アミノフラボンに対する感応性を判定する方法
癌を処置する方法および組成物について本明細書で議論する。具体的には、治療薬を用いた処置に対する患者の感応性、患者を処置するための組成物、およびその処置方法を判定する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、出願日２００８年６月１６日の「Methods for Determining Sensitivity to Aminoflavones」という名称の米国特許仮出願第６１／１２９，２８０号の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本明細書で引用する全ての刊行物および特許について、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００３】
フラボノイドは、天然のものでも合成のものでも、様々な生物活性を示す。こうした化合物は、例えば、プロテインキナーゼＣ、アロマターゼ、トポイソメラーゼ、またはサイクリン依存性キナーゼ活性を阻害し、あるいは抗有糸分裂活性を示す。具体的には、５，４’−ジアミノフラボンが、ヒトの乳癌細胞系ＭＣＧ−７に対して細胞毒性を示す。Akama等、J. Med. Chem.、４１、２０５６−２０６７（１９８８）を参照されたい。
【０００４】
フラボン環の６，７，８，および３’位において様々な置換基を実現する実験により、５，４’−ジアミノ−６，８，３’−トリフルオロフラボンの特に７位における置換成分の構造活性相関についてのある推測がもたらされた。溶解度などの親フラボン化合物の特定の物理的性質を、７位において、全てではなくいくつかの置換基を存在させることにより改善することができる。特定の７−置換化合物もまた、ヒトの特定の乳癌細胞系に対する細胞毒性が実証されている。Akama等、J. Med. Chem.、２０６１−６２を参照されたい。
【０００５】
アミノフラボンの派生物は、特定の乳腺腫に対して増殖阻害特性を示す（例えば、米国特許第５，５３９，１１２号および６，８１２，２４６号参照）が、他の乳腺腫は、アミノフラボンに耐性を有する（つまり、生物反応が限られている）。最近、国立癌研究所が、アミノフラボンに対する細胞系の感応性を調べるために、様々な腫瘍細胞系についてのヒト腫瘍スクリーン（「ＮＣＩ６０スクリーン」）を実施した。ＮＣＩ６０スクリーンにより、多様なヒト癌の増殖を選択的に止めるまたは阻害する化合物の能力が測定される。ＮＣＩ６０スクリーンの結果は、概ね、アミノフラボン（ＡＦ）およびそのプロドラッグＡＦＰ４６４が特定の種類のヒト固形腫瘍（例えば、非小細胞の肺癌、肝臓癌、およびメラノーマ）に対して活性を示すというものであった。米国特許第６，８１２，２４６号、図１Ａ〜１Ｄ参照。さらに、Meng等の「Activation of Aminoflavone (NSC 686288) by a Sulfotransferase is Required for the Antiproliferative effect of the Drug and for Induction of Histone γ-H2AX」、癌研究２００６；６６：（１９）、９６５６−６４（２００６年１０月１日）参照。
【０００６】
合計８個の乳癌細胞系が、ＮＣＩ６０スクリーンでスクリーニングされた（米国特許第６，８１２，２４６号、図１参照）。しかし、スクリーニングされた８個の細胞系のうち、２つの細胞系はアミノフラボンへの感応性があり、６つはアミノフラボンに耐性を有した。米国特許第６，８１２，２４６号、図１Ｂを参照されたい。この明らかな差異は、エストロゲン受容体（「ＥＲ」）の有無に起因するものであった。それら２つの感応性のある細胞系はＥＲ陽性であり、それら６つの耐性を有する細胞系はＥＲ陰性である。重要なことに、ＥＰ陽性細胞系は、１０ナノモルの大きさのオーダーのＡＦＰ４６４に感応性を有するのに対して、ＥＲ陰性細胞系は、ＧＩ／ＩＣ５０が１０〜１００μＭものＡＦＰ４６４に耐性を有する。この場合、ＡＦＰ４６４に感応性がある細胞系は、１μＭ未満のＡＦＰ４６４に対するＩＣ５０値を有するのに対して、耐性を有する細胞系は、１μＭ超のＡＦＰ４６４に対するＩＣ５０値を有する。
【０００７】
したがって、ＥＲ陽性腫瘍はアミノフラボンに感応性があり、ＥＲ陰性腫瘍はアミノフラボンに感応性を有さなかった。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の選択癌細胞系における局在を示す図であって、そのＡｈＲが、主に、ＡＦ感応性ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−ＴＡＭ１乳癌細胞系の細胞質に局在するとともにＡＦ耐性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞系の核に局在する図である。
【図１Ｂ】ＤＮＡ二重鎖切断のマーカであるリン酸化γ−Ｈ２ＡＸの免疫蛍光（図１Ｂ）を示す図であって、ＡＦ：ＡｈＲ複合体が細胞質から核に転移して、最終的にＤＮＡ損傷および細胞死に導くシグナル伝達カスケードを活性化したことを示す図である。
【図２】選択卵巣癌細胞系におけるＡｈＲの免疫蛍光染色を示す図であって、ＡｈＲが、主に、ＡＦ感応性ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞系の細胞質に局在するとともにＡＦ耐性ＯＶＣＡＲ−８卵巣癌細胞系の核に局在する様を示す図である。
【図３】選択「トリプル・ネガティブ」乳癌細胞系におけるＡｈＲの免疫蛍光染色を示す図であって、核ＡｈＲを有するＭＸ−１細胞がＡＦＰ４６４を用いた処置に耐性を有し（ＩＣ５０＝３０μＭ）、細胞質ＡｈＲを有するＨＣＣ１９３７およびＩＧＲＯＶ１系がＡＦＰ４６４に感応性を有する（ＩＣ５０ １０〜２００ｎＭ）様を示し、９６ウェル・プレートにおけるＡＦＰ４６４への５日間の細胞の連続的曝露と、メチルテトラゾリウムのホルマザンへの生細胞を用いた変換（ＭＴＴアッセイ）による細胞増殖の検出との結果として得られる３つ全ての細胞系の増殖曲線を示す図である。
【図４Ａ】ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を用いた前処置後のＥＲ発現を示すウエスタン・ブロットの図であって、ＥＲ発現のアップレギュレーションがアミノフラボンに対する細胞の感応性に相関する様（ＩＣ５０〜１μＭ）を示す図である。
【図４Ｂ】ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を用いた前処置後のＥＲ発現を示すウエスタン・ブロットの図であって、ＥＲ発現のアップレギュレーションがアミノフラボンに対する細胞の感応性に相関する様（ＩＣ５０〜１μＭ）を示す図である。
【図５】ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を用いて前処置を行い、（適用可能ならば）続いてＡＦＰ４６４で処置される「トリプル・ネガティブ」乳癌細胞系におけるＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１発現の棒グラフを示す図であって、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１の発現が、ＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸）で処置し、次いでＡＦＰ４６４で処置した場合にアップレギュレートされる様を示す図である。
【図６】「トリプル・ネガティブ」乳癌異種移植片を使用したインビボ検査から収集されるデータを示す線グラフを示す図であって、ＳＡＨＡを用いて腫瘍の前処置を行い、次いでＡＦＰ４６４を用いて処置を行うと、ＡＦＰ４６４のみを使用する場合と比較して細胞増殖が減少することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書では、アミノフラボン化合物に対する感応性を判定する方法および処置の必要な患者にアミノフラボン化合物を投与する方法を記載する。
【００１０】
「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」の語は全て、分化の喪失を伴う、あるいは伴わない制御されていない増殖によって特徴付けられる異常増殖を示す細胞を指す。「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」の語は、転移癌ならびに非転移癌を含む。
【００１１】
癌「の処置」、癌「処置」、または癌を「処置する」とは、腫瘍細胞の発達の制限、安定化または退縮を含めて、有益なまたは所望の臨床結果をもたらす手法のことを指す。有益なまたは所望の臨床結果には、１つまたは複数の症状または状態の緩和または改善、病気の程度の減少、病気の状態の安定化、病気の発展の阻止、病気の拡大の阻止、病気進行を先に引き延ばすことまたは遅くすること、病気発症を先に引き延ばすことまたは遅くすること、病状の改善または緩和、および（部分的または全体的）寛解が含まれるが、これらに限定されない。〜「の処置」、〜「処置」、または〜を「処置する」とは、処置なしで予想される場合よりも患者の生存を長くすることを意味することもある。〜「の処置」、〜「処置」、または〜を「処置する」とは、病気の進行を一時的に抑制すること、および／または対象中での病気の進行を永久的に停止することを意味することもある。〜「の処置」、〜「処置」、または〜を「処置する」とは、腫瘍、腫瘍細胞もしくは癌細胞、または腫瘍細胞もしくは癌細胞群の増殖を抑止すること、これらを死滅させること、これらに対する正常な増殖を回復させること、またはこれらの増殖を遅くする手法を指すこともある。〜「の処置」、〜「処置」、〜を「処置する」とは、化合物を哺乳類に処方または投与して、進行の停止、安定化または退縮を含めて有益なまたは所望の臨床結果をもたらすことを指すこともある。
【００１２】
「投与」または「投与すること」という語は、治療化合物または医療処置を、こうした処置が必要な患者に提供、処方、注入すること、摂取させること、あるいは、こうした処置が必要な患者に対して、治療化合物または医療処置を取得および／または導入する他の任意の方法または手段を示す。
【００１３】
以下の詳細な説明では、当業者が特許請求されている発明を実施することが可能になるのに十分な詳細を提供する。他の例を用いることができること、ならびに修正および置換えを行うことができることを理解されたい。
【００１４】
１つのケースでは、動物中の腫瘍を処置する方法を提供する。例えば、腫瘍を分析（例えば、生検組織試料、腫瘍マーカの分析、または循環性腫瘍細胞の分析を用いて）して、腫瘍が所定の遺伝子クラスタを有するかどうかを（例えば、ルミナル（luminal）型またはベイサル（basal）Ａ型）を判定することができ、もしそうであれば、アミノフラボン化合物を患者に投与することが可能である。別のケースでは、腫瘍がベイサルＢ型の遺伝子クラスタを有する場合、アミノフラボン化合物を用いる処置の前に、例えばヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤などの遺伝子転写を改変することができる薬剤を用いた前処置が患者に施される。
【００１５】
遺伝子プロファイルを判定する方法は、腫瘍細胞を患者から切除すること、この細胞を洗浄すること、および任意選択で解離すること、ならびに例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁することを任意選択で含む。次いで、これらの細胞から全ＲＮＡを抽出し、これを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社またはＩｌｌｕｍｉｎａ社のヒトゲノム・アレイを使用して全ゲノム分析にかける。
【００１６】
乳腺腫瘍は、解離されていてもされていなくても、その遺伝子的プロファイルおよび組織構造に基づいて分類することができる。例えば、Neveおよび同僚たちは、特定の乳癌細胞系を、その遺伝子的および組織構造的プロファイルで分類している。Neve R.M.等「A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes」、癌細胞、２００６年１２月、１０（６）：５１５−２７を参照されたい。これらの遺伝子的および組織構造的プロファイルは、例えば肝臓、結腸、前立腺、骨、肝臓、肺、小腸、膵臓、皮膚などの様々な癌細胞上で実施することができる。
【００１７】
収集した細胞のＥＲ状態は、当技術分野で知られている方法（例えば、免疫蛍光または免疫ペルオキシターゼ・アッセイ、ウエスタン・プロット分析、ＥＲ特異なｍＲＮＡの識別、電気泳動モビリティ・アッセイ（ＥＶＳＡ）で測定される、３つの異なるＥＲ特異な抗体に対するＥＲ−ＥＲＥ複合体の相互作用）で判定することが可能である。例えば、Averboukh等の「Classification of Breast Cancer Cells on the Basis of a Functional Assay for Estrogen」、分子医療、Ｖｏ．４、Issue ７、４５４−４６７（１９９８年７月）を参照されたい。例えば、ＴＥ１−１１（Ａｂｃａｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）によりａｂ１６４６０として販売、またはＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州デンバー（＃２５１２）により販売）などのＥＲαに特有の抗体を、ＦＩＴＣとコンジュゲートされた抗マウス抗体と合わせて使用して免疫蛍光アッセイを実施することも、ホースラディッシュペルオキシダーゼと合わせて使用して、エストロゲン受容体を検出するために免疫組織化学検査を実施することも可能である。
【００１８】
ルミナルまたはベイサル状態を、当技術分野で知られた方法で判定することができる。例えば、Tibshirani等の「Diagnosis of Multiple Cancer Types by Shrunken Centroids of Gene Expression」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：６５６７−６５７２（２００２）によるマイクロアッセイ予測分析（ＰＡＭ）を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ２．０ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）Ａｓｓａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標））と同様に使用することができる。これらのルミナルおよびベイサル状態は、ベイサルＡおよびベイサルＢならびにルミナルＡおよびルミナルＢに上で議論したものと同一の方法でさらに分けることができる。
【００１９】
例えば、ＥＲＢＢ３−、ＥＳＲ１−陽性、ＥＳＲ１−陰性、ＣＡＶ１−陽性、ＫＲＴ５−、ＫＲＴ１４−遺伝子に対して既知のマーカを用いた遺伝子発現プロファイルは、（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）の）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ２．０ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）Ａｓｓａｙで判定することができる。ルミナル細胞型乳癌細胞は、通常、ベイサル細胞型乳癌細胞と比較してＥＲＢＢ３−およびＥＳＲ１−陽性遺伝子を過剰発現させる。同様に、ベイサル細胞型乳癌細胞は、ルミナル細胞型と比較してＥＳＲ１−陰性およびＣＡＶ１−陽性遺伝子を過剰発現させる。ベイサル細胞型は、ベイサルＡおよびベイサルＢ細胞型にさらに分けることができる。ベイサルＡ細胞型は、ベイサルＢ細胞型と比較してＫＲＴ５−およびＫＲＴ１４−陽性遺伝子を過剰発現させる。ベイサルＢ細胞型は、ベイサルＡよりもＶＩＭ−陽性遺伝子の発現が高い。「過剰発現する」または「過剰発現」といった語は、腫瘍形成性であると推測される細胞中のｍＲＮＡおよび／または遺伝子もしくは遺伝子クラスタのコピー数が、正常すなわち腫瘍形成性でないと考えられる異なる遺伝子型の細胞の少なくとも約２倍に増加することを指す。過剰発現は、例えば、実際のｍＲＮＡレベル、遺伝子または遺伝子クラスタのコピー数を核酸プローブまたは同様の技法を用いて比較することにより、あるいは、例えば、蛋白質または遺伝子もしくは遺伝子クラスタでコード化された蛋白質に対する抗体の結合の強度を、免疫蛍光もしくは放射標識抗体または同様の検出試薬を用いて測定することにより判定することができる。
【００２０】
別のケースでは、先立って最多で２つの事前化学療法レジメンに失敗した乳癌患者またはホルモン処置に失敗したＥＲ−陽性患者を、まず、ＡＦＰ４６４を用いた処置の前にボリノスタット（またはスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ））、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いて処置する。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、約１〜約４００ｍｇ／ｋｇの用量、好ましくは１日に約２００〜約４００ｍｇの用量で投与することができる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ＡＦＰ４６４の投与の２〜７日前、好ましくはＡＦＰ４６４の投与の３〜６日前、最も好ましくはＡＦＰ４６４の投与の５日前に投与することができる。
【００２１】
ＡＦＰ４６４は、好ましくは約１〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で、好ましくは約３５〜約７０ｍｇ／ｋｇで、最も好ましくは約３５ｍｇ／ｋｇで投与する。処置スケジュールは、上で議論した任意の服用範囲で、ＡＦＰ４６４の少なくとも１度の追加の服用を含むことがある。追加のＡＦＰ４６４は、初回服用後の任意の日に、好ましくは３日目、５日目、１５日目、１７日目、および１９日目（初回服用日を１日目とする）に投与することができる。
【００２２】
ＡＦＰ４６４の投与前に、少なくとも１度のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の追加の投与を行うこともできる。例えば、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を３日間投与し、ＡＦＰ４６４投与の１日前に再度投与することができる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の追加の投与は、ＡＦＰ４６４の投与後に（ＡＦＰ４６４の投与前の追加の服用に加えてまたはその代わりに）も行うことができる。例えば、ＨＤＡＣの追加の投与は、ＡＦＰ４６４の投与後１０〜１５日目に、好ましくはＡＦＰ４６４投与後１２〜１４日目に行うことができる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ＡＦＰ４６４の投与後１２、１３、および１４日目に投与することもできる。
【００２３】
上の記載に従って使用することのできるアミノフラボン化合物の例には以下が含まれる。
【化１】
【００２４】
上の化学式では、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、ＣＯＣＨ２−Ｒ７であり、ただし、Ｒ７は、アミノ、分岐もしくは直鎖アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、またはアルキルもしくはジアルキルアミノアルキル、あるいはαアミノ酸残基であり、ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈではない。
【００２５】
上の化学式では、Ｒ３は、Ｈ、分岐もしくは直鎖アルキル、ヒドロキシアルキル、アルカノイルオキシアルキル（alkanoyloxyalkyl）、アルカノイルオキシ（alkanoyloxy）、アルコキシ、またはアルコキシアルキル、あるいは、
【００２６】
薬学的に許容可能な上の物質の塩である。
【００２７】
他の例には、５−アミノ−６，８−ジフルオロ−２−［３−フルオロ−４−［（Ｌ−リジル）アミノ）］フェニル］−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、５−アミノ−２−［４−［２−アミノ−５−グアニジノペンタノイル（guanidinopentanoyl）］アミノ］−３−フルオロフェニル］−６，８−ジフロオロ−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、６，８−ジフロオロ−７−メチル−５−（ジメチルアミノ）アセトアミド−２−［４−（ジメチルアミノ）アセトアミド−３−フルオロフェニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、５−アミノ−６，８−ジフルオロ−７−メチル−２−［４−（ジメチルアミノ）アセトアミド−３−フルオロフェニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンとが含まれる。
【００２８】
上で説明したように使用することの可能なアミノフラボン化合物には、ＡＦＰ４６４が含まれるが、これは以下の構造を有する。
【化２】
【００２９】
限定するわけではないが、本明細書の開示内容に従って使用することの可能なアミノフラボン化合物（およびその派生物、薬学的に許容可能な塩、または代用物）には、表１に示す任意の化合物が含まれる。
【表１】
【００３０】
本明細書に記載する化合物および組成物は、どのような投与経路（例えば、経口、皮下、および非経口投与）に適した形態にも調製することができる。非経口投与には、例えば、静脈内、腹膜内、肺内、および髄膜内注入が含まれる。これらの化合物および組成物は、局所的に投与することも可能である。
【００３１】
さらに、スクリーニング・テスト・キットを製作し、病院、看護師、医者、および／または他の医療を職業とする人に販売することもできる。通常、病理医は、乳腺腫瘍組織の生検を実施し、この腫瘍組織に含まれる腫瘍細胞の遺伝子プロファイルを判定して、上で議論した方法のいずれかにより、腫瘍がアミノフラボン（または他のアミノフラボン・アナログもしくはプロドラッグ）に感応性を有するかどうかを判定することができる。次いで、医療提供者は、遺伝子発現プロファイルがアミノフラボンに感応性を有する場合、腫瘍を処置するためにアミノフラボンを投与することができる。この開示内容によるテスト・キットは、遺伝子発現およびコピー数を判定するのに必要な材料（例えば、核酸プローブおよび試薬またはマイクロアレイ・チップ）を含むことがある。もう１つの選択肢として、患者の遺伝子プロファイル（例えば、ベイサルＢ）に基づいて、医療提供者は、アミノフラボン（例えば、ＡＦＰ４６４）の前に、またはアミノフラボンと組み合わせて、ＨＤＡＣ阻害剤を投与することもできる。
【００３２】
スクリーニング・テスト・キットには、ＡｈＲに対する既知の抗体を用いてＡｈＲの局在を判定するために、ＡｈＲの免疫組織化学もしくは免疫蛍光染色剤、または腫瘍生検標本もしくは循環性腫瘍細胞の量子ドット技術を用いた免疫染色剤が含まれることもある。
【００３３】
別のケースでは、本明細書で開示する方法を含んだ腫瘍量を減少させる方法により、未処置の腫瘍と比較して腫瘍量を１５％〜８５％減少させることが可能である。本明細書で開示する方法で、未処置の腫瘍と比較して腫瘍量を２５％〜７５％減少させることができるのが好ましく、５９％減少させるのが最も好ましい。
【００３４】
別のケースでは、動物の腫瘍（例えば、乳腺、肝臓、卵巣または膵臓）の増殖を阻害および／または軽減する方法を提供する。ＡＦＰ４６４の細胞の細胞質中のＡｈＲとの複合体、すなわちＡＦＰ４６４：ＡｈＲ複合体は、核に転移してＣＹＰ１Ａ１転写を誘発する。ＣＹＰ１Ａ１は、最終的に細胞死を起こすカスケード・パスウェイ（cascade pathway）につながる。したがって、腫瘍または循環性腫瘍細胞を分析して、ＡｈＲが主として腫瘍細胞の細胞質に局在しているかどうかを判定することができ、もしそうであれば、アミノフラボン化合物をこの患者に投与することができる。例えば、腫瘍中のＡｈＲの局在は、ＡｈＲに対する抗体を用いた、腫瘍または循環性腫瘍細胞の試料の免疫組織化学または蛍光免疫染色で判定することができる。例えば、Ｂｉｏｍｏｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ペンシルバニア州プリマスミーティング（＃ＳＡ−２１０）から販売されている抗体、またはＡｂｎｏｖａ（台湾）カタログ番号Ｈ０００００１９６−Ｍ０２で販売されている抗体を使用してＡｈＲの局在を判定することができる。アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の局在は、当技術分野で知られた方法で判定することができる。例えば、こうした局在は、ＡｈＲに対する市販抗体（Ａｂｎｏｖａ、Ｂｉｏｍｏｌ）を含んだ懸濁液中で解離癌細胞を培養し、免疫蛍光法でＡｈＲを検出することにより、または保管腫瘍組織を用い、免疫ペルオキシターゼをベースとする組織診断でＡｈＲを検出することにより判定することができる。
【００３５】
本開示内容のこれらおよび他の特性および利点は、詳細な説明を読むことにより当業者にとって明らかになるであろう。特定の課題または環境への本開示内容の応用は、当業者の実施可能な範囲内のことであることを理解されたい。本開示内容の実施のいくつかを、以下の非限定的例を用いて例示する。
【００３６】
表２に示す乳癌細胞系のスクリーニングを実施して、上で議論した技法に従いアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の局在を判定した。ＭＴＴアッセイを実施して、様々な乳癌細胞系における細胞死を測定した。この例では、ＡＦＰ４６４での処置後にＩＣ５０およびＩＣ１００値が１μＭ未満の乳癌細胞系は、ＡＦ感応性と判定され、ＡＦＰ４６４での処置後にＩＣ５０およびＩＣ１００値が１μＭ超の乳癌細胞系は、ＡＦ耐性と判定された。ＡｈＲが主に細胞質中に存在する細胞系は全て、ＡＦ感応性であることを示した。ＭＣＦ−７は、ＩＣ５０値が１６ｎＭであり、ＩＣ１００値が３００ｎＭであった。ＭＣＦ−７ ＨＥＲ２−１８（本質的にタモキシフェンおよびハーセプチンに耐性を有するＭＣＦ−７）は、ＩＣ５０値が２０ｎＭで、ＩＣ１００値が３７５ｎＭであった。ＭＣＦ−７ ＴＡＭ１（後天的にタモキシフェンへの耐性を有するＭＣＦ−７）は、ＩＣ５０値が２５ｎＭで、ＩＣ１００値が２００ｎＭであった。Ｔ４７Ｄは、ＩＣ５０値が１４ｎＭで、ＩＣ１００値が２０ｎＭであった。また、４つの細胞系は全て、表２に示すようにＥＲ状態が陽性であり、値が示すように、それぞれＡＦ感応性であった。
【００３７】
一方、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ１０Ａ細胞系は、ＡＦ耐性と判定された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＩＣ５０値が２５μＭであり、ＩＣ１００値が１００μＭ超であった。ＭＣＦ１０Ａは、ＩＣ５０値が３μＭであり、ＩＣ１００値が９μＭであった。これらの細胞系は両方とも、ＡｈＲが主に核内に局在した。図１Ａに示すように、ＡｈＲは、主に、ＡＦ耐性ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−ＴＡＭ１乳癌細胞系の細胞質内に局在する。細胞質を示すために、左側の列でＴＲＩＴＣを使用する。（ＤＮＡへの結合により）核を示すために、ＤＡＰＩを右側の列で使用する。また、ＡＦ耐性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞系における核中へのＡｈＲの主な局在を図１Ａに示す。
【００３８】
図１Ｂは、ＤＮＡ二重鎖切断のマーカであるリン酸化γ−Ｈ２ＡＸの免疫蛍光を（２番目の列に）示す。γ−Ｈ２ＡＸ染色は、ＡＦ：ＡｈＲ複合体が細胞質から核に転移して、最終的にアポトーシスに導くシグナル伝達カスケードを活性化したことを示している。リン酸化γ−Ｈ２ＡＸは、細胞中のＤＮＡ損傷応答の指示薬である。理論に束縛されるものではないが、γ−Ｈ２ＡＸの局在は、ＡＦ：ＡｈＲ複合体がＤＮＡ損傷の原因であることを示す。
【表２】
【００３９】
同様に、表３に示す卵巣癌細胞系のスクリーニングを実施して、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の局在を判定した。下で示すように、さらに図２および３に示すように、ＡｈＲが主に細胞質中に局在する細胞系（例えば、ＯＶＣＡＲ−３およびＩＧＲＯＶ−１）は全て、ＡｈＲが主に核中に存在する細胞系（例えば、ＯＶＣＲ−８）よりもＡＦＰ４６４での処置に対して強い感応性を有した。ＯＶＣＡ−３は、ＩＣ５０値が０．２５２μＭであった。ＩＧＲＯＶ−１は、ＩＣ５０値が０．４２μＭであった。ＡＦ耐性ＯＶＣＡＲ−８は、ＩＣ値が１３μＭであった。
【００４０】
ＡｈＲの局在および、細胞系がＡＦ感応性かＡＦ耐性であるかを判定するのにＡｈＲの局在が影響を与えることは、処置の流れを決定するのに役立つことがある。さらに、ＡＦＰ４６４の処置を、ＡｈＲが主に細胞質中に局在することが分かっている、例えば膵臓腫瘍などの別の種類の腫瘍にまで拡張することが可能である。
【表３】
【００４１】
図３は、トリプル・ネガティブＭＸ−１乳癌細胞系、ＥＲ陰性ベイサルＡ ＨＣＣ１９３７乳癌細胞系、およびＩＧＲＯＶ１卵巣癌細胞系におけるＡｈＲの局在を示す。ＡｈＲ局在は、上で議論したように、ＡＦＰ４６４の細胞毒性活性に相関する。核ＡｈＲを有するＭＸ−１は、ＡＦＰ４６４での処置に耐性を有し（ＩＣ５０＝３０μＭ）、細胞質ＡｈＲを有するＨＣＣ１９３７およびＩＧＲＯＶ１系は、ＡＦＰ４６４に感応性を有する（ＩＣ５０ １０〜２００ｎＭ）。９６ウェル・プレートにおけるＡＦＰ４６４への５日間の細胞の連続的曝露と、メチルテトラゾリウムのホルマザンへの生細胞を用いた変換（ＭＴＴアッセイ）による細胞増殖の検出との結果として得られる３つ全ての細胞系の増殖曲線を示す。図３の細胞系は全て、非常に活動的な形態の遺伝子乳癌および卵巣癌の原因となる欠陥をＢＲＣＡ腫瘍サプレッサ遺伝子中に有する。ＭＸ−１には、ＢＲＣＡ１欠失およびＢＲＣＡ２変異があり、ＨＣＣ１９３７では、ＢＲＣＡ１が変異し完全に欠陥となり、ＩＧＲＯＶ１では、ＢＲＣＡ２（＋／−）が欠陥である。
【００４２】
感応性細胞では、ＡＦＰ４６４は、ＡｈＲ介在シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）依存の生体異物反応および細胞死を誘発する。耐性細胞では、ＣＹＰシステムは誘発されない。リアルタイムＰＣＲアセスメントにより、ＡｈＲ依存の生体異物反応が回復するといった、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中でＨＤＡＣ阻害剤およびＡＦＰ４６４を用いた処置によるＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１の誘発が示された（図５、下記でさらに議論する）。
【００４３】
以下の表４に示すように、１１個の乳癌細胞系の遺伝子プロファイルを判定し、各細胞系をテストして、アミノフラボンの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。阻害濃度５０％は、ＭＴＴアッセイでＮＣＩ ＤＴＰインビトロ・テスト手順（http://dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.htm）に従って求めた。独立した３度のＭＴＴインビトロ腫瘍細胞増殖阻害実験を実施し、表４に示す平均ＩＣ５０値が得られた。
【表４】
【００４４】
ＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７ Ｔａｍ１、およびＭＣＦ−７ Ｈｅｒ２−１８細胞系は全て、ルミナル型遺伝子クラスタである。これらの細胞系の全ては、ＡＦ４６４に対して感応性を有する０．０１６〜０．０２０のμＭ範囲のＡＦ ＩＣ５０濃度を有する。上で議論した先のＮＣＩ細胞系スクリーン結果に基づいて、ＥＲ陰性腫瘍はアミノフラボンに耐性を有すると考えた。しかし、表４に示すように、ＨＣＣ１９３７、ＢＴ２０、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（全てベイサルＡ型）、およびＳＫＢＲ３（ルミナル型）は、全てＥＲ陰性腫瘍細胞であり、全てＡＦＰ４６４に感応性を有する。これらのＥＲ陰性細胞系のＡＦ ＩＣ５０濃度は、０．０１０〜０．０２０μＭに過ぎない。したがって、ＥＲ状態に関連する遺伝子プロファイルのみでは、ＡＦでの処置に対する腫瘍の感応性を予測することはできない。ＡＦＰ４６４は、常にルミナル型組織構造であるＥＲ陽性乳癌細胞に有効であるだけでなく、ベイサルＡサブタイプのＥＲ陰性乳癌にも有効である。
【００４５】
別のケースでは、表５Ａおよび５Ｂに示すように、例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）などのＨＤＡＣ阻害剤を用いた、ＥＲ陰性、「トリプル・ネガティブ」、またはベイサルＢ乳癌細胞系の前処置により、細胞系のＥＲ状態が変調され、細胞系が〜１μＭのＩＣ５０でアミノフラボンへの感応性を有するようになった。こうした結果は、ＳＡＨＡによるこれらの細胞系の感作が時間、スケジュール、および細胞型に依存していることを示している。
【表５Ａ】
【表５Ｂ】
【００４６】
薬品ごとに最多で８つの濃度を用い、ＭＴＴアッセイで増殖を判定することにより、固定ＩＣ５０比率でChouおよびTalalayの方法（Chou, T.C.およびTalalay, P「Quantitative analysis of dose-effect relationships: The combine effects of multiple drugs or enzyme inhibitors」Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．、２２：２７−５５、１９８４参照）に従って、組合せ検査を実施した。１つのケースでは、有効（ＥＤ）量５０、７５または９０％での組合せ指数が１未満の場合は、２つの薬剤の相乗効果が示され、１の場合は、薬剤は相加的であり、１より大きい場合は、薬剤は拮抗的である。
【００４７】
図４Ａおよび４Ｂは、ＳＡＨＡ（このケースでは、ボリノスタット）で処置する際の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞系（図４Ａ）およびＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞系（図４Ｂ）中のＥＲαの誘発を示すウエスタン・ブロットを示す。図４Ａおよび４Ｂそれぞれのレーン１は、それぞれの細胞をＤＭＳＯで処置した対照を示す。図４Ａのレーン２は、ＳＡＨＡを用いて６０時間２．５μＭ（ＩＣ５０）で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を示す。図４Ａのレーン３は、ＳＡＨＡを用いて６０時間１３．５μＭ（ＩＣ１００）で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を示す。図示のように、ＥＲα誘発は、ＳＡＨＡ処置後に増加する。図４Ｂのレーン２および３は同様の結果を示すが、図４Ｂのレーン２は、ＳＡＨＡを用いて４８時間８μＭ（ＩＣ５０）で処置したＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞系を示し、図４Ｂのレーン３は、ＳＡＨＡを用いて４８時間１００μＭ（ＩＣ１００）で処置したＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞系を示すものである。
【００４８】
図５は、ＳＡＨＡで処置し、次いでＡＦＰ４６４で処置した後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞におけるＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１経路の誘発を測定する棒グラフである。左側の棒グラフは、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１に対するＲＮＡの発現がほとんどないことを示す対照を示す。中央のグラフは、ＳＡＨＡで４８時間処置し、次いでＡＦＰ４６４で６時間処置した後に、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１に対するＲＮＡの発現が増加したことを示す。右側のグラフは、ＳＡＨＡで４８時間処置し、次いでＡＦＰ４６４で２４時間処置した後に、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１に対するＲＮＡの発現がほとんどないことを示し、このことは、ＳＡＨＡによる感作が時間およびスケジュールに依存していることを示している。ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１発現ベクター・コンストラクトを使用し、これらのベクターｃＤＮＡで標準曲線を作成することにより、免疫蛍光信号をコピー数に対して基準化した。ベースラインおよび２４時間のＡＦＰ４６４と比較して、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１の誘発は、ＳＡＨＡで前処置された細胞中でＡＦＰ４６４処置の６時間後に確認される。
【００４９】
次いで、上で議論した発見事項を説明するインビボ検査を実施した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞系は、元々、テキサス州、ヒューストンのＭＤ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの患者腫瘍から確立されたものである。これらの細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州、マナサス）から得た。この細胞系は、「トリプル・ネガティブ」乳癌のカテゴリに属し、したがって、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体ならびにＨＥＲ２／ｎｅｕが欠如している。また、この細胞系は、ｐ５３変位を含んでいる。
【００５０】
Ｎｃｒ／ｎｕの遺伝的背景の胸腺形成不全ヌードマウスを用いて、細胞系からのヒト腫瘍異種移植片ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の確立および連続的増殖を行った。腫瘍断片（〜３０ｍｍ３のサイズ）をヌードマウスに皮下移植し、腫瘍が〜７０ｍｍ３のメディアン（median）体積に達した際に処置を開始した（移植後〜１０日間、初期）。この皮下異種移植片ステージング・システムは、米国国立癌研究所のＤｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍで定義されたものである。メディアン体積１９０ｍｍ３（１００〜４００ｍｍ３）の腫瘍は、進行期と称される。腫瘍サイズが６３〜２００ｍｍ３の際に処置が開始される場合は、このモデルは初期とみなされる。Alley MC、Hollingshead MG、Dykes DJ、Waud WRの「Human tumor xenograft models in NCI drug development」、Teicher BA、Andrews PA編集、Anticancer drug development guide: preclinical screening, clinical trials, and approval、第２版、ニュージャージー州、トトワ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ社、２００４、ｐ．１２５−５２参照。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、増殖の早い腫瘍（対数増殖における平均倍増時間〜４．５日間）であり、９５％超のテーク・レート（take rate）を有するので、国立癌研究所の初期腫瘍異種移植片モデルに適した基準を満たしている。Fiebig HH、Burger AMの「Human tumor xenografts and explants」、Teicher BA編集、Animal models in cancer research、ニュージャージー州、トトワ、Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ社、２００１、ｐ．１１３−３７参照。また、Geran RI、Greenberg NH、MacDonald MM、Schumacher AM、Abbott BJの「Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems」、Cancer Chemother １９７２、Rep３：１−１０３参照。１つのグループは、両側腹部にそれぞれ１〜２個の腫瘍があるマウスを７〜８匹含んだ。
【００５１】
次に、処置およびデータ評価について議論する。ＡＦＰ４６４を５％無菌グルコース溶液（ビヒクル）中に溶解し、静脈内に投与し、ボリノスタット／ＳＡＨＡをメチルセルロース／ツイーン８０中で調製し、経口投与を行った。実験開始前のＡＦＰ４６４の最大耐量（ＭＴＤ）は、静注で７５ｍｇ／ｋｇ／日と判定された。ＳＡＨＡを非中毒量の５０ｍｇ／ｋｇ／日で経口投与した。マウス中のＳＡＨＡのＭＴＤは１７５ｍｇ／ｋｇ／日である。この実験では、１５０ｍｇを超えるＳＡＨＡを連続した３日間投与した（−２、−１および０日目（ｄ０）、１２〜１４日目（ｄ１２〜１４））。ＡＦＰ４６４は、１、３、５、１５、１７、および１９日目に投与した。
【００５２】
腫瘍増殖の後に、連続ノギス測定、重量記録を行い、標準式（長さ×幅２）／２を用いて腫瘍体積を算出した。ただし、長さは、最大寸法であり、幅は、長さに垂直な最小寸法である。ｍｍ３での腫瘍体積が、この式から導き出される適当な変数である一方で、１ｍｍ３が１ｍｇの腫瘍重量に等しいことに留意しなければならない。皮下増殖ヒト腫瘍異種移植片における抗癌剤効果のアセスメント向けの国立癌研究所ガイドラインを用いて、データを評価した。具体的に指定されたソフトウェア（Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ）を使用して、メディアン相対腫瘍体積を時間に対してプロットした。各腫瘍について、Ｘ日目の腫瘍体積を０日目の腫瘍体積で除することにより（無作為時間）、相対腫瘍体積を算出した。対照に対して処置した最大腫瘍阻害／最適腫瘍阻害％（Ｔ／Ｃ）について、増殖曲線を分析したが、ただし、処置（Ｔ）および対照（Ｃ）グループごとの腫瘍体積（δＴＶ）の変化を日ごとに算出した。初めの処置日（ステージング日）のメディアン腫瘍体積を、指定の観察日のメディアン腫瘍重量から減ずることにより腫瘍を測定した。これらの値を用いて、％Ｔ／Ｃを以下のように算出した。
【００５３】
％Ｔ／Ｃ＝（ΔＴ／ΔＣ）×１００、ただしΔＴ＞０、または
％Ｔ／Ｃ＝（ΔＴ／Ｔ１）×１００、ただしΔＴ＜０でＴ１＝処置開始時のメディアン腫瘍体積である。
【００５４】
得られた最適（最小）値を用いて抗腫瘍活性を定量化し、この効果が生じる日にちを示す。腫瘍阻害を、５０未満の最適Ｔ／Ｃと定義する。部分的腫瘍退縮を、腫瘍体積が処置開始時の腫瘍体積の５０％以下に減少することと定義する。完全退行とは、実験期間の任意の時間に、腫瘍量が６３ｍｍ３未満に減少する例である。
【００５５】
図６および表６は、結果ならびにインビボ検査の処置スケジュールを示す。対照グループのメディアン相対腫瘍体積は、予想されたとおり、絶えずその他のグループのものよりも大きかった。予想に反してその他のグループのものよりも小さかったのは、ＳＡＨＡ＋ＡＦＰ４６４ ３５ｍｇ／ｋｇのグループであった。これらの結果は、ＳＡＨＡを用いた前処置およびＡＦを用いた処置により、こうした処置を取らなければ耐性乳癌である腫瘍のパーセント増殖阻害を増大させることができることを示している。
【表６】
【００５６】
癌患者の処置について以下で議論する。腫瘍の生検を患者から得ることができる。当明細書に記載するように、この生検を組織学的技法で分析し、かつ／または遺伝子クラスタを分析することができる。患者がＥＲ陽性乳癌を有する場合、アミノフラボン化合物をこの患者に投与して、患者血漿中で約１μＭの濃度を達成する。患者がホルモン療法に耐性を有する乳癌を有する場合、アミノフラボン化合物をこの患者に投与する。患者がホルモン療法とハーセプチン療法との両方に耐性を有する乳癌を有する場合、アミノフラボン化合物をこの患者に投与する。
【００５７】
乳癌の遺伝子プロファイルを判定し、腫瘍がルミナルまたはベイサルＡ型の遺伝子クラスタを示す場合、アミノフラボン化合物を患者に投与する。患者がＥＲ陰性、「トリプル・ネガティブ」、ベイサルＢ型の遺伝子クラスタを伴う乳癌を有する場合、患者に、アミノフラボン化合物を用いた処置の前に、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を用いた前処置を行う。ＨＤＡＣ阻害剤を用いた前処置により、エストロゲン受容体シグナリングが変調され、細胞がアミノフラボンに対して感応性を有するようになる。
【００５８】
他の例では、腫瘍（例えば、乳癌、卵巣癌、肝臓癌または膵臓癌）におけるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の局在を判定し、この腫瘍が主に細胞質に局在するＡｈＲを有する場合、アミノフラボン化合物を患者に投与する。
【００５９】
もう１つの選択肢として、または上記に加えて、単一薬剤ＡＦＰ４６４を７４ｍｇ／ｍ２で、２１日周期のうちの１日目および８日目（Ｄ１およびＤ８）に静脈内投与して、ホルモン処置に失敗した患者を処置することもできる。任意選択で、最多で２つの事前化学療法レジメンに失敗した患者を、２１日周期のうちのＤ１およびＤ８の７４ｍｇ／ｍ２の用量でのＡＦＰ４６４の各静脈内投与の前５日間、４００ｍｇ／日 ＰＯでＳＡＨＡを用いて処置することもできる。病状が悪化するか、または毒性が許容可能でなくなるまで処置を行うことができる。ＡＦＰ４６４は、７４ｍｇ／ｍ２で３時間の静脈内注入として投与することができる。ボリノスタットは、各ＡＦＰ４６４服用の５日前に経口投与することができる。
【００６０】
上の説明および図面は、本明細書の開示内容を例示するものである。当業者は、上の開示内容に、置換、追加、削除、改変および／または他の変更を行うことができることを理解するであろう。
【技術分野】
【０００１】
本願は、出願日２００８年６月１６日の「Methods for Determining Sensitivity to Aminoflavones」という名称の米国特許仮出願第６１／１２９，２８０号の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本明細書で引用する全ての刊行物および特許について、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００３】
フラボノイドは、天然のものでも合成のものでも、様々な生物活性を示す。こうした化合物は、例えば、プロテインキナーゼＣ、アロマターゼ、トポイソメラーゼ、またはサイクリン依存性キナーゼ活性を阻害し、あるいは抗有糸分裂活性を示す。具体的には、５，４’−ジアミノフラボンが、ヒトの乳癌細胞系ＭＣＧ−７に対して細胞毒性を示す。Akama等、J. Med. Chem.、４１、２０５６−２０６７（１９８８）を参照されたい。
【０００４】
フラボン環の６，７，８，および３’位において様々な置換基を実現する実験により、５，４’−ジアミノ−６，８，３’−トリフルオロフラボンの特に７位における置換成分の構造活性相関についてのある推測がもたらされた。溶解度などの親フラボン化合物の特定の物理的性質を、７位において、全てではなくいくつかの置換基を存在させることにより改善することができる。特定の７−置換化合物もまた、ヒトの特定の乳癌細胞系に対する細胞毒性が実証されている。Akama等、J. Med. Chem.、２０６１−６２を参照されたい。
【０００５】
アミノフラボンの派生物は、特定の乳腺腫に対して増殖阻害特性を示す（例えば、米国特許第５，５３９，１１２号および６，８１２，２４６号参照）が、他の乳腺腫は、アミノフラボンに耐性を有する（つまり、生物反応が限られている）。最近、国立癌研究所が、アミノフラボンに対する細胞系の感応性を調べるために、様々な腫瘍細胞系についてのヒト腫瘍スクリーン（「ＮＣＩ６０スクリーン」）を実施した。ＮＣＩ６０スクリーンにより、多様なヒト癌の増殖を選択的に止めるまたは阻害する化合物の能力が測定される。ＮＣＩ６０スクリーンの結果は、概ね、アミノフラボン（ＡＦ）およびそのプロドラッグＡＦＰ４６４が特定の種類のヒト固形腫瘍（例えば、非小細胞の肺癌、肝臓癌、およびメラノーマ）に対して活性を示すというものであった。米国特許第６，８１２，２４６号、図１Ａ〜１Ｄ参照。さらに、Meng等の「Activation of Aminoflavone (NSC 686288) by a Sulfotransferase is Required for the Antiproliferative effect of the Drug and for Induction of Histone γ-H2AX」、癌研究２００６；６６：（１９）、９６５６−６４（２００６年１０月１日）参照。
【０００６】
合計８個の乳癌細胞系が、ＮＣＩ６０スクリーンでスクリーニングされた（米国特許第６，８１２，２４６号、図１参照）。しかし、スクリーニングされた８個の細胞系のうち、２つの細胞系はアミノフラボンへの感応性があり、６つはアミノフラボンに耐性を有した。米国特許第６，８１２，２４６号、図１Ｂを参照されたい。この明らかな差異は、エストロゲン受容体（「ＥＲ」）の有無に起因するものであった。それら２つの感応性のある細胞系はＥＲ陽性であり、それら６つの耐性を有する細胞系はＥＲ陰性である。重要なことに、ＥＰ陽性細胞系は、１０ナノモルの大きさのオーダーのＡＦＰ４６４に感応性を有するのに対して、ＥＲ陰性細胞系は、ＧＩ／ＩＣ５０が１０〜１００μＭものＡＦＰ４６４に耐性を有する。この場合、ＡＦＰ４６４に感応性がある細胞系は、１μＭ未満のＡＦＰ４６４に対するＩＣ５０値を有するのに対して、耐性を有する細胞系は、１μＭ超のＡＦＰ４６４に対するＩＣ５０値を有する。
【０００７】
したがって、ＥＲ陽性腫瘍はアミノフラボンに感応性があり、ＥＲ陰性腫瘍はアミノフラボンに感応性を有さなかった。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の選択癌細胞系における局在を示す図であって、そのＡｈＲが、主に、ＡＦ感応性ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−ＴＡＭ１乳癌細胞系の細胞質に局在するとともにＡＦ耐性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞系の核に局在する図である。
【図１Ｂ】ＤＮＡ二重鎖切断のマーカであるリン酸化γ−Ｈ２ＡＸの免疫蛍光（図１Ｂ）を示す図であって、ＡＦ：ＡｈＲ複合体が細胞質から核に転移して、最終的にＤＮＡ損傷および細胞死に導くシグナル伝達カスケードを活性化したことを示す図である。
【図２】選択卵巣癌細胞系におけるＡｈＲの免疫蛍光染色を示す図であって、ＡｈＲが、主に、ＡＦ感応性ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞系の細胞質に局在するとともにＡＦ耐性ＯＶＣＡＲ−８卵巣癌細胞系の核に局在する様を示す図である。
【図３】選択「トリプル・ネガティブ」乳癌細胞系におけるＡｈＲの免疫蛍光染色を示す図であって、核ＡｈＲを有するＭＸ−１細胞がＡＦＰ４６４を用いた処置に耐性を有し（ＩＣ５０＝３０μＭ）、細胞質ＡｈＲを有するＨＣＣ１９３７およびＩＧＲＯＶ１系がＡＦＰ４６４に感応性を有する（ＩＣ５０ １０〜２００ｎＭ）様を示し、９６ウェル・プレートにおけるＡＦＰ４６４への５日間の細胞の連続的曝露と、メチルテトラゾリウムのホルマザンへの生細胞を用いた変換（ＭＴＴアッセイ）による細胞増殖の検出との結果として得られる３つ全ての細胞系の増殖曲線を示す図である。
【図４Ａ】ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を用いた前処置後のＥＲ発現を示すウエスタン・ブロットの図であって、ＥＲ発現のアップレギュレーションがアミノフラボンに対する細胞の感応性に相関する様（ＩＣ５０〜１μＭ）を示す図である。
【図４Ｂ】ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を用いた前処置後のＥＲ発現を示すウエスタン・ブロットの図であって、ＥＲ発現のアップレギュレーションがアミノフラボンに対する細胞の感応性に相関する様（ＩＣ５０〜１μＭ）を示す図である。
【図５】ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を用いて前処置を行い、（適用可能ならば）続いてＡＦＰ４６４で処置される「トリプル・ネガティブ」乳癌細胞系におけるＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１発現の棒グラフを示す図であって、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１の発現が、ＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸）で処置し、次いでＡＦＰ４６４で処置した場合にアップレギュレートされる様を示す図である。
【図６】「トリプル・ネガティブ」乳癌異種移植片を使用したインビボ検査から収集されるデータを示す線グラフを示す図であって、ＳＡＨＡを用いて腫瘍の前処置を行い、次いでＡＦＰ４６４を用いて処置を行うと、ＡＦＰ４６４のみを使用する場合と比較して細胞増殖が減少することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書では、アミノフラボン化合物に対する感応性を判定する方法および処置の必要な患者にアミノフラボン化合物を投与する方法を記載する。
【００１０】
「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」の語は全て、分化の喪失を伴う、あるいは伴わない制御されていない増殖によって特徴付けられる異常増殖を示す細胞を指す。「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」の語は、転移癌ならびに非転移癌を含む。
【００１１】
癌「の処置」、癌「処置」、または癌を「処置する」とは、腫瘍細胞の発達の制限、安定化または退縮を含めて、有益なまたは所望の臨床結果をもたらす手法のことを指す。有益なまたは所望の臨床結果には、１つまたは複数の症状または状態の緩和または改善、病気の程度の減少、病気の状態の安定化、病気の発展の阻止、病気の拡大の阻止、病気進行を先に引き延ばすことまたは遅くすること、病気発症を先に引き延ばすことまたは遅くすること、病状の改善または緩和、および（部分的または全体的）寛解が含まれるが、これらに限定されない。〜「の処置」、〜「処置」、または〜を「処置する」とは、処置なしで予想される場合よりも患者の生存を長くすることを意味することもある。〜「の処置」、〜「処置」、または〜を「処置する」とは、病気の進行を一時的に抑制すること、および／または対象中での病気の進行を永久的に停止することを意味することもある。〜「の処置」、〜「処置」、または〜を「処置する」とは、腫瘍、腫瘍細胞もしくは癌細胞、または腫瘍細胞もしくは癌細胞群の増殖を抑止すること、これらを死滅させること、これらに対する正常な増殖を回復させること、またはこれらの増殖を遅くする手法を指すこともある。〜「の処置」、〜「処置」、〜を「処置する」とは、化合物を哺乳類に処方または投与して、進行の停止、安定化または退縮を含めて有益なまたは所望の臨床結果をもたらすことを指すこともある。
【００１２】
「投与」または「投与すること」という語は、治療化合物または医療処置を、こうした処置が必要な患者に提供、処方、注入すること、摂取させること、あるいは、こうした処置が必要な患者に対して、治療化合物または医療処置を取得および／または導入する他の任意の方法または手段を示す。
【００１３】
以下の詳細な説明では、当業者が特許請求されている発明を実施することが可能になるのに十分な詳細を提供する。他の例を用いることができること、ならびに修正および置換えを行うことができることを理解されたい。
【００１４】
１つのケースでは、動物中の腫瘍を処置する方法を提供する。例えば、腫瘍を分析（例えば、生検組織試料、腫瘍マーカの分析、または循環性腫瘍細胞の分析を用いて）して、腫瘍が所定の遺伝子クラスタを有するかどうかを（例えば、ルミナル（luminal）型またはベイサル（basal）Ａ型）を判定することができ、もしそうであれば、アミノフラボン化合物を患者に投与することが可能である。別のケースでは、腫瘍がベイサルＢ型の遺伝子クラスタを有する場合、アミノフラボン化合物を用いる処置の前に、例えばヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤などの遺伝子転写を改変することができる薬剤を用いた前処置が患者に施される。
【００１５】
遺伝子プロファイルを判定する方法は、腫瘍細胞を患者から切除すること、この細胞を洗浄すること、および任意選択で解離すること、ならびに例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁することを任意選択で含む。次いで、これらの細胞から全ＲＮＡを抽出し、これを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社またはＩｌｌｕｍｉｎａ社のヒトゲノム・アレイを使用して全ゲノム分析にかける。
【００１６】
乳腺腫瘍は、解離されていてもされていなくても、その遺伝子的プロファイルおよび組織構造に基づいて分類することができる。例えば、Neveおよび同僚たちは、特定の乳癌細胞系を、その遺伝子的および組織構造的プロファイルで分類している。Neve R.M.等「A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes」、癌細胞、２００６年１２月、１０（６）：５１５−２７を参照されたい。これらの遺伝子的および組織構造的プロファイルは、例えば肝臓、結腸、前立腺、骨、肝臓、肺、小腸、膵臓、皮膚などの様々な癌細胞上で実施することができる。
【００１７】
収集した細胞のＥＲ状態は、当技術分野で知られている方法（例えば、免疫蛍光または免疫ペルオキシターゼ・アッセイ、ウエスタン・プロット分析、ＥＲ特異なｍＲＮＡの識別、電気泳動モビリティ・アッセイ（ＥＶＳＡ）で測定される、３つの異なるＥＲ特異な抗体に対するＥＲ−ＥＲＥ複合体の相互作用）で判定することが可能である。例えば、Averboukh等の「Classification of Breast Cancer Cells on the Basis of a Functional Assay for Estrogen」、分子医療、Ｖｏ．４、Issue ７、４５４−４６７（１９９８年７月）を参照されたい。例えば、ＴＥ１−１１（Ａｂｃａｍ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）によりａｂ１６４６０として販売、またはＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州デンバー（＃２５１２）により販売）などのＥＲαに特有の抗体を、ＦＩＴＣとコンジュゲートされた抗マウス抗体と合わせて使用して免疫蛍光アッセイを実施することも、ホースラディッシュペルオキシダーゼと合わせて使用して、エストロゲン受容体を検出するために免疫組織化学検査を実施することも可能である。
【００１８】
ルミナルまたはベイサル状態を、当技術分野で知られた方法で判定することができる。例えば、Tibshirani等の「Diagnosis of Multiple Cancer Types by Shrunken Centroids of Gene Expression」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：６５６７−６５７２（２００２）によるマイクロアッセイ予測分析（ＰＡＭ）を、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ２．０ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）Ａｓｓａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標））と同様に使用することができる。これらのルミナルおよびベイサル状態は、ベイサルＡおよびベイサルＢならびにルミナルＡおよびルミナルＢに上で議論したものと同一の方法でさらに分けることができる。
【００１９】
例えば、ＥＲＢＢ３−、ＥＳＲ１−陽性、ＥＳＲ１−陰性、ＣＡＶ１−陽性、ＫＲＴ５−、ＫＲＴ１４−遺伝子に対して既知のマーカを用いた遺伝子発現プロファイルは、（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）の）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３Ａ２．０ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）Ａｓｓａｙで判定することができる。ルミナル細胞型乳癌細胞は、通常、ベイサル細胞型乳癌細胞と比較してＥＲＢＢ３−およびＥＳＲ１−陽性遺伝子を過剰発現させる。同様に、ベイサル細胞型乳癌細胞は、ルミナル細胞型と比較してＥＳＲ１−陰性およびＣＡＶ１−陽性遺伝子を過剰発現させる。ベイサル細胞型は、ベイサルＡおよびベイサルＢ細胞型にさらに分けることができる。ベイサルＡ細胞型は、ベイサルＢ細胞型と比較してＫＲＴ５−およびＫＲＴ１４−陽性遺伝子を過剰発現させる。ベイサルＢ細胞型は、ベイサルＡよりもＶＩＭ−陽性遺伝子の発現が高い。「過剰発現する」または「過剰発現」といった語は、腫瘍形成性であると推測される細胞中のｍＲＮＡおよび／または遺伝子もしくは遺伝子クラスタのコピー数が、正常すなわち腫瘍形成性でないと考えられる異なる遺伝子型の細胞の少なくとも約２倍に増加することを指す。過剰発現は、例えば、実際のｍＲＮＡレベル、遺伝子または遺伝子クラスタのコピー数を核酸プローブまたは同様の技法を用いて比較することにより、あるいは、例えば、蛋白質または遺伝子もしくは遺伝子クラスタでコード化された蛋白質に対する抗体の結合の強度を、免疫蛍光もしくは放射標識抗体または同様の検出試薬を用いて測定することにより判定することができる。
【００２０】
別のケースでは、先立って最多で２つの事前化学療法レジメンに失敗した乳癌患者またはホルモン処置に失敗したＥＲ−陽性患者を、まず、ＡＦＰ４６４を用いた処置の前にボリノスタット（またはスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ））、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いて処置する。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、約１〜約４００ｍｇ／ｋｇの用量、好ましくは１日に約２００〜約４００ｍｇの用量で投与することができる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ＡＦＰ４６４の投与の２〜７日前、好ましくはＡＦＰ４６４の投与の３〜６日前、最も好ましくはＡＦＰ４６４の投与の５日前に投与することができる。
【００２１】
ＡＦＰ４６４は、好ましくは約１〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で、好ましくは約３５〜約７０ｍｇ／ｋｇで、最も好ましくは約３５ｍｇ／ｋｇで投与する。処置スケジュールは、上で議論した任意の服用範囲で、ＡＦＰ４６４の少なくとも１度の追加の服用を含むことがある。追加のＡＦＰ４６４は、初回服用後の任意の日に、好ましくは３日目、５日目、１５日目、１７日目、および１９日目（初回服用日を１日目とする）に投与することができる。
【００２２】
ＡＦＰ４６４の投与前に、少なくとも１度のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の追加の投与を行うこともできる。例えば、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を３日間投与し、ＡＦＰ４６４投与の１日前に再度投与することができる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の追加の投与は、ＡＦＰ４６４の投与後に（ＡＦＰ４６４の投与前の追加の服用に加えてまたはその代わりに）も行うことができる。例えば、ＨＤＡＣの追加の投与は、ＡＦＰ４６４の投与後１０〜１５日目に、好ましくはＡＦＰ４６４投与後１２〜１４日目に行うことができる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ＡＦＰ４６４の投与後１２、１３、および１４日目に投与することもできる。
【００２３】
上の記載に従って使用することのできるアミノフラボン化合物の例には以下が含まれる。
【化１】
【００２４】
上の化学式では、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、ＣＯＣＨ２−Ｒ７であり、ただし、Ｒ７は、アミノ、分岐もしくは直鎖アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、またはアルキルもしくはジアルキルアミノアルキル、あるいはαアミノ酸残基であり、ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈではない。
【００２５】
上の化学式では、Ｒ３は、Ｈ、分岐もしくは直鎖アルキル、ヒドロキシアルキル、アルカノイルオキシアルキル（alkanoyloxyalkyl）、アルカノイルオキシ（alkanoyloxy）、アルコキシ、またはアルコキシアルキル、あるいは、
【００２６】
薬学的に許容可能な上の物質の塩である。
【００２７】
他の例には、５−アミノ−６，８−ジフルオロ−２−［３−フルオロ−４−［（Ｌ−リジル）アミノ）］フェニル］−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、５−アミノ−２−［４−［２−アミノ−５−グアニジノペンタノイル（guanidinopentanoyl）］アミノ］−３−フルオロフェニル］−６，８−ジフロオロ−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、６，８−ジフロオロ−７−メチル−５−（ジメチルアミノ）アセトアミド−２−［４−（ジメチルアミノ）アセトアミド−３−フルオロフェニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、５−アミノ−６，８−ジフルオロ−７−メチル−２−［４−（ジメチルアミノ）アセトアミド−３−フルオロフェニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンとが含まれる。
【００２８】
上で説明したように使用することの可能なアミノフラボン化合物には、ＡＦＰ４６４が含まれるが、これは以下の構造を有する。
【化２】
【００２９】
限定するわけではないが、本明細書の開示内容に従って使用することの可能なアミノフラボン化合物（およびその派生物、薬学的に許容可能な塩、または代用物）には、表１に示す任意の化合物が含まれる。
【表１】
【００３０】
本明細書に記載する化合物および組成物は、どのような投与経路（例えば、経口、皮下、および非経口投与）に適した形態にも調製することができる。非経口投与には、例えば、静脈内、腹膜内、肺内、および髄膜内注入が含まれる。これらの化合物および組成物は、局所的に投与することも可能である。
【００３１】
さらに、スクリーニング・テスト・キットを製作し、病院、看護師、医者、および／または他の医療を職業とする人に販売することもできる。通常、病理医は、乳腺腫瘍組織の生検を実施し、この腫瘍組織に含まれる腫瘍細胞の遺伝子プロファイルを判定して、上で議論した方法のいずれかにより、腫瘍がアミノフラボン（または他のアミノフラボン・アナログもしくはプロドラッグ）に感応性を有するかどうかを判定することができる。次いで、医療提供者は、遺伝子発現プロファイルがアミノフラボンに感応性を有する場合、腫瘍を処置するためにアミノフラボンを投与することができる。この開示内容によるテスト・キットは、遺伝子発現およびコピー数を判定するのに必要な材料（例えば、核酸プローブおよび試薬またはマイクロアレイ・チップ）を含むことがある。もう１つの選択肢として、患者の遺伝子プロファイル（例えば、ベイサルＢ）に基づいて、医療提供者は、アミノフラボン（例えば、ＡＦＰ４６４）の前に、またはアミノフラボンと組み合わせて、ＨＤＡＣ阻害剤を投与することもできる。
【００３２】
スクリーニング・テスト・キットには、ＡｈＲに対する既知の抗体を用いてＡｈＲの局在を判定するために、ＡｈＲの免疫組織化学もしくは免疫蛍光染色剤、または腫瘍生検標本もしくは循環性腫瘍細胞の量子ドット技術を用いた免疫染色剤が含まれることもある。
【００３３】
別のケースでは、本明細書で開示する方法を含んだ腫瘍量を減少させる方法により、未処置の腫瘍と比較して腫瘍量を１５％〜８５％減少させることが可能である。本明細書で開示する方法で、未処置の腫瘍と比較して腫瘍量を２５％〜７５％減少させることができるのが好ましく、５９％減少させるのが最も好ましい。
【００３４】
別のケースでは、動物の腫瘍（例えば、乳腺、肝臓、卵巣または膵臓）の増殖を阻害および／または軽減する方法を提供する。ＡＦＰ４６４の細胞の細胞質中のＡｈＲとの複合体、すなわちＡＦＰ４６４：ＡｈＲ複合体は、核に転移してＣＹＰ１Ａ１転写を誘発する。ＣＹＰ１Ａ１は、最終的に細胞死を起こすカスケード・パスウェイ（cascade pathway）につながる。したがって、腫瘍または循環性腫瘍細胞を分析して、ＡｈＲが主として腫瘍細胞の細胞質に局在しているかどうかを判定することができ、もしそうであれば、アミノフラボン化合物をこの患者に投与することができる。例えば、腫瘍中のＡｈＲの局在は、ＡｈＲに対する抗体を用いた、腫瘍または循環性腫瘍細胞の試料の免疫組織化学または蛍光免疫染色で判定することができる。例えば、Ｂｉｏｍｏｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ペンシルバニア州プリマスミーティング（＃ＳＡ−２１０）から販売されている抗体、またはＡｂｎｏｖａ（台湾）カタログ番号Ｈ０００００１９６−Ｍ０２で販売されている抗体を使用してＡｈＲの局在を判定することができる。アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の局在は、当技術分野で知られた方法で判定することができる。例えば、こうした局在は、ＡｈＲに対する市販抗体（Ａｂｎｏｖａ、Ｂｉｏｍｏｌ）を含んだ懸濁液中で解離癌細胞を培養し、免疫蛍光法でＡｈＲを検出することにより、または保管腫瘍組織を用い、免疫ペルオキシターゼをベースとする組織診断でＡｈＲを検出することにより判定することができる。
【００３５】
本開示内容のこれらおよび他の特性および利点は、詳細な説明を読むことにより当業者にとって明らかになるであろう。特定の課題または環境への本開示内容の応用は、当業者の実施可能な範囲内のことであることを理解されたい。本開示内容の実施のいくつかを、以下の非限定的例を用いて例示する。
【００３６】
表２に示す乳癌細胞系のスクリーニングを実施して、上で議論した技法に従いアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の局在を判定した。ＭＴＴアッセイを実施して、様々な乳癌細胞系における細胞死を測定した。この例では、ＡＦＰ４６４での処置後にＩＣ５０およびＩＣ１００値が１μＭ未満の乳癌細胞系は、ＡＦ感応性と判定され、ＡＦＰ４６４での処置後にＩＣ５０およびＩＣ１００値が１μＭ超の乳癌細胞系は、ＡＦ耐性と判定された。ＡｈＲが主に細胞質中に存在する細胞系は全て、ＡＦ感応性であることを示した。ＭＣＦ−７は、ＩＣ５０値が１６ｎＭであり、ＩＣ１００値が３００ｎＭであった。ＭＣＦ−７ ＨＥＲ２−１８（本質的にタモキシフェンおよびハーセプチンに耐性を有するＭＣＦ−７）は、ＩＣ５０値が２０ｎＭで、ＩＣ１００値が３７５ｎＭであった。ＭＣＦ−７ ＴＡＭ１（後天的にタモキシフェンへの耐性を有するＭＣＦ−７）は、ＩＣ５０値が２５ｎＭで、ＩＣ１００値が２００ｎＭであった。Ｔ４７Ｄは、ＩＣ５０値が１４ｎＭで、ＩＣ１００値が２０ｎＭであった。また、４つの細胞系は全て、表２に示すようにＥＲ状態が陽性であり、値が示すように、それぞれＡＦ感応性であった。
【００３７】
一方、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ１０Ａ細胞系は、ＡＦ耐性と判定された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＩＣ５０値が２５μＭであり、ＩＣ１００値が１００μＭ超であった。ＭＣＦ１０Ａは、ＩＣ５０値が３μＭであり、ＩＣ１００値が９μＭであった。これらの細胞系は両方とも、ＡｈＲが主に核内に局在した。図１Ａに示すように、ＡｈＲは、主に、ＡＦ耐性ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−ＴＡＭ１乳癌細胞系の細胞質内に局在する。細胞質を示すために、左側の列でＴＲＩＴＣを使用する。（ＤＮＡへの結合により）核を示すために、ＤＡＰＩを右側の列で使用する。また、ＡＦ耐性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞系における核中へのＡｈＲの主な局在を図１Ａに示す。
【００３８】
図１Ｂは、ＤＮＡ二重鎖切断のマーカであるリン酸化γ−Ｈ２ＡＸの免疫蛍光を（２番目の列に）示す。γ−Ｈ２ＡＸ染色は、ＡＦ：ＡｈＲ複合体が細胞質から核に転移して、最終的にアポトーシスに導くシグナル伝達カスケードを活性化したことを示している。リン酸化γ−Ｈ２ＡＸは、細胞中のＤＮＡ損傷応答の指示薬である。理論に束縛されるものではないが、γ−Ｈ２ＡＸの局在は、ＡＦ：ＡｈＲ複合体がＤＮＡ損傷の原因であることを示す。
【表２】
【００３９】
同様に、表３に示す卵巣癌細胞系のスクリーニングを実施して、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の局在を判定した。下で示すように、さらに図２および３に示すように、ＡｈＲが主に細胞質中に局在する細胞系（例えば、ＯＶＣＡＲ−３およびＩＧＲＯＶ−１）は全て、ＡｈＲが主に核中に存在する細胞系（例えば、ＯＶＣＲ−８）よりもＡＦＰ４６４での処置に対して強い感応性を有した。ＯＶＣＡ−３は、ＩＣ５０値が０．２５２μＭであった。ＩＧＲＯＶ−１は、ＩＣ５０値が０．４２μＭであった。ＡＦ耐性ＯＶＣＡＲ−８は、ＩＣ値が１３μＭであった。
【００４０】
ＡｈＲの局在および、細胞系がＡＦ感応性かＡＦ耐性であるかを判定するのにＡｈＲの局在が影響を与えることは、処置の流れを決定するのに役立つことがある。さらに、ＡＦＰ４６４の処置を、ＡｈＲが主に細胞質中に局在することが分かっている、例えば膵臓腫瘍などの別の種類の腫瘍にまで拡張することが可能である。
【表３】
【００４１】
図３は、トリプル・ネガティブＭＸ−１乳癌細胞系、ＥＲ陰性ベイサルＡ ＨＣＣ１９３７乳癌細胞系、およびＩＧＲＯＶ１卵巣癌細胞系におけるＡｈＲの局在を示す。ＡｈＲ局在は、上で議論したように、ＡＦＰ４６４の細胞毒性活性に相関する。核ＡｈＲを有するＭＸ−１は、ＡＦＰ４６４での処置に耐性を有し（ＩＣ５０＝３０μＭ）、細胞質ＡｈＲを有するＨＣＣ１９３７およびＩＧＲＯＶ１系は、ＡＦＰ４６４に感応性を有する（ＩＣ５０ １０〜２００ｎＭ）。９６ウェル・プレートにおけるＡＦＰ４６４への５日間の細胞の連続的曝露と、メチルテトラゾリウムのホルマザンへの生細胞を用いた変換（ＭＴＴアッセイ）による細胞増殖の検出との結果として得られる３つ全ての細胞系の増殖曲線を示す。図３の細胞系は全て、非常に活動的な形態の遺伝子乳癌および卵巣癌の原因となる欠陥をＢＲＣＡ腫瘍サプレッサ遺伝子中に有する。ＭＸ−１には、ＢＲＣＡ１欠失およびＢＲＣＡ２変異があり、ＨＣＣ１９３７では、ＢＲＣＡ１が変異し完全に欠陥となり、ＩＧＲＯＶ１では、ＢＲＣＡ２（＋／−）が欠陥である。
【００４２】
感応性細胞では、ＡＦＰ４６４は、ＡｈＲ介在シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）依存の生体異物反応および細胞死を誘発する。耐性細胞では、ＣＹＰシステムは誘発されない。リアルタイムＰＣＲアセスメントにより、ＡｈＲ依存の生体異物反応が回復するといった、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中でＨＤＡＣ阻害剤およびＡＦＰ４６４を用いた処置によるＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１の誘発が示された（図５、下記でさらに議論する）。
【００４３】
以下の表４に示すように、１１個の乳癌細胞系の遺伝子プロファイルを判定し、各細胞系をテストして、アミノフラボンの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。阻害濃度５０％は、ＭＴＴアッセイでＮＣＩ ＤＴＰインビトロ・テスト手順（http://dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.htm）に従って求めた。独立した３度のＭＴＴインビトロ腫瘍細胞増殖阻害実験を実施し、表４に示す平均ＩＣ５０値が得られた。
【表４】
【００４４】
ＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７ Ｔａｍ１、およびＭＣＦ−７ Ｈｅｒ２−１８細胞系は全て、ルミナル型遺伝子クラスタである。これらの細胞系の全ては、ＡＦ４６４に対して感応性を有する０．０１６〜０．０２０のμＭ範囲のＡＦ ＩＣ５０濃度を有する。上で議論した先のＮＣＩ細胞系スクリーン結果に基づいて、ＥＲ陰性腫瘍はアミノフラボンに耐性を有すると考えた。しかし、表４に示すように、ＨＣＣ１９３７、ＢＴ２０、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（全てベイサルＡ型）、およびＳＫＢＲ３（ルミナル型）は、全てＥＲ陰性腫瘍細胞であり、全てＡＦＰ４６４に感応性を有する。これらのＥＲ陰性細胞系のＡＦ ＩＣ５０濃度は、０．０１０〜０．０２０μＭに過ぎない。したがって、ＥＲ状態に関連する遺伝子プロファイルのみでは、ＡＦでの処置に対する腫瘍の感応性を予測することはできない。ＡＦＰ４６４は、常にルミナル型組織構造であるＥＲ陽性乳癌細胞に有効であるだけでなく、ベイサルＡサブタイプのＥＲ陰性乳癌にも有効である。
【００４５】
別のケースでは、表５Ａおよび５Ｂに示すように、例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）などのＨＤＡＣ阻害剤を用いた、ＥＲ陰性、「トリプル・ネガティブ」、またはベイサルＢ乳癌細胞系の前処置により、細胞系のＥＲ状態が変調され、細胞系が〜１μＭのＩＣ５０でアミノフラボンへの感応性を有するようになった。こうした結果は、ＳＡＨＡによるこれらの細胞系の感作が時間、スケジュール、および細胞型に依存していることを示している。
【表５Ａ】
【表５Ｂ】
【００４６】
薬品ごとに最多で８つの濃度を用い、ＭＴＴアッセイで増殖を判定することにより、固定ＩＣ５０比率でChouおよびTalalayの方法（Chou, T.C.およびTalalay, P「Quantitative analysis of dose-effect relationships: The combine effects of multiple drugs or enzyme inhibitors」Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．、２２：２７−５５、１９８４参照）に従って、組合せ検査を実施した。１つのケースでは、有効（ＥＤ）量５０、７５または９０％での組合せ指数が１未満の場合は、２つの薬剤の相乗効果が示され、１の場合は、薬剤は相加的であり、１より大きい場合は、薬剤は拮抗的である。
【００４７】
図４Ａおよび４Ｂは、ＳＡＨＡ（このケースでは、ボリノスタット）で処置する際の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞系（図４Ａ）およびＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞系（図４Ｂ）中のＥＲαの誘発を示すウエスタン・ブロットを示す。図４Ａおよび４Ｂそれぞれのレーン１は、それぞれの細胞をＤＭＳＯで処置した対照を示す。図４Ａのレーン２は、ＳＡＨＡを用いて６０時間２．５μＭ（ＩＣ５０）で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を示す。図４Ａのレーン３は、ＳＡＨＡを用いて６０時間１３．５μＭ（ＩＣ１００）で処置したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を示す。図示のように、ＥＲα誘発は、ＳＡＨＡ処置後に増加する。図４Ｂのレーン２および３は同様の結果を示すが、図４Ｂのレーン２は、ＳＡＨＡを用いて４８時間８μＭ（ＩＣ５０）で処置したＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞系を示し、図４Ｂのレーン３は、ＳＡＨＡを用いて４８時間１００μＭ（ＩＣ１００）で処置したＨｓ５７８Ｔ乳癌細胞系を示すものである。
【００４８】
図５は、ＳＡＨＡで処置し、次いでＡＦＰ４６４で処置した後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞におけるＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１経路の誘発を測定する棒グラフである。左側の棒グラフは、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１に対するＲＮＡの発現がほとんどないことを示す対照を示す。中央のグラフは、ＳＡＨＡで４８時間処置し、次いでＡＦＰ４６４で６時間処置した後に、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１に対するＲＮＡの発現が増加したことを示す。右側のグラフは、ＳＡＨＡで４８時間処置し、次いでＡＦＰ４６４で２４時間処置した後に、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１に対するＲＮＡの発現がほとんどないことを示し、このことは、ＳＡＨＡによる感作が時間およびスケジュールに依存していることを示している。ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１発現ベクター・コンストラクトを使用し、これらのベクターｃＤＮＡで標準曲線を作成することにより、免疫蛍光信号をコピー数に対して基準化した。ベースラインおよび２４時間のＡＦＰ４６４と比較して、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１の誘発は、ＳＡＨＡで前処置された細胞中でＡＦＰ４６４処置の６時間後に確認される。
【００４９】
次いで、上で議論した発見事項を説明するインビボ検査を実施した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞系は、元々、テキサス州、ヒューストンのＭＤ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの患者腫瘍から確立されたものである。これらの細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州、マナサス）から得た。この細胞系は、「トリプル・ネガティブ」乳癌のカテゴリに属し、したがって、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体ならびにＨＥＲ２／ｎｅｕが欠如している。また、この細胞系は、ｐ５３変位を含んでいる。
【００５０】
Ｎｃｒ／ｎｕの遺伝的背景の胸腺形成不全ヌードマウスを用いて、細胞系からのヒト腫瘍異種移植片ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の確立および連続的増殖を行った。腫瘍断片（〜３０ｍｍ３のサイズ）をヌードマウスに皮下移植し、腫瘍が〜７０ｍｍ３のメディアン（median）体積に達した際に処置を開始した（移植後〜１０日間、初期）。この皮下異種移植片ステージング・システムは、米国国立癌研究所のＤｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍで定義されたものである。メディアン体積１９０ｍｍ３（１００〜４００ｍｍ３）の腫瘍は、進行期と称される。腫瘍サイズが６３〜２００ｍｍ３の際に処置が開始される場合は、このモデルは初期とみなされる。Alley MC、Hollingshead MG、Dykes DJ、Waud WRの「Human tumor xenograft models in NCI drug development」、Teicher BA、Andrews PA編集、Anticancer drug development guide: preclinical screening, clinical trials, and approval、第２版、ニュージャージー州、トトワ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ社、２００４、ｐ．１２５−５２参照。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、増殖の早い腫瘍（対数増殖における平均倍増時間〜４．５日間）であり、９５％超のテーク・レート（take rate）を有するので、国立癌研究所の初期腫瘍異種移植片モデルに適した基準を満たしている。Fiebig HH、Burger AMの「Human tumor xenografts and explants」、Teicher BA編集、Animal models in cancer research、ニュージャージー州、トトワ、Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ社、２００１、ｐ．１１３−３７参照。また、Geran RI、Greenberg NH、MacDonald MM、Schumacher AM、Abbott BJの「Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems」、Cancer Chemother １９７２、Rep３：１−１０３参照。１つのグループは、両側腹部にそれぞれ１〜２個の腫瘍があるマウスを７〜８匹含んだ。
【００５１】
次に、処置およびデータ評価について議論する。ＡＦＰ４６４を５％無菌グルコース溶液（ビヒクル）中に溶解し、静脈内に投与し、ボリノスタット／ＳＡＨＡをメチルセルロース／ツイーン８０中で調製し、経口投与を行った。実験開始前のＡＦＰ４６４の最大耐量（ＭＴＤ）は、静注で７５ｍｇ／ｋｇ／日と判定された。ＳＡＨＡを非中毒量の５０ｍｇ／ｋｇ／日で経口投与した。マウス中のＳＡＨＡのＭＴＤは１７５ｍｇ／ｋｇ／日である。この実験では、１５０ｍｇを超えるＳＡＨＡを連続した３日間投与した（−２、−１および０日目（ｄ０）、１２〜１４日目（ｄ１２〜１４））。ＡＦＰ４６４は、１、３、５、１５、１７、および１９日目に投与した。
【００５２】
腫瘍増殖の後に、連続ノギス測定、重量記録を行い、標準式（長さ×幅２）／２を用いて腫瘍体積を算出した。ただし、長さは、最大寸法であり、幅は、長さに垂直な最小寸法である。ｍｍ３での腫瘍体積が、この式から導き出される適当な変数である一方で、１ｍｍ３が１ｍｇの腫瘍重量に等しいことに留意しなければならない。皮下増殖ヒト腫瘍異種移植片における抗癌剤効果のアセスメント向けの国立癌研究所ガイドラインを用いて、データを評価した。具体的に指定されたソフトウェア（Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ）を使用して、メディアン相対腫瘍体積を時間に対してプロットした。各腫瘍について、Ｘ日目の腫瘍体積を０日目の腫瘍体積で除することにより（無作為時間）、相対腫瘍体積を算出した。対照に対して処置した最大腫瘍阻害／最適腫瘍阻害％（Ｔ／Ｃ）について、増殖曲線を分析したが、ただし、処置（Ｔ）および対照（Ｃ）グループごとの腫瘍体積（δＴＶ）の変化を日ごとに算出した。初めの処置日（ステージング日）のメディアン腫瘍体積を、指定の観察日のメディアン腫瘍重量から減ずることにより腫瘍を測定した。これらの値を用いて、％Ｔ／Ｃを以下のように算出した。
【００５３】
％Ｔ／Ｃ＝（ΔＴ／ΔＣ）×１００、ただしΔＴ＞０、または
％Ｔ／Ｃ＝（ΔＴ／Ｔ１）×１００、ただしΔＴ＜０でＴ１＝処置開始時のメディアン腫瘍体積である。
【００５４】
得られた最適（最小）値を用いて抗腫瘍活性を定量化し、この効果が生じる日にちを示す。腫瘍阻害を、５０未満の最適Ｔ／Ｃと定義する。部分的腫瘍退縮を、腫瘍体積が処置開始時の腫瘍体積の５０％以下に減少することと定義する。完全退行とは、実験期間の任意の時間に、腫瘍量が６３ｍｍ３未満に減少する例である。
【００５５】
図６および表６は、結果ならびにインビボ検査の処置スケジュールを示す。対照グループのメディアン相対腫瘍体積は、予想されたとおり、絶えずその他のグループのものよりも大きかった。予想に反してその他のグループのものよりも小さかったのは、ＳＡＨＡ＋ＡＦＰ４６４ ３５ｍｇ／ｋｇのグループであった。これらの結果は、ＳＡＨＡを用いた前処置およびＡＦを用いた処置により、こうした処置を取らなければ耐性乳癌である腫瘍のパーセント増殖阻害を増大させることができることを示している。
【表６】
【００５６】
癌患者の処置について以下で議論する。腫瘍の生検を患者から得ることができる。当明細書に記載するように、この生検を組織学的技法で分析し、かつ／または遺伝子クラスタを分析することができる。患者がＥＲ陽性乳癌を有する場合、アミノフラボン化合物をこの患者に投与して、患者血漿中で約１μＭの濃度を達成する。患者がホルモン療法に耐性を有する乳癌を有する場合、アミノフラボン化合物をこの患者に投与する。患者がホルモン療法とハーセプチン療法との両方に耐性を有する乳癌を有する場合、アミノフラボン化合物をこの患者に投与する。
【００５７】
乳癌の遺伝子プロファイルを判定し、腫瘍がルミナルまたはベイサルＡ型の遺伝子クラスタを示す場合、アミノフラボン化合物を患者に投与する。患者がＥＲ陰性、「トリプル・ネガティブ」、ベイサルＢ型の遺伝子クラスタを伴う乳癌を有する場合、患者に、アミノフラボン化合物を用いた処置の前に、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を用いた前処置を行う。ＨＤＡＣ阻害剤を用いた前処置により、エストロゲン受容体シグナリングが変調され、細胞がアミノフラボンに対して感応性を有するようになる。
【００５８】
他の例では、腫瘍（例えば、乳癌、卵巣癌、肝臓癌または膵臓癌）におけるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の局在を判定し、この腫瘍が主に細胞質に局在するＡｈＲを有する場合、アミノフラボン化合物を患者に投与する。
【００５９】
もう１つの選択肢として、または上記に加えて、単一薬剤ＡＦＰ４６４を７４ｍｇ／ｍ２で、２１日周期のうちの１日目および８日目（Ｄ１およびＤ８）に静脈内投与して、ホルモン処置に失敗した患者を処置することもできる。任意選択で、最多で２つの事前化学療法レジメンに失敗した患者を、２１日周期のうちのＤ１およびＤ８の７４ｍｇ／ｍ２の用量でのＡＦＰ４６４の各静脈内投与の前５日間、４００ｍｇ／日 ＰＯでＳＡＨＡを用いて処置することもできる。病状が悪化するか、または毒性が許容可能でなくなるまで処置を行うことができる。ＡＦＰ４６４は、７４ｍｇ／ｍ２で３時間の静脈内注入として投与することができる。ボリノスタットは、各ＡＦＰ４６４服用の５日前に経口投与することができる。
【００６０】
上の説明および図面は、本明細書の開示内容を例示するものである。当業者は、上の開示内容に、置換、追加、削除、改変および／または他の変更を行うことができることを理解するであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳腺腫瘍体積を減少させる方法であって、
前記乳腺腫瘍がエストロゲン受容体陰性ルミナル・サブタイプ遺伝子クラスタおよびベイサルＡサブタイプ遺伝子クラスタからなる群から選択される型の細胞を含むかどうかを判定するステップと、
前記乳腺組織試料がエストロゲン受容体陰性ルミナル・サブタイプ遺伝子クラスタおよびベイサルＡサブタイプ遺伝子クラスタからなる群から選択される型の細胞を含む場合、前記乳腺腫瘍を有する哺乳類に有効量の化合物を投与するステップと、
を含み、
前記化合物が、以下の一般式を有し、
【化１】
前記一般式では、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、ＣＯＣＨ２−Ｒ７であり、ただし、Ｒ７は、アミノ、分岐もしくは直鎖アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、またはアルキルもしくはジアルキルアミノアルキル、あるいはαアミノ酸残基であり、ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈではなく、
前記一般式では、Ｒ３は、Ｈ、分岐もしくは直鎖アルキル、ヒドロキシアルキル、アルカノイルオキシアルキル、アルカノイルオキシ、アルコキシ、またはアルコキシアルキルであり、あるいは、薬学的に許容可能な、前記物質の塩であり、
前記乳腺腫瘍の体積が、少なくとも約１５％減少される方法。
【請求項２】
前記化合物が以下の一般式の物質である、請求項１に記載の方法。
【化２】
【請求項３】
前記化合物が、５−アミノ−６，８−ジフルオロ−２−［３−フルオロ−４−［（Ｌ−リジル）アミノ）］フェニル］−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、５−アミノ−２−［４−［２−アミノ−５−グアニジノペンタノイル］アミノ］−３−フルオロフェニル］−６，８−ジフロオロ−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、６，８−ジフロオロ−７−メチル−５−（ジメチルアミノ）アセトアミド−２−［４−（ジメチルアミノ）アセトアミド−３−フルオロフェニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、５−アミノ−６，８−ジフルオロ−７−メチル−２−［４−（ジメチルアミノ）アセトアミド−３−フルオロフェニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンとからなる群から選択される、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、経口、非経口、または局所投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記局所投与が、静脈内投与、腹膜内投与、肺内投与、または髄膜内投与からなる群から選択される、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞型を判定する前記ステップが、遺伝子発現プロファイルを実施するステップを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞型を判定する前記ステップが、前記乳腺組織試料の細胞中のＥＲＢＢ−３およびＥＳＲ−１遺伝子が過剰発現しているかどうかを判定するステップを含む、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記乳腺組織試料中のＥＲＢＢ−３またはＥＳＴ−１遺伝子の発現が、非腫瘍形成性乳腺組織中のＥＲＢＢ−３またはＥＳＴ−１遺伝子の発現よりも、少なくとも約２倍多い、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞型を判定する前記ステップが、前記乳腺組織試料の細胞中のＫＲＴ５およびＫＲＴ１４遺伝子が過剰発現しているかどうかを判定するステップを含む、
請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ＫＲＴ５またはＫＲＴ１４遺伝子の発現が、非腫瘍形成性乳腺組織中のＫＲＴ５またはＫＲＴ１４遺伝子の発現よりも、少なくとも約２倍多い、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
処置の必要な患者の腫瘍の増殖を阻害する方法であって、
前記患者にヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を投与するステップと、
次いで、前記患者に、以下の一般式を有する化合物を投与するステップと
を含み、
【化３】
前記一般式では、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、ＣＯＣＨ２−Ｒ７であり、ただし、Ｒ７は、アミノ、分岐もしくは直鎖アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、またはアルキルもしくはジアルキルアミノアルキル、あるいはαアミノ酸残基であり、ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈではなく、
前記一般式では、Ｒ３は、Ｈ、分岐もしくは直鎖アルキル、ヒドロキシアルキル、アルカノイルオキシアルキル、アルカノイルオキシ、アルコキシ、またはアルコキシアルキルであり、あるいは、薬学的に許容可能な、前記物質の塩であり、
前記腫瘍の増殖が、約１５〜約８５％減少される方法。
【請求項１２】
前記化合物が以下の一般式の物質である、請求項１１に記載の方法。
【化４】
【請求項１３】
前記化合物が、５−アミノ−６，８−ジフルオロ−２−［３−フルオロ−４−［（Ｌ−リジル）アミノ）］フェニル］−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、５−アミノ−２−［４−［２−アミノ−５−グアニジノペンタノイル］アミノ］−３−フルオロフェニル］−６，８−ジフロオロ−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、６，８−ジフロオロ−７−メチル−５−（ジメチルアミノ）アセトアミド−２−［４−（ジメチルアミノ）アセトアミド−３−フルオロフェニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、５−アミノ−６，８−ジフルオロ−７−メチル−２−［４−（ジメチルアミノ）アセトアミド−３−フルオロフェニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンとからなる群から選択される、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記処置化合物を前記患者に投与する前記ステップにより、前記患者の血漿中の前記増殖阻害化合物の濃度が約０．１μＭ〜約５００μＭになる、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）である、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記増殖阻害化合物の投与の２〜７日前に前記ＨＤＡＣ阻害剤を投与する、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記増殖阻害化合物の投与の３〜６日前に前記ＨＤＡＣ阻害剤を投与する、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記増殖阻害化合物の投与の５日前に前記ＨＤＡＣ阻害剤を投与する、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＨＤＡＣ阻害剤を経口投与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＤＡＣ阻害剤を約１〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＤＡＣ阻害剤を約２５〜約７５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤を約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物がＡＦＰ４６４である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物を約１〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、
請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物を約３５〜約７０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物を約３５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、
請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物の投与の後にＨＤＡＣ阻害剤の第２の投与を実施するステップをさらに含む、
請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
前記増殖阻害化合物の前記投与の後１０〜１５日に前記ＨＤＡＣ阻害剤を投与する、
請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記増殖阻害化合物の前記投与の後１２〜１４日に前記ＨＤＡＣ阻害剤を投与する、
請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記増殖阻害化合物の前記投与の後の１２〜１４日それぞれの日に連続して前記ＨＤＡＣ阻害剤を投与する、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＨＤＡＣ阻害剤の前記第２の投与の後に前記化合物の少なくとも１度の追加投与を実施するステップをさらに含む、
請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤の前記第２の投与の３日後に、前記化合物の前記少なくとも１度の追加投与を実施する、
請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物の少なくとも１度の追加投与を約３５ｍｇ／ｋｇの服用量で実施する、
請求項３３に記載の方法。
【請求項１】
乳腺腫瘍体積を減少させる方法であって、
前記乳腺腫瘍がエストロゲン受容体陰性ルミナル・サブタイプ遺伝子クラスタおよびベイサルＡサブタイプ遺伝子クラスタからなる群から選択される型の細胞を含むかどうかを判定するステップと、
前記乳腺組織試料がエストロゲン受容体陰性ルミナル・サブタイプ遺伝子クラスタおよびベイサルＡサブタイプ遺伝子クラスタからなる群から選択される型の細胞を含む場合、前記乳腺腫瘍を有する哺乳類に有効量の化合物を投与するステップと、
を含み、
前記化合物が、以下の一般式を有し、
【化１】
前記一般式では、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、ＣＯＣＨ２−Ｒ７であり、ただし、Ｒ７は、アミノ、分岐もしくは直鎖アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、またはアルキルもしくはジアルキルアミノアルキル、あるいはαアミノ酸残基であり、ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈではなく、
前記一般式では、Ｒ３は、Ｈ、分岐もしくは直鎖アルキル、ヒドロキシアルキル、アルカノイルオキシアルキル、アルカノイルオキシ、アルコキシ、またはアルコキシアルキルであり、あるいは、薬学的に許容可能な、前記物質の塩であり、
前記乳腺腫瘍の体積が、少なくとも約１５％減少される方法。
【請求項２】
前記化合物が以下の一般式の物質である、請求項１に記載の方法。
【化２】
【請求項３】
前記化合物が、５−アミノ−６，８−ジフルオロ−２−［３−フルオロ−４−［（Ｌ−リジル）アミノ）］フェニル］−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、５−アミノ−２−［４−［２−アミノ−５−グアニジノペンタノイル］アミノ］−３−フルオロフェニル］−６，８−ジフロオロ−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、６，８−ジフロオロ−７−メチル−５−（ジメチルアミノ）アセトアミド−２−［４−（ジメチルアミノ）アセトアミド−３−フルオロフェニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、５−アミノ−６，８−ジフルオロ−７−メチル−２−［４−（ジメチルアミノ）アセトアミド−３−フルオロフェニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンとからなる群から選択される、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、経口、非経口、または局所投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記局所投与が、静脈内投与、腹膜内投与、肺内投与、または髄膜内投与からなる群から選択される、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞型を判定する前記ステップが、遺伝子発現プロファイルを実施するステップを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞型を判定する前記ステップが、前記乳腺組織試料の細胞中のＥＲＢＢ−３およびＥＳＲ−１遺伝子が過剰発現しているかどうかを判定するステップを含む、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記乳腺組織試料中のＥＲＢＢ−３またはＥＳＴ−１遺伝子の発現が、非腫瘍形成性乳腺組織中のＥＲＢＢ−３またはＥＳＴ−１遺伝子の発現よりも、少なくとも約２倍多い、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞型を判定する前記ステップが、前記乳腺組織試料の細胞中のＫＲＴ５およびＫＲＴ１４遺伝子が過剰発現しているかどうかを判定するステップを含む、
請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ＫＲＴ５またはＫＲＴ１４遺伝子の発現が、非腫瘍形成性乳腺組織中のＫＲＴ５またはＫＲＴ１４遺伝子の発現よりも、少なくとも約２倍多い、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
処置の必要な患者の腫瘍の増殖を阻害する方法であって、
前記患者にヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を投与するステップと、
次いで、前記患者に、以下の一般式を有する化合物を投与するステップと
を含み、
【化３】
前記一般式では、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、ＣＯＣＨ２−Ｒ７であり、ただし、Ｒ７は、アミノ、分岐もしくは直鎖アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、またはアルキルもしくはジアルキルアミノアルキル、あるいはαアミノ酸残基であり、ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、Ｈではなく、
前記一般式では、Ｒ３は、Ｈ、分岐もしくは直鎖アルキル、ヒドロキシアルキル、アルカノイルオキシアルキル、アルカノイルオキシ、アルコキシ、またはアルコキシアルキルであり、あるいは、薬学的に許容可能な、前記物質の塩であり、
前記腫瘍の増殖が、約１５〜約８５％減少される方法。
【請求項１２】
前記化合物が以下の一般式の物質である、請求項１１に記載の方法。
【化４】
【請求項１３】
前記化合物が、５−アミノ−６，８−ジフルオロ−２−［３−フルオロ−４−［（Ｌ−リジル）アミノ）］フェニル］−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、５−アミノ−２−［４−［２−アミノ−５−グアニジノペンタノイル］アミノ］−３−フルオロフェニル］−６，８−ジフロオロ−７−メチル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、６，８−ジフロオロ−７−メチル−５−（ジメチルアミノ）アセトアミド−２−［４−（ジメチルアミノ）アセトアミド−３−フルオロフェニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンと、５−アミノ−６，８−ジフルオロ−７−メチル−２−［４−（ジメチルアミノ）アセトアミド−３−フルオロフェニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンとからなる群から選択される、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記処置化合物を前記患者に投与する前記ステップにより、前記患者の血漿中の前記増殖阻害化合物の濃度が約０．１μＭ〜約５００μＭになる、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）である、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記増殖阻害化合物の投与の２〜７日前に前記ＨＤＡＣ阻害剤を投与する、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記増殖阻害化合物の投与の３〜６日前に前記ＨＤＡＣ阻害剤を投与する、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記増殖阻害化合物の投与の５日前に前記ＨＤＡＣ阻害剤を投与する、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＨＤＡＣ阻害剤を経口投与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＤＡＣ阻害剤を約１〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＤＡＣ阻害剤を約２５〜約７５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤を約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物がＡＦＰ４６４である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物を約１〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、
請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物を約３５〜約７０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物を約３５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、
請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物の投与の後にＨＤＡＣ阻害剤の第２の投与を実施するステップをさらに含む、
請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
前記増殖阻害化合物の前記投与の後１０〜１５日に前記ＨＤＡＣ阻害剤を投与する、
請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記増殖阻害化合物の前記投与の後１２〜１４日に前記ＨＤＡＣ阻害剤を投与する、
請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記増殖阻害化合物の前記投与の後の１２〜１４日それぞれの日に連続して前記ＨＤＡＣ阻害剤を投与する、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＨＤＡＣ阻害剤の前記第２の投与の後に前記化合物の少なくとも１度の追加投与を実施するステップをさらに含む、
請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤の前記第２の投与の３日後に、前記化合物の前記少なくとも１度の追加投与を実施する、
請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物の少なくとも１度の追加投与を約３５ｍｇ／ｋｇの服用量で実施する、
請求項３３に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５２４３７４（Ｐ２０１１−５２４３７４Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１３７５８（Ｐ２０１１−５１３７５８）
【出願日】平成２１年６月１６日（２００９．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４７４８０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００８７３１
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５１０３２８４１２）ティグリス ファーマスーティカルズ，インク． (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＩＧＲＩＳ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】３３５９ Ｗｏｏｄｓ Ｅｄｇｅ Ｃｉｒｃｌｅ，Ｓｕｉｔｅ １０３，Ｂｏｎｉｔａ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｆｌｏｒｉｄａ ３４１３４，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１６日（２００９．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４７４８０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００８７３１
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５１０３２８４１２）ティグリス ファーマスーティカルズ，インク． (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＩＧＲＩＳ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】３３５９ Ｗｏｏｄｓ Ｅｄｇｅ Ｃｉｒｃｌｅ，Ｓｕｉｔｅ １０３，Ｂｏｎｉｔａ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｆｌｏｒｉｄａ ３４１３４，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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