アジュバント処理されたウシ用ワクチン
本発明はイー・コリＯ１５７：Ｈ７のシェディングに拮抗する安全かつ効果的なワクチン組成物を提供する。免疫原的に活性な成分としてイー・コリＯ１５７：Ｈ７、代謝性油などのアジュバント、および薬理学的に許容される担体を免疫化ワクチンに処方する。本発明はまた、イー・コリＯ１５７：Ｈ７のシェディングを防止または改善する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、動物、特にウシにおけるイー・コリＯ１５７：Ｈ７定着を減少させるアジュバント処理されたワクチン、その製法、およびそのシェディング（shedding）を防止するために、その物を動物、特にウシに投与する方法に関する。
【０００２】
（従来技術）
イー・コリＯ１５７：Ｈ７は毒性かつ一般的な食品媒介病原菌であり、このようなイー・コリＯ１５７：Ｈ７感染がヒトの健康に対する重大な関心の一の源である。イー・コリＯ１５７による感染に付随するヒトでの病気が１９８２年よりますます頻繁に報告されている。ヒトの病気とウシ製品を消費することとの間の疫学的関係が、合衆国、カナダおよび他の国々の飼育場または飼養場から集めた仔ウシまたは成体のウシの糞便からイー・コリＯ１５７：Ｈ７が単離されることで支持された。ヒト以外の動物からヒトに拡散する、ヒト感染の主たる原因は、汚染した牛肉または他の肉類製品を摂食することである。
【０００３】
イー・コリＯ１５７：Ｈ７は反芻動物および他の動物の腸に定着し、一般にこれらの動物にて顕性疾患を惹起するものではない。イー・コリＯ１５７：Ｈ７がその定着した動物の糞便にシェディングすることが、ヒトにおけるイー・コリＯ１５７：Ｈ７感染の原因の一つとなっている。したがって、ヒト感染を防止するには、動物、特にウシにおけるイー・コリＯ１５７：Ｈ７のコロニー形成およびシェディングを根絶または減少させることが重要である。仔ウシにイー・コリＯ１５７：Ｈ７を経口接種することで血清中のＬＰＳに対する抗体およびベロ毒素に対する中和抗体の迅速かつ持続的な増加が誘発されることが証明されている。穀類から干し草に短期間に飼料を変えることでウシからのイー・コリのシェディングを減少させる試みもなされた。しかし、この飼料を変更する方法は、全体的に、環境の糞便汚染を排除することができない。というのも、アメリカのウシが干し草だけで構成されている飼料を食べているとするのは疑わしいからである。
【０００４】
ウシは大量に食肉処理され、ヒトに感染するのに必要なイー・コリＯ１５７：Ｈ７の数は少なくてすむため（１０−１００匹）、イー・コリＯ１５７：Ｈ７は深刻な健康問題を抱えたままである。食肉処理の段階でイー・コリＯ１５７：Ｈ７を検出し、その後で死滅させる；ウシの飼料を変えて腸内イー・コリＯ１５７：Ｈ７の数を減少させる；および動物を免疫処理してイー・コリＯ１５７：Ｈ７のシェディングを妨げる、とする改良された方法に対する研究に焦点が当てられた。それでもなお、場合によっては、時に悲惨な経済的健全性と環境衛生の結果を伴って、イー・コリＯ１５７：Ｈ７は、網をくぐり抜け、ほとんど大抵人的誤り（不適当な調理または交差汚染）と一緒になって、大損害を惹起する。ここ数年間において、科学者、家畜生産業者、ジャーナリスト、関連業者、政府代表者および缶詰工場の関係者は、農場経営者／牧場経営者が、食用処理されたウシが食品媒介病原菌をその体外または体内にて缶詰工場内に持ち込むであろう危険性を排除するよう（あるいは少なくとも最小限にするよう）積極的に努力する責任を前提として履行する必要のあることを示している。（ａ）クリーナー動物（cleaner animal）が、残骸、切り分けられた肉、最終の牛肉製品での病原菌の残存を減少させるであろう；（ｂ）優良管理事例（Good Management Practices）、または優良生産事例（Good Production Practices）が食肉処理用のクリーナー動物を提供することの助けとなるであろう；および（ｃ）食肉処理されるウシの内外に存在する食品媒介病原菌を最小限とするのに、介入の選択および管理事例の影響力が調査されるべきである、と主張されている。
【０００５】
テキサス肥畜飼育者組合は、北大西洋で取れるワカメから造られるタスコ（Tasco）（登録商標）なる製品を、食肉処理に付す前の１４日間、飼料に配合すると、ウシにおいてイー・コリＯ１５７：Ｈ７が３００％減少したと報告している。ＣＡＬＦ Ｎｅｗｓ（２００２）は、プロバイオティクスまたはいわゆる「体に良い細菌」（実際には、ラクトバシラス・アシドフィルス（lactobacillus acidophilus）菌株）を含有する新しい食用成分が、米国食肉協会研究財団により資金供給された研究に基づいて、生きているウシにて５０％程度のイー・コリＯ１５７：Ｈ７の存在を減少させうると報告した。Zhaoら（１９９８）は、イー・コリＯ１５７：Ｈ７に暴露される前に、選択されたプロバイオティクス菌（非腸管出血性大腸菌およびミラビリス変形菌を含む）をウシに投与すると、大抵の動物にてイー・コリＯ１５７：Ｈ７のキャリッジのレベルを減少させうる結果が得られることを報告した；Ｌ−ファーマ・インク（L-Pharma, Inc.）は、現在、この研究に基づくウシ用のプロバイオティクスを販売している。
【０００６】
にもかかわらず、反芻動物、特にウシにて、その残骸を介してヒトの食料に到達しうる、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の定着を効果的に防止するワクチンを製造する課題がいまなお存在する。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、不活化または死滅の全体またはサブユニットのイー・コリＯ１５７：Ｈ７抗原からなる群より選択される免疫原的に活性な成分を、代謝性油および水酸化アルミニウムアジュバントと組み合わせて含む、ワクチン組成物を提供する。
代謝性油は、他の慣用的なワクチン賦形剤と一緒に、免疫原的に刺激する量にてワクチン組成物にて利用される。
【０００８】
本発明のさらなる実施形態において、ワクチン組成物は、単位用量当たり少なくとも１ｘ１０９個の不活化イー・コリＯ１５７：Ｈ７またはその成分と、約３−８％、好ましくは５％の代謝性油および約１０−２５％、好ましくは１５％の水酸化アルミニウムを含む約５ないし１０容量／容量％のアジュバントとを含む。
本発明の特に好ましい実施形態は、少なくとも２つの投与単位の死滅または不活化イー・コリＯ１５７：Ｈ７を含むウシ用のワクチン組成物であって、その投与単位の各々が少なくとも１ｘ１０９個のバクテリンと、約５ないし２５容量／容量％のアジュバントとを含み、該アジュバントが少なくとも一つの代謝性油、および水酸化アルミニウムを含み、さらには該投与単位が医薬上許容される担体を含む、ところのワクチン組成物である。
さらには、本発明の目的および特徴は、本明細書に記載の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０００９】
（発明の詳細な記載）
一般に、新規なワクチンを設計する際の問題は、生菌ワクチンが付与された標的宿主にて十分な安全性を欠く可能性があり、そして死菌または不活化菌ワクチンは十分に効果的な免疫原応答を刺激する能力を欠く可能性がある、というものである。通常、許容される効能を得るために、アジュバントまたは免疫原的に刺激する化合物が、ワクチン組成物にて死菌または不活化菌と組み合わせて使用される。しかしながら、標的となる宿主の安全性はアジュバントの添加により譲歩されることが多い。例えば、妊娠している動物は、アジュバントを含有する死菌または不活化菌ワクチンを投与した後で、何度も有意に高割合で流産していることが分かっている。加えて、食用の動物の場合、食品の消費のために販売されている動物の食肉の質に悪影響を与える、注射部位の反応を最少とすることが極めて望ましい。
【００１０】
この度、適当なアジュバント、例えば、代謝性油を、本明細書に記載されるような免疫原的に活性な成分と組み合わせて使用すると、得られるイー・コリＯ１５７：Ｈ７ワクチンの組成物は使用について安全であり、特にウシにて有用であることが見出された。かくして、本発明は、肉質にとって有害である注射部位の反応を最少にしながら、効果的な免疫性と、安全性という目標を同時に達成するものである。
安全かつ効果的なワクチン組成物は：不活化または死滅の全体またはサブユニットのイー・コリＯ１５７：Ｈ７またはその混合物からなる群より選択される免疫原的に活性な成分と、適当なアジュバントとを一緒に含む。かかるワクチンは、反芻動物の定着を効果的に防止し、それによりイー・コリＯ１５７：Ｈ７がヒトの食料供給にシェディングする可能性を軽減または排除するであろう。
本明細書にて用いる場合、「免疫原的に活性な」なる語は、免疫応答を刺激する、すなわち、抗体、特に体液性抗体の産生を刺激するか、または細胞媒介性応答を刺激する、能力を意味する。効果的で免疫性を付与する免疫原的に活性な成分の量は変更可能であり、免疫応答を惹起し、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の定着に対して免疫学的保護を付与するのに十分な量である。投与単位当たりの免疫原的に活性な成分の量は、好ましくは少なくとも１ｘ１０９個の細胞である。これらの量は不活化または死滅の全細胞またはサブユニットの抗原に適している。
【００１１】
免疫原的に活性な成分は、慣用的な技法を用いて定着した動物から単離された全細胞またはサブユニットのイー・コリＯ１５７：Ｈ７とすることができる。また、イー・コリＯ１５７：Ｈ７などの生物の保管を維持する種々の国内および国際菌株保存機関から入手可能な菌株などの、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の入手可能な多くの単離体から誘導することもできる。アメリカン・タイプ・カルチャ・コレクション（ＡＴＣＣ）には、例えば、とりわけ、ＡＴＣＣ番号３５１５０、４３８８８、４３８８９、４３８９０、４３８９４および４３８９５の下に、イー・コリＯ１５７：Ｈ７が寄託されている。セントロ・ヴェネゾタノ・デュ・コレシオネス・デュ・ミクロオルガニスモス、インスチツト・デュ・ビオロジア・エクスペリメンタル、ユニバーシダッド・セントラル・デュ・ベネズエラには、イー・コリＯ１５７：Ｈ７がＣＶＣＭ８１５の下に寄託されている。コレクション・デュ・ルインスチツト・パスツール、インスチツト・パスツールには、イー・コリＯ１５７：Ｈ７がＣＩＰ７５９の下で寄託されている。バイオレソース・コレクション・アンド・リサーチ・センター、フード・インダストリ・リサーチ・アンド・デベロップメント・インスチチュートには、イー・コリＯ１５７：Ｈ７がＢＣＲＣ５９の下で寄託されている。また、ＰＣＴ ＷＯ ００／０４９２２はイー・コリＯ１５７：Ｈ７のＯ−特異的ポリサッカライドから調製される特定のサブユニットのイー・コリＯ１５７：Ｈ７抗原を記載する。
【００１２】
ワクチン処理工程として、本明細書では、動物当たり少なくとも一つの投与単位を意図する。二つまたはそれ以上の投与単位が特に有用である。投与単位は、典型的には、約１ないし２ミリリットルであり、各投与単位は上記した量の細菌または細菌成分を含有する。当業者であれば、バクテリンまたはその成分の有効な免疫化量が動物にデリバリーされる限り、投与単位当たりのワクチン組成物の最適量、ならびにワクチン処理工程当たりの投与単位の総数を最適化しうることを理解するであろう。
本発明のイー・コリＯ１５７：Ｈ７ワクチン組成物は、その成分の一つとして最も好ましくは代謝性油を含有する適当なアジュバントを含有する。本明細書で使用する場合の「アジュバント」なる語は、ワクチンまたは免疫原に対する体内の応答を改善するいずれの成分をもいう。アジュバントは、典型的には、本発明のワクチン処方の約０．１ないし５０％容量／容量、好ましくはワクチンの約１ないし５０％、より好ましくは約１ないし２０％、特に１ないし１０％容量／容量からなる。約５ないし１５％容量／容量の量がさらにより好ましい。
【００１３】
ワクチン組成物に利用されるアジュバントとして、標的となる種により代謝可能な少なくとも一つの免疫刺激性油が挙げられる。本発明の組成物に使用するのに適する代謝性油として、オイルエマルジョン、例えば、ＳＰオイル（後記する）、エマルシゲン（Emulsigen）（ＭＰＶラボラトリー、ラルストン、ＮＺ）、モンタニド（Montanide）２６４,２６６,２６（セピック（Seppic）ＳＡ、パリ、フランス）ならびにピーナッツオイルおよび他の植物を基礎とする油、スクアラン（鮫肝油）または獣医のワクチン慣習においてアジュバントの使用に適する他の代謝性油が挙げられる。
アジュバント組成物は、好ましくは、代謝性油に加えて、１またはそれ以上の湿潤剤または分散剤を、アジュバントの容量に対して約０．１ないし２５％、より好ましくは約１ないし１０％、さらにより好ましくは約１ないし３％の量にて含む。湿潤剤または分散剤としては非イオン性界面活性剤が特に好ましい。アジュバントの他の成分として、アジュバントの容量に付き約１容量％までの量のベンジルアルコール、ホルマリンおよびチメロサールなどの保存剤が挙げられる。
【００１４】
特に好ましいアジュバントは、ＳＰオイルと称される代謝性油の処方である。実施例を含む明細書に記載されるように、「ＳＰオイル」なる語は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、スクアラン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートおよび緩衝化された塩類溶液を含むオイルエマルジョンを表す。一般に、ＳＰオイルエマルジョンは約１ないし３容量／容量％のブロックコポリマー、約２ないし６容量／容量％のスクアラン、より好ましくは約３ないし６％のスクアランおよび約０．１ないし約０．５容量／容量％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含み、残りが緩衝化された塩類溶液であろう。
本発明の極めて好ましいワクチン組成物において、代謝性油は、好ましくは約１０−２０容量／容量％の量の、最も好ましくは約１５容量／容量％の量の水酸化アルミニウムゲルと一緒に利用される。このＳＰオイルと水酸化アルミニウムゲルの組み合わせが、ワクチン処理された反芻動物にて全身性および局所性免疫作用の両方の作用が誘発されるという点で特に有用なワクチンを提供する。もう一つ別の意外な特徴は、このアジュバントの組み合わせが、あるケースにおいて、特定の抗原形態にてその安全性を有意に改善する点にある。
【００１５】
ＳＰオイルを利用する場合、本発明のワクチン組成物中のアジュバントとしてのＳＰオイルの免疫原的に刺激する量は、免疫原的に活性な成分、感染の可能性のある照射の程度、ワクチン組成物の投与方法、ウシの年齢および大きさ等に従って変化しうる。一般に、ワクチン組成物の約１％ないし５０容量／容量％の量のＳＰオイルが適当であり、好ましくは約４％ないし１０容量／容量％、より好ましくは約４％ないし５容量／容量％のＳＰオイルである。
本発明のワクチン組成物に用いるのに適する医薬的に（または薬理学的に）許容される担体は、獣医薬組成物に適する慣用的な液体担体、好ましくは組織培地にて用いるのに適する平衡塩類溶液または他の水基剤溶液であってもよい。他の入手可能な担体も利用することができる。
【００１６】
当該分野にて入手可能な付加的な賦形剤を、上記した種々の実施形態に従ってワクチン組成物に含めてもよい。例えば、ｐＨ調整剤を利用してもよい。
上記した、担体を含む、本発明のワクチン組成物の成分は、利用可能な技法を用いて一緒にすることができる。
上記した、活性成分としてのイー・コリＯ１５７：Ｈ７の免疫原的に活性な成分に加えて、本発明のワクチン組成物はまた、他の活性成分、例えば、サルモネラ・ダブリスまたはサルモネラ・チフィムリウス等あるいはその組み合わせに拮抗して方向付けられる抗病原性成分を含有してもよい。一またはそれ以上のこれら細菌の量は、効能に関する文献から決定してもよく、あるいは利用可能な技法を用いて決定してもよい。
【００１７】
本発明の一の実施形態において、本発明の免疫原的に活性な成分を、多糖類、ペプチド、蛋白等、あるいはその組み合わせなどの適当な生体化合物とコンジュゲートさせてもよい。
本発明の好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物を上記した投与単位形態に処方し、投与を容易にし、投与量の均一性を確実にしてもよい。エマルジョンの調製に適用できる技法などの、利用可能な技法を用いて処方を行ってもよい。
本発明のワクチン組成物は、非経口的に、例えば、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内等、好ましくは皮下的に投与することができる。
【００１８】
実際に行うにおいて、本発明のワクチン組成物は、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の担体に照射可能と予想される時間により決定することのできる、一の投与計画に従った有効量にて、非経口的に、皮下的に、または他の利用可能な手段により、好ましくは非経口的に、より好ましくは皮下的に投与される。この方法においては、処理される動物は天然の照射の前に免疫性を構築する時間を有していてもよい。本発明を限定するものでない、実施例によれば、典型的な治療計画または投与計画は、潜在的な照射の少なくとも約２−８週間前に、一の投与単位を非経口投与すること、好ましくは皮下注射することを含めてもよい。少なくとも２回の投与、例えば、バクテリンに潜在的に照射する約８週前に一の投与単位を、処理された動物の潜在的照射の約３−５週前に第二の投与単位を投与することが好ましい。上記したように、投与単位は、典型的には、活性成分を一の量にて含有し、アジュバントおよび不活性成分を上記したように一定の割合にて含有する、約０．１ないし１０ミリリットルのワクチン組成物の範囲内にあるであろう。おそらく、約０．５ないし５ミリリットルの範囲内にある投与単位がより好ましく、約１ないし２ミリリットルが特に好ましい。
【００１９】
本発明をさらに明確に理解するために、以下にその実施例を述べる。これら実施例は単なる例示であり、本発明の範囲および基礎となる原理を制限するものと決して解釈されるべきではない。実際、本明細書に示され、記載される修飾に加えて、本発明の種々の修飾が以下の実施例および以上の記載から明らかとなるであろう。かかる修飾もまた、添付した特許請求の範囲の範囲内にあると意図される。
【００２０】
実施例
実施例１−ワクチンの調製
【表１】
【００２１】
成分を混合し、安定な塊またはエマルジョンが形成されるまで均一化する。均一化の前に、成分または混合物をオートクレーブに付してもよい。エマルジョンをさらに濾過により滅菌処理に付してもよい。
【００２２】
ワクチン処方：ウシのイー・コリＯ１５７：Ｈ７バクテリン
投与容量：２ｍｌ／投与
【表２】
【００２３】
１３．８リットルを３．８６ｘ１０９個の細胞／ｍｌの濃度の発酵物より収穫した。
＊７５０ｍｌのＳＰオイルは０．７５ｍｌの５％チメロサールを含有する（７５０ｍｌｘ０．００１＝０．７５ｍｌ）
６ｍｌ−０．７５ｍｌ＝５．２５ｍｌ（必要とする添加量）
【００２４】
ブレンド経路
１． 不活化菌を少なくとも３０分間、１５０−２００ｒｐｍで混合し、十分な混合を確保する。
２． ３０００ｍｌの混合菌を採取し、１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離に付す（残りの抗原のストックを４℃に維持する）。
３． ペレットを集め、該ペレットを０．０１Ｍ ＰＢＳを用いて３０００ｍｌとして再度懸濁させ、十分に混合する。
４． ９７１．５ｍｌの再度懸濁された細胞を採取し、２０２８．５ｍｌの０．０１Ｍ ＰＢＳを添加して総容量を３０００ｍｌとする。これがフラクションＡである。
５． もう一度９７１．５ｍｌの再度懸濁された細胞を採取し、２０２８．５ｍｌの０．０１Ｍ ＰＢＳを添加して総容量を３０００ｍｌとする。これがフラクションＢである。
６．２２５０ｍｌのＡｌＯＨゲルをフラクションＡに加え、この組み合わせを１時間１５０−２００ｒｐｍで混合する。
７． ７５０ｍｌのＳＰオイルをフラクションＢに加え、この組み合わせを１時間１５０−２００ｒｐｍで混合する。
８． 上記のフラクションＡとフラクションＢを合わせ、その組み合わせを１時間１５０−２００ｒｐｍで混合する。
９． ５．２５ｍｌの５％チメロサールを添加し、その容量を０．０１Ｍ ＰＢＳを用いて１４８００ｍｌとする。
１０． ワクチンを少なくとも３０分間１５０−２００ｒｐｍで混合する。
１１． ｐＨをチェックし、必要ならばｐＨを７（＋０．２）に調整する。
１２． ｐＨを調整した後、ワクチンを０．０１Ｍ ＰＢＳを用いて１５０００ｍｌとし、少なくともさらに３０分間混合する。
１３． ワクチンを充填してラベルを貼る。
【００２５】
実施例２
アジュバント処理した、またはアジュバント処理していないイー・コリＯ１５７：Ｈ７ワクチンで予防接種した後のウシにおける血清学的応答の評価およびウシにおける試験ワクチンの安全性
商業的供給源から得た２４頭の健康な雑種のウシをこの試験に用いる。その年齢は第一の予防接種時に６−１２月齢の範囲にあり、雌雄の両方の動物を用いる。ウシは適用される動物保護規定に合致するハウジングに収容されているグループである。水と食べ物は自由に摂取することができる。試験責任者と相談した上で植物獣医師（plant veterinarian）が必要があるとしたすべての動物を処理した。試験の前および間の処理を記録する。抗生物質または場合によっては免疫抑制薬を必要とする動物を試験から除外する。
【００２６】
ワクチン組成物を処方して、９ＣＦＲ§§１１３．２６および１１３．３３にて規定されるように、不妊および実験室の動物の安全性について試験する。ワクチンを２−７℃で貯蔵する。仔ウシを無作為に一群６頭の動物の群に分ける。群６を従来通りにアジュバント処理したワクチンで予防接種する。群７を本発明に従ってアジュバント処理したワクチンで予防接種し、群５予防接種されていない対照として適用する。仔ウシに適当なワクチンを２ｍｌの用量で皮下経路を介して予防接種する。第二の用量を３−４週にて投与し、第三の用量をさらに３−４週後に投与する。仔ウシを第一と第二の投与の際に採血し、その後、第三の予防接種から４週経過するまで毎週採血する。各血清サンプルを抗体反応について評価する。
血清分析を統計的に解析し、抗体応答における違いを決定する。ＥＬＩＳＡ価を測定し、ワクチン応答を評価して結果を平均化する。
【００２７】
各予防接種の後、３日間、注射部位を観察する。何らかの注射部位の反応が認められたならば、その場合、ウシを予防接種後１４日まで、あるいはその反応が消えるまで観察する。注射部位の反応を３つの方向（長さ、幅および高さ）にて測定する。毎日の反応の評点をＬｘＷｘＨで算定する。合計の反応の評点をMann Whitney Rank Sumで解析する。有意性のレベルをｐ＜０．０５にセットする。
結果は以下のとおりである：
血清学：ＥＬＩＳＡ価
対照：群５
標準アジュバント：群６
本発明のＳＰオイル オイル／水酸化アルミニウムアジュバント：群７
【００２８】
【表３】
【００２９】
結果：第三の予防接種から１４日経過後のＥＬＩＳＡ価のレベルに基づき、群７の動物が対照群および群６の動物と比べて高い免疫原的応答を示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】
−１ｄｐｖ２＝第二の予防接種の前の日における注射部位の評価
０ｄｐｖ２＝第二の予防接種の日における注射部位の評価
１ｄｐｖ２＝第二の予防接種の１日経過後における注射部位の評価
２ｄｐｖ２＝第二の予防接種の２日経過後における注射部位の評価
３ｄｐｖ２＝第二の予防接種の３日経過後における注射部位の評価
４ｄｐｖ２＝第二の予防接種の４日経過後における注射部位の評価
５ｄｐｖ２＝第二の予防接種の５日経過後における注射部位の評価
６ｄｐｖ２＝第二の予防接種の６日経過後における注射部位の評価
７ｄｐｖ２＝第二の予防接種の７日経過後における注射部位の評価
１０ｄｐｖ２＝第二の予防接種の１０日経過後における注射部位の評価
１１ｄｐｖ２＝第二の予防接種の１１日経過後における注射部位の評価
【００３２】
結果は、本発明に従ってアジュバント処理したワクチンにおいて、有意に高い免疫原性応答を示しながら、反応部位にて同様の反応速度のあることを示す。
【００３３】
実施例３
フィールド実験
実施例１のワクチン組成物を２ヶ月にわたる実験の商業的フィードロットにて利用し、イー・コリＯ１５７：Ｈ７のフィードロットのウシにおける有病率を減少させる種々のインターベンションの有効性を評価して比較した。実施例１のイー・コリを一ヶ月の間隔で実験の間２回投与した。最後の予防接種から３日目に、ＵＳＤＡ−ＦＳＩＳはワクチン接種したウシの食肉処理を許可した。該ワクチンは宿主の免疫系を刺激し、特にＴ細胞およびＢ細胞の両方が体液性抗体およびある種のＣＭＩ因子を惹起することを刺激した。
【００３４】
処理場に輸送してから４８時間以内に、一の囲い当たり２５頭のウシから皮および糞便のサンプルを集めた。収集後、サンプルを分析するために研究室に送った。イー・コリＯ１５７：Ｈ７分析のデータは、病原菌の陽性について試験し、囲い当たりに収集したサンプル全体で割った、皮、糞便および皮または糞便のパーセンテージとして報告された。皮および糞便のサンプルは共に同じ動物に由来するため、皮または糞便のいずれかのサンプルが陽性であるならば、該動物は陽性であると考えられるとして、研究者は該データを解析した。処理の間の陽性サンプルのパーセンテージの差はカイ二乗適合度試験を用いて測定した（SAS Inc.、Cary、ＮＣ）。該ワクチンは皮サンプルでの病原菌の有病率を２０．３％減少させ、糞便サンプル中では３１．１％減少させることが判明した。ラクトバシラス・アシドフィルスまたはネオマイシン薬用飼料補助品で処理するような他のインターベンション方法と合わせると、該ワクチンは抗原のシェディングにおいてさらなる減少を提供する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、動物、特にウシにおけるイー・コリＯ１５７：Ｈ７定着を減少させるアジュバント処理されたワクチン、その製法、およびそのシェディング（shedding）を防止するために、その物を動物、特にウシに投与する方法に関する。
【０００２】
（従来技術）
イー・コリＯ１５７：Ｈ７は毒性かつ一般的な食品媒介病原菌であり、このようなイー・コリＯ１５７：Ｈ７感染がヒトの健康に対する重大な関心の一の源である。イー・コリＯ１５７による感染に付随するヒトでの病気が１９８２年よりますます頻繁に報告されている。ヒトの病気とウシ製品を消費することとの間の疫学的関係が、合衆国、カナダおよび他の国々の飼育場または飼養場から集めた仔ウシまたは成体のウシの糞便からイー・コリＯ１５７：Ｈ７が単離されることで支持された。ヒト以外の動物からヒトに拡散する、ヒト感染の主たる原因は、汚染した牛肉または他の肉類製品を摂食することである。
【０００３】
イー・コリＯ１５７：Ｈ７は反芻動物および他の動物の腸に定着し、一般にこれらの動物にて顕性疾患を惹起するものではない。イー・コリＯ１５７：Ｈ７がその定着した動物の糞便にシェディングすることが、ヒトにおけるイー・コリＯ１５７：Ｈ７感染の原因の一つとなっている。したがって、ヒト感染を防止するには、動物、特にウシにおけるイー・コリＯ１５７：Ｈ７のコロニー形成およびシェディングを根絶または減少させることが重要である。仔ウシにイー・コリＯ１５７：Ｈ７を経口接種することで血清中のＬＰＳに対する抗体およびベロ毒素に対する中和抗体の迅速かつ持続的な増加が誘発されることが証明されている。穀類から干し草に短期間に飼料を変えることでウシからのイー・コリのシェディングを減少させる試みもなされた。しかし、この飼料を変更する方法は、全体的に、環境の糞便汚染を排除することができない。というのも、アメリカのウシが干し草だけで構成されている飼料を食べているとするのは疑わしいからである。
【０００４】
ウシは大量に食肉処理され、ヒトに感染するのに必要なイー・コリＯ１５７：Ｈ７の数は少なくてすむため（１０−１００匹）、イー・コリＯ１５７：Ｈ７は深刻な健康問題を抱えたままである。食肉処理の段階でイー・コリＯ１５７：Ｈ７を検出し、その後で死滅させる；ウシの飼料を変えて腸内イー・コリＯ１５７：Ｈ７の数を減少させる；および動物を免疫処理してイー・コリＯ１５７：Ｈ７のシェディングを妨げる、とする改良された方法に対する研究に焦点が当てられた。それでもなお、場合によっては、時に悲惨な経済的健全性と環境衛生の結果を伴って、イー・コリＯ１５７：Ｈ７は、網をくぐり抜け、ほとんど大抵人的誤り（不適当な調理または交差汚染）と一緒になって、大損害を惹起する。ここ数年間において、科学者、家畜生産業者、ジャーナリスト、関連業者、政府代表者および缶詰工場の関係者は、農場経営者／牧場経営者が、食用処理されたウシが食品媒介病原菌をその体外または体内にて缶詰工場内に持ち込むであろう危険性を排除するよう（あるいは少なくとも最小限にするよう）積極的に努力する責任を前提として履行する必要のあることを示している。（ａ）クリーナー動物（cleaner animal）が、残骸、切り分けられた肉、最終の牛肉製品での病原菌の残存を減少させるであろう；（ｂ）優良管理事例（Good Management Practices）、または優良生産事例（Good Production Practices）が食肉処理用のクリーナー動物を提供することの助けとなるであろう；および（ｃ）食肉処理されるウシの内外に存在する食品媒介病原菌を最小限とするのに、介入の選択および管理事例の影響力が調査されるべきである、と主張されている。
【０００５】
テキサス肥畜飼育者組合は、北大西洋で取れるワカメから造られるタスコ（Tasco）（登録商標）なる製品を、食肉処理に付す前の１４日間、飼料に配合すると、ウシにおいてイー・コリＯ１５７：Ｈ７が３００％減少したと報告している。ＣＡＬＦ Ｎｅｗｓ（２００２）は、プロバイオティクスまたはいわゆる「体に良い細菌」（実際には、ラクトバシラス・アシドフィルス（lactobacillus acidophilus）菌株）を含有する新しい食用成分が、米国食肉協会研究財団により資金供給された研究に基づいて、生きているウシにて５０％程度のイー・コリＯ１５７：Ｈ７の存在を減少させうると報告した。Zhaoら（１９９８）は、イー・コリＯ１５７：Ｈ７に暴露される前に、選択されたプロバイオティクス菌（非腸管出血性大腸菌およびミラビリス変形菌を含む）をウシに投与すると、大抵の動物にてイー・コリＯ１５７：Ｈ７のキャリッジのレベルを減少させうる結果が得られることを報告した；Ｌ−ファーマ・インク（L-Pharma, Inc.）は、現在、この研究に基づくウシ用のプロバイオティクスを販売している。
【０００６】
にもかかわらず、反芻動物、特にウシにて、その残骸を介してヒトの食料に到達しうる、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の定着を効果的に防止するワクチンを製造する課題がいまなお存在する。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、不活化または死滅の全体またはサブユニットのイー・コリＯ１５７：Ｈ７抗原からなる群より選択される免疫原的に活性な成分を、代謝性油および水酸化アルミニウムアジュバントと組み合わせて含む、ワクチン組成物を提供する。
代謝性油は、他の慣用的なワクチン賦形剤と一緒に、免疫原的に刺激する量にてワクチン組成物にて利用される。
【０００８】
本発明のさらなる実施形態において、ワクチン組成物は、単位用量当たり少なくとも１ｘ１０９個の不活化イー・コリＯ１５７：Ｈ７またはその成分と、約３−８％、好ましくは５％の代謝性油および約１０−２５％、好ましくは１５％の水酸化アルミニウムを含む約５ないし１０容量／容量％のアジュバントとを含む。
本発明の特に好ましい実施形態は、少なくとも２つの投与単位の死滅または不活化イー・コリＯ１５７：Ｈ７を含むウシ用のワクチン組成物であって、その投与単位の各々が少なくとも１ｘ１０９個のバクテリンと、約５ないし２５容量／容量％のアジュバントとを含み、該アジュバントが少なくとも一つの代謝性油、および水酸化アルミニウムを含み、さらには該投与単位が医薬上許容される担体を含む、ところのワクチン組成物である。
さらには、本発明の目的および特徴は、本明細書に記載の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０００９】
（発明の詳細な記載）
一般に、新規なワクチンを設計する際の問題は、生菌ワクチンが付与された標的宿主にて十分な安全性を欠く可能性があり、そして死菌または不活化菌ワクチンは十分に効果的な免疫原応答を刺激する能力を欠く可能性がある、というものである。通常、許容される効能を得るために、アジュバントまたは免疫原的に刺激する化合物が、ワクチン組成物にて死菌または不活化菌と組み合わせて使用される。しかしながら、標的となる宿主の安全性はアジュバントの添加により譲歩されることが多い。例えば、妊娠している動物は、アジュバントを含有する死菌または不活化菌ワクチンを投与した後で、何度も有意に高割合で流産していることが分かっている。加えて、食用の動物の場合、食品の消費のために販売されている動物の食肉の質に悪影響を与える、注射部位の反応を最少とすることが極めて望ましい。
【００１０】
この度、適当なアジュバント、例えば、代謝性油を、本明細書に記載されるような免疫原的に活性な成分と組み合わせて使用すると、得られるイー・コリＯ１５７：Ｈ７ワクチンの組成物は使用について安全であり、特にウシにて有用であることが見出された。かくして、本発明は、肉質にとって有害である注射部位の反応を最少にしながら、効果的な免疫性と、安全性という目標を同時に達成するものである。
安全かつ効果的なワクチン組成物は：不活化または死滅の全体またはサブユニットのイー・コリＯ１５７：Ｈ７またはその混合物からなる群より選択される免疫原的に活性な成分と、適当なアジュバントとを一緒に含む。かかるワクチンは、反芻動物の定着を効果的に防止し、それによりイー・コリＯ１５７：Ｈ７がヒトの食料供給にシェディングする可能性を軽減または排除するであろう。
本明細書にて用いる場合、「免疫原的に活性な」なる語は、免疫応答を刺激する、すなわち、抗体、特に体液性抗体の産生を刺激するか、または細胞媒介性応答を刺激する、能力を意味する。効果的で免疫性を付与する免疫原的に活性な成分の量は変更可能であり、免疫応答を惹起し、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の定着に対して免疫学的保護を付与するのに十分な量である。投与単位当たりの免疫原的に活性な成分の量は、好ましくは少なくとも１ｘ１０９個の細胞である。これらの量は不活化または死滅の全細胞またはサブユニットの抗原に適している。
【００１１】
免疫原的に活性な成分は、慣用的な技法を用いて定着した動物から単離された全細胞またはサブユニットのイー・コリＯ１５７：Ｈ７とすることができる。また、イー・コリＯ１５７：Ｈ７などの生物の保管を維持する種々の国内および国際菌株保存機関から入手可能な菌株などの、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の入手可能な多くの単離体から誘導することもできる。アメリカン・タイプ・カルチャ・コレクション（ＡＴＣＣ）には、例えば、とりわけ、ＡＴＣＣ番号３５１５０、４３８８８、４３８８９、４３８９０、４３８９４および４３８９５の下に、イー・コリＯ１５７：Ｈ７が寄託されている。セントロ・ヴェネゾタノ・デュ・コレシオネス・デュ・ミクロオルガニスモス、インスチツト・デュ・ビオロジア・エクスペリメンタル、ユニバーシダッド・セントラル・デュ・ベネズエラには、イー・コリＯ１５７：Ｈ７がＣＶＣＭ８１５の下に寄託されている。コレクション・デュ・ルインスチツト・パスツール、インスチツト・パスツールには、イー・コリＯ１５７：Ｈ７がＣＩＰ７５９の下で寄託されている。バイオレソース・コレクション・アンド・リサーチ・センター、フード・インダストリ・リサーチ・アンド・デベロップメント・インスチチュートには、イー・コリＯ１５７：Ｈ７がＢＣＲＣ５９の下で寄託されている。また、ＰＣＴ ＷＯ ００／０４９２２はイー・コリＯ１５７：Ｈ７のＯ−特異的ポリサッカライドから調製される特定のサブユニットのイー・コリＯ１５７：Ｈ７抗原を記載する。
【００１２】
ワクチン処理工程として、本明細書では、動物当たり少なくとも一つの投与単位を意図する。二つまたはそれ以上の投与単位が特に有用である。投与単位は、典型的には、約１ないし２ミリリットルであり、各投与単位は上記した量の細菌または細菌成分を含有する。当業者であれば、バクテリンまたはその成分の有効な免疫化量が動物にデリバリーされる限り、投与単位当たりのワクチン組成物の最適量、ならびにワクチン処理工程当たりの投与単位の総数を最適化しうることを理解するであろう。
本発明のイー・コリＯ１５７：Ｈ７ワクチン組成物は、その成分の一つとして最も好ましくは代謝性油を含有する適当なアジュバントを含有する。本明細書で使用する場合の「アジュバント」なる語は、ワクチンまたは免疫原に対する体内の応答を改善するいずれの成分をもいう。アジュバントは、典型的には、本発明のワクチン処方の約０．１ないし５０％容量／容量、好ましくはワクチンの約１ないし５０％、より好ましくは約１ないし２０％、特に１ないし１０％容量／容量からなる。約５ないし１５％容量／容量の量がさらにより好ましい。
【００１３】
ワクチン組成物に利用されるアジュバントとして、標的となる種により代謝可能な少なくとも一つの免疫刺激性油が挙げられる。本発明の組成物に使用するのに適する代謝性油として、オイルエマルジョン、例えば、ＳＰオイル（後記する）、エマルシゲン（Emulsigen）（ＭＰＶラボラトリー、ラルストン、ＮＺ）、モンタニド（Montanide）２６４,２６６,２６（セピック（Seppic）ＳＡ、パリ、フランス）ならびにピーナッツオイルおよび他の植物を基礎とする油、スクアラン（鮫肝油）または獣医のワクチン慣習においてアジュバントの使用に適する他の代謝性油が挙げられる。
アジュバント組成物は、好ましくは、代謝性油に加えて、１またはそれ以上の湿潤剤または分散剤を、アジュバントの容量に対して約０．１ないし２５％、より好ましくは約１ないし１０％、さらにより好ましくは約１ないし３％の量にて含む。湿潤剤または分散剤としては非イオン性界面活性剤が特に好ましい。アジュバントの他の成分として、アジュバントの容量に付き約１容量％までの量のベンジルアルコール、ホルマリンおよびチメロサールなどの保存剤が挙げられる。
【００１４】
特に好ましいアジュバントは、ＳＰオイルと称される代謝性油の処方である。実施例を含む明細書に記載されるように、「ＳＰオイル」なる語は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、スクアラン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートおよび緩衝化された塩類溶液を含むオイルエマルジョンを表す。一般に、ＳＰオイルエマルジョンは約１ないし３容量／容量％のブロックコポリマー、約２ないし６容量／容量％のスクアラン、より好ましくは約３ないし６％のスクアランおよび約０．１ないし約０．５容量／容量％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含み、残りが緩衝化された塩類溶液であろう。
本発明の極めて好ましいワクチン組成物において、代謝性油は、好ましくは約１０−２０容量／容量％の量の、最も好ましくは約１５容量／容量％の量の水酸化アルミニウムゲルと一緒に利用される。このＳＰオイルと水酸化アルミニウムゲルの組み合わせが、ワクチン処理された反芻動物にて全身性および局所性免疫作用の両方の作用が誘発されるという点で特に有用なワクチンを提供する。もう一つ別の意外な特徴は、このアジュバントの組み合わせが、あるケースにおいて、特定の抗原形態にてその安全性を有意に改善する点にある。
【００１５】
ＳＰオイルを利用する場合、本発明のワクチン組成物中のアジュバントとしてのＳＰオイルの免疫原的に刺激する量は、免疫原的に活性な成分、感染の可能性のある照射の程度、ワクチン組成物の投与方法、ウシの年齢および大きさ等に従って変化しうる。一般に、ワクチン組成物の約１％ないし５０容量／容量％の量のＳＰオイルが適当であり、好ましくは約４％ないし１０容量／容量％、より好ましくは約４％ないし５容量／容量％のＳＰオイルである。
本発明のワクチン組成物に用いるのに適する医薬的に（または薬理学的に）許容される担体は、獣医薬組成物に適する慣用的な液体担体、好ましくは組織培地にて用いるのに適する平衡塩類溶液または他の水基剤溶液であってもよい。他の入手可能な担体も利用することができる。
【００１６】
当該分野にて入手可能な付加的な賦形剤を、上記した種々の実施形態に従ってワクチン組成物に含めてもよい。例えば、ｐＨ調整剤を利用してもよい。
上記した、担体を含む、本発明のワクチン組成物の成分は、利用可能な技法を用いて一緒にすることができる。
上記した、活性成分としてのイー・コリＯ１５７：Ｈ７の免疫原的に活性な成分に加えて、本発明のワクチン組成物はまた、他の活性成分、例えば、サルモネラ・ダブリスまたはサルモネラ・チフィムリウス等あるいはその組み合わせに拮抗して方向付けられる抗病原性成分を含有してもよい。一またはそれ以上のこれら細菌の量は、効能に関する文献から決定してもよく、あるいは利用可能な技法を用いて決定してもよい。
【００１７】
本発明の一の実施形態において、本発明の免疫原的に活性な成分を、多糖類、ペプチド、蛋白等、あるいはその組み合わせなどの適当な生体化合物とコンジュゲートさせてもよい。
本発明の好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物を上記した投与単位形態に処方し、投与を容易にし、投与量の均一性を確実にしてもよい。エマルジョンの調製に適用できる技法などの、利用可能な技法を用いて処方を行ってもよい。
本発明のワクチン組成物は、非経口的に、例えば、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内等、好ましくは皮下的に投与することができる。
【００１８】
実際に行うにおいて、本発明のワクチン組成物は、イー・コリＯ１５７：Ｈ７の担体に照射可能と予想される時間により決定することのできる、一の投与計画に従った有効量にて、非経口的に、皮下的に、または他の利用可能な手段により、好ましくは非経口的に、より好ましくは皮下的に投与される。この方法においては、処理される動物は天然の照射の前に免疫性を構築する時間を有していてもよい。本発明を限定するものでない、実施例によれば、典型的な治療計画または投与計画は、潜在的な照射の少なくとも約２−８週間前に、一の投与単位を非経口投与すること、好ましくは皮下注射することを含めてもよい。少なくとも２回の投与、例えば、バクテリンに潜在的に照射する約８週前に一の投与単位を、処理された動物の潜在的照射の約３−５週前に第二の投与単位を投与することが好ましい。上記したように、投与単位は、典型的には、活性成分を一の量にて含有し、アジュバントおよび不活性成分を上記したように一定の割合にて含有する、約０．１ないし１０ミリリットルのワクチン組成物の範囲内にあるであろう。おそらく、約０．５ないし５ミリリットルの範囲内にある投与単位がより好ましく、約１ないし２ミリリットルが特に好ましい。
【００１９】
本発明をさらに明確に理解するために、以下にその実施例を述べる。これら実施例は単なる例示であり、本発明の範囲および基礎となる原理を制限するものと決して解釈されるべきではない。実際、本明細書に示され、記載される修飾に加えて、本発明の種々の修飾が以下の実施例および以上の記載から明らかとなるであろう。かかる修飾もまた、添付した特許請求の範囲の範囲内にあると意図される。
【００２０】
実施例
実施例１−ワクチンの調製
【表１】
【００２１】
成分を混合し、安定な塊またはエマルジョンが形成されるまで均一化する。均一化の前に、成分または混合物をオートクレーブに付してもよい。エマルジョンをさらに濾過により滅菌処理に付してもよい。
【００２２】
ワクチン処方：ウシのイー・コリＯ１５７：Ｈ７バクテリン
投与容量：２ｍｌ／投与
【表２】
【００２３】
１３．８リットルを３．８６ｘ１０９個の細胞／ｍｌの濃度の発酵物より収穫した。
＊７５０ｍｌのＳＰオイルは０．７５ｍｌの５％チメロサールを含有する（７５０ｍｌｘ０．００１＝０．７５ｍｌ）
６ｍｌ−０．７５ｍｌ＝５．２５ｍｌ（必要とする添加量）
【００２４】
ブレンド経路
１． 不活化菌を少なくとも３０分間、１５０−２００ｒｐｍで混合し、十分な混合を確保する。
２． ３０００ｍｌの混合菌を採取し、１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離に付す（残りの抗原のストックを４℃に維持する）。
３． ペレットを集め、該ペレットを０．０１Ｍ ＰＢＳを用いて３０００ｍｌとして再度懸濁させ、十分に混合する。
４． ９７１．５ｍｌの再度懸濁された細胞を採取し、２０２８．５ｍｌの０．０１Ｍ ＰＢＳを添加して総容量を３０００ｍｌとする。これがフラクションＡである。
５． もう一度９７１．５ｍｌの再度懸濁された細胞を採取し、２０２８．５ｍｌの０．０１Ｍ ＰＢＳを添加して総容量を３０００ｍｌとする。これがフラクションＢである。
６．２２５０ｍｌのＡｌＯＨゲルをフラクションＡに加え、この組み合わせを１時間１５０−２００ｒｐｍで混合する。
７． ７５０ｍｌのＳＰオイルをフラクションＢに加え、この組み合わせを１時間１５０−２００ｒｐｍで混合する。
８． 上記のフラクションＡとフラクションＢを合わせ、その組み合わせを１時間１５０−２００ｒｐｍで混合する。
９． ５．２５ｍｌの５％チメロサールを添加し、その容量を０．０１Ｍ ＰＢＳを用いて１４８００ｍｌとする。
１０． ワクチンを少なくとも３０分間１５０−２００ｒｐｍで混合する。
１１． ｐＨをチェックし、必要ならばｐＨを７（＋０．２）に調整する。
１２． ｐＨを調整した後、ワクチンを０．０１Ｍ ＰＢＳを用いて１５０００ｍｌとし、少なくともさらに３０分間混合する。
１３． ワクチンを充填してラベルを貼る。
【００２５】
実施例２
アジュバント処理した、またはアジュバント処理していないイー・コリＯ１５７：Ｈ７ワクチンで予防接種した後のウシにおける血清学的応答の評価およびウシにおける試験ワクチンの安全性
商業的供給源から得た２４頭の健康な雑種のウシをこの試験に用いる。その年齢は第一の予防接種時に６−１２月齢の範囲にあり、雌雄の両方の動物を用いる。ウシは適用される動物保護規定に合致するハウジングに収容されているグループである。水と食べ物は自由に摂取することができる。試験責任者と相談した上で植物獣医師（plant veterinarian）が必要があるとしたすべての動物を処理した。試験の前および間の処理を記録する。抗生物質または場合によっては免疫抑制薬を必要とする動物を試験から除外する。
【００２６】
ワクチン組成物を処方して、９ＣＦＲ§§１１３．２６および１１３．３３にて規定されるように、不妊および実験室の動物の安全性について試験する。ワクチンを２−７℃で貯蔵する。仔ウシを無作為に一群６頭の動物の群に分ける。群６を従来通りにアジュバント処理したワクチンで予防接種する。群７を本発明に従ってアジュバント処理したワクチンで予防接種し、群５予防接種されていない対照として適用する。仔ウシに適当なワクチンを２ｍｌの用量で皮下経路を介して予防接種する。第二の用量を３−４週にて投与し、第三の用量をさらに３−４週後に投与する。仔ウシを第一と第二の投与の際に採血し、その後、第三の予防接種から４週経過するまで毎週採血する。各血清サンプルを抗体反応について評価する。
血清分析を統計的に解析し、抗体応答における違いを決定する。ＥＬＩＳＡ価を測定し、ワクチン応答を評価して結果を平均化する。
【００２７】
各予防接種の後、３日間、注射部位を観察する。何らかの注射部位の反応が認められたならば、その場合、ウシを予防接種後１４日まで、あるいはその反応が消えるまで観察する。注射部位の反応を３つの方向（長さ、幅および高さ）にて測定する。毎日の反応の評点をＬｘＷｘＨで算定する。合計の反応の評点をMann Whitney Rank Sumで解析する。有意性のレベルをｐ＜０．０５にセットする。
結果は以下のとおりである：
血清学：ＥＬＩＳＡ価
対照：群５
標準アジュバント：群６
本発明のＳＰオイル オイル／水酸化アルミニウムアジュバント：群７
【００２８】
【表３】
【００２９】
結果：第三の予防接種から１４日経過後のＥＬＩＳＡ価のレベルに基づき、群７の動物が対照群および群６の動物と比べて高い免疫原的応答を示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】
−１ｄｐｖ２＝第二の予防接種の前の日における注射部位の評価
０ｄｐｖ２＝第二の予防接種の日における注射部位の評価
１ｄｐｖ２＝第二の予防接種の１日経過後における注射部位の評価
２ｄｐｖ２＝第二の予防接種の２日経過後における注射部位の評価
３ｄｐｖ２＝第二の予防接種の３日経過後における注射部位の評価
４ｄｐｖ２＝第二の予防接種の４日経過後における注射部位の評価
５ｄｐｖ２＝第二の予防接種の５日経過後における注射部位の評価
６ｄｐｖ２＝第二の予防接種の６日経過後における注射部位の評価
７ｄｐｖ２＝第二の予防接種の７日経過後における注射部位の評価
１０ｄｐｖ２＝第二の予防接種の１０日経過後における注射部位の評価
１１ｄｐｖ２＝第二の予防接種の１１日経過後における注射部位の評価
【００３２】
結果は、本発明に従ってアジュバント処理したワクチンにおいて、有意に高い免疫原性応答を示しながら、反応部位にて同様の反応速度のあることを示す。
【００３３】
実施例３
フィールド実験
実施例１のワクチン組成物を２ヶ月にわたる実験の商業的フィードロットにて利用し、イー・コリＯ１５７：Ｈ７のフィードロットのウシにおける有病率を減少させる種々のインターベンションの有効性を評価して比較した。実施例１のイー・コリを一ヶ月の間隔で実験の間２回投与した。最後の予防接種から３日目に、ＵＳＤＡ−ＦＳＩＳはワクチン接種したウシの食肉処理を許可した。該ワクチンは宿主の免疫系を刺激し、特にＴ細胞およびＢ細胞の両方が体液性抗体およびある種のＣＭＩ因子を惹起することを刺激した。
【００３４】
処理場に輸送してから４８時間以内に、一の囲い当たり２５頭のウシから皮および糞便のサンプルを集めた。収集後、サンプルを分析するために研究室に送った。イー・コリＯ１５７：Ｈ７分析のデータは、病原菌の陽性について試験し、囲い当たりに収集したサンプル全体で割った、皮、糞便および皮または糞便のパーセンテージとして報告された。皮および糞便のサンプルは共に同じ動物に由来するため、皮または糞便のいずれかのサンプルが陽性であるならば、該動物は陽性であると考えられるとして、研究者は該データを解析した。処理の間の陽性サンプルのパーセンテージの差はカイ二乗適合度試験を用いて測定した（SAS Inc.、Cary、ＮＣ）。該ワクチンは皮サンプルでの病原菌の有病率を２０．３％減少させ、糞便サンプル中では３１．１％減少させることが判明した。ラクトバシラス・アシドフィルスまたはネオマイシン薬用飼料補助品で処理するような他のインターベンション方法と合わせると、該ワクチンは抗原のシェディングにおいてさらなる減少を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活化または死滅の全体またはサブユニットのイー・コリＯ１５７：Ｈ７あるいはその混合物からなる群より選択される免疫原的に活性な成分；代謝性油のアジュバント；および任意の医薬上許容される担体を含む、ワクチン組成物。
【請求項２】
免疫原的に活性な成分が不活化または死滅の全体またはサブユニットのイー・コリＯ１５７：Ｈ７であるところの、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
免疫原的に活性な成分が不活化の全体のイー・コリＯ１５７：Ｈ７であるところの、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
アジュバントがワクチン組成物の０．１ないし５０容量／容量％からなるところの、請求項１または２記載の組成物。
【請求項５】
アジュバントが代謝性油および水酸化アルミニウムゲルを含むところの、上記した請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
アジュバントが代謝性油の１ないし５０容量／容量％からなるところの、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
代謝性油がスクアランであるところの、請求項５または６記載の組成物。
【請求項８】
アジュバントがさらに１またはそれ以上の湿潤剤および／または分散剤を含むところの、請求項５ないし７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
湿潤剤および／または分散剤がアジュバントの０．１ないし２５容量／容量％からなるところの、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
湿潤剤および／または分散剤が非イオン性界面活性剤からなる群より選択されるところの、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロックコポリマーおよびポリオキシエチレンエステルからなる群より選択されるところの、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
免疫原的に活性な成分が単位用量当たり少なくとも１ｘ１０９個の細胞を提供するのに十分な量にて存在するところの、請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
動物を請求項１記載の組成物で処理することを含む、動物中のイー・コリＯ１５７のシェディングを減少させる方法。
【請求項１４】
動物をさらにラクトバシラス・アシドフィルスまたはネオマイシン薬用飼料補助品で処理することを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１】
不活化または死滅の全体またはサブユニットのイー・コリＯ１５７：Ｈ７あるいはその混合物からなる群より選択される免疫原的に活性な成分；代謝性油のアジュバント；および任意の医薬上許容される担体を含む、ワクチン組成物。
【請求項２】
免疫原的に活性な成分が不活化または死滅の全体またはサブユニットのイー・コリＯ１５７：Ｈ７であるところの、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
免疫原的に活性な成分が不活化の全体のイー・コリＯ１５７：Ｈ７であるところの、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
アジュバントがワクチン組成物の０．１ないし５０容量／容量％からなるところの、請求項１または２記載の組成物。
【請求項５】
アジュバントが代謝性油および水酸化アルミニウムゲルを含むところの、上記した請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
アジュバントが代謝性油の１ないし５０容量／容量％からなるところの、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
代謝性油がスクアランであるところの、請求項５または６記載の組成物。
【請求項８】
アジュバントがさらに１またはそれ以上の湿潤剤および／または分散剤を含むところの、請求項５ないし７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
湿潤剤および／または分散剤がアジュバントの０．１ないし２５容量／容量％からなるところの、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
湿潤剤および／または分散剤が非イオン性界面活性剤からなる群より選択されるところの、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロックコポリマーおよびポリオキシエチレンエステルからなる群より選択されるところの、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
免疫原的に活性な成分が単位用量当たり少なくとも１ｘ１０９個の細胞を提供するのに十分な量にて存在するところの、請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
動物を請求項１記載の組成物で処理することを含む、動物中のイー・コリＯ１５７のシェディングを減少させる方法。
【請求項１４】
動物をさらにラクトバシラス・アシドフィルスまたはネオマイシン薬用飼料補助品で処理することを含む、請求項１３記載の方法。
【公表番号】特表２００６−５１９８８０（Ｐ２００６−５１９８８０Ａ）
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９２２２（Ｐ２００６−５０９２２２）
【出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００６９４１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８０４００
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００６９４１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８０４００
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
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