ウシ個体における枝肉重量を評価する遺伝子マーカー及びそれを用いた枝肉重量評価方法
【課題】遺伝子マーカーを用いたウシ個体における枝肉重量を評価する評価方法を提供すること。
【解決手段】ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基を決定し、それがＧのとき、枝肉重量が重いと評価する。またはウシＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸を決定し、メチオニンであるとき、枝肉重量が重いと評価する。
【解決手段】ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基を決定し、それがＧのとき、枝肉重量が重いと評価する。またはウシＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸を決定し、メチオニンであるとき、枝肉重量が重いと評価する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ個体における枝肉重量を評価する遺伝子マーカー及びそれを用いた枝肉重量評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシの肉質や枝肉重量は、価格に直結する経済形質であり、これらに関する遺伝的能力をどのように評価し、ウシの改良に役立てるかについては、育種価による方法などが考案され、用いられてきた。
【０００３】
肉質や枝肉重量は、複数の遺伝子が関与する量的形質と考えられる。もし、肉質や枝肉重量に比較的大きな影響を与える遺伝子またはゲノム領域(QTL)が特定でき、優良な遺伝子型の判別ができれば、それをウシの改良に利用することができる。
【０００４】
これまでに、黒毛和種種雄牛の父方半きょうだい家系を用いたＱＴＬ解析により、ウシ６番染色体上に体重または枝肉重量に影響を与えるゲノム領域が存在することが報告されている（非特許文献１参照）。その後、別の黒毛和種種雄牛において、６番染色体上の同じ領域にＱＴＬが確認された（非特許文献２参照）。一方、ある褐毛和種種雄牛とその優良型遺伝的形質を受け継いだ産子種雄牛においても、上記とほぼ同じ領域にＱＴＬが検出されていた。
【非特許文献１】Takasuga et al. (2007) Mamm. Genome 18, 125-136.
【非特許文献２】瀬戸口ら(2006)日本動物遺伝育種学会第7回大会要旨集
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、実際に、どのような遺伝情報が優良型遺伝的形質を担っているのかわからないため、ウシ個体における枝肉重量を評価する際、遺伝子型などの遺伝情報を用いることができなかった。
そこで、本発明は、遺伝子マーカーを用いたウシ個体における枝肉重量を評価する評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ウシ６番染色体上の体重または枝肉重量に影響を与えるゲノム領域を詳細に解析することにより、ＮＣＡＰＧ遺伝子のＳＮＰのうちで、ｅ９部位におけるＳＮＰが、６番染色体上の体重または枝肉重量QTLの責任ＳＮＰもしくは責任ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰであること、それによって、ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位を含み、ｅ９部位における塩基がＧであるＤＮＡが、枝肉重量を増加させる遺伝子マーカーとして有用であることを見出し、さらに、ｅ９部位における塩基がＧであるＳＮＰは優性変異であること、また、このＳＮＰを有するＮＣＡＰＧ遺伝子はＥ９部位におけるアミノ酸がメチオニンである変異ＮＣＡＰＧタンパク質をコードすることなどを明らかにし、本発明の完成に至った。
【０００７】
そこで、本発明の、ウシ個体における枝肉重量を評価する評価方法は、ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基またはＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸を決定することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明のウシＮＣＡＰＧ遺伝子は、ｅ９部位がＧである。本発明のウシＮＣＡＰＧタンパク質は、Ｅ９部位におけるアミノ酸がメチオニンである。
【０００９】
また、本発明のＤＮＡは、ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位を含む前記遺伝子の一部又は全部を有し、当該ｅ９部位における塩基がＧである。
【００１０】
また、本発明の、ウシ個体における枝肉重量を評価する遺伝子マーカーは、ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位を含む前記遺伝子の一部又は全部を有するＤＮＡからなる。
【００１１】
また、本発明の、枝肉重量の重いウシ個体を選択する選択方法は、各ウシ個体でＮＣＡＰＧ遺伝子のＳＮＰのうちで、ｅ９部位における塩基を決定する工程と、ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、当該塩基がＧである個体を選択する工程とを含む。
【００１２】
また、本発明の、野生型ウシ個体の枝肉重量を増加させる方法は、交配によらず、遺伝子組換え技術を用いて、ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、ｅ９部位の塩基をＧに置換したウシを作出すること、またはＥ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質を発現するウシを作出することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のウシは、Ｅ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質をコードする外来性ＤＮＡを有する。この外来性ＤＮＡは当該ＮＣＡＰＧタンパク質を発現する発現ベクターであってもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、遺伝子マーカーを用いたウシ個体における枝肉重量を評価する評価方法を提供することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコルを用いる。
【００１６】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１７】
＝＝ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のＳＮＰ＝＝
ウシ野生型ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基はＴであるが、実施例に示すように、ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基がＧである場合、枝肉の重量が増加する。従って、ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のＳＮＰのうちで、ｅ９部位における塩基を決定すれば、枝肉の重量を評価したり、予測したりすることができる。
【００１８】
ここで、ｅ９部位とは、配列番号１のウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｃＤＮＡ(NM_001102376)における１３７２番目の塩基、及びウシゲノム中のＮＣＡＰＧ遺伝子や転写産物ｈｎＲＮＡ、ＮＣＡＰＧ遺伝子ホモログなどにおける当該塩基に対応する塩基すべてを指すものとする。
【００１９】
ウシ野生型ＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸はイソロイシンであるが、ｅ９部位における塩基がＧであるウシ変異ＮＣＡＰＧ遺伝子は、Ｅ９部位におけるアミノ酸がメチオニンである変異ＮＣＡＰＧタンパク質をコードする。従って、ＮＣＡＰＧ遺伝子ｅ９部位における塩基を決定するかわりに、ウシＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸を決定してもよい。
【００２０】
ここで、Ｅ９部位とは、配列番号２のウシＮＣＡＰＧタンパク質(NP_001095846)における４４２番目のアミノ酸、及び部分ペプチドやＮＣＡＰＧホモログなどにおける当該アミノ酸に対応するアミノ酸すべてを指すものとする。
【００２１】
＝＝遺伝子マーカー＝＝
本発明において、ウシ個体の枝肉の重量を評価する際の診断マーカーは、ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位におけるＳＮＰを検出するための遺伝子関連物質をいう。例えば、ＮＣＡＰＧ遺伝子を含むＤＮＡ、転写物であるｈｎＲＮＡやｍＲＮＡ、翻訳物であるポリペプチド、最終産物であるタンパク質などが含まれる。
【００２２】
診断マーカーがＮＣＡＰＧ遺伝子等のＤＮＡの場合、上記ＳＮＰを検出するためには、ＳＮＰを有する塩基を決定できればよい。具体的には、塩基配列を直接決定してもよく、ＰＣＲを利用してもよく、ＲＦＬＰを利用してもよく、特に検出方法は限定されない。診断マーカーがＮＣＡＰＧ遺伝子の転写産物であるｈｎＲＮＡやｍＲＮＡである場合も、ＲＮＡ配列を決定することにより、ＳＮＰを検出できる。これらＳＮＰを直接検出する場合、配列を決定する核酸にはＮＣＡＰＧ遺伝子全体が含まれる必要はなく、ＮＣＡＰＧ遺伝子やｃＤＮＡの一部であってもよく、ＳＮＰを有する塩基（ここでは、ｅ９部位における塩基）が含まれ、その塩基を決定することができれば十分である。
【００２３】
診断マーカーがＮＣＡＰＧタンパク質等のペプチドの場合、上記変異を検出するためには、常法によって、変異を有するアミノ酸を直接決定してもよい。この変異を直接検出する場合、配列を決定するペプチドにはＮＣＡＰＧタンパク質全体が含まれる必要はなく、ＮＣＡＰＧタンパク質の一部であってもよく、変異を有するアミノ酸（ここでは、Ｅ９部位におけるアミノ酸）が含まれ、そのアミノ酸を決定することができれば十分である。
【００２４】
＝＝ＳＮＰの判定方法＝＝
ｅ９部位における塩基の種類は、分子生物学的に決定すればよく、例えば、ウシ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ｅ９部位の塩基を常法によって決定する。このｅ９部位の塩基がＧのヘテロ接合またはＧのホモ接合であれば、そのウシの枝肉の重量は重いと評価できる。
【００２５】
Ｅ９部位におけるアミノ酸も、例えば、抗体等を用いてウシ細胞からＮＣＡＰＧタンパク質を精製し、常法に従って、アミノ酸配列を決定すればよい。このＥ９部位におけるアミノ酸がメチオニンであれば、そのウシの枝肉の重量は重いと評価できる。
【００２６】
また、この評価方法を用いて、多数のウシの中から、枝肉重量の重いウシ個体を選択することができる。すなわち、各ウシ個体で、ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基を決定し、少なくとも一方のアリルで、その塩基がＧである個体を選択すること、またはＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸を決定し、少なくともそのアミノ酸がメチオニンである変異ＮＣＡＰＧタンパク質を有する個体を選択することにより、枝肉重量の重いウシ個体を選択することができる。
【００２７】
ここで、ＮＣＡＰＧ遺伝子は、ウシの中で高度に保存されているため、本発明を実施する対象となるウシの種類は、黒毛和種、褐毛和種、ホルスタイン種など、特に限定されない。
【００２８】
＝＝ＳＮＰの人為的操作＝＝
ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、ｅ９部位の塩基がＧであり、そのためＥ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質を発現する変異ウシにおいては、実施例のように、枝肉重量が増加している。このＮＣＡＰＧ遺伝子において、ｅ９部位以外の変異はないか、あっても枝肉重量の増加とは関連しない。
【００２９】
従って、野生型ウシ個体の枝肉重量を増加させるためには、交配によらず、ノックアウト動物作製、ノックダウン動物作製、トランスジェニック動物作製など、広く知られている個体における遺伝子組換え技術を用いて、ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、ｅ９部位の塩基をＧに置換したウシを作出したり、またはＥ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質を発現するウシを作出したりすればよい。
【００３０】
これまでウシを用いて、胚幹細胞が樹立され（Biochem. Biophys. Res. Commun. vol.309, p.104-113, 2003）、ノックアウトウシも作出されている（Nat Ganet vol.36, p.671-672, 2004）。このような発生工学的な遺伝子組換え技術を用い、ウシ個体において、特定の塩基を目的の塩基に置換することも可能である。
【００３１】
そこで、ＮＣＡＰＧ遺伝子の両方のアリルにおいて、ｅ９部位の塩基としてＧを有しないウシ個体の枝肉重量を増加させるには、例えば、ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、ｅ９部位の塩基をＧに置換したウシを作出すればよい。この場合、この変異アリルは優性であるため、必ずしも両方のアリルを置換する必要はなく、一方を置換するだけでよい。
【００３２】
あるいは、実施例に示すように、この変異は優性変異であるため、ウシ個体中でＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸がメチオニンである変異タンパク質を発現するウシを作出することにより、枝肉重量を増加したウシ個体を作出することもできる。具体的には、例えば、当該変異タンパク質を発現する発現ベクターを導入されたトランスジェニックウシを作出すればよい。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を用いてより詳細に説明する。
【００３４】
［１］ＤＮＡの抽出及びマイクロサテライトとＳＮＰのタイピング方法
ゲノムDNAは、精液、腎周囲脂肪もしくは血液より常法により抽出した。目的とするゲノム断片を特異的に増幅できるプライマーを用いて、PCR法により該当ゲノム領域を増幅した。マイクロサテライトについては、リバース側プライマーを蛍光標識し、PCR増幅産物をABI 3730 DNAアナライザー(アプライドバイオシステムズ社)で電気泳動後、GENESCANとGeneMapperソフトウェア(アプライドバイオシステムズ社)により解析することでタイピングを行った。SNPについては、Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (アプライドバイオシステムズ社)を用いてPCR増幅産物のダイレクトシークエンシングを行うことによって配列を決定し、SNPの検出およびタイピングを行った。表２のSNP 19については、繰り返し配列の多型であるので、リバース側プライマーを蛍光標識し、PCR増幅産物をABI 3730 DNAアナライザー(アプライドバイオシステムズ社)で電気泳動後、GENESCANとGeneMapperソフトウェア(アプライドバイオシステムズ社)により解析することでタイピングを行った。
【００３５】
［２］枝肉の重量の測定方法
枝肉重量は、屠場に出荷されたウシの枝肉の格付け成績を用いた。
【００３６】
［３］枝肉の重量に関するＳＮＰの統計学的処理
本実施例では、ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位に生じたＧへの変異が優性変異であり、枝肉重量に影響を及ぼすことを示す。
【００３７】
ウシ６番染色体上に枝肉重量または体重QTLを検出している黒毛和種種雄牛３頭（Ａ〜Ｃ）と褐毛和種種雄牛2頭（Ｄ、Ｅ）のゲノムＤＮＡを、ウシゲノム配列を用いて作成した多数のマイクロサテライトマーカーとSNPマーカーでタイピングし比較した。この際、各マーカーで得られる２つのアリル型が、相同染色体の優良型（Ｑ）に由来するか非優良型（ｑ）に由来するかを見分けるために、それぞれの種雄牛の産子についてもタイピングを行った。表１に用いたプライマーを示す。
【表１】
【００３８】
その結果、ＮＣＡＰＧ遺伝子を含む約660 kb(SNP0-DIK9017)の領域が、５頭の種雄牛の優良型アリルで共通し、かつ、５頭の種雄牛すべてで非優良型アリルとは区別できるマーカーを含むことがわかった。
【００３９】
この領域に存在する４つの遺伝子のタンパク質翻訳領域に存在するＳＮＰを検索したところ、種雄牛Ａにおいてヘテロであり、かつ、アミノ酸置換を伴うＳＮＰを５箇所見出した。それらについて、各種雄牛を調べたところ、種雄牛５頭すべてがヘテロでもつＳＮＰはｅ９部位におけるもののみであった。
【００４０】
このＳＮＰを含む、近傍１９個のＳＮＰ（表２）について、枝肉重量への影響を調べた。
【表２】
【００４１】
ここで、ＰＣＲに用いたプライマーを表３に示した。
【表３】
【００４２】
まず、黒毛和種去勢牛７９９０頭の枝肉重量上位集団(570-670 kg; 上位4.7%)のうちの94頭（同じ種雄牛の産子は5頭まで）、下位集団(290-410 kg; 下位4.6%)のうちの96頭（同じ種雄牛の産子は5頭まで）をタイピングし、2x2表でFisherの正確検定を行ったところ（表３「p値」参照）、このｅ９部位との相関性が最も高かった(表４のSNP 9: p (アリル数) = 1.2 x 10-11)。
【表４】
【００４３】
次にfastPHASEプログラム(Scheet, P. and M. Stephens (2006) Am J Hum Genet 78, 629-644.)を用いて、１９個のＳＮＰで構成されるハプロタイプを推定したところ、このｅ９部位がＧであるハプロタイプだけが枝肉重量上位集団内の頻度の方が下位集団内の頻度より大きかった(表５のハプロタイプ5と6: これらのハプロタイプとそれ以外のハプロタイプについての2x2表のFisherの正確検定値は、p = 6.7 x 10-11)。
【表５】
【００４４】
このように、枝肉重量に影響を及ぼす変異は、ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位に生じたＧであり、この変異が優性変異であることがわかる。
【００４５】
［４]マーカーとしての利用
種雄牛A-Dの産子をタイピングし、枝肉重量との相関を調べた。結果を表６及び表７に示す。
【表６】
【表７】
【００４６】
ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位におけるＧへの変異で判定される枝肉の重量増加効果は、一方のアリルでの変異（ヘテロ個体）で常に効果を示し、両方のアリルで変異を生じても(ホモ個体）、ヘテロ個体と比べると、家系によって効果は異なるが、最初の変異より効果は小さかった。このように、この変異が不完全優性であることが確認された。
【００４７】
また、特定の家系ではなく、任意の集団３７５頭をタイピングした結果においても、同等の結果が得られたことから、このＳＮＰは、枝肉重量を増加させる遺伝子型を判別できる良いマーカーとして広く利用可能であることがわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ個体における枝肉重量を評価する遺伝子マーカー及びそれを用いた枝肉重量評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシの肉質や枝肉重量は、価格に直結する経済形質であり、これらに関する遺伝的能力をどのように評価し、ウシの改良に役立てるかについては、育種価による方法などが考案され、用いられてきた。
【０００３】
肉質や枝肉重量は、複数の遺伝子が関与する量的形質と考えられる。もし、肉質や枝肉重量に比較的大きな影響を与える遺伝子またはゲノム領域(QTL)が特定でき、優良な遺伝子型の判別ができれば、それをウシの改良に利用することができる。
【０００４】
これまでに、黒毛和種種雄牛の父方半きょうだい家系を用いたＱＴＬ解析により、ウシ６番染色体上に体重または枝肉重量に影響を与えるゲノム領域が存在することが報告されている（非特許文献１参照）。その後、別の黒毛和種種雄牛において、６番染色体上の同じ領域にＱＴＬが確認された（非特許文献２参照）。一方、ある褐毛和種種雄牛とその優良型遺伝的形質を受け継いだ産子種雄牛においても、上記とほぼ同じ領域にＱＴＬが検出されていた。
【非特許文献１】Takasuga et al. (2007) Mamm. Genome 18, 125-136.
【非特許文献２】瀬戸口ら(2006)日本動物遺伝育種学会第7回大会要旨集
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、実際に、どのような遺伝情報が優良型遺伝的形質を担っているのかわからないため、ウシ個体における枝肉重量を評価する際、遺伝子型などの遺伝情報を用いることができなかった。
そこで、本発明は、遺伝子マーカーを用いたウシ個体における枝肉重量を評価する評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ウシ６番染色体上の体重または枝肉重量に影響を与えるゲノム領域を詳細に解析することにより、ＮＣＡＰＧ遺伝子のＳＮＰのうちで、ｅ９部位におけるＳＮＰが、６番染色体上の体重または枝肉重量QTLの責任ＳＮＰもしくは責任ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰであること、それによって、ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位を含み、ｅ９部位における塩基がＧであるＤＮＡが、枝肉重量を増加させる遺伝子マーカーとして有用であることを見出し、さらに、ｅ９部位における塩基がＧであるＳＮＰは優性変異であること、また、このＳＮＰを有するＮＣＡＰＧ遺伝子はＥ９部位におけるアミノ酸がメチオニンである変異ＮＣＡＰＧタンパク質をコードすることなどを明らかにし、本発明の完成に至った。
【０００７】
そこで、本発明の、ウシ個体における枝肉重量を評価する評価方法は、ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基またはＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸を決定することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明のウシＮＣＡＰＧ遺伝子は、ｅ９部位がＧである。本発明のウシＮＣＡＰＧタンパク質は、Ｅ９部位におけるアミノ酸がメチオニンである。
【０００９】
また、本発明のＤＮＡは、ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位を含む前記遺伝子の一部又は全部を有し、当該ｅ９部位における塩基がＧである。
【００１０】
また、本発明の、ウシ個体における枝肉重量を評価する遺伝子マーカーは、ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位を含む前記遺伝子の一部又は全部を有するＤＮＡからなる。
【００１１】
また、本発明の、枝肉重量の重いウシ個体を選択する選択方法は、各ウシ個体でＮＣＡＰＧ遺伝子のＳＮＰのうちで、ｅ９部位における塩基を決定する工程と、ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、当該塩基がＧである個体を選択する工程とを含む。
【００１２】
また、本発明の、野生型ウシ個体の枝肉重量を増加させる方法は、交配によらず、遺伝子組換え技術を用いて、ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、ｅ９部位の塩基をＧに置換したウシを作出すること、またはＥ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質を発現するウシを作出することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のウシは、Ｅ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質をコードする外来性ＤＮＡを有する。この外来性ＤＮＡは当該ＮＣＡＰＧタンパク質を発現する発現ベクターであってもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、遺伝子マーカーを用いたウシ個体における枝肉重量を評価する評価方法を提供することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコルを用いる。
【００１６】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１７】
＝＝ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のＳＮＰ＝＝
ウシ野生型ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基はＴであるが、実施例に示すように、ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基がＧである場合、枝肉の重量が増加する。従って、ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のＳＮＰのうちで、ｅ９部位における塩基を決定すれば、枝肉の重量を評価したり、予測したりすることができる。
【００１８】
ここで、ｅ９部位とは、配列番号１のウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｃＤＮＡ(NM_001102376)における１３７２番目の塩基、及びウシゲノム中のＮＣＡＰＧ遺伝子や転写産物ｈｎＲＮＡ、ＮＣＡＰＧ遺伝子ホモログなどにおける当該塩基に対応する塩基すべてを指すものとする。
【００１９】
ウシ野生型ＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸はイソロイシンであるが、ｅ９部位における塩基がＧであるウシ変異ＮＣＡＰＧ遺伝子は、Ｅ９部位におけるアミノ酸がメチオニンである変異ＮＣＡＰＧタンパク質をコードする。従って、ＮＣＡＰＧ遺伝子ｅ９部位における塩基を決定するかわりに、ウシＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸を決定してもよい。
【００２０】
ここで、Ｅ９部位とは、配列番号２のウシＮＣＡＰＧタンパク質(NP_001095846)における４４２番目のアミノ酸、及び部分ペプチドやＮＣＡＰＧホモログなどにおける当該アミノ酸に対応するアミノ酸すべてを指すものとする。
【００２１】
＝＝遺伝子マーカー＝＝
本発明において、ウシ個体の枝肉の重量を評価する際の診断マーカーは、ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位におけるＳＮＰを検出するための遺伝子関連物質をいう。例えば、ＮＣＡＰＧ遺伝子を含むＤＮＡ、転写物であるｈｎＲＮＡやｍＲＮＡ、翻訳物であるポリペプチド、最終産物であるタンパク質などが含まれる。
【００２２】
診断マーカーがＮＣＡＰＧ遺伝子等のＤＮＡの場合、上記ＳＮＰを検出するためには、ＳＮＰを有する塩基を決定できればよい。具体的には、塩基配列を直接決定してもよく、ＰＣＲを利用してもよく、ＲＦＬＰを利用してもよく、特に検出方法は限定されない。診断マーカーがＮＣＡＰＧ遺伝子の転写産物であるｈｎＲＮＡやｍＲＮＡである場合も、ＲＮＡ配列を決定することにより、ＳＮＰを検出できる。これらＳＮＰを直接検出する場合、配列を決定する核酸にはＮＣＡＰＧ遺伝子全体が含まれる必要はなく、ＮＣＡＰＧ遺伝子やｃＤＮＡの一部であってもよく、ＳＮＰを有する塩基（ここでは、ｅ９部位における塩基）が含まれ、その塩基を決定することができれば十分である。
【００２３】
診断マーカーがＮＣＡＰＧタンパク質等のペプチドの場合、上記変異を検出するためには、常法によって、変異を有するアミノ酸を直接決定してもよい。この変異を直接検出する場合、配列を決定するペプチドにはＮＣＡＰＧタンパク質全体が含まれる必要はなく、ＮＣＡＰＧタンパク質の一部であってもよく、変異を有するアミノ酸（ここでは、Ｅ９部位におけるアミノ酸）が含まれ、そのアミノ酸を決定することができれば十分である。
【００２４】
＝＝ＳＮＰの判定方法＝＝
ｅ９部位における塩基の種類は、分子生物学的に決定すればよく、例えば、ウシ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ｅ９部位の塩基を常法によって決定する。このｅ９部位の塩基がＧのヘテロ接合またはＧのホモ接合であれば、そのウシの枝肉の重量は重いと評価できる。
【００２５】
Ｅ９部位におけるアミノ酸も、例えば、抗体等を用いてウシ細胞からＮＣＡＰＧタンパク質を精製し、常法に従って、アミノ酸配列を決定すればよい。このＥ９部位におけるアミノ酸がメチオニンであれば、そのウシの枝肉の重量は重いと評価できる。
【００２６】
また、この評価方法を用いて、多数のウシの中から、枝肉重量の重いウシ個体を選択することができる。すなわち、各ウシ個体で、ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基を決定し、少なくとも一方のアリルで、その塩基がＧである個体を選択すること、またはＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸を決定し、少なくともそのアミノ酸がメチオニンである変異ＮＣＡＰＧタンパク質を有する個体を選択することにより、枝肉重量の重いウシ個体を選択することができる。
【００２７】
ここで、ＮＣＡＰＧ遺伝子は、ウシの中で高度に保存されているため、本発明を実施する対象となるウシの種類は、黒毛和種、褐毛和種、ホルスタイン種など、特に限定されない。
【００２８】
＝＝ＳＮＰの人為的操作＝＝
ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、ｅ９部位の塩基がＧであり、そのためＥ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質を発現する変異ウシにおいては、実施例のように、枝肉重量が増加している。このＮＣＡＰＧ遺伝子において、ｅ９部位以外の変異はないか、あっても枝肉重量の増加とは関連しない。
【００２９】
従って、野生型ウシ個体の枝肉重量を増加させるためには、交配によらず、ノックアウト動物作製、ノックダウン動物作製、トランスジェニック動物作製など、広く知られている個体における遺伝子組換え技術を用いて、ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、ｅ９部位の塩基をＧに置換したウシを作出したり、またはＥ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質を発現するウシを作出したりすればよい。
【００３０】
これまでウシを用いて、胚幹細胞が樹立され（Biochem. Biophys. Res. Commun. vol.309, p.104-113, 2003）、ノックアウトウシも作出されている（Nat Ganet vol.36, p.671-672, 2004）。このような発生工学的な遺伝子組換え技術を用い、ウシ個体において、特定の塩基を目的の塩基に置換することも可能である。
【００３１】
そこで、ＮＣＡＰＧ遺伝子の両方のアリルにおいて、ｅ９部位の塩基としてＧを有しないウシ個体の枝肉重量を増加させるには、例えば、ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、ｅ９部位の塩基をＧに置換したウシを作出すればよい。この場合、この変異アリルは優性であるため、必ずしも両方のアリルを置換する必要はなく、一方を置換するだけでよい。
【００３２】
あるいは、実施例に示すように、この変異は優性変異であるため、ウシ個体中でＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸がメチオニンである変異タンパク質を発現するウシを作出することにより、枝肉重量を増加したウシ個体を作出することもできる。具体的には、例えば、当該変異タンパク質を発現する発現ベクターを導入されたトランスジェニックウシを作出すればよい。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を用いてより詳細に説明する。
【００３４】
［１］ＤＮＡの抽出及びマイクロサテライトとＳＮＰのタイピング方法
ゲノムDNAは、精液、腎周囲脂肪もしくは血液より常法により抽出した。目的とするゲノム断片を特異的に増幅できるプライマーを用いて、PCR法により該当ゲノム領域を増幅した。マイクロサテライトについては、リバース側プライマーを蛍光標識し、PCR増幅産物をABI 3730 DNAアナライザー(アプライドバイオシステムズ社)で電気泳動後、GENESCANとGeneMapperソフトウェア(アプライドバイオシステムズ社)により解析することでタイピングを行った。SNPについては、Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (アプライドバイオシステムズ社)を用いてPCR増幅産物のダイレクトシークエンシングを行うことによって配列を決定し、SNPの検出およびタイピングを行った。表２のSNP 19については、繰り返し配列の多型であるので、リバース側プライマーを蛍光標識し、PCR増幅産物をABI 3730 DNAアナライザー(アプライドバイオシステムズ社)で電気泳動後、GENESCANとGeneMapperソフトウェア(アプライドバイオシステムズ社)により解析することでタイピングを行った。
【００３５】
［２］枝肉の重量の測定方法
枝肉重量は、屠場に出荷されたウシの枝肉の格付け成績を用いた。
【００３６】
［３］枝肉の重量に関するＳＮＰの統計学的処理
本実施例では、ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位に生じたＧへの変異が優性変異であり、枝肉重量に影響を及ぼすことを示す。
【００３７】
ウシ６番染色体上に枝肉重量または体重QTLを検出している黒毛和種種雄牛３頭（Ａ〜Ｃ）と褐毛和種種雄牛2頭（Ｄ、Ｅ）のゲノムＤＮＡを、ウシゲノム配列を用いて作成した多数のマイクロサテライトマーカーとSNPマーカーでタイピングし比較した。この際、各マーカーで得られる２つのアリル型が、相同染色体の優良型（Ｑ）に由来するか非優良型（ｑ）に由来するかを見分けるために、それぞれの種雄牛の産子についてもタイピングを行った。表１に用いたプライマーを示す。
【表１】
【００３８】
その結果、ＮＣＡＰＧ遺伝子を含む約660 kb(SNP0-DIK9017)の領域が、５頭の種雄牛の優良型アリルで共通し、かつ、５頭の種雄牛すべてで非優良型アリルとは区別できるマーカーを含むことがわかった。
【００３９】
この領域に存在する４つの遺伝子のタンパク質翻訳領域に存在するＳＮＰを検索したところ、種雄牛Ａにおいてヘテロであり、かつ、アミノ酸置換を伴うＳＮＰを５箇所見出した。それらについて、各種雄牛を調べたところ、種雄牛５頭すべてがヘテロでもつＳＮＰはｅ９部位におけるもののみであった。
【００４０】
このＳＮＰを含む、近傍１９個のＳＮＰ（表２）について、枝肉重量への影響を調べた。
【表２】
【００４１】
ここで、ＰＣＲに用いたプライマーを表３に示した。
【表３】
【００４２】
まず、黒毛和種去勢牛７９９０頭の枝肉重量上位集団(570-670 kg; 上位4.7%)のうちの94頭（同じ種雄牛の産子は5頭まで）、下位集団(290-410 kg; 下位4.6%)のうちの96頭（同じ種雄牛の産子は5頭まで）をタイピングし、2x2表でFisherの正確検定を行ったところ（表３「p値」参照）、このｅ９部位との相関性が最も高かった(表４のSNP 9: p (アリル数) = 1.2 x 10-11)。
【表４】
【００４３】
次にfastPHASEプログラム(Scheet, P. and M. Stephens (2006) Am J Hum Genet 78, 629-644.)を用いて、１９個のＳＮＰで構成されるハプロタイプを推定したところ、このｅ９部位がＧであるハプロタイプだけが枝肉重量上位集団内の頻度の方が下位集団内の頻度より大きかった(表５のハプロタイプ5と6: これらのハプロタイプとそれ以外のハプロタイプについての2x2表のFisherの正確検定値は、p = 6.7 x 10-11)。
【表５】
【００４４】
このように、枝肉重量に影響を及ぼす変異は、ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位に生じたＧであり、この変異が優性変異であることがわかる。
【００４５】
［４]マーカーとしての利用
種雄牛A-Dの産子をタイピングし、枝肉重量との相関を調べた。結果を表６及び表７に示す。
【表６】
【表７】
【００４６】
ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位におけるＧへの変異で判定される枝肉の重量増加効果は、一方のアリルでの変異（ヘテロ個体）で常に効果を示し、両方のアリルで変異を生じても(ホモ個体）、ヘテロ個体と比べると、家系によって効果は異なるが、最初の変異より効果は小さかった。このように、この変異が不完全優性であることが確認された。
【００４７】
また、特定の家系ではなく、任意の集団３７５頭をタイピングした結果においても、同等の結果が得られたことから、このＳＮＰは、枝肉重量を増加させる遺伝子型を判別できる良いマーカーとして広く利用可能であることがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ個体における枝肉重量を評価する評価方法であって、
ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基またはＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸を決定することを特徴とする評価方法。
【請求項２】
ｅ９部位における塩基がＧであることを特徴とするウシＮＣＡＰＧ遺伝子。
【請求項３】
Ｅ９部位におけるアミノ酸がメチオニンであることを特徴とするウシＮＣＡＰＧタンパク質。
【請求項４】
ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位を含む前記遺伝子の一部又は全部を有し、当該ｅ９部位における塩基がＧであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項５】
ウシ個体における枝肉重量を評価する遺伝子マーカーであって、
ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位を含む前記遺伝子の一部又は全部を有するＤＮＡからなることを特徴とする遺伝子マーカー。
【請求項６】
枝肉重量の重いウシ個体を選択する選択方法であって、
各ウシ個体でＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基を決定する工程と、
ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、当該塩基がＧである個体を選択する工程と、
を含む選択方法。
【請求項７】
野生型ウシ個体の枝肉重量を増加させる方法であって、
遺伝子組換え技術を用いて、ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、ｅ９部位の塩基をＧに置換したウシを作出することを特徴とする方法。
【請求項８】
野生型ウシ個体の枝肉重量を増加させる方法であって、
遺伝子組換え技術を用いて、Ｅ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質を発現するウシを作出することを特徴とする方法。
【請求項９】
Ｅ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質をコードする外来性ＤＮＡを有するウシ。
【請求項１０】
前記外来性ＤＮＡが、前記ＮＣＡＰＧタンパク質を発現する発現ベクターであることを特徴とする請求項９に記載のウシ。
【請求項１１】
Ｅ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質を発現する発現ベクター。
【請求項１】
ウシ個体における枝肉重量を評価する評価方法であって、
ＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基またはＮＣＡＰＧタンパク質のＥ９部位におけるアミノ酸を決定することを特徴とする評価方法。
【請求項２】
ｅ９部位における塩基がＧであることを特徴とするウシＮＣＡＰＧ遺伝子。
【請求項３】
Ｅ９部位におけるアミノ酸がメチオニンであることを特徴とするウシＮＣＡＰＧタンパク質。
【請求項４】
ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位を含む前記遺伝子の一部又は全部を有し、当該ｅ９部位における塩基がＧであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項５】
ウシ個体における枝肉重量を評価する遺伝子マーカーであって、
ウシＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位を含む前記遺伝子の一部又は全部を有するＤＮＡからなることを特徴とする遺伝子マーカー。
【請求項６】
枝肉重量の重いウシ個体を選択する選択方法であって、
各ウシ個体でＮＣＡＰＧ遺伝子のｅ９部位における塩基を決定する工程と、
ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、当該塩基がＧである個体を選択する工程と、
を含む選択方法。
【請求項７】
野生型ウシ個体の枝肉重量を増加させる方法であって、
遺伝子組換え技術を用いて、ＮＣＡＰＧ遺伝子の少なくとも一方のアリルで、ｅ９部位の塩基をＧに置換したウシを作出することを特徴とする方法。
【請求項８】
野生型ウシ個体の枝肉重量を増加させる方法であって、
遺伝子組換え技術を用いて、Ｅ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質を発現するウシを作出することを特徴とする方法。
【請求項９】
Ｅ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質をコードする外来性ＤＮＡを有するウシ。
【請求項１０】
前記外来性ＤＮＡが、前記ＮＣＡＰＧタンパク質を発現する発現ベクターであることを特徴とする請求項９に記載のウシ。
【請求項１１】
Ｅ９部位のアミノ酸がメチオニンであるＮＣＡＰＧタンパク質を発現する発現ベクター。
【公開番号】特開２００９−２４０２３３（Ｐ２００９−２４０２３３Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９１３２８（Ｐ２００８−９１３２８）
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【出願人】（５９５０３８５５６）社団法人畜産技術協会 (10)
【出願人】（５９１１５５２４２）鹿児島県 (56)
【出願人】（５９１２０２１５５）熊本県 (17)
【出願人】（５９２０７２７９１）鳥取県 (19)
【出願人】（３９１０１１７００）宮崎県 (63)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【出願人】（５９５０３８５５６）社団法人畜産技術協会 (10)
【出願人】（５９１１５５２４２）鹿児島県 (56)
【出願人】（５９１２０２１５５）熊本県 (17)
【出願人】（５９２０７２７９１）鳥取県 (19)
【出願人】（３９１０１１７００）宮崎県 (63)
【Ｆターム（参考）】
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