは、２つの遺伝子座に見られ、一方は染色体２上であり、そしてもう一方は染色体２２上であり、これらはそれぞれ、カッパ鎖およびラムダ鎖をコードする配列を含有する。配列類似性に基づいて、１０のファミリー（ＶＬ１〜ＶＬ１０）に属する、およそ３１の機能性ヒトＶλ遺伝子セグメント（ラムダ型軽鎖をコードするＶＬセグメントであるもの）がある。Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９６）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６４：２２０−３２。７つのファミリー、ＶＫＩ〜ＶＫＶＩＩに属する、約４０の機能性生殖系列ヒトＶκセグメント（カッパ型軽鎖をコードするＶＬセグメントであるもの）がある。本発明の抗体は、カッパまたはラムダ軽鎖を含んでもよく、場合によって、例えばＶＫＩＩＩ／Ａ２７などのＶＫＩＩＩファミリー中の生殖系列Ｖκセグメントによってコードされるアミノ酸配列に、少なくとも約８０％、場合によって少なくとも約８５％、９０％、９５％、または９８％同一である、軽鎖可変領域を含むものを含んでもよい。あるいは、軽鎖可変領域は、ＶＫＩ、ＶＫＩＩ、ＶＫＩＶ、ＶＫＶ、ＶＫＶＩ、またはＶＫＶＩＩファミリー中のＶκセグメントによってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９８％同一であってもよい。
【００３３】
本明細書に意味する際、「単量体」は、抗体を指す場合、１つより多いポリペプチド鎖を含んでもよい、１つの完全抗体である。例えば、多くの天然存在抗体の単量体は、２つの重鎖および２つの軽鎖、すなわち全部で４つのポリペプチド鎖からなる。さらに、いくつかの一本鎖抗体の単量体（１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖ）は、単一ポリペプチド鎖である。しかし、ｓｃＦｖは、重鎖および軽鎖の可変領域間のリンカーの長さのため、自発的に二量体化することも可能である。こうした場合、単量体は、二量体ｓｃＦｖ（またはディアボディ）であってもよい。同様に、２つの重鎖を含みそして軽鎖をまったく含まない、天然存在ヒトコブラクダ抗体の単量体（Ｍｕｌｄｅｒｍａｎｓら， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：２７７−３０２；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら， ２００１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：２６２８５−９０）またはｓｃＦｖ−Ｆｃは二量体である。要するに、単量体は１つの完全抗体であり、抗体の部分であるすべての分子を含んで完全である。
【００３４】
「ヒト」抗体は、最終的にヒト供給源から得られる配列によってコードされる抗体である。例えば、ヒト血液から単離される抗体は、ヒト抗体である。不死化細胞とヒト抗体産生細胞の融合物である、ハイブリドーマ細胞株由来の抗体は、ヒト抗体である。さらに、抗体可変領域をコードするヒトＤＮＡのファージ・ライブラリーから単離された抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体には、ヒト抗体をコードする配列が、トランスジェニック動物中の抗体をコードする配列の少なくともいくつかを置換している、トランスジェニック動物によって産生されるヒト配列を持つ抗体もまた含まれ、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号および第６，０７５，１８１号に記載されるものがある。さらに、抗体をコードするヒト起源の核酸が導入されている、宿主細胞によって、ヒト抗体を産生してもよい。「ヒト」抗原は、ヒトに存在する分子であり、例えば他の可能性の中でも、ヒトで発現されるタンパク質、あるいはヒトで見られる糖または炭水化物である。
【００３５】
「ヒト化抗体」は、抗体の可変領域（単数または複数）のフレームワーク領域がヒト起源であり、そしてＣＤＲが別に由来する抗体である。ヒト化抗体は、例えば米国特許第５，６９３，７６１号に記載される。
【００３６】
抗体は、付着したＮまたはＯ連結グリカンを有してもよい。Ｏ連結グリカンは、全部ではないが、いくつかのセリンまたはスレオニン残基に付加される。どのセリンまたはスレオニンがグリコシル化されるかを予測するためのコンセンサス配列はないが、いくつかの予測因子が知られる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖａｒｋｉら監修， 第８章， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９９９）を参照されたい。Ｎ連結グリカンは、配列関係Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒに存在するアスパラギン残基に付加され、ここで、Ｘｘｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である。こうした配列は、本明細書において、Ｎ−グリカン部位またはＮ−グリコシル化部位と称される。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖａｒｋｉら監修， 第７章， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９９９）。Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列に続くプロリンは、アスパラギンがグリコシル化される頻度を実質的に減少させる。Ｇａｖｅｌおよびｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９９０）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ３（５）：４３３−４２。
【００３７】
Ｎ−グリカンは、複雑で、そして不均一な構造を有しうる。図１に示すように、Ｎ−グリカンは、例えば、枝（高マンノース・オリゴ糖と称される）を持たないか、あるいは２つ、３つ、または４つの枝を有してもよく、その各々が、シアル酸残基で終結してもまたはしなくてもよい。図１に示すもの以外の構造が可能である。枝の長さは多様であってもよい。例えば、単一の枝が、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびガラクトースを含む単位（ＬａｃＮＡｃ単位と称する）を２以上含んでも、または１つのＬａｃＮＡｃ単位のみを含んでもよい。図１Ｂ〜１Ｇを参照されたい。シアル酸残基は、一般的に負に荷電するため、異なる数のシアル酸残基を含む抗体は、例えば陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィーによって、電荷に基づいて分離可能である。また、等電点電気泳動ゲルを用いて、場合によってはキャピラリー電気泳動を用いて、こうした不均一性を検出してもよい。シアル酸残基の数が異なるため、異なる電荷を有する構造変異体を、本明細書において、「アイソフォーム」と称する。
【００３８】
すべてのクラスの天然存在抗体のＣＨ２ドメインは、Ｎ連結グリカン部位を含有することも可能であるし、そして通常、含有する。ＴａｏおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９８９）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２５９５−２６０１；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９７）， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（ＴＩＢＴＥＣＨ）１５：２６−３２；Ｒｉｏｔｔら， ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， 第３版， Ｍｏｓｂｙ， １９９３。しかし、シアル酸は、組換えＩｇＧ抗体上に、微量を超えて見出されることは稀であり、ＣＨ２ Ｎ−グリカン部位は、あるとしても稀にしかシアル化されないと示唆される。Ｈａｒｒｉｓら（２００４）， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ． ６２：１３７−５４。本発明の組成物および方法の抗体は、Ｆｃ領域中にＮ連結グリカン部位を有してもよい。さらに、本発明の組成物および方法で用いる抗体は、別の箇所、例えば可変ドメイン、場合によってＶＨおよび／またはＶＬドメイン中に、Ｎ連結グリカン部位を有してもよく、該抗体は、多様な度合いにシアル化されうる、付着した多様なＮ−グリカンを有してもよい。こうした可変領域グリコシル化は、抗原に対する結合親和性、抗体産生、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、および臓器ターゲティングに影響を及ぼしうる。Ｃｏｌｏｍａら（１９９９）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２：２１６２−７０；ＧａｌａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２：５４８９−９４。ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤアイソタイプの抗体は、一般的に、ＩｇＧ抗体よりも高くグリコシル化される。Ｒｉｏｔｔら、上記。したがって、これらのサブクラスのモノクローナル抗体の調製物は、シアル化の相違を含む、グリコシル化の相違のため、複数の構造変異体を含む可能性もある。
【００３９】
構造変異体が生じうる別の方式は、ジスルフィド結合の異なった形成を通じて生じる。天然存在抗体は、一般的に、ポリペプチド鎖内および鎖間の両方に、ジスルフィド結合を含有する。例えば、重鎖および軽鎖の各定常および可変ドメインは、鎖内ジスルフィド結合を形成可能な、非常に保存されたシステイン残基を含み、この各々は、約６０〜７０アミノ酸のループを囲む。さらに、鎖間ジスルフィド結合が、重鎖および軽鎖間、ならびに２つの重鎖間に存在可能である。大部分の天然存在抗体は、ヒンジ領域中のシステイン残基を介して、２つの重鎖間の１以上の鎖間ジスルフィド結合を有することも可能である。ジスルフィド結合は、システイン残基の多様な異なる対の間に形成可能であり、異なるパターンのジスルフィド結合を持つ構造変異体を生じさせる。異なるジスルフィド結合パターンを有するこれらの構造変異体は、例えば、イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または逆相ＨＰＬＣによって、互いから分離可能である。
【００４０】
本発明の抗体は、本明細書にその全体が援用される、米国特許出願公報第ＵＳ ２００５／０００４３５３ Ａ１号に詳細に記載されるものなどの、特定の物理的性質を有してもよい。この出願に記載される抗体の中には、番号１１１８、１１１８＊、１１１９、１１２１、および１１２１＊と称する５つの抗体がある。これらの抗体およびその部分の配列を、付随する配列表に開示し、そして配列表の配列の同一性を、表１に簡単に説明する。１つの側面において、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＡアイソタイプのものであってもよい。抗体がＩｇＧ抗体である場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であってもよい。本発明の抗体は、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、および／または配列番号３０と、少なくとも８０％、場合によって、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である重鎖可変領域を含んでもよい。本発明の抗体は、配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、および／または配列番号３１と、少なくとも８０％、場合によって、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％同一である軽鎖可変領域を含んでもよい。別の側面において、本発明の抗体は、ＣＤＲの特定の配列を有してもよい。例えば、抗体は、以下のアミノ酸配列：（ａ）配列番号３６におけるのと同じ順序および間隔で、配列番号３６のアミノ酸の少なくとも７つを含むアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号３７を含むアミノ酸配列、のうちの１つを含む、重鎖ＣＤＲ３を有してもよい。
【００４１】
本明細書において、第一の配列が、例えば、配列ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号５６）の１０アミノ酸からなる場合、７アミノ酸が、第一の配列中のものと同一であり、そして該配列におけるのと同じ相対的位置に存在するならば、別の配列は、第一の配列におけるのと「同じ順序および間隔」の７アミノ酸を有する。例えば、配列ＲＡＡＡＡＶＳＳＳＹ（配列番号５７）は、ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号５６）におけるのと同じ順序および間隔の７アミノ酸を有する。対照的に、配列ＲＡＳＳＶＳＳＳＹ（配列番号５８）は、ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号５６）と比較して、内部欠失を含有し、欠失のどちらかの側に３アミノ酸および６アミノ酸があるため、これは、この配列に関しては当てはまらない。したがって、該配列は、第一の配列と同じ順序および間隔の最大６アミノ酸を有する。ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹ（配列番号５６）と同じ順序および間隔の７アミノ酸を有しうる最短のありうる配列は、例えば、長さ７アミノ酸のもの、例えばＳＱＳＶＳＳＳ（配列番号５９）である。
【００４２】
「同一性」は、核酸またはアミノ酸分子の対の間の比較を指す。配列同一性を決定するための方法が知られる。典型的な好ましいコンピュータプログラムは、遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）ウィスコンシンパッケージ、バージョン１０．０プログラム、「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら， １９８４， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７；ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ， １９８１，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２−４８９）である。「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメータには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、ならびにＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ．３５３−３５８， １９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５， １９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の匹敵する比較マトリックス；（２）アミノ酸配列の各ギャップに対する３０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに１のペナルティ、またはヌクレオチド配列の各ギャップに対する５０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに３のペナルティ；（３）末端ギャップに対するペナルティなし；および（４）長いギャップに対する最大ペナルティなし、が含まれる。ＧＡＰを用いて同一性を決定する際、長さの一部に渡って、またはすべてに渡って、２つの配列を並列させてもよい。この並列部分は、本明細書において、「同一性領域」と称される。
【００４３】
「実質的に類似の」ポリペプチドは、本明細書に意味する際、アミノ酸配列が互いに少なくとも約９０％同一であり、そして非改変ポリペプチドの生物学的活性を、望ましい方式で維持するかまたは改変する。
【００４４】
「組換えタンパク質」または「組換え抗体」は、宿主細胞によって天然には産生されない、該細胞によって産生されるタンパク質または抗体である。宿主細胞は、核酸を細胞内に導入する他の方法の中でも、組換えウイルスでのウイルス感染、トランスフェクション、形質転換、核酸でコーティングされた微粒子銃での照射、またはエレクトロポレーションなどの「遺伝子操作」法を用いた、宿主細胞内への、タンパク質または抗体の発現を可能にする核酸配列の導入の結果として、組換えタンパク質または抗体を産生する。
【００４５】
いくつかの態様において、抗体は、ＩＦＮ−γ、場合によってヒトＩＦＮ−γに特異的に結合可能である。抗体はまた、タンパク質であってもまたはなくてもよい、他の抗原にも結合してもよい。本発明の組成物に含有される抗体は、天然存在抗体と同一であってもまたは実質的に類似であってもよく、そして／または、組換えタンパク質であってもまたはそうでなくてもよい。場合によって、抗体が結合する抗原は、ヒト・ポリペプチド、その断片、または長さ少なくとも１０アミノ酸の実質的に類似のポリペプチドを含んでもよい。
【００４６】
一般的に、本発明の方法および組成物は、例えば以下のポリペプチドの１つのすべてまたは部分を含む、任意の分子に結合する抗体を安定化させるのに有用である：ｆｌｔ３リガンド（本明細書に援用される国際出願ＷＯ ９４／２８３９１に記載されるようなもの）、ＣＤ４０リガンド（本明細書に援用される米国特許第６，０８７，３２９号に記載されるようなもの）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、Ｔｅｋ、Ｔｅｋ−デルタ、Ｔｉｅ−２、レプチン、ＩＬ−２、アンジオポエチン−２（本明細書に援用される、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら（１９９７）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（５３２２）：５５−６０に記載されるようなもの）、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子のリガンド（ＲＡＮＫＬ、本明細書に援用される国際出願ＷＯ ０１／３６６３７に記載されるようなもの）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、本明細書に援用される国際出願ＷＯ ９７／０１６３３に記載されるようなもの）、胸腺間質由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、本明細書に援用されるオーストラリア特許第５８８８１９号に記載されるようなもの）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子（例えば、本明細書に援用される米国特許第６，２０４，３６３号に記載される）、上皮増殖因子、角化細胞増殖因子、巨核球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｔｅ）増殖および発生因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、インスリン様増殖因子類、副甲状腺ホルモン、αインターフェロン類、γインターフェロン、およびコンセンサス・インターフェロン類を含むインターフェロン類（どちらも本明細書に援用される、米国特許第４，６９５，６２３号および第４，８９７４７１号に記載されるものなど）、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、ＧＤＮＦを含むグリア細胞由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ １〜５）、ニューロトロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子類、リンホトキシン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、および細胞表面分子ＥＬＫおよびＨｅｋの多様なリガンド（ｅｐｈ関連キナーゼのリガンドまたはＬＥＲＫＳなど）。本発明の方法にしたがって産生可能なポリペプチドの説明は、例えば、すべて本明細書に援用される、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．ＩＩ（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ監修， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， マサチューセッツ州ケンブリッジ， １９９８）；Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙおよびＬｅｉｇｈ監修， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， ニューヨーク， １９９３）；およびＴｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ａ．Ｗ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， カリフォルニア州サンディエゴ， １９９１）に見出すことも可能である。
【００４７】
本発明の組成物または方法で用いる抗体が結合可能な他の抗原には、前述のポリペプチドいずれかの受容体、またはこうした受容体に対するアンタゴニストのアミノ酸配列のすべてまたは部分が含まれ、以下が含まれる：腫瘍壊死因子受容体の両方の型（どちらも本明細書に援用される、米国特許第５，３９５，７６０号および米国特許第５，６１０，２７９号に記載されるような、ｐ５５およびｐ７５と称するＴＮＦＲ、ＥＭＢＲＥＬ（登録商標）として市販されている融合タンパク質エタネルセプトを含む）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体（Ｉ型およびＩＩ型；すべて本明細書に援用される、欧州特許第０ ４６０ ８４６号、米国特許第４，９６８，６０７号、および米国特許第５，７６７，０６４号に記載される）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（本明細書に援用される米国特許第６，３３７，０７２号に記載されるものなど）、ＩＬ−１アンタゴニストまたは阻害剤（すべて本明細書に援用される、米国特許第５，９８１，７１３号、第６，０９６，７２８号、および第５，０７５，２２２号に記載されるものなど）、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体（どちらも本明細書に援用される、欧州特許第０ ３６７ ５６６号および米国特許第５，８５６，２９６号に記載されるようなもの）、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子の受容体、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ、どちらも本明細書に援用される、ＷＯ ０１／３６６３７および米国特許第６，２７１，３４９号に記載される）、破骨細胞形成抑制因子（例えば、本明細書に援用される米国特許第６，０１５，９３８号に記載される）、ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４を含む）、およびＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などの死のドメインを含む受容体。
【００４８】
本発明の組成物または方法で用いる抗体が結合可能な他の抗原は、分化抗原（ＣＤポリペプチドと称する）またはそのリガンドあるいはこれらのいずれかに実質的に類似のポリペプチドのアミノ酸配列のすべてまたは部分を含む。こうした抗原は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（本明細書に援用される、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ， Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ， Ｋｉｋｕｔａｎｉら監修，日本・神戸， １９９６）に開示される。類似のＣＤポリペプチドが、それに続くワークショップで開示されている。こうした抗原の例には、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそのリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド等）が含まれる。ＣＤ抗原のいくつかは、４１ＢＢおよびＯＸ４０もまた含むＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。リガンドはしばしば、４１ＢＢリガンドおよびＯＸリガンドもメンバーであるように、ＴＮＦファミリーのメンバーである。したがって、ＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーもまた、本発明の方法によって安定化される抗体が結合可能な抗原でありうる。
【００４９】
本発明の方法および組成物によって安定化される抗体はまた、酵素的に活性であるポリペプチドまたはそのリガンドにも結合可能である。例には、以下のポリペプチドまたはそのリガンド、あるいはこれらの１つに実質的に類似のポリペプチドの１つのすべてまたは部分を含むポリペプチドが含まれる：メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリン・ファミリーメンバー、多様なキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、組織プラスミノーゲン・アクチベーター、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン類、ＩＬ−２アンタゴニスト、アルファ−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−アルファ変換酵素、上述の酵素いずれかに対するリガンド、ならびに多数の他の酵素およびそのリガンド。
【００５０】
本発明の組成物および方法をさらに用いて、以下の抗原に結合する抗体を安定化させてもよい：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−βおよびその類似体（米国特許第５，２７２，０６４号および第５，１４９，７９２号に記載されるものなど）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体（本明細書に援用される米国特許第６，２３５，８８３ Ｂ１号に記載されるものを含む）、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞増殖因子、破骨細胞形成抑制因子リガンド、インターフェロン・ガンマ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１、およびｚＴＮＦ４としても知られるＢｌｙＳ；ＤｏおよびＣｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ（２００２）， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． １３（１）：１９−２５を参照されたい）、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現される遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸および／または膵臓癌患者の血清に上昇したレベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳癌、結腸癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、および／または腎臓癌細胞、ならびに／あるいは黒色腫、神経膠腫または神経芽腫細胞、腫瘍の壊死コア上に発現される癌関連エピトープまたはポリペプチド、インテグリン・アルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン類、ｃ−ＭＥＴ、ＭＥＴ、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリン（ｌｅｕｋｏｉｎｔｅｇｒｉｎ）、アドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（因子ＶＩＩａ組織因子の阻害剤）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原であるもの）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｙｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）。
【００５１】
本発明の方法および組成物によって安定化される抗体は：腫瘍抗原ｇｐ７２をターゲットとする抗体；ガングリオシドＧＤ３に対する抗体；ガングリオシドＧＤ２に対する抗体；またはこれらに実質的に類似の抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含む、抗イディオタイプ抗体であってもよい。
【００５２】
本発明の薬剤組成物は、抗体が、４℃で２年間貯蔵した後、出発時の物理的および化学的構造ならびに生物学的活性を本質的に保持するならば、本明細書に意味する際、「安定」であると見なされる。物理的構造および生物学的活性は、多くのありうるアッセイの中でも、例えば、実施例２に説明するように、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、Ａ５４９アッセイ、および／または蛍光発光によって、多様な方法で測定可能である。方法または組成物は、これらの方法の少なくとも１つによって測定した際に、出発物質の特性の実質的な保持を促進するならば、「安定化」させている。
【００５３】
フリーズドライ組成物である「凍結乾燥」薬剤組成物は、特定の濃度で特定の分子を含有し、そして／または特定のｐＨであると記載してもよい。本明細書に意味する際、これは、凍結乾燥組成物を、使用に推奨される希釈剤の量中に再懸濁した際に、該組成物が、記載する濃度で記載する分子を含有し、そして記載するｐＨを有することを意味する。
【００５４】
本発明の薬剤組成物は、少なくとも緩衝剤および抗体を、そして場合によって少なくとも１つの安定化化合物、例えば糖、炭水化物、塩、アミノ酸、または界面活性剤などを含む。当業者は、緩衝剤以外の構成要素が、しばしば、抗体を含む薬剤組成物内に含有されることを知っている。例えば、薬剤組成物はしばしば等張であり、すなわち細胞が浸されていても、細胞の浸透圧体積変化を引き起こさないような、溶質濃度を有する。等張組成物は、一般的に、約２５０〜約３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。多様な種類の溶質、例えば糖、多糖、炭水化物、または塩を用いて、溶液を等張にする、すなわち等張化することも可能である。
【００５５】
緩衝剤は、例えば、以下またはその塩のいずれであってもよい：コハク酸塩、ヒスチジン、酢酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、有機酸、Ｔｒｉｓ、ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、モノ−Ｔｒｉｓ、ピロリン酸、リン酸塩、プロピオン酸塩、カルボン酸、硫酸塩、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ＢＩＣＩＮＥ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、イミダゾール、アミノエタンスルホネートまたはその誘導体（ＴＥＳとしても知られるトリス（ヒドロキシメチル）−メチル−２−アミノエタンスルホネート、またはＭＥＳとしても知られる２−モルホリノエタンスルホン酸）、アミノプロパンスルホネートまたはその誘導体、シュウ酸、フマル酸、およびジエタノールアミン。上述の緩衝剤の塩には、とりわけ、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、および／またはカリウム塩が含まれてもよい。例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ヒスチジン、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウムが、本明細書に意図する緩衝剤の範囲内に含まれる。組成物のｐＨは、約３．５〜約９、場合によって約５〜約７、約５〜約６．５、約４．５〜約６．５、約４．５〜約５．５、約５．５〜約６．５、約５．７〜約６．５、約５．７〜約６．３、約５、または約６であってもよい。
【００５６】
緩衝剤濃度は、少なくとも約０．５ｍＭであり、そして約３００ｍＭを超えない。いくつかの態様において、緩衝剤濃度は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約５ｍＭ〜約１５ｍＭであってもよい。
【００５７】
本発明の組成物は、配合物を等張化するよう働きうるもの、他の可能性の中でも、塩、炭水化物、界面活性剤および／または糖を含んでもよい。典型的な塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウム塩が含まれ、例えば、とりわけ、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムがある。少なくとも約１、５、または１０ｍＭであり、そして約３００、２００、１００、５０、または３０ｍＭを超えない濃度で、塩を用いてもよい。約５０ｍＭ〜約１７５ｍＭおよび約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度が意図される。
【００５８】
典型的な糖、多糖、および／または炭水化物には、とりわけ、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、糖酸、グルコース、フルクトース、マンノース、マルトース、マルトトリオース、ラクトース、ラクツロース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ラフィノース、とりわけ、デキストラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、またはセルロースなどの多糖が含まれる。こうした糖、多糖、および／または炭水化物を、例えば約０．００１％〜約２５％、約１％〜約２０％、または約１％〜約１０％を含む多様な濃度で用いてもよい。
【００５９】
典型的な界面活性剤には、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０を含むポリソルベート、ならびにポリアクスマー１８８を含むポリアクスマーが含まれる。これらを、約０．０００１％〜約０．１％、場合によって約０．００１％〜約０．０１％の濃度で用いてもよい。
【００６０】
抗体を含む薬剤組成物のｐＨおよび／または特定の緩衝剤は、抗体の安定性に影響を及ぼしうる。異なるｐＨおよび／または緩衝剤が、異なる抗体、あるいは異なる構造変異体または単一の抗体の構造変異体の組み合わせを安定化させうる。抗体の多様な物理的および生物学的特性を測定してもよい。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーは、抗体が、全長より小さい片に切断されているか、あるいは二量体またはより高次の凝集体に凝集しているかを決定可能である。逆相クロマトグラフィーもまた、抗体がより小さい断片に切断されているかどうかに関する情報を提供可能である。さらに、蛍光分光法によって、最大蛍光発光の波長（２つの波長間の比として表してもよい）を決定してもよい。この波長の変化は、抗体の二次または三次構造の変化を示しうる。ｐＨ変化は、異なる方式で、物理的構造の異なる側面に影響を及ぼしうる。さらに、生物学的活性に対する影響は、物理的構造に対する影響に対して、明らかな関連を示してもまたは示さなくてもよい。抗原への結合によって、例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて、細胞に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いて、生物学的活性を測定してもよい。
【００６１】
本質的にＦｉｓｈｗｉｌｄら， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４： ８４５−８５１に記載されるように、インターフェロン・ガンマへの特異的結合を測定してもよい。簡潔には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、約１〜２μｇ／ｍｌの濃度のＩＦＮ−γの溶液を約５０μｌ／ウェル用いて、マイクロタイタープレートをコーティングし、そしてＰＢＳ中の５％ニワトリ血清を用いてブロッキングしてもよい。次いで、プレートを、結合に関して試験中である抗体と、そして西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）・ペルオキシダーゼにコンジュゲート化した、試験中の抗体に結合するであろう抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ抗体は、ヒト全長ＩｇＧ１試験抗体に結合するであろう）と、連続してインキュベーションしてもよい。最後に、２，２’−アジノ−ビス［３−エチルベンゾチアゾリン（ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉａｚｏｌｅｎｅ）−６−スルホン酸］（ＡＢＴＳ）などの検出可能な西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ基質を添加し、そして４９０および４１５ｎｍで吸光度を測定してもよい。４９０ｎｍでの吸光度を４１５ｎｍのものから引く。生物学的活性、結合活性を有する抗体の量、または単量体型である抗体の量を最大にするｐＨおよび／または緩衝剤が望ましい。ＰＢＳ中の０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて、工程間で、プレートを徹底的に洗浄してもよい。抗原結合のためのこの周知のアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、ほぼいかなる抗原に対する結合に関しても試験可能である。
【００６２】
本発明の薬剤組成物は、液体、凍結乾燥、または凍結組成物であってもよい。液体または凍結組成物は、あらかじめ凍結乾燥されていてもまたはいなくてもよい。液体組成物は、凍結されていてもまたはいなくてもよい。
【００６３】
ＩＦＮ−γは、免疫機能のいくつかの側面の重要な陽性制御因子である。したがって、インターフェロン・ガンマの生物学的活性の阻害は、多様な自己免疫および／または炎症疾患に対抗する手段でありうる。生物学的活性を阻害可能な、多様なＩＦＮ−γ抗体が当該技術分野に知られる。米国特許出願第２００５／０００４３５３号および第２００３／００４９６４７号。こうした抗体は、多様な自己免疫および／または炎症疾患を治療する際に有用でありうる。例えば米国特許第６，０３６，９５６号、第６，３３３，０３２号、および第６，５５８，６６１号を参照されたい。
【００６４】
抗体を産生し、そして精製する多くの方法が当該技術分野に周知であり、そしてこれらのいずれを用いて、本発明の方法および組成物で用いる抗体を産生してもよい。典型的な方法は、例えば、米国特許出願第２００５／０００４３５３号に記載される。例えば、哺乳動物に抗原を接種し、そして血液から、抗原に対するポリクローナル抗体を採取することによって、本発明の方法および組成物で用いる抗体を産生してもよい。あるいは、接種した哺乳動物から脾臓細胞を採取し、そして不死化細胞に融合させて、モノクローナル抗体を産生しそして分泌するハイブリドーマ株を産生してもよい。抗原に結合する抗体を産生する株に関して、こうした株をスクリーニングしてもよい。さらに、抗体をコードする核酸を細菌中にクローニングしてもよい。いくつかの態様において、細菌によって抗体を産生させてもよい。あるいは、抗体をコードするＤＮＡを酵母、哺乳動物、植物、または昆虫細胞などの真核宿主細胞内に導入してもよいし、そして抗体を哺乳動物細胞によって産生させてもよい。細胞が哺乳動物細胞である場合、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓを含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫（例えばＮＳＯ、ＮＳ１）、ＰＣ１２、またはＷＩ３８細胞であってもよい。
【００６５】
タンパク質精製の技術分野に知られる多くの方法のいかなる１つまたは組み合わせによって、抗体を精製してもよい。例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ監修， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９０；Ｗｈｅｅｌｗｒｉｇｈｔ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｃａｌｅ ｕｐ ｏｆ Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， Ｈａｎｓｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９１；Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， 第３版， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １９９３；Ｇａｇｎｏｎ， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖａｌｉｄａｔｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， １９９６を参照されたい。１つの非常に一般的な抗体精製法は、プロテインＡクロマトグラフィーである。
【００６６】
本発明の組成物を、多様な障害の治療法として用いてもよい。例えば、インターフェロン・ガンマに結合する抗体を用いて、エリテマトーデス、ならびに多発性硬化症、関節リウマチ、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎を含む多様な自己免疫疾患、ならびにクローン病および潰瘍性結腸炎などの炎症性腸疾患を治療してもよい。米国特許第６，０３６，９５６号、第６，３３３，０３２号、および第６，５５８，６６１号を参照されたい。他の抗体の多くの他の使用が当該技術分野に知られ、例えば関節リウマチを治療するための抗ＴＮＦ受容体抗体の使用、または癌を治療するための抗ＥＧＦ受容体抗体の使用がある。抗体を用いて、例えば骨肉腫、膠芽細胞腫、神経膠腫、黒色腫、および髄膜腫、ならびに肺癌、乳癌、頭部および頸部癌、膀胱癌、卵巣癌、皮膚癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、腎細胞癌、膵臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、および食道癌を含む癌を治療してもよい。本明細書において、「胃腸癌」は、胃癌、食道癌、膵臓癌、および結腸直腸癌を含む。本発明の方法を用いてやはり治療可能であるのは、血液学的癌である。
【００６７】
疾患の治療は、障害の少なくとも１つの症状の軽減、疾患の重症度の減少、あるいは治療している状態に続いて、ある程度の頻度で起こる、より深刻な疾患への進行の遅延または予防を含む。治療は、疾患が完全に治癒することを意味する必要はない。有用な療法剤は、疾患の重症度を減少させるか、疾患またはその治療に関連する症状（単数または複数）の重症度を減少させるか、あるいは治療している状態に続いて、ある程度の頻度で起こりうる、より深刻な疾患の開始を遅延させさえすればよい。本明細書に意味する際、当該技術分野に知られ、そして臨床設定において疾患重症度を評価するのに用いられる方法によって、疾患の重症度を評価してもよい。
【００６８】
いかなる適切な経路によって組成物を投与してもよい。これらを、例えば、皮下、静脈内、関節内、筋内、動脈内、腹腔内注射してもよいし、あるいは例えば関節または腫瘍などの体の罹患領域内に直接注射してもよい。注入によってまたはボーラス注射によって、組成物を投与してもよい。いくつかの態様において、鼻、直腸、胃、または膣投与など、粘膜を通じた吸収によって、あるいは吸入によって、組成物を投与してもよい。体腔に挿入される座薬として経皮投与してもよいし、または点眼剤として投与してもよい。あるいは、経口投与してもよい。
【００６９】
「療法的有効用量」、すなわち治療している状態を治療するのに有効であり得るいかなる投薬量、頻度、および期間で、本発明の組成物を投与してもよい。当業者は、これが、他の考慮の中でも、抗体の分子の性質、結合する抗原のｉｎ ｖｉｖｏ濃度、ならびに治療している障害の性質および重症度に応じることを理解するであろう。望ましい結果を達成するのに必要なだけ長く、治療を続けてもよい。他の可能な投薬量措置の中でも、単回投薬として、または１日多数回、毎日、１日おき、週２回、週３回、毎週、１週おき、毎月、１ヶ月おき、１０週ごと、および１２週ごとを含めて、周期的に投与される一連の投薬として、本発明の療法分子を投与してもよい。治療の周期性は、治療期間を通じて、一定であってもまたはなくてもよい。例えば、治療をまず、毎週間隔で行って、そして後に、１週おきに行ってもよい。数日、数週、数ヶ月、または数年の期間を有する治療が、本発明に含まれる。治療を中断し、そして次いで再開してもよい。最初の治療後、維持用量を投与してもよい。単独で、または他の治療、特にその疾患を治療するために通常投与される治療と組み合わせて、本発明の組成物を投与してもよい。
【００７０】
投薬量は、体重キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）として、または皮膚表面平方メートルあたりのミリグラム（ｍｇ／ｍ２）として、あるいは身長または体重に関わらず、固定した用量として、測定可能である。これらのすべては、当該技術分野において、標準的な投薬量単位である。ヒトの皮膚表面積は、標準的な公式を用いて、身長および体重から計算される。各投薬量は、例えば、約０．００１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜約５０ｍｇ／患者体重ｋｇ、約０．０１ｍｇ／患者体重ｋｇ〜約５０ｍｇ／患者体重ｋｇ、約０．０２〜約５０ｍｇ／患者体重ｋｇであってもよい。場合によって、投薬量は、約０．０５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約１．０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【００７１】
当業者は、投与経路が、本発明の組成物の投薬量および濃度に影響を及ぼしうることを知っている。例えば、組成物を皮下投与する場合、投与可能な体積は、約５ｍｌ以下、場合によって約３、２、または１ｍｌ以下に限定されうる。したがって、組成物の濃度は、体積の限定によって影響を受ける可能性もある。他方で、組成物を静脈内注入する場合、より多くの体積を注射可能であり、そしてしたがって、組成物はより濃縮されていないことも可能である。
【００７２】
いくつかの態様において、本発明の組成物および方法は、抗体が、約５０ｍｇ／ｍｌ未満、場合によって約４５、４０、３５、３０、２５、１０、５、１、または０．１ｍｇ／ｍｌ未満またはそれに等しい濃度であることを必要とする。あるいは、またはさらに、本発明の組成物および方法は、抗体が、約０．０１、０．１、１、５、１０、または５０ｍｇ／ｍｌより大きいかまたはそれに等しい、場合によって、約７５ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、または２５０ｍｇ／ｍｌより大きいかまたはそれに等しい濃度であることを必要としうる。当業者は、特定の抗体のための特定の異なる投与経路には、より高いまたはより低い濃度の組成物が、より適切でありうることを知っている。さらに、抗体濃度は、抗体にはどの配合物が最適であるかに関して、影響を及ぼしうる。したがって、異なる濃度の同じ抗体に、異なる配合物が適している可能性もある。異なる抗体に必要な有効用量は、結合親和性、解離定数、および抗体が結合する抗原の存在量などの要因に応じて、非常に異なりうる。したがって、異なる濃度の抗体を有する組成物が、異なる場合で適切であろう。さらに、抗体を皮下投与する際、この方式で投与可能な容量は限定される。したがって、皮下投与される抗体組成物は、例えば静脈内注入によって投与される同じ抗体組成物より、より濃縮されていてもよい。
【００７３】
本発明を記載してきたが、以下の実施例を、例示の目的で提供し、そして限定の目的では提供しない。本明細書に引用するすべての参考文献は、その全体が本明細書に援用される。
【００７４】
実施例
実施例１：アイソフォームの精製
以下の実施例において、用いた抗体は、培養哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞）によって産生された２つの重鎖および２つの軽鎖を含む、ヒトＩＦＮ−γに対する全長ヒトＩｇＧ１抗体であり、そしてその重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１７および配列番号１８に開示する。重鎖アミノ酸配列は、ＶＨおよびＣＨ２領域中、それぞれ、配列番号１７のアミノ酸２８および２９７にＮ−グリカン部位を有した。本実施例において、分子あたり異なる数のシアル酸を有するアイソフォームを単離した。バルク抗体物質は、いくつかのカラム・クロマトグラフィー工程を用いて精製されており、そしてアイソフォームを含む多様な構造変異体が互いに分離されていない、ろ過精製バルク（本明細書において、ＦＰＢと称する）を指す。
【００７５】
培養哺乳動物細胞上清から、３つのカラム・クロマトグラフィー工程において、バルク抗体物質（ＦＰＢ）を精製し、そして電荷にしたがって分子を分離する弱陽イオン交換（ＣＥＸ）カラムに適用し、そして０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２を含有する可動相を用いて、溶出した。このカラムのプロフィールを図２に示す。異なる数のシアル酸残基を含有するアイソフォームを含む分画を収集し、そして濃縮した。同時に、分画を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５に緩衝液交換した。対応するＣＥＸ高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）プロフィールによって、最終濃縮アイソフォーム溶液各々の純度を決定し、該プロフィールは、主に、精製前のものに匹敵する溶出時間を持つ１つのＣＥＸピークを含有した。ＣＥＸ主ピークの面積を、２１５および２８０ｎｍ両方で検出される、いかなる少量のＣＥＸピークも含めたすべてのピーク下の総面積で割ることによって、純度パーセントを定量化した。各アイソフォーム溶液の典型的な純度は、９３％〜９６％であった。表２。各々の精製アイソフォーム溶液の吸光度を、２８０ｎｍで測定し、そして各アイソフォーム溶液の濃度を、ここから得た。表２（以下）は、純度パーセント、濃度、および各精製アイソフォーム溶液の総量、ならびに各アイソフォームが含む総ＦＰＢのパーセントを示す。この最後の数字は、陽イオン交換カラムで検出される各ピーク下の面積を、すべてのピーク下の面積の合計で割ることによって、計算される。表２に含めていないピーク−３、＋３、および＋４は、合わせて、総ＦＰＢの残った６％を構成する。
【００７６】
表２
【００７７】
【表２】
【００７８】
実施例２：異なるｐＨでのアイソフォームおよびＦＰＢの配合、ならびにその安定性の評価
以下の実験は、４℃および３７℃の両方で、多様なｐＨでの、精製アイソフォームおよびＦＰＢの安定性を比較する。ＦＰＢと一緒に、精製アイソフォームを各々、最終濃度１ｍｇ／ｍｌで、以下の緩衝液中に配合した：１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４；１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５；１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６；１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７；および１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８。すべての試料はまた、５％（ｗ／ｖ）ソルビトールも含有した。蒸発を防ぐために用いるｏ−リング・キャップ付きの無菌微量試験管中に等分する前に、０．２μｍ膜を通じてろ過することによって、すべての配合抗体溶液および対応するプラセボ、すなわち抗体を欠く配合溶液を滅菌した。各試料の総容量は、約３００μｌ〜３５０μｌであった。配合抗体溶液および対応するプラセボの１組を４℃でインキュベーションし、一方、別の組を３７℃でインキュベーションし、これらはどちらも静置条件下にあった。
【００７９】
他の技術の中でも、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、逆相ＨＰＬＣ、および蛍光分光法を用いて、０、２週、１ヶ月、および３ヶ月の時点で、各試料の生物物理的および生化学的安定性を評価した。分析超遠心分離（ＡＵＣ）を用いて、ＳＥＣによって検出されたＨＭＷ種のおよその分子量を決定した。ｐＨ５の配合物中で３ヶ月間インキュベーションしておいた試料に関して、生物活性を評価した。４℃および３７℃で貯蔵しておいた、各配合タンパク質溶液、ならびに各プラセボを、不溶性種および透明度に関して調べた。４℃または３７℃のいずれかで３ヵ月置いた後、抗体を含む試料および含まない試料両方が、すべて、無色透明を維持し、そして微粒子物質を含まなかった。
【００８０】
タンデムに連結した２つのＳＥＣカラムを用いると、ＳＥＣは、単量体（この場合、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する四量体抗体）、高分子量（ＨＭＷ）（例えば二量体および凝集体）、および低分子量（ＬＭＷ）種のレベルの定量化を提供した。各カラム試料は、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、２０μｇであった。多数の試料を流して、再現性を保証した。検出波長を、２１５および２８０ｎｍに設定した。ＳＥＣにおいて、大部分の試料では、大部分の物質は、単一の主要なピークとして溶出した。このピークは、単量体を含有する。この関連において、抗体がＩｇＧ抗体である場合、単量体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む四量体抗体であり、分子量は、およそ１５０，０００ダルトンであった。しかし、単量体主ピーク以外の４つの目立つピークが、３７℃でインキュベーションした配合物由来の試料の中で観察された。１０ｍＭリン酸ナトリウム、５％ソルビトール中、ｐＨ８に配合したＦＰＢおよび個々の異なる精製アイソフォームを含有し、３７℃で３ヶ月間貯蔵した試料のＳＥＣカラム・プロフィールを図３に示す。これらの試料はすべて、単量体を含有する顕著な主ピークを、そして２つのより高分子量のものに加えて、２つのより低分子量のピークを示した。２つの低分子量種をＬＭＷ１およびＬＭＷ２と称した。最高の高分子量種を凝集体と称し、そして次の溶出種を二量体（２つの四量体抗体を含む二量体を意味する）と称した。これらの命名は、分析超遠心分離（ＡＵＣ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した分子量に基づいた。ＡＵＣを用いて、非還元条件下で、ＳＥＣによって検出されたＨＭＷ種のおよその分子量を決定した。還元条件下での、すなわちジスルフィド結合が破壊される条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、ＨＭＷ種のサイズを評価した。
【００８１】
図４Ａ〜４Ｅは、各時点で、ＳＥＣによって測定されるような単量体として維持された総物質パーセントを示す。すべてのｐＨで、４℃でインキュベーションしたすべての試料において、ほとんどの物質は、少なくとも３ヶ月間、抗体単量体のままであった。しかし、３７℃で貯蔵した試料は、特にｐＨ５の試料中で、単量体種のかなりの損失を示した（図４Ｂ）。３７℃、ｐＨ５で貯蔵した、アイソフォーム・ピーク−２およびピーク０の物質は、他のいかなる試料よりも多くの単量体を損失し、そしてアイソフォーム・ピーク−２およびピーク０の試料は、試験した大部分の他のｐＨで、単量体パーセントに関して、より低いスコアの試料の中にあった。群として、そして個々に、３７℃、ｐＨ５の試料は、他のいかなるｐＨおよび温度でインキュベーションした試料より、はるかに多くの単量体損失を示した。群として、そして個々に、３７℃、ｐＨ６でインキュベーションした試料は、他のいかなる３７℃の試料よりも、より高い割合の単量体を含有した。図４Ａ〜４Ｅ。
【００８２】
これらの実験はまた、異なるアイソフォームおよびＦＰＢ間の相違も明らかにし、相違は、ｐＨ４および５の３７℃の試料で特に明らかであった。ＦＰＢは、一貫して、すべてのｐＨで、最高量の単量体を有する試料の中にあった。図４Ａ〜４Ｅ。ｐＨ４および５で、ＦＰＢは、いかなる精製アイソフォームより安定であり、アイソフォームの組み合わせは混合物を安定化することが示唆された。図４Ａ〜４Ｂ。ｐＨ７および８で、ＦＰＢは、一貫して、最も安定した精製アイソフォームと同程度に安定であり、そしてアイソフォーム−２、−１、＋１、および０より、より安定であり、これらのアイソフォームは、合わせて、ＦＰＢに含有される総抗体の約８５％を含む。図４Ｄ〜４Ｅ。ｐＨ６では、ＦＰＢおよびアイソフォーム＋２、＋１、および０は、ほぼ等しく安定であり、そしてアイソフォーム−１および−２は、わずかにより安定でなかった。図４Ｃ。ＦＰＢ中のアイソフォーム混合物中の各アイソフォームが、ＦＰＢにおいて、精製型における場合と同じ安定性を有するならば、ＦＰＢは、最も安定でないアイソフォームおよび最も安定なアイソフォームのものの間の安定性を有すると予期される。これは、いかなるｐＨでもあてはまらない。したがって、これらのデータは、ＦＰＢ中のアイソフォーム混合物が、安定化する影響を発揮することを意味すると解釈可能である。
【００８３】
図５は、高分子量種（水平線より上、ΣＨＭＷと表示）、すなわち二量体および凝集体、ならびに低分試料種（水平線より下、ΣＬＭＷと表示）、すなわちＬＭＷ１およびＬＭＷ２である、４℃（図５Ａ）および３７℃（図５Ｂ）でインキュベーションした試料の中のＳＥＣカラムプロフィール下の総面積の割合を示す。異なるｐＨで、４℃でインキュベーションした試料は同様である。にもかかわらず、４℃でインキュベーションしたＦＰＢ試料は、一貫して、すべてのｐＨに渡って、他の試料より低いレベルのＨＭＷ種を有し、そしてアイソフォーム・ピーク＋２試料は、一貫して、他の試料より高いレベルのＨＭＷ種を有する。３７℃でインキュベーションした試料は、互いに根本的に異なり、そしてｐＨ５の試料、特にアイソフォーム・ピーク０および−２の試料は、他のｐＨでインキュベーションした試料に比較して、実質的に非常に高い比率の二量体および凝集体を含有した。ｐＨ４、７、および８でインキュベーションした試料は、低い割合のＨＭＷ種を含有したが、ｐＨ６の試料は、３７℃の試料の中で、最低の割合のＨＭＷ種を含有した。さらに、３７℃でインキュベーションしたｐＨ７および８の試料は、他のｐＨの３７℃の試料より、わずかに多量のＬＭＷ１およびＬＭＷ２を有する。図５Ｂ。
【００８４】
図６は、３７℃でインキュベーションした試料の中で、二量体（図６Ａ）またはより高次の凝集体（図６Ｂ）であった、ＳＥＣカラム・プロフィール下の総面積の割合を示す。ｐＨ５でインキュベーションした試料は、他のｐＨでインキュベーションした試料より実質的により高い割合の二量体および凝集体を有した。ｐＨ５の試料の中で、アイソフォーム・ピーク−２およびピーク０の試料は、他の試料より高い割合の凝集体を含有した。ｐＨ４、７、および８でインキュベーションした試料は、低い割合の凝集体および二量体を含有したが、ｐＨ６の試料は、最低の割合の二量体および凝集体を含有した。したがって、図４〜６のデータは、３７℃でインキュベーションしたｐＨ６の試料が、他の３７℃の試料よりも少ない高分子量種を含有したことを示す。凝集体は、免疫原性であることが知られるため、凝集体の形成は、抗体配合物において、特に懸念される。Ｈｅｒｍｅｌｉｎｇら（２００４）， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２１（６）：８９７−９０３。
【００８５】
Ａｇｉｌａｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ−８カラム上で行う逆相ＨＰＬＣを用いて、抗体のフォールディングに関連しうる特性である疎水性に関連する、配合抗体の変化をさらに性質決定した。さらに、逆相クロマトグラフィーは、貯蔵中の抗体の切断を介して形成可能な親水性または疎水性ペプチドの形成を検出可能である。溶液ＢおよびＡの３０：７０の混合物中で、逆相カラムに装填し、そして３０％溶液Ｂから５０％溶液Ｂに進行する勾配中で溶出した。溶液Ａは、０．１２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、そして溶液Ｂは、６０％イソプロパノール、３０％アセトニトリル、０．１２％ＴＦＡであった。図７Ａおよび７Ｂは、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８、５％ソルビトール中、４℃（図７Ａ）および３７℃（図７Ｂ）で３ヶ月インキュベーションした試料からの逆相ＯＤ２１５カラム・プロフィール群を示す。３７℃の試料のカラム・プロフィール中の初期に、小さいピークが観察され、これはおそらく、抗体から切断された小さい親水性ペプチドである。このピークは、４℃の試料には存在しない。どちらの温度の物質の大部分も、単一ピークとして移動したが、ピークは、４℃の試料におけるより、３７℃の試料でより広い。図７。
【００８６】
図８は、主ピークの部分（図８Ａ）または初期に溶出する切断された種の部分（図８Ｂ）である、多様に示したｐＨでの３７℃の試料の逆相カラム・プロフィール下の総面積の割合を示す。試験した他のいかなるｐＨよりも、ｐＨ８で、より多くの切断された種が観察される。ｐＨ５〜ｐＨ７の試料は、最低の割合の切断種を有し、そして最高の割合の主ピーク中の物質を有する。アイソフォームおよびＦＰＢ間の相違は、ｐＨ８で最大である。最多の凝集体を生じたアイソフォーム・ピーク−２および０はまた、ｐＨ８で最多の親水性クリップを有する。ＦＰＢは、ｐＨ８で、アイソフォーム・ピーク−２および０より少ないクリップを有するが、アイソフォーム・ピーク−１、＋１、および＋２より多い。
【００８７】
蛍光分光法によって、各時点での試料の三次構造および二次構造の変化を評価した。０．１８ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで、対応する配合緩衝液で試料を希釈した。２３℃の試料チャンバーを用い、発光スキャンモードで操作する、Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの二元発光ビーム蛍光分光計から、固有の蛍光測定値を得た。励起波長２８０ｎｍで、３００〜４２５ｎｍの間、発光スキャンを行って、チロシンおよびトリプトファン残基による蛍光を評価した。励起波長２９３ｎｍでもまた発光スキャンを行い、主にトリプトファン残基による蛍光を評価した。
【００８８】
結果は、ゼロ時点のすべての試料に関して、３ヶ月の貯蔵後の、４℃のすべての試料に関して、そしてｐＨ６、７、および８の３７℃の試料に関して、最大蛍光発光の波長が３２６ｎｍであることを示した。しかし、ｐＨ４および５の３７℃の試料に関しては、最大蛍光発光の波長は３３８ｎｍであった。生データは提示しない。これらのデータを、３２６ｎｍおよび３３８ｎｍの発光の間の比として、図９に示す。結果は、３７℃でインキュベーションしたｐＨ４およびｐＨ５の試料では、３２６ｎｍ／３２８ｎｍの比が、約１以下であり、３７℃のｐＨ６、７、または８の試料におけるように、明らかに１より大きくはないように、発光スペクトルがシフトしたことを示す。データは、３７℃でインキュベーションしたｐＨ４および５の試料中の抗体の三次構造の変化を示す。検出された蛍光は、トリプトファンおよびチロシン残基によるため、データはまた、３７℃でインキュベーションしたｐＨ４および５の抗体試料において、これらのアミノ酸のより高い曝露も示す。
【００８９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に基づくアッセイを用いて、生物学的活性を評価した。このアッセイは、Ａ５４９肺細胞を利用する。Ａ５４９細胞の増殖は、ＩＦＮ−γによって阻害可能である。該アッセイは、細胞をＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥＴＭ（ＡｃｃｕＭｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．、イリノイ州シカゴ）で染色することによって、増殖を測定する。ＩＦＮ−γによる増殖の阻害を半分救済するのに必要な抗体の濃度（ＩＣ５０）を表３に示す。このアッセイは、本明細書に援用される米国特許出願第２００５／０００４３５３号により詳細に説明される。表３に示す温度で、ｐＨ５で３ヶ月間貯蔵した精製アイソフォームおよびＦＰＢの試料を試験した。
【００９０】
表３
【００９１】
【表３】
【００９２】
これらのデータは、上述の試料の物理的特性、およびここで測定するような生物学的活性の間に明らかな関連がないことを示す。３７℃、ｐＨ５で形成される二量体および凝集体がかなりの量であることを考慮すると、これらのデータは、二量体および凝集体の形成が、ここで測定するような生物学的機能に影響を及ぼさないことを示唆するようである。しかし、他の実験において、希釈が、ｐＨ５の試料に存在する可溶性凝集体および二量体の形成を少なくとも部分的に逆転させうることが立証されている。データ未提示。この実験を行うために、試料を希釈することから、この実験から、生物学的活性に対する、凝集体および二量体形成の影響に関していかなる結論付けを行うことも不可能である。要約すると、すべての試料は、少なくともここで試験した生物学的活性の側面において、生物学的に活性である。試料の免疫原性は評価しない。
【００９３】
ＳＥＣ、逆相、および蛍光発光データを合わせて解釈すると、結果は、ｐＨ６の貯蔵条件が、試験した他の条件よりも抗体の構造を保持することを示唆する。特に、蛍光発光データは、ｐＨ６、７、および８の条件が、ｐＨ４および５の条件に匹敵し、そしてこれらより優れていることを示す。逆相データは、ｐＨ５、６、および７の条件が、ｐＨ４および８の条件に匹敵し、そしてこれらより優れていることを示した。最後に、ＳＥＣのデータは、ｐＨ６の条件が、３７℃でのＦＰＢおよびすべての個々のアイソフォームに関して、最も好ましいことを示し、これにｐＨ４、７、および８の条件が続いた。ｐＨ５の条件において、凝集体および二量体の大部分が、３７℃で観察された。４℃でほぼ２年後、ここに記載する各配合物中のＦＰＢ試料のｐＨを測定すると、各配合物に関して、ｐＨが不変であることが示された。ｐＨ６、７、および８で配合し、そして３７℃で３ヶ月インキュベーションし、そしてその後、４℃でほぼ２１ヶ月貯蔵した試料もまた、不変のｐＨを有し、一方、ｐＨ４および５で配合して、同様に処理した試料は、ほぼ１ｐＨ単位の増加を受けた。データ未提示。ｐＨ４および５で配合した試料のｐＨの増加は、タンパク質分解および／または用いた緩衝剤の特定のロットの何らかの特性による可能性もある。
【００９４】
データはまた、ＦＰＢが、試験した各条件において、最も安定な個々のアイソフォームと同程度にまたはより安定であることも示す。図４Ａ〜４Ｅを参照されたい。個々のアイソフォームが、単離中で、そしてＦＰＢの構成要素としてインキュベーションされた際、同一の安定性を有するならば、ＦＰＢは、最も安定なアイソフォームおよび最も安定しないアイソフォームの間の中間の安定性であろうと予期される。これが当てはまらないという事実は、アイソフォームの組み合わせが、組成物を安定化させうることを示唆する。
【００９５】
実施例３：ソルビトールを含み、そして含まず、ある範囲のｐＨの多様な緩衝剤を用いた配合物
以下の実験を行って、上述のように、実施例１に記載する抗体の多様なアイソフォームを含有するＦＰＢを含有する組成物の安定性に対する、ｐＨの影響、および用いた特定の緩衝剤の影響の間を区別した。さらに、ソルビトールを含む試料および含まない試料を比較して、安定性に対するソルビトールの影響を決定した。１０ｍＭクエン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはヒスチジン中、４、５、６、７、または８のターゲットｐＨで、およそ１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に各試料を配合した。最終濃度および可能な限りターゲットｐＨに近いｐＨで、抗体以外のすべての構成要素を含む配合物溶液を作製した。濃縮溶液から、直接、配合溶液になるように、抗体調製物を、およそ２９倍希釈し、これは、いくつかの場合、ｐＨを実質的に変化させた。これは、試験したいくつかのｐＨが、いくつかの緩衝剤の緩衝範囲内でなかったため、驚くべきことではない。表４は、試料を記載し、そして抗体添加後の最終配合物の実際のｐＨを示す。ＮＡＮＯＤＲＯＰＴＭ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国デラウェア州ウィルミントン）を用いて、２８０ナノメートルの光学密度（ＯＤ２８０）を測定し、そして１．５μｇ／ｍｌ／ＯＤ２８０の吸光係数を用いて、タンパク質濃度を計算することによって、各完全配合物のタンパク質濃度を測定した。
【００９６】
４℃または３７℃の静置条件下で、試料をインキュベーションした。蒸発を防ぐために用いるｏ−リング・キャップ付きの無菌微量試験管中に等分する前に、０．２μｍ膜を通じてろ過することによって、すべての配合抗体溶液および対応するプラセボ、すなわち抗体を欠く配合溶液を滅菌した。各試料の総体積は、約６５０μｌであった。
【００９７】
表４：試料の説明
【００９８】
【表４Ａ】
【００９９】
【表４Ｂ】
【０１００】
実施例２に説明するように、ＳＥＣを用いて、貯蔵０、４、８、および１２週間後、安定性を評価した。図１３は、ソルビトールを含み（左のパネル）そして含まず（右のパネル）、ゼロ時点で、ＳＥＣによって測定するような、単量体パーセントを示す。図１３および続く図において、列挙するｐＨは、ターゲットｐＨであり、上に説明するように、いくつかの場合では、実際のｐＨ（表４に列挙するもの）とは幾分異なる。配合物のｐＨがターゲットｐＨから実質的に逸脱している場合のデータ点（すべてを含むターゲットｐＨ４以外）を図から省く。ソルビトールを含む配合物および含まない配合物のすべては、ゼロ時点では、同程度の単量体パーセント（およそ９８％）を有した。図１３。図１４は、ソルビトールの存在下（左のパネル）および非存在下（右のパネル）での、３７℃で１２週間後の単量体パーセントを示す。４のターゲットｐＨの試料は、一般的に、約９５％以下の単量体を有し、５のターゲットｐＨのクエン酸ナトリウム試料、ならびに７および８のターゲットｐＨのリン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム試料、ならびにターゲットｐＨ８のソルビトールを含まないヒスチジン試料も同様であった。ソルビトールを含む試料および含まない試料のデータは、一般的に同程度であるが、ソルビトールは、いくつかの例で保護効果を示した。３７℃で１２週間後、ソルビトールを加えた、ヒスチジン、酢酸ナトリウム、およびクエン酸ナトリウム中の最高の試料は、９７％に近い単量体を有し、一方、ソルビトールを加えたリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム中の最高の試料は、わずかにより少ない単量体パーセントを有した。図１４。４℃でインキュベーションした、試験した緩衝剤のいずれか１つに加えてソルビトールを含む試料は、１２週間後、単量体パーセントに本質的にまったく変化を示さなかった。データ未提示。
【０１０１】
ソルビトールを含みまたは含まず、ヒスチジンまたは酢酸ナトリウムを含有する試料に関して、ｐＨ６の試料が、３７℃で１２週間後、同じ緩衝剤中、同じ試料の間で、最高の単量体パーセントを有した。図１５および１６。ソルビトールとともに、リン酸カリウムを含有する試料に関しても同じことが当てはまった。図１８。残りの試料において（ソルビトールを含む、および含まない、クエン酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウム、ならびにソルビトールを含まないリン酸カリウム）、３７℃で１２週間後、ｐＨ６の試料が、最高で、そしてほぼ等しい単量体パーセントを持つ２つの試料の１つであった。図１７〜１９。したがって、ｐＨ６は、用いた緩衝剤に関わらず、抗体を安定化させるために最高のｐＨまたは２つの最高のｐＨの１つのいずれかであった。
【０１０２】
図２０は、３７℃で１２週間後の、ソルビトールを含み、そして含まずに試験した、緩衝剤およびｐＨのすべてに関する単量体パーセントを示す。これは、試験した緩衝剤すべてに関する単量体パーセントが、ｐＨ６では非常に近いが、他のｐＨではそうではなかったため、抗体の安定性が、約ｐＨ６以外のｐＨでは、用いた緩衝剤にはるかにより依存することを示す。これはまた、特にｐＨ８の試料において、ソルビトールの防御効果も明らかにする。しかし、異なる緩衝剤が異なるｐＨ範囲に渡って有効であった。例えば、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムは、ターゲットｐＨ５および６で最も有効であったが、ターゲットｐＨ７および８では、ヒスチジンおよびクエン酸よりもはるかに低い単量体パーセントを有した。ヒスチジンはターゲットｐＨ５〜７で有効であったが、ターゲットｐＨ６で最適であった。酢酸ナトリウムはターゲットｐＨ５〜６でよく働き、そしてクエン酸ナトリウムは、ターゲットｐＨ６〜７で最も有効であった。また、クエン酸ナトリウムは、他の緩衝剤に比較して、ターゲットｐＨ４で非常に低い単量体パーセントを有し、これは、クエン酸ナトリウム試料の実際のｐＨが、ターゲットｐＨ４の他のいずれの試料よりも、ｐＨ４により近い（そしてより酸性である）という事実を反映している可能性もある。クエン酸ナトリウムはまた、試験した剤すべてが、最大でもｐＨ５の０．２３ｐＨ単位以内のｐＨを有したにもかかわらず、ｐＨ５で試験したすべての緩衝剤のうち、最低の単量体パーセントも有した。
【０１０３】
図２１は、ソルビトールを含む試料および含まない試料に関して、ＳＥＣ（実施例２に説明するようなもの）によって決定した際の、低分子量種（ＬＭＷ１およびＬＭＷ２）のパーセントを示す。図２０と組み合わせて考えると、図２１は、単量体損失の大部分が、ソルビトールを含む試料および含まない試料中の低分子量種の形成によるものであることを示す。
【０１０４】
図２２は、３７℃で１２週間静置インキュベーションした後、ＳＥＣによって測定した際に二量体である総試料のパーセントを示す。ｐＨ７または８でインキュベーションした試料、特にリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム中の試料は、より高い二量体パーセントを有した。ソルビトールは、ｐＨ８で、ヒスチジン試料に対してわずかな防御効果を有した。したがって、二量体形成は、ｐＨ７または８のリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム中の試料で見られる単量体パーセントの減少のある程度を説明する。
【０１０５】
総合すると、これらのデータは、抗体が、多様な緩衝剤中、約ｐＨ６で比較的安定であることを示す。ソルビトールは、いくつかの条件下で、安定化効果を有する。３７℃でインキュベーションした試料中、単量体パーセントの損失の大部分は、低分子量種の形成のためであったが、ｐＨ７および８のいくつかの試料では、二量体形成もまた原因であった。３７℃で１２週間貯蔵した後のソルビトールを含むおよび含まないすべての試料のｐＨの測定は、ゼロ時点で測定したものとｐＨの変化を示さなかった。データ未提示。
【０１０６】
実施例４：安定性に関する精製アイソフォーム混合物の試験
異なる精製アイソフォーム（実施例１に記載）が異なる安定性を有することを、実施例２に示し、そしてＦＰＢ（すべてのアイソフォームを含有する）は、一般的に、精製アイソフォームのうち、最も安定なものと同程度に安定であった。この観察のありうる説明は、ＦＰＢ試料に存在するいくつかの要素が、個々のアイソフォームの単離中に取り除かれることである。これが正しいならば、ＦＰＢにおいて見られるものとほぼ同じ比のアイソフォーム混合物（以下の表５に記載するＩｓｏＢｕｌｋ混合物のようなもの）が、ＦＰＢより安定でないことが予期される。
【０１０７】
以下に記載する実験において、安定性に関して、精製アイソフォームの多様な組み合わせを試験した。さらに、ＦＰＢ（ＩｓｏＢｕｌｋと称する）に存在するのとほぼ同じ比のアイソフォーム−２、−１、０、１、および２の混合物を試験して、こうした混合物がＦＰＢと同様に振舞うかどうかを決定した。ＦＰＢは、ＩｓｏＢｕｌｋを作製するのに用いたものに加えて、３種、すなわち３、４、および−３を少量含有する。図２を参照されたい。表５は、試料を説明する。
【０１０８】
表５：試料の説明
【０１０９】
【表５Ａ】
【０１１０】
【表５Ｂ】
【０１１１】
図２３は、選択したｐＨで優れた緩衝能を持つ緩衝剤を加えた５％ソルビトールを含む配合物中で、４℃または３７℃で１２週間インキュベーションした後の、ｐＨ４〜８のＦＰＢ（左のパネル）とＩｓｏＢｕｌｋ（右のパネル）の比較を示す。実施例２に記載するように、ＳＥＣによって単量体パーセントを測定した。酢酸ナトリウムは、ｐＨ４および５で用いた緩衝剤であり、ｐＨ６ではヒスチジンを用い、そしてｐＨ７および８ではリン酸ナトリウムを用いた。４℃でインキュベーションしたＦＰＢおよびＩｓｏＢｕｌｋ試料（図２３、黒塗りの円）はどちらも、ゼロ時点の試料と実質的に同じであった。データ未提示。４℃でインキュベーションしたＩｓｏＢｕｌｋ試料はすべて、４℃でインキュベーションしたＦＰＢ試料に関して観察されたもの（約９９％）に比較して、わずかにより低い単量体パーセント（約９８％）を有した。３７℃でインキュベーションしたＦＰＢ試料は、ｐＨ４、５、および６で、ＩｓｏＢｕｌｋ試料よりわずかにより高い単量体パーセントを有し、そしてｐＨ７および８で顕著により高い単量体パーセントを有した。ＦＰＢ対ＩｓｏＢｕｌｋに関して、出発単量体パーセントおよびｐＨ４、５、または６、３７℃で１２週間後の単量体パーセントの間の相違は、ほぼ同じであった。したがって、ＦＰＢおよびＩｓｏＢｕｌｋは、ｐＨ４、５、または６でほぼ同等に安定である。このデータはまた、ＩｓｏＢｕｌｋが、ｐＨ７および８で、ＦＰＢより安定でないことも示す。したがって、少なくともｐＨ４〜６では、図４で観察された結果は、アイソフォーム精製中に、ＦＰＢ中の安定化要素が除去されたことによっては説明不能である。こうした説明は、ｐＨ７および８でのＦＰＢに比較したＩｓｏＢｕｌｋの安定性減少を潜在的に説明しうる。
【０１１２】
図２４および２５は、３７℃で８週間静置インキュベーションした後の、精製アイソフォームまたはアイソフォーム混合物を含有する個々の試料をＳＥＣ（上述のようなもの）によって測定した際の、純単量体パーセント損失を示す。５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５（図２４）中、または５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジンｐＨ６（図２５）中のいずれかに、試料を配合した。単一の精製アイソフォームを含有する試料は、単量体パーセントの最大の損失を有し、その後、２つの精製アイソフォームの混合物を含有する試料が続いた。これは、試験した配合物両方に当てはまった。図２４および２５。３以上のアイソフォーム混合物を含有する試料は、単量体パーセントにおけるの同程度の損失を有し、これは一般的に、単一アイソフォームまたは２つのアイソフォームの混合物に関して観察されるものより低かった。試験した２つの混合物の１つ（アイソフォーム２および−２）は、３以上のアイソフォームの混合物に匹敵した。これらのデータは、３以上のアイソフォームを含有する混合物が、より少ないアイソフォームを含有する混合物に比較して、安定化されていることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１Ａ〜１Ｇは、Ｎ−グリカン・コア構造（１Ａ）、ガラクトースを加えたＮ−アセチルグルコサミン（ＬａｃＮＡｃ）単位を１より多く含む枝がない、二シアル化二分岐Ｎ−グリカン（１Ｂ）、二シアル化三分岐Ｎ−グリカン（１Ｃ）、２つのＬａｃＮＡｃ単位を含む１つの枝を含む、二シアル化三分岐Ｎ−グリカン（１Ｄ）、四シアル化四分岐Ｎ−グリカン（１Ｅ）、２つのＬａｃＮＡｃ単位を含む１つの枝を含む、三シアル化四分岐Ｎ−グリカン（１Ｆ）、および２つのＬａｃＮＡｃ単位を含む２つの枝を含む、三シアル化四分岐Ｎ−グリカン（１Ｇ）の構造を示す図である。記号は、以下の糖残基を表す：黒塗りの正方形、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；白抜きの円、マンノース（Ｍａｎ）；白抜きのひし形、ガラクトース（Ｇａｌ）；黒塗りのひし形、シアル酸（Ｓｉａ）；および白抜きの三角形、フコース（Ｆｕｃ）。
【図２】図２は、重鎖可変領域中にＮ−グリカン部位を有する抗体の精製調製物を装填しておいた、陽イオン交換カラムからの、２８０ナノメートル（ＯＤ２８０）での光学密度を示す、溶出プロフィールを示す。少なくとも８つの異なる荷電変異体またはアイソフォームが検出された。
【図３】図３は、３７℃で３ヶ月貯蔵した後の、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８、５％ソルビトール中に配合した試料からの、一組の重ね合わせサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＯＤ２１５カラム・プロフィールを示す。
【図４Ａ】時間、貯蔵温度、およびｐＨの関数としての、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢに関する、非変性ＳＥＣによって検出した際の単量体型である総抗体のパーセントを示す。各パネルは、４℃（黒塗り記号）および３７℃（白抜き記号）両方の、ｐＨ４（図４Ａ）、ｐＨ５（図４Ｂ）、ｐＨ６（図４Ｃ）、ｐＨ７（図４Ｄ）、およびｐＨ８（図４Ｅ）に関する、０〜３ヶ月の時点での単量体パーセントを示す。試料を以下のように配合した：ｐＨ４、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ５、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ６、５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジン；ならびにｐＨ７および８、５％ソルビトール、１０ｍＭリン酸ナトリウム。
【図４Ｂ】時間、貯蔵温度、およびｐＨの関数としての、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢに関する、非変性ＳＥＣによって検出した際の単量体型である総抗体のパーセントを示す。各パネルは、４℃（黒塗り記号）および３７℃（白抜き記号）両方の、ｐＨ４（図４Ａ）、ｐＨ５（図４Ｂ）、ｐＨ６（図４Ｃ）、ｐＨ７（図４Ｄ）、およびｐＨ８（図４Ｅ）に関する、０〜３ヶ月の時点での単量体パーセントを示す。試料を以下のように配合した：ｐＨ４、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ５、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ６、５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジン；ならびにｐＨ７および８、５％ソルビトール、１０ｍＭリン酸ナトリウム。
【図４Ｃ】時間、貯蔵温度、およびｐＨの関数としての、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢに関する、非変性ＳＥＣによって検出した際の単量体型である総抗体のパーセントを示す。各パネルは、４℃（黒塗り記号）および３７℃（白抜き記号）両方の、ｐＨ４（図４Ａ）、ｐＨ５（図４Ｂ）、ｐＨ６（図４Ｃ）、ｐＨ７（図４Ｄ）、およびｐＨ８（図４Ｅ）に関する、０〜３ヶ月の時点での単量体パーセントを示す。試料を以下のように配合した：ｐＨ４、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ５、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ６、５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジン；ならびにｐＨ７および８、５％ソルビトール、１０ｍＭリン酸ナトリウム。
【図４Ｄ】時間、貯蔵温度、およびｐＨの関数としての、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢに関する、非変性ＳＥＣによって検出した際の単量体型である総抗体のパーセントを示す。各パネルは、４℃（黒塗り記号）および３７℃（白抜き記号）両方の、ｐＨ４（図４Ａ）、ｐＨ５（図４Ｂ）、ｐＨ６（図４Ｃ）、ｐＨ７（図４Ｄ）、およびｐＨ８（図４Ｅ）に関する、０〜３ヶ月の時点での単量体パーセントを示す。試料を以下のように配合した：ｐＨ４、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ５、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ６、５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジン；ならびにｐＨ７および８、５％ソルビトール、１０ｍＭリン酸ナトリウム。
【図４Ｅ】時間、貯蔵温度、およびｐＨの関数としての、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢに関する、非変性ＳＥＣによって検出した際の単量体型である総抗体のパーセントを示す。各パネルは、４℃（黒塗り記号）および３７℃（白抜き記号）両方の、ｐＨ４（図４Ａ）、ｐＨ５（図４Ｂ）、ｐＨ６（図４Ｃ）、ｐＨ７（図４Ｄ）、およびｐＨ８（図４Ｅ）に関する、０〜３ヶ月の時点での単量体パーセントを示す。試料を以下のように配合した：ｐＨ４、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ５、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ６、５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジン；ならびにｐＨ７および８、５％ソルビトール、１０ｍＭリン酸ナトリウム。
【図５Ａ】図５は、示すような多様なｐＨで、４℃（図５Ａ）および３７℃（図５Ｂ）での３ヶ月の貯蔵後に、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢ中で形成されている低分子量および高分子量（それぞれ、ＬＭＷおよびＨＭＷ）種のパーセントを示す。ＬＭＷおよびＨＭＷ種をＳＥＣによって検出した。図４におけるように試料を配合した。
【図５Ｂ】図５は、示すような多様なｐＨで、４℃（図５Ａ）および３７℃（図５Ｂ）での３ヶ月の貯蔵後に、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢ中で形成されている低分子量および高分子量（それぞれ、ＬＭＷおよびＨＭＷ）種のパーセントを示す。ＬＭＷおよびＨＭＷ種をＳＥＣによって検出した。図４におけるように試料を配合した。
【図６Ａ】図６は、示すような多様なｐＨで、３７℃での３ヶ月のインキュベーション後に、ＳＥＣによって検出した際の、二量体（図６Ａ）および凝集体（図６Ｂ）であった、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢ由来の物質中の抗体総量の比率を示す。図４におけるように試料を配合した。
【図６Ｂ】図６は、示すような多様なｐＨで、３７℃での３ヶ月のインキュベーション後に、ＳＥＣによって検出した際の、二量体（図６Ａ）および凝集体（図６Ｂ）であった、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢ由来の物質中の抗体総量の比率を示す。図４におけるように試料を配合した。
【図７Ａ】図７は、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５％ソルビトールを含有する配合物中の、ｐＨ８での４℃（図７Ａ）または３７℃（図７Ｂ）で３ヶ月貯蔵した、図中に示すような、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢ由来の物質の重ね合わせＯＤ２１５逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）カラム・プロフィールを示す。
【図７Ｂ】図７は、１０ｍＭリン酸ナトリウムおよび５％ソルビトールを含有する配合物中の、ｐＨ８での４℃（図７Ａ）または３７℃（図７Ｂ）で３ヶ月貯蔵した、図中に示すような、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢ由来の物質の重ね合わせＯＤ２１５逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）カラム・プロフィールを示す。
【図８Ａ】図８は、示すような多様なｐＨで、３７℃でのインキュベーションの３ヶ月後の、図中に示すような、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢにおける、主ピーク中（図８Ａ）および親水性クリップ種中（図８Ｂ）の総抗体パーセントに対するｐＨの影響を示す。検出はＲＰＣによる。図４におけるように試料を配合した。
【図８Ｂ】図８は、示すような多様なｐＨで、３７℃でのインキュベーションの３ヶ月後の、図中に示すような、精製アイソフォーム・ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢにおける、主ピーク中（図８Ａ）および親水性クリップ種中（図８Ｂ）の総抗体パーセントに対するｐＨの影響を示す。検出はＲＰＣによる。図４におけるように試料を配合した。
【図９】図９は、多様なｐＨで、３７℃でのインキュベーションの３ヶ月後の、図中に示すような、ピーク−２、−１、０、＋１、および＋２、ならびにＦＰＢの配合物に関する、３３８ｎｍでのものに比較した、発光波長３２６ｎｍでの固有の蛍光強度の比を示す。励起波長は２８０ｎｍである。図４におけるように試料を配合した。
【図１０】図１０は、ヒトＶＨセグメント５−５１によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１は、ヒトＶＨセグメント５−ａによってコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２は、ヒトＶκセグメントＶＫＩＩＩ／Ａ２７によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１３】図１３は、０時点で、５％ソルビトールを含む（左のパネル）または含まない（右のパネル）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム
【０１１４】
【化１】
【０１１５】
、ヒスチジン
【０１１６】
【化２】
【０１１７】
、リン酸カリウム
【０１１８】
【化３】
【０１１９】
、リン酸ナトリウム
【０１２０】
【化４】
【０１２１】
、またはクエン酸ナトリウム
【０１２２】
【化５】
【０１２３】
中の試料においてＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。ターゲットｐＨ４のすべての試料を示すが、いくつかはｐＨ４ではない。実施例３、表４を参照されたい。ターゲットｐＨから０．４ｐＨ単位以内にないすべての他の試料を省く。
【図１４】図１４は、５％ソルビトールを含む（左のパネル）または含まない（右のパネル）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム
【０１２４】
【化６】
【０１２５】
、ヒスチジン
【０１２６】
【化７】
【０１２７】
、リン酸カリウム
【０１２８】
【化８】
【０１２９】
、リン酸ナトリウム
【０１３０】
【化９】
【０１３１】
、またはクエン酸ナトリウム
【０１３２】
【化１０】
【０１３３】
中で３７℃で１２週間静置した後の試料において、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。ターゲットｐＨ４での試料以外、ターゲットｐＨから０．４ｐＨ単位以内にないすべての他の試料を省く。
【図１５】図１５は、５％ソルビトールを含む（左のパネル）または含まない（右のパネル）、１０ｍＭ酢酸ナトリウム中の試料における、３７℃での、時間の関数としての、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。図中の試料名は表４（実施例３）におけるとおりである。ターゲットｐＨの０．４ｐＨ単位以内にない試料を省く。
【図１６】図１６は、５％ソルビトールを含む（左のパネル）または含まない（右のパネル）、１０ｍＭヒスチジン中の試料における、３７℃での、時間の関数としての、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。図中の試料名は表４（実施例３）におけるとおりである。
【図１７】図１７は、５％ソルビトールを含む（左のパネル）および含まない（右のパネル）、１０ｍＭクエン酸ナトリウム中の試料における、３７℃での、時間の関数としての、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。図中の試料名は表４（実施例３）におけるとおりである。ターゲットｐＨの０．４ｐＨ単位以内にない試料を省く。
【図１８】図１８は、５％ソルビトールを含む（左のパネル）および含まない（右のパネル）、１０ｍＭリン酸カリウム中の試料における、３７℃での、時間の関数としての、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。図中の試料名は表４（実施例３）におけるとおりである。
【図１９】図１９は、５％ソルビトールを含む（左のパネル）および含まない（右のパネル）、１０ｍＭリン酸ナトリウム中の試料における、３７℃での、時間の関数としての、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。図中の試料名は表４（実施例３）におけるとおりである。
【図２０】図２０は、ターゲットｐＨの関数としての、３７℃での静置インキュベーション１２週間後のＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントを示す。ターゲットｐＨ４のすべての試料を示すが、ターゲットｐＨから０．４ｐＨ単位より大きいすべての他の試料を省く。左のパネル中の試料は５％ソルビトールを含有し、そして右のパネル中の試料はソルビトールを含有しない。１０ｍＭの濃度で存在する異なる緩衝剤を、以下のように示す：
【０１３４】
【化１１】
【０１３５】
、酢酸ナトリウム；
【０１３６】
【化１２】
【０１３７】
、ヒスチジン；
【０１３８】
【化１３】
【０１３９】
、リン酸カリウム；
【０１４０】
【化１４】
【０１４１】
、リン酸ナトリウム；および
【０１４２】
【化１５】
【０１４３】
、クエン酸ナトリウム。ｙ軸のスケールは、左のパネルおよび右のパネルで異なる。
【図２１】図２１は、５％ソルビトールを含む試料（左のパネル）および含まない試料（右のパネル）中の、ターゲットｐＨの関数としての、３７℃での静置インキュベーション１２週間後の、ＳＥＣによって測定されるような、低分子量種、ＬＭＷ１およびＬＭＷ２のパーセントを示す。１０ｍＭの濃度で存在する異なる緩衝剤を、図２０の説明に記載するように示す。ターゲットｐＨから０．４ｐＨ単位より大きい、ターゲットｐＨ４のもの以外の試料を省く。
【図２２】図２２は、５％ソルビトールを含む試料（左のパネル）および含まない試料（右のパネル）中の、ターゲットｐＨの関数としての、３７℃での静置インキュベーション１２週間後の、ＳＥＣによって測定されるような、二量体パーセントを示す。１０ｍＭの濃度で存在する異なる緩衝剤を、以下のように示す：
【０１４４】
【化１６】
【０１４５】
、酢酸ナトリウム；
【０１４６】
【化１７】
【０１４７】
、ヒスチジン；
【０１４８】
【化１８】
【０１４９】
、リン酸カリウム；
【０１５０】
【化１９】
【０１５１】
、リン酸ナトリウム；および
【０１５２】
【化２０】
【０１５３】
、クエン酸ナトリウム。ターゲットｐＨから０．４ｐＨ単位より大きい、ターゲットｐＨ４のもの以外の試料を省く。図の下部に沿った線は、多様な試料の０時点での二量体パーセントに相当し、これらはすべて非常に類似であった。
【図２３】図２３は、４℃（黒塗りの円）または３７℃（白抜きの円）のいずれかで１２週間静置インキュベーションした後の、ＦＰＢ（左のパネル）またはＩｓｏＢｕｌｋ混合物（右のパネル、実施例４および表５に詳細に記載する）のいずれかを含有する試料に関する、ターゲットｐＨの関数としての、ＳＥＣによって測定されるような単量体パーセントを示す。すべての試料は、ソルビトールを含有した。ターゲットｐＨは、実際のｐＨに非常に近かった。ｐＨ４および５の試料を１０ｍＭ酢酸ナトリウム中で配合した。ｐＨ６の試料を１０ｍＭヒスチジン中で配合した。ｐＨ７および８の試料を１０ｍＭリン酸ナトリウム中で配合した。
【図２４】図２４は、示すように、単一精製アイソフォーム、あるいは２、３、４、５、または８の異なるアイソフォームの混合物のいずれかを含有する個々の試料に関する、３７℃での静置インキュベーション８週間後の、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントの純損失を示す。すべての試料を、５％ソルビトール、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中に配合する。単一精製アイソフォームに関するデータは、実施例２に記載する実験に由来する。アイソフォーム混合物に関するデータは、実施例３および４に記載する実験に由来する。１つまたは２つのアイソフォームを含有する試料に関するデータ点の隣の数字は、どのアイソフォームが試料中に含まれるかを示す。３、４、および５つのアイソフォームを含有する試料は、それぞれ、Ａ５Ｓ（−１、−２、−３）、Ａ５Ｓ（１、２、３、４）、およびＡ５Ｓ（ＩｓｏＢｕｌｋ）である。これらは、実施例４および表５に記載される。８つのアイソフォームを含有する試料はＦＰＢである。
【図２５】図２５は、示すように、単一精製アイソフォーム、あるいは２、３、５、または８の異なるアイソフォームの混合物のいずれかを含有する個々の試料に関する、３７℃での静置インキュベーション８週間後の、ＳＥＣによって測定した際の単量体パーセントの純損失を示す。すべての試料を、５％ソルビトール、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６中に配合する。単一精製アイソフォームに関するデータは、実施例２に記載する実験に由来する。混合物に関するデータは、実施例３および４に記載する実験に由来する。１つまたは２つのアイソフォームを含有する試料に関するデータ点の隣の数字は、どのアイソフォームが試料中に含まれるかを示す。３つおよび５つのアイソフォームを含有する試料は、それぞれ、Ｈ６Ｓ（−１、−２、−３）およびＨ６Ｓ（ＩｓｏＢｕｌｋ）である。これらは、実施例４および表５に記載される。８つのアイソフォームを含有する試料はＦＰＢである。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体および緩衝剤の精製調製物を含む薬剤組成物であって、
該組成物が約５．５〜約６．５のｐＨであり、そして
該精製調製物が、抗体の少なくとも３つの異なるアイソフォームを含む
前記薬剤組成物。
【請求項２】
抗体が重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を含む、請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項３】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも８０％同一であり、そして／または抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも８０％同一である、請求項１または２記載の薬剤組成物。
【請求項４】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも９０％同一である、請求項３記載の薬剤組成物。
【請求項５】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０を含み、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１を含む、請求項４記載の薬剤組成物。
【請求項６】
抗体が：配列番号３４を含むＣＤＲ１；配列番号３５を含むＣＤＲ２；および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含み、そして／または
抗体が：配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１；配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２；および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む
請求項１〜５のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項７】
緩衝剤が、ヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウムである、請求項１〜６のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項８】
緩衝剤がヒスチジンである、請求項７記載の薬剤組成物。
【請求項９】
緩衝剤が酢酸ナトリウムである、請求項７記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
糖、炭水化物、および／または塩をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
ソルビトールを含む、請求項１０記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
抗体がＣＨＯ細胞中で産生される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
組成物のｐＨが、約５．７〜約６．３である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
組成物のｐＨが約６．０である、請求項１３記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
液体である、請求項１〜１４のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
抗体がヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％が、単量体ピーク中にある、請求項１〜１６のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１８】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９５％が、単量体ピーク中にある、請求項１〜１７のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
緩衝剤を含む組成物中に精製調製物を配合することを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を安定化させるための方法であって、
該組成物が約５．５〜約６．５のｐＨを有し、そして
該精製調製物が、抗体の少なくとも３つの異なるアイソフォームを含む
前記方法。
【請求項２０】
抗体が重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも８０％同一であり、そして／または抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも８０％同一である、請求項１９または２０記載の方法。
【請求項２２】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも９０％同一である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０を含み、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
抗体が：配列番号３４を含むＣＤＲ１；配列番号３５を含むＣＤＲ２；および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含み、そして／または
抗体が：配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１；配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２；および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む
請求項１９〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
緩衝剤が、ヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウムである、請求項１９〜２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
緩衝剤がヒスチジンである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
緩衝剤が酢酸ナトリウムである、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
組成物が、糖、炭水化物、および／または塩をさらに含む、請求項１９〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
抗体がＣＨＯ細胞中で作製される、請求項１９〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１９〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
組成物が、約５．７〜約６．３のｐＨを有する、請求項１９〜３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％が、単量体ピーク中にある、請求項１９〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
ヒスチジンおよびモノクローナル抗体の精製調製物を含む薬剤組成物であって、
該精製調製物が、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして
該組成物のｐＨが約５〜約７である
前記薬剤組成物。
【請求項３４】
抗体が重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を含む、請求項３３記載の薬剤組成物。
【請求項３５】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも８０％同一であり、そして／または抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも８０％同一である、請求項３３または３４記載の薬剤組成物。
【請求項３６】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも９０％同一である、請求項３５記載の薬剤組成物。
【請求項３７】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０を含み、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１を含む、請求項３６記載の薬剤組成物。
【請求項３８】
抗体が：配列番号３４を含むＣＤＲ１；配列番号３５を含むＣＤＲ２；および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含み、そして／または
抗体が：配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１；配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２；および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む
請求項３３〜３７のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項３９】
抗体がＩｇＧ抗体である、請求項３３〜３８のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４０】
液体である、請求項３３〜３９のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４１】
糖、炭水化物、および／または塩をさらに含む、請求項３３〜４０のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４２】
抗体がＣＨＯ細胞中で作製される、請求項３３〜４１のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４３】
組成物のｐＨが、約５．７〜約６．３である、請求項３３〜４２のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４４】
抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項３３〜４２のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４５】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％が、単量体ピーク中にある、請求項３３〜４４のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９５％が、単量体ピーク中にある、請求項４５記載の薬剤組成物。
【請求項４７】
ヒスチジンを含む組成物中に抗体を配合することを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を安定化させるための方法であって、
該精製調製物が、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして
該組成物のｐＨが約５〜約７である
前記方法。
【請求項４８】
組成物が、糖、炭水化物、および／または塩をさらに含む、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも８０％同一であり、そして／または抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも８０％同一である、請求項４７または４８記載の方法。
【請求項５０】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも９０％同一である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０を含み、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１を含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
抗体が：配列番号３４を含むＣＤＲ１；配列番号３５を含むＣＤＲ２；および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含み、そして／または
抗体が：配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１；配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２；および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む
請求項４７〜５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項５３】
ソルビトールおよびヒスチジンを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を含む薬剤組成物であって、
抗体が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
該薬剤組成物が約６のｐＨを有する
前記薬剤組成物。
【請求項５４】
ソルビトールおよび酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、またはリン酸カリウムを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を含む薬剤組成物であって、
抗体が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
該薬剤組成物が約５〜約６のｐＨを有する
前記薬剤組成物。
【請求項５５】
ソルビトールおよびクエン酸ナトリウムを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を含む薬剤組成物であって、
抗体が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
該薬剤組成物が約６〜約７のｐＨを有する
前記薬剤組成物。
【請求項５６】
モノクローナル抗体の精製調製物および酢酸ナトリウムを含む薬剤組成物であって、
該精製調製物が、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして
該組成物のｐＨが、約５〜約６である
前記薬剤組成物。
【請求項１】
モノクローナル抗体および緩衝剤の精製調製物を含む薬剤組成物であって、
該組成物が約５．５〜約６．５のｐＨであり、そして
該精製調製物が、抗体の少なくとも３つの異なるアイソフォームを含む
前記薬剤組成物。
【請求項２】
抗体が重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を含む、請求項１記載の薬剤組成物。
【請求項３】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも８０％同一であり、そして／または抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも８０％同一である、請求項１または２記載の薬剤組成物。
【請求項４】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも９０％同一である、請求項３記載の薬剤組成物。
【請求項５】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０を含み、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１を含む、請求項４記載の薬剤組成物。
【請求項６】
抗体が：配列番号３４を含むＣＤＲ１；配列番号３５を含むＣＤＲ２；および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含み、そして／または
抗体が：配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１；配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２；および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む
請求項１〜５のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項７】
緩衝剤が、ヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウムである、請求項１〜６のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項８】
緩衝剤がヒスチジンである、請求項７記載の薬剤組成物。
【請求項９】
緩衝剤が酢酸ナトリウムである、請求項７記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
糖、炭水化物、および／または塩をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
ソルビトールを含む、請求項１０記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
抗体がＣＨＯ細胞中で産生される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
組成物のｐＨが、約５．７〜約６．３である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
組成物のｐＨが約６．０である、請求項１３記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
液体である、請求項１〜１４のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
抗体がヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％が、単量体ピーク中にある、請求項１〜１６のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１８】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９５％が、単量体ピーク中にある、請求項１〜１７のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
緩衝剤を含む組成物中に精製調製物を配合することを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を安定化させるための方法であって、
該組成物が約５．５〜約６．５のｐＨを有し、そして
該精製調製物が、抗体の少なくとも３つの異なるアイソフォームを含む
前記方法。
【請求項２０】
抗体が重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を有する、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも８０％同一であり、そして／または抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも８０％同一である、請求項１９または２０記載の方法。
【請求項２２】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも９０％同一である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０を含み、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
抗体が：配列番号３４を含むＣＤＲ１；配列番号３５を含むＣＤＲ２；および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含み、そして／または
抗体が：配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１；配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２；および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む
請求項１９〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
緩衝剤が、ヒスチジン、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはクエン酸ナトリウムである、請求項１９〜２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
緩衝剤がヒスチジンである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
緩衝剤が酢酸ナトリウムである、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
組成物が、糖、炭水化物、および／または塩をさらに含む、請求項１９〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
抗体がＣＨＯ細胞中で作製される、請求項１９〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１９〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
組成物が、約５．７〜約６．３のｐＨを有する、請求項１９〜３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％が、単量体ピーク中にある、請求項１９〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
ヒスチジンおよびモノクローナル抗体の精製調製物を含む薬剤組成物であって、
該精製調製物が、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして
該組成物のｐＨが約５〜約７である
前記薬剤組成物。
【請求項３４】
抗体が重鎖および／または軽鎖の可変領域中にＮ−グリカン部位を含む、請求項３３記載の薬剤組成物。
【請求項３５】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも８０％同一であり、そして／または抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも８０％同一である、請求項３３または３４記載の薬剤組成物。
【請求項３６】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも９０％同一である、請求項３５記載の薬剤組成物。
【請求項３７】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０を含み、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１を含む、請求項３６記載の薬剤組成物。
【請求項３８】
抗体が：配列番号３４を含むＣＤＲ１；配列番号３５を含むＣＤＲ２；および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含み、そして／または
抗体が：配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１；配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２；および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む
請求項３３〜３７のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項３９】
抗体がＩｇＧ抗体である、請求項３３〜３８のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４０】
液体である、請求項３３〜３９のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４１】
糖、炭水化物、および／または塩をさらに含む、請求項３３〜４０のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４２】
抗体がＣＨＯ細胞中で作製される、請求項３３〜４１のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４３】
組成物のｐＨが、約５．７〜約６．３である、請求項３３〜４２のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４４】
抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項３３〜４２のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４５】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９０％が、単量体ピーク中にある、請求項３３〜４４のいずれか１項記載の薬剤組成物。
【請求項４６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価した際、精製調製物中の検出可能なタンパク質の少なくとも９５％が、単量体ピーク中にある、請求項４５記載の薬剤組成物。
【請求項４７】
ヒスチジンを含む組成物中に抗体を配合することを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を安定化させるための方法であって、
該精製調製物が、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして
該組成物のｐＨが約５〜約７である
前記方法。
【請求項４８】
組成物が、糖、炭水化物、および／または塩をさらに含む、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも８０％同一であり、そして／または抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも８０％同一である、請求項４７または４８記載の方法。
【請求項５０】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１と少なくとも９０％同一である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
重鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０を含み、そして／または軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１を含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
抗体が：配列番号３４を含むＣＤＲ１；配列番号３５を含むＣＤＲ２；および配列番号３６または配列番号３７を含むＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含み、そして／または
抗体が：配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４０を含むＣＤＲ１；配列番号４１または配列番号４２を含むＣＤＲ２；および配列番号４３または配列番号４４を含むＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む
請求項４７〜５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項５３】
ソルビトールおよびヒスチジンを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を含む薬剤組成物であって、
抗体が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
該薬剤組成物が約６のｐＨを有する
前記薬剤組成物。
【請求項５４】
ソルビトールおよび酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、またはリン酸カリウムを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を含む薬剤組成物であって、
抗体が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
該薬剤組成物が約５〜約６のｐＨを有する
前記薬剤組成物。
【請求項５５】
ソルビトールおよびクエン酸ナトリウムを含む、モノクローナル抗体の精製調製物を含む薬剤組成物であって、
抗体が、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、または配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、または配列番号３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
該薬剤組成物が約６〜約７のｐＨを有する
前記薬剤組成物。
【請求項５６】
モノクローナル抗体の精製調製物および酢酸ナトリウムを含む薬剤組成物であって、
該精製調製物が、抗体の少なくとも３つのアイソフォームを含み、そして
該組成物のｐＨが、約５〜約６である
前記薬剤組成物。
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公表番号】特表２００８−５４０６８４（Ｐ２００８−５４０６８４Ａ）
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１２５８４（Ｐ２００８−５１２５８４）
【出願日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９６５０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２５２０７
【国際公開日】平成１８年１１月２３日（２００６．１１．２３）
【出願人】（５００２０３７０９）アムジェン インコーポレイテッド (76)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９６５０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２５２０７
【国際公開日】平成１８年１１月２３日（２００６．１１．２３）
【出願人】（５００２０３７０９）アムジェン インコーポレイテッド (76)
【Ｆターム（参考）】
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