ウィルス感染の治療
本発明は、ＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター系の阻害剤の、ウィルス性疾患の予防又は治療のための、殊にインフルエンザ又はボルナ病のウィルス感染の予防又は治療のための、医薬品を製造するための使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター系の阻害剤の、ウィルス性疾患の予防又は治療のための、殊にインフルエンザ又はボルナ病のウィルス感染の予防又は治療のための医薬品を製造するための使用に関する。
【０００２】
ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−１、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎ウィルス、ＥＢＶ、ＶＳＶ及びインフルエンザウィルスを含む、ウィルスの複数のファミリーによってＮＦ−κＢは活性化される１。前記ウィルスのうちのいくつか、例えばレトロウィルス又はがんウィルスにとっては、前記転写因子の活性化がウィルス複製を援助する可能性がある一方で、ＲＮＡウィルス、例えばＶＳＶ又はインフルエンザウィルスによって感染すると、ＮＦ−κＢは抗ウィルス的に作用することが一般的な見方である２、３。ＲＮＡウィルス感染は一般に、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮｓ）によって媒介される先天性抗ウィルス反応の活性化を生じる。前記抗ウィルスプログラムはＩＦＮβ遺伝子のウィルスによる誘導により、構成的に発現した転写因子、即ちＡＰ−１、ＩＲＦ−３及びＮＦ−κＢを通して開始される４。ＩＦＮβの他に、炎症及び免疫反応の誘導に関連したその他の遺伝子も、ＮＦ−κＢによって調節されていて、例えばＩＬ−６、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１２である。従って、ＩＦＮβ、ＩＬ−６及びＩＬ−１２のＶＳＶにより誘導された発現は、ＮＦ−κＢアクチベーター、ＩκＢキナーゼ２（ＩＫＫ２）を欠失した細胞において欠損している２。
【０００３】
ウィルス増殖へのＮＦ−κＢ干渉のその他のレベルは、アポトーシスを調節するその能力を通してである。ＮＦ−κＢは主として、抗アポトーシス遺伝子、例えばＢｃｌ−ＸＬ、Ａ２０、又はｃｌＡＰｓを上方調節させることによる、生存因子であると考えられている５、６。しかし、ＮＦ−κＢはある種の状況下では、例えばデス誘導ＣＤ９５リガンド及びそのレセプターの上方調節により、アポトーシス促進的に作用するとも報告された５、６。このように、ＮＦ−κＢによるアポトーシスの、状況に応じた調節の概念が生じた６。例えば、デングウィルス感染ＨｅｐＧ２肝細胞はＮＦ−κＢ依存的にアポトーシスを経るが７、一方でＣ型肝炎ウィルスコアタンパク質によって誘導されたＮＦ−κＢ活性化は、同じ細胞系において細胞をアポトーシスから保護する８。
【０００４】
ＮＦ−κＢ依存性反応の一般的なウィルスのインドューサーは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のようである。ほとんどのＲＮＡウィルスは、細胞が危険信号と感知する可能性がある、共通した分子的なパターンを表示するｄｓＲＮＡ様複製中間体を産生する９。
【０００５】
インフルエンザウィルス又はインフルエンザウィルス産物によるＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）及びＮＦ−κＢの活性化はよく記録されている１０〜１３が、しかし、このシグナリングモジュールの機能はウィルス感染細胞においては未だ明らかでない。これまでの知識は、ウィルスの非構造タンパク質１（ＮＳ１）の完全なコード領域の欠失を有する、ｄｅｌＮＳ１と名付けられたリコンビナントウィルスで得られたデータに限られている１４。インフルエンザｄｅｌＮＳ１ウィルスでの細胞の感染は、促進されたＮＦ−κＢ活性化及びＩＦＮβ産生３と同様に促進されたアポトーシスも生じ１５、ＮＳ１タンパク質は、前記の推定上の抗ウィルス性反応の少なくとも部分的なアンタゴニストであることを示唆する。それにもかかわらず、感染の結果のための、インフルエンザウィルス誘導ＮＦ−κＢ活性化の重要性は未だに直接的に述べられてはいない。
【０００６】
本出願によれば、ＮＦ−κＢ依存的なウィルスによる誘導はアポトーシス促進因子ＴＲＡＩＬを介して媒介され、前記ＴＲＡＩＬは、オートクリン及びパラクリン様式において、特にインフルエンザウィルス感染の状況において、ウィルス増殖を促進する。
【０００７】
本発明の第１の観点は、ＴＲＡＩＬリガンド／レセプター系の阻害剤の、ウィルス感染の治療のため、特にＲＮＡウィルス、例えばマイナス鎖ＲＮＡウィルス、例えばインフルエンザウィルス及びボルナ病ウィルスによって引き起こされるウィルス感染の治療のための医薬品を製造するための使用に関する。とりわけ有利には、インフルエンザウィルス感染の予防又は治療である。ＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター阻害剤は、ヒト又は家畜又は野生動物、例えば馬又は羊におけるウィルス感染の予防又は治療のために使用される。本発明の阻害剤は、ウィルス感染の予防及び／又は急性又は慢性的なウィルス感染の治療のために投与されてよい。
【０００８】
本発明の有利な実施態様においては、阻害剤はＴＲＡＩＬ（ＴＲＡＩＬリガンドＡＰＯ−２）阻害剤である。例えばＴＲＡＩＬ阻害剤は、
（ａ）阻害性の抗ＴＲＡＩＬ抗体、又は前記抗体のフラグメント、及び
（ｂ）可溶性のＴＲＡＩＬレセプター分子、又は前記分子のＴＲＡＩＬ結合部
から選択されてよい。
【０００９】
有利には、阻害性の抗ＴＲＡＩＬ抗体、及び前記抗体の抗原結合フラグメント及び可溶性ＴＲＡＩＬレセプター分子又は前記分子のＴＲＡＩＬリガンド結合部である。適した抗ＴＲＡＩＬ抗体の例は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、又は抗体フラグメント、例えばタンパク質分解性フラグメント又はリコンビナント一本鎖フラグメントである。前記抗体はこの分野で公知の免疫化及び選択方法によって得られてよい。更に有利には、可溶性ＴＲＡＩＬレセプター分子、例えば膜貫通ドメインを有しない可溶性ＴＲＡＩＬレセプター分子２８、又はＴＲＡＩＬに結合することが可能なＴＲＡＩＬレセプターペプチドである。
【００１０】
ＴＲＡＩＬレセプター分子は、ＴＲＡＩＬレセプター−１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＤＲ４）、ＴＲＡＩＬレセプター−２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、Ａｐｏ２、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ２ａ、ＴＲＩＣＫ２ｂ）、ＴＲＡＩＬレセプター−３（ＤＣＲ１）、ＴＲＡＩＬレセプター−４（ＤＣＲ２、ＴＲＵＮＤ）及びＯＰＧ（オステオプロテゲリン）から選択されてよい。有利には、ＴＲＡＩＬレセプター−１及びＴＲＡＩＬレセプター−２、より有利にはＴＲＡＩＬレセプター−２である。ＴＲＡＩＬレセプターは、ＷＯ９８／３２８５６、ＷＯ９８／３５９８６、ＷＯ９８／４１６２９、ＷＯ９９／１０４８４、ＷＯ００／６６１５６及び参考文献２８に記載されていて、これらは引用によって本発明に組み込まれる。本発明は、上記した複数のＴＲＡＩＬレセプターの組み合わせた使用を含んでもよい。
【００１１】
とりわけ有利には、ＴＲＡＩＬレセプター分子の細胞外ドメインを含有するＴＲＡＩＬ阻害剤である。前記細胞外ドメインは、異種ポリペプチドドメイン、特にＣＨ２及びＣＨ３ドメイン及び場合によってヒンジ領域を含むＦｃ免疫グロブリン分子、例えばヒトＩｇＧ分子からのＦｃ免疫グロブリン分子に場合によって融合している。
【００１２】
本発明の更なる実施態様においては、阻害剤は、
（ａ）阻害性の抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体、又は前記抗体のフラグメント、及び
（ｂ）阻害性のＴＲＡＩＬフラグメント
から選択されてよいＴＲＡＩＬレセプター阻害剤である。
【００１３】
適した阻害性の抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の例、例えばＴＲＡＩＬレセプター−１、ＴＲＡＩＬレセプター−２、ＴＲＡＩＬレセプター−３、ＴＲＡＩＬレセプター−４に対する抗体又はＯＰＧ、及び阻害性のＴＲＡＩＬリガンドフラグメントはＷＯ９８／３５９８６、ＷＯ９９／１０４８４、ＷＯ００／７３３４９、参考文献３１及び参考文献３２に記載されていて、これらは引用によって本発明に組込まれる。抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、又はタンパク質分解性又はリコンビナント抗体フラグメントであってよい。特に有利には、抗ＴＲＡＩＬ Ｒ１抗体及び抗ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体である。
【００１４】
更なる実施態様においては阻害剤は、ＴＲＡＩＬレセプター−１又はＴＲＡＩＬレセプター−２のデスドメインとＦＡＤＤのデスドメインとの相互作用を阻害してよい。適した阻害剤の例は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２又はＦＡＤＤのデスドメインに特異的に指向した抗体又はフラグメントである。その上、阻害剤はＦＡＤＤのデスエフェクタードメインとカスパーゼ−８及び／又はカスパーゼ１０との相互作用を阻害してよく、これによりデスレセプター、例えばＴＲＡＩＬレセプターにより誘導された過程、例えばアポトーシスの過程を阻害してよい。これに関連して、参考文献３３及びこれに引用された参考文献が参照される。
【００１５】
本発明のまた更なる実施態様においては、阻害剤は核酸エフェクター分子である。核酸エフェクター分子はアンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子及びリボザイムから選択されてよく、これらは少なくとも一つのＴＲＡＩＬレセプター遺伝子及び／又はＴＲＡＩＬリガンド遺伝子の発現を阻害してよい。
【００１６】
更なる実施態様においては、阻害剤は細胞内のＴＲＡＩＬレセプターシグナル伝達に指向してよく、例えばＴＲＡＩＬレセプターシグナル伝達の特異的な阻害剤又はアポトーシスシグナル伝達の一般的な阻害剤であってよい。前記細胞内阻害剤の例は、アポトーシス阻害剤、特に細胞内アポトーシス阻害剤、例えばカスパーゼ阻害剤、例えばカスパーゼ−３、カスパーゼ−８又はカスパーゼ−１０阻害剤、Ｂｉｄ阻害剤、Ｂａｘ阻害剤、又はこれらの全ての組み合わせから選択される。適した阻害剤の例は、一般的なカスパーゼ阻害剤、例えば、ＷＯ０２／０９４２６３、ＷＯ０１／１０３８３、ＷＯ０１／４２２１６、ＷＯ０１／９００７０、ＷＯ０１／９４３５１、ＷＯ０１／２１６００、ＷＯ００／６１５４２、ＷＯ９９／４７５４５、ジペプチド阻害剤（ＷＯ９９／４７１５４）、カルバマート阻害剤（ＷＯ０１／７２７０７）、置換されたアスパラギン酸アセタール（ＷＯ０１／８１３３０）、ヘテロサイクリルジカルバミド（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌｄｉｃａｒｂａｍｉｄｅｓ）（ＷＯ０２／０８５８９９）、キノリン−（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド）誘導体（ＵＳ２００１２６４６７）、置換された２−アミノベンズアミドカスパーゼ阻害剤（ＷＯ００／５５１１４）、置換されたα−ヒドロキシ酸カスパーゼ阻害剤（ＷＯ０１／１６０９３）、ニトロシル化による阻害（ＷＯ９８／４３６２１）；ＣＡＳＰ−１：（ＷＯ０２／０００８５３；ＣＡＳＰ−３：タンパク質阻害剤（ＷＯ０２／０６６０５０）、アンチセンス分子（ＷＯ０１／５３３１０）、ニコチニル−アスパルチル−ケトン（ＷＯ０１／２７０８５）、γ−ケト酸ジペプチド誘導体（ＷＯ０２／４８１７９、ＷＯ００／３２６２０、ＷＯ００／５５１２７）、ＣＡＳＰ−８：アンチセンス分子（ＷＯ０１／５３５４１）、相互作用タンパク質（ＷＯ００／３９１６０） ＣＡＳＰ−９：アンチセンスモジュレーター（ＷＯ０２／２２６４１）；ＣＡＳＰ２：アンチセンス分子（ＷＯ０２／２４７２０）；ＣＡＳＰ−６：アンチセンス分子（ＷＯ０２／２９０６６）；ＣＡＳＰ−７：アンチセンス分子（ＷＯ０２／２２６４０）；ＣＡＳＰ−１２阻害剤：ＷＯ００／５９９２４、これらは引用によって本発明に組み込まれる。更なる例は、ミトコンドリアの阻害剤、例えばＢｃｌ−２調節因子（ＷＯ０２／０９７０９４）；Ｂａｄ由来のＢｃｌ−２（ＷＯ９４／２７４２６）ミュータントペプチド（ＷＯ０２／２０５６８）、Ｂａｄ（ＷＯ９６／１３６１４）、ＢＨ３相互作用ドメインデスアゴニスト（ＷＯ９８／０９９８０）、Ｂａｘ阻害剤タンパク質（ＷＯ９８／４０３９７）、ＢＬＫ遺伝子及び遺伝子産物（ＷＯ９９／５０４１４）、これらは引用によって本発明に組み込まれる。アポトーシスの更に適した細胞内モジュレーターは、ＣＡＳＰ９／Ａｐａｆ−１会合のモジュレーター（ＷＯ０２／０６４１２８）、Ａｐａｆ−１発現のアンチセンスモジュレーター（ＷＯ０２／３２９２１）、アポトーシス阻害のためのペプチド（ＷＯ９９／４３７０１）、単純ヘルペスウィルスのＲ１サブユニットを含む抗アポトーシス性組成物（ＷＯ００／０７６１８）、ＭＥＫＫ１及びそのフラグメント（ＷＯ９９／４１３８５）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）のモジュレーター（ＷＯ０１／６４７４１）、アポトーシス阻害剤のモジュレーター（ＷＯ９７／０６１８２、ＷＯ００／７７２０１、ＷＯ０１／５９１０８、ＷＯ０２／０５３５８６）及びＨＩＡＰ２（ＷＯ００／０８１４４）であり、これらは引用によって本発明に組み込まれる。更に、上記の阻害剤の全ての組み合わせを使用してよい。
【００１７】
阻害剤、又は前記阻害剤の組み合わせは、これを必要とする被験体、特にヒト患者に、特定の症状の治療のために十分な量において、適した方法によって投与される。例えば、阻害剤は薬学的に許容可能なキャリアー、希釈剤及び／又は佐剤と共に、薬学的な組成物として処方されてよい。治療の効能及び毒性は標準的なプロトコルに従って決定されてよい。薬学的な組成物は、全身に、例えば腹腔内に、筋肉内に、又は静脈内に、又は局所的に、例えば鼻腔内に投与されてよい。有利には、静脈内及び／又は鼻腔内投与である。
【００１８】
阻害剤のとりわけ有利な組み合わせは、細胞外ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬレセプター阻害剤、例えば抗ＴＲＡＩＬ抗体、又は異種ポリペプチドに場合によって融合した可溶性の細胞外ＴＲＡＩＬレセプタードメインと、細胞内のＴＲＡＩＬレセプターシグナル伝達阻害剤との、組み合わせである。
【００１９】
場合によって、更なる有効成分が存在し、前記有効成分は抗ウィルス薬、例えばウィルスの膜貫通タンパク質に指向したアマンタジン及び前記誘導体、例えばリマンタジン、ウィルスのノイラミニダーゼ、特にインフルエンザウィルスからのノイラミニダーゼの阻害剤、例えばリレンザ、Ｒａｆ−Ｍｅｋ−Ｅｒｋシグナル伝達経路の阻害剤、例えば２０１２６又はＰＣＴ／ＤＥ０１／０１２９２に記載されたその他の阻害剤、ＭＩＫＫ／ＳＥＫ／ＹＭＫシグナル伝達経路の阻害剤、又はＤＥ１０１３８９１２に記載された更なるシグナル伝達経路の構成要素の阻害剤、及び合成ヌクレオシド類似物、例えば３−デアザアデノジン（３−ｄｅａｚａａｄｅｎｏｚｉｎｅ）及びリバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎｅ）である。
【００２０】
投与される阻害剤の用量は勿論、治療される被験体、被験体の重量、損傷のタイプ及び重傷度、投与の方法、及び処方する医師の判断に依存する。抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ又は−Ｌ抗体又は可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質、例えばＴＲＡＩＬ−Ｒ融合タンパク質の投与のためには、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの１日量が適している。
【００２１】
更に、本発明の観点は、化合物がＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター系を阻害することが可能であるかを決定することを含む、ウィルス感染、特にＲＮＡウィルス、例えばインフルエンザ又はボルナ病のウィルスによる感染の阻害剤を同定及び／又は特性決定する方法である。ＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター系の阻害は有利には、ＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター媒介アポトーシス又はＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター媒介細胞活性化の阻害を含む。更に有利には、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２とＦＡＤＤデスドメインとの相互作用の阻害、又はＦＡＤＤデスエフェクタードメインとカスパーゼ−８及び／又はカスパーゼ１０との相互作用の阻害である。
【００２２】
上記の方法は、分子ベースアッセイであってよく、その際ＴＲＡＩＬリガンドとＴＲＡＩＬレセプターとの相互作用に及ぼす、試験される化合物の効果は、ほぼ精製されかつ単離された成分、例えばリコンビナント分子を含む試験系において解析される。又は、方法は細胞ベースアッセイとして実施されてもよく、その際適した試験細胞、例えばＴＲＡＩＬレセプターを発現又は過剰発現する試験細胞を使用する。適した分子ベースアッセイ及び細胞ベースアッセイ系、例えばハイスループットアッセイ系はこの分野において公知である。
【００２３】
更に本発明は以下の図及び実施例において、より詳細に説明される。
【００２４】
図の説明
図１：ＮＦ−κＢシグナリングは効率的なインフルエンザウィルス産生に重要である
ａ）ＩκＢα分解のイムノブロット分析。ベクター、ＩＫＫ２ ＥＥ、ＩＫＫ２ ＫＤ又はＩκＢαｍｕｔを安定発現するＡ５４９細胞系をＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、表示した時間の後に回収した。過剰発現したＩκＢαｍｕｔはＳＤＳゲルにおいて遅延を示すことに注意。ＩＫＫ ＥＥ細胞系は構成的なＩκＢα分解を示さないが、刺激後のｄｅ ｎｏｖｏ ＩκＢα発現の回復はより迅速である。これは、刺激又は感染したＩＫＫ２ ＥＥ細胞において一貫して観察された、強化したＮＦ−κＢシグナル強度のためである可能性がある。
ｂ）ＮＦ−κＢプロモーター−ルシフェラーゼ−リポーター遺伝子アッセイ。安定に形質導入したＭＤＣＫ細胞系を３×ＮＦ−κＢ結合部位人工プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ−リポーター遺伝子プラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＦＰＶで感染させ（ＭＯＩ＝５）、及び感染後（ｐ．ｉ．）４時間目に回収して、ルシフェラーゼアッセイを行った。各バーは、三回の独立したトランスフェクションの平均及び標準偏差を示す。
ｃ）ＩＦＮβプロモーター／エンハンソソームルシフェラーゼ−リポーター遺伝子−アッセイ。安定に形質導入したＭＤＣＫ細胞系を、誘導可能なＩＦＮβ発現を担うＡＰ−１、ＩＲＦ及びＮＦ−κＢ結合部位を有するＩＦＮβ−プロモーター／エンハンソソームによって駆動されるルシフェラーゼ−リポータープラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をインフルエンザＡウィルスで感染させ（ＭＯＩ＝５）、及びｐ．ｉ．４時間目に回収して、ルシフェラーゼアッセイを行った。各バーは、三回の独立した実験の平均及び標準偏差を示す。
ｄ）異なるＭＤＣＫ及びＩ型インターフェロン欠損ベロ細胞系をＦＰＶで感染させた（ＭＯＩ＝１）。上清を９時間に回収し、ウィルス収量をＭＤＣＫ細胞上のプラークアッセイにおいて定量した。データを、ベクターコントロールと比較したウィルス力価のパーセンテージとして示す。各バーは、三回の独立した実験の平均及び標準偏差を示す。
ｅ）ｄにおいて記載した通りに、ＦＰＶで感染させた異なるＡ５４９細胞系を用いて実験を行った。対数目盛りにおいて、絶対プラーク形成単位としてデータを示す。各バーは、三回の独立した実験の平均及び標準偏差を示す。
【００２５】
図２：ＮＦ−κＢは、インフルエンザウィルス感染の状況下においては、Ａ５４９細胞系においてアポトーシス促進的に作用する。
ａ）初期のアポトーシスマーカーであるＰＡＲＰ分断のための、イムノブロット。Ａ５４９細胞系を、模擬感染又はＦＰＶで感染させ（ＭＯＩ＝１）、ｐ．ｉ．２４時間目にＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶解バッファーにおいて溶解した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ及びブロッティング後、メンブランを抗ＰＡＲＰ ｍＡｂを用いたウェスタンブロットにかけ、タンパク質の分断及び非分断形状の両方を検出した。Ｅｒｋブロットは負荷コントロールとして務める。
ｂ）Ａ５４９細胞系をＦＰＶで感染させ（ＭＯＩ＝１）、幅広いカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ又は不活性コントロール（Ｚ−ＦＡ−ＦＭＫ）の様々な濃度でインキュベーションした。ｐ．ｉ．２４時間目に上清を回収し、ウィルス力価を測定した。
ｃ）ｂ）における通りに、ＦＰＶで感染させた（ＭＯＩ＝１）異なるベロ細胞系で実験を実施した。
【００２６】
図３：アポトーシス促進タンパク質ＴＲＡＩＬはインフルエンザＡウィルス感染すると誘導される
ａ）Ａ５４９細胞系を模擬処置又はＦＰＶで感染させた（ＭＯＩ＝１）。ｐ．ｉ．２４時間目にＲＮＡを単離し、ＲＮアーゼプロテクションアッセイにかけた。
ｂ）Ａ５４９（野生型）細胞におけるＴＲＡＩＬ発現のイムノブロット法。Ａ５４９細胞をＦＰＶで感染させ（ＭＯＩ＝１０）、異なる時間、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶解バッファー中で溶解させた。ウィルス性のＮＰ蓄積を、感染経過のためのコントロールとして使用した。
ｃ）異なるＡ５４９細胞系をＦＰＶで感染させ（ＭＯＩ＝５）、タンパク質分泌を妨げるためにモネンシンで処理した。ｐ．ｉ．８時間目に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＴＲＡＩＬ発現のために染色し、これをＦＡＣＳ分析において検出した。グレー線：非感染細胞、黒線：ウィルス感染細胞。
【００２７】
図４：ＴＲＡＩＬはインフルエンザＡウィルス増殖のための重要なメディエーターである。
ａ）可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＦｃはＴＲＡＩＬ媒介カスパーゼ活性化を妨げる。Ａ５４９細胞を未処置のままにするか、又はリコンビナントのフラッグタグ化したヒトＴＲＡＩＬ（２０ｎｇ／ｍｌ）で、可溶性ＴＲＡＩＬレセプター２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ、１０μｇ／ｍｌ）あり又はなしで１６時間刺激した。溶解物を、アポトーシス誘導の測定のために抗ＰＡＲＰウェスタンブロットにかけた。
ｂ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃの存在はインフルエンザウィルス産生を減少させる。Ａ５４９野生型細胞をＦＰＶで感染させた（ＭＯＩ＝１）。感染後、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）又はコントロールとしてＴＮＦ−Ｒ２−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。ｐ．ｉ．９時間後及び２４時間後に上清を回収し、ウィルス力価を測定した。
ｃ）ＴＮＦ−Ｒ２−ＦｃはＴＮＦα誘導ＩκＢα分解を妨げる。Ａ５４９細胞を未処置のままにするか、又はＴＮＦ−Ｒ２−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、リコンビナントＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。
ｄ）Ａ５４９細胞系をＦＰＶ（ＭＯＩ＝１）で感染させた。ｐ．ｉ．６時間目にリコンビナントのフラッグタグ化ヒトＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ／ｍｌ）を感染培地に添加した。ｐ．ｉ．９時間目に上清を回収し、ウィルス力価を測定した。各バーは、三回の独立した実験の平均及び標準偏差を示す。
【００２８】
実施例
１．方法
１．１ウィルス、細胞系及びウィルス感染
トリインフルエンザウィルス Ａ／Ｂｒａｓｔｉｓｌａｖａ／７９（Ｈ７Ｎ７；家禽ペストウィルス（ＦＰＶ））を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｇｉｅｓｓｅｎのウィルス株コレクションから取得し、異なる細胞系の感染のために使用した。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞及びアフリカミドリザル腎臓細胞（ベロ）を、１０％熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を補給した最小必須培地（ＭＥＭ）中において成長させた。Ａ５４９ヒト肺癌腫細胞を１０％熱非働化ＦＢＳ及び抗生物質を補給したＨａｍ’ｓＦ１２培地中において成長させた。トランスドミナントｍｌκＢαと同様に構成的に活性があり、ドミナントネガティブなＩＫＫ２も安定発現するＡ５４９、ＭＤＣＫ及びベロ細胞系を、ｐＣＦＧ５−ＩＥＧＺレトロウィルスベクター系２７及び両種指向性Ｐｈｏｅｎｉｘ ｐｒｏｄｕｃｅｒ 細胞系を用いて、ほぼＤｅｎｋ．ｅｔ ａｌ１６において記載されたように、レトロウィルス形質導入アプローチによって生じさせた。感染のために、細胞をＰＢＳで洗浄し、示した感染多重度（ＭＯＩ）で、ＰＢＳ／ＢＡ（０．２％ＢＳＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．９ｍＭ ＣａＣｌ２、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＰＢＳ）中で希釈したウィルスで、１時間室温でインキュベートした。接種材料を吸引し、細胞を０．２％ＢＳＡ及び抗生物質を含有するＭＥＭ又はＨａｍ’ｓＦ１２でインキュベートした。ｐ．ｉ．９時間目又は２４時間目に上清を回収し、感染粒子（プラーク力価）の数をサンプル中において評価した。簡単に言うと、６ウェルディッシュ中の９０％集密度に成長したＭＤＣＫ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／ＢＡ中で上清の段階希釈で１時間３７℃で感染させた。接種材料を吸引し、０．６％寒天（Ｏｘｏｉｄ）、０．３％ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び１．５％ＮａＨＣＯ３で補給したＭＥＭ／ＢＡ（０．２％ＢＳＡ及び抗生物質を含有する培地）２ｍｌ中で、３７℃、５％ＣＯ２で２〜３日間細胞をインキュベートした。ウィルスプラークをニュートラル−レッドでの染色によって視覚化した。
【００２９】
１．２阻害剤、抗体及び試薬
カスパーゼ阻害剤、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ又は阻害剤コントロールＺ−ＦＡ−ＦＭＫ（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をすぐに使用可能であるようにＤＭＳＯ中２ｍＭで供給した。ＤＭＳＯを溶媒コントロールとして、最も高い阻害剤濃度を代表して、２％の終濃度で使用した。マウス抗ＰＡＲＰモノクローナル抗体をＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＴＲＡＩＬウェスタンブロットのためにヒトＴＲＡＩＬに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した（ｓｃ−８４４０）。ＦＡＣＳのためのＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２に対するＭＡｂｓも、リコンビナントのフラッグタグ化ヒトＴＲＡＩＬと同様にＡｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能である。可溶性ＴＲＡＩＬ−レセプター２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ）及び可溶性のＴＮＦ−αレセプター（ｓＴＮＦ−Ｒ２−Ｆｃ）は、参考文献２８にほぼ説明されたように、ヒトＩｇＧ−Ｆｃとの融合タンパク質として生産された。
【００３０】
１．３ プラスミド、トランスフェクション及びウェスタンブロット
ＩＦＮβ−プロモーター−ルシフェラーゼプラスミドは、Ｊ．Ｈｉｓｃｏｔｔ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａによって好意により提供された。３×ＮＦ−κＢレポータープラスミドは以前に１３に説明されている。ＭＤＣＫ細胞をリポフェクタミン２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、Ｂａｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２９によるプロトコルによりトランスフェクションした。ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイを以前に説明されたように実施した２５、３０。ウェスタンブロットのために細胞をＴｒｉｔｏｎ溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭグリセロールリン酸ナトリウム、２０ｍＭピロリン酸ナトリウム、５μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭバナジン酸ナトリウム、５ｍＭベンズアミンジン）中で、氷上で１０〜２０分間溶解した。細胞溶解物を次に遠心分離し、上清中のタンパク質の含量を、ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｙｅ ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定した。タンパク質の等量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、ニトロセルロース膜上にブロットした。
【００３１】
１．４フローサイトメトリー法
ＴＲＡＩＬを細胞内染色法により検出した。Ａ５４９細胞系をＦＰＶで、５のＭＯＩで８時間、タンパク質分泌をさけるために２μＭモネンシンの存在下で感染させた。細胞を４％パラホルムアルデヒドで、４℃で２０分間固定し、引き続き透過バッファー（０．１％サポニン／１％ウシ胎仔血清／ＰＢＳ）中で２回洗浄した。ＴＲＡＩＬに対するマウスモノクローナル抗体又はアイソタイプコントロール抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのインキュベーション後、細胞をビオチン−Ｓｐ−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ）、及びストレプトアビジン−Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で染色した。ＦＬ３−チャンネルにおいて、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて蛍光を測定した。全てのＦＡＣＳ分析は少なくとも２回繰り返され、ほぼ類似した結果を示した。
【００３２】
１．５ ＲＮアーゼプロテクションアッセイ
Ａ５４９細胞系を模擬感染させたか又はＦＰＶで１のＭＯＩで感染させた。ｐ．ｉ．２４時間目に細胞を溶解させ、ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従ってＲＮＡを単離した。精製ＲＮＡを、製造者の指示に従って、ＲｉｂｏＱｕａｎｔ Ｍｕｌｔｉ−Ｐｒｏｂｅ ＲＮａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｈＡＰＯ−３（ＢＤ−Ｐｈａｒｉｍｉｎｇｅｎ）にかけた。
【００３３】
２．結果
インフルエンザウィルス感染の間のＩＫＫ及びＮＦ−κＢ活性化の役割を分析するために、我々は、ドミナントネガティブＩＫＫ２（ＩＫＫ ＫＤ）、構成的に活性のあるＩＫＫ２（ＩＫＫ ＥＥ）、又はＮＦ−κＢ活性化を妨げる、ＩκＢαの分解可能でないミュータント（ＩκＢαｍｕｔ）１６を安定発現する宿主細胞系を樹立した。図１はＩＫＫ ＫＤ又はＩκＢαｍｕｔの発現がＮＦ−κＢ活性化の効率的な遮断を生じることを示す。ＴＮＦ−α誘導ＩκＢα分解（図１ａ）又はＮＦ−κＢ依存性プロモーターエレメントからのインフルエンザウィルスが誘導した転写（図１ｂ）は前記ミュータントの存在下で損われている。ＩＫＫ ＥＥの高発現は前記細胞系においては良好に寛容性ではなく、導入遺伝子はいくつかの継代のあとにかろうじて検出可能になるだけであるが（データ掲載せず）、ＩＫＫ ＥＥ細胞系における促進したＮＦ−κＢ依存性転写活性は、それでもウィルス感染すると検出可能であった。人工ＮＦ−κＢリポーター遺伝子構造が、ＩＦＮβプロモーター／エンハンソソームを収容するリポーター遺伝子プラスミドによって置き換わると、異なるミュータントは転写活性にほぼ同様の効果を示す（図１ｃ）が、しかしＩＦＮβ発現のためのその他の、ウィルスが誘導した転写因子の関与のためにあまり顕著ではない。これはＮＦ−κＢは、ＩＦＮβ発現を抗ウィルス機能として調節する２という、これまでの報告と一致する。
【００３４】
しかし、前記の異なる細胞系においてインフルエンザウィルス産生の効率を調べると、異なる結果を見出した。ウィルス増殖はＮＦ−κＢ阻害すると損なわれ、活性状態、ＩＫＫ ＥＥを発現する細胞においては促進された（図１ｄ、ｅ）。効果はＭａｄｉｎｅ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）上皮細胞において、及びベロ細胞においても同様であった（図１ｄ）。後者の細胞系は１型インターフェロンを発現せず１７、観察された効果における前記サイトカインの顕著な関与を除外する。ウィルス増殖の阻害又は促進は、導入遺伝子作用の効率と相関し（データ掲載せず）、Ａ５４９肺上皮細胞においてもっとも強力で、その際異なる細胞系間のウィルス力価の差は１０倍までであった（図１ｅ）。この結果は、それぞれのＮＦ−κＢ欠損ＣＲＬ細胞系とボルナ病ウィルス（ＢＤＶ）、別のマイナス鎖ＲＮＡウィルスでの感染により得られた結果とは異なる。前記結果では、ＮＦ−κＢの阻害は複製には顕著な効果を及ぼさず、しかしＩＫＫ ＥＥの発現による経路の活性化は、Ｉ型インターフェロンの大規模な誘導のために、ウィルス複製を強く損なった（Ｏ．Ｐ．及びＳ．Ｌ．、未発表データ）。これは、インフルエンザウィルス複製に特異的なＮＦ−κＢの決定的な作用を示唆し、前記作用はＩ型インターフェロン反応とは無関係に生じるようである。
【００３５】
ＮＦ−κＢは転写因子であり、従って根本的な機構は、プロウィルス的な（ｐｒｏｖｉｒａｌ）作用因子の調節に関与する可能性が高い。ＮＦ−κＢはアポトーシス促進遺伝子及び抗アポトーシス遺伝子の両方の調節因子６なので、異なるＮＦ−κＢ細胞系におけるアポトーシスのウィルス誘導を調べた。初期のアポトーシス事象を観察するために、主要なカスパーゼ基質、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）のタンパク質分解による分断を選択した。インフルエンザウィルス感染は、ベクター細胞系における顕著な分断を生じ、これは更にＩＫＫ ＥＥ発現細胞において促進された（図２ａ）。対照的に、ウィルス誘導ＰＡＲＰ分断は、トランスドミナントネガティブミュータント、ＩＫＫ又はＩκＢαを発現する感染細胞において損なわれた（図２ａ）。この意外な発見は、インフルエンザウィルス感染の状況下では、ＮＦ−κＢが抗アポトーシス的というよりむしろアポトーシス促進的に作用することを示す。事実、アポトーシス誘導及びカスパーゼ活性化は効率的なウィルス増殖に必要である可能性がある。ウィルス収量は、Ａ５４９及びベロ細胞の両方において、汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの存在下では強力に損なわれたが、不活性なアナログＺ−ＦＡ−ＦＭＫによっては損なわれなかった（図２ｂ、ｃ）。
【００３６】
まとめると、インフルエンザ感染の間にＮＦ−κＢはアポトーシス促進因子を上方調節させ、これはウィルス産生を促進させることをデータは示す。従って、様々なアポトーシス調節因子、例えばカスパーゼ８、Ｆａｓ（ＡＰＯ−１、ＣＤ９５）、デスレセプター３（ＤＲ３）、ＴＲＡＩＬ又はＴＮＦ−Ｒ１の、ウィルスにより誘導された遺伝子発現を、ベクター、ＩＫＫ ＥＥ、又はＩＫＫ ＫＤ発現細胞系において、ＲＮアーゼプロテクションアッセイを用いて調べた（図３ａ）。興味深いことに、ベクタートランスフェクションした細胞系又はＩＫＫ ＥＥ発現細胞系において、ウィルス感染すると強力に上方調節されるが、ＩＫＫ ＫＤ発現細胞系において完全に存在しない唯一の前記遺伝子は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）の遺伝子であった。ＴＲＡＩＬはインフルエンザウィルス感染の間の時間にわたって増加しつづける量で発現し（図３ｂ）、ＩＫＫ ＫＤ又はｍＩκＢαによるＮＦ−κＢシグナリングの阻害はウィルス誘導ＴＲＡＩＬ合成を完全に遮断した（図３ｃ）。
【００３７】
ＮＦ−κＢ依存性に促進されたインフルエンザウィルス複製にＴＲＡＩＬが関与しているかを試験するために、我々はＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ、ＴＲＡＩＬの効果的な阻害剤２８の非存在下又は存在下でウィルス力価を測定した。前記試薬はＴＲＡＩＬ誘導ＰＡＲＰ分断を効果的に遮断した（図４ａ）だけでなく、しかし２４時間後にはウィルス産生を約８０％減少させた（図４ｂ）。これは、ＴＲＡＩＬは確かにプロウィルスの因子であることを示す。反対に、可溶性ＴＮＦ−Ｒ２−Ｆｃ、別の、アポトーシス促進的で、ウィルスによって誘導されるサイトカインのためのレセプターは、ウィルス力価の顕著な減少を生じなかった（図４ｂ）が、前記試薬の同濃度は効果的にＴＮＦα誘導ＩκＢα分解を遮断した（図４ｃ）。ＴＲＡＩＬがウィルス増殖を援助するという知見と一致して、低濃度リコンビナントヒトＴＲＡＩＬでの感染細胞の刺激は、Ａ５４９細胞におけるウィルス産生を促進し、異なる細胞系におけるＮＦ−κＢ欠損の表現型をレスキューした（図４ｄ）。
【００３８】
このように、アポトーシスインドューサーＴＲＡＩＬは、インフルエンザウィルス感染細胞において、ＮＦ−κＢ依存的に誘導されたプロウィルスの因子である。
【００３９】
３．考察
インフルエンザウィルス感染細胞におけるＮＦ−κＢの役割は、詳細には研究されてこなかったが、ＮＦ−κＢ活性化及びアポトーシス誘導の両方は、インフルエンザウィルス感染に対する抗ウィルス反応であると一般的に考えられてきた。本出願に示したデータによれば、ＮＦ−κＢはインフルエンザウィルス感染の状況下ではむしろ、少なくともアポトーシス促進因子ＴＲＡＩＬの発現を調節することによって、プロウィルス的に作用するというシナリオに我々は直面する。
【００４０】
これまでは、ＴＲＡＩＬの転写調節に関してはほとんど知られていない。しかし、最近の研究では、ＴＲＡＩＬの発現は、事実ＮＦ−κＢ依存的にジャーカットＴ細胞において、ｃ−Ｒｅｌ結合部位を通して近位ＴＲＡＩＬプロモーター中で誘導されうることが実証された１８。我々は上記に、これが上皮細胞において、ウィルスのインドューサーでも当てはまることを示した。１３０００個のうち８４個の遺伝子中のＴＲＡＩＬを同定し、前記遺伝子がヒトインフルエンザウィルスでの感染に対する反応において調節解除されるという、最近の転写のプロファイリングアプローチ１９からの知見によって我々のデータは支持されている。更に、ＴＲＡＩＬ及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ１／２は、複数のその他のウィルスでの感染の間に上方調節することが示されており２０〜２３、これは感染細胞又は免疫系の細胞を選択的に殺すという抗ウィルス性の反応であると仮定されてきた。しかしインフルエンザウィルス感染の場合には、ＮＦ−κＢ依存的なＴＲＡＩＬ誘導及び引き続くＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスはプロウィルス的な現象であることを、我々のデータは明らかに示している。従って、インフルエンザウィルスは宿主細胞保護機構の利点を活かす能力を獲得し、これによりウィルス複製を援助する可能性がある。存在する細胞内活動の利点を生かすことは、宿主細胞中に前記方法を積極的に誘導するよりむしろ、ウィルスの侵入者にとっては容易なことである。前記仮定にそうと、ウィルスは抗ウィルス反応の制限と、ウィルス成長を援助する十分なシグナリング強度の維持との間でバランスを保つ機構を必要とする。そのようなバランス制御は、ウィルスＮＳ１タンパク質によって供給されている可能性があり、前記タンパク質はある種の転写因子の活性を許容した制限に維持し３、２４、２５、これにより抗ウィルス反応の過多を妨げ、しかしいくつかのプロウィルスのタンパク質をそれでも産生させる。前記モデルを支持して、リコンビナントＴＲＡＩＬは、細胞が１０〜２０ｎｇ／ｍｌまでの濃度において感染の後期に刺激される場合のみに、ウィルス増殖を促進させることを観察した（図４ｄ）。より初期の刺激又はＴＲＡＩＬのより高い濃度は、支持的な効果の損失を生じる（データ掲載せず）。ＴＲＡＩＬを後期に必要とすることは、ウィルス複製サイクルの間のタンパク質の発現速度論と良好に相関する（図３ｃ）。
【００４１】
更に、インフルエンザウィルスはアポトーシス促進タンパク質、ＰＢ１−Ｆ２をウィルス生活環の後期に発現する２６という最近の知見は、効率的なウィルス成長のためにアポトーシス誘導を必要とすることと一致している。我々は、ＮＦ−κＢ及びＴＲＡＩＬを、インフルエンザウィルス複製のための決定的な細胞内因子であるとして同定した。我々の発見は、ＮＦ−κＢ及び／又はより具体的にはＴＲＡＩＬの薬理学的な阻害は、ウィルスに対する防御において治療的な価値がある可能性を示唆し、前記ウィルスはいまだに世界的に、人の健康に対する最も大きな脅威の１つであり続けている。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、ＮＦ−κＢシグナリングは効率的なインフルエンザウィルス産生に重要であることを示す図である。
【図２】図２は、ＮＦ−κＢは、インフルエンザウィルス感染の状況下においては、Ａ５４９細胞系においてアポトーシス促進的に作用することを示す図である。
【図３】図３は、アポトーシス促進タンパク質ＴＲＡＩＬはインフルエンザＡウィルス感染すると誘導されることを示す図である。
【図４】図４は、ＴＲＡＩＬはインフルエンザＡウィルス増殖のための重要なメディエーターであることを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター系の阻害剤の、ウィルス性疾患の予防又は治療のための、殊にインフルエンザ又はボルナ病のウィルス感染の予防又は治療のための医薬品を製造するための使用に関する。
【０００２】
ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−１、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎ウィルス、ＥＢＶ、ＶＳＶ及びインフルエンザウィルスを含む、ウィルスの複数のファミリーによってＮＦ−κＢは活性化される１。前記ウィルスのうちのいくつか、例えばレトロウィルス又はがんウィルスにとっては、前記転写因子の活性化がウィルス複製を援助する可能性がある一方で、ＲＮＡウィルス、例えばＶＳＶ又はインフルエンザウィルスによって感染すると、ＮＦ−κＢは抗ウィルス的に作用することが一般的な見方である２、３。ＲＮＡウィルス感染は一般に、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮｓ）によって媒介される先天性抗ウィルス反応の活性化を生じる。前記抗ウィルスプログラムはＩＦＮβ遺伝子のウィルスによる誘導により、構成的に発現した転写因子、即ちＡＰ−１、ＩＲＦ−３及びＮＦ−κＢを通して開始される４。ＩＦＮβの他に、炎症及び免疫反応の誘導に関連したその他の遺伝子も、ＮＦ−κＢによって調節されていて、例えばＩＬ−６、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１２である。従って、ＩＦＮβ、ＩＬ−６及びＩＬ−１２のＶＳＶにより誘導された発現は、ＮＦ−κＢアクチベーター、ＩκＢキナーゼ２（ＩＫＫ２）を欠失した細胞において欠損している２。
【０００３】
ウィルス増殖へのＮＦ−κＢ干渉のその他のレベルは、アポトーシスを調節するその能力を通してである。ＮＦ−κＢは主として、抗アポトーシス遺伝子、例えばＢｃｌ−ＸＬ、Ａ２０、又はｃｌＡＰｓを上方調節させることによる、生存因子であると考えられている５、６。しかし、ＮＦ−κＢはある種の状況下では、例えばデス誘導ＣＤ９５リガンド及びそのレセプターの上方調節により、アポトーシス促進的に作用するとも報告された５、６。このように、ＮＦ−κＢによるアポトーシスの、状況に応じた調節の概念が生じた６。例えば、デングウィルス感染ＨｅｐＧ２肝細胞はＮＦ−κＢ依存的にアポトーシスを経るが７、一方でＣ型肝炎ウィルスコアタンパク質によって誘導されたＮＦ−κＢ活性化は、同じ細胞系において細胞をアポトーシスから保護する８。
【０００４】
ＮＦ−κＢ依存性反応の一般的なウィルスのインドューサーは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）のようである。ほとんどのＲＮＡウィルスは、細胞が危険信号と感知する可能性がある、共通した分子的なパターンを表示するｄｓＲＮＡ様複製中間体を産生する９。
【０００５】
インフルエンザウィルス又はインフルエンザウィルス産物によるＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）及びＮＦ−κＢの活性化はよく記録されている１０〜１３が、しかし、このシグナリングモジュールの機能はウィルス感染細胞においては未だ明らかでない。これまでの知識は、ウィルスの非構造タンパク質１（ＮＳ１）の完全なコード領域の欠失を有する、ｄｅｌＮＳ１と名付けられたリコンビナントウィルスで得られたデータに限られている１４。インフルエンザｄｅｌＮＳ１ウィルスでの細胞の感染は、促進されたＮＦ−κＢ活性化及びＩＦＮβ産生３と同様に促進されたアポトーシスも生じ１５、ＮＳ１タンパク質は、前記の推定上の抗ウィルス性反応の少なくとも部分的なアンタゴニストであることを示唆する。それにもかかわらず、感染の結果のための、インフルエンザウィルス誘導ＮＦ−κＢ活性化の重要性は未だに直接的に述べられてはいない。
【０００６】
本出願によれば、ＮＦ−κＢ依存的なウィルスによる誘導はアポトーシス促進因子ＴＲＡＩＬを介して媒介され、前記ＴＲＡＩＬは、オートクリン及びパラクリン様式において、特にインフルエンザウィルス感染の状況において、ウィルス増殖を促進する。
【０００７】
本発明の第１の観点は、ＴＲＡＩＬリガンド／レセプター系の阻害剤の、ウィルス感染の治療のため、特にＲＮＡウィルス、例えばマイナス鎖ＲＮＡウィルス、例えばインフルエンザウィルス及びボルナ病ウィルスによって引き起こされるウィルス感染の治療のための医薬品を製造するための使用に関する。とりわけ有利には、インフルエンザウィルス感染の予防又は治療である。ＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター阻害剤は、ヒト又は家畜又は野生動物、例えば馬又は羊におけるウィルス感染の予防又は治療のために使用される。本発明の阻害剤は、ウィルス感染の予防及び／又は急性又は慢性的なウィルス感染の治療のために投与されてよい。
【０００８】
本発明の有利な実施態様においては、阻害剤はＴＲＡＩＬ（ＴＲＡＩＬリガンドＡＰＯ−２）阻害剤である。例えばＴＲＡＩＬ阻害剤は、
（ａ）阻害性の抗ＴＲＡＩＬ抗体、又は前記抗体のフラグメント、及び
（ｂ）可溶性のＴＲＡＩＬレセプター分子、又は前記分子のＴＲＡＩＬ結合部
から選択されてよい。
【０００９】
有利には、阻害性の抗ＴＲＡＩＬ抗体、及び前記抗体の抗原結合フラグメント及び可溶性ＴＲＡＩＬレセプター分子又は前記分子のＴＲＡＩＬリガンド結合部である。適した抗ＴＲＡＩＬ抗体の例は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、又は抗体フラグメント、例えばタンパク質分解性フラグメント又はリコンビナント一本鎖フラグメントである。前記抗体はこの分野で公知の免疫化及び選択方法によって得られてよい。更に有利には、可溶性ＴＲＡＩＬレセプター分子、例えば膜貫通ドメインを有しない可溶性ＴＲＡＩＬレセプター分子２８、又はＴＲＡＩＬに結合することが可能なＴＲＡＩＬレセプターペプチドである。
【００１０】
ＴＲＡＩＬレセプター分子は、ＴＲＡＩＬレセプター−１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＤＲ４）、ＴＲＡＩＬレセプター−２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、Ａｐｏ２、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ２ａ、ＴＲＩＣＫ２ｂ）、ＴＲＡＩＬレセプター−３（ＤＣＲ１）、ＴＲＡＩＬレセプター−４（ＤＣＲ２、ＴＲＵＮＤ）及びＯＰＧ（オステオプロテゲリン）から選択されてよい。有利には、ＴＲＡＩＬレセプター−１及びＴＲＡＩＬレセプター−２、より有利にはＴＲＡＩＬレセプター−２である。ＴＲＡＩＬレセプターは、ＷＯ９８／３２８５６、ＷＯ９８／３５９８６、ＷＯ９８／４１６２９、ＷＯ９９／１０４８４、ＷＯ００／６６１５６及び参考文献２８に記載されていて、これらは引用によって本発明に組み込まれる。本発明は、上記した複数のＴＲＡＩＬレセプターの組み合わせた使用を含んでもよい。
【００１１】
とりわけ有利には、ＴＲＡＩＬレセプター分子の細胞外ドメインを含有するＴＲＡＩＬ阻害剤である。前記細胞外ドメインは、異種ポリペプチドドメイン、特にＣＨ２及びＣＨ３ドメイン及び場合によってヒンジ領域を含むＦｃ免疫グロブリン分子、例えばヒトＩｇＧ分子からのＦｃ免疫グロブリン分子に場合によって融合している。
【００１２】
本発明の更なる実施態様においては、阻害剤は、
（ａ）阻害性の抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体、又は前記抗体のフラグメント、及び
（ｂ）阻害性のＴＲＡＩＬフラグメント
から選択されてよいＴＲＡＩＬレセプター阻害剤である。
【００１３】
適した阻害性の抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の例、例えばＴＲＡＩＬレセプター−１、ＴＲＡＩＬレセプター−２、ＴＲＡＩＬレセプター−３、ＴＲＡＩＬレセプター−４に対する抗体又はＯＰＧ、及び阻害性のＴＲＡＩＬリガンドフラグメントはＷＯ９８／３５９８６、ＷＯ９９／１０４８４、ＷＯ００／７３３４９、参考文献３１及び参考文献３２に記載されていて、これらは引用によって本発明に組込まれる。抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、又はタンパク質分解性又はリコンビナント抗体フラグメントであってよい。特に有利には、抗ＴＲＡＩＬ Ｒ１抗体及び抗ＴＲＡＩＬ Ｒ２抗体である。
【００１４】
更なる実施態様においては阻害剤は、ＴＲＡＩＬレセプター−１又はＴＲＡＩＬレセプター−２のデスドメインとＦＡＤＤのデスドメインとの相互作用を阻害してよい。適した阻害剤の例は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２又はＦＡＤＤのデスドメインに特異的に指向した抗体又はフラグメントである。その上、阻害剤はＦＡＤＤのデスエフェクタードメインとカスパーゼ−８及び／又はカスパーゼ１０との相互作用を阻害してよく、これによりデスレセプター、例えばＴＲＡＩＬレセプターにより誘導された過程、例えばアポトーシスの過程を阻害してよい。これに関連して、参考文献３３及びこれに引用された参考文献が参照される。
【００１５】
本発明のまた更なる実施態様においては、阻害剤は核酸エフェクター分子である。核酸エフェクター分子はアンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子及びリボザイムから選択されてよく、これらは少なくとも一つのＴＲＡＩＬレセプター遺伝子及び／又はＴＲＡＩＬリガンド遺伝子の発現を阻害してよい。
【００１６】
更なる実施態様においては、阻害剤は細胞内のＴＲＡＩＬレセプターシグナル伝達に指向してよく、例えばＴＲＡＩＬレセプターシグナル伝達の特異的な阻害剤又はアポトーシスシグナル伝達の一般的な阻害剤であってよい。前記細胞内阻害剤の例は、アポトーシス阻害剤、特に細胞内アポトーシス阻害剤、例えばカスパーゼ阻害剤、例えばカスパーゼ−３、カスパーゼ−８又はカスパーゼ−１０阻害剤、Ｂｉｄ阻害剤、Ｂａｘ阻害剤、又はこれらの全ての組み合わせから選択される。適した阻害剤の例は、一般的なカスパーゼ阻害剤、例えば、ＷＯ０２／０９４２６３、ＷＯ０１／１０３８３、ＷＯ０１／４２２１６、ＷＯ０１／９００７０、ＷＯ０１／９４３５１、ＷＯ０１／２１６００、ＷＯ００／６１５４２、ＷＯ９９／４７５４５、ジペプチド阻害剤（ＷＯ９９／４７１５４）、カルバマート阻害剤（ＷＯ０１／７２７０７）、置換されたアスパラギン酸アセタール（ＷＯ０１／８１３３０）、ヘテロサイクリルジカルバミド（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌｄｉｃａｒｂａｍｉｄｅｓ）（ＷＯ０２／０８５８９９）、キノリン−（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド）誘導体（ＵＳ２００１２６４６７）、置換された２−アミノベンズアミドカスパーゼ阻害剤（ＷＯ００／５５１１４）、置換されたα−ヒドロキシ酸カスパーゼ阻害剤（ＷＯ０１／１６０９３）、ニトロシル化による阻害（ＷＯ９８／４３６２１）；ＣＡＳＰ−１：（ＷＯ０２／０００８５３；ＣＡＳＰ−３：タンパク質阻害剤（ＷＯ０２／０６６０５０）、アンチセンス分子（ＷＯ０１／５３３１０）、ニコチニル−アスパルチル−ケトン（ＷＯ０１／２７０８５）、γ−ケト酸ジペプチド誘導体（ＷＯ０２／４８１７９、ＷＯ００／３２６２０、ＷＯ００／５５１２７）、ＣＡＳＰ−８：アンチセンス分子（ＷＯ０１／５３５４１）、相互作用タンパク質（ＷＯ００／３９１６０） ＣＡＳＰ−９：アンチセンスモジュレーター（ＷＯ０２／２２６４１）；ＣＡＳＰ２：アンチセンス分子（ＷＯ０２／２４７２０）；ＣＡＳＰ−６：アンチセンス分子（ＷＯ０２／２９０６６）；ＣＡＳＰ−７：アンチセンス分子（ＷＯ０２／２２６４０）；ＣＡＳＰ−１２阻害剤：ＷＯ００／５９９２４、これらは引用によって本発明に組み込まれる。更なる例は、ミトコンドリアの阻害剤、例えばＢｃｌ−２調節因子（ＷＯ０２／０９７０９４）；Ｂａｄ由来のＢｃｌ−２（ＷＯ９４／２７４２６）ミュータントペプチド（ＷＯ０２／２０５６８）、Ｂａｄ（ＷＯ９６／１３６１４）、ＢＨ３相互作用ドメインデスアゴニスト（ＷＯ９８／０９９８０）、Ｂａｘ阻害剤タンパク質（ＷＯ９８／４０３９７）、ＢＬＫ遺伝子及び遺伝子産物（ＷＯ９９／５０４１４）、これらは引用によって本発明に組み込まれる。アポトーシスの更に適した細胞内モジュレーターは、ＣＡＳＰ９／Ａｐａｆ−１会合のモジュレーター（ＷＯ０２／０６４１２８）、Ａｐａｆ−１発現のアンチセンスモジュレーター（ＷＯ０２／３２９２１）、アポトーシス阻害のためのペプチド（ＷＯ９９／４３７０１）、単純ヘルペスウィルスのＲ１サブユニットを含む抗アポトーシス性組成物（ＷＯ００／０７６１８）、ＭＥＫＫ１及びそのフラグメント（ＷＯ９９／４１３８５）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）のモジュレーター（ＷＯ０１／６４７４１）、アポトーシス阻害剤のモジュレーター（ＷＯ９７／０６１８２、ＷＯ００／７７２０１、ＷＯ０１／５９１０８、ＷＯ０２／０５３５８６）及びＨＩＡＰ２（ＷＯ００／０８１４４）であり、これらは引用によって本発明に組み込まれる。更に、上記の阻害剤の全ての組み合わせを使用してよい。
【００１７】
阻害剤、又は前記阻害剤の組み合わせは、これを必要とする被験体、特にヒト患者に、特定の症状の治療のために十分な量において、適した方法によって投与される。例えば、阻害剤は薬学的に許容可能なキャリアー、希釈剤及び／又は佐剤と共に、薬学的な組成物として処方されてよい。治療の効能及び毒性は標準的なプロトコルに従って決定されてよい。薬学的な組成物は、全身に、例えば腹腔内に、筋肉内に、又は静脈内に、又は局所的に、例えば鼻腔内に投与されてよい。有利には、静脈内及び／又は鼻腔内投与である。
【００１８】
阻害剤のとりわけ有利な組み合わせは、細胞外ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬレセプター阻害剤、例えば抗ＴＲＡＩＬ抗体、又は異種ポリペプチドに場合によって融合した可溶性の細胞外ＴＲＡＩＬレセプタードメインと、細胞内のＴＲＡＩＬレセプターシグナル伝達阻害剤との、組み合わせである。
【００１９】
場合によって、更なる有効成分が存在し、前記有効成分は抗ウィルス薬、例えばウィルスの膜貫通タンパク質に指向したアマンタジン及び前記誘導体、例えばリマンタジン、ウィルスのノイラミニダーゼ、特にインフルエンザウィルスからのノイラミニダーゼの阻害剤、例えばリレンザ、Ｒａｆ−Ｍｅｋ−Ｅｒｋシグナル伝達経路の阻害剤、例えば２０１２６又はＰＣＴ／ＤＥ０１／０１２９２に記載されたその他の阻害剤、ＭＩＫＫ／ＳＥＫ／ＹＭＫシグナル伝達経路の阻害剤、又はＤＥ１０１３８９１２に記載された更なるシグナル伝達経路の構成要素の阻害剤、及び合成ヌクレオシド類似物、例えば３−デアザアデノジン（３−ｄｅａｚａａｄｅｎｏｚｉｎｅ）及びリバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎｅ）である。
【００２０】
投与される阻害剤の用量は勿論、治療される被験体、被験体の重量、損傷のタイプ及び重傷度、投与の方法、及び処方する医師の判断に依存する。抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ又は−Ｌ抗体又は可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒタンパク質、例えばＴＲＡＩＬ−Ｒ融合タンパク質の投与のためには、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの１日量が適している。
【００２１】
更に、本発明の観点は、化合物がＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター系を阻害することが可能であるかを決定することを含む、ウィルス感染、特にＲＮＡウィルス、例えばインフルエンザ又はボルナ病のウィルスによる感染の阻害剤を同定及び／又は特性決定する方法である。ＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター系の阻害は有利には、ＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター媒介アポトーシス又はＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター媒介細胞活性化の阻害を含む。更に有利には、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２とＦＡＤＤデスドメインとの相互作用の阻害、又はＦＡＤＤデスエフェクタードメインとカスパーゼ−８及び／又はカスパーゼ１０との相互作用の阻害である。
【００２２】
上記の方法は、分子ベースアッセイであってよく、その際ＴＲＡＩＬリガンドとＴＲＡＩＬレセプターとの相互作用に及ぼす、試験される化合物の効果は、ほぼ精製されかつ単離された成分、例えばリコンビナント分子を含む試験系において解析される。又は、方法は細胞ベースアッセイとして実施されてもよく、その際適した試験細胞、例えばＴＲＡＩＬレセプターを発現又は過剰発現する試験細胞を使用する。適した分子ベースアッセイ及び細胞ベースアッセイ系、例えばハイスループットアッセイ系はこの分野において公知である。
【００２３】
更に本発明は以下の図及び実施例において、より詳細に説明される。
【００２４】
図の説明
図１：ＮＦ−κＢシグナリングは効率的なインフルエンザウィルス産生に重要である
ａ）ＩκＢα分解のイムノブロット分析。ベクター、ＩＫＫ２ ＥＥ、ＩＫＫ２ ＫＤ又はＩκＢαｍｕｔを安定発現するＡ５４９細胞系をＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、表示した時間の後に回収した。過剰発現したＩκＢαｍｕｔはＳＤＳゲルにおいて遅延を示すことに注意。ＩＫＫ ＥＥ細胞系は構成的なＩκＢα分解を示さないが、刺激後のｄｅ ｎｏｖｏ ＩκＢα発現の回復はより迅速である。これは、刺激又は感染したＩＫＫ２ ＥＥ細胞において一貫して観察された、強化したＮＦ−κＢシグナル強度のためである可能性がある。
ｂ）ＮＦ−κＢプロモーター−ルシフェラーゼ−リポーター遺伝子アッセイ。安定に形質導入したＭＤＣＫ細胞系を３×ＮＦ−κＢ結合部位人工プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ−リポーター遺伝子プラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＦＰＶで感染させ（ＭＯＩ＝５）、及び感染後（ｐ．ｉ．）４時間目に回収して、ルシフェラーゼアッセイを行った。各バーは、三回の独立したトランスフェクションの平均及び標準偏差を示す。
ｃ）ＩＦＮβプロモーター／エンハンソソームルシフェラーゼ−リポーター遺伝子−アッセイ。安定に形質導入したＭＤＣＫ細胞系を、誘導可能なＩＦＮβ発現を担うＡＰ−１、ＩＲＦ及びＮＦ−κＢ結合部位を有するＩＦＮβ−プロモーター／エンハンソソームによって駆動されるルシフェラーゼ−リポータープラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をインフルエンザＡウィルスで感染させ（ＭＯＩ＝５）、及びｐ．ｉ．４時間目に回収して、ルシフェラーゼアッセイを行った。各バーは、三回の独立した実験の平均及び標準偏差を示す。
ｄ）異なるＭＤＣＫ及びＩ型インターフェロン欠損ベロ細胞系をＦＰＶで感染させた（ＭＯＩ＝１）。上清を９時間に回収し、ウィルス収量をＭＤＣＫ細胞上のプラークアッセイにおいて定量した。データを、ベクターコントロールと比較したウィルス力価のパーセンテージとして示す。各バーは、三回の独立した実験の平均及び標準偏差を示す。
ｅ）ｄにおいて記載した通りに、ＦＰＶで感染させた異なるＡ５４９細胞系を用いて実験を行った。対数目盛りにおいて、絶対プラーク形成単位としてデータを示す。各バーは、三回の独立した実験の平均及び標準偏差を示す。
【００２５】
図２：ＮＦ−κＢは、インフルエンザウィルス感染の状況下においては、Ａ５４９細胞系においてアポトーシス促進的に作用する。
ａ）初期のアポトーシスマーカーであるＰＡＲＰ分断のための、イムノブロット。Ａ５４９細胞系を、模擬感染又はＦＰＶで感染させ（ＭＯＩ＝１）、ｐ．ｉ．２４時間目にＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶解バッファーにおいて溶解した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ及びブロッティング後、メンブランを抗ＰＡＲＰ ｍＡｂを用いたウェスタンブロットにかけ、タンパク質の分断及び非分断形状の両方を検出した。Ｅｒｋブロットは負荷コントロールとして務める。
ｂ）Ａ５４９細胞系をＦＰＶで感染させ（ＭＯＩ＝１）、幅広いカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ又は不活性コントロール（Ｚ−ＦＡ−ＦＭＫ）の様々な濃度でインキュベーションした。ｐ．ｉ．２４時間目に上清を回収し、ウィルス力価を測定した。
ｃ）ｂ）における通りに、ＦＰＶで感染させた（ＭＯＩ＝１）異なるベロ細胞系で実験を実施した。
【００２６】
図３：アポトーシス促進タンパク質ＴＲＡＩＬはインフルエンザＡウィルス感染すると誘導される
ａ）Ａ５４９細胞系を模擬処置又はＦＰＶで感染させた（ＭＯＩ＝１）。ｐ．ｉ．２４時間目にＲＮＡを単離し、ＲＮアーゼプロテクションアッセイにかけた。
ｂ）Ａ５４９（野生型）細胞におけるＴＲＡＩＬ発現のイムノブロット法。Ａ５４９細胞をＦＰＶで感染させ（ＭＯＩ＝１０）、異なる時間、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶解バッファー中で溶解させた。ウィルス性のＮＰ蓄積を、感染経過のためのコントロールとして使用した。
ｃ）異なるＡ５４９細胞系をＦＰＶで感染させ（ＭＯＩ＝５）、タンパク質分泌を妨げるためにモネンシンで処理した。ｐ．ｉ．８時間目に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＴＲＡＩＬ発現のために染色し、これをＦＡＣＳ分析において検出した。グレー線：非感染細胞、黒線：ウィルス感染細胞。
【００２７】
図４：ＴＲＡＩＬはインフルエンザＡウィルス増殖のための重要なメディエーターである。
ａ）可溶性ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＦｃはＴＲＡＩＬ媒介カスパーゼ活性化を妨げる。Ａ５４９細胞を未処置のままにするか、又はリコンビナントのフラッグタグ化したヒトＴＲＡＩＬ（２０ｎｇ／ｍｌ）で、可溶性ＴＲＡＩＬレセプター２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ、１０μｇ／ｍｌ）あり又はなしで１６時間刺激した。溶解物を、アポトーシス誘導の測定のために抗ＰＡＲＰウェスタンブロットにかけた。
ｂ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃの存在はインフルエンザウィルス産生を減少させる。Ａ５４９野生型細胞をＦＰＶで感染させた（ＭＯＩ＝１）。感染後、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）又はコントロールとしてＴＮＦ−Ｒ２−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。ｐ．ｉ．９時間後及び２４時間後に上清を回収し、ウィルス力価を測定した。
ｃ）ＴＮＦ−Ｒ２−ＦｃはＴＮＦα誘導ＩκＢα分解を妨げる。Ａ５４９細胞を未処置のままにするか、又はＴＮＦ−Ｒ２−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、リコンビナントＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。
ｄ）Ａ５４９細胞系をＦＰＶ（ＭＯＩ＝１）で感染させた。ｐ．ｉ．６時間目にリコンビナントのフラッグタグ化ヒトＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ／ｍｌ）を感染培地に添加した。ｐ．ｉ．９時間目に上清を回収し、ウィルス力価を測定した。各バーは、三回の独立した実験の平均及び標準偏差を示す。
【００２８】
実施例
１．方法
１．１ウィルス、細胞系及びウィルス感染
トリインフルエンザウィルス Ａ／Ｂｒａｓｔｉｓｌａｖａ／７９（Ｈ７Ｎ７；家禽ペストウィルス（ＦＰＶ））を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｇｉｅｓｓｅｎのウィルス株コレクションから取得し、異なる細胞系の感染のために使用した。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞及びアフリカミドリザル腎臓細胞（ベロ）を、１０％熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び抗生物質を補給した最小必須培地（ＭＥＭ）中において成長させた。Ａ５４９ヒト肺癌腫細胞を１０％熱非働化ＦＢＳ及び抗生物質を補給したＨａｍ’ｓＦ１２培地中において成長させた。トランスドミナントｍｌκＢαと同様に構成的に活性があり、ドミナントネガティブなＩＫＫ２も安定発現するＡ５４９、ＭＤＣＫ及びベロ細胞系を、ｐＣＦＧ５−ＩＥＧＺレトロウィルスベクター系２７及び両種指向性Ｐｈｏｅｎｉｘ ｐｒｏｄｕｃｅｒ 細胞系を用いて、ほぼＤｅｎｋ．ｅｔ ａｌ１６において記載されたように、レトロウィルス形質導入アプローチによって生じさせた。感染のために、細胞をＰＢＳで洗浄し、示した感染多重度（ＭＯＩ）で、ＰＢＳ／ＢＡ（０．２％ＢＳＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．９ｍＭ ＣａＣｌ２、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＰＢＳ）中で希釈したウィルスで、１時間室温でインキュベートした。接種材料を吸引し、細胞を０．２％ＢＳＡ及び抗生物質を含有するＭＥＭ又はＨａｍ’ｓＦ１２でインキュベートした。ｐ．ｉ．９時間目又は２４時間目に上清を回収し、感染粒子（プラーク力価）の数をサンプル中において評価した。簡単に言うと、６ウェルディッシュ中の９０％集密度に成長したＭＤＣＫ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／ＢＡ中で上清の段階希釈で１時間３７℃で感染させた。接種材料を吸引し、０．６％寒天（Ｏｘｏｉｄ）、０．３％ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び１．５％ＮａＨＣＯ３で補給したＭＥＭ／ＢＡ（０．２％ＢＳＡ及び抗生物質を含有する培地）２ｍｌ中で、３７℃、５％ＣＯ２で２〜３日間細胞をインキュベートした。ウィルスプラークをニュートラル−レッドでの染色によって視覚化した。
【００２９】
１．２阻害剤、抗体及び試薬
カスパーゼ阻害剤、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ又は阻害剤コントロールＺ−ＦＡ−ＦＭＫ（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をすぐに使用可能であるようにＤＭＳＯ中２ｍＭで供給した。ＤＭＳＯを溶媒コントロールとして、最も高い阻害剤濃度を代表して、２％の終濃度で使用した。マウス抗ＰＡＲＰモノクローナル抗体をＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＴＲＡＩＬウェスタンブロットのためにヒトＴＲＡＩＬに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した（ｓｃ−８４４０）。ＦＡＣＳのためのＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２に対するＭＡｂｓも、リコンビナントのフラッグタグ化ヒトＴＲＡＩＬと同様にＡｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能である。可溶性ＴＲＡＩＬ−レセプター２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ）及び可溶性のＴＮＦ−αレセプター（ｓＴＮＦ−Ｒ２−Ｆｃ）は、参考文献２８にほぼ説明されたように、ヒトＩｇＧ−Ｆｃとの融合タンパク質として生産された。
【００３０】
１．３ プラスミド、トランスフェクション及びウェスタンブロット
ＩＦＮβ−プロモーター−ルシフェラーゼプラスミドは、Ｊ．Ｈｉｓｃｏｔｔ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａによって好意により提供された。３×ＮＦ−κＢレポータープラスミドは以前に１３に説明されている。ＭＤＣＫ細胞をリポフェクタミン２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、Ｂａｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２９によるプロトコルによりトランスフェクションした。ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイを以前に説明されたように実施した２５、３０。ウェスタンブロットのために細胞をＴｒｉｔｏｎ溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭグリセロールリン酸ナトリウム、２０ｍＭピロリン酸ナトリウム、５μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭバナジン酸ナトリウム、５ｍＭベンズアミンジン）中で、氷上で１０〜２０分間溶解した。細胞溶解物を次に遠心分離し、上清中のタンパク質の含量を、ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｙｅ ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定した。タンパク質の等量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、ニトロセルロース膜上にブロットした。
【００３１】
１．４フローサイトメトリー法
ＴＲＡＩＬを細胞内染色法により検出した。Ａ５４９細胞系をＦＰＶで、５のＭＯＩで８時間、タンパク質分泌をさけるために２μＭモネンシンの存在下で感染させた。細胞を４％パラホルムアルデヒドで、４℃で２０分間固定し、引き続き透過バッファー（０．１％サポニン／１％ウシ胎仔血清／ＰＢＳ）中で２回洗浄した。ＴＲＡＩＬに対するマウスモノクローナル抗体又はアイソタイプコントロール抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのインキュベーション後、細胞をビオチン−Ｓｐ−コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ）、及びストレプトアビジン−Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で染色した。ＦＬ３−チャンネルにおいて、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて蛍光を測定した。全てのＦＡＣＳ分析は少なくとも２回繰り返され、ほぼ類似した結果を示した。
【００３２】
１．５ ＲＮアーゼプロテクションアッセイ
Ａ５４９細胞系を模擬感染させたか又はＦＰＶで１のＭＯＩで感染させた。ｐ．ｉ．２４時間目に細胞を溶解させ、ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従ってＲＮＡを単離した。精製ＲＮＡを、製造者の指示に従って、ＲｉｂｏＱｕａｎｔ Ｍｕｌｔｉ−Ｐｒｏｂｅ ＲＮａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｈＡＰＯ−３（ＢＤ−Ｐｈａｒｉｍｉｎｇｅｎ）にかけた。
【００３３】
２．結果
インフルエンザウィルス感染の間のＩＫＫ及びＮＦ−κＢ活性化の役割を分析するために、我々は、ドミナントネガティブＩＫＫ２（ＩＫＫ ＫＤ）、構成的に活性のあるＩＫＫ２（ＩＫＫ ＥＥ）、又はＮＦ−κＢ活性化を妨げる、ＩκＢαの分解可能でないミュータント（ＩκＢαｍｕｔ）１６を安定発現する宿主細胞系を樹立した。図１はＩＫＫ ＫＤ又はＩκＢαｍｕｔの発現がＮＦ−κＢ活性化の効率的な遮断を生じることを示す。ＴＮＦ−α誘導ＩκＢα分解（図１ａ）又はＮＦ−κＢ依存性プロモーターエレメントからのインフルエンザウィルスが誘導した転写（図１ｂ）は前記ミュータントの存在下で損われている。ＩＫＫ ＥＥの高発現は前記細胞系においては良好に寛容性ではなく、導入遺伝子はいくつかの継代のあとにかろうじて検出可能になるだけであるが（データ掲載せず）、ＩＫＫ ＥＥ細胞系における促進したＮＦ−κＢ依存性転写活性は、それでもウィルス感染すると検出可能であった。人工ＮＦ−κＢリポーター遺伝子構造が、ＩＦＮβプロモーター／エンハンソソームを収容するリポーター遺伝子プラスミドによって置き換わると、異なるミュータントは転写活性にほぼ同様の効果を示す（図１ｃ）が、しかしＩＦＮβ発現のためのその他の、ウィルスが誘導した転写因子の関与のためにあまり顕著ではない。これはＮＦ−κＢは、ＩＦＮβ発現を抗ウィルス機能として調節する２という、これまでの報告と一致する。
【００３４】
しかし、前記の異なる細胞系においてインフルエンザウィルス産生の効率を調べると、異なる結果を見出した。ウィルス増殖はＮＦ−κＢ阻害すると損なわれ、活性状態、ＩＫＫ ＥＥを発現する細胞においては促進された（図１ｄ、ｅ）。効果はＭａｄｉｎｅ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）上皮細胞において、及びベロ細胞においても同様であった（図１ｄ）。後者の細胞系は１型インターフェロンを発現せず１７、観察された効果における前記サイトカインの顕著な関与を除外する。ウィルス増殖の阻害又は促進は、導入遺伝子作用の効率と相関し（データ掲載せず）、Ａ５４９肺上皮細胞においてもっとも強力で、その際異なる細胞系間のウィルス力価の差は１０倍までであった（図１ｅ）。この結果は、それぞれのＮＦ−κＢ欠損ＣＲＬ細胞系とボルナ病ウィルス（ＢＤＶ）、別のマイナス鎖ＲＮＡウィルスでの感染により得られた結果とは異なる。前記結果では、ＮＦ−κＢの阻害は複製には顕著な効果を及ぼさず、しかしＩＫＫ ＥＥの発現による経路の活性化は、Ｉ型インターフェロンの大規模な誘導のために、ウィルス複製を強く損なった（Ｏ．Ｐ．及びＳ．Ｌ．、未発表データ）。これは、インフルエンザウィルス複製に特異的なＮＦ−κＢの決定的な作用を示唆し、前記作用はＩ型インターフェロン反応とは無関係に生じるようである。
【００３５】
ＮＦ−κＢは転写因子であり、従って根本的な機構は、プロウィルス的な（ｐｒｏｖｉｒａｌ）作用因子の調節に関与する可能性が高い。ＮＦ−κＢはアポトーシス促進遺伝子及び抗アポトーシス遺伝子の両方の調節因子６なので、異なるＮＦ−κＢ細胞系におけるアポトーシスのウィルス誘導を調べた。初期のアポトーシス事象を観察するために、主要なカスパーゼ基質、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）のタンパク質分解による分断を選択した。インフルエンザウィルス感染は、ベクター細胞系における顕著な分断を生じ、これは更にＩＫＫ ＥＥ発現細胞において促進された（図２ａ）。対照的に、ウィルス誘導ＰＡＲＰ分断は、トランスドミナントネガティブミュータント、ＩＫＫ又はＩκＢαを発現する感染細胞において損なわれた（図２ａ）。この意外な発見は、インフルエンザウィルス感染の状況下では、ＮＦ−κＢが抗アポトーシス的というよりむしろアポトーシス促進的に作用することを示す。事実、アポトーシス誘導及びカスパーゼ活性化は効率的なウィルス増殖に必要である可能性がある。ウィルス収量は、Ａ５４９及びベロ細胞の両方において、汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの存在下では強力に損なわれたが、不活性なアナログＺ−ＦＡ−ＦＭＫによっては損なわれなかった（図２ｂ、ｃ）。
【００３６】
まとめると、インフルエンザ感染の間にＮＦ−κＢはアポトーシス促進因子を上方調節させ、これはウィルス産生を促進させることをデータは示す。従って、様々なアポトーシス調節因子、例えばカスパーゼ８、Ｆａｓ（ＡＰＯ−１、ＣＤ９５）、デスレセプター３（ＤＲ３）、ＴＲＡＩＬ又はＴＮＦ−Ｒ１の、ウィルスにより誘導された遺伝子発現を、ベクター、ＩＫＫ ＥＥ、又はＩＫＫ ＫＤ発現細胞系において、ＲＮアーゼプロテクションアッセイを用いて調べた（図３ａ）。興味深いことに、ベクタートランスフェクションした細胞系又はＩＫＫ ＥＥ発現細胞系において、ウィルス感染すると強力に上方調節されるが、ＩＫＫ ＫＤ発現細胞系において完全に存在しない唯一の前記遺伝子は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）の遺伝子であった。ＴＲＡＩＬはインフルエンザウィルス感染の間の時間にわたって増加しつづける量で発現し（図３ｂ）、ＩＫＫ ＫＤ又はｍＩκＢαによるＮＦ−κＢシグナリングの阻害はウィルス誘導ＴＲＡＩＬ合成を完全に遮断した（図３ｃ）。
【００３７】
ＮＦ−κＢ依存性に促進されたインフルエンザウィルス複製にＴＲＡＩＬが関与しているかを試験するために、我々はＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ、ＴＲＡＩＬの効果的な阻害剤２８の非存在下又は存在下でウィルス力価を測定した。前記試薬はＴＲＡＩＬ誘導ＰＡＲＰ分断を効果的に遮断した（図４ａ）だけでなく、しかし２４時間後にはウィルス産生を約８０％減少させた（図４ｂ）。これは、ＴＲＡＩＬは確かにプロウィルスの因子であることを示す。反対に、可溶性ＴＮＦ−Ｒ２−Ｆｃ、別の、アポトーシス促進的で、ウィルスによって誘導されるサイトカインのためのレセプターは、ウィルス力価の顕著な減少を生じなかった（図４ｂ）が、前記試薬の同濃度は効果的にＴＮＦα誘導ＩκＢα分解を遮断した（図４ｃ）。ＴＲＡＩＬがウィルス増殖を援助するという知見と一致して、低濃度リコンビナントヒトＴＲＡＩＬでの感染細胞の刺激は、Ａ５４９細胞におけるウィルス産生を促進し、異なる細胞系におけるＮＦ−κＢ欠損の表現型をレスキューした（図４ｄ）。
【００３８】
このように、アポトーシスインドューサーＴＲＡＩＬは、インフルエンザウィルス感染細胞において、ＮＦ−κＢ依存的に誘導されたプロウィルスの因子である。
【００３９】
３．考察
インフルエンザウィルス感染細胞におけるＮＦ−κＢの役割は、詳細には研究されてこなかったが、ＮＦ−κＢ活性化及びアポトーシス誘導の両方は、インフルエンザウィルス感染に対する抗ウィルス反応であると一般的に考えられてきた。本出願に示したデータによれば、ＮＦ−κＢはインフルエンザウィルス感染の状況下ではむしろ、少なくともアポトーシス促進因子ＴＲＡＩＬの発現を調節することによって、プロウィルス的に作用するというシナリオに我々は直面する。
【００４０】
これまでは、ＴＲＡＩＬの転写調節に関してはほとんど知られていない。しかし、最近の研究では、ＴＲＡＩＬの発現は、事実ＮＦ−κＢ依存的にジャーカットＴ細胞において、ｃ−Ｒｅｌ結合部位を通して近位ＴＲＡＩＬプロモーター中で誘導されうることが実証された１８。我々は上記に、これが上皮細胞において、ウィルスのインドューサーでも当てはまることを示した。１３０００個のうち８４個の遺伝子中のＴＲＡＩＬを同定し、前記遺伝子がヒトインフルエンザウィルスでの感染に対する反応において調節解除されるという、最近の転写のプロファイリングアプローチ１９からの知見によって我々のデータは支持されている。更に、ＴＲＡＩＬ及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ１／２は、複数のその他のウィルスでの感染の間に上方調節することが示されており２０〜２３、これは感染細胞又は免疫系の細胞を選択的に殺すという抗ウィルス性の反応であると仮定されてきた。しかしインフルエンザウィルス感染の場合には、ＮＦ−κＢ依存的なＴＲＡＩＬ誘導及び引き続くＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスはプロウィルス的な現象であることを、我々のデータは明らかに示している。従って、インフルエンザウィルスは宿主細胞保護機構の利点を活かす能力を獲得し、これによりウィルス複製を援助する可能性がある。存在する細胞内活動の利点を生かすことは、宿主細胞中に前記方法を積極的に誘導するよりむしろ、ウィルスの侵入者にとっては容易なことである。前記仮定にそうと、ウィルスは抗ウィルス反応の制限と、ウィルス成長を援助する十分なシグナリング強度の維持との間でバランスを保つ機構を必要とする。そのようなバランス制御は、ウィルスＮＳ１タンパク質によって供給されている可能性があり、前記タンパク質はある種の転写因子の活性を許容した制限に維持し３、２４、２５、これにより抗ウィルス反応の過多を妨げ、しかしいくつかのプロウィルスのタンパク質をそれでも産生させる。前記モデルを支持して、リコンビナントＴＲＡＩＬは、細胞が１０〜２０ｎｇ／ｍｌまでの濃度において感染の後期に刺激される場合のみに、ウィルス増殖を促進させることを観察した（図４ｄ）。より初期の刺激又はＴＲＡＩＬのより高い濃度は、支持的な効果の損失を生じる（データ掲載せず）。ＴＲＡＩＬを後期に必要とすることは、ウィルス複製サイクルの間のタンパク質の発現速度論と良好に相関する（図３ｃ）。
【００４１】
更に、インフルエンザウィルスはアポトーシス促進タンパク質、ＰＢ１−Ｆ２をウィルス生活環の後期に発現する２６という最近の知見は、効率的なウィルス成長のためにアポトーシス誘導を必要とすることと一致している。我々は、ＮＦ−κＢ及びＴＲＡＩＬを、インフルエンザウィルス複製のための決定的な細胞内因子であるとして同定した。我々の発見は、ＮＦ−κＢ及び／又はより具体的にはＴＲＡＩＬの薬理学的な阻害は、ウィルスに対する防御において治療的な価値がある可能性を示唆し、前記ウィルスはいまだに世界的に、人の健康に対する最も大きな脅威の１つであり続けている。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、ＮＦ−κＢシグナリングは効率的なインフルエンザウィルス産生に重要であることを示す図である。
【図２】図２は、ＮＦ−κＢは、インフルエンザウィルス感染の状況下においては、Ａ５４９細胞系においてアポトーシス促進的に作用することを示す図である。
【図３】図３は、アポトーシス促進タンパク質ＴＲＡＩＬはインフルエンザＡウィルス感染すると誘導されることを示す図である。
【図４】図４は、ＴＲＡＩＬはインフルエンザＡウィルス増殖のための重要なメディエーターであることを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター系の阻害剤の、ウィルス感染の予防又は治療のための医薬品を製造するための使用。
【請求項２】
インフルエンザ又はボルナ病の、ウィルス感染の予防又は治療のための請求項１記載の使用。
【請求項３】
インフルエンザウィルス感染の予防又は治療のための請求項１記載の使用。
【請求項４】
ヒトにおけるウィルス感染の予防又は治療のための請求項１から３までのいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
家畜又は野生動物におけるウィルス感染の予防又は治療のための請求項１から３までのいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
阻害剤はＴＲＡＩＬリガンド阻害剤である、請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
ＴＲＡＩＬリガンド阻害剤は、
（ａ）阻害性の抗ＴＲＡＩＬリガンド抗体、又は前記抗体のフラグメント、及び
（ｂ）可溶性のＴＲＡＩＬレセプター分子、又は前記分子のＴＲＡＩＬリガンド結合部
から選択される請求項６記載の使用。
【請求項８】
ＴＲＡＩＬレセプター分子は、ＴＲＡＩＬレセプター−１、ＴＲＡＩＬレセプター−２、ＴＲＡＩＬレセプター−３、ＴＲＡＩＬレセプター−４及びＯＰＧ（オステオプロテゲリン）から選択される、請求項７記載の使用。
【請求項９】
ＴＲＡＩＬリガンド阻害剤は、異種ポリペプチドドメインに場合によって融合した、ＴＲＡＩＬレセプター分子の細胞外ドメインである、請求項８又は９記載の使用。
【請求項１０】
ＴＲＡＩＬリガンド阻害剤は、Ｆｃ免疫グロブリン分子に融合した、ＴＲＡＩＬレセプター分子の細胞外ドメインである、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
阻害剤はＴＲＡＩＬレセプター阻害剤である、請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
ＴＲＡＩＬレセプター阻害剤は、
（ａ）阻害性の抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体、又は前記抗体のフラグメント；及び
（ｂ）阻害性のＴＲＡＩＬリガンドフラグメント
から選択される、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
阻害剤は核酸エフェクター分子である、請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
核酸エフェクター分子は、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、及びリボザイムから選択される、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
阻害剤は細胞内のＴＲＡＩＬレセプターシグナル伝達の阻害剤である、請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
阻害剤は、ＴＲＡＩＬレセプター−１又はＴＲＡＩＬレセプター−２のデスドメインとＦＡＤＤのデスドメインとの相互作用の阻害剤、又はＦＡＤＤのデスエフェクタードメインとカスパーゼ−８及び／又はカスパーゼ１０との相互作用の阻害剤である、請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１７】
医薬品は、有効成分として少なくとも１つの阻害剤を、薬学的に許容可能なキャリアー、希釈剤、及び／又は佐剤と共に含む、請求項１から１６までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１８】
医薬品は更なる有効成分を含む、請求項１から１７までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１９】
化合物がＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬレセプター系を阻害することが可能であるかを決定することを含む、ウィルス感染の阻害剤を同定及び／又は特性決定する方法。
【請求項２０】
阻害は、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬレセプター媒介アポトーシスの阻害を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
阻害は、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬレセプター媒介細胞活性化の阻害を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項１】
ＴＲＡＩＬリガンド／ＴＲＡＩＬレセプター系の阻害剤の、ウィルス感染の予防又は治療のための医薬品を製造するための使用。
【請求項２】
インフルエンザ又はボルナ病の、ウィルス感染の予防又は治療のための請求項１記載の使用。
【請求項３】
インフルエンザウィルス感染の予防又は治療のための請求項１記載の使用。
【請求項４】
ヒトにおけるウィルス感染の予防又は治療のための請求項１から３までのいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
家畜又は野生動物におけるウィルス感染の予防又は治療のための請求項１から３までのいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
阻害剤はＴＲＡＩＬリガンド阻害剤である、請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
ＴＲＡＩＬリガンド阻害剤は、
（ａ）阻害性の抗ＴＲＡＩＬリガンド抗体、又は前記抗体のフラグメント、及び
（ｂ）可溶性のＴＲＡＩＬレセプター分子、又は前記分子のＴＲＡＩＬリガンド結合部
から選択される請求項６記載の使用。
【請求項８】
ＴＲＡＩＬレセプター分子は、ＴＲＡＩＬレセプター−１、ＴＲＡＩＬレセプター−２、ＴＲＡＩＬレセプター−３、ＴＲＡＩＬレセプター−４及びＯＰＧ（オステオプロテゲリン）から選択される、請求項７記載の使用。
【請求項９】
ＴＲＡＩＬリガンド阻害剤は、異種ポリペプチドドメインに場合によって融合した、ＴＲＡＩＬレセプター分子の細胞外ドメインである、請求項８又は９記載の使用。
【請求項１０】
ＴＲＡＩＬリガンド阻害剤は、Ｆｃ免疫グロブリン分子に融合した、ＴＲＡＩＬレセプター分子の細胞外ドメインである、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
阻害剤はＴＲＡＩＬレセプター阻害剤である、請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
ＴＲＡＩＬレセプター阻害剤は、
（ａ）阻害性の抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体、又は前記抗体のフラグメント；及び
（ｂ）阻害性のＴＲＡＩＬリガンドフラグメント
から選択される、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
阻害剤は核酸エフェクター分子である、請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
核酸エフェクター分子は、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、及びリボザイムから選択される、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
阻害剤は細胞内のＴＲＡＩＬレセプターシグナル伝達の阻害剤である、請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
阻害剤は、ＴＲＡＩＬレセプター−１又はＴＲＡＩＬレセプター−２のデスドメインとＦＡＤＤのデスドメインとの相互作用の阻害剤、又はＦＡＤＤのデスエフェクタードメインとカスパーゼ−８及び／又はカスパーゼ１０との相互作用の阻害剤である、請求項１から５までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１７】
医薬品は、有効成分として少なくとも１つの阻害剤を、薬学的に許容可能なキャリアー、希釈剤、及び／又は佐剤と共に含む、請求項１から１６までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１８】
医薬品は更なる有効成分を含む、請求項１から１７までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１９】
化合物がＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬレセプター系を阻害することが可能であるかを決定することを含む、ウィルス感染の阻害剤を同定及び／又は特性決定する方法。
【請求項２０】
阻害は、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬレセプター媒介アポトーシスの阻害を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
阻害は、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬレセプター媒介細胞活性化の阻害を含む、請求項１９記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００７−５３３５９５（Ｐ２００７−５３３５９５Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０４８７９（Ｐ２００６−５０４８７９）
【出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３２４５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５４７９
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【出願人】（５０５３６０３６２）アポゲニクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (8)
【氏名又は名称原語表記】Ａｐｏｇｅｎｉｘ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｉｍ Ｎｅｕｅｎｈｅｉｍｅｒ Ｆｅｌｄ ５８１，Ｄ−６９１２０ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ
【出願人】（５０２０１６７６９）メディノヴァ・ゲゼルシャフト・フューア・メディツィーニシェ・イノヴァツィオーネン・アウス・アカデーミシャー・フォルシュング・エム・ベー・ハー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３２４５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５４７９
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【出願人】（５０５３６０３６２）アポゲニクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (8)
【氏名又は名称原語表記】Ａｐｏｇｅｎｉｘ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｉｍ Ｎｅｕｅｎｈｅｉｍｅｒ Ｆｅｌｄ ５８１，Ｄ−６９１２０ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ
【出願人】（５０２０１６７６９）メディノヴァ・ゲゼルシャフト・フューア・メディツィーニシェ・イノヴァツィオーネン・アウス・アカデーミシャー・フォルシュング・エム・ベー・ハー (1)
【Ｆターム（参考）】
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