オリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体、それらを含有する組成物およびＢ細胞腫瘍を治療するための方法
本発明は、配列番号１の配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体、それらを含有する組成物、ならびにオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体あるいはオリゴヌクレオチドを含有する組成物の使用によりＢ細胞腫瘍を治療する方法を提供する。オリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、Ｂ細胞腫瘍細胞上でＣＤ４０をアップレギュレートし、且つＢ細胞腫瘍細胞からのＩＬ−１０の産生を刺激する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号１に示される配列を有するオリゴヌクレオチド、またはその機能的相同体、それらを含有する組成物、ならびにオリゴヌクレオチドを用いてＢ細胞腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、Ｂ細胞腫瘍細胞上でＣＤ４０をアップレギュレートし、かつＢ細胞腫瘍細胞を刺激してＩＬ−１０を産生させることによってＢ細胞腫瘍を治療するための方法を提供する。オリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体を単独で使用するかまたは化学療法剤、免疫療法剤および放射線と併用することで、Ｂ細胞腫瘍の治療が可能である。
【背景技術】
【０００２】
リンパ性悪性疾患は、ＷＨＯ分類系(American Journal of Surgical Pathology, 1997, 21(1): 114-121)に基づき、Ｂ細胞腫瘍、Ｔ細胞／ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞腫瘍およびホジキンリンパ腫という３つの主要なクラスに分類される。
【０００３】
Ｂ細胞腫瘍は、前駆Ｂ細胞腫瘍および末梢Ｂ細胞腫瘍という２つのグループにさらに分かれる。前駆Ｂ細胞腫瘍は、前駆体Ｂ−急性リンパ芽球性白血病（Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｂ−ＡＬＬ）／リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）を含む。末梢Ｂ細胞腫瘍は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／免疫細胞腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚の濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴ型節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−単球様Ｂ細胞）、脾性辺縁帯リンパ腫（＋／−絨毛リンパ球）、ヘアリー細胞白血病、形質細胞腫／形質細胞骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫およびバーキットリンパ腫を含む。
【０００４】
Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）およびＢ細胞急性リンパ芽球性／リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）は、Ｂ細胞白血病の２つのタイプである。Ｂ−ＣＬＬ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ５およびＣＤ２３を発現する(Nicholas Chiorazzi, M. D., et al. N Engl J Med 2005;352:804-15)。Ｂ−ＡＬＬ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ１０＋マーカーを発現する。
【０００５】
小リンパ球性リンパ腫はＢ細胞腫瘍である。小リンパ球性リンパ腫におけるＢ細胞のモノクローナル母集団は、ＣＤ１９、ＣＤ５およびＣＤ２３を発現する(Catherine Thieblemont,et al. Blood. 2004; 103:2727-2737)。
【０００６】
現行の治療オプションには、診断されたＢ細胞腫瘍に応じて、化学療法、放射線療法および免疫療法がある。
【０００７】
正常Ｂリンパ球および樹状細胞の細胞表面上に発現されるＣＤ４０は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーである。Ｔリンパ球上で発現されるＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）は、腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーである(Castle BE, et al. J Immunol 1993; 151 : 1777-1788)。ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の相互作用は、Ｂリンパ球、樹状細胞および単球の増殖、分化および抗原提示を促進する(Ranheim EA, et al. J Exp Med 1993;177: 925-935; Yellin MJ et al. J Immunol 1994; 153: 666-674; Banchereau J, et al. Annu Rev Immunol 1994; 12: 881-922; M.von Bergwelt-Baildon MS, et al. Blood 2002; 99: 3319-3325)。
【０００８】
ＣＤ４０はＢ細胞腫瘍細胞上でも発現する。ＣＤ４０の発現を高めることでＢ細胞腫瘍細胞のアポトーシスが促進されることが実証されている(Peter Chu, et al. PNAS, March 19, 2002, vol. 99, no: 6 3854-3859; Frank Dicker, et al. BLOOD, 15 April 2005 Volume 105, Number 8: 3193-3198)。in vitroとin vivoの双方での実験で、ＣＤ４０の刺激およびアップレギュレーションによりＢ細胞腫瘍細胞の成長阻害が誘発されることが示された(Funakoshi et al., Blood 83: 2787-2794,1994; Murphy et al., Blood 86: 1946-1953 ,1995; Eliopoulos, A. G, et al. 1996. Oncogene 13:2243; Hirano, A.,et al. 1999. Blood 93:2999; Tong, A. W., M et al. 2001.Clin. Cancer Res. 7:691)。
【０００９】
Ｂ細胞腫瘍細胞上でのＣＤ４０発現の促進が、Ｂ細胞腫瘍細胞の抗原性を増強し、その結果、同細胞に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生を促進することが報告された。ＣＴＬはＢ細胞腫瘍細胞を効率的に殺滅しうる(Dilloo D, et al. Blood. 1997;90: 1927-1933; Kato K, et al. J Clin Invest. 1998;101 :1133-1141 ; Wierda WG, et al. Blood. 2000;96:2917-2924 ; Takahashi S, et al. Hum Gene Ther. 2001;12:659-670; Takahashi S, et al. Cancer Gene Ther.2001 ;8:378-387)。ＣＤ４０Ｌの存在下で、ＣＤ４０を発現するＢ細胞慢性リンパ性白血病細胞は、ＣＤ４細胞傷害性Ｔリンパ球によって殺滅されうる(Frank Dicker, et al. Blood, 15 April 2005 Vo1 105, Num 8: 3193-3198)。バーキットリンパ腫の細胞上におけるＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用により、細胞における腫瘍抗原の特異的ＣＴＬに対する提示の促進が可能となる(Khanna, R.et al. 1997. J. Immunol. 159:5782)。in vivo実験および臨床試験では、ＣＤ４０の活性化によりＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞の免疫原性が増強され、その結果、同細胞に特異的なＣＴＬの産生が誘導されうることも実証された(Kato, K.,et al. 1998.J. Clin. Invest. 101 :1133; Wierda, W. G.,et al. 2000. Blood 96: 2917)。
【００１０】
これらのデータを併せると、Ｂ細胞腫瘍細胞上でのＣＤ４０の発現を促進することでＢ細胞腫瘍に対する抗腫瘍免疫性が刺激されうることが示唆される。抗腫瘍免疫性は、
１．Ｂ細胞腫瘍細胞のアポトーシスの促進、
２．Ｂ細胞腫瘍細胞の成長の阻害、
３．Ｂ細胞腫瘍細胞の免疫原性の増強と、それによる同細胞に特異的なＣＴＬの産生促進
を含むがこれらに限定されない。
【００１１】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、特定のＴ細胞、単球、マクロファージ、およびＢ細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞から発生した新生細胞の一部によって産生されるホモ二量体サイトカインである(Kitabayashi et at., 1995; Masood et al., 1995; Sjoberg et al., 1996; Beatty et al., 1997; Boulland et al., 1998; Jones et al., 1999)。ＩＬ−１０活性は、それに特異的な細胞表面受容体によって仲介される。受容体は、抗原提示細胞、リンパ球およびＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞の上に発現する。外因性ＩＬ−１０の添加により患者から新たに単離されたＢ−ＣＬＬ細胞の増殖が阻害されることが見出された(Jesper Jurlander, Chun-Fai Lai, Jimmy Tan, et al. Characterization of interleukin-10 receptor expression on B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood, Vol 89, No 11 (June 1), 1997: pp 4146-4152)。ＩＬ−１０は、Ｂ−ＣＬＬ細胞の増殖を阻害し、且つＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを促進することも報告された(Anne-Catherine Fluckiger, lsabelle Durand, and Jacques Banchereau. lnterleukin 10 Induces Apoptotic Cell Death of B-Chronic Lymphocytic Leukemia Cells. J. Exp. Med. Volume 179 January 1994 91-99)。ＩＬ−１０の免疫刺激性の抗癌特性についてはレビューで論じられており、それからは腫瘍微環境内でのＩＬ−１０の過剰発現が癌の免疫拒絶を触媒しうることが推定される(Simone Mocellin, Francesco M. Marincola and Howard A. Young. Interleukin-10 and the immune response against cancer: a counterpoint. Journal of Leukocyte Biology. 2005; 78:1043-1051)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明では、発明者らは、オリゴヌクレオチドおよび本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによるＢ細胞腫瘍を治療するための方法を提供する。オリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、Ｂ細胞腫瘍細胞上でのＣＤ４０の発現を促進し、且つＢ細胞腫瘍細胞におけるＩＬ−１０の産生を刺激し、すべてがＢ細胞腫瘍の治療に寄与する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の実施形態では、本発明は、５’−ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣ−３’（オリゴ２として設計または配列番号１として指定）の配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体を提供する。オリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体は、部分的または完全なホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾であるリン酸塩骨格修飾を有しうる。オリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体は、化学修飾を有しうるかまたは微量塩基との置換を有しうる。オリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体は、任意の他のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片の機能的部分でありうるかあるいはプラスミド、細菌ベクター、ウイルスベクターまたはＤＮＡワクチンにそれぞれクローニングされうる。配列番号１の配列を有するオリゴヌクレオチドは、１つもしくは複数の塩基（好ましくは１〜１０個の塩基）をその各末端に付加するかまたはオリゴヌクレオチド内で塩基を変化させることにより修飾されうる。当業者は、本発明の目的を達成するために、当該技術分野で周知の内容および本発明における教示内容に基づいて、配列番号１の配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体、配列（配列番号１）を有するオリゴヌクレオチドの１つもしくは複数のコピーを一本鎖または二本鎖のＤＮＡ断片の使用することを決定することができる。
【００１４】
第２の実施形態では、本発明は、被験者において本発明のオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体またはそれらを含有する組成物を用いて、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法を提供する。被験者はヒトまたは動物である。Ｂ細胞腫瘍は、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫および骨髄腫を含むがこれらに限定されない。
【００１５】
第３の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体またはそれらを含有する組成物を使用して、Ｂ細胞腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することにより、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法を提供する。
【００１６】
第４の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体またはそれらを含有する組成物を使用して、Ｂ細胞腫瘍細胞上でＣＤ４０をアップレギュレートすることにより、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法を提供する。
【００１７】
第５の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体またはそれらを含有する組成物を使用して、Ｂ細胞腫瘍細胞におけるＩＬ−１０の産生を刺激することにより、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、本発明における治療有効量のオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体を単独で含有する、あるいは１種もしくは複数種の医薬的に許容できる担体中に含有する、または当該担体とともに含有する組成物を提供する。組成物を、経腸投与、非経口投与および局所投与するかまたは吸入投与してもよい。
【００１９】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法であって、治療有効量の本発明のオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体あるいはそれらを含有する組成物、および化学療法剤、免疫療法剤および放射線療法で使用される作用物質を含む抗−Ｂ細胞腫瘍剤の少なくとも１種を含有する組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
定義
本発明では、以下の用語は下記の意味を有するものとする。
【００２１】
「オリゴヌクレオチド」は、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基および交換可能な有機塩基に連結される糖（例えばデオキシリボース）を有する分子）を意味する。シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）という４種の有機塩基が存在する。オリゴヌクレオチドを、市販されている自動オリゴヌクレオチドシンセサイザで合成するか、または既知の技術を用いて既存の核酸配列から調製してもよい。
【００２２】
オリゴヌクレオチドの「骨格修飾」は、オリゴヌクレオチドがホスホロチオエートで修飾されたリン酸塩骨格（すなわちリン酸塩の酸素の少なくとも１つが硫黄と置換される）または他の修飾骨格を有することを意味するものとする。
【００２３】
オリゴヌクレオチドの「化学修飾」は、ヌクレオチドの活性基を利用するかまたはヌクレオチド類似体を生成することによる修飾を意味するものとする。修飾はオリゴヌクレオチドの合成の間または合成後に生じうる。合成の間、修飾塩基（チミジン類似体を含むがこれに限定されない）が内部にまたは５’末端側に取り込まれうる。合成後、（アミノ修飾因子、３’もしくは５’水酸基、またはリン酸基を介して）活性基を用いて修飾がなされうる。
【００２４】
「Ｂ細胞腫瘍」は、Ｂリンパ球系の細胞の異常な増殖から発生した疾患を意味するものとする。Ｂ細胞腫瘍は、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫および骨髄腫（形質細胞腫／形質細胞骨髄腫）に分類されうる。Ｂ細胞白血病は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、前駆Ｂ−急性リンパ芽球性白血病（Ｂ細胞急性リンパ性白血病、Ｂ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病およびヘアリー細胞白血病を含む。Ｂ細胞リンパ腫は、小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫／免疫細胞腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴ型節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−単球様Ｂ細胞）、脾性辺縁帯リンパ腫（＋／−絨毛リンパ球）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫およびバーキットリンパ腫を含む。
【００２５】
「被験者」は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、マウスおよびラットを含む（がこれらに限定されない）哺乳動物を意味するものとする。本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞腫瘍を有する被験者に投与されうる。
【００２６】
「抗−Ｂ細胞腫瘍剤」は、被験者のＢ細胞腫瘍を治療するために用いられる作用物質を意味するものとする。作用物質は、本発明のオリゴヌクレオチド、化学療法剤、免疫療法剤および放射線療法で使用される作用物質を含む。本発明のオリゴヌクレオチドを、１種もしくは複数種の他の抗−Ｂ細胞腫瘍剤の投与に先立ち、投与と同時にまたは投与後に投与することで、Ｂ細胞腫瘍の治療において相乗効果が得られる可能性がある。
【００２７】
「化学療法剤」は、本発明のオリゴヌクレオチドと併用してＢ細胞腫瘍を治療する化学療法剤を意味するものとする。Ｂ細胞腫瘍の治療においては、本発明のオリゴヌクレオチドを１種もしくは複数種の化学療法剤と併用してもよい。化学療法剤は、シクロホスファミドまたはクロラムブシル、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキサート、プレドニゾン、アントラサイクリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、プリン類似体（例えば、リン酸フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシンおよびペントスタチン）、シトシン、アラビノシド、シスプラチン、エトポシドならびにイホスファミドなどのアルキル化剤を含むがこれらに限定されない。化学療法においては、本発明のオリゴヌクレオチドをさらに１種もしくは複数種の化学療法剤と併用してもよい。併用剤として、ＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよビーズキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰに加え、プロカルバジンおよびブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰに加え、メトトレキサート、ブレオマイシンおよびロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシドおよびロイコボリンに加え、標準ＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキサートおよびロイコボリン）、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、固定用量のプレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）、ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イホスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量のシタラビンおよびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾンおよびブレオマイシン）、ＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＰに加えてブレオマイシン、メトトレキサート、プロカルバジン、窒素マスタード、シトシンアラビノシドおよびエトポシド、ＭＯＰＰ（メクロレタミン（窒素マスタード）、ビンクリスチン（オンコビン）、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ＡＢＶＤ（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）、ＣｈＩＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびストレプトゾトシン）、ＭＯＰＰに加えてＡＢＶＤ、ＭＯＰＰに加えてＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびビンブラスチン）またはＢＣＶＰＰ（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ならびにＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびプレドニゾン）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
「免疫療法剤」は、本発明のオリゴヌクレオチドと併用してＢ細胞腫瘍を治療する免疫療法剤を意味するものとする。Ｂ細胞腫瘍の治療においては、本発明のオリゴヌクレオチドを１種もしくは複数種の免疫療法剤と併用してもよい。免疫療法剤には抗−ＣＤ２０抗体が含まれるがこれに限定されない。ＣＤ２０抗体は、Ｂ細胞腫瘍細胞の細胞表面上でＣＤ２０タンパク質と特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を含む。ＣＤ２０抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体ならびにヒト化抗体でありうる。「ＣＤ２０」はＢ細胞膜タンパク質であり(Tedder et al., Immunology Today 15: 450-454 (1994))、正常Ｂ細胞および腫瘍Ｂ細胞の双方の上で発現される(John C. Byrd,et al. J Clin Oncol 2001 ; 19: 2165-2170; Huhn D, et al. Blood 2001, 98: 1326-1331)。
【００２９】
「医薬的に許容できる担体」は、本発明のオリゴヌクレオチドを被験者に投与するのに適する、１種もしくは複数種の固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。担体は、有機物、無機物、天然物または合成物でありうる。担体は、あらゆる溶液、希釈剤、溶媒、分散媒、リポソーム、エマルジョン、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに本発明のオリゴヌクレオチドの投与に適する任意の他の担体を含み、それらの使用は当該技術分野で周知である。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチドの「治療有効量」は、被験者におけるＢ細胞腫瘍の治療において所望の結果を得るのに用いられる用量を示すものとする。用量は、当業者に周知の標準的な技術によって決定可能であり、かつ被験者の大きさまたは／および健康全般あるいは疾患の重篤度を含む（がこれらに限定されない）因子に応じて変化しうる。本発明のオリゴヌクレオチドの導入は、単回の治療として行っても、一連の複数回の治療にわたって行ってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドにおける投与の用量は、１投与当たり約１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。しかし、Ｂ細胞腫瘍の治療における用量は、上記用量よりも１０〜１，０００倍高い範囲内で使用されうる。投与計画は、最適な治療効果をもたらすように当業者により調節されうる。
【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチドを投与する「経路」は、経腸投与、非経口投与および局所投与または吸入を意味するものとする。本明細書で用いられる用語「経腸」は、経口投与、胃内投与、腸内投与および直腸投与を含む。用語「非経口」は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与または膣投与を含む。用語「局所」は、オリゴヌクレオチドの表皮、口腔ならびに耳、目および鼻への外部からの適用を意味する。
【００３２】
「医薬組成物」という用語は、医薬的に許容できる担体を伴うかまたは伴わない、治療有効量のオリゴヌクレオチドを含有する組成物を意味するものとする。組成物は、水溶液または食塩水、粒子、エアロゾル、ペレット、顆粒、粉末、タブレット、被覆タブレット、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップおよび種々の薬剤送達系における使用に適する他の医薬組成物を含むがこれらに限定されない。組成物は、注射、経口、口腔、直腸および膣使用、吸入ならびにデポー剤における適用に適する。組成物は、すべての場合に製造および保存の条件下で無菌かつ安定であり、微生物汚染に対して保護されなければならない。注射においては、組成物は、注射可能な溶液または分散液の即時調製のための水溶液または分散液および粉末を含むことになる。本発明における「粉末」は、オリゴヌクレオチドを含有する微細分散した固体粒子を含有する組成物を示す。粉末は、使用前に他の医薬的に許容できる担体（例えば、水、ＰＢＳ、食塩水および他の医薬的に許容できる緩衝液）と調合されうる。オリゴヌクレオチドを１種もしくは複数種の適切な溶媒および他の必要とされる成分に混和させることで溶液を調製してもよい。オリゴヌクレオチドを分散媒（例えば、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびオイル）および他の必要とされる成分を含有する賦形剤に混和させることで分散液を調製してもよい。経口投与においては、組成物を食用担体と調合することで、タブレット、ピル、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などが形成されることになる。口腔投与においては、組成物は、従来式のタブレットまたはロゼンジとなる。吸入においては、組成物は、加圧パックからのエアロゾルスプレーまたはネブライザーまたは乾燥粉末となり、当業者により選択可能である。オリゴヌクレオチドはまた、直腸用または膣用およびデポー用の医薬的に許容できる組成物として調合されうる。組成物中においてオリゴヌクレオチドは、単独使用してもよく、あるいは化学療法剤、免疫療法剤、および標的細胞の特異的な受容体もしくは分子によって認識されるリガンドを含む（がこれらに限定されない）１種もしくは複数種の他の作用物質と併用してもよい。別の作用物質と併用するオリゴヌクレオチドは、別々の組成物としてもよく、（１）オリゴヌクレオチドが第２の作用物質と投与前に混合される、（２）オリゴヌクレオチドおよび第２の作用物質が異なる時刻に被験者に投与される、（３）オリゴヌクレオチドおよび第２の作用物質が被験者の異なる部位に投与されるといったような方法で使用可能である。さらに、組成物は、本発明のオリゴヌクレオチドの配列を有する、プラスミド、細菌ベクター、ウイルスベクターおよび核酸ワクチンを含有しうる。
【実施例】
【００３３】
以下の実施例は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。本明細書においては、例えば合理的な当業者が着想するような理にかなった変形を本発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。
【００３４】
実施例１：オリゴヌクレオチドの合成
５’−ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣ−３’の配列（オリゴ２として設計、配列番号１）を有するオリゴヌクレオチドが設計および合成されている。
【００３５】
オリゴ２の機能を分析するため、５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ−３’（配列番号２）の配列を有する２００６、および５’−ｇｇｇｇｇａｃｇａｔｃｇｔｃｇｇｇｇｇｇ−３’（配列番号３）の配列を有する２２１６という２つの対照オリゴヌクレオチドも合成した。３つのオリゴヌクレオチドは、サンゴン・バイオテック・カンパニー（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ）（上海、中国）にて合成し、リムラス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ様細胞分解産物アッセイ（アソシエイツ・オブ・ケープ・コッド（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｉｎｃ））の利用によりエンドトキシンについて試験し、発熱物質を含有しない試薬中で操作した。２００６(J Immunol 2000: 164: 1617)は、正常Ｂ細胞を強く活性化させるよく研究されたオリゴヌクレオチドである。２２１６(Eur J Immunol 2001; 31:2154)は、形質細胞様樹状細胞内で大量のタイプＩインターフェロンを誘導するもう一つのよく研究されたオリゴヌクレオチドである。
【００３６】
オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当業者に周知であり、特に固相合成が一般に用いられている。具体的には、合成のプロセスにおいて用いられる固体支持体は多孔質ガラス（ＣＰＧ）ビーズである。このビーズは表面に孔およびチャネルを有し、それらの内部に保護されたヌクレオチドが結合する。オリゴヌクレオチド合成は、３’−末端ヌクレオチドで開始し、５’−末端ヌクレオチドが結合するまで繰り返される５つのステップからなる一連のサイクルを通して進行する。これらのステップは、脱保護、活性化、共役、キャッピングおよび安定化である。
【００３７】
ステップ１：脱保護
ＣＰＧ（多孔質ガラス）ビーズに付着した保護ヌクレオシド内の保護基が、反応性の５’−水酸基を残してトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によって除去される。
【００３８】
ステップ２：活性化
このステップでは、テトラゾールが、テトラゾリルホスホラミダイト中間体を形成する共役ホスホラミダイトヌクレオシドを攻撃する。
【００３９】
ステップ３：共役
テトラゾリルホスホラミダイト中間体がレシピエントの水酸基と反応し、５’から３’への連結が形成される。テトラゾールが再構成され、プロセスが継続する。
【００４０】
ステップ４：キャッピング
このステップでは、無水酢酸およびＮ−メチルイミダゾールからなるアセチル化試薬を用いることで、オリゴヌクレオチドのその５’−末端上の反応性水酸基が遮断され、共役できない事態が回避される。
【００４１】
ステップ５：安定化
一旦キャッピングステップが完了すると、サイクルにおける最終ステップは、伸長するオリゴヌクレオチド鎖と直前に付加された塩基の間のリン酸塩連結を安定化させる酸化ステップである。このステップを、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および水の中で弱酸化剤のヨウ素の存在下で行う。
【００４２】
この最終ステップ後、配列内の各ヌクレオチドについてサイクルを繰り返す。合成の完了後、一本鎖ＤＮＡ分子をＨＡＰ、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、Ｃ１８およびＯＰＣなどの方法によって精製する。
【００４３】
実施例２ オリゴ２により誘導されるヒトＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシス
１．ヒトＢ−ＣＬＬ細胞の調製
未治療のＢ−ＣＬＬ（病理学的に同定された）患者（ザ・ファースト・ホスピタル（Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、ジリン大学（Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、中国）由来の血液試料を、承認された書面でのインフォームドコンセントの取得後に採取した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール・パック（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））密度勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣ内のＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋Ｂ−ＣＬＬ細胞をＢ細胞単離キット（ミルテニー・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ベルギッシュグラートバハ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ）、ドイツ）を用いてＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋細胞（Ｂ−ＣＬＬ細胞）が９５％を超えるように精製した。細胞調製をミルテニー・バイオテクの使用説明書に従って行った。
【００４４】
２．オリゴ２により誘導されるヒトＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシス
Ｂ−ＣＬＬ細胞を、オリゴ２、２００６または２２１６（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴ２、２００６または２２１６を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。
【００４５】
インキュベーションの３、５および７日後、細胞を計数し、テトラメチル−ローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｌｎｃ））(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＴＭＲＥ陽性（生存）およびＴＭＲＥ陰性（アポトーシス）のＢ−ＣＬＬ細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳＡｒｉａ）によって測定した。生存Ｂ−ＣＬＬ細胞数は、全細胞数に、ＴＭＲＥ陽性細胞のパーセンテージを各時点で掛けることにより計算した。Ｂ−ＣＬＬ患者由来の１０種の血液試料を用いて実験を繰り返し、平均した結果（ｎ＝１０）は、オリゴ２がＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを有意に誘導し、オリゴ２によって誘導される作用が２００６によって誘導される作用と比べて約２倍強いことを示した（表１）。さらに、Ｂ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスに対するオリゴ２および２００６の用量作用もまた観察された。結果は、０．１〜１０μｇ／ｍｌの範囲の様々な用量のオリゴ２がＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを明らかに誘導することを示した（図１）。比較によると、１μｇ／ｍｌの用量でのオリゴ２のアポトーシス誘導作用は、２００６のそれと比べて約３倍強い。総合すると、これらの結果は、オリゴ２を用いることでＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスの誘導によりＢ−ＣＬＬが治療されうることを示している。
【００４６】
【表１】
【００４７】
実施例３ オリゴ２によるヒトＢ−ＣＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーション
１．ヒトＢ−ＣＬＬ細胞の調製
実施例２に記載の手順を用い、ヒトＢ−ＣＬＬ細胞をＢ−ＣＬＬ患者から単離した。
【００４８】
２．オリゴ２によるヒトＢ−ＣＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーション
Ｂ−ＣＬＬ細胞を、オリゴ２、２００６または２２１６（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴ２、２００６または２２１６を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。
【００４９】
インキュベーションの７日後、細胞を計数し、ＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体（ベクトン・ディッキンソン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ））（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＣＤ４０抗体で染色したＢ−ＣＬＬ細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）によって測定した。結果（図２）は、オリゴ２がＢ−ＣＬＬ細胞上でのＣＤ４０の発現を有意にアップレギュレートすることを示したものであり、これはオリゴ２を使用することで細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションによりＢ−ＣＬＬが治療されうることを示す。ＣＤ４０のアップレギュレーションは、Ｂ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを促進し、Ｂ−ＣＬＬ細胞の成長阻害を誘発し、かつＢ−ＣＬＬ細胞における免疫原性を高めることにより、Ｂ−ＣＬＬ細胞に特異的なＣＴＬの産生を刺激する。Ｂ−ＣＬＬ患者由来の少なくとも１０種の血液試料を用いて実験を繰り返し、同様の結果が得られた。
【００５０】
実施例４ オリゴ２により誘導されるヒト小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシス
１．ヒト小リンパ球性リンパ腫細胞の調製
承認された書面でのインフォームドコンセントの取得後、小リンパ球性リンパ腫細胞を、（病理学的に同定された）小リンパ球性リンパ腫を有する患者（ザ・ファースト・ホスピタル、ジリン大学、中国）由来のリンパ節の生検組織から単離した。生検組織を粗表面のスライドグラスで磨り潰し、６ｃｍの培養プレート内の１０％のヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）５ｍｌに細胞を放出した。放出された細胞を、ステンレス鋼メッシュを通して濾過し、１５ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を有する５０ｍｌのコニカルチューブ内に回収した。チューブを３００×ｇで１０分間遠心し、次いで上清を廃棄した。ＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋小リンパ球性リンパ腫細胞を、Ｂ細胞単離キット（ミルテニー・バイオテク、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）を用いて、ＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋細胞（小リンパ球性リンパ腫細胞）が９５％を超えるように精製した。細胞調製をミルテニー・バイオテクの使用説明書に従って行った。
【００５１】
２．オリゴ２により誘導される小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシス
小リンパ球性リンパ腫細胞をオリゴ２、２００６または２２１６（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で、最終濃度を３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴ２、２００６または２２１６を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。
【００５２】
インキュベーションの３、５および７日後、細胞を計数し、テトラメチル−ローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＴＭＲＥ陽性（生存）およびＴＭＲＥ陰性（アポトーシス）の小リンパ球性リンパ腫細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）によって測定した。生存小リンパ球性リンパ腫細胞数は、全細胞数にＴＭＲＥ陽性細胞のパーセンテージを各時点で掛けることにより計算した。小リンパ球性リンパ腫を有する患者由来の５種の試料を用いて実験を繰り返し、平均した結果（ｎ＝５）は、オリゴ２が小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシスを有意に誘導することを示したものであり（表２）、これはオリゴ２を使用し、小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシスを誘導することで小リンパ球性リンパ腫が治療されうることを示す。
【００５３】
【表２】
【００５４】
実施例５ オリゴ２により誘発される小リンパ球性リンパ腫細胞のＣＤ４０のアップレギュレーション
１．ヒト小リンパ球性リンパ腫細胞の調製
実施例４に記載の手順を用い、ヒト小リンパ球性リンパ腫細胞を患者から単離した。
【００５５】
２．オリゴ２により誘導される小リンパ球性リンパ腫細胞のＣＤ４０のアップレギュレート
小リンパ球性リンパ腫細胞をオリゴ２、２００６または２２１６（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴ２、２００６または２２１６を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。
【００５６】
インキュベーションの７日後、細胞を計数し、ＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体（ベクトン・ディッキンソン）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＣＤ４０抗体で染色した小リンパ球性リンパ腫細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）によって測定した。結果（図３）は、オリゴ２が小リンパ球性リンパ腫細胞上でのＣＤ４０の発現を有意にアップレギュレートすることを示したものであり、これはオリゴ２を用いることで細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションにより小リンパ球性リンパ腫が治療されうることを示す。ＣＤ４０のアップレギュレーションは、小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシスを促進し、小リンパ球性リンパ腫細胞の成長阻害を誘導し、かつ小リンパ球性リンパ腫細胞における免疫原性を高めることにより、同細胞に特異的なＣＴＬの産生を刺激する。５種の試料を用いて実験を繰り返し、同様の結果が得られた。
【００５７】
実施例６ オリゴ２により誘導されるヒトＢ細胞急性リンパ芽球性／リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）細胞のアポトーシス
１．ヒトＢ−ＡＬＬ細胞の調製
未治療のＢ−ＡＬＬ（病理学的に同定された）患者（ザ・ファースト・ホスピタル、ジリン大学、中国）由来の血液試料を、承認された書面でのインフォームドコンセントの取得後、採取した。ＰＢＭＣをフィコール・パック（ファルマシア）密度勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣ内のＣＤ１９＋ＣＤ１０＋Ｂ−ＡＬＬ細胞を、Ｂ細胞単離キット（ミルテニー・バイオテク、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）を用いて、ＣＤ１９＋ＣＤ１０＋細胞（Ｂ−ＡＬＬ細胞）が９５％を超えるように精製した。細胞調製をミルテニー・バイオテクの使用説明書に従って行った。
【００５８】
２．オリゴ２により誘導されるＢ−ＡＬＬ細胞のアポトーシス
Ｂ−ＡＬＬ細胞を、オリゴ２または２２１６（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で、最終濃度３μｇ／ｍｌとして）とともにインキュベートした。オリゴ２または２２１６を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。
【００５９】
インキュベーションの３、５および７日後、細胞を計数し、テトラメチル−ローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＴＭＲＥ陽性（生存）およびＴＭＲＥ陰性（アポトーシス）のＢ−ＡＬＬ細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）によって測定した。生存Ｂ−ＡＬＬ細胞数を、全細胞数とＴＭＲＥ陽性細胞百分率を各時点で掛けることにより計算した。結果は、オリゴ２がＢ−ＡＬＬ細胞のアポトーシスを有意に誘導することを示したものであり（図４）、これはオリゴ２を用いることでＢ−ＡＬＬ細胞のアポトーシスの誘導によりＢ−ＡＬＬが治療されうることを示す。Ｂ−ＡＬＬ患者由来の１０種の血液試料を用いて実験を繰り返し、同様の結果が得られた。
【００６０】
実施例７ オリゴ２によるＢ−ＡＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーション
１．ヒトＢ−ＡＬＬ細胞の調製
実施例６に記載の手順を用い、ヒトＢ−ＡＬＬ細胞を患者の血液試料から調製した。
【００６１】
Ｂ−ＡＬＬ細胞を、オリゴ２または２２１６（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴ２または２２１６を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。
【００６２】
インキュベーションの３、５、７日後、細胞を計数し、ＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体（ベクトン・ディッキンソン）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＣＤ４０抗体で染色したＢ−ＡＬＬ細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）によって測定した。結果（図５）は、オリゴ２がＢ−ＡＬＬ細胞上でのＣＤ４０の発現を有意にアップレギュレートすることを示したものであり、これはオリゴ２を用いることで細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションによりＢ−ＡＬＬが治療されうることを示す。ＣＤ４０のアップレギュレーションは、Ｂ−ＡＬＬ細胞のアポトーシスを促進し、Ｂ−ＡＬＬ細胞の成長阻害を誘発し、かつＢ−ＡＬＬ細胞における免疫原性を高めることにより、Ｂ−ＡＬＬ細胞に特異的なＣＴＬの産生を刺激する。Ｂ−ＡＬＬ患者由来の１０種の試料を用いて実験を繰り返し、同様の結果が得られた。
【００６３】
実施例８ オリゴ２により誘導されるＢ−ＣＬＬからのＩＬ−１０の産生
１．ヒトＢ−ＣＬＬ細胞の調製
実施例２に記載の手順を用い、ヒトＢ−ＣＬＬ細胞をＢ−ＣＬＬ患者から単離した。
【００６４】
２．オリゴ２により誘導されるＢ−ＣＬＬからのＩＬ−１０の産生
Ｂ−ＣＬＬ細胞を、オリゴ２（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともに３通りに培養した。オリゴ２を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。７２時間後または指定時刻に培養上清を回収し、フルオロカインＭＡＰイムノアッセイ（Ｆｌｕｏｒｏｋｉｎｅ ＭＡＰ Ｉｍｍｕｎｏａｒｒａｙ）（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））システムで、ＩＬ−１０について評価した。我々のデータは、オリゴ２を誘因としてＢ−ＣＬＬ細胞から高レベルのＩＬ−１０の産生がもたらされることを示した（図６）。６時間後、ＩＬ−１０産生の大幅な増加が検出され、２４時間後にピークに達し、７２時間の培養にわたり高レベルを保持した。さらに、我々のデータは、外因性ｒｈ−ＩＬ−１０（シェリング（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ））のＢ−ＣＬＬ細胞培養物への添加により、ＩＬ−１０の用量依存的にアポトーシス性Ｂ−ＣＬＬ細胞が誘導され、それは抗−ＩＬ−１０抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）によって特異的に遮断されうることをさらに示した。これらの実験結果は、オリゴ２を用い、Ｂ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを自己分泌的に引き起こすＩＬ−１０の産生を誘導することによりＢ−ＣＬＬが治療されうることを示している。実験をＢ−ＣＬＬ患者の少なくとも１０種の試料を用いて繰り返した。
【００６５】
実施例９ ヒト正常ＰＢＭＣの増殖に対するオリゴ２の作用
ヒトＰＢＭＣを、フィコール・ハイパック密度勾配遠心分離（ファルマシア）により健常な供血者（ザ・ブラッド・センター・オブ・ジリン・プロヴィンス（Ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ）、中国）の軟膜から単離した。ＰＢＭＣの生存度は、トリパンブルー排除による測定によると９５〜９９％であった。
【００６６】
ＰＢＭＣ（６×１０５／ウェル）を９６ウェルＵ底プレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））に播種し、オリゴ２（６μｇ／ｍｌ）とともにあるいはそれを伴わずにトリプリケートで３６時間培養後、［３Ｈ］チミジン（ニューイングランド・ニュークリア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）、マサチューセッツ州）で１６時間パルスを与えた。細胞をガラス繊維フィルター上に回収し、シンチレーションカウンターで検出した。細胞増殖を（トリプリケートのウェルからの）ＳＩ（刺激指数）として表した。５種の正常血液試料からのデータを示す。２００６および２２１６を対照として用いた。結果は、オリゴ２がＰＢＭＣの増殖を明らかに刺激しうることを示し（図７）、これはオリゴ２がアポトーシスを誘導することなく正常ヒトＰＢＭＣに対して増殖促進性を示し、且つ培養細胞に対して毒性を示さないことを示した。
【００６７】
本発明を詳細に説明してきたが、当業者にとっては、好ましい実施形態を参照することにより、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱することなく改良および変形を行えることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】オリゴ２により誘導されるＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシス（用量） Ｂ−ＣＬＬ細胞は、様々な量のオリゴ２とともにまたはそれを伴わずに１０％ヒトＡＢ血清培地内で培養された。７日目、細胞はＴＭＲＥで染色された。生存Ｂ−ＣＬＬ細胞数は、ＴＭＲＥ陽性細胞のパーセンテージにより計算された。
【図２】Ｂ−ＣＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションに対するオリゴ２の作用 Ｂ−ＣＬＬ細胞は、オリゴ２とともにまたはそれを伴わずに７日間インキュベートされ、次いでフローサイトメトリーを用いてＣＤ４０の発現を分析するためにＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体で染色された。発現レベルはＭＦＩ数で示された。
【図３】小リンパ球性リンパ腫細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションに対するオリゴ２の作用 小リンパ球性リンパ腫細胞は、オリゴ２とともにまたはそれを伴わずにインキュベートされた。７日目、細胞は、フローサイトメトリーを用いてＣＤ４０の発現を分析するためにＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体で染色された。発現レベルはＭＦＩ数で示された。
【図４】オリゴ２により誘導されるＢ−ＡＬＬ細胞のアポトーシス Ｂ−ＡＬＬ細胞は、オリゴ２とともにまたはそれを伴わずにインキュベートされた。インキュベーションの３、５および７日目、細胞はＴＭＲＥで染色された後、フローサイトメトリーで分析された。生存Ｂ−ＡＬＬ細胞数は、ＴＭＲＥ陽性細胞のパーセンテージにより計算された。
【図５】オリゴ２によるＢ−ＡＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーション Ｂ−ＡＬＬ細胞は、１μｇ／ｍｌのオリゴ２とともにまたはそれを伴わずに培養された。培養の３、５および７日目、細胞は、フローサイトメトリーを用いてＣＤ４０の発現を分析するためにＦＩＴＣで標識された抗−ＣＤ４０ ｍＡｂで染色された。発現レベルはＭＦＩ数で示された。
【図６】オリゴ２により誘導されるＢ−ＣＬＬ細胞からのインターロイキン−１０の産生 Ｂ−ＣＬＬ細胞は、オリゴ２とともにまたはそれを伴わずに無血清培地内で培養された。上清は、指定時刻で回収され、ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−１０について評価された。
【図７】ヒト正常ＰＢＭＣの増殖に対するオリゴ２の作用 正常ヒトＰＢＭＣは、オリゴ２、２２１６または２００６とともに３６時間培養され、次いでそれぞれ細胞の増殖を測定するために［３Ｈ］チミジンと混和された。５種の血液試料が分析された。細胞の増殖がＳＩとして表された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号１に示される配列を有するオリゴヌクレオチド、またはその機能的相同体、それらを含有する組成物、ならびにオリゴヌクレオチドを用いてＢ細胞腫瘍細胞のアポトーシスを誘発し、Ｂ細胞腫瘍細胞上でＣＤ４０をアップレギュレートし、かつＢ細胞腫瘍細胞を刺激してＩＬ−１０を産生させることによってＢ細胞腫瘍を治療するための方法を提供する。オリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体を単独で使用するかまたは化学療法剤、免疫療法剤および放射線と併用することで、Ｂ細胞腫瘍の治療が可能である。
【背景技術】
【０００２】
リンパ性悪性疾患は、ＷＨＯ分類系(American Journal of Surgical Pathology, 1997, 21(1): 114-121)に基づき、Ｂ細胞腫瘍、Ｔ細胞／ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞腫瘍およびホジキンリンパ腫という３つの主要なクラスに分類される。
【０００３】
Ｂ細胞腫瘍は、前駆Ｂ細胞腫瘍および末梢Ｂ細胞腫瘍という２つのグループにさらに分かれる。前駆Ｂ細胞腫瘍は、前駆体Ｂ−急性リンパ芽球性白血病（Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｂ−ＡＬＬ）／リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）を含む。末梢Ｂ細胞腫瘍は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／免疫細胞腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚の濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴ型節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−単球様Ｂ細胞）、脾性辺縁帯リンパ腫（＋／−絨毛リンパ球）、ヘアリー細胞白血病、形質細胞腫／形質細胞骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫およびバーキットリンパ腫を含む。
【０００４】
Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）およびＢ細胞急性リンパ芽球性／リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）は、Ｂ細胞白血病の２つのタイプである。Ｂ−ＣＬＬ細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ５およびＣＤ２３を発現する(Nicholas Chiorazzi, M. D., et al. N Engl J Med 2005;352:804-15)。Ｂ−ＡＬＬ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ１０＋マーカーを発現する。
【０００５】
小リンパ球性リンパ腫はＢ細胞腫瘍である。小リンパ球性リンパ腫におけるＢ細胞のモノクローナル母集団は、ＣＤ１９、ＣＤ５およびＣＤ２３を発現する(Catherine Thieblemont,et al. Blood. 2004; 103:2727-2737)。
【０００６】
現行の治療オプションには、診断されたＢ細胞腫瘍に応じて、化学療法、放射線療法および免疫療法がある。
【０００７】
正常Ｂリンパ球および樹状細胞の細胞表面上に発現されるＣＤ４０は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーである。Ｔリンパ球上で発現されるＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）は、腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーである(Castle BE, et al. J Immunol 1993; 151 : 1777-1788)。ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の相互作用は、Ｂリンパ球、樹状細胞および単球の増殖、分化および抗原提示を促進する(Ranheim EA, et al. J Exp Med 1993;177: 925-935; Yellin MJ et al. J Immunol 1994; 153: 666-674; Banchereau J, et al. Annu Rev Immunol 1994; 12: 881-922; M.von Bergwelt-Baildon MS, et al. Blood 2002; 99: 3319-3325)。
【０００８】
ＣＤ４０はＢ細胞腫瘍細胞上でも発現する。ＣＤ４０の発現を高めることでＢ細胞腫瘍細胞のアポトーシスが促進されることが実証されている(Peter Chu, et al. PNAS, March 19, 2002, vol. 99, no: 6 3854-3859; Frank Dicker, et al. BLOOD, 15 April 2005 Volume 105, Number 8: 3193-3198)。in vitroとin vivoの双方での実験で、ＣＤ４０の刺激およびアップレギュレーションによりＢ細胞腫瘍細胞の成長阻害が誘発されることが示された(Funakoshi et al., Blood 83: 2787-2794,1994; Murphy et al., Blood 86: 1946-1953 ,1995; Eliopoulos, A. G, et al. 1996. Oncogene 13:2243; Hirano, A.,et al. 1999. Blood 93:2999; Tong, A. W., M et al. 2001.Clin. Cancer Res. 7:691)。
【０００９】
Ｂ細胞腫瘍細胞上でのＣＤ４０発現の促進が、Ｂ細胞腫瘍細胞の抗原性を増強し、その結果、同細胞に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生を促進することが報告された。ＣＴＬはＢ細胞腫瘍細胞を効率的に殺滅しうる(Dilloo D, et al. Blood. 1997;90: 1927-1933; Kato K, et al. J Clin Invest. 1998;101 :1133-1141 ; Wierda WG, et al. Blood. 2000;96:2917-2924 ; Takahashi S, et al. Hum Gene Ther. 2001;12:659-670; Takahashi S, et al. Cancer Gene Ther.2001 ;8:378-387)。ＣＤ４０Ｌの存在下で、ＣＤ４０を発現するＢ細胞慢性リンパ性白血病細胞は、ＣＤ４細胞傷害性Ｔリンパ球によって殺滅されうる(Frank Dicker, et al. Blood, 15 April 2005 Vo1 105, Num 8: 3193-3198)。バーキットリンパ腫の細胞上におけるＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用により、細胞における腫瘍抗原の特異的ＣＴＬに対する提示の促進が可能となる(Khanna, R.et al. 1997. J. Immunol. 159:5782)。in vivo実験および臨床試験では、ＣＤ４０の活性化によりＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞の免疫原性が増強され、その結果、同細胞に特異的なＣＴＬの産生が誘導されうることも実証された(Kato, K.,et al. 1998.J. Clin. Invest. 101 :1133; Wierda, W. G.,et al. 2000. Blood 96: 2917)。
【００１０】
これらのデータを併せると、Ｂ細胞腫瘍細胞上でのＣＤ４０の発現を促進することでＢ細胞腫瘍に対する抗腫瘍免疫性が刺激されうることが示唆される。抗腫瘍免疫性は、
１．Ｂ細胞腫瘍細胞のアポトーシスの促進、
２．Ｂ細胞腫瘍細胞の成長の阻害、
３．Ｂ細胞腫瘍細胞の免疫原性の増強と、それによる同細胞に特異的なＣＴＬの産生促進
を含むがこれらに限定されない。
【００１１】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、特定のＴ細胞、単球、マクロファージ、およびＢ細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞から発生した新生細胞の一部によって産生されるホモ二量体サイトカインである(Kitabayashi et at., 1995; Masood et al., 1995; Sjoberg et al., 1996; Beatty et al., 1997; Boulland et al., 1998; Jones et al., 1999)。ＩＬ−１０活性は、それに特異的な細胞表面受容体によって仲介される。受容体は、抗原提示細胞、リンパ球およびＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞の上に発現する。外因性ＩＬ−１０の添加により患者から新たに単離されたＢ−ＣＬＬ細胞の増殖が阻害されることが見出された(Jesper Jurlander, Chun-Fai Lai, Jimmy Tan, et al. Characterization of interleukin-10 receptor expression on B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood, Vol 89, No 11 (June 1), 1997: pp 4146-4152)。ＩＬ−１０は、Ｂ−ＣＬＬ細胞の増殖を阻害し、且つＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを促進することも報告された(Anne-Catherine Fluckiger, lsabelle Durand, and Jacques Banchereau. lnterleukin 10 Induces Apoptotic Cell Death of B-Chronic Lymphocytic Leukemia Cells. J. Exp. Med. Volume 179 January 1994 91-99)。ＩＬ−１０の免疫刺激性の抗癌特性についてはレビューで論じられており、それからは腫瘍微環境内でのＩＬ−１０の過剰発現が癌の免疫拒絶を触媒しうることが推定される(Simone Mocellin, Francesco M. Marincola and Howard A. Young. Interleukin-10 and the immune response against cancer: a counterpoint. Journal of Leukocyte Biology. 2005; 78:1043-1051)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明では、発明者らは、オリゴヌクレオチドおよび本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによるＢ細胞腫瘍を治療するための方法を提供する。オリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、Ｂ細胞腫瘍細胞上でのＣＤ４０の発現を促進し、且つＢ細胞腫瘍細胞におけるＩＬ−１０の産生を刺激し、すべてがＢ細胞腫瘍の治療に寄与する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の実施形態では、本発明は、５’−ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣ−３’（オリゴ２として設計または配列番号１として指定）の配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体を提供する。オリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体は、部分的または完全なホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾であるリン酸塩骨格修飾を有しうる。オリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体は、化学修飾を有しうるかまたは微量塩基との置換を有しうる。オリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体は、任意の他のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片の機能的部分でありうるかあるいはプラスミド、細菌ベクター、ウイルスベクターまたはＤＮＡワクチンにそれぞれクローニングされうる。配列番号１の配列を有するオリゴヌクレオチドは、１つもしくは複数の塩基（好ましくは１〜１０個の塩基）をその各末端に付加するかまたはオリゴヌクレオチド内で塩基を変化させることにより修飾されうる。当業者は、本発明の目的を達成するために、当該技術分野で周知の内容および本発明における教示内容に基づいて、配列番号１の配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体、配列（配列番号１）を有するオリゴヌクレオチドの１つもしくは複数のコピーを一本鎖または二本鎖のＤＮＡ断片の使用することを決定することができる。
【００１４】
第２の実施形態では、本発明は、被験者において本発明のオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体またはそれらを含有する組成物を用いて、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法を提供する。被験者はヒトまたは動物である。Ｂ細胞腫瘍は、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫および骨髄腫を含むがこれらに限定されない。
【００１５】
第３の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体またはそれらを含有する組成物を使用して、Ｂ細胞腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することにより、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法を提供する。
【００１６】
第４の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体またはそれらを含有する組成物を使用して、Ｂ細胞腫瘍細胞上でＣＤ４０をアップレギュレートすることにより、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法を提供する。
【００１７】
第５の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体またはそれらを含有する組成物を使用して、Ｂ細胞腫瘍細胞におけるＩＬ−１０の産生を刺激することにより、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、本発明における治療有効量のオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体を単独で含有する、あるいは１種もしくは複数種の医薬的に許容できる担体中に含有する、または当該担体とともに含有する組成物を提供する。組成物を、経腸投与、非経口投与および局所投与するかまたは吸入投与してもよい。
【００１９】
さらに別の実施形態では、本発明は、Ｂ細胞腫瘍を治療する方法であって、治療有効量の本発明のオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体あるいはそれらを含有する組成物、および化学療法剤、免疫療法剤および放射線療法で使用される作用物質を含む抗−Ｂ細胞腫瘍剤の少なくとも１種を含有する組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
定義
本発明では、以下の用語は下記の意味を有するものとする。
【００２１】
「オリゴヌクレオチド」は、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基および交換可能な有機塩基に連結される糖（例えばデオキシリボース）を有する分子）を意味する。シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）という４種の有機塩基が存在する。オリゴヌクレオチドを、市販されている自動オリゴヌクレオチドシンセサイザで合成するか、または既知の技術を用いて既存の核酸配列から調製してもよい。
【００２２】
オリゴヌクレオチドの「骨格修飾」は、オリゴヌクレオチドがホスホロチオエートで修飾されたリン酸塩骨格（すなわちリン酸塩の酸素の少なくとも１つが硫黄と置換される）または他の修飾骨格を有することを意味するものとする。
【００２３】
オリゴヌクレオチドの「化学修飾」は、ヌクレオチドの活性基を利用するかまたはヌクレオチド類似体を生成することによる修飾を意味するものとする。修飾はオリゴヌクレオチドの合成の間または合成後に生じうる。合成の間、修飾塩基（チミジン類似体を含むがこれに限定されない）が内部にまたは５’末端側に取り込まれうる。合成後、（アミノ修飾因子、３’もしくは５’水酸基、またはリン酸基を介して）活性基を用いて修飾がなされうる。
【００２４】
「Ｂ細胞腫瘍」は、Ｂリンパ球系の細胞の異常な増殖から発生した疾患を意味するものとする。Ｂ細胞腫瘍は、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫および骨髄腫（形質細胞腫／形質細胞骨髄腫）に分類されうる。Ｂ細胞白血病は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、前駆Ｂ−急性リンパ芽球性白血病（Ｂ細胞急性リンパ性白血病、Ｂ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病およびヘアリー細胞白血病を含む。Ｂ細胞リンパ腫は、小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫／免疫細胞腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴ型節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−単球様Ｂ細胞）、脾性辺縁帯リンパ腫（＋／−絨毛リンパ球）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫およびバーキットリンパ腫を含む。
【００２５】
「被験者」は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、マウスおよびラットを含む（がこれらに限定されない）哺乳動物を意味するものとする。本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞腫瘍を有する被験者に投与されうる。
【００２６】
「抗−Ｂ細胞腫瘍剤」は、被験者のＢ細胞腫瘍を治療するために用いられる作用物質を意味するものとする。作用物質は、本発明のオリゴヌクレオチド、化学療法剤、免疫療法剤および放射線療法で使用される作用物質を含む。本発明のオリゴヌクレオチドを、１種もしくは複数種の他の抗−Ｂ細胞腫瘍剤の投与に先立ち、投与と同時にまたは投与後に投与することで、Ｂ細胞腫瘍の治療において相乗効果が得られる可能性がある。
【００２７】
「化学療法剤」は、本発明のオリゴヌクレオチドと併用してＢ細胞腫瘍を治療する化学療法剤を意味するものとする。Ｂ細胞腫瘍の治療においては、本発明のオリゴヌクレオチドを１種もしくは複数種の化学療法剤と併用してもよい。化学療法剤は、シクロホスファミドまたはクロラムブシル、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキサート、プレドニゾン、アントラサイクリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、プリン類似体（例えば、リン酸フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシンおよびペントスタチン）、シトシン、アラビノシド、シスプラチン、エトポシドならびにイホスファミドなどのアルキル化剤を含むがこれらに限定されない。化学療法においては、本発明のオリゴヌクレオチドをさらに１種もしくは複数種の化学療法剤と併用してもよい。併用剤として、ＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよビーズキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰに加え、プロカルバジンおよびブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰに加え、メトトレキサート、ブレオマイシンおよびロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシドおよびロイコボリンに加え、標準ＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキサートおよびロイコボリン）、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、固定用量のプレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）、ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イホスファミド、メトトレキサートおよびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量のシタラビンおよびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾンおよびブレオマイシン）、ＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＰに加えてブレオマイシン、メトトレキサート、プロカルバジン、窒素マスタード、シトシンアラビノシドおよびエトポシド、ＭＯＰＰ（メクロレタミン（窒素マスタード）、ビンクリスチン（オンコビン）、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ＡＢＶＤ（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）、ＣｈＩＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびストレプトゾトシン）、ＭＯＰＰに加えてＡＢＶＤ、ＭＯＰＰに加えてＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびビンブラスチン）またはＢＣＶＰＰ（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ならびにＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびプレドニゾン）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
「免疫療法剤」は、本発明のオリゴヌクレオチドと併用してＢ細胞腫瘍を治療する免疫療法剤を意味するものとする。Ｂ細胞腫瘍の治療においては、本発明のオリゴヌクレオチドを１種もしくは複数種の免疫療法剤と併用してもよい。免疫療法剤には抗−ＣＤ２０抗体が含まれるがこれに限定されない。ＣＤ２０抗体は、Ｂ細胞腫瘍細胞の細胞表面上でＣＤ２０タンパク質と特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を含む。ＣＤ２０抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体ならびにヒト化抗体でありうる。「ＣＤ２０」はＢ細胞膜タンパク質であり(Tedder et al., Immunology Today 15: 450-454 (1994))、正常Ｂ細胞および腫瘍Ｂ細胞の双方の上で発現される(John C. Byrd,et al. J Clin Oncol 2001 ; 19: 2165-2170; Huhn D, et al. Blood 2001, 98: 1326-1331)。
【００２９】
「医薬的に許容できる担体」は、本発明のオリゴヌクレオチドを被験者に投与するのに適する、１種もしくは複数種の固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。担体は、有機物、無機物、天然物または合成物でありうる。担体は、あらゆる溶液、希釈剤、溶媒、分散媒、リポソーム、エマルジョン、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに本発明のオリゴヌクレオチドの投与に適する任意の他の担体を含み、それらの使用は当該技術分野で周知である。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチドの「治療有効量」は、被験者におけるＢ細胞腫瘍の治療において所望の結果を得るのに用いられる用量を示すものとする。用量は、当業者に周知の標準的な技術によって決定可能であり、かつ被験者の大きさまたは／および健康全般あるいは疾患の重篤度を含む（がこれらに限定されない）因子に応じて変化しうる。本発明のオリゴヌクレオチドの導入は、単回の治療として行っても、一連の複数回の治療にわたって行ってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドにおける投与の用量は、１投与当たり約１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。しかし、Ｂ細胞腫瘍の治療における用量は、上記用量よりも１０〜１，０００倍高い範囲内で使用されうる。投与計画は、最適な治療効果をもたらすように当業者により調節されうる。
【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチドを投与する「経路」は、経腸投与、非経口投与および局所投与または吸入を意味するものとする。本明細書で用いられる用語「経腸」は、経口投与、胃内投与、腸内投与および直腸投与を含む。用語「非経口」は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与または膣投与を含む。用語「局所」は、オリゴヌクレオチドの表皮、口腔ならびに耳、目および鼻への外部からの適用を意味する。
【００３２】
「医薬組成物」という用語は、医薬的に許容できる担体を伴うかまたは伴わない、治療有効量のオリゴヌクレオチドを含有する組成物を意味するものとする。組成物は、水溶液または食塩水、粒子、エアロゾル、ペレット、顆粒、粉末、タブレット、被覆タブレット、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップおよび種々の薬剤送達系における使用に適する他の医薬組成物を含むがこれらに限定されない。組成物は、注射、経口、口腔、直腸および膣使用、吸入ならびにデポー剤における適用に適する。組成物は、すべての場合に製造および保存の条件下で無菌かつ安定であり、微生物汚染に対して保護されなければならない。注射においては、組成物は、注射可能な溶液または分散液の即時調製のための水溶液または分散液および粉末を含むことになる。本発明における「粉末」は、オリゴヌクレオチドを含有する微細分散した固体粒子を含有する組成物を示す。粉末は、使用前に他の医薬的に許容できる担体（例えば、水、ＰＢＳ、食塩水および他の医薬的に許容できる緩衝液）と調合されうる。オリゴヌクレオチドを１種もしくは複数種の適切な溶媒および他の必要とされる成分に混和させることで溶液を調製してもよい。オリゴヌクレオチドを分散媒（例えば、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびオイル）および他の必要とされる成分を含有する賦形剤に混和させることで分散液を調製してもよい。経口投与においては、組成物を食用担体と調合することで、タブレット、ピル、ドラジェ、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などが形成されることになる。口腔投与においては、組成物は、従来式のタブレットまたはロゼンジとなる。吸入においては、組成物は、加圧パックからのエアロゾルスプレーまたはネブライザーまたは乾燥粉末となり、当業者により選択可能である。オリゴヌクレオチドはまた、直腸用または膣用およびデポー用の医薬的に許容できる組成物として調合されうる。組成物中においてオリゴヌクレオチドは、単独使用してもよく、あるいは化学療法剤、免疫療法剤、および標的細胞の特異的な受容体もしくは分子によって認識されるリガンドを含む（がこれらに限定されない）１種もしくは複数種の他の作用物質と併用してもよい。別の作用物質と併用するオリゴヌクレオチドは、別々の組成物としてもよく、（１）オリゴヌクレオチドが第２の作用物質と投与前に混合される、（２）オリゴヌクレオチドおよび第２の作用物質が異なる時刻に被験者に投与される、（３）オリゴヌクレオチドおよび第２の作用物質が被験者の異なる部位に投与されるといったような方法で使用可能である。さらに、組成物は、本発明のオリゴヌクレオチドの配列を有する、プラスミド、細菌ベクター、ウイルスベクターおよび核酸ワクチンを含有しうる。
【実施例】
【００３３】
以下の実施例は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。本明細書においては、例えば合理的な当業者が着想するような理にかなった変形を本発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。
【００３４】
実施例１：オリゴヌクレオチドの合成
５’−ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣ−３’の配列（オリゴ２として設計、配列番号１）を有するオリゴヌクレオチドが設計および合成されている。
【００３５】
オリゴ２の機能を分析するため、５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ−３’（配列番号２）の配列を有する２００６、および５’−ｇｇｇｇｇａｃｇａｔｃｇｔｃｇｇｇｇｇｇ−３’（配列番号３）の配列を有する２２１６という２つの対照オリゴヌクレオチドも合成した。３つのオリゴヌクレオチドは、サンゴン・バイオテック・カンパニー（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ）（上海、中国）にて合成し、リムラス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ様細胞分解産物アッセイ（アソシエイツ・オブ・ケープ・コッド（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｉｎｃ））の利用によりエンドトキシンについて試験し、発熱物質を含有しない試薬中で操作した。２００６(J Immunol 2000: 164: 1617)は、正常Ｂ細胞を強く活性化させるよく研究されたオリゴヌクレオチドである。２２１６(Eur J Immunol 2001; 31:2154)は、形質細胞様樹状細胞内で大量のタイプＩインターフェロンを誘導するもう一つのよく研究されたオリゴヌクレオチドである。
【００３６】
オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当業者に周知であり、特に固相合成が一般に用いられている。具体的には、合成のプロセスにおいて用いられる固体支持体は多孔質ガラス（ＣＰＧ）ビーズである。このビーズは表面に孔およびチャネルを有し、それらの内部に保護されたヌクレオチドが結合する。オリゴヌクレオチド合成は、３’−末端ヌクレオチドで開始し、５’−末端ヌクレオチドが結合するまで繰り返される５つのステップからなる一連のサイクルを通して進行する。これらのステップは、脱保護、活性化、共役、キャッピングおよび安定化である。
【００３７】
ステップ１：脱保護
ＣＰＧ（多孔質ガラス）ビーズに付着した保護ヌクレオシド内の保護基が、反応性の５’−水酸基を残してトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によって除去される。
【００３８】
ステップ２：活性化
このステップでは、テトラゾールが、テトラゾリルホスホラミダイト中間体を形成する共役ホスホラミダイトヌクレオシドを攻撃する。
【００３９】
ステップ３：共役
テトラゾリルホスホラミダイト中間体がレシピエントの水酸基と反応し、５’から３’への連結が形成される。テトラゾールが再構成され、プロセスが継続する。
【００４０】
ステップ４：キャッピング
このステップでは、無水酢酸およびＮ−メチルイミダゾールからなるアセチル化試薬を用いることで、オリゴヌクレオチドのその５’−末端上の反応性水酸基が遮断され、共役できない事態が回避される。
【００４１】
ステップ５：安定化
一旦キャッピングステップが完了すると、サイクルにおける最終ステップは、伸長するオリゴヌクレオチド鎖と直前に付加された塩基の間のリン酸塩連結を安定化させる酸化ステップである。このステップを、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）および水の中で弱酸化剤のヨウ素の存在下で行う。
【００４２】
この最終ステップ後、配列内の各ヌクレオチドについてサイクルを繰り返す。合成の完了後、一本鎖ＤＮＡ分子をＨＡＰ、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、Ｃ１８およびＯＰＣなどの方法によって精製する。
【００４３】
実施例２ オリゴ２により誘導されるヒトＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシス
１．ヒトＢ−ＣＬＬ細胞の調製
未治療のＢ−ＣＬＬ（病理学的に同定された）患者（ザ・ファースト・ホスピタル（Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、ジリン大学（Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、中国）由来の血液試料を、承認された書面でのインフォームドコンセントの取得後に採取した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール・パック（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））密度勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣ内のＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋Ｂ−ＣＬＬ細胞をＢ細胞単離キット（ミルテニー・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ベルギッシュグラートバハ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ）、ドイツ）を用いてＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋細胞（Ｂ−ＣＬＬ細胞）が９５％を超えるように精製した。細胞調製をミルテニー・バイオテクの使用説明書に従って行った。
【００４４】
２．オリゴ２により誘導されるヒトＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシス
Ｂ−ＣＬＬ細胞を、オリゴ２、２００６または２２１６（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴ２、２００６または２２１６を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。
【００４５】
インキュベーションの３、５および７日後、細胞を計数し、テトラメチル−ローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｌｎｃ））(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＴＭＲＥ陽性（生存）およびＴＭＲＥ陰性（アポトーシス）のＢ−ＣＬＬ細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳＡｒｉａ）によって測定した。生存Ｂ−ＣＬＬ細胞数は、全細胞数に、ＴＭＲＥ陽性細胞のパーセンテージを各時点で掛けることにより計算した。Ｂ−ＣＬＬ患者由来の１０種の血液試料を用いて実験を繰り返し、平均した結果（ｎ＝１０）は、オリゴ２がＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを有意に誘導し、オリゴ２によって誘導される作用が２００６によって誘導される作用と比べて約２倍強いことを示した（表１）。さらに、Ｂ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスに対するオリゴ２および２００６の用量作用もまた観察された。結果は、０．１〜１０μｇ／ｍｌの範囲の様々な用量のオリゴ２がＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを明らかに誘導することを示した（図１）。比較によると、１μｇ／ｍｌの用量でのオリゴ２のアポトーシス誘導作用は、２００６のそれと比べて約３倍強い。総合すると、これらの結果は、オリゴ２を用いることでＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスの誘導によりＢ−ＣＬＬが治療されうることを示している。
【００４６】
【表１】
【００４７】
実施例３ オリゴ２によるヒトＢ−ＣＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーション
１．ヒトＢ−ＣＬＬ細胞の調製
実施例２に記載の手順を用い、ヒトＢ−ＣＬＬ細胞をＢ−ＣＬＬ患者から単離した。
【００４８】
２．オリゴ２によるヒトＢ−ＣＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーション
Ｂ−ＣＬＬ細胞を、オリゴ２、２００６または２２１６（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴ２、２００６または２２１６を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。
【００４９】
インキュベーションの７日後、細胞を計数し、ＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体（ベクトン・ディッキンソン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ））（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＣＤ４０抗体で染色したＢ−ＣＬＬ細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）によって測定した。結果（図２）は、オリゴ２がＢ−ＣＬＬ細胞上でのＣＤ４０の発現を有意にアップレギュレートすることを示したものであり、これはオリゴ２を使用することで細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションによりＢ−ＣＬＬが治療されうることを示す。ＣＤ４０のアップレギュレーションは、Ｂ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを促進し、Ｂ−ＣＬＬ細胞の成長阻害を誘発し、かつＢ−ＣＬＬ細胞における免疫原性を高めることにより、Ｂ−ＣＬＬ細胞に特異的なＣＴＬの産生を刺激する。Ｂ−ＣＬＬ患者由来の少なくとも１０種の血液試料を用いて実験を繰り返し、同様の結果が得られた。
【００５０】
実施例４ オリゴ２により誘導されるヒト小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシス
１．ヒト小リンパ球性リンパ腫細胞の調製
承認された書面でのインフォームドコンセントの取得後、小リンパ球性リンパ腫細胞を、（病理学的に同定された）小リンパ球性リンパ腫を有する患者（ザ・ファースト・ホスピタル、ジリン大学、中国）由来のリンパ節の生検組織から単離した。生検組織を粗表面のスライドグラスで磨り潰し、６ｃｍの培養プレート内の１０％のヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）５ｍｌに細胞を放出した。放出された細胞を、ステンレス鋼メッシュを通して濾過し、１５ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を有する５０ｍｌのコニカルチューブ内に回収した。チューブを３００×ｇで１０分間遠心し、次いで上清を廃棄した。ＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋小リンパ球性リンパ腫細胞を、Ｂ細胞単離キット（ミルテニー・バイオテク、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）を用いて、ＣＤ５＋ＣＤ１９＋ＣＤ２３＋細胞（小リンパ球性リンパ腫細胞）が９５％を超えるように精製した。細胞調製をミルテニー・バイオテクの使用説明書に従って行った。
【００５１】
２．オリゴ２により誘導される小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシス
小リンパ球性リンパ腫細胞をオリゴ２、２００６または２２１６（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で、最終濃度を３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴ２、２００６または２２１６を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。
【００５２】
インキュベーションの３、５および７日後、細胞を計数し、テトラメチル−ローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＴＭＲＥ陽性（生存）およびＴＭＲＥ陰性（アポトーシス）の小リンパ球性リンパ腫細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）によって測定した。生存小リンパ球性リンパ腫細胞数は、全細胞数にＴＭＲＥ陽性細胞のパーセンテージを各時点で掛けることにより計算した。小リンパ球性リンパ腫を有する患者由来の５種の試料を用いて実験を繰り返し、平均した結果（ｎ＝５）は、オリゴ２が小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシスを有意に誘導することを示したものであり（表２）、これはオリゴ２を使用し、小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシスを誘導することで小リンパ球性リンパ腫が治療されうることを示す。
【００５３】
【表２】
【００５４】
実施例５ オリゴ２により誘発される小リンパ球性リンパ腫細胞のＣＤ４０のアップレギュレーション
１．ヒト小リンパ球性リンパ腫細胞の調製
実施例４に記載の手順を用い、ヒト小リンパ球性リンパ腫細胞を患者から単離した。
【００５５】
２．オリゴ２により誘導される小リンパ球性リンパ腫細胞のＣＤ４０のアップレギュレート
小リンパ球性リンパ腫細胞をオリゴ２、２００６または２２１６（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴ２、２００６または２２１６を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。
【００５６】
インキュベーションの７日後、細胞を計数し、ＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体（ベクトン・ディッキンソン）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＣＤ４０抗体で染色した小リンパ球性リンパ腫細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）によって測定した。結果（図３）は、オリゴ２が小リンパ球性リンパ腫細胞上でのＣＤ４０の発現を有意にアップレギュレートすることを示したものであり、これはオリゴ２を用いることで細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションにより小リンパ球性リンパ腫が治療されうることを示す。ＣＤ４０のアップレギュレーションは、小リンパ球性リンパ腫細胞のアポトーシスを促進し、小リンパ球性リンパ腫細胞の成長阻害を誘導し、かつ小リンパ球性リンパ腫細胞における免疫原性を高めることにより、同細胞に特異的なＣＴＬの産生を刺激する。５種の試料を用いて実験を繰り返し、同様の結果が得られた。
【００５７】
実施例６ オリゴ２により誘導されるヒトＢ細胞急性リンパ芽球性／リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）細胞のアポトーシス
１．ヒトＢ−ＡＬＬ細胞の調製
未治療のＢ−ＡＬＬ（病理学的に同定された）患者（ザ・ファースト・ホスピタル、ジリン大学、中国）由来の血液試料を、承認された書面でのインフォームドコンセントの取得後、採取した。ＰＢＭＣをフィコール・パック（ファルマシア）密度勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣ内のＣＤ１９＋ＣＤ１０＋Ｂ−ＡＬＬ細胞を、Ｂ細胞単離キット（ミルテニー・バイオテク、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ）を用いて、ＣＤ１９＋ＣＤ１０＋細胞（Ｂ−ＡＬＬ細胞）が９５％を超えるように精製した。細胞調製をミルテニー・バイオテクの使用説明書に従って行った。
【００５８】
２．オリゴ２により誘導されるＢ−ＡＬＬ細胞のアポトーシス
Ｂ−ＡＬＬ細胞を、オリゴ２または２２１６（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で、最終濃度３μｇ／ｍｌとして）とともにインキュベートした。オリゴ２または２２１６を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。
【００５９】
インキュベーションの３、５および７日後、細胞を計数し、テトラメチル−ローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＴＭＲＥ陽性（生存）およびＴＭＲＥ陰性（アポトーシス）のＢ−ＡＬＬ細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）によって測定した。生存Ｂ−ＡＬＬ細胞数を、全細胞数とＴＭＲＥ陽性細胞百分率を各時点で掛けることにより計算した。結果は、オリゴ２がＢ−ＡＬＬ細胞のアポトーシスを有意に誘導することを示したものであり（図４）、これはオリゴ２を用いることでＢ−ＡＬＬ細胞のアポトーシスの誘導によりＢ−ＡＬＬが治療されうることを示す。Ｂ−ＡＬＬ患者由来の１０種の血液試料を用いて実験を繰り返し、同様の結果が得られた。
【００６０】
実施例７ オリゴ２によるＢ−ＡＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーション
１．ヒトＢ−ＡＬＬ細胞の調製
実施例６に記載の手順を用い、ヒトＢ−ＡＬＬ細胞を患者の血液試料から調製した。
【００６１】
Ｂ−ＡＬＬ細胞を、オリゴ２または２２１６（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、１０％ヒトＡＢ血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともにインキュベートした。オリゴ２または２２１６を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。
【００６２】
インキュベーションの３、５、７日後、細胞を計数し、ＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体（ベクトン・ディッキンソン）（モレキュラー・プローブス）(Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004)で１０分間染色した。ＣＤ４０抗体で染色したＢ−ＡＬＬ細胞をフローサイトメトリー（Ｂ．Ｄ．ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）によって測定した。結果（図５）は、オリゴ２がＢ−ＡＬＬ細胞上でのＣＤ４０の発現を有意にアップレギュレートすることを示したものであり、これはオリゴ２を用いることで細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションによりＢ−ＡＬＬが治療されうることを示す。ＣＤ４０のアップレギュレーションは、Ｂ−ＡＬＬ細胞のアポトーシスを促進し、Ｂ−ＡＬＬ細胞の成長阻害を誘発し、かつＢ−ＡＬＬ細胞における免疫原性を高めることにより、Ｂ−ＡＬＬ細胞に特異的なＣＴＬの産生を刺激する。Ｂ−ＡＬＬ患者由来の１０種の試料を用いて実験を繰り返し、同様の結果が得られた。
【００６３】
実施例８ オリゴ２により誘導されるＢ−ＣＬＬからのＩＬ−１０の産生
１．ヒトＢ−ＣＬＬ細胞の調製
実施例２に記載の手順を用い、ヒトＢ−ＣＬＬ細胞をＢ−ＣＬＬ患者から単離した。
【００６４】
２．オリゴ２により誘導されるＢ−ＣＬＬからのＩＬ−１０の産生
Ｂ−ＣＬＬ細胞を、オリゴ２（４８ウェルプレートで、１０６細胞／ウェルとし、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）内で最終濃度３μｇ／ｍｌとした）とともに３通りに培養した。オリゴ２を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン）で希釈した。同容量の希釈物（無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ハイクローン））を対照（培地）として用いた。７２時間後または指定時刻に培養上清を回収し、フルオロカインＭＡＰイムノアッセイ（Ｆｌｕｏｒｏｋｉｎｅ ＭＡＰ Ｉｍｍｕｎｏａｒｒａｙ）（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））システムで、ＩＬ−１０について評価した。我々のデータは、オリゴ２を誘因としてＢ−ＣＬＬ細胞から高レベルのＩＬ−１０の産生がもたらされることを示した（図６）。６時間後、ＩＬ−１０産生の大幅な増加が検出され、２４時間後にピークに達し、７２時間の培養にわたり高レベルを保持した。さらに、我々のデータは、外因性ｒｈ−ＩＬ−１０（シェリング（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ））のＢ−ＣＬＬ細胞培養物への添加により、ＩＬ−１０の用量依存的にアポトーシス性Ｂ−ＣＬＬ細胞が誘導され、それは抗−ＩＬ−１０抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ）によって特異的に遮断されうることをさらに示した。これらの実験結果は、オリゴ２を用い、Ｂ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスを自己分泌的に引き起こすＩＬ−１０の産生を誘導することによりＢ−ＣＬＬが治療されうることを示している。実験をＢ−ＣＬＬ患者の少なくとも１０種の試料を用いて繰り返した。
【００６５】
実施例９ ヒト正常ＰＢＭＣの増殖に対するオリゴ２の作用
ヒトＰＢＭＣを、フィコール・ハイパック密度勾配遠心分離（ファルマシア）により健常な供血者（ザ・ブラッド・センター・オブ・ジリン・プロヴィンス（Ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ）、中国）の軟膜から単離した。ＰＢＭＣの生存度は、トリパンブルー排除による測定によると９５〜９９％であった。
【００６６】
ＰＢＭＣ（６×１０５／ウェル）を９６ウェルＵ底プレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））に播種し、オリゴ２（６μｇ／ｍｌ）とともにあるいはそれを伴わずにトリプリケートで３６時間培養後、［３Ｈ］チミジン（ニューイングランド・ニュークリア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）、マサチューセッツ州）で１６時間パルスを与えた。細胞をガラス繊維フィルター上に回収し、シンチレーションカウンターで検出した。細胞増殖を（トリプリケートのウェルからの）ＳＩ（刺激指数）として表した。５種の正常血液試料からのデータを示す。２００６および２２１６を対照として用いた。結果は、オリゴ２がＰＢＭＣの増殖を明らかに刺激しうることを示し（図７）、これはオリゴ２がアポトーシスを誘導することなく正常ヒトＰＢＭＣに対して増殖促進性を示し、且つ培養細胞に対して毒性を示さないことを示した。
【００６７】
本発明を詳細に説明してきたが、当業者にとっては、好ましい実施形態を参照することにより、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱することなく改良および変形を行えることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】オリゴ２により誘導されるＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシス（用量） Ｂ−ＣＬＬ細胞は、様々な量のオリゴ２とともにまたはそれを伴わずに１０％ヒトＡＢ血清培地内で培養された。７日目、細胞はＴＭＲＥで染色された。生存Ｂ−ＣＬＬ細胞数は、ＴＭＲＥ陽性細胞のパーセンテージにより計算された。
【図２】Ｂ−ＣＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションに対するオリゴ２の作用 Ｂ−ＣＬＬ細胞は、オリゴ２とともにまたはそれを伴わずに７日間インキュベートされ、次いでフローサイトメトリーを用いてＣＤ４０の発現を分析するためにＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体で染色された。発現レベルはＭＦＩ数で示された。
【図３】小リンパ球性リンパ腫細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーションに対するオリゴ２の作用 小リンパ球性リンパ腫細胞は、オリゴ２とともにまたはそれを伴わずにインキュベートされた。７日目、細胞は、フローサイトメトリーを用いてＣＤ４０の発現を分析するためにＦＩＴＣ−ＣＤ４０抗体で染色された。発現レベルはＭＦＩ数で示された。
【図４】オリゴ２により誘導されるＢ−ＡＬＬ細胞のアポトーシス Ｂ−ＡＬＬ細胞は、オリゴ２とともにまたはそれを伴わずにインキュベートされた。インキュベーションの３、５および７日目、細胞はＴＭＲＥで染色された後、フローサイトメトリーで分析された。生存Ｂ−ＡＬＬ細胞数は、ＴＭＲＥ陽性細胞のパーセンテージにより計算された。
【図５】オリゴ２によるＢ−ＡＬＬ細胞上でのＣＤ４０のアップレギュレーション Ｂ−ＡＬＬ細胞は、１μｇ／ｍｌのオリゴ２とともにまたはそれを伴わずに培養された。培養の３、５および７日目、細胞は、フローサイトメトリーを用いてＣＤ４０の発現を分析するためにＦＩＴＣで標識された抗−ＣＤ４０ ｍＡｂで染色された。発現レベルはＭＦＩ数で示された。
【図６】オリゴ２により誘導されるＢ−ＣＬＬ細胞からのインターロイキン−１０の産生 Ｂ−ＣＬＬ細胞は、オリゴ２とともにまたはそれを伴わずに無血清培地内で培養された。上清は、指定時刻で回収され、ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−１０について評価された。
【図７】ヒト正常ＰＢＭＣの増殖に対するオリゴ２の作用 正常ヒトＰＢＭＣは、オリゴ２、２２１６または２００６とともに３６時間培養され、次いでそれぞれ細胞の増殖を測定するために［３Ｈ］チミジンと混和された。５種の血液試料が分析された。細胞の増殖がＳＩとして表された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを１コピー〜５コピー含むＤＮＡ断片またはその機能的相同体。
【請求項３】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを機能的部分として含むＤＮＡ断片またはその機能的相同体。
【請求項４】
配列番号１の配列を有するオリゴヌクレオチドが１〜１０個の塩基により隣接されうる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体。
【請求項５】
リン酸塩骨格修飾を有しうる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体。
【請求項６】
前記リン酸塩骨格修飾がホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体。
【請求項７】
前記ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾が部分的または完全である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体。
【請求項８】
塩基が化学的に修飾されうるかまたは微量塩基に変化されうる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体。
【請求項９】
合成物または単離物でありうる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体を含むベクター。
【請求項１１】
細菌ベクター、プラスミド、ウイルスベクターまたはＤＮＡワクチンでありうる請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体を含有する組成物。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片またはそれらの機能的相同体が、単独投与されるか、または少なくとも１種の医薬的に許容できる担体とともにもしくは該担体内で投与されるか、あるいは少なくとも１種の他の抗−Ｂ細胞腫瘍剤と併せて投与される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗−Ｂ細胞腫瘍剤が化学療法剤、免疫療法剤または放射線療法で使用される作用物質である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記免疫療法剤が抗−ＣＤ２０抗体を含むがこれに限定されない請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記放射線療法が体外照射または放射性標識抗体治療である請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
被験者内のＢ細胞腫瘍を治療するための方法であって、治療有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片またはそれらの機能的相同体あるいは請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物を前記被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項１８】
前記Ｂ細胞腫瘍がＢ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫または骨髄腫である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｂ細胞白血病がＢ細胞慢性リンパ性白血病またはＢ細胞急性リンパ性白血病を含むがこれらに限定されず、かつ前記Ｂ細胞リンパ腫が小リンパ球性リンパ腫を含むがこれに限定されない請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験者がヒトまたは動物である請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片またはそれらの機能的相同体あるいは請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物が、経腸投与、非経口投与または局所投与されるかあるいは吸入投与される請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
Ｂ細胞腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片またはそれらの機能的相同体あるいは請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物を被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
ヒトＢ細胞腫瘍細胞上でのＣＤ４０の発現を促進するための方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片またはそれらの機能的相同体あるいは請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物を被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２４】
Ｂ細胞腫瘍細胞におけるＩＬ−１０の産生を誘導するための方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片またはそれらの機能的相同体あるいは請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物を被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２５】
前記Ｂ細胞腫瘍細胞がＢ細胞白血病細胞、Ｂ細胞リンパ腫細胞または骨髄腫細胞である請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂ細胞白血病細胞がＢ細胞慢性リンパ性白血病細胞またはＢ細胞急性リンパ性白血病細胞を含むがこれらに限定されず、かつＢ細胞リンパ腫細胞が小リンパ球性リンパ腫細胞を含むがこれに限定されない請求項２５に記載の方法。
【請求項１】
配列番号１で示される配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその機能的相同体。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを１コピー〜５コピー含むＤＮＡ断片またはその機能的相同体。
【請求項３】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを機能的部分として含むＤＮＡ断片またはその機能的相同体。
【請求項４】
配列番号１の配列を有するオリゴヌクレオチドが１〜１０個の塩基により隣接されうる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体。
【請求項５】
リン酸塩骨格修飾を有しうる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体。
【請求項６】
前記リン酸塩骨格修飾がホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体。
【請求項７】
前記ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート修飾が部分的または完全である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体。
【請求項８】
塩基が化学的に修飾されうるかまたは微量塩基に変化されうる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体。
【請求項９】
合成物または単離物でありうる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体を含むベクター。
【請求項１１】
細菌ベクター、プラスミド、ウイルスベクターまたはＤＮＡワクチンでありうる請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片およびそれらの機能的相同体を含有する組成物。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片またはそれらの機能的相同体が、単独投与されるか、または少なくとも１種の医薬的に許容できる担体とともにもしくは該担体内で投与されるか、あるいは少なくとも１種の他の抗−Ｂ細胞腫瘍剤と併せて投与される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗−Ｂ細胞腫瘍剤が化学療法剤、免疫療法剤または放射線療法で使用される作用物質である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記免疫療法剤が抗−ＣＤ２０抗体を含むがこれに限定されない請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記放射線療法が体外照射または放射性標識抗体治療である請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
被験者内のＢ細胞腫瘍を治療するための方法であって、治療有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片またはそれらの機能的相同体あるいは請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物を前記被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項１８】
前記Ｂ細胞腫瘍がＢ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫または骨髄腫である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｂ細胞白血病がＢ細胞慢性リンパ性白血病またはＢ細胞急性リンパ性白血病を含むがこれらに限定されず、かつ前記Ｂ細胞リンパ腫が小リンパ球性リンパ腫を含むがこれに限定されない請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験者がヒトまたは動物である請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片またはそれらの機能的相同体あるいは請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物が、経腸投与、非経口投与または局所投与されるかあるいは吸入投与される請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
Ｂ細胞腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片またはそれらの機能的相同体あるいは請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物を被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
ヒトＢ細胞腫瘍細胞上でのＣＤ４０の発現を促進するための方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片またはそれらの機能的相同体あるいは請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物を被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２４】
Ｂ細胞腫瘍細胞におけるＩＬ−１０の産生を誘導するための方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片またはそれらの機能的相同体あるいは請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物を被験者に投与するステップを含む、方法。
【請求項２５】
前記Ｂ細胞腫瘍細胞がＢ細胞白血病細胞、Ｂ細胞リンパ腫細胞または骨髄腫細胞である請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂ細胞白血病細胞がＢ細胞慢性リンパ性白血病細胞またはＢ細胞急性リンパ性白血病細胞を含むがこれらに限定されず、かつＢ細胞リンパ腫細胞が小リンパ球性リンパ腫細胞を含むがこれに限定されない請求項２５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００８−５３９７６８（Ｐ２００８−５３９７６８Ａ）
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１１５３２（Ｐ２００８−５１１５３２）
【出願日】平成１８年２月１３日（２００６．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００６／０００２１６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２２４６４
【国際公開日】平成１８年１１月２３日（２００６．１１．２３）
【出願人】（５０７３７９０７２）チャンチュン ファプ バイオテクノロジー カンパニー リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１３日（２００６．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００６／０００２１６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２２４６４
【国際公開日】平成１８年１１月２３日（２００６．１１．２３）
【出願人】（５０７３７９０７２）チャンチュン ファプ バイオテクノロジー カンパニー リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]