アポトーシス誘導のためのＮ−アルキルグリシン三量体の同定
ヒト癌細胞の細胞周期を停止させ、かつ癌の治療に有用なアポトーシスを誘導する能力を有するＮ−アルキルグルシン三量体。前記Ｎ−アルキルグリシン三量体とタキソールとの組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(本発明の概要)
本発明は、Ｎ−アルキルグリシンの三量体のライブラリのスクリーニングから得られた、本明細書中Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃと呼ばれる２種の擬似ペプチドの同定、合成、および精製に関する。これらの化合物は、細胞周期を停止させた後、ヒトの癌細胞にアポトーシスを誘導する能力を有する。
【０００２】
(現行技術)
細胞増殖は、細胞外増殖シグナル、細胞サイズ、およびＤＮＡの完全性を一体化する多数のチェックポイントに関与する、順序付けられかつ厳密に規制された過程である。体細胞周期は、ＤＮＡ合成期(Ｓ期)と、単一の細胞が２個の娘細胞に分裂する分裂期とに分けられる。これらの期は、２つのギャップ期(Ｇ１およびＧ２)によって切り離されている。
【０００３】
人体の細胞の大部分は、非分裂終末分化状態、すなわちＧ０期にある。しかし、増殖因子や細胞同士の接触、細胞外基質への付着など、適切な外部からの刺激によって、サイクリン依存性キナーゼ(Ｃｄｋ)の触媒活性が制御され、したがって複製開始点が形成される。特定のＣｄｋによるｐＲｂのリン酸化は、Ｅ２Ｆ／ＤＰとの結合を弱め、Ｇ１からＳ期への進行が可能になり(Chellappan，s.P.他、1991)、ｐ１５INK4b、ｐ１６INK4a、ｐ２１Cip1、およびｐ２７KIP1などのＣｄｋ阻害剤による負の制御を受ける(Sherr, C.J.およびRoberts, J.M.、1995)。ＤＮＡ合成が首尾よく終了した後、細胞はＧ２期に入って有糸分裂に備える。一旦開始したらＤＮＡ複製を終了しなければならない。Ｇ１制限点は、細胞周期を、増殖因子依存性の初期Ｇ１と、後期Ｇ１から有糸分裂までの増殖因子依存性の期とに分ける。シグナル伝達経路は、初期Ｇ１期細胞が制限点を通過して最終的な細胞分裂をするのか、またはシグナル伝達強度が不十分であるために細胞周期から出てＧ０期に入るのか、またはアポトーシスに入るのかを決定する。プロアポトーシスシグナルと抗アポトーシスシグナルとの全体的なバランスが、細胞の運命を決定する。
【０００４】
腫瘍細胞は、細胞喪失を最小限に抑え、すなわちアポトーシスを抑制し、かつ／または調節解除された増殖を高める恒常的メカニズムを乱す、遺伝的変化をもたらす。ヒト癌細胞の一般的な特徴は、ｐ１６の不活性化、サイクリンＤの過剰発現、および／またはｐＲｂの不活性化である(Hall, M.およびPeters, G.、1996）。腫瘍細胞および／または内皮細胞などの腫瘍増殖を支える非腫瘍細胞にアポトーシスを誘導することは、癌治療で最も重要な目標である。癌細胞は、アポトーシス機構のいくつかの構成要素における突然変異が原因で、通常はアポトーシスに対して抵抗力がある。
【０００５】
腫瘍学で現在使用されている最も広範にわたる抗腫瘍性スペクトルを持つ薬物の中にタキソールがある。タキソールは、微小管を安定化し、チューブリンに戻る解重合を阻害し、微小管動態の動力学的崩壊を引き起こすことによってＧ２／Ｍ期停止を誘導する。タキソールは、遺伝子転写(例えばｂａｘ、ｂａｋ)、サイクリン依存性キナーゼ、ｃ−ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ(ＪＮＫ／ＳＡＰＫ)、およびｂｃｌ−２のリン酸化の活性化を誘導する、まだ十分に記述されていないいくつかのメカニズムを通して、アポトーシスを誘導することもできる(Srivastava, R.K他、1999）。タキソールは、癌ならびに健常な細胞にもアポトーシスを誘導するので、深刻な副作用を持つ。
【０００６】
(発明の説明)
本発明の結果は、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃなどの化合物が、細胞周期およびアポトーシスの仕組みを調節することによって機能し、したがってこれらの化合物またはその誘導体は、癌の予防および／または処置薬として、またその他の増殖性疾患の処置薬として、好ましく使用できることを実証している。さらに、同定された化合物は、アポトーシス過程の導入に関与する別の分子標的の研究に、いくつかの手段を提供する。
【０００７】
２種の化合物、例えばＮ−アルキルグリシン三量体のコンビナトリアルライブラリのスクリーニングから得られたＮ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、Ｇ１停止を誘導し、アポトーシスを誘導することができた。
【０００８】
Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃ化合物は、ヒト結腸腺癌、ヒトグリア芽細胞腫、慢性骨髄性白血病、ヒト乳癌、および肺癌などの癌を示すヒト癌細胞系の一団に対し、増殖阻害特性を有する。同定された化合物は、フローサイトメトリーおよびアネキシンＶアッセイと組み合わせたＤＮＡ断片化によって決定されたように、アポトーシスの誘導原であると同定された。アポトーシスは化学療法薬が癌細胞の増殖を阻害する重要な細胞機能である。
【０００９】
より詳細には、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、血清飢餓によって、指数関数的に増殖する細胞またはＧ０／Ｇ１期で同調する細胞にＧ１細胞停止を誘導する。Ｎ１３−１３−１０Ｃによって誘導された細胞周期進行中のＧ１停止は、ｐＲｂおよびｐ１３０の過剰リン酸化の阻害に関連していた。さらに、ｐＲｂ、ｐ１０７、ｃｙｃＡ、およびその活性化パートナーＣｄｋ２のＥ２Ｆ依存性タンパク質発現に、著しい減少が観察された。最後に、ＣＫＩ、ｐ２１Cip1、およびｐ２７kip1の過剰発現が示された。ｐ２７kip1のレベルは、主にユビキチン−プロテオソーム経路によって制御されると考えられる(Hengst, L.およびReed, S.I．、1996；Shirane, L.他、1999)。特定のプロテアソーム阻害剤が新規な抗癌剤として作用する可能性については、現在徹底的に調査中であり、したがって、ｐ２７kip1の蓄積を説明し、かつＮ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃが働くメカニズムを定義するために、さらなる分析が行われる。ｐ２７kip1の発現は、広範な腫瘍スペクトルの診断で、非依存性予後因子であることが報告されている。ヒト腫瘍でのｐ２７kip1発現の減少または欠如は、様々な悪性腫瘍の病原力が高いこと、およびその予後が不十分であることに関連していた(Lloyd, R.V.他、1999；Karter他、2000)。ｐ２７kip1の異所性過剰発現は異種移植モデルで腫瘍の発生を誘導できなかったことに関係していた(Chen J.他、1996）。したがって、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは癌処置で最も重要な候補である。
【００１０】
その他の目標の中で、その他の効果の中でもタキソールの動作との相乗作用を示すことのできる化合物を同定するために、化合物を選択する初期スクリーンを考慮に入れた。選択されたアッセイでは、タキソール効果との相乗作用を示す化合物の混合物を同定することが可能であった。一部の混合物は細胞増殖の阻害剤であることがわかり、またタキソールと併用するとそのような阻害が妨害された。本発明では、細胞増殖を阻害し、血清飢餓によって指数関数的細胞およびＧ０／Ｇ１期で同調した細胞にＧ１細胞停止を誘導し、かつアポトーシスを誘導することのできる、化合物の同定について記述する。これらの化合物は抗癌剤と見なす好ましい治療プロフィルを有する。
【００１１】
細胞周期のＧ１停止を誘発する化合物は、指数関数的細胞とＧ０／Ｇ１同調細胞との両方で観察され、ｐＲｂおよびｐ１３０の低リン酸化と関係している。さらに、ｐＲｂ、ｐ１０７、ｃｙｃＡ、およびその活性化パートナーＣｄｋ２の、Ｅ２Ｆ依存性タンパク質発現の著しい減少が観察される。最後に、ｐ２１Cip1およびｐ２７kip1の付随的誘導が検出される。化合物のプロアポトーシス作用は、アネキシンＶ染色およびＤＮＡの低２倍性によって評価され、サブＧ１特異的であることが確認された。この化合物の別の特徴は、リン酸化によってｂｃｌ−ｘＬを不活性化しないことである。
【００１２】
10,648個の化合物を含むペプトイドライブラリのスクリーニングでは、Ｎ−アルキルグリシンオリゴマー分子(ペプトイド)の三量体の制御された混合物を、４つの位置的走査フォーマットで使用しかつ構成した。化学的多様性は、位置Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３を２２種の異なる第１級アミンで置換することによって導入した。Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３に応じて３つのサブグループに分割された６６種の制御された混合物は、位置を画定した。このライブラリを、細胞増殖アッセイで、ＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞によりスクリーニングした。化合物は、単独で、または低用量のタキソール(１１ｎＭ）と一緒に試験をした。培養から７２時間後、細胞生存度をＭＴＴアッセイで測定した。
【００１３】
一部の混合物は細胞増殖の阻害剤であることがわかったが、タキソールと併用するとそのような阻害はいくらか妨害された。用量反応曲線を作成し６種の混合物を同定した。４種の異なるアミンがＲ１の位置にあり、１種のアミンがＲ２の位置にあり、１種がＲ３の位置にある。次いで４種の化合物を合成し、符号化命名法により、Ｎ４−１３−１０Ｃ、Ｎ５−１３−１０Ｃ、Ｎ１０−１３−１０Ｃ、およびＮ１３−１３−１０Ｃと名付けた(Ｎ４、Ｎ５、Ｎ１０、およびＮ１３とも省略する)。これらはそのＮ末端残基が互いに異なっていた。４種の化合物は全て、試験系内の細胞増殖を阻害したが、タキソールは、Ｎ１０−１３−１０Ｃ(図１.Ｂ)およびＮ１３−１３−１０Ｃ(図１.Ａ)の場合のみその化合物の作用を妨げた。Ｎ１３−１３−１０Ｃは、ＩＣ50＝３５μＭの最も強力な増殖阻害剤であり、次いでＩＣ50＝４０μＭのＮ１０−１３−１０Ｃ、ＩＣ50＝１００μＭのＮ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃであった。
【００１４】
Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、それぞれのＩＣ50で連続希釈したタキソールと組み合わせてアッセイを行った場合、これらの化合物の抗増殖作用がタキソール単独の場合に比べて強化されたことが観察された(図１.Ｃ)。
【００１５】
これらの化合物によって誘導された増殖の阻害を、ヒト結腸腺癌(ＨＴ２９およびＬｏＶｏ)、ヒトグリア芽細胞腫(Ｔ９８ｇ)、慢性骨髄性白血病(Ｋ５６２)、ヒト乳腺癌(ＭＤＡ．ＭＢ ４３５およびその肺転移性誘導体であるｌｕｎｇ２およびｌｕｎｇ６)を含めたいくつかの細胞系で評価した。４種の化合物で処置した後７２時間で得られた細胞増殖阻害(ＭＴＴアッセイ)のＩＣ50値を表１に示す。
【００１６】
Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、処置後７２時間でのフローサイトメトリーＤＮＡ分析およびサブＧ１ピーク検出によって決定されたように、ＨＴ２９細胞にアポトーシスを誘導することができた。これに対し、サブＧ１ピークは、Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃで処置した細胞では観察されなかった(図２)。この観察はＨＴ２９細胞だけに限定されるものではなかった。Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、ＨＴ２９およびＭＤＡ.ＭＢ.４３５ ｌｕｎｇ２誘導体細胞で最高のアポトーシス(５０〜７０％)を誘導した(図３.Ａ)。腺癌ＬｏＶｏ細胞、ＭＤＡ.ＭＢ.４３５、およびそのｌｕｎｇ６誘導体は約２０〜３０％のアポトーシスを示したのに対し、Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃはアポトーシスを示さなかった。
【００１７】
ＨＴ２９細胞を、高用量のＮ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで７２時間処置し、サブＧ１ピークをフローサイトメトリーで検出した。図３.Ｂに示すように、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０でＨＴ２９を処置した結果、用量依存性のアポトーシスが生じた。
【００１８】
Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃのアポトーシスの特徴を検出するために、時間経過分析を実施した(図４.Ａ)。アポトーシスは、すでに４８時間後にＨＴ２９処置の細胞で著しく、７２時間でアッセイを行った最高用量で最大に到達し、Ｎ１０−１３−１０Ｃの場合で２０％、Ｎ１３−１３−１０Ｃの場合で約４０％であった。さらに、どちらの化合物も単独で、培養から２４時間後にＧ１期の細胞のパーセンテージが上昇したように見えるが、Ｇ２/Ｍの蓄積は時間が経過しても観察されなかった。しかし、低用量のタキソールとの併用では、Ｎ−１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで処置した細胞集団の約６０％がＧ２/Ｍ期で保持され、タキソール単独の場合と比べても高いパーセンテージであった。これは、タキソールの抗増殖作用に比べ、ＨＴ２９細胞に対するＮ１３−１３−１０Ｃの作用が強化されたことを説明している(図１)。
【００１９】
ＤＮＡ染色の分析は、Ｎ１３−１３−１０ＣまたはＮ１０−１３−１０Ｃで処置したＨＴ２９細胞に関し、複数の時間パルスで実施した。次いで細胞を、薬物無しで最長７２時間、培地に戻した。図４.Ｂに示すように、アポトーシスの不可逆的誘導を引き起こすには、最短で２４時間のＮ１３−１３−１０Ｃのパルスが必要であった。Ｎ１３−１３−１０Ｃにより、１時間、３時間、および６時間という短い時間パルスで処置した細胞は、対照細胞と異ならない細胞周期プロフィルを示す。
【００２０】
アポトーシスの初期事象は、アネキシンＶ、すなわちホスファチジルセリンに対して親和性の高いリン脂質結合タンパク質を介してモニタすることのできる、原形質膜の内部小葉から外部小葉へのホスファチジルセリンの転座である。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ検出アッセイを実施して、Ｎ１３−１３−１０ＣによりＨＴ２９細胞に誘導された初期アポトーシスの発症を確認した。アネキシンＶ検出の時間経過分析によれば、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)で処置してから４０時間後、初期アポトーシス細胞(ＩＰ陰性、アネキシンＶ陽性)が１４％であることが示された。これは、対照細胞に比べて３．５倍の増加であることを表し、タキソール処置をした細胞と類似している(図５)。
【００２１】
様々なストレス要因に応答してアポトーシスを活性化するために、ＪＮＫが細胞内シグナルを仲介することがすでに報告されているので(Tournier他、2000；Xia他、1995；Minden A.およびKarin,M.、1997：lp,Y.およびDavis,R.J.、1998；Chen他、1996；Johnson他、1996；Verheij他、1996；Park他、1997)、ＨＴ２９細胞は、Ｎ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで処置されてきた。ウェスタンブロット分析では、ＪＮＫ−リン酸化特異的抗体と共にブロットをインキュベーションした後に観察されるように、３〜６時間後にＪＮＫが活性化することが明らかになった(図６Ａ)。
【００２２】
抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質は、シトクロームｃの遊離をミトコンドリアから守り、それによって細胞の生存を保つことが、当技術分野で知られている。一方タキソールは、微小管安定化剤であり、Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−２のＪＮＫ依存性リン酸化を誘導することが記述されている(Razandi他、2000；Srivastava他、1999)。そのようなリン酸化は、抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質の不活性化を仲介する。Ｎ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃ単独で、あるいはタキソールと併用して処置したＨＴ２９細胞において、ＪＮＫの活性化が、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質の１種であるＢｃｌ−ｘLのリン酸化に関係するのかを評価するために、経時分析を行った。タキソールで処置したＨＴ２９細胞抽出物では、ゆっくりと移行するバンドが検出されたが、これはリン酸化したｂｃｌ−ｘLに対応するものであった。この作用は、Ｎ１０−１３−１０Ｃで処置した細胞では観察されなかった(図６.Ｂ)。さらに、タキソールと併用した場合、Ｎ１０−１３−１０Ｃによる処置は、タキソールで誘導されたＢｃｌ−ｘL過剰リン酸化を妨げなかった。これと同じパターンがＮ１３−１３−１０Ｃで処置した細胞で観察された(データは図示せず）。Ｂａｘ、すなわちｂｃｌファミリーのプロアポトーシスの一種は、ＨＴ２９細胞をＮ１０−１３−１０Ｃおよび／またはタキソールに曝露した後に増加しなかった。
【００２３】
すでに述べたように、Ｎ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで処置した細胞では、２４時間後にＧ０/Ｇ１期の細胞のわずかな増加が観察されたが(図４.Ａ)、この作用は、細胞周期の特定のチェックポイントでの細胞停止に起因すると予測される。実験的に、この発見は、同調細胞を持つ細胞モデルで化合物を分析することにより立証された。Ｔ９８ｇ細胞は、７２時間後、ＭＣＤＢ １０５培地中の血清飢餓により、Ｇ１期で停止した(８２％)。１０％の血清を再び添加すると、細胞は細胞周期に再び入ることが可能になった。ＦＣＳ導入から１９時間後、細胞の５０％を超える量がＳ期にあり、わずか２０％がＧ１に残った。血清添加時にＮ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃを培養物に添加すると、Ｓ期進入が抑制された(図７.Ａ)。細胞の約４０％がＧ１に残った。結論として、Ｎ１０−１３−１０ＣとＮ１３−１３−１０Ｃの両方は、細胞周期ＤＮＡ分析によって決定されたように、非同調または同調の細胞培養でＧ１停止を引き起こすことができた。比較すると、ｃｄｋ２阻害剤であるオロムチンはＧ１で細胞の８０％を保持していた。トポイソメラーゼII型阻害剤エトポシドで処置した細胞は細胞周期のＳ期で停止した(細胞集団の８５％)。タキソールはＧ２／Ｍ停止を誘導するので、その動作はＧ１／Ｓチェックポイントと無関係であり、処置から１９時間後に細胞周期プロフィルをもたらさない。
【００２４】
細胞周期のＧ１停止を確認するために、本発明者等はＢｒｄＵ取込みアッセイによってＤＮＡ合成を分析した。化合物Ｎ４−１３−１０Ｃ、Ｎ５−１３−１０Ｃ、Ｎ１０−１３−１０Ｃ、Ｎ１３−１３−１０Ｃ、エトポシド、またはオロムチンの連続希釈物について、図７.Ａに示すように、同調Ｔ９８ｇ細胞でアッセイを行った。停止細胞は、血清を単独でまたは試験化合物と共に再び添加することによって、１７時間、細胞周期に再進入させ、その後２時間、１０μＭ ＢｒｄＵと組み合わせた。図７.ＢおよびＣに示すように、オロムチンはＢｒｄＵ取込みの非常に強力な阻害剤であり(ＩＣ50＝５０μＭ)、ＤＮＡ染色により観察されたＧ１期の８２％の細胞と相関している(図７.Ａ)。ＤＮＡ合成阻害の順位は、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(ＩＣ50＝１５０μＭ)、Ｎ１０−１３−１０Ｃ(ＩＣ50＝１００μＭ)、エトポシド(ＩＣ50＝２００μＭ)の順である。Ｎ５−１３−１０Ｃはある程度までＢｒｄＵ取込みを阻害するが(１８０μＭで３０％)、Ｎ４−１３−１０Ｃは阻害しない。
【００２５】
細胞周期の進行は、いくつかのメカニズム全体を通してその制御を維持し、その１つでは、網膜芽細胞腫ｐＲｂなどのチェックポイントタンパク質が関係する。ｐＲｂ、ｐ１３０、およびｐ１０７は、いわゆるポケットタンパク質ファミリーを構成するが、結局ｐＲｂだけが、Ｇ１／Ｓチェックポイント制御の中心である(Harrington他、1998）。その非リン酸化形態では、ｐＲｂは、Ｅ２Ｆ、すなわちＳ期進行に必要不可欠な遺伝子の転写を制御する転写因子に結合し、これを抑圧する。分裂促進的刺激の後、ｐＲｂは、サイクリンＤ／ｃｄｋ４によって部分的にリン酸化し、サイクリンＥの発現に十分なＥ２Ｆを遊離する。さらに、サイクリンＥ／ｃｄｋ２はｐＲｂを完全にリン酸化し、遊離Ｅ２Ｆを放出し、Ｓ期へのＥ２Ｆ依存的進行を促進させる。
【００２６】
Ｎ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで処置した細胞によって誘導されたＧ１停止の分析では、ｐＲｂのリン酸化状態が注目された。Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃ ＨＴ２９処置済み細胞の、ｐＲｂ発現の時間経過分析は、ウェスタンブロットによって行った。本発明者等は、Ｓｅｒ780でのｐＲｂの特異的ｃｙｃＤ１/ｃｄｋ４リン酸化について分析した(Kitagawa他、1996)。このＳｅｒ780でのｐＲｂリン酸化は、全体的なｐＲｂレベルに比べ、Ｎ１３−１３−１０ＣでＨＴ２９細胞を処置した後に低下しなかった(図８.Ａ)。この結果は、ｃｙｃＤ１/ｃｄｋ４活性が損なわれず、ｃｙｃＥ/Ｃｄｋ２活性がある程度まで阻害されることを示すと考えられる。さらに、ｐＲｂレベルは、培養から２４時間後、対照の場合よりも化合物で処置した細胞の場合に低下した。
【００２７】
同調Ｔ９８ｇ細胞上のＮ１３−１３−１０Ｃおよびタキソールが、ポケットタンパク質、サイクリン、およびＣｄｋのタンパク質発現に及ぼす影響は、Ｇ１チェックポイントに関係していた。図８.Ａに示すＨＴ２９細胞では、Ｔ９８ｇ細胞をＮ１３−１３−１０Ｃで処置することによって、ｐＲｂ過剰リン酸化が妨げられ、全体的なｐＲｂレベルが低下した(図８.Ｂ)。一方、ｐ１３０も低リン酸化状態のままであるが、全体的なレベルは上昇する。最後にｐ１０７レベルのダウンレギュレーションが行われる。ｃｙｃＡ、ｐ１０７、およびｐＲｂなどのＥ２Ｆ制御遺伝子の発現は、ダウンレギュレーションされる。ｐＲｂリン酸化の時間経過は、ｃｙｃＥ/Ｃｄｋ２活性の阻害によるＧ０/Ｇ１停止と十分相関している。ｐＲｂのダウンレギュレーションはアポトーシスと相関する。
【００２８】
３μＭまたは３０μＭのＮ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃの存在下、ｃｙｃＤ、Ｃｄｋ４、およびｐＲｂタンパク質を含む33Ｐａｎ Ｑｉｎａｓｅアッセイを行った。そのようなアッセイでは、ｐＲｂ低リン酸化の阻害が観察されず、ｃｙｃＤ/Ｃｄｋ４活性がＮ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃの影響を受けないことが確認された(図８.Ａ)。
【００２９】
本発明者等は、ｃｙｃＡタンパク質レベルおよびｐＲｂリン酸化が、Ｎ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで処置した細胞の細胞抽出物で低下することを観察した(図８)。これらの化合物が、Ｃｄｋ２活性の直接阻害剤であるかどうかを評価するために、Ｃｄｋ２に関するin vitro キナーゼアッセイを行った。どちらの化合物も、３μＭまたは３０μＭでｃｙｃＡ−Ｃｄｋ２キナーゼ活性を阻害することはできなかった。
【００３０】
タンパク質のリン酸化および細胞周期の進行を促進させるため、サイクリンによる活性化と共にＴｙｒ/Ｔｈｒ残基のリン酸化では、Ｃｄｋが必要であることが当技術分野で知られている。Ｃｙｃ/Ｃｄｋ活性は、Ｐ１５INK4bやｐ１６INK4a、ｐ２１Cip1、ｐ２７KIP1などのＣＫＩによって、負に調節される(Sherr, C.J.およびRoberts, J.M．、1995)。本発明者等は、Ｇ１/Ｓ移行チェックポイントで細胞の進入を制御することが知られているｐ２１Cip1およびｐ２７kip1のレベルを、ウェスタンブロットによって分析した(図８.Ｂ)。ｐ２７kip1およびｐ２１Cip1はどちらも、アセンブリＣｄｋ４−６/ＣｙｃＤ複合体の増強剤であると記述されている(LaBaer他、1997)。一方、ｐ２７kip1およびｐ２１Cip1は、全てのＣｄｋ２複合体の強力な阻害剤であり、１分子のｐ２１Cip1は、これら複合体の活性を完全に阻害するのに十分である(Hengst他、1998；Adkins他、2000)。正常な細胞では、Ｇ０期中はｐ２７kip1の量が高いが、ＴＧＦ□やｐ５３、またはＡＭＰｃなどの特定の分裂促進因子によって引き起こされたＧ１/Ｓ期への再進入によって、その量は急速に減少する(Poon、R.Y.他、1995)。ｐ２７kip1の強制発現の結果、Ｇ１期で細胞停止になる(Polyak, K.他、1994；Toyoshima, H.およびHunter, T.、1994）。ウェスタンブロットによれば、Ｔ９８ｇ細胞でのＮ１３−１３−１０Ｃによる処置の１５時間後、ｐ２７kip1の誘導がかなりのものであることが明らかになったが、これは、低リン酸化したｐＲｂの検出と並行したものである。
【００３１】
ｐ２１Cip1の分析は、Ｎ１３−１３−１０Ｃによる処置の１７時間後、ピークレベルを示した。ｐ２１Cip1およびｐ２７kip1の過剰発現は、Ｎ１３−１３−１０Ｃで２４時間処置し、また４８時間(図８.Ｃ.)処置したＨＴ２９細胞でも観察された。ｐ２１Cip1は、ｐ５３の下流媒介物でもあり(Haapajarvi他、1999)、ＨＴ２９細胞が変異したｐ５３を含み、Ｔ９８ｇ細胞はｐ５３の野生型なので；ｐ２１Cip1発現の誘導はｐ５３に無関係であることを示している。さらに、ｐ５３のレベルは、Ｎ１３−１３−１０Ｃによる処置の後に変化しない。
【００３２】
(その他の実施例)
Ｎ−アルキルグリシンのライブラリの合成。６６種の制御された混合物中、10,648個の化合物のライブラリを、固相中、位置走査フォーマットを使用して合成した。２２種の市販されている第１級アミンを集めたものを使用して、このライブラリに所望の化学的多様性を導入した。この合成の詳細は他の箇所で述べる(WO0228885)。簡単に言うと、リンクアミド樹脂(Rapp Polymere、０．７ミリ当量)から開始し、８ステップ合成経路では、Ｆｍｏｃ保護基の初期遊離を行った。次いで、塩化クロロアセチルとのアシル化の後、特定の第１級アミンまたは２２種のアミンの等モル混合物を使用して、クロロメチル中間体の対応するアミノ化を行う連続ステップを、必要に応じて実施した。これらの反応の全ては二重に行った。最後に、トリフルオロ酢酸−ジクロロメタン−水の混合物を使用して、生成物を樹脂から引き離し、溶媒を蒸発させ、残留物を凍結乾燥し、１０％ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に１０ｍｇ/ｍｌの濃度で溶解して、スクリーニングにかけた。
【００３３】
Ｎ１３−１３−１０ＣおよびＮ１０−１３−１０Ｃの合成。これらの化合物は、ポリスチレンリンクアミドＡＭ ＲＡＭ樹脂を固体支持体として使用して(０．６ｇ、負荷０．７ｍｍｏｌ/ｇ、０．４２ｍｍｏｌ)、１０ｍＬのポリプロピンレンシリンジ内で合成した。脱保護：樹脂を膨潤させた後、ピペリジンの２０％ＤＭＦ(ジメチルホルムアミド)溶液５ｍＬを含有する溶液を添加し、この混合物を２５℃で３０分間撹拌した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ(３×５ｍＬ)、ｉＰｒＯＨ(３×５ｍＬ)、およびＤＣＭ(ジクロロメタン)(３×５ｍＬ)で洗浄した。アシル化：樹脂を、クロロ酢酸(１９８ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ)およびＮ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(２．１ｍｍｏｌ)を５ｍＬのＤＣＭ−ＤＭＦ(２:１)に溶かした溶液で処理した。反応混合物を、室温で３０分間撹拌し、濾過した。樹脂の液分を除去し、ＤＣＭ(３×５ｍＬ)、ｉＰｒＯＨ(３×５ｍＬ)、およびＤＭＦ(３×５ｍＬ)で洗浄した。アミンのカップリング:フェネチルアミン(２．１ｍｍｏｌ)およびトリエチルアミン(２．１ｍｍｏｌ)を５ｍｌのＤＭＦに溶かした溶液を、樹脂に添加し、その懸濁液を２５℃で３時間撹拌した。上澄みを除去し、混合物の液分を除去して、ＤＭＦ(３×３ｍＬ)、ｉＰｒＯＨ(３×３ｍＬ)、およびＣＨ2Ｃｌ2(３×３ｍＬ)で洗浄した。第２および第３のアシル化ステップと、アミンのカップリングを、上述のように実施した。これら２種のアミンのカップリングは、Ｎ１３−１３−１０Ｃの場合は４−メトキシフェネチルアミン(２．１ｍｍｏｌ)を使用して、またＮ１０−１３−１０Ｃの場合は第３のアミノ化ステップでフェネチルアミンを使用して実施した。切断：樹脂を、２５℃で３０分間、６０:４０:２(ｖ/ｖ/ｖ)ＴＦＡ/ＤＣＭ/Ｈ2Ｏの混合物で処理した。切断混合物を濾過し、合わせた濾液を貯めて、溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去した。上記プロセスの全ては二重に実施した。
【００３４】
分析および構造データ
分析は、Kromasil 100 Ｃ８(15×0.46ｃｍ、５μｍ)カラムを使用して、流量１ｍｌ/分の高速液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)によって行った。溶媒Ａは、0.07％ＴＦＡ(トリフルオロ酢酸)を含有するアセトニトリル(ＣＨ3ＣＮ)からなり、溶媒Ｂは、Ｈ2Ｏに0.1％のＴＦＡを溶かしたものであった。分析条件は、２分で２０％溶媒Ａ、１７分で２０〜８０％、１分で８０％溶媒Ａ、流量１ｍｌ/分およびλ２２０ｎｍで設定した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
【表２】
【００３７】
細胞。ＨＴ２９およびＬｏＶｏ(ヒト結腸腺癌)およびＭＤＡ.ＭＢ.４３５細胞と、これらの誘導体であるＭＤＡ.ＭＢ.４３５Ｌｕｎｇ２およびＭＤＡ.ＭＢ．４３５ Ｌｕｎｇ６(ヒト乳腺癌)細胞を、ウシ胎児血清(ＦＣＳ)１０％を含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地で培養した。ヒトグリア芽細胞腫Ｔ９８ｇおよび慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地で増殖させた。全ての細胞は、その指数増殖期にあるものを使用し、ＥＺ−ＰＣＲマイコプラズマ試験キット(Biological Industries)を用いてマイコプラズマが無いかどうか試験をした。
【００３８】
細胞アッセイ。ＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞を用いた細胞増殖アッセイで、コンビナトリアルライブラリをスクリーニングした。化合物は、単独で、または低用量のタキソール(ｎＭ)と共に試験をした。培養から３日後、細胞生存度をＭＴＴアッセイ(３−４,５−ジメチル−２−チアゾリル−２,５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド)により測定した。ＭＴＴを、細胞培養物中に、１ｍｇ/ｍｌの最終濃度で添加し、３７℃で４時間インキュベーションした後、１５％ＳＤＳ/ＤＭＦ(ｖ/ｖ）を用いて細胞溶解を行った。５７０ｎｍでのＭＴＴ−ホルマザンと、６３０ｎｍでの参照フィルタの分光光度測定により、細胞生存度を定量した。化合物だけに起因する増殖阻害を、タキソールおよび化合物で処置した培養物で観察された阻害と比較した。
【００３９】
アネキシンＶアッセイ。処理した細胞を、ＥＤＴＡ 0.02％を溶かしたハンクス液(ＨＢＳＳ)により収集し、ＨＢＳＳで洗浄し、次いで１％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)を含有するＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩液)で洗浄し、最後に、１％ＢＳＡを含有するアネキシンＶインキュベーション緩衝液(１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ７．４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；２．５ｍＭ ＣａＣｌ2)に再懸濁した。１０5個の細胞を、５μｌのアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ(Bender MedSystems)と共に室温で１時間、暗所でインキュベートした。死細胞を２μｇ/ｍｌのヨウ化プロピジウム(ＰＩ)で染色した。分析はフローサイトメトリーによって直ちに行った。
【００４０】
ＤＮＡ分析。化合物で処理した浮遊細胞および付着細胞を、トリプシン処理によって収集し、ＰＢＳで２回洗浄した。これらの細胞を、氷冷した７０％エタノールを用いて−２０℃で一晩、透過化処理した。これらの細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、０．５×１０6細胞/ｍｌに調節し、２０μｇ/ｍｌのヨウ化プロピジウムおよび２μｍ/ｍｌのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリーで３０分間、３７℃でインキュベートした。細胞を、４℃で一晩維持し、次いでフローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリー実験は、Ｅｐｉｃｓ ＸＬフローサイトメータ(Coulter Corporation、Hialeah、フロリダ州)を使用して実施した。機器は標準的な構成で設定した。サンプルの励起は、出力１５ｍＷの標準的な４８８ｎｍ空冷アルゴンイオンレーザを使用して行った。ＰＩの前方散乱(ＦＳＣ)、側方散乱(ＳＳＣ)、および赤色(６２０ｎｍ)蛍光が得られた。光学調節は、１０ｎｍ蛍光ビーズ(Immunocheck、Epics Division)からの最適化シグナルを基にした。時間は、機器の安定性の管理として使用した。赤色蛍光を、1024モノパラメトリックヒストグラムに投影した。凝集体は、ピーク蛍光シグナルに対してその領域の近くの単細胞をゲート処理することにより、排除した。単一蛍光ヒストグラムに関するＤＮＡ分析(Ploidy分析)は、Multicycleソフトウェア(Phoenix Flow Systems、San Diego、Ca)を使用して行った。
【００４１】
ウェスタンブロット法。浮遊細胞および付着細胞を収集し、ペレットを、ＲＩＰＡ緩衝液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ７．４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ６３０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ/ｍｌロイペプチン、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4)またはデオキシコール酸緩衝液(１０ｍＭ リン酸緩衝液７．４、０．１ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％デオキシコレート、１％ Ｉｇｅｐａｌ、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＰＭＳＦ)に再懸濁した。タンパク質の濃度は、ＲＩＰＡ抽出物に関してはＢＣＡタンパク質アッセイキット(Pierce)で、デオキシコレート抽出物に関してはブラッドフォードアッセイ(BioRad)で決定した。全タンパク質(２０〜３０μｇ/レーン)を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜(Gellman)に移し、Ｂｃｌ−ｘL(Transduction)；Ｂａｘ(Santa Cruz)；ＪＮＫ(Santa Cruz)；ホスホ−ＪＮＫ（Cell Signaling）；ｐＲｂ(Pharmingen)；ｐＲｂ−ホスホＳｅｒ７８０(Cell signalling)；ｐ１３０(Santa Cruz)；ｐ１０７(Santa Cruz)；Ｃｄｋ２(Santa Cruz)；ｐ２７Kip1(Santa Cruz)；ｐ２１Cip1（Santa Cruz）；アクチン(Sigma)；またはチューブリン(ＩＣＮ）に対する抗体でプローブし、ＥＣＬシステム(Amercham Pharmacia biotech)で進化させた。
【００４２】
ＢｒｄＵアッセイ。マイクロタイタープレート中、5000細胞/ウェルのＴ９８ｇグリア芽腫細胞を、ＭＣＤＢ １０５培地の血清欠乏状態によって７２時間、Ｇ１期で停止させた。血清(１０％)の再添加により、細胞を、連続希釈した化合物で１７時間処理し、その後、１０μＭ ＢｒｄＵと２時間半一緒にした。ＢｒｄＵの取込み、すなわちＤＮＡの合成は、製造業者が述べるように、細胞増殖ＥＬＩＳＡシステムのバージョン２(AmershamPharmacia biotech)で定量した。
【００４３】
Ｃｄｋ２／ＣｙｃＡ−Ｅキナーゼ活性の試験をするためのキナーゼアッセイ。ＥＬＩＳＡプレートを、２００μｌの遮断溶液(１％ＢＳＡ、0.02％ Ｔｗｅｅｎ、および0.02％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ)で一晩、４℃で遮断した。次いでプレートを、続けて３回、それぞれ５分ずつ、１００μｌの洗浄溶液(0.02％ Ｔｗｅｅｎおよび0.02％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ)で洗浄した。次いでプレートを室温で２〜４時間乾燥した。キナーゼアッセイは、ヒストンＨ1 ４μｇ、３０μＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＤＴＴ、ＡＴＰ−Ｐ32 ０．１μｌ、８００ｎＭ ＧＳＴ−ＣＤＫ２、および８００ｎＭ ＧＳＴ−サイクリンＡを含有して最終体積が６０μｌになるキナーゼ緩衝液(Ｈｅｐｅｓ ２５ｍＭ ｐＨ７．４ およびＭｇＣｌ2 １０ｍＭ)中で行った。アッセイは、チェックされるペプチド混合物を種々の濃度で含み、または含まない状態で実施した。阻害の制御は、反応媒体に８００ｎＭのｐ２１を添加して行った。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、各混合物５０μｌをドットブロット装置内に配置したニトロセルロース膜に濾過した。次いでサンプルを、２００μｌのキナーゼ緩衝液で洗浄し、次いで３５μｌの１０％ ＴＣＡで洗浄し、最後に２回、１００μｌの１０％ＴＣＡの後に１００μｌのＨ2Ｏで洗浄した。このプロセスの後、膜を室温で乾燥した。膜に関連する放射能を「Phosphor-imager(蛍リン光体イメージャ)」で検出した。
【００４４】
Ｃｄｋ４／ＣｙｃＤ１キナーゼ活性のアッセイを行うため、バキュロウイルス発現系を用いて組換えＧＳＴ−融合タンパク質としてＳｆ９昆虫細胞内にＣｄｋ４を発現させた。キナーゼアッセイは、33ＰａｎＱｉｎａｓｅ活性アッセイ(ProQinase)およびベックマンコールター／Sagianロボットシステムを使用し、９６ウェルフラッシュプレート(ＮＥＮ)で、５０μｌ反応体積中で行った。反応カクテルは、アッセイ緩衝液２０ｕｌ(５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ-ＮａＯＨ ｐＨ７．５、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、３μＭ ＭｎＣｌ2、３μＭ オルトバナジン酸Ｎａ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１μＭ (33Ｐ)-ｄＡＴＰ)；ｐＲｂタンパク質１μｇ；酵素１００ｎｇ；および試験化合物の１０％ＤＭＳＯ溶液５μｌであった。この反応カクテルを、３０℃で８０分間インキュベートした。反応を、５０μｌの０．２％(ｖ/ｖ)Ｈ3ＰＯ4で停止させ、プレートを吸引し、０．９％(ｗ/ｖ)ＮａＣｌで２回洗浄した。33Ｐの取込みは、マイクロプレートシンチレーションカウンタ(Microbeta、Wallac)で決定した。
【００４５】
図の説明
図１で、化合物Ｎ１０−１３−１０Ｃ、Ｎ１３−１３−１０Ｃ、Ｎ４−１３−１０Ｃ、およびＮ５−１３−１０Ｃは、ＨＴ２９増殖を阻害する。タキソールは、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃの作用を妨げる。(Ａ、Ｂ)ＨＴ２９細胞を、タキソール(１１ｎＭ)と共に、またはタキソール無しで、いくつかの濃度のペプトイドで増殖させた。ＭＴＴアッセイを処理から７２時間後に行った。増殖の阻害は、対照細胞の増殖と比較したＮ４−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃ(Ａ.)、Ｎ５−１３−１０ＣおよびＮ１０−１３−１０Ｃ(Ｂ.)で示されている。ＩＣ50値はペプトイドごとに指定される。Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、ＨＰＬＣによる精製ペプトイドであり、大部分の活性画分に相当する。Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０ＣペプトイドはＨＰＬＣで精製しなかった。(Ｃ)ＨＴ２９細胞を、タキソール単独あるいはＩＣ50値のＮ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)またはＮ１０−１３−１０Ｃ(４０μＭ)と組み合わせて連続希釈したもので処理した。増殖を、処理から７２時間後にＭＴＴアッセイで評価した。１００％の任意の値を未処理の培養物の濃度測定速度に割り当て、その他全ての値をその基準に対して示した。これらの値は６回(ｎ=６)繰り返した平均である。
【００４６】
図２は、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃがプロアポトーシスペプトイドであり、一方、Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃがそうではない状態を示す図である。細胞周期プロフィルをＤＮＡ染色によって分析した。Ｎ４−１３−１０Ｃ(１００μＭ）、Ｎ５−１３−１０Ｃ(１００μＭ)、Ｎ１０−１３−１０Ｃ(４０μＭ)、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)、タキソール(１１ｎＭ)、または対照としてＤＭＳＯの存在下、ＨＴ２９細胞を７２時間増殖させた。Ｇ０/Ｇ１、Ｓ、Ｇ２/Ｍ、またはサブＧ１ピークでの細胞の画分を特定した。
【００４７】
図３は、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃの特異的なプロアポトーシス作用を示す図である。(Ａ)表１に明記したＩＣ50値でのＮ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで処理した７２時間後の、ＨＴ２９、ＬｏＶｏ、ＭＤＡ.ＭＢ.４３５、およびその肺転移性誘導体ｌｕｎｇ２およびｌｕｎｇ６を含んだいくつかの細胞系に関するサブＧ１ピーク分析である。(Ｂ)それぞれ１、５、１０、２０、３０、および３５、または４０μＭで、Ｎ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０ＣによりＨＴ２９細胞を処理した７２時間後の、サブＧ１ピークの用量反応分析。両方において、浮遊細胞および付着細胞を収集し、固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、ＤＮＡ含量をフローサイトメトリーにより評価した。低２倍体ＤＮＡ含量、すなわちサブＧ１ピークを有する細胞の画分を示す。
【００４８】
図４(Ａ)は、ＨＴ２９細胞をＮ１０−１３−１０Ｃ(４０μＭ)、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)、および／またはタキソール(１１ｎＭ)で２４時間、４８時間、および７２時間処理した後の、細胞周期プロフィルの時間経過分析を示す図である。サブＧ１(濃青色)、Ｇ０/Ｇ１(赤色)、Ｓ(黄色)、Ｇ２/Ｍ(青色)ＤＮＡ含量を有する細胞の画分を、全細胞集団の％として示す。図４(Ｂ)は、Ｎ１３−１３−１０Ｃパルス実験を示す図である。ＨＴ２９細胞を、３５μＭのＮ１３−１３−１０Ｃで１、３、６、２４、４８、または７２時間、過渡的に処理し、最長７２時間で、生成物無しで培地に戻した。ＤＮＡ染色をフローサイトメトリーによって分析した。
【００４９】
図５は、初期アポトーシスの検出を示す図である。ＤＭＳＯ(右パネル)、Ｎ１３−１３−１０Ｃ、３５μＭ(中央パネル)、またはタキソール、１１ｎＭ(左パネル)で処理してから４０時間後のアネキシンＶアッセイである。ＨＴ２９処理済み細胞を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩで染色し、フローサイトメトリーにかけた。アネキシンＶ陽性細胞(縦軸)およびＰＩ陽性細胞(横軸、対数値)の蛍光ドットブロットを示す。集団のパーセンテージとして表した細胞分布を示す。初期アポトーシス細胞は第１象限、Ｑ１(ＡｎＶ＋/ＩＰ−)；死細胞はＱ２(ＡｎＶ＋/ＩＰ＋)；生細胞はＱ３(ＡｎＶ−/ＩＰ−)；壊死細胞はＱ４(ＡｎＶ−/ＩＰ＋)にある。
【００５０】
図６(Ａ)は、ＪＮＫが、Ｎ１３−１３−１０Ｃで処理した後に活性化する状態を示す。ＨＴ２９細胞を、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)で１、３、６、および２４時間処理し、収集し、免疫ブロットして、ＳＡＰ/ＪＮＫ ＭＡＰキナーゼの活性化を評価した。ウェスタンブロットは、最初にＪＮＫ蛍リン光体特異的抗体でプローブし、ストリップし、ｐａｎ−ＪＮＫ抗体およびアクチンで再びプローブして、全タンパク質レベルを標準化した。ＪＮＫのリン酸化は、Ｎ１３−１３−１０Ｃで処理してから３〜６時間後に観察された。図６(Ｂ）は、Ｂｃｌ−ｘＬが、Ｎ１０−１３−１０Ｃでの処置後に、リン酸化によって翻訳後修飾されない状態を示す。ＨＴ２９細胞を、Ｎ１０−１３−１０Ｃ(４０μＭ）、タキソール(１１ｎＭ）、またはこれら両方の組合せで３、６、および２４時間処理した。浮遊細胞および付着細胞からの抽出物を、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｘ、およびアクチンに対して免疫ブロットして、全タンパク質負荷を標準化した。
【００５１】
図７は、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０ＣがＧ１細胞周期停止を誘導するが、Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃは誘導しない状態を示す。(Ａ)Ｔ９８ｇ細胞を同調させ、ＦＣＳ単独、あるいはＮ１０−１３−１０Ｃ(１００μＭ)、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(１００μＭ)、オロムチン(１００μＭ)、エトポシド(５μＭ)、またはタキソール(３０ｎＭ)と組み合わせて１９時間、再初期化した。細胞周期プロフィルを、ヨウ化プロピジウムＤＮＡ染色によって評価し、フローサイトメトリーにより分析した。Ｇ１、Ｓ、Ｇ２/Ｍ ＤＮＡ含量を有する細胞の画分を、全細胞集団の％として示す。(ＢおよびＣ)同調させたＴ９８ｇ細胞を、ＦＣＳ単独、あるいは連続希釈したＮ４−１３−１０Ｃ、Ｎ５−１３−１０Ｃ、Ｎ１０−１３−１０Ｃ、Ｎ１３−１３−１０Ｃ、オロムチン、またはエトポシドと組み合わせて１９時間、再初期化し、最後の２時間でＢｒｄＵにより標識した。ＢｒｄＵの取込みを、抗ＢｒｄＵ抗体を使用するＥＬＩＳＡによって評価した。１００％の任意の値を、未処理の培養物によるＤＮＡ合成の濃度測定測定速度に割り当て、その他の全ての値は、その基準に対して示した。これらの値は３回(ｎ=３)繰り返した平均である。
【００５２】
図８は、Ｇ０/Ｇ１チェックポイントに含まれるタンパク質の発現を示す図である。(Ａ)ＨＴ２９細胞を、Ｎ１０−１３−１０Ｃ(４０μＭ)またはＮ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)で１、３、６、および２４時間処理し、収集し、免疫ブロットして、全ｐＲｂレベル、またはｐＲｂ−Ｓｅｒ780(ＰｂＲｂ)でのＣｄｋ４特異的リン酸化を評価した。ウェスタンブロットは、最初にｐＲｂ−Ｓｅｒ780リン酸化特異的抗体でプローブし、ストリップし、ｐａｎ-ｐＲｂ抗体およびチューブリンで再びプローブして、全タンパク質レベルを標準化した。(Ｂ)Ｔ９８ｇ細胞を、血清飢餓により同調させ、１０％ＦＣＳおよびＤＭＳＯ(Ｃ)、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(１００μＭ)またはタキソール(３０ｎＭ)で、１５、１７、２４、または２９時間再初期化した。全タンパク質抽出物のウェスタンブロットは、ｐ１３０、ｐＲｂ、ｐ１０７、Ｃｄｋ２、ｃｙｃＡ、ｐ２７、ｐ２１、およびアクチンに対する抗体でプローブした。非リン酸化、低リン酸化、ならびに過剰リン酸化したｐＲｂが検出される(矢印)。(Ｃ)Ｎ１３−１３−１０Ｃ(４０μＭ）、または対照としてＤＭＳＯで、２４時間および４８時間処理したＨＴ２９細胞である。免疫ブロットは、Ｃｄｋ２、ｃｙｃＡ、ｐ２１、ｐ２７、およびアクチンに対する抗体で染色した。
【００５３】
表１で、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、ＨＴ２９、ＬｏＶｏ、Ｋ５６２、Ｔ９８ｇ、ＭＤＡ.ＭＢ.４３５、およびその肺転移性誘導体ｌｕｎｇ２およびｌｕｎｇ６を含んだヒト癌細胞系の一団に対し、増殖阻害性を有する状態を示す。細胞系ごとに処理後７２時間でＭＴＴアッセイを行うことにより、Ｎ１０−１３−１０Ｃ、Ｎ１３−１３−１０Ｃ、Ｎ４−１３−１０Ｃ、およびＮ５−１３−１０ＣのＩＣ50を決定した(ｎ.ｄ.と定められていない限り)。
【００５４】
(引用文献)
【００５５】
【表３】
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】化合物Ｎ１０−１３−１０Ｃ、Ｎ１３−１３−１０Ｃ、Ｎ４−１３−１０Ｃ、およびＮ５−１３−１０Ｃは、ＨＴ２９増殖を阻害する。
【図２】Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃがプロアポトーシスペプトイドであり、一方、Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃがそうではない状態を示す図である。
【図３】Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃの特異的なプロアポトーシス作用を示す図である。
【図４】(Ａ)は、ＨＴ２９細胞をＮ１０−１３−１０Ｃ(４０μＭ)、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)、および／またはタキソール(１１ｎＭ)で２４時間、４８時間、および７２時間処理した後の、細胞周期プロフィルの時間経過分析を示す図であり、(Ｂ)は、Ｎ１３−１３−１０Ｃパルス実験を示す図である。
【図５】初期アポトーシスの検出を示す図である。
【図６】(Ａ)は、ＪＮＫが、Ｎ１３−１３−１０Ｃで処理した後に活性化する状態を示し、(Ｂ)は、Ｂｃｌ−ｘＬが、Ｎ１０−１３−１０Ｃでの処置後に、リン酸化によって翻訳後修飾されない状態を示す。
【図７】Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０ＣがＧ１細胞周期停止を誘導するが、Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃは誘導しない状態を示す。
【図８】Ｇ０/Ｇ１チェックポイントに含まれるタンパク質の発現を示す図である。
【図９】表１は、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、ＨＴ２９、ＬｏＶｏ、Ｋ５６２、Ｔ９８ｇ、ＭＤＡ.ＭＢ.４３５、およびその肺転移性誘導体ｌｕｎｇ２およびｌｕｎｇ６を含んだヒト癌細胞系の一団に対し、増殖阻害性を有する状態を示す。
【技術分野】
【０００１】
(本発明の概要)
本発明は、Ｎ−アルキルグリシンの三量体のライブラリのスクリーニングから得られた、本明細書中Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃと呼ばれる２種の擬似ペプチドの同定、合成、および精製に関する。これらの化合物は、細胞周期を停止させた後、ヒトの癌細胞にアポトーシスを誘導する能力を有する。
【０００２】
(現行技術)
細胞増殖は、細胞外増殖シグナル、細胞サイズ、およびＤＮＡの完全性を一体化する多数のチェックポイントに関与する、順序付けられかつ厳密に規制された過程である。体細胞周期は、ＤＮＡ合成期(Ｓ期)と、単一の細胞が２個の娘細胞に分裂する分裂期とに分けられる。これらの期は、２つのギャップ期(Ｇ１およびＧ２)によって切り離されている。
【０００３】
人体の細胞の大部分は、非分裂終末分化状態、すなわちＧ０期にある。しかし、増殖因子や細胞同士の接触、細胞外基質への付着など、適切な外部からの刺激によって、サイクリン依存性キナーゼ(Ｃｄｋ)の触媒活性が制御され、したがって複製開始点が形成される。特定のＣｄｋによるｐＲｂのリン酸化は、Ｅ２Ｆ／ＤＰとの結合を弱め、Ｇ１からＳ期への進行が可能になり(Chellappan，s.P.他、1991)、ｐ１５INK4b、ｐ１６INK4a、ｐ２１Cip1、およびｐ２７KIP1などのＣｄｋ阻害剤による負の制御を受ける(Sherr, C.J.およびRoberts, J.M.、1995)。ＤＮＡ合成が首尾よく終了した後、細胞はＧ２期に入って有糸分裂に備える。一旦開始したらＤＮＡ複製を終了しなければならない。Ｇ１制限点は、細胞周期を、増殖因子依存性の初期Ｇ１と、後期Ｇ１から有糸分裂までの増殖因子依存性の期とに分ける。シグナル伝達経路は、初期Ｇ１期細胞が制限点を通過して最終的な細胞分裂をするのか、またはシグナル伝達強度が不十分であるために細胞周期から出てＧ０期に入るのか、またはアポトーシスに入るのかを決定する。プロアポトーシスシグナルと抗アポトーシスシグナルとの全体的なバランスが、細胞の運命を決定する。
【０００４】
腫瘍細胞は、細胞喪失を最小限に抑え、すなわちアポトーシスを抑制し、かつ／または調節解除された増殖を高める恒常的メカニズムを乱す、遺伝的変化をもたらす。ヒト癌細胞の一般的な特徴は、ｐ１６の不活性化、サイクリンＤの過剰発現、および／またはｐＲｂの不活性化である(Hall, M.およびPeters, G.、1996）。腫瘍細胞および／または内皮細胞などの腫瘍増殖を支える非腫瘍細胞にアポトーシスを誘導することは、癌治療で最も重要な目標である。癌細胞は、アポトーシス機構のいくつかの構成要素における突然変異が原因で、通常はアポトーシスに対して抵抗力がある。
【０００５】
腫瘍学で現在使用されている最も広範にわたる抗腫瘍性スペクトルを持つ薬物の中にタキソールがある。タキソールは、微小管を安定化し、チューブリンに戻る解重合を阻害し、微小管動態の動力学的崩壊を引き起こすことによってＧ２／Ｍ期停止を誘導する。タキソールは、遺伝子転写(例えばｂａｘ、ｂａｋ)、サイクリン依存性キナーゼ、ｃ−ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ(ＪＮＫ／ＳＡＰＫ)、およびｂｃｌ−２のリン酸化の活性化を誘導する、まだ十分に記述されていないいくつかのメカニズムを通して、アポトーシスを誘導することもできる(Srivastava, R.K他、1999）。タキソールは、癌ならびに健常な細胞にもアポトーシスを誘導するので、深刻な副作用を持つ。
【０００６】
(発明の説明)
本発明の結果は、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃなどの化合物が、細胞周期およびアポトーシスの仕組みを調節することによって機能し、したがってこれらの化合物またはその誘導体は、癌の予防および／または処置薬として、またその他の増殖性疾患の処置薬として、好ましく使用できることを実証している。さらに、同定された化合物は、アポトーシス過程の導入に関与する別の分子標的の研究に、いくつかの手段を提供する。
【０００７】
２種の化合物、例えばＮ−アルキルグリシン三量体のコンビナトリアルライブラリのスクリーニングから得られたＮ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、Ｇ１停止を誘導し、アポトーシスを誘導することができた。
【０００８】
Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃ化合物は、ヒト結腸腺癌、ヒトグリア芽細胞腫、慢性骨髄性白血病、ヒト乳癌、および肺癌などの癌を示すヒト癌細胞系の一団に対し、増殖阻害特性を有する。同定された化合物は、フローサイトメトリーおよびアネキシンＶアッセイと組み合わせたＤＮＡ断片化によって決定されたように、アポトーシスの誘導原であると同定された。アポトーシスは化学療法薬が癌細胞の増殖を阻害する重要な細胞機能である。
【０００９】
より詳細には、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、血清飢餓によって、指数関数的に増殖する細胞またはＧ０／Ｇ１期で同調する細胞にＧ１細胞停止を誘導する。Ｎ１３−１３−１０Ｃによって誘導された細胞周期進行中のＧ１停止は、ｐＲｂおよびｐ１３０の過剰リン酸化の阻害に関連していた。さらに、ｐＲｂ、ｐ１０７、ｃｙｃＡ、およびその活性化パートナーＣｄｋ２のＥ２Ｆ依存性タンパク質発現に、著しい減少が観察された。最後に、ＣＫＩ、ｐ２１Cip1、およびｐ２７kip1の過剰発現が示された。ｐ２７kip1のレベルは、主にユビキチン−プロテオソーム経路によって制御されると考えられる(Hengst, L.およびReed, S.I．、1996；Shirane, L.他、1999)。特定のプロテアソーム阻害剤が新規な抗癌剤として作用する可能性については、現在徹底的に調査中であり、したがって、ｐ２７kip1の蓄積を説明し、かつＮ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃが働くメカニズムを定義するために、さらなる分析が行われる。ｐ２７kip1の発現は、広範な腫瘍スペクトルの診断で、非依存性予後因子であることが報告されている。ヒト腫瘍でのｐ２７kip1発現の減少または欠如は、様々な悪性腫瘍の病原力が高いこと、およびその予後が不十分であることに関連していた(Lloyd, R.V.他、1999；Karter他、2000)。ｐ２７kip1の異所性過剰発現は異種移植モデルで腫瘍の発生を誘導できなかったことに関係していた(Chen J.他、1996）。したがって、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは癌処置で最も重要な候補である。
【００１０】
その他の目標の中で、その他の効果の中でもタキソールの動作との相乗作用を示すことのできる化合物を同定するために、化合物を選択する初期スクリーンを考慮に入れた。選択されたアッセイでは、タキソール効果との相乗作用を示す化合物の混合物を同定することが可能であった。一部の混合物は細胞増殖の阻害剤であることがわかり、またタキソールと併用するとそのような阻害が妨害された。本発明では、細胞増殖を阻害し、血清飢餓によって指数関数的細胞およびＧ０／Ｇ１期で同調した細胞にＧ１細胞停止を誘導し、かつアポトーシスを誘導することのできる、化合物の同定について記述する。これらの化合物は抗癌剤と見なす好ましい治療プロフィルを有する。
【００１１】
細胞周期のＧ１停止を誘発する化合物は、指数関数的細胞とＧ０／Ｇ１同調細胞との両方で観察され、ｐＲｂおよびｐ１３０の低リン酸化と関係している。さらに、ｐＲｂ、ｐ１０７、ｃｙｃＡ、およびその活性化パートナーＣｄｋ２の、Ｅ２Ｆ依存性タンパク質発現の著しい減少が観察される。最後に、ｐ２１Cip1およびｐ２７kip1の付随的誘導が検出される。化合物のプロアポトーシス作用は、アネキシンＶ染色およびＤＮＡの低２倍性によって評価され、サブＧ１特異的であることが確認された。この化合物の別の特徴は、リン酸化によってｂｃｌ−ｘＬを不活性化しないことである。
【００１２】
10,648個の化合物を含むペプトイドライブラリのスクリーニングでは、Ｎ−アルキルグリシンオリゴマー分子(ペプトイド)の三量体の制御された混合物を、４つの位置的走査フォーマットで使用しかつ構成した。化学的多様性は、位置Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３を２２種の異なる第１級アミンで置換することによって導入した。Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３に応じて３つのサブグループに分割された６６種の制御された混合物は、位置を画定した。このライブラリを、細胞増殖アッセイで、ＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞によりスクリーニングした。化合物は、単独で、または低用量のタキソール(１１ｎＭ）と一緒に試験をした。培養から７２時間後、細胞生存度をＭＴＴアッセイで測定した。
【００１３】
一部の混合物は細胞増殖の阻害剤であることがわかったが、タキソールと併用するとそのような阻害はいくらか妨害された。用量反応曲線を作成し６種の混合物を同定した。４種の異なるアミンがＲ１の位置にあり、１種のアミンがＲ２の位置にあり、１種がＲ３の位置にある。次いで４種の化合物を合成し、符号化命名法により、Ｎ４−１３−１０Ｃ、Ｎ５−１３−１０Ｃ、Ｎ１０−１３−１０Ｃ、およびＮ１３−１３−１０Ｃと名付けた(Ｎ４、Ｎ５、Ｎ１０、およびＮ１３とも省略する)。これらはそのＮ末端残基が互いに異なっていた。４種の化合物は全て、試験系内の細胞増殖を阻害したが、タキソールは、Ｎ１０−１３−１０Ｃ(図１.Ｂ)およびＮ１３−１３−１０Ｃ(図１.Ａ)の場合のみその化合物の作用を妨げた。Ｎ１３−１３−１０Ｃは、ＩＣ50＝３５μＭの最も強力な増殖阻害剤であり、次いでＩＣ50＝４０μＭのＮ１０−１３−１０Ｃ、ＩＣ50＝１００μＭのＮ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃであった。
【００１４】
Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、それぞれのＩＣ50で連続希釈したタキソールと組み合わせてアッセイを行った場合、これらの化合物の抗増殖作用がタキソール単独の場合に比べて強化されたことが観察された(図１.Ｃ)。
【００１５】
これらの化合物によって誘導された増殖の阻害を、ヒト結腸腺癌(ＨＴ２９およびＬｏＶｏ)、ヒトグリア芽細胞腫(Ｔ９８ｇ)、慢性骨髄性白血病(Ｋ５６２)、ヒト乳腺癌(ＭＤＡ．ＭＢ ４３５およびその肺転移性誘導体であるｌｕｎｇ２およびｌｕｎｇ６)を含めたいくつかの細胞系で評価した。４種の化合物で処置した後７２時間で得られた細胞増殖阻害(ＭＴＴアッセイ)のＩＣ50値を表１に示す。
【００１６】
Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、処置後７２時間でのフローサイトメトリーＤＮＡ分析およびサブＧ１ピーク検出によって決定されたように、ＨＴ２９細胞にアポトーシスを誘導することができた。これに対し、サブＧ１ピークは、Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃで処置した細胞では観察されなかった(図２)。この観察はＨＴ２９細胞だけに限定されるものではなかった。Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、ＨＴ２９およびＭＤＡ.ＭＢ.４３５ ｌｕｎｇ２誘導体細胞で最高のアポトーシス(５０〜７０％)を誘導した(図３.Ａ)。腺癌ＬｏＶｏ細胞、ＭＤＡ.ＭＢ.４３５、およびそのｌｕｎｇ６誘導体は約２０〜３０％のアポトーシスを示したのに対し、Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃはアポトーシスを示さなかった。
【００１７】
ＨＴ２９細胞を、高用量のＮ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで７２時間処置し、サブＧ１ピークをフローサイトメトリーで検出した。図３.Ｂに示すように、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０でＨＴ２９を処置した結果、用量依存性のアポトーシスが生じた。
【００１８】
Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃのアポトーシスの特徴を検出するために、時間経過分析を実施した(図４.Ａ)。アポトーシスは、すでに４８時間後にＨＴ２９処置の細胞で著しく、７２時間でアッセイを行った最高用量で最大に到達し、Ｎ１０−１３−１０Ｃの場合で２０％、Ｎ１３−１３−１０Ｃの場合で約４０％であった。さらに、どちらの化合物も単独で、培養から２４時間後にＧ１期の細胞のパーセンテージが上昇したように見えるが、Ｇ２/Ｍの蓄積は時間が経過しても観察されなかった。しかし、低用量のタキソールとの併用では、Ｎ−１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで処置した細胞集団の約６０％がＧ２/Ｍ期で保持され、タキソール単独の場合と比べても高いパーセンテージであった。これは、タキソールの抗増殖作用に比べ、ＨＴ２９細胞に対するＮ１３−１３−１０Ｃの作用が強化されたことを説明している(図１)。
【００１９】
ＤＮＡ染色の分析は、Ｎ１３−１３−１０ＣまたはＮ１０−１３−１０Ｃで処置したＨＴ２９細胞に関し、複数の時間パルスで実施した。次いで細胞を、薬物無しで最長７２時間、培地に戻した。図４.Ｂに示すように、アポトーシスの不可逆的誘導を引き起こすには、最短で２４時間のＮ１３−１３−１０Ｃのパルスが必要であった。Ｎ１３−１３−１０Ｃにより、１時間、３時間、および６時間という短い時間パルスで処置した細胞は、対照細胞と異ならない細胞周期プロフィルを示す。
【００２０】
アポトーシスの初期事象は、アネキシンＶ、すなわちホスファチジルセリンに対して親和性の高いリン脂質結合タンパク質を介してモニタすることのできる、原形質膜の内部小葉から外部小葉へのホスファチジルセリンの転座である。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ検出アッセイを実施して、Ｎ１３−１３−１０ＣによりＨＴ２９細胞に誘導された初期アポトーシスの発症を確認した。アネキシンＶ検出の時間経過分析によれば、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)で処置してから４０時間後、初期アポトーシス細胞(ＩＰ陰性、アネキシンＶ陽性)が１４％であることが示された。これは、対照細胞に比べて３．５倍の増加であることを表し、タキソール処置をした細胞と類似している(図５)。
【００２１】
様々なストレス要因に応答してアポトーシスを活性化するために、ＪＮＫが細胞内シグナルを仲介することがすでに報告されているので(Tournier他、2000；Xia他、1995；Minden A.およびKarin,M.、1997：lp,Y.およびDavis,R.J.、1998；Chen他、1996；Johnson他、1996；Verheij他、1996；Park他、1997)、ＨＴ２９細胞は、Ｎ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで処置されてきた。ウェスタンブロット分析では、ＪＮＫ−リン酸化特異的抗体と共にブロットをインキュベーションした後に観察されるように、３〜６時間後にＪＮＫが活性化することが明らかになった(図６Ａ)。
【００２２】
抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質は、シトクロームｃの遊離をミトコンドリアから守り、それによって細胞の生存を保つことが、当技術分野で知られている。一方タキソールは、微小管安定化剤であり、Ｂｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−２のＪＮＫ依存性リン酸化を誘導することが記述されている(Razandi他、2000；Srivastava他、1999)。そのようなリン酸化は、抗アポトーシスＢｃｌ−２タンパク質の不活性化を仲介する。Ｎ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃ単独で、あるいはタキソールと併用して処置したＨＴ２９細胞において、ＪＮＫの活性化が、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質の１種であるＢｃｌ−ｘLのリン酸化に関係するのかを評価するために、経時分析を行った。タキソールで処置したＨＴ２９細胞抽出物では、ゆっくりと移行するバンドが検出されたが、これはリン酸化したｂｃｌ−ｘLに対応するものであった。この作用は、Ｎ１０−１３−１０Ｃで処置した細胞では観察されなかった(図６.Ｂ)。さらに、タキソールと併用した場合、Ｎ１０−１３−１０Ｃによる処置は、タキソールで誘導されたＢｃｌ−ｘL過剰リン酸化を妨げなかった。これと同じパターンがＮ１３−１３−１０Ｃで処置した細胞で観察された(データは図示せず）。Ｂａｘ、すなわちｂｃｌファミリーのプロアポトーシスの一種は、ＨＴ２９細胞をＮ１０−１３−１０Ｃおよび／またはタキソールに曝露した後に増加しなかった。
【００２３】
すでに述べたように、Ｎ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで処置した細胞では、２４時間後にＧ０/Ｇ１期の細胞のわずかな増加が観察されたが(図４.Ａ)、この作用は、細胞周期の特定のチェックポイントでの細胞停止に起因すると予測される。実験的に、この発見は、同調細胞を持つ細胞モデルで化合物を分析することにより立証された。Ｔ９８ｇ細胞は、７２時間後、ＭＣＤＢ １０５培地中の血清飢餓により、Ｇ１期で停止した(８２％)。１０％の血清を再び添加すると、細胞は細胞周期に再び入ることが可能になった。ＦＣＳ導入から１９時間後、細胞の５０％を超える量がＳ期にあり、わずか２０％がＧ１に残った。血清添加時にＮ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃを培養物に添加すると、Ｓ期進入が抑制された(図７.Ａ)。細胞の約４０％がＧ１に残った。結論として、Ｎ１０−１３−１０ＣとＮ１３−１３−１０Ｃの両方は、細胞周期ＤＮＡ分析によって決定されたように、非同調または同調の細胞培養でＧ１停止を引き起こすことができた。比較すると、ｃｄｋ２阻害剤であるオロムチンはＧ１で細胞の８０％を保持していた。トポイソメラーゼII型阻害剤エトポシドで処置した細胞は細胞周期のＳ期で停止した(細胞集団の８５％)。タキソールはＧ２／Ｍ停止を誘導するので、その動作はＧ１／Ｓチェックポイントと無関係であり、処置から１９時間後に細胞周期プロフィルをもたらさない。
【００２４】
細胞周期のＧ１停止を確認するために、本発明者等はＢｒｄＵ取込みアッセイによってＤＮＡ合成を分析した。化合物Ｎ４−１３−１０Ｃ、Ｎ５−１３−１０Ｃ、Ｎ１０−１３−１０Ｃ、Ｎ１３−１３−１０Ｃ、エトポシド、またはオロムチンの連続希釈物について、図７.Ａに示すように、同調Ｔ９８ｇ細胞でアッセイを行った。停止細胞は、血清を単独でまたは試験化合物と共に再び添加することによって、１７時間、細胞周期に再進入させ、その後２時間、１０μＭ ＢｒｄＵと組み合わせた。図７.ＢおよびＣに示すように、オロムチンはＢｒｄＵ取込みの非常に強力な阻害剤であり(ＩＣ50＝５０μＭ)、ＤＮＡ染色により観察されたＧ１期の８２％の細胞と相関している(図７.Ａ)。ＤＮＡ合成阻害の順位は、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(ＩＣ50＝１５０μＭ)、Ｎ１０−１３−１０Ｃ(ＩＣ50＝１００μＭ)、エトポシド(ＩＣ50＝２００μＭ)の順である。Ｎ５−１３−１０Ｃはある程度までＢｒｄＵ取込みを阻害するが(１８０μＭで３０％)、Ｎ４−１３−１０Ｃは阻害しない。
【００２５】
細胞周期の進行は、いくつかのメカニズム全体を通してその制御を維持し、その１つでは、網膜芽細胞腫ｐＲｂなどのチェックポイントタンパク質が関係する。ｐＲｂ、ｐ１３０、およびｐ１０７は、いわゆるポケットタンパク質ファミリーを構成するが、結局ｐＲｂだけが、Ｇ１／Ｓチェックポイント制御の中心である(Harrington他、1998）。その非リン酸化形態では、ｐＲｂは、Ｅ２Ｆ、すなわちＳ期進行に必要不可欠な遺伝子の転写を制御する転写因子に結合し、これを抑圧する。分裂促進的刺激の後、ｐＲｂは、サイクリンＤ／ｃｄｋ４によって部分的にリン酸化し、サイクリンＥの発現に十分なＥ２Ｆを遊離する。さらに、サイクリンＥ／ｃｄｋ２はｐＲｂを完全にリン酸化し、遊離Ｅ２Ｆを放出し、Ｓ期へのＥ２Ｆ依存的進行を促進させる。
【００２６】
Ｎ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで処置した細胞によって誘導されたＧ１停止の分析では、ｐＲｂのリン酸化状態が注目された。Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃ ＨＴ２９処置済み細胞の、ｐＲｂ発現の時間経過分析は、ウェスタンブロットによって行った。本発明者等は、Ｓｅｒ780でのｐＲｂの特異的ｃｙｃＤ１/ｃｄｋ４リン酸化について分析した(Kitagawa他、1996)。このＳｅｒ780でのｐＲｂリン酸化は、全体的なｐＲｂレベルに比べ、Ｎ１３−１３−１０ＣでＨＴ２９細胞を処置した後に低下しなかった(図８.Ａ)。この結果は、ｃｙｃＤ１/ｃｄｋ４活性が損なわれず、ｃｙｃＥ/Ｃｄｋ２活性がある程度まで阻害されることを示すと考えられる。さらに、ｐＲｂレベルは、培養から２４時間後、対照の場合よりも化合物で処置した細胞の場合に低下した。
【００２７】
同調Ｔ９８ｇ細胞上のＮ１３−１３−１０Ｃおよびタキソールが、ポケットタンパク質、サイクリン、およびＣｄｋのタンパク質発現に及ぼす影響は、Ｇ１チェックポイントに関係していた。図８.Ａに示すＨＴ２９細胞では、Ｔ９８ｇ細胞をＮ１３−１３−１０Ｃで処置することによって、ｐＲｂ過剰リン酸化が妨げられ、全体的なｐＲｂレベルが低下した(図８.Ｂ)。一方、ｐ１３０も低リン酸化状態のままであるが、全体的なレベルは上昇する。最後にｐ１０７レベルのダウンレギュレーションが行われる。ｃｙｃＡ、ｐ１０７、およびｐＲｂなどのＥ２Ｆ制御遺伝子の発現は、ダウンレギュレーションされる。ｐＲｂリン酸化の時間経過は、ｃｙｃＥ/Ｃｄｋ２活性の阻害によるＧ０/Ｇ１停止と十分相関している。ｐＲｂのダウンレギュレーションはアポトーシスと相関する。
【００２８】
３μＭまたは３０μＭのＮ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃの存在下、ｃｙｃＤ、Ｃｄｋ４、およびｐＲｂタンパク質を含む33Ｐａｎ Ｑｉｎａｓｅアッセイを行った。そのようなアッセイでは、ｐＲｂ低リン酸化の阻害が観察されず、ｃｙｃＤ/Ｃｄｋ４活性がＮ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃの影響を受けないことが確認された(図８.Ａ)。
【００２９】
本発明者等は、ｃｙｃＡタンパク質レベルおよびｐＲｂリン酸化が、Ｎ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで処置した細胞の細胞抽出物で低下することを観察した(図８)。これらの化合物が、Ｃｄｋ２活性の直接阻害剤であるかどうかを評価するために、Ｃｄｋ２に関するin vitro キナーゼアッセイを行った。どちらの化合物も、３μＭまたは３０μＭでｃｙｃＡ−Ｃｄｋ２キナーゼ活性を阻害することはできなかった。
【００３０】
タンパク質のリン酸化および細胞周期の進行を促進させるため、サイクリンによる活性化と共にＴｙｒ/Ｔｈｒ残基のリン酸化では、Ｃｄｋが必要であることが当技術分野で知られている。Ｃｙｃ/Ｃｄｋ活性は、Ｐ１５INK4bやｐ１６INK4a、ｐ２１Cip1、ｐ２７KIP1などのＣＫＩによって、負に調節される(Sherr, C.J.およびRoberts, J.M．、1995)。本発明者等は、Ｇ１/Ｓ移行チェックポイントで細胞の進入を制御することが知られているｐ２１Cip1およびｐ２７kip1のレベルを、ウェスタンブロットによって分析した(図８.Ｂ)。ｐ２７kip1およびｐ２１Cip1はどちらも、アセンブリＣｄｋ４−６/ＣｙｃＤ複合体の増強剤であると記述されている(LaBaer他、1997)。一方、ｐ２７kip1およびｐ２１Cip1は、全てのＣｄｋ２複合体の強力な阻害剤であり、１分子のｐ２１Cip1は、これら複合体の活性を完全に阻害するのに十分である(Hengst他、1998；Adkins他、2000)。正常な細胞では、Ｇ０期中はｐ２７kip1の量が高いが、ＴＧＦ□やｐ５３、またはＡＭＰｃなどの特定の分裂促進因子によって引き起こされたＧ１/Ｓ期への再進入によって、その量は急速に減少する(Poon、R.Y.他、1995)。ｐ２７kip1の強制発現の結果、Ｇ１期で細胞停止になる(Polyak, K.他、1994；Toyoshima, H.およびHunter, T.、1994）。ウェスタンブロットによれば、Ｔ９８ｇ細胞でのＮ１３−１３−１０Ｃによる処置の１５時間後、ｐ２７kip1の誘導がかなりのものであることが明らかになったが、これは、低リン酸化したｐＲｂの検出と並行したものである。
【００３１】
ｐ２１Cip1の分析は、Ｎ１３−１３−１０Ｃによる処置の１７時間後、ピークレベルを示した。ｐ２１Cip1およびｐ２７kip1の過剰発現は、Ｎ１３−１３−１０Ｃで２４時間処置し、また４８時間(図８.Ｃ.)処置したＨＴ２９細胞でも観察された。ｐ２１Cip1は、ｐ５３の下流媒介物でもあり(Haapajarvi他、1999)、ＨＴ２９細胞が変異したｐ５３を含み、Ｔ９８ｇ細胞はｐ５３の野生型なので；ｐ２１Cip1発現の誘導はｐ５３に無関係であることを示している。さらに、ｐ５３のレベルは、Ｎ１３−１３−１０Ｃによる処置の後に変化しない。
【００３２】
(その他の実施例)
Ｎ−アルキルグリシンのライブラリの合成。６６種の制御された混合物中、10,648個の化合物のライブラリを、固相中、位置走査フォーマットを使用して合成した。２２種の市販されている第１級アミンを集めたものを使用して、このライブラリに所望の化学的多様性を導入した。この合成の詳細は他の箇所で述べる(WO0228885)。簡単に言うと、リンクアミド樹脂(Rapp Polymere、０．７ミリ当量)から開始し、８ステップ合成経路では、Ｆｍｏｃ保護基の初期遊離を行った。次いで、塩化クロロアセチルとのアシル化の後、特定の第１級アミンまたは２２種のアミンの等モル混合物を使用して、クロロメチル中間体の対応するアミノ化を行う連続ステップを、必要に応じて実施した。これらの反応の全ては二重に行った。最後に、トリフルオロ酢酸−ジクロロメタン−水の混合物を使用して、生成物を樹脂から引き離し、溶媒を蒸発させ、残留物を凍結乾燥し、１０％ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に１０ｍｇ/ｍｌの濃度で溶解して、スクリーニングにかけた。
【００３３】
Ｎ１３−１３−１０ＣおよびＮ１０−１３−１０Ｃの合成。これらの化合物は、ポリスチレンリンクアミドＡＭ ＲＡＭ樹脂を固体支持体として使用して(０．６ｇ、負荷０．７ｍｍｏｌ/ｇ、０．４２ｍｍｏｌ)、１０ｍＬのポリプロピンレンシリンジ内で合成した。脱保護：樹脂を膨潤させた後、ピペリジンの２０％ＤＭＦ(ジメチルホルムアミド)溶液５ｍＬを含有する溶液を添加し、この混合物を２５℃で３０分間撹拌した。樹脂を濾過し、ＤＭＦ(３×５ｍＬ)、ｉＰｒＯＨ(３×５ｍＬ)、およびＤＣＭ(ジクロロメタン)(３×５ｍＬ)で洗浄した。アシル化：樹脂を、クロロ酢酸(１９８ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ)およびＮ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(２．１ｍｍｏｌ)を５ｍＬのＤＣＭ−ＤＭＦ(２:１)に溶かした溶液で処理した。反応混合物を、室温で３０分間撹拌し、濾過した。樹脂の液分を除去し、ＤＣＭ(３×５ｍＬ)、ｉＰｒＯＨ(３×５ｍＬ)、およびＤＭＦ(３×５ｍＬ)で洗浄した。アミンのカップリング:フェネチルアミン(２．１ｍｍｏｌ)およびトリエチルアミン(２．１ｍｍｏｌ)を５ｍｌのＤＭＦに溶かした溶液を、樹脂に添加し、その懸濁液を２５℃で３時間撹拌した。上澄みを除去し、混合物の液分を除去して、ＤＭＦ(３×３ｍＬ)、ｉＰｒＯＨ(３×３ｍＬ)、およびＣＨ2Ｃｌ2(３×３ｍＬ)で洗浄した。第２および第３のアシル化ステップと、アミンのカップリングを、上述のように実施した。これら２種のアミンのカップリングは、Ｎ１３−１３−１０Ｃの場合は４−メトキシフェネチルアミン(２．１ｍｍｏｌ)を使用して、またＮ１０−１３−１０Ｃの場合は第３のアミノ化ステップでフェネチルアミンを使用して実施した。切断：樹脂を、２５℃で３０分間、６０:４０:２(ｖ/ｖ/ｖ)ＴＦＡ/ＤＣＭ/Ｈ2Ｏの混合物で処理した。切断混合物を濾過し、合わせた濾液を貯めて、溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去した。上記プロセスの全ては二重に実施した。
【００３４】
分析および構造データ
分析は、Kromasil 100 Ｃ８(15×0.46ｃｍ、５μｍ)カラムを使用して、流量１ｍｌ/分の高速液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)によって行った。溶媒Ａは、0.07％ＴＦＡ(トリフルオロ酢酸)を含有するアセトニトリル(ＣＨ3ＣＮ)からなり、溶媒Ｂは、Ｈ2Ｏに0.1％のＴＦＡを溶かしたものであった。分析条件は、２分で２０％溶媒Ａ、１７分で２０〜８０％、１分で８０％溶媒Ａ、流量１ｍｌ/分およびλ２２０ｎｍで設定した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
【表２】
【００３７】
細胞。ＨＴ２９およびＬｏＶｏ(ヒト結腸腺癌)およびＭＤＡ.ＭＢ.４３５細胞と、これらの誘導体であるＭＤＡ.ＭＢ.４３５Ｌｕｎｇ２およびＭＤＡ.ＭＢ．４３５ Ｌｕｎｇ６(ヒト乳腺癌)細胞を、ウシ胎児血清(ＦＣＳ)１０％を含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地で培養した。ヒトグリア芽細胞腫Ｔ９８ｇおよび慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地で増殖させた。全ての細胞は、その指数増殖期にあるものを使用し、ＥＺ−ＰＣＲマイコプラズマ試験キット(Biological Industries)を用いてマイコプラズマが無いかどうか試験をした。
【００３８】
細胞アッセイ。ＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞を用いた細胞増殖アッセイで、コンビナトリアルライブラリをスクリーニングした。化合物は、単独で、または低用量のタキソール(ｎＭ)と共に試験をした。培養から３日後、細胞生存度をＭＴＴアッセイ(３−４,５−ジメチル−２−チアゾリル−２,５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド)により測定した。ＭＴＴを、細胞培養物中に、１ｍｇ/ｍｌの最終濃度で添加し、３７℃で４時間インキュベーションした後、１５％ＳＤＳ/ＤＭＦ(ｖ/ｖ）を用いて細胞溶解を行った。５７０ｎｍでのＭＴＴ−ホルマザンと、６３０ｎｍでの参照フィルタの分光光度測定により、細胞生存度を定量した。化合物だけに起因する増殖阻害を、タキソールおよび化合物で処置した培養物で観察された阻害と比較した。
【００３９】
アネキシンＶアッセイ。処理した細胞を、ＥＤＴＡ 0.02％を溶かしたハンクス液(ＨＢＳＳ)により収集し、ＨＢＳＳで洗浄し、次いで１％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)を含有するＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩液)で洗浄し、最後に、１％ＢＳＡを含有するアネキシンＶインキュベーション緩衝液(１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ７．４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；２．５ｍＭ ＣａＣｌ2)に再懸濁した。１０5個の細胞を、５μｌのアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ(Bender MedSystems)と共に室温で１時間、暗所でインキュベートした。死細胞を２μｇ/ｍｌのヨウ化プロピジウム(ＰＩ)で染色した。分析はフローサイトメトリーによって直ちに行った。
【００４０】
ＤＮＡ分析。化合物で処理した浮遊細胞および付着細胞を、トリプシン処理によって収集し、ＰＢＳで２回洗浄した。これらの細胞を、氷冷した７０％エタノールを用いて−２０℃で一晩、透過化処理した。これらの細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、０．５×１０6細胞/ｍｌに調節し、２０μｇ/ｍｌのヨウ化プロピジウムおよび２μｍ/ｍｌのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅフリーで３０分間、３７℃でインキュベートした。細胞を、４℃で一晩維持し、次いでフローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリー実験は、Ｅｐｉｃｓ ＸＬフローサイトメータ(Coulter Corporation、Hialeah、フロリダ州)を使用して実施した。機器は標準的な構成で設定した。サンプルの励起は、出力１５ｍＷの標準的な４８８ｎｍ空冷アルゴンイオンレーザを使用して行った。ＰＩの前方散乱(ＦＳＣ)、側方散乱(ＳＳＣ)、および赤色(６２０ｎｍ)蛍光が得られた。光学調節は、１０ｎｍ蛍光ビーズ(Immunocheck、Epics Division)からの最適化シグナルを基にした。時間は、機器の安定性の管理として使用した。赤色蛍光を、1024モノパラメトリックヒストグラムに投影した。凝集体は、ピーク蛍光シグナルに対してその領域の近くの単細胞をゲート処理することにより、排除した。単一蛍光ヒストグラムに関するＤＮＡ分析(Ploidy分析)は、Multicycleソフトウェア(Phoenix Flow Systems、San Diego、Ca)を使用して行った。
【００４１】
ウェスタンブロット法。浮遊細胞および付着細胞を収集し、ペレットを、ＲＩＰＡ緩衝液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ７．４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ６３０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ/ｍｌロイペプチン、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4)またはデオキシコール酸緩衝液(１０ｍＭ リン酸緩衝液７．４、０．１ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％デオキシコレート、１％ Ｉｇｅｐａｌ、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＰＭＳＦ)に再懸濁した。タンパク質の濃度は、ＲＩＰＡ抽出物に関してはＢＣＡタンパク質アッセイキット(Pierce)で、デオキシコレート抽出物に関してはブラッドフォードアッセイ(BioRad)で決定した。全タンパク質(２０〜３０μｇ/レーン)を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜(Gellman)に移し、Ｂｃｌ−ｘL(Transduction)；Ｂａｘ(Santa Cruz)；ＪＮＫ(Santa Cruz)；ホスホ−ＪＮＫ（Cell Signaling）；ｐＲｂ(Pharmingen)；ｐＲｂ−ホスホＳｅｒ７８０(Cell signalling)；ｐ１３０(Santa Cruz)；ｐ１０７(Santa Cruz)；Ｃｄｋ２(Santa Cruz)；ｐ２７Kip1(Santa Cruz)；ｐ２１Cip1（Santa Cruz）；アクチン(Sigma)；またはチューブリン(ＩＣＮ）に対する抗体でプローブし、ＥＣＬシステム(Amercham Pharmacia biotech)で進化させた。
【００４２】
ＢｒｄＵアッセイ。マイクロタイタープレート中、5000細胞/ウェルのＴ９８ｇグリア芽腫細胞を、ＭＣＤＢ １０５培地の血清欠乏状態によって７２時間、Ｇ１期で停止させた。血清(１０％)の再添加により、細胞を、連続希釈した化合物で１７時間処理し、その後、１０μＭ ＢｒｄＵと２時間半一緒にした。ＢｒｄＵの取込み、すなわちＤＮＡの合成は、製造業者が述べるように、細胞増殖ＥＬＩＳＡシステムのバージョン２(AmershamPharmacia biotech)で定量した。
【００４３】
Ｃｄｋ２／ＣｙｃＡ−Ｅキナーゼ活性の試験をするためのキナーゼアッセイ。ＥＬＩＳＡプレートを、２００μｌの遮断溶液(１％ＢＳＡ、0.02％ Ｔｗｅｅｎ、および0.02％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ)で一晩、４℃で遮断した。次いでプレートを、続けて３回、それぞれ５分ずつ、１００μｌの洗浄溶液(0.02％ Ｔｗｅｅｎおよび0.02％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ)で洗浄した。次いでプレートを室温で２〜４時間乾燥した。キナーゼアッセイは、ヒストンＨ1 ４μｇ、３０μＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＤＴＴ、ＡＴＰ−Ｐ32 ０．１μｌ、８００ｎＭ ＧＳＴ−ＣＤＫ２、および８００ｎＭ ＧＳＴ−サイクリンＡを含有して最終体積が６０μｌになるキナーゼ緩衝液(Ｈｅｐｅｓ ２５ｍＭ ｐＨ７．４ およびＭｇＣｌ2 １０ｍＭ)中で行った。アッセイは、チェックされるペプチド混合物を種々の濃度で含み、または含まない状態で実施した。阻害の制御は、反応媒体に８００ｎＭのｐ２１を添加して行った。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、各混合物５０μｌをドットブロット装置内に配置したニトロセルロース膜に濾過した。次いでサンプルを、２００μｌのキナーゼ緩衝液で洗浄し、次いで３５μｌの１０％ ＴＣＡで洗浄し、最後に２回、１００μｌの１０％ＴＣＡの後に１００μｌのＨ2Ｏで洗浄した。このプロセスの後、膜を室温で乾燥した。膜に関連する放射能を「Phosphor-imager(蛍リン光体イメージャ)」で検出した。
【００４４】
Ｃｄｋ４／ＣｙｃＤ１キナーゼ活性のアッセイを行うため、バキュロウイルス発現系を用いて組換えＧＳＴ−融合タンパク質としてＳｆ９昆虫細胞内にＣｄｋ４を発現させた。キナーゼアッセイは、33ＰａｎＱｉｎａｓｅ活性アッセイ(ProQinase)およびベックマンコールター／Sagianロボットシステムを使用し、９６ウェルフラッシュプレート(ＮＥＮ)で、５０μｌ反応体積中で行った。反応カクテルは、アッセイ緩衝液２０ｕｌ(５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ-ＮａＯＨ ｐＨ７．５、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、３μＭ ＭｎＣｌ2、３μＭ オルトバナジン酸Ｎａ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１μＭ (33Ｐ)-ｄＡＴＰ)；ｐＲｂタンパク質１μｇ；酵素１００ｎｇ；および試験化合物の１０％ＤＭＳＯ溶液５μｌであった。この反応カクテルを、３０℃で８０分間インキュベートした。反応を、５０μｌの０．２％(ｖ/ｖ)Ｈ3ＰＯ4で停止させ、プレートを吸引し、０．９％(ｗ/ｖ)ＮａＣｌで２回洗浄した。33Ｐの取込みは、マイクロプレートシンチレーションカウンタ(Microbeta、Wallac)で決定した。
【００４５】
図の説明
図１で、化合物Ｎ１０−１３−１０Ｃ、Ｎ１３−１３−１０Ｃ、Ｎ４−１３−１０Ｃ、およびＮ５−１３−１０Ｃは、ＨＴ２９増殖を阻害する。タキソールは、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃの作用を妨げる。(Ａ、Ｂ)ＨＴ２９細胞を、タキソール(１１ｎＭ)と共に、またはタキソール無しで、いくつかの濃度のペプトイドで増殖させた。ＭＴＴアッセイを処理から７２時間後に行った。増殖の阻害は、対照細胞の増殖と比較したＮ４−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃ(Ａ.)、Ｎ５−１３−１０ＣおよびＮ１０−１３−１０Ｃ(Ｂ.)で示されている。ＩＣ50値はペプトイドごとに指定される。Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、ＨＰＬＣによる精製ペプトイドであり、大部分の活性画分に相当する。Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０ＣペプトイドはＨＰＬＣで精製しなかった。(Ｃ)ＨＴ２９細胞を、タキソール単独あるいはＩＣ50値のＮ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)またはＮ１０−１３−１０Ｃ(４０μＭ)と組み合わせて連続希釈したもので処理した。増殖を、処理から７２時間後にＭＴＴアッセイで評価した。１００％の任意の値を未処理の培養物の濃度測定速度に割り当て、その他全ての値をその基準に対して示した。これらの値は６回(ｎ=６)繰り返した平均である。
【００４６】
図２は、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃがプロアポトーシスペプトイドであり、一方、Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃがそうではない状態を示す図である。細胞周期プロフィルをＤＮＡ染色によって分析した。Ｎ４−１３−１０Ｃ(１００μＭ）、Ｎ５−１３−１０Ｃ(１００μＭ)、Ｎ１０−１３−１０Ｃ(４０μＭ)、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)、タキソール(１１ｎＭ)、または対照としてＤＭＳＯの存在下、ＨＴ２９細胞を７２時間増殖させた。Ｇ０/Ｇ１、Ｓ、Ｇ２/Ｍ、またはサブＧ１ピークでの細胞の画分を特定した。
【００４７】
図３は、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃの特異的なプロアポトーシス作用を示す図である。(Ａ)表１に明記したＩＣ50値でのＮ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０Ｃで処理した７２時間後の、ＨＴ２９、ＬｏＶｏ、ＭＤＡ.ＭＢ.４３５、およびその肺転移性誘導体ｌｕｎｇ２およびｌｕｎｇ６を含んだいくつかの細胞系に関するサブＧ１ピーク分析である。(Ｂ)それぞれ１、５、１０、２０、３０、および３５、または４０μＭで、Ｎ１０−１３−１０ＣまたはＮ１３−１３−１０ＣによりＨＴ２９細胞を処理した７２時間後の、サブＧ１ピークの用量反応分析。両方において、浮遊細胞および付着細胞を収集し、固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、ＤＮＡ含量をフローサイトメトリーにより評価した。低２倍体ＤＮＡ含量、すなわちサブＧ１ピークを有する細胞の画分を示す。
【００４８】
図４(Ａ)は、ＨＴ２９細胞をＮ１０−１３−１０Ｃ(４０μＭ)、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)、および／またはタキソール(１１ｎＭ)で２４時間、４８時間、および７２時間処理した後の、細胞周期プロフィルの時間経過分析を示す図である。サブＧ１(濃青色)、Ｇ０/Ｇ１(赤色)、Ｓ(黄色)、Ｇ２/Ｍ(青色)ＤＮＡ含量を有する細胞の画分を、全細胞集団の％として示す。図４(Ｂ)は、Ｎ１３−１３−１０Ｃパルス実験を示す図である。ＨＴ２９細胞を、３５μＭのＮ１３−１３−１０Ｃで１、３、６、２４、４８、または７２時間、過渡的に処理し、最長７２時間で、生成物無しで培地に戻した。ＤＮＡ染色をフローサイトメトリーによって分析した。
【００４９】
図５は、初期アポトーシスの検出を示す図である。ＤＭＳＯ(右パネル)、Ｎ１３−１３−１０Ｃ、３５μＭ(中央パネル)、またはタキソール、１１ｎＭ(左パネル)で処理してから４０時間後のアネキシンＶアッセイである。ＨＴ２９処理済み細胞を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩで染色し、フローサイトメトリーにかけた。アネキシンＶ陽性細胞(縦軸)およびＰＩ陽性細胞(横軸、対数値)の蛍光ドットブロットを示す。集団のパーセンテージとして表した細胞分布を示す。初期アポトーシス細胞は第１象限、Ｑ１(ＡｎＶ＋/ＩＰ−)；死細胞はＱ２(ＡｎＶ＋/ＩＰ＋)；生細胞はＱ３(ＡｎＶ−/ＩＰ−)；壊死細胞はＱ４(ＡｎＶ−/ＩＰ＋)にある。
【００５０】
図６(Ａ)は、ＪＮＫが、Ｎ１３−１３−１０Ｃで処理した後に活性化する状態を示す。ＨＴ２９細胞を、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)で１、３、６、および２４時間処理し、収集し、免疫ブロットして、ＳＡＰ/ＪＮＫ ＭＡＰキナーゼの活性化を評価した。ウェスタンブロットは、最初にＪＮＫ蛍リン光体特異的抗体でプローブし、ストリップし、ｐａｎ−ＪＮＫ抗体およびアクチンで再びプローブして、全タンパク質レベルを標準化した。ＪＮＫのリン酸化は、Ｎ１３−１３−１０Ｃで処理してから３〜６時間後に観察された。図６(Ｂ）は、Ｂｃｌ−ｘＬが、Ｎ１０−１３−１０Ｃでの処置後に、リン酸化によって翻訳後修飾されない状態を示す。ＨＴ２９細胞を、Ｎ１０−１３−１０Ｃ(４０μＭ）、タキソール(１１ｎＭ）、またはこれら両方の組合せで３、６、および２４時間処理した。浮遊細胞および付着細胞からの抽出物を、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｘ、およびアクチンに対して免疫ブロットして、全タンパク質負荷を標準化した。
【００５１】
図７は、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０ＣがＧ１細胞周期停止を誘導するが、Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃは誘導しない状態を示す。(Ａ)Ｔ９８ｇ細胞を同調させ、ＦＣＳ単独、あるいはＮ１０−１３−１０Ｃ(１００μＭ)、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(１００μＭ)、オロムチン(１００μＭ)、エトポシド(５μＭ)、またはタキソール(３０ｎＭ)と組み合わせて１９時間、再初期化した。細胞周期プロフィルを、ヨウ化プロピジウムＤＮＡ染色によって評価し、フローサイトメトリーにより分析した。Ｇ１、Ｓ、Ｇ２/Ｍ ＤＮＡ含量を有する細胞の画分を、全細胞集団の％として示す。(ＢおよびＣ)同調させたＴ９８ｇ細胞を、ＦＣＳ単独、あるいは連続希釈したＮ４−１３−１０Ｃ、Ｎ５−１３−１０Ｃ、Ｎ１０−１３−１０Ｃ、Ｎ１３−１３−１０Ｃ、オロムチン、またはエトポシドと組み合わせて１９時間、再初期化し、最後の２時間でＢｒｄＵにより標識した。ＢｒｄＵの取込みを、抗ＢｒｄＵ抗体を使用するＥＬＩＳＡによって評価した。１００％の任意の値を、未処理の培養物によるＤＮＡ合成の濃度測定測定速度に割り当て、その他の全ての値は、その基準に対して示した。これらの値は３回(ｎ=３)繰り返した平均である。
【００５２】
図８は、Ｇ０/Ｇ１チェックポイントに含まれるタンパク質の発現を示す図である。(Ａ)ＨＴ２９細胞を、Ｎ１０−１３−１０Ｃ(４０μＭ)またはＮ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)で１、３、６、および２４時間処理し、収集し、免疫ブロットして、全ｐＲｂレベル、またはｐＲｂ−Ｓｅｒ780(ＰｂＲｂ)でのＣｄｋ４特異的リン酸化を評価した。ウェスタンブロットは、最初にｐＲｂ−Ｓｅｒ780リン酸化特異的抗体でプローブし、ストリップし、ｐａｎ-ｐＲｂ抗体およびチューブリンで再びプローブして、全タンパク質レベルを標準化した。(Ｂ)Ｔ９８ｇ細胞を、血清飢餓により同調させ、１０％ＦＣＳおよびＤＭＳＯ(Ｃ)、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(１００μＭ)またはタキソール(３０ｎＭ)で、１５、１７、２４、または２９時間再初期化した。全タンパク質抽出物のウェスタンブロットは、ｐ１３０、ｐＲｂ、ｐ１０７、Ｃｄｋ２、ｃｙｃＡ、ｐ２７、ｐ２１、およびアクチンに対する抗体でプローブした。非リン酸化、低リン酸化、ならびに過剰リン酸化したｐＲｂが検出される(矢印)。(Ｃ)Ｎ１３−１３−１０Ｃ(４０μＭ）、または対照としてＤＭＳＯで、２４時間および４８時間処理したＨＴ２９細胞である。免疫ブロットは、Ｃｄｋ２、ｃｙｃＡ、ｐ２１、ｐ２７、およびアクチンに対する抗体で染色した。
【００５３】
表１で、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、ＨＴ２９、ＬｏＶｏ、Ｋ５６２、Ｔ９８ｇ、ＭＤＡ.ＭＢ.４３５、およびその肺転移性誘導体ｌｕｎｇ２およびｌｕｎｇ６を含んだヒト癌細胞系の一団に対し、増殖阻害性を有する状態を示す。細胞系ごとに処理後７２時間でＭＴＴアッセイを行うことにより、Ｎ１０−１３−１０Ｃ、Ｎ１３−１３−１０Ｃ、Ｎ４−１３−１０Ｃ、およびＮ５−１３−１０ＣのＩＣ50を決定した(ｎ.ｄ.と定められていない限り)。
【００５４】
(引用文献)
【００５５】
【表３】
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】化合物Ｎ１０−１３−１０Ｃ、Ｎ１３−１３−１０Ｃ、Ｎ４−１３−１０Ｃ、およびＮ５−１３−１０Ｃは、ＨＴ２９増殖を阻害する。
【図２】Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃがプロアポトーシスペプトイドであり、一方、Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃがそうではない状態を示す図である。
【図３】Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃの特異的なプロアポトーシス作用を示す図である。
【図４】(Ａ)は、ＨＴ２９細胞をＮ１０−１３−１０Ｃ(４０μＭ)、Ｎ１３−１３−１０Ｃ(３５μＭ)、および／またはタキソール(１１ｎＭ)で２４時間、４８時間、および７２時間処理した後の、細胞周期プロフィルの時間経過分析を示す図であり、(Ｂ)は、Ｎ１３−１３−１０Ｃパルス実験を示す図である。
【図５】初期アポトーシスの検出を示す図である。
【図６】(Ａ)は、ＪＮＫが、Ｎ１３−１３−１０Ｃで処理した後に活性化する状態を示し、(Ｂ)は、Ｂｃｌ−ｘＬが、Ｎ１０−１３−１０Ｃでの処置後に、リン酸化によって翻訳後修飾されない状態を示す。
【図７】Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０ＣがＧ１細胞周期停止を誘導するが、Ｎ４−１３−１０ＣおよびＮ５−１３−１０Ｃは誘導しない状態を示す。
【図８】Ｇ０/Ｇ１チェックポイントに含まれるタンパク質の発現を示す図である。
【図９】表１は、Ｎ１０−１３−１０ＣおよびＮ１３−１３−１０Ｃは、ＨＴ２９、ＬｏＶｏ、Ｋ５６２、Ｔ９８ｇ、ＭＤＡ.ＭＢ.４３５、およびその肺転移性誘導体ｌｕｎｇ２およびｌｕｎｇ６を含んだヒト癌細胞系の一団に対し、増殖阻害性を有する状態を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タキソールと式Ｉの化合物とを含む、医薬品組成物
【化１】
（式中、Ｒ1は、ＨまたはＯＲ’であり、
Ｒ2は、Ｈ、Ｒ”であり、
Ｒ3は、Ｈ、Ｒ”であり、
Ｒ4は、Ｈ、Ｒ”、ＯＲ’であり、
Ｒ’は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル残基であり、
Ｒ”は、メチル、エチル、ブチルである）。
【請求項２】
Ｒ1はＨであり、Ｒ2はＯＲ’であり、Ｒ3はＨであり、ＯＲ’はパラ位にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ1はＯＲ’であり、Ｒ2はＯＲ’であり、Ｒ4はＨであり、ＯＲ’はパラ位にある、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ4はＨである、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
アポトーシス誘導用の薬物を調製するための、請求項１から４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項６】
過剰増殖性疾患治療用の薬物を調製するための、請求項１から４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項７】
化合物を同時にまたは順次施用する、請求項１から６のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項８】
タキソールを含む第１のパッケージと式Ｉの化合物を含む第２のパッケージとを含む部品の医薬品キット。
【請求項９】
癌治療の方法であって、
タキソールで第１の治療を行うステップと、
前記癌細胞にアポトーシスを誘導する請求項１から５のいずれかに記載の化合物で、患者に第２の治療を行うステップと
を含み、前記第１および第２の治療を、任意の順序でまたは同時に行う方法。
【請求項１】
タキソールと式Ｉの化合物とを含む、医薬品組成物
【化１】
（式中、Ｒ1は、ＨまたはＯＲ’であり、
Ｒ2は、Ｈ、Ｒ”であり、
Ｒ3は、Ｈ、Ｒ”であり、
Ｒ4は、Ｈ、Ｒ”、ＯＲ’であり、
Ｒ’は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル残基であり、
Ｒ”は、メチル、エチル、ブチルである）。
【請求項２】
Ｒ1はＨであり、Ｒ2はＯＲ’であり、Ｒ3はＨであり、ＯＲ’はパラ位にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ1はＯＲ’であり、Ｒ2はＯＲ’であり、Ｒ4はＨであり、ＯＲ’はパラ位にある、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ4はＨである、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
アポトーシス誘導用の薬物を調製するための、請求項１から４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項６】
過剰増殖性疾患治療用の薬物を調製するための、請求項１から４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項７】
化合物を同時にまたは順次施用する、請求項１から６のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項８】
タキソールを含む第１のパッケージと式Ｉの化合物を含む第２のパッケージとを含む部品の医薬品キット。
【請求項９】
癌治療の方法であって、
タキソールで第１の治療を行うステップと、
前記癌細胞にアポトーシスを誘導する請求項１から５のいずれかに記載の化合物で、患者に第２の治療を行うステップと
を含み、前記第１および第２の治療を、任意の順序でまたは同時に行う方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５２４５８７（Ｐ２００７−５２４５８７Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０５０５９（Ｐ２００６−５０５０５９）
【出願日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３７４９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２２０４
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３７４９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９２２０４
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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