へスペレチン包接化合物およびナリンゲニン包接化合物の合成方法
【課題】天然に存在するフラバノンであるヘスペリジンまたはナリンジンの生体吸収性を向上させるための方法として、生体吸収性の向上したヘスペレチン包接化合物およびナリンゲニン包接化合物ならびにそれらを合成する方法を提供すること。
【解決手段】本発明によって、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法が提供される。この方法の１例は、ヘスペリジンまたはナリンジンを、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を得る工程；および該ヘスペリジン包接化合物または該ナリンジン包接化合物を加水分解してヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程を包含する。あるいは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンを直接包接してもよい。
【解決手段】本発明によって、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法が提供される。この方法の１例は、ヘスペリジンまたはナリンジンを、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を得る工程；および該ヘスペリジン包接化合物または該ナリンジン包接化合物を加水分解してヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程を包含する。あるいは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンを直接包接してもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラバノン包接化合物の製造方法ならびにフラバノン包接化合物を含む食品および医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリフェノールは、同一分子内に複数のフェノール性水酸基を有する植物成分の総称である。ポリフェノールは種々の植物に含まれており、抗酸化能力に優れた物質である。ポリフェノールは、種々の生理活性を有しており、医薬品、食品などの種々の用途に利用されている。ポリフェノールの中でも特に、フラボノイドに関する研究が進んでいる。
【０００３】
フラボノイドについては、例えば、以下のような生理活性が知られている。ヘスペリジンおよびルチンは、古くからビタミンＰとして知られており、ビタミンＰは、血圧を下げる作用を有することが知られている（非特許文献１：神谷真太郎、新ビタミン学（日本ビタミン学会）１９６９、ｐ４３９）。ヘスペリジンはさらに、抗アレルギー作用（非特許文献２：松田英秋ら、薬学雑誌、１１１、１９３−１９８（１９９１）、非特許文献３：Ｊ．Ａ．Ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｅｍｉｍら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４６，１１８−７１２（１９９４））、ＬＤＬ−コレステロールを減少させ血中コレステロール値を改善する作用（非特許文献４：Ｍ．Ｔ．Ｍｏｎｆｏｒｔｅら、ＩｌＦａｒｍａｃｏ，５０，５９５−５９９（１９９５））、抗癌作用（非特許文献５：Ｔ．Ｔａｎａｋａら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５４，４６５３−４６５９（１９９４）、非特許文献６：Ｔ．Ｔａｎａｋａら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５７，２４６−２５２（１９９７）、非特許文献７：Ｔ．Ｔａｎａｋａら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，７６１−７６９（１９９７）、非特許文献８：Ｔ．Ｔａｎａｋａら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，９５７−９６５（１９９７））などの生理作用を有することが報告されている。非特許文献９（Ａ．Ｇａｒｇ，Ｓ．Ｇａｒｇ、Ｌ．Ｊ．Ｄ．ＺａｎｅｖｅｌｄおよびＡ．Ｋ．Ｓｉｎｇｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｔｒｕｓ ｂｉｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ，ＰＨＹＴＯＴＨＥＲＡＰＹ ＲＥＳＡＲＣＨ １５，６５５−６６９（２００１））は、ヘスペリジンの化学および薬理作用について概説している。非特許文献９は、ヘスペリジンが、上記の作用以外にも、毛細血管壁の透過性および脆弱性を低下させる作用、大腸炎抑制作用、関節炎抑制作用、血小板および細胞の凝集抑制作用などの多様な生理作用を有することを記載する。
【０００４】
さらに、最近の研究では、ヘスペリジンは前駆脂肪細胞の分化を促進し、糖尿病などの症状を改善する作用も期待されている。ヘスペリジンはまた、血行改善効果を持ち、血行改善による、肩こり、冷え性等の改善効果（特許文献１：特開平１１−１７１７７８号公報）、肌状態の改善効果（特許文献２：特開２００３−３２５１３５号公報）、および骨粗しょう症改善効果（特許文献３：特開２００２−２３４８４４号公報）などを有することも報告されている。
【０００５】
ナリンジンは柑橘類の苦味物質として知られており、苦味の付与を目的に食品・飲料などに用いられている。またそのアグリコンであるナリンゲニンは、抗変異原性（非特許文献１０：Ｗ．Ｌ．ＢｅａｒおよびＲ．Ｗ．Ｔｅｅｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ ｏｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ １Ａ２ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：３６０９−３６１４（２０００）．）、細胞成長抑制作用（非特許文献１１：Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ− ｏｒ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ＨＬ６０ ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６２：２１９９−２２０４（１９９８））、筋収縮促進作用（非特許文献１２：Ｍ．Ｄ．ＨｅｒｒｅｒａおよびＥ．Ｍａｒｈｕｅｎｄａ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ ａｎｄ ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ ｏｎ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ ｉｎ ｒａｔ ｖａｓ ｄｅｆｅｒｅｎｓ−Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ａｌｐｈａ−２ ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃ．２４：７３９−７４２（１９９３））、腸管運動阻害作用（非特許文献１３：Ｇ．Ｄ．Ｃａｒｌｏら，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５：１０５４−１０５９（１９９３））、カルシウム流入阻害作用（非特許文献１４：Ｊ．Ｓｕｍｍａｎｅｎら，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ Ｃａ２＋ ｆｌｕｘｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ＧＨ４Ｃ１ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４１４：１２５−１３３（２００１））などの種々の生理活性を有することが報告されている。
【０００６】
フラボノイドは、ｐＨ３〜１０の領域で難溶性であり、沈澱を形成しやすい。例えば、フラボノイドの１種であるバイカレインは、投与量の約３００万分の１しか吸収されない。このように、フラボノイドは、体内への吸収効率が極めて悪いことが知られている（非特許文献１５：Ｗ．Ｗａｋｕｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，５７５，１３１−１３６（１９９２））。体内に吸収されないと、フラボノイドの持つ生理活性が生体内で充分発揮されない。そこで、その吸収効率を上昇させることが切望されていた。
【０００７】
天然に存在するフラボノイドは、一般的にアグリコンに糖が結合した配糖体の形で存在する。配糖体の形態のフラボノイドは、動物により摂取された後、腸管中に存在する細菌が産生する酵素により糖が加水分解され、アグリコンとなった後、大腸から体内に取り込まれると考えられている。フラボノイドの体内への吸収量を上げるための様々な試みが検討されてきたが、その一つとしてフラボノイドの溶解性を向上させる方法が検討されてきた。
【０００８】
例えば、非特許文献１６（Ｋａｙｏｋｏ Ｓｈｉｍｏｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５１巻，第９号（２００３））は、アグリコンであるケルセチン、ケルセチンの二配糖化物であるルチン、およびケルセチンの三配糖化物である４Ｇ−α−Ｄ−グルコピラノシルルチン（αＧ−ルチン）のラット体内への吸収性を比較している。非特許文献１６によれば、ケルセチン＜ルチン＜αＧ−ルチンの順で吸収性が上昇する。
【０００９】
ケルセチン、ルチンおよびαＧ−ルチンの吸収性および水への溶解度を以下の表１および図５にまとめる。吸収性は、非特許文献１６の表１のＡＵＣ０→２４ｈに基づく。なお、ここで、ＡＵＣ０→２４ｈは、非修飾体とメチル化体との合計（例えば、ケルセチンの場合は、ケルセチン、タマリゼチンおよびイソラムネチンの合計）の値を用いた。相対比として、αＧ−ルチンのＡＵＣ０→２４ｈを１．０としたときの比を示す。溶解度は、ルチンおよびαＧ−ルチンについて既知の値を示す。ケルセチンは水にほとんど溶けない。なお、図５においては、対数グラフ上に載せるためにケルセチンの溶解度を０．０１としてプロットした。
【００１０】
【表１】
【００１１】
表１および図５を見ると、溶解度が上昇するほど吸収性が上昇することがわかる。これらのことから、フラボノイドの溶解度を上昇させれば吸収性が上昇すると考えられる。
【００１２】
一般に、フラボノイドを配糖化すると溶解度が上昇する。そのため、フラボノイドを配糖化することにより溶解度を上昇させる試みが種々行われている。
【００１３】
例えば、特許文献４（特開２０００−７８９５６号公報）は、フラボノイド（例えば、配糖体であるヘスペリジン）に糖を結合させることにより、その糖転移化合物が非糖転移化合物よりも高率で体内に吸収されることを記載する。
【００１４】
特許文献５（特開２０００−７８９５５号公報）は、フラボノイド（例えば、配糖体であるヘスペリジン）に糖が結合した糖転移化合物と、フラボノイドとを共に生体に投与することにより、フラボノイドの生体への吸収効率が大きく改善されることを記載する。
【００１５】
フラボノイドの水に対する溶解度を向上させる方法としては他に、フラボノイドをシクロデキストリンで包接する方法が公知である。例えば、特許文献６（特開平６−５４６６４号公報）は、ケルセチンの配糖体であるルチンをシクロデキストリンで包接することにより、水に対する溶解度を大幅に向上させることができることを記載する。
【００１６】
しかし、他方で、ルチンをβ−シクロデキストリンで包接しても吸収性にほとんど影響がないという文献（非特許文献１７：Ｋｏｕｚｏｕ Ｍｉｙａｋｅら，Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｏｒａｌ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ｂｙ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５（３），３９９−４０７（２０００））もある。
【００１７】
このように、従来、フラボノイドの吸収性を向上させる方法の一つとして、フラボノイドの溶解度を向上させることが試みられていた。フラボノイドの溶解度を向上させるためには、配糖体であるフラボノイドをさらに配糖化するか、またはシクロデキストリンで包接することが主に試みられていた。
【００１８】
非特許文献１８（Ｒ．Ｆｉｃａｒｒａら，Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｉｄｓ／β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ＮＭＲ，ＦＴ−ＩＲ，ＤＳＣ，Ｘ−ｒａｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ２９（２００２）１００５−１０１４）は、ヘスペレチン、ヘスペリジン、ナリンゲニン、ナリンジンをβ−シクロデキストリンで包接し、包接されているかどうかを調べている。非特許文献１８は、包接化合物の形成は水中での溶解度を上昇させることを記載しており、そして治療処方物において、薬物の溶解および吸収を改善する可能性があることを示唆している。しかし、非特許文献１８は、これらの複合体の吸収性自体については調べていない。また、ヘスペレチンの配糖体とヘスペレチン包接物とでどちらがより生物学的利用能が高いかについては記載していない。また、非特許文献１８に記載の方法では、メタノールなどの有機溶媒を用いて包接化合物を調製している。メタノールは人体に有害であるので、この方法を用いて調製された包接化合物は、食品として使用できない。
【００１９】
さらに、吸収性を向上させる別の方法としては、フラボノイド配糖体の糖を切断してフラボノイドアグリコンとして摂取する方法が試みられてきた。
【００２０】
ヘスペリジンの場合は、アグリコンであるヘスペレチンが、配糖体であるヘスペリジンより容易に吸収されることが非特許文献１９（Ｂｏｏｔｈ ＡＮら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆａｔｅ ｏｆ ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ，ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ，ｈｏｍｏｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ ａｎｄ ｄｉｏｓｍｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３０：６６１−６６８（１９５８））において示されている。
【００２１】
ルチンについては、β−シクロデキストリンで包接して溶解性を上げる方法は、吸収性向上にほとんど効果がない。ルチンに糖を転移して配糖体にする方法は、ルチンをシクロデキストリンで包接するよりもさらに溶解性を上げる効果が高く、そして吸収性をさらに上げる効果も高い。
【００２２】
ヘスペリジンについては、ヘスペリジンに糖を転移して配糖体にすることにより溶解性を上げる方法よりも、ヘスペリジンの糖を切断して、溶解性が最も悪いアグリコンの形態にする方法の方が、吸収性を上げる効果は高い。
【００２３】
このようにフラボノイドの種類によって吸収性を上げる方法は異なると考えられ、吸収性を最も上げる方法を予測することは困難である。
【００２４】
ヘスペレチン包接物およびナリンゲニン包接物を効率的に包接する方法も公知ではない。
【特許文献１】特開平１１−１７１７７８号公報（第１頁）
【特許文献２】特開２００３−３２５１３５号公報（第１頁）
【特許文献３】特開２００２−２３４８４４号公報（第１頁）
【特許文献４】特開２０００−７８９５６号公報（第１頁要約）
【特許文献５】特開２０００−７８９５５号公報（第２頁）
【特許文献６】特開平６−５４６６４号公報（第１頁）
【非特許文献１】神谷真太郎、新ビタミン学（日本ビタミン学会）１９６９、ｐ４３９
【非特許文献２】松田英秋ら、薬学雑誌、１１１、１９３−１９８（１９９１）
【非特許文献３】Ｊ．Ａ．Ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｅｍｉｍら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４６，１１８−７１２（１９９４）
【非特許文献４】Ｍ．Ｔ．Ｍｏｎｆｏｒｔｅら、ＩｌＦａｒｍａｃｏ，５０，５９５−５９９（１９９５）
【非特許文献５】Ｔ．Ｔａｎａｋａら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５４，４６５３−４６５９（１９９４）
【非特許文献６】Ｔ．Ｔａｎａｋａら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５７，２４６−２５２（１９９７）
【非特許文献７】Ｔ．Ｔａｎａｋａら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，７６１−７６９（１９９７）
【非特許文献８】Ｔ．Ｔａｎａｋａら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，９５７−９６５（１９９７）
【非特許文献９】Ａ．Ｇａｒｇ，Ｓ．Ｇａｒｇ、Ｌ．Ｊ．Ｄ．ＺａｎｅｖｅｌｄおよびＡ．Ｋ．Ｓｉｎｇｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｔｒｕｓ ｂｉｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ，ＰＨＹＴＯＴＨＥＲＡＰＹ ＲＥＳＡＲＣＨ １５，６５５−６６９（２００１）
【非特許文献１０】Ｗ．Ｌ．ＢｅａｒおよびＲ．Ｗ．Ｔｅｅｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ ｏｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ １Ａ２ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：３６０９−３６１４（２０００）
【非特許文献１１】Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ− ｏｒ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ＨＬ６０ ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６２：２１９９−２２０４（１９９８）
【非特許文献１２】Ｍ．Ｄ．ＨｅｒｒｅｒａおよびＥ．Ｍａｒｈｕｅｎｄａ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ ａｎｄ ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ ｏｎ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ ｉｎ ｒａｔ ｖａｓ ｄｅｆｅｒｅｎｓ−Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ａｌｐｈａ−２ ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃ．２４：７３９−７４２（１９９３）
【非特許文献１３】Ｇ．Ｄ．Ｃａｒｌｏら，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５：１０５４−１０５９（１９９３）
【非特許文献１４】Ｊ．Ｓｕｍｍａｎｅｎら，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ Ｃａ２＋ ｆｌｕｘｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ＧＨ４Ｃ１ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４１４：１２５−１３３（２００１）
【非特許文献１５】Ｗ．Ｗａｋｕｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，５７５，１３１−１３６（１９９２）
【非特許文献１６】Ｋａｙｏｋｏ Ｓｈｉｍｏｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５１巻，第９号（２００３）
【非特許文献１７】Ｋｏｕｚｏｕ Ｍｉｙａｋｅら，Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｏｒａｌ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ｂｙ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５（３），３９９−４０７（２０００）（図７）
【非特許文献１８】Ｒ．Ｆｉｃａｒｒａら，Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｉｄｓ／β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ＮＭＲ，ＦＴ−ＩＲ，ＤＳＣ，Ｘ−ｒａｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ２９（２００２）１００５−１０１４
【非特許文献１９】Ｂｏｏｔｈ ＡＮら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆａｔｅ ｏｆ ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ，ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ，ｈｏｍｏｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ ａｎｄ ｄｉｏｓｍｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３０：６６１−６６８（１９５８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、天然に存在する配糖体の形態であるヘスペリジンまたはナリンジンの生体吸収性を高める方法として、ヘスペレチン包接化合物およびナリンゲニン包接化合物を合成する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、天然に存在する配糖体の形態であるヘスペリジンまたはナリンジンを加水分解により糖を除去してアグリコンであるヘスペレチンまたはナリンゲニンとし、これらをさらにβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接する方法をとるか、ヘスペリジンまたはナリンジンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によってまず包接した後、さらにこれらから加水分解によって糖を除去することによりフラボノイドアグリコンの包接物に変化させる方法をとることが、ヘスペリジンまたはナリンジンの生体吸収性を最も高める方法であることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００２７】
本発明の方法は、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法であって、
ヘスペリジンまたはナリンジンを、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を得る工程；および
該ヘスペリジン包接化合物または該ナリンジン包接化合物を加水分解してヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程
を包含する。
【００２８】
１つの実施形態では、上記加水分解する工程は、該ヘスペリジン包接化合物または該ナリンジン包接化合物にラムノシダーゼおよびグルコシダーゼを作用させることにより行われ得る。
【００２９】
１つの実施形態では、上記β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはその修飾物が、β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンに１〜６個のグルコース残基が側鎖として連結した分岐β−シクロデキストリン、およびそれらの化学修飾物からなる群より選択され得る。
【００３０】
１つの実施形態では、上記ヘスペリジンまたはナリンジンを、分岐β−シクロデキストリンによって包接され得る。
【００３１】
１つの実施形態では、上記分岐β−シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンに２個のグルコース残基が側鎖として連結した化合物であり得る。
【００３２】
１つの実施形態では、上記フラバノン包接化合物はヘスペレチン包接化合物であり得る。
【００３３】
本発明の別の方法は、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法であって、
ヘスペレチンまたはナリンゲニンを含む塩基性懸濁液または塩基性水溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を含む酸性水溶液とを混合することにより、ヘスペレチンまたはナリンゲニンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程
を包含する。
【００３４】
１つの実施形態では、上記β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはその修飾物は、β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンに１〜６個のグルコース残基が側鎖として連結した分岐β−シクロデキストリン、およびそれらの化学修飾物からなる群より選択され得る。
【００３５】
１つの実施形態では、上記ヘスペレチンまたはナリンゲニンを、分岐β−シクロデキストリンによって包接し得る。
【００３６】
１つの実施形態では、上記分岐β−シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンに２個のグルコース残基が側鎖として連結した化合物であり得る。
【００３７】
１つの実施形態では、上記フラバノン包接化合物は、ヘスペレチン包接化合物であり得る。
【００３８】
本発明のさらに別の方法は、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法であって、
ヘスペレチンまたはナリンゲニンを含む有機溶媒溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を含む水溶液とを混合することにより、ヘスペレチンまたはナリンゲニンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程
を包含し、ここで、該有機溶媒は、エタノール、イソプロパノールまたはテトラヒドロフランである。
【００３９】
本発明の食品は、フラバノン包接化合物を含む食品であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている。
【００４０】
１つの実施形態では、本発明の食品は、健康食品であり得る。
【００４１】
１つの実施形態では、本発明の健康食品は、血流改善および冷え性改善用であり得る。
【００４２】
１つの実施形態では、本発明の健康食品は、肌状態改善用であり得る。
【００４３】
１つの実施形態では、本発明の健康食品は、コレステロール低下用であり得る。
【００４４】
１つの実施形態では、本発明の健康食品は、アレルギー症状改善用であり得る。
【００４５】
１つの実施形態では、本発明の健康食品は、抗炎症用であり得る。
【００４６】
本発明の医薬品は、フラバノン包接化合物を含む医薬品であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている。
【００４７】
本発明の皮膚外用剤は、フラバノン包接化合物を含む皮膚外用剤であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている。
【００４８】
本発明の包接化合物は、フラバノン包接化合物であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、分岐β−シクロデキストリンまたは化学修飾β−シクロデキストリンによって包接されている。
【発明の効果】
【００４９】
ヘスペリジンまたはナリンジンを加水分解により、ヘスペレチンまたはナリンゲニンとした後、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によってこれらを包接するか、ヘスペリジンまたはナリンジンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接し、さらにこれらから加水分解によって糖を除去してフラボノイドアグリコンの包接物に変化させることにより、生体吸収性が極めて高い、ヘスペレチン包接化合物およびナリンゲニン包接化合物が高い効率で提供される。これらの包接物は生体吸収性が高いため、高い効率で迅速に体内に吸収されるため、ヘスペリジンまたはナリンジンを摂取した時と同様の生理効果を、少量摂取しただけで発揮し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００５１】
本発明により、フラバノン包接化合物を製造する方法が提供される。このフラバノン包接化合物において、フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、このフラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている。
【００５２】
本明細書中で「包接化合物」とは、分子錯体であって、一方の化学種が１〜３次元の分子規模の空間を作り、その空間に他方の化学種が取り込まれる（すなわち、包接される）ことによって生じる化合物をいう。空間を提供する化合物をホスト、包接される化学種をゲストという。本発明で合成されるフラバノン包接化合物においては、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物がホストであり、フラバノンがゲストである。
【００５３】
（１．フラバノン）
本発明で合成される包接化合物においてゲストとして使用されるフラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンである。フラバノンは好ましくはヘスペレチンである。
【００５４】
ヘスペレチンは、３’，５，７−トリヒドロキシ−４’−メトキシフラバノンとも呼ばれる。ヘスペレチンは、以下の構造を有する：
【化１】
【００５５】
ヘスペレチンは、ヘスペリジンのアグリコンである。ヘスペレチンは、ヘスペリジンをヘスペリジナーゼまたはナリンギナーゼによって分解することにより入手され得る。ヘスペリジンはフラボノイドの一種であり、柑橘類(例えば、温州みかん、夏みかん、伊予みかん、ネーブルオレンジ、バレンシアオレンジ）に含まれており、特に温州みかんに多く含まれている。ヘスペリジンは、未熟期のみかんに多量に含まれる。ヘスペリジンは、ミカンの部位でも、黄色い外果皮と果肉との間にある、白い中果皮に最も多く含まれている。ヘスペリジンは、柑橘類の果皮、果汁または種子より抽出することができる。例えば、温州みかんの搾汁粕からヘスペリジンを抽出する場合は、水酸化カルシウムを加えてｐＨを１１．５〜１２．５に調整してから撹拌混合し、これを圧搾してから遠心分離する。この液に酸を加えてｐＨを５〜５．５にしてから加温し、遠心分離により沈澱しているヘスペリジンを回収する方法が示されている（特開平８−１８８５９３号公報）。その後、ヘスペリジン水溶液を調製し、糖部分を（例えば、ナリンギナーゼの作用または酸性条件での加水分解により）分解することにより、ヘスペレチンが得られ得る。柑橘類からヘスペリジンを得る方法の詳細は、例えば、Ｋｉｎｇ ＦＥおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ Ａ．，Ｎａｔｕｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ，Ｐａｒｔ ３．Ｊ．Ｃｈｅｍ．ｓｏｃ．（ＩＩ）：１７０４−１７０９（１９３１）に記載される。あるいは、市販のヘスペリジンを原料として用いてもよい。ヘスペリジンは、例えば、ハマリ産業株式会社から販売される。ヘスペレチンは、ヘスペリジンのアグリコンである。ヘスペリジンから酸分解によってヘスペレチンを得る方法の詳細は、例えば、Ａｓａｈｉｎａ Ｙ．ら，Ｆｌａｖａｎｏｎｅ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ（Ｖ）：Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖａｎｏｎｅ ａｎｄ ｆｌａｖｏｎｏｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｏｃ−Ｊａｐａｎ ５０：２１７−２２３（１９３１）に記載される。ヘスペレチンは、ヘスペリジンをラムノシダーゼおよびグルコシダーゼによって酵素分解することによっても入手され得る。
【００５６】
ナリンゲニンは、４’，５，７−トリヒドロキシフラバノンとも呼ばれる。ナリンゲニンは、以下の構造を有する：
【化２】
【００５７】
ナリンゲニンは、その配糖化物として天然に存在する。すなわち、ナリンゲニンは、ナリンジン（ナリンギンともいう）のアグリコンである。ナリンゲニンは、ナリンジンをナリンギナーゼによって分解することにより入手され得る。ナリンジンはフラボノイドの一種であり、柑橘類、特にグレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ ｐａｒａｄｉｓｉ ＭＡＣＦ．）、ザボン（Ｃｉｔｒｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）などに多く含まれている。ナリンジンは柑橘類の苦味物質である。ナリンジンは一般に、グレープフルーツの果実中に０．０３〜０．１％含まれる。ナリンジンは、グレープフルーツの部位でも、黄色い外果皮と果肉との間にある、白い中果皮に最も多く含まれている。ナリンジンは、グレープフルーツ、ザボンなどの果皮、果汁または種子より、水または室温時有機溶媒（例えば、エタノールもしくはメタノール）で抽出することにより、分離され得る。ナリンジンの溶解度は水に対し０．１重量％であるが、アルカリ性水溶液に対しては１．０重量％以上溶解する。それゆえ、グレープフルーツ、ザボンなどの果皮、果汁または種子中のナリンジンをまずアルカリ性水溶液に溶解させ、酸で中和することにより、ナリンジンを結晶化してもよい。その後、ナリンジン水溶液を調製し、ナリンギナーゼを作用させて糖部分を分解することにより、ナリンゲニンが得られ得る。グレープフルーツからナリンジンを得る方法の詳細は、例えば、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｇｒａｐｅｆｒｕｉｔ ｊｕｉｃｅ．（Ｏｒｉｉ Ｙら，１９９７年 臨床薬理)に記載される。あるいは、市販のナリンジンを原料として用いてもよい。ナリンジンは、例えば、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社から販売される。ナリンジンからナリンゲニンを得る方法の詳細は、例えば、酵素利用ハンドブック 小崎道雄 監修 地人書館刊に記載される。
【００５８】
（２．β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物）
本発明で合成される包接化合物においては、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物が、ホストとして作用する。これらのホストは、その空洞内部に種々の有機化合物を取り込み、複合体を形成することが既に知られている。シクロデキストリンの空洞内部は、比較的疎水環境にあるため、水を媒体とした環境下では、親油性物質、あるいは親水性分子構造の中の比較的親油性となる官能基を選択的に取り込む傾向がある。
【００５９】
本明細書では、「β−シクロデキストリン」とは、７個の環状α−（１→４）結合したＤ−グルコピラノース単位から構成されるマルトオリゴ糖をいう。β−シクロデキストリンは、立体的には、底の抜けたバケツの側壁を取り囲むようにグルコース残基が配位している。β−シクロデキストリンは、澱粉などの多糖にシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を作用させることにより調製され得る。β−シクロデキストリンの製造方法は、例えば、シクロデキストリン−基礎と応用−（戸田不二緒 監修 産業図書刊）に記載される。β−シクロデキストリンはまた、例えば、株式会社 横浜国際バイオ研究所から市販されている。
【００６０】
本明細書では、「分岐β−シクロデキストリン」とは、β−シクロデキストリンに１個以上のグルコース残基が側鎖として連結した一般的に「分岐β−シクロデキストリン」と呼ばれるもの、およびβ−シクロデキストリンに結合しているグルコース残基のＣ４位水酸基またはＣ６位水酸基にβ−結合でガラクトシル基を結合させたガラクトシル−分岐βシクロデキストリン、β−シクロデキストリンに直接ガラクトシル基が結合したガラクトシル分岐β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンにマンノース残基が結合した６−Ｏ−α−Ｄ−マンノシル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンに結合しているグルコース残基のＣ４位水酸基またはＣ６位水酸基にα−結合でマンノース残基を結合させたマンノース−分岐βシクロデキストリン、β−シクロデキストリンにＮ−アセチルグルコサミン残基が結合した６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−β−シクロデキストリンなどの一般に「ヘテロ分岐β−シクロデキストリン」と呼ばれているものをいう。包接能力を維持しかつ構造的に可能である限り、結合する残基は、β−シクロデキストリンの任意の位置に連結し得るが、好ましくは、バケツの底側にあたる位置に連結する。包接能力を維持しかつ構造的に可能である限り、結合する残基は、β−シクロデキストリンの１箇所または２箇所以上に連結し得るが、好ましくは、１箇所に連結する。β−シクロデキストリンに連結する残基は、好ましくは１〜６個であり、より好ましくは１〜５個であり、さらに好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１または２個であり、最も好ましくは２個である。β−シクロデキストリンに連結する複数の残基からなる鎖は、直鎖状であってもよく、分岐していてもよい。分岐シクロデキストリンはシクロデキストリンよりも更に高い水溶性を示す。
【００６１】
分岐β−シクロデキストリンは、例えば、まず、澱粉にＣＧＴａｓｅを作用させて得られた、β−シクロデキストリン含有澱粉分解物に、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどのシクロデキストリンを分解しないかまたは分解し難い酵素を添加して、澱粉分解物に残存する非環状デキストリンを分解してオリゴ糖を生成させる。次いで、このβ−シクロデキストリンおよびオリゴ糖を含む澱粉分解物に、プルラナーゼ、イソアミラーゼなどの枝切り酵素を作用させて、オリゴ糖をシクロデキストリンに連結させることによって製造され得る。あるいは、純粋なβ−シクロデキストリンを含む水溶液中に、マルトース、マルトトリオースなどを添加し、この溶液に枝切り酵素を作用させることによっても製造され得る。あるいは、澱粉にシクロデキストリン生成酵素を作用させると、溶液中に分岐β−シクロデキストリンが形成される（特開平６−５４６６４号公報）ので、これらを利用してもよい。分岐β−シクロデキストリンの製造方法は、例えば、特開平６−１４７８９号公報に記載される。分岐β−シクロデキストリンはまた、例えば、株式会社 横浜国際バイオ研究所から市販されている。
【００６２】
本明細書では、「それらの修飾物」とは、β−シクロデキストリンの修飾物または分岐β−シクロデキストリンの修飾物をいう。便宜上、分岐β−シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンの修飾物には含まれない。β−シクロデキストリンおよび分岐β−シクロデキストリンは、包接能力を維持しかつ構造的に可能である限り、任意に修飾され得る。修飾は好ましくは化学修飾である。化学修飾の例としては、メチル化、プロピル化、モノアセチル化、トリアセチル化、モノクロロトリアジニル化、ヒドロキシエチル化、２−ヒドロキシプロピル化、２，３−ジヒドロキシプロピル化、２−ヒドロキシブチル化、２−ヒドロキシイソブチル化、ジエチルアミノエチル化、トリメチルアンモニオプロピル化などが挙げられる。化学修飾β−シクロデキストリンの市販品の具体例としては、以下が挙げられる：ＣＡＶＡＳＯＬ Ｗ７ Ｍ、ＣＡＶＡＳＯＬＷ７ Ｍ ＰｈａｒｍａおよびＣＡＶＡＳＯＬ Ｗ７ Ｍ ＴＬ（いずれも、ワッカーケミカルズイーストアジア株式会社製）として市販されるメチル−β−シクロデキストリン；ＣＡＶＡＳＯＬＷ７ ＨＰおよびＣＡＶＡＳＯＬ Ｗ７ ＨＰ Ｐｈａｒｍａ（いずれも、ワッカーケミカルズイーストアジア株式会社製）として市販されるヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン；ＣＡＶＡＳＯＬ Ｗ７ Ａ（いずれも、ワッカーケミカルズ イーストアジア株式会社製）として市販されるモノアセチル−β−シクロデキストリン；ＣＡＶＡＳＯＬ Ｗ７ ＴＡ（いずれも、ワッカーケミカルズ イーストアジア株式会社製）として市販されるトリアセチル−β−シクロデキストリン；ならびにＣＡＶＡＳＯＬ Ｗ７ ＭＣＴ（いずれも、ワッカーケミカルズ イーストアジア株式会社製）として市販されるモノクロロトリアジニル−β−シクロデキストリン。β−シクロデキストリンまたは分岐β−シクロデキストリンを化学修飾する方法は当該分野で公知であり、例えば、シクロデキストリン−基礎と応用−（戸田不二緒 監修 産業図書刊）に記載される。
【００６３】
本発明の包接化合物の合成方法においては、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物のうちの１種の化合物を単独で用いてもよく、２種以上混合して用いてもよい。１種で単独で用いることが好ましい。本発明の合成方法においては、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を精製して用いることもできるが、これらのシクロデキストリンを調製して精製をしていない溶液を用いてもよい。精製物を用いることが好ましい。
【００６４】
（３．フラバノン包接化合物）
本発明で合成されるフラバノン包接化合物は、一般式［Ｆ］ｍ・［βＣＤ−Ｒ］ｎにより示される。ここで、Ｆは、
【化３】
または
【化４】
であり、βＣＤ−Ｒは、（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）６（Ｃ６Ｈ９Ｏ５）−Ｒ１を示し、Ｒ１は、Ｈ、−（Ｃ６Ｈ１１Ｏ５）（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｓ、低級アルキル、置換アルキル、アシルおよびアジニルからなる群より選択され、ｍ、ｎおよびｓはそれぞれ１以上の任意の整数である。周知のとおり、βＣＤは、グルコース残基が７つ連なった環状構造をとる。
【００６５】
本明細書中では、「低級アルキル」とは、鎖中に１〜６個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖であり得る基を意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ヘプチル、ノニル、デシル、フルオロメチル、トリフルオロメチルおよびシクロプロピルメチルが挙げられる。
【００６６】
本明細書中では、「置換アルキル」とは、アルキル基が１つ以上の置換基で置換されることを意味し、これらの置換基は、同じであっても異なっていてもよい。各置換基は、ハロ、アルキル、アリール、シクロアルキル、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、−ＮＨ（アルキル）、−ＮＨ（シクロアルキル）、−Ｎ（アルキル）２、カルボキシおよび−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキルからなる群から独立して選択される。
【００６７】
本明細書中では、「アシル」は、Ｈ−Ｃ（Ｏ）−基、アルキル−Ｃ（Ｏ）−基、アルケニル−Ｃ（Ｏ）−基、アルキニル−Ｃ（Ｏ）−基、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−基、シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）−基またはシクロアルキニル−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。適切なアシル基の非限定的な例としては、ホルミル、アセチル、プロパノイル、２−メチルプロパノイルおよびシクロヘキサノイルが挙げられる。
【００６８】
本発明で合成されるフラバノン包接化合物において、フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、このフラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている。フラバノンは好ましくは、分岐β−シクロデキストリンによって包接されている。
【００６９】
ｍ：ｎは、好ましくは１：１であり、ｍは、好ましくは１であり、ｎは好ましくは１である。
【００７０】
Ｒ１は好ましくは−（Ｃ６Ｈ１１Ｏ５）（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｓである。−（Ｃ６Ｈ１１Ｏ５）（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｓは、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。直鎖状であることが好ましい。
【００７１】
ｓは好ましくは０〜５であり、より好ましくは０〜４であり、さらに好ましくは０〜３であり、さらにより好ましくは０〜２であり、さらにより好ましくは０〜１であり、最も好ましくは１である。
【００７２】
ホストとゲストとから包接化合物が形成されたことは、当該分野で公知の方法により確認され得る。例えば、Ｘ線回折、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、示差走査熱分析（ＤＳＣ）、フーリエ変換赤外分光計（ＦＴ−ＩＲ）などにより確認され得る。
【００７３】
本発明で合成されるフラバノン包接化合物においては、ホストとゲストとが分子数の比にして１：１で包接しており、そのことは、例えば、ＮＭＲにより確認され得る。
【００７４】
（４．フラバノン包接化合物を合成する方法）
本発明の方法により、フラバノン包接化合物が合成される。本発明の方法は、以下のいずれかの方法である。
【００７５】
（４．１ 配糖体を包接した後、糖部分を加水分解してアグリコン包接化合物を得る方法）
本発明の第１の方法は、フラバノン包接化合物を合成する方法であって、ヘスペリジンまたはナリンジンを、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を得る工程；および該ヘスペリジン包接化合物または該ナリンジン包接化合物を加水分解してヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程を包含する。
【００７６】
包接化合物を合成する一般的な方法としては、シクロデキストリンの飽和水溶液中で包接化合物を作製する飽和水溶液法、シクロデキストリンと水およびゲスト物質を混練し、包接化合物を得る混練法、シクロデキストリンまたはシクロデキストリンを含む多糖水溶液とゲスト物質を噴霧乾燥して、包接化合物を含む粉体を得る噴霧乾燥法などがある。これらの方法の詳細は当該分野で公知である。シクロデキストリンと水およびゲスト物質を混練し、包接化合物を得る混練法の詳細は、例えば、ＣＤ包接フレーバー粉末の作成とその除放性質（吉井英文 ２００４年 日本食品工学会誌）に記載される。シクロデキストリンまたはシクロデキストリンを含む多糖水溶液とゲスト物質を噴霧乾燥して、包接化合物を含む粉体を得る噴霧乾燥法の詳細は、例えば、機能性食品粉末の作成とその特性に関する研究（吉井英文 ２００３年 日本食品工学会年次大会講演要旨集）に記載される。
【００７７】
本発明の合成方法では、まず、配糖体であるヘスペリジンまたはナリンジンを、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を得る。本発明の合成方法は、ヘスペリジンおよびナリンジンが天然物であり、ヘスペレチンおよびナリンゲニンと比較して非常に容易かつ安価に入手できるという利点を有する。
【００７８】
ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物は、以下の手順Ａ１またはＢ１で作製され得る。
【００７９】
（Ａ１．塩基性水溶液を用いる手順）
ヘスペリジンまたはナリンジンの塩基性水溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物の酸性水溶液とを少しずつ混合して中和させると、この中和溶液中で包接化合物が形成される。ヘスペリジンまたはナリンジンは、塩基性にすると溶解度が上昇するので、ヘスペリジンまたはナリンジンの水溶液を塩基性にすることが好ましく、ｐＨを約１０〜約１２にすることがより好ましく、約１０．５〜約１１．５にすることが最も好ましい。溶液を塩基性にするためには、当該分野で公知の任意の塩基を用い得る。溶液を塩基性にするために用いられ得る塩基の例として、以下が挙げられる：水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、リン酸カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよびかんすい。得られるフラバノン包接化合物を食品用途に用いる場合、塩基は、食品添加物として用いられ得る塩基であることが好ましい。１種類の塩基を単独で用いてもよく、２種以上の塩基を混合して用いてもよい。
【００８０】
有機溶媒を用いないで合成を行う場合、安全性の懸念がないことから、得られる包接化合物を食品に利用し得るという利点を有する。また、有機溶媒を用いない場合、有害物質が残留していないことを確認する必要がないため、簡便であり、コストが低くなるという利点も有する。
【００８１】
（Ｂ１．有機溶媒を用いる手順）
ヘスペリジンまたはナリンジンを有機溶媒中に溶解した液に、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物の水溶液を少しずつ混合しながら撹拌することで、包接化合物を形成させてもよい。有機溶媒としては、水溶性のものが良く、好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン等が挙げられる。
【００８２】
上記のＡ１の手順およびＢ１の手順のいずれにおいても、混合する際のヘスペリジンまたはナリンジンとβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物とのモル濃度比は、任意に設定され得るが、好ましくは１：２〜１：６であり、より好ましくは１：３〜１：４である。
【００８３】
次いで、このヘスペリジン包接化合物またはこのナリンジン包接化合物を加水分解してヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る。ヘスペリジン包接化合物またはこのナリンジン包接化合物の加水分解は、酵素的に行ってもよく、化学的に行ってもよい。
【００８４】
加水分解を酵素的に行う場合、ラムノシダーゼおよびグルコシダーゼを用いる。ラムノシダーゼは、ヘスペリジンおよびナリンジン中のラムノース残基を加水分解する。グルコシダーゼは、ヘスペリジンおよびナリンジン中のグルコース残基を加水分解する。ラムノシダーゼおよびグルコシダーゼは、当該分野で容易に入手され得る。
【００８５】
例えば、一般にナリンギナーゼと呼ばれる酵素は、ラムノシダーゼおよびβ−グルコシダーゼを含む混合物である。ナリンギナーゼは、糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）またはＣｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ ｓｐ．）の培養液より、水で抽出し、濃縮した後、エタノールで処理することにより得られ得る。
【００８６】
抽出は、０℃〜１５℃で行われることが好ましい。濃縮は、０℃〜３０℃で行われることが好ましい。エタノール処理は、０℃〜１５℃で行われることが好ましい。ナリンギナーゼは、田辺製薬株式会社から、ナリンギナーゼとして販売されている。
【００８７】
一般にヘスペリジナーゼと呼ばれる酵素は、ラムノシダーゼおよびβ−グルコシダーゼを含む。ヘスペリジナーゼは、糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ））の培養液より、水で抽出し、濃縮した後、エタノールで処理することにより得られ得る。
【００８８】
抽出は、０℃〜１５℃で行われることが好ましい。濃縮は、０℃〜３０℃で行われることが好ましい。エタノール処理は、０℃〜１５℃で行われることが好ましい。ヘスペリジナーゼは、田辺製薬株式会社から、可溶性ヘスペリジナーゼ＜タナベ＞２号として販売されている。
【００８９】
これら以外にも、他の任意のグルコシダーゼおよびラムノシダーゼを用いてもよい。
【００９０】
グルコシダーゼおよびラムノシダーゼを作用させる前にヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を精製してもよく、あるいは、形成されたヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を精製することなくそのまま次の工程を行ってもよい。ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を含む溶液のｐＨは、任意に設定されるが、好ましくは、酵素反応を最適化するために、酸性に調整され、より好ましくはｐＨが約４〜５になるように調整される。酸性溶液中で包接されて溶解している状態を安定的に維持し、反応後のヘスペレチン包接物またはナリンゲニン包接物の収率を上げるために、ヘスペリジンまたはナリンジンの反応溶液中の濃度を０．１ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは４ｍｇ／ｍｌ〜１２ｍｇ／ｍｌとし、ヘスペリジンまたはナリンジンとシクロデキストリンとのモル比を１：２〜１：６、好ましくは１：３〜１：４とする。
【００９１】
ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物に対して添加されるグルコシダーゼおよびラムノシダーゼの量は、任意に設定され得る。グルコシダーゼの量は、好ましくは、約０．００１重量％〜約１０重量％であり、より好ましくは約０．０１重量％〜約５重量％であり、さらに好ましくは約０．０５重量％〜約１重量％である。ラムノシダーゼの量は、好ましくは、約０．００１重量％〜約１０重量％であり、より好ましくは約０．０１重量％〜約５重量％であり、さらに好ましくは約０．０５重量％〜約１重量％である。例えば、グルコシダーゼおよびラムノシダーゼとしてナリンギナーゼを用いた場合、ナリンギナーゼの量は、好ましくは約０．０１重量％〜約１０重量％であり、より好ましくは約０．０５重量％〜約５重量％であり、さらに好ましくは約０．１重量％〜約１重量％である。
【００９２】
ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物と酵素とを反応させる際の溶液の温度は、任意に設定され得るが、好ましくは約１０℃〜約７０℃であり、より好ましくは約２０℃〜約６５℃であり、さらに好ましくは約３０℃〜約６０℃であり、最も好ましくは約４０℃〜約５５℃である。もちろん、反応温度は、使用する酵素の反応至適温度、反応効率などを考慮して設定される。反応時間は、任意に設定され得るが、好ましくは約３０分間〜約１００時間であり、より好ましくは約１時間〜約８０時間であり、さらに好ましくは約５時間〜約６０時間であり、最も好ましくは約１０時間〜約５０時間である。酵素反応後、この反応液を、必要に応じて、酵素反応よりも高温（例えば、約５０℃〜約９０℃、好ましくは約６０℃〜約８０℃）の条件で任意の時間（例えば、約１時間〜約６時間、好ましくは約２時間〜約４時間）保持してもよい。
【００９３】
このようにしてラムノシダーゼおよびグルコシダーゼがヘスペリジン包接物またはナリンジン包接化合物に作用すると、これらのフラバノンの糖部分が加水分解され、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物が形成される。
【００９４】
加水分解を化学的に行う場合、ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を酸加水分解し得る。β−シクロデキストリンおよびアグリコン部分を分解しない限り、酸加水分解には、任意の酸を使用し得る。酸加水分解に使用され得る酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸が挙げられる。得られるフラバノン包接化合物を食品用途に用いる場合、酸は、食品添加物として用いられ得る酸であることが好ましい。塩酸を用いることが好ましい。１種類の酸を単独で用いてもよく、２種以上の酸を混合して用いてもよい。加水分解開始時における酸濃度は、好ましくは約０．１Ｎ〜約１０Ｎであり、より好ましくは約１Ｎ〜約５Ｎである。酸濃度が低すぎると未分解ヘスペリジンの残存率が高くなる場合がある。酸濃度が高すぎると、β−シクロデキストリンによる包接が外れてしまう場合、またはβ−シクロデキストリン部分およびアグリコン部分が分解される場合がある。
【００９５】
酸加水分解の際の反応温度は特に限定されないが、溶液を沸騰温度付近まで加熱することが好ましい。酸加水分解の反応時間は、特に限定されないが、好ましくは約１分間〜約１００時間であり、より好ましくは約１０分間〜約５０時間であり、さらにより好ましくは約１時間〜約４０時間であり、最も好ましくは約１０時間〜約３０時間である。反応時間が短すぎると、酸加水分解が不十分になる場合がある。反応時間が長すぎると、β−シクロデキストリンによる包接が外れてしまう場合、またはβ−シクロデキストリン部分およびアグリコン部分が分解される場合がある。
【００９６】
（４．２ アグリコンにβ−シクロデキストリンを直接包接させる方法）
ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物は、アグリコンにβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を直接包接させることによって合成され得る。本発明のこの方法は、（Ａ２）ヘスペレチンまたはナリンゲニンを含む塩基性懸濁液または塩基性水溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を含む酸性水溶液とを混合することにより、ヘスペレチンまたはナリンゲニンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程、あるいは、（Ｂ２）ヘスペレチンまたはナリンゲニンを含む有機溶媒溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を含む水溶液とを混合することにより、ヘスペレチンまたはナリンゲニンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程を包含する。アグリコンにβ−シクロデキストリンなどを直接包接させる場合も、上記のヘスペリジンまたはナリンジンを包接する場合について記載した方法と同様の包接方法を使用する。
【００９７】
ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物は、以下の手順Ａ２またはＢ２で作製され得る。
【００９８】
（Ａ２．塩基性水溶液を用いる手順）
例えば、ヘスペレチンまたはナリンゲニンの塩基性懸濁液または塩基性水溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物の酸性水溶液とを少しずつ混合して中和させると、この中和溶液中で包接化合物が形成される。ヘスペレチンまたはナリンゲニンは、塩基性にすると溶解度が上昇するので、ヘスペリジンまたはナリンゲニンの懸濁液または水溶液を塩基性にすることが好ましく、ｐＨを約１０〜約１４にすることがより好ましく、約１１．５〜約１３．５にすることが最も好ましい。懸濁液または水溶液を塩基性にするためには、当該分野で公知の任意の塩基を用い得る。懸濁液または水溶液を塩基性にするために用いられ得る塩基の例として、以下が挙げられる：水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、リン酸カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよびかんすい。得られるフラバノン包接化合物を食品用途に用いる場合、塩基は、食品添加物として用いられ得る塩基であることが好ましい。１種類の塩基を単独で用いてもよく、２種以上の塩基を混合して用いてもよい。
【００９９】
有機溶媒を用いないで合成を行う場合、安全性の懸念がないことから、得られる包接化合物を食品に利用し得るという利点を有する。また、有機溶媒を用いない場合、有害物質が残留していないことを確認する必要がないため、簡便であり、コストが低くなるという利点も有する。
【０１００】
（Ｂ２．有機溶媒を用いる手順）
ヘスペレチンンまたはナリンゲニンを有機溶媒中に溶解した液に、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物の水溶液を少しずつ混合しながら撹拌することで、包接化合物を形成させてもよい。有機溶媒としては、水溶性のものが良く、好ましくは、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン等が挙げられる。
【０１０１】
上記のＡ２の手順およびＢ２の手順のいずれにおいても、混合する際のヘスペレチンまたはナリンゲニンとβ−シクロデキストリンとのモル濃度比は、任意に設定され得るが、好ましくは１：１〜１：６であり、より好ましくは１：２〜１：４である。
【０１０２】
混合は、任意の温度で行われ得る。混合後、この混合液を、必要に応じて、混合時よりも高温（例えば、約５０℃〜約９０℃、好ましくは約６０℃〜約８０℃）の条件で任意の時間（例えば、約１時間〜約６時間、好ましくは約２時間〜約４時間）保持してもよい。
【０１０３】
（５．フラバノン包接化合物の溶解度の確認方法）
フラバノン包接化合物の溶解度は、当該分野で公知の方法によって確認され得る。例えば、０．１Ｎ ＮａＯＨ中の種々の濃度のフラバノン塩基性溶液２．２体積部に、０．１Ｎ ＨＣｌ中のβ−シクロデキストリン溶液１．７体積部を少量ずつ攪拌しながら添加して溶液のｐＨを中性に変化させながらフラバノン包接化合物を形成させ、析出が生じるか否かを確認することにより、簡便に溶解度を確認し得る。あるいは、例えば、フラバノン包接化合物を２０℃の水に添加し、３０分間攪拌したときに溶解するか否かを確認することにより、溶解度を確認し得る。
【０１０４】
（６．フラバノン包接化合物の吸収性の確認方法）
フラバノン包接化合物の吸収性は、当該分野に公知の方法を用いて確認され得る。フラバノン包接化合物の吸収性は、例えば、以下のようにして測定され得る。予備飼育（例えば、約３日〜１週間）した動物（例えば、６週齢のオスｄｄＹマウス）を絶食（例えば、約１４時間）させ、所定濃度のフラバノン包接化合物の溶液（例えば、２００μｌ）を経口投与する。ゾンデを用いて胃に直接投与してもよい。投与後、経時的に（例えば、心臓から）採血し、血清を分離する。次いで、血清に対し、スルファターゼ、グルクロニダーゼを含む溶液を添加して反応させた後、アセトニトリルを添加して遠心分離し、上清を濃縮遠心により乾固する。これをアセトニトリル／メタノール／水（５０：２０：３０、ｖ／ｖ／ｖ）で溶解し、攪拌した後、ソニケーションし、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて電気化学検出器で検出することにより、得られた血清中のフラバノン誘導体量を定量する。
【０１０５】
あるいは、得られた血液をＪ．Ａ．Ｂｏｕｔｉｎらの方法（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２１，１１５７−１１６６（１９９３））によって前処理したのちに、ＨＰＬＣを用いてそれに含まれるフラバノン包接化合物の量を定量してもよい。Ｊ．Ａ．Ｂｏｕｔｉｎらの方法は以下のとおりである。採取された血液５００μｌにアセトニトリル１０００μｌを添加し、充分振とうした後、１５分間静置する。５５００ｒｐｍで２０分間遠心した後、その上清をとり、凍結乾燥する。凍結乾燥した試料をアセトニトリル／蒸留水（２０／８０；Ｖ／Ｖ，０．０１Ｍ ＮａＯＨ）溶液１００μｌで溶解し、ＨＰＬＣで分析する。ＨＰＬＣの条件は、測定するフラバノン包接化合物により若干の違いはあるが、基本的な条件は以下のとおりである。カラム：ＯＤＳ、カラム温度：４０℃、溶離液：アセトニトリル／蒸留水（２０／８０；Ｖ／Ｖ）、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ ２８０ｎｍ。血液中のフラバノン包接化合物濃度は濃度既知のフラバノン化合物を用いて検量線を作成し求める。なお、実験動物としてはマウスのほか、ラットなどを用いることもできる。
【０１０６】
（７．フラバノン包接化合物を含む食品）
本発明の食品は、本発明の方法で合成されるフラバノン包接化合物を含む。食品は、任意の食品であり得る。食品は、固体であっても、半固体であっても、液体であってもよいが、好ましくは液体である。食品は、好ましくは、健康食品であり、より好ましくは健康飲料であるが、これらに限定されない。健康食品は、その健康食品に含まれるフラバノン包接化合物中のフラバノン（すなわち、ヘスペレチンまたはナリンゲニン）と同じ通常の用途に用いられ得る。健康食品の用途・効能の例としては、血流改善および冷え性改善用、肌状態改善用、コレステロール低下用、アレルギー症状改善用、ならびに抗炎症用が挙げられる。本発明の食品は、フラバノン包接化合物に加えて、甜茶抽出物を含み得る。甜茶抽出物を含むことにより、フラバノン包接化合物の生理活性と甜茶抽出物の生理活性との相乗効果が得られ得る。特に、本発明の食品がアレルギー症状改善用である場合、本発明の食品は、フラバノン包接化合物に加えて、甜茶抽出物を含むことが好ましい。
【０１０７】
食品は、例えば、冷菓（アイスクリーム、アイスミルク、氷菓など）、嗜好性飲料（例えば、清涼飲料、炭酸飲料（サイダー、ラムネ等）、薬味飲料、アルコール性飲料、粉末ジュースなど）、乳製品（牛乳、ヨーグルト、アイスクリーム、バター、マーガリン、チーズ、ホイップクリーム等）、菓子類（洋菓子、和菓子、スナック菓子等、例えば、あんこ、羊羹、饅頭、チョコレート、ガム、ゼリー、寒天、杏仁豆腐、ケーキ、カステラ、クッキー、煎餅、錠菓等）、パン、餅、水産練製品（蒲鉾、ちくわ等）、畜肉加工品（ソーセージ、ハム等）、果実加工品（ジャム、マーマレード、果実ソース等）、調味料（ドレッシング、マヨネーズ、味噌等）、麺類（うどん、そば等）、漬物、および蓄肉、魚肉、果実の瓶詰、缶詰類などであり得る。
【０１０８】
本発明の方法で合成された包接化合物を食品に添加するには特別な工程を必要とせず、食品の製造工程の初期において原料と共に添加するか、製造工程中に添加するか、あるいは製造工程の終期に添加する。添加方式は混和、混練、溶解、浸漬、散布、噴霧、塗布等通常の方法を食品の種類および性状に応じて選択する。本発明の食品は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１０９】
（８．フラバノン包接化合物を含む医薬品）
本発明の医薬品は、本発明の方法で合成されたフラバノン包接化合物を含む。医薬品は、任意の医薬品であり得る。医薬品は、固体であっても、半固体であっても、液体であってもよいが、好ましくは液体である。
【０１１０】
本発明の方法で合成された包接化合物を医薬品に添加するには特別な工程を必要とせず、医薬品の製造工程の初期において原料と共に添加するか、製造工程中に添加するか、あるいは製造工程の終期に添加する。添加方式は混和、混練、溶解、浸漬、散布、噴霧、塗布等通常の方法を医薬品の種類および性状に応じて選択する。本発明の医薬品は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１１１】
（９．フラバノン包接化合物の他の用途）
本発明の方法で合成されたフラバノン包接化合物は、他の種々の用途に用いられ得る。このような用途の例としては、皮膚外用剤が挙げられる。皮膚外用剤の例としては、例えば、化粧水、乳液、クリーム、美容液、養毛剤、育毛剤、パック、口紅、リップクリーム、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、ファンデーション、アイカラー、チークカラー、シャンプー、リンス、ヘアーリキッド、ヘアートニック、パーマネントウェーブ剤、ヘアカラー、トリートメント、浴用剤、ハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、ボディローションなどが挙げられる。本発明の方法で合成されたフラバノン包接化合物を含む皮膚外用剤は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１１２】
本明細書中では、フラバノン包接化合物を繊維に結合したり、繊維材料に混合したり、繊維に含浸させたり、または布帛の表面に塗布したりすることにより、その繊維または布帛から製造した衣類（例えば、肌着など）と皮膚とが接触したときにフラバノン包接化合物が経皮吸収されるような利用方法におけるフラバノン包接化合物を含む衣類も、皮膚外用剤の概念に含む。フラバノン包接化合物を繊維に結合することは、例えば、架橋などにより行われ得る。化合物を繊維に結合する方法、繊維材料に混合する方法、繊維に含浸させる方法、布帛表面に塗布する方法などは、当該分野で公知である。
【０１１３】
本発明の方法で合成された包接化合物を皮膚外用剤に添加するには特別な工程を必要とせず、皮膚外用剤の製造工程の初期において原料と共に添加するか、製造工程中に添加するか、あるいは製造工程の終期に添加する。添加方式は混和、混練、溶解、浸漬、散布、噴霧、塗布等通常の方法を皮膚外用剤の種類および性状に応じて選択する。本発明の方法で合成された皮膚外用剤は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【実施例】
【０１１４】
＜製造実施例１：包接ヘスペリジンを介した包接ヘスペレチンの製造＞
０．１ＮのＮａＯＨ １００重量部にヘスペリジン（ハマリ産業株式会社から購入）１重量部を加えて溶解し、ヘスペリジン溶液（ｐＨ＝１２．５）を調製した。０．１ＮのＨＣｌ ７６．８重量部に９．７７２重量部の分岐β−シクロデキストリン（Ｇ２−β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入））を加えて溶解し、分岐β−シクロデキストリン溶液（ｐＨ＝１．２）を調製した。分岐β−シクロデキストリン溶液をヘスペリジン溶液に撹拌しながら少量ずつ加えて中和することにより、ヘスペリジン包接物溶液を調製した（ヘスペリジン濃度５．６５ｍｇ／ｇ、ヘスペリジン：分岐β−シクロデキストリンのモル比＝１：４）。この溶液中でヘスペリジン包接物が形成されていることを、ＮＭＲにより確認した。
【０１１５】
この溶液に、さらに５ＮのＨＣｌ（約５重量部）を加えてｐＨを４．５に調整した後、ナリンギナーゼ（田辺製薬株式会社から購入）０．８８重量部を加え溶解させた。この溶液を、振盪しながら４８時間５０℃に保つことにより、ナンリンギナーゼを包接ヘスペリジンに作用させた。この反応液を、７５℃で４時間保持することにより、ヘスペレチン包接物溶液を得た。反応溶液を遠心分離して上清を取り、移動相はアセトニトリル／水（２５：７５、ｖ／ｖ）、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、検出器はＵＶ（波長２８０ｎｍ）の条件で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて分析したところ、溶液中に存在しているのは大部分がヘスペレチンの包接物であり、最初のヘスペリジン包接物の９５％以上がヘスペレチン包接物に変化していたことがわかった。ヘスペレチンが分岐β−シクロデキストリンに包接されている状態であることは、ＮＭＲにより確認した。
【０１１６】
この結果、大部分のヘスペリジンが分岐シクロデキストリンに包接された状態のまま、ヘスペレチンに結合しているラムノースおよびグルコースが切断されたことにより、ヘスペレチン包接物となったことがわかった。
【０１１７】
多孔性合成吸着剤による吸着性の差を利用して、このヘスペレチン包接物溶液から、切断されたグルコース、ラムノース、未反応の分岐β−シクロデキストリン、塩類等を除去するために、オルガノ（株）製の商品名アンバーライトＸＡＤ １６ＨＰを充填したカラムに通液した。包接ヘスペレチンだけがカラムに吸着され、その他の物質は流出した。包接ヘスペレチンが吸着しているカラムを水で洗浄した後に、エタノール ５０ｖ／ｖ％の溶液を通液し、カラムから包接ヘスペレチンを流出させた。この流出液のエタノールを留去させた後、残った溶液を噴霧乾燥して粉末を得た。この粉末は、水に良好な溶解性を示し、粉末に含有されているヘスペレチンは、ほぼ１００％分岐β−シクロデキストリンによって包接されており、包接されていないヘスペレチンが残っていないことをＤＳＣおよびＦＴ−ＩＲで分析することにより確認した。
【０１１８】
＜製造実施例２：ヘスペレチンを直接包接することによる包接ヘスペレチンの製造＞
蒸留水１００重量部にヘスペリジン（ハマリ産業株式会社から購入）１重量部を加えて懸濁液を作り、これに１ＮのＨＣｌを用いてｐＨ＝２に調整した。この溶液を、１００℃に保ちながら２４時間保持し、ヘスペリジンを加水分解させた。反応後の沈澱物には、ヘスペレチン、ヘスペレチン−７−グルコシドおよび未反応のヘスペリジンが含まれていた。
【０１１９】
これらの生成物を０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ＝約１１）に完全に溶解した後、疎水性合成吸着剤による吸着性の差を利用してヘスペレチンとその他の物質に分離するために、アマシャムバイオサイエンス株式会社製 Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０を充填したカラムに通液した。排出された１００ｍｌの液中にはヘスペレチン−７−グルコシドおよび未反応のヘスペリジンが含まれていた。このカラムに水１００ｍｌを通液したところ、最初に出てきた７０ｍｌには、不純物とヘスペレチン−７−グルコシドおよび未反応のヘスペリジンが含まれており、残りの３０ｍｌにはヘスペレチンが含まれていた。さらに、エタノール５０ｖ／ｖ）％の溶液２００ｍｌを通液してこのカラムからヘスペレチン全量を流出させた。ヘスペレチンを含む流出液のエタノールを留去させた後の沈澱物を乾燥して、ヘスペレチンの粉末を得た。
【０１２０】
ヘスペレチンの粉末を９ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｎ ＮａＯＨに溶解してヘスペレチン溶液（ｐＨ＝１２．３）を調製した。分岐β−シクロデキストリン（Ｇ２−β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入））を１１８ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｎ ＨＣｌに溶解して分岐β−シクロデキストリン溶液（ｐＨ＝１．２）を調製した。分岐β−シクロデキストリン溶液１．７体積部をヘスペレチン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、ヘスペレチン包接物溶液を調製した。この反応液を、８５℃で、６時間保持した。
【０１２１】
多孔性合成吸着剤による吸着性の差を利用して、このヘスペレチン包接物溶液から未反応の分岐β−シクロデキストリン、塩類等を除去するために、オルガノ（株）製 商品名アンバーライトＸＡＤ １６ＨＰを充填したカラムに通液した。包接ヘスペレチンだけがカラムに吸着され、その他の物質は流出した。包接ヘスペレチンが吸着しているカラムを水で洗浄した後に、エタノール ５０ｖ／ｖ％の溶液を通液し、カラムから包接ヘスペレチンを流出させた。この流出液のエタノールを留去させた後、残った溶液を噴霧乾燥して、噴霧乾燥して粉末を得た。この粉末は、水に良好な溶解性を示し、粉末に含有されているヘスペレチンは、ほぼ１００％分岐β−シクロデキストリンによって包接されており、包接されていないヘスペレチンが残っていないことを、ＤＳＣおよびＦＴ−ＩＲで分析することにより確認した。
【０１２２】
＜溶解性試験１：β−シクロデキストリンによる包接性試験＞
０．１ＮのＨＣｌにβ−シクロデキストリン（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入）を１５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、β−シクロデキストリン溶液を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンを２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させ、アグリコン溶液を調製した。フラボノイドアグリコンとして、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ルテオリン、アピゲニン、ダイゼイン（いずれも、シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製）およびケルセチン（和光純薬工業株式会社製）を用いた。β−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンのβ−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１２３】
β−シクロデキストリン溶液とアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。いずれのフラボノイドアグリコンを用いた場合も、析出は生じず、溶液状態であった。このことから、β−シクロデキストリンは、フラバノンアグリコンの包接ホストとして適切であることがわかった。
【０１２４】
＜溶解性試験２：分岐β−シクロデキストリンによる包接性試験＞
０．１ＮのＨＣｌに分岐−β−シクロデキストリン（β−シクロデキストリンを構成するグルコースの１つにα１−６結合によりマルトース残基が連結したもの；Ｇ２−β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入）を１１７．９ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、分岐β−シクロデキストリン溶液を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンを９．０９ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させ、アグリコン溶液を調製した。フラボノイドアグリコンとして、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、アピゲニンおよびダイゼインを用いた。分岐β−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンの分岐β−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１２５】
分岐β−シクロデキストリン溶液とアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。この結果、フラバノンのアグリコンであるヘスペレチンおよびナリンゲニンを用いた場合は溶液状態で析出は生じなかった。しかし、他のフラボン、フラバノール、イソフラボン類のフラボノイドアグリコンを用いた場合は析出が生じた。このことから、分岐β−シクロデキストリンは、フラバノンアグリコンの包接ホストとして適切であることがわかった。
【０１２６】
＜溶解性比較試験１：α−シクロデキストリンによる包接性試験＞
０．１ＮのＨＣｌにα−シクロデキストリンを４５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、α−シクロデキストリン溶液を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンを６ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させ、アグリコン溶液を調製した。フラボノイドアグリコンとして、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、アピゲニンおよびダイゼインを用いた。α−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えてのｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンのα−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１２７】
α−シクロデキストリン溶液とアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。この結果、いずれのフラボノイドアグリコンを用いた場合であっても析出が生じた。このことから、α−シクロデキストリンは、フラボノイドアグリコンの包接ホストとして適切でないことがわかった。
【０１２８】
＜溶解性比較試験２：分岐α−シクロデキストリンによる包接性試験＞
０．１ＮのＨＣｌに分岐−α−シクロデキストリン（α−シクロデキストリンを構成するグルコースの一つにα１−６結合でマルトース残基が連結したもの；Ｇ２−α−ＣＤ）を１１７．９ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、分岐α−シクロデキストリン溶液を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンを９．０９ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させ、アグリコン溶液を調製した。フラボノイドアグリコンとして、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、アピゲニンおよびダイゼインを用いた。分岐α−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンの分岐α−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１２９】
分岐α−シクロデキストリン溶液とアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。この結果、いずれのフラボノイドアグリコンを用いた場合であっても析出が生じた。このことから、分岐α−シクロデキストリンは、フラボノイドアグリコンの包接ホストとして適切でないことがわかった。
【０１３０】
＜溶解性比較試験３：γ−シクロデキストリンによる包接性試験＞
０．１ＮのＨＣｌにγ−シクロデキストリンを９０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、γ−シクロデキストリン溶液を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンを９．０９ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させ、アグリコン溶液を調製した。フラボノイドアグリコンとして、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、アピゲニンおよびダイゼインを用いた。γ−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンのγ−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１３１】
γ−シクロデキストリン溶液とアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。この結果、いずれのフラボノイドアグリコンを用いた場合であっても析出が生じた。このことから、γ−シクロデキストリンは、フラボノイドアグリコンの包接ホストとして適切でないことがわかった。
【０１３２】
＜溶解性試験３：β−シクロデキストリン包接物溶液の溶解度＞
０．１ＮのＨＣｌにβ−シクロデキストリンを１５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、β−シクロデキストリン溶液を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンの濃度を変えて溶解させ、アグリコン溶液を調製した。フラボノイドとして、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ルテオリン、ケルセチン、アピゲニンおよびダイゼインを用いた。β−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンのβ−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１３３】
β−シクロデキストリンとアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。このようにしてアグリコン濃度の違いによる析出の有無を確認した。結果を表２に示す。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
析出が生じなかった最大の最終アグリコン濃度を溶解度とみなした。ヘスペレチンβＣＤ包接物の溶解度は、２．８ｍｇ／ｍｌであり、ナリンゲニンβＣＤ包接物の溶解度は２．８ｍｇ／ｍｌであり、ケルセチンβＣＤ包接物の溶解度は１．４ｍｇ／ｍｌであり、ルテオリンβＣＤ包接物の溶解度は１．７ｍｇ／ｍｌであり、アピゲニンβＣＤ包接物の溶解度は１．１ｍｇ／ｍｌであり、ダイゼインβＣＤ包接物の溶解度は１．１ｍｇ／ｍｌであった。これらの溶解度を図１にグラフとして示す。この結果、ヘスペレチン、ナリンゲニンのフラバノン類の包接物溶液が他のフラボノイドの包接物溶液よりも溶解性が高いことがわかった。
【０１３６】
＜溶解性試験４：分岐β−シクロデキストリン包接物溶液の溶解度＞
０．１ＮのＨＣｌに分岐β−シクロデキストリン（β−シクロデキストリンを構成するグルコースの1つにα1-6結合によりマルトース残基が連結したもの；Ｇ２−β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入））を１５０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、分岐β−シクロデキストリン溶液（ｐＨ＝１．２）を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンの濃度を変えて溶解させて、アグリコン溶液（ｐＨ＝約１２〜１３）を調製した。フラボノイドアグリコンとして、ヘスペレチンおよびケルセチンを用いた。分岐β−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンの分岐β−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１３７】
分岐β−シクロデキストリン溶液とアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。このようにしてアグリコン濃度の違いによる析出の有無を確認した。結果を表３に示す。
【０１３８】
【表３】
【０１３９】
析出が生じなかった最大の最終アグリコン濃度を溶解度とみなした。ヘスペレチンＧ２−βＣＤ包接物の溶解度は、７．３ｍｇ／ｍｌであり、ケルセチンＧ２−βＣＤ包接物の溶解度は３．４ｍｇ／ｍｌであった。これらの溶解度を図１にグラフとして示す。この結果、ヘスペレチンの包接物溶液がケルセチンの包接物溶液よりも顕著に溶解性が高いことがわかった。
【０１４０】
＜評価実施例１：ヘスペレチン包接物の吸収性試験（Ｇ２−β−ＣＤ）＞
０．１Ｎ ＨＣｌ ８．４７ｍｌに分岐β−シクロデキストリン（β−シクロデキストリンを構成するグルコースの１つにα１−６結合によりマルトース残基が連結したもの；Ｇ２−β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入））を１ｇ溶かし、分岐β−シクロデキストリン溶液とした。０．１Ｎ ＮａＯＨ １１ｍｌにヘスペレチン１００ｍｇを溶かし、ヘスペレチン溶液とした。ソニケーションをしながらヘスペレチン溶液を分岐β−シクロデキストリン溶液に加えて、Ｇ２−β−ＣＤ包接ヘスペレチン溶液とした（ヘスペレチン濃度５ｍｇ／ｍｌ）。
【０１４１】
６週齢の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に飼料としてＭＦ（オリエンタル酵母（株）製）を与えて３日間予備飼育した後、試験物質投与前１４時間絶食下においた。その後、Ｇ２−β−ＣＤ包接ヘスペレチン溶液（ヘスペレチン濃度：５ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌ経口投与した。投与１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、および９時間後にそれぞれ５〜６匹のマウスの心臓より採血し、常法により血清を分離した。
【０１４２】
採取した血清試料中のヘスペリジン誘導体量を定量するために、各血清試料５０μｌに対し、スルファターゼＨ−２（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製、スルファターゼ４，０８０ユニット／ｍｌおよびグルクロニダーゼ１４１，０００ユニット／ｍｌからなる）を酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．０）で１０倍希釈したものを５０μｌ加えて３７℃で２時間反応させた。次いで、この反応液にアセトニトリル７５０μｌを加え十分に攪拌した後、遠心分離し、上清を濃縮遠心により乾固して固体を得た。この固体を１００〜４００μｌのアセトニトリル／メタノール／水（５０：２０：３０、ｖ／ｖ／ｖ）で溶解、撹拌後１５分程度ソニケーションし、高速液体クロマトグラフィーにかけ、電気化学検出器（ＥＳＡ社製 クーロケムＩＩＩ）を使用して分析した。それぞれの血清試料中のヘスペレチンの濃度を、ヘスペレチンを標準として換算することによって求めた。結果を図２および表４に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図３および表５に示す。
【０１４３】
＜評価実施例２：溶解した状態のヘスペレチン包接物（β−ＣＤ）の吸収性試験＞
０．１Ｎ ＨＣｌ ８．４７ｍｌにβ−シクロデキストリン（β-ＣＤ、株式会社 横
浜国際バイオ研究所より購入）を１ｇ溶かし、これに蒸留水１０ｍｌを加えてβ−シクロデキストリン溶液とした。０．１Ｎ ＮａＯＨ １１ｍｌにヘスペレチン（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製）１００ｍｇを溶かし、ヘスペレチン溶液とした。ソニケーションをしながらヘスペレチン溶液をβ−シクロデキストリン溶液に加えて、β−ＣＤ包接ヘスペレチン溶液とした（ヘスペレチン濃度３．３３ｍｇ／ｍｌ）。この溶液３００μｌを、評価実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法で吸収性を測定した。なお、この評価実施例では、包接物を溶解した状態に保ちながら評価実施例１と同じ量のヘスペレチンを投与するために、評価実施例１と比較してヘスペレチン濃度を下げ、投与容積を増やしている。結果を図２および表４に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図３および表５に示す。
【０１４４】
＜評価実施例３：懸濁した状態のヘスペレチン包接物（β−ＣＤ）の吸収性試験＞
０．１Ｎ ＨＣｌ ８．４７ｍｌにβ−シクロデキストリン（β−ＣＤ、株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入）を１ｇ溶かし、β−シクロデキストリン溶液とした。０．１Ｎ ＮａＯＨ １１ｍｌにヘスペレチン（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製）１００ｍｇを溶かし、ヘスペレチン溶液とした。ソニケーションをしながらヘスペレチン溶液をβ−シクロデキストリン溶液に加えて、β−ＣＤ包接ヘスペレチン溶液とした（ヘスペレチン濃度５ｍｇ／ｍｌ）。この溶液２００μｌを、実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法で吸収性を測定した。なお、この評価実施例では、評価実施例１と同じ濃度で、同じ投与容積で、かつ同じ重量のヘスペレチンを投与するために、懸濁した状態で投与した。結果を図２および表４に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図３および表５に示す。
【０１４５】
＜評価比較例１：ヘスペレチンの吸収性試験＞
蒸留水にヘスペレチン（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社より購入）５０ｍｇを加えてヘスペレチン懸濁液を調製した（ヘスペレチン濃度５ｍｇ／ｍｌ）。この溶液をよく撹拌した後すばやく２００μｌとり、実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法で吸収性を測定した。結果を図２および表４に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図３および表５に示す。
【０１４６】
＜評価比較例２：ヘスペリジンの吸収性試験＞
蒸留水にヘスペリジン（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社より購入；純度８０％）を１２６ｍｇ（ヘスペリジン換算１０１ｍｇ）加えてヘスペリジン懸濁液を調製した（ヘスペレチン濃度５ｍｇ／ｍｌ）。この溶液をよく撹拌した後すばやく２００μｌとり、実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法で吸収性を測定した。結果を図２および表４に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図３および表５に示す。
【０１４７】
＜評価比較例３：酵素処理ヘスペリジンの吸収性試験＞
蒸留水に酵素処理ヘスペリジン（ヘスペリジンにさらにグルコース残基が１個付加されたもの；江崎グリコ株式会社より購入）１２８ｍｇを加えて酵素処理ヘスペリジン溶液を調製した（ヘスペレチン濃度５ｍｇ／ｍｌ）。この溶液を２００μｌとり、実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法で吸収性を測定した。結果を図２および表４に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図３および表５に示す。
【０１４８】
＜評価比較例４：分岐β−シクロデキストリンで包接したケルセチン（Ｇ２−β−ＣＤ）の吸収性試験＞
０．１Ｎ ＨＣｌ８．４７ｍｌにＧ２−β−シクロデキストリン（Ｇ２−β−ＣＤ、株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入）を１．２ｇ溶かし、分岐β−シクロデキストリン溶液とした。０．１Ｎ ＮａＯＨ １０．８ｍｌにケルセチン（和光純薬工業株式会社から購入）６０ｍｇを溶かし、ケルセチン溶液とした。ソニケーションをしながらケルセチン溶液をＧ２−β−シクロデキストリン溶液に加えて、Ｇ２−β−ＣＤ包接ケルセチン溶液とした（ケルセチン濃度３ｍｇ／ｍｌ）。この溶液２００μｌとり、実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法でケルセチンとその代謝物であるタマリゼチンおよびイソラムネチンの吸収量を測定し、それらの合計を吸収性として評価した。結果を図６および表６に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図７および表７に示す。
【０１４９】
＜評価比較例５：ケルセチンの吸収性試験＞
蒸留水にケルセチン（和光純薬工業株式会社より購入）３０ｍｇを加えてケルセチン懸濁液を調製した（ケルセチン濃度３ｍｇ／ｍｌ）。この溶液をよく撹拌した後すばやく２００μｌとり、実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法でケルセチンの吸収性を測定した。結果を図６および表６に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図７および表７に示す。
【０１５０】
＜評価実施例１〜３および評価比較例１〜５のまとめ＞
【表４】
【０１５１】
【表５】
【０１５２】
表５において相対比は、酵素処理（ＰＡ−Ｔ）のＡＵＣを１．０としたときの比を示す。
【０１５３】
【表６】
【０１５４】
【表７】
【０１５５】
表７において相対比は、ケルセチンのＡＵＣを０．０６としたときの比を示す。表１におけるケルセチンのＡＵＣの相対比が０．０６であり、これに合わせたからである。
【０１５６】
評価実施例１〜３および評価比較例１〜３の結果、溶解した状態のヘスペレチン−β−シクロデキストリン包接物の投与から１５分後の血清中ヘスペレチン濃度は、ヘスペレチン、ヘスペリジンおよび酵素処理ヘスペリジンを投与した場合の血清中ヘスペレチン濃度に比べてそれぞれ、約６倍、約７００倍および約１８０倍の高濃度であることが示された。ヘスペレチン−β−シクロデキストリン包接物を析出した状態で投与した場合も、投与から１５分後の血清中ヘスペレチン濃度は、ヘスペレチン、ヘスペリジンおよび酵素処理ヘスペリジンを投与した場合の血清中ヘスペレチン濃度に比べてそれぞれ、約９倍、約９７０倍および約２４０倍の高濃度であることが示された。さらに、ヘスペレチン−Ｇ２−β−シクロデキストリン包接物の投与から１５分後の血清中ヘスペレチン濃度は、ヘスペレチン、ヘスペリジンおよび酵素処理ヘスペリジンを投与した場合の血清中ヘスペレチン濃度に比べてそれぞれ、約９倍、約１０６０倍および約２７０倍の高濃度であることが示された。
【０１５７】
ヘスペレチン−Ｇ２−β−シクロデキストリン包接物を投与したときの投与０〜９時間のＡＵＣ（血中濃度下面積）は、ヘスペレチン、ヘスペリジンおよび酵素処理ヘスペリジンを投与した場合のＡＵＣと比べてそれぞれ、約４．４倍、約６４倍および約２７倍と顕著に高い値を示した。この結果から、ヘスペレチンをＧ２−β−シクロデキストリンまたはβ−ＣＤで包接することにより体内への吸収効率が高くなることが分かった。
【０１５８】
この結果、吸収性は、βＣＤ包接＞Ｇ２−β−ＣＤ包接≫ヘスペレチン≫酵素処理＞ヘスペリジンとなった。
【０１５９】
表５および図４からわかるように、アグリコンがヘスペレチンの場合、溶解度の上昇と吸収性とは全く関係がなかった。これは、図５に示されるような、アグリコンがケルセチンの場合に溶解度が上昇すると吸収性が上昇するという従来の知識からは全く予想できないことであった。また、β−シクロデキストリンで包接した包接化合物の溶解度がそれほど上がらなくても吸収性は上がることがわかった。
【０１６０】
本発明者らの実験結果によれば、分岐βシクロデキストリンのヘスペレチン包接物とβシクロデキストリンのヘスペレチン包接物とでは溶解性に差があるにもかかわらず、吸収性向上効果にはほとんど差がないことがわかった。それゆえ、包接により水への溶解性が上がることだけが、吸収性向上の理由ではなく、ヘスペレチンがシクロデキストリンに包接されることにより極性が変わる等の何らかの変化が吸収性向上に影響している可能性があると考えられる。
【０１６１】
（マウスにおける吸収性試験）
ナリンゲニンＧ２−βＣＤ包接物、ナリンゲニンまたはナリンジンを評価実施例１と同様にマウスに投与して吸収性を試験することにより、ナリンジンの場合も、ヘスペリジンの場合と同様に、ナリンゲニンを包接することにより、吸収性が顕著に向上することがわかる。また、ヘスペリジンＧ２−βＣＤ包接物またはメチルヘスペリジンを評価実施例１と同様にマウスに投与して吸収性を試験することにより、ヘスペレチン包接物を与えた場合に比べて、吸収性は顕著に向上しないことがわかる。
【０１６２】
＜評価実施例４Ａ−１：ヘスペレチン包接物のヒト吸収性試験（Ｇ２−β−ＣＤ）＞
酵素処理ヘスペリジン（江崎グリコ株式会社製）２７０ｇを４．５Ｌの水道水に溶解し、５ＮのＨＣｌを約４０ｍｌ加えてｐＨを５．５に調整した。この溶液にナリンギナーゼ９ｇおよびグルコアミラーゼ９ｇを加えて溶解し、温度を５５℃に保ったまま４８時間反応させて、沈澱を回収した。この沈澱を精製するために４．５Ｌの水を加えた後、５ＮのＮａＯＨを約４０ｍｌ加えてｐＨを１１．０に調整していったん全ての沈澱を溶解した。その後、５ＮのＨＣｌを約６０ｍｌ加えてｐＨを２．０まで下げることによりヘスペレチンを沈澱させ、上清中に残っている酵素処理ヘスペリジン、ヘスペリジンおよびヘスペレチン−７−グルコシドを除去した。この操作をもう一度繰り返して回収した沈澱を水で２度洗ったあと、沈澱物をフリーズドライして約３０ｇの粉末を得た。この粉末を高速液体クロマトグラフィーに流してヘスペレチンのピーク面積を調べたところ約９８％であった。この精製されたヘスペレチン１８００ｍｇを０．１ＮのＮａＯＨ ３００ｍｌに溶解させヘスペレチン溶液とした。
【０１６３】
分岐β−シクロデキストリン（Ｇ２−β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入））１７．６ｇを０．１ＮのＨＣｌ ２４０ｍｌに溶解し、これを少量ずつヘスペレチン溶液に撹拌しながら加えて中和（ｐＨ＝７．５）しながらヘスペレチン包接物溶液を作成し、水を加えて全体の容量を６００ｍｌ（ヘスペレチン換算：３ｍｇ／ｍｌ）とした。
【０１６４】
健康な２７〜４４才の成人男性５名を被験者とし、前日の午後９時３０分以降絶食し、朝９時３０分にヘスペレチン包接物溶液１００ｍｌ（ヘスペレチン含有量３００ｍｇ）を摂取した。摂取前、３０分後および１時間後に、上腕部静脈から約１０ｍｌの血液を経時的に採取し、遠心分離により血清を分離した。
【０１６５】
採取した血清試料中のヘスペリジン誘導体量を定量するために、各血清試料５００μｌに対し、酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）を５００μｌ加えた。さらに、スルファターゼＨ−２（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製、スルファターゼ４０８０ユニット／ｍｌおよびグルクロニダーゼ１４１，０００ユニット／ｍｌからなる）を酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．０）で１０倍希釈したものを１００μｌ加えて３７℃で２時間反応させた。次いで、シュウ酸（０．０１Ｍ）を５００μｌ添加し、十分に攪拌した後、８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を平衡化したＯａｓｉｓ ＨＬＢ ３０ｍｇ／１ｃｃ（日本ウォーターズ株式会社製）にロードした。シュウ酸（０．０１Ｍ）１ｍｌ、水１ｍｌで洗浄後、メタノール１ｍｌで溶出回収した。これを濃縮遠心により乾固した。ここに２００μｌのアセトニトリルを添加、撹拌後１５分程度ソニケーションし、溶解させ、遠心分離後、上清を高速液体クロマトグラフィーにかけ、電気化学検出器（ＥＳＡ社製 クーロケムＩＩＩ）を使用して分析した。それぞれの血清試料中のヘスペレチンの濃度を、ヘスペレチンを標準として換算することによって求めた。結果を図８および表８に示す。
【０１６６】
＜評価実施例４Ａ−２：ヘスペレチン包接物のヒト吸収性試験（β−ＣＤ）＞
β−シクロデキストリン（β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入））１３．５gを０．１ＮのＨＣｌ ２４０ｍｌに溶解し、これを少量ずつヘスペレチン溶液に撹拌しながら加えて中和（ｐＨ＝７．５）しながらヘスペレチン包接物溶液を作成し、水を加えて全体の容量を６００ｍｌ（ヘスペレチン換算：３ｍｇ／ｍｌ）とした。
【０１６７】
評価実施例４Ａ−１と同じ被験者に対して、評価実施例４Ａ−１と同様の方法で吸収性を測定した。結果を図８および表８に示す。
【０１６８】
＜評価比較例６Ａ：ヘスペレチンのヒト吸収性試験＞
水道水１００ｍｌに評価実施例４Ａ−１と同様に調整したヘスペレチン３００ｍｇを加えてヘスペレチン懸濁液を調製した（ヘスペレチン濃度：３ｍｇ／ｍｌ）。評価実施例４Ａ−１と同じ被験者に、この溶液をよく撹拌した後摂取させ、評価実施例４Ａ−１と同様の方法で吸収性を測定した。結果を図８および表８に示す。
【０１６９】
＜評価実施例４Ａ−１、評価実施例４Ａ−２および評価比較例６Ａのまとめ＞
【表８】
【０１７０】
図８および表８に示すとおり、Ｇ２−βＣＤ包接物を摂取した場合のヘスペレチン吸収量は、ヘスペレチンを摂取した場合に比べ、摂取３０分および１時間後のいずれにおいても有意に高い値を示した。β−ＣＤ包接物を摂取した場合も同様に、ヘスペレチン吸収量は、ヘスペレチンを摂取した場合に比べ、摂取３０分および１時間後に有意に高い値を示した。それゆえ、評価実施例４Ａ−１、評価実施例４Ａ−２および評価比較例６Ａの結果、ヒトにおいても、図２におけるマウスの結果同様、ヘスペレチンをＧ２−βＣＤまたはβ−ＣＤで包接することにより吸収性が顕著に向上することがわかった。
【０１７１】
（ヒトにおける吸収性試験）
ヘスペレチンβＣＤ包接物、ヘスペリジン、酵素処理ヘスペリジンについても、評価実施例４Ａ−１と同様にヒトに投与して吸収性を試験することにより、ヘスペレチンを包接することにより、吸収性が顕著に向上することがわかる。
【０１７２】
＜評価実施例４Ｂおよび評価比較例６Ｂ：ヘスペレチン包接物（Ｇ２−β−ＣＤ）および酵素処理ヘスペリジンのヒト吸収性試験＞
健康な２７歳の成人男性1名、２５歳の成人女性1名を被験者とし、前日の午後９時３０分以降絶食し、ヘスペレチン含有量が違う以外は評価実施例４Ａ−１と同様に調製したヘスペレチン包接物（Ｇ２−β−ＣＤ包接物）溶液１００ｍｌ（ヘスペレチン含有量1００ｍｇ；評価実施例４Ｂ）、もしくはヘスペレチン含有量が違う以外は評価比較例３と同様に調製した酵素処理ヘスペリジン溶液１００ｍｌ（ヘスペレチン含有量1００ｍｇ；評価比較例６Ｂ）を朝９時３０分に摂取した。摂取前、１５分後、３０分後、４５分後、および６０分後、上腕部静脈から約１０ｍｌの血液を経時的に採取し、遠心分離により血清を分離した。採取した血清試料中のヘスペリジン誘導体量を、評価実施例４Ａ−１と同様の方法によって測定した。結果を図９および表９に示す。
【０１７３】
＜評価実施例４Ｂおよび評価比較例６Ｂのまとめ＞
【表９】
【０１７４】
図９および表９に示すとおり、Ｇ２−βＣＤ包接物を摂取した場合のヘスペレチン吸収量は、酵素処理ヘスペリジンを摂取した場合に比べ、摂取１５分後から６０分後まで終始、高い値を示した。この結果、ヘスペレチンをＧ２−βＣＤで包接することにより、酵素処理ヘスペリジンと比較して、吸収性が顕著に向上することがわかった。
【０１７５】
＜評価比較例６Ｃ−１および評価比較例６Ｃ−２：ヘスペリジンおよび酵素処理ヘスペリジンのヒト吸収性試験＞
健康な成人男性４名および成人女性３名を被験者とし、前日の午後９時３０分以降絶食し、ヘスペリジン（浜理薬品工業株式会社製）を蒸留水に添加して攪拌した懸濁液１００ｍｌ（ヘスペレチン含有量１５００ｍｇ；評価比較例６Ｃ−１）、もしくはヘスペレチン含有量が違う以外は評価比較例３と同様に調製した酵素処理ヘスペリジン溶液１００ｍｌ（ヘスペレチン含有量１５００ｍｇ；評価比較例６Ｃ−２）を朝９時３０分に摂取した。摂取前、３０分後、１時間後、および２時間後、上腕部静脈から約１０ｍｌの血液を経時的に採取し、遠心分離により血清を分離した。採取した血清試料中のヘスペリジン誘導体量を、評価実施例４Ａ−１と同様の方法によって測定した。結果を図１０および表１０に示す。
【０１７６】
＜評価比較例６Ｃ−１および評価比較例６Ｃ−２のまとめ＞
【表１０】
【０１７７】
図１０および表１０に示すとおり、酵素処理ヘスペリジンを採取した場合のヘスペレチン吸収量は、ヘスペリジンを摂取した場合に比べ、摂取３０分後および１時間後において高い値を示した。この結果、酵素処理ヘスペリジンは、ヘスペリジンよりも吸収性が高いことがわかった。
【０１７８】
評価実施例４Ａ−１、評価実施例４Ａ−２、評価実施例４Ｂ、評価比較例６Ａ、評価比較例６Ｂ、評価比較例６Ｃ−１および評価比較例６Ｃ−２をまとめて考えると、ヘスペレチンＧ２−β−ＣＤ包接物およびヘスペレチンβ−ＣＤ包接物は、いずれも、酵素処理ヘスペリジン、ヘスペリジンおよびヘスペレチンのいずれよりも吸収性が極めて高いことがわかった。
【０１７９】
（ヘスペレチンの種々の効果）
ヘスペレチン分岐βＣＤ包接物をヒト、マウス、ラットなどに投与することにより、アレルギー反応抑制効果が確認される。
【０１８０】
＜評価実施例５：ヘスペレチン分岐（Ｇ２）βＣＤ包接物のアレルギー反応抑制効果検証試験＞
５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス４２匹を予備飼育の後、体重が均等になるように、７匹ずつ、対照群（Ａ群）、甜茶抽出物投与群（Ｂ群）、酵素処理ヘスペリジン投与群（Ｃ１群、６００ｍｇ／ｋｇ；Ｃ２群、１２０ｍｇ／ｋｇ）、ヘスペレチン包接物（評価実施例１と同様の方法で製造したヘスペレチン分岐（Ｇ２）βＣＤ包接物）投与群（Ｄ１、Ｄ２群）、甜茶およびヘスペレチン包接物投与群（Ｅ群）の６群に分けた。マウスに５日間連続で被験物質溶液２００μＬを胃ゾンデにより経口投与した。このとき、被験物質溶液を、表１１に示す投与量となるように調整した。経口投与３日目、片側の耳介にＤＮＰ特異的ＩｇＥ抗体１３７５ｎｇ／ｍｌ（シグマ社製）を５μｌ皮内注射し、感作を行った。５日目の経口投与１時間後に０．２ｍｌの０．２５％エバンスブルー含有生理食塩水に溶解したＤＮＰ結合ウシ血清アルブミン０．０５ｍｇを尾静脈投与し、アレルギー反応を惹起した。惹起３０分後、両方の耳介を切除し、直径７ｍｍの皮革打抜き用パンチを用いて中央部を打ち抜いた。それぞれの耳介について、滲出したエバンスブルーをホルムアミドで抽出し、その濃度を６２０ｎｍの吸光度で測定した。Ａ群についての、感作した側の耳介の色素滲出量と感作していない側の耳介の色素滲出量との差の平均を１として、各群のアレルギー反応抑制率を算出した。その結果を図１１に示す。
【０１８１】
図１１に示すとおり、甜茶抽出物を単独で投与したＢ群では、蒸留水を投与したＡ群に対し、アレルギー反応の抑制傾向が認められたが、効果が弱かった。この結果は、甜茶抽出物が単独でアレルギー反応抑制効果を有することを示唆する。
【０１８２】
酵素処理ヘスペリジンを単独投与したＣ１群、Ｃ２群ではアレルギー抑制効果は認められなかった。
【０１８３】
ヘスペレチン包接物を単独で投与したＤ１群では、蒸留水を投与したＡ群に対し、６０％を超える高いアレルギー反応抑制効果が認められたが、投与量を減らしたＤ２群では効果が低かった。これらの結果から、ヘスペレチン包接物が単独でアレルギー反応抑制効果を有することが示された。Ｃ群の酵素処理ヘスペリジン投与量とＤ１群のヘスペレチン包接物投与量はヘスペレチン換算で同等である。ヘスペレチン包接物は体内でヘスペレチンを放出すると考えられる。ヘスペリジンはアレルギー反応抑制作用を有することが公知である。また、ヘスペリジンは体内でアグリコンであるヘスペレチンに分解・吸収され、ヘスペレチンが抗アレルギー効果を発揮すると考えられている。このことから、ヘスペレチン包接物のアレルギー反応抑制効果は、ヘスペレチン吸収性の向上により、活性が強く発揮されたものと考えられる。従って、ヘスペレチン包接化合物として投与することにより、ヘスペリジンを投与したときよりも顕著に高いアレルギー反応抑制効果を、少量の摂取によって発揮させ得る。
【０１８４】
Ｂ群と等用量の甜茶およびＤ２群と等用量のヘスペレチン包接物を組み合わせて投与したＥ群では、蒸留水を投与したＡ群に対し、約６０％のアレルギー反応抑制効果が認められた。この効果は、それぞれの投与量を単独で与えた場合のアレルギー反応抑制率の合計（約１７％）よりも顕著に高い。この結果は、単独ではアレルギー反応抑制効果が低い投与量でも、甜茶抽出物とヘスペレチン包接物とを組み合わせることで、アレルギー反応抑制効果が相乗的に増強されたこと示唆する。
【０１８５】
【表１１】
【０１８６】
ヘスペレチン分岐βＣＤ包接物をヒト、マウス、ラットなどに投与することにより、血中コレステロール低下効果が確認される。
【０１８７】
＜評価実施例６：ヘスペレチンＧ２βＣＤ包接物のコレステロール上昇抑制効果検証試験＞
６週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス３０匹を予備飼育の後、体重が均等になるように、１０匹ずつ、対照群（蒸留水投与）、ヘスペレチン投与群、およびヘスペレチンＧ２βＣＤ包接物（製造実施例１と同様の方法で製造したヘスペレチン分岐（Ｇ２）βＣＤ包接物）投与群の３群に分けた。３群に分けた後、１％コレステロール添加食をマウスに４週間摂食させた。この１％コレステロール添加食は高コレステロール食であり、その組成は、１ｋｇあたりの重量で、コレステロール（和光純薬）１０ｇ、カゼイン（オリエンタル酵母）２００ｇ、コーンスターチ（オリエンタル酵母）５４１ｇ、大豆油（和光純薬）１００ｇ、ＤＬ−メチオニン（和光純薬）２ｇ、ミネラルミックス（オリエンタル酵母）４０ｇ、ビタミンミックス（オリエンタル酵母）２２ｇ、セルロース（オリエンタル酵母）８５ｇであった。この４週間の摂食期間の間、マウスには１週間に５回、被験物質溶液２００μＬを胃ゾンデにより経口投与した。被験物質溶液は、対照群は蒸留水であり、ヘスペレチン投与群は０．５％ヘスペレチン溶液であり、そしてヘスペレチンＧ２βＣＤ包接物投与群はヘスペレチン投与量がヘスペレチン投与群と等量になるように調整したヘスペレチンＧ２βＣＤ包接物の溶液とした。なお、０．５％ヘスペレチン溶液は完全には溶解しないので、十分に懸濁した状態で投与した。
【０１８８】
４週間後、マウスを頚椎脱臼により屠殺して解剖を行い、体重、臓器重量（肝臓、心臓、脾臓、副精巣周囲脂肪および腎臓周囲脂肪の重量）、ならびに血中および肝臓中のコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよび中性脂肪を測定した。詳細には、体重を測定後、解剖時にマウスを頚椎脱臼し、心臓より採血を行った後、肝臓、心臓、脾臓、副精巣周囲脂肪および腎臓周囲脂肪を摘出し、重量を測定し、摘出した肝臓を直ちに液体窒素で凍結し、−８０℃で凍結保管した。血中の検査項目（コレステロール、ＨＤＬコレステロールおよび中性脂肪）については、解剖時に、採取した血液を遠心分離機で血清に分離した後、市販の脂質測定キット（コレステロールＥテストワコー、ＨＤＬ−コレステロールＥテストワコー、トリグリセライドＥテストワコー；すべて和光純薬製）を用いて測定した。肝臓中の検査項目（コレステロール、ＨＤＬコレステロールおよび中性脂肪）については、凍結保管しておいた肝臓を０．５ｇ秤量したのち、Ｆｏｌｃｈ法（Ｊ．Ｆｏｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，４９７，１９５７）にて脂質をクロロホルム抽出した後、減圧下で濃縮乾固し、エタノールに溶解しさらに溶解液（蒸留水中にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を５ｇ／Ｌ、コール酸ナトリウムを３ｍｍｏｌ／Ｌ含む）を１００μＬ添加し溶液としたものを、血清と同様に市販キットにて測定した。
【０１８９】
その結果の平均を表１２に示す。表１２に示すとおり、対照群と比較して、ヘスペレチン包接物投与群は約１５％、ヘスペレチン群は約７％、肝臓コレステロールの上昇を抑制した。副精巣周囲脂肪および腎臓周囲脂肪重量は内臓脂肪の指標であるので、解剖時に測定した。副精巣周囲脂肪重量に関しては、対照群と比較して、ヘスペレチン包接物投与群は約１６％低い値を、ヘスペレチン投与群は約１４％低い値を示した。腎臓周囲脂肪重量に関しては、対照群と比較して、ヘスペレチン包接物投与群は約３６％低い値を、ヘスペレチン群は約２９％低い値を示した。各群間で体重、肝臓、心臓および脾臓重量に差は見られなかった（表には示さず）ことから、いずれもヘスペレチンを投与することにより、脂質の各指標が低下すること、さらにヘスペレチン包接物投与群で、ヘスペレチン投与群よりも高い脂質抑制効果が見られることがわかった。これらの結果は、図８および９の結果に見られるとおり、ヘスペレチン包接物投与群においてヘスペレチンの体内吸収性が向上したことに起因すると考えられる。
【０１９０】
【表１２】
【０１９１】
ヘスペレチン分岐βＣＤ包接物をヒト、マウス、ラットなどに投与することにより、血流改善効果および冷え性改善効果が確認される。
【０１９２】
＜評価実施例７：ヘスペレチンＧ２βＣＤ包接物の血流改善効果検証試験＞
酵素処理ヘスペリジンは血流改善効果を有し、冷え症に有効であることが報告されている（第５８、５９回 日本栄養・食糧学会、吉谷ら）。冷え症診断基準（寺澤 捷年：生薬学誌，４１（２），１９８７）により冷え症と診断された２７歳女性において、ヘスペレチン換算４０ｍｇ相当にあたるヘスペレチン包接物（評価実施例４Ａ−１と同様の方法で製造したヘスペレチン分岐（Ｇ２）βＣＤ包接物）もしくは酵素処理ヘスペリジンを３７℃の水１００ｍｌに溶解させて摂取した際の血流改善効果を冷却負荷法で比較した（参考文献：鹿野昌彦，「末梢循環障害とサーモグラフィー」，ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＴＨＥＲＭＯＲＯＧＹ，１７（２），１１１−１１３，１９９８；および定方美恵子，佐藤悦，佐山光子，湊孝子，兵頭慶子，定方昭夫，「冷え症の客観的評価に対する予備的研究」，新潟大学医療技術短期大学紀要，７（２），２１５−２２６，２０００）。なお、３７℃の水１００ｍｌだけを摂取したときの血流改善値もコントロールとして測定した。食後２時間以上あけて試験飲料を摂取し、３０分間安静にした後、左手を１５℃に設定した水流付き恒温槽に１分間浸し、冷却負荷をかけた。その後３０分間、５分毎に、サーモグラフィー（ＮＥＣ三栄 ＴＨ３１００ＭＲ）で左手指先の体表面温度を、レーザー血流計（オメガウェーブ ＦＬＯ−Ｎ１）で血流量を測定した。
【０１９３】
その結果を表１３、表１４、図１２および図１３に示す。図１２を、冷却直前温度を１００％とし、冷却直後温度を０％としたときの表面温度回復率で示した。図１３を、冷却直前の数値を１００％としたときの変化率で表した。図１２に示すとおり、ヘスペレチン包接物摂取により、酵素処理ヘスペリジンを摂取した場合よりも迅速に高い温度回復率が認められた。また、図１３に示すとおり、ヘスペレチン包接物を摂取することにより、酵素処理ヘスペリジンよりも早い血流量の回復が認められた。以上の結果は、図８および９の結果に見られるとおり、ヘスペレチン包接物摂取では、ヘスペレチンの体内吸収が速やかであり、吸収量も高まっていることに起因すると考えられる。
【０１９４】
【表１３】
【０１９５】
【表１４】
【０１９６】
ヘスペレチン分岐βＣＤ包接物をヒト、マウス、ラットなどに投与することにより、肌状態改善効果が確認される。
【０１９７】
ヘスペレチン分岐βＣＤ包接物をヒト、マウス、ラットなどに投与することにより、抗炎症効果が確認される。
【０１９８】
＜評価実施例８：ヘスペレチン分岐βＣＤ包接物の抗炎症効果検証試験＞
５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス１０匹を予備飼育の後、体重が均等になるように、５匹ずつ、対照群（Ａ群）、ヘスペレチン包接物（評価実施例１と同様の方法で製造したヘスペレチン分岐（Ｇ２）βＣＤ包接物）投与群（Ｂ群）の２群に分けた。マウスには４日間連続で被験物質溶液２００μＬを胃ゾンデにより経口投与した。被験物質溶液は、表１５に示す投与量となるよう調整した。経口投与４日目、マウスの左耳介中央に１０μＬ／ｅａｒの０．０６％クロトン油（シグマ社製）を塗布した。３時間後、０．２ｍｌの１％エバンスブルー含有生理食塩水を尾静脈より投与し、さらに１時間後、耳介を切除した。直径７ｍｍの皮革打抜き用パンチを用いて中央部を打ち抜き、耳介に滲出したエバンスブルーをホルムアミドで抽出し、その濃度を６２０ｎｍの吸光度で測定した。Ａ群の右耳介色素滲出量と左耳介色素滲出量との差を１として、Ｂ群の炎症抑制率を評価した。その結果を表１５に示す。
【０１９９】
表１５に示すとおり、ヘスペレチン包接物を投与したＢ群では、蒸留水を投与したＡ群に対し、炎症が４１％抑制された。この結果から、ヘスペレチン包接物が抗炎症作用を有することが示された。
【０２００】
【表１５】
【０２０１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２０２】
本発明により、生体吸収性が極めて高い、ヘスペレチン包接化合物およびナリンゲニン包接化合物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】図１は、種々のフラボノイドアグリコンをβ−シクロデキストリン（βＣＤ）または分岐β−シクロデキストリン（Ｇ２βＣＤ）で包接して得られた包接化合物の溶解度を示すグラフである。
【図２】図２は、分岐β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（Ｇ２βＣＤ包接；評価実施例１）、溶解状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接２００μｌ；評価実施例２）、析出した状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接３００μｌ；評価実施例３）、ヘスペレチン（ヘスペレチン；評価比較例１）、ヘスペリジン（ヘスペリジン；評価比較例２）、酵素処理することにより糖鎖付加したヘスペリジン（酵素処理（ＰＡ−Ｔ）；評価比較例３）をマウスに経口投与した後のマウス心臓血中のヘスペレチン濃度を経時的に示すグラフである。
【図３】図３は、分岐β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（Ｇ２βＣＤ包接；評価実施例１）、溶解状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接２００μｌ；評価実施例２）、析出した状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接３００μｌ；評価実施例３）、ヘスペレチン（ヘスペレチン；評価比較例１）、ヘスペリジン（ヘスペリジン；評価比較例２）、酵素処理することにより糖鎖付加したヘスペリジン（酵素処理（ＰＡ−Ｔ）；評価比較例３）をマウスに経口投与した後のマウス心臓血中のヘスペレチン濃度の０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を示すグラフである。
【図４】図４は、分岐β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（Ｇ２βＣＤ包接；評価実施例１）、溶解状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接２００μｌ；評価実施例２）、析出した状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接３００μｌ；評価実施例３）の吸収性の相対比をＸ軸にとり、溶解性をＹ軸にとったグラフである。
【図５】図５は、酵素処理することにより糖鎖付加したルチン（酵素処理（αＧルチン））、ルチン（ルチン）、ケルセチン（ケルセチン）の吸収性の相対比をＸ軸にとり、溶解性をＹ軸にとったグラフである。
【図６】図６は、分岐β−シクロデキストリンで包接したケルセチン（Ｇ２βＣＤ包接ケルセチン；評価比較例４）またはケルセチン（ケルセチン；評価比較例５）をマウスに経口投与した後のマウス心臓血中のケルセチン濃度とタマリゼチン濃度とイソラムネチン濃度との合計を経時的に示すグラフである。
【図７】図７は、分岐β−シクロデキストリンで包接したケルセチン（Ｇ２βＣＤ包接ケルセチン；評価比較例４）またはケルセチン（ケルセチン；評価比較例５）をマウスに経口投与した後のマウス心臓血中のケルセチン濃度とタマリゼチン濃度とイソラムネチン濃度との合計の０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を示すグラフである。
【図８】図８は、分岐β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（Ｇ２βＣＤ包接物；評価実施例４Ａ−１）、析出した状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接物；評価実施例４Ａ−２）またはヘスペレチン（ヘスペレチン；評価比較例６Ａ−１）をヒトに経口摂取させた後のヒトの血清試料中のヘスペレチン濃度を経時的に示すグラフである。
【図９】図９は、分岐β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（Ｇ２βＣＤ包接物；評価実施例４Ｂ）または酵素処理ヘスペリジン（酵素処理ヘスペリジン；評価比較例６Ｂ）をヒトに経口摂取させた後のヒトの血清試料中のヘスペレチン濃度を経時的に示すグラフである。
【図１０】図１０は、ヘスペリジン（ヘスペリジン；評価比較例６Ｃ−１）または酵素処理ヘスペリジン（酵素処理ヘスペリジン；評価比較例６Ｃ−２）をヒトに経口摂取させた後のヒトの血清試料中のヘスペレチン濃度を経時的に示すグラフである。
【図１１】図１１は、蒸留水、甜茶抽出物（８０ｍｇ／ｋｇ）、酵素処理ヘスペリジン（６００ｍｇ／ｋｇまたは１２０ｍｇ／ｋｇ）、分岐β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（ヘスペレチン包接物；５５０ｍｇ／ｋｇまたは５５ｍｇ／ｋｇ）または甜茶抽出物とヘスペレチン包接物との混合物をマウスに経口投与した場合の、Ａ群のアレルギー反応と比較したアレルギー反応抑制率（％）を示すグラフである。
【図１２】図１２は、コントロール（水）、酵素処理ヘスペリジンまたはヘスペレチン包接物をヒトに経口摂取させた場合の表面温度回復率の経時変化を示すグラフである。縦軸は回復率（％）を、横軸は経過時間（分）を示す。
【図１３】図１３は、コントロール（水）、酵素処理ヘスペリジンまたはヘスペレチン包接物をヒトに経口摂取させた場合の血流量回復率の経時変化を示すグラフである。縦軸は回復率（％）を、横軸は経過時間（分）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラバノン包接化合物の製造方法ならびにフラバノン包接化合物を含む食品および医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリフェノールは、同一分子内に複数のフェノール性水酸基を有する植物成分の総称である。ポリフェノールは種々の植物に含まれており、抗酸化能力に優れた物質である。ポリフェノールは、種々の生理活性を有しており、医薬品、食品などの種々の用途に利用されている。ポリフェノールの中でも特に、フラボノイドに関する研究が進んでいる。
【０００３】
フラボノイドについては、例えば、以下のような生理活性が知られている。ヘスペリジンおよびルチンは、古くからビタミンＰとして知られており、ビタミンＰは、血圧を下げる作用を有することが知られている（非特許文献１：神谷真太郎、新ビタミン学（日本ビタミン学会）１９６９、ｐ４３９）。ヘスペリジンはさらに、抗アレルギー作用（非特許文献２：松田英秋ら、薬学雑誌、１１１、１９３−１９８（１９９１）、非特許文献３：Ｊ．Ａ．Ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｅｍｉｍら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４６，１１８−７１２（１９９４））、ＬＤＬ−コレステロールを減少させ血中コレステロール値を改善する作用（非特許文献４：Ｍ．Ｔ．Ｍｏｎｆｏｒｔｅら、ＩｌＦａｒｍａｃｏ，５０，５９５−５９９（１９９５））、抗癌作用（非特許文献５：Ｔ．Ｔａｎａｋａら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５４，４６５３−４６５９（１９９４）、非特許文献６：Ｔ．Ｔａｎａｋａら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５７，２４６−２５２（１９９７）、非特許文献７：Ｔ．Ｔａｎａｋａら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，７６１−７６９（１９９７）、非特許文献８：Ｔ．Ｔａｎａｋａら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，９５７−９６５（１９９７））などの生理作用を有することが報告されている。非特許文献９（Ａ．Ｇａｒｇ，Ｓ．Ｇａｒｇ、Ｌ．Ｊ．Ｄ．ＺａｎｅｖｅｌｄおよびＡ．Ｋ．Ｓｉｎｇｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｔｒｕｓ ｂｉｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ，ＰＨＹＴＯＴＨＥＲＡＰＹ ＲＥＳＡＲＣＨ １５，６５５−６６９（２００１））は、ヘスペリジンの化学および薬理作用について概説している。非特許文献９は、ヘスペリジンが、上記の作用以外にも、毛細血管壁の透過性および脆弱性を低下させる作用、大腸炎抑制作用、関節炎抑制作用、血小板および細胞の凝集抑制作用などの多様な生理作用を有することを記載する。
【０００４】
さらに、最近の研究では、ヘスペリジンは前駆脂肪細胞の分化を促進し、糖尿病などの症状を改善する作用も期待されている。ヘスペリジンはまた、血行改善効果を持ち、血行改善による、肩こり、冷え性等の改善効果（特許文献１：特開平１１−１７１７７８号公報）、肌状態の改善効果（特許文献２：特開２００３−３２５１３５号公報）、および骨粗しょう症改善効果（特許文献３：特開２００２−２３４８４４号公報）などを有することも報告されている。
【０００５】
ナリンジンは柑橘類の苦味物質として知られており、苦味の付与を目的に食品・飲料などに用いられている。またそのアグリコンであるナリンゲニンは、抗変異原性（非特許文献１０：Ｗ．Ｌ．ＢｅａｒおよびＲ．Ｗ．Ｔｅｅｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ ｏｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ １Ａ２ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：３６０９−３６１４（２０００）．）、細胞成長抑制作用（非特許文献１１：Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ− ｏｒ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ＨＬ６０ ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６２：２１９９−２２０４（１９９８））、筋収縮促進作用（非特許文献１２：Ｍ．Ｄ．ＨｅｒｒｅｒａおよびＥ．Ｍａｒｈｕｅｎｄａ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ ａｎｄ ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ ｏｎ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ ｉｎ ｒａｔ ｖａｓ ｄｅｆｅｒｅｎｓ−Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ａｌｐｈａ−２ ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃ．２４：７３９−７４２（１９９３））、腸管運動阻害作用（非特許文献１３：Ｇ．Ｄ．Ｃａｒｌｏら，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５：１０５４−１０５９（１９９３））、カルシウム流入阻害作用（非特許文献１４：Ｊ．Ｓｕｍｍａｎｅｎら，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ Ｃａ２＋ ｆｌｕｘｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ＧＨ４Ｃ１ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４１４：１２５−１３３（２００１））などの種々の生理活性を有することが報告されている。
【０００６】
フラボノイドは、ｐＨ３〜１０の領域で難溶性であり、沈澱を形成しやすい。例えば、フラボノイドの１種であるバイカレインは、投与量の約３００万分の１しか吸収されない。このように、フラボノイドは、体内への吸収効率が極めて悪いことが知られている（非特許文献１５：Ｗ．Ｗａｋｕｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，５７５，１３１−１３６（１９９２））。体内に吸収されないと、フラボノイドの持つ生理活性が生体内で充分発揮されない。そこで、その吸収効率を上昇させることが切望されていた。
【０００７】
天然に存在するフラボノイドは、一般的にアグリコンに糖が結合した配糖体の形で存在する。配糖体の形態のフラボノイドは、動物により摂取された後、腸管中に存在する細菌が産生する酵素により糖が加水分解され、アグリコンとなった後、大腸から体内に取り込まれると考えられている。フラボノイドの体内への吸収量を上げるための様々な試みが検討されてきたが、その一つとしてフラボノイドの溶解性を向上させる方法が検討されてきた。
【０００８】
例えば、非特許文献１６（Ｋａｙｏｋｏ Ｓｈｉｍｏｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５１巻，第９号（２００３））は、アグリコンであるケルセチン、ケルセチンの二配糖化物であるルチン、およびケルセチンの三配糖化物である４Ｇ−α−Ｄ−グルコピラノシルルチン（αＧ−ルチン）のラット体内への吸収性を比較している。非特許文献１６によれば、ケルセチン＜ルチン＜αＧ−ルチンの順で吸収性が上昇する。
【０００９】
ケルセチン、ルチンおよびαＧ−ルチンの吸収性および水への溶解度を以下の表１および図５にまとめる。吸収性は、非特許文献１６の表１のＡＵＣ０→２４ｈに基づく。なお、ここで、ＡＵＣ０→２４ｈは、非修飾体とメチル化体との合計（例えば、ケルセチンの場合は、ケルセチン、タマリゼチンおよびイソラムネチンの合計）の値を用いた。相対比として、αＧ−ルチンのＡＵＣ０→２４ｈを１．０としたときの比を示す。溶解度は、ルチンおよびαＧ−ルチンについて既知の値を示す。ケルセチンは水にほとんど溶けない。なお、図５においては、対数グラフ上に載せるためにケルセチンの溶解度を０．０１としてプロットした。
【００１０】
【表１】
【００１１】
表１および図５を見ると、溶解度が上昇するほど吸収性が上昇することがわかる。これらのことから、フラボノイドの溶解度を上昇させれば吸収性が上昇すると考えられる。
【００１２】
一般に、フラボノイドを配糖化すると溶解度が上昇する。そのため、フラボノイドを配糖化することにより溶解度を上昇させる試みが種々行われている。
【００１３】
例えば、特許文献４（特開２０００−７８９５６号公報）は、フラボノイド（例えば、配糖体であるヘスペリジン）に糖を結合させることにより、その糖転移化合物が非糖転移化合物よりも高率で体内に吸収されることを記載する。
【００１４】
特許文献５（特開２０００−７８９５５号公報）は、フラボノイド（例えば、配糖体であるヘスペリジン）に糖が結合した糖転移化合物と、フラボノイドとを共に生体に投与することにより、フラボノイドの生体への吸収効率が大きく改善されることを記載する。
【００１５】
フラボノイドの水に対する溶解度を向上させる方法としては他に、フラボノイドをシクロデキストリンで包接する方法が公知である。例えば、特許文献６（特開平６−５４６６４号公報）は、ケルセチンの配糖体であるルチンをシクロデキストリンで包接することにより、水に対する溶解度を大幅に向上させることができることを記載する。
【００１６】
しかし、他方で、ルチンをβ−シクロデキストリンで包接しても吸収性にほとんど影響がないという文献（非特許文献１７：Ｋｏｕｚｏｕ Ｍｉｙａｋｅら，Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｏｒａｌ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ｂｙ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５（３），３９９−４０７（２０００））もある。
【００１７】
このように、従来、フラボノイドの吸収性を向上させる方法の一つとして、フラボノイドの溶解度を向上させることが試みられていた。フラボノイドの溶解度を向上させるためには、配糖体であるフラボノイドをさらに配糖化するか、またはシクロデキストリンで包接することが主に試みられていた。
【００１８】
非特許文献１８（Ｒ．Ｆｉｃａｒｒａら，Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｉｄｓ／β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ＮＭＲ，ＦＴ−ＩＲ，ＤＳＣ，Ｘ−ｒａｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ２９（２００２）１００５−１０１４）は、ヘスペレチン、ヘスペリジン、ナリンゲニン、ナリンジンをβ−シクロデキストリンで包接し、包接されているかどうかを調べている。非特許文献１８は、包接化合物の形成は水中での溶解度を上昇させることを記載しており、そして治療処方物において、薬物の溶解および吸収を改善する可能性があることを示唆している。しかし、非特許文献１８は、これらの複合体の吸収性自体については調べていない。また、ヘスペレチンの配糖体とヘスペレチン包接物とでどちらがより生物学的利用能が高いかについては記載していない。また、非特許文献１８に記載の方法では、メタノールなどの有機溶媒を用いて包接化合物を調製している。メタノールは人体に有害であるので、この方法を用いて調製された包接化合物は、食品として使用できない。
【００１９】
さらに、吸収性を向上させる別の方法としては、フラボノイド配糖体の糖を切断してフラボノイドアグリコンとして摂取する方法が試みられてきた。
【００２０】
ヘスペリジンの場合は、アグリコンであるヘスペレチンが、配糖体であるヘスペリジンより容易に吸収されることが非特許文献１９（Ｂｏｏｔｈ ＡＮら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆａｔｅ ｏｆ ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ，ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ，ｈｏｍｏｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ ａｎｄ ｄｉｏｓｍｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３０：６６１−６６８（１９５８））において示されている。
【００２１】
ルチンについては、β−シクロデキストリンで包接して溶解性を上げる方法は、吸収性向上にほとんど効果がない。ルチンに糖を転移して配糖体にする方法は、ルチンをシクロデキストリンで包接するよりもさらに溶解性を上げる効果が高く、そして吸収性をさらに上げる効果も高い。
【００２２】
ヘスペリジンについては、ヘスペリジンに糖を転移して配糖体にすることにより溶解性を上げる方法よりも、ヘスペリジンの糖を切断して、溶解性が最も悪いアグリコンの形態にする方法の方が、吸収性を上げる効果は高い。
【００２３】
このようにフラボノイドの種類によって吸収性を上げる方法は異なると考えられ、吸収性を最も上げる方法を予測することは困難である。
【００２４】
ヘスペレチン包接物およびナリンゲニン包接物を効率的に包接する方法も公知ではない。
【特許文献１】特開平１１−１７１７７８号公報（第１頁）
【特許文献２】特開２００３−３２５１３５号公報（第１頁）
【特許文献３】特開２００２−２３４８４４号公報（第１頁）
【特許文献４】特開２０００−７８９５６号公報（第１頁要約）
【特許文献５】特開２０００−７８９５５号公報（第２頁）
【特許文献６】特開平６−５４６６４号公報（第１頁）
【非特許文献１】神谷真太郎、新ビタミン学（日本ビタミン学会）１９６９、ｐ４３９
【非特許文献２】松田英秋ら、薬学雑誌、１１１、１９３−１９８（１９９１）
【非特許文献３】Ｊ．Ａ．Ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｅｍｉｍら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４６，１１８−７１２（１９９４）
【非特許文献４】Ｍ．Ｔ．Ｍｏｎｆｏｒｔｅら、ＩｌＦａｒｍａｃｏ，５０，５９５−５９９（１９９５）
【非特許文献５】Ｔ．Ｔａｎａｋａら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５４，４６５３−４６５９（１９９４）
【非特許文献６】Ｔ．Ｔａｎａｋａら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５７，２４６−２５２（１９９７）
【非特許文献７】Ｔ．Ｔａｎａｋａら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，７６１−７６９（１９９７）
【非特許文献８】Ｔ．Ｔａｎａｋａら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１８，９５７−９６５（１９９７）
【非特許文献９】Ａ．Ｇａｒｇ，Ｓ．Ｇａｒｇ、Ｌ．Ｊ．Ｄ．ＺａｎｅｖｅｌｄおよびＡ．Ｋ．Ｓｉｎｇｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｔｒｕｓ ｂｉｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ，ＰＨＹＴＯＴＨＥＲＡＰＹ ＲＥＳＡＲＣＨ １５，６５５−６６９（２００１）
【非特許文献１０】Ｗ．Ｌ．ＢｅａｒおよびＲ．Ｗ．Ｔｅｅｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ ｏｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ １Ａ２ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：３６０９−３６１４（２０００）
【非特許文献１１】Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ− ｏｒ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ＨＬ６０ ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６２：２１９９−２２０４（１９９８）
【非特許文献１２】Ｍ．Ｄ．ＨｅｒｒｅｒａおよびＥ．Ｍａｒｈｕｅｎｄａ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ ａｎｄ ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ ｏｎ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ ｉｎ ｒａｔ ｖａｓ ｄｅｆｅｒｅｎｓ−Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ａｌｐｈａ−２ ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃ．２４：７３９−７４２（１９９３）
【非特許文献１３】Ｇ．Ｄ．Ｃａｒｌｏら，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４５：１０５４−１０５９（１９９３）
【非特許文献１４】Ｊ．Ｓｕｍｍａｎｅｎら，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ Ｃａ２＋ ｆｌｕｘｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ＧＨ４Ｃ１ ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４１４：１２５−１３３（２００１）
【非特許文献１５】Ｗ．Ｗａｋｕｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，５７５，１３１−１３６（１９９２）
【非特許文献１６】Ｋａｙｏｋｏ Ｓｈｉｍｏｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５１巻，第９号（２００３）
【非特許文献１７】Ｋｏｕｚｏｕ Ｍｉｙａｋｅら，Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｏｒａｌ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ｂｙ ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５（３），３９９−４０７（２０００）（図７）
【非特許文献１８】Ｒ．Ｆｉｃａｒｒａら，Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｉｄｓ／β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ＮＭＲ，ＦＴ−ＩＲ，ＤＳＣ，Ｘ−ｒａｙ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ２９（２００２）１００５−１０１４
【非特許文献１９】Ｂｏｏｔｈ ＡＮら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆａｔｅ ｏｆ ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ，ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ，ｈｏｍｏｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ ａｎｄ ｄｉｏｓｍｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３０：６６１−６６８（１９５８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、天然に存在する配糖体の形態であるヘスペリジンまたはナリンジンの生体吸収性を高める方法として、ヘスペレチン包接化合物およびナリンゲニン包接化合物を合成する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、天然に存在する配糖体の形態であるヘスペリジンまたはナリンジンを加水分解により糖を除去してアグリコンであるヘスペレチンまたはナリンゲニンとし、これらをさらにβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接する方法をとるか、ヘスペリジンまたはナリンジンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によってまず包接した後、さらにこれらから加水分解によって糖を除去することによりフラボノイドアグリコンの包接物に変化させる方法をとることが、ヘスペリジンまたはナリンジンの生体吸収性を最も高める方法であることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。
【００２７】
本発明の方法は、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法であって、
ヘスペリジンまたはナリンジンを、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を得る工程；および
該ヘスペリジン包接化合物または該ナリンジン包接化合物を加水分解してヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程
を包含する。
【００２８】
１つの実施形態では、上記加水分解する工程は、該ヘスペリジン包接化合物または該ナリンジン包接化合物にラムノシダーゼおよびグルコシダーゼを作用させることにより行われ得る。
【００２９】
１つの実施形態では、上記β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはその修飾物が、β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンに１〜６個のグルコース残基が側鎖として連結した分岐β−シクロデキストリン、およびそれらの化学修飾物からなる群より選択され得る。
【００３０】
１つの実施形態では、上記ヘスペリジンまたはナリンジンを、分岐β−シクロデキストリンによって包接され得る。
【００３１】
１つの実施形態では、上記分岐β−シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンに２個のグルコース残基が側鎖として連結した化合物であり得る。
【００３２】
１つの実施形態では、上記フラバノン包接化合物はヘスペレチン包接化合物であり得る。
【００３３】
本発明の別の方法は、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法であって、
ヘスペレチンまたはナリンゲニンを含む塩基性懸濁液または塩基性水溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を含む酸性水溶液とを混合することにより、ヘスペレチンまたはナリンゲニンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程
を包含する。
【００３４】
１つの実施形態では、上記β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはその修飾物は、β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンに１〜６個のグルコース残基が側鎖として連結した分岐β−シクロデキストリン、およびそれらの化学修飾物からなる群より選択され得る。
【００３５】
１つの実施形態では、上記ヘスペレチンまたはナリンゲニンを、分岐β−シクロデキストリンによって包接し得る。
【００３６】
１つの実施形態では、上記分岐β−シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンに２個のグルコース残基が側鎖として連結した化合物であり得る。
【００３７】
１つの実施形態では、上記フラバノン包接化合物は、ヘスペレチン包接化合物であり得る。
【００３８】
本発明のさらに別の方法は、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法であって、
ヘスペレチンまたはナリンゲニンを含む有機溶媒溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を含む水溶液とを混合することにより、ヘスペレチンまたはナリンゲニンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程
を包含し、ここで、該有機溶媒は、エタノール、イソプロパノールまたはテトラヒドロフランである。
【００３９】
本発明の食品は、フラバノン包接化合物を含む食品であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている。
【００４０】
１つの実施形態では、本発明の食品は、健康食品であり得る。
【００４１】
１つの実施形態では、本発明の健康食品は、血流改善および冷え性改善用であり得る。
【００４２】
１つの実施形態では、本発明の健康食品は、肌状態改善用であり得る。
【００４３】
１つの実施形態では、本発明の健康食品は、コレステロール低下用であり得る。
【００４４】
１つの実施形態では、本発明の健康食品は、アレルギー症状改善用であり得る。
【００４５】
１つの実施形態では、本発明の健康食品は、抗炎症用であり得る。
【００４６】
本発明の医薬品は、フラバノン包接化合物を含む医薬品であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている。
【００４７】
本発明の皮膚外用剤は、フラバノン包接化合物を含む皮膚外用剤であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている。
【００４８】
本発明の包接化合物は、フラバノン包接化合物であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、分岐β−シクロデキストリンまたは化学修飾β−シクロデキストリンによって包接されている。
【発明の効果】
【００４９】
ヘスペリジンまたはナリンジンを加水分解により、ヘスペレチンまたはナリンゲニンとした後、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によってこれらを包接するか、ヘスペリジンまたはナリンジンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接し、さらにこれらから加水分解によって糖を除去してフラボノイドアグリコンの包接物に変化させることにより、生体吸収性が極めて高い、ヘスペレチン包接化合物およびナリンゲニン包接化合物が高い効率で提供される。これらの包接物は生体吸収性が高いため、高い効率で迅速に体内に吸収されるため、ヘスペリジンまたはナリンジンを摂取した時と同様の生理効果を、少量摂取しただけで発揮し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００５１】
本発明により、フラバノン包接化合物を製造する方法が提供される。このフラバノン包接化合物において、フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、このフラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている。
【００５２】
本明細書中で「包接化合物」とは、分子錯体であって、一方の化学種が１〜３次元の分子規模の空間を作り、その空間に他方の化学種が取り込まれる（すなわち、包接される）ことによって生じる化合物をいう。空間を提供する化合物をホスト、包接される化学種をゲストという。本発明で合成されるフラバノン包接化合物においては、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物がホストであり、フラバノンがゲストである。
【００５３】
（１．フラバノン）
本発明で合成される包接化合物においてゲストとして使用されるフラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンである。フラバノンは好ましくはヘスペレチンである。
【００５４】
ヘスペレチンは、３’，５，７−トリヒドロキシ−４’−メトキシフラバノンとも呼ばれる。ヘスペレチンは、以下の構造を有する：
【化１】
【００５５】
ヘスペレチンは、ヘスペリジンのアグリコンである。ヘスペレチンは、ヘスペリジンをヘスペリジナーゼまたはナリンギナーゼによって分解することにより入手され得る。ヘスペリジンはフラボノイドの一種であり、柑橘類(例えば、温州みかん、夏みかん、伊予みかん、ネーブルオレンジ、バレンシアオレンジ）に含まれており、特に温州みかんに多く含まれている。ヘスペリジンは、未熟期のみかんに多量に含まれる。ヘスペリジンは、ミカンの部位でも、黄色い外果皮と果肉との間にある、白い中果皮に最も多く含まれている。ヘスペリジンは、柑橘類の果皮、果汁または種子より抽出することができる。例えば、温州みかんの搾汁粕からヘスペリジンを抽出する場合は、水酸化カルシウムを加えてｐＨを１１．５〜１２．５に調整してから撹拌混合し、これを圧搾してから遠心分離する。この液に酸を加えてｐＨを５〜５．５にしてから加温し、遠心分離により沈澱しているヘスペリジンを回収する方法が示されている（特開平８−１８８５９３号公報）。その後、ヘスペリジン水溶液を調製し、糖部分を（例えば、ナリンギナーゼの作用または酸性条件での加水分解により）分解することにより、ヘスペレチンが得られ得る。柑橘類からヘスペリジンを得る方法の詳細は、例えば、Ｋｉｎｇ ＦＥおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ Ａ．，Ｎａｔｕｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ，Ｐａｒｔ ３．Ｊ．Ｃｈｅｍ．ｓｏｃ．（ＩＩ）：１７０４−１７０９（１９３１）に記載される。あるいは、市販のヘスペリジンを原料として用いてもよい。ヘスペリジンは、例えば、ハマリ産業株式会社から販売される。ヘスペレチンは、ヘスペリジンのアグリコンである。ヘスペリジンから酸分解によってヘスペレチンを得る方法の詳細は、例えば、Ａｓａｈｉｎａ Ｙ．ら，Ｆｌａｖａｎｏｎｅ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ（Ｖ）：Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖａｎｏｎｅ ａｎｄ ｆｌａｖｏｎｏｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｏｃ−Ｊａｐａｎ ５０：２１７−２２３（１９３１）に記載される。ヘスペレチンは、ヘスペリジンをラムノシダーゼおよびグルコシダーゼによって酵素分解することによっても入手され得る。
【００５６】
ナリンゲニンは、４’，５，７−トリヒドロキシフラバノンとも呼ばれる。ナリンゲニンは、以下の構造を有する：
【化２】
【００５７】
ナリンゲニンは、その配糖化物として天然に存在する。すなわち、ナリンゲニンは、ナリンジン（ナリンギンともいう）のアグリコンである。ナリンゲニンは、ナリンジンをナリンギナーゼによって分解することにより入手され得る。ナリンジンはフラボノイドの一種であり、柑橘類、特にグレープフルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ ｐａｒａｄｉｓｉ ＭＡＣＦ．）、ザボン（Ｃｉｔｒｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）などに多く含まれている。ナリンジンは柑橘類の苦味物質である。ナリンジンは一般に、グレープフルーツの果実中に０．０３〜０．１％含まれる。ナリンジンは、グレープフルーツの部位でも、黄色い外果皮と果肉との間にある、白い中果皮に最も多く含まれている。ナリンジンは、グレープフルーツ、ザボンなどの果皮、果汁または種子より、水または室温時有機溶媒（例えば、エタノールもしくはメタノール）で抽出することにより、分離され得る。ナリンジンの溶解度は水に対し０．１重量％であるが、アルカリ性水溶液に対しては１．０重量％以上溶解する。それゆえ、グレープフルーツ、ザボンなどの果皮、果汁または種子中のナリンジンをまずアルカリ性水溶液に溶解させ、酸で中和することにより、ナリンジンを結晶化してもよい。その後、ナリンジン水溶液を調製し、ナリンギナーゼを作用させて糖部分を分解することにより、ナリンゲニンが得られ得る。グレープフルーツからナリンジンを得る方法の詳細は、例えば、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｇｒａｐｅｆｒｕｉｔ ｊｕｉｃｅ．（Ｏｒｉｉ Ｙら，１９９７年 臨床薬理)に記載される。あるいは、市販のナリンジンを原料として用いてもよい。ナリンジンは、例えば、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社から販売される。ナリンジンからナリンゲニンを得る方法の詳細は、例えば、酵素利用ハンドブック 小崎道雄 監修 地人書館刊に記載される。
【００５８】
（２．β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物）
本発明で合成される包接化合物においては、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物が、ホストとして作用する。これらのホストは、その空洞内部に種々の有機化合物を取り込み、複合体を形成することが既に知られている。シクロデキストリンの空洞内部は、比較的疎水環境にあるため、水を媒体とした環境下では、親油性物質、あるいは親水性分子構造の中の比較的親油性となる官能基を選択的に取り込む傾向がある。
【００５９】
本明細書では、「β−シクロデキストリン」とは、７個の環状α−（１→４）結合したＤ−グルコピラノース単位から構成されるマルトオリゴ糖をいう。β−シクロデキストリンは、立体的には、底の抜けたバケツの側壁を取り囲むようにグルコース残基が配位している。β−シクロデキストリンは、澱粉などの多糖にシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を作用させることにより調製され得る。β−シクロデキストリンの製造方法は、例えば、シクロデキストリン−基礎と応用−（戸田不二緒 監修 産業図書刊）に記載される。β−シクロデキストリンはまた、例えば、株式会社 横浜国際バイオ研究所から市販されている。
【００６０】
本明細書では、「分岐β−シクロデキストリン」とは、β−シクロデキストリンに１個以上のグルコース残基が側鎖として連結した一般的に「分岐β−シクロデキストリン」と呼ばれるもの、およびβ−シクロデキストリンに結合しているグルコース残基のＣ４位水酸基またはＣ６位水酸基にβ−結合でガラクトシル基を結合させたガラクトシル−分岐βシクロデキストリン、β−シクロデキストリンに直接ガラクトシル基が結合したガラクトシル分岐β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンにマンノース残基が結合した６−Ｏ−α−Ｄ−マンノシル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンに結合しているグルコース残基のＣ４位水酸基またはＣ６位水酸基にα−結合でマンノース残基を結合させたマンノース−分岐βシクロデキストリン、β−シクロデキストリンにＮ−アセチルグルコサミン残基が結合した６−Ｏ−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−β−シクロデキストリンなどの一般に「ヘテロ分岐β−シクロデキストリン」と呼ばれているものをいう。包接能力を維持しかつ構造的に可能である限り、結合する残基は、β−シクロデキストリンの任意の位置に連結し得るが、好ましくは、バケツの底側にあたる位置に連結する。包接能力を維持しかつ構造的に可能である限り、結合する残基は、β−シクロデキストリンの１箇所または２箇所以上に連結し得るが、好ましくは、１箇所に連結する。β−シクロデキストリンに連結する残基は、好ましくは１〜６個であり、より好ましくは１〜５個であり、さらに好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１または２個であり、最も好ましくは２個である。β−シクロデキストリンに連結する複数の残基からなる鎖は、直鎖状であってもよく、分岐していてもよい。分岐シクロデキストリンはシクロデキストリンよりも更に高い水溶性を示す。
【００６１】
分岐β−シクロデキストリンは、例えば、まず、澱粉にＣＧＴａｓｅを作用させて得られた、β−シクロデキストリン含有澱粉分解物に、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどのシクロデキストリンを分解しないかまたは分解し難い酵素を添加して、澱粉分解物に残存する非環状デキストリンを分解してオリゴ糖を生成させる。次いで、このβ−シクロデキストリンおよびオリゴ糖を含む澱粉分解物に、プルラナーゼ、イソアミラーゼなどの枝切り酵素を作用させて、オリゴ糖をシクロデキストリンに連結させることによって製造され得る。あるいは、純粋なβ−シクロデキストリンを含む水溶液中に、マルトース、マルトトリオースなどを添加し、この溶液に枝切り酵素を作用させることによっても製造され得る。あるいは、澱粉にシクロデキストリン生成酵素を作用させると、溶液中に分岐β−シクロデキストリンが形成される（特開平６−５４６６４号公報）ので、これらを利用してもよい。分岐β−シクロデキストリンの製造方法は、例えば、特開平６−１４７８９号公報に記載される。分岐β−シクロデキストリンはまた、例えば、株式会社 横浜国際バイオ研究所から市販されている。
【００６２】
本明細書では、「それらの修飾物」とは、β−シクロデキストリンの修飾物または分岐β−シクロデキストリンの修飾物をいう。便宜上、分岐β−シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンの修飾物には含まれない。β−シクロデキストリンおよび分岐β−シクロデキストリンは、包接能力を維持しかつ構造的に可能である限り、任意に修飾され得る。修飾は好ましくは化学修飾である。化学修飾の例としては、メチル化、プロピル化、モノアセチル化、トリアセチル化、モノクロロトリアジニル化、ヒドロキシエチル化、２−ヒドロキシプロピル化、２，３−ジヒドロキシプロピル化、２−ヒドロキシブチル化、２−ヒドロキシイソブチル化、ジエチルアミノエチル化、トリメチルアンモニオプロピル化などが挙げられる。化学修飾β−シクロデキストリンの市販品の具体例としては、以下が挙げられる：ＣＡＶＡＳＯＬ Ｗ７ Ｍ、ＣＡＶＡＳＯＬＷ７ Ｍ ＰｈａｒｍａおよびＣＡＶＡＳＯＬ Ｗ７ Ｍ ＴＬ（いずれも、ワッカーケミカルズイーストアジア株式会社製）として市販されるメチル−β−シクロデキストリン；ＣＡＶＡＳＯＬＷ７ ＨＰおよびＣＡＶＡＳＯＬ Ｗ７ ＨＰ Ｐｈａｒｍａ（いずれも、ワッカーケミカルズイーストアジア株式会社製）として市販されるヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン；ＣＡＶＡＳＯＬ Ｗ７ Ａ（いずれも、ワッカーケミカルズ イーストアジア株式会社製）として市販されるモノアセチル−β−シクロデキストリン；ＣＡＶＡＳＯＬ Ｗ７ ＴＡ（いずれも、ワッカーケミカルズ イーストアジア株式会社製）として市販されるトリアセチル−β−シクロデキストリン；ならびにＣＡＶＡＳＯＬ Ｗ７ ＭＣＴ（いずれも、ワッカーケミカルズ イーストアジア株式会社製）として市販されるモノクロロトリアジニル−β−シクロデキストリン。β−シクロデキストリンまたは分岐β−シクロデキストリンを化学修飾する方法は当該分野で公知であり、例えば、シクロデキストリン−基礎と応用−（戸田不二緒 監修 産業図書刊）に記載される。
【００６３】
本発明の包接化合物の合成方法においては、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物のうちの１種の化合物を単独で用いてもよく、２種以上混合して用いてもよい。１種で単独で用いることが好ましい。本発明の合成方法においては、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を精製して用いることもできるが、これらのシクロデキストリンを調製して精製をしていない溶液を用いてもよい。精製物を用いることが好ましい。
【００６４】
（３．フラバノン包接化合物）
本発明で合成されるフラバノン包接化合物は、一般式［Ｆ］ｍ・［βＣＤ−Ｒ］ｎにより示される。ここで、Ｆは、
【化３】
または
【化４】
であり、βＣＤ−Ｒは、（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）６（Ｃ６Ｈ９Ｏ５）−Ｒ１を示し、Ｒ１は、Ｈ、−（Ｃ６Ｈ１１Ｏ５）（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｓ、低級アルキル、置換アルキル、アシルおよびアジニルからなる群より選択され、ｍ、ｎおよびｓはそれぞれ１以上の任意の整数である。周知のとおり、βＣＤは、グルコース残基が７つ連なった環状構造をとる。
【００６５】
本明細書中では、「低級アルキル」とは、鎖中に１〜６個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖であり得る基を意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ヘプチル、ノニル、デシル、フルオロメチル、トリフルオロメチルおよびシクロプロピルメチルが挙げられる。
【００６６】
本明細書中では、「置換アルキル」とは、アルキル基が１つ以上の置換基で置換されることを意味し、これらの置換基は、同じであっても異なっていてもよい。各置換基は、ハロ、アルキル、アリール、シクロアルキル、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、−ＮＨ（アルキル）、−ＮＨ（シクロアルキル）、−Ｎ（アルキル）２、カルボキシおよび−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキルからなる群から独立して選択される。
【００６７】
本明細書中では、「アシル」は、Ｈ−Ｃ（Ｏ）−基、アルキル−Ｃ（Ｏ）−基、アルケニル−Ｃ（Ｏ）−基、アルキニル−Ｃ（Ｏ）−基、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−基、シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）−基またはシクロアルキニル−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。適切なアシル基の非限定的な例としては、ホルミル、アセチル、プロパノイル、２−メチルプロパノイルおよびシクロヘキサノイルが挙げられる。
【００６８】
本発明で合成されるフラバノン包接化合物において、フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、このフラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている。フラバノンは好ましくは、分岐β−シクロデキストリンによって包接されている。
【００６９】
ｍ：ｎは、好ましくは１：１であり、ｍは、好ましくは１であり、ｎは好ましくは１である。
【００７０】
Ｒ１は好ましくは−（Ｃ６Ｈ１１Ｏ５）（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｓである。−（Ｃ６Ｈ１１Ｏ５）（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｓは、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。直鎖状であることが好ましい。
【００７１】
ｓは好ましくは０〜５であり、より好ましくは０〜４であり、さらに好ましくは０〜３であり、さらにより好ましくは０〜２であり、さらにより好ましくは０〜１であり、最も好ましくは１である。
【００７２】
ホストとゲストとから包接化合物が形成されたことは、当該分野で公知の方法により確認され得る。例えば、Ｘ線回折、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、示差走査熱分析（ＤＳＣ）、フーリエ変換赤外分光計（ＦＴ−ＩＲ）などにより確認され得る。
【００７３】
本発明で合成されるフラバノン包接化合物においては、ホストとゲストとが分子数の比にして１：１で包接しており、そのことは、例えば、ＮＭＲにより確認され得る。
【００７４】
（４．フラバノン包接化合物を合成する方法）
本発明の方法により、フラバノン包接化合物が合成される。本発明の方法は、以下のいずれかの方法である。
【００７５】
（４．１ 配糖体を包接した後、糖部分を加水分解してアグリコン包接化合物を得る方法）
本発明の第１の方法は、フラバノン包接化合物を合成する方法であって、ヘスペリジンまたはナリンジンを、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を得る工程；および該ヘスペリジン包接化合物または該ナリンジン包接化合物を加水分解してヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程を包含する。
【００７６】
包接化合物を合成する一般的な方法としては、シクロデキストリンの飽和水溶液中で包接化合物を作製する飽和水溶液法、シクロデキストリンと水およびゲスト物質を混練し、包接化合物を得る混練法、シクロデキストリンまたはシクロデキストリンを含む多糖水溶液とゲスト物質を噴霧乾燥して、包接化合物を含む粉体を得る噴霧乾燥法などがある。これらの方法の詳細は当該分野で公知である。シクロデキストリンと水およびゲスト物質を混練し、包接化合物を得る混練法の詳細は、例えば、ＣＤ包接フレーバー粉末の作成とその除放性質（吉井英文 ２００４年 日本食品工学会誌）に記載される。シクロデキストリンまたはシクロデキストリンを含む多糖水溶液とゲスト物質を噴霧乾燥して、包接化合物を含む粉体を得る噴霧乾燥法の詳細は、例えば、機能性食品粉末の作成とその特性に関する研究（吉井英文 ２００３年 日本食品工学会年次大会講演要旨集）に記載される。
【００７７】
本発明の合成方法では、まず、配糖体であるヘスペリジンまたはナリンジンを、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を得る。本発明の合成方法は、ヘスペリジンおよびナリンジンが天然物であり、ヘスペレチンおよびナリンゲニンと比較して非常に容易かつ安価に入手できるという利点を有する。
【００７８】
ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物は、以下の手順Ａ１またはＢ１で作製され得る。
【００７９】
（Ａ１．塩基性水溶液を用いる手順）
ヘスペリジンまたはナリンジンの塩基性水溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物の酸性水溶液とを少しずつ混合して中和させると、この中和溶液中で包接化合物が形成される。ヘスペリジンまたはナリンジンは、塩基性にすると溶解度が上昇するので、ヘスペリジンまたはナリンジンの水溶液を塩基性にすることが好ましく、ｐＨを約１０〜約１２にすることがより好ましく、約１０．５〜約１１．５にすることが最も好ましい。溶液を塩基性にするためには、当該分野で公知の任意の塩基を用い得る。溶液を塩基性にするために用いられ得る塩基の例として、以下が挙げられる：水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、リン酸カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよびかんすい。得られるフラバノン包接化合物を食品用途に用いる場合、塩基は、食品添加物として用いられ得る塩基であることが好ましい。１種類の塩基を単独で用いてもよく、２種以上の塩基を混合して用いてもよい。
【００８０】
有機溶媒を用いないで合成を行う場合、安全性の懸念がないことから、得られる包接化合物を食品に利用し得るという利点を有する。また、有機溶媒を用いない場合、有害物質が残留していないことを確認する必要がないため、簡便であり、コストが低くなるという利点も有する。
【００８１】
（Ｂ１．有機溶媒を用いる手順）
ヘスペリジンまたはナリンジンを有機溶媒中に溶解した液に、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物の水溶液を少しずつ混合しながら撹拌することで、包接化合物を形成させてもよい。有機溶媒としては、水溶性のものが良く、好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン等が挙げられる。
【００８２】
上記のＡ１の手順およびＢ１の手順のいずれにおいても、混合する際のヘスペリジンまたはナリンジンとβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物とのモル濃度比は、任意に設定され得るが、好ましくは１：２〜１：６であり、より好ましくは１：３〜１：４である。
【００８３】
次いで、このヘスペリジン包接化合物またはこのナリンジン包接化合物を加水分解してヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る。ヘスペリジン包接化合物またはこのナリンジン包接化合物の加水分解は、酵素的に行ってもよく、化学的に行ってもよい。
【００８４】
加水分解を酵素的に行う場合、ラムノシダーゼおよびグルコシダーゼを用いる。ラムノシダーゼは、ヘスペリジンおよびナリンジン中のラムノース残基を加水分解する。グルコシダーゼは、ヘスペリジンおよびナリンジン中のグルコース残基を加水分解する。ラムノシダーゼおよびグルコシダーゼは、当該分野で容易に入手され得る。
【００８５】
例えば、一般にナリンギナーゼと呼ばれる酵素は、ラムノシダーゼおよびβ−グルコシダーゼを含む混合物である。ナリンギナーゼは、糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）またはＣｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ ｓｐ．）の培養液より、水で抽出し、濃縮した後、エタノールで処理することにより得られ得る。
【００８６】
抽出は、０℃〜１５℃で行われることが好ましい。濃縮は、０℃〜３０℃で行われることが好ましい。エタノール処理は、０℃〜１５℃で行われることが好ましい。ナリンギナーゼは、田辺製薬株式会社から、ナリンギナーゼとして販売されている。
【００８７】
一般にヘスペリジナーゼと呼ばれる酵素は、ラムノシダーゼおよびβ−グルコシダーゼを含む。ヘスペリジナーゼは、糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ））の培養液より、水で抽出し、濃縮した後、エタノールで処理することにより得られ得る。
【００８８】
抽出は、０℃〜１５℃で行われることが好ましい。濃縮は、０℃〜３０℃で行われることが好ましい。エタノール処理は、０℃〜１５℃で行われることが好ましい。ヘスペリジナーゼは、田辺製薬株式会社から、可溶性ヘスペリジナーゼ＜タナベ＞２号として販売されている。
【００８９】
これら以外にも、他の任意のグルコシダーゼおよびラムノシダーゼを用いてもよい。
【００９０】
グルコシダーゼおよびラムノシダーゼを作用させる前にヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を精製してもよく、あるいは、形成されたヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を精製することなくそのまま次の工程を行ってもよい。ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を含む溶液のｐＨは、任意に設定されるが、好ましくは、酵素反応を最適化するために、酸性に調整され、より好ましくはｐＨが約４〜５になるように調整される。酸性溶液中で包接されて溶解している状態を安定的に維持し、反応後のヘスペレチン包接物またはナリンゲニン包接物の収率を上げるために、ヘスペリジンまたはナリンジンの反応溶液中の濃度を０．１ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは４ｍｇ／ｍｌ〜１２ｍｇ／ｍｌとし、ヘスペリジンまたはナリンジンとシクロデキストリンとのモル比を１：２〜１：６、好ましくは１：３〜１：４とする。
【００９１】
ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物に対して添加されるグルコシダーゼおよびラムノシダーゼの量は、任意に設定され得る。グルコシダーゼの量は、好ましくは、約０．００１重量％〜約１０重量％であり、より好ましくは約０．０１重量％〜約５重量％であり、さらに好ましくは約０．０５重量％〜約１重量％である。ラムノシダーゼの量は、好ましくは、約０．００１重量％〜約１０重量％であり、より好ましくは約０．０１重量％〜約５重量％であり、さらに好ましくは約０．０５重量％〜約１重量％である。例えば、グルコシダーゼおよびラムノシダーゼとしてナリンギナーゼを用いた場合、ナリンギナーゼの量は、好ましくは約０．０１重量％〜約１０重量％であり、より好ましくは約０．０５重量％〜約５重量％であり、さらに好ましくは約０．１重量％〜約１重量％である。
【００９２】
ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物と酵素とを反応させる際の溶液の温度は、任意に設定され得るが、好ましくは約１０℃〜約７０℃であり、より好ましくは約２０℃〜約６５℃であり、さらに好ましくは約３０℃〜約６０℃であり、最も好ましくは約４０℃〜約５５℃である。もちろん、反応温度は、使用する酵素の反応至適温度、反応効率などを考慮して設定される。反応時間は、任意に設定され得るが、好ましくは約３０分間〜約１００時間であり、より好ましくは約１時間〜約８０時間であり、さらに好ましくは約５時間〜約６０時間であり、最も好ましくは約１０時間〜約５０時間である。酵素反応後、この反応液を、必要に応じて、酵素反応よりも高温（例えば、約５０℃〜約９０℃、好ましくは約６０℃〜約８０℃）の条件で任意の時間（例えば、約１時間〜約６時間、好ましくは約２時間〜約４時間）保持してもよい。
【００９３】
このようにしてラムノシダーゼおよびグルコシダーゼがヘスペリジン包接物またはナリンジン包接化合物に作用すると、これらのフラバノンの糖部分が加水分解され、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物が形成される。
【００９４】
加水分解を化学的に行う場合、ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を酸加水分解し得る。β−シクロデキストリンおよびアグリコン部分を分解しない限り、酸加水分解には、任意の酸を使用し得る。酸加水分解に使用され得る酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸が挙げられる。得られるフラバノン包接化合物を食品用途に用いる場合、酸は、食品添加物として用いられ得る酸であることが好ましい。塩酸を用いることが好ましい。１種類の酸を単独で用いてもよく、２種以上の酸を混合して用いてもよい。加水分解開始時における酸濃度は、好ましくは約０．１Ｎ〜約１０Ｎであり、より好ましくは約１Ｎ〜約５Ｎである。酸濃度が低すぎると未分解ヘスペリジンの残存率が高くなる場合がある。酸濃度が高すぎると、β−シクロデキストリンによる包接が外れてしまう場合、またはβ−シクロデキストリン部分およびアグリコン部分が分解される場合がある。
【００９５】
酸加水分解の際の反応温度は特に限定されないが、溶液を沸騰温度付近まで加熱することが好ましい。酸加水分解の反応時間は、特に限定されないが、好ましくは約１分間〜約１００時間であり、より好ましくは約１０分間〜約５０時間であり、さらにより好ましくは約１時間〜約４０時間であり、最も好ましくは約１０時間〜約３０時間である。反応時間が短すぎると、酸加水分解が不十分になる場合がある。反応時間が長すぎると、β−シクロデキストリンによる包接が外れてしまう場合、またはβ−シクロデキストリン部分およびアグリコン部分が分解される場合がある。
【００９６】
（４．２ アグリコンにβ−シクロデキストリンを直接包接させる方法）
ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物は、アグリコンにβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を直接包接させることによって合成され得る。本発明のこの方法は、（Ａ２）ヘスペレチンまたはナリンゲニンを含む塩基性懸濁液または塩基性水溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を含む酸性水溶液とを混合することにより、ヘスペレチンまたはナリンゲニンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程、あるいは、（Ｂ２）ヘスペレチンまたはナリンゲニンを含む有機溶媒溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を含む水溶液とを混合することにより、ヘスペレチンまたはナリンゲニンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程を包含する。アグリコンにβ−シクロデキストリンなどを直接包接させる場合も、上記のヘスペリジンまたはナリンジンを包接する場合について記載した方法と同様の包接方法を使用する。
【００９７】
ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物は、以下の手順Ａ２またはＢ２で作製され得る。
【００９８】
（Ａ２．塩基性水溶液を用いる手順）
例えば、ヘスペレチンまたはナリンゲニンの塩基性懸濁液または塩基性水溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物の酸性水溶液とを少しずつ混合して中和させると、この中和溶液中で包接化合物が形成される。ヘスペレチンまたはナリンゲニンは、塩基性にすると溶解度が上昇するので、ヘスペリジンまたはナリンゲニンの懸濁液または水溶液を塩基性にすることが好ましく、ｐＨを約１０〜約１４にすることがより好ましく、約１１．５〜約１３．５にすることが最も好ましい。懸濁液または水溶液を塩基性にするためには、当該分野で公知の任意の塩基を用い得る。懸濁液または水溶液を塩基性にするために用いられ得る塩基の例として、以下が挙げられる：水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、リン酸カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよびかんすい。得られるフラバノン包接化合物を食品用途に用いる場合、塩基は、食品添加物として用いられ得る塩基であることが好ましい。１種類の塩基を単独で用いてもよく、２種以上の塩基を混合して用いてもよい。
【００９９】
有機溶媒を用いないで合成を行う場合、安全性の懸念がないことから、得られる包接化合物を食品に利用し得るという利点を有する。また、有機溶媒を用いない場合、有害物質が残留していないことを確認する必要がないため、簡便であり、コストが低くなるという利点も有する。
【０１００】
（Ｂ２．有機溶媒を用いる手順）
ヘスペレチンンまたはナリンゲニンを有機溶媒中に溶解した液に、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物の水溶液を少しずつ混合しながら撹拌することで、包接化合物を形成させてもよい。有機溶媒としては、水溶性のものが良く、好ましくは、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン等が挙げられる。
【０１０１】
上記のＡ２の手順およびＢ２の手順のいずれにおいても、混合する際のヘスペレチンまたはナリンゲニンとβ−シクロデキストリンとのモル濃度比は、任意に設定され得るが、好ましくは１：１〜１：６であり、より好ましくは１：２〜１：４である。
【０１０２】
混合は、任意の温度で行われ得る。混合後、この混合液を、必要に応じて、混合時よりも高温（例えば、約５０℃〜約９０℃、好ましくは約６０℃〜約８０℃）の条件で任意の時間（例えば、約１時間〜約６時間、好ましくは約２時間〜約４時間）保持してもよい。
【０１０３】
（５．フラバノン包接化合物の溶解度の確認方法）
フラバノン包接化合物の溶解度は、当該分野で公知の方法によって確認され得る。例えば、０．１Ｎ ＮａＯＨ中の種々の濃度のフラバノン塩基性溶液２．２体積部に、０．１Ｎ ＨＣｌ中のβ−シクロデキストリン溶液１．７体積部を少量ずつ攪拌しながら添加して溶液のｐＨを中性に変化させながらフラバノン包接化合物を形成させ、析出が生じるか否かを確認することにより、簡便に溶解度を確認し得る。あるいは、例えば、フラバノン包接化合物を２０℃の水に添加し、３０分間攪拌したときに溶解するか否かを確認することにより、溶解度を確認し得る。
【０１０４】
（６．フラバノン包接化合物の吸収性の確認方法）
フラバノン包接化合物の吸収性は、当該分野に公知の方法を用いて確認され得る。フラバノン包接化合物の吸収性は、例えば、以下のようにして測定され得る。予備飼育（例えば、約３日〜１週間）した動物（例えば、６週齢のオスｄｄＹマウス）を絶食（例えば、約１４時間）させ、所定濃度のフラバノン包接化合物の溶液（例えば、２００μｌ）を経口投与する。ゾンデを用いて胃に直接投与してもよい。投与後、経時的に（例えば、心臓から）採血し、血清を分離する。次いで、血清に対し、スルファターゼ、グルクロニダーゼを含む溶液を添加して反応させた後、アセトニトリルを添加して遠心分離し、上清を濃縮遠心により乾固する。これをアセトニトリル／メタノール／水（５０：２０：３０、ｖ／ｖ／ｖ）で溶解し、攪拌した後、ソニケーションし、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて電気化学検出器で検出することにより、得られた血清中のフラバノン誘導体量を定量する。
【０１０５】
あるいは、得られた血液をＪ．Ａ．Ｂｏｕｔｉｎらの方法（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２１，１１５７−１１６６（１９９３））によって前処理したのちに、ＨＰＬＣを用いてそれに含まれるフラバノン包接化合物の量を定量してもよい。Ｊ．Ａ．Ｂｏｕｔｉｎらの方法は以下のとおりである。採取された血液５００μｌにアセトニトリル１０００μｌを添加し、充分振とうした後、１５分間静置する。５５００ｒｐｍで２０分間遠心した後、その上清をとり、凍結乾燥する。凍結乾燥した試料をアセトニトリル／蒸留水（２０／８０；Ｖ／Ｖ，０．０１Ｍ ＮａＯＨ）溶液１００μｌで溶解し、ＨＰＬＣで分析する。ＨＰＬＣの条件は、測定するフラバノン包接化合物により若干の違いはあるが、基本的な条件は以下のとおりである。カラム：ＯＤＳ、カラム温度：４０℃、溶離液：アセトニトリル／蒸留水（２０／８０；Ｖ／Ｖ）、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ ２８０ｎｍ。血液中のフラバノン包接化合物濃度は濃度既知のフラバノン化合物を用いて検量線を作成し求める。なお、実験動物としてはマウスのほか、ラットなどを用いることもできる。
【０１０６】
（７．フラバノン包接化合物を含む食品）
本発明の食品は、本発明の方法で合成されるフラバノン包接化合物を含む。食品は、任意の食品であり得る。食品は、固体であっても、半固体であっても、液体であってもよいが、好ましくは液体である。食品は、好ましくは、健康食品であり、より好ましくは健康飲料であるが、これらに限定されない。健康食品は、その健康食品に含まれるフラバノン包接化合物中のフラバノン（すなわち、ヘスペレチンまたはナリンゲニン）と同じ通常の用途に用いられ得る。健康食品の用途・効能の例としては、血流改善および冷え性改善用、肌状態改善用、コレステロール低下用、アレルギー症状改善用、ならびに抗炎症用が挙げられる。本発明の食品は、フラバノン包接化合物に加えて、甜茶抽出物を含み得る。甜茶抽出物を含むことにより、フラバノン包接化合物の生理活性と甜茶抽出物の生理活性との相乗効果が得られ得る。特に、本発明の食品がアレルギー症状改善用である場合、本発明の食品は、フラバノン包接化合物に加えて、甜茶抽出物を含むことが好ましい。
【０１０７】
食品は、例えば、冷菓（アイスクリーム、アイスミルク、氷菓など）、嗜好性飲料（例えば、清涼飲料、炭酸飲料（サイダー、ラムネ等）、薬味飲料、アルコール性飲料、粉末ジュースなど）、乳製品（牛乳、ヨーグルト、アイスクリーム、バター、マーガリン、チーズ、ホイップクリーム等）、菓子類（洋菓子、和菓子、スナック菓子等、例えば、あんこ、羊羹、饅頭、チョコレート、ガム、ゼリー、寒天、杏仁豆腐、ケーキ、カステラ、クッキー、煎餅、錠菓等）、パン、餅、水産練製品（蒲鉾、ちくわ等）、畜肉加工品（ソーセージ、ハム等）、果実加工品（ジャム、マーマレード、果実ソース等）、調味料（ドレッシング、マヨネーズ、味噌等）、麺類（うどん、そば等）、漬物、および蓄肉、魚肉、果実の瓶詰、缶詰類などであり得る。
【０１０８】
本発明の方法で合成された包接化合物を食品に添加するには特別な工程を必要とせず、食品の製造工程の初期において原料と共に添加するか、製造工程中に添加するか、あるいは製造工程の終期に添加する。添加方式は混和、混練、溶解、浸漬、散布、噴霧、塗布等通常の方法を食品の種類および性状に応じて選択する。本発明の食品は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１０９】
（８．フラバノン包接化合物を含む医薬品）
本発明の医薬品は、本発明の方法で合成されたフラバノン包接化合物を含む。医薬品は、任意の医薬品であり得る。医薬品は、固体であっても、半固体であっても、液体であってもよいが、好ましくは液体である。
【０１１０】
本発明の方法で合成された包接化合物を医薬品に添加するには特別な工程を必要とせず、医薬品の製造工程の初期において原料と共に添加するか、製造工程中に添加するか、あるいは製造工程の終期に添加する。添加方式は混和、混練、溶解、浸漬、散布、噴霧、塗布等通常の方法を医薬品の種類および性状に応じて選択する。本発明の医薬品は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１１１】
（９．フラバノン包接化合物の他の用途）
本発明の方法で合成されたフラバノン包接化合物は、他の種々の用途に用いられ得る。このような用途の例としては、皮膚外用剤が挙げられる。皮膚外用剤の例としては、例えば、化粧水、乳液、クリーム、美容液、養毛剤、育毛剤、パック、口紅、リップクリーム、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、ファンデーション、アイカラー、チークカラー、シャンプー、リンス、ヘアーリキッド、ヘアートニック、パーマネントウェーブ剤、ヘアカラー、トリートメント、浴用剤、ハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、ボディローションなどが挙げられる。本発明の方法で合成されたフラバノン包接化合物を含む皮膚外用剤は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１１２】
本明細書中では、フラバノン包接化合物を繊維に結合したり、繊維材料に混合したり、繊維に含浸させたり、または布帛の表面に塗布したりすることにより、その繊維または布帛から製造した衣類（例えば、肌着など）と皮膚とが接触したときにフラバノン包接化合物が経皮吸収されるような利用方法におけるフラバノン包接化合物を含む衣類も、皮膚外用剤の概念に含む。フラバノン包接化合物を繊維に結合することは、例えば、架橋などにより行われ得る。化合物を繊維に結合する方法、繊維材料に混合する方法、繊維に含浸させる方法、布帛表面に塗布する方法などは、当該分野で公知である。
【０１１３】
本発明の方法で合成された包接化合物を皮膚外用剤に添加するには特別な工程を必要とせず、皮膚外用剤の製造工程の初期において原料と共に添加するか、製造工程中に添加するか、あるいは製造工程の終期に添加する。添加方式は混和、混練、溶解、浸漬、散布、噴霧、塗布等通常の方法を皮膚外用剤の種類および性状に応じて選択する。本発明の方法で合成された皮膚外用剤は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【実施例】
【０１１４】
＜製造実施例１：包接ヘスペリジンを介した包接ヘスペレチンの製造＞
０．１ＮのＮａＯＨ １００重量部にヘスペリジン（ハマリ産業株式会社から購入）１重量部を加えて溶解し、ヘスペリジン溶液（ｐＨ＝１２．５）を調製した。０．１ＮのＨＣｌ ７６．８重量部に９．７７２重量部の分岐β−シクロデキストリン（Ｇ２−β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入））を加えて溶解し、分岐β−シクロデキストリン溶液（ｐＨ＝１．２）を調製した。分岐β−シクロデキストリン溶液をヘスペリジン溶液に撹拌しながら少量ずつ加えて中和することにより、ヘスペリジン包接物溶液を調製した（ヘスペリジン濃度５．６５ｍｇ／ｇ、ヘスペリジン：分岐β−シクロデキストリンのモル比＝１：４）。この溶液中でヘスペリジン包接物が形成されていることを、ＮＭＲにより確認した。
【０１１５】
この溶液に、さらに５ＮのＨＣｌ（約５重量部）を加えてｐＨを４．５に調整した後、ナリンギナーゼ（田辺製薬株式会社から購入）０．８８重量部を加え溶解させた。この溶液を、振盪しながら４８時間５０℃に保つことにより、ナンリンギナーゼを包接ヘスペリジンに作用させた。この反応液を、７５℃で４時間保持することにより、ヘスペレチン包接物溶液を得た。反応溶液を遠心分離して上清を取り、移動相はアセトニトリル／水（２５：７５、ｖ／ｖ）、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、検出器はＵＶ（波長２８０ｎｍ）の条件で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて分析したところ、溶液中に存在しているのは大部分がヘスペレチンの包接物であり、最初のヘスペリジン包接物の９５％以上がヘスペレチン包接物に変化していたことがわかった。ヘスペレチンが分岐β−シクロデキストリンに包接されている状態であることは、ＮＭＲにより確認した。
【０１１６】
この結果、大部分のヘスペリジンが分岐シクロデキストリンに包接された状態のまま、ヘスペレチンに結合しているラムノースおよびグルコースが切断されたことにより、ヘスペレチン包接物となったことがわかった。
【０１１７】
多孔性合成吸着剤による吸着性の差を利用して、このヘスペレチン包接物溶液から、切断されたグルコース、ラムノース、未反応の分岐β−シクロデキストリン、塩類等を除去するために、オルガノ（株）製の商品名アンバーライトＸＡＤ １６ＨＰを充填したカラムに通液した。包接ヘスペレチンだけがカラムに吸着され、その他の物質は流出した。包接ヘスペレチンが吸着しているカラムを水で洗浄した後に、エタノール ５０ｖ／ｖ％の溶液を通液し、カラムから包接ヘスペレチンを流出させた。この流出液のエタノールを留去させた後、残った溶液を噴霧乾燥して粉末を得た。この粉末は、水に良好な溶解性を示し、粉末に含有されているヘスペレチンは、ほぼ１００％分岐β−シクロデキストリンによって包接されており、包接されていないヘスペレチンが残っていないことをＤＳＣおよびＦＴ−ＩＲで分析することにより確認した。
【０１１８】
＜製造実施例２：ヘスペレチンを直接包接することによる包接ヘスペレチンの製造＞
蒸留水１００重量部にヘスペリジン（ハマリ産業株式会社から購入）１重量部を加えて懸濁液を作り、これに１ＮのＨＣｌを用いてｐＨ＝２に調整した。この溶液を、１００℃に保ちながら２４時間保持し、ヘスペリジンを加水分解させた。反応後の沈澱物には、ヘスペレチン、ヘスペレチン−７−グルコシドおよび未反応のヘスペリジンが含まれていた。
【０１１９】
これらの生成物を０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ＝約１１）に完全に溶解した後、疎水性合成吸着剤による吸着性の差を利用してヘスペレチンとその他の物質に分離するために、アマシャムバイオサイエンス株式会社製 Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０を充填したカラムに通液した。排出された１００ｍｌの液中にはヘスペレチン−７−グルコシドおよび未反応のヘスペリジンが含まれていた。このカラムに水１００ｍｌを通液したところ、最初に出てきた７０ｍｌには、不純物とヘスペレチン−７−グルコシドおよび未反応のヘスペリジンが含まれており、残りの３０ｍｌにはヘスペレチンが含まれていた。さらに、エタノール５０ｖ／ｖ）％の溶液２００ｍｌを通液してこのカラムからヘスペレチン全量を流出させた。ヘスペレチンを含む流出液のエタノールを留去させた後の沈澱物を乾燥して、ヘスペレチンの粉末を得た。
【０１２０】
ヘスペレチンの粉末を９ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｎ ＮａＯＨに溶解してヘスペレチン溶液（ｐＨ＝１２．３）を調製した。分岐β−シクロデキストリン（Ｇ２−β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入））を１１８ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｎ ＨＣｌに溶解して分岐β−シクロデキストリン溶液（ｐＨ＝１．２）を調製した。分岐β−シクロデキストリン溶液１．７体積部をヘスペレチン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、ヘスペレチン包接物溶液を調製した。この反応液を、８５℃で、６時間保持した。
【０１２１】
多孔性合成吸着剤による吸着性の差を利用して、このヘスペレチン包接物溶液から未反応の分岐β−シクロデキストリン、塩類等を除去するために、オルガノ（株）製 商品名アンバーライトＸＡＤ １６ＨＰを充填したカラムに通液した。包接ヘスペレチンだけがカラムに吸着され、その他の物質は流出した。包接ヘスペレチンが吸着しているカラムを水で洗浄した後に、エタノール ５０ｖ／ｖ％の溶液を通液し、カラムから包接ヘスペレチンを流出させた。この流出液のエタノールを留去させた後、残った溶液を噴霧乾燥して、噴霧乾燥して粉末を得た。この粉末は、水に良好な溶解性を示し、粉末に含有されているヘスペレチンは、ほぼ１００％分岐β−シクロデキストリンによって包接されており、包接されていないヘスペレチンが残っていないことを、ＤＳＣおよびＦＴ−ＩＲで分析することにより確認した。
【０１２２】
＜溶解性試験１：β−シクロデキストリンによる包接性試験＞
０．１ＮのＨＣｌにβ−シクロデキストリン（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入）を１５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、β−シクロデキストリン溶液を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンを２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させ、アグリコン溶液を調製した。フラボノイドアグリコンとして、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ルテオリン、アピゲニン、ダイゼイン（いずれも、シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製）およびケルセチン（和光純薬工業株式会社製）を用いた。β−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンのβ−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１２３】
β−シクロデキストリン溶液とアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。いずれのフラボノイドアグリコンを用いた場合も、析出は生じず、溶液状態であった。このことから、β−シクロデキストリンは、フラバノンアグリコンの包接ホストとして適切であることがわかった。
【０１２４】
＜溶解性試験２：分岐β−シクロデキストリンによる包接性試験＞
０．１ＮのＨＣｌに分岐−β−シクロデキストリン（β−シクロデキストリンを構成するグルコースの１つにα１−６結合によりマルトース残基が連結したもの；Ｇ２−β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入）を１１７．９ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、分岐β−シクロデキストリン溶液を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンを９．０９ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させ、アグリコン溶液を調製した。フラボノイドアグリコンとして、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、アピゲニンおよびダイゼインを用いた。分岐β−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンの分岐β−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１２５】
分岐β−シクロデキストリン溶液とアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。この結果、フラバノンのアグリコンであるヘスペレチンおよびナリンゲニンを用いた場合は溶液状態で析出は生じなかった。しかし、他のフラボン、フラバノール、イソフラボン類のフラボノイドアグリコンを用いた場合は析出が生じた。このことから、分岐β−シクロデキストリンは、フラバノンアグリコンの包接ホストとして適切であることがわかった。
【０１２６】
＜溶解性比較試験１：α−シクロデキストリンによる包接性試験＞
０．１ＮのＨＣｌにα−シクロデキストリンを４５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、α−シクロデキストリン溶液を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンを６ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させ、アグリコン溶液を調製した。フラボノイドアグリコンとして、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、アピゲニンおよびダイゼインを用いた。α−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えてのｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンのα−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１２７】
α−シクロデキストリン溶液とアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。この結果、いずれのフラボノイドアグリコンを用いた場合であっても析出が生じた。このことから、α−シクロデキストリンは、フラボノイドアグリコンの包接ホストとして適切でないことがわかった。
【０１２８】
＜溶解性比較試験２：分岐α−シクロデキストリンによる包接性試験＞
０．１ＮのＨＣｌに分岐−α−シクロデキストリン（α−シクロデキストリンを構成するグルコースの一つにα１−６結合でマルトース残基が連結したもの；Ｇ２−α−ＣＤ）を１１７．９ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、分岐α−シクロデキストリン溶液を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンを９．０９ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させ、アグリコン溶液を調製した。フラボノイドアグリコンとして、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、アピゲニンおよびダイゼインを用いた。分岐α−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンの分岐α−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１２９】
分岐α−シクロデキストリン溶液とアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。この結果、いずれのフラボノイドアグリコンを用いた場合であっても析出が生じた。このことから、分岐α−シクロデキストリンは、フラボノイドアグリコンの包接ホストとして適切でないことがわかった。
【０１３０】
＜溶解性比較試験３：γ−シクロデキストリンによる包接性試験＞
０．１ＮのＨＣｌにγ−シクロデキストリンを９０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、γ−シクロデキストリン溶液を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンを９．０９ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させ、アグリコン溶液を調製した。フラボノイドアグリコンとして、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、アピゲニンおよびダイゼインを用いた。γ−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンのγ−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１３１】
γ−シクロデキストリン溶液とアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。この結果、いずれのフラボノイドアグリコンを用いた場合であっても析出が生じた。このことから、γ−シクロデキストリンは、フラボノイドアグリコンの包接ホストとして適切でないことがわかった。
【０１３２】
＜溶解性試験３：β−シクロデキストリン包接物溶液の溶解度＞
０．１ＮのＨＣｌにβ−シクロデキストリンを１５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、β−シクロデキストリン溶液を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンの濃度を変えて溶解させ、アグリコン溶液を調製した。フラボノイドとして、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ルテオリン、ケルセチン、アピゲニンおよびダイゼインを用いた。β−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンのβ−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１３３】
β−シクロデキストリンとアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。このようにしてアグリコン濃度の違いによる析出の有無を確認した。結果を表２に示す。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
析出が生じなかった最大の最終アグリコン濃度を溶解度とみなした。ヘスペレチンβＣＤ包接物の溶解度は、２．８ｍｇ／ｍｌであり、ナリンゲニンβＣＤ包接物の溶解度は２．８ｍｇ／ｍｌであり、ケルセチンβＣＤ包接物の溶解度は１．４ｍｇ／ｍｌであり、ルテオリンβＣＤ包接物の溶解度は１．７ｍｇ／ｍｌであり、アピゲニンβＣＤ包接物の溶解度は１．１ｍｇ／ｍｌであり、ダイゼインβＣＤ包接物の溶解度は１．１ｍｇ／ｍｌであった。これらの溶解度を図１にグラフとして示す。この結果、ヘスペレチン、ナリンゲニンのフラバノン類の包接物溶液が他のフラボノイドの包接物溶液よりも溶解性が高いことがわかった。
【０１３６】
＜溶解性試験４：分岐β−シクロデキストリン包接物溶液の溶解度＞
０．１ＮのＨＣｌに分岐β−シクロデキストリン（β−シクロデキストリンを構成するグルコースの1つにα1-6結合によりマルトース残基が連結したもの；Ｇ２−β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入））を１５０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、分岐β−シクロデキストリン溶液（ｐＨ＝１．２）を調製した。０．１ＮのＮａＯＨに各種のフラボノイドアグリコンの濃度を変えて溶解させて、アグリコン溶液（ｐＨ＝約１２〜１３）を調製した。フラボノイドアグリコンとして、ヘスペレチンおよびケルセチンを用いた。分岐β−シクロデキストリン溶液１．７体積部をアグリコン溶液２．２体積部中に少量ずつ撹拌しながら加えて溶液のｐＨを中性領域に変化させることにより、フラボノイドアグリコンの分岐β−シクロデキストリン包接物溶液を調製した。
【０１３７】
分岐β−シクロデキストリン溶液とアグリコン溶液との混合終了後、３０分間放置し、析出が生じたか否かを目視により判断した。このようにしてアグリコン濃度の違いによる析出の有無を確認した。結果を表３に示す。
【０１３８】
【表３】
【０１３９】
析出が生じなかった最大の最終アグリコン濃度を溶解度とみなした。ヘスペレチンＧ２−βＣＤ包接物の溶解度は、７．３ｍｇ／ｍｌであり、ケルセチンＧ２−βＣＤ包接物の溶解度は３．４ｍｇ／ｍｌであった。これらの溶解度を図１にグラフとして示す。この結果、ヘスペレチンの包接物溶液がケルセチンの包接物溶液よりも顕著に溶解性が高いことがわかった。
【０１４０】
＜評価実施例１：ヘスペレチン包接物の吸収性試験（Ｇ２−β−ＣＤ）＞
０．１Ｎ ＨＣｌ ８．４７ｍｌに分岐β−シクロデキストリン（β−シクロデキストリンを構成するグルコースの１つにα１−６結合によりマルトース残基が連結したもの；Ｇ２−β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入））を１ｇ溶かし、分岐β−シクロデキストリン溶液とした。０．１Ｎ ＮａＯＨ １１ｍｌにヘスペレチン１００ｍｇを溶かし、ヘスペレチン溶液とした。ソニケーションをしながらヘスペレチン溶液を分岐β−シクロデキストリン溶液に加えて、Ｇ２−β−ＣＤ包接ヘスペレチン溶液とした（ヘスペレチン濃度５ｍｇ／ｍｌ）。
【０１４１】
６週齢の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に飼料としてＭＦ（オリエンタル酵母（株）製）を与えて３日間予備飼育した後、試験物質投与前１４時間絶食下においた。その後、Ｇ２−β−ＣＤ包接ヘスペレチン溶液（ヘスペレチン濃度：５ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌ経口投与した。投与１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、および９時間後にそれぞれ５〜６匹のマウスの心臓より採血し、常法により血清を分離した。
【０１４２】
採取した血清試料中のヘスペリジン誘導体量を定量するために、各血清試料５０μｌに対し、スルファターゼＨ−２（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製、スルファターゼ４，０８０ユニット／ｍｌおよびグルクロニダーゼ１４１，０００ユニット／ｍｌからなる）を酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．０）で１０倍希釈したものを５０μｌ加えて３７℃で２時間反応させた。次いで、この反応液にアセトニトリル７５０μｌを加え十分に攪拌した後、遠心分離し、上清を濃縮遠心により乾固して固体を得た。この固体を１００〜４００μｌのアセトニトリル／メタノール／水（５０：２０：３０、ｖ／ｖ／ｖ）で溶解、撹拌後１５分程度ソニケーションし、高速液体クロマトグラフィーにかけ、電気化学検出器（ＥＳＡ社製 クーロケムＩＩＩ）を使用して分析した。それぞれの血清試料中のヘスペレチンの濃度を、ヘスペレチンを標準として換算することによって求めた。結果を図２および表４に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図３および表５に示す。
【０１４３】
＜評価実施例２：溶解した状態のヘスペレチン包接物（β−ＣＤ）の吸収性試験＞
０．１Ｎ ＨＣｌ ８．４７ｍｌにβ−シクロデキストリン（β-ＣＤ、株式会社 横
浜国際バイオ研究所より購入）を１ｇ溶かし、これに蒸留水１０ｍｌを加えてβ−シクロデキストリン溶液とした。０．１Ｎ ＮａＯＨ １１ｍｌにヘスペレチン（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製）１００ｍｇを溶かし、ヘスペレチン溶液とした。ソニケーションをしながらヘスペレチン溶液をβ−シクロデキストリン溶液に加えて、β−ＣＤ包接ヘスペレチン溶液とした（ヘスペレチン濃度３．３３ｍｇ／ｍｌ）。この溶液３００μｌを、評価実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法で吸収性を測定した。なお、この評価実施例では、包接物を溶解した状態に保ちながら評価実施例１と同じ量のヘスペレチンを投与するために、評価実施例１と比較してヘスペレチン濃度を下げ、投与容積を増やしている。結果を図２および表４に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図３および表５に示す。
【０１４４】
＜評価実施例３：懸濁した状態のヘスペレチン包接物（β−ＣＤ）の吸収性試験＞
０．１Ｎ ＨＣｌ ８．４７ｍｌにβ−シクロデキストリン（β−ＣＤ、株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入）を１ｇ溶かし、β−シクロデキストリン溶液とした。０．１Ｎ ＮａＯＨ １１ｍｌにヘスペレチン（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製）１００ｍｇを溶かし、ヘスペレチン溶液とした。ソニケーションをしながらヘスペレチン溶液をβ−シクロデキストリン溶液に加えて、β−ＣＤ包接ヘスペレチン溶液とした（ヘスペレチン濃度５ｍｇ／ｍｌ）。この溶液２００μｌを、実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法で吸収性を測定した。なお、この評価実施例では、評価実施例１と同じ濃度で、同じ投与容積で、かつ同じ重量のヘスペレチンを投与するために、懸濁した状態で投与した。結果を図２および表４に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図３および表５に示す。
【０１４５】
＜評価比較例１：ヘスペレチンの吸収性試験＞
蒸留水にヘスペレチン（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社より購入）５０ｍｇを加えてヘスペレチン懸濁液を調製した（ヘスペレチン濃度５ｍｇ／ｍｌ）。この溶液をよく撹拌した後すばやく２００μｌとり、実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法で吸収性を測定した。結果を図２および表４に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図３および表５に示す。
【０１４６】
＜評価比較例２：ヘスペリジンの吸収性試験＞
蒸留水にヘスペリジン（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社より購入；純度８０％）を１２６ｍｇ（ヘスペリジン換算１０１ｍｇ）加えてヘスペリジン懸濁液を調製した（ヘスペレチン濃度５ｍｇ／ｍｌ）。この溶液をよく撹拌した後すばやく２００μｌとり、実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法で吸収性を測定した。結果を図２および表４に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図３および表５に示す。
【０１４７】
＜評価比較例３：酵素処理ヘスペリジンの吸収性試験＞
蒸留水に酵素処理ヘスペリジン（ヘスペリジンにさらにグルコース残基が１個付加されたもの；江崎グリコ株式会社より購入）１２８ｍｇを加えて酵素処理ヘスペリジン溶液を調製した（ヘスペレチン濃度５ｍｇ／ｍｌ）。この溶液を２００μｌとり、実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法で吸収性を測定した。結果を図２および表４に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図３および表５に示す。
【０１４８】
＜評価比較例４：分岐β−シクロデキストリンで包接したケルセチン（Ｇ２−β−ＣＤ）の吸収性試験＞
０．１Ｎ ＨＣｌ８．４７ｍｌにＧ２−β−シクロデキストリン（Ｇ２−β−ＣＤ、株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入）を１．２ｇ溶かし、分岐β−シクロデキストリン溶液とした。０．１Ｎ ＮａＯＨ １０．８ｍｌにケルセチン（和光純薬工業株式会社から購入）６０ｍｇを溶かし、ケルセチン溶液とした。ソニケーションをしながらケルセチン溶液をＧ２−β−シクロデキストリン溶液に加えて、Ｇ２−β−ＣＤ包接ケルセチン溶液とした（ケルセチン濃度３ｍｇ／ｍｌ）。この溶液２００μｌとり、実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法でケルセチンとその代謝物であるタマリゼチンおよびイソラムネチンの吸収量を測定し、それらの合計を吸収性として評価した。結果を図６および表６に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図７および表７に示す。
【０１４９】
＜評価比較例５：ケルセチンの吸収性試験＞
蒸留水にケルセチン（和光純薬工業株式会社より購入）３０ｍｇを加えてケルセチン懸濁液を調製した（ケルセチン濃度３ｍｇ／ｍｌ）。この溶液をよく撹拌した後すばやく２００μｌとり、実施例１と同様の条件の４７匹のｄｄＹマウス（♂）に経口投与し、実施例１と同様の方法でケルセチンの吸収性を測定した。結果を図６および表６に示す。また、このグラフの０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果を図７および表７に示す。
【０１５０】
＜評価実施例１〜３および評価比較例１〜５のまとめ＞
【表４】
【０１５１】
【表５】
【０１５２】
表５において相対比は、酵素処理（ＰＡ−Ｔ）のＡＵＣを１．０としたときの比を示す。
【０１５３】
【表６】
【０１５４】
【表７】
【０１５５】
表７において相対比は、ケルセチンのＡＵＣを０．０６としたときの比を示す。表１におけるケルセチンのＡＵＣの相対比が０．０６であり、これに合わせたからである。
【０１５６】
評価実施例１〜３および評価比較例１〜３の結果、溶解した状態のヘスペレチン−β−シクロデキストリン包接物の投与から１５分後の血清中ヘスペレチン濃度は、ヘスペレチン、ヘスペリジンおよび酵素処理ヘスペリジンを投与した場合の血清中ヘスペレチン濃度に比べてそれぞれ、約６倍、約７００倍および約１８０倍の高濃度であることが示された。ヘスペレチン−β−シクロデキストリン包接物を析出した状態で投与した場合も、投与から１５分後の血清中ヘスペレチン濃度は、ヘスペレチン、ヘスペリジンおよび酵素処理ヘスペリジンを投与した場合の血清中ヘスペレチン濃度に比べてそれぞれ、約９倍、約９７０倍および約２４０倍の高濃度であることが示された。さらに、ヘスペレチン−Ｇ２−β−シクロデキストリン包接物の投与から１５分後の血清中ヘスペレチン濃度は、ヘスペレチン、ヘスペリジンおよび酵素処理ヘスペリジンを投与した場合の血清中ヘスペレチン濃度に比べてそれぞれ、約９倍、約１０６０倍および約２７０倍の高濃度であることが示された。
【０１５７】
ヘスペレチン−Ｇ２−β−シクロデキストリン包接物を投与したときの投与０〜９時間のＡＵＣ（血中濃度下面積）は、ヘスペレチン、ヘスペリジンおよび酵素処理ヘスペリジンを投与した場合のＡＵＣと比べてそれぞれ、約４．４倍、約６４倍および約２７倍と顕著に高い値を示した。この結果から、ヘスペレチンをＧ２−β−シクロデキストリンまたはβ−ＣＤで包接することにより体内への吸収効率が高くなることが分かった。
【０１５８】
この結果、吸収性は、βＣＤ包接＞Ｇ２−β−ＣＤ包接≫ヘスペレチン≫酵素処理＞ヘスペリジンとなった。
【０１５９】
表５および図４からわかるように、アグリコンがヘスペレチンの場合、溶解度の上昇と吸収性とは全く関係がなかった。これは、図５に示されるような、アグリコンがケルセチンの場合に溶解度が上昇すると吸収性が上昇するという従来の知識からは全く予想できないことであった。また、β−シクロデキストリンで包接した包接化合物の溶解度がそれほど上がらなくても吸収性は上がることがわかった。
【０１６０】
本発明者らの実験結果によれば、分岐βシクロデキストリンのヘスペレチン包接物とβシクロデキストリンのヘスペレチン包接物とでは溶解性に差があるにもかかわらず、吸収性向上効果にはほとんど差がないことがわかった。それゆえ、包接により水への溶解性が上がることだけが、吸収性向上の理由ではなく、ヘスペレチンがシクロデキストリンに包接されることにより極性が変わる等の何らかの変化が吸収性向上に影響している可能性があると考えられる。
【０１６１】
（マウスにおける吸収性試験）
ナリンゲニンＧ２−βＣＤ包接物、ナリンゲニンまたはナリンジンを評価実施例１と同様にマウスに投与して吸収性を試験することにより、ナリンジンの場合も、ヘスペリジンの場合と同様に、ナリンゲニンを包接することにより、吸収性が顕著に向上することがわかる。また、ヘスペリジンＧ２−βＣＤ包接物またはメチルヘスペリジンを評価実施例１と同様にマウスに投与して吸収性を試験することにより、ヘスペレチン包接物を与えた場合に比べて、吸収性は顕著に向上しないことがわかる。
【０１６２】
＜評価実施例４Ａ−１：ヘスペレチン包接物のヒト吸収性試験（Ｇ２−β−ＣＤ）＞
酵素処理ヘスペリジン（江崎グリコ株式会社製）２７０ｇを４．５Ｌの水道水に溶解し、５ＮのＨＣｌを約４０ｍｌ加えてｐＨを５．５に調整した。この溶液にナリンギナーゼ９ｇおよびグルコアミラーゼ９ｇを加えて溶解し、温度を５５℃に保ったまま４８時間反応させて、沈澱を回収した。この沈澱を精製するために４．５Ｌの水を加えた後、５ＮのＮａＯＨを約４０ｍｌ加えてｐＨを１１．０に調整していったん全ての沈澱を溶解した。その後、５ＮのＨＣｌを約６０ｍｌ加えてｐＨを２．０まで下げることによりヘスペレチンを沈澱させ、上清中に残っている酵素処理ヘスペリジン、ヘスペリジンおよびヘスペレチン−７−グルコシドを除去した。この操作をもう一度繰り返して回収した沈澱を水で２度洗ったあと、沈澱物をフリーズドライして約３０ｇの粉末を得た。この粉末を高速液体クロマトグラフィーに流してヘスペレチンのピーク面積を調べたところ約９８％であった。この精製されたヘスペレチン１８００ｍｇを０．１ＮのＮａＯＨ ３００ｍｌに溶解させヘスペレチン溶液とした。
【０１６３】
分岐β−シクロデキストリン（Ｇ２−β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入））１７．６ｇを０．１ＮのＨＣｌ ２４０ｍｌに溶解し、これを少量ずつヘスペレチン溶液に撹拌しながら加えて中和（ｐＨ＝７．５）しながらヘスペレチン包接物溶液を作成し、水を加えて全体の容量を６００ｍｌ（ヘスペレチン換算：３ｍｇ／ｍｌ）とした。
【０１６４】
健康な２７〜４４才の成人男性５名を被験者とし、前日の午後９時３０分以降絶食し、朝９時３０分にヘスペレチン包接物溶液１００ｍｌ（ヘスペレチン含有量３００ｍｇ）を摂取した。摂取前、３０分後および１時間後に、上腕部静脈から約１０ｍｌの血液を経時的に採取し、遠心分離により血清を分離した。
【０１６５】
採取した血清試料中のヘスペリジン誘導体量を定量するために、各血清試料５００μｌに対し、酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）を５００μｌ加えた。さらに、スルファターゼＨ−２（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製、スルファターゼ４０８０ユニット／ｍｌおよびグルクロニダーゼ１４１，０００ユニット／ｍｌからなる）を酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．０）で１０倍希釈したものを１００μｌ加えて３７℃で２時間反応させた。次いで、シュウ酸（０．０１Ｍ）を５００μｌ添加し、十分に攪拌した後、８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を平衡化したＯａｓｉｓ ＨＬＢ ３０ｍｇ／１ｃｃ（日本ウォーターズ株式会社製）にロードした。シュウ酸（０．０１Ｍ）１ｍｌ、水１ｍｌで洗浄後、メタノール１ｍｌで溶出回収した。これを濃縮遠心により乾固した。ここに２００μｌのアセトニトリルを添加、撹拌後１５分程度ソニケーションし、溶解させ、遠心分離後、上清を高速液体クロマトグラフィーにかけ、電気化学検出器（ＥＳＡ社製 クーロケムＩＩＩ）を使用して分析した。それぞれの血清試料中のヘスペレチンの濃度を、ヘスペレチンを標準として換算することによって求めた。結果を図８および表８に示す。
【０１６６】
＜評価実施例４Ａ−２：ヘスペレチン包接物のヒト吸収性試験（β−ＣＤ）＞
β−シクロデキストリン（β−ＣＤ（株式会社 横浜国際バイオ研究所より購入））１３．５gを０．１ＮのＨＣｌ ２４０ｍｌに溶解し、これを少量ずつヘスペレチン溶液に撹拌しながら加えて中和（ｐＨ＝７．５）しながらヘスペレチン包接物溶液を作成し、水を加えて全体の容量を６００ｍｌ（ヘスペレチン換算：３ｍｇ／ｍｌ）とした。
【０１６７】
評価実施例４Ａ−１と同じ被験者に対して、評価実施例４Ａ−１と同様の方法で吸収性を測定した。結果を図８および表８に示す。
【０１６８】
＜評価比較例６Ａ：ヘスペレチンのヒト吸収性試験＞
水道水１００ｍｌに評価実施例４Ａ−１と同様に調整したヘスペレチン３００ｍｇを加えてヘスペレチン懸濁液を調製した（ヘスペレチン濃度：３ｍｇ／ｍｌ）。評価実施例４Ａ−１と同じ被験者に、この溶液をよく撹拌した後摂取させ、評価実施例４Ａ−１と同様の方法で吸収性を測定した。結果を図８および表８に示す。
【０１６９】
＜評価実施例４Ａ−１、評価実施例４Ａ−２および評価比較例６Ａのまとめ＞
【表８】
【０１７０】
図８および表８に示すとおり、Ｇ２−βＣＤ包接物を摂取した場合のヘスペレチン吸収量は、ヘスペレチンを摂取した場合に比べ、摂取３０分および１時間後のいずれにおいても有意に高い値を示した。β−ＣＤ包接物を摂取した場合も同様に、ヘスペレチン吸収量は、ヘスペレチンを摂取した場合に比べ、摂取３０分および１時間後に有意に高い値を示した。それゆえ、評価実施例４Ａ−１、評価実施例４Ａ−２および評価比較例６Ａの結果、ヒトにおいても、図２におけるマウスの結果同様、ヘスペレチンをＧ２−βＣＤまたはβ−ＣＤで包接することにより吸収性が顕著に向上することがわかった。
【０１７１】
（ヒトにおける吸収性試験）
ヘスペレチンβＣＤ包接物、ヘスペリジン、酵素処理ヘスペリジンについても、評価実施例４Ａ−１と同様にヒトに投与して吸収性を試験することにより、ヘスペレチンを包接することにより、吸収性が顕著に向上することがわかる。
【０１７２】
＜評価実施例４Ｂおよび評価比較例６Ｂ：ヘスペレチン包接物（Ｇ２−β−ＣＤ）および酵素処理ヘスペリジンのヒト吸収性試験＞
健康な２７歳の成人男性1名、２５歳の成人女性1名を被験者とし、前日の午後９時３０分以降絶食し、ヘスペレチン含有量が違う以外は評価実施例４Ａ−１と同様に調製したヘスペレチン包接物（Ｇ２−β−ＣＤ包接物）溶液１００ｍｌ（ヘスペレチン含有量1００ｍｇ；評価実施例４Ｂ）、もしくはヘスペレチン含有量が違う以外は評価比較例３と同様に調製した酵素処理ヘスペリジン溶液１００ｍｌ（ヘスペレチン含有量1００ｍｇ；評価比較例６Ｂ）を朝９時３０分に摂取した。摂取前、１５分後、３０分後、４５分後、および６０分後、上腕部静脈から約１０ｍｌの血液を経時的に採取し、遠心分離により血清を分離した。採取した血清試料中のヘスペリジン誘導体量を、評価実施例４Ａ−１と同様の方法によって測定した。結果を図９および表９に示す。
【０１７３】
＜評価実施例４Ｂおよび評価比較例６Ｂのまとめ＞
【表９】
【０１７４】
図９および表９に示すとおり、Ｇ２−βＣＤ包接物を摂取した場合のヘスペレチン吸収量は、酵素処理ヘスペリジンを摂取した場合に比べ、摂取１５分後から６０分後まで終始、高い値を示した。この結果、ヘスペレチンをＧ２−βＣＤで包接することにより、酵素処理ヘスペリジンと比較して、吸収性が顕著に向上することがわかった。
【０１７５】
＜評価比較例６Ｃ−１および評価比較例６Ｃ−２：ヘスペリジンおよび酵素処理ヘスペリジンのヒト吸収性試験＞
健康な成人男性４名および成人女性３名を被験者とし、前日の午後９時３０分以降絶食し、ヘスペリジン（浜理薬品工業株式会社製）を蒸留水に添加して攪拌した懸濁液１００ｍｌ（ヘスペレチン含有量１５００ｍｇ；評価比較例６Ｃ−１）、もしくはヘスペレチン含有量が違う以外は評価比較例３と同様に調製した酵素処理ヘスペリジン溶液１００ｍｌ（ヘスペレチン含有量１５００ｍｇ；評価比較例６Ｃ−２）を朝９時３０分に摂取した。摂取前、３０分後、１時間後、および２時間後、上腕部静脈から約１０ｍｌの血液を経時的に採取し、遠心分離により血清を分離した。採取した血清試料中のヘスペリジン誘導体量を、評価実施例４Ａ−１と同様の方法によって測定した。結果を図１０および表１０に示す。
【０１７６】
＜評価比較例６Ｃ−１および評価比較例６Ｃ−２のまとめ＞
【表１０】
【０１７７】
図１０および表１０に示すとおり、酵素処理ヘスペリジンを採取した場合のヘスペレチン吸収量は、ヘスペリジンを摂取した場合に比べ、摂取３０分後および１時間後において高い値を示した。この結果、酵素処理ヘスペリジンは、ヘスペリジンよりも吸収性が高いことがわかった。
【０１７８】
評価実施例４Ａ−１、評価実施例４Ａ−２、評価実施例４Ｂ、評価比較例６Ａ、評価比較例６Ｂ、評価比較例６Ｃ−１および評価比較例６Ｃ−２をまとめて考えると、ヘスペレチンＧ２−β−ＣＤ包接物およびヘスペレチンβ−ＣＤ包接物は、いずれも、酵素処理ヘスペリジン、ヘスペリジンおよびヘスペレチンのいずれよりも吸収性が極めて高いことがわかった。
【０１７９】
（ヘスペレチンの種々の効果）
ヘスペレチン分岐βＣＤ包接物をヒト、マウス、ラットなどに投与することにより、アレルギー反応抑制効果が確認される。
【０１８０】
＜評価実施例５：ヘスペレチン分岐（Ｇ２）βＣＤ包接物のアレルギー反応抑制効果検証試験＞
５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス４２匹を予備飼育の後、体重が均等になるように、７匹ずつ、対照群（Ａ群）、甜茶抽出物投与群（Ｂ群）、酵素処理ヘスペリジン投与群（Ｃ１群、６００ｍｇ／ｋｇ；Ｃ２群、１２０ｍｇ／ｋｇ）、ヘスペレチン包接物（評価実施例１と同様の方法で製造したヘスペレチン分岐（Ｇ２）βＣＤ包接物）投与群（Ｄ１、Ｄ２群）、甜茶およびヘスペレチン包接物投与群（Ｅ群）の６群に分けた。マウスに５日間連続で被験物質溶液２００μＬを胃ゾンデにより経口投与した。このとき、被験物質溶液を、表１１に示す投与量となるように調整した。経口投与３日目、片側の耳介にＤＮＰ特異的ＩｇＥ抗体１３７５ｎｇ／ｍｌ（シグマ社製）を５μｌ皮内注射し、感作を行った。５日目の経口投与１時間後に０．２ｍｌの０．２５％エバンスブルー含有生理食塩水に溶解したＤＮＰ結合ウシ血清アルブミン０．０５ｍｇを尾静脈投与し、アレルギー反応を惹起した。惹起３０分後、両方の耳介を切除し、直径７ｍｍの皮革打抜き用パンチを用いて中央部を打ち抜いた。それぞれの耳介について、滲出したエバンスブルーをホルムアミドで抽出し、その濃度を６２０ｎｍの吸光度で測定した。Ａ群についての、感作した側の耳介の色素滲出量と感作していない側の耳介の色素滲出量との差の平均を１として、各群のアレルギー反応抑制率を算出した。その結果を図１１に示す。
【０１８１】
図１１に示すとおり、甜茶抽出物を単独で投与したＢ群では、蒸留水を投与したＡ群に対し、アレルギー反応の抑制傾向が認められたが、効果が弱かった。この結果は、甜茶抽出物が単独でアレルギー反応抑制効果を有することを示唆する。
【０１８２】
酵素処理ヘスペリジンを単独投与したＣ１群、Ｃ２群ではアレルギー抑制効果は認められなかった。
【０１８３】
ヘスペレチン包接物を単独で投与したＤ１群では、蒸留水を投与したＡ群に対し、６０％を超える高いアレルギー反応抑制効果が認められたが、投与量を減らしたＤ２群では効果が低かった。これらの結果から、ヘスペレチン包接物が単独でアレルギー反応抑制効果を有することが示された。Ｃ群の酵素処理ヘスペリジン投与量とＤ１群のヘスペレチン包接物投与量はヘスペレチン換算で同等である。ヘスペレチン包接物は体内でヘスペレチンを放出すると考えられる。ヘスペリジンはアレルギー反応抑制作用を有することが公知である。また、ヘスペリジンは体内でアグリコンであるヘスペレチンに分解・吸収され、ヘスペレチンが抗アレルギー効果を発揮すると考えられている。このことから、ヘスペレチン包接物のアレルギー反応抑制効果は、ヘスペレチン吸収性の向上により、活性が強く発揮されたものと考えられる。従って、ヘスペレチン包接化合物として投与することにより、ヘスペリジンを投与したときよりも顕著に高いアレルギー反応抑制効果を、少量の摂取によって発揮させ得る。
【０１８４】
Ｂ群と等用量の甜茶およびＤ２群と等用量のヘスペレチン包接物を組み合わせて投与したＥ群では、蒸留水を投与したＡ群に対し、約６０％のアレルギー反応抑制効果が認められた。この効果は、それぞれの投与量を単独で与えた場合のアレルギー反応抑制率の合計（約１７％）よりも顕著に高い。この結果は、単独ではアレルギー反応抑制効果が低い投与量でも、甜茶抽出物とヘスペレチン包接物とを組み合わせることで、アレルギー反応抑制効果が相乗的に増強されたこと示唆する。
【０１８５】
【表１１】
【０１８６】
ヘスペレチン分岐βＣＤ包接物をヒト、マウス、ラットなどに投与することにより、血中コレステロール低下効果が確認される。
【０１８７】
＜評価実施例６：ヘスペレチンＧ２βＣＤ包接物のコレステロール上昇抑制効果検証試験＞
６週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス３０匹を予備飼育の後、体重が均等になるように、１０匹ずつ、対照群（蒸留水投与）、ヘスペレチン投与群、およびヘスペレチンＧ２βＣＤ包接物（製造実施例１と同様の方法で製造したヘスペレチン分岐（Ｇ２）βＣＤ包接物）投与群の３群に分けた。３群に分けた後、１％コレステロール添加食をマウスに４週間摂食させた。この１％コレステロール添加食は高コレステロール食であり、その組成は、１ｋｇあたりの重量で、コレステロール（和光純薬）１０ｇ、カゼイン（オリエンタル酵母）２００ｇ、コーンスターチ（オリエンタル酵母）５４１ｇ、大豆油（和光純薬）１００ｇ、ＤＬ−メチオニン（和光純薬）２ｇ、ミネラルミックス（オリエンタル酵母）４０ｇ、ビタミンミックス（オリエンタル酵母）２２ｇ、セルロース（オリエンタル酵母）８５ｇであった。この４週間の摂食期間の間、マウスには１週間に５回、被験物質溶液２００μＬを胃ゾンデにより経口投与した。被験物質溶液は、対照群は蒸留水であり、ヘスペレチン投与群は０．５％ヘスペレチン溶液であり、そしてヘスペレチンＧ２βＣＤ包接物投与群はヘスペレチン投与量がヘスペレチン投与群と等量になるように調整したヘスペレチンＧ２βＣＤ包接物の溶液とした。なお、０．５％ヘスペレチン溶液は完全には溶解しないので、十分に懸濁した状態で投与した。
【０１８８】
４週間後、マウスを頚椎脱臼により屠殺して解剖を行い、体重、臓器重量（肝臓、心臓、脾臓、副精巣周囲脂肪および腎臓周囲脂肪の重量）、ならびに血中および肝臓中のコレステロール、ＨＤＬコレステロールおよび中性脂肪を測定した。詳細には、体重を測定後、解剖時にマウスを頚椎脱臼し、心臓より採血を行った後、肝臓、心臓、脾臓、副精巣周囲脂肪および腎臓周囲脂肪を摘出し、重量を測定し、摘出した肝臓を直ちに液体窒素で凍結し、−８０℃で凍結保管した。血中の検査項目（コレステロール、ＨＤＬコレステロールおよび中性脂肪）については、解剖時に、採取した血液を遠心分離機で血清に分離した後、市販の脂質測定キット（コレステロールＥテストワコー、ＨＤＬ−コレステロールＥテストワコー、トリグリセライドＥテストワコー；すべて和光純薬製）を用いて測定した。肝臓中の検査項目（コレステロール、ＨＤＬコレステロールおよび中性脂肪）については、凍結保管しておいた肝臓を０．５ｇ秤量したのち、Ｆｏｌｃｈ法（Ｊ．Ｆｏｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，４９７，１９５７）にて脂質をクロロホルム抽出した後、減圧下で濃縮乾固し、エタノールに溶解しさらに溶解液（蒸留水中にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を５ｇ／Ｌ、コール酸ナトリウムを３ｍｍｏｌ／Ｌ含む）を１００μＬ添加し溶液としたものを、血清と同様に市販キットにて測定した。
【０１８９】
その結果の平均を表１２に示す。表１２に示すとおり、対照群と比較して、ヘスペレチン包接物投与群は約１５％、ヘスペレチン群は約７％、肝臓コレステロールの上昇を抑制した。副精巣周囲脂肪および腎臓周囲脂肪重量は内臓脂肪の指標であるので、解剖時に測定した。副精巣周囲脂肪重量に関しては、対照群と比較して、ヘスペレチン包接物投与群は約１６％低い値を、ヘスペレチン投与群は約１４％低い値を示した。腎臓周囲脂肪重量に関しては、対照群と比較して、ヘスペレチン包接物投与群は約３６％低い値を、ヘスペレチン群は約２９％低い値を示した。各群間で体重、肝臓、心臓および脾臓重量に差は見られなかった（表には示さず）ことから、いずれもヘスペレチンを投与することにより、脂質の各指標が低下すること、さらにヘスペレチン包接物投与群で、ヘスペレチン投与群よりも高い脂質抑制効果が見られることがわかった。これらの結果は、図８および９の結果に見られるとおり、ヘスペレチン包接物投与群においてヘスペレチンの体内吸収性が向上したことに起因すると考えられる。
【０１９０】
【表１２】
【０１９１】
ヘスペレチン分岐βＣＤ包接物をヒト、マウス、ラットなどに投与することにより、血流改善効果および冷え性改善効果が確認される。
【０１９２】
＜評価実施例７：ヘスペレチンＧ２βＣＤ包接物の血流改善効果検証試験＞
酵素処理ヘスペリジンは血流改善効果を有し、冷え症に有効であることが報告されている（第５８、５９回 日本栄養・食糧学会、吉谷ら）。冷え症診断基準（寺澤 捷年：生薬学誌，４１（２），１９８７）により冷え症と診断された２７歳女性において、ヘスペレチン換算４０ｍｇ相当にあたるヘスペレチン包接物（評価実施例４Ａ−１と同様の方法で製造したヘスペレチン分岐（Ｇ２）βＣＤ包接物）もしくは酵素処理ヘスペリジンを３７℃の水１００ｍｌに溶解させて摂取した際の血流改善効果を冷却負荷法で比較した（参考文献：鹿野昌彦，「末梢循環障害とサーモグラフィー」，ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＴＨＥＲＭＯＲＯＧＹ，１７（２），１１１−１１３，１９９８；および定方美恵子，佐藤悦，佐山光子，湊孝子，兵頭慶子，定方昭夫，「冷え症の客観的評価に対する予備的研究」，新潟大学医療技術短期大学紀要，７（２），２１５−２２６，２０００）。なお、３７℃の水１００ｍｌだけを摂取したときの血流改善値もコントロールとして測定した。食後２時間以上あけて試験飲料を摂取し、３０分間安静にした後、左手を１５℃に設定した水流付き恒温槽に１分間浸し、冷却負荷をかけた。その後３０分間、５分毎に、サーモグラフィー（ＮＥＣ三栄 ＴＨ３１００ＭＲ）で左手指先の体表面温度を、レーザー血流計（オメガウェーブ ＦＬＯ−Ｎ１）で血流量を測定した。
【０１９３】
その結果を表１３、表１４、図１２および図１３に示す。図１２を、冷却直前温度を１００％とし、冷却直後温度を０％としたときの表面温度回復率で示した。図１３を、冷却直前の数値を１００％としたときの変化率で表した。図１２に示すとおり、ヘスペレチン包接物摂取により、酵素処理ヘスペリジンを摂取した場合よりも迅速に高い温度回復率が認められた。また、図１３に示すとおり、ヘスペレチン包接物を摂取することにより、酵素処理ヘスペリジンよりも早い血流量の回復が認められた。以上の結果は、図８および９の結果に見られるとおり、ヘスペレチン包接物摂取では、ヘスペレチンの体内吸収が速やかであり、吸収量も高まっていることに起因すると考えられる。
【０１９４】
【表１３】
【０１９５】
【表１４】
【０１９６】
ヘスペレチン分岐βＣＤ包接物をヒト、マウス、ラットなどに投与することにより、肌状態改善効果が確認される。
【０１９７】
ヘスペレチン分岐βＣＤ包接物をヒト、マウス、ラットなどに投与することにより、抗炎症効果が確認される。
【０１９８】
＜評価実施例８：ヘスペレチン分岐βＣＤ包接物の抗炎症効果検証試験＞
５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス１０匹を予備飼育の後、体重が均等になるように、５匹ずつ、対照群（Ａ群）、ヘスペレチン包接物（評価実施例１と同様の方法で製造したヘスペレチン分岐（Ｇ２）βＣＤ包接物）投与群（Ｂ群）の２群に分けた。マウスには４日間連続で被験物質溶液２００μＬを胃ゾンデにより経口投与した。被験物質溶液は、表１５に示す投与量となるよう調整した。経口投与４日目、マウスの左耳介中央に１０μＬ／ｅａｒの０．０６％クロトン油（シグマ社製）を塗布した。３時間後、０．２ｍｌの１％エバンスブルー含有生理食塩水を尾静脈より投与し、さらに１時間後、耳介を切除した。直径７ｍｍの皮革打抜き用パンチを用いて中央部を打ち抜き、耳介に滲出したエバンスブルーをホルムアミドで抽出し、その濃度を６２０ｎｍの吸光度で測定した。Ａ群の右耳介色素滲出量と左耳介色素滲出量との差を１として、Ｂ群の炎症抑制率を評価した。その結果を表１５に示す。
【０１９９】
表１５に示すとおり、ヘスペレチン包接物を投与したＢ群では、蒸留水を投与したＡ群に対し、炎症が４１％抑制された。この結果から、ヘスペレチン包接物が抗炎症作用を有することが示された。
【０２００】
【表１５】
【０２０１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２０２】
本発明により、生体吸収性が極めて高い、ヘスペレチン包接化合物およびナリンゲニン包接化合物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】図１は、種々のフラボノイドアグリコンをβ−シクロデキストリン（βＣＤ）または分岐β−シクロデキストリン（Ｇ２βＣＤ）で包接して得られた包接化合物の溶解度を示すグラフである。
【図２】図２は、分岐β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（Ｇ２βＣＤ包接；評価実施例１）、溶解状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接２００μｌ；評価実施例２）、析出した状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接３００μｌ；評価実施例３）、ヘスペレチン（ヘスペレチン；評価比較例１）、ヘスペリジン（ヘスペリジン；評価比較例２）、酵素処理することにより糖鎖付加したヘスペリジン（酵素処理（ＰＡ−Ｔ）；評価比較例３）をマウスに経口投与した後のマウス心臓血中のヘスペレチン濃度を経時的に示すグラフである。
【図３】図３は、分岐β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（Ｇ２βＣＤ包接；評価実施例１）、溶解状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接２００μｌ；評価実施例２）、析出した状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接３００μｌ；評価実施例３）、ヘスペレチン（ヘスペレチン；評価比較例１）、ヘスペリジン（ヘスペリジン；評価比較例２）、酵素処理することにより糖鎖付加したヘスペリジン（酵素処理（ＰＡ−Ｔ）；評価比較例３）をマウスに経口投与した後のマウス心臓血中のヘスペレチン濃度の０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を示すグラフである。
【図４】図４は、分岐β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（Ｇ２βＣＤ包接；評価実施例１）、溶解状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接２００μｌ；評価実施例２）、析出した状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接３００μｌ；評価実施例３）の吸収性の相対比をＸ軸にとり、溶解性をＹ軸にとったグラフである。
【図５】図５は、酵素処理することにより糖鎖付加したルチン（酵素処理（αＧルチン））、ルチン（ルチン）、ケルセチン（ケルセチン）の吸収性の相対比をＸ軸にとり、溶解性をＹ軸にとったグラフである。
【図６】図６は、分岐β−シクロデキストリンで包接したケルセチン（Ｇ２βＣＤ包接ケルセチン；評価比較例４）またはケルセチン（ケルセチン；評価比較例５）をマウスに経口投与した後のマウス心臓血中のケルセチン濃度とタマリゼチン濃度とイソラムネチン濃度との合計を経時的に示すグラフである。
【図７】図７は、分岐β−シクロデキストリンで包接したケルセチン（Ｇ２βＣＤ包接ケルセチン；評価比較例４）またはケルセチン（ケルセチン；評価比較例５）をマウスに経口投与した後のマウス心臓血中のケルセチン濃度とタマリゼチン濃度とイソラムネチン濃度との合計の０時間〜９時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を示すグラフである。
【図８】図８は、分岐β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（Ｇ２βＣＤ包接物；評価実施例４Ａ−１）、析出した状態の、β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（βＣＤ包接物；評価実施例４Ａ−２）またはヘスペレチン（ヘスペレチン；評価比較例６Ａ−１）をヒトに経口摂取させた後のヒトの血清試料中のヘスペレチン濃度を経時的に示すグラフである。
【図９】図９は、分岐β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（Ｇ２βＣＤ包接物；評価実施例４Ｂ）または酵素処理ヘスペリジン（酵素処理ヘスペリジン；評価比較例６Ｂ）をヒトに経口摂取させた後のヒトの血清試料中のヘスペレチン濃度を経時的に示すグラフである。
【図１０】図１０は、ヘスペリジン（ヘスペリジン；評価比較例６Ｃ−１）または酵素処理ヘスペリジン（酵素処理ヘスペリジン；評価比較例６Ｃ−２）をヒトに経口摂取させた後のヒトの血清試料中のヘスペレチン濃度を経時的に示すグラフである。
【図１１】図１１は、蒸留水、甜茶抽出物（８０ｍｇ／ｋｇ）、酵素処理ヘスペリジン（６００ｍｇ／ｋｇまたは１２０ｍｇ／ｋｇ）、分岐β−シクロデキストリンで包接したヘスペレチン（ヘスペレチン包接物；５５０ｍｇ／ｋｇまたは５５ｍｇ／ｋｇ）または甜茶抽出物とヘスペレチン包接物との混合物をマウスに経口投与した場合の、Ａ群のアレルギー反応と比較したアレルギー反応抑制率（％）を示すグラフである。
【図１２】図１２は、コントロール（水）、酵素処理ヘスペリジンまたはヘスペレチン包接物をヒトに経口摂取させた場合の表面温度回復率の経時変化を示すグラフである。縦軸は回復率（％）を、横軸は経過時間（分）を示す。
【図１３】図１３は、コントロール（水）、酵素処理ヘスペリジンまたはヘスペレチン包接物をヒトに経口摂取させた場合の血流量回復率の経時変化を示すグラフである。縦軸は回復率（％）を、横軸は経過時間（分）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法であって、
ヘスペリジンまたはナリンジンを、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を得る工程；および
該ヘスペリジン包接化合物または該ナリンジン包接化合物を加水分解してヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記加水分解する工程が、該ヘスペリジン包接化合物または該ナリンジン包接化合物にラムノシダーゼおよびグルコシダーゼを作用させることにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはその修飾物が、β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンに１〜６個のグルコース残基が側鎖として連結した分岐β−シクロデキストリン、およびそれらの化学修飾物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヘスペリジンまたはナリンジンを、分岐β−シクロデキストリンによって包接する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記分岐β−シクロデキストリンが、β−シクロデキストリンに２個のグルコース残基が側鎖として連結した化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記フラバノン包接化合物がヘスペレチン包接化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法であって、
ヘスペレチンまたはナリンゲニンを含む塩基性懸濁液または塩基性水溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を含む酸性水溶液とを混合することにより、ヘスペレチンまたはナリンゲニンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程
を包含する、方法。
【請求項８】
前記β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはその修飾物が、β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンに１〜６個のグルコース残基が側鎖として連結した分岐β−シクロデキストリン、およびそれらの化学修飾物からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヘスペレチンまたはナリンゲニンを、分岐β−シクロデキストリンによって包接する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記分岐β−シクロデキストリンが、β−シクロデキストリンに２個のグルコース残基が側鎖として連結した化合物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記フラバノン包接化合物がヘスペレチン包接化合物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法であって、
ヘスペレチンまたはナリンゲニンを含む有機溶媒溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を含む水溶液とを混合することにより、ヘスペレチンまたはナリンゲニンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程
を包含し、ここで、該有機溶媒は、エタノール、イソプロパノールまたはテトラヒドロフランである、方法。
【請求項１３】
フラバノン包接化合物を含む食品であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている、食品。
【請求項１４】
健康食品である、請求項１３に記載の食品。
【請求項１５】
血流改善および冷え性改善用である、請求項１４に記載の食品。
【請求項１６】
肌状態改善用である、請求項１４に記載の食品。
【請求項１７】
コレステロール低下用である、請求項１４に記載の食品。
【請求項１８】
アレルギー症状改善用である、請求項１４に記載の食品。
【請求項１９】
抗炎症用である、請求項１４に記載の食品。
【請求項２０】
フラバノン包接化合物を含む医薬品であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている、医薬品。
【請求項２１】
フラバノン包接化合物を含む皮膚外用剤であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている、皮膚外用剤。
【請求項２２】
フラバノン包接化合物であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、分岐β−シクロデキストリンまたは化学修飾β−シクロデキストリンによって包接されている、包接化合物。
【請求項１】
ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法であって、
ヘスペリジンまたはナリンジンを、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペリジン包接化合物またはナリンジン包接化合物を得る工程；および
該ヘスペリジン包接化合物または該ナリンジン包接化合物を加水分解してヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記加水分解する工程が、該ヘスペリジン包接化合物または該ナリンジン包接化合物にラムノシダーゼおよびグルコシダーゼを作用させることにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはその修飾物が、β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンに１〜６個のグルコース残基が側鎖として連結した分岐β−シクロデキストリン、およびそれらの化学修飾物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヘスペリジンまたはナリンジンを、分岐β−シクロデキストリンによって包接する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記分岐β−シクロデキストリンが、β−シクロデキストリンに２個のグルコース残基が側鎖として連結した化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記フラバノン包接化合物がヘスペレチン包接化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法であって、
ヘスペレチンまたはナリンゲニンを含む塩基性懸濁液または塩基性水溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を含む酸性水溶液とを混合することにより、ヘスペレチンまたはナリンゲニンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程
を包含する、方法。
【請求項８】
前記β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはその修飾物が、β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンに１〜６個のグルコース残基が側鎖として連結した分岐β−シクロデキストリン、およびそれらの化学修飾物からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヘスペレチンまたはナリンゲニンを、分岐β−シクロデキストリンによって包接する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記分岐β−シクロデキストリンが、β−シクロデキストリンに２個のグルコース残基が側鎖として連結した化合物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記フラバノン包接化合物がヘスペレチン包接化合物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物であるフラバノン包接化合物を合成する方法であって、
ヘスペレチンまたはナリンゲニンを含む有機溶媒溶液と、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物を含む水溶液とを混合することにより、ヘスペレチンまたはナリンゲニンをβ−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接して、ヘスペレチン包接化合物またはナリンゲニン包接化合物を得る工程
を包含し、ここで、該有機溶媒は、エタノール、イソプロパノールまたはテトラヒドロフランである、方法。
【請求項１３】
フラバノン包接化合物を含む食品であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている、食品。
【請求項１４】
健康食品である、請求項１３に記載の食品。
【請求項１５】
血流改善および冷え性改善用である、請求項１４に記載の食品。
【請求項１６】
肌状態改善用である、請求項１４に記載の食品。
【請求項１７】
コレステロール低下用である、請求項１４に記載の食品。
【請求項１８】
アレルギー症状改善用である、請求項１４に記載の食品。
【請求項１９】
抗炎症用である、請求項１４に記載の食品。
【請求項２０】
フラバノン包接化合物を含む医薬品であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている、医薬品。
【請求項２１】
フラバノン包接化合物を含む皮膚外用剤であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、β−シクロデキストリン、分岐β−シクロデキストリンまたはそれらの修飾物によって包接されている、皮膚外用剤。
【請求項２２】
フラバノン包接化合物であって、該フラバノンは、ヘスペレチンまたはナリンゲニンであり、該フラバノンは、分岐β−シクロデキストリンまたは化学修飾β−シクロデキストリンによって包接されている、包接化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００６−１８２７７７（Ｐ２００６−１８２７７７Ａ）
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３４９６７９（Ｐ２００５−３４９６７９）
【出願日】平成１７年１２月２日（２００５．１２．２）
【出願人】（００００００２２８）江崎グリコ株式会社 (187)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２日（２００５．１２．２）
【出願人】（００００００２２８）江崎グリコ株式会社 (187)
【Ｆターム（参考）】
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