ウシ乳汁成長因子
【課題】 従来技術関連の困難または欠陥の１つ以上を克服するか、少なくとも軽減する成長因子の提供。
【解決手段】 アミノ酸配列DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHFSRCPKQYKHYCIKGRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFYを含むウシ乳汁成長因子（ＢＭＧＦ）であるポリペプチド、またはその機能的に活性なフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、ＥＧＦレセプターに結合し、実質的または部分的に精製された形態であるポリペプチド。
【解決手段】 アミノ酸配列DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHFSRCPKQYKHYCIKGRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFYを含むウシ乳汁成長因子（ＢＭＧＦ）であるポリペプチド、またはその機能的に活性なフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、ＥＧＦレセプターに結合し、実質的または部分的に精製された形態であるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ乳汁、乳製品または乳製品抽出物からの、新規の成長因子に関する。本発明は、上記成長因子の成熟型および前駆体型をコードする核酸を単離、クローニングおよび配列決定するための組換え型ＤＮＡ技術の使用、ならびに、上記成長因子の組換え製造におけるこれらの核酸の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
成長因子は、細胞送達、成長および発育、アポトーシス、胚形成、免疫応答の開始、細胞の生存および分化、創傷治癒、および癌等の、広範囲の生理学的経過および病理学的経過に関与している。治療に使用される可能性があるため、当然のこととして、正常な成長調節を推進する基本的なメカニズムを理解するためばかりでなく、成長因子の単離、特性化、および成長因子の機能的メカニズムの明確化に大いなる関心がよせられている。
【０００３】
成長因子はバイオテクノロジー産業において、培養中の細胞の成長に使用される規定された培地の必須成分も含む。長年にわたって、細胞成長に必須の成分を培地に補足するために動物の血清が使用されてきた。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が最もよく使用されるが、製薬工程における動物を供与源とするタンパク質およびヒトを供与源とするタンパク質の安全性に関する市場および規制の問題がある。
【０００４】
乳汁を主成分とする血清代替品を使用してかなりの進歩を遂げたにも関わらず、細胞培養培地の補足物としてのウシ体液を取り巻く安全性の問題（潜伏病原体に感染する可能性の結果として（たとえば、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ））は、これらが安全ではないと考えられることを意味する。したがって、既知の供与源で且つ規定された純度の成長因子を含む完全に規定された細胞培養培地の開発に注意が集中した。これは、精製された天然分子または組換え分子により、細胞培養培地の成長因子成分が提供されることを意味する。
【０００５】
乳汁は、乳幼児の成長および発育に必要な、重要な栄養物である。乳汁は、カゼイン、ラクトフェリン、ラクトアルブミン、ラクトース、およびビタミン類、イオン、酵素等の、様々な他の成分等の栄養源である。多数の成長因子が、ヒトおよびウシの乳汁で同定されている。この中には、インシュリン様成長因子ＩおよびII、線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子β、および血小板由来成長因子などが含まれる。ヒト乳汁中に表皮成長因子が存在するが、ウシ乳汁では、納得できるほど証明されていない（Iacopetta et al., Acta Paediatr, 81, 287, (1992)）。乳腺の発生および分化（Collier et al, Livestock Production Science,35,21,(1993)）、発育中の新生児免疫系の調節（Ishizaka et al. Cellular Immunol, 159, 77, (1994)）、胃腸の成長および成熟（Read et al, Pediatric Research, 18, 133, (1984)）、および他の器官における可能な作用を含め、幾つかの役割が、乳汁由来成長因子について提案されている。乳汁由来成長因子は、培養中の様々な細胞の成長を支持することも証明されている。さらに、チーズ製造の副生成物であるウシ乳汁の乳清は、哺乳類細胞の成長を短期的にまたは長期的に支持することもでき（Derouiche et al, Lait, 70, 313, (1990); Damerdji et al., Biotechnology Tech,2,253, (1988)）、抗腫瘍活性を有することも証明されている（Bounous et al, Clin. Invest. Med. 11, 312, (1988))。従来技術としては、哺乳類細胞培養における血清の代替品としての、複数の細胞成長刺激因子を含有するウシ乳汁乳清抽出物の使用について記述している、本出願者に付与されたオーストラリア特許第６４５５８９号が挙げられる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、従来技術関連の困難または欠陥の１つ以上を克服すること、少なくとも軽減することである。
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様において、ウシ乳汁、乳製品または乳製品抽出物から得られる新規の成長因子（以後、ウシ乳汁成長因子（ＢＭＧＦ）と呼ぶ）が提供される。本明細書で使用する用語「乳汁」は、ヒトまたは動物を供与源とする必乳期分泌物を指す。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】オーストラリア特許ＡＵ６４５５８９号に従って調製されたウシのチーズ乳清抽出物（ＧＦＥ−２）を、酸性化および限外濾過ならびに一連のクロマトグラフィーステップに供した。この図は、おのおののクロマトグラフィーステップにおける、タンパク質の溶出プロファイルとＥＧＦ−受容体結合アッセイの活性を示す。
【図２】図２は、ＢＭＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。還元（Ｒ）条件または非還元（Ｎ）条件下、８〜２５％成形済phastゲルを用いたPharmacia Phastsystemで、ＢＭＧＦの精製調製物を分析し、次いで、銀染色により可視化した。各図の左の数字は、サイズ標準の移動位置を表す（９４ｋＤａ、ホスホリラーゼｂ、６７ｋＤａ、アルブミン、４３ｋＤａ、オボアルブミン、３０ｋＤａ、カルボニックアンヒドラーゼ、２０．１ｋＤａ、トリプシンインヒビター、１４．４ｋＤａ、α−ラクトアルブミン）。
【図３】図３は、ＢＭＧＦのアミノ酸配列決定を示す図である。Ｘは、アミノ末端配列決定で同定されなかったアミノ酸を示す。
【図４】図４は、ＢＭＧＦの脱グリコシル化を示す図である。ＮＡＮａｓｅII、Ｏ−グリコシダーゼＤＳおよびＰＮＧａｓｅＦの存在下および非存在下で、精製されたＢＭＧＦをインキュベートし、１０〜２０％のＴｒｉｃｉｎｅゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。（詳細については、実施例３参照）。
【図５】図５は、ＢＭＧＦのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す図である。
【図６】図６は、pGH(1-46)-Met-ＢＭＧＦ発現ベクターの構築を示す図である。矢印は、オーセンティックＢＭＧＦを生成するための臭化シアン切断の部位を示す。
【図７】図７は、精製された組換え型オーセンティックＢＭＧＦ（Ａ）および組換え型pGH(1-46)-Met ＢＭＧＦ融合タンパク質（Ｂ）のＣ４逆相ＨＰＬＣを示す図である。挿入図は還元条件（Ｒ）および非還元条件（Ｎ）における、精製された調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図８】図８は、様々な培養細胞系の増殖に及ぼすＢＭＧＦの影響を示す図である。細胞増殖を、ＢＭＧＦの濃度上昇に対する応答として表し、ＢＭＧＦの非存在下でインキュベートした細胞を上回るパーセント上昇として示す。５０ｎｇ／ｍｌの濃度のインシュリン様成長因子１類似体（ＬＲ3ＩＧＦ−１）の存在下および非存在下で、ＢＭＧＦの濃度を上昇させながら、Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３細胞およびＩＥＣ−６細胞をインキュベートした。
【図９】図９は、ＢＭＧＦ（５００μｇ／ｋｇ／日）または媒体（０．１Ｍの酢酸）を７日間注入した後の、Sprague-Dawleyラットの、総体重に対する消化管の重量（g/kg）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ＢＭＧＦは、実質的に純粋な形であってもよく、部分的に純粋な形であってもよい。「実質的に純粋」という用語は、ここでは少なくとも約７０％純粋であるＢＭＧＦの純度を述べるのに用いる。
【００１０】
「部分的に純粋」という用語は、ここでは、タンパク質１ｍｇあたり０．３ユニット以上の特定の活性を有するＢＭＧＦの純度を述べるのに用いる。
【００１１】
ここで、ＢＭＧＦ活性の測定単位として用いられた「１ユニット」という用語は、明細書の実施例１で述べたアッセイ条件下において、125Ｉで標識した組換え型ヒト表皮成長因子が、ＡＧ２４０８細胞への結合の５０％と競合するのに必要なＢＭＧＦの総量によって定義される。
【００１２】
天然のグリコシル化型のＢＭＧＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、約２１〜２５ｋＤａの分子量を有していてもよい。ＢＭＧＦは、線維芽細胞または上皮細胞、またはそれらの両方の増殖を刺激する能力を有する。
【００１３】
本発明のこの態様の好ましい形態では、ＢＭＧＦは、下記のようなアミノ酸配列を有してもよい。DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHFSRCPKQYKHYCIKGRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFY
【００１４】
本明細書で開示されるＢＭＧＦは成長因子の表皮成長因子群のひとつである。ＢＭＧＦは８０個のアミノ酸残基および８個のハーフシステイン、マウスの膵臓のβ腫瘍細胞の規定された培地から精製された表皮細胞様分子にも述べられているパターン（Shing et al, Science, 259, 1604, (1993)）を含む。ヒト型のこの成長因子のアミノ酸配列はベータセルリンとよばれ、ヒト腺癌細胞系統から得られた核酸配列からも導き出される（Sasada et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 190, 1173, (1993)）。ＢＭＧＦとマウスベータセルリン（５８の同一の残基を有する）とヒトベータセルリン（７２の同一の残基を有する）の間の配列相同性に基づくと、ＢＭＧＦはベータセルリンのウシ型であろう。明らかに、それは同じ分子でない。ウシのチーズ乳清抽出物から単離されたＢＭＧＦは２１〜２５ｋＤａの分子量を有し、これは天然のマウスベータセルリンにおいて報告されている分子量３２ｋＤａよりも実質的に小さいサイズである。
【００１５】
本発明は、ＢＭＧＦの前駆体型およびＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）も、その範囲内に含む。このようなフラグメントは、増強または縮小された成長刺激活性を有する可能性、またはＢＭＧＦの刺激活性に応答する細胞の範囲を拡大または制限する可能性、あるいはそれらの両方の可能性がある。それらは、消化管損傷の予防もしくは修復、または創傷治癒等の領域で有用な可能性があるが、その限りではない。
【００１６】
当業者に周知の方法によって、これらを生成することができる。位置指定突然変異誘発等の（しかし、それに限定されない）遺伝子レベルでの方法、または化
学的修飾等の（しかし、それに限定されない）タンパク質レベルでの方法は、本発明の範囲内である。
【００１７】
本発明のこの態様の好ましい形態では、ＢＭＧＦのフラグメントは、下記のアミノ酸配列 DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHF、または GYAGARCERVDLFY、または DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPK、または RRGHFSRCPK、または QYK、または HYCIK、または GRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFYを含んでもよい。
【００１８】
本発明は、実質的にグリコシル化されていないＢＭＧＦも提供する。たとえば、グリコシル化されたＢＭＧＦを酵素的に脱グリコシル化ステップに供し、脱グリコシル化型を回収することによって、これを調製することができる。非グリコシル化型または部分的に非グリコシル化型のＢＭＧＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、約９〜１４ｋＤａの分子量を有してもよい。
【００１９】
本発明のこの態様のさらなる好ましい形態では、ＢＭＧＦは、ウシ乳汁、ウシ乳汁製品またはウシ乳汁製品抽出物から得られる。さらに好ましくは、ＢＭＧＦは、チーズ乳清から得られ、最も好ましくは、ウシのチーズ乳清抽出物から得られる。
【００２０】
本発明のさらなる態様において、実質的に純粋な形または部分的に純粋な形で、ＢＭＧＦを、ウシ乳汁または乳製品から単離する方法が提供される。好ましくは、ＢＭＧＦは、ウシ乳汁またはウシ乳汁製品から単離される。さらに好ましくは、ＢＭＧＦは、チーズ乳清またはチーズ乳清抽出物から単離され、最も好ましくは、ウシのチーズ乳清またはウシのチーズ乳清抽出物から単離される。グリコシル化型のＢＭＧＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、約２１〜２５ｋＤａの分子量を有していてもよい。ＢＭＧＦは、線維芽細胞および／または上皮細胞、および／または骨芽細胞の増殖を刺激する能力を有してもよい。
【００２１】
本発明のこの態様の好ましい形態では、ＢＭＧＦは下記のようなアミノ酸配列を有してもよい。
DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHFSRCPKQYKHYCIKGRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFY
【００２２】
本発明のこの態様において、実質的に純粋なＢＭＧＦを単離する方法は、乳汁または乳製品または乳製品抽出物を、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィー等の様々なクロマトグラフィー方法または、必要に応じてさらなる精製工程、あるいはそれらの両方に供することを含む。「乳製品」は、チーズ乳清、スキムミルク、酸（カゼイン）、乳清および初乳を含んでもよい。上に略述したクロマトグラフィー工程の前に、乳汁または乳製品をＡＵ６４５５８９号に略述されている工程に供し、乳製品抽出物を得ることが好ましい。ＡＵ６４５５８９号を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本明細書では、「乳製品抽出物」を、オーストラリア特許ＡＵ６４５５８９号に記載の方法によって、乳汁または乳製品から調製された抽出物と定義する。明確にするために、乳製品抽出物の定義は、チーズ乳清抽出物を含む。
【００２３】
各精製ステップから回収され、且つ適当なアッセイ、たとえば、ＡＧ２８０４細胞を使用した放射性受容体アッセイ、または、たとえば、Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３細胞を使用した細胞成長アッセイで生物学的活性を示す試料分画をプールし、次の精製ステップに進めることができる。プールされた分画のそれぞれからの試料を、用量応答分析（a dose response analysis）に供し、それによって、前述のアッセイにおける最大活性の５０％応答を引き出すのに必要な物質の量を推定することができる。この量を「１ユニット」と定義し、この値を、各プール内の物質の量に関する値と共に利用して、精製収率、および本方法の各ステップにおける比活性を算出することができる。実質的に純粋なＢＭＧＦの等質性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、約２１〜２５ｋＤａの１つのバンドとしての泳動Ｎ末端配列分析、質量分析法、またはＥＧＦ受容体への特異的結合、あるいはそれらを組み合わせた方法により、実証することができる。
【００２４】
本発明のこの態様の好ましい形態において、実質的に純粋なＢＭＧＦを単離する方法であって、ウシ乳汁、乳製品または乳製品抽出物を提供するステップと、ウシ乳汁、乳製品または乳製品抽出物を限外濾過に供して第１分画を得るステップと、上記第１分画を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して第２分画を得るステップと、上記第２分画をゲル濾過クロマトグラフィーに供して第３分画を得るステップと、上記第３分画を逆相高速液体クロマトグラフィー（（ＲＰ）ＨＰＬＣ）に供して第４分画を得るステップと、上記第４分画をアフィニティクロマトグラフィーに供して第５分画を得るステップと、上記第５分画を（ＲＰ）ＨＰＬＣに供して第６分画を得るステップと、上記第６分画を（ＲＰ）ＨＰＬＣに供して実質的に純粋なＢＭＧＦを得るステップとを含む方法が提供される。
【００２５】
本発明のこの態様のさらなる好ましい形態において、実質的に純粋なＢＭＧＦを単離する方法であって、ＡＵ６４５５８９号に従って調製された乳製品抽出物を提供するステップと、上記乳製品抽出物を酸性化に供するステップと、上記酸性化された乳製品抽出物を限外濾過に供して第１分画を得るステップと、上記第１分画を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して第２分画を得るステップと、上記第２分画をゲル濾過クロマトグラフィーに供して第３分画を得るステップと、上記第３分画を逆相高速液体クロマトグラフィー（（ＲＰ）ＨＰＬＣ）に供して第４分画を得るステップと、上記第４分画をアフィニティクロマトグラフィーに供して第５分画を得るステップと、上記第５分画を（ＲＰ）ＨＰＬＣに供して第６分画を得るステップと、上記第６分画を（ＲＰ）ＨＰＬＣに供して実質的に純粋なＢＭＧＦを得るステップとを含む方法が提供される。
【００２６】
上記乳汁、乳製品または乳製品抽出物を、さらに、酸性化ステップに供することが好ましい。この酸性化ステップは、限外濾過の前に実施することが好ましい。さらに好ましくは、酸性化はｐＨ２．５で実施する。
【００２７】
上記限外濾過は、好ましくは約５０〜１５０ｋＤａ、さらに好ましくは、約１００ｋＤａの排除限界を有する膜を使用して実施する。
【００２８】
上記陰イオン交換クロマトグラフィーは、アガロースを主成分とする陰イオン交換カラムを使用して実施することが好ましい。
【００２９】
上記限外濾過は、約３ｋＤａ〜７０ｋＤａの範囲の分子量を有するタンパク質を分離するカラムを使用して実施することが好ましい。
【００３０】
上記第１回（ＲＰ）ＨＰＬＣは、Ｃ４マトリックスまたはＣ１８マトリックスを使用して実施することが好ましい。
【００３１】
上記アフィニティクロマトグラフィーは、ヘパリン／アガロースを主成分とするアフィニティカラムを使用して実施することが好ましい。
【００３２】
上記第２回（ＲＰ）ＨＰＬＣは、Ｃ４マトリックスまたはＣ１８マトリックスを使用して実施することが好ましい。
【００３３】
上記第３回（ＲＰ）ＨＰＬＣは、Ｃ４マトリックスまたはＣ１８マトリックスを使用して実施することが好ましい。
【００３４】
出発物質として、ＡＵ６４５５８９号に従って調製された乳製品抽出物を製造する代わりに、ウシ乳汁または乳製品を使用することが可能である。この方法を選択する場合、陰イオン交換クロマトグラフィーステップの前に、予備的精製ステップを使用して、脂肪、固形分および酸性タンパク質を除去することが可能である。
【００３５】
実質的に精製されたＢＭＧＦを、ＢＭＧＦを認識するかまたはＢＭＧＦを結合する、あるいはその両方の働きをするポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生に使用することが可能であり、これは本発明の範囲内にあると考えられる。
【００３６】
したがって、本発明のさらなる態様において、ＢＭＧＦに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が提供される。
【００３７】
ＢＭＧＦのエピトープに対する抗体の産生に使用することが可能な様々な方法が、当技術分野で知られている。ウサギ、マウス、ヤギ等を含むが、それに限定されない様々な宿主動物を、ＢＭＧＦタンパク質で免疫化した後、これらのＢＭＧＦ抗体の産生に使用することが可能である。宿主に応じて、免疫学的応答を高めるためにアジュバントを使用することが可能であり、その例として、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄｓ）（完全および不完全）が挙げられるが、その限りではない。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞系による抗体分子の連続産生を可能にする技術を使用することにより、モノクローナル抗体を調製することが可能である。これらの技術としては、ハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, Nature 256,495 (1975))が挙げられるが、その限りではない。ＢＭＧＦに対する抗体を、たとえば、成長因子に関するスクリーニングアッセイ、およびＢＭＧＦタンパク質のアフィニティ精製で、様々な組織、体液および細胞系におけるＢＭＧＦの成熟型および前駆体型の検出に使用することができる。
【００３８】
本発明のさらなる態様において、ＢＭＧＦまたはＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメントをコードするそのフラグメントを提供する。この核酸はＢＭＧＦの成熟型をコードしてもよく、または前駆体型をコードしてもよい。
【００３９】
好ましくは、上記核酸は、図５に示す配列を有する。
【００４０】
遺伝暗号が縮重しているため、それをコードする他の核酸配列または機能的に等価のアミノ酸配列は、本発明の範囲内に含まれる。ＢＭＧＦヌクレオチド配列のこのような交替は、結果として同じ遺伝子産物または機能的に等価の遺伝子産物を生じる異なるヌクレオチドの置換を含んでもよい。欠失および／または付加を有し、且つ結果として機能的に等価の遺伝子産物を生じる核酸配列も、本発明の範囲内に含まれる。さらに、この遺伝子産物は、機能的に活性な生成物を依然として産生する配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含んでもよい。
【００４１】
本発明のさらなる態様において、ＢＭＧＦまたはＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメントをコードするそのフラグメントを単離する方法を提供する。この核酸は、ＢＭＧＦの成熟型をコードしてもよく、または前駆体型をコードしてもよい。
【００４２】
ＢＭＧＦをコードする核酸は、ＢＭＧＦ活性を産生する細胞源から得ることが可能である。たとえば、核酸源として腎細胞を使用してもよい。ＢＭＧＦをコードする核酸は、ＢＭＧＦのｍＲＮＡを相補的ｃＤＮＡに逆転写し、次に、成熟タンパク質または前駆体タンパク質の一部、好ましくはＮ末端部分およびＣ末端部分をコードする核酸配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得ることが好ましい。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドプライマーは、下記の配列
5' ATC TAG GTT ACC ATG GAT GGG AAT TCA ACC AGA 3' 5' ATC TAG GTT ACC GGC GAT GGG AAT TCA ACC AGA 3' 5' CTA GAT AAG CTT TCA TCA GTA AAA CAA GTC AAC TCT 3'またはこれらと実質的に相同の配列を有する。
【００４３】
上記オリゴヌクレオチドプライマーは、核酸の指向性のクローニングを容易にするために、制限酵素部位を含むことが好ましい。
【００４４】
さらに好ましくは、上記プライマーは下記のヌクレオチド配列を含む。 5' GGG AAT TCA ACC AGA 3' 5' GTA AAA CAA GTC AAC TCT 3'
【００４５】
最も好ましくは、上記プライマーは、 5' GGG AAT TCA ACC AGA AGT CCT GAA 3' 5' GTA AAA CAA GTC AAC TCT CTC ACA CCT 3'である。
【００４６】
したがって、本発明のこの態様の好ましい形態において、ＢＭＧＦ、またはＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメントをコードするそのフラグメントを単離する方法であって、ＢＭＧＦ活性を有する細胞供与源を提供するステップと、この細胞を処理して、それからｍＲＮＡを得るステップと、このようにして得られたｍＲＮＡを処理して、それからｃＤＮＡを生成するステップと、このようにして得られたｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲによって増幅して、核酸を生成するステップとを含む方法を提供する。
【００４７】
存在するタンパク質をコードする核酸を得るための、当業者に周知の他の方法および、ＢＭＧＦの成熟型または前駆型をコードする核酸を得るためのこれらの方法の使用も本発明の範囲に含まれる。これらの方法は、ＢＭＧＦの成熟型および／または前駆体型の核酸配列またはアミノ酸配列の知見から核酸を化学的に合成するか、あるいは、ＢＭＧＦの成熟型または前駆体型、あるいはそれらの両方の一部もしくは全部をコードするヌクレオチド配列に相同の同位元素標識核酸配列または非同位元素標識核酸配列を用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー、あるいはそれらの両方をスクリーニングするか、好ましくは、ウシライブラリーをスクリーニングするかの、いずれかを含む（が、これに限定されない）。
【００４８】
当業者に周知の、組換えＤＮＡテクノロジーの標準技術を使用して、ＢＭＧＦの成熟型または前駆体型をコードする核酸を適当なベクター、たとえば発現ベク
ターにクローニングすることができる。
【００４９】
したがって本発明のさらなる態様において、ＢＭＧＦをコードする核酸、またはＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメントをコードする核酸を含むベクターが提供される。
【００５０】
この核酸はＢＭＧＦの成熟型をコードしてもよく、または前駆体型をコードしてもよい。
【００５１】
上記核酸はウシＢＭＧＦをコードすることが好ましい。さらに好ましくは、この核酸は図５に示す配列を有する。
【００５２】
多数のベクター宿主系が利用可能であり、その例としてｐＢＲ３２２またはｐＵＣ誘導体等のプラスミド、あるいはλ誘導体等のバクテリオファージが挙げられる（が、これに限定されない）。
【００５３】
本発明のベクターを使用して、宿主細胞において組換え型ＢＭＧＦを発現させることが可能である。
【００５４】
したがって本発明のさらなる態様において、組換え型ＢＭＧＦが提供される。
【００５５】
組換え型ＢＭＧＦは実質的に純粋な形であってもよく、部分的に純粋な形であってもよい。組換え型ＢＭＧＦは、好ましくは少なくとも約７０％純粋であり、さらに好ましくは少なくとも約９０％純粋であり、最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。この組換え型ＢＭＧＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、非グリコシル化で約９ｋＤａの分子量を有してもよい。この組換え型ＢＭＧＦは、線維芽細胞および／または上皮細胞、および／または骨芽細胞の増殖を刺激する能力を有してもよい。
【００５６】
本発明のこの態様の好ましい形態において、上記組換え型ＢＭＧＦは、下記のようなアミノ酸配列を有してもよい。
DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHFSRCPKQYKHYCIKGRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFY
【００５７】
本発明は、組換え型ＢＭＧＦの前駆体型および組換え型ＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）も、その範囲内に含む。
【００５８】
本発明のこの態様の好ましい形態において、ＢＭＧＦの上記フラグメントは、下記のアミノ酸配列 DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHF、または GYAGARCERVDLFY、または DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPK、または RRGHFSRCPK、または QYK、または HYCIK、または GRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFY、またはこれに実質的に相同の配列を含んでもよい。
【００５９】
本発明は、組換え型ＢＭＧＦを産生する方法であって、ＢＭＧＦ、ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメントをコードするそのフラグメントを含むベクター、および宿主細胞を提供するステップと、上記ベクターを上記宿主細胞に導入するステップと、上記組換え型ＢＭＧＦを発現させるステップと、上記組換え型ＢＭＧＦを単離するステップとを含む方法も提供する。
【００６０】
上記ベクターを、形質転換、形質導入、高電圧パルス法および感染等（これに限定されない）の方法によって、宿主細胞に導入することが可能である。宿主細胞としては、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞等の細菌が挙げられるが、これに限定されない。
【００６１】
この組換え型ＢＭＧＦを、融合タンパク質として発現させることが可能である。本発明のこの態様に従って形成される融合タンパク質は、宿主細胞内の封入体として単離することが可能である。
【００６２】
このようにして形成された組換え型ＢＭＧＦを、好ましくは宿主細胞の破壊後に、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーおよび／または、必要に応じてさらなる精製工程等の技術を使用した、当業者に周知の従来のポリペプチド精製方法によって単離できることは理解されるであろう。この組換え型ＢＭＧＦは、当業者に周知の従来の方法を使用して融合タンパク質として単離することもでき、その融合パートナーから切断することもできる。
【００６３】
本発明のこの態様の好ましい形態において、本出願者に付与されたオーストラリア特許第６３３０９９号（その全開示内容を引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に従って、ブタ成長ホルモンの一部が任意に切断可能な配列を介して、ＢＭＧＦのＮ末端配列に連結された融合タンパク質として、上記組換え型ＢＭＧＦを調製することが可能である。
【００６４】
天然由来の成熟型または前駆体型のＢＭＧＦ、およびその融合パートナーを含むまたは含まない成熟型または前駆体型のいずれかとして単離される組換え型ＢＭＧＦタンパク質を含む本発明のＢＭＧＦ（およびその突然変異体、類似体、フラグメントおよび誘導体）を、単独でまたは他の因子（たとえば、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１類似体（これに限定されない））と組み合せて、あるいは、たとえば、胎仔血清の補足物として、in vitroにおける、哺乳類細胞あるいはより組織化された構造、たとえば、皮膚の成長または増殖あるいはそれらの両方に、単独でまたは他の因子と組み合せて、創傷治癒または組織修復、あるいはそれらの両方の増進、たとえば、表面創傷の治療に、単独でまたは他の因子と組み合せて、炎症性腸疾患および粘膜免疫性等の、消化管バリア機能障害関連の病気の予防、緩和または治療に、乳児用調合乳の補足物として、歯周病の予防、治療または
緩和に、美容上の用途に使用することが可能である。
【００６５】
したがって本発明は、哺乳類の細胞および組織の成長または増殖、あるいはそれらの両方を促進するための組成物であって、培地、好ましくは規定された培地と共に、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を含有する組成物を提供する。
【００６６】
本発明は、哺乳類の細胞および組織の成長または増殖、あるいはそれらの両方を促進するための方法であって、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を含有する培地中で、上記細胞または組織を成長させることを含む方法も提供する。
【００６７】
「有効量」という言葉は、ここでは統計上有意な反応を９５％信用できるレベルで誘発するのに十分な量を意味するＢＭＧＦを用いる方法において用いられる（p<0.05となるのは、その効果が偶然のみによる場合である）。
【００６８】
本発明のさらなる態様において、哺乳類の細胞および組織の成長または増殖、あるいはそれらの両方を促進するための方法であって、相乗的に応答をするＩＧＦの有効量とともに、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を含有する培地中で、上記細胞または組織を成長させることを含む方法も提供する。
【００６９】
本発明のさらなる様態において培地に含まれるＩＧＦまたはインシュリン様成長因子は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２または、本出願者に付与されたオーストラリア特許第６３３０９９号に述べられているＬＲ3ＩＧＦ−１のような機能的に活性なＩＧＦの突然変異体、または類似体であってもよい。
【００７０】
本発明のさらなる態様において、表面創傷を治療するための組成物であって、薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体と共に、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を含有する組成物が提供される。
【００７１】
本発明は、創傷治癒または組織修復、あるいはそれらの両方を増進するための方法であって、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む方法も提供する。
【００７２】
治療することが可能な創傷のタイプに制限はなく、この例としては、表面潰瘍（たとえば、圧迫性潰瘍、静脈鬱滞性潰瘍、糖尿病性潰瘍および粥腫性潰瘍）、火傷または偶発性創傷（裂傷および切り傷等）ならびに胃および腸（大腸および小腸）等の上皮で覆われた器官に対する創傷、ならびに目の角膜損傷等が挙げられる（が、それに限定されない）。創傷部位へのＢＭＧＦの適用は、粉末、ゲル、軟膏または包帯の形であってもよく、ＢＭＧＦを組み込んだ他の創傷用包帯であってもよい。ＢＭＧＦは、単独または他の成長因子を含む混合物のいずれで創傷に塗布してもよく、他の成分、たとえば、アジュバント、担体および可溶化剤と併用してもよい。組成物中のＢＭＧＦの濃度は重要ではないが、細胞増殖、特に上皮細胞増殖を惹起するのに十分でなければならない。
【００７３】
消化管は腸内腔に存在する潜在的に有害な物質により絶えず攻撃されているため、その後の正常な粘膜バリアのメンテナンスが、成人および乳幼児の生命に極めて重大である。バリア機能は、たとえば高投与量化学療法、感染および外傷の間に起こるような上皮表面への損傷によって損なわれる可能性がある。さらに、通常の抗原および管腔の抗原に感作した後に発生する炎症誘発性応答は、上皮損傷および高い浸透性につながる。この免疫機能保全は、脂肪便症および炎症性腸疾患を含む疾患の病因において重要な役割を果たすと考えられる。ＢＭＧＦの上皮細胞刺激活性を考えると、本発明のさらなる用途は、単独で、または、他の成長因子と組み合せのいずれかで、好ましくは溶腸性製剤として炎症性腸疾患および粘膜免疫性等の消化管機能障害関連の病気を治療、緩和または予防することである。
【００７４】
したがって本発明のさらなる態様において、消化管機能障害関連の病気を治療、緩和または予防するための組成物であって、薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体と共に、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を含有する組成物が提供される。
【００７５】
本発明は、消化管機能障害関連の病気を予防、緩和または治療するための方法であって、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む方法も提供する。
【００７６】
本発明は、歯周病を予防または治療するための方法であって、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む方法も提供する。
【００７７】
美容上の用途におけるＢＭＧＦの使用であって、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む使用も提供する。
【００７８】
本発明は、栄養成分と共に、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）を含む、乳児用調合物も提供する。
好ましくは、この乳児用調合物は調合乳である。
【００７９】
本明細書の説明および請求項を通して、語「含む（comprise）」およびその語の変形、たとえば「含んでいる（comprising）」や「含む（comprises）」は、他の添加物、成分、整数またはステップを排除するものではない。
【００８０】
次に、添付の実施例および図面を参照しながら、本発明をさらに完全に説明する。しかし、以下の説明は例示に過ぎず、いかなる形でも、上記の本発明の一般性に対する制限としてとらえてはならないことを理解すべきである。
【実施例】
【００８１】
［実施例１ ウシのチーズ乳清抽出物からのＢＭＧＦの単離］
［ステップ１ 限外濾過サイズ排除］
６Ｌのウシのチーズ乳清抽出物（ＡＵ６４５５８９号に略述されているものに従って調製されたＧＦＥ−２）（タンパク質濃度＝４０ｍｇ/ｍｌ）を、ＨＣｌでｐＨ２．５に酸性化し、次いで、Sartorius Sarton II クロスフロー（crossflow）濾過ユニット（Sartorius社製, Gottingen, Germany)に取り付けられた１００ｋＤａのポリスルホネート排除膜を通過させてマイクロフィルトレーションした。このステップで得られた透過物を、０．１μｍの中空線維カートリッジを備えたAmicon DC-10限外濾過ユニット（Amicon社製, Danvers, MA）を使用して、ダイアフィルトレーションし、次いで、同じユニットを使用して、３ｋＤａの三酢酸セルロース膜を通過させて約１．８Ｌに濃縮した。
【００８２】
［ステップ２ 陰イオン交換クロマトグラフィー］
脱塩して濃縮した透過物を、固体Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅで２０ｍMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）とし、５ＭのＨＣｌでｐＨを７．５に調整し、１μｍの膜を通過させて濾過し、ＦＰＬＣシステム（Pharmacia社製, Sweden）に取り付けられたＱ−セファロースカラム（５×１５ｃｍ、Pharmacia社製, Sweden）に、流速５ｍｌ／分で適用した。次いで、このカラムを２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで洗浄し、カラムに結合したままのタンパク質（ＢＭＧＦを含む）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌに溶解した０〜０．６ＭのＮａＣｌの線形塩勾配（linear salt gradient）２．１Ｌにより、流速５ｍｌ／分にて溶離した。３０ｍｌの分画を回収し、ＢＭＧＦ活性について分析した（図１）。活性を、表皮成長因子（ＥＧＦ）受容体結合活性として測定した。ＢＭＧＦを含有する分画をプールし、次いで、Ｈ2Ｏ（２×２０Ｌ）に対して１６時間透析し、凍結乾燥させた。
【００８３】
［ＥＧＦ受容体結合アッセイ］
ＡＧ２８０４芽細胞上に存在する特異的ＥＧＦ受容体に結合する［125Ｉ］−ｒｈＥＧＦに関する競合によって、ＢＭＧＦを測定した。簡単に記載すると、２４ウェルプレートの１０％のＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中で、ＡＧ２８０４細胞を７０〜８０％密集まで成長させた。この細胞を結合緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、８ｍＭのグルコース、０．１％のＢＳＡ）で２回洗浄し、次いで、カラム分画および［125Ｉ］−ｒｈＥＧＦ（１００００ｃｐｍ）と共に、結合緩衝液中で、４℃にて１８時間インキュベートした。この段階の終わりに、細胞をＨａｎｋｓ緩衝食塩水（ＨＢＳＳ）で３回洗浄し、１ｍｌの０．５ＭのＮａＯＨ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で、室温にて３０分間溶解した。細胞溶解物の放射能をガンマカウンターで測定した。カラム分画の代わりに結合緩衝液を加えることにより、総結合量を測定した。試料の代わりに、過剰の（１００ｎｇ）非標識ｒｈＥＧＦを加えることにより、非特異的結合を測定したところ、通常、総結合量の約５％であった。アッセイにおいて、非標識ｒｈＥＧＦの量を増加させて（０．２〜１００ｎｇ）使用することにより、ＥＧＦ競合用の標準曲線を得た。
【００８４】
［ステップ３ ゲル濾過クロマトグラフィー］
上記ステップからの凍結乾燥したＢＭＧＦプールを、１５ｍｌの１５０ｍＭのＮａＣｌ、１Ｍの氷酢酸、および１０％（ｖ/ｖ）のＣＨ3ＣＮで再構成し、０．２２μｍの膜を通過させて濾過し、ＦＰＬＣに取り付けられたSuperdex-75 35/600（３．５×６０ｃｍ、Amersham Pharmacia Biotech社製, Sydney, Australia）カラムに、流速３．５ｍｌ／分で適用する。１７．５ｍｌの分画を回収し、ＢＭＧＦ活性について分析する（図１）。
【００８５】
［ステップ４ Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ］
ＢＭＧＦ活性を含有する分画をプールし、０．１％のＴＦＡで１：４に希釈し、０．１％のＴＡＦで平衡化したＤｅｌｔａ−Ｐａｃｋ Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（１５μｍ、３００Å、２５×１００ｍｍ、Millipore-Waters社製, Lane Cove, New South Wales, Australia)に適用する。このカラムを０．１％のＴＦＡで徹底的に洗浄し、次いで結合タンパク質を、０〜８０％のＣＨ3ＣＮの線形勾配および０．０８％のＴＦＡで流速５ｍｌ／分にて８０分にわたって溶離する。１０ｍｌの分画を回収し、ＢＭＧＦ活性を含有する分画（図１）をプールして凍結乾燥させる。
【００８６】
［ステップ５ アフィニティクロマトグラフィー］
上記ステップからの凍結乾燥したプールを、２０ｍｌの２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で再構成し、ＦＰＬＣに取り付けられた５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ヘパリン−セファロースアフィニティカラム（Amersham Pharmacia Biotech社製, Sydney, Australia）に流速０．５ｍｌ／分にて適用する。Ｏ．Ｄ．280nmがベースラインに戻るまで、このカラムを２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄し、次いで結合タンパク質を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した０〜１MのＮａＣｌの線形塩勾配７５ｍｌで溶離する。１ｍｌの分画を回収し、ＢＭＧＦ活性を含有するものをプールする。
【００８７】
［ステップ６ Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ＃１］
ヘパリン−セファロースプールを１０％のプロパノール、０．１３％のＨＦＢＡで１：４に希釈し、Nova-Pack C18 RP-HPLCカラム（４μｍ、６０Å、８×１００ｍｍ、Millipore-Waters社製, Lane Cove, New South Wales, Australia)に、１ｍｌ／分の流速で適用する。このカラムを１０％のプロパノール、０．１３％のＨＦＢＡで洗浄し、結合したタンパク質を１０分間にわたり１０〜２４％のプロパノール、０．１３％のＨＦＢＡ、次いで、１６０分間にわたり２４〜４０％のプロパノール、０．１３％のＨＦＢＡという２段階勾配で溶離する。１ｍｌ分画を回収し、ＢＭＧＦ活性に関して分析する（図１）。
【００８８】
［ステップ７ Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ＃２］
上記ステップからのＢＭＧＦ活性を含有する分画をプールし、０．１％のＴＦＡで１：３に希釈し、上と同じカラムに１ｍｌ／分の流速で適用する。このカラムを０．１％のＴＦＡで洗浄し、結合したタンパク質を１０分間にわたり０〜１０％のＣＨ3ＣＮ、次いで２５０分間にわたり１０〜３５％のＣＨ3ＣＮという２段階勾配で１ｍｌ／分の流速にて溶離する（図１）。２ｍｌ分画を回収し、ＢＭＧＦ活性について分析する。ＢＭＧＦ活性を含有する分画をプールし、必要な時まで−２０℃で保存する。
【００８９】
精製の結果の概要を表１に示す。上記ＢＭＧＦは、最高９９％（９９％を含む）純粋で、且つ約２１〜２５ｋＤａの分子量を有する形態で、最後のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣステップからの活性分画に存在する。これらの基準は、Pharmacia Phast システム（図２参照）を用いて実行した、銀染色された８〜２５％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＮ末端配列分析から推定される。
【００９０】
【表１】
【００９１】
［実施例２ ＢＭＧＦのＮ末端配列分析およびペプチド配列分析］
ウシＢＭＧＦおよびエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ消化により生成したペプチドフラグメントのアミノ酸配列を、Hewlett-Packard G1000Aタンパク質シークエンサーを使用して決定した。２０μｇの精製ＢＭＧＦを、変性緩衝液（６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ８．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ）４００μｌに溶解した１００μｌの４ｍＭのＤＴＴにより、暗所で室温にて３０分間還元した。変性緩衝液中に２００μＣｉのヨード［２−3Ｈ］酢酸を含有する１μｍｏｌのヨード酢酸を加え、上述の通りにインキュベートすることにより、変性し、還元されたＢＭＧＦをＳ−カルボキシメチル化した。次に、変性緩衝液に溶解したヨード酢酸１６μｍｏｌを加え、インキュベーションをさらに１５分間続けた。５μｌのＴＦＡを加えることにより反応を停止させ、［3Ｈ］カルボキシメチル化したＢＭＧＦをＲＰ−ＨＰＬＣで回収した。［3Ｈ］カルボキシメチル化ＢＭＧＦを真空下で乾燥させ、Ｎ末端から配列決定するか、あるいは１００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中、３７℃にて１６時間、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（０．５μｇ、Promega）で消化した。５μｌのＴＦＡを加えることにより反応を停止させ、このようにして得られたペプチドフラグメントを、C18 RP-HPLCカラム（２．１×３０ｍｍ、Bownlee Lab製, Santa Clara, CA）で、７０分間にわたり、０．２５ｍｌ／分の流速で０〜５０％のＣＨ3ＣＮおよび０．０８％のＴＦＡの線形勾配を使用して分離した。ペプチド含有分画を真空下で乾燥させ、配列を決定した（図３）。
【００９２】
［実施例３ ＢＭＧＦの脱グリコシル化］
１．５ｍｌポリプロピレン微量遠沈管内で、１０μｇの純粋なＢＭＧＦを乾燥させ、１６μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に再懸濁し、０．２ユニットのα２−３，６−ノイラミニダーゼ（ＮＡＮａｓｅ II）および０．００２ユニットのエンド−α−アセチルガラクトサミニダーゼ（Ｏ−グリコシダーゼ ＤＳ）（BioRad製, Richmond, California）を加え、この反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、５００ｍＭリン酸ナトリウム（２塩基）で反応体積を４０μｌに増やし、２．５μｌの２％ＳＤＳおよび１Ｍのβ−メルカプトエタノールを加えた。次いで、反応混合物を９５℃に５分間加熱し、氷上に置き、次いで２．５μｌのＮｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０および０．００５ユニットのＰｅｐｔｉｄｅ−Ｎ4（アセチル−β−グルコサミニル）−アスパラギンアミニダーゼ（ＰＭＧａｓｅ Ｆ）（BioRad, Richmond, California）を加え、３７℃で３時間インキュベートした。次いで、反応混合物を真空下で乾燥させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元緩衝液に再懸濁し、１０〜２０％のＴｒｉｃｉｎｅゲル（Novex）で実行した（図４）。
【００９３】
［実施例４ ＢＭＧＦの成熟型のクローニング］
ＢＭＧＦのＮ末端アミノ酸配列およびＣ末端アミノ酸配列（実施例２参照）に相当する２つのオリゴヌクレオチドプライマー（下記参照）を化学的に合成し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による、ウシＢＭＧＦの完全成熟型をコードするヌクレオチド配列の増幅に使用した。
プライマー１ 5' GAT GGG AAT TCA ACC AGA AGT CCT GAA 3'
プライマー２ 5' GTA AAA CAA GTC AAC TCT CTC ACA CCT 3'
【００９４】
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Qiagen社製, Clifton Hill, Victoria, Australia）を使用して、８０〜９０％密集Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎細胞（ＭＤＢＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２２）から全ＲＮＡを単離した。オリゴｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII（Life Technologies社製, Melbourne, Australia）を使用して、１μｇの全ＭＤＢＫ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。上記プライマーと共に、次のｃＤＮＡをＰＣＲ用の鋳型として使用した。５０μｌの６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＳＯ4、１８ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4（ｐＨ９．１）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、各プライマー２００ｎｇ、１ＵのｅＬＯＮＧａｓｅ（Life Technologies社製, Melbourne, Australia）および１μｌのｃＤＮＡで、ＰＣＲを実施した。最初に９４℃で３分間インキュベートした後、９４℃で１分、５０℃で１分、および６８℃で１分、続いて最後に６８℃で３分延長し、３０サイクルの増幅を実施した。
【００９５】
２％のアガロースゲルによる電気泳動でＰＣＲ反応を分析した。２４０ｂｐの生成物ゲルから切り取り、Promega PCR Preps Purificationキットを使用して精製した。製造業者の説明書に従って、精製したＰＣＲ生成物を、ベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に平滑末端連結した。ＢＭＧＦベクター構築物をE. coli TOP 10（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレートで選択した。Amplicycle シークエンシングキット（Perkin-Elmer社製）ならびに普遍Ｍ１３前進プライマー（−４０）および逆プライマーを使用して、ジデオキシ鎖終結法（Sanger et al., Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463, (1977)）により、成熟ＢＭＧＦの完全ヌクレオチド配列（図５参照）を決定した。
【００９６】
［実施例５ Ｅ． ｃｏｌｉのＢＭＧＦ ｃＤＮＡ発現プラスミドの構築］
発現ベクター構築のための成熟ＢＭＧＦ［Asp1-Tyr80］の全８０アミノ酸をコードするＤＮＡを得るために、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Qiagen社製, Clifton Hill, Victoria, Australia）を使用して、８０〜９０％密集Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎細胞（ＭＤＢＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２２）から全ＲＮＡを単離した。オリゴｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII（Life Technologies, Melbourne, Australia）を使用して、１μｇの全ＭＤＢＫ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。以下に示すプライマーと共に、次のｃＤＮＡをＰＣＲ用の鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は上述と同じであった。
【００９７】
【表２】
【００９８】
【表３】
【００９９】
２％のアガロースゲルによる電気泳動でＰＣＲ反応を分析した。２７３ｂｐの生成物をゲルから切り取り、Promega PCR Preps Purificationキットを使用して精製した。精製したＰＣＲ生成物およびプラスミドｐ［Ｍｅｔ1］−ｐＧＨ（１〜４６）を、制限酵素Ｈｐａ ＩおよびＨｉｎｄ III（New England Biolbs）で消化し、消化したＰＣＲ生成物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、リニアにしたｐ［Ｍｅｔ1］−ｐＧＨ（１〜４６）に連結した（図６）。ｐ［Ｍｅｔ1］−ｐＧＨ（１〜４６）は、強力なｔｒｃプロモーターの下流にあるメチオニル・ブタ成長ホルモンの最初の４６アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクターである（GroPep Pty Ltdが所有し、特許権を得ている）。ベクター構築物をE. coli JM101 (lacq）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレートで選択した。
【０１００】
［実施例６ Ｅ． ｃｏｌｉ形質転換体により生成されるオーセンティックＢＭＧＦの精製］
プラスミド［Ｍｅｔ1］−ｐＧＨ（１〜４６）−Ｍｅｔ−ＢＭＧＦを含むE. coli JM101菌株を単一コロニーとして選択し、６０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、３３ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、７．５ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．７ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０μＭのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、０．２％のＤ−グルコース、０．０００５％のチアミンおよび５０μｇ／ｍｌのアンピシリンから成るスターター培養２０ｍｌの接種に使用した。この培養を３７℃で１６時間成長させた。次いで、スターター培養を使用して、各３Ｌの成長培地（３０ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、７ｍＭのＫ2ＳＯ4、１２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１９ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１３９ｍＭのＤ−グルコース、２．４ｍＭのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、０．０００４％のチアミン、０．０３５ｍＭのＦｅ（II）ＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、０．００７4ｍＭのＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０００８ｍＭのＣｕＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０７4ｍＭのクエン酸三ナトリウム、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（ｐＨ６．９））が入っている２つの５Ｌ発酵槽（Ａｐｐｌｉｃｏｎ）を接種した。６００ｎｍにおける吸光度のＯ．Ｄ．が４．０に達するまで細菌を３７℃で成長させ、次いで、０．３３ｍＭのＩＰＧＴで誘導し、グルコースが、ｐＨの急な上昇によって示される限界値になるまで培養を続けた。温度、ｐＨおよび酸素の制御は、自動管理下にあった（ＦＣ４データシステム、Real Time Engineering）。Ｒａｎｎｉｅホモジナイザーを５回通過させた後、５０００p.s.iで細胞を破壊し、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２５分、４℃）で封入体を回収した。６０００ｒｐｍにおける遠心分離により、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、０．５ｍＭのＺｎＣｌ2で、この封入体を２回洗浄し、−８０℃で保存した。
【０１０１】
２０ｇのバッチ内で、洗浄した封入体を解凍し、８Ｍの尿素、０．１ＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭのグリシン、４０ｍＭのジチオトレイトール、および０
．５ｍＭのＺｎＣｌ2（ｐＨ９．０）に１０％（ｗ/ｖ）で懸濁し、室温で３０分間攪拌した。可溶化した封入体を１４０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、結果として得られた上清を、Cellufine GCL-1000を詰めて、２ｍｌ／分の流速にて、８Ｍの尿素、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭのグリシン、１．６ｍＭのジチオトレイトールおよび０．５ｍＭのＺｎＣｌ2（ｐＨ９．０）で平衡化したPharmacia-LKB XXカラムで、脱塩した。３０ｍｌ分画を回収し、組換え型［Ｍｅｔ1］−ｐＧＨ（１〜４６）−Ｍｅｔ−ＢＭＧＦ融合タンパク質を含有する分画をプールし、このプールを、４Ｍの尿素、４０ｍＭのグリシン、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．４ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭの２−ヒドロキシエチルジスルフィド、ｐＨ９．０中に、最終タンパク質濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるように希釈することにより、酸化的再生に供する。室温で３時間攪拌した後、ＨＣｌでｐＨを６．４５に調整することにより、反応を停止させた。
【０１０２】
次に、再生した融合タンパクを、１５ｍｌ／分の流速にて８Ｍの尿素、５０ｍMの酢酸アンモニウム（ｐH６．４５）で平衡化したSepharose Fast Flow S (Amersham Pharmacia Biotech, Sydney, Australia）１００ｍｌを詰めた、Pharmacia-LKB XK50カラムに充填した。ＯＤ280nmがベースラインに戻るまで、このカラムを上記緩衝液で洗浄した。次いで、このカラムを、同じ緩衝液に溶解した０〜０．７ＭのＮａＣｌの線形塩勾配で、１５ｍｌ／分の流速にて溶離した。３０ｍｌ分画を回収し、融合タンパク質を含む分画をプールした。
【０１０３】
この融合タンパク質のプールを脱塩し、C4 Prep-Pakカラム（４０ｍｍ×１００ｍｍ；３００Å、１５μｍ；Millipore-Waters社製, Lane Cove, New South Wales, Australia）を用いた逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーでさらに精製した。このタンパク質プールをＴＦＡが０．１％になるように調整し、５０ｍｌ／分にてＣ４カラムに充填した。このカラムを０．１％のＴＦＡで徹底的に洗浄し、０．０８％のＴＦＡの存在下、１８〜５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの勾配で、２０ｍｌ／分の流速にて、９０分にわたってタンパク質を溶離した。３０ｍｌの分画を回収し、プールされた融合タンパク質を含有する分画を凍結乾燥した。
【０１０４】
融合タンパク質プールをマイクロボア逆相ＨＰＬＣ（２．１ｍｍ×１００ｍｍ、Brownlee Lab製, Santa Clara, Ca）で分析して、１つのタンパク質ピークが同定された（図７Ｂ）。ＢＭＧＦ調製物の純度をＮ末端配列分析でさらに確認すると、予期されるＢＭＧＦに関する末端配列を与え、おおよその純度は９９％以上であった。還元条件下もしくは非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、予期された１４．５ｋＤａの単一タンパク質も検出された（図７Ｂ、挿入図）。
【０１０５】
オーセンティックＢＭＧＦを生成するために、１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にて、１００倍モル過剰な臭化シアンを含有する０．１３ＭのＨＣｌに凍結乾燥タンパク質を可溶化することにより、融合タンパク質を切断した。この切断反応を、暗所にて室温で、２５時間実施した。切断後、１ＭのＮａＣｌでカラムからバッチ状にタンパク質を溶離したこと以外は上述の通りに、イオン交換クロマトグラフィーで反応混合物から臭化シアンを除去した。
【０１０６】
オーセンティックＢＭＧＦを融合パートナーから逆相ＨＰＬＣで分離した。Ｓ−セファロースタンパク質プールを０．１％のＴＦＡで１：４（ｖ／ｖ）に希釈し、５０ｍｌ／分の流速にて、C4 Prep-Pakカラム（２５ｍｍ×１００ｍｍ；３００Å、１５μｍ；Millipore-Waters社製, Lane Cove, New South Wales, Australia）に適用した。ＯＤ280nmがベースラインに戻るまで、このカラムを０．１％のＴＦＡで徹底的に洗浄し、次いで、０．０８％のＴＦＡの存在下、１６〜３２％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの勾配で、２０ｍｌ／分の流速にて１５０分にわたって、このカラムを溶離した。２６ｍｌの分画を回収し、純粋なＢＭＧＦを含有する分画をプールした。
【０１０７】
最終ＢＭＧＦタンパク質プールのマイクロボアＣ４逆相ＨＰＬＣ（２．１ｍｍ×１００ｍｍ）による分析で、１つのタンパク質ピークが同定された。ＢＭＧＦ調製品の純度をさらに確認した。ＢＭＧＦ調製物の純度をＮ末端配列分析でさらに確認すると、予期されるＢＭＧＦに関する末端配列を与え、おおよその純度は９９％以上であった。エレクトロスプレーイオン化質量分析法により決定された組換え型ＢＭＧＦの分子量は８９９５．１±０．８３であった。これは、ＢＭＧＦアミノ酸配列から算出した理論上の分子量８９９５．０２と一致する。還元条件または非還元条件で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、約９ｋＤａの１つのタンパク質ピークが検出された（図７Ａ、挿入図）。
【０１０８】
［実施例７ ＢＭＧＦの分裂促進活性］
一連の細胞系のオーセンティックＢＭＧＦおよび組換え型ＢＭＧＦの分裂促進活性をメチレンブルー細胞増殖アッセイで測定した。細胞系を９６ウェルプレートで、１０〜２０×１０4細胞／ｍｌの密度で継代培養し、５％のＣＯ2下３７℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをＤＭＥＭで徹底的に洗浄して残留培地を除去し、その後天然ＢＭＧＦまたは組換え型ＢＭＧＦを様々な濃度で加えた（図８参照）。一部の細胞系では、ＢＭＧＦと５０ｎｇ／ｍｌのＬＲ3ＩＧＦ−１との共インキュベーションの影響を試験した。４８時間インキュベーション後、０．１５ＭのＮａＣｌでプレートを２回洗浄し、細胞の単層を固定し、１％メチレンブルーを加えて６００ｎｍにおける吸光度を測定することにより、細胞質量を定量した。ウシのチーズ乳清抽出物から単離されたＢＭＧＦも、組換えによって生成したＢＭＧＦも、Ｂａｌｂ/ｃ ３Ｔ３細胞において、同等の効力であった。ＢＭＧＦは、上皮細胞、線維芽細胞および骨芽細胞を含む広範囲の細胞系を刺激した。この例としては、Ｂａｌｂ/ｃ ３Ｔ３細胞、ＨａＣａＴ細胞、ＩＥＣ−６細胞、ＳＦ３１６９細胞、Ｍｖ１Ｌｕ細胞およびＣａｌＯｓｔ細胞などが挙げられる。場合によっては、たとえば、消化管上皮細胞系ＩＥＣ−６では、ＢＭＧＦがＬＲ3ＩＧＦ−１と相乗的に作用した。
【０１０９】
［実施例８ 消化管成長に対するＢＭＧＦの作用］
媒体（０．１Ｍの酢酸）またはＢＭＧＦ（５００μｇ／ｋｇ／日）が入っている浸透圧ミニポンプを、オスのSprague Dawleyラット（投与群当たり８匹）の肩甲骨上領域の皮下に移植し、そのラットを、Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ代謝ケージ内で、２５℃、１２時間、明／暗周期に維持した環境で、７日間飼育した。動物は、水および高炭水化物飼料を絶えず入手できた。７日後、ラットをＣＯ2過剰投与により屠殺し、総消化管重量を測定した。体重ｋｇ当たりの総消化管重量は、７日後、ＢＭＧＦ投与ラットで２５％高かった（図９）。
【０１１０】
［実施例９ クリーム（Ｏ/Ｗタイプ）
成分 ％
ソルビタンモノステアレート ２．０
ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート ３．０
セチルアルコール ５．０
軽流動パラフィン ８．０
ミリスチン酸イソプロピル ２．０
有効物質ＢＭＧＦ １．０−１０-5
プロピレングリコール ２．０
グリセリン ２．０
脱イオン水 ７６
保存料およびその他の安定剤（適量）
【０１１１】
水性相を５５〜６０℃に加熱し、有効物質をその中に溶解し、勢いよく攪拌することにより、融解した脂質相をその中に分散させる。室温に冷却し、均質化させる。同様の方式で、それぞれ０．４μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌを含有するクリームを製造することができる。このクリーム１００μｌ／ｃｍ2創傷を塗布する。
【０１１２】
［実施例１０ 軟膏（Ｗ／Ｏタイプ）］
成分 ％
ソルビタントリオリエート ５．０
ワックス（微晶質） ３．０
軽流動パラフィン ９．０
ミリスチン酸イソプロピル １０．０
ラノリンアルコール ３．０
有効物質ＢＭＧＦ １．０-１０−５
プロピレングリコール ２．０
グリセリン ２．０
硫酸マグネシウム（含水） ０．７
脱イオン水 ６５．３
保存料およびその他（適量）
【０１１３】
穏やかに加熱しながら上記有効成分を水性相に溶解し、その溶液を溶融した脂質相に分散させる。室温に冷却し均質化させる。同様の方式で、軟膏１００μｌ／ｃｍ2創傷を塗布する。
【０１１４】
［実施例１１ 口内洗浄剤］
成分 ％
有効成分ＢＭＧＦ １．０-１０-3
ポリエチレングリコール（７）−グリセロールココエート ２．０
脱イオン水 １３
グリセリン（８６％） １８
ペパーミントオイル １０
エタノール ５５
保存料およびその他（適量）
【０１１５】
有効物質を脱イオン水に溶解する。ＰＥＧ（７）−グリセリルココエートおよびグリセリンｎを溶液に加えて溶解する。ペパーミントオイルをエタノールに溶解し、２つの溶液を攪拌しながら混合する。この溶液を使用前に１：１０まで希釈する。
【０１１６】
［実施例１２ 非経口用溶液］
成分
有効物質ＢＭＧＦ １ｍｇ／ｍｌ
±ヒト血清アルブミン １ｍｇ／ｍｌ
アルギニンまたはグリセリン ２０ｍｇ／ｍｌ
±炭水化物 ５〜２０ｍｇ／ｍｌ
ｐＨ７
【０１１７】
上記炭水化物はグルコース、マンノース、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチまたはそれらの混合物である。リン酸塩、コハク酸塩、アミノ酸またはそれらの混合物でｐＨを調製する。
【０１１８】
０．５ｍｌ中に０．５ｍｇのＢＭＧＦが入ったバイアルを製造して凍結乾燥させる。
【０１１９】
［実施例１３ 練り歯磨き］
有効物質ＢＭＧＦ １．０-１０-5ｇ
メチルセルロース ０．８ｇ
炭酸カルシウム ３０ｇ
コロイド状シリカ ３ｇ
軽流動パラフィン ２ｇ
グリセリン ２０ｇ
甘味料
香味料
保存料
脱イオン水 合計 １００ｇ
【０１２０】
有効物質とメチルセルロースとの混合物を含む粉末を、脱イオン水、パラフィンおよびグリセリンの一部で湿らせる。添加物を溶液に加える。残りの水で仕上げた後、ペーストを均一化する。
【０１２１】
最後に、本明細書に略述した本発明の精神から逸脱することなく、様々な変更、修飾および／または付加を行うことができることを理解されたい。
【図１−１】
【図１−２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ乳汁、乳製品または乳製品抽出物からの、新規の成長因子に関する。本発明は、上記成長因子の成熟型および前駆体型をコードする核酸を単離、クローニングおよび配列決定するための組換え型ＤＮＡ技術の使用、ならびに、上記成長因子の組換え製造におけるこれらの核酸の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
成長因子は、細胞送達、成長および発育、アポトーシス、胚形成、免疫応答の開始、細胞の生存および分化、創傷治癒、および癌等の、広範囲の生理学的経過および病理学的経過に関与している。治療に使用される可能性があるため、当然のこととして、正常な成長調節を推進する基本的なメカニズムを理解するためばかりでなく、成長因子の単離、特性化、および成長因子の機能的メカニズムの明確化に大いなる関心がよせられている。
【０００３】
成長因子はバイオテクノロジー産業において、培養中の細胞の成長に使用される規定された培地の必須成分も含む。長年にわたって、細胞成長に必須の成分を培地に補足するために動物の血清が使用されてきた。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が最もよく使用されるが、製薬工程における動物を供与源とするタンパク質およびヒトを供与源とするタンパク質の安全性に関する市場および規制の問題がある。
【０００４】
乳汁を主成分とする血清代替品を使用してかなりの進歩を遂げたにも関わらず、細胞培養培地の補足物としてのウシ体液を取り巻く安全性の問題（潜伏病原体に感染する可能性の結果として（たとえば、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ））は、これらが安全ではないと考えられることを意味する。したがって、既知の供与源で且つ規定された純度の成長因子を含む完全に規定された細胞培養培地の開発に注意が集中した。これは、精製された天然分子または組換え分子により、細胞培養培地の成長因子成分が提供されることを意味する。
【０００５】
乳汁は、乳幼児の成長および発育に必要な、重要な栄養物である。乳汁は、カゼイン、ラクトフェリン、ラクトアルブミン、ラクトース、およびビタミン類、イオン、酵素等の、様々な他の成分等の栄養源である。多数の成長因子が、ヒトおよびウシの乳汁で同定されている。この中には、インシュリン様成長因子ＩおよびII、線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子β、および血小板由来成長因子などが含まれる。ヒト乳汁中に表皮成長因子が存在するが、ウシ乳汁では、納得できるほど証明されていない（Iacopetta et al., Acta Paediatr, 81, 287, (1992)）。乳腺の発生および分化（Collier et al, Livestock Production Science,35,21,(1993)）、発育中の新生児免疫系の調節（Ishizaka et al. Cellular Immunol, 159, 77, (1994)）、胃腸の成長および成熟（Read et al, Pediatric Research, 18, 133, (1984)）、および他の器官における可能な作用を含め、幾つかの役割が、乳汁由来成長因子について提案されている。乳汁由来成長因子は、培養中の様々な細胞の成長を支持することも証明されている。さらに、チーズ製造の副生成物であるウシ乳汁の乳清は、哺乳類細胞の成長を短期的にまたは長期的に支持することもでき（Derouiche et al, Lait, 70, 313, (1990); Damerdji et al., Biotechnology Tech,2,253, (1988)）、抗腫瘍活性を有することも証明されている（Bounous et al, Clin. Invest. Med. 11, 312, (1988))。従来技術としては、哺乳類細胞培養における血清の代替品としての、複数の細胞成長刺激因子を含有するウシ乳汁乳清抽出物の使用について記述している、本出願者に付与されたオーストラリア特許第６４５５８９号が挙げられる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、従来技術関連の困難または欠陥の１つ以上を克服すること、少なくとも軽減することである。
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様において、ウシ乳汁、乳製品または乳製品抽出物から得られる新規の成長因子（以後、ウシ乳汁成長因子（ＢＭＧＦ）と呼ぶ）が提供される。本明細書で使用する用語「乳汁」は、ヒトまたは動物を供与源とする必乳期分泌物を指す。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】オーストラリア特許ＡＵ６４５５８９号に従って調製されたウシのチーズ乳清抽出物（ＧＦＥ−２）を、酸性化および限外濾過ならびに一連のクロマトグラフィーステップに供した。この図は、おのおののクロマトグラフィーステップにおける、タンパク質の溶出プロファイルとＥＧＦ−受容体結合アッセイの活性を示す。
【図２】図２は、ＢＭＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。還元（Ｒ）条件または非還元（Ｎ）条件下、８〜２５％成形済phastゲルを用いたPharmacia Phastsystemで、ＢＭＧＦの精製調製物を分析し、次いで、銀染色により可視化した。各図の左の数字は、サイズ標準の移動位置を表す（９４ｋＤａ、ホスホリラーゼｂ、６７ｋＤａ、アルブミン、４３ｋＤａ、オボアルブミン、３０ｋＤａ、カルボニックアンヒドラーゼ、２０．１ｋＤａ、トリプシンインヒビター、１４．４ｋＤａ、α−ラクトアルブミン）。
【図３】図３は、ＢＭＧＦのアミノ酸配列決定を示す図である。Ｘは、アミノ末端配列決定で同定されなかったアミノ酸を示す。
【図４】図４は、ＢＭＧＦの脱グリコシル化を示す図である。ＮＡＮａｓｅII、Ｏ−グリコシダーゼＤＳおよびＰＮＧａｓｅＦの存在下および非存在下で、精製されたＢＭＧＦをインキュベートし、１０〜２０％のＴｒｉｃｉｎｅゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。（詳細については、実施例３参照）。
【図５】図５は、ＢＭＧＦのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す図である。
【図６】図６は、pGH(1-46)-Met-ＢＭＧＦ発現ベクターの構築を示す図である。矢印は、オーセンティックＢＭＧＦを生成するための臭化シアン切断の部位を示す。
【図７】図７は、精製された組換え型オーセンティックＢＭＧＦ（Ａ）および組換え型pGH(1-46)-Met ＢＭＧＦ融合タンパク質（Ｂ）のＣ４逆相ＨＰＬＣを示す図である。挿入図は還元条件（Ｒ）および非還元条件（Ｎ）における、精製された調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。
【図８】図８は、様々な培養細胞系の増殖に及ぼすＢＭＧＦの影響を示す図である。細胞増殖を、ＢＭＧＦの濃度上昇に対する応答として表し、ＢＭＧＦの非存在下でインキュベートした細胞を上回るパーセント上昇として示す。５０ｎｇ／ｍｌの濃度のインシュリン様成長因子１類似体（ＬＲ3ＩＧＦ−１）の存在下および非存在下で、ＢＭＧＦの濃度を上昇させながら、Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３細胞およびＩＥＣ−６細胞をインキュベートした。
【図９】図９は、ＢＭＧＦ（５００μｇ／ｋｇ／日）または媒体（０．１Ｍの酢酸）を７日間注入した後の、Sprague-Dawleyラットの、総体重に対する消化管の重量（g/kg）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ＢＭＧＦは、実質的に純粋な形であってもよく、部分的に純粋な形であってもよい。「実質的に純粋」という用語は、ここでは少なくとも約７０％純粋であるＢＭＧＦの純度を述べるのに用いる。
【００１０】
「部分的に純粋」という用語は、ここでは、タンパク質１ｍｇあたり０．３ユニット以上の特定の活性を有するＢＭＧＦの純度を述べるのに用いる。
【００１１】
ここで、ＢＭＧＦ活性の測定単位として用いられた「１ユニット」という用語は、明細書の実施例１で述べたアッセイ条件下において、125Ｉで標識した組換え型ヒト表皮成長因子が、ＡＧ２４０８細胞への結合の５０％と競合するのに必要なＢＭＧＦの総量によって定義される。
【００１２】
天然のグリコシル化型のＢＭＧＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、約２１〜２５ｋＤａの分子量を有していてもよい。ＢＭＧＦは、線維芽細胞または上皮細胞、またはそれらの両方の増殖を刺激する能力を有する。
【００１３】
本発明のこの態様の好ましい形態では、ＢＭＧＦは、下記のようなアミノ酸配列を有してもよい。DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHFSRCPKQYKHYCIKGRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFY
【００１４】
本明細書で開示されるＢＭＧＦは成長因子の表皮成長因子群のひとつである。ＢＭＧＦは８０個のアミノ酸残基および８個のハーフシステイン、マウスの膵臓のβ腫瘍細胞の規定された培地から精製された表皮細胞様分子にも述べられているパターン（Shing et al, Science, 259, 1604, (1993)）を含む。ヒト型のこの成長因子のアミノ酸配列はベータセルリンとよばれ、ヒト腺癌細胞系統から得られた核酸配列からも導き出される（Sasada et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 190, 1173, (1993)）。ＢＭＧＦとマウスベータセルリン（５８の同一の残基を有する）とヒトベータセルリン（７２の同一の残基を有する）の間の配列相同性に基づくと、ＢＭＧＦはベータセルリンのウシ型であろう。明らかに、それは同じ分子でない。ウシのチーズ乳清抽出物から単離されたＢＭＧＦは２１〜２５ｋＤａの分子量を有し、これは天然のマウスベータセルリンにおいて報告されている分子量３２ｋＤａよりも実質的に小さいサイズである。
【００１５】
本発明は、ＢＭＧＦの前駆体型およびＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）も、その範囲内に含む。このようなフラグメントは、増強または縮小された成長刺激活性を有する可能性、またはＢＭＧＦの刺激活性に応答する細胞の範囲を拡大または制限する可能性、あるいはそれらの両方の可能性がある。それらは、消化管損傷の予防もしくは修復、または創傷治癒等の領域で有用な可能性があるが、その限りではない。
【００１６】
当業者に周知の方法によって、これらを生成することができる。位置指定突然変異誘発等の（しかし、それに限定されない）遺伝子レベルでの方法、または化
学的修飾等の（しかし、それに限定されない）タンパク質レベルでの方法は、本発明の範囲内である。
【００１７】
本発明のこの態様の好ましい形態では、ＢＭＧＦのフラグメントは、下記のアミノ酸配列 DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHF、または GYAGARCERVDLFY、または DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPK、または RRGHFSRCPK、または QYK、または HYCIK、または GRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFYを含んでもよい。
【００１８】
本発明は、実質的にグリコシル化されていないＢＭＧＦも提供する。たとえば、グリコシル化されたＢＭＧＦを酵素的に脱グリコシル化ステップに供し、脱グリコシル化型を回収することによって、これを調製することができる。非グリコシル化型または部分的に非グリコシル化型のＢＭＧＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、約９〜１４ｋＤａの分子量を有してもよい。
【００１９】
本発明のこの態様のさらなる好ましい形態では、ＢＭＧＦは、ウシ乳汁、ウシ乳汁製品またはウシ乳汁製品抽出物から得られる。さらに好ましくは、ＢＭＧＦは、チーズ乳清から得られ、最も好ましくは、ウシのチーズ乳清抽出物から得られる。
【００２０】
本発明のさらなる態様において、実質的に純粋な形または部分的に純粋な形で、ＢＭＧＦを、ウシ乳汁または乳製品から単離する方法が提供される。好ましくは、ＢＭＧＦは、ウシ乳汁またはウシ乳汁製品から単離される。さらに好ましくは、ＢＭＧＦは、チーズ乳清またはチーズ乳清抽出物から単離され、最も好ましくは、ウシのチーズ乳清またはウシのチーズ乳清抽出物から単離される。グリコシル化型のＢＭＧＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、約２１〜２５ｋＤａの分子量を有していてもよい。ＢＭＧＦは、線維芽細胞および／または上皮細胞、および／または骨芽細胞の増殖を刺激する能力を有してもよい。
【００２１】
本発明のこの態様の好ましい形態では、ＢＭＧＦは下記のようなアミノ酸配列を有してもよい。
DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHFSRCPKQYKHYCIKGRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFY
【００２２】
本発明のこの態様において、実質的に純粋なＢＭＧＦを単離する方法は、乳汁または乳製品または乳製品抽出物を、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーおよび逆相高速液体クロマトグラフィー等の様々なクロマトグラフィー方法または、必要に応じてさらなる精製工程、あるいはそれらの両方に供することを含む。「乳製品」は、チーズ乳清、スキムミルク、酸（カゼイン）、乳清および初乳を含んでもよい。上に略述したクロマトグラフィー工程の前に、乳汁または乳製品をＡＵ６４５５８９号に略述されている工程に供し、乳製品抽出物を得ることが好ましい。ＡＵ６４５５８９号を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本明細書では、「乳製品抽出物」を、オーストラリア特許ＡＵ６４５５８９号に記載の方法によって、乳汁または乳製品から調製された抽出物と定義する。明確にするために、乳製品抽出物の定義は、チーズ乳清抽出物を含む。
【００２３】
各精製ステップから回収され、且つ適当なアッセイ、たとえば、ＡＧ２８０４細胞を使用した放射性受容体アッセイ、または、たとえば、Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３細胞を使用した細胞成長アッセイで生物学的活性を示す試料分画をプールし、次の精製ステップに進めることができる。プールされた分画のそれぞれからの試料を、用量応答分析（a dose response analysis）に供し、それによって、前述のアッセイにおける最大活性の５０％応答を引き出すのに必要な物質の量を推定することができる。この量を「１ユニット」と定義し、この値を、各プール内の物質の量に関する値と共に利用して、精製収率、および本方法の各ステップにおける比活性を算出することができる。実質的に純粋なＢＭＧＦの等質性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、約２１〜２５ｋＤａの１つのバンドとしての泳動Ｎ末端配列分析、質量分析法、またはＥＧＦ受容体への特異的結合、あるいはそれらを組み合わせた方法により、実証することができる。
【００２４】
本発明のこの態様の好ましい形態において、実質的に純粋なＢＭＧＦを単離する方法であって、ウシ乳汁、乳製品または乳製品抽出物を提供するステップと、ウシ乳汁、乳製品または乳製品抽出物を限外濾過に供して第１分画を得るステップと、上記第１分画を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して第２分画を得るステップと、上記第２分画をゲル濾過クロマトグラフィーに供して第３分画を得るステップと、上記第３分画を逆相高速液体クロマトグラフィー（（ＲＰ）ＨＰＬＣ）に供して第４分画を得るステップと、上記第４分画をアフィニティクロマトグラフィーに供して第５分画を得るステップと、上記第５分画を（ＲＰ）ＨＰＬＣに供して第６分画を得るステップと、上記第６分画を（ＲＰ）ＨＰＬＣに供して実質的に純粋なＢＭＧＦを得るステップとを含む方法が提供される。
【００２５】
本発明のこの態様のさらなる好ましい形態において、実質的に純粋なＢＭＧＦを単離する方法であって、ＡＵ６４５５８９号に従って調製された乳製品抽出物を提供するステップと、上記乳製品抽出物を酸性化に供するステップと、上記酸性化された乳製品抽出物を限外濾過に供して第１分画を得るステップと、上記第１分画を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して第２分画を得るステップと、上記第２分画をゲル濾過クロマトグラフィーに供して第３分画を得るステップと、上記第３分画を逆相高速液体クロマトグラフィー（（ＲＰ）ＨＰＬＣ）に供して第４分画を得るステップと、上記第４分画をアフィニティクロマトグラフィーに供して第５分画を得るステップと、上記第５分画を（ＲＰ）ＨＰＬＣに供して第６分画を得るステップと、上記第６分画を（ＲＰ）ＨＰＬＣに供して実質的に純粋なＢＭＧＦを得るステップとを含む方法が提供される。
【００２６】
上記乳汁、乳製品または乳製品抽出物を、さらに、酸性化ステップに供することが好ましい。この酸性化ステップは、限外濾過の前に実施することが好ましい。さらに好ましくは、酸性化はｐＨ２．５で実施する。
【００２７】
上記限外濾過は、好ましくは約５０〜１５０ｋＤａ、さらに好ましくは、約１００ｋＤａの排除限界を有する膜を使用して実施する。
【００２８】
上記陰イオン交換クロマトグラフィーは、アガロースを主成分とする陰イオン交換カラムを使用して実施することが好ましい。
【００２９】
上記限外濾過は、約３ｋＤａ〜７０ｋＤａの範囲の分子量を有するタンパク質を分離するカラムを使用して実施することが好ましい。
【００３０】
上記第１回（ＲＰ）ＨＰＬＣは、Ｃ４マトリックスまたはＣ１８マトリックスを使用して実施することが好ましい。
【００３１】
上記アフィニティクロマトグラフィーは、ヘパリン／アガロースを主成分とするアフィニティカラムを使用して実施することが好ましい。
【００３２】
上記第２回（ＲＰ）ＨＰＬＣは、Ｃ４マトリックスまたはＣ１８マトリックスを使用して実施することが好ましい。
【００３３】
上記第３回（ＲＰ）ＨＰＬＣは、Ｃ４マトリックスまたはＣ１８マトリックスを使用して実施することが好ましい。
【００３４】
出発物質として、ＡＵ６４５５８９号に従って調製された乳製品抽出物を製造する代わりに、ウシ乳汁または乳製品を使用することが可能である。この方法を選択する場合、陰イオン交換クロマトグラフィーステップの前に、予備的精製ステップを使用して、脂肪、固形分および酸性タンパク質を除去することが可能である。
【００３５】
実質的に精製されたＢＭＧＦを、ＢＭＧＦを認識するかまたはＢＭＧＦを結合する、あるいはその両方の働きをするポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生に使用することが可能であり、これは本発明の範囲内にあると考えられる。
【００３６】
したがって、本発明のさらなる態様において、ＢＭＧＦに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が提供される。
【００３７】
ＢＭＧＦのエピトープに対する抗体の産生に使用することが可能な様々な方法が、当技術分野で知られている。ウサギ、マウス、ヤギ等を含むが、それに限定されない様々な宿主動物を、ＢＭＧＦタンパク質で免疫化した後、これらのＢＭＧＦ抗体の産生に使用することが可能である。宿主に応じて、免疫学的応答を高めるためにアジュバントを使用することが可能であり、その例として、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄｓ）（完全および不完全）が挙げられるが、その限りではない。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞系による抗体分子の連続産生を可能にする技術を使用することにより、モノクローナル抗体を調製することが可能である。これらの技術としては、ハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, Nature 256,495 (1975))が挙げられるが、その限りではない。ＢＭＧＦに対する抗体を、たとえば、成長因子に関するスクリーニングアッセイ、およびＢＭＧＦタンパク質のアフィニティ精製で、様々な組織、体液および細胞系におけるＢＭＧＦの成熟型および前駆体型の検出に使用することができる。
【００３８】
本発明のさらなる態様において、ＢＭＧＦまたはＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメントをコードするそのフラグメントを提供する。この核酸はＢＭＧＦの成熟型をコードしてもよく、または前駆体型をコードしてもよい。
【００３９】
好ましくは、上記核酸は、図５に示す配列を有する。
【００４０】
遺伝暗号が縮重しているため、それをコードする他の核酸配列または機能的に等価のアミノ酸配列は、本発明の範囲内に含まれる。ＢＭＧＦヌクレオチド配列のこのような交替は、結果として同じ遺伝子産物または機能的に等価の遺伝子産物を生じる異なるヌクレオチドの置換を含んでもよい。欠失および／または付加を有し、且つ結果として機能的に等価の遺伝子産物を生じる核酸配列も、本発明の範囲内に含まれる。さらに、この遺伝子産物は、機能的に活性な生成物を依然として産生する配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含んでもよい。
【００４１】
本発明のさらなる態様において、ＢＭＧＦまたはＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメントをコードするそのフラグメントを単離する方法を提供する。この核酸は、ＢＭＧＦの成熟型をコードしてもよく、または前駆体型をコードしてもよい。
【００４２】
ＢＭＧＦをコードする核酸は、ＢＭＧＦ活性を産生する細胞源から得ることが可能である。たとえば、核酸源として腎細胞を使用してもよい。ＢＭＧＦをコードする核酸は、ＢＭＧＦのｍＲＮＡを相補的ｃＤＮＡに逆転写し、次に、成熟タンパク質または前駆体タンパク質の一部、好ましくはＮ末端部分およびＣ末端部分をコードする核酸配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得ることが好ましい。好ましくは、上記オリゴヌクレオチドプライマーは、下記の配列
5' ATC TAG GTT ACC ATG GAT GGG AAT TCA ACC AGA 3' 5' ATC TAG GTT ACC GGC GAT GGG AAT TCA ACC AGA 3' 5' CTA GAT AAG CTT TCA TCA GTA AAA CAA GTC AAC TCT 3'またはこれらと実質的に相同の配列を有する。
【００４３】
上記オリゴヌクレオチドプライマーは、核酸の指向性のクローニングを容易にするために、制限酵素部位を含むことが好ましい。
【００４４】
さらに好ましくは、上記プライマーは下記のヌクレオチド配列を含む。 5' GGG AAT TCA ACC AGA 3' 5' GTA AAA CAA GTC AAC TCT 3'
【００４５】
最も好ましくは、上記プライマーは、 5' GGG AAT TCA ACC AGA AGT CCT GAA 3' 5' GTA AAA CAA GTC AAC TCT CTC ACA CCT 3'である。
【００４６】
したがって、本発明のこの態様の好ましい形態において、ＢＭＧＦ、またはＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメントをコードするそのフラグメントを単離する方法であって、ＢＭＧＦ活性を有する細胞供与源を提供するステップと、この細胞を処理して、それからｍＲＮＡを得るステップと、このようにして得られたｍＲＮＡを処理して、それからｃＤＮＡを生成するステップと、このようにして得られたｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲによって増幅して、核酸を生成するステップとを含む方法を提供する。
【００４７】
存在するタンパク質をコードする核酸を得るための、当業者に周知の他の方法および、ＢＭＧＦの成熟型または前駆型をコードする核酸を得るためのこれらの方法の使用も本発明の範囲に含まれる。これらの方法は、ＢＭＧＦの成熟型および／または前駆体型の核酸配列またはアミノ酸配列の知見から核酸を化学的に合成するか、あるいは、ＢＭＧＦの成熟型または前駆体型、あるいはそれらの両方の一部もしくは全部をコードするヌクレオチド配列に相同の同位元素標識核酸配列または非同位元素標識核酸配列を用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー、あるいはそれらの両方をスクリーニングするか、好ましくは、ウシライブラリーをスクリーニングするかの、いずれかを含む（が、これに限定されない）。
【００４８】
当業者に周知の、組換えＤＮＡテクノロジーの標準技術を使用して、ＢＭＧＦの成熟型または前駆体型をコードする核酸を適当なベクター、たとえば発現ベク
ターにクローニングすることができる。
【００４９】
したがって本発明のさらなる態様において、ＢＭＧＦをコードする核酸、またはＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメントをコードする核酸を含むベクターが提供される。
【００５０】
この核酸はＢＭＧＦの成熟型をコードしてもよく、または前駆体型をコードしてもよい。
【００５１】
上記核酸はウシＢＭＧＦをコードすることが好ましい。さらに好ましくは、この核酸は図５に示す配列を有する。
【００５２】
多数のベクター宿主系が利用可能であり、その例としてｐＢＲ３２２またはｐＵＣ誘導体等のプラスミド、あるいはλ誘導体等のバクテリオファージが挙げられる（が、これに限定されない）。
【００５３】
本発明のベクターを使用して、宿主細胞において組換え型ＢＭＧＦを発現させることが可能である。
【００５４】
したがって本発明のさらなる態様において、組換え型ＢＭＧＦが提供される。
【００５５】
組換え型ＢＭＧＦは実質的に純粋な形であってもよく、部分的に純粋な形であってもよい。組換え型ＢＭＧＦは、好ましくは少なくとも約７０％純粋であり、さらに好ましくは少なくとも約９０％純粋であり、最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。この組換え型ＢＭＧＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、非グリコシル化で約９ｋＤａの分子量を有してもよい。この組換え型ＢＭＧＦは、線維芽細胞および／または上皮細胞、および／または骨芽細胞の増殖を刺激する能力を有してもよい。
【００５６】
本発明のこの態様の好ましい形態において、上記組換え型ＢＭＧＦは、下記のようなアミノ酸配列を有してもよい。
DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHFSRCPKQYKHYCIKGRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFY
【００５７】
本発明は、組換え型ＢＭＧＦの前駆体型および組換え型ＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）も、その範囲内に含む。
【００５８】
本発明のこの態様の好ましい形態において、ＢＭＧＦの上記フラグメントは、下記のアミノ酸配列 DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHF、または GYAGARCERVDLFY、または DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPK、または RRGHFSRCPK、または QYK、または HYCIK、または GRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFY、またはこれに実質的に相同の配列を含んでもよい。
【００５９】
本発明は、組換え型ＢＭＧＦを産生する方法であって、ＢＭＧＦ、ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメントをコードするそのフラグメントを含むベクター、および宿主細胞を提供するステップと、上記ベクターを上記宿主細胞に導入するステップと、上記組換え型ＢＭＧＦを発現させるステップと、上記組換え型ＢＭＧＦを単離するステップとを含む方法も提供する。
【００６０】
上記ベクターを、形質転換、形質導入、高電圧パルス法および感染等（これに限定されない）の方法によって、宿主細胞に導入することが可能である。宿主細胞としては、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞等の細菌が挙げられるが、これに限定されない。
【００６１】
この組換え型ＢＭＧＦを、融合タンパク質として発現させることが可能である。本発明のこの態様に従って形成される融合タンパク質は、宿主細胞内の封入体として単離することが可能である。
【００６２】
このようにして形成された組換え型ＢＭＧＦを、好ましくは宿主細胞の破壊後に、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーおよび／または、必要に応じてさらなる精製工程等の技術を使用した、当業者に周知の従来のポリペプチド精製方法によって単離できることは理解されるであろう。この組換え型ＢＭＧＦは、当業者に周知の従来の方法を使用して融合タンパク質として単離することもでき、その融合パートナーから切断することもできる。
【００６３】
本発明のこの態様の好ましい形態において、本出願者に付与されたオーストラリア特許第６３３０９９号（その全開示内容を引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に従って、ブタ成長ホルモンの一部が任意に切断可能な配列を介して、ＢＭＧＦのＮ末端配列に連結された融合タンパク質として、上記組換え型ＢＭＧＦを調製することが可能である。
【００６４】
天然由来の成熟型または前駆体型のＢＭＧＦ、およびその融合パートナーを含むまたは含まない成熟型または前駆体型のいずれかとして単離される組換え型ＢＭＧＦタンパク質を含む本発明のＢＭＧＦ（およびその突然変異体、類似体、フラグメントおよび誘導体）を、単独でまたは他の因子（たとえば、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１類似体（これに限定されない））と組み合せて、あるいは、たとえば、胎仔血清の補足物として、in vitroにおける、哺乳類細胞あるいはより組織化された構造、たとえば、皮膚の成長または増殖あるいはそれらの両方に、単独でまたは他の因子と組み合せて、創傷治癒または組織修復、あるいはそれらの両方の増進、たとえば、表面創傷の治療に、単独でまたは他の因子と組み合せて、炎症性腸疾患および粘膜免疫性等の、消化管バリア機能障害関連の病気の予防、緩和または治療に、乳児用調合乳の補足物として、歯周病の予防、治療または
緩和に、美容上の用途に使用することが可能である。
【００６５】
したがって本発明は、哺乳類の細胞および組織の成長または増殖、あるいはそれらの両方を促進するための組成物であって、培地、好ましくは規定された培地と共に、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を含有する組成物を提供する。
【００６６】
本発明は、哺乳類の細胞および組織の成長または増殖、あるいはそれらの両方を促進するための方法であって、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を含有する培地中で、上記細胞または組織を成長させることを含む方法も提供する。
【００６７】
「有効量」という言葉は、ここでは統計上有意な反応を９５％信用できるレベルで誘発するのに十分な量を意味するＢＭＧＦを用いる方法において用いられる（p<0.05となるのは、その効果が偶然のみによる場合である）。
【００６８】
本発明のさらなる態様において、哺乳類の細胞および組織の成長または増殖、あるいはそれらの両方を促進するための方法であって、相乗的に応答をするＩＧＦの有効量とともに、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を含有する培地中で、上記細胞または組織を成長させることを含む方法も提供する。
【００６９】
本発明のさらなる様態において培地に含まれるＩＧＦまたはインシュリン様成長因子は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２または、本出願者に付与されたオーストラリア特許第６３３０９９号に述べられているＬＲ3ＩＧＦ−１のような機能的に活性なＩＧＦの突然変異体、または類似体であってもよい。
【００７０】
本発明のさらなる態様において、表面創傷を治療するための組成物であって、薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体と共に、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を含有する組成物が提供される。
【００７１】
本発明は、創傷治癒または組織修復、あるいはそれらの両方を増進するための方法であって、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む方法も提供する。
【００７２】
治療することが可能な創傷のタイプに制限はなく、この例としては、表面潰瘍（たとえば、圧迫性潰瘍、静脈鬱滞性潰瘍、糖尿病性潰瘍および粥腫性潰瘍）、火傷または偶発性創傷（裂傷および切り傷等）ならびに胃および腸（大腸および小腸）等の上皮で覆われた器官に対する創傷、ならびに目の角膜損傷等が挙げられる（が、それに限定されない）。創傷部位へのＢＭＧＦの適用は、粉末、ゲル、軟膏または包帯の形であってもよく、ＢＭＧＦを組み込んだ他の創傷用包帯であってもよい。ＢＭＧＦは、単独または他の成長因子を含む混合物のいずれで創傷に塗布してもよく、他の成分、たとえば、アジュバント、担体および可溶化剤と併用してもよい。組成物中のＢＭＧＦの濃度は重要ではないが、細胞増殖、特に上皮細胞増殖を惹起するのに十分でなければならない。
【００７３】
消化管は腸内腔に存在する潜在的に有害な物質により絶えず攻撃されているため、その後の正常な粘膜バリアのメンテナンスが、成人および乳幼児の生命に極めて重大である。バリア機能は、たとえば高投与量化学療法、感染および外傷の間に起こるような上皮表面への損傷によって損なわれる可能性がある。さらに、通常の抗原および管腔の抗原に感作した後に発生する炎症誘発性応答は、上皮損傷および高い浸透性につながる。この免疫機能保全は、脂肪便症および炎症性腸疾患を含む疾患の病因において重要な役割を果たすと考えられる。ＢＭＧＦの上皮細胞刺激活性を考えると、本発明のさらなる用途は、単独で、または、他の成長因子と組み合せのいずれかで、好ましくは溶腸性製剤として炎症性腸疾患および粘膜免疫性等の消化管機能障害関連の病気を治療、緩和または予防することである。
【００７４】
したがって本発明のさらなる態様において、消化管機能障害関連の病気を治療、緩和または予防するための組成物であって、薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体と共に、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を含有する組成物が提供される。
【００７５】
本発明は、消化管機能障害関連の病気を予防、緩和または治療するための方法であって、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む方法も提供する。
【００７６】
本発明は、歯周病を予防または治療するための方法であって、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む方法も提供する。
【００７７】
美容上の用途におけるＢＭＧＦの使用であって、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）の有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む使用も提供する。
【００７８】
本発明は、栄養成分と共に、ＢＭＧＦ、あるいはＢＭＧＦの突然変異体、類似体および誘導体、ＢＭＧＦの前駆体型および融合タンパク質型ならびにＢＭＧＦの機能的に活性なフラグメント（ペプチド）を含む、乳児用調合物も提供する。
好ましくは、この乳児用調合物は調合乳である。
【００７９】
本明細書の説明および請求項を通して、語「含む（comprise）」およびその語の変形、たとえば「含んでいる（comprising）」や「含む（comprises）」は、他の添加物、成分、整数またはステップを排除するものではない。
【００８０】
次に、添付の実施例および図面を参照しながら、本発明をさらに完全に説明する。しかし、以下の説明は例示に過ぎず、いかなる形でも、上記の本発明の一般性に対する制限としてとらえてはならないことを理解すべきである。
【実施例】
【００８１】
［実施例１ ウシのチーズ乳清抽出物からのＢＭＧＦの単離］
［ステップ１ 限外濾過サイズ排除］
６Ｌのウシのチーズ乳清抽出物（ＡＵ６４５５８９号に略述されているものに従って調製されたＧＦＥ−２）（タンパク質濃度＝４０ｍｇ/ｍｌ）を、ＨＣｌでｐＨ２．５に酸性化し、次いで、Sartorius Sarton II クロスフロー（crossflow）濾過ユニット（Sartorius社製, Gottingen, Germany)に取り付けられた１００ｋＤａのポリスルホネート排除膜を通過させてマイクロフィルトレーションした。このステップで得られた透過物を、０．１μｍの中空線維カートリッジを備えたAmicon DC-10限外濾過ユニット（Amicon社製, Danvers, MA）を使用して、ダイアフィルトレーションし、次いで、同じユニットを使用して、３ｋＤａの三酢酸セルロース膜を通過させて約１．８Ｌに濃縮した。
【００８２】
［ステップ２ 陰イオン交換クロマトグラフィー］
脱塩して濃縮した透過物を、固体Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅで２０ｍMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）とし、５ＭのＨＣｌでｐＨを７．５に調整し、１μｍの膜を通過させて濾過し、ＦＰＬＣシステム（Pharmacia社製, Sweden）に取り付けられたＱ−セファロースカラム（５×１５ｃｍ、Pharmacia社製, Sweden）に、流速５ｍｌ／分で適用した。次いで、このカラムを２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで洗浄し、カラムに結合したままのタンパク質（ＢＭＧＦを含む）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌに溶解した０〜０．６ＭのＮａＣｌの線形塩勾配（linear salt gradient）２．１Ｌにより、流速５ｍｌ／分にて溶離した。３０ｍｌの分画を回収し、ＢＭＧＦ活性について分析した（図１）。活性を、表皮成長因子（ＥＧＦ）受容体結合活性として測定した。ＢＭＧＦを含有する分画をプールし、次いで、Ｈ2Ｏ（２×２０Ｌ）に対して１６時間透析し、凍結乾燥させた。
【００８３】
［ＥＧＦ受容体結合アッセイ］
ＡＧ２８０４芽細胞上に存在する特異的ＥＧＦ受容体に結合する［125Ｉ］−ｒｈＥＧＦに関する競合によって、ＢＭＧＦを測定した。簡単に記載すると、２４ウェルプレートの１０％のＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中で、ＡＧ２８０４細胞を７０〜８０％密集まで成長させた。この細胞を結合緩衝液（１００ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、８ｍＭのグルコース、０．１％のＢＳＡ）で２回洗浄し、次いで、カラム分画および［125Ｉ］−ｒｈＥＧＦ（１００００ｃｐｍ）と共に、結合緩衝液中で、４℃にて１８時間インキュベートした。この段階の終わりに、細胞をＨａｎｋｓ緩衝食塩水（ＨＢＳＳ）で３回洗浄し、１ｍｌの０．５ＭのＮａＯＨ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で、室温にて３０分間溶解した。細胞溶解物の放射能をガンマカウンターで測定した。カラム分画の代わりに結合緩衝液を加えることにより、総結合量を測定した。試料の代わりに、過剰の（１００ｎｇ）非標識ｒｈＥＧＦを加えることにより、非特異的結合を測定したところ、通常、総結合量の約５％であった。アッセイにおいて、非標識ｒｈＥＧＦの量を増加させて（０．２〜１００ｎｇ）使用することにより、ＥＧＦ競合用の標準曲線を得た。
【００８４】
［ステップ３ ゲル濾過クロマトグラフィー］
上記ステップからの凍結乾燥したＢＭＧＦプールを、１５ｍｌの１５０ｍＭのＮａＣｌ、１Ｍの氷酢酸、および１０％（ｖ/ｖ）のＣＨ3ＣＮで再構成し、０．２２μｍの膜を通過させて濾過し、ＦＰＬＣに取り付けられたSuperdex-75 35/600（３．５×６０ｃｍ、Amersham Pharmacia Biotech社製, Sydney, Australia）カラムに、流速３．５ｍｌ／分で適用する。１７．５ｍｌの分画を回収し、ＢＭＧＦ活性について分析する（図１）。
【００８５】
［ステップ４ Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ］
ＢＭＧＦ活性を含有する分画をプールし、０．１％のＴＦＡで１：４に希釈し、０．１％のＴＡＦで平衡化したＤｅｌｔａ−Ｐａｃｋ Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（１５μｍ、３００Å、２５×１００ｍｍ、Millipore-Waters社製, Lane Cove, New South Wales, Australia)に適用する。このカラムを０．１％のＴＦＡで徹底的に洗浄し、次いで結合タンパク質を、０〜８０％のＣＨ3ＣＮの線形勾配および０．０８％のＴＦＡで流速５ｍｌ／分にて８０分にわたって溶離する。１０ｍｌの分画を回収し、ＢＭＧＦ活性を含有する分画（図１）をプールして凍結乾燥させる。
【００８６】
［ステップ５ アフィニティクロマトグラフィー］
上記ステップからの凍結乾燥したプールを、２０ｍｌの２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で再構成し、ＦＰＬＣに取り付けられた５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ヘパリン−セファロースアフィニティカラム（Amersham Pharmacia Biotech社製, Sydney, Australia）に流速０．５ｍｌ／分にて適用する。Ｏ．Ｄ．280nmがベースラインに戻るまで、このカラムを２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄し、次いで結合タンパク質を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した０〜１MのＮａＣｌの線形塩勾配７５ｍｌで溶離する。１ｍｌの分画を回収し、ＢＭＧＦ活性を含有するものをプールする。
【００８７】
［ステップ６ Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ＃１］
ヘパリン−セファロースプールを１０％のプロパノール、０．１３％のＨＦＢＡで１：４に希釈し、Nova-Pack C18 RP-HPLCカラム（４μｍ、６０Å、８×１００ｍｍ、Millipore-Waters社製, Lane Cove, New South Wales, Australia)に、１ｍｌ／分の流速で適用する。このカラムを１０％のプロパノール、０．１３％のＨＦＢＡで洗浄し、結合したタンパク質を１０分間にわたり１０〜２４％のプロパノール、０．１３％のＨＦＢＡ、次いで、１６０分間にわたり２４〜４０％のプロパノール、０．１３％のＨＦＢＡという２段階勾配で溶離する。１ｍｌ分画を回収し、ＢＭＧＦ活性に関して分析する（図１）。
【００８８】
［ステップ７ Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ＃２］
上記ステップからのＢＭＧＦ活性を含有する分画をプールし、０．１％のＴＦＡで１：３に希釈し、上と同じカラムに１ｍｌ／分の流速で適用する。このカラムを０．１％のＴＦＡで洗浄し、結合したタンパク質を１０分間にわたり０〜１０％のＣＨ3ＣＮ、次いで２５０分間にわたり１０〜３５％のＣＨ3ＣＮという２段階勾配で１ｍｌ／分の流速にて溶離する（図１）。２ｍｌ分画を回収し、ＢＭＧＦ活性について分析する。ＢＭＧＦ活性を含有する分画をプールし、必要な時まで−２０℃で保存する。
【００８９】
精製の結果の概要を表１に示す。上記ＢＭＧＦは、最高９９％（９９％を含む）純粋で、且つ約２１〜２５ｋＤａの分子量を有する形態で、最後のＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣステップからの活性分画に存在する。これらの基準は、Pharmacia Phast システム（図２参照）を用いて実行した、銀染色された８〜２５％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＮ末端配列分析から推定される。
【００９０】
【表１】
【００９１】
［実施例２ ＢＭＧＦのＮ末端配列分析およびペプチド配列分析］
ウシＢＭＧＦおよびエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ消化により生成したペプチドフラグメントのアミノ酸配列を、Hewlett-Packard G1000Aタンパク質シークエンサーを使用して決定した。２０μｇの精製ＢＭＧＦを、変性緩衝液（６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ-Ｃｌ（ｐＨ８．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ）４００μｌに溶解した１００μｌの４ｍＭのＤＴＴにより、暗所で室温にて３０分間還元した。変性緩衝液中に２００μＣｉのヨード［２−3Ｈ］酢酸を含有する１μｍｏｌのヨード酢酸を加え、上述の通りにインキュベートすることにより、変性し、還元されたＢＭＧＦをＳ−カルボキシメチル化した。次に、変性緩衝液に溶解したヨード酢酸１６μｍｏｌを加え、インキュベーションをさらに１５分間続けた。５μｌのＴＦＡを加えることにより反応を停止させ、［3Ｈ］カルボキシメチル化したＢＭＧＦをＲＰ−ＨＰＬＣで回収した。［3Ｈ］カルボキシメチル化ＢＭＧＦを真空下で乾燥させ、Ｎ末端から配列決定するか、あるいは１００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中、３７℃にて１６時間、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（０．５μｇ、Promega）で消化した。５μｌのＴＦＡを加えることにより反応を停止させ、このようにして得られたペプチドフラグメントを、C18 RP-HPLCカラム（２．１×３０ｍｍ、Bownlee Lab製, Santa Clara, CA）で、７０分間にわたり、０．２５ｍｌ／分の流速で０〜５０％のＣＨ3ＣＮおよび０．０８％のＴＦＡの線形勾配を使用して分離した。ペプチド含有分画を真空下で乾燥させ、配列を決定した（図３）。
【００９２】
［実施例３ ＢＭＧＦの脱グリコシル化］
１．５ｍｌポリプロピレン微量遠沈管内で、１０μｇの純粋なＢＭＧＦを乾燥させ、１６μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に再懸濁し、０．２ユニットのα２−３，６−ノイラミニダーゼ（ＮＡＮａｓｅ II）および０．００２ユニットのエンド−α−アセチルガラクトサミニダーゼ（Ｏ−グリコシダーゼ ＤＳ）（BioRad製, Richmond, California）を加え、この反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、５００ｍＭリン酸ナトリウム（２塩基）で反応体積を４０μｌに増やし、２．５μｌの２％ＳＤＳおよび１Ｍのβ−メルカプトエタノールを加えた。次いで、反応混合物を９５℃に５分間加熱し、氷上に置き、次いで２．５μｌのＮｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０および０．００５ユニットのＰｅｐｔｉｄｅ−Ｎ4（アセチル−β−グルコサミニル）−アスパラギンアミニダーゼ（ＰＭＧａｓｅ Ｆ）（BioRad, Richmond, California）を加え、３７℃で３時間インキュベートした。次いで、反応混合物を真空下で乾燥させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元緩衝液に再懸濁し、１０〜２０％のＴｒｉｃｉｎｅゲル（Novex）で実行した（図４）。
【００９３】
［実施例４ ＢＭＧＦの成熟型のクローニング］
ＢＭＧＦのＮ末端アミノ酸配列およびＣ末端アミノ酸配列（実施例２参照）に相当する２つのオリゴヌクレオチドプライマー（下記参照）を化学的に合成し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による、ウシＢＭＧＦの完全成熟型をコードするヌクレオチド配列の増幅に使用した。
プライマー１ 5' GAT GGG AAT TCA ACC AGA AGT CCT GAA 3'
プライマー２ 5' GTA AAA CAA GTC AAC TCT CTC ACA CCT 3'
【００９４】
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Qiagen社製, Clifton Hill, Victoria, Australia）を使用して、８０〜９０％密集Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎細胞（ＭＤＢＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２２）から全ＲＮＡを単離した。オリゴｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII（Life Technologies社製, Melbourne, Australia）を使用して、１μｇの全ＭＤＢＫ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。上記プライマーと共に、次のｃＤＮＡをＰＣＲ用の鋳型として使用した。５０μｌの６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＳＯ4、１８ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．５ｍＭのＭｇＳＯ4（ｐＨ９．１）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、各プライマー２００ｎｇ、１ＵのｅＬＯＮＧａｓｅ（Life Technologies社製, Melbourne, Australia）および１μｌのｃＤＮＡで、ＰＣＲを実施した。最初に９４℃で３分間インキュベートした後、９４℃で１分、５０℃で１分、および６８℃で１分、続いて最後に６８℃で３分延長し、３０サイクルの増幅を実施した。
【００９５】
２％のアガロースゲルによる電気泳動でＰＣＲ反応を分析した。２４０ｂｐの生成物ゲルから切り取り、Promega PCR Preps Purificationキットを使用して精製した。製造業者の説明書に従って、精製したＰＣＲ生成物を、ベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に平滑末端連結した。ＢＭＧＦベクター構築物をE. coli TOP 10（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレートで選択した。Amplicycle シークエンシングキット（Perkin-Elmer社製）ならびに普遍Ｍ１３前進プライマー（−４０）および逆プライマーを使用して、ジデオキシ鎖終結法（Sanger et al., Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463, (1977)）により、成熟ＢＭＧＦの完全ヌクレオチド配列（図５参照）を決定した。
【００９６】
［実施例５ Ｅ． ｃｏｌｉのＢＭＧＦ ｃＤＮＡ発現プラスミドの構築］
発現ベクター構築のための成熟ＢＭＧＦ［Asp1-Tyr80］の全８０アミノ酸をコードするＤＮＡを得るために、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Qiagen社製, Clifton Hill, Victoria, Australia）を使用して、８０〜９０％密集Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎細胞（ＭＤＢＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２２）から全ＲＮＡを単離した。オリゴｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔII（Life Technologies, Melbourne, Australia）を使用して、１μｇの全ＭＤＢＫ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。以下に示すプライマーと共に、次のｃＤＮＡをＰＣＲ用の鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は上述と同じであった。
【００９７】
【表２】
【００９８】
【表３】
【００９９】
２％のアガロースゲルによる電気泳動でＰＣＲ反応を分析した。２７３ｂｐの生成物をゲルから切り取り、Promega PCR Preps Purificationキットを使用して精製した。精製したＰＣＲ生成物およびプラスミドｐ［Ｍｅｔ1］−ｐＧＨ（１〜４６）を、制限酵素Ｈｐａ ＩおよびＨｉｎｄ III（New England Biolbs）で消化し、消化したＰＣＲ生成物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、リニアにしたｐ［Ｍｅｔ1］−ｐＧＨ（１〜４６）に連結した（図６）。ｐ［Ｍｅｔ1］−ｐＧＨ（１〜４６）は、強力なｔｒｃプロモーターの下流にあるメチオニル・ブタ成長ホルモンの最初の４６アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクターである（GroPep Pty Ltdが所有し、特許権を得ている）。ベクター構築物をE. coli JM101 (lacq）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレートで選択した。
【０１００】
［実施例６ Ｅ． ｃｏｌｉ形質転換体により生成されるオーセンティックＢＭＧＦの精製］
プラスミド［Ｍｅｔ1］−ｐＧＨ（１〜４６）−Ｍｅｔ−ＢＭＧＦを含むE. coli JM101菌株を単一コロニーとして選択し、６０ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、３３ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、７．５ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．７ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０μＭのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、０．２％のＤ−グルコース、０．０００５％のチアミンおよび５０μｇ／ｍｌのアンピシリンから成るスターター培養２０ｍｌの接種に使用した。この培養を３７℃で１６時間成長させた。次いで、スターター培養を使用して、各３Ｌの成長培地（３０ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、７ｍＭのＫ2ＳＯ4、１２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１９ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１３９ｍＭのＤ−グルコース、２．４ｍＭのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、０．０００４％のチアミン、０．０３５ｍＭのＦｅ（II）ＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、０．００７4ｍＭのＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０００８ｍＭのＣｕＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０７4ｍＭのクエン酸三ナトリウム、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（ｐＨ６．９））が入っている２つの５Ｌ発酵槽（Ａｐｐｌｉｃｏｎ）を接種した。６００ｎｍにおける吸光度のＯ．Ｄ．が４．０に達するまで細菌を３７℃で成長させ、次いで、０．３３ｍＭのＩＰＧＴで誘導し、グルコースが、ｐＨの急な上昇によって示される限界値になるまで培養を続けた。温度、ｐＨおよび酸素の制御は、自動管理下にあった（ＦＣ４データシステム、Real Time Engineering）。Ｒａｎｎｉｅホモジナイザーを５回通過させた後、５０００p.s.iで細胞を破壊し、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２５分、４℃）で封入体を回収した。６０００ｒｐｍにおける遠心分離により、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、０．５ｍＭのＺｎＣｌ2で、この封入体を２回洗浄し、−８０℃で保存した。
【０１０１】
２０ｇのバッチ内で、洗浄した封入体を解凍し、８Ｍの尿素、０．１ＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭのグリシン、４０ｍＭのジチオトレイトール、および０
．５ｍＭのＺｎＣｌ2（ｐＨ９．０）に１０％（ｗ/ｖ）で懸濁し、室温で３０分間攪拌した。可溶化した封入体を１４０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、結果として得られた上清を、Cellufine GCL-1000を詰めて、２ｍｌ／分の流速にて、８Ｍの尿素、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭのグリシン、１．６ｍＭのジチオトレイトールおよび０．５ｍＭのＺｎＣｌ2（ｐＨ９．０）で平衡化したPharmacia-LKB XXカラムで、脱塩した。３０ｍｌ分画を回収し、組換え型［Ｍｅｔ1］−ｐＧＨ（１〜４６）−Ｍｅｔ−ＢＭＧＦ融合タンパク質を含有する分画をプールし、このプールを、４Ｍの尿素、４０ｍＭのグリシン、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．４ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭの２−ヒドロキシエチルジスルフィド、ｐＨ９．０中に、最終タンパク質濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるように希釈することにより、酸化的再生に供する。室温で３時間攪拌した後、ＨＣｌでｐＨを６．４５に調整することにより、反応を停止させた。
【０１０２】
次に、再生した融合タンパクを、１５ｍｌ／分の流速にて８Ｍの尿素、５０ｍMの酢酸アンモニウム（ｐH６．４５）で平衡化したSepharose Fast Flow S (Amersham Pharmacia Biotech, Sydney, Australia）１００ｍｌを詰めた、Pharmacia-LKB XK50カラムに充填した。ＯＤ280nmがベースラインに戻るまで、このカラムを上記緩衝液で洗浄した。次いで、このカラムを、同じ緩衝液に溶解した０〜０．７ＭのＮａＣｌの線形塩勾配で、１５ｍｌ／分の流速にて溶離した。３０ｍｌ分画を回収し、融合タンパク質を含む分画をプールした。
【０１０３】
この融合タンパク質のプールを脱塩し、C4 Prep-Pakカラム（４０ｍｍ×１００ｍｍ；３００Å、１５μｍ；Millipore-Waters社製, Lane Cove, New South Wales, Australia）を用いた逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーでさらに精製した。このタンパク質プールをＴＦＡが０．１％になるように調整し、５０ｍｌ／分にてＣ４カラムに充填した。このカラムを０．１％のＴＦＡで徹底的に洗浄し、０．０８％のＴＦＡの存在下、１８〜５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの勾配で、２０ｍｌ／分の流速にて、９０分にわたってタンパク質を溶離した。３０ｍｌの分画を回収し、プールされた融合タンパク質を含有する分画を凍結乾燥した。
【０１０４】
融合タンパク質プールをマイクロボア逆相ＨＰＬＣ（２．１ｍｍ×１００ｍｍ、Brownlee Lab製, Santa Clara, Ca）で分析して、１つのタンパク質ピークが同定された（図７Ｂ）。ＢＭＧＦ調製物の純度をＮ末端配列分析でさらに確認すると、予期されるＢＭＧＦに関する末端配列を与え、おおよその純度は９９％以上であった。還元条件下もしくは非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、予期された１４．５ｋＤａの単一タンパク質も検出された（図７Ｂ、挿入図）。
【０１０５】
オーセンティックＢＭＧＦを生成するために、１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にて、１００倍モル過剰な臭化シアンを含有する０．１３ＭのＨＣｌに凍結乾燥タンパク質を可溶化することにより、融合タンパク質を切断した。この切断反応を、暗所にて室温で、２５時間実施した。切断後、１ＭのＮａＣｌでカラムからバッチ状にタンパク質を溶離したこと以外は上述の通りに、イオン交換クロマトグラフィーで反応混合物から臭化シアンを除去した。
【０１０６】
オーセンティックＢＭＧＦを融合パートナーから逆相ＨＰＬＣで分離した。Ｓ−セファロースタンパク質プールを０．１％のＴＦＡで１：４（ｖ／ｖ）に希釈し、５０ｍｌ／分の流速にて、C4 Prep-Pakカラム（２５ｍｍ×１００ｍｍ；３００Å、１５μｍ；Millipore-Waters社製, Lane Cove, New South Wales, Australia）に適用した。ＯＤ280nmがベースラインに戻るまで、このカラムを０．１％のＴＦＡで徹底的に洗浄し、次いで、０．０８％のＴＦＡの存在下、１６〜３２％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの勾配で、２０ｍｌ／分の流速にて１５０分にわたって、このカラムを溶離した。２６ｍｌの分画を回収し、純粋なＢＭＧＦを含有する分画をプールした。
【０１０７】
最終ＢＭＧＦタンパク質プールのマイクロボアＣ４逆相ＨＰＬＣ（２．１ｍｍ×１００ｍｍ）による分析で、１つのタンパク質ピークが同定された。ＢＭＧＦ調製品の純度をさらに確認した。ＢＭＧＦ調製物の純度をＮ末端配列分析でさらに確認すると、予期されるＢＭＧＦに関する末端配列を与え、おおよその純度は９９％以上であった。エレクトロスプレーイオン化質量分析法により決定された組換え型ＢＭＧＦの分子量は８９９５．１±０．８３であった。これは、ＢＭＧＦアミノ酸配列から算出した理論上の分子量８９９５．０２と一致する。還元条件または非還元条件で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、約９ｋＤａの１つのタンパク質ピークが検出された（図７Ａ、挿入図）。
【０１０８】
［実施例７ ＢＭＧＦの分裂促進活性］
一連の細胞系のオーセンティックＢＭＧＦおよび組換え型ＢＭＧＦの分裂促進活性をメチレンブルー細胞増殖アッセイで測定した。細胞系を９６ウェルプレートで、１０〜２０×１０4細胞／ｍｌの密度で継代培養し、５％のＣＯ2下３７℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをＤＭＥＭで徹底的に洗浄して残留培地を除去し、その後天然ＢＭＧＦまたは組換え型ＢＭＧＦを様々な濃度で加えた（図８参照）。一部の細胞系では、ＢＭＧＦと５０ｎｇ／ｍｌのＬＲ3ＩＧＦ−１との共インキュベーションの影響を試験した。４８時間インキュベーション後、０．１５ＭのＮａＣｌでプレートを２回洗浄し、細胞の単層を固定し、１％メチレンブルーを加えて６００ｎｍにおける吸光度を測定することにより、細胞質量を定量した。ウシのチーズ乳清抽出物から単離されたＢＭＧＦも、組換えによって生成したＢＭＧＦも、Ｂａｌｂ/ｃ ３Ｔ３細胞において、同等の効力であった。ＢＭＧＦは、上皮細胞、線維芽細胞および骨芽細胞を含む広範囲の細胞系を刺激した。この例としては、Ｂａｌｂ/ｃ ３Ｔ３細胞、ＨａＣａＴ細胞、ＩＥＣ−６細胞、ＳＦ３１６９細胞、Ｍｖ１Ｌｕ細胞およびＣａｌＯｓｔ細胞などが挙げられる。場合によっては、たとえば、消化管上皮細胞系ＩＥＣ−６では、ＢＭＧＦがＬＲ3ＩＧＦ−１と相乗的に作用した。
【０１０９】
［実施例８ 消化管成長に対するＢＭＧＦの作用］
媒体（０．１Ｍの酢酸）またはＢＭＧＦ（５００μｇ／ｋｇ／日）が入っている浸透圧ミニポンプを、オスのSprague Dawleyラット（投与群当たり８匹）の肩甲骨上領域の皮下に移植し、そのラットを、Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ代謝ケージ内で、２５℃、１２時間、明／暗周期に維持した環境で、７日間飼育した。動物は、水および高炭水化物飼料を絶えず入手できた。７日後、ラットをＣＯ2過剰投与により屠殺し、総消化管重量を測定した。体重ｋｇ当たりの総消化管重量は、７日後、ＢＭＧＦ投与ラットで２５％高かった（図９）。
【０１１０】
［実施例９ クリーム（Ｏ/Ｗタイプ）
成分 ％
ソルビタンモノステアレート ２．０
ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート ３．０
セチルアルコール ５．０
軽流動パラフィン ８．０
ミリスチン酸イソプロピル ２．０
有効物質ＢＭＧＦ １．０−１０-5
プロピレングリコール ２．０
グリセリン ２．０
脱イオン水 ７６
保存料およびその他の安定剤（適量）
【０１１１】
水性相を５５〜６０℃に加熱し、有効物質をその中に溶解し、勢いよく攪拌することにより、融解した脂質相をその中に分散させる。室温に冷却し、均質化させる。同様の方式で、それぞれ０．４μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌを含有するクリームを製造することができる。このクリーム１００μｌ／ｃｍ2創傷を塗布する。
【０１１２】
［実施例１０ 軟膏（Ｗ／Ｏタイプ）］
成分 ％
ソルビタントリオリエート ５．０
ワックス（微晶質） ３．０
軽流動パラフィン ９．０
ミリスチン酸イソプロピル １０．０
ラノリンアルコール ３．０
有効物質ＢＭＧＦ １．０-１０−５
プロピレングリコール ２．０
グリセリン ２．０
硫酸マグネシウム（含水） ０．７
脱イオン水 ６５．３
保存料およびその他（適量）
【０１１３】
穏やかに加熱しながら上記有効成分を水性相に溶解し、その溶液を溶融した脂質相に分散させる。室温に冷却し均質化させる。同様の方式で、軟膏１００μｌ／ｃｍ2創傷を塗布する。
【０１１４】
［実施例１１ 口内洗浄剤］
成分 ％
有効成分ＢＭＧＦ １．０-１０-3
ポリエチレングリコール（７）−グリセロールココエート ２．０
脱イオン水 １３
グリセリン（８６％） １８
ペパーミントオイル １０
エタノール ５５
保存料およびその他（適量）
【０１１５】
有効物質を脱イオン水に溶解する。ＰＥＧ（７）−グリセリルココエートおよびグリセリンｎを溶液に加えて溶解する。ペパーミントオイルをエタノールに溶解し、２つの溶液を攪拌しながら混合する。この溶液を使用前に１：１０まで希釈する。
【０１１６】
［実施例１２ 非経口用溶液］
成分
有効物質ＢＭＧＦ １ｍｇ／ｍｌ
±ヒト血清アルブミン １ｍｇ／ｍｌ
アルギニンまたはグリセリン ２０ｍｇ／ｍｌ
±炭水化物 ５〜２０ｍｇ／ｍｌ
ｐＨ７
【０１１７】
上記炭水化物はグルコース、マンノース、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチまたはそれらの混合物である。リン酸塩、コハク酸塩、アミノ酸またはそれらの混合物でｐＨを調製する。
【０１１８】
０．５ｍｌ中に０．５ｍｇのＢＭＧＦが入ったバイアルを製造して凍結乾燥させる。
【０１１９】
［実施例１３ 練り歯磨き］
有効物質ＢＭＧＦ １．０-１０-5ｇ
メチルセルロース ０．８ｇ
炭酸カルシウム ３０ｇ
コロイド状シリカ ３ｇ
軽流動パラフィン ２ｇ
グリセリン ２０ｇ
甘味料
香味料
保存料
脱イオン水 合計 １００ｇ
【０１２０】
有効物質とメチルセルロースとの混合物を含む粉末を、脱イオン水、パラフィンおよびグリセリンの一部で湿らせる。添加物を溶液に加える。残りの水で仕上げた後、ペーストを均一化する。
【０１２１】
最後に、本明細書に略述した本発明の精神から逸脱することなく、様々な変更、修飾および／または付加を行うことができることを理解されたい。
【図１−１】
【図１−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列
DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHFSRCPKQYKHYCIKGRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFY
を含むウシ乳汁成長因子（ＢＭＧＦ）であるポリペプチド、またはその機能的に活性なフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドはＥＧＦレセプターに結合し、
該ポリペプチドが実質的に精製され、または部分的に精製された形態であるポリペプチド。
【請求項２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、２１〜２５ｋＤａの分子量を有する請求項１に記載のＢＭＧＦまたはその機能的に活性なフラグメント。
【請求項３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、９〜１４ｋＤａの分子量を有する非グリコシル化型または部分的非グリコシル化型の請求項１に記載のＢＭＧＦまたはその機能的に活性なフラグメント。
【請求項４】
ウシ乳汁、乳製品または乳製品抽出物から得られる請求項１〜３のいずれか１に記載のＢＭＧＦまたはその機能的に活性なフラグメント。
【請求項５】
ＢＭＧＦ、またはその機能的に活性なフラグメントをコードする核酸分子であって、配列番号２で示される配列、またはその機能的に活性なフラグメントをコードする配列を有する核酸分子。
【請求項６】
創傷治癒または組織修復、あるいはそれらの両方を増進するための薬剤の製造における、請求項１〜３のいずれかに記載のＢＭＧＦ、またはその機能的に活性なフラグンメントの有効量の使用。
【請求項７】
消化管バリア機能障害関連の病気を予防、緩和もしくは治療するための薬剤の製造における、請求項１〜３のいずれかに記載のＢＭＧＦ、またはその機能的に活性なフラグンメントの有効量の使用。
【請求項８】
歯周病を予防、緩和もしくは治療するための薬剤の製造における、請求項１〜３のいずれかに記載のＢＭＧＦ、またはその機能的に活性なフラグンメントの有効量の使用。
【請求項９】
美容における供給を提供するための薬剤の製造における、請求項１〜３のいずれかに記載のＢＭＧＦ、またはその機能的に活性なフラグンメントの有効量の使用。
【請求項１】
以下のアミノ酸配列
DGNSTRSPEDDGLLCGDHAENCPATTTQPKRRGHFSRCPKQYKHYCIKGRCRFVVAEQTPSCVCDEGYAGARCERVDLFY
を含むウシ乳汁成長因子（ＢＭＧＦ）であるポリペプチド、またはその機能的に活性なフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドはＥＧＦレセプターに結合し、
該ポリペプチドが実質的に精製され、または部分的に精製された形態であるポリペプチド。
【請求項２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、２１〜２５ｋＤａの分子量を有する請求項１に記載のＢＭＧＦまたはその機能的に活性なフラグメント。
【請求項３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、９〜１４ｋＤａの分子量を有する非グリコシル化型または部分的非グリコシル化型の請求項１に記載のＢＭＧＦまたはその機能的に活性なフラグメント。
【請求項４】
ウシ乳汁、乳製品または乳製品抽出物から得られる請求項１〜３のいずれか１に記載のＢＭＧＦまたはその機能的に活性なフラグメント。
【請求項５】
ＢＭＧＦ、またはその機能的に活性なフラグメントをコードする核酸分子であって、配列番号２で示される配列、またはその機能的に活性なフラグメントをコードする配列を有する核酸分子。
【請求項６】
創傷治癒または組織修復、あるいはそれらの両方を増進するための薬剤の製造における、請求項１〜３のいずれかに記載のＢＭＧＦ、またはその機能的に活性なフラグンメントの有効量の使用。
【請求項７】
消化管バリア機能障害関連の病気を予防、緩和もしくは治療するための薬剤の製造における、請求項１〜３のいずれかに記載のＢＭＧＦ、またはその機能的に活性なフラグンメントの有効量の使用。
【請求項８】
歯周病を予防、緩和もしくは治療するための薬剤の製造における、請求項１〜３のいずれかに記載のＢＭＧＦ、またはその機能的に活性なフラグンメントの有効量の使用。
【請求項９】
美容における供給を提供するための薬剤の製造における、請求項１〜３のいずれかに記載のＢＭＧＦ、またはその機能的に活性なフラグンメントの有効量の使用。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図８−３】
【図８−４】
【図９】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図８−３】
【図８−４】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−９９０８８（Ｐ２０１０−９９０８８Ａ）
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３４５５（Ｐ２０１０−１３４５５）
【出願日】平成２２年１月２５日（２０１０．１．２５）
【分割の表示】特願２０００−５２０４７８（Ｐ２０００−５２０４７８）の分割
【原出願日】平成１０年１１月１２日（１９９８．１１．１２）
【出願人】（５００２１６２３７）ノヴォザイムズ・バイオファーマ・エイユー・リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２５日（２０１０．１．２５）
【分割の表示】特願２０００−５２０４７８（Ｐ２０００−５２０４７８）の分割
【原出願日】平成１０年１１月１２日（１９９８．１１．１２）
【出願人】（５００２１６２３７）ノヴォザイムズ・バイオファーマ・エイユー・リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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