エタノール生成のための好熱性微生物
好熱性微生物は増大されたエタノール生成を許容するよう改善され、ここで第一の改変はラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化であり、及び第二の改変はピルベートデヒドロゲナーゼ遺伝子をアップレギュレートする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は細菌発酵の生成物としてのエタノールの生成に関する。詳細には、本発明は好熱性細菌によるエタノール生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細菌代謝は細菌種及び環境条件に因りさまざまな異なる機構をとおして起こりうる。全ての病原体を含む有機栄養（従属栄養）細菌は有機化合物の酸化からエネルギーを得、炭水化物（特にグルコース）、脂質及びタンパク質は最も一般に酸化される化合物である。細菌によるこれらの有機化合物の生物学的酸化は化学エネルギー源としてのＡＴＰの合成をもたらす。上記プロセスはまた生合成反応のために細菌細胞により必要とされるより単純な有機化合物（前駆分子）の生成をも許容する。細菌が好適な基質を代謝する一般的なプロセスは、グルコースをＡＴＰの生成を伴ってピルベートに変換する一連の反応である解糖である。代謝エネルギーの生成におけるピルベートの運命は微生物及び環境条件に因り変化する。ピルベートの３の主な反応がある。
【０００３】
第一に、好気条件下で、多くの微生物はクエン酸サイクル及びピルベートデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）により触媒されるピルベートのアセチルコエンザイムＡへの変換を用いてエネルギーを生成するであろう。
【０００４】
第二に、嫌気条件下で、いくつかのエタノール生成生物はピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）により触媒されるピルベートのアセトアルデヒドへの脱炭酸及び続くアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）により触媒されるＮＡＤＨによるアセトアルデヒドのエタノールへの還元によりアルコール発酵を行いうる。
【０００５】
第三のプロセスはラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）による触媒をとおして起こるピルベートのラクテートへの変換である。
【０００６】
天然に嫌気発酵を行う微生物を用いて又はピルベートデカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を組み込む組換え微生物の使用をとおしてエタノール生成のために微生物を用いることにおいて多くの興味がある。これらの微生物を用いることによるエタノール生成においていくつかの成功があるが、発酵はしばしば特に微生物が低レベルのエタノール耐性しか有しない場合、高濃度のエタノールにより妥協される。
好熱性細菌はエタノール生成に提案されており、及びそれらの使用は発酵が生成されたエタノールが５０℃超の温度で蒸気として除去されることを許容する高温で行われうるという利点を有する；これはまた発酵が高い糖濃度を用いて行われることをも許容する。しかしながら、効率的にエタノールを生成しうる好適な好熱性細菌を発見することは問題が多い。
【０００７】
ＷＯ８８／０９３０９は好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ株ＬＬＤ−Ｒを用いたエタノール生成を開示する。ＬＬＤ−Ｒは培養物から自然発生的に生じた胞子形成欠損株であり、及びそこでｌｄｈ遺伝子は自然発生的な突然変異により又は化学的突然変異誘発により不活性化されている。上記株はしかしながら以下に示されるように不安定である。
【０００８】
ＷＯ０１／４９８６５はエタノール生成のための、ピルベートデカルボキシラーゼをコードする異種の遺伝子で形質転換された及びネイティブのアルコールデヒドロゲナーゼ機能を有するグラム陽性細菌を開示する。上記細菌は好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓであり、及び上記細菌はトランスポゾン挿入を用いたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化により改変されうる。ＷＯ０１／４９８６５中で開示される細菌は全てＢａｃｉｌｌｕｓ株ＬＬＤ−Ｒに由来する。株ＬＮ及びＴＮは株ＬＬＤ−Ｒの改善された誘導体として開示される。しかしながら、全ての株はプラスミド形質転換を妨げるＨａｅＩＩＩ型制限酵素システムを含み、及びそれゆえ非メチル化ＤＮＡ内の形質転換を妨げる。
【０００９】
ＷＯ０１／８５９６６は制限酵素問題を克服するｉｎ ｖｉｖｏメチル化により調製される微生物を開示する。これは株ＬＬＤ−Ｒ、ＬＮ及びＴＮへのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓからのＨａｅＩＩＩメチルトランスフェラーゼでの形質転換を必要とする。しかしながら、株ＬＬＤ−Ｒ、ＬＮ及びＴＮは不安定な変異体であり、及び特に低ｐＨで及び高い糖濃度でラクテート生成野生型株に自発的に戻る。これはエタノールからラクテートへの発酵生成物変化をもたらし、上記株をエタノール生成には不適当にする。
【００１０】
ＷＯ０２／２９０３０は、株ＬＬＤ−Ｒ及びその誘導体がｌｄｈ遺伝子のコード領域中に天然の挿入エレメント（ＩＥ）を含むことを開示する。これのｌｄｈ遺伝子への（及びｌｄｈ遺伝子からの）転位及び続く遺伝子不活性化は不安定であり、回復をもたらす。このことへの提案された解決法はプラスミドＤＮＡをＩＥ配列に統合することであった。
【００１１】
それゆえ、本分野において、エタノール生成のための微生物の作出は研究室で作出された化学的突然変異Ｂａｃｉｌｌｕｓ微生物を改変すること、これらをｉｎ ｖｉｖｏメチル化手順で処理すること及びプラスミドＤＮＡをＩＥ配列に統合するために上記微生物をさらに改変することに頼る。上記手順は複雑で、不確定であり、及びまたどのように上記株が使用されうるかという調節の問題もある。
それゆえ、エタノール生成のための改善された微生物について要求がある。
【発明の概要】
【００１２】
発明の要約
本発明の第一の局面にしたがって、好熱性微生物は増大されたエタノール生成を許容するよう改変され、ここで第一の改変はラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化であり、及び第二の改変はピルベートデヒドロゲナーゼ遺伝子をアップレギュレートする。
本発明に係る微生物は野生型に比較して増大されたエタノール生成を示す。
本発明の第二の局面にしたがって、エタノールの生成方法はＣ3、Ｃ5又はＣ6糖の存在下の好適な条件下で上記に提供される定義にしたがう微生物を培養することを含む。
図面の説明
本発明は付属の図面を引用して示され、ここで：
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は解糖の代謝経路を略図で示す；
【図２】図２はＰＤＨ複合体の遺伝子を示す；
【図３】図３はＰＤＨの標的化アップレギュレーションのためのプロモーター置換構築物の概略図である；
【図４】図４はダブル−クロスオーバーのアップレギュレートされたＰＤＨ変異体のためのプロモーター置換構築物の概略図である；
【図５】図５は安定なＰＦＬ−ネガティブ変異体を作出するために意図されるノックアウト構築物の概略図である、及び
【図６】図６は本発明に係る変異体微生物で生成される高いエタノール生成のグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の説明
本発明はラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を破壊するための及びＰＤＨ遺伝子をアップレギュレートするための好熱性微生物の改変に基づく。
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を不活性化することはピルベートのラクテートへの分解を妨げることを助け、及びそれゆえピルベートデカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼを用いたピルベートのエタノールへの分解を（適切な条件下で）促進する。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が遺伝子内の又は遺伝子の欠失により破壊される場合、それは好ましい。
【００１５】
ＰＤＨ遺伝子をアップレギュレートすることはピルベートのアセチルＣｏＡへの変換を促進し、アセチルＣｏＡはその後適切な条件下でアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いてアセトアルデヒド及び最後にはエタノールを生成するために使用されうる。ＰＤＨをアップレギュレートするさらなる利点はグルコース取り込み及び解糖に対して阻害効果を有するピルベート値が減少されることである。これはエタノール生成をさらに促進する。
【００１６】
上記微生物はどんな好熱性微生物でもありうるが、上記微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐのものである場合それは好ましい。詳細には、上記微生物がＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の野生型微生物、詳細にはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓである場合それは好ましい。
【００１７】
好ましい態様において、改変のために選択される微生物は「野生型」であると言われる、すなわち、それらは研究室で作出された変異体ではない。上記微生物は好熱性細菌を含むと期待される環境サンプルから単離されうる。単離された野生型微生物はエタノールを生成する能力を有するであろうが、改変されない場合、ラクテートが主要な発酵生成物であるようである。上記単離物はまた高温でヘキソース及び／又はペントース糖、及びそれらのオリゴマー上で生育するそれらの能力について選択される。
【００１８】
本発明に係る微生物が、上記微生物が発酵プロセスにおいて使用されることを許容するいくつかの所望の特性を有することは好ましい。上記微生物は好ましくは制限酵素システムを有しないべきであり、それによりｉｎ ｖｉｖｏメチル化の必要性を避ける。さらに、上記微生物は少なくとも３％エタノールまで安定であるべきであり、及び基質としてセロビオース及びデンプンを含むＣ3、Ｃ5及びＣ6糖（又はそれらのオリゴマー）を利用する能力を有するべきである。上記微生物が高い頻度で形質転換可能である場合それは好ましい。さらに、上記微生物は０．３ｈ-1以上の希釈速度を支持するような連続培養物における成長速度を有するべきである（典型的に０．３ＯＤ600）。
【００１９】
上記微生物は好熱性であろう、及び４０℃〜８５℃の温度範囲で生育するであろう。好ましくは、上記微生物は５０℃〜７０℃の温度範囲内で生育するであろう。さらに、上記微生物がｐＨ７．２以下、詳細にはｐＨ６．９〜ｐＨ４．５の条件下で生育することが所望される。
【００２０】
上記微生物は胞子形成体でありうる又は胞子形成をしない。上記発酵プロセスの成功は必ずしも上記微生物の胞子形成する能力によらないが、上記微生物を上記発酵プロセスの終わりに動物フィードストックとして使用することが所望されるとき、いくつかの状況下では胞子形成体を有することが好まれうる。これは動物フィードストックとして使用されるとき優れた免疫刺激を提供する胞子形成体の能力のためである。胞子形成微生物はまた発酵中に沈殿する能力をも有し、及びそれゆえ遠心分離の必要性なしに単離されうる。したがって、上記微生物は複雑な又は高価な分離手順の必要性なしに動物フィードストック中で使用されうる。
【００２１】
ラクテートデヒドロゲナーゼについての核酸配列は今や既知である。この配列を用いて、当業者は異なる機構をとおして上記遺伝子の不活性化を達成するようラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を標的化することが可能である。上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子がトランスポゾンの挿入により又は好ましくは上記遺伝子配列若しくは上記遺伝子配列の一部の欠失により不活性化される場合それは好ましい。欠失はトランスポゾン不活性化が使用されるときしばしば経験される上記遺伝子配列の再活性化の困難さを避けるので、欠失は好ましい。好ましい態様において、上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子はプラスミド及び上記微生物の染色体の間で天然の相同組換え又は統合を達成する温度感受性プラスミド（ＰＣＴ／ＧＢ０６／０１５８６中に開示されるプラスミドｐＵＢ１９０−ｌｄｈ）の統合により不活性化される。染色体統合体は抗生剤（例えば、カナマイシン）に対するそれらの抵抗性に基づいて選択されうる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子への統合はシングルクロスオーバー組換え事件により又はダブル（又はそれより多い）クロスオーバー組換え事件により起こりうる。ダブルクロスオーバー事件がＬＤＨ遺伝子（又はその部分）及びはじめの統合体、すなわち温度感受性プラスミドを除去するよう行われることは好ましい。このようにして、上記変異体微生物はどんな異種のＤＮＡをも含まないであろう、及びそれゆえＧＭＯ規定にしたがって遺伝的に改変された生物（ＧＭＯ）として分類されないであろう。
【００２２】
上記第二の改変はＰＤＨをアップレギュレートすることである。ＰＤＨは３のユニット−Ｅ１：ピルベートデカルボキシラーゼ（ＥＣ １．２．４．１であり、ＥＣ ４．１．１．１ではない）、Ｅ２：ヂヒドロリポアミドトランスアセチラーゼ、及びＥ３：ヂヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼを含む、大きな酵素複合体である。上記複合体はＮＡＤ、ＦＡＤ、コエンザイムＡリポ酸及びチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）を含むいくつかの共同因子を必要とする。Ｅ１ユニットはα及びβサブユニットのヘテロダイマーであるので、４の遺伝子が上記複合体をコードし、及びしばしばｐｄｈＡ、ｐｄｈＢ、ｐｄｈＣ及びｐｄｈＤ（それぞれＥ１α、Ｅ１β、Ｅ２及びＥ３）として記述される。ＰＤＨのＥ１ユニットは、ＰＤＣ ＥＣ ４．１．１．１がＴＰＰを必要とし、及び同様の脱炭酸反応を触媒するのと同様にＴＰＰを必要とするが、（他の酵素ユニットが有する）コエンザイムＡ及びリポ酸の存在下では生成物はアセトアルデヒドではなくアセチルＣｏＡである。しかしながら、Ｅ１ユニットのＰＤＣ活性は、それがＰＤＨ中の他のユニットと複合体化されていないとき計測されている（Ｌｅｓｓａｒｄ ＆ Ｐｅｒｈａｍ； Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；１９９４，２６９：１４，１０３７８−１０３８３；Ｔｏｍａｒ ｅｔ ａｌ； Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ２００３，６２，７６−８２； Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ； Ｓｃｉｅｎｃｅ； ２００４， ３０６： Ｏｃｔ ２９，８７２−８７６，補足データ）。したがって、アセトアルデヒドがアセチルＣｏＡ以上に生成されるように、ＥＣ １．２．４．１のＰＤＣ活性はＰＤＨのアップレギュレーションにより高められうる。高められたＰＤＨ活性はまたピルベートボトルネック（渋滞）を除去し、副生成物としてのより少ないアセテート及びフォルメートを伴ってより多くのエタノールが生成されることを許容すると考えられる。
【００２３】
この終わりに、ＰＤＨ遺伝子及び周囲の配列を標準の「ゲノムウォーキング」技術を用いて単離した。約８．８ｋｂのＤＮＡを単離し、シークエンスし、及び図２及び表１中に示される以下の遺伝子を含むことを発見した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
推定プロモーター領域は図２（矢印）中に示される−１はｐｄｈＡの開始から上流であり、及び推定第二プロモーターはｐｄｈＣの前方である。ＰＤＨクラスター中の第二プロモーターの以前の例はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓについて報告されたが（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ２００２， １８４：１０， ２７８０−２７８８）、ほとんどの示されたＰＤＨ遺伝子クラスターは上記クラスターの上流にただ一つのプロモーターを有する（Ｎｅｖｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ； Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ； １９９８ １３８５， ３６７−３７２）。上記アップレギュレーションは本分野において知られる技術を用いて行われうる。詳細には、アップレギュレーションはＰＤＨ複合体の上流の好適なプロモーター又はエンハンサー配列を導入することにより行われうる。
【００２６】
上記酵素複合体は好気及び嫌気条件下の両方ではたらくことが知られるが（Ｃａｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ； Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ； １９８５， ４９：３， ６７４−６７８）、それは一般的には好気性酵素であると考えられ（Ｃｈ １５； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｎｅｌｓｏｎ ＆ Ｃｏｘ； ２nd Ｅｄ， Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３， ｐ４４７）、ピルベートフォルメートリアーゼ（ＰＦＬ）はその嫌気性相対物である。両方の酵素は解糖において形成されたピルベートをアセチルＣｏＡに変換してＴＣＡサイクルに供給するが、上記サイクルは完全に好気条件下でのみはたらく。しかしながら、嫌気条件を使用することが所望されるので、嫌気条件においてはたらくプロモーターは本発明における使用のために好ましい。したがって、嫌気条件下ではたらくと考えられる酵素のためのプロモーター−例はＬＤＨプロモーター（Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＣＡ１５０３、ＤＳＭ１３２４０及びＡＴＣＣ１４５７９からのＰ ｌｄｈ）及びフェレドキシンプロモーター（Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＤＳＭ１３２４０からのＰ ｆｅｒｒＡ）である−を同定し、単離し及びｐｄｈＡの開始からすぐ上流の適切な部位に安定に統合した。使用される株及びＰＤＨ複合体に挿入されるプロモーターは表２中に示される。ほとんどの例において、上記プロモーターはＰＤＨ発現における１０倍増大、グルコース消費における増大、ピルベートをごくわずかな値まで減少させること及びエタノール生成における〜５０％増大を作出する。おもしろいことに、アセテート値は同じままであり、エタノール生成を好むエタノール：アセテート比率における増大をもたらした。
【００２７】
【表２】
【００２８】
好ましい態様において、第三の改変はＰＤＣ活性を高めるために導入される。これはＥ２（ＥＣ２．３．１．１２）を不活性化することにより行われうる。不活性化はＬＤＨの不活性化と同様の様式で、ただしＥ２遺伝子を破壊の標的として行われうる。
【００２９】
さらなる態様において、本発明に係る微生物は、ピルベートフォルメートリアーゼ遺伝子を不活性化し、それによりピルベートのアセチルＣｏＡ及びフォルメートへの変換を妨げる／減少させるさらなる改変を含む。ピルベートフォルメートリアーゼ（ＰＦＬ）はピルベートデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）の「嫌気性相対物」であり、及びピルベートをアセチルＣｏＡ及びフォルメートに変換する（図１を参照のこと）。アセチルＣｏＡはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｃＨＤ）を介してエタノールに変換されうる一方で、フォルメートはエタノール生成生物における成長を阻害する可能性を有する所望されない副生成物である。
【００３０】
ＰＦＬをエタノール生成に向かう代謝の流れを促進するために及びエタノール合成への残りの経路の酸化還元バランスを改善するためにノックアウトの標的として選択した。追加の利点はフォルメート生成の消去である。ＰＦＬ活性は変えられた表現型の持続のための抗生物質選択に頼らない変異体を作出するために（以下に示される）ＬＤＨノックアウトのための同じプロトコールを用いて不活性化されうる。この態様において、嫌気条件下でエタノール生成が増大されるように、上記微生物がラクテートデヒドロゲナーゼ不活性化及びピルベートデヒドロゲナーゼのアップレギュレーションの両方を含むことは好ましい。
【００３１】
ＰＦＬ遺伝子はＬＤＨの不活性化について開示される技術を用いて不活性化されうる。トランスポゾン挿入が使用されうる又は遺伝子欠失（又は部分的な遺伝子欠失）が使用されうる。遺伝子欠失（又は部分欠失）が使用されることは好ましい。
【００３２】
さらなる好ましい態様において、上記微生物はまた異種のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をも含むであろう。この異種の遺伝子の発現はエタノールが主たる発酵生成物であるように代謝を向けなおす酵素の作出をもたらす。上記遺伝子はｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓを含むｚｙｍｏｍｏｎａｓ種を含む、典型的に嫌気性発酵を行う微生物から得られうる。
【００３３】
上記遺伝子の調製及び微生物への組み込みの方法は、例えば、Ｉｎｇｒａｍ ｅｔａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｈ ＆ ＢｉｏＥｎｇ， １９９８； ５８（２＋３）：２０４−２１４及びＵＳ ５９１６７８７中で知られ、それぞれの内容を本明細書中に援用する。上記遺伝子は、当業者により理解されるであろうように、プラスミド中に導入され又は染色体に統合されうる。
【００３４】
本発明に係る微生物は選択される好熱性微生物に因り、慣習的な培養条件下で培養されうる。基質、温度、ｐＨ及び他の生育条件の選択は既知の培養必要条件に基づいて選択されうる、例えば、それぞれの内容を本明細書中に援用する、ＷＯ０１／４９８６５及びＷＯ０１／８５９６６を参照のこと。
本発明はここで以下の実施例において、付属の図面を引用して、例示のためにのみ示されるであろう。
【実施例】
【００３５】
ＬＤＨ遺伝子の不活性化
実施例１：安定なＬＤＨ変異体の作出
策を遺伝子置換及び以下の２のアプローチによりＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｄａｓｉｕｓ ＮＣＩＭＢ １１９５５中のＬＤＨ遺伝子の安定な変異を作出するよう設計した。
アプローチ１において、ＬＤＨコード配列の中央に近い２の存在する独特の制限酵素部位を欠失を作出するために活用した。単一のラージＰＣＲ産物を入手可能なＬＤＨ配列のほとんどを含むゲノムＤＮＡから作出し、及びｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のマルチプルクローニング部位中のＳｍａＩ部位にクローニングした。上記ｐＵＣ１９クローンをその後ＢｓｔＥＩＩ及びＢｓｒＧＩで連続して消化し、及びＫｌｅｎｏｗ消化後に再ライゲートし、ＢｓｔＥＩＩ及びＢｓｒＧＩの間のＬＤＨ遺伝子における内部欠失を作出した。
【００３６】
アプローチ２において、ＬＤＨ遺伝子を、ＬＤＨ配列の中央における欠失の作出を伴って、２のＰＣＲ産物がｐＵＣ１９０中で共にライゲートされることを許容するように以下のオリゴプライマーでＮｏｔＩ部位を導入して、２のＰＣＲ産物としてクローニングした。
内部欠失を有する、それぞれのアプローチから生ずるＬＤＨ遺伝子を３の可能性のあるデリバリーシステム：ｐＵＢ１９０、ｐＮＷ３３Ｎ及びＴＭＯ１９にサブクローニングした。
表３は欠失アプローチ２に使用されるＰＣＲプライマーを示す。
【００３７】
【表３】
【００３８】
表４は上記デリバリーベクターの特性を列挙する。
【００３９】
【表４】
【００４０】
アプローチ１：ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして使用するために１１９５５から調製した。１１９５５の２０ｍＬ一晩培養（ＴＧＰ媒質、５２℃）からの細胞を遠心分離（４０００ｒｐｍ、２０分間）により回収した。上記細胞ペレットを２．５ｍｇリソザイム及び５０μＬのリボヌクレアーゼＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を含む５ｍＬ ＳＴＥ緩衝液（０．３Ｍスクロース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁した。これを３０℃で１時間インキュベートし、その後５ｍｇプロテイナーゼＫ及び５０μＬの１０％ ＳＤＳを添加し、続いて３７℃でさらに１時間インキュベートした。溶解された培養物をその後等体積のフェノール：クロロフォルム（１：１）、続いてクロロフォルムで連続して抽出し、その後イソプロパノールで沈殿させた。７０％氷冷エタノールで２回洗浄した後、上記ＤＮＡペレットを０．５ｍＬ ＴＥ緩衝液中に再溶解した。
【００４１】
アプローチ２：ＬＤＨ欠失構築物の作出
ＰＣＲをＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行い、及び反応条件は以下のとおりであった：サイクル１−９５℃で５分間の変性、４７℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長、サイクル２〜３０−９５℃で１分間の変性、４７℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長、及び７２℃で５分間の最後のインキュベーション。使用された酵素はＰｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）の等しい混合物であった。使用された緩衝液及びｄＮＴＰｓは製造業者の教示（Ｐｆｕ、Ｐｒｏｍｅｇａ）にしたがった。使用されたＤＮＡテンプレートは上記で調製された１１９５５ゲノムＤＮＡであり、及び生ずるＰＣＲ産物は製造業者の教示にしたがってアガロースゲル電気泳動、続いてゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、 Ｑｉａｇｅｎ）を用いた上記ゲルからの溶離を介して精製された。上記精製されたＰＣＲ産物をＳｍａＩで事前に消化されたｐＵＣ１９（ＮＥＢ）中にライゲートし、上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、及び制限酵素分析により特徴付けた。
【００４２】
（プライマー３及び４を用いて作出された、断片の３’末端に導入された新規ＰｓｔＩ部位及び５’末端に導入されたＮｏｔＩ部位を伴う）ｐＵＣ１９に挿入された断片２を伴うプラスミド（ｐＴＭＯ０２）をＮｏｔＩ及びＰｓｔＩで消化した。生ずる断片（約０．４ｋｂ）を、ＮｏｔＩ及びＰｓｔＩで消化された（プライマー対１及び２で作出された）断片１を有するｐＵＣ１９プラスミド（ｐＴＭＯ０１）中にライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。前のように、アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、及び上記挿入物の向きを確立するために制限酵素分析により特徴付けた。
【００４３】
所望の構築物に期待される制限酵素パターンを有するプラスミド（ｐＴＭＯ０３）を同定し、及びＭ１３ｍｐ１８後退及び前進プライマーを用いたシークエンスにより実証した。
変異されたＬＤＨ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩでの消化によりｐＴＭＯ０３から切り取り、及び前のようにアガロースゲル電気泳動をとおして精製した。上記断片をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ（ＮＥＢ、製造業者の教示にしたがって）で処理して、ＸｂａＩで消化され及びＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理されたｐＵＢ１９０中へのライゲーションのためにブラントエンドを作出した。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＳＣＳ１１０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。前のように、アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、及び制限酵素分析により特徴付けた。所望の構築物に期待される制限酵素パターンを有するプラスミド（ｐＴＭＯ１４、ｐＵＢ１９０骨組に基づく）を同定し、及び以下に示されるプロトコールを用いたエレクトロポーレーションによりＮＣＩＭＢ１１９５５を形質転換するために使用した。
【００４４】
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ ＮＣＩＭＢ １１９５５のためのエレクトロポーレーションプロトコール
１１９５５の凍結ストックをＴＧＰ媒質中の一晩培養物を生育し（５５℃で２５０ｒｐｍで振騰される、２５０ｍＬ円錐フラスコ中で５０ｍＬ体積、ＯＤ600〜２）、等体積の２０％グリセロールを添加し、１ｍＬ等分に分け、及び−８０℃で凍結管中で貯蔵することにより作出した。１ｍＬのこのストックを２５０ｍｌ円錐フラスコ中の５０ｍＬの事前に温められたＴＧＰを接種するために使用し、それを１．４のＯＤ600が達成されるまでインキュベート（５５℃、２５０ｒｐｍ）した。
【００４５】
上記フラスコを氷上で１０分間冷却し、その後上記培養物を５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ管中で４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上記ペレットを５０ｍＬの氷冷エレクトロポーレーション媒質中に再懸濁し、及び遠心分離（４，０００ｒｐｍ、２０分間）した。３回のさらなる洗浄をこのように（１×２５ｍＬ及び２×１０ｍＬ）行い、その後上記ペレットを１．５ｍＬの氷冷エレクトロポーレーション媒質中に再懸濁し、６０μＬ等分に分け、及び将来の使用のために−８０℃で０．５ｍＬエッペンドルフ管中で貯蔵した（又は即座に使用した）。
【００４６】
エレクトロポーレーションのために、水中の１〜２μＬのＤＮＡを氷上で維持されるエッペンドルフ管中の６０μＬのエレクトロコンピーテント細胞に添加し、及びおだやかに混合した。この懸濁物を事前に冷却されたエレクトロポーレーションキュベット（１ｍｍギャップ）に移し、及び２５００Ｖ、１０μＦキャパシタンス及び６００Ωレジスタンスでエレクトロポーレートした。パルスの直後に、１ｍＬの事前に温められたＴＧＰを添加し、混合し、及び上記懸濁物をスクリュートップ管に移し、及び振騰温浴中で５２℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、上記懸濁物を直接プレートにまいた（例えば、２×０．５ｍＬ）又は遠心分離し（４，０００ｒｐｍ、２０分間）、２００μＬ〜５００μＬ ＴＧＰ中に再懸濁し、及び適切な抗生物質を含むＴＧＰアガー上に広げ、及び５２℃で一晩生育させた。抗生物質抵抗性形質転換体は２４時間後に観察された。
【００４７】
【表５】
【００４８】
シングルクロスオーバーＬＤＨネガティブ第一統合体の選択
生物のゲノムへの統合のために使用されるプラスミド（例えば、ｐＴＭＯ１４）は温度感受性である。ｐＵＢ１９０に基づくノックアウトベクターは５４℃でホスト内で複製することができるが、６５℃超ではできない。したがって、６８℃でカナマイシンの存在下で生育するために、上記ホストはゲノム内に上記プラスミドを組み込まなければならない。
【００４９】
ｐＴＭＯ１４でのＧ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｄａｓｉｕｓ ＮＣＩＭＢ １１９５５の形質転換からのカナマイシン抵抗性コロニーを１２μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＴＧＰアガー上のシングルコロニーへのストリーキングにより精製した。この形質転換体をゲノムＬＤＨ対立遺伝子での相同組換えをしかけることにより１１９５５中で第一統合体を作出するために使用した。これは５２℃及び２５０ｒｐｍで２５０ｍＬ円錐フラスコ中で一晩５０ｍＬ ＴＧＰ媒質中で上記株を生育させ、上記培養物を遠心分離し（４，０００ｒｐｍ、２０分間）、１ｍＬ ＴＧＰ中に上記細胞を再懸濁し、及び６８℃で一晩のインキュベーションのために１２μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＴＧＰアガープレート上に広げることにより達成された。これらの条件下で、ｐＵＢ１９０は自主栄養プラスミドとして複製することはできない。この方法で得られたコロニーの大多数は、ラクテート生成について試験されるとき、増大されたエタノール生成を伴うＬＤＨ−表現型を与え、ＬＤＨ位置での統合によるＬＤＨ変異体の作出を示す。
【００５０】
ダブルクロスオーバーによる遺伝子置換ＬＤＨ変異体の作出
ｐＴＭＯ１４の推定第一統合体（ＴＭ１５）を上記の形質転換から同定し、及びダブル組換え体を得るために使用した。これは５４℃で８時間及び５２℃で１６時間を交替する、カナマイシンを含まないＴＧＰ媒質中のＴＭ１５の５の連続したサブ培養物（５０ｍＬファルコン管中の５ｍＬ、２５０ｒｐｍ、サブ培養物間で１％移動）をとおして達成された。これらの５の継代後、生ずる培養物を連続希釈し、及び１００μＬサンプルをＴＧＰプレート上に広げ、及び一晩生育させた。１２μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＴＧＰアガー上への生ずるコロニーのレプリカプレート作成をカナマイシン感受性コロニーを同定するために使用した。精製するためのアガー上のシングルコロニーへのストリーキング後、これらのカナマイシン感受性誘導体をラクテート生成について試験し、及び予想されるように、ＬＤＨ＋及びＬＤＨ−の混合物であることが証明された。１のＬＤＨ−誘導体、ＴＭ８９をＰＣＲ及びサザンブロットによりさらに特徴付けた。
【００５１】
ＬＤＨ遺伝子置換の証明
ゲノムＤＮＡをＴＭ１５（第一統合体）及びＴＭ８９（推定ダブル組換えＬＤＨ−）から調製し、及び上記に使用される条件を用いた、プライマー１及び４を用いたＰＣＲにテンプレートとして使用した。１１９５５からのゲノムＤＮＡを対照として使用した。上記ＰＣＲ産物（約０．８ｋｂバンドが全ての３のテンプレートから得られた）を以前に示されるように精製し、及びサンプルをＮｏｔＩで消化し、その後０．７％アガロース電気泳動ゲル上で流した。１１９５５のＰＣＲ産物は予想されるようにＮｏｔＩ消化の証拠を示さず、一方ＴＭ８９のＰＣＲ産物は０．４ｋｂ辺りの２のバンドを与え、変異された対立遺伝子での野生型遺伝子の置換を示した。第一統合体であるＴＭ１５のＰＣＲ産物のＮｏｔＩ消化は、切断されていない（０．８ｋｂ）バンドの痕跡を伴って、ＴＭ８９で見られる上記２のバンドを主に与えた。これはＴＭ１５ゲノムＤＮＡのサザンブロットで得られた結果により説明されうる。
【００５２】
１１９５５、ＴＭ１５及びＴＭ８９のゲノムＤＮＡをＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、及び電気泳動アガロースゲル上で流した。上記ＤＮＡを正荷電ナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ）上に移し、及びＤＩＧ標識化された（ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ、製造業者の教示にしたがって）プライマー１及び４（表３）を用いた１１９５５ＬＤＨ遺伝子からのＰＣＲにより作出されたプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしているバンドを供給される検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて視覚化した。サザンブロットはＴＭ１５のＮｏｔＩ消化において約７．５ｋｂの多く増幅されたバンド、ＴＭ１５のＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ及びＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ消化において約７．０及び０．４ｋｂの同様に増幅されたバンドの証拠を示し、この第一統合体中のＬＤＨ位置で統合されるｐＴＭＯ１４の多数のタンデムコピーの統合を示した。全ての３の制限酵素消化で、ＴＭ８９は、遺伝子置換と一致して、１１９５５に比較して余分のハイブリダイズしているバンドを示す異なる制限酵素パターンの証拠を示した。
【００５３】
実施例２：安定なアップレギュレートされたＰＤＨ変異体の作出
ａ）ｐｄｈクラスターのクローニング及びシークエンス
プライマー ５’−ＡＹＧＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＴＧＲＴＣＧＡＴＴＴＣＡＴＧ−３’（前進；配列ＩＤ番号３１）及び５’−ＣＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＡＡＴＴＴＧＧＣＴＴ−３’（後退；配列ＩＤ番号３２）を既知のＢａｃｉｌｌｕｓ及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＰＤＨ配列の間の配列ホモロジーに基づいて設計し、及びテンプレートとしてＧ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ １１９５５からのゲノムＤＮＡを用いて１．８ｋｂ断片を増幅するために使用した。上記ＰＣＲを以前に示されるように行い、及び精製ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９（ＮＥＢ）にライゲートさせた。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、及びシークエンスした。この第一の断片をその後以下のライブラリーをスクリーニングするためにプローブとして使用した。
Ｇ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ １１９５５からのゲノムＤＮＡを標準のプロトコールを用いて１０の異なる制限酵素で消化した。制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＭｆｅＩは２．５〜５ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を作出し、それらは、製造業者の教示にしたがって、コロニーのいくつかのライブラリー（ｐＬＩＴＭＵＳ２８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を形成するためにクローニングされた。これらのライブラリーを標識化ＤＮＡプローブでスクリーニングした（ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ、製造業者の教示にしたがって）。
【００５４】
上記プローブとハイブリダイズしたどのコロニーにおけるＤＮＡ断片も単離し、及びシークエンスした。以前に同定された１．８ｋｂ ｐｄｈ領域にまたがる及びさらなる〜１．８ｋｂ分この領域から下流に伸びる３．６ｋｂ ＥｃｏＲＶゲノムＤＮＡ断片を含む１のクローンを同定した。上記断片はペプチドデフォルミラーゼ２（ｐｄｆ２）を伴う５’領域で始まる３の完全な遺伝子をコードした。ｐｄｆ２の位置づけられた下流には（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓからの推定タンパク質ｙｋａＡ（ＢＳＵ１４５７０）へのホモロジーを示す）推定遺伝子をコードするオープンリーディングフレームがあり、一方下流で次のオープンリーディングフレームは１１１０ｂｐの大きさであり、及びピルベートデヒドロゲナーゼＡ αサブユニット（ｐｄｈＡ（α））をコードすると考えられる。ｐｄｈＡ（α）遺伝子のすぐ隣に及びＥｃｏＲＶ断片の３’末端の向こうに伸びて、ｐｄｈＡ βサブユニット（ｐｄｈＡ（β））をコードすると考えられる遺伝子の一部が存在する。ｐｄｈＡ α及びβ遺伝子のタンデム配置は親密に関連した種において同定される既知のｐｄｈ遺伝子クラスターと一致する。
【００５５】
このＥｃｏＲＶ断片を同定するために使用されるアプローチをさらなるＤＮＡ配列を単離するために繰り返した。上記ＥｃｏＲＶ断片の３’領域に結合する前進プライマー５’−ＡＣＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧ−３’（配列ＩＤ番号５）及び後退プライマー５’−ＴＴＴＡＡＧＴＧＣＴＣＴＡＧＧＡＡＡＡＴＡＡＣＡＧ−３’（配列ＩＤ番号６）を用いて、新規プローブ、ＧＴ−ＤＩＧ２を以前のようにＰＣＲにより作出した。そのいくつかはＧＴＤＩＧ−２領域のすぐ上流で切れることが示された一組の制限酵素をＧ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓから単離されたゲノムＤＮＡを消化するために使用した。
【００５６】
ＮｃｏＩ消化に由来する断片を単離し、及び以前のようにクローニングした（ｐＬＩＴＭＵＳ２８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、製造業者の教示にしたがって）。ＧＴ−ＤＩＧ２プローブでのスクリーニングに際して、ＥｃｏＲＶ断片の下流に位置される〜６ｋｂ ＤＮＡから成るＮｃｏＩ ＤＮＡ断片を含むクローンを同定した。ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＶ断片の配列は８８８４ｂｐの長さの１の連続配列（コンティグ）を形成した。シークエンス分析は、このコンティグは両側に２の推定遺伝子が位置する４の近隣の遺伝子から成るｐｄｈ遺伝子クラスターを含むことを明らかにした。上記コンティグ内にコードされる遺伝子の構成は図２中に示される。
【００５７】
ｂ）シングルクロスオーバーＰＤＨ変異体−概念の証明
Ｇ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ １１９５５のＬＤＨ−変異体においてＰＤＨのアップレギュレートされた変異体を作出するために使用される策は、異種のプロモーターの容易な挿入及び続いてそれらを好適な統合ベクターに挿入することを許容する制限酵素部位が先にあるｐｄｈＡコード配列を伴うカセットを設計する及び作出するために、以前に同定されたｐｄｈＡ配列の使用を含んだ。上記必要性はＧ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ又はＧ． ｓｔｅａｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＬＤＨ−プロモーターの如き強い構成的プロモーターのためであった。上記アプローチは図３中に例示される。
【００５８】
必要とされる変異体をホスト株への上記統合ベクターの形質転換及びカナマイシン抵抗性統合体についての選択により作出した。上記統合事件は容易に可逆であるので、上記シングルクロスオーバー変異体は抗生物質の不在下では不安定である。
【００５９】
ｉ）アップレギュレーションワークのためのベクターの開発
上記策をうまくいかせるために、新規デリバリーベクターはマルチプルクローニング部位内のＮｄｅＩ制限酵素部位の使用を許容するよう構築されなければならなかった。以下の表３はｐＵＢ１９０で開発されたベクターを示し、及び比較する：
【００６０】
【表６】
【００６１】
表５．アップレギュレーションワークのために構築されたベクター
ｉｉ）ｐｄｈＡ骨組断片
ＮｄｅＩ部位の終末のＡＴＧがｐｄｈＡ遺伝子の推定ＡＴＧ開始コドンを示すように、以前に示されるように、ｐＵＣ１９にクローニングされた元の１．８ｋｂ ＰＣＲ産物から得られたｐｄｈＡ配列をＸｂａＩＩ／ＮｄｅＩ部位を組み込む前進プライマー５’−ＡＡＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＴ−３’（配列ＩＤ番号７）を設計するために使用した。上記開始コドンは他のｐｄｈＡ遺伝子の配置及び可能なリーディングフレームの調査により割り当てられた。
【００６２】
これを、以前に示されるＰＣＲプロトコールを用いて、ｐｄｈＡ（α）遺伝子の前部分を増幅するために（ＨｉｎｄＩＩＩ部位を組み込む）後退プライマー５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＴＧ−３’（配列ＩＤ番号８）と共に使用した。約１ｋｂのＰＣＲ産物を作出し、精製し、及びｐＵＣ１９（ＮＥＢ）にライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、その後ｐｄｈＡ断片をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、及び標準のプロトコールを用いてｐＴＭＯ３１にサブクローニングした。ｐＴＭＯ３１における最終構築物をシークエンスにより実証し、及びｐＴＭＯ４６として割り当てた。
【００６３】
ｉｉｉ）プロモーター断片及び最終デリバリー構築物の作出
上記プロモーター断片をその後ＫｐｎＩ／ＮｄｅＩ断片として−ｐｄｈＡ遺伝子に先行して−ｐＴＭＯ４６構築物にクローニングした。以下のプロモーター領域をはじめの構築物のために選択した：
【００６４】
【表７】
【００６５】
表６．ＰＤＨアップレギュレーションにおいて使用されるプロモーター及びそれらの源
プライマーをＫｐｎＩ／ＮｄｅＩ断片として（以前に示されるようにＧ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ １１９５５、Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＡ１５０３、Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ１３２４０及びＢ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１４５７９から単離された）ゲノムＤＮＡからのこれらのプロモーター領域を作出するために設計し、及びＰＣＲ産物を以前に示される成分及びプロトコールを用いて得た。上記精製ＰＣＲ産物をｐＴＭＯ２３（ＮｄｅＩ部位が欠失したｐＵＣ１９）にライゲートし、及び上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、その後上記プロモーター断片をＫｐｎＩ及びＮｄｅＩで消化し、及び標準のプロトコールを用いてｐＴＭＯ４６にサブクローニングした。ｐＴＭＯ４６における最終構築物をシークエンスにより実証し、及び表７中のプラスミドとして割り当てた。
【００６６】
【表８】
【００６７】
表７．ＰＤＨアップレギュレーションのためのシングルクロスオーバー構築物
ｉｖ）Ｇ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ骨組への最終構築物の統合
ＴＭ８９を以前に示されるエレクトロポーレーションプロトコールを用いて上記プラスミドで形質転換した。推定統合体を以前に示されるように選択し、及びＰＤＨ活性はもちろん、ＡＳＹＥグルコース媒質（嫌気条件）中でのエタノール及び有機酸生成について試験した。結果は表８中に示される。
【００６８】
【表９】
【００６９】
表８．ＡＳＹＥ（０．５％）＋２％グルコース中の新規プロモーター統合体の８時間培養物についてのＰＤＨ分析
上記新規プロモーターは、この時点でＴＭ８９よりかなり高い、比較的高い値のＰＤＨ活性を与えるように見える（しかしながら、ＴＭ８９について記録される低いタンパク質値はＴＭ８９がそのピーク生成点を過ぎていた可能性があることを示す）。それぞれのプロモーターの２の統合体の間の乏しい一致はこれらのプロモーターの相対的強度の比較を困難にする。
【００７０】
ＰＤＨ値について試験された同じ株をまた、これらの新規プロモーターのいずれかが元のプロモーターに勝る利点を提供するかどうかを確立するためのさらなる試みにおいて、増大されたグルコース値及びより低い通気でエタノール生成について試験した。結果は以下の表９中に示される：
【００７１】
【表１０】
【００７２】
表９は２の酸素制限条件下で３％グルコース中の新規プロモーターの効率を調査した。
プロモーター置換の不安定性が上記分析において不一致を生じたので、これらのプロモーターを完全に特徴付け及び比較するためにダブル組換えを作出することが必要であることが明らかになった。安定なＰＤＨアップレギュレーション変異はまた最終的な生物においても必要とされた。
【００７３】
ｃ）ダブルクロスオーバーＰＤＨ変異体
ｉ）最終デリバリー構築物の作出
安定なダブルクロスオーバー統合体を、ｐｄｈＡ遺伝子の上流の配列が図４中に概略されるようにプロモーター断片の前に位置される、表７中のｐＴＭＯ５８シリーズに基づく、さらなる一連のベクターを用いて作出した。これは組換え事件におけるベクター配列の削除及びｐｄｈ遺伝子の前の置換プロモーターの安定な挿入を許容した。
例えば、Ｇ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ １１９５５ ｐｄｈクラスターより先にある配列の部分を、両方の端にＫｐｎＩ部位を導入するために、以前に示されるようにＰＣＲにより増幅した。この配列（１０７２ｂｐ）は３２６ｂｐのｐｄｆ２遺伝子及び全ての介在するオープンリーディングフレーム−ｙｋａＡホモログ−を含んだが、ｙｋａＡ及びｐｄｈＡの翻訳開始の間の配列を省く。上記精製ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９にライゲートし、及び上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、その後上記上流断片をＫｐｎＩで消化し、及び標準のプロトコールを用いてｐＴＭＯ５９にサブクローニングした。最終構築物を−上記挿入物の向きを確立するために−制限酵素分析により、及びシークエンスにより実証し、及びｐＴＭＯ７０として割り当てた。
【００７４】
ｉｉ）Ｇ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ骨組への最終構築物の統合
ＴＭ８９を以前に示されるエレクトロポーレーションプロトコールを用いてｐＴＭＯ７０で形質転換した。推定統合体を以前に示されるように選択し、及びＰＤＨ活性はもちろん、ＡＳＹＥグルコース媒質（嫌気条件）中でのエタノール及び有機酸生成について試験した。
【００７５】
ｉｉｉ）ＴＭ８９におけるＰ ｌｄｈ（ＮＣＡ１５０３）のダブルクロスオーバーの作出
ｐＴＭＯ７０での形質転換からの２の主要な統合体を以前に示されるようにカナマイシンの不在下での振騰液体媒質中での連続サブ培養のために選択した。３サブ培養後、サンプルを希釈し、及びＴＧＰアガー上にまいた。好適な数のコロニーを含むプレートをＴＧＰ+カナマイシンプレートにレプリカプレート作成し、及びカナマイシン感受性コロニーをつつき、及び精製した。これらの株をＡＳＹＥ（０．５％）＋２％グルコース中でのエタノール生成について試験した。試験された１６の推定ダブル組換え体のうち、５（ＴＭ１７９−ＴＭ１８３）が所望の表現型を与えた（その他は親ＴＭ８９と同一であるように見えた）。結果は表１０中に与えられる。
【００７６】
【表１１】
【００７７】
表１０．推定ダブルクロスオーバー変異体における代謝産物形成
ｄ）ダブル組換え体におけるベクターからのＫａｎR遺伝子の存在のチェック
それらの構築において使用されるベクターからのｋａｎR遺伝子がダブル組換え株ＴＭ８９及びＴＭ１８０中にもはや存在しないことをチェックするために、ＰＣＲ反応を図３中に示されるｋａｎR遺伝子について設計されるプライマーを用いて行った。対照ＰＣＲ反応は、ＴＭ８９及びＴＭ１８０においてシングルコピーで存在すると予想されるであろうｐｄｈ遺伝子及び先行する領域についてのプライマーの使用を含んだ。５の株（ＴＭ１５及びＬＣ１２．１、ＴＭ８９及びＴＭ１８０からのシングルクロスオーバー統合体、及びＴＭ１７７）からのゲノムＤＮＡを単離し、及びテンプレートとして使用した。ＴＭ１５、ＬＣ１２．１及びＴＭ１７７は全てカナマイシン抵抗性を示し、及びｋａｎR遺伝子を含むベクターＤＮＡを有すると予想されるであろう。ＰＣＲ反応は以前に示される条件及び成分で行われ、及び実験の詳細は図５中に与えられる。
【００７８】
結果は、シングルクロスオーバー株は全て予想されるようにｋａｎプライマーで予想される大きさ（約０．６ｋｂ）のＰＣＲ産物を与えるが、ＴＭ８９又はＴＭ１８０からはｋａｎプライマーでのＰＣＲ産物はないことを示す。これは、ｋａｎR遺伝子が予想されるように、これらのダブル組換え体において存在しないことを示す。しかしながら、ｐｄｈ領域プライマーは全ての５のゲノムＤＮＡで予想される大きさの産物を与えた。Ｐ ｌｄｈ（ＮＣＡ１５０３）置換挿入物は野生型配列より小さいので、ＬＣ１２．１及びＴＭ１８０ゲノムＤＮＡは他の３の株より約０．２ｋｂ小さい産物を与える。
【００７９】
実施例３：安定なＰＦＬネガティブ変異体の作出
ＰＦＬノックアウトベクターは策２中のＬＤＨノックアウトと全く同じ様式で構築され、及び図５中に概略される。
ａ）ＰＦＬノックアウトベクター構築
既知のＢａｃｉｌｌｕｓ ＰＦＬ配列の間の配列ホモロジーに基づいて設計される、変性したプライマー５’−ＣＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＷＧＧＣＧＴＹＣＴＴＧＡＴＡＴＧＧＡＴＡＣＡ−３’（前進、配列ＩＤ番号２５）、及び５’−ＴＴＣＧＣＡＣＣＴＧＧＷＧＣＡＡＡＹＧＧＴＴＣＴＣＣ−３’（後退、配列ＩＤ番号２６）をＧ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ １１９５５からのゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて１．７ｋｂ断片を増幅するために使用した。ＰＣＲを以前に示されるように行い、及び精製ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９（ＮＥＢ）にライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、及びシークエンスした。生ずるプラスミドをｐＴＭＯ９５として割り当てた。
【００８０】
第二のシリーズのＰＣＲを断片３の３’末端及び断片４の５’末端にＮｏｔＩ部位を導入するためのプライマーで行った。ＰＣＲ１において、プライマー５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＣＡＣＧＧＡＣＣＡＧＧＴＴＡ−３’（前進、配列ＩＤ番号２７）及び５’−ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＧＣ−３’（後退、配列ＩＤ番号２８）を以前に示される条件及び成分でｐＴＭＯ９５と混合し、及び精製ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９（ＮＥＢ）にライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、及びシークエンスした。生ずるプラスミドをｐＴＭＯ１０５として割り当てた。
【００８１】
ＰＣＲ２において、プライマー５’−ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣＧＴＣＧＡＡＴＴＴＧＧＣＧＡＴＧＡ−３’（前進、配列ＩＤ番号２９）及び５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＧＴＡＴＡＣＡＡＣＧＴＴＡＧＡＣＧＴＡＡ−３’（後退、配列ＩＤ番号３０）を以前に示される条件及び成分でｐＴＭＯ９５と混合し、及び精製ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９（ＮＥＢ）にライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、及びシークエンスした。生ずるプラスミドをｐＴＭＯ１０７として割り当てた。
【００８２】
断片４を含むプラスミドｐＴＭＯ１０７をＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。生ずる断片（６２２ｂｐ）を、ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで事前に消化された、断片３を含むｐＴＭＯ１０５にライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。以前のように、アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、及び上記挿入物の向きを確立するために制限酵素分析により特徴付けた。所望の構築物に期待される制限酵素パターンを有するプラスミド（ｐＴＭＯ１１０）を同定し、及びＭ１３ｍｐ１８後退及び前進プライマーを用いたシークエンスにより実証した。
【００８３】
上記変異されたＰＦＬ遺伝子断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでの消化によりｐＴＭＯ１１０から切り取り、及び精製断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで事前に消化されたｐＴＭＯ３１とライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、及び上記挿入物の向きを確立するために制限酵素分析により特徴付けた。生ずるプラスミドをｐＴＭＯ１１１として割り当てた。
【００８４】
ｂ）シングルクロスオーバーＰＦＬネガティブ変異体
プラスミドｐＴＭＯ１１１を以前に示されるようにＴＭ８９及びＴＭ１８０にエレクトロポーレーションにより導入した。両方の株の形質転換体を液体培養物（２ＴＹ＋ｋａｎ１２μｇ／ｍＬ）中で生育させ、及び以前に示されるように統合について選択するために６８℃のＴＧＰ+ｋａｎ１２μｇ／ｍＬアガー上に非常に高い細胞密度でまいた。
コロニーを６８℃のＴＧＰ＋ｋａｎ１２μｇ／ｍＬ上でのストリーキングにより精製し、及びＴＭ８９及びＴＭ１８０により計測可能な値のフォルメート生成を与えることが以前に示されている条件である、１５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ管中の１０ｍＬのＡＳＹＥ（０．５％）＋２％グルコースを用いた（すなわち、低酸素条件下での）、生成試験のために２ＴＹ＋ｋａｎ１２μｇ／ｍＬシード培養物を接種するために使用した。フォルメート生成はより高い酸素値では通常見られない（表９を参照のこと）。ＴＭ８９及びＴＭ１８０中のｐＴＭＯ１１１の推定統合体の試験結果は以下の表１１中に示される。
【００８５】
【表１２】
【００８６】
表１１ ＴＭ８９及びＴＭ１８０中のｐＴＭＯ１１１推定統合体（６８℃）
ＴＭ８９推定統合体の代謝プロファイル（表１１）は全てこの試験におけるＴＭ８９に非常に似ているようであった。あまり生育しなかったｐＴＭＯ１１１／ＴＭ８９／１．１及びｐＴＭＯ１１１／ＴＭ８９／１．３を除外して、それらはＴＭ８９と同様の値でフォルメートを生成し（約２０ｍＭ）、及び同様の値の他の代謝物及び同様の値の残留のグルコースを有した。しかしながら、ＴＭ８９推定統合体はｐｆｌＢ位置での真の統合体ではない可能性がある。あるいは、ＴＭ８９の変異体はこれらの条件下では安定でなく、及び観察された結果は、可能性としてより低い通気下での統合体のより高い不安定性を反映して、復帰突然変異体（上記プラスミドのループアウト）の選択を反映する可能性があった。
【００８７】
ＴＭ８９推定統合体は非常に異なるように見える。全ては、ＴＭ１８０対照と比較されるとき、フォルメートの生成を示さず、低アセテート及び非常に低い残留グルコースを示した。これらはおそらくｐｆｌＢ位置での真の統合体であり、及びそれゆえＰＦＬ生成において欠損している。
【００８８】
ｃ）安定な遺伝子置換ＰＦＬネガティブ変異体
両方の株の第一統合体（ＴＭ１８０及びＴＭ８９中のｐＴＭＯ１１１）を遺伝子置換のための推定ダブルクロスオーバーを作出するために使用した。それぞれの株のいくつかの第一統合体を以前に示されるように、カナマイシンの不在下の振騰液体媒質中で連続的にサブ培養し、その後上記培養物を連続希釈し、ＴＧＰ上にまき、及びＫａｎsコロニーを同定するためにｋａｎ（１２μｇ／ｍＬ）を含むＴＧＰにレプリカプレート作成した。
【００８９】
これらのＫａｎsコロニーをフォルメート生成における減少についてスクリーニングしたとき、それぞれのホストについての４のコロニーはフォルメート生成の欠損を示した。これらの単離物の代謝プロファイルは表１２中に与えられる。
【００９０】
【表１３】
【００９１】
表１２：ＴＭ８９及びＴＭ１８０における推定安定遺伝子置換ＰＦＬネガティブ変異体
ＴＭ８９に基づくＰＦＬ変異体ＴＭ２３６及びＴＭ２３７を中及び低酸素条件下で試験した。低酸素値で、これらの２の株はほとんど生育しなかった。それらは少量のグルコースのみを利用し、及びわずかな（約５ｍＭ）エタノールのみを生成した。見られた唯一の顕著な生成物はピルベート（約１２ｍＭ）であり、計測可能なフォルメート又はアセテートはなかった。しかしながら、増大された酸素で、それらの代謝プロファイルはＴＭ８９により似ているように見えた。この表現型は、ＰＤＨ発現が低通気／嫌気条件下では低すぎてＰＦＬの役割を効果的に置換できないＰＦＬノックアウトとフィットするであろう、及びＴＭ８９中のｐＴＭＯ１１１の推定第一統合体がＴＭ８９と同様に見える、表１２中の第一統合体により示される表現型を説明するであろう。これはこれらの条件下でのＰＦＬ変異体の乏しい生育を説明するであろう、及び相同組換えによる野生型への復帰への強い選択を提供する。ＴＭ８９の他の推定ＰＦＬネガティブ変異体−ＴＭ２４４及びＴＭ２４５−を異なる第一統合体から単離したが、ＴＭ３６及びＴＭ３７と同様のプロファイルを有する。
【００９２】
ＴＭ１８０に基づくＰＦＬ変異体ＴＭ２４０、ＴＭ２４１、ＴＭ２４２及びＴＭ２４３（ＴＭ２４３は他の３とは異なる第一統合体からであった）は表１１中のＴＭ１８０に基づく第一統合体で見られたのと同様の表現型を示す（計測可能なフォルメート生成はなく、ＴＭ１８０と比較されるときより高いエタノール及びより低いアセテート）。それらはそれゆえ遺伝子置換からの安定なＰＦＬ変異体であると仮定される。
【００９３】
ｄ）ＰＦＬ遺伝子置換の証明
上記に示される推定ＰＦＬ変異体は真の遺伝子置換であったかどうかを試験するために、ＰＣＲ実験を設定した。ゲノムＤＮＡをＴＭ２３６、ＴＭ２４１、ＴＭ２４２及びＴＭ２４３について調製した。使用されたプライマーはノックアウト設計のためのＰＦＬ配列を提供した１１９５５から元のＰＦＬ ＰＣＲ産物を作出するために使用された、配列ＩＤ番号２５及び配列ＩＤ番号２６であった。ＰＦＬノックアウト構築物ｐＴＭＯ１１１において使用されたＰＦＬ配列は全てプライマー配列、配列ＩＤ番号２５及び２６の内側であり、上記配列はｐＴＭＯ１１１内に含まれないことを意味する。したがって、上記ノックアウト構築物はこれらのプライマーでＰＣＲ産物を作出するはずないが、上記遺伝子置換株及び野生型株は産物を作出するはずである。
【００９４】
ＰＦＬネガティブ遺伝子置換変異体からのゲノムＤＮＡは野生型の産物より０．４ｋｂ小さい、及び新規ＮｏｔＩ部位を有する単一のＰＣＲ産物を与えるはずである。
これらのプライマー及びゲノムＤＮＡを用いて、対照として１１９５５ゲノムＤＮＡ及びｐＴＭＯ１１１プラスミドＤＮＡを伴って、全ての４の変異体は、１１９５５からの約１．７ｋｂ（理論上１６９４ｂｐ）の単一の産物と比較して、約１．３ｋｂ（理論上１３４２ｂｐ）の単一のＰＣＲ産物を与えたことが示された。予想されるように、ｐＴＭＯ１１１では産物は得られなかった。上記５の株からのＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｏｔＩで消化し、及びアガロース電気泳動ゲル上で流した。全ての４のＰＦＬネガティブ変異体からのＰＣＲ産物は完全に消化され、約０．６〜０．７ｋｂ（理論上６５０ｂｐ及び６９１ｂｐ）の２の産物を与え、一方で１１９５５の産物はＮｏｔＩにより切断されなかった。この試験は決定的であるはずであり、それゆえこれらの４の株は天然のｐｆｌ遺伝子が０．４ｋｂ欠失及び新規ＮｏｔＩ部位を含むｐｆｌ遺伝子で（相同組換えにより）置換されている真のＰＦＬ変異体であると結論付けられうる。
【００９５】
キシラン発酵：
クイック及びシンプル管培養実験をオートクレーブされ及びさまざまなヘミセルラーゼで処理された商業的に入手可能なキシラン（Ｓｉｇｍａ）中でＴＭ２４２で行った。私たちはＨＰＬＣ分析において糖ピークの消失を観察し、及びさらなる実験において私たちはエタノール生成を観察した−このことは、上記生物が酵素処理されたヘミセルロース（商業的なリグノセルロースエタノール生成の最終的な標的）を発酵させることができる可能性を有するのみでなく、この生物はグルコース及びキシロースを分解するために最も大量の酵素及び時間を必要とする二量体−セロビオース及びキシロビオース−を利用することができることを示す。これは現行の技術を超える顕著な改善及び利点である。ヘミセルラーゼを用いたエタノール生成の結果は表１３中に示される。
【００９６】
【表１４】
【００９７】
変異体１１９５５及びＴＭ２４２をまた炭素源として異なる炭水化物を用いた嫌気発酵についても試験した。結果は表１３中に示される。
【００９８】
【表１５】
【００９９】
ＴＭ８９として本明細書中に定義される微生物及びプラスミドｐＵＢ １９０−ｌｄｈはそれぞれＮＣＩＭＢアクセス番号４１２７５及び４１２７６の下に寄託されている。保管所はＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ， Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ， Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ， Ａｂｅｒｄｅｅｎ， ＡＢ２１ ９ＹＡ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍである。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は細菌発酵の生成物としてのエタノールの生成に関する。詳細には、本発明は好熱性細菌によるエタノール生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細菌代謝は細菌種及び環境条件に因りさまざまな異なる機構をとおして起こりうる。全ての病原体を含む有機栄養（従属栄養）細菌は有機化合物の酸化からエネルギーを得、炭水化物（特にグルコース）、脂質及びタンパク質は最も一般に酸化される化合物である。細菌によるこれらの有機化合物の生物学的酸化は化学エネルギー源としてのＡＴＰの合成をもたらす。上記プロセスはまた生合成反応のために細菌細胞により必要とされるより単純な有機化合物（前駆分子）の生成をも許容する。細菌が好適な基質を代謝する一般的なプロセスは、グルコースをＡＴＰの生成を伴ってピルベートに変換する一連の反応である解糖である。代謝エネルギーの生成におけるピルベートの運命は微生物及び環境条件に因り変化する。ピルベートの３の主な反応がある。
【０００３】
第一に、好気条件下で、多くの微生物はクエン酸サイクル及びピルベートデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）により触媒されるピルベートのアセチルコエンザイムＡへの変換を用いてエネルギーを生成するであろう。
【０００４】
第二に、嫌気条件下で、いくつかのエタノール生成生物はピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）により触媒されるピルベートのアセトアルデヒドへの脱炭酸及び続くアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）により触媒されるＮＡＤＨによるアセトアルデヒドのエタノールへの還元によりアルコール発酵を行いうる。
【０００５】
第三のプロセスはラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）による触媒をとおして起こるピルベートのラクテートへの変換である。
【０００６】
天然に嫌気発酵を行う微生物を用いて又はピルベートデカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を組み込む組換え微生物の使用をとおしてエタノール生成のために微生物を用いることにおいて多くの興味がある。これらの微生物を用いることによるエタノール生成においていくつかの成功があるが、発酵はしばしば特に微生物が低レベルのエタノール耐性しか有しない場合、高濃度のエタノールにより妥協される。
好熱性細菌はエタノール生成に提案されており、及びそれらの使用は発酵が生成されたエタノールが５０℃超の温度で蒸気として除去されることを許容する高温で行われうるという利点を有する；これはまた発酵が高い糖濃度を用いて行われることをも許容する。しかしながら、効率的にエタノールを生成しうる好適な好熱性細菌を発見することは問題が多い。
【０００７】
ＷＯ８８／０９３０９は好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ株ＬＬＤ−Ｒを用いたエタノール生成を開示する。ＬＬＤ−Ｒは培養物から自然発生的に生じた胞子形成欠損株であり、及びそこでｌｄｈ遺伝子は自然発生的な突然変異により又は化学的突然変異誘発により不活性化されている。上記株はしかしながら以下に示されるように不安定である。
【０００８】
ＷＯ０１／４９８６５はエタノール生成のための、ピルベートデカルボキシラーゼをコードする異種の遺伝子で形質転換された及びネイティブのアルコールデヒドロゲナーゼ機能を有するグラム陽性細菌を開示する。上記細菌は好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓであり、及び上記細菌はトランスポゾン挿入を用いたラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化により改変されうる。ＷＯ０１／４９８６５中で開示される細菌は全てＢａｃｉｌｌｕｓ株ＬＬＤ−Ｒに由来する。株ＬＮ及びＴＮは株ＬＬＤ−Ｒの改善された誘導体として開示される。しかしながら、全ての株はプラスミド形質転換を妨げるＨａｅＩＩＩ型制限酵素システムを含み、及びそれゆえ非メチル化ＤＮＡ内の形質転換を妨げる。
【０００９】
ＷＯ０１／８５９６６は制限酵素問題を克服するｉｎ ｖｉｖｏメチル化により調製される微生物を開示する。これは株ＬＬＤ−Ｒ、ＬＮ及びＴＮへのＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓからのＨａｅＩＩＩメチルトランスフェラーゼでの形質転換を必要とする。しかしながら、株ＬＬＤ−Ｒ、ＬＮ及びＴＮは不安定な変異体であり、及び特に低ｐＨで及び高い糖濃度でラクテート生成野生型株に自発的に戻る。これはエタノールからラクテートへの発酵生成物変化をもたらし、上記株をエタノール生成には不適当にする。
【００１０】
ＷＯ０２／２９０３０は、株ＬＬＤ−Ｒ及びその誘導体がｌｄｈ遺伝子のコード領域中に天然の挿入エレメント（ＩＥ）を含むことを開示する。これのｌｄｈ遺伝子への（及びｌｄｈ遺伝子からの）転位及び続く遺伝子不活性化は不安定であり、回復をもたらす。このことへの提案された解決法はプラスミドＤＮＡをＩＥ配列に統合することであった。
【００１１】
それゆえ、本分野において、エタノール生成のための微生物の作出は研究室で作出された化学的突然変異Ｂａｃｉｌｌｕｓ微生物を改変すること、これらをｉｎ ｖｉｖｏメチル化手順で処理すること及びプラスミドＤＮＡをＩＥ配列に統合するために上記微生物をさらに改変することに頼る。上記手順は複雑で、不確定であり、及びまたどのように上記株が使用されうるかという調節の問題もある。
それゆえ、エタノール生成のための改善された微生物について要求がある。
【発明の概要】
【００１２】
発明の要約
本発明の第一の局面にしたがって、好熱性微生物は増大されたエタノール生成を許容するよう改変され、ここで第一の改変はラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化であり、及び第二の改変はピルベートデヒドロゲナーゼ遺伝子をアップレギュレートする。
本発明に係る微生物は野生型に比較して増大されたエタノール生成を示す。
本発明の第二の局面にしたがって、エタノールの生成方法はＣ3、Ｃ5又はＣ6糖の存在下の好適な条件下で上記に提供される定義にしたがう微生物を培養することを含む。
図面の説明
本発明は付属の図面を引用して示され、ここで：
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は解糖の代謝経路を略図で示す；
【図２】図２はＰＤＨ複合体の遺伝子を示す；
【図３】図３はＰＤＨの標的化アップレギュレーションのためのプロモーター置換構築物の概略図である；
【図４】図４はダブル−クロスオーバーのアップレギュレートされたＰＤＨ変異体のためのプロモーター置換構築物の概略図である；
【図５】図５は安定なＰＦＬ−ネガティブ変異体を作出するために意図されるノックアウト構築物の概略図である、及び
【図６】図６は本発明に係る変異体微生物で生成される高いエタノール生成のグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の説明
本発明はラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を破壊するための及びＰＤＨ遺伝子をアップレギュレートするための好熱性微生物の改変に基づく。
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を不活性化することはピルベートのラクテートへの分解を妨げることを助け、及びそれゆえピルベートデカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼを用いたピルベートのエタノールへの分解を（適切な条件下で）促進する。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が遺伝子内の又は遺伝子の欠失により破壊される場合、それは好ましい。
【００１５】
ＰＤＨ遺伝子をアップレギュレートすることはピルベートのアセチルＣｏＡへの変換を促進し、アセチルＣｏＡはその後適切な条件下でアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いてアセトアルデヒド及び最後にはエタノールを生成するために使用されうる。ＰＤＨをアップレギュレートするさらなる利点はグルコース取り込み及び解糖に対して阻害効果を有するピルベート値が減少されることである。これはエタノール生成をさらに促進する。
【００１６】
上記微生物はどんな好熱性微生物でもありうるが、上記微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐのものである場合それは好ましい。詳細には、上記微生物がＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の野生型微生物、詳細にはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓである場合それは好ましい。
【００１７】
好ましい態様において、改変のために選択される微生物は「野生型」であると言われる、すなわち、それらは研究室で作出された変異体ではない。上記微生物は好熱性細菌を含むと期待される環境サンプルから単離されうる。単離された野生型微生物はエタノールを生成する能力を有するであろうが、改変されない場合、ラクテートが主要な発酵生成物であるようである。上記単離物はまた高温でヘキソース及び／又はペントース糖、及びそれらのオリゴマー上で生育するそれらの能力について選択される。
【００１８】
本発明に係る微生物が、上記微生物が発酵プロセスにおいて使用されることを許容するいくつかの所望の特性を有することは好ましい。上記微生物は好ましくは制限酵素システムを有しないべきであり、それによりｉｎ ｖｉｖｏメチル化の必要性を避ける。さらに、上記微生物は少なくとも３％エタノールまで安定であるべきであり、及び基質としてセロビオース及びデンプンを含むＣ3、Ｃ5及びＣ6糖（又はそれらのオリゴマー）を利用する能力を有するべきである。上記微生物が高い頻度で形質転換可能である場合それは好ましい。さらに、上記微生物は０．３ｈ-1以上の希釈速度を支持するような連続培養物における成長速度を有するべきである（典型的に０．３ＯＤ600）。
【００１９】
上記微生物は好熱性であろう、及び４０℃〜８５℃の温度範囲で生育するであろう。好ましくは、上記微生物は５０℃〜７０℃の温度範囲内で生育するであろう。さらに、上記微生物がｐＨ７．２以下、詳細にはｐＨ６．９〜ｐＨ４．５の条件下で生育することが所望される。
【００２０】
上記微生物は胞子形成体でありうる又は胞子形成をしない。上記発酵プロセスの成功は必ずしも上記微生物の胞子形成する能力によらないが、上記微生物を上記発酵プロセスの終わりに動物フィードストックとして使用することが所望されるとき、いくつかの状況下では胞子形成体を有することが好まれうる。これは動物フィードストックとして使用されるとき優れた免疫刺激を提供する胞子形成体の能力のためである。胞子形成微生物はまた発酵中に沈殿する能力をも有し、及びそれゆえ遠心分離の必要性なしに単離されうる。したがって、上記微生物は複雑な又は高価な分離手順の必要性なしに動物フィードストック中で使用されうる。
【００２１】
ラクテートデヒドロゲナーゼについての核酸配列は今や既知である。この配列を用いて、当業者は異なる機構をとおして上記遺伝子の不活性化を達成するようラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を標的化することが可能である。上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子がトランスポゾンの挿入により又は好ましくは上記遺伝子配列若しくは上記遺伝子配列の一部の欠失により不活性化される場合それは好ましい。欠失はトランスポゾン不活性化が使用されるときしばしば経験される上記遺伝子配列の再活性化の困難さを避けるので、欠失は好ましい。好ましい態様において、上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子はプラスミド及び上記微生物の染色体の間で天然の相同組換え又は統合を達成する温度感受性プラスミド（ＰＣＴ／ＧＢ０６／０１５８６中に開示されるプラスミドｐＵＢ１９０−ｌｄｈ）の統合により不活性化される。染色体統合体は抗生剤（例えば、カナマイシン）に対するそれらの抵抗性に基づいて選択されうる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子への統合はシングルクロスオーバー組換え事件により又はダブル（又はそれより多い）クロスオーバー組換え事件により起こりうる。ダブルクロスオーバー事件がＬＤＨ遺伝子（又はその部分）及びはじめの統合体、すなわち温度感受性プラスミドを除去するよう行われることは好ましい。このようにして、上記変異体微生物はどんな異種のＤＮＡをも含まないであろう、及びそれゆえＧＭＯ規定にしたがって遺伝的に改変された生物（ＧＭＯ）として分類されないであろう。
【００２２】
上記第二の改変はＰＤＨをアップレギュレートすることである。ＰＤＨは３のユニット−Ｅ１：ピルベートデカルボキシラーゼ（ＥＣ １．２．４．１であり、ＥＣ ４．１．１．１ではない）、Ｅ２：ヂヒドロリポアミドトランスアセチラーゼ、及びＥ３：ヂヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼを含む、大きな酵素複合体である。上記複合体はＮＡＤ、ＦＡＤ、コエンザイムＡリポ酸及びチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）を含むいくつかの共同因子を必要とする。Ｅ１ユニットはα及びβサブユニットのヘテロダイマーであるので、４の遺伝子が上記複合体をコードし、及びしばしばｐｄｈＡ、ｐｄｈＢ、ｐｄｈＣ及びｐｄｈＤ（それぞれＥ１α、Ｅ１β、Ｅ２及びＥ３）として記述される。ＰＤＨのＥ１ユニットは、ＰＤＣ ＥＣ ４．１．１．１がＴＰＰを必要とし、及び同様の脱炭酸反応を触媒するのと同様にＴＰＰを必要とするが、（他の酵素ユニットが有する）コエンザイムＡ及びリポ酸の存在下では生成物はアセトアルデヒドではなくアセチルＣｏＡである。しかしながら、Ｅ１ユニットのＰＤＣ活性は、それがＰＤＨ中の他のユニットと複合体化されていないとき計測されている（Ｌｅｓｓａｒｄ ＆ Ｐｅｒｈａｍ； Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；１９９４，２６９：１４，１０３７８−１０３８３；Ｔｏｍａｒ ｅｔ ａｌ； Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ２００３，６２，７６−８２； Ｆｒａｎｋ ｅｔ ａｌ； Ｓｃｉｅｎｃｅ； ２００４， ３０６： Ｏｃｔ ２９，８７２−８７６，補足データ）。したがって、アセトアルデヒドがアセチルＣｏＡ以上に生成されるように、ＥＣ １．２．４．１のＰＤＣ活性はＰＤＨのアップレギュレーションにより高められうる。高められたＰＤＨ活性はまたピルベートボトルネック（渋滞）を除去し、副生成物としてのより少ないアセテート及びフォルメートを伴ってより多くのエタノールが生成されることを許容すると考えられる。
【００２３】
この終わりに、ＰＤＨ遺伝子及び周囲の配列を標準の「ゲノムウォーキング」技術を用いて単離した。約８．８ｋｂのＤＮＡを単離し、シークエンスし、及び図２及び表１中に示される以下の遺伝子を含むことを発見した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
推定プロモーター領域は図２（矢印）中に示される−１はｐｄｈＡの開始から上流であり、及び推定第二プロモーターはｐｄｈＣの前方である。ＰＤＨクラスター中の第二プロモーターの以前の例はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓについて報告されたが（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ２００２， １８４：１０， ２７８０−２７８８）、ほとんどの示されたＰＤＨ遺伝子クラスターは上記クラスターの上流にただ一つのプロモーターを有する（Ｎｅｖｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ； Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ； １９９８ １３８５， ３６７−３７２）。上記アップレギュレーションは本分野において知られる技術を用いて行われうる。詳細には、アップレギュレーションはＰＤＨ複合体の上流の好適なプロモーター又はエンハンサー配列を導入することにより行われうる。
【００２６】
上記酵素複合体は好気及び嫌気条件下の両方ではたらくことが知られるが（Ｃａｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ； Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ； １９８５， ４９：３， ６７４−６７８）、それは一般的には好気性酵素であると考えられ（Ｃｈ １５； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｎｅｌｓｏｎ ＆ Ｃｏｘ； ２nd Ｅｄ， Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３， ｐ４４７）、ピルベートフォルメートリアーゼ（ＰＦＬ）はその嫌気性相対物である。両方の酵素は解糖において形成されたピルベートをアセチルＣｏＡに変換してＴＣＡサイクルに供給するが、上記サイクルは完全に好気条件下でのみはたらく。しかしながら、嫌気条件を使用することが所望されるので、嫌気条件においてはたらくプロモーターは本発明における使用のために好ましい。したがって、嫌気条件下ではたらくと考えられる酵素のためのプロモーター−例はＬＤＨプロモーター（Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＮＣＡ１５０３、ＤＳＭ１３２４０及びＡＴＣＣ１４５７９からのＰ ｌｄｈ）及びフェレドキシンプロモーター（Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ＤＳＭ１３２４０からのＰ ｆｅｒｒＡ）である−を同定し、単離し及びｐｄｈＡの開始からすぐ上流の適切な部位に安定に統合した。使用される株及びＰＤＨ複合体に挿入されるプロモーターは表２中に示される。ほとんどの例において、上記プロモーターはＰＤＨ発現における１０倍増大、グルコース消費における増大、ピルベートをごくわずかな値まで減少させること及びエタノール生成における〜５０％増大を作出する。おもしろいことに、アセテート値は同じままであり、エタノール生成を好むエタノール：アセテート比率における増大をもたらした。
【００２７】
【表２】
【００２８】
好ましい態様において、第三の改変はＰＤＣ活性を高めるために導入される。これはＥ２（ＥＣ２．３．１．１２）を不活性化することにより行われうる。不活性化はＬＤＨの不活性化と同様の様式で、ただしＥ２遺伝子を破壊の標的として行われうる。
【００２９】
さらなる態様において、本発明に係る微生物は、ピルベートフォルメートリアーゼ遺伝子を不活性化し、それによりピルベートのアセチルＣｏＡ及びフォルメートへの変換を妨げる／減少させるさらなる改変を含む。ピルベートフォルメートリアーゼ（ＰＦＬ）はピルベートデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）の「嫌気性相対物」であり、及びピルベートをアセチルＣｏＡ及びフォルメートに変換する（図１を参照のこと）。アセチルＣｏＡはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡｃＨＤ）を介してエタノールに変換されうる一方で、フォルメートはエタノール生成生物における成長を阻害する可能性を有する所望されない副生成物である。
【００３０】
ＰＦＬをエタノール生成に向かう代謝の流れを促進するために及びエタノール合成への残りの経路の酸化還元バランスを改善するためにノックアウトの標的として選択した。追加の利点はフォルメート生成の消去である。ＰＦＬ活性は変えられた表現型の持続のための抗生物質選択に頼らない変異体を作出するために（以下に示される）ＬＤＨノックアウトのための同じプロトコールを用いて不活性化されうる。この態様において、嫌気条件下でエタノール生成が増大されるように、上記微生物がラクテートデヒドロゲナーゼ不活性化及びピルベートデヒドロゲナーゼのアップレギュレーションの両方を含むことは好ましい。
【００３１】
ＰＦＬ遺伝子はＬＤＨの不活性化について開示される技術を用いて不活性化されうる。トランスポゾン挿入が使用されうる又は遺伝子欠失（又は部分的な遺伝子欠失）が使用されうる。遺伝子欠失（又は部分欠失）が使用されることは好ましい。
【００３２】
さらなる好ましい態様において、上記微生物はまた異種のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をも含むであろう。この異種の遺伝子の発現はエタノールが主たる発酵生成物であるように代謝を向けなおす酵素の作出をもたらす。上記遺伝子はｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓを含むｚｙｍｏｍｏｎａｓ種を含む、典型的に嫌気性発酵を行う微生物から得られうる。
【００３３】
上記遺伝子の調製及び微生物への組み込みの方法は、例えば、Ｉｎｇｒａｍ ｅｔａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｈ ＆ ＢｉｏＥｎｇ， １９９８； ５８（２＋３）：２０４−２１４及びＵＳ ５９１６７８７中で知られ、それぞれの内容を本明細書中に援用する。上記遺伝子は、当業者により理解されるであろうように、プラスミド中に導入され又は染色体に統合されうる。
【００３４】
本発明に係る微生物は選択される好熱性微生物に因り、慣習的な培養条件下で培養されうる。基質、温度、ｐＨ及び他の生育条件の選択は既知の培養必要条件に基づいて選択されうる、例えば、それぞれの内容を本明細書中に援用する、ＷＯ０１／４９８６５及びＷＯ０１／８５９６６を参照のこと。
本発明はここで以下の実施例において、付属の図面を引用して、例示のためにのみ示されるであろう。
【実施例】
【００３５】
ＬＤＨ遺伝子の不活性化
実施例１：安定なＬＤＨ変異体の作出
策を遺伝子置換及び以下の２のアプローチによりＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｄａｓｉｕｓ ＮＣＩＭＢ １１９５５中のＬＤＨ遺伝子の安定な変異を作出するよう設計した。
アプローチ１において、ＬＤＨコード配列の中央に近い２の存在する独特の制限酵素部位を欠失を作出するために活用した。単一のラージＰＣＲ産物を入手可能なＬＤＨ配列のほとんどを含むゲノムＤＮＡから作出し、及びｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のマルチプルクローニング部位中のＳｍａＩ部位にクローニングした。上記ｐＵＣ１９クローンをその後ＢｓｔＥＩＩ及びＢｓｒＧＩで連続して消化し、及びＫｌｅｎｏｗ消化後に再ライゲートし、ＢｓｔＥＩＩ及びＢｓｒＧＩの間のＬＤＨ遺伝子における内部欠失を作出した。
【００３６】
アプローチ２において、ＬＤＨ遺伝子を、ＬＤＨ配列の中央における欠失の作出を伴って、２のＰＣＲ産物がｐＵＣ１９０中で共にライゲートされることを許容するように以下のオリゴプライマーでＮｏｔＩ部位を導入して、２のＰＣＲ産物としてクローニングした。
内部欠失を有する、それぞれのアプローチから生ずるＬＤＨ遺伝子を３の可能性のあるデリバリーシステム：ｐＵＢ１９０、ｐＮＷ３３Ｎ及びＴＭＯ１９にサブクローニングした。
表３は欠失アプローチ２に使用されるＰＣＲプライマーを示す。
【００３７】
【表３】
【００３８】
表４は上記デリバリーベクターの特性を列挙する。
【００３９】
【表４】
【００４０】
アプローチ１：ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして使用するために１１９５５から調製した。１１９５５の２０ｍＬ一晩培養（ＴＧＰ媒質、５２℃）からの細胞を遠心分離（４０００ｒｐｍ、２０分間）により回収した。上記細胞ペレットを２．５ｍｇリソザイム及び５０μＬのリボヌクレアーゼＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を含む５ｍＬ ＳＴＥ緩衝液（０．３Ｍスクロース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁した。これを３０℃で１時間インキュベートし、その後５ｍｇプロテイナーゼＫ及び５０μＬの１０％ ＳＤＳを添加し、続いて３７℃でさらに１時間インキュベートした。溶解された培養物をその後等体積のフェノール：クロロフォルム（１：１）、続いてクロロフォルムで連続して抽出し、その後イソプロパノールで沈殿させた。７０％氷冷エタノールで２回洗浄した後、上記ＤＮＡペレットを０．５ｍＬ ＴＥ緩衝液中に再溶解した。
【００４１】
アプローチ２：ＬＤＨ欠失構築物の作出
ＰＣＲをＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行い、及び反応条件は以下のとおりであった：サイクル１−９５℃で５分間の変性、４７℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長、サイクル２〜３０−９５℃で１分間の変性、４７℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長、及び７２℃で５分間の最後のインキュベーション。使用された酵素はＰｆｕポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＴａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）の等しい混合物であった。使用された緩衝液及びｄＮＴＰｓは製造業者の教示（Ｐｆｕ、Ｐｒｏｍｅｇａ）にしたがった。使用されたＤＮＡテンプレートは上記で調製された１１９５５ゲノムＤＮＡであり、及び生ずるＰＣＲ産物は製造業者の教示にしたがってアガロースゲル電気泳動、続いてゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、 Ｑｉａｇｅｎ）を用いた上記ゲルからの溶離を介して精製された。上記精製されたＰＣＲ産物をＳｍａＩで事前に消化されたｐＵＣ１９（ＮＥＢ）中にライゲートし、上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、及び制限酵素分析により特徴付けた。
【００４２】
（プライマー３及び４を用いて作出された、断片の３’末端に導入された新規ＰｓｔＩ部位及び５’末端に導入されたＮｏｔＩ部位を伴う）ｐＵＣ１９に挿入された断片２を伴うプラスミド（ｐＴＭＯ０２）をＮｏｔＩ及びＰｓｔＩで消化した。生ずる断片（約０．４ｋｂ）を、ＮｏｔＩ及びＰｓｔＩで消化された（プライマー対１及び２で作出された）断片１を有するｐＵＣ１９プラスミド（ｐＴＭＯ０１）中にライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。前のように、アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、及び上記挿入物の向きを確立するために制限酵素分析により特徴付けた。
【００４３】
所望の構築物に期待される制限酵素パターンを有するプラスミド（ｐＴＭＯ０３）を同定し、及びＭ１３ｍｐ１８後退及び前進プライマーを用いたシークエンスにより実証した。
変異されたＬＤＨ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩでの消化によりｐＴＭＯ０３から切り取り、及び前のようにアガロースゲル電気泳動をとおして精製した。上記断片をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ（ＮＥＢ、製造業者の教示にしたがって）で処理して、ＸｂａＩで消化され及びＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理されたｐＵＢ１９０中へのライゲーションのためにブラントエンドを作出した。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＳＣＳ１１０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。前のように、アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、及び制限酵素分析により特徴付けた。所望の構築物に期待される制限酵素パターンを有するプラスミド（ｐＴＭＯ１４、ｐＵＢ１９０骨組に基づく）を同定し、及び以下に示されるプロトコールを用いたエレクトロポーレーションによりＮＣＩＭＢ１１９５５を形質転換するために使用した。
【００４４】
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ ＮＣＩＭＢ １１９５５のためのエレクトロポーレーションプロトコール
１１９５５の凍結ストックをＴＧＰ媒質中の一晩培養物を生育し（５５℃で２５０ｒｐｍで振騰される、２５０ｍＬ円錐フラスコ中で５０ｍＬ体積、ＯＤ600〜２）、等体積の２０％グリセロールを添加し、１ｍＬ等分に分け、及び−８０℃で凍結管中で貯蔵することにより作出した。１ｍＬのこのストックを２５０ｍｌ円錐フラスコ中の５０ｍＬの事前に温められたＴＧＰを接種するために使用し、それを１．４のＯＤ600が達成されるまでインキュベート（５５℃、２５０ｒｐｍ）した。
【００４５】
上記フラスコを氷上で１０分間冷却し、その後上記培養物を５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ管中で４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上記ペレットを５０ｍＬの氷冷エレクトロポーレーション媒質中に再懸濁し、及び遠心分離（４，０００ｒｐｍ、２０分間）した。３回のさらなる洗浄をこのように（１×２５ｍＬ及び２×１０ｍＬ）行い、その後上記ペレットを１．５ｍＬの氷冷エレクトロポーレーション媒質中に再懸濁し、６０μＬ等分に分け、及び将来の使用のために−８０℃で０．５ｍＬエッペンドルフ管中で貯蔵した（又は即座に使用した）。
【００４６】
エレクトロポーレーションのために、水中の１〜２μＬのＤＮＡを氷上で維持されるエッペンドルフ管中の６０μＬのエレクトロコンピーテント細胞に添加し、及びおだやかに混合した。この懸濁物を事前に冷却されたエレクトロポーレーションキュベット（１ｍｍギャップ）に移し、及び２５００Ｖ、１０μＦキャパシタンス及び６００Ωレジスタンスでエレクトロポーレートした。パルスの直後に、１ｍＬの事前に温められたＴＧＰを添加し、混合し、及び上記懸濁物をスクリュートップ管に移し、及び振騰温浴中で５２℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、上記懸濁物を直接プレートにまいた（例えば、２×０．５ｍＬ）又は遠心分離し（４，０００ｒｐｍ、２０分間）、２００μＬ〜５００μＬ ＴＧＰ中に再懸濁し、及び適切な抗生物質を含むＴＧＰアガー上に広げ、及び５２℃で一晩生育させた。抗生物質抵抗性形質転換体は２４時間後に観察された。
【００４７】
【表５】
【００４８】
シングルクロスオーバーＬＤＨネガティブ第一統合体の選択
生物のゲノムへの統合のために使用されるプラスミド（例えば、ｐＴＭＯ１４）は温度感受性である。ｐＵＢ１９０に基づくノックアウトベクターは５４℃でホスト内で複製することができるが、６５℃超ではできない。したがって、６８℃でカナマイシンの存在下で生育するために、上記ホストはゲノム内に上記プラスミドを組み込まなければならない。
【００４９】
ｐＴＭＯ１４でのＧ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｄａｓｉｕｓ ＮＣＩＭＢ １１９５５の形質転換からのカナマイシン抵抗性コロニーを１２μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＴＧＰアガー上のシングルコロニーへのストリーキングにより精製した。この形質転換体をゲノムＬＤＨ対立遺伝子での相同組換えをしかけることにより１１９５５中で第一統合体を作出するために使用した。これは５２℃及び２５０ｒｐｍで２５０ｍＬ円錐フラスコ中で一晩５０ｍＬ ＴＧＰ媒質中で上記株を生育させ、上記培養物を遠心分離し（４，０００ｒｐｍ、２０分間）、１ｍＬ ＴＧＰ中に上記細胞を再懸濁し、及び６８℃で一晩のインキュベーションのために１２μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＴＧＰアガープレート上に広げることにより達成された。これらの条件下で、ｐＵＢ１９０は自主栄養プラスミドとして複製することはできない。この方法で得られたコロニーの大多数は、ラクテート生成について試験されるとき、増大されたエタノール生成を伴うＬＤＨ−表現型を与え、ＬＤＨ位置での統合によるＬＤＨ変異体の作出を示す。
【００５０】
ダブルクロスオーバーによる遺伝子置換ＬＤＨ変異体の作出
ｐＴＭＯ１４の推定第一統合体（ＴＭ１５）を上記の形質転換から同定し、及びダブル組換え体を得るために使用した。これは５４℃で８時間及び５２℃で１６時間を交替する、カナマイシンを含まないＴＧＰ媒質中のＴＭ１５の５の連続したサブ培養物（５０ｍＬファルコン管中の５ｍＬ、２５０ｒｐｍ、サブ培養物間で１％移動）をとおして達成された。これらの５の継代後、生ずる培養物を連続希釈し、及び１００μＬサンプルをＴＧＰプレート上に広げ、及び一晩生育させた。１２μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＴＧＰアガー上への生ずるコロニーのレプリカプレート作成をカナマイシン感受性コロニーを同定するために使用した。精製するためのアガー上のシングルコロニーへのストリーキング後、これらのカナマイシン感受性誘導体をラクテート生成について試験し、及び予想されるように、ＬＤＨ＋及びＬＤＨ−の混合物であることが証明された。１のＬＤＨ−誘導体、ＴＭ８９をＰＣＲ及びサザンブロットによりさらに特徴付けた。
【００５１】
ＬＤＨ遺伝子置換の証明
ゲノムＤＮＡをＴＭ１５（第一統合体）及びＴＭ８９（推定ダブル組換えＬＤＨ−）から調製し、及び上記に使用される条件を用いた、プライマー１及び４を用いたＰＣＲにテンプレートとして使用した。１１９５５からのゲノムＤＮＡを対照として使用した。上記ＰＣＲ産物（約０．８ｋｂバンドが全ての３のテンプレートから得られた）を以前に示されるように精製し、及びサンプルをＮｏｔＩで消化し、その後０．７％アガロース電気泳動ゲル上で流した。１１９５５のＰＣＲ産物は予想されるようにＮｏｔＩ消化の証拠を示さず、一方ＴＭ８９のＰＣＲ産物は０．４ｋｂ辺りの２のバンドを与え、変異された対立遺伝子での野生型遺伝子の置換を示した。第一統合体であるＴＭ１５のＰＣＲ産物のＮｏｔＩ消化は、切断されていない（０．８ｋｂ）バンドの痕跡を伴って、ＴＭ８９で見られる上記２のバンドを主に与えた。これはＴＭ１５ゲノムＤＮＡのサザンブロットで得られた結果により説明されうる。
【００５２】
１１９５５、ＴＭ１５及びＴＭ８９のゲノムＤＮＡをＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、及び電気泳動アガロースゲル上で流した。上記ＤＮＡを正荷電ナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ）上に移し、及びＤＩＧ標識化された（ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ、製造業者の教示にしたがって）プライマー１及び４（表３）を用いた１１９５５ＬＤＨ遺伝子からのＰＣＲにより作出されたプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしているバンドを供給される検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて視覚化した。サザンブロットはＴＭ１５のＮｏｔＩ消化において約７．５ｋｂの多く増幅されたバンド、ＴＭ１５のＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ及びＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ消化において約７．０及び０．４ｋｂの同様に増幅されたバンドの証拠を示し、この第一統合体中のＬＤＨ位置で統合されるｐＴＭＯ１４の多数のタンデムコピーの統合を示した。全ての３の制限酵素消化で、ＴＭ８９は、遺伝子置換と一致して、１１９５５に比較して余分のハイブリダイズしているバンドを示す異なる制限酵素パターンの証拠を示した。
【００５３】
実施例２：安定なアップレギュレートされたＰＤＨ変異体の作出
ａ）ｐｄｈクラスターのクローニング及びシークエンス
プライマー ５’−ＡＹＧＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＴＧＲＴＣＧＡＴＴＴＣＡＴＧ−３’（前進；配列ＩＤ番号３１）及び５’−ＣＧＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＡＡＴＴＴＧＧＣＴＴ−３’（後退；配列ＩＤ番号３２）を既知のＢａｃｉｌｌｕｓ及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＰＤＨ配列の間の配列ホモロジーに基づいて設計し、及びテンプレートとしてＧ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ １１９５５からのゲノムＤＮＡを用いて１．８ｋｂ断片を増幅するために使用した。上記ＰＣＲを以前に示されるように行い、及び精製ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９（ＮＥＢ）にライゲートさせた。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、及びシークエンスした。この第一の断片をその後以下のライブラリーをスクリーニングするためにプローブとして使用した。
Ｇ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ １１９５５からのゲノムＤＮＡを標準のプロトコールを用いて１０の異なる制限酵素で消化した。制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＭｆｅＩは２．５〜５ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を作出し、それらは、製造業者の教示にしたがって、コロニーのいくつかのライブラリー（ｐＬＩＴＭＵＳ２８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を形成するためにクローニングされた。これらのライブラリーを標識化ＤＮＡプローブでスクリーニングした（ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ、製造業者の教示にしたがって）。
【００５４】
上記プローブとハイブリダイズしたどのコロニーにおけるＤＮＡ断片も単離し、及びシークエンスした。以前に同定された１．８ｋｂ ｐｄｈ領域にまたがる及びさらなる〜１．８ｋｂ分この領域から下流に伸びる３．６ｋｂ ＥｃｏＲＶゲノムＤＮＡ断片を含む１のクローンを同定した。上記断片はペプチドデフォルミラーゼ２（ｐｄｆ２）を伴う５’領域で始まる３の完全な遺伝子をコードした。ｐｄｆ２の位置づけられた下流には（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓからの推定タンパク質ｙｋａＡ（ＢＳＵ１４５７０）へのホモロジーを示す）推定遺伝子をコードするオープンリーディングフレームがあり、一方下流で次のオープンリーディングフレームは１１１０ｂｐの大きさであり、及びピルベートデヒドロゲナーゼＡ αサブユニット（ｐｄｈＡ（α））をコードすると考えられる。ｐｄｈＡ（α）遺伝子のすぐ隣に及びＥｃｏＲＶ断片の３’末端の向こうに伸びて、ｐｄｈＡ βサブユニット（ｐｄｈＡ（β））をコードすると考えられる遺伝子の一部が存在する。ｐｄｈＡ α及びβ遺伝子のタンデム配置は親密に関連した種において同定される既知のｐｄｈ遺伝子クラスターと一致する。
【００５５】
このＥｃｏＲＶ断片を同定するために使用されるアプローチをさらなるＤＮＡ配列を単離するために繰り返した。上記ＥｃｏＲＶ断片の３’領域に結合する前進プライマー５’−ＡＣＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧ−３’（配列ＩＤ番号５）及び後退プライマー５’−ＴＴＴＡＡＧＴＧＣＴＣＴＡＧＧＡＡＡＡＴＡＡＣＡＧ−３’（配列ＩＤ番号６）を用いて、新規プローブ、ＧＴ−ＤＩＧ２を以前のようにＰＣＲにより作出した。そのいくつかはＧＴＤＩＧ−２領域のすぐ上流で切れることが示された一組の制限酵素をＧ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓから単離されたゲノムＤＮＡを消化するために使用した。
【００５６】
ＮｃｏＩ消化に由来する断片を単離し、及び以前のようにクローニングした（ｐＬＩＴＭＵＳ２８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、製造業者の教示にしたがって）。ＧＴ−ＤＩＧ２プローブでのスクリーニングに際して、ＥｃｏＲＶ断片の下流に位置される〜６ｋｂ ＤＮＡから成るＮｃｏＩ ＤＮＡ断片を含むクローンを同定した。ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＶ断片の配列は８８８４ｂｐの長さの１の連続配列（コンティグ）を形成した。シークエンス分析は、このコンティグは両側に２の推定遺伝子が位置する４の近隣の遺伝子から成るｐｄｈ遺伝子クラスターを含むことを明らかにした。上記コンティグ内にコードされる遺伝子の構成は図２中に示される。
【００５７】
ｂ）シングルクロスオーバーＰＤＨ変異体−概念の証明
Ｇ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ １１９５５のＬＤＨ−変異体においてＰＤＨのアップレギュレートされた変異体を作出するために使用される策は、異種のプロモーターの容易な挿入及び続いてそれらを好適な統合ベクターに挿入することを許容する制限酵素部位が先にあるｐｄｈＡコード配列を伴うカセットを設計する及び作出するために、以前に同定されたｐｄｈＡ配列の使用を含んだ。上記必要性はＧ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ又はＧ． ｓｔｅａｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＬＤＨ−プロモーターの如き強い構成的プロモーターのためであった。上記アプローチは図３中に例示される。
【００５８】
必要とされる変異体をホスト株への上記統合ベクターの形質転換及びカナマイシン抵抗性統合体についての選択により作出した。上記統合事件は容易に可逆であるので、上記シングルクロスオーバー変異体は抗生物質の不在下では不安定である。
【００５９】
ｉ）アップレギュレーションワークのためのベクターの開発
上記策をうまくいかせるために、新規デリバリーベクターはマルチプルクローニング部位内のＮｄｅＩ制限酵素部位の使用を許容するよう構築されなければならなかった。以下の表３はｐＵＢ１９０で開発されたベクターを示し、及び比較する：
【００６０】
【表６】
【００６１】
表５．アップレギュレーションワークのために構築されたベクター
ｉｉ）ｐｄｈＡ骨組断片
ＮｄｅＩ部位の終末のＡＴＧがｐｄｈＡ遺伝子の推定ＡＴＧ開始コドンを示すように、以前に示されるように、ｐＵＣ１９にクローニングされた元の１．８ｋｂ ＰＣＲ産物から得られたｐｄｈＡ配列をＸｂａＩＩ／ＮｄｅＩ部位を組み込む前進プライマー５’−ＡＡＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＴ−３’（配列ＩＤ番号７）を設計するために使用した。上記開始コドンは他のｐｄｈＡ遺伝子の配置及び可能なリーディングフレームの調査により割り当てられた。
【００６２】
これを、以前に示されるＰＣＲプロトコールを用いて、ｐｄｈＡ（α）遺伝子の前部分を増幅するために（ＨｉｎｄＩＩＩ部位を組み込む）後退プライマー５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＴＧ−３’（配列ＩＤ番号８）と共に使用した。約１ｋｂのＰＣＲ産物を作出し、精製し、及びｐＵＣ１９（ＮＥＢ）にライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、その後ｐｄｈＡ断片をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、及び標準のプロトコールを用いてｐＴＭＯ３１にサブクローニングした。ｐＴＭＯ３１における最終構築物をシークエンスにより実証し、及びｐＴＭＯ４６として割り当てた。
【００６３】
ｉｉｉ）プロモーター断片及び最終デリバリー構築物の作出
上記プロモーター断片をその後ＫｐｎＩ／ＮｄｅＩ断片として−ｐｄｈＡ遺伝子に先行して−ｐＴＭＯ４６構築物にクローニングした。以下のプロモーター領域をはじめの構築物のために選択した：
【００６４】
【表７】
【００６５】
表６．ＰＤＨアップレギュレーションにおいて使用されるプロモーター及びそれらの源
プライマーをＫｐｎＩ／ＮｄｅＩ断片として（以前に示されるようにＧ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ １１９５５、Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＡ１５０３、Ｇ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＳＭ１３２４０及びＢ． ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ１４５７９から単離された）ゲノムＤＮＡからのこれらのプロモーター領域を作出するために設計し、及びＰＣＲ産物を以前に示される成分及びプロトコールを用いて得た。上記精製ＰＣＲ産物をｐＴＭＯ２３（ＮｄｅＩ部位が欠失したｐＵＣ１９）にライゲートし、及び上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、その後上記プロモーター断片をＫｐｎＩ及びＮｄｅＩで消化し、及び標準のプロトコールを用いてｐＴＭＯ４６にサブクローニングした。ｐＴＭＯ４６における最終構築物をシークエンスにより実証し、及び表７中のプラスミドとして割り当てた。
【００６６】
【表８】
【００６７】
表７．ＰＤＨアップレギュレーションのためのシングルクロスオーバー構築物
ｉｖ）Ｇ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ骨組への最終構築物の統合
ＴＭ８９を以前に示されるエレクトロポーレーションプロトコールを用いて上記プラスミドで形質転換した。推定統合体を以前に示されるように選択し、及びＰＤＨ活性はもちろん、ＡＳＹＥグルコース媒質（嫌気条件）中でのエタノール及び有機酸生成について試験した。結果は表８中に示される。
【００６８】
【表９】
【００６９】
表８．ＡＳＹＥ（０．５％）＋２％グルコース中の新規プロモーター統合体の８時間培養物についてのＰＤＨ分析
上記新規プロモーターは、この時点でＴＭ８９よりかなり高い、比較的高い値のＰＤＨ活性を与えるように見える（しかしながら、ＴＭ８９について記録される低いタンパク質値はＴＭ８９がそのピーク生成点を過ぎていた可能性があることを示す）。それぞれのプロモーターの２の統合体の間の乏しい一致はこれらのプロモーターの相対的強度の比較を困難にする。
【００７０】
ＰＤＨ値について試験された同じ株をまた、これらの新規プロモーターのいずれかが元のプロモーターに勝る利点を提供するかどうかを確立するためのさらなる試みにおいて、増大されたグルコース値及びより低い通気でエタノール生成について試験した。結果は以下の表９中に示される：
【００７１】
【表１０】
【００７２】
表９は２の酸素制限条件下で３％グルコース中の新規プロモーターの効率を調査した。
プロモーター置換の不安定性が上記分析において不一致を生じたので、これらのプロモーターを完全に特徴付け及び比較するためにダブル組換えを作出することが必要であることが明らかになった。安定なＰＤＨアップレギュレーション変異はまた最終的な生物においても必要とされた。
【００７３】
ｃ）ダブルクロスオーバーＰＤＨ変異体
ｉ）最終デリバリー構築物の作出
安定なダブルクロスオーバー統合体を、ｐｄｈＡ遺伝子の上流の配列が図４中に概略されるようにプロモーター断片の前に位置される、表７中のｐＴＭＯ５８シリーズに基づく、さらなる一連のベクターを用いて作出した。これは組換え事件におけるベクター配列の削除及びｐｄｈ遺伝子の前の置換プロモーターの安定な挿入を許容した。
例えば、Ｇ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ １１９５５ ｐｄｈクラスターより先にある配列の部分を、両方の端にＫｐｎＩ部位を導入するために、以前に示されるようにＰＣＲにより増幅した。この配列（１０７２ｂｐ）は３２６ｂｐのｐｄｆ２遺伝子及び全ての介在するオープンリーディングフレーム−ｙｋａＡホモログ−を含んだが、ｙｋａＡ及びｐｄｈＡの翻訳開始の間の配列を省く。上記精製ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９にライゲートし、及び上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、その後上記上流断片をＫｐｎＩで消化し、及び標準のプロトコールを用いてｐＴＭＯ５９にサブクローニングした。最終構築物を−上記挿入物の向きを確立するために−制限酵素分析により、及びシークエンスにより実証し、及びｐＴＭＯ７０として割り当てた。
【００７４】
ｉｉ）Ｇ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ骨組への最終構築物の統合
ＴＭ８９を以前に示されるエレクトロポーレーションプロトコールを用いてｐＴＭＯ７０で形質転換した。推定統合体を以前に示されるように選択し、及びＰＤＨ活性はもちろん、ＡＳＹＥグルコース媒質（嫌気条件）中でのエタノール及び有機酸生成について試験した。
【００７５】
ｉｉｉ）ＴＭ８９におけるＰ ｌｄｈ（ＮＣＡ１５０３）のダブルクロスオーバーの作出
ｐＴＭＯ７０での形質転換からの２の主要な統合体を以前に示されるようにカナマイシンの不在下での振騰液体媒質中での連続サブ培養のために選択した。３サブ培養後、サンプルを希釈し、及びＴＧＰアガー上にまいた。好適な数のコロニーを含むプレートをＴＧＰ+カナマイシンプレートにレプリカプレート作成し、及びカナマイシン感受性コロニーをつつき、及び精製した。これらの株をＡＳＹＥ（０．５％）＋２％グルコース中でのエタノール生成について試験した。試験された１６の推定ダブル組換え体のうち、５（ＴＭ１７９−ＴＭ１８３）が所望の表現型を与えた（その他は親ＴＭ８９と同一であるように見えた）。結果は表１０中に与えられる。
【００７６】
【表１１】
【００７７】
表１０．推定ダブルクロスオーバー変異体における代謝産物形成
ｄ）ダブル組換え体におけるベクターからのＫａｎR遺伝子の存在のチェック
それらの構築において使用されるベクターからのｋａｎR遺伝子がダブル組換え株ＴＭ８９及びＴＭ１８０中にもはや存在しないことをチェックするために、ＰＣＲ反応を図３中に示されるｋａｎR遺伝子について設計されるプライマーを用いて行った。対照ＰＣＲ反応は、ＴＭ８９及びＴＭ１８０においてシングルコピーで存在すると予想されるであろうｐｄｈ遺伝子及び先行する領域についてのプライマーの使用を含んだ。５の株（ＴＭ１５及びＬＣ１２．１、ＴＭ８９及びＴＭ１８０からのシングルクロスオーバー統合体、及びＴＭ１７７）からのゲノムＤＮＡを単離し、及びテンプレートとして使用した。ＴＭ１５、ＬＣ１２．１及びＴＭ１７７は全てカナマイシン抵抗性を示し、及びｋａｎR遺伝子を含むベクターＤＮＡを有すると予想されるであろう。ＰＣＲ反応は以前に示される条件及び成分で行われ、及び実験の詳細は図５中に与えられる。
【００７８】
結果は、シングルクロスオーバー株は全て予想されるようにｋａｎプライマーで予想される大きさ（約０．６ｋｂ）のＰＣＲ産物を与えるが、ＴＭ８９又はＴＭ１８０からはｋａｎプライマーでのＰＣＲ産物はないことを示す。これは、ｋａｎR遺伝子が予想されるように、これらのダブル組換え体において存在しないことを示す。しかしながら、ｐｄｈ領域プライマーは全ての５のゲノムＤＮＡで予想される大きさの産物を与えた。Ｐ ｌｄｈ（ＮＣＡ１５０３）置換挿入物は野生型配列より小さいので、ＬＣ１２．１及びＴＭ１８０ゲノムＤＮＡは他の３の株より約０．２ｋｂ小さい産物を与える。
【００７９】
実施例３：安定なＰＦＬネガティブ変異体の作出
ＰＦＬノックアウトベクターは策２中のＬＤＨノックアウトと全く同じ様式で構築され、及び図５中に概略される。
ａ）ＰＦＬノックアウトベクター構築
既知のＢａｃｉｌｌｕｓ ＰＦＬ配列の間の配列ホモロジーに基づいて設計される、変性したプライマー５’−ＣＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＷＧＧＣＧＴＹＣＴＴＧＡＴＡＴＧＧＡＴＡＣＡ−３’（前進、配列ＩＤ番号２５）、及び５’−ＴＴＣＧＣＡＣＣＴＧＧＷＧＣＡＡＡＹＧＧＴＴＣＴＣＣ−３’（後退、配列ＩＤ番号２６）をＧ． ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ １１９５５からのゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて１．７ｋｂ断片を増幅するために使用した。ＰＣＲを以前に示されるように行い、及び精製ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９（ＮＥＢ）にライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、及びシークエンスした。生ずるプラスミドをｐＴＭＯ９５として割り当てた。
【００８０】
第二のシリーズのＰＣＲを断片３の３’末端及び断片４の５’末端にＮｏｔＩ部位を導入するためのプライマーで行った。ＰＣＲ１において、プライマー５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＣＡＣＧＧＡＣＣＡＧＧＴＴＡ−３’（前進、配列ＩＤ番号２７）及び５’−ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＧＣ−３’（後退、配列ＩＤ番号２８）を以前に示される条件及び成分でｐＴＭＯ９５と混合し、及び精製ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９（ＮＥＢ）にライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、及びシークエンスした。生ずるプラスミドをｐＴＭＯ１０５として割り当てた。
【００８１】
ＰＣＲ２において、プライマー５’−ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣＧＴＣＧＡＡＴＴＴＧＧＣＧＡＴＧＡ−３’（前進、配列ＩＤ番号２９）及び５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＧＴＡＴＡＣＡＡＣＧＴＴＡＧＡＣＧＴＡＡ−３’（後退、配列ＩＤ番号３０）を以前に示される条件及び成分でｐＴＭＯ９５と混合し、及び精製ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９（ＮＥＢ）にライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、制限酵素分析により特徴付け、及びシークエンスした。生ずるプラスミドをｐＴＭＯ１０７として割り当てた。
【００８２】
断片４を含むプラスミドｐＴＭＯ１０７をＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。生ずる断片（６２２ｂｐ）を、ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで事前に消化された、断片３を含むｐＴＭＯ１０５にライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。以前のように、アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、及び上記挿入物の向きを確立するために制限酵素分析により特徴付けた。所望の構築物に期待される制限酵素パターンを有するプラスミド（ｐＴＭＯ１１０）を同定し、及びＭ１３ｍｐ１８後退及び前進プライマーを用いたシークエンスにより実証した。
【００８３】
上記変異されたＰＦＬ遺伝子断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでの消化によりｐＴＭＯ１１０から切り取り、及び精製断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで事前に消化されたｐＴＭＯ３１とライゲートした。上記ライゲーション混合物を標準のプロトコールを用いてＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを選択し、及び含まれるプラスミドを単離し、及び上記挿入物の向きを確立するために制限酵素分析により特徴付けた。生ずるプラスミドをｐＴＭＯ１１１として割り当てた。
【００８４】
ｂ）シングルクロスオーバーＰＦＬネガティブ変異体
プラスミドｐＴＭＯ１１１を以前に示されるようにＴＭ８９及びＴＭ１８０にエレクトロポーレーションにより導入した。両方の株の形質転換体を液体培養物（２ＴＹ＋ｋａｎ１２μｇ／ｍＬ）中で生育させ、及び以前に示されるように統合について選択するために６８℃のＴＧＰ+ｋａｎ１２μｇ／ｍＬアガー上に非常に高い細胞密度でまいた。
コロニーを６８℃のＴＧＰ＋ｋａｎ１２μｇ／ｍＬ上でのストリーキングにより精製し、及びＴＭ８９及びＴＭ１８０により計測可能な値のフォルメート生成を与えることが以前に示されている条件である、１５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ管中の１０ｍＬのＡＳＹＥ（０．５％）＋２％グルコースを用いた（すなわち、低酸素条件下での）、生成試験のために２ＴＹ＋ｋａｎ１２μｇ／ｍＬシード培養物を接種するために使用した。フォルメート生成はより高い酸素値では通常見られない（表９を参照のこと）。ＴＭ８９及びＴＭ１８０中のｐＴＭＯ１１１の推定統合体の試験結果は以下の表１１中に示される。
【００８５】
【表１２】
【００８６】
表１１ ＴＭ８９及びＴＭ１８０中のｐＴＭＯ１１１推定統合体（６８℃）
ＴＭ８９推定統合体の代謝プロファイル（表１１）は全てこの試験におけるＴＭ８９に非常に似ているようであった。あまり生育しなかったｐＴＭＯ１１１／ＴＭ８９／１．１及びｐＴＭＯ１１１／ＴＭ８９／１．３を除外して、それらはＴＭ８９と同様の値でフォルメートを生成し（約２０ｍＭ）、及び同様の値の他の代謝物及び同様の値の残留のグルコースを有した。しかしながら、ＴＭ８９推定統合体はｐｆｌＢ位置での真の統合体ではない可能性がある。あるいは、ＴＭ８９の変異体はこれらの条件下では安定でなく、及び観察された結果は、可能性としてより低い通気下での統合体のより高い不安定性を反映して、復帰突然変異体（上記プラスミドのループアウト）の選択を反映する可能性があった。
【００８７】
ＴＭ８９推定統合体は非常に異なるように見える。全ては、ＴＭ１８０対照と比較されるとき、フォルメートの生成を示さず、低アセテート及び非常に低い残留グルコースを示した。これらはおそらくｐｆｌＢ位置での真の統合体であり、及びそれゆえＰＦＬ生成において欠損している。
【００８８】
ｃ）安定な遺伝子置換ＰＦＬネガティブ変異体
両方の株の第一統合体（ＴＭ１８０及びＴＭ８９中のｐＴＭＯ１１１）を遺伝子置換のための推定ダブルクロスオーバーを作出するために使用した。それぞれの株のいくつかの第一統合体を以前に示されるように、カナマイシンの不在下の振騰液体媒質中で連続的にサブ培養し、その後上記培養物を連続希釈し、ＴＧＰ上にまき、及びＫａｎsコロニーを同定するためにｋａｎ（１２μｇ／ｍＬ）を含むＴＧＰにレプリカプレート作成した。
【００８９】
これらのＫａｎsコロニーをフォルメート生成における減少についてスクリーニングしたとき、それぞれのホストについての４のコロニーはフォルメート生成の欠損を示した。これらの単離物の代謝プロファイルは表１２中に与えられる。
【００９０】
【表１３】
【００９１】
表１２：ＴＭ８９及びＴＭ１８０における推定安定遺伝子置換ＰＦＬネガティブ変異体
ＴＭ８９に基づくＰＦＬ変異体ＴＭ２３６及びＴＭ２３７を中及び低酸素条件下で試験した。低酸素値で、これらの２の株はほとんど生育しなかった。それらは少量のグルコースのみを利用し、及びわずかな（約５ｍＭ）エタノールのみを生成した。見られた唯一の顕著な生成物はピルベート（約１２ｍＭ）であり、計測可能なフォルメート又はアセテートはなかった。しかしながら、増大された酸素で、それらの代謝プロファイルはＴＭ８９により似ているように見えた。この表現型は、ＰＤＨ発現が低通気／嫌気条件下では低すぎてＰＦＬの役割を効果的に置換できないＰＦＬノックアウトとフィットするであろう、及びＴＭ８９中のｐＴＭＯ１１１の推定第一統合体がＴＭ８９と同様に見える、表１２中の第一統合体により示される表現型を説明するであろう。これはこれらの条件下でのＰＦＬ変異体の乏しい生育を説明するであろう、及び相同組換えによる野生型への復帰への強い選択を提供する。ＴＭ８９の他の推定ＰＦＬネガティブ変異体−ＴＭ２４４及びＴＭ２４５−を異なる第一統合体から単離したが、ＴＭ３６及びＴＭ３７と同様のプロファイルを有する。
【００９２】
ＴＭ１８０に基づくＰＦＬ変異体ＴＭ２４０、ＴＭ２４１、ＴＭ２４２及びＴＭ２４３（ＴＭ２４３は他の３とは異なる第一統合体からであった）は表１１中のＴＭ１８０に基づく第一統合体で見られたのと同様の表現型を示す（計測可能なフォルメート生成はなく、ＴＭ１８０と比較されるときより高いエタノール及びより低いアセテート）。それらはそれゆえ遺伝子置換からの安定なＰＦＬ変異体であると仮定される。
【００９３】
ｄ）ＰＦＬ遺伝子置換の証明
上記に示される推定ＰＦＬ変異体は真の遺伝子置換であったかどうかを試験するために、ＰＣＲ実験を設定した。ゲノムＤＮＡをＴＭ２３６、ＴＭ２４１、ＴＭ２４２及びＴＭ２４３について調製した。使用されたプライマーはノックアウト設計のためのＰＦＬ配列を提供した１１９５５から元のＰＦＬ ＰＣＲ産物を作出するために使用された、配列ＩＤ番号２５及び配列ＩＤ番号２６であった。ＰＦＬノックアウト構築物ｐＴＭＯ１１１において使用されたＰＦＬ配列は全てプライマー配列、配列ＩＤ番号２５及び２６の内側であり、上記配列はｐＴＭＯ１１１内に含まれないことを意味する。したがって、上記ノックアウト構築物はこれらのプライマーでＰＣＲ産物を作出するはずないが、上記遺伝子置換株及び野生型株は産物を作出するはずである。
【００９４】
ＰＦＬネガティブ遺伝子置換変異体からのゲノムＤＮＡは野生型の産物より０．４ｋｂ小さい、及び新規ＮｏｔＩ部位を有する単一のＰＣＲ産物を与えるはずである。
これらのプライマー及びゲノムＤＮＡを用いて、対照として１１９５５ゲノムＤＮＡ及びｐＴＭＯ１１１プラスミドＤＮＡを伴って、全ての４の変異体は、１１９５５からの約１．７ｋｂ（理論上１６９４ｂｐ）の単一の産物と比較して、約１．３ｋｂ（理論上１３４２ｂｐ）の単一のＰＣＲ産物を与えたことが示された。予想されるように、ｐＴＭＯ１１１では産物は得られなかった。上記５の株からのＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｏｔＩで消化し、及びアガロース電気泳動ゲル上で流した。全ての４のＰＦＬネガティブ変異体からのＰＣＲ産物は完全に消化され、約０．６〜０．７ｋｂ（理論上６５０ｂｐ及び６９１ｂｐ）の２の産物を与え、一方で１１９５５の産物はＮｏｔＩにより切断されなかった。この試験は決定的であるはずであり、それゆえこれらの４の株は天然のｐｆｌ遺伝子が０．４ｋｂ欠失及び新規ＮｏｔＩ部位を含むｐｆｌ遺伝子で（相同組換えにより）置換されている真のＰＦＬ変異体であると結論付けられうる。
【００９５】
キシラン発酵：
クイック及びシンプル管培養実験をオートクレーブされ及びさまざまなヘミセルラーゼで処理された商業的に入手可能なキシラン（Ｓｉｇｍａ）中でＴＭ２４２で行った。私たちはＨＰＬＣ分析において糖ピークの消失を観察し、及びさらなる実験において私たちはエタノール生成を観察した−このことは、上記生物が酵素処理されたヘミセルロース（商業的なリグノセルロースエタノール生成の最終的な標的）を発酵させることができる可能性を有するのみでなく、この生物はグルコース及びキシロースを分解するために最も大量の酵素及び時間を必要とする二量体−セロビオース及びキシロビオース−を利用することができることを示す。これは現行の技術を超える顕著な改善及び利点である。ヘミセルラーゼを用いたエタノール生成の結果は表１３中に示される。
【００９６】
【表１４】
【００９７】
変異体１１９５５及びＴＭ２４２をまた炭素源として異なる炭水化物を用いた嫌気発酵についても試験した。結果は表１３中に示される。
【００９８】
【表１５】
【００９９】
ＴＭ８９として本明細書中に定義される微生物及びプラスミドｐＵＢ １９０−ｌｄｈはそれぞれＮＣＩＭＢアクセス番号４１２７５及び４１２７６の下に寄託されている。保管所はＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ， Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ， Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ， Ａｂｅｒｄｅｅｎ， ＡＢ２１ ９ＹＡ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増大されたエタノール生成を許容するよう改変された好熱性微生物であり、第一の改変はラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化であり、及び第二の改変はピルベートデヒドロゲナーゼ遺伝子をアップレギュレートする、好熱性微生物。
【請求項２】
上記第二の改変はピルベートデヒドロゲナーゼ遺伝子の上流の遺伝子プロモーターの挿入であり、上記プロモーターは嫌気条件下ではたらく、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ヂヒドロリポアミドトランスアセチラーゼ遺伝子（ＥＣ ２．３．１．１２）を不活性化するための第三の改変を含む、請求項１又は請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
ピルベートフォルメートリアーゼ（ＰＦＬ）遺伝子を不活性化するためのさらなる改変を含む、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項５】
上記微生物は制限酵素システムを含まない、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項６】
上記微生物はｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ種である、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項７】
上記微生物はｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓである、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項８】
上記微生物は胞子形成体である、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項９】
上記微生物は３０％（ｗ／ｖ）までのエタノールを含む培養媒質中で安定である、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１０】
上記微生物はセロビオース、キシロビオース、及び／又はデンプン又はそれらのオリゴマーを代謝しうる、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１１】
上記微生物は高頻度で形質転換可能である、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１２】
上記微生物は４０℃〜８５℃、好ましくは５０℃〜７０℃の温度で生育する、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１３】
上記微生物は非天然ｐｄｃ遺伝子を含む、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１４】
上記微生物は非天然ａｄｈ遺伝子を含む、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１５】
上記天然ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子又はその一部が欠失している、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１６】
上記微生物はラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子において統合エレメントを含まない、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１７】
Ｃ３、Ｃ５又はＣ６糖又はそれらのオリゴマーの存在下の好適な条件下でいずれかの前記請求項に記載の微生物を培養することを含む、エタノール製造方法。
【請求項１８】
上記方法は４０℃〜７０℃の温度で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記温度は５２℃〜６５℃である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記微生物は４〜７．５のｐＨの培養中で維持される、請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれかに記載の微生物を含む、動物飼料。
【請求項２２】
不活性化されたＰＦＬ遺伝子を含む、上記ＬＤＨ遺伝子は不活性化された又は野生型に比較して減少された値で発現される、及び上記ＰＤＨ遺伝子は野生型を超える値で発現される、微生物。
【請求項１】
増大されたエタノール生成を許容するよう改変された好熱性微生物であり、第一の改変はラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化であり、及び第二の改変はピルベートデヒドロゲナーゼ遺伝子をアップレギュレートする、好熱性微生物。
【請求項２】
上記第二の改変はピルベートデヒドロゲナーゼ遺伝子の上流の遺伝子プロモーターの挿入であり、上記プロモーターは嫌気条件下ではたらく、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ヂヒドロリポアミドトランスアセチラーゼ遺伝子（ＥＣ ２．３．１．１２）を不活性化するための第三の改変を含む、請求項１又は請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
ピルベートフォルメートリアーゼ（ＰＦＬ）遺伝子を不活性化するためのさらなる改変を含む、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項５】
上記微生物は制限酵素システムを含まない、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項６】
上記微生物はｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ種である、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項７】
上記微生物はｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓである、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項８】
上記微生物は胞子形成体である、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項９】
上記微生物は３０％（ｗ／ｖ）までのエタノールを含む培養媒質中で安定である、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１０】
上記微生物はセロビオース、キシロビオース、及び／又はデンプン又はそれらのオリゴマーを代謝しうる、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１１】
上記微生物は高頻度で形質転換可能である、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１２】
上記微生物は４０℃〜８５℃、好ましくは５０℃〜７０℃の温度で生育する、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１３】
上記微生物は非天然ｐｄｃ遺伝子を含む、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１４】
上記微生物は非天然ａｄｈ遺伝子を含む、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１５】
上記天然ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子又はその一部が欠失している、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１６】
上記微生物はラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子において統合エレメントを含まない、いずれかの前記請求項に記載の微生物。
【請求項１７】
Ｃ３、Ｃ５又はＣ６糖又はそれらのオリゴマーの存在下の好適な条件下でいずれかの前記請求項に記載の微生物を培養することを含む、エタノール製造方法。
【請求項１８】
上記方法は４０℃〜７０℃の温度で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記温度は５２℃〜６５℃である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記微生物は４〜７．５のｐＨの培養中で維持される、請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれかに記載の微生物を含む、動物飼料。
【請求項２２】
不活性化されたＰＦＬ遺伝子を含む、上記ＬＤＨ遺伝子は不活性化された又は野生型に比較して減少された値で発現される、及び上記ＰＤＨ遺伝子は野生型を超える値で発現される、微生物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５０４７４７（Ｐ２０１０−５０４７４７Ａ）
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２９７６８（Ｐ２００９−５２９７６８）
【出願日】平成１９年９月２８日（２００７．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００３６９９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３８０１９
【国際公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【出願人】（５０７３６４１３７）ティーエムオー リニューアブルズ リミティド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２８日（２００７．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００３６９９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３８０１９
【国際公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【出願人】（５０７３６４１３７）ティーエムオー リニューアブルズ リミティド (7)
【Ｆターム（参考）】
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