ウイルス感染治療のための乳酸菌の使用
本発明は、ウイルス感染の治療及び／又は予防のための薬学的組成物の製造のための、乳酸菌から選択される少なくとも一種のプロバイオティクス細菌株の使用に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス感染の治療及び／又は予防のための薬学的組成物の製造のための、乳酸菌から選択される少なくとも一種のプロバイオティクス細菌(Probiotic bacteria)株の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクス細菌は生きている微生物と定義され、適量の投与で宿主に有益な働きを及ぼす。乳酸菌やビフィズス菌は、プロバイオティクス製品として最も頻繁に使用されている細菌である。これらの細菌は一般的に安全で、これらの菌体に基づいたプロバイオティクス製品も同様である。どのような年代に対しても病原性はなく、免疫低下者に対しても病原性はない。種々のプロバイオティクス細菌の摂取は様々な生理的、病理的状況において、臨床的な有益性を示してきた。最も明解な影響は、抗生物質治療や、ロタウイルスの感染が原因で生じる下痢において示されてきた。また、プロバイオティクス細菌の摂取後、炎症性腸疾患やアトピー性皮膚炎、さらに、高コレステロール血症に対しても、良好な臨床的な効果が示されている。プロバイオティクス細菌がこれらの臨床的改良に、寄与する機序は明らかではない。動物におけるインビトロ・インビボの研究と同様に、ヒト由来のインビトロにおける研究から、種々の乳酸菌は先天性免疫、および後天性免疫に様々な方法で影響を及ぼしていることが示されている。臨床的な研究においては主に先天性細胞免疫系の刺激や、自然感染に対する体液性免疫応答の増進や、経口又は全身免疫の増進が示されている。先天性免疫系について、多形核細胞（PMN）の食作用活性の上昇や、NK細胞の腫瘍攻撃活性の上昇が報告されている。われわれの知見として、プロバイオティクス細菌摂取後における特異的細胞免疫系への影響を示す臨床研究はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明に従い、乳酸菌やグラム陰性細菌のP.ルンデンシス（P. lundensis）の毎日の摂取後の先天性免疫や後天性免疫系への影響を徹底的に検討した。興味深いことに、L.プランタラム（L. plantarum）を受けた被験者において、特異的な細胞免疫系の活性化が観察され、L.パラカゼイ（L. paracasei）を受けた被験者においても、同様のことが示された。さらに、種々の乳酸菌スピーシーズを受けた被験者では、NKT細胞集団の増加や食作用活性の増強のように、先天性免疫における免疫増強効果が観察された。グラム陰性細菌であるP.ルンデンシスでは効果はなく、ここに記載している実験のとおり、測定した他のどのような免疫パラメーターにも影響しなかった。
【０００４】
抗生物質耐性の発達や様々な感染治療における失敗により、代替的手段としてプロバイオティクスに関心が高まっている。カゼなどの問題に対して、プロバイオティック機能性食品に対する必要性が存在するであろう。毎年のカゼ感染の罹患率の高い数値の観点からもこのことは明らかである。ビタミンCを多く含む食物は伝統的にカゼの発症を抑えるために摂取されてきた。市場には免疫系に何らかの影響を与えると謳う多数の様々な製品がある。
【０００５】
本出願の目的とするところは、プロバイオティック機能性食品の規則的な投与後に、カゼの症状といった問題にどのように影響するかを明らかにし、ゆえに、一般的な地域社会においてこの問題の代替案なり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要約
本発明の目的は、ウイルス感染の治療及び／又は予防のための薬学的組成物の製造のための、乳酸菌から選択される、少なくとも1種類のプロバイオティクス細菌(Probiotic bacteria)株の使用である。
【０００７】
本発明のもう1つの目的は、ウイルス感染の治療及び／又は予防ほうほうであり、ここで、乳酸菌から選択される、少なくとも1種のプロバイオティクス細菌(Probiotic bacteria)株が個体に投与される。
【０００８】
本発明に従って使用される乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ラムノーザス（Lactobacillus rhamnsosus）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、からなる群より選択されたものであり得るがそれに限らない。
【０００９】
本発明に従って使用されるラクトバチルス・プランタラムは299、DSM 6595、ラクトバチルス・プランタラム299v、DSM 9843、ラクトバチルス・プランタラム HEAL 9、DSM 15312、ラクトバチルス・プランタラムHEAL 19、DSM 15313、及びラクトバチルス・プランタラムHEAL 99、DSM 15316からなる群より選択されたものであり得るがそれらに限らない。
【００１０】
本発明に従って使用されるラクトバチルス・パラカゼイは、ラクトバチルス・パラカゼイ8700:2、DSM 13434、ラクトバチルス・パラカゼイ02A、DSM13432からなる群より選択されたものであり得るがそれらに限らない。本発明に従って使用されるラクトバチルス・ガセリはラクトバチルス・ガセリVPG44、DSM 16737から選択されたものであり得るがそれらに限らない。
【００１１】
ここで明確に開示したプロバイオティクス細菌株よりも、他のプロバイオティクス細菌株は、当然に本発明に従い使用され得、それらは、期待される効果、すなわちウイルス感染の緩和もしくは、ウイルスの感染の予防効果を提供する限り、本発明の範囲内である。
【００１２】
本発明の実施形態では少なくとも二つのプロバイオティクス細菌株が薬学的組成物において使用される。前記の少なくとも二つの株は連続的に、もしくは同時に投与されることを意図している。すなわち、株は一つの組成物として、混合された形で投与されるか、もしくは、順番に分離した異なる組成物として投与され得る。
【００１３】
本発明に従い、ウイルス感染の治療が可能である。治療可能なウイルス感染とは、I型単純ヘルペスウイルス、II型単純ヘルペスウイルス、帯状疱疹ウイルス、感冒ウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、RS（respiratory syncytial）ウイルス、エンテロウイルス、及びコロナウイルスからなる群より選択されたものであるがそれに限らない。ここで特に述べていないプロバイオティクス細菌が影響を及ぼす他のどんなウイルスの感染も、本発明の範囲内である。風邪を引き起こす原因については多くの様々なウイルスやその形態が存在することが知られている。すべてのこのようなウイルスは本発明の範囲内である。
【００１４】
本文中に記載されている単語「治療及び／又は予防」とは、個体における予防的な処置、すなわち、すでに個体で進行してしまった疾病／感染を治療するのと同様に、疾病や感染を予防するために、疾病やウイルス感染が発症する前に、プロバイオティクス細菌を用いた処置が開始されることを含む。後者の場合、例えば徴候の緩和が期待されることか、もしくは患者の一般的症状がよい方向に向かうこと、もしくは患者が疾病/感染からより早く治癒するということである。つまり、個体が感染を患うリスクがあるかどうか、もしくは患者で、すでに感染が進行してしまったかというである。
【００１５】
本発明の実施形態において前記株は薬学的組成物中に約1×106から約1×1014 CFU、好ましくは、約1×108から約1×1012より好ましくは、1×109か1×1011の量が存在するが、それに限定されない。
【００１６】
本発明に従う薬学的組成物は例えば液体製剤であり、もしくは固体製剤である。
【００１７】
薬学的組成物が固体製剤であるとき、錠剤、吸引錠剤、スウィート(sweet)、チューイングタブレット(chewing tablet)、チューインガム、カプセル剤、サシェ、散剤、顆粒剤、被覆粒子、被覆錠剤、腸溶錠、腸溶カプセル剤、メルティングストリップ（melting strip）、もしくはフィルムとして処方される。
【００１８】
薬学的組成物が液体製剤であるとき経口液剤、懸濁剤、乳濁剤、もしくはシロップ剤として処方される。前記の組成物は、さらにオートミール粥、乳酸醗酵食品、難消化性澱粉、食物繊維、炭水化物、タンパク質及び糖化タンパク質からなる群より独立に選択される担体材料を含んでもよいが、それらに限定されない。
【００１９】
本発明の実施形態において、前記の薬学的組成物は、医療用食物、機能性食物、栄養補助食品、栄養製品、又は食品調製物である。
【００２０】
本発明に従い使用され、本発明に従い製造される、本発明に従う薬学的組成物は、不活性ビヒクル、もしくは薬学的に許容されるアジュバント、担体、保存料などのような、当業者によく知られた、その他の物質を含んでもよい。
【００２１】
用語「薬学的組成物」は必ずしもその通常の意味での薬学的組成物である必要はないが、ウイルス感染の治療や予防といった、必要とされる効果が満たされる限り、食品組成物、栄養補助食品、機能性食品、医療用食品、又は栄養食品として処方されてもよい。前記の食品組成物とは、飲料、ヨーグルト、ジュース、アイスクリーム、パン、ビスケット、シリアル、ヘルスバー、スプレッド、及び栄養製品からなる群から選んでもよい。食品組成物には、さらにオートミール粥、乳酸醗酵食品、難消化性澱粉、食物繊維、炭水化物、タンパク質及び糖化タンパク質からなる群より選ばれた、担体材料をさらに含んでもよい。
【００２２】
従って、本発明に従う組成物の使用は、予防的に使用可能であるという意味では、ウイルス感染が進行してしまう前に使用できるので、非常に有益である。使用された薬学的組成物は必ずしも本来の意味で薬学的組成物である必要はないが、健康補助食品や機能性食品であってもよいので、正常健常人にとって予防的に本発明の組成物を摂取することは非常に都合がよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
実施例
実施例1
被験者と治験基準
18歳から55歳の（平均26歳）57人の明確に健康なボランティアを盲検プラセボ対照研究のために選んだ。被験者は無作為的に8群に割り当て、グラム陽性菌、L.プランタラム（L. plantarum） 299v (n= 7)、L.プランタラム・Heal（L. plantarum Heal） 19 (n= 7)、L.ファーメンタム（L. fermentum） 35D (n= 7)、L.パラカゼイ（L. paracasei） 8700:2 (n= 7)、L.ガセリ（L. gasseri） VPG 44 (n= 7)、L.ラムノーザス（L. rhamnsosus） 271 (n= 7)、もしくはグラム陰性菌P.ルンデンシス（P. Lundensis） n= 7)、もしくはプラセボ (n= 10)を受けた。菌体の用量は乳酸菌においては1010細菌/日で、P.ルンデンシスにおいては109細菌/日であった。対象群にはスキムミルク粉末1ｇを与えた。群によっては、調査は6週間か、もしくは9週間行った。そのうち2週間は休薬期間であり、アクティブ研究期間は2週間か5週間で、残りは2週間のフォローアップ期間である（図4）。それぞれの被験者に対して、すべての試験期間中で消費するべきではないプロバイオティック製品を含む製品リストを渡した。末梢血サンプルは被験者の静脈より2、3回、0日目、14 日目、35 日目に採血した。被験者の副作用の訴え、健康状態、摂取した研究製品の確認を記録した日誌は治験中記録した。
【００２４】
フローサイトメトリー
全血中のリンパ球の表現形の解析はフローサイトメトリーにより行った。様々な細胞集団の表面マーカーとして、以下に示す抗ヒトモノクローナル抗体を用いた。CD3 FITC (SK7)、CD4 APC (SK3)、CD8 PerCP (SK1)、CD19 PerCP (SJ25C1)、CD56 PE (MY31)、CD16 PE (B73.1)、およびCD5 FITC (L17F12)。以下に示す抗ヒトモノクローナル抗体は様々な活性化および記憶マーカーを検出するために使用される：CD25 FITC (2A3)、HLA-DR PE (L243)、CD45RO PE(UCHL-1)、CD38 PE (HB7)、CD27 PE(L128)、およびCD11b PE (D12)。すべての抗体は、ベクトン、ディッキンソン社（エレンボーデン、ベルギー）より購入した。全血（100 μl）は抗体（10 μl）と暗所にて4℃、30 分インキュベートし、その後2 mlのFACS lysing solution（ベクトン、ディッキンソン社）を加え、暗所にて20℃、15 分インキュベートした。細胞は3 ｍｌのFACSFlowを加えて洗浄し、300 x gにて5 分間遠心し、200 μlのFACSFlowで再懸濁した。解析はFacsCalibur（ベクトン、ディッキンソン社）とCellQuestソフトウェアを用いて行った。
【００２５】
食作用測定法
単球や顆粒球の食作用活性はPHAGOTEST（登録商標）（オルペゲン・ファーマ社、ハイデルベルグ、ドイツ）を用いて、製造業者の仕様書に従い幾つかの改変を加えて測定した。簡単に説明すると、20×106個のFITC標識された大腸菌（E. ｃoli）、もしくは黄色ブドウ球菌（S. aureus）をあらかじめ冷やしておいた全血（100 μl）に加える。血球細胞と細菌を37℃、10 インキュベートし、FacsCaliburとCellQuestソフトウェアを行った。
【００２６】
計算
様々な免疫パラメーターに関する個人間の変化は、14日目と0日目、あるいは35日目と0日目に得られた個人の値の比を計算することで決定した。これらの比は、すべての群の計算と統計処理に使用した。
【００２７】
統計処理
すべての統計学的解析はStatviewを用いて行った。マンフォイットニーU検定は異なる群間を比較するために使用した。
【００２８】
結果
臨床学的観察
57人のボランティアのうち54人が完全に研究された。2 名が感染し、抗生物質治療のために除外した（1 名はプラセボ群で、もう1 名はP.ルンデンシス受種群）。また、1 名は16 日目に妊娠のため除外した（プラセボ群）。研究製品の摂取後に、緩やかな胃腸系の副作用のみが報告された（図1）
【００２９】
乳酸菌摂取がT細胞を活性化する
活性化マーカーのCD4+およびCD8+T細胞において、個々の変動もあり、ベースライン（0日目）が非常に高かった。様々な細胞表面マーカー発現している細胞の百分率のベースラインは図2に示した。この時点の種々の群間において、有意な差異は見られなかった。非常に大きな個体間差が観察されたので、それぞれ個人の0日目と比較した14日目と、35日目の比の値を比較するために選択した。すべての計算値とその比較は比の値（14日目/0日目と35日目/0日目）で行った。L.プランタラム 299vを含む研究製品を摂取した14日後、CD8+ T細胞上の活性化マーカーCD25の約2倍の発現上昇が観察された（p=0.01）(図5)。また、有意ではないものの（p=0.12）、L.プランタラム 299v摂取によって、CD8+ 細胞上のHLA-DRの強いアップレギュレーションも示された。さらに、L.プランタラム 299v摂取後にCD4+T細胞の活性化の傾向が観察された。グラム陰性細菌P.ルンデンシスと同様に本研究に含まれる他の乳酸菌種の摂取も行ったところ、CD4+ T細胞もCD8+T細胞も活性化しなかった。しかしながら、L.パラカゼイ摂取では確かに、CD4+ T細胞のHLA-DRの発現が上昇する傾向にあった（p=0.18）。
【００３０】
乳酸菌の摂取はCD4+ T細胞の記憶型表現形誘導させる
CD4+ およびCD8+ T細胞上のCD45ROの発現の蛍光強度の幾何平均（Geometric means of the fluorescence intensity（GMFI））を異なる研究製品を受けた群間で比較した。上記の通り、群の計算値は個人の比の値に基づいて（14日目/0日目と35日目/0日目）比較のために使用した。L.プランタラム299vを含む研究製品を摂取して35日後、CD4+T細胞におけるCD45ROのGMFI値は有意に上昇した（p=0.03）。また、L.プランタラムの摂取後のCD8+ T細胞上のCD45ROの増加する傾向も存在した（図6）。その上、L.パラカゼイの摂取がCD8+T細胞上のCD45ROのアップレギュレーションにポジティブな効果を持っているようである‘（p=0.10）(図６)
【００３１】
研究製品の摂取による様々な細胞の集団への効果
L.パラカゼイを摂取することで、NKT細胞と同定できるリンパ球の百分率が上昇した（p=0.06）（図7）。0日目と比較して、相対的に増大したか減少したかについてはCD4+T細胞、CD8+ T細胞、B細胞、B-1細胞（CD19+、CD5+）、NK細胞、顆粒球、単球などの、他の細胞に関しては確認できなかった。
【００３２】
食作用活性
顆粒球と単球はFSC-SSCダイヤグラムで同定できる。これらの細胞の、FITCラベルしたグラム陰性菌とグラム陽性菌の食作用活性についてテストした。図8に示したとおり、L.プランタラム299v （p=0.064）、L.プランタラムHeal19 （p=0.064）、L.ファーメンタム（p=0.064）、又はL.パラカゼイ（p=0.05）受けたボランティアから得た顆粒球は、プラセボ群のボランティアより得た顆粒球に比べて、より効果的にグラム陰性菌である大腸菌の食作用を示した。ところが、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌では食作用の群間での差異が見られなかった。単球における、食作用活性の差異も検出されなかった（データは示さない）。
【００３３】
考察
免疫系の一次タスクは迅速かつ猛烈に微生物と反応し、その結果感染を予防し、治癒する。微生物の殺傷には強力な機構を採用しており、我々自身の組織も損傷を受ける。ゆえに、我々自身の組織にも、その環境に存在する、無害な物質にも応答しないことが必要である。ゆえに、免疫系は、我々自身の体の成分と、食物や吸い込んできたタンパク質の両方に対する寛容を進展し、維持している。もし、これが機能しなくなると、幾多もの疾病を引き起こす。特定の免疫寛容を発生する手段は免疫系において不可欠な作業である。
【００３４】
すべての免疫反応において、ヘルパーT細胞が中心的な役割を担っている。ヘルパーT細胞が特定の抗原により活性化され、分裂し、成熟すると、様々なサイトカインを産生し、それらは免疫系における、細胞障害性T細胞やB細胞などの、他のタイプの細胞に働きかける。ヘルパーT細胞の活性化は抗体産生を含むほとんどのタイプの免疫反応を作り上げるために必要である。逆に、ヘルパーT細胞の活性化が阻害されると、ほとんどのタイプの免疫反応は麻痺してしまう。
【００３５】
ヘルパーT細胞の活性化と寛容の維持を堅固にするには様々な機構が存在する。一つの機構は、胸腺T細胞内で自分自身の組織を認識し、反応する能力をもって排除することである。しかしながら、その排除は完全ではないので、さらに外来性抗原に対する特異的な免疫寛容を発達させる必要がある。そうでないと、吸入し摂取するすべてのタイプの物質に対して猛烈に反応することになり、広範囲の炎症を引き起こし免疫資源を無駄にする。
【００３６】
寛容の維持に中心的な細胞のタイプは制御性T細胞である。この細胞タイプは表面にCD4やCD25を発現し、細胞内においてはCTLA-4を保持し、核内タンパク質であるFoxp3を転写するといった特定のマーカーによって認識され得る。制御型T細胞は無害な物質に遭遇した際に、他のT細胞が活性化するのを抑える能力を有し、従って、要求されていないすべてのタイプの免疫反応を回避する。
【００３７】
CD4+やCD25+のような特定のマーカーに関連している本文中の記号「＋」は、そのマーカーがT細胞に発現していることを意味する。例えば、CD4+CD25+T細胞はその表面上にCD4マーカーとCD25マーカーの両方が発現しているT細胞である。しかしながら、発現されるマーカーの量については何も述べず、それが存在することのみである。CD4++またはCD25++のようなマーカーに関連している本文中の記号「＋＋」は、そのマーカーがT細胞表層上で多量に発現していることを意味する。制御型T細胞はCD25をその表面上で多量に発現している細胞、すなわちCD4+CD25++T細胞である。それに対して、CD4+CD25+T細胞は単に活性化したT細胞である。時には、CD4CD25のように、「＋」や「＋＋」といった特異的な記号は使用されず、これはCD4+CD25+細胞と同様に活性化された細胞を意味する。すなわち、CD4CD25はCD4+CD25+と同じである。制御型T細胞に関して議論する際には常にCD4+CD25++細胞と表記される。
【００３８】
この、盲検プラセボ対照研究は独自のもので、初めて異なるグラム陽性菌である乳酸菌、またはグラム陰性菌P.ルンデンシス摂取後の様々な免疫パラメーターに対する影響を比較した最初の研究である。面白いことに、P.ルンデンシス摂取後は確かに測定したどんな免疫パラメーターも影響を及ぼさなかった。これに対して、乳酸菌摂取は特異的免疫系、先天性免疫系の両者の異なる要素に影響を与えた。この研究における新規な知見は、L.プランタラムの摂取がT細胞集団において、記憶細胞の活性化と誘導にポジティブな影響を及ぼすと断言できる。細胞傷害性T 細胞のHLA-DRのアップレギュレーションに対する強い傾向とIL-2受容体α鎖（CD25）の有意なアップレギュレーションが見られた。これらの活性化マーカーに対するアップレギュレーションに対する傾向はL. プランタラム摂取後における、ヘルパーT細胞においても観察された。活性化マーカーの発現はT細胞が抗原特異的、または非特異的な刺激に応答して増殖開始すること、および静止期T細胞(resting T cell)と比較してより早くそのエフェクター機能を働かせることを示している。L.プランタラムによって誘導されるT細胞の活性化の背景にある機構は、微生物化合物が、Toll様受容体に結合することで活性化し、抗原提示をしている細胞を介していると考えられる。抗原提示細胞の活性化は、T細胞に対する抗原提示をより効果的にする。さらに、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T 細胞の両者ともに様々なToll様受容体を発現しており、微生物成分および生産物による、非特異的な活性化に対してこれらの細胞がおそらく感知させると考えられる。
【００３９】
ヘルパーT細胞コンパートメントの類似点から、CD45ROの発現は細胞障害性T細胞において記憶集団をマークするようである。L.プランタラム摂取後35日目において、ヘルパーT細胞の、この記憶型細胞マーカーの有意な発現上昇と、細胞障害性T細胞がアップレギュレーションする傾向が見出された。さらにまた、L.パラカゼイも細胞障害性T細胞上のCD45ROのアップレギュレーションの傾向を示した。ナイーブT細胞と比較して、CD45RO＋T細胞は幅広い範囲でサイトカインの分泌を行っている。その上、CD3-TCR複合体が次善最適条件下において刺激を受けたとき、CD45RO＋T細胞は増殖しIL-2を産生することができる。これに対して、ナイーブT細胞はこれらの機能を実行するには、強いCD3-TCR刺激が必要である。感染およびワクチン接種後の効果的な免疫応答の誘導には、記憶型T細胞の形成が重要となる。
【００４０】
先天性の細胞性免疫系は、プロバイオティクス細菌の摂取によっても引き起こされる。L.パラカゼイ摂取に引き続いて、ナチュラルキラーT（NKT）細胞集団が増大することが実証された。NKT細胞はNK細胞マーカーのCD56やT細胞マーカーのCD3-T細胞受容体複合体を共発現しているリンパ球亜集団を構成する。ヒトおよびマウスにおける研究では、多発性硬化症やI型糖尿病、全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患の制御において、NKT細胞が中心的な役割を担っていることが実証されている。NKT細胞はさらに、腫瘍やウイルス感染に対するエフェクター機能を働かせる。すなわち、NKT細胞は自身の機能について多面的である。プロバイオティクス細菌の免疫に対する効果を評価したその他臨床的な研究では、L.ラムノーザスHN101および、ビフィドバクテリウム・ラクチス（Bifidobacterium lactis） HN019の摂取がNK細胞の（NKT細胞を含む）のK562細胞へ対する腫瘍殺傷活性を高めることを示した。この研究においては、ほかにも多核球細胞の食作用活性が、様々な乳酸菌の摂取後に増加するという他人による観察も確認されている。本研究において観察された種々の免疫パラメーターへの影響の結果として、ウイルス上昇するといった感染および／または腫瘍に対して、免疫防御が強化されるという点において細胞障害性T細胞の活性化とNKT細胞の増大が同時に起こると推測される。インビトロの知見として、乳酸菌は単球細胞のIL-12、およびIL-18の分泌を誘導することを見出し、これらの細菌の摂取が、細胞を介した活性を刺激しているという理論を支持している
本発明に従い、L.プランタラムおよびL.パラカゼイの摂取が特異的、および先天的細胞免疫系に深い影響を有していると結論付けられた。
【００４１】
実施例2
この実施例での目標は、幾つかの（異なる種の）乳酸菌を順序正しく次々に投与したときと比較して、同じ種の乳酸菌をより長期間与えることによる免疫系に対する効果を検討することである。
【００４２】
ボランティアは14日間、もしくは35日間凍結乾燥された粉末状の菌体を与えられた。グラム陽性細菌として、ラクトバチルス・プランタラム299vのプロバイオティクス細菌を単独、もしくはL.ラムノーザス、L.ファーメンタム、L.パラカゼイ、L.ガセリとの組み合わせで使用した。また、グラム陰性細菌としてシュードモナス・ルンデンシスを使用した。
以下に示す群で研究を行った。
１）ラクトバチルス・プランタラム35日間
２）L.プランタラム7日間、L.ラムノーザス7日間、L.ファーメンタム 7日間、L.パラカゼイ7日間、L.ガセリ7日間、合計35日間（連続）
３）L.プランタラム、L.ラムノーザス、L.ファーメンタム、L.パラカゼイ、L.ガセリの混合物。合計14日間
４）L.ラムノーザス14日間
５）L.ファーメンタム14日間
６）L.パラカゼイ14日間
７）L.ガセリ14日間
８）シュードモナス・ルンデンシス14日間
コントロール群2）プラセボ35日間
コントロール群1）プラセボ14日間
血液サンプルは0日目、14日目、35日目に採血した。CD25が大量に発現されているヘルパーT細胞（CD4+）の量は、上記実験例1にて説明したフローサイトメトリーを用いて、各群で決定した。
【００４３】
結果
14日目に、5種類の異なる乳酸菌株を順番に摂取した個人において、CD4+CD25++T細胞の増大は境界の有意性であった。
【００４４】
考察
CD25分子を高密度で発現している（CD4+CD25++）ヘルパーT細胞（CD4+）は自己免疫疾患、アレルギー、炎症性腸疾患から保護するのに重要であることが示されてきた。この知見からは、連続的に異なる乳酸菌を摂取した後に、これらの細胞の数が増えるということが、上記疾病の進行に関するリスクを懸念する個人にとって、これらの菌体の摂取が有益であることを示唆している。
【００４５】
実験例3
この研究の目的は、少なくとも三ヶ月の間、乳酸菌を凍結乾燥品／機能性食品における摂取がカゼの症状の重篤度、発症率、期間にどのように影響するか詳細に研究することである。
【００４６】
インビトロの研究、もしくは動物実験は、ヒトに投与したときの有効性の程度を反映しないことから、ヒトにおけるインビボで行うことは重要である。これらの菌体は、培養後直接投与した際に、小腸内にて定着する能力があることが先行研究において実証されている。
すなわち目的は、ラクトバチルス・プランタラム299v（DSM 9843）とラクトバチルス・パラカゼイ8700:2（DSM 13434）の混合物（1×109 cfu/日）の消費で、カゼのリスクを減少することができるかどうか検討することである。
この研究に参加した個人は500人で、90日間行った。250人は活性化製品を摂取し、250人はプラセボ群とした。
研究は無作為抽出し、二重盲検プラセボ対照実験法の二つの治療群で行った。
除外基準は以下の通り：製剤の中に含まれる含有物に対してアレルギーか既知の不耐性を有する者；医学に処置されたアレルギー；現在、深刻な胃腸障害で治療中である者；妊娠もしくは授乳をしている者；12ヶ月以内にインフルエンザウイルスに対するワクチンを接種した者；喫煙者。
【００４７】
与えられたプロバイオティクスは凍結乾燥したラクトバチルス・プランタラム299vおよびラクトバチルス・パラカゼイ8700:2である。スクロース、マルトデキストリンさらに加水分解されたゼラチンを凍結保護物質として加えた。投与量は毎日1ｇ（約1×109 cfu/日）の凍結乾燥した乳酸菌の摂取で、朝食とともに摂食した。
製品は、プロビ エービー（ルンド、スウェーデン）によって製造され、袋詰めされ、ラベルが貼られている。製品の品質もプロビ エービーによって確認されている。それぞれのサシェには、研究で使用した名前、賞味期限、保存の方法、製造業社名、調査責任者の名前と電話番号が記されている。溶解及び摂取に対する詳細な指示が二次パッケージに挿入される。製品はサシェで提供される。
開始14日前から開始後104日目まで、被験者はプロバイオティクス細菌を含む製品を摂ってはならない。被験者が試験期間中、摂ってはいけないプロバイオティクス製品のリストを配布する。
糞試料は一日目（研究製品を摂取する前）、15日目（摂取後）、104日目（摂取後）に提出された。サンプルは2本のチューブで回収し、18時間以内に解析を行い、この期間の間、凍結保存した。サンプルは乳酸菌について分析される。
血液サンプルは1日目と15日目に回収し、サンプルはCD4＋とCD8＋について解析を行った。
【００４８】
実験例1と2の結果からすると、プラセボ群と比較してプロバイオティクス混合物を摂取した方がカゼに対する防御の増大が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図1は治験中において、胃腸系に何らかのマイナーな副作用の報告がなされたボランティアの数を示す。
【図２】図2は血液1 ml当りの様々なリンパ球のベースライン数（0日目）（平均値±(SEM)）を示す。
【図３】図3は様々な細胞の活性化と記憶マーカーに対して陽性であるリンパ球のベースライン（0日目）の百分率とGMFI（平均値±(ＳＥＭ）)を示す。
【図４】被験者を無作為に9つの異なる実験群に割り当てた。治験は二週間の休薬期間を設けて、その後続いて、アクティブ研究期間を実施した。この期間では、被験者たちは1日当たり1つの用量の研究製品を14日間（L.プランタラム Heal19、L.ファーメンタム、L.パラカゼイ、L.ガセリ、L.ラムノーザス、P.ルンデンシス群）もしくは35日間（L.プランタラム299v及びプラセボ群）消費した。それぞれの用量は、1010（乳酸菌群）コロニー形成単位（CFU）または109CFU細菌（P.ルンデンシス群）である。
【図５】活性化表現形であるCD8CD25、CD8HLA-DR、CD4CD25やCD4HLA-DRを発現しているリンパ球の百分率をフローサイトメトリーで解析したものである。群平均値(±SEM)は個人内での数値の割合に基づいており、14日目／0日目、35日目／0日目（L.プランタラムとプラセボ群のみを）で示す。
【図６】記憶型表現形であるCD8CD45ROおよびCD4CD45ROを発現しているリンパ球の百分率をフローサイトメトリーにて解析した。群平均値(±ＳＥＭ)は個体の割合に基づいており、14日目／0日目、35日目／0日目（L.プランタラムとプラセボ群のみ）で示す。
【図７】NKT細胞マーカー（CD56CD16CD3）に対して陽性のリンパ球の百分率をフローサイトメトリーにて解析した。群の計算は個体の割合に基づく（14日目／0日目）。
【図８】好中球の食作用活性は、FITC標識した大腸菌または、黄色ブドウ球菌と全血球細胞をインキュベートすることで解析した。14日目と0日目に得た平均蛍光値の割合を個々に決定し、群計算値を図に示した。
【図９】図9は実験2からの活性化表現形であるCD4CD25が発現しているリンパ球の割合を示す。
【図１０】図10は実験2からの活性化表現形であるCD4+CD25++が発現しているリンパ球の割合を示す。
【図１１】図11は実験2からの活性化表現形であるCD8+HLA-DR+が発現しているリンパ球の割合を示す。
【図１２】図12は実験2からの活性化表現形であるCD8+CD25+が発現しているリンパ球の割合を示す。
【図１３】図13は実験2からの活性化表現形であるCD4CD45ROが発現しているリンパ球の割合を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス感染の治療及び／又は予防のための薬学的組成物の製造のための、乳酸菌から選択される少なくとも一種のプロバイオティクス細菌(Probiotic bacteria)株の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクス細菌は生きている微生物と定義され、適量の投与で宿主に有益な働きを及ぼす。乳酸菌やビフィズス菌は、プロバイオティクス製品として最も頻繁に使用されている細菌である。これらの細菌は一般的に安全で、これらの菌体に基づいたプロバイオティクス製品も同様である。どのような年代に対しても病原性はなく、免疫低下者に対しても病原性はない。種々のプロバイオティクス細菌の摂取は様々な生理的、病理的状況において、臨床的な有益性を示してきた。最も明解な影響は、抗生物質治療や、ロタウイルスの感染が原因で生じる下痢において示されてきた。また、プロバイオティクス細菌の摂取後、炎症性腸疾患やアトピー性皮膚炎、さらに、高コレステロール血症に対しても、良好な臨床的な効果が示されている。プロバイオティクス細菌がこれらの臨床的改良に、寄与する機序は明らかではない。動物におけるインビトロ・インビボの研究と同様に、ヒト由来のインビトロにおける研究から、種々の乳酸菌は先天性免疫、および後天性免疫に様々な方法で影響を及ぼしていることが示されている。臨床的な研究においては主に先天性細胞免疫系の刺激や、自然感染に対する体液性免疫応答の増進や、経口又は全身免疫の増進が示されている。先天性免疫系について、多形核細胞（PMN）の食作用活性の上昇や、NK細胞の腫瘍攻撃活性の上昇が報告されている。われわれの知見として、プロバイオティクス細菌摂取後における特異的細胞免疫系への影響を示す臨床研究はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明に従い、乳酸菌やグラム陰性細菌のP.ルンデンシス（P. lundensis）の毎日の摂取後の先天性免疫や後天性免疫系への影響を徹底的に検討した。興味深いことに、L.プランタラム（L. plantarum）を受けた被験者において、特異的な細胞免疫系の活性化が観察され、L.パラカゼイ（L. paracasei）を受けた被験者においても、同様のことが示された。さらに、種々の乳酸菌スピーシーズを受けた被験者では、NKT細胞集団の増加や食作用活性の増強のように、先天性免疫における免疫増強効果が観察された。グラム陰性細菌であるP.ルンデンシスでは効果はなく、ここに記載している実験のとおり、測定した他のどのような免疫パラメーターにも影響しなかった。
【０００４】
抗生物質耐性の発達や様々な感染治療における失敗により、代替的手段としてプロバイオティクスに関心が高まっている。カゼなどの問題に対して、プロバイオティック機能性食品に対する必要性が存在するであろう。毎年のカゼ感染の罹患率の高い数値の観点からもこのことは明らかである。ビタミンCを多く含む食物は伝統的にカゼの発症を抑えるために摂取されてきた。市場には免疫系に何らかの影響を与えると謳う多数の様々な製品がある。
【０００５】
本出願の目的とするところは、プロバイオティック機能性食品の規則的な投与後に、カゼの症状といった問題にどのように影響するかを明らかにし、ゆえに、一般的な地域社会においてこの問題の代替案なり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要約
本発明の目的は、ウイルス感染の治療及び／又は予防のための薬学的組成物の製造のための、乳酸菌から選択される、少なくとも1種類のプロバイオティクス細菌(Probiotic bacteria)株の使用である。
【０００７】
本発明のもう1つの目的は、ウイルス感染の治療及び／又は予防ほうほうであり、ここで、乳酸菌から選択される、少なくとも1種のプロバイオティクス細菌(Probiotic bacteria)株が個体に投与される。
【０００８】
本発明に従って使用される乳酸菌は、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ラムノーザス（Lactobacillus rhamnsosus）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、からなる群より選択されたものであり得るがそれに限らない。
【０００９】
本発明に従って使用されるラクトバチルス・プランタラムは299、DSM 6595、ラクトバチルス・プランタラム299v、DSM 9843、ラクトバチルス・プランタラム HEAL 9、DSM 15312、ラクトバチルス・プランタラムHEAL 19、DSM 15313、及びラクトバチルス・プランタラムHEAL 99、DSM 15316からなる群より選択されたものであり得るがそれらに限らない。
【００１０】
本発明に従って使用されるラクトバチルス・パラカゼイは、ラクトバチルス・パラカゼイ8700:2、DSM 13434、ラクトバチルス・パラカゼイ02A、DSM13432からなる群より選択されたものであり得るがそれらに限らない。本発明に従って使用されるラクトバチルス・ガセリはラクトバチルス・ガセリVPG44、DSM 16737から選択されたものであり得るがそれらに限らない。
【００１１】
ここで明確に開示したプロバイオティクス細菌株よりも、他のプロバイオティクス細菌株は、当然に本発明に従い使用され得、それらは、期待される効果、すなわちウイルス感染の緩和もしくは、ウイルスの感染の予防効果を提供する限り、本発明の範囲内である。
【００１２】
本発明の実施形態では少なくとも二つのプロバイオティクス細菌株が薬学的組成物において使用される。前記の少なくとも二つの株は連続的に、もしくは同時に投与されることを意図している。すなわち、株は一つの組成物として、混合された形で投与されるか、もしくは、順番に分離した異なる組成物として投与され得る。
【００１３】
本発明に従い、ウイルス感染の治療が可能である。治療可能なウイルス感染とは、I型単純ヘルペスウイルス、II型単純ヘルペスウイルス、帯状疱疹ウイルス、感冒ウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、RS（respiratory syncytial）ウイルス、エンテロウイルス、及びコロナウイルスからなる群より選択されたものであるがそれに限らない。ここで特に述べていないプロバイオティクス細菌が影響を及ぼす他のどんなウイルスの感染も、本発明の範囲内である。風邪を引き起こす原因については多くの様々なウイルスやその形態が存在することが知られている。すべてのこのようなウイルスは本発明の範囲内である。
【００１４】
本文中に記載されている単語「治療及び／又は予防」とは、個体における予防的な処置、すなわち、すでに個体で進行してしまった疾病／感染を治療するのと同様に、疾病や感染を予防するために、疾病やウイルス感染が発症する前に、プロバイオティクス細菌を用いた処置が開始されることを含む。後者の場合、例えば徴候の緩和が期待されることか、もしくは患者の一般的症状がよい方向に向かうこと、もしくは患者が疾病/感染からより早く治癒するということである。つまり、個体が感染を患うリスクがあるかどうか、もしくは患者で、すでに感染が進行してしまったかというである。
【００１５】
本発明の実施形態において前記株は薬学的組成物中に約1×106から約1×1014 CFU、好ましくは、約1×108から約1×1012より好ましくは、1×109か1×1011の量が存在するが、それに限定されない。
【００１６】
本発明に従う薬学的組成物は例えば液体製剤であり、もしくは固体製剤である。
【００１７】
薬学的組成物が固体製剤であるとき、錠剤、吸引錠剤、スウィート(sweet)、チューイングタブレット(chewing tablet)、チューインガム、カプセル剤、サシェ、散剤、顆粒剤、被覆粒子、被覆錠剤、腸溶錠、腸溶カプセル剤、メルティングストリップ（melting strip）、もしくはフィルムとして処方される。
【００１８】
薬学的組成物が液体製剤であるとき経口液剤、懸濁剤、乳濁剤、もしくはシロップ剤として処方される。前記の組成物は、さらにオートミール粥、乳酸醗酵食品、難消化性澱粉、食物繊維、炭水化物、タンパク質及び糖化タンパク質からなる群より独立に選択される担体材料を含んでもよいが、それらに限定されない。
【００１９】
本発明の実施形態において、前記の薬学的組成物は、医療用食物、機能性食物、栄養補助食品、栄養製品、又は食品調製物である。
【００２０】
本発明に従い使用され、本発明に従い製造される、本発明に従う薬学的組成物は、不活性ビヒクル、もしくは薬学的に許容されるアジュバント、担体、保存料などのような、当業者によく知られた、その他の物質を含んでもよい。
【００２１】
用語「薬学的組成物」は必ずしもその通常の意味での薬学的組成物である必要はないが、ウイルス感染の治療や予防といった、必要とされる効果が満たされる限り、食品組成物、栄養補助食品、機能性食品、医療用食品、又は栄養食品として処方されてもよい。前記の食品組成物とは、飲料、ヨーグルト、ジュース、アイスクリーム、パン、ビスケット、シリアル、ヘルスバー、スプレッド、及び栄養製品からなる群から選んでもよい。食品組成物には、さらにオートミール粥、乳酸醗酵食品、難消化性澱粉、食物繊維、炭水化物、タンパク質及び糖化タンパク質からなる群より選ばれた、担体材料をさらに含んでもよい。
【００２２】
従って、本発明に従う組成物の使用は、予防的に使用可能であるという意味では、ウイルス感染が進行してしまう前に使用できるので、非常に有益である。使用された薬学的組成物は必ずしも本来の意味で薬学的組成物である必要はないが、健康補助食品や機能性食品であってもよいので、正常健常人にとって予防的に本発明の組成物を摂取することは非常に都合がよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
実施例
実施例1
被験者と治験基準
18歳から55歳の（平均26歳）57人の明確に健康なボランティアを盲検プラセボ対照研究のために選んだ。被験者は無作為的に8群に割り当て、グラム陽性菌、L.プランタラム（L. plantarum） 299v (n= 7)、L.プランタラム・Heal（L. plantarum Heal） 19 (n= 7)、L.ファーメンタム（L. fermentum） 35D (n= 7)、L.パラカゼイ（L. paracasei） 8700:2 (n= 7)、L.ガセリ（L. gasseri） VPG 44 (n= 7)、L.ラムノーザス（L. rhamnsosus） 271 (n= 7)、もしくはグラム陰性菌P.ルンデンシス（P. Lundensis） n= 7)、もしくはプラセボ (n= 10)を受けた。菌体の用量は乳酸菌においては1010細菌/日で、P.ルンデンシスにおいては109細菌/日であった。対象群にはスキムミルク粉末1ｇを与えた。群によっては、調査は6週間か、もしくは9週間行った。そのうち2週間は休薬期間であり、アクティブ研究期間は2週間か5週間で、残りは2週間のフォローアップ期間である（図4）。それぞれの被験者に対して、すべての試験期間中で消費するべきではないプロバイオティック製品を含む製品リストを渡した。末梢血サンプルは被験者の静脈より2、3回、0日目、14 日目、35 日目に採血した。被験者の副作用の訴え、健康状態、摂取した研究製品の確認を記録した日誌は治験中記録した。
【００２４】
フローサイトメトリー
全血中のリンパ球の表現形の解析はフローサイトメトリーにより行った。様々な細胞集団の表面マーカーとして、以下に示す抗ヒトモノクローナル抗体を用いた。CD3 FITC (SK7)、CD4 APC (SK3)、CD8 PerCP (SK1)、CD19 PerCP (SJ25C1)、CD56 PE (MY31)、CD16 PE (B73.1)、およびCD5 FITC (L17F12)。以下に示す抗ヒトモノクローナル抗体は様々な活性化および記憶マーカーを検出するために使用される：CD25 FITC (2A3)、HLA-DR PE (L243)、CD45RO PE(UCHL-1)、CD38 PE (HB7)、CD27 PE(L128)、およびCD11b PE (D12)。すべての抗体は、ベクトン、ディッキンソン社（エレンボーデン、ベルギー）より購入した。全血（100 μl）は抗体（10 μl）と暗所にて4℃、30 分インキュベートし、その後2 mlのFACS lysing solution（ベクトン、ディッキンソン社）を加え、暗所にて20℃、15 分インキュベートした。細胞は3 ｍｌのFACSFlowを加えて洗浄し、300 x gにて5 分間遠心し、200 μlのFACSFlowで再懸濁した。解析はFacsCalibur（ベクトン、ディッキンソン社）とCellQuestソフトウェアを用いて行った。
【００２５】
食作用測定法
単球や顆粒球の食作用活性はPHAGOTEST（登録商標）（オルペゲン・ファーマ社、ハイデルベルグ、ドイツ）を用いて、製造業者の仕様書に従い幾つかの改変を加えて測定した。簡単に説明すると、20×106個のFITC標識された大腸菌（E. ｃoli）、もしくは黄色ブドウ球菌（S. aureus）をあらかじめ冷やしておいた全血（100 μl）に加える。血球細胞と細菌を37℃、10 インキュベートし、FacsCaliburとCellQuestソフトウェアを行った。
【００２６】
計算
様々な免疫パラメーターに関する個人間の変化は、14日目と0日目、あるいは35日目と0日目に得られた個人の値の比を計算することで決定した。これらの比は、すべての群の計算と統計処理に使用した。
【００２７】
統計処理
すべての統計学的解析はStatviewを用いて行った。マンフォイットニーU検定は異なる群間を比較するために使用した。
【００２８】
結果
臨床学的観察
57人のボランティアのうち54人が完全に研究された。2 名が感染し、抗生物質治療のために除外した（1 名はプラセボ群で、もう1 名はP.ルンデンシス受種群）。また、1 名は16 日目に妊娠のため除外した（プラセボ群）。研究製品の摂取後に、緩やかな胃腸系の副作用のみが報告された（図1）
【００２９】
乳酸菌摂取がT細胞を活性化する
活性化マーカーのCD4+およびCD8+T細胞において、個々の変動もあり、ベースライン（0日目）が非常に高かった。様々な細胞表面マーカー発現している細胞の百分率のベースラインは図2に示した。この時点の種々の群間において、有意な差異は見られなかった。非常に大きな個体間差が観察されたので、それぞれ個人の0日目と比較した14日目と、35日目の比の値を比較するために選択した。すべての計算値とその比較は比の値（14日目/0日目と35日目/0日目）で行った。L.プランタラム 299vを含む研究製品を摂取した14日後、CD8+ T細胞上の活性化マーカーCD25の約2倍の発現上昇が観察された（p=0.01）(図5)。また、有意ではないものの（p=0.12）、L.プランタラム 299v摂取によって、CD8+ 細胞上のHLA-DRの強いアップレギュレーションも示された。さらに、L.プランタラム 299v摂取後にCD4+T細胞の活性化の傾向が観察された。グラム陰性細菌P.ルンデンシスと同様に本研究に含まれる他の乳酸菌種の摂取も行ったところ、CD4+ T細胞もCD8+T細胞も活性化しなかった。しかしながら、L.パラカゼイ摂取では確かに、CD4+ T細胞のHLA-DRの発現が上昇する傾向にあった（p=0.18）。
【００３０】
乳酸菌の摂取はCD4+ T細胞の記憶型表現形誘導させる
CD4+ およびCD8+ T細胞上のCD45ROの発現の蛍光強度の幾何平均（Geometric means of the fluorescence intensity（GMFI））を異なる研究製品を受けた群間で比較した。上記の通り、群の計算値は個人の比の値に基づいて（14日目/0日目と35日目/0日目）比較のために使用した。L.プランタラム299vを含む研究製品を摂取して35日後、CD4+T細胞におけるCD45ROのGMFI値は有意に上昇した（p=0.03）。また、L.プランタラムの摂取後のCD8+ T細胞上のCD45ROの増加する傾向も存在した（図6）。その上、L.パラカゼイの摂取がCD8+T細胞上のCD45ROのアップレギュレーションにポジティブな効果を持っているようである‘（p=0.10）(図６)
【００３１】
研究製品の摂取による様々な細胞の集団への効果
L.パラカゼイを摂取することで、NKT細胞と同定できるリンパ球の百分率が上昇した（p=0.06）（図7）。0日目と比較して、相対的に増大したか減少したかについてはCD4+T細胞、CD8+ T細胞、B細胞、B-1細胞（CD19+、CD5+）、NK細胞、顆粒球、単球などの、他の細胞に関しては確認できなかった。
【００３２】
食作用活性
顆粒球と単球はFSC-SSCダイヤグラムで同定できる。これらの細胞の、FITCラベルしたグラム陰性菌とグラム陽性菌の食作用活性についてテストした。図8に示したとおり、L.プランタラム299v （p=0.064）、L.プランタラムHeal19 （p=0.064）、L.ファーメンタム（p=0.064）、又はL.パラカゼイ（p=0.05）受けたボランティアから得た顆粒球は、プラセボ群のボランティアより得た顆粒球に比べて、より効果的にグラム陰性菌である大腸菌の食作用を示した。ところが、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌では食作用の群間での差異が見られなかった。単球における、食作用活性の差異も検出されなかった（データは示さない）。
【００３３】
考察
免疫系の一次タスクは迅速かつ猛烈に微生物と反応し、その結果感染を予防し、治癒する。微生物の殺傷には強力な機構を採用しており、我々自身の組織も損傷を受ける。ゆえに、我々自身の組織にも、その環境に存在する、無害な物質にも応答しないことが必要である。ゆえに、免疫系は、我々自身の体の成分と、食物や吸い込んできたタンパク質の両方に対する寛容を進展し、維持している。もし、これが機能しなくなると、幾多もの疾病を引き起こす。特定の免疫寛容を発生する手段は免疫系において不可欠な作業である。
【００３４】
すべての免疫反応において、ヘルパーT細胞が中心的な役割を担っている。ヘルパーT細胞が特定の抗原により活性化され、分裂し、成熟すると、様々なサイトカインを産生し、それらは免疫系における、細胞障害性T細胞やB細胞などの、他のタイプの細胞に働きかける。ヘルパーT細胞の活性化は抗体産生を含むほとんどのタイプの免疫反応を作り上げるために必要である。逆に、ヘルパーT細胞の活性化が阻害されると、ほとんどのタイプの免疫反応は麻痺してしまう。
【００３５】
ヘルパーT細胞の活性化と寛容の維持を堅固にするには様々な機構が存在する。一つの機構は、胸腺T細胞内で自分自身の組織を認識し、反応する能力をもって排除することである。しかしながら、その排除は完全ではないので、さらに外来性抗原に対する特異的な免疫寛容を発達させる必要がある。そうでないと、吸入し摂取するすべてのタイプの物質に対して猛烈に反応することになり、広範囲の炎症を引き起こし免疫資源を無駄にする。
【００３６】
寛容の維持に中心的な細胞のタイプは制御性T細胞である。この細胞タイプは表面にCD4やCD25を発現し、細胞内においてはCTLA-4を保持し、核内タンパク質であるFoxp3を転写するといった特定のマーカーによって認識され得る。制御型T細胞は無害な物質に遭遇した際に、他のT細胞が活性化するのを抑える能力を有し、従って、要求されていないすべてのタイプの免疫反応を回避する。
【００３７】
CD4+やCD25+のような特定のマーカーに関連している本文中の記号「＋」は、そのマーカーがT細胞に発現していることを意味する。例えば、CD4+CD25+T細胞はその表面上にCD4マーカーとCD25マーカーの両方が発現しているT細胞である。しかしながら、発現されるマーカーの量については何も述べず、それが存在することのみである。CD4++またはCD25++のようなマーカーに関連している本文中の記号「＋＋」は、そのマーカーがT細胞表層上で多量に発現していることを意味する。制御型T細胞はCD25をその表面上で多量に発現している細胞、すなわちCD4+CD25++T細胞である。それに対して、CD4+CD25+T細胞は単に活性化したT細胞である。時には、CD4CD25のように、「＋」や「＋＋」といった特異的な記号は使用されず、これはCD4+CD25+細胞と同様に活性化された細胞を意味する。すなわち、CD4CD25はCD4+CD25+と同じである。制御型T細胞に関して議論する際には常にCD4+CD25++細胞と表記される。
【００３８】
この、盲検プラセボ対照研究は独自のもので、初めて異なるグラム陽性菌である乳酸菌、またはグラム陰性菌P.ルンデンシス摂取後の様々な免疫パラメーターに対する影響を比較した最初の研究である。面白いことに、P.ルンデンシス摂取後は確かに測定したどんな免疫パラメーターも影響を及ぼさなかった。これに対して、乳酸菌摂取は特異的免疫系、先天性免疫系の両者の異なる要素に影響を与えた。この研究における新規な知見は、L.プランタラムの摂取がT細胞集団において、記憶細胞の活性化と誘導にポジティブな影響を及ぼすと断言できる。細胞傷害性T 細胞のHLA-DRのアップレギュレーションに対する強い傾向とIL-2受容体α鎖（CD25）の有意なアップレギュレーションが見られた。これらの活性化マーカーに対するアップレギュレーションに対する傾向はL. プランタラム摂取後における、ヘルパーT細胞においても観察された。活性化マーカーの発現はT細胞が抗原特異的、または非特異的な刺激に応答して増殖開始すること、および静止期T細胞(resting T cell)と比較してより早くそのエフェクター機能を働かせることを示している。L.プランタラムによって誘導されるT細胞の活性化の背景にある機構は、微生物化合物が、Toll様受容体に結合することで活性化し、抗原提示をしている細胞を介していると考えられる。抗原提示細胞の活性化は、T細胞に対する抗原提示をより効果的にする。さらに、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T 細胞の両者ともに様々なToll様受容体を発現しており、微生物成分および生産物による、非特異的な活性化に対してこれらの細胞がおそらく感知させると考えられる。
【００３９】
ヘルパーT細胞コンパートメントの類似点から、CD45ROの発現は細胞障害性T細胞において記憶集団をマークするようである。L.プランタラム摂取後35日目において、ヘルパーT細胞の、この記憶型細胞マーカーの有意な発現上昇と、細胞障害性T細胞がアップレギュレーションする傾向が見出された。さらにまた、L.パラカゼイも細胞障害性T細胞上のCD45ROのアップレギュレーションの傾向を示した。ナイーブT細胞と比較して、CD45RO＋T細胞は幅広い範囲でサイトカインの分泌を行っている。その上、CD3-TCR複合体が次善最適条件下において刺激を受けたとき、CD45RO＋T細胞は増殖しIL-2を産生することができる。これに対して、ナイーブT細胞はこれらの機能を実行するには、強いCD3-TCR刺激が必要である。感染およびワクチン接種後の効果的な免疫応答の誘導には、記憶型T細胞の形成が重要となる。
【００４０】
先天性の細胞性免疫系は、プロバイオティクス細菌の摂取によっても引き起こされる。L.パラカゼイ摂取に引き続いて、ナチュラルキラーT（NKT）細胞集団が増大することが実証された。NKT細胞はNK細胞マーカーのCD56やT細胞マーカーのCD3-T細胞受容体複合体を共発現しているリンパ球亜集団を構成する。ヒトおよびマウスにおける研究では、多発性硬化症やI型糖尿病、全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患の制御において、NKT細胞が中心的な役割を担っていることが実証されている。NKT細胞はさらに、腫瘍やウイルス感染に対するエフェクター機能を働かせる。すなわち、NKT細胞は自身の機能について多面的である。プロバイオティクス細菌の免疫に対する効果を評価したその他臨床的な研究では、L.ラムノーザスHN101および、ビフィドバクテリウム・ラクチス（Bifidobacterium lactis） HN019の摂取がNK細胞の（NKT細胞を含む）のK562細胞へ対する腫瘍殺傷活性を高めることを示した。この研究においては、ほかにも多核球細胞の食作用活性が、様々な乳酸菌の摂取後に増加するという他人による観察も確認されている。本研究において観察された種々の免疫パラメーターへの影響の結果として、ウイルス上昇するといった感染および／または腫瘍に対して、免疫防御が強化されるという点において細胞障害性T細胞の活性化とNKT細胞の増大が同時に起こると推測される。インビトロの知見として、乳酸菌は単球細胞のIL-12、およびIL-18の分泌を誘導することを見出し、これらの細菌の摂取が、細胞を介した活性を刺激しているという理論を支持している
本発明に従い、L.プランタラムおよびL.パラカゼイの摂取が特異的、および先天的細胞免疫系に深い影響を有していると結論付けられた。
【００４１】
実施例2
この実施例での目標は、幾つかの（異なる種の）乳酸菌を順序正しく次々に投与したときと比較して、同じ種の乳酸菌をより長期間与えることによる免疫系に対する効果を検討することである。
【００４２】
ボランティアは14日間、もしくは35日間凍結乾燥された粉末状の菌体を与えられた。グラム陽性細菌として、ラクトバチルス・プランタラム299vのプロバイオティクス細菌を単独、もしくはL.ラムノーザス、L.ファーメンタム、L.パラカゼイ、L.ガセリとの組み合わせで使用した。また、グラム陰性細菌としてシュードモナス・ルンデンシスを使用した。
以下に示す群で研究を行った。
１）ラクトバチルス・プランタラム35日間
２）L.プランタラム7日間、L.ラムノーザス7日間、L.ファーメンタム 7日間、L.パラカゼイ7日間、L.ガセリ7日間、合計35日間（連続）
３）L.プランタラム、L.ラムノーザス、L.ファーメンタム、L.パラカゼイ、L.ガセリの混合物。合計14日間
４）L.ラムノーザス14日間
５）L.ファーメンタム14日間
６）L.パラカゼイ14日間
７）L.ガセリ14日間
８）シュードモナス・ルンデンシス14日間
コントロール群2）プラセボ35日間
コントロール群1）プラセボ14日間
血液サンプルは0日目、14日目、35日目に採血した。CD25が大量に発現されているヘルパーT細胞（CD4+）の量は、上記実験例1にて説明したフローサイトメトリーを用いて、各群で決定した。
【００４３】
結果
14日目に、5種類の異なる乳酸菌株を順番に摂取した個人において、CD4+CD25++T細胞の増大は境界の有意性であった。
【００４４】
考察
CD25分子を高密度で発現している（CD4+CD25++）ヘルパーT細胞（CD4+）は自己免疫疾患、アレルギー、炎症性腸疾患から保護するのに重要であることが示されてきた。この知見からは、連続的に異なる乳酸菌を摂取した後に、これらの細胞の数が増えるということが、上記疾病の進行に関するリスクを懸念する個人にとって、これらの菌体の摂取が有益であることを示唆している。
【００４５】
実験例3
この研究の目的は、少なくとも三ヶ月の間、乳酸菌を凍結乾燥品／機能性食品における摂取がカゼの症状の重篤度、発症率、期間にどのように影響するか詳細に研究することである。
【００４６】
インビトロの研究、もしくは動物実験は、ヒトに投与したときの有効性の程度を反映しないことから、ヒトにおけるインビボで行うことは重要である。これらの菌体は、培養後直接投与した際に、小腸内にて定着する能力があることが先行研究において実証されている。
すなわち目的は、ラクトバチルス・プランタラム299v（DSM 9843）とラクトバチルス・パラカゼイ8700:2（DSM 13434）の混合物（1×109 cfu/日）の消費で、カゼのリスクを減少することができるかどうか検討することである。
この研究に参加した個人は500人で、90日間行った。250人は活性化製品を摂取し、250人はプラセボ群とした。
研究は無作為抽出し、二重盲検プラセボ対照実験法の二つの治療群で行った。
除外基準は以下の通り：製剤の中に含まれる含有物に対してアレルギーか既知の不耐性を有する者；医学に処置されたアレルギー；現在、深刻な胃腸障害で治療中である者；妊娠もしくは授乳をしている者；12ヶ月以内にインフルエンザウイルスに対するワクチンを接種した者；喫煙者。
【００４７】
与えられたプロバイオティクスは凍結乾燥したラクトバチルス・プランタラム299vおよびラクトバチルス・パラカゼイ8700:2である。スクロース、マルトデキストリンさらに加水分解されたゼラチンを凍結保護物質として加えた。投与量は毎日1ｇ（約1×109 cfu/日）の凍結乾燥した乳酸菌の摂取で、朝食とともに摂食した。
製品は、プロビ エービー（ルンド、スウェーデン）によって製造され、袋詰めされ、ラベルが貼られている。製品の品質もプロビ エービーによって確認されている。それぞれのサシェには、研究で使用した名前、賞味期限、保存の方法、製造業社名、調査責任者の名前と電話番号が記されている。溶解及び摂取に対する詳細な指示が二次パッケージに挿入される。製品はサシェで提供される。
開始14日前から開始後104日目まで、被験者はプロバイオティクス細菌を含む製品を摂ってはならない。被験者が試験期間中、摂ってはいけないプロバイオティクス製品のリストを配布する。
糞試料は一日目（研究製品を摂取する前）、15日目（摂取後）、104日目（摂取後）に提出された。サンプルは2本のチューブで回収し、18時間以内に解析を行い、この期間の間、凍結保存した。サンプルは乳酸菌について分析される。
血液サンプルは1日目と15日目に回収し、サンプルはCD4＋とCD8＋について解析を行った。
【００４８】
実験例1と2の結果からすると、プラセボ群と比較してプロバイオティクス混合物を摂取した方がカゼに対する防御の増大が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図1は治験中において、胃腸系に何らかのマイナーな副作用の報告がなされたボランティアの数を示す。
【図２】図2は血液1 ml当りの様々なリンパ球のベースライン数（0日目）（平均値±(SEM)）を示す。
【図３】図3は様々な細胞の活性化と記憶マーカーに対して陽性であるリンパ球のベースライン（0日目）の百分率とGMFI（平均値±(ＳＥＭ）)を示す。
【図４】被験者を無作為に9つの異なる実験群に割り当てた。治験は二週間の休薬期間を設けて、その後続いて、アクティブ研究期間を実施した。この期間では、被験者たちは1日当たり1つの用量の研究製品を14日間（L.プランタラム Heal19、L.ファーメンタム、L.パラカゼイ、L.ガセリ、L.ラムノーザス、P.ルンデンシス群）もしくは35日間（L.プランタラム299v及びプラセボ群）消費した。それぞれの用量は、1010（乳酸菌群）コロニー形成単位（CFU）または109CFU細菌（P.ルンデンシス群）である。
【図５】活性化表現形であるCD8CD25、CD8HLA-DR、CD4CD25やCD4HLA-DRを発現しているリンパ球の百分率をフローサイトメトリーで解析したものである。群平均値(±SEM)は個人内での数値の割合に基づいており、14日目／0日目、35日目／0日目（L.プランタラムとプラセボ群のみを）で示す。
【図６】記憶型表現形であるCD8CD45ROおよびCD4CD45ROを発現しているリンパ球の百分率をフローサイトメトリーにて解析した。群平均値(±ＳＥＭ)は個体の割合に基づいており、14日目／0日目、35日目／0日目（L.プランタラムとプラセボ群のみ）で示す。
【図７】NKT細胞マーカー（CD56CD16CD3）に対して陽性のリンパ球の百分率をフローサイトメトリーにて解析した。群の計算は個体の割合に基づく（14日目／0日目）。
【図８】好中球の食作用活性は、FITC標識した大腸菌または、黄色ブドウ球菌と全血球細胞をインキュベートすることで解析した。14日目と0日目に得た平均蛍光値の割合を個々に決定し、群計算値を図に示した。
【図９】図9は実験2からの活性化表現形であるCD4CD25が発現しているリンパ球の割合を示す。
【図１０】図10は実験2からの活性化表現形であるCD4+CD25++が発現しているリンパ球の割合を示す。
【図１１】図11は実験2からの活性化表現形であるCD8+HLA-DR+が発現しているリンパ球の割合を示す。
【図１２】図12は実験2からの活性化表現形であるCD8+CD25+が発現しているリンパ球の割合を示す。
【図１３】図13は実験2からの活性化表現形であるCD4CD45ROが発現しているリンパ球の割合を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染の治療及び／又は予防のための薬学的組成物の製造のための、乳酸菌から選択される、少なくとも1種のプロバイオティクス細菌(Probiotic bacteria)株の使用。
【請求項２】
前記の少なくとも1種の乳酸菌株が、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ラムノーザス（Lactobacillus rhamnsosus）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）及びラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ラクトバチルス・プランタラムが、ラクトバチルス・プランタラム299、DSM 6595、ラクトバチルス・プランタラム299v、DSM 9843、ラクトバチルス・プランタラム HEAL 9、DSM 15312、ラクトバチルス・プランタラム HEAL 19、DSM 15313、及びラクトバチルス・プランタラム HEAL 99、DSM 15316からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記ラクトバチルス・パラカゼイ株が、ラクトバチルス・パラカゼイ 8700:2、DSM 13434、ラクトバチルス・パラカゼイ 02A、DSM13432からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記ラクトバチルス・ガセリが、ラクトバチルス・ガセリ VPG44、DSM 16737から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
少なくとも2つのプロバイオティクス細菌株が使用される、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記少なくとも2つの株が、連続又は同時に投与される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ウイルス感染が、I型単純ヘルペスウイルス、II型単純ヘルペスウイルス、帯状疱疹ウイルス、感冒ウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、RS（respiratory syncytial）ウイルス、エンテロウイルス、及びコロナウイルスからなる群から選択されるウイルスが原因となる、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記薬学的組成物が、液体製剤又は固体製剤である、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記固体製剤が、錠剤、吸引錠剤(sucking tablet)、スウィート(sweet)、チューイングタブレット(chewing tablet)、チューインガム、カプセル剤、サシェ、散剤、顆粒剤、被覆粒子、被覆錠剤、腸溶錠、メルティングストリップ（melting strip）、及びフィルムからなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記液体製剤が、経口液剤、懸濁剤、乳濁剤、及びシロップ剤からなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記組成物が、担体材料を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬学的組成物が、医療用食品、機能性食品、栄養補助食品、栄養製品、又は食品調製物である、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記担体材料が、オートミール粥、乳酸醗酵食品、難消化性澱粉、食物繊維、炭水化物、タンパク質、及び糖化タンパク質からなる群から独立的に選択される、請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記食品調製物が、飲料、ヨーグルト、ジュース、アイスクリーム、パン、ビスケット、シリアル、ヘルスバー及びスプレッドからなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記株(単数又は複数)の各々が組成物中に、約1×106から約1×1014 CFU、好ましくは約1×108から約1×1012、より好ましくは約1×109から約1×1011の量で存在する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
乳酸菌から選択される少なくとも一種のプロバイオティクス細菌株を個体に投与する、ウイルス感染の治療及び／又は予防方法。
【請求項１８】
前記プロバイオティクス株が、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノーザス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・パラカゼイ、及びラクトバチルス・ガセリからなる群から選択されて個体に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも２種のプロバイオティクス細菌株が投与される、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記株が連続又は同時に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルス感染が、I型単純ヘルペスウイルス、II型単純ヘルペスウイルス、帯状疱疹ウイルス、感冒ウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、RSウイルス、エンテロウイルス及びコロナウイルスからなる群から選択されるウイルスが原因となる、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１】
ウイルス感染の治療及び／又は予防のための薬学的組成物の製造のための、乳酸菌から選択される、少なくとも1種のプロバイオティクス細菌(Probiotic bacteria)株の使用。
【請求項２】
前記の少なくとも1種の乳酸菌株が、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ラムノーザス（Lactobacillus rhamnsosus）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）及びラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ラクトバチルス・プランタラムが、ラクトバチルス・プランタラム299、DSM 6595、ラクトバチルス・プランタラム299v、DSM 9843、ラクトバチルス・プランタラム HEAL 9、DSM 15312、ラクトバチルス・プランタラム HEAL 19、DSM 15313、及びラクトバチルス・プランタラム HEAL 99、DSM 15316からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記ラクトバチルス・パラカゼイ株が、ラクトバチルス・パラカゼイ 8700:2、DSM 13434、ラクトバチルス・パラカゼイ 02A、DSM13432からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記ラクトバチルス・ガセリが、ラクトバチルス・ガセリ VPG44、DSM 16737から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
少なくとも2つのプロバイオティクス細菌株が使用される、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記少なくとも2つの株が、連続又は同時に投与される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ウイルス感染が、I型単純ヘルペスウイルス、II型単純ヘルペスウイルス、帯状疱疹ウイルス、感冒ウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、RS（respiratory syncytial）ウイルス、エンテロウイルス、及びコロナウイルスからなる群から選択されるウイルスが原因となる、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記薬学的組成物が、液体製剤又は固体製剤である、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記固体製剤が、錠剤、吸引錠剤(sucking tablet)、スウィート(sweet)、チューイングタブレット(chewing tablet)、チューインガム、カプセル剤、サシェ、散剤、顆粒剤、被覆粒子、被覆錠剤、腸溶錠、メルティングストリップ（melting strip）、及びフィルムからなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記液体製剤が、経口液剤、懸濁剤、乳濁剤、及びシロップ剤からなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記組成物が、担体材料を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬学的組成物が、医療用食品、機能性食品、栄養補助食品、栄養製品、又は食品調製物である、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記担体材料が、オートミール粥、乳酸醗酵食品、難消化性澱粉、食物繊維、炭水化物、タンパク質、及び糖化タンパク質からなる群から独立的に選択される、請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記食品調製物が、飲料、ヨーグルト、ジュース、アイスクリーム、パン、ビスケット、シリアル、ヘルスバー及びスプレッドからなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記株(単数又は複数)の各々が組成物中に、約1×106から約1×1014 CFU、好ましくは約1×108から約1×1012、より好ましくは約1×109から約1×1011の量で存在する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
乳酸菌から選択される少なくとも一種のプロバイオティクス細菌株を個体に投与する、ウイルス感染の治療及び／又は予防方法。
【請求項１８】
前記プロバイオティクス株が、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノーザス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・パラカゼイ、及びラクトバチルス・ガセリからなる群から選択されて個体に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも２種のプロバイオティクス細菌株が投与される、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記株が連続又は同時に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルス感染が、I型単純ヘルペスウイルス、II型単純ヘルペスウイルス、帯状疱疹ウイルス、感冒ウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、RSウイルス、エンテロウイルス及びコロナウイルスからなる群から選択されるウイルスが原因となる、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００９−５１１４７０（Ｐ２００９−５１１４７０Ａ）
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３４４９０（Ｐ２００８−５３４４９０）
【出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００６／００１１３８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４０４４５
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（５０００４５２５７）プロビ エービー (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００６／００１１３８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４０４４５
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（５０００４５２５７）プロビ エービー (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]