クニッツドメインから誘導されたヒトプラスミンの阻害剤
【課題】新規なプラスミンインヒビターを提供する。
【解決手段】リポプロテイン結合凝集阻害体（ＬＡＣＩ）の第１のクニッツドメイン（Ｋ１）を改変したポリペプチド。
【解決手段】リポプロテイン結合凝集阻害体（ＬＡＣＩ）の第１のクニッツドメイン（Ｋ１）を改変したポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトリポプロテイン結合凝固阻害剤ＬＡＣＩの第一のクニッツドメイン（Ｋ１）の新規の変異体に関するものである。本発明はまたプラスミンを阻害する他の変更されたクニッツドメインおよび他のプラスミン阻害剤に関するものである。
【０００２】
本出願は１９９４年１月１１日に出願された米国特許出願第０８／１７９，６５８号の一部継続出願である第０８／２０８，２６５号（係属中）の一部継続出願である。これらの出願の各々はここに参考文献として組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
繊維素溶解に主に反応できる薬剤はプラスミノーゲンの活性化形熊であるプラスミンである。多くの物質は活性化ハゲマン因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、およびプラズマカリクレイン（ｐＫＡ）を含むプラスミノーゲンを活性化することができる。ｐＫＡはウロキナーゼのチモーゲン形熊の活性化因子および直接型プラスミノーゲン活性化因子の両方である。
【０００４】
プラスミンは正常の循環血液中には検出できないが、プラスミノーゲン、チモーゲンは約３μＭで存在する。追加の未測定量のプラスミノーゲンは繊維素および細胞外のマトリックスおよび細胞表面の他の化合物に結合する。正常血液はプラスミンの生理学的阻害剤、α２−プラスミン阻害剤（α２−ＰＩ）を約２μＭ含有する。プラスミンおよびα２−ＰＩは１：１コンプレックスを形成する。マトリックスまたは細胞結合プラスミンはα２−ＰＩによって阻害に対し比較的近づきがたい。従って、プラスミンの活性化は前繊維素溶解状熊を引き起こすα２−ＰＩの中和力を超えることができる。
【０００５】
一度生成したプラスミンは：ｉ．繊維素クロットを、ときには時期尚早に分解させる；
ｉｉ．もろく容易に溶解するクロットを分解生成物から形成させ、繊維素分解生成物によって血小板の粘着／凝集を阻害させて止血を損なう繊維素（クロットの組み立て物質）を消化し；
ｉｉｉ．血小板と直接相互作用して、高剪断血液流の領域で損傷した内皮に接着しないようにし血小板栓塞形成に必要な凝集を損なう糖蛋白ＩｂおよびＩＩｂ／ＩＩＩａを開裂する（ＡＤＥＬ８６）；
ｉｖ．さらに前分解状態を促進する外部からの凝集経路の酵素を蛋白質分解により不活性化する。
【０００６】
ロビンス（ＲＯＢＢ８７）はプラスミノーゲン−プラスミンシステムを詳細に再検討した。ＲＯＢＢ８７およびここに引用した文献は、参考文献として組み込まれる。
【０００７】
繊維素溶解およびフィブリノーゲン溶解
過剰の出血に導く不適当な繊維素溶解およびフィブリノーゲン溶解は心肺バイパスのような体外循環を必要とする外科手術を複雑にすることが多く、そしてまた血栓崩壊の治療および器官移植、特に肝臓の移植で出会う。出血性素質の高い頻度を特徴とする他の臨床状態は肝硬変、類澱粉症、急性前骨髄細胞白血病、および充実性腫瘍を含む。止血の回復は血漿および／または血漿生成物の注入を必要とし、これは免疫学的反応の危険があり、病原体、例えば肝炎ウイルスおよびＨＩＶにさらされる。
【０００８】
非常に高い血液の損失は大量注入でも溶解を妨害する。生命がおびやかされるとき、出血はε−アミノカプロン酸（ＨＯＯＶ９３参照）（ＥＡＣＡ）、ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ ａｃｉｄ、またはアプロチニン（ＮＥＵＨ８９）のような抗繊維素溶解素を用いて処理される。アプロチニンはまたＴｒａｓｙｌｏｌ（登録商標）およびＢｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＢＰＴＩ）としても知られている。以下、アプロチニンは「ＢＰＴＩ」と呼ぶ。ＥＡＣＡおよびｔｒａｎｅｘａｍｉｃ ａｃｉｄはクリングルを結合することによりプラスミンが繊維素を結合しないようにして、血漿中に遊離プロテアーゼとしてプラスミンを残す。ＢＰＴＩはプラスミンの直接の阻害剤であり、これらの薬剤の中で最も有効である。血栓症の合併症、腎毒および、ＢＰＴＩの場合には、免疫原性に対するポテンシャルによって、これらの薬剤は慎重に使用され、通常「ラストリゾート」（ＰＵＴＴ８９）として保留される。抗繊維素溶解剤の３種すべては標的特異性および親和力を欠き、特徴のない代謝経路を通って組織および器官と相互に作用する。親和力が低いために必要な大量投与、免疫反応に対する特異性および潜在能力を欠くための副作用および器官／組織毒性は、出血を防ぐようにまたは常用の術後の治療として輸血治療を回避または減らすようにこれらの抗繊維素溶解剤を予防的に使用する機会を増やしている。従って、安全な抗繊維素溶解剤が必要とされている。このような薬剤の本質的特性は次の通りである。
ｉ．適切な標的繊維素溶解酵素の中和；
ｉｉ．投薬量を最少にするため標的酵素への結合の高い親和力；
ｉｉｉ．副作用を減らすため、標的に対する高い特異性；
ｉｖ．潜在的免疫原性および器官／ 組織毒性を最少にするためのヒト蛋白質への高度の類似性。
効き目のある抗繊維素溶解による阻害に対する候補標的である繊維素溶解酵素はすべてキモトリピン相同のセリンプロテアーゼである。
【０００９】
過剰出血
過剰出血は不完全な凝固作用、高い繊維素溶解活性、またはこれら２つの条件の組合せの結果起きる。最も出血しやすい体質ではプラスミンの活性を制御しなければならない。血液のロスを減らす際にＢＰＴＩの臨床的に有益な効果はプラスミン（ＫＤ−０．３ｎＭ）またはプラズマカリクレイン（ＫＤ−１００ｎＭ）または両方の酵素の阻害の結果であると考えられる。
【００１０】
ＧＡＲＤ９３は最近使用の血栓溶解素を再検討して、血栓溶解剤（例えばｔＰＡ）は血管を開かないが、過剰の出血は非常に安全な流出口であると言っている。ｔＰＡおよびストレプトキナーゼは短い血漿半減期をもつが、これらを活性化するプラスミンは系内に長期間残り、上記のように、この系はプラスミン阻害剤内で潜在的に不完全である。従って、プラスミノーゲンの過剰な活性化は凝結および有害なまたは致命的な出血へと危険な無能力へ導く。
【００１１】
ＢＰＴＩは有効なプラスミン阻害剤であるが、補助的使用には皮膚試験を必要とするほど十分に抗原性であることが見出された。さらに、出血を抑えるために必要なＢＰＴＩの投与量はかなり高く作用機構は明らかでない。ＢＰＴＩはプラスミンに作用すると言う者もいるが、血漿カリクレインを阻害することにより作用すると言う者もいる。ＦＲＡＥ８９はＢＰＴＩ約８４０ｍｇの投与量が８０人の心臓切開手術の患者の血液のロスを略半分に減らし、平均輸血量を７４％まで減らしたことを報告している。マイルス社は最近手術中の出血を減らすためトラシロールを米国に導入した（トラシロールのマイルス製品パンフレット参照、ここに参考文献として組み込む。）。ＬＯＨＭ９３はプラスミン阻害剤が眼の手術の際の出血をコントロールするために有用であることを示唆している。ＳＨＥＲ８９はＢＰＴＩが結腸手術の出血を制限する際に有効であることを報告している。
【００１２】
ＢＰＴＩのように略有効であるか一層有効であるが、ヒト蛋白質ドメインとは略同一であるプラスミン阻害剤は似た治療学的潜在性を与えるが抗原性には潜在性が小さい。
【００１３】
脈管形成
プラスミンは脈管形成の鍵となる酵素である。ＯＲＥＩ９４はプラスミンの３８ｋＤａ断片（触媒ドメインを欠いている）が転移の強い阻害剤であり、プラスミンが腫瘍（ＦＩＤＬ９４）転移を阻止するのに有用であることを示している。ＥＬＬＩ９２、ＥＬＬＩ９３、ＯＲＥＩ９４およびＦＩＤＬ９４も参照、これらを参考文献としてここに組み込む。
【００１４】
プラスミン
プラスミンはプラスミノーゲンから導かれるセリンプロテアーゼである。プラスミンの触媒ドメイン（またはＣａｔＤｏｍ）はペプチド結合を、特にアルギン残基の後におよびリジン残基の後にはさらに小さい範囲まで切断し、トリプシン、キモトリプシン、カリクレイン、および多くの他のセリンプロテアーゼに非常に相同である。プラスミンの特異性の大部分は繊維素のクリングルス結合から誘導する（ＬＵＣＡ８３、ＶＡＲＡ８３、ＶＡＲＡ８４）。活性化の際には、ＡＲＧ５６１−Ｖａｌ５６２の間の結合は切断され、新しく遊離のアミノ末端が塩橋を形成する。
にもかかわらず、クリングルスは２個のジスルフィドを介してＣａｔＤｏｍに結合している（ＣＯＬＭ８７、ＲＯＢＢ８７）。
【００１５】
ＢＰＴＩは約３００ｐＭのＫＤでプラスミンを阻害することが報告されている（ＳＣＨＮ８６）。ＡＵＥＲ８８はＢＰＴＩ（Ｒ１５）が約１３ｎＭのプラスミンに対してＫｉを有することを報告し、Ｒ１５がプラスミン結合に対するＫ１５よりも実質的にさらに悪いことを示唆している。ＳＣＨＮ８６は残基Ｃ１４とＣ３８がアラニンに転換したＢＰＴＩが約４．５ｎＭのプラスミンに対するＫｉを有することを報告している。ＫＩＤＯ８８はＡＰＰ−Ｉが約７５ｐＭ（７．５×１０−１Ｍ）のプラスミンに対するＫｉを有することを報告しており、今までに報告されたヒトプラスミン中で最も有効な阻害剤である。ＤＥＮＮ９４ａは、しかしながら、ＡＰＰ−ＩがＫｉ＝２２５ｎＭ（２５．５×１０−７Ｍ）のプラスミンを阻害する。我々の第２および第３のライブラリーはＡＰＰ−Ｉが有効なプラスミンバインダーであるという仮定の下に設計された。選択工程は大抵の位置でＡＰＰ−Ｉ残基を選択せずＤＥＮＮ９４ａの報告は何故これが起きたかを説明している。
【００１６】
組み換えＤＮＡ技法を用いると、天然の蛋白質遺伝子の変異体を符号化する変異遺伝子を発現することによって新規の蛋白質を得ることが可能である。突然変異体を拾うための幾つかの戦略が知られている。戦略の一つは、幾つかの残基を一定に保持し、他の残基をランダムに突然変異させ、そしてさらに他の残基を予め定められた方法で突然変異させる。これは「多様化」と呼ばれ、ラドナーらの米国特許５，２２３，４０９に定義されており、ここに参考文献として組み込む。
【００１７】
ＤＥＮＮ９４ａおよびＤＥＮＮ９４ｂは因子ＶＩＩａとの組織因子のコンプレックスに結合するためＡＰＰ−Ｉに基づくクニッツドメインを選択することを報告している。これらは親としてＬＡＣＩ−Ｋ１を使用せず、標的としてプラスミンを使用しなかった。かれらが得た高い親和力の結合体は約２ｎＭの彼等の標的に対するＫＤを有する。我々の第一ラウンドの選択はこの範囲で親和力を有するが、我々の第二ラウンドの選択はこれよりも約２５倍すぐれている。
【００１８】
特定の種からの蛋白質はその種の各々に注入したとき免疫反応をあまり起こさないらしいと思われる。ネズミの抗体はヒトでは高い抗原性がある。ヒトの一定ドメインとネズミの変異性ドメインを有する「キメラの」抗体は抗原性が少ないことが明らかである。いわゆる「ヒト化」抗体はヒトの一定ドメインおよびネズミ抗体からのＣＤＲｓ中に可変ドメインを有し、可変ドメインの枠組みがヒトを起源とする。「ヒト化」抗体は「キメラの」抗体よりも抗原性がはるかに小さい。「ヒト化」抗体では、蛋白質の５０ないし６０個の残基が非ヒト起源である。この発明の蛋白質は、大抵の場合、約６０個のアミノ酸のみからなり、通常は工学技術の蛋白質および親の蛋白質との間には１０以下の相違点がある。ヒトはヒトインシュリンのようなヒト蛋白質にさえも抗体を発現するが、このような抗体は結合が弱くその意図した生物学的機能を注入した蛋白質が示すことを妨げない場合が多い。処理すべき種からの蛋白質を使用すると免疫反応がないという保証はない。けれども、ヒト蛋白質に配列が非常に近い蛋白質を取り出すと、ヒトの強い免疫反応の危険性を非常に減らす。
【００１９】
クニッツドメインは非常に安定であり、酵母または他のホスト器官中に有効に生成させることができる。少なくとも１０個のヒトクニッツドメインが報告されている。ＡＰＰ−Ｉはかって有効なプラスミン阻害剤であると考えられていたが、実際には、プラスミンを阻害するヒトクニッツドメインは存在せずＢＰＴＩも同様である。従って、プラスミンの阻害剤に良く効きヒトクニッツドメインの配列に近いクニッツドメインの配列を提供することが本発明の目的である。
【００２０】
位置特異的の突然変異誘発を使用すると、非ランダムであろうとランダムであろうと、活性が改良された変異体結合蛋白質を得ることは当該分野では知られているが、成功は確実ではない。
【発明の概要】
【００２１】
本発明はヒトプラスミンの阻害に有効なＢＰＴＩ相同のクニッツドメインの変異体に関するものである。特に本発明はヒトに非免疫原性であるらしいヒトＬＡＣＩの１個のドメインの変異体に関するものであり、そしてこれは好ましくは約５ｎＭ以下、さらに好ましくは約３００ｐＭ以下、そして最も好ましくは約１００ｐＭ以下のＫＤでプラスミンを阻害する。本発明はまたこれらの新規の蛋白質の治療学の診断上の使用に関するものである。
【００２２】
プラスミン阻害蛋白質は、不適当な繊維素溶解またはフィブリノーゲン溶解、血栓症に関連する過剰の出血、手術後の出血、および不適当な雄性のものを含めて、プラスミンによって引き起こされまたは悪化される臨床状態の防止と治療のために有用である。プラスミン結合変異体は、阻害するかしないとしても、インヴィトロで、プラスミン活性の領域をイメージするため試料中のプラスミンをアッセイするために、インヴイヴォで、プラスミンを精製するために使用される。
【００２３】
好ましい変異体ＱＳ４およびＮＳ４は、位置１３、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４および３９で変異性を有する約５千万の蛋白質を可能にするライブラリーから選択された。これらの蛋白質はヒト蛋白質と略同一のアミノ酸配列を有するが、約２ｎＭのＫｉでプラスミンを阻害する（即ち、ＢＰＴＩよりも約６倍以下の効能であるが、ＡＰＰ−Ｉよりも１００倍良い）。
【００２４】
特に好ましくは蛋白質、ＳＰＩ１１は、位置１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、および２１で変異性を可能にするライブラリーから選択され、１００ｐＭよりも小さい（即ち、結合においてＢＰＴＩよりも約３倍優れている）プラスミンに対して親和力をもち、そしてウシ蛋白質のＢＰＴＩよりも、ヒト蛋白質のＬＡＣＩの配列に非常に似ている。このライブラリーから選択されプラスミンに対して非常に高い親和力をもつと考えられている他のＬＡＣＩ−Ｋ１変異体はＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、およびＳＰＩ２３を含む。位置１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２１、３１、３２、３４、３５、および３９で変異性を可能にする追加のライブリーがスクリーニングされ、一致した配列（ＳＰＩｃｏｎ１）が見出された。ＱＳ４よりも良いことが示され、従って一層好ましい変異体はＳＰＩ５１とＳＰＩ４７を含む。プラスミンに対して非常に高い親和力をもっており未だ基本的にヒトアミノ酸配列を保持しているらしい配列を同定したところ、配列ＳＰＩ６０、ＳＰＩ５９、ＳＰＩ４２、ＳＰＩ５５、ＳＰＩ５６、ＳＰＩ５２、ＳＰＩ４６、ＳＰＩ４９、ＳＰＩ５３、ＳＰＩ４１、およびＳＰＩ５７を含む。プラスミンの活性位置と高い親和力を与えるアミノ酸配列情報は他のクニッツドメイン、特にヒト起源のクニッツドメインに転移させることができ、幾つかの蛋白質の設計が開示される。
【００２５】
本発明の好ましいプラスミン阻害剤は次の必須条件を１またはそれ以上満足する。
１）プラスミンに対するＫｉは多くて２０ｎＭ、好ましくは約５ｎＭよりも多くなく、さらに好ましくは約３００ｐＭよりも多くない、そして最も好ましくは約１００ｐＭよりも多くない。
２）阻害剤はＢＰＴＩを参照した残基数をもつ表１４に示される要件に合うクニッツドメインからなる、３）クニッツドメイン位置１２−２１および３２−３９にて、アミノ酸タイプのひとつを表１５のその位置に対してまとめた、そして４）この阻害剤は、ＢＰＴＩの配列に対する前記クニッツドメインのアミノ酸配列よりも、群ＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、ＮＳ４、ヒトＬＡＣＩ−Ｋ２、ヒトＬＡＣＩ−Ｋ３、ヒトコラーゲンα３ＫｕＤｏｍ、ヒトＴＦＰＩ−２ドメイン１、ヒトＴＦＰＩ−２ドメイン２、ヒトＴＦＰＩ−２ドメイン３、ヒトＩＴＩ−Ｋ１、ヒトＩＴＩ−Ｋ２、ヒトプロテアーゼネキシン−ＩＩ、ヒトＡＰＰ−Ｉ、ＤＰＩ−１．１．１、ＤＰＩ−１．１．２、ＤＰＩ−１．１．３、ＤＰＩ−１．２．１、ＤＰＩ−１．３．１、ＤＰＩ−２．１、ＤＰＩ−３．１．１、ＤＰＩ−３．２．１、ＤＰＩ−３．３．１、ＤＰＩ−４．１．１、ＤＰＩ−４．２．１、ＤＰＩ−４．２．２、ＤＰＩ−４．２．３、ＤＰＩ−４．２．４、ＤＰＩ−４．２．５、ＤＰＩ−５．１、ＤＰＩ−５．２、ＤＰＩ−６．１、ＤＰＩ−６．２から選択される参照配列に対してアミノ酸配列が似ている。
【００２６】
命名法
ここで、親和力はＫＤ（ＫＤ（Ａ，Ｂ）＝〔Ａ〕〔Ｂ〕／〔Ａ−Ｂ〕）。数字の小さいＫＤは高い親和力を表す。本発明のために、「プラスミン阻害蛋白質」はプラスミンを約２０ｎＭ以下のＫｉで結合し阻害するものである。「阻害」はプラスミンの触媒作用を阻止し、インヴイトロで発色体または螢光発生体物質を用いるアッセイまたは高分子を含むアッセイにおいて測定できることを示す。
【００２７】
アミノ酸残基は３種類の方法で検討される：アミノ酸のフルネーム、標準３文字コード、および標準１文字コード。表は１文字コードのみを使用する。はっきりさせる必要がある場合にはテキストはフルネームと３文字コードを使用する。
【００２８】
本発明の目的のために、「実質的に相同」の配列は、任意特定の領域にわたって、少なくとも５１％、さらに好ましくは８０％、同一である。ここで、同一である配列は「実質的に相同」であると解される。配列は少なくとも２０個のアミノ酸の１領域内で十分に似ている（５１％以上）が比較の領域の外では全体として異なる場合に、配列はなおも「実質的に相同」である。他の配列に関して１の配列の１のアミノ酸の挿入は１のミスマッチとして数える。最も好ましくは、末端とは別の、６個よりも多くない残基が異なる。好ましくは、配列の、特に特定領域の分岐は「保守的改変」の形態にある。
【００２９】
「保守的改変」は次のように定義される。
（ａ）表９に定義されるようなアミノ酸の保守的置換」；および（ｂ）末端、ドメイン境界、ループ、または移動度が比較的高い他の部分でのアミノ酸の単一または複数の挿入または削除。
【００３０】
好ましくは、末端を除いて、約６個よりも少ないアミノ酸を任意の位置で挿入または削除し、この改変部は重要な結合部位を含むことが知られている領域の外側にある。
クニッツドメイン
【００３１】
ここで、「クニッツドメイン」および「ＫｕＤｏｍ」は、（クニッツ大豆トリプシン阻害剤ではなく）ＢＰＴＩの相同体を意味するように交代で使用される。ＫｕＤｏｍは、少なくとも２個、そして好ましくは３個のジスルフィドを含む少なくとも５１個のアミノ酸（そして約６１個までのアミノ酸）を有する蛋白質のドメインである。ここで、全クニッツドメインの残基はＢＰＴＩ（すなわち、残基１−５８）を参照して番号を付けられる。従って第一のシステイン残基は残基５であり、最後のシステインは５５である。アミノ酸配列は、本配列の目的のために、表１４に示される配列に対して３以下のミスマッチで配列される場合にクニッツドメインと考えられる。１個の残基の挿入または削除は１個のミスマッチとして数える。表１４において、「ｘ」は任意のアミノ酸に一致し「Ｘ」はその位置に対してリストされたタイプに一致する。ジスルフィドボンドは５と５５、１４と３８、そして３０と５１の少なくとも２個を結合する。ジスルフィドの数は１によって減らされ得るが、標準システインの数はいずれも対にならないでは残らない。従って、１個のシステインを変える場合、次に償うシステインを適当な場所に加えるかマッチするシステインを非システインによって置き換える（後者が、一般に好ましい）。例えば、ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｆｕｎｅｂｒｉｓ雄補助腺プロテアーゼ阻害剤は位置５にシステインがないが、位置−１（位置１の直前）にシステインがある；恐らく、これはＣＹＳ５５に対してジスルフィドを形成する。Ｃｙｓ１４およびＣｙｓ３８を置換すると、Ｇｌｙ１２、（ＧｌｙまたはＳｅｒ）３７、およびＧｌｙ３６の必要性が落ちる。追加のドメイン（他のクニッツドメインを含めて）を含むゼロから多数の残基までクニッツドメインのいずれかの末端に結合することができる。
【００３２】
好適例の詳細な説明
クニッツドメインのようなプロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼの活性部位に結合して機能し、その結果、ペプチドボンド（「切れやすいボンド」）は：１）
開裂しない、２）非常に遅く開裂する、または３）阻害剤の構造が開裂した部分の放出または分離を妨げるので効果がないように開裂する。クニッツドメインでは、ジスルフィドボンドは露出したペプチドボンドが開裂したとしても共に蛋白質を保持するように働く。切れやすいボンドのアミノ酸部位の残基からの、ボンドから移動してしまった残基は、慣習によりＰ１、Ｐ２、Ｐ３等と呼ばれる。切れやすいボンドに続く残基はＰ１’、Ｐ２’、Ｐ３’等と呼ばれる（ＳＣＨＥ６７、ＳＣＨＥ６８）。一般に各セリンプロテアーゼは、基質または阻害剤の残基Ｐ１、Ｐ２等の側鎖基と主鎖原子を受け取る部位（複数の残基からなる）Ｓ１、Ｓ２等、および基質または阻害剤の残基Ｐ１’、Ｐ２’等の側鎖基と主鎖原子を受け取る部位Ｓ１’、Ｓ２’等を受け入れる。基質に関してプロテアーゼ特異性をそしてプロテアーゼに関して阻害剤特異性を与えることは、Ｓ部位とＰ側鎖基と主鎖原子との間の相互作用である。新しいアミノ末端をもつ断片がまずプロテアーゼを残すため、小さい分子プロテアーゼ阻害剤を設計する多くの作業者は部位Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３等を結合する化合物に集中した。
【００３３】
ＬＡＳＫ８０は蛋白質プロテアーゼ阻害剤を概説する。若干の阻害剤はポリペプチド鎖上に複数の反応性部位を有し、通常これらのドメインは異なる配列、特異性、およびトポロジーさえも有する。Ｐ５およびＰ’５領域のアミノ酸置換は阻害剤の特異性に影響することが知られている。これらは１の酵素クラスから他のクラスに特異性を変化することができるので、かってＰ１残基に焦点が合わされ、これらが非常に近いことに注意が向けられた。ＬＡＳＫ８０は、ＫｕＤｏｍｓの中で、Ｐ１＝ＬｙｓまたはＡｒｇをもつ阻害剤はトリプシンを阻害し、Ｐ１＝Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＬｅｕおよびＭｅｔをもつものはキモトリプシンを阻害し、そしてＰ１＝ＡｌａまたはＳｅｒをもつものはエラスターゼを阻害すると示唆している。ＬＡＳＫ８０は続けて、カザル阻害剤の中で、Ｐ１＝ＬｅｕまたはＭｅｔをもつものはエラスターゼの強い阻害剤であり、そしてボウマン−キルク族ではエラスターゼはＰ１＝Ａｌａで阻害されるが、Ｐ１＝Ｌｅｕでは阻害されないと言っている。このような制限された変化は本当に高い親和力（すなわち、１ないし１０ｎＭよりも良い）の阻害剤を提供しない。
【００３４】
クニッツドメインは上記のように定義される。ＢＰＴＩ（原型的なクニッツドメイン）の３Ｄ構造（高分解にて）が知られている。Ｘ線構造の１つがブルックハーベンプロテインデーターバンクに「６ＰＴＩ」として寄託されている。若干のＢＰＴＩ相同体（ＥＩＧＥ９０、ＨＹＮＥ９０）の３Ｄ構造が知られている。少なくとも７０個のＫｕＤｏｍ配列が知られている。既知のヒト相同体はＬＡＣＩの３個のＫｕＤｏｍ（ＷＵＮＴ８８、ＧＩＲＡ８９、ＮＯＶＯ８９）、インター−α−トリプシン阻害剤の２個のＫｕＤｏｍ、ＡＰＰ−Ｉ（ＫＩＤＯ８８）、コラーゲンからの１個のＫｕＤｏｍ、およびＴＦＰＩ−２（ＳＰＲＥ９４）の３個のＫｕＤｏｍを含む。
【００３５】
ＬＡＣＩ
リポプロテイン結合凝集阻害体（ＬＡＣＩ）は３個のＫｕＤｏｍを含む分子量３９ｋＤａ（表１のアミノ酸配列）のヒト血清ホスホグリココプロテインである。
以下このプロテインをＬＡＣＩと呼び、そのクニッツドメインをＬＡＣＩ−Ｋ１（残基５０ないし１０７）、ＬＡＣＩ−Ｋ２（残基１２１ないし１７８）、およびＬＡＣＩ−Ｋ３（残基２１３ないし２７０）と呼ぶ。ＬＡＣＩのｃＤＮＡ配列はＷＵＮＴ８８に報告されている。ＧＩＲＡ８９は３個のＫｕＤｏｍの各々のＰ１残基を変更した突然変異体の研究を報告している。ＬＡＣＩ−Ｋ１はＦ．ＶＩＩａが組織因子に結合するとき因子ＶＩＩａ（Ｆ．ＶＩＩａ）を阻害し、ＬＡＣＩ−Ｋ２は因子Ｘａを阻害する。ＬＡＣＩ−Ｋ３が何かを阻害するか否かは知られていない。ＬＡＣＩもＬＡＣＩのＫｕＤｏｍのいずれも、強いプラスミン阻害剤ではない。
【００３６】
本発明のＫｕＤｏｍは実質的にＬＡＣＩ−Ｋ１と相同であるが、以下に記述する強いプラスミン阻害活性を与える方法では異なる。本発明の他のＫｕＤｏｍは他の天然に生じるＫｕＤｏｍ、特に他のヒトＫｕＤｏｍと相同である。ヒトに使用するには、本発明の蛋白質は、免疫反応を引き起こす危険を減らすため、ＢＰＴＩよりもヒトＫｕＤｏｍに配列がさらに似ているように設計される。
【００３７】
ＬＡＣＩ−Ｋ１の第１ライブラリーおよびプラスミンに結合するための選択体
出願人は、ヒトプラスミンに対して高い親和力を有する変異体にＬＡＣＩ−Ｋ１の第１ライブラリーをスクリーニングして表２および表３に示される配列を得た。これらの配列は表１６に示されるようにまとめることができ、「好ましい残基」は結合プラスミンとして同定される３２個の変異体の少なくとも１個に現われる。表１７に示されるように、残基１３、１６、１７、１８および１９の好ましいものは強い。３１および３２で認められるタイプの範囲は限定されるが、この選択は３１での酸性基と３２での中性基が好ましいことを示している。残基１７のＡｒｇが好ましく、他の正に荷電したアミノ酸のＬｙｓはライブラリーに無く、Ａｒｇに適当な置換基である。部位３４および３９での多くのアミノ酸タイプは高い親和力のプラスミン結合と矛盾がないが、若干のタイプは結合を妨げる。
【００３８】
蛋白質の幾つかは検出できる分量がなかったので、ここに開示されたライブラリーの明確な単離物のすべては分析しなかった。
表２に示されるように、選択された蛋白質の１つ、ＱＳ４を調製した。ＱＳ４はプラスミンを約２ｎＭのＫｉで阻害する。この阻害のレベルはＢＰＴＩのそれよりも小さいが、ＱＳ４は免疫原性に対して小さいポテンシャルを有するのでヒトに使用するために好ましい分子である。表２および表３に示される他の蛋白質は非常に有効なプラスミンの阻害剤であり、抗原性のおそれが小さい。
【００３９】
残基１０−２１を変える第２ライブラリー
表５に示され、残基１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９および２１にて変異できるＬＡＣＩ−Ｋ１誘導体の第２ライブラリーを調製した。これはプラスミンに結合するためにスクリーニングされ、表６に示される蛋白質を得た。
【００４０】
表６の「共通」はＥ１０ＴＧＰＣＲＡＲＦＥＲＷ２１であり、７個の下線を付けた残基がＬＡＣＩ−Ｋ１とは異なる。酸性アミノ酸のみ（Ｇｌｕ：１７またはＡｓｐ：１５）が部位１０に認められ；ＬｙｓとＡｓｎが認められない。ＧｌｕとＡｓｐは略等しい頻度で現れるので、恐らく結合に等しく貢献しているのだろう。酸性残基は部位１１に認めれなかった。Ｔｈｒは良く現れるＳｅｒ（９／３２）と最も共通していた（１１／３２）；Ｇｌｙは８回現れた。１３で、Ｐｒｏは非常に好ましく（２４／３２）で２番目はＡｌａ（５／３２）であった。１５で、Ａｒｇは非常に好ましく（２５／３２）、しかし数個（７／３２）の単離体はＬｙｓをもつ。特に、ＢＰＴＩ（Ｒ１５）はＢＰＴＩよりも悪いプラスミン阻害剤である。１６で、Ａｌａは好ましく（２２／３２）、しかしＧｌｙはかなり頻繁に（１０／３２）で現れた。１７で、二番目（９／３２）に来るＬｙｓと、Ａｒｇは最も普通（１５／３２）であった。残基１７と１８で、ＡＰＰ−ＩはＭｅｔとＩｌｅを持つ。１８で、ＩｌｅまたはＰｈｅを許した。４個の単離体のみが１８でＩｌｅをもち、これらのどれも１７でＭｅｔを持たない。これはＫＩＤＯ８８を考慮すると驚いたが、ＤＥＮＮ９４ａを考慮すると良く理解された。この単離体の収集は１９で広い分布をもつ（Ｇｌｕ：８、Ｐｒｏ：７、Ａｓｐ：４、Ａｌａ：３、Ｈｉｓ：３、Ｇｌｙ：２、Ｇｌｎ：２、Ａｓｎ：１、Ｓｅｒ：１、およびＡｒｇ：１）が、酸性側の基が塩基性のものよりも非常に好ましい。２１で、分布は（Ｔｒｐ：１６、Ｐｈｅ：１４、Ｌｅｕ：２、Ｃｙｓ：０）であり、ＢＰＴＩは２１でＴｙｒをもつ。
【００４１】
クローニングによる純粋なファージの結合はこれら蛋白質の１つまたは別のものがＢＰＴＩファージの結合と比較されることを示している（表６）。蛋白質ＳＰＩ１１のＫｉを決定し、実質的にＢＰＴＩよりも優れている約８８ｐＭであることを見出した。
【００４２】
１０−２１および３１−２９を変える第３ライブラリー
表７に示されるように、残基３１、３２、３４、３５、および３９で多様に導入されたＤＮＡ源として結合するプラスミンに対して２凹選択された第２ライブラリー（残基１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、および２０で変る）のファージのプールを使用した。
【００４３】
このライブラリーはプラスミンに結合するために３回スクリーニングし、表８に示される単離物が得られた。アミノ酸タイプの分布は表１８に示され、「ｘ」
はアミノ酸タイプが認められないことを意味し、「＊」はＬＡＣＩ−Ｋ１に対して野性タイプであることを示している。
これらの配列はＥ１０ＴＧＰＣＲＡＫＦＤＲＷ２１・・・・Ｅ３１ＡＦＶＹＧＧＣＧＧ４０（表４のＳＰＩｃｏｎ１）の１０−２１および３１−４０の領域が共通していた。１０個の下線を付けたアミノ酸はＬＡＣＩ−Ｋ１とは異なる。８個の変化部位で、第２のタイプが全く共通であった：１０でのＡｓｐ、１１でのＡｌａ、１９でのＧｌｕ、２１でのＰｈｅ、３１でのＴｈｒ、３２でのＰｒｏまたはＳｅｒ、３４でのＬｅｕまたはＩｌｅ、および３９でのＧｌｕ。部位１７で、非常に有効な阻害剤ＳＰＩ１１はＲをもつ。従っ
て、配列Ｄ１０ＴＧＰＣＲＡＲＦＤＲＦ２１・・・・Ｅ３１ＡＦＩＹＧＧＣＥＧ４０（表４のＤＰＩ−１．１．１）は６個の残基のみがＬＡＣＩ−Ｋ１とは異なり、非常に共通している残基で選択された配列と合っており、部位１０、１７、２１、３４、および３９で好ましい置換基をもつ。ＤＰＩ−１．１．１ はプラスミンに対して非常に高い親和力をもちヒトの免疫原性に対して潜在性が殆どないことが期待される。
【００４４】
プラスミン阻害活性に対して蛋白質ＳＰＩ１１、ＢＰＴＩ、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、ＳＰＩ２２、ＳＰＩ５４およびＳＰＩ４３の予備的試験は与えられた順番で置いた。ＳＰＩ１１は約８８ｐＭのＫｉのＢＰＴＩよりも実質的に有効である。ＳＰＩ２３とＳＰＩ５１は活性が似ておりＢＰＴＩよりも僅かに劣る。ＳＰＩ４７はＳＰＩ５１よりも劣るがＱＳ４よりも良い。ＳＰＩ２２はＱＳ４よりも弱い。ＳＰＩ５４とＳＰＩ４３はＱＳ４程は有効でなく、Ｋｉは恐らく＞４ｎＭであろう。
表４に示されるように、配列ＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、およびＮＳ４のいずれか一つに残基５−５５で非常に相同であるＫｕＤｏｍは、プラスミンの有効な阻害剤（ＫＤ＞５ｎＭ）であるらしい、そしてヒトの抗原性に対して低い潜在性を有する。さらに好ましくは、プラスミンに対して高い親和力をもつように、ＫｕＤｏｍは残基１０−２１と３１−３９で同一であり、配列ＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、およびＮＳ４のいずれかと比較して残基５−９、２２−３０、および４０−５５で５またはそれ以下の相違点をもつ配列である。
【００４５】
選択された配列および選択された天然のＫｕＤｏｍの結合データーを使用すると、我々は他の親のヒトＫｕＤｏｍに応用できる高い親和力のプラスミン阻害ＫｕＤｏｍに対してレシピを書くことができる。まず、ＫｕＤｏｍは表１４の必要条件に合わなければならない。表１５に示される置換基はいずれかのＫｕＤｏｍに高い親和力のプラスミン阻害活性を与えるようだ。従って表１４に示されるように、ＫｕＤｏｍである配列を含み、その位置で表１５に示されるアミノ酸タイプを位置１２−２１および３２−３９の各々で含む蛋白質は、ヒトプラスミンの有効な阻害剤である。さらに好ましくは、蛋白質は表１５に示される位置のすべてに対して表１５に示されるアミノ酸タイプをもつ。免疫反応に対する潜在性を減らすために、結合領域の外側に配列を与えるように親の蛋白質として１または他のヒトＫｕＤｏｍを使用する必要がある。
【００４６】
残基５から残基５５までのＳＰＩ１１に実質的に相同であるアミノ酸配列を含み、位置１３−１９、３１、３２、３４、および３９でＳＰＩ１１と同一である蛋白質は、５ｎＭ以下のＫｉでヒトプラスミンを阻害する。ＳＰＩ１１は７個の位置でＬＡＣＩ−Ｋ１と異なる。これらの置換基がプラスミン結合および阻害を助長する際に等しく重要であるかは明らかでない。ＳＰＩ１１の置換された位置の１つがＬＡＣＩ−Ｋ１に見出される残基に変わる（すなわち「逆戻りした」）７個の分子があり、２１では残基の２個が逆戻りし、３５では３個の残基が逆戻りし、３５では４個の残基が逆戻りし、２１では５個の残基が逆戻りし、７では６個の残基が逆戻りする。さらに逆戻りした残基をもつものはプラスミンに対して親和力が小さいが、免疫原性に対する潜在性も小さいことが期待される。当業者は十分な有効性と低い免疫原性の蛋白質をこの１２６のコレクションから選び取ることができる。またＬＡＣＩ−Ｋ１とは異なるアミノ酸によるＳＰＩ１１の代用は、蛋白質を薬剤として使用するには適さなくする程度までプラスミンに対する親和力を減らすことなく、免疫原性を減らすことができる。
【００４７】
設計されたＫｕＤｏｍプラスミン阻害剤
以下、「ＤＰＩ」は、分子のＳＰＩシリーズ、特にＳＰＩ１１からのアミノ酸配列情報を組み込むＫｕＤｏｍｓである「設計されたプラスミン阻害剤、Ｄｅｓｉｇｅｄ Ｐｌａｓｍｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」を意味する。幾つかのＤＰＩの配列およびその親の蛋白質が表４に示されている。
【００４８】
配列ＤＰＩ−１．１．１、ＤＰＩ−１．１．２、ＤＰＩ−１．１．３、ＤＰＩ−１．１．４、ＤＰＩ−１．１．５、およびＤＰＩ−１．１．６（表４）はＬＡＣＩ−Ｋ１とは６、５、５、４、３、および２個のアミノ酸とはそれぞれ異なり、プラスミンに対する親和力が徐々に減り、ヒト配列への類似性が免疫原性の見込みを減らすように増加するシリーズを示す。各ライブラリーからの選択はＭ１８Ｆが鍵となる代用であり、Ｉ１７ＫまたはＩ１７Ｒが非常に重要であることを示している。第２と第３のライブラリーからの選択は、Ａｒｇが１５にて非常に好ましく、１１での酸側鎖基が結合に不利であることを示している。非常に有効な阻害剤ＳＰＩ１１は、ＢＰＴＩのように、Ｒ１７をもつことによってコンセンサスからは異なる。ＤＰＩ−１．１．１は突然変異体Ｄ１１Ｔ、Ｋ１５Ｒ、Ｉ１７Ｒ、Ｍ１８Ｆ、Ｋ１９Ｄ、およびＥ３２Ａを運び、プラスミン阻害剤として非常に有効である。ＤＰＩ−１．１．２はＤ１１Ｔ、Ｋ１５Ｒ、Ｉ１７Ｒ、Ｍ１８Ｆ、およびＫ１９Ｄを運び、非常に有効である。ＬＡＣＩ−Ｋ１に関してＤＰＩ−１．１．３は突然変異体Ｄ１１Ａ、Ｋ１５Ｒ、Ｉ１７Ｒ、Ｍ１８Ｆ、およびＫ１９Ｄを運ぶ。ＤＰＩ−１．１．３はＴ１１の代わりにＡ１１をもつのでＤＰＩ−１．１．２とは異なる；両蛋白質は非常に有効なプラスミン阻害剤である。ＤＰＩ−１．１．４は突然変異体Ｉ１７Ｒ、Ｍ１８Ｆ、Ｋ１９Ｄ、およびＥ３２Ａを運び、完全に有効でなければならない。ＤＰＩ−１．１．４はＳＰＩ１１突然変異体が少ないのであまり有効ではないが、また免疫原性も小さい。ＤＰＩ−１．１．５は突然変異体Ｉ１７Ｒ、Ｍ１８Ｆ、およびＫ１９Ｄを運ぶ。この蛋白質は良い阻害体であり、免疫原性は小さい。ＤＰＩ−１．１．６は突然変異体Ｉ１７ＲおよびＭ１８Ｆのみを運ぶが、プラスミンを阻害する必要がある。
【００４９】
蛋白質ＤＰＩ−１．２．１はヒトＬＡＣＩ−Ｋ２に基づき、表４に示される。突然変異体Ｐ１１Ｔ、Ｉ１３Ｐ、Ｙ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、Ｔ１９Ｄ、Ｒ３２Ｅ、Ｋ３４Ｉ、およびＬ３９Ｅはプラスミンに対して高い親和力を与える。これらの置換体の幾つかは必要ではないかも知れない；特に、Ｐ１１ＴとＴ１９Ｄは必要ではない。プラスミン親和力を改善する他の突然変異体は、Ｅ９Ａ、Ｄ１０Ｅ、Ｇ１６Ａ、Ｙ２１Ｗ、Ｙ２１Ｆ、Ｒ３２Ｔ、Ｋ３４Ｖ、およびＬ３９Ｇを含む。
【００５０】
蛋白質ＤＰＩ−１．３．１（表４）はヒトＬＡＣＩ−Ｋ３に基づく。突然変異体Ｒ１１Ｔ、Ｌ１３Ｐ、Ｎ１７Ｒ、Ｅ１８Ｆ、Ｎ１９Ｄ、Ｒ３１Ｅ、Ｐ３２Ｅ、Ｋ３４Ｉ、およびＳ３６Ｇはプラスミンに対して高い親和力を与える。これらの置換体の幾つかは必要ではないかも知れない；特に、Ｎ１９ＤとＰ３２Ｅは必要ではない。ＫＤを改善する他の変化は、Ｄ１０Ｅ、Ｎ１７Ｋ、Ｆ２１ＷおよびＧ３９Ｅを含む。
【００５１】
蛋白質ＤＰＩ−２．１（表４）はヒトコラーゲンα３ＫｕＤｏｍに基づく。突然変異体Ｅ１１Ｔ、Ｔ１３Ｐ、Ｄ１６Ａ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、Ｌ１９Ｄ、Ａ３１Ｅ、Ｒ３２Ｅ、およびＷ３４Ｉはプラスミンに対して高い親和力を与える。これらの置換体の幾つかは必要ではないかも知れない；特に、Ｌ１９ＤとＡ３１Ｅは必要ではない。プラスミン親和力を改善する他の突然変異体は、Ｋ１９Ａ、Ｄ１０Ｅ、Ｄ１６Ｇ、Ｋ２０Ｒ、Ｒ３２Ｔ、Ｗ３４Ｖ、およびＧ３９Ｅを含む。
【００５２】
ＤＰＩ−３．１．１（表４）はヒトＴＦＰＩ−２ドメイン１から誘導される。交換体Ｙ１１Ｔ、Ｌ１７Ｒ、Ｌ１８Ｆ、Ｌ１９Ｄ、およびＲ３１Ｅはプラスミンに対して高い親和力を与える。突然変異体Ｌ１９Ｄは必要ではないかも知れない。プラスミン結合を促進する他の突然変異体は、Ｙ２１Ｗ、Ｙ２１Ｆ、Ｑ３２Ｅ、Ｌ３４Ｉ、Ｌ３４Ｖ、およびＥ３９Ｇを含む。
【００５３】
ＤＰＩ−３．２．１（表４）はヒトＴＦＰＩ−２ドメイン２から誘導される。親ドメインは残基９（１個の残基）および４２（２個の残基）の後の挿入を含む。突然変異体（Ｖ９ＥＴＧＰＣ１４によって置き換えられたＶ９ＳＶＤＤＱＣ１４）、Ｅ１５Ｒ、Ｓ１７Ｋ、Ｔ１８Ｆ、Ｋ３２Ｔ、Ｆ３４Ｖ、および（Ｅ３９ＧＮＲＮＲ４４）によって置き換えられた（Ｈ３９ＲＮＲＩＥＮＲ４４）はプラスミンに対して高い親和力を与える。
アミノ酸の数を変える必要があるため、ＤＰＩ−３．２．１は他の改変されたひとＫｕＤｏｍよりも免疫原性に対して高い潜在性をもつ。
【００５４】
ＤＰＩ−３．３．１（表４）はヒトＴＦＰＩ−２ドメイン３から誘導される。交換体Ｅ１１Ｔ、Ｌ１３Ｐ、Ｓ１５Ｒ、Ｎ１７Ｒ、Ｖ１８Ｆ、Ｔ３４Ｉ、およびＴ３６Ｇはプラスミンに対して高い親和力を与える。突然変異体Ｅ１１Ｔ、Ｌ１３Ｐ、およびＴ３４Ｉは必要ではないかも知れない。プラスミン結合を促進する他の突然変異体は、Ｄ１０Ｅ、Ｔ１９Ｄ、Ｙ２１Ｗ、およびＧ３９Ｅを含む。
【００５５】
ＤＰＩ−４．１．１（表４）はＳ１０Ｅ、Ｍ１５Ｒ、Ｍ１７Ｋ、Ｔ１８Ｆ、Ｑ３４Ｖ、およびＭ３９Ｇの断定によるヒトＩＴＩ−Ｋ１からである。突然変異体Ｍ３９ＧおよびＱ３４Ｖは必要ではないかも知れない。プラスミン結合を促進する他の突然変異体は、Ａ１１Ｔ、Ｇ１６Ａ、Ｍ１７Ｒ、Ｓ１９Ｄ、Ｙ２１Ｗ、およびＹ２１Ｆを含む。
【００５６】
ＤＰＩ−４．２．１（表４）はヒトＩＴＩ−Ｋ２から突然変異体Ｖ１０Ｄ、Ｒ１１Ｔ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、およびＰ３４Ｖまでである。突然変異体Ｐ３４Ｖは必要ではないかも知れない。プラスミン結合を促進する他の突然変異体は、Ｖ１０Ｅ、Ｑ１９Ｄ、Ｌ２０Ｒ、Ｗ２１Ｆ、Ｐ３４ＩおよびＱ３９Ｅを含む。ＤＰＩ−４．２．２は３個の突然変異体Ｒ１１Ｔ、Ｆ１７Ｒ、およびＩ１８Ｆのみをもつので特に好ましい蛋白質である。ＤＰＩ−４．２．３は４個の突然変異体Ｒ１１Ｔ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、およびＬ２０Ｒのみをもつので特に好ましい蛋白質である。ＤＰＩ−４．２．４は５個の突然変異体Ｒ１１Ｔ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、Ｌ２０Ｒ、およびＰ３４Ｖのみをもつので特に好ましい蛋白質である。ＤＰＩ−４．２．５は突然変異体Ｖ１０Ｅ、Ｒ１１Ｔ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、Ｌ２０Ｒ、Ｖ３１Ｅ、Ｌ３２Ｔ、Ｐ３４Ｖ、およびＱ３９Ｇを運び、非常に有効にプラスミンを阻害する。各蛋白質ＤＰＩ−４．２．１、ＤＰＩ−４．２．２、ＤＰＩ−４．２．３、ＤＰＩ−４．２．４、ＤＰＩ−４．２．５はプラスミンの非常に有効な阻害剤である。
【００５７】
ＤＥＮＮ９４ａの前は、ＡＰＰ−Ｉは非常に有効なプラスミン阻害剤であった。
従って、非常にＡＰＰ−Ｉとは異なる位置１０−２１にてＡＰＰ−Ｉ残基を可能にするように設計されたライブラリーから蛋白質を選択することは驚くことであった。それにもかかわらず、ＡＰＰ−Ｉは有効なプラスミン阻害剤に変換できる。ＤＰＩ−５．１はヒトＡＰＰ−Ｉ（またプロテアーゼネクシン−ＩＩとして知られている）から突然変異体Ｍ１７ＲおよびＩ１８Ｆによって誘導され、ＡＰＰ−Ｉ自体よりもはるかに優れたプラスミン阻害剤である。ＤＰＩ−５．２はさらに突然変異体Ｓ１９Ｄ、Ａ３１Ｅ、およびＦ３４Ｉを運び、プラスミンに対してさらに高い親和力を促進することができる。
ＤＰＩ−６．１は５個の置換体Ｋ１１Ｔ、Ｑ１５Ｒ、Ｔ１６Ａ、Ｍ１７Ｒ、およびＭ１８ＦによってＨＫＩ Ｂ９ ＫｕＤｏｍ（ＮＯＲＲ９３）から誘導される。ＤＰＩ−６．１は有効なプラスミン阻害体である。ＤＰＩ−６．２はプラスミン結合を促進する追加の突然変異体Ｔ１９ＤおよびＡ３４Ｖを運び、プラスミン結合を促進する。
【００５８】
ＢＰＴＩは既知の天然に生じたＫｕＤｏｍプラスミン阻害剤であるが、改良することができる。ＤＰＩ−７．１はプラスミンに対する親和力を増加する突然変異体Ｉ１８ＦによってＢＰＴＩから誘導される。ＤＰＩ−７．２はプラスミン結合を増加させる突然変異体Ｋ１５Ｒを更に運ぶ。ＤＰＩ−７．３は追加の突然変異体Ｒ３９Ｇを運ぶ。ＤＰＩ−７．４は突然変異体Ｙ１０Ｄ、Ｋ１５Ｒ、Ｉ１８Ｆ、Ｉ１９Ｄ、Ｑ３１Ｅ、およびＲ３９Ｇを運び、非常に高い親和力をプラスミンに対して有する。
【００５９】
クニッツドメインの改変
ＫｕＤｏｍは全く小さい；循環からの除去が速すぎるような、製薬学的問題の原因であるならば、２以上のドメインを結合することができる。好ましいリンカーは１個以上のアミノ酸の配列である。好ましいリンカーはヒト蛋白質の繰り返しのドメインの間に見出されるものであり、特にリンカーはヒトＢＰＴＩ相同体に見出され、その１つは２個のドメイン（ＢＡＬＤ８５、ＡＬＢＲ８３ｂ）を有し他のものは３個（ＷＵＮＴ８８）を有する。ペプチドリンカーは全体の蛋白質が組み換えＤＮＡ技法によって発現される利点を有する。また免疫原共役体を形成するために通常使用されるもののような、非ペプチジルリンカーを使用することもできる。ＢＰＴＩ様ＫｕＤｏｍの血清滞在を増加させる代わりの手段はポリエチレングリコールにこれを連結することである、いわゆるＰＥＧ化（ＤＡＶＩ７９）。
【００６０】
ＳＰＩ１１および他のＫｕＤｏｍプラスミン阻害剤の特異性を改良する方法：
ＫｕＤｏｍＳＰＩ１１の表面の大部分をプラスミンの表面に相補的にしたので、Ｒ１５はプラスミンに特異的結合するために必須ではない。凝固および繊維素溶解の経路で酵素の多くはＡｒｇまたはＬｙｓの後で選択的に切断する。Ｐ１位置に塩基性残基を持たないと特異性が一層大きくなる。変異体ＳＰＩ１１−Ｒ１５Ａ（表１１に示される）は、Ｐ１でＡｌａを有し、良好なプラスミン阻害体であり、ＳＰＩ１１よりも他のプロテアーゼに関連してプラスミンに対して高い特異性を有することができる。プラスミンに対するＳＰＩ１１−Ｒ１５Ａの親和力はプラスミンに対するＳＰＩ１１の親和力よりも小さいが、他のＡｒｇ／Ｌｙｓ好適酵素に対する親和力のロスはより大きく、多くの応用で、特異性は親和力よりも一層重要である。良い親和力と非常に高い特異性をもつ他の突然変異体はＳＰＩ１１−Ｒ１５ＧおよびＳＰＩ１１−Ｒ１５Ｎ−Ｅ３２Ａを含む。このアプローチは他の高い親和力のプラスミン阻害剤に応用することができる。
【００６１】
ＳＰＩ１１の親和力の増加
表１２に示されるようなＳＰＩ１１の変異および結合物の選択はＳＰＩ１１よりも高いプラスミンに対する親和力を有するクニッツドメインを生成することである。この第４のライブラリーは１４−３８のジスルフィドを多様化することができる。表に示されるＤＮＡの２個の部分は合成され、ＰＣＲ反応でプライマーと共に用いられＮｓｉＩからＢｓｔＥＩＩまで走行するＤＮＡを生成する。プライマーは表に示される合成小片の、第一に対しては長さ２１および第二に対しては長さ１７の５’末端と同一である。変異性が非常に高いので、１０８と１０９個（多ければ多いほど良い）の形質転換細胞を得るように努力した。
【００６２】
生成の方法
本発明の蛋白質は次の方法を含む従来の技術のいずれによっても生成することができる。
ａ）成分、例えばアミノ酸の一連のカップリングによる非生物学の合成ｂ）適当なホスト細胞での組み換えＤＮＡ技法による生成、およびｃ）例えば、ＬＡＣＩ−Ｋ１から望まない配列を除去して合成置換配列をカップリングする半合成法。
【００６３】
ここに開示される蛋白質は、属Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｅｒｗｉｎｉａからのバクテリア、属Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ，ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような酵母菌、またはＣＯＳ−１のような培養した哺乳類動物の細胞のような適当なホスト中で組み換えにより好ましく生成される。さらに好ましいホストは種Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ の微生物である。ホスト細胞中で機能的な任意のプロモーターを使用して遺伝子発現をコントロールすることができる。
【００６４】
好ましくは蛋白質は分泌され、最も好ましくは、条件付の媒体から得られる。
分泌は、蛋白質が正確に折りたたまれて数個の菌で条件付の媒体中に生成されるので、好ましいルートである。分泌は要求されない。
【００６５】
グリコグループを含む特別の理由がない限り、グリコグループの抗原性に対してポテンシャルを減らすようにＮ−結合グリコシル化部位を欠くように設計された蛋白質が好ましく、その結果等量の蛋白質を、１）Ｅ．ｃｏｌｉ， ２） Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ， ３） Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ， ４） Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，および５）哺乳動物の細胞を含む広範囲の器官の中に発現させることができる。
【００６６】
組み換え型生成物を分解するプロテアーゼを生成するホスト細胞の問題を減らすには幾つかの意味がある；特にＢＡＮＥ９０およびＢＡＮＥ９１参照。ＶＡＮＤ９２はＥ．ｃｏｌｉ 中のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ 信号ペプチダーゼの過剰発現が異種の融合蛋白質の発現を増大させることを報告している。ＡＮＢＡ８８はＰＭＳＦ（セリンプロテアーゼ阻害剤）を培養基に添加すると融合蛋白質の収率が改善されることを報告している。
【００６７】
ここに開示されているこれらの蛋白質および他の蛋白質の生成に影響する他の因子は次のものを含む：１）コドンの使用（ホストに対するコドンを最適化することが好ましい）、２）シグナル配列、３）意図したプロセシング部位でのアミノ酸配列、プロセシング酵素の存在と局在性、処理生成物を部分的に変えまたは分解する種々の酵素の欠失、突然変異、または阻害、および分泌（許容分泌ホストが好ましい）においてホストをさらに複製できるようにする突然変異体。
【００６８】
組み換えＤＮＡ技術の一般的原則の参照作業はワストンらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，ＩおよびＩＩ巻、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ（１９８７）； ダーネルらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８６）； Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８５）；オールドら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ： Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ（１９８１）；サムブルックらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）； およびアウスベルらのＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，（１９８７，１９９２）を含む。これらの文献および引用された文献はここに参考文献として組み込まれる。
【００６９】
プラスミン結合および阻害のためのアッセイ
適当な方法を使用して本発明の化合物を試験することができる。スカッチャード（Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９４９）５１：６６０−６６９）は蛋白質結合に応用できる結合を測定し分析する古典的方法を記載している。この方法は比較的純粋な蛋白質、および結合した蛋白質を結合していない蛋白質から区別する能力を要する。
【００７０】
ＫＤを測定する第二の適当な方法は、酵素に対して阻害活性を測定することである。測定すべきＫＤが１ｎＭないし１μＭの範囲にあると、この方法は発色体または螢光基質および比較的純粋な阻害剤を数十マイクログラムないしミリグラム必要とする。ＫＤが５ｎＭないし５０ｐＭの範囲の本発明の蛋白質に対し、ナノグラムないしマイクログラムの阻害剤で十分である。この方法を使用するとき、阻害剤と酵素基質との間の競合は真のＫｉよりも高い測定したＫｉを与えることができる。ここに報告された測定は、補正が非常に小さくどの補正もＫｉを小さくするのであまり正確ではない。ここに、我々はＫＤの直接の測定値として測定されたＫｉを使用する。
【００７１】
第二の物質の蛋白質の親和力を決定する第三の方法は、Ｍ１３のような遺伝子パッケージに蛋白質を表示し、固定化した「第二の物質」に接着する蛋白質の能力を測定することである。この方法は遺伝子パッケージを増幅することができるので非常に鋭敏である。ｐＨステップグラジエントを使用して結合定数に対する少なくとも半定量的な値を得る。プロテアーゼに対する既知の親和力の阻害剤を使用して他のファージ表示阻害剤に判断されるものに対して標準のプロフィルを確立する。他の適当な蛋白質結合の測定方法はいずれも使用することができる。
【００７２】
好ましくは、本発明の蛋白質はプラスミンに対するＫＤが多くて約５ｎＭ、さらに好ましくは多くて約３００ｐＭ、そして最も好ましくは１００ｐＭ以下である。好ましくは、結合はＫｉがＫＤと同じであるように阻害する。プラスミンに対するＱＳ４のＫｉは約２ｎＭである。プラスミンに対するＳＰＩ１１のＫｉは約８８ｐＭである。
【００７３】
製薬学的方法および調製
本発明の好ましい対象は哺乳動物である。本発明は特にヒトの治療に有用であるが、また獣医学的応用にも適している。
【００７４】
ここで、「保護」は「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「抑止」、および「治療」を含む。「予防」は病気の誘発前に薬剤を投与することを含む。「抑止」は病気が臨床上現れる前に薬剤を投与することを含む。「治療」は病気が現れた後に薬剤を投与することを含む。
【００７５】
ヒトおよび獣医の薬では、誘導事象が未知であるか潜伏しているか、または患者が誘導事象の発生した後まで確かめられないので、「予防」と「抑止」との間を区別することはできない。我々は「予防」と「抑止」を含むように「治療」とは区別して「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」の語を使用する。ここで、「保護」は「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」を含む。保護は無制限に使用される必要はない。
【００７６】
本発明の蛋白質は、どんな方法でも、系統的にまたは局所的に投与することができ、対象を病気または不都合な状態から保護する。例えば、この種の組成物を非経口投与、巨丸剤注入または逐次灌流によって投与することができる。代わりに、または同時に、経口投与することができる。適当な摂生は有効量の蛋白質の投与からなり、時間、日、月、または年の期間にわたる１回の投与または複数回の投与で行われる。
【００７７】
本発明の蛋白質の適当な投与量は受容者の年齢、性別、健康、および体重、同時治療の種類、あるいは、治療回数、および望まれる効果に依存する。しかしながら、最も好ましい投与量は、当業者によって理解され決定できるので、この分野で知られている方法で投与量を調整して過度の実験をすることなく、各対象に合わせて調整することができる。
【００７８】
蛋白質を含む薬剤の臨床前および臨床時のテスト方法は、例えば、ベルコウらのＴｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９８７； グッドマンら著のＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，（１９９０）； Ａｖｅｒｙ’ｓ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＤＩＳ Ｐｒｅｓｓ，ＬＴＤ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ．（１９８７），エバジのＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９８５）、これらの文献および引用された文献は、ここに参考文献として組み込まれる。
【００７９】
ここに開示した蛋白質の他に、製薬組成物は製薬学的に受入られる担体、賦形薬、または補助薬を含む。例えば前記各文献を参照。
【００８０】
インヴィトロ診断方法および試薬
本発明の蛋白質はインヴィトロで、プラスミンを含む任意適当な試料に応用して存在するプラスミンを測定することができる。このようにするため、アッセイは存在するプラスミンの分量に依存する検出できるシグナルを与えるシグナル生成システム（ＳＰＳ）を含まなければならない。シグナルは視覚であるいは機械で検出される。可能なシグナルは着色、螢光、または発光生成物の生成、アッセイ成分または製品による発光の吸収または放射の特性の変更、および成分または製品の沈澱または凝集を含む。
【００８１】
診断試薬と最も密接に結合するＳＰＳの成分は「標識」と呼ばれる。標識は、例えば、放射性同位元素、螢光団、酵素、補酵素、酵素基質、電子密集化合物、または凝集性粒子である。放射性同位元素は、例えば、γカウンターまたはシンチレーションカウンターを使用して、またはオートラジオグラフィーによって検出できる。特に有用な同位元素は３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、および、好ましくは１２５Ｉである。また化合物を螢光化合物で標識を付けることもできる。螢光による標識を付けた化合物は適当な長さの光に露光させ、その存在を検出することができる。最も普通に使用される螢光標識化合物はフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミンである。代わりに、螢光放出金属、例えば１２５Ｅｕまたは他のランタナイドを、ジエチレントリアミン五酢酸またはエチレンジアミン四酢酸のような金属キレート基を用いて結合蛋白質に結合させる。また蛋白質は化学ルミネセンス化合物、例えばルミノール、イソルミノール、ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびオキザレートエステルにカップリングすることによって検出できるように標識を付けることができる。同様に、生物発光化合物、例えばルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンを使用して結合蛋白質に標識を付けることができる。生物発光蛋白質の存在は発光の存在を検出して決定される。酵素標識、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが好ましい。
【００８２】
２つの基本タイプのアッセイがある：異種および同種。異種アッセイでは、分析物への類縁分子の結合は標識に影響を与えない；従って、分析物の分量を決定するため、結合した標識を遊離標識から分離しなければならない。同種アッセイでは、相互作用は標識の活性に影響を与え、分析物は分離しないで測定することができる。
【００８３】
一般に、プラスミン結合蛋白質（ＰＢＰ）は、抗プラスミン抗体を使用する同じ方法で診断に利用することができる。従って、アッセイ形式によって、または、競合阻害によって、プラスミンを結合する他の物質によって、プラスミンをアッセイするために使用することができる。
【００８４】
通常試料は生物学的流体、例えば血液、尿、リンパ液、精液、乳、または脳脊髄液、またはそれらの誘導体、または生物学的組織、例えば組織切片または均等質である。試料は何でもよい。試料が生物学的流体または組織であるならば、ヒトまたは他の哺乳動物、脊椎動物または動物、または植物から取り出すことができる。好ましい試料は血液、またはその断片または誘導体である。
【００８５】
１つの好適例では、プラスミン結合蛋白質（ＰＢＰ）を固定化し、試料中のプラスミンを既知量の標識を付けたまたは特異的に標識を付けたプラスミン類似体を競合させる。「プラスミン類似体」はプラスミンそれ自体を含むＰＢＰに結合するためのプラスミンと競合できる分子である。前に標識を付けてもよく、または標識をプラスミンからプラスミン類似体を区別する部分に特異的に結合することによって後で標識を付けてもよい。相を分離して、一つの相の中の標識を付けたプラスミン類似体を定量する。
「サンドウイッチアッセイ」では、不溶化プラスミン結合剤（ＰＢＡ）、および標識ＰＢＡの両方を用いる。プラスミン分析物は不溶化ＰＢＡによって捕捉され、標識ＰＢＡによって標識を付けられ、第三コンプレックスを形成する。試薬を任意の順番で試料に添加することができる。ＰＢＡｓは同じかまたは異なり、１つだけのＰＢＡは本発明によるＰＢＰでなければならない（他のＰＢＡは例えば、抗体であってもよい）。第三コンプレックスの標識を付けたＰＢＡの量は試料中のプラスミンの量に正比例する。
【００８６】
上述の２つの好適例は両方とも異種アッセイである。同種アッセイはＰＢＰをプラスミンに結合して標識が影響を受けることだけが必要である。プラスミン阻害剤を診断試薬として使用するならばプラスミン分析物はそれ自体標識として働くことができる。
【００８７】
標識は直接または間接に（例えば、標識を付けた抗ＰＢＰ抗体を介して）、共有結合的に（例えば、ＳＰＤＰを用いて）または非共有結合的に、プラスミン結合蛋白質に結合させることができ、診断試薬を生成する。同様にプラスミン結合蛋白質は固相支持体に結合し固相（「捕獲」）診断試薬を生成する。適当な支持体はガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、およびマグネタイトを含む。本発明の目的のために、担体はある程度まで溶解でき、または溶解しない。支持体材料は結合した分子がプラスミンを結合できる限りどんな構造でもよい。
【００８８】
インヴィヴォ診断用途
プラスミンに緊密に結合するクニッツドメインはインヴィヴォ映像のために使用できる。病巣の診断映像はモノクローナル抗体のための最大の商業的好機の一つと考えられたが、この好機は達成されなかった。かなり努力したにもかかわらず、２種のモノクローナル抗体を基礎とした映像剤のみが認められた。モノクローナル抗体を用いて得られるこの失望させられる結果は大部分次の理由による： ｉ）不十分な親和力および／または特異性；
ｉｉ）標的部位への弱い浸透；
ｉｉｉ）非標的部位からの遅いクリアランス；
ｉｖ）免疫原性（大部分はネズミ）；および ｖ）高い生成コストおよび低い安定性。
【００８９】
これらの制限が診断映像分野においてペプチドを基礎とした映像剤の開発の開始へと最も導かれた。弱い浸透と遅いクリアランスの問題を潜在的に解決すると同時に、ペプチドを基礎とした映像剤は十分な親和力、特異性およびインヴィヴォ安定性を有し最も応用に有効である。
【００９０】
製作された蛋白質は映像剤としての要求に非常に適している。特に、既知のインヴィヴォクリアランス率と機構を有する小さく安定なヒト起源蛋白質ドメインを工学技術によって得られる異例の親和力と特異性は、初期の、さらに信頼性のある結果、小さい毒性／副作用、さらに低い生産と貯蔵のコスト、および標識調製のさらに大きい便利さに加わる。実際に、工学処理された蛋白質映像剤を用いて実時間の映像のゴールを達成できる必要がある。プラスミン結合蛋白質、例えば、ＳＰＩ１１は内出血の部位を制限するために用いられる。
【００９１】
放射性同位元素の標識を付けた結合蛋白質は、ヒトまたは動物の対象に投与できる。次の動的および／または静的映像に適当な放射性同位元素検出装置を用いることができるように、一般に注射、例えば、静脈注射または動脈注射または十分な量の投与手段によって投与は行われる。投与量は診断に有効な映像を与えることができる最少量であり、既知の放射性同位元素映像剤をガイドとして用いるこの分野で普通の手段で決定することができる。
【００９２】
一般に、映像は対象の全体で、または健康状態または検討される病気に関連した身体または器官の一部で行われる。放射性同位元素結合蛋白質は蓄積した。関連する標的器官で時間で所定点にて蓄積された放射性同位元素の標識を付けた結合蛋白質の量を次に定量することができる。
【００９３】
特に適当な放射性同位元素検出装置はシンチレーションカメラ、例えばγカメラである。カメラでの検出装置は放射性崩壊を検知し、記録し、（そして任意にディジタル化する）。デジタル化した情報は任意の適当な方法で分析することができ、その多くはこの分野で知られている。例えば、時間−放射性分析は、時間と共に標的器官によって、放射性同位元素の標識を付けた結合蛋白質のクリアランスによる取り込みを示すことができる。
【００９４】
適当な放射性同位元素を選ぶ際に種々の因子を考慮に入れる。アイソトープを選ぶには、映像の際に解像度を良い品質にする、ヒトや動物の診断用に安全である、そして好ましくは、身体に受ける放射線の分量を減らすように半減期が短いことである。使用する放射性同位元素は好ましくは製薬学的に不活性であり、投与量には実質的に生理学的効果をもたせない。結合蛋白質は異なる沃素アイソトープ、例えば、１２３Ｉ、１２５Ｉまたは１３１Ｉ（例えば米国特許４，６０９，７２５参照）を用いて放射性同位元素標識を付けることができる。標識の分量は適当にモニターされる必要がある。
【００９５】
ヒト対象に応用する際には、身体の全暴露量を減らし、標識分子の検出可能性を最適にするため、標識用の１２５Ｉとは別のラジオアイソトープを使用することが望ましい。ヒトに使用するため臨床的に入手できることを考慮すると、好ましい放射性同位元素の標識は次のものを含む：９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１２３Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅまたは2１Ａｔ。放射性同位元素の標識を付けた蛋白質は種々の方法で調製することができる。これらはクロラミン−Ｔまたはラクトパーオキシダーゼ法による放射性同位元素ハロゲン化、および続く高圧液体クロマトグラフィーによる精製を含む、例えば、ＧｕｔｋｏｗｓｋａらのＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ： （１９８７）１６（１）：１８３参照。
放射性同位元素標識の他の方法は、例えばＩＯＤＯＢＥＡＤＳ（登録商標）を使用することができる。
【００９６】
放射性同位元素標識蛋白質は、活性剤を哺乳動物の薬剤の作用部位に到達するようにする任意の手段によって投与することができる。蛋白質は経口投与するとき消化されてしまうので、非経口投与、すなわち、静脈内の皮下注射、筋肉内注射が通常吸収を最適にするために使用される。
【００９７】
他の用途
本発明のプラスミン結合蛋白質はまたプラスミンを流体、例えば血液から精製するために使用することができる。このために、ＰＢＰは好ましくは不溶性支持体に固定化される。このような支持体は固相診断試薬を調製する際に有用なものとして既に記述されたものを含む。
【００９８】
蛋白質は、蛋白質の分離または精製の際の表示のために分子量マーカーとして使用することができる。蛋白質は分子量マーカーとして使うように変性されることが必要である。蛋白質の第二の一般的効用は加水分解した蛋白質を栄養源として使用することである。蛋白質はまた溶液の粘度を上げるために使用することもできる。
【００９９】
本発明の蛋白質は上記の目的のいずれにも、またさらにこの明細書の初めに議論したような治療および診断の目的にも使用することができる。
【０１００】
ペプチドの調製
化学的ポリペプチド合成はこの分野で急速に展開している領域であり、固相ポリペプチド合成の方法は次の文献に良く記述されているので、これらを参考文献として組み込む。（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ Ａｍｅｒ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４（１９６３）； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１−３４７（１９８６）； Ｗａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２５：Ｓ２１−Ｓ３７（１９８６）； Ｆｉｅｌｄｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ ３５：１６１（１９９０）； ＭｉｌｌｉＧｅｎ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏｓ．２ ａｎｄ ２ａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，１９８７）Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，同上，ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，同上。タンとカイザーは（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７７，１６：１５３１−４１）１８年前にＢＰＴＩと相同体を合成した。
【０１０１】
この分野で知られているように、この種の方法は反応性機能基、例えば遊離アミノ、カルボキシルおよびチオ基をブロッキングしまたは保護することを含む。
ポリペプチドボンドを形成後、保護基を除去する。従って、各アミノ酸残基の添加は保護および脱保護のための幾つかの反応工程を必要とする。最近の方法は固相合成を利用し、Ｃ−末端アミノ酸を、濾過できる不溶性樹脂粒子に共有結合させる。反応物は、自動化機械を用いて樹脂粒子を適当な溶媒で洗浄して除く。「ｔＢｏｃ」法および「Ｆｍｏｃ」法を含めて種々の方法がこの分野では良く知られている。特に、Ａｔｈｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒｎｓ １：５３８−５４６（１９８１）および Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ ２０：４５１−４５４（１９８２）参照。
【０１０２】
実施例
実施例１：ＬＡＣＩ（Ｋ１）ライブラリーの構築
ＮｓｉＩ−およびＭｌｕＩ−適合化末端をもつ合成オリゴヌクレオチド二本鎖ＤＮＡ分子を、上記２個の酵素で予め開裂した親ベクター（ＬＡＣＩ−Ｋ１：：ＩＩＩ）にクローンした。得られた連結物質をＸＬＩＭＲ（Ｆ−）Ｅ．ｃｏｌｉ株に電気穿孔法によりトランスフェクションし、アンピリシン（Ａｐ）プレートで培養し、ファージ発生ＡｐＲコロニーを得た。段階１に対する斑図はＰ１領域に集中し、残基１３、１６、１７、１８および１９に影響を及ぼした。６．６×１０５の異なるＤＮＡ配列（３．１ ×１０５の異なる蛋白質配列）を見込んだ。得られたライブラリーは１．４ ×１０６の独立したｃｆｕ’ｓからなり、ライブラリー全体のほぼ二倍の表示である。この培養から生成したファージストックは約３．９ｍｌ中に１．４×１０１３のｐｆｕ’ｓの全滴定量を与え、平均で、全体で１×１０７そしてファージストックｍｌ当たり２．６×１０６倍の各独立したクローンが表示された。
【０１０３】
残基３１、３２、３４および３９（段階ＩＩ）の斑を与えるため、ＭｌｕＩ−およびＢｓｔＥＩＩ−適合化末端を用いた合成オリゴヌクレオチド二本鎖ＤＮＡ分子を、次の１つから誘導された予め開裂したＲｆＤＮＡにクローニングをした。
ｉ）親構築物、 ｉｉ）段階Ｉライブラリー、または ｉｉｉ）所定の標的に結合する第一の段階から選択された表示ファージ。
【０１０４】
段階ＩＩのための斑図は、残基３１、３２、３４および３９にて変更による４０９６の異なるＤＮＡ配列（１６００の異なる蛋白質配列）を見込んだ。最後の段階ＩＩの斑は、段階Ｉにおいて所定の標的を用いる３ラウンドの結合と溶離に続いて残っている斑の水準に依存する。
【０１０５】
両段階について合わせた可能な斑は２．７×１０８の異なるＤＮＡ配列または５．０×１０７の異なる蛋白質配列に等しい。予め選択した表示ファージは、段階ＩＩの斑に対してＲｆＤＮＡの起源として使用され、最後の斑の水準は恐らく１０５ないし１０６の範囲内であろう。
【０１０６】
実施例２：プラスミンに結合するためのＬＡＣＩ−Ｋ１ライブラリーのスクリーニング プラスミンに結合するＬＡＣＩ−Ｋ１変異体を選択するための全体図は、緩衝液中（１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ含有ＰＢＳ）のプラスミン−ビーズ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；カタログ番号５２７８０２）でファージ表示ライブラリーをインキュベーションし、結合せず不十分に保持された表示ファージ変異体を ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含有するＰＢＳで洗浄することを含む。さらに強く結合した表示ファージは低いｐＨの溶離緩衝液、一般には１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ含有のクエン酸緩衝液（ｐＨ２．０）で溶離し、直ちにトリス緩衝液でｐＨ７．５ まで中和する。この工程は選択の１ラウンドを構成する。
【０１０７】
中和した溶離表示ファージは次のいずれにも使用できる：
ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉのＦ＋株を植付けて新しい表示ファージストックを生成し、選択の次のラウンドに使用する（いわゆる従来のスクリーニング）、または
ｉｉ）プロテアーゼビーズを用いて選択の他の直接のラウンドに直接使用する（いわゆるクイックスクリーニング）。
【０１０８】
一般に、いずれかの方法の３ラウンド、または２つの組合せが、最終の選択された表示ファージを生じるように行われ、そこから代表する数に配列分析をして、表示ファージのプールとしてまたは各クローンとして結合性を分析する。
【０１０９】
ＬＡＣＩ−Ｋ１ライブラリーについて、選択の２段階が行われ、各々は結合と溶離の３ラウンドからなる。クローンの副次集団を生じるプラスミンに対して結合と溶離の３ラウンドを通過した段階Ｉライブラリー（斑入り残基１３、１６、１７、１８、および１９）を、段階Ｉ選択は使用した。この選択した副次集団から誘導されたＲｆＤＮＡを使用して段階ＩＩライブラリー（斑入り残基３１、３２、３４および３９の追加）を生成した。約５．６×１０７の独立した形質転換細胞が得られた。最終選択を起こす同じ標的プロテアーゼを用いて結合と溶離のさらに３ラウンドを、段階ＩＩライブラリーは受けた。
【０１１０】
プラスミン−アガロースビーズに対する選択の２段階に続いて、最終選択表示ファージの代表的な数（１６）に配列分析をした。表２はアパーケースで斑入りの位置で選択されたアミノ酸を用いて選択されたＬＡＣＩ−Ｋ１ドメインの配列分析を示す。残基Ｐ１３、Ａ１６、Ｒ１７、Ｆ１８、およびＥ１９の絶対的選択に注意。Ｅに対して３１およびＱに対して３２での選択が非常に強い。３４では一致がない；観察されたアミノ酸は｛Ｔ３、Ｙ２、Ｈ２、Ｄ、Ｒ、Ａ、Ｖ２、Ｉ３、およびＬ｝である。
Ｃβ（Ｔ、Ｉ、およびＶ）で分枝する側鎖基をもつアミノ酸は多様に表され好ましい。位置３９では、強い一致はない（Ｇ６、Ｄ３、Ｑ２、Ａ２、Ｒ、Ｆ、Ｅ）が、Ｇ、Ｄ、Ｑ、およびＡは好ましく見える（この順で）。
【０１１１】
プラスミンに対するＬＡＣＩ−Ｋ１ライブラリーの単独のスクリーニングは１６の配列分析をした選択された表示ファージから非常に似ている一致を与えた。これらの配列を表３に示す（上の場合の選択された残基）。これらの配列はＥが位置１９で優勢である表２のものからはずれており。Ｔ、Ｖ、またはＳの３４（Ｔ５、Ｖ３、Ｓ３、Ｉ２、Ｌ、Ａ、Ｆ）にて一致している。２組を合わせると、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｈ、Ｙ、およびＬに対し（優先の順で）優先し、Ｆ、Ｄ、およびＲが許される。
【０１１２】
発現、精製および動力学的分析
３単離物ＱＳ４、ＡＲＦＫ＃１、およびＡＲＦＫ＃２を酵母発現ベクターに再クローンした。酵母発現ベクターはｐＭＦアルファ８（ＫＵＲＪ８２およびＭＩＹＡ８５）から誘導した。ＬＡＣＩ変異体遺伝子はｍａｔα１遺伝子の部分に融合し、ｍａｔα１プロモーター−シグナルペプチドおよびＬＡＣＩ変異体にシークェンス融合されたリーダーからなるハイブリッド遺伝子を生成した。クローニング部位を表２４に示す。特に、正しく処理したＬＡＣＩ−Ｋ１変異体蛋白質は表２および３に詳述するように、Ｎ−末端ｍｅｔに残基ｇｌｕ−ａｌａ−ａｌａ−ｇｌｕを付加する（表２および表３の残基１）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ の発現は媒質１リットル当たり５００μｇ収率のプロテアーゼ阻害剤を与える。酵母発現ＬＡＣＩ（クニッツドメイン１）、ＢＰＴＩおよびＬＡＣＩ変異体：ＱＳ４、ＡＲＦＫ＃１およびＡＲＦＫ＃２はトリプシンアガロースビーズを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
【０１１３】
最も好ましい生成ホストはアルコールオキシダーゼ装置を用いるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ である。他のものは酵母 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ に多くの蛋白質を生成した。例えば、ヴェドヴィックら（ＶＥＤ９１）およびワグナーら（ＷＡＧＮ９２）は
【数１】
で培養基に分泌蛋白質としてメタノールによって誘導したアルコールオキシダーゼプロモーターからアプロチニンを生成した。グレッグら（ＧＲＥＧ９３）
はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ で多くの蛋白質の生成を検討した。ＧＲＥＧ９３の表１はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ に生成した蛋白質および収率を示す。
【０１１４】
動力学的データー
阻害剤の量を変えて ２．５×１０−８Ｍでプラスミンによるスクシニル−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−（Ｆ３Ａｃ）ＡＭＣ（メチルクマリン）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）の加水分解の阻害は、最少二乗法により密着結合基質に対する標準型に合っていた。２個のＡＲＦＫ変異体の予備動力学的分析はＱＳ４変異体のそれに非常に良く似た阻害活性を示した。これらの測定は親和力が血液中の蛋白質の作用に関連しているように生理的な量の塩（１５０ｍＭ）で行った。
表２３はＱＳ４がヒトプラスミンの非常に特異的阻害剤であることを示す。ＬＡＣＩ−Ｋ１誘導体ＱＳ４を表示するファージは他のプロテアーゼ標的に結合するよりも少なくとも５０倍プラスミンビーズに結合する。
【０１１５】
プラスミンのための新しいライブラリー：
Ｍ１３ ｇＩＩＩｐに表示され表５に示される相違点を含むＬＡＣＩ−Ｋ１ドメインの新しいライブラリーはプラスミン結合のために作成され分離された。表６は選択され一致した配列を示す。我々はクローンによる純ファージのＢＰＴＩ表示ファージへの結合と比較して、選択された蛋白質の結合を特徴づけた。単離体１１、１５、０８、２３、および２２はＢＰＴＩファージよりも優れている。我々は可溶性ＳＰＩ１１（選択されたプラスミン阻害剤♯１１）を生成し、その阻害活性を試験し、ＢＰＴＩよりも少なくとも二倍良い８８ｐＭのＫｉを得た。このようにして、選択したＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、およびＳＰＩ２２はＢＰＴＩよりもはるかに優れており、ＳＰＩ２３がＢＰＴＩとほぼ同じ有効性がある。リストにあげた蛋白質はすべてＢＰＴＩよりもヒト蛋白質アミノ酸配列に非常に近く、免疫原性に対してポテンシャルが小さかった。
【０１１６】
米国および外国の特許または特許出願、および未特許の開示物を含めて、ここに全文献の全体を参考文献として組み込む。
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトリポプロテイン結合凝固阻害剤ＬＡＣＩの第一のクニッツドメイン（Ｋ１）の新規の変異体に関するものである。本発明はまたプラスミンを阻害する他の変更されたクニッツドメインおよび他のプラスミン阻害剤に関するものである。
【０００２】
本出願は１９９４年１月１１日に出願された米国特許出願第０８／１７９，６５８号の一部継続出願である第０８／２０８，２６５号（係属中）の一部継続出願である。これらの出願の各々はここに参考文献として組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
繊維素溶解に主に反応できる薬剤はプラスミノーゲンの活性化形熊であるプラスミンである。多くの物質は活性化ハゲマン因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、およびプラズマカリクレイン（ｐＫＡ）を含むプラスミノーゲンを活性化することができる。ｐＫＡはウロキナーゼのチモーゲン形熊の活性化因子および直接型プラスミノーゲン活性化因子の両方である。
【０００４】
プラスミンは正常の循環血液中には検出できないが、プラスミノーゲン、チモーゲンは約３μＭで存在する。追加の未測定量のプラスミノーゲンは繊維素および細胞外のマトリックスおよび細胞表面の他の化合物に結合する。正常血液はプラスミンの生理学的阻害剤、α２−プラスミン阻害剤（α２−ＰＩ）を約２μＭ含有する。プラスミンおよびα２−ＰＩは１：１コンプレックスを形成する。マトリックスまたは細胞結合プラスミンはα２−ＰＩによって阻害に対し比較的近づきがたい。従って、プラスミンの活性化は前繊維素溶解状熊を引き起こすα２−ＰＩの中和力を超えることができる。
【０００５】
一度生成したプラスミンは：ｉ．繊維素クロットを、ときには時期尚早に分解させる；
ｉｉ．もろく容易に溶解するクロットを分解生成物から形成させ、繊維素分解生成物によって血小板の粘着／凝集を阻害させて止血を損なう繊維素（クロットの組み立て物質）を消化し；
ｉｉｉ．血小板と直接相互作用して、高剪断血液流の領域で損傷した内皮に接着しないようにし血小板栓塞形成に必要な凝集を損なう糖蛋白ＩｂおよびＩＩｂ／ＩＩＩａを開裂する（ＡＤＥＬ８６）；
ｉｖ．さらに前分解状態を促進する外部からの凝集経路の酵素を蛋白質分解により不活性化する。
【０００６】
ロビンス（ＲＯＢＢ８７）はプラスミノーゲン−プラスミンシステムを詳細に再検討した。ＲＯＢＢ８７およびここに引用した文献は、参考文献として組み込まれる。
【０００７】
繊維素溶解およびフィブリノーゲン溶解
過剰の出血に導く不適当な繊維素溶解およびフィブリノーゲン溶解は心肺バイパスのような体外循環を必要とする外科手術を複雑にすることが多く、そしてまた血栓崩壊の治療および器官移植、特に肝臓の移植で出会う。出血性素質の高い頻度を特徴とする他の臨床状態は肝硬変、類澱粉症、急性前骨髄細胞白血病、および充実性腫瘍を含む。止血の回復は血漿および／または血漿生成物の注入を必要とし、これは免疫学的反応の危険があり、病原体、例えば肝炎ウイルスおよびＨＩＶにさらされる。
【０００８】
非常に高い血液の損失は大量注入でも溶解を妨害する。生命がおびやかされるとき、出血はε−アミノカプロン酸（ＨＯＯＶ９３参照）（ＥＡＣＡ）、ｔｒａｎｅｘａｍｉｃ ａｃｉｄ、またはアプロチニン（ＮＥＵＨ８９）のような抗繊維素溶解素を用いて処理される。アプロチニンはまたＴｒａｓｙｌｏｌ（登録商標）およびＢｏｖｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＢＰＴＩ）としても知られている。以下、アプロチニンは「ＢＰＴＩ」と呼ぶ。ＥＡＣＡおよびｔｒａｎｅｘａｍｉｃ ａｃｉｄはクリングルを結合することによりプラスミンが繊維素を結合しないようにして、血漿中に遊離プロテアーゼとしてプラスミンを残す。ＢＰＴＩはプラスミンの直接の阻害剤であり、これらの薬剤の中で最も有効である。血栓症の合併症、腎毒および、ＢＰＴＩの場合には、免疫原性に対するポテンシャルによって、これらの薬剤は慎重に使用され、通常「ラストリゾート」（ＰＵＴＴ８９）として保留される。抗繊維素溶解剤の３種すべては標的特異性および親和力を欠き、特徴のない代謝経路を通って組織および器官と相互に作用する。親和力が低いために必要な大量投与、免疫反応に対する特異性および潜在能力を欠くための副作用および器官／組織毒性は、出血を防ぐようにまたは常用の術後の治療として輸血治療を回避または減らすようにこれらの抗繊維素溶解剤を予防的に使用する機会を増やしている。従って、安全な抗繊維素溶解剤が必要とされている。このような薬剤の本質的特性は次の通りである。
ｉ．適切な標的繊維素溶解酵素の中和；
ｉｉ．投薬量を最少にするため標的酵素への結合の高い親和力；
ｉｉｉ．副作用を減らすため、標的に対する高い特異性；
ｉｖ．潜在的免疫原性および器官／ 組織毒性を最少にするためのヒト蛋白質への高度の類似性。
効き目のある抗繊維素溶解による阻害に対する候補標的である繊維素溶解酵素はすべてキモトリピン相同のセリンプロテアーゼである。
【０００９】
過剰出血
過剰出血は不完全な凝固作用、高い繊維素溶解活性、またはこれら２つの条件の組合せの結果起きる。最も出血しやすい体質ではプラスミンの活性を制御しなければならない。血液のロスを減らす際にＢＰＴＩの臨床的に有益な効果はプラスミン（ＫＤ−０．３ｎＭ）またはプラズマカリクレイン（ＫＤ−１００ｎＭ）または両方の酵素の阻害の結果であると考えられる。
【００１０】
ＧＡＲＤ９３は最近使用の血栓溶解素を再検討して、血栓溶解剤（例えばｔＰＡ）は血管を開かないが、過剰の出血は非常に安全な流出口であると言っている。ｔＰＡおよびストレプトキナーゼは短い血漿半減期をもつが、これらを活性化するプラスミンは系内に長期間残り、上記のように、この系はプラスミン阻害剤内で潜在的に不完全である。従って、プラスミノーゲンの過剰な活性化は凝結および有害なまたは致命的な出血へと危険な無能力へ導く。
【００１１】
ＢＰＴＩは有効なプラスミン阻害剤であるが、補助的使用には皮膚試験を必要とするほど十分に抗原性であることが見出された。さらに、出血を抑えるために必要なＢＰＴＩの投与量はかなり高く作用機構は明らかでない。ＢＰＴＩはプラスミンに作用すると言う者もいるが、血漿カリクレインを阻害することにより作用すると言う者もいる。ＦＲＡＥ８９はＢＰＴＩ約８４０ｍｇの投与量が８０人の心臓切開手術の患者の血液のロスを略半分に減らし、平均輸血量を７４％まで減らしたことを報告している。マイルス社は最近手術中の出血を減らすためトラシロールを米国に導入した（トラシロールのマイルス製品パンフレット参照、ここに参考文献として組み込む。）。ＬＯＨＭ９３はプラスミン阻害剤が眼の手術の際の出血をコントロールするために有用であることを示唆している。ＳＨＥＲ８９はＢＰＴＩが結腸手術の出血を制限する際に有効であることを報告している。
【００１２】
ＢＰＴＩのように略有効であるか一層有効であるが、ヒト蛋白質ドメインとは略同一であるプラスミン阻害剤は似た治療学的潜在性を与えるが抗原性には潜在性が小さい。
【００１３】
脈管形成
プラスミンは脈管形成の鍵となる酵素である。ＯＲＥＩ９４はプラスミンの３８ｋＤａ断片（触媒ドメインを欠いている）が転移の強い阻害剤であり、プラスミンが腫瘍（ＦＩＤＬ９４）転移を阻止するのに有用であることを示している。ＥＬＬＩ９２、ＥＬＬＩ９３、ＯＲＥＩ９４およびＦＩＤＬ９４も参照、これらを参考文献としてここに組み込む。
【００１４】
プラスミン
プラスミンはプラスミノーゲンから導かれるセリンプロテアーゼである。プラスミンの触媒ドメイン（またはＣａｔＤｏｍ）はペプチド結合を、特にアルギン残基の後におよびリジン残基の後にはさらに小さい範囲まで切断し、トリプシン、キモトリプシン、カリクレイン、および多くの他のセリンプロテアーゼに非常に相同である。プラスミンの特異性の大部分は繊維素のクリングルス結合から誘導する（ＬＵＣＡ８３、ＶＡＲＡ８３、ＶＡＲＡ８４）。活性化の際には、ＡＲＧ５６１−Ｖａｌ５６２の間の結合は切断され、新しく遊離のアミノ末端が塩橋を形成する。
にもかかわらず、クリングルスは２個のジスルフィドを介してＣａｔＤｏｍに結合している（ＣＯＬＭ８７、ＲＯＢＢ８７）。
【００１５】
ＢＰＴＩは約３００ｐＭのＫＤでプラスミンを阻害することが報告されている（ＳＣＨＮ８６）。ＡＵＥＲ８８はＢＰＴＩ（Ｒ１５）が約１３ｎＭのプラスミンに対してＫｉを有することを報告し、Ｒ１５がプラスミン結合に対するＫ１５よりも実質的にさらに悪いことを示唆している。ＳＣＨＮ８６は残基Ｃ１４とＣ３８がアラニンに転換したＢＰＴＩが約４．５ｎＭのプラスミンに対するＫｉを有することを報告している。ＫＩＤＯ８８はＡＰＰ−Ｉが約７５ｐＭ（７．５×１０−１Ｍ）のプラスミンに対するＫｉを有することを報告しており、今までに報告されたヒトプラスミン中で最も有効な阻害剤である。ＤＥＮＮ９４ａは、しかしながら、ＡＰＰ−ＩがＫｉ＝２２５ｎＭ（２５．５×１０−７Ｍ）のプラスミンを阻害する。我々の第２および第３のライブラリーはＡＰＰ−Ｉが有効なプラスミンバインダーであるという仮定の下に設計された。選択工程は大抵の位置でＡＰＰ−Ｉ残基を選択せずＤＥＮＮ９４ａの報告は何故これが起きたかを説明している。
【００１６】
組み換えＤＮＡ技法を用いると、天然の蛋白質遺伝子の変異体を符号化する変異遺伝子を発現することによって新規の蛋白質を得ることが可能である。突然変異体を拾うための幾つかの戦略が知られている。戦略の一つは、幾つかの残基を一定に保持し、他の残基をランダムに突然変異させ、そしてさらに他の残基を予め定められた方法で突然変異させる。これは「多様化」と呼ばれ、ラドナーらの米国特許５，２２３，４０９に定義されており、ここに参考文献として組み込む。
【００１７】
ＤＥＮＮ９４ａおよびＤＥＮＮ９４ｂは因子ＶＩＩａとの組織因子のコンプレックスに結合するためＡＰＰ−Ｉに基づくクニッツドメインを選択することを報告している。これらは親としてＬＡＣＩ−Ｋ１を使用せず、標的としてプラスミンを使用しなかった。かれらが得た高い親和力の結合体は約２ｎＭの彼等の標的に対するＫＤを有する。我々の第一ラウンドの選択はこの範囲で親和力を有するが、我々の第二ラウンドの選択はこれよりも約２５倍すぐれている。
【００１８】
特定の種からの蛋白質はその種の各々に注入したとき免疫反応をあまり起こさないらしいと思われる。ネズミの抗体はヒトでは高い抗原性がある。ヒトの一定ドメインとネズミの変異性ドメインを有する「キメラの」抗体は抗原性が少ないことが明らかである。いわゆる「ヒト化」抗体はヒトの一定ドメインおよびネズミ抗体からのＣＤＲｓ中に可変ドメインを有し、可変ドメインの枠組みがヒトを起源とする。「ヒト化」抗体は「キメラの」抗体よりも抗原性がはるかに小さい。「ヒト化」抗体では、蛋白質の５０ないし６０個の残基が非ヒト起源である。この発明の蛋白質は、大抵の場合、約６０個のアミノ酸のみからなり、通常は工学技術の蛋白質および親の蛋白質との間には１０以下の相違点がある。ヒトはヒトインシュリンのようなヒト蛋白質にさえも抗体を発現するが、このような抗体は結合が弱くその意図した生物学的機能を注入した蛋白質が示すことを妨げない場合が多い。処理すべき種からの蛋白質を使用すると免疫反応がないという保証はない。けれども、ヒト蛋白質に配列が非常に近い蛋白質を取り出すと、ヒトの強い免疫反応の危険性を非常に減らす。
【００１９】
クニッツドメインは非常に安定であり、酵母または他のホスト器官中に有効に生成させることができる。少なくとも１０個のヒトクニッツドメインが報告されている。ＡＰＰ−Ｉはかって有効なプラスミン阻害剤であると考えられていたが、実際には、プラスミンを阻害するヒトクニッツドメインは存在せずＢＰＴＩも同様である。従って、プラスミンの阻害剤に良く効きヒトクニッツドメインの配列に近いクニッツドメインの配列を提供することが本発明の目的である。
【００２０】
位置特異的の突然変異誘発を使用すると、非ランダムであろうとランダムであろうと、活性が改良された変異体結合蛋白質を得ることは当該分野では知られているが、成功は確実ではない。
【発明の概要】
【００２１】
本発明はヒトプラスミンの阻害に有効なＢＰＴＩ相同のクニッツドメインの変異体に関するものである。特に本発明はヒトに非免疫原性であるらしいヒトＬＡＣＩの１個のドメインの変異体に関するものであり、そしてこれは好ましくは約５ｎＭ以下、さらに好ましくは約３００ｐＭ以下、そして最も好ましくは約１００ｐＭ以下のＫＤでプラスミンを阻害する。本発明はまたこれらの新規の蛋白質の治療学の診断上の使用に関するものである。
【００２２】
プラスミン阻害蛋白質は、不適当な繊維素溶解またはフィブリノーゲン溶解、血栓症に関連する過剰の出血、手術後の出血、および不適当な雄性のものを含めて、プラスミンによって引き起こされまたは悪化される臨床状態の防止と治療のために有用である。プラスミン結合変異体は、阻害するかしないとしても、インヴィトロで、プラスミン活性の領域をイメージするため試料中のプラスミンをアッセイするために、インヴイヴォで、プラスミンを精製するために使用される。
【００２３】
好ましい変異体ＱＳ４およびＮＳ４は、位置１３、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４および３９で変異性を有する約５千万の蛋白質を可能にするライブラリーから選択された。これらの蛋白質はヒト蛋白質と略同一のアミノ酸配列を有するが、約２ｎＭのＫｉでプラスミンを阻害する（即ち、ＢＰＴＩよりも約６倍以下の効能であるが、ＡＰＰ−Ｉよりも１００倍良い）。
【００２４】
特に好ましくは蛋白質、ＳＰＩ１１は、位置１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、および２１で変異性を可能にするライブラリーから選択され、１００ｐＭよりも小さい（即ち、結合においてＢＰＴＩよりも約３倍優れている）プラスミンに対して親和力をもち、そしてウシ蛋白質のＢＰＴＩよりも、ヒト蛋白質のＬＡＣＩの配列に非常に似ている。このライブラリーから選択されプラスミンに対して非常に高い親和力をもつと考えられている他のＬＡＣＩ−Ｋ１変異体はＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、およびＳＰＩ２３を含む。位置１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２１、３１、３２、３４、３５、および３９で変異性を可能にする追加のライブリーがスクリーニングされ、一致した配列（ＳＰＩｃｏｎ１）が見出された。ＱＳ４よりも良いことが示され、従って一層好ましい変異体はＳＰＩ５１とＳＰＩ４７を含む。プラスミンに対して非常に高い親和力をもっており未だ基本的にヒトアミノ酸配列を保持しているらしい配列を同定したところ、配列ＳＰＩ６０、ＳＰＩ５９、ＳＰＩ４２、ＳＰＩ５５、ＳＰＩ５６、ＳＰＩ５２、ＳＰＩ４６、ＳＰＩ４９、ＳＰＩ５３、ＳＰＩ４１、およびＳＰＩ５７を含む。プラスミンの活性位置と高い親和力を与えるアミノ酸配列情報は他のクニッツドメイン、特にヒト起源のクニッツドメインに転移させることができ、幾つかの蛋白質の設計が開示される。
【００２５】
本発明の好ましいプラスミン阻害剤は次の必須条件を１またはそれ以上満足する。
１）プラスミンに対するＫｉは多くて２０ｎＭ、好ましくは約５ｎＭよりも多くなく、さらに好ましくは約３００ｐＭよりも多くない、そして最も好ましくは約１００ｐＭよりも多くない。
２）阻害剤はＢＰＴＩを参照した残基数をもつ表１４に示される要件に合うクニッツドメインからなる、３）クニッツドメイン位置１２−２１および３２−３９にて、アミノ酸タイプのひとつを表１５のその位置に対してまとめた、そして４）この阻害剤は、ＢＰＴＩの配列に対する前記クニッツドメインのアミノ酸配列よりも、群ＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、ＮＳ４、ヒトＬＡＣＩ−Ｋ２、ヒトＬＡＣＩ−Ｋ３、ヒトコラーゲンα３ＫｕＤｏｍ、ヒトＴＦＰＩ−２ドメイン１、ヒトＴＦＰＩ−２ドメイン２、ヒトＴＦＰＩ−２ドメイン３、ヒトＩＴＩ−Ｋ１、ヒトＩＴＩ−Ｋ２、ヒトプロテアーゼネキシン−ＩＩ、ヒトＡＰＰ−Ｉ、ＤＰＩ−１．１．１、ＤＰＩ−１．１．２、ＤＰＩ−１．１．３、ＤＰＩ−１．２．１、ＤＰＩ−１．３．１、ＤＰＩ−２．１、ＤＰＩ−３．１．１、ＤＰＩ−３．２．１、ＤＰＩ−３．３．１、ＤＰＩ−４．１．１、ＤＰＩ−４．２．１、ＤＰＩ−４．２．２、ＤＰＩ−４．２．３、ＤＰＩ−４．２．４、ＤＰＩ−４．２．５、ＤＰＩ−５．１、ＤＰＩ−５．２、ＤＰＩ−６．１、ＤＰＩ−６．２から選択される参照配列に対してアミノ酸配列が似ている。
【００２６】
命名法
ここで、親和力はＫＤ（ＫＤ（Ａ，Ｂ）＝〔Ａ〕〔Ｂ〕／〔Ａ−Ｂ〕）。数字の小さいＫＤは高い親和力を表す。本発明のために、「プラスミン阻害蛋白質」はプラスミンを約２０ｎＭ以下のＫｉで結合し阻害するものである。「阻害」はプラスミンの触媒作用を阻止し、インヴイトロで発色体または螢光発生体物質を用いるアッセイまたは高分子を含むアッセイにおいて測定できることを示す。
【００２７】
アミノ酸残基は３種類の方法で検討される：アミノ酸のフルネーム、標準３文字コード、および標準１文字コード。表は１文字コードのみを使用する。はっきりさせる必要がある場合にはテキストはフルネームと３文字コードを使用する。
【００２８】
本発明の目的のために、「実質的に相同」の配列は、任意特定の領域にわたって、少なくとも５１％、さらに好ましくは８０％、同一である。ここで、同一である配列は「実質的に相同」であると解される。配列は少なくとも２０個のアミノ酸の１領域内で十分に似ている（５１％以上）が比較の領域の外では全体として異なる場合に、配列はなおも「実質的に相同」である。他の配列に関して１の配列の１のアミノ酸の挿入は１のミスマッチとして数える。最も好ましくは、末端とは別の、６個よりも多くない残基が異なる。好ましくは、配列の、特に特定領域の分岐は「保守的改変」の形態にある。
【００２９】
「保守的改変」は次のように定義される。
（ａ）表９に定義されるようなアミノ酸の保守的置換」；および（ｂ）末端、ドメイン境界、ループ、または移動度が比較的高い他の部分でのアミノ酸の単一または複数の挿入または削除。
【００３０】
好ましくは、末端を除いて、約６個よりも少ないアミノ酸を任意の位置で挿入または削除し、この改変部は重要な結合部位を含むことが知られている領域の外側にある。
クニッツドメイン
【００３１】
ここで、「クニッツドメイン」および「ＫｕＤｏｍ」は、（クニッツ大豆トリプシン阻害剤ではなく）ＢＰＴＩの相同体を意味するように交代で使用される。ＫｕＤｏｍは、少なくとも２個、そして好ましくは３個のジスルフィドを含む少なくとも５１個のアミノ酸（そして約６１個までのアミノ酸）を有する蛋白質のドメインである。ここで、全クニッツドメインの残基はＢＰＴＩ（すなわち、残基１−５８）を参照して番号を付けられる。従って第一のシステイン残基は残基５であり、最後のシステインは５５である。アミノ酸配列は、本配列の目的のために、表１４に示される配列に対して３以下のミスマッチで配列される場合にクニッツドメインと考えられる。１個の残基の挿入または削除は１個のミスマッチとして数える。表１４において、「ｘ」は任意のアミノ酸に一致し「Ｘ」はその位置に対してリストされたタイプに一致する。ジスルフィドボンドは５と５５、１４と３８、そして３０と５１の少なくとも２個を結合する。ジスルフィドの数は１によって減らされ得るが、標準システインの数はいずれも対にならないでは残らない。従って、１個のシステインを変える場合、次に償うシステインを適当な場所に加えるかマッチするシステインを非システインによって置き換える（後者が、一般に好ましい）。例えば、ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｆｕｎｅｂｒｉｓ雄補助腺プロテアーゼ阻害剤は位置５にシステインがないが、位置−１（位置１の直前）にシステインがある；恐らく、これはＣＹＳ５５に対してジスルフィドを形成する。Ｃｙｓ１４およびＣｙｓ３８を置換すると、Ｇｌｙ１２、（ＧｌｙまたはＳｅｒ）３７、およびＧｌｙ３６の必要性が落ちる。追加のドメイン（他のクニッツドメインを含めて）を含むゼロから多数の残基までクニッツドメインのいずれかの末端に結合することができる。
【００３２】
好適例の詳細な説明
クニッツドメインのようなプロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼの活性部位に結合して機能し、その結果、ペプチドボンド（「切れやすいボンド」）は：１）
開裂しない、２）非常に遅く開裂する、または３）阻害剤の構造が開裂した部分の放出または分離を妨げるので効果がないように開裂する。クニッツドメインでは、ジスルフィドボンドは露出したペプチドボンドが開裂したとしても共に蛋白質を保持するように働く。切れやすいボンドのアミノ酸部位の残基からの、ボンドから移動してしまった残基は、慣習によりＰ１、Ｐ２、Ｐ３等と呼ばれる。切れやすいボンドに続く残基はＰ１’、Ｐ２’、Ｐ３’等と呼ばれる（ＳＣＨＥ６７、ＳＣＨＥ６８）。一般に各セリンプロテアーゼは、基質または阻害剤の残基Ｐ１、Ｐ２等の側鎖基と主鎖原子を受け取る部位（複数の残基からなる）Ｓ１、Ｓ２等、および基質または阻害剤の残基Ｐ１’、Ｐ２’等の側鎖基と主鎖原子を受け取る部位Ｓ１’、Ｓ２’等を受け入れる。基質に関してプロテアーゼ特異性をそしてプロテアーゼに関して阻害剤特異性を与えることは、Ｓ部位とＰ側鎖基と主鎖原子との間の相互作用である。新しいアミノ末端をもつ断片がまずプロテアーゼを残すため、小さい分子プロテアーゼ阻害剤を設計する多くの作業者は部位Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３等を結合する化合物に集中した。
【００３３】
ＬＡＳＫ８０は蛋白質プロテアーゼ阻害剤を概説する。若干の阻害剤はポリペプチド鎖上に複数の反応性部位を有し、通常これらのドメインは異なる配列、特異性、およびトポロジーさえも有する。Ｐ５およびＰ’５領域のアミノ酸置換は阻害剤の特異性に影響することが知られている。これらは１の酵素クラスから他のクラスに特異性を変化することができるので、かってＰ１残基に焦点が合わされ、これらが非常に近いことに注意が向けられた。ＬＡＳＫ８０は、ＫｕＤｏｍｓの中で、Ｐ１＝ＬｙｓまたはＡｒｇをもつ阻害剤はトリプシンを阻害し、Ｐ１＝Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＬｅｕおよびＭｅｔをもつものはキモトリプシンを阻害し、そしてＰ１＝ＡｌａまたはＳｅｒをもつものはエラスターゼを阻害すると示唆している。ＬＡＳＫ８０は続けて、カザル阻害剤の中で、Ｐ１＝ＬｅｕまたはＭｅｔをもつものはエラスターゼの強い阻害剤であり、そしてボウマン−キルク族ではエラスターゼはＰ１＝Ａｌａで阻害されるが、Ｐ１＝Ｌｅｕでは阻害されないと言っている。このような制限された変化は本当に高い親和力（すなわち、１ないし１０ｎＭよりも良い）の阻害剤を提供しない。
【００３４】
クニッツドメインは上記のように定義される。ＢＰＴＩ（原型的なクニッツドメイン）の３Ｄ構造（高分解にて）が知られている。Ｘ線構造の１つがブルックハーベンプロテインデーターバンクに「６ＰＴＩ」として寄託されている。若干のＢＰＴＩ相同体（ＥＩＧＥ９０、ＨＹＮＥ９０）の３Ｄ構造が知られている。少なくとも７０個のＫｕＤｏｍ配列が知られている。既知のヒト相同体はＬＡＣＩの３個のＫｕＤｏｍ（ＷＵＮＴ８８、ＧＩＲＡ８９、ＮＯＶＯ８９）、インター−α−トリプシン阻害剤の２個のＫｕＤｏｍ、ＡＰＰ−Ｉ（ＫＩＤＯ８８）、コラーゲンからの１個のＫｕＤｏｍ、およびＴＦＰＩ−２（ＳＰＲＥ９４）の３個のＫｕＤｏｍを含む。
【００３５】
ＬＡＣＩ
リポプロテイン結合凝集阻害体（ＬＡＣＩ）は３個のＫｕＤｏｍを含む分子量３９ｋＤａ（表１のアミノ酸配列）のヒト血清ホスホグリココプロテインである。
以下このプロテインをＬＡＣＩと呼び、そのクニッツドメインをＬＡＣＩ−Ｋ１（残基５０ないし１０７）、ＬＡＣＩ−Ｋ２（残基１２１ないし１７８）、およびＬＡＣＩ−Ｋ３（残基２１３ないし２７０）と呼ぶ。ＬＡＣＩのｃＤＮＡ配列はＷＵＮＴ８８に報告されている。ＧＩＲＡ８９は３個のＫｕＤｏｍの各々のＰ１残基を変更した突然変異体の研究を報告している。ＬＡＣＩ−Ｋ１はＦ．ＶＩＩａが組織因子に結合するとき因子ＶＩＩａ（Ｆ．ＶＩＩａ）を阻害し、ＬＡＣＩ−Ｋ２は因子Ｘａを阻害する。ＬＡＣＩ−Ｋ３が何かを阻害するか否かは知られていない。ＬＡＣＩもＬＡＣＩのＫｕＤｏｍのいずれも、強いプラスミン阻害剤ではない。
【００３６】
本発明のＫｕＤｏｍは実質的にＬＡＣＩ−Ｋ１と相同であるが、以下に記述する強いプラスミン阻害活性を与える方法では異なる。本発明の他のＫｕＤｏｍは他の天然に生じるＫｕＤｏｍ、特に他のヒトＫｕＤｏｍと相同である。ヒトに使用するには、本発明の蛋白質は、免疫反応を引き起こす危険を減らすため、ＢＰＴＩよりもヒトＫｕＤｏｍに配列がさらに似ているように設計される。
【００３７】
ＬＡＣＩ−Ｋ１の第１ライブラリーおよびプラスミンに結合するための選択体
出願人は、ヒトプラスミンに対して高い親和力を有する変異体にＬＡＣＩ−Ｋ１の第１ライブラリーをスクリーニングして表２および表３に示される配列を得た。これらの配列は表１６に示されるようにまとめることができ、「好ましい残基」は結合プラスミンとして同定される３２個の変異体の少なくとも１個に現われる。表１７に示されるように、残基１３、１６、１７、１８および１９の好ましいものは強い。３１および３２で認められるタイプの範囲は限定されるが、この選択は３１での酸性基と３２での中性基が好ましいことを示している。残基１７のＡｒｇが好ましく、他の正に荷電したアミノ酸のＬｙｓはライブラリーに無く、Ａｒｇに適当な置換基である。部位３４および３９での多くのアミノ酸タイプは高い親和力のプラスミン結合と矛盾がないが、若干のタイプは結合を妨げる。
【００３８】
蛋白質の幾つかは検出できる分量がなかったので、ここに開示されたライブラリーの明確な単離物のすべては分析しなかった。
表２に示されるように、選択された蛋白質の１つ、ＱＳ４を調製した。ＱＳ４はプラスミンを約２ｎＭのＫｉで阻害する。この阻害のレベルはＢＰＴＩのそれよりも小さいが、ＱＳ４は免疫原性に対して小さいポテンシャルを有するのでヒトに使用するために好ましい分子である。表２および表３に示される他の蛋白質は非常に有効なプラスミンの阻害剤であり、抗原性のおそれが小さい。
【００３９】
残基１０−２１を変える第２ライブラリー
表５に示され、残基１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９および２１にて変異できるＬＡＣＩ−Ｋ１誘導体の第２ライブラリーを調製した。これはプラスミンに結合するためにスクリーニングされ、表６に示される蛋白質を得た。
【００４０】
表６の「共通」はＥ１０ＴＧＰＣＲＡＲＦＥＲＷ２１であり、７個の下線を付けた残基がＬＡＣＩ−Ｋ１とは異なる。酸性アミノ酸のみ（Ｇｌｕ：１７またはＡｓｐ：１５）が部位１０に認められ；ＬｙｓとＡｓｎが認められない。ＧｌｕとＡｓｐは略等しい頻度で現れるので、恐らく結合に等しく貢献しているのだろう。酸性残基は部位１１に認めれなかった。Ｔｈｒは良く現れるＳｅｒ（９／３２）と最も共通していた（１１／３２）；Ｇｌｙは８回現れた。１３で、Ｐｒｏは非常に好ましく（２４／３２）で２番目はＡｌａ（５／３２）であった。１５で、Ａｒｇは非常に好ましく（２５／３２）、しかし数個（７／３２）の単離体はＬｙｓをもつ。特に、ＢＰＴＩ（Ｒ１５）はＢＰＴＩよりも悪いプラスミン阻害剤である。１６で、Ａｌａは好ましく（２２／３２）、しかしＧｌｙはかなり頻繁に（１０／３２）で現れた。１７で、二番目（９／３２）に来るＬｙｓと、Ａｒｇは最も普通（１５／３２）であった。残基１７と１８で、ＡＰＰ−ＩはＭｅｔとＩｌｅを持つ。１８で、ＩｌｅまたはＰｈｅを許した。４個の単離体のみが１８でＩｌｅをもち、これらのどれも１７でＭｅｔを持たない。これはＫＩＤＯ８８を考慮すると驚いたが、ＤＥＮＮ９４ａを考慮すると良く理解された。この単離体の収集は１９で広い分布をもつ（Ｇｌｕ：８、Ｐｒｏ：７、Ａｓｐ：４、Ａｌａ：３、Ｈｉｓ：３、Ｇｌｙ：２、Ｇｌｎ：２、Ａｓｎ：１、Ｓｅｒ：１、およびＡｒｇ：１）が、酸性側の基が塩基性のものよりも非常に好ましい。２１で、分布は（Ｔｒｐ：１６、Ｐｈｅ：１４、Ｌｅｕ：２、Ｃｙｓ：０）であり、ＢＰＴＩは２１でＴｙｒをもつ。
【００４１】
クローニングによる純粋なファージの結合はこれら蛋白質の１つまたは別のものがＢＰＴＩファージの結合と比較されることを示している（表６）。蛋白質ＳＰＩ１１のＫｉを決定し、実質的にＢＰＴＩよりも優れている約８８ｐＭであることを見出した。
【００４２】
１０−２１および３１−２９を変える第３ライブラリー
表７に示されるように、残基３１、３２、３４、３５、および３９で多様に導入されたＤＮＡ源として結合するプラスミンに対して２凹選択された第２ライブラリー（残基１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、および２０で変る）のファージのプールを使用した。
【００４３】
このライブラリーはプラスミンに結合するために３回スクリーニングし、表８に示される単離物が得られた。アミノ酸タイプの分布は表１８に示され、「ｘ」
はアミノ酸タイプが認められないことを意味し、「＊」はＬＡＣＩ−Ｋ１に対して野性タイプであることを示している。
これらの配列はＥ１０ＴＧＰＣＲＡＫＦＤＲＷ２１・・・・Ｅ３１ＡＦＶＹＧＧＣＧＧ４０（表４のＳＰＩｃｏｎ１）の１０−２１および３１−４０の領域が共通していた。１０個の下線を付けたアミノ酸はＬＡＣＩ−Ｋ１とは異なる。８個の変化部位で、第２のタイプが全く共通であった：１０でのＡｓｐ、１１でのＡｌａ、１９でのＧｌｕ、２１でのＰｈｅ、３１でのＴｈｒ、３２でのＰｒｏまたはＳｅｒ、３４でのＬｅｕまたはＩｌｅ、および３９でのＧｌｕ。部位１７で、非常に有効な阻害剤ＳＰＩ１１はＲをもつ。従っ
て、配列Ｄ１０ＴＧＰＣＲＡＲＦＤＲＦ２１・・・・Ｅ３１ＡＦＩＹＧＧＣＥＧ４０（表４のＤＰＩ−１．１．１）は６個の残基のみがＬＡＣＩ−Ｋ１とは異なり、非常に共通している残基で選択された配列と合っており、部位１０、１７、２１、３４、および３９で好ましい置換基をもつ。ＤＰＩ−１．１．１ はプラスミンに対して非常に高い親和力をもちヒトの免疫原性に対して潜在性が殆どないことが期待される。
【００４４】
プラスミン阻害活性に対して蛋白質ＳＰＩ１１、ＢＰＴＩ、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、ＳＰＩ２２、ＳＰＩ５４およびＳＰＩ４３の予備的試験は与えられた順番で置いた。ＳＰＩ１１は約８８ｐＭのＫｉのＢＰＴＩよりも実質的に有効である。ＳＰＩ２３とＳＰＩ５１は活性が似ておりＢＰＴＩよりも僅かに劣る。ＳＰＩ４７はＳＰＩ５１よりも劣るがＱＳ４よりも良い。ＳＰＩ２２はＱＳ４よりも弱い。ＳＰＩ５４とＳＰＩ４３はＱＳ４程は有効でなく、Ｋｉは恐らく＞４ｎＭであろう。
表４に示されるように、配列ＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、およびＮＳ４のいずれか一つに残基５−５５で非常に相同であるＫｕＤｏｍは、プラスミンの有効な阻害剤（ＫＤ＞５ｎＭ）であるらしい、そしてヒトの抗原性に対して低い潜在性を有する。さらに好ましくは、プラスミンに対して高い親和力をもつように、ＫｕＤｏｍは残基１０−２１と３１−３９で同一であり、配列ＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、およびＮＳ４のいずれかと比較して残基５−９、２２−３０、および４０−５５で５またはそれ以下の相違点をもつ配列である。
【００４５】
選択された配列および選択された天然のＫｕＤｏｍの結合データーを使用すると、我々は他の親のヒトＫｕＤｏｍに応用できる高い親和力のプラスミン阻害ＫｕＤｏｍに対してレシピを書くことができる。まず、ＫｕＤｏｍは表１４の必要条件に合わなければならない。表１５に示される置換基はいずれかのＫｕＤｏｍに高い親和力のプラスミン阻害活性を与えるようだ。従って表１４に示されるように、ＫｕＤｏｍである配列を含み、その位置で表１５に示されるアミノ酸タイプを位置１２−２１および３２−３９の各々で含む蛋白質は、ヒトプラスミンの有効な阻害剤である。さらに好ましくは、蛋白質は表１５に示される位置のすべてに対して表１５に示されるアミノ酸タイプをもつ。免疫反応に対する潜在性を減らすために、結合領域の外側に配列を与えるように親の蛋白質として１または他のヒトＫｕＤｏｍを使用する必要がある。
【００４６】
残基５から残基５５までのＳＰＩ１１に実質的に相同であるアミノ酸配列を含み、位置１３−１９、３１、３２、３４、および３９でＳＰＩ１１と同一である蛋白質は、５ｎＭ以下のＫｉでヒトプラスミンを阻害する。ＳＰＩ１１は７個の位置でＬＡＣＩ−Ｋ１と異なる。これらの置換基がプラスミン結合および阻害を助長する際に等しく重要であるかは明らかでない。ＳＰＩ１１の置換された位置の１つがＬＡＣＩ−Ｋ１に見出される残基に変わる（すなわち「逆戻りした」）７個の分子があり、２１では残基の２個が逆戻りし、３５では３個の残基が逆戻りし、３５では４個の残基が逆戻りし、２１では５個の残基が逆戻りし、７では６個の残基が逆戻りする。さらに逆戻りした残基をもつものはプラスミンに対して親和力が小さいが、免疫原性に対する潜在性も小さいことが期待される。当業者は十分な有効性と低い免疫原性の蛋白質をこの１２６のコレクションから選び取ることができる。またＬＡＣＩ−Ｋ１とは異なるアミノ酸によるＳＰＩ１１の代用は、蛋白質を薬剤として使用するには適さなくする程度までプラスミンに対する親和力を減らすことなく、免疫原性を減らすことができる。
【００４７】
設計されたＫｕＤｏｍプラスミン阻害剤
以下、「ＤＰＩ」は、分子のＳＰＩシリーズ、特にＳＰＩ１１からのアミノ酸配列情報を組み込むＫｕＤｏｍｓである「設計されたプラスミン阻害剤、Ｄｅｓｉｇｅｄ Ｐｌａｓｍｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」を意味する。幾つかのＤＰＩの配列およびその親の蛋白質が表４に示されている。
【００４８】
配列ＤＰＩ−１．１．１、ＤＰＩ−１．１．２、ＤＰＩ−１．１．３、ＤＰＩ−１．１．４、ＤＰＩ−１．１．５、およびＤＰＩ−１．１．６（表４）はＬＡＣＩ−Ｋ１とは６、５、５、４、３、および２個のアミノ酸とはそれぞれ異なり、プラスミンに対する親和力が徐々に減り、ヒト配列への類似性が免疫原性の見込みを減らすように増加するシリーズを示す。各ライブラリーからの選択はＭ１８Ｆが鍵となる代用であり、Ｉ１７ＫまたはＩ１７Ｒが非常に重要であることを示している。第２と第３のライブラリーからの選択は、Ａｒｇが１５にて非常に好ましく、１１での酸側鎖基が結合に不利であることを示している。非常に有効な阻害剤ＳＰＩ１１は、ＢＰＴＩのように、Ｒ１７をもつことによってコンセンサスからは異なる。ＤＰＩ−１．１．１は突然変異体Ｄ１１Ｔ、Ｋ１５Ｒ、Ｉ１７Ｒ、Ｍ１８Ｆ、Ｋ１９Ｄ、およびＥ３２Ａを運び、プラスミン阻害剤として非常に有効である。ＤＰＩ−１．１．２はＤ１１Ｔ、Ｋ１５Ｒ、Ｉ１７Ｒ、Ｍ１８Ｆ、およびＫ１９Ｄを運び、非常に有効である。ＬＡＣＩ−Ｋ１に関してＤＰＩ−１．１．３は突然変異体Ｄ１１Ａ、Ｋ１５Ｒ、Ｉ１７Ｒ、Ｍ１８Ｆ、およびＫ１９Ｄを運ぶ。ＤＰＩ−１．１．３はＴ１１の代わりにＡ１１をもつのでＤＰＩ−１．１．２とは異なる；両蛋白質は非常に有効なプラスミン阻害剤である。ＤＰＩ−１．１．４は突然変異体Ｉ１７Ｒ、Ｍ１８Ｆ、Ｋ１９Ｄ、およびＥ３２Ａを運び、完全に有効でなければならない。ＤＰＩ−１．１．４はＳＰＩ１１突然変異体が少ないのであまり有効ではないが、また免疫原性も小さい。ＤＰＩ−１．１．５は突然変異体Ｉ１７Ｒ、Ｍ１８Ｆ、およびＫ１９Ｄを運ぶ。この蛋白質は良い阻害体であり、免疫原性は小さい。ＤＰＩ−１．１．６は突然変異体Ｉ１７ＲおよびＭ１８Ｆのみを運ぶが、プラスミンを阻害する必要がある。
【００４９】
蛋白質ＤＰＩ−１．２．１はヒトＬＡＣＩ−Ｋ２に基づき、表４に示される。突然変異体Ｐ１１Ｔ、Ｉ１３Ｐ、Ｙ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、Ｔ１９Ｄ、Ｒ３２Ｅ、Ｋ３４Ｉ、およびＬ３９Ｅはプラスミンに対して高い親和力を与える。これらの置換体の幾つかは必要ではないかも知れない；特に、Ｐ１１ＴとＴ１９Ｄは必要ではない。プラスミン親和力を改善する他の突然変異体は、Ｅ９Ａ、Ｄ１０Ｅ、Ｇ１６Ａ、Ｙ２１Ｗ、Ｙ２１Ｆ、Ｒ３２Ｔ、Ｋ３４Ｖ、およびＬ３９Ｇを含む。
【００５０】
蛋白質ＤＰＩ−１．３．１（表４）はヒトＬＡＣＩ−Ｋ３に基づく。突然変異体Ｒ１１Ｔ、Ｌ１３Ｐ、Ｎ１７Ｒ、Ｅ１８Ｆ、Ｎ１９Ｄ、Ｒ３１Ｅ、Ｐ３２Ｅ、Ｋ３４Ｉ、およびＳ３６Ｇはプラスミンに対して高い親和力を与える。これらの置換体の幾つかは必要ではないかも知れない；特に、Ｎ１９ＤとＰ３２Ｅは必要ではない。ＫＤを改善する他の変化は、Ｄ１０Ｅ、Ｎ１７Ｋ、Ｆ２１ＷおよびＧ３９Ｅを含む。
【００５１】
蛋白質ＤＰＩ−２．１（表４）はヒトコラーゲンα３ＫｕＤｏｍに基づく。突然変異体Ｅ１１Ｔ、Ｔ１３Ｐ、Ｄ１６Ａ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、Ｌ１９Ｄ、Ａ３１Ｅ、Ｒ３２Ｅ、およびＷ３４Ｉはプラスミンに対して高い親和力を与える。これらの置換体の幾つかは必要ではないかも知れない；特に、Ｌ１９ＤとＡ３１Ｅは必要ではない。プラスミン親和力を改善する他の突然変異体は、Ｋ１９Ａ、Ｄ１０Ｅ、Ｄ１６Ｇ、Ｋ２０Ｒ、Ｒ３２Ｔ、Ｗ３４Ｖ、およびＧ３９Ｅを含む。
【００５２】
ＤＰＩ−３．１．１（表４）はヒトＴＦＰＩ−２ドメイン１から誘導される。交換体Ｙ１１Ｔ、Ｌ１７Ｒ、Ｌ１８Ｆ、Ｌ１９Ｄ、およびＲ３１Ｅはプラスミンに対して高い親和力を与える。突然変異体Ｌ１９Ｄは必要ではないかも知れない。プラスミン結合を促進する他の突然変異体は、Ｙ２１Ｗ、Ｙ２１Ｆ、Ｑ３２Ｅ、Ｌ３４Ｉ、Ｌ３４Ｖ、およびＥ３９Ｇを含む。
【００５３】
ＤＰＩ−３．２．１（表４）はヒトＴＦＰＩ−２ドメイン２から誘導される。親ドメインは残基９（１個の残基）および４２（２個の残基）の後の挿入を含む。突然変異体（Ｖ９ＥＴＧＰＣ１４によって置き換えられたＶ９ＳＶＤＤＱＣ１４）、Ｅ１５Ｒ、Ｓ１７Ｋ、Ｔ１８Ｆ、Ｋ３２Ｔ、Ｆ３４Ｖ、および（Ｅ３９ＧＮＲＮＲ４４）によって置き換えられた（Ｈ３９ＲＮＲＩＥＮＲ４４）はプラスミンに対して高い親和力を与える。
アミノ酸の数を変える必要があるため、ＤＰＩ−３．２．１は他の改変されたひとＫｕＤｏｍよりも免疫原性に対して高い潜在性をもつ。
【００５４】
ＤＰＩ−３．３．１（表４）はヒトＴＦＰＩ−２ドメイン３から誘導される。交換体Ｅ１１Ｔ、Ｌ１３Ｐ、Ｓ１５Ｒ、Ｎ１７Ｒ、Ｖ１８Ｆ、Ｔ３４Ｉ、およびＴ３６Ｇはプラスミンに対して高い親和力を与える。突然変異体Ｅ１１Ｔ、Ｌ１３Ｐ、およびＴ３４Ｉは必要ではないかも知れない。プラスミン結合を促進する他の突然変異体は、Ｄ１０Ｅ、Ｔ１９Ｄ、Ｙ２１Ｗ、およびＧ３９Ｅを含む。
【００５５】
ＤＰＩ−４．１．１（表４）はＳ１０Ｅ、Ｍ１５Ｒ、Ｍ１７Ｋ、Ｔ１８Ｆ、Ｑ３４Ｖ、およびＭ３９Ｇの断定によるヒトＩＴＩ−Ｋ１からである。突然変異体Ｍ３９ＧおよびＱ３４Ｖは必要ではないかも知れない。プラスミン結合を促進する他の突然変異体は、Ａ１１Ｔ、Ｇ１６Ａ、Ｍ１７Ｒ、Ｓ１９Ｄ、Ｙ２１Ｗ、およびＹ２１Ｆを含む。
【００５６】
ＤＰＩ−４．２．１（表４）はヒトＩＴＩ−Ｋ２から突然変異体Ｖ１０Ｄ、Ｒ１１Ｔ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、およびＰ３４Ｖまでである。突然変異体Ｐ３４Ｖは必要ではないかも知れない。プラスミン結合を促進する他の突然変異体は、Ｖ１０Ｅ、Ｑ１９Ｄ、Ｌ２０Ｒ、Ｗ２１Ｆ、Ｐ３４ＩおよびＱ３９Ｅを含む。ＤＰＩ−４．２．２は３個の突然変異体Ｒ１１Ｔ、Ｆ１７Ｒ、およびＩ１８Ｆのみをもつので特に好ましい蛋白質である。ＤＰＩ−４．２．３は４個の突然変異体Ｒ１１Ｔ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、およびＬ２０Ｒのみをもつので特に好ましい蛋白質である。ＤＰＩ−４．２．４は５個の突然変異体Ｒ１１Ｔ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、Ｌ２０Ｒ、およびＰ３４Ｖのみをもつので特に好ましい蛋白質である。ＤＰＩ−４．２．５は突然変異体Ｖ１０Ｅ、Ｒ１１Ｔ、Ｆ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、Ｌ２０Ｒ、Ｖ３１Ｅ、Ｌ３２Ｔ、Ｐ３４Ｖ、およびＱ３９Ｇを運び、非常に有効にプラスミンを阻害する。各蛋白質ＤＰＩ−４．２．１、ＤＰＩ−４．２．２、ＤＰＩ−４．２．３、ＤＰＩ−４．２．４、ＤＰＩ−４．２．５はプラスミンの非常に有効な阻害剤である。
【００５７】
ＤＥＮＮ９４ａの前は、ＡＰＰ−Ｉは非常に有効なプラスミン阻害剤であった。
従って、非常にＡＰＰ−Ｉとは異なる位置１０−２１にてＡＰＰ−Ｉ残基を可能にするように設計されたライブラリーから蛋白質を選択することは驚くことであった。それにもかかわらず、ＡＰＰ−Ｉは有効なプラスミン阻害剤に変換できる。ＤＰＩ−５．１はヒトＡＰＰ−Ｉ（またプロテアーゼネクシン−ＩＩとして知られている）から突然変異体Ｍ１７ＲおよびＩ１８Ｆによって誘導され、ＡＰＰ−Ｉ自体よりもはるかに優れたプラスミン阻害剤である。ＤＰＩ−５．２はさらに突然変異体Ｓ１９Ｄ、Ａ３１Ｅ、およびＦ３４Ｉを運び、プラスミンに対してさらに高い親和力を促進することができる。
ＤＰＩ−６．１は５個の置換体Ｋ１１Ｔ、Ｑ１５Ｒ、Ｔ１６Ａ、Ｍ１７Ｒ、およびＭ１８ＦによってＨＫＩ Ｂ９ ＫｕＤｏｍ（ＮＯＲＲ９３）から誘導される。ＤＰＩ−６．１は有効なプラスミン阻害体である。ＤＰＩ−６．２はプラスミン結合を促進する追加の突然変異体Ｔ１９ＤおよびＡ３４Ｖを運び、プラスミン結合を促進する。
【００５８】
ＢＰＴＩは既知の天然に生じたＫｕＤｏｍプラスミン阻害剤であるが、改良することができる。ＤＰＩ−７．１はプラスミンに対する親和力を増加する突然変異体Ｉ１８ＦによってＢＰＴＩから誘導される。ＤＰＩ−７．２はプラスミン結合を増加させる突然変異体Ｋ１５Ｒを更に運ぶ。ＤＰＩ−７．３は追加の突然変異体Ｒ３９Ｇを運ぶ。ＤＰＩ−７．４は突然変異体Ｙ１０Ｄ、Ｋ１５Ｒ、Ｉ１８Ｆ、Ｉ１９Ｄ、Ｑ３１Ｅ、およびＲ３９Ｇを運び、非常に高い親和力をプラスミンに対して有する。
【００５９】
クニッツドメインの改変
ＫｕＤｏｍは全く小さい；循環からの除去が速すぎるような、製薬学的問題の原因であるならば、２以上のドメインを結合することができる。好ましいリンカーは１個以上のアミノ酸の配列である。好ましいリンカーはヒト蛋白質の繰り返しのドメインの間に見出されるものであり、特にリンカーはヒトＢＰＴＩ相同体に見出され、その１つは２個のドメイン（ＢＡＬＤ８５、ＡＬＢＲ８３ｂ）を有し他のものは３個（ＷＵＮＴ８８）を有する。ペプチドリンカーは全体の蛋白質が組み換えＤＮＡ技法によって発現される利点を有する。また免疫原共役体を形成するために通常使用されるもののような、非ペプチジルリンカーを使用することもできる。ＢＰＴＩ様ＫｕＤｏｍの血清滞在を増加させる代わりの手段はポリエチレングリコールにこれを連結することである、いわゆるＰＥＧ化（ＤＡＶＩ７９）。
【００６０】
ＳＰＩ１１および他のＫｕＤｏｍプラスミン阻害剤の特異性を改良する方法：
ＫｕＤｏｍＳＰＩ１１の表面の大部分をプラスミンの表面に相補的にしたので、Ｒ１５はプラスミンに特異的結合するために必須ではない。凝固および繊維素溶解の経路で酵素の多くはＡｒｇまたはＬｙｓの後で選択的に切断する。Ｐ１位置に塩基性残基を持たないと特異性が一層大きくなる。変異体ＳＰＩ１１−Ｒ１５Ａ（表１１に示される）は、Ｐ１でＡｌａを有し、良好なプラスミン阻害体であり、ＳＰＩ１１よりも他のプロテアーゼに関連してプラスミンに対して高い特異性を有することができる。プラスミンに対するＳＰＩ１１−Ｒ１５Ａの親和力はプラスミンに対するＳＰＩ１１の親和力よりも小さいが、他のＡｒｇ／Ｌｙｓ好適酵素に対する親和力のロスはより大きく、多くの応用で、特異性は親和力よりも一層重要である。良い親和力と非常に高い特異性をもつ他の突然変異体はＳＰＩ１１−Ｒ１５ＧおよびＳＰＩ１１−Ｒ１５Ｎ−Ｅ３２Ａを含む。このアプローチは他の高い親和力のプラスミン阻害剤に応用することができる。
【００６１】
ＳＰＩ１１の親和力の増加
表１２に示されるようなＳＰＩ１１の変異および結合物の選択はＳＰＩ１１よりも高いプラスミンに対する親和力を有するクニッツドメインを生成することである。この第４のライブラリーは１４−３８のジスルフィドを多様化することができる。表に示されるＤＮＡの２個の部分は合成され、ＰＣＲ反応でプライマーと共に用いられＮｓｉＩからＢｓｔＥＩＩまで走行するＤＮＡを生成する。プライマーは表に示される合成小片の、第一に対しては長さ２１および第二に対しては長さ１７の５’末端と同一である。変異性が非常に高いので、１０８と１０９個（多ければ多いほど良い）の形質転換細胞を得るように努力した。
【００６２】
生成の方法
本発明の蛋白質は次の方法を含む従来の技術のいずれによっても生成することができる。
ａ）成分、例えばアミノ酸の一連のカップリングによる非生物学の合成ｂ）適当なホスト細胞での組み換えＤＮＡ技法による生成、およびｃ）例えば、ＬＡＣＩ−Ｋ１から望まない配列を除去して合成置換配列をカップリングする半合成法。
【００６３】
ここに開示される蛋白質は、属Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｅｒｗｉｎｉａからのバクテリア、属Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ，ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような酵母菌、またはＣＯＳ−１のような培養した哺乳類動物の細胞のような適当なホスト中で組み換えにより好ましく生成される。さらに好ましいホストは種Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ の微生物である。ホスト細胞中で機能的な任意のプロモーターを使用して遺伝子発現をコントロールすることができる。
【００６４】
好ましくは蛋白質は分泌され、最も好ましくは、条件付の媒体から得られる。
分泌は、蛋白質が正確に折りたたまれて数個の菌で条件付の媒体中に生成されるので、好ましいルートである。分泌は要求されない。
【００６５】
グリコグループを含む特別の理由がない限り、グリコグループの抗原性に対してポテンシャルを減らすようにＮ−結合グリコシル化部位を欠くように設計された蛋白質が好ましく、その結果等量の蛋白質を、１）Ｅ．ｃｏｌｉ， ２） Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ， ３） Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ， ４） Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，および５）哺乳動物の細胞を含む広範囲の器官の中に発現させることができる。
【００６６】
組み換え型生成物を分解するプロテアーゼを生成するホスト細胞の問題を減らすには幾つかの意味がある；特にＢＡＮＥ９０およびＢＡＮＥ９１参照。ＶＡＮＤ９２はＥ．ｃｏｌｉ 中のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ 信号ペプチダーゼの過剰発現が異種の融合蛋白質の発現を増大させることを報告している。ＡＮＢＡ８８はＰＭＳＦ（セリンプロテアーゼ阻害剤）を培養基に添加すると融合蛋白質の収率が改善されることを報告している。
【００６７】
ここに開示されているこれらの蛋白質および他の蛋白質の生成に影響する他の因子は次のものを含む：１）コドンの使用（ホストに対するコドンを最適化することが好ましい）、２）シグナル配列、３）意図したプロセシング部位でのアミノ酸配列、プロセシング酵素の存在と局在性、処理生成物を部分的に変えまたは分解する種々の酵素の欠失、突然変異、または阻害、および分泌（許容分泌ホストが好ましい）においてホストをさらに複製できるようにする突然変異体。
【００６８】
組み換えＤＮＡ技術の一般的原則の参照作業はワストンらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，ＩおよびＩＩ巻、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ（１９８７）； ダーネルらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８６）； Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８５）；オールドら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ： Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ（１９８１）；サムブルックらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）； およびアウスベルらのＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，（１９８７，１９９２）を含む。これらの文献および引用された文献はここに参考文献として組み込まれる。
【００６９】
プラスミン結合および阻害のためのアッセイ
適当な方法を使用して本発明の化合物を試験することができる。スカッチャード（Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９４９）５１：６６０−６６９）は蛋白質結合に応用できる結合を測定し分析する古典的方法を記載している。この方法は比較的純粋な蛋白質、および結合した蛋白質を結合していない蛋白質から区別する能力を要する。
【００７０】
ＫＤを測定する第二の適当な方法は、酵素に対して阻害活性を測定することである。測定すべきＫＤが１ｎＭないし１μＭの範囲にあると、この方法は発色体または螢光基質および比較的純粋な阻害剤を数十マイクログラムないしミリグラム必要とする。ＫＤが５ｎＭないし５０ｐＭの範囲の本発明の蛋白質に対し、ナノグラムないしマイクログラムの阻害剤で十分である。この方法を使用するとき、阻害剤と酵素基質との間の競合は真のＫｉよりも高い測定したＫｉを与えることができる。ここに報告された測定は、補正が非常に小さくどの補正もＫｉを小さくするのであまり正確ではない。ここに、我々はＫＤの直接の測定値として測定されたＫｉを使用する。
【００７１】
第二の物質の蛋白質の親和力を決定する第三の方法は、Ｍ１３のような遺伝子パッケージに蛋白質を表示し、固定化した「第二の物質」に接着する蛋白質の能力を測定することである。この方法は遺伝子パッケージを増幅することができるので非常に鋭敏である。ｐＨステップグラジエントを使用して結合定数に対する少なくとも半定量的な値を得る。プロテアーゼに対する既知の親和力の阻害剤を使用して他のファージ表示阻害剤に判断されるものに対して標準のプロフィルを確立する。他の適当な蛋白質結合の測定方法はいずれも使用することができる。
【００７２】
好ましくは、本発明の蛋白質はプラスミンに対するＫＤが多くて約５ｎＭ、さらに好ましくは多くて約３００ｐＭ、そして最も好ましくは１００ｐＭ以下である。好ましくは、結合はＫｉがＫＤと同じであるように阻害する。プラスミンに対するＱＳ４のＫｉは約２ｎＭである。プラスミンに対するＳＰＩ１１のＫｉは約８８ｐＭである。
【００７３】
製薬学的方法および調製
本発明の好ましい対象は哺乳動物である。本発明は特にヒトの治療に有用であるが、また獣医学的応用にも適している。
【００７４】
ここで、「保護」は「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「抑止」、および「治療」を含む。「予防」は病気の誘発前に薬剤を投与することを含む。「抑止」は病気が臨床上現れる前に薬剤を投与することを含む。「治療」は病気が現れた後に薬剤を投与することを含む。
【００７５】
ヒトおよび獣医の薬では、誘導事象が未知であるか潜伏しているか、または患者が誘導事象の発生した後まで確かめられないので、「予防」と「抑止」との間を区別することはできない。我々は「予防」と「抑止」を含むように「治療」とは区別して「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」の語を使用する。ここで、「保護」は「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」を含む。保護は無制限に使用される必要はない。
【００７６】
本発明の蛋白質は、どんな方法でも、系統的にまたは局所的に投与することができ、対象を病気または不都合な状態から保護する。例えば、この種の組成物を非経口投与、巨丸剤注入または逐次灌流によって投与することができる。代わりに、または同時に、経口投与することができる。適当な摂生は有効量の蛋白質の投与からなり、時間、日、月、または年の期間にわたる１回の投与または複数回の投与で行われる。
【００７７】
本発明の蛋白質の適当な投与量は受容者の年齢、性別、健康、および体重、同時治療の種類、あるいは、治療回数、および望まれる効果に依存する。しかしながら、最も好ましい投与量は、当業者によって理解され決定できるので、この分野で知られている方法で投与量を調整して過度の実験をすることなく、各対象に合わせて調整することができる。
【００７８】
蛋白質を含む薬剤の臨床前および臨床時のテスト方法は、例えば、ベルコウらのＴｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９８７； グッドマンら著のＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，（１９９０）； Ａｖｅｒｙ’ｓ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＤＩＳ Ｐｒｅｓｓ，ＬＴＤ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ．（１９８７），エバジのＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｂｏｓｔｏｎ，（１９８５）、これらの文献および引用された文献は、ここに参考文献として組み込まれる。
【００７９】
ここに開示した蛋白質の他に、製薬組成物は製薬学的に受入られる担体、賦形薬、または補助薬を含む。例えば前記各文献を参照。
【００８０】
インヴィトロ診断方法および試薬
本発明の蛋白質はインヴィトロで、プラスミンを含む任意適当な試料に応用して存在するプラスミンを測定することができる。このようにするため、アッセイは存在するプラスミンの分量に依存する検出できるシグナルを与えるシグナル生成システム（ＳＰＳ）を含まなければならない。シグナルは視覚であるいは機械で検出される。可能なシグナルは着色、螢光、または発光生成物の生成、アッセイ成分または製品による発光の吸収または放射の特性の変更、および成分または製品の沈澱または凝集を含む。
【００８１】
診断試薬と最も密接に結合するＳＰＳの成分は「標識」と呼ばれる。標識は、例えば、放射性同位元素、螢光団、酵素、補酵素、酵素基質、電子密集化合物、または凝集性粒子である。放射性同位元素は、例えば、γカウンターまたはシンチレーションカウンターを使用して、またはオートラジオグラフィーによって検出できる。特に有用な同位元素は３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、および、好ましくは１２５Ｉである。また化合物を螢光化合物で標識を付けることもできる。螢光による標識を付けた化合物は適当な長さの光に露光させ、その存在を検出することができる。最も普通に使用される螢光標識化合物はフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミンである。代わりに、螢光放出金属、例えば１２５Ｅｕまたは他のランタナイドを、ジエチレントリアミン五酢酸またはエチレンジアミン四酢酸のような金属キレート基を用いて結合蛋白質に結合させる。また蛋白質は化学ルミネセンス化合物、例えばルミノール、イソルミノール、ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびオキザレートエステルにカップリングすることによって検出できるように標識を付けることができる。同様に、生物発光化合物、例えばルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンを使用して結合蛋白質に標識を付けることができる。生物発光蛋白質の存在は発光の存在を検出して決定される。酵素標識、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが好ましい。
【００８２】
２つの基本タイプのアッセイがある：異種および同種。異種アッセイでは、分析物への類縁分子の結合は標識に影響を与えない；従って、分析物の分量を決定するため、結合した標識を遊離標識から分離しなければならない。同種アッセイでは、相互作用は標識の活性に影響を与え、分析物は分離しないで測定することができる。
【００８３】
一般に、プラスミン結合蛋白質（ＰＢＰ）は、抗プラスミン抗体を使用する同じ方法で診断に利用することができる。従って、アッセイ形式によって、または、競合阻害によって、プラスミンを結合する他の物質によって、プラスミンをアッセイするために使用することができる。
【００８４】
通常試料は生物学的流体、例えば血液、尿、リンパ液、精液、乳、または脳脊髄液、またはそれらの誘導体、または生物学的組織、例えば組織切片または均等質である。試料は何でもよい。試料が生物学的流体または組織であるならば、ヒトまたは他の哺乳動物、脊椎動物または動物、または植物から取り出すことができる。好ましい試料は血液、またはその断片または誘導体である。
【００８５】
１つの好適例では、プラスミン結合蛋白質（ＰＢＰ）を固定化し、試料中のプラスミンを既知量の標識を付けたまたは特異的に標識を付けたプラスミン類似体を競合させる。「プラスミン類似体」はプラスミンそれ自体を含むＰＢＰに結合するためのプラスミンと競合できる分子である。前に標識を付けてもよく、または標識をプラスミンからプラスミン類似体を区別する部分に特異的に結合することによって後で標識を付けてもよい。相を分離して、一つの相の中の標識を付けたプラスミン類似体を定量する。
「サンドウイッチアッセイ」では、不溶化プラスミン結合剤（ＰＢＡ）、および標識ＰＢＡの両方を用いる。プラスミン分析物は不溶化ＰＢＡによって捕捉され、標識ＰＢＡによって標識を付けられ、第三コンプレックスを形成する。試薬を任意の順番で試料に添加することができる。ＰＢＡｓは同じかまたは異なり、１つだけのＰＢＡは本発明によるＰＢＰでなければならない（他のＰＢＡは例えば、抗体であってもよい）。第三コンプレックスの標識を付けたＰＢＡの量は試料中のプラスミンの量に正比例する。
【００８６】
上述の２つの好適例は両方とも異種アッセイである。同種アッセイはＰＢＰをプラスミンに結合して標識が影響を受けることだけが必要である。プラスミン阻害剤を診断試薬として使用するならばプラスミン分析物はそれ自体標識として働くことができる。
【００８７】
標識は直接または間接に（例えば、標識を付けた抗ＰＢＰ抗体を介して）、共有結合的に（例えば、ＳＰＤＰを用いて）または非共有結合的に、プラスミン結合蛋白質に結合させることができ、診断試薬を生成する。同様にプラスミン結合蛋白質は固相支持体に結合し固相（「捕獲」）診断試薬を生成する。適当な支持体はガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、およびマグネタイトを含む。本発明の目的のために、担体はある程度まで溶解でき、または溶解しない。支持体材料は結合した分子がプラスミンを結合できる限りどんな構造でもよい。
【００８８】
インヴィヴォ診断用途
プラスミンに緊密に結合するクニッツドメインはインヴィヴォ映像のために使用できる。病巣の診断映像はモノクローナル抗体のための最大の商業的好機の一つと考えられたが、この好機は達成されなかった。かなり努力したにもかかわらず、２種のモノクローナル抗体を基礎とした映像剤のみが認められた。モノクローナル抗体を用いて得られるこの失望させられる結果は大部分次の理由による： ｉ）不十分な親和力および／または特異性；
ｉｉ）標的部位への弱い浸透；
ｉｉｉ）非標的部位からの遅いクリアランス；
ｉｖ）免疫原性（大部分はネズミ）；および ｖ）高い生成コストおよび低い安定性。
【００８９】
これらの制限が診断映像分野においてペプチドを基礎とした映像剤の開発の開始へと最も導かれた。弱い浸透と遅いクリアランスの問題を潜在的に解決すると同時に、ペプチドを基礎とした映像剤は十分な親和力、特異性およびインヴィヴォ安定性を有し最も応用に有効である。
【００９０】
製作された蛋白質は映像剤としての要求に非常に適している。特に、既知のインヴィヴォクリアランス率と機構を有する小さく安定なヒト起源蛋白質ドメインを工学技術によって得られる異例の親和力と特異性は、初期の、さらに信頼性のある結果、小さい毒性／副作用、さらに低い生産と貯蔵のコスト、および標識調製のさらに大きい便利さに加わる。実際に、工学処理された蛋白質映像剤を用いて実時間の映像のゴールを達成できる必要がある。プラスミン結合蛋白質、例えば、ＳＰＩ１１は内出血の部位を制限するために用いられる。
【００９１】
放射性同位元素の標識を付けた結合蛋白質は、ヒトまたは動物の対象に投与できる。次の動的および／または静的映像に適当な放射性同位元素検出装置を用いることができるように、一般に注射、例えば、静脈注射または動脈注射または十分な量の投与手段によって投与は行われる。投与量は診断に有効な映像を与えることができる最少量であり、既知の放射性同位元素映像剤をガイドとして用いるこの分野で普通の手段で決定することができる。
【００９２】
一般に、映像は対象の全体で、または健康状態または検討される病気に関連した身体または器官の一部で行われる。放射性同位元素結合蛋白質は蓄積した。関連する標的器官で時間で所定点にて蓄積された放射性同位元素の標識を付けた結合蛋白質の量を次に定量することができる。
【００９３】
特に適当な放射性同位元素検出装置はシンチレーションカメラ、例えばγカメラである。カメラでの検出装置は放射性崩壊を検知し、記録し、（そして任意にディジタル化する）。デジタル化した情報は任意の適当な方法で分析することができ、その多くはこの分野で知られている。例えば、時間−放射性分析は、時間と共に標的器官によって、放射性同位元素の標識を付けた結合蛋白質のクリアランスによる取り込みを示すことができる。
【００９４】
適当な放射性同位元素を選ぶ際に種々の因子を考慮に入れる。アイソトープを選ぶには、映像の際に解像度を良い品質にする、ヒトや動物の診断用に安全である、そして好ましくは、身体に受ける放射線の分量を減らすように半減期が短いことである。使用する放射性同位元素は好ましくは製薬学的に不活性であり、投与量には実質的に生理学的効果をもたせない。結合蛋白質は異なる沃素アイソトープ、例えば、１２３Ｉ、１２５Ｉまたは１３１Ｉ（例えば米国特許４，６０９，７２５参照）を用いて放射性同位元素標識を付けることができる。標識の分量は適当にモニターされる必要がある。
【００９５】
ヒト対象に応用する際には、身体の全暴露量を減らし、標識分子の検出可能性を最適にするため、標識用の１２５Ｉとは別のラジオアイソトープを使用することが望ましい。ヒトに使用するため臨床的に入手できることを考慮すると、好ましい放射性同位元素の標識は次のものを含む：９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１２３Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅまたは2１Ａｔ。放射性同位元素の標識を付けた蛋白質は種々の方法で調製することができる。これらはクロラミン−Ｔまたはラクトパーオキシダーゼ法による放射性同位元素ハロゲン化、および続く高圧液体クロマトグラフィーによる精製を含む、例えば、ＧｕｔｋｏｗｓｋａらのＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ： （１９８７）１６（１）：１８３参照。
放射性同位元素標識の他の方法は、例えばＩＯＤＯＢＥＡＤＳ（登録商標）を使用することができる。
【００９６】
放射性同位元素標識蛋白質は、活性剤を哺乳動物の薬剤の作用部位に到達するようにする任意の手段によって投与することができる。蛋白質は経口投与するとき消化されてしまうので、非経口投与、すなわち、静脈内の皮下注射、筋肉内注射が通常吸収を最適にするために使用される。
【００９７】
他の用途
本発明のプラスミン結合蛋白質はまたプラスミンを流体、例えば血液から精製するために使用することができる。このために、ＰＢＰは好ましくは不溶性支持体に固定化される。このような支持体は固相診断試薬を調製する際に有用なものとして既に記述されたものを含む。
【００９８】
蛋白質は、蛋白質の分離または精製の際の表示のために分子量マーカーとして使用することができる。蛋白質は分子量マーカーとして使うように変性されることが必要である。蛋白質の第二の一般的効用は加水分解した蛋白質を栄養源として使用することである。蛋白質はまた溶液の粘度を上げるために使用することもできる。
【００９９】
本発明の蛋白質は上記の目的のいずれにも、またさらにこの明細書の初めに議論したような治療および診断の目的にも使用することができる。
【０１００】
ペプチドの調製
化学的ポリペプチド合成はこの分野で急速に展開している領域であり、固相ポリペプチド合成の方法は次の文献に良く記述されているので、これらを参考文献として組み込む。（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ Ａｍｅｒ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４（１９６３）； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１−３４７（１９８６）； Ｗａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２５：Ｓ２１−Ｓ３７（１９８６）； Ｆｉｅｌｄｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ ３５：１６１（１９９０）； ＭｉｌｌｉＧｅｎ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏｓ．２ ａｎｄ ２ａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，１９８７）Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，同上，ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，同上。タンとカイザーは（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７７，１６：１５３１−４１）１８年前にＢＰＴＩと相同体を合成した。
【０１０１】
この分野で知られているように、この種の方法は反応性機能基、例えば遊離アミノ、カルボキシルおよびチオ基をブロッキングしまたは保護することを含む。
ポリペプチドボンドを形成後、保護基を除去する。従って、各アミノ酸残基の添加は保護および脱保護のための幾つかの反応工程を必要とする。最近の方法は固相合成を利用し、Ｃ−末端アミノ酸を、濾過できる不溶性樹脂粒子に共有結合させる。反応物は、自動化機械を用いて樹脂粒子を適当な溶媒で洗浄して除く。「ｔＢｏｃ」法および「Ｆｍｏｃ」法を含めて種々の方法がこの分野では良く知られている。特に、Ａｔｈｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒｎｓ １：５３８−５４６（１９８１）および Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ ２０：４５１−４５４（１９８２）参照。
【０１０２】
実施例
実施例１：ＬＡＣＩ（Ｋ１）ライブラリーの構築
ＮｓｉＩ−およびＭｌｕＩ−適合化末端をもつ合成オリゴヌクレオチド二本鎖ＤＮＡ分子を、上記２個の酵素で予め開裂した親ベクター（ＬＡＣＩ−Ｋ１：：ＩＩＩ）にクローンした。得られた連結物質をＸＬＩＭＲ（Ｆ−）Ｅ．ｃｏｌｉ株に電気穿孔法によりトランスフェクションし、アンピリシン（Ａｐ）プレートで培養し、ファージ発生ＡｐＲコロニーを得た。段階１に対する斑図はＰ１領域に集中し、残基１３、１６、１７、１８および１９に影響を及ぼした。６．６×１０５の異なるＤＮＡ配列（３．１ ×１０５の異なる蛋白質配列）を見込んだ。得られたライブラリーは１．４ ×１０６の独立したｃｆｕ’ｓからなり、ライブラリー全体のほぼ二倍の表示である。この培養から生成したファージストックは約３．９ｍｌ中に１．４×１０１３のｐｆｕ’ｓの全滴定量を与え、平均で、全体で１×１０７そしてファージストックｍｌ当たり２．６×１０６倍の各独立したクローンが表示された。
【０１０３】
残基３１、３２、３４および３９（段階ＩＩ）の斑を与えるため、ＭｌｕＩ−およびＢｓｔＥＩＩ−適合化末端を用いた合成オリゴヌクレオチド二本鎖ＤＮＡ分子を、次の１つから誘導された予め開裂したＲｆＤＮＡにクローニングをした。
ｉ）親構築物、 ｉｉ）段階Ｉライブラリー、または ｉｉｉ）所定の標的に結合する第一の段階から選択された表示ファージ。
【０１０４】
段階ＩＩのための斑図は、残基３１、３２、３４および３９にて変更による４０９６の異なるＤＮＡ配列（１６００の異なる蛋白質配列）を見込んだ。最後の段階ＩＩの斑は、段階Ｉにおいて所定の標的を用いる３ラウンドの結合と溶離に続いて残っている斑の水準に依存する。
【０１０５】
両段階について合わせた可能な斑は２．７×１０８の異なるＤＮＡ配列または５．０×１０７の異なる蛋白質配列に等しい。予め選択した表示ファージは、段階ＩＩの斑に対してＲｆＤＮＡの起源として使用され、最後の斑の水準は恐らく１０５ないし１０６の範囲内であろう。
【０１０６】
実施例２：プラスミンに結合するためのＬＡＣＩ−Ｋ１ライブラリーのスクリーニング プラスミンに結合するＬＡＣＩ−Ｋ１変異体を選択するための全体図は、緩衝液中（１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ含有ＰＢＳ）のプラスミン−ビーズ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；カタログ番号５２７８０２）でファージ表示ライブラリーをインキュベーションし、結合せず不十分に保持された表示ファージ変異体を ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ を含有するＰＢＳで洗浄することを含む。さらに強く結合した表示ファージは低いｐＨの溶離緩衝液、一般には１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ含有のクエン酸緩衝液（ｐＨ２．０）で溶離し、直ちにトリス緩衝液でｐＨ７．５ まで中和する。この工程は選択の１ラウンドを構成する。
【０１０７】
中和した溶離表示ファージは次のいずれにも使用できる：
ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉのＦ＋株を植付けて新しい表示ファージストックを生成し、選択の次のラウンドに使用する（いわゆる従来のスクリーニング）、または
ｉｉ）プロテアーゼビーズを用いて選択の他の直接のラウンドに直接使用する（いわゆるクイックスクリーニング）。
【０１０８】
一般に、いずれかの方法の３ラウンド、または２つの組合せが、最終の選択された表示ファージを生じるように行われ、そこから代表する数に配列分析をして、表示ファージのプールとしてまたは各クローンとして結合性を分析する。
【０１０９】
ＬＡＣＩ−Ｋ１ライブラリーについて、選択の２段階が行われ、各々は結合と溶離の３ラウンドからなる。クローンの副次集団を生じるプラスミンに対して結合と溶離の３ラウンドを通過した段階Ｉライブラリー（斑入り残基１３、１６、１７、１８、および１９）を、段階Ｉ選択は使用した。この選択した副次集団から誘導されたＲｆＤＮＡを使用して段階ＩＩライブラリー（斑入り残基３１、３２、３４および３９の追加）を生成した。約５．６×１０７の独立した形質転換細胞が得られた。最終選択を起こす同じ標的プロテアーゼを用いて結合と溶離のさらに３ラウンドを、段階ＩＩライブラリーは受けた。
【０１１０】
プラスミン−アガロースビーズに対する選択の２段階に続いて、最終選択表示ファージの代表的な数（１６）に配列分析をした。表２はアパーケースで斑入りの位置で選択されたアミノ酸を用いて選択されたＬＡＣＩ−Ｋ１ドメインの配列分析を示す。残基Ｐ１３、Ａ１６、Ｒ１７、Ｆ１８、およびＥ１９の絶対的選択に注意。Ｅに対して３１およびＱに対して３２での選択が非常に強い。３４では一致がない；観察されたアミノ酸は｛Ｔ３、Ｙ２、Ｈ２、Ｄ、Ｒ、Ａ、Ｖ２、Ｉ３、およびＬ｝である。
Ｃβ（Ｔ、Ｉ、およびＶ）で分枝する側鎖基をもつアミノ酸は多様に表され好ましい。位置３９では、強い一致はない（Ｇ６、Ｄ３、Ｑ２、Ａ２、Ｒ、Ｆ、Ｅ）が、Ｇ、Ｄ、Ｑ、およびＡは好ましく見える（この順で）。
【０１１１】
プラスミンに対するＬＡＣＩ−Ｋ１ライブラリーの単独のスクリーニングは１６の配列分析をした選択された表示ファージから非常に似ている一致を与えた。これらの配列を表３に示す（上の場合の選択された残基）。これらの配列はＥが位置１９で優勢である表２のものからはずれており。Ｔ、Ｖ、またはＳの３４（Ｔ５、Ｖ３、Ｓ３、Ｉ２、Ｌ、Ａ、Ｆ）にて一致している。２組を合わせると、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｈ、Ｙ、およびＬに対し（優先の順で）優先し、Ｆ、Ｄ、およびＲが許される。
【０１１２】
発現、精製および動力学的分析
３単離物ＱＳ４、ＡＲＦＫ＃１、およびＡＲＦＫ＃２を酵母発現ベクターに再クローンした。酵母発現ベクターはｐＭＦアルファ８（ＫＵＲＪ８２およびＭＩＹＡ８５）から誘導した。ＬＡＣＩ変異体遺伝子はｍａｔα１遺伝子の部分に融合し、ｍａｔα１プロモーター−シグナルペプチドおよびＬＡＣＩ変異体にシークェンス融合されたリーダーからなるハイブリッド遺伝子を生成した。クローニング部位を表２４に示す。特に、正しく処理したＬＡＣＩ−Ｋ１変異体蛋白質は表２および３に詳述するように、Ｎ−末端ｍｅｔに残基ｇｌｕ−ａｌａ−ａｌａ−ｇｌｕを付加する（表２および表３の残基１）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ の発現は媒質１リットル当たり５００μｇ収率のプロテアーゼ阻害剤を与える。酵母発現ＬＡＣＩ（クニッツドメイン１）、ＢＰＴＩおよびＬＡＣＩ変異体：ＱＳ４、ＡＲＦＫ＃１およびＡＲＦＫ＃２はトリプシンアガロースビーズを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
【０１１３】
最も好ましい生成ホストはアルコールオキシダーゼ装置を用いるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ である。他のものは酵母 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ に多くの蛋白質を生成した。例えば、ヴェドヴィックら（ＶＥＤ９１）およびワグナーら（ＷＡＧＮ９２）は
【数１】
で培養基に分泌蛋白質としてメタノールによって誘導したアルコールオキシダーゼプロモーターからアプロチニンを生成した。グレッグら（ＧＲＥＧ９３）
はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ で多くの蛋白質の生成を検討した。ＧＲＥＧ９３の表１はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ に生成した蛋白質および収率を示す。
【０１１４】
動力学的データー
阻害剤の量を変えて ２．５×１０−８Ｍでプラスミンによるスクシニル−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−（Ｆ３Ａｃ）ＡＭＣ（メチルクマリン）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）の加水分解の阻害は、最少二乗法により密着結合基質に対する標準型に合っていた。２個のＡＲＦＫ変異体の予備動力学的分析はＱＳ４変異体のそれに非常に良く似た阻害活性を示した。これらの測定は親和力が血液中の蛋白質の作用に関連しているように生理的な量の塩（１５０ｍＭ）で行った。
表２３はＱＳ４がヒトプラスミンの非常に特異的阻害剤であることを示す。ＬＡＣＩ−Ｋ１誘導体ＱＳ４を表示するファージは他のプロテアーゼ標的に結合するよりも少なくとも５０倍プラスミンビーズに結合する。
【０１１５】
プラスミンのための新しいライブラリー：
Ｍ１３ ｇＩＩＩｐに表示され表５に示される相違点を含むＬＡＣＩ−Ｋ１ドメインの新しいライブラリーはプラスミン結合のために作成され分離された。表６は選択され一致した配列を示す。我々はクローンによる純ファージのＢＰＴＩ表示ファージへの結合と比較して、選択された蛋白質の結合を特徴づけた。単離体１１、１５、０８、２３、および２２はＢＰＴＩファージよりも優れている。我々は可溶性ＳＰＩ１１（選択されたプラスミン阻害剤♯１１）を生成し、その阻害活性を試験し、ＢＰＴＩよりも少なくとも二倍良い８８ｐＭのＫｉを得た。このようにして、選択したＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、およびＳＰＩ２２はＢＰＴＩよりもはるかに優れており、ＳＰＩ２３がＢＰＴＩとほぼ同じ有効性がある。リストにあげた蛋白質はすべてＢＰＴＩよりもヒト蛋白質アミノ酸配列に非常に近く、免疫原性に対してポテンシャルが小さかった。
【０１１６】
米国および外国の特許または特許出願、および未特許の開示物を含めて、ここに全文献の全体を参考文献として組み込む。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表４に示されるＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、およびＮＳ４から成る群から選択される参照配列の残基５ないし５５に実質的に相同であるアミノ酸配列からなるプラスミン阻害蛋白質。
【請求項２】
表４に示されるＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、およびＮＳ４から成る群から選択される参照配列と比較して、配列が残基１０−２１および３１−３９で同一であり、残基５−９、２２−３０、および４０−５５で５以下の異なる配列を有する請求項１記載の蛋白質。
【請求項３】
前記蛋白質がＢＰＴＩを参照して残基数をもつ表１４に示される要求に合うクニッツドメインからなり、そして前記蛋白質がクニッツドメイン位置１２−２１および３２−３９にて表１５のその位置に対して挙げたアミノ酸タイプの１つを有し、前記クニッツドメインの配列が、ＢＰＴＩの配列に対する前記クニッツドメインのアミノ酸配列よりも、ＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、ＮＳ４、ヒトＬＡＣＩ−Ｋ２、ヒトＬＡＣＩ−Ｋ３、ヒトコラーゲンα３ＫｕＤｏｍ、ヒトＴＦＰＩ−２ドメイン１、ヒトＴＦＰＩ−２ドメイン２、ヒトＴＦＰＩ−２ドメイン３、ヒトＩＴＩ−Ｋ１、ヒトＩＴＩ−Ｋ２、ヒトプロテアーゼネキシン−ＩＩ、ヒトＡＰＰ−Ｉ、ＤＰＩ−１．１．１、ＤＰＩ−１．１．２、ＤＰＩ−１．１．３、ＤＰＩ−１．２．１、ＤＰＩ−１．３．１、ＤＰＩ−２．１、ＤＰＩ−３．１．１、ＤＰＩ−３．２．１、ＤＰＩ−３．３．１、ＤＰＩ−４．１．１、ＤＰＩ−４．２．１、ＤＰＩ−４．２．２、ＤＰＩ−４．２．３、ＤＰＩ−４．２．４、ＤＰＩ−４．２．５、ＤＰＩ−５．１、ＤＰＩ−５．２、ＤＰＩ−６．１、ＤＰＩ−６．２の群から選択された参照配列にアミノ酸配列がさらに似ている、プラスミン阻害蛋白質。
【請求項４】
残基１８がＰｈｅであり、残基１５がＡｒｇであり、残基１６がＡｌａであり、そして残基１７がＡｒｇである請求項３記載の蛋白質。
【請求項５】
前記蛋白質が１００ｐＭ以下のヒトプラスミンに対するＫｉを有する請求項１たは３記載の蛋白質。
【請求項６】
そこから利益を得るヒトまたは動物の対象に対して、請求項１または３記載の蛋白質のプラスミン阻害量を投与することからなる過剰のプラスミン活性に帰する障害を防止または治療する方法。
【請求項７】
標識しまたは不溶化した形態で請求項１または３記載の蛋白質を提供し、前記蛋白質と試料中のプラスミンのコンプレックスが形成されるかどうかを決定することから成るプラスミンに対するアッセイ方法。
【請求項８】
混合物を請求項１または３記載の蛋白質または類似体と、不溶化形態で接触させ、プラスミンを結合させてなる混合物からプラスミンを精製する方法。
【請求項９】
親のクニッツドメインがヒト起源であり、蛋白質がヒトプラスミンを約３００ピコモル以下のＫｉで阻害する請求項３記載の蛋白質。
【請求項１０】
蛋白質が表１５に示される各位置で表１５におけるその位置に対して示されるアミノ酸タイプを有する請求項３記載の蛋白質。
【請求項１１】
約１００ｐＭ以下のＫｉを有するプラスミン阻害蛋白質。
【請求項１】
表４に示されるＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、およびＮＳ４から成る群から選択される参照配列の残基５ないし５５に実質的に相同であるアミノ酸配列からなるプラスミン阻害蛋白質。
【請求項２】
表４に示されるＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、およびＮＳ４から成る群から選択される参照配列と比較して、配列が残基１０−２１および３１−３９で同一であり、残基５−９、２２−３０、および４０−５５で５以下の異なる配列を有する請求項１記載の蛋白質。
【請求項３】
前記蛋白質がＢＰＴＩを参照して残基数をもつ表１４に示される要求に合うクニッツドメインからなり、そして前記蛋白質がクニッツドメイン位置１２−２１および３２−３９にて表１５のその位置に対して挙げたアミノ酸タイプの１つを有し、前記クニッツドメインの配列が、ＢＰＴＩの配列に対する前記クニッツドメインのアミノ酸配列よりも、ＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ４７、ＱＳ４、ＮＳ４、ヒトＬＡＣＩ−Ｋ２、ヒトＬＡＣＩ−Ｋ３、ヒトコラーゲンα３ＫｕＤｏｍ、ヒトＴＦＰＩ−２ドメイン１、ヒトＴＦＰＩ−２ドメイン２、ヒトＴＦＰＩ−２ドメイン３、ヒトＩＴＩ−Ｋ１、ヒトＩＴＩ−Ｋ２、ヒトプロテアーゼネキシン−ＩＩ、ヒトＡＰＰ−Ｉ、ＤＰＩ−１．１．１、ＤＰＩ−１．１．２、ＤＰＩ−１．１．３、ＤＰＩ−１．２．１、ＤＰＩ−１．３．１、ＤＰＩ−２．１、ＤＰＩ−３．１．１、ＤＰＩ−３．２．１、ＤＰＩ−３．３．１、ＤＰＩ−４．１．１、ＤＰＩ−４．２．１、ＤＰＩ−４．２．２、ＤＰＩ−４．２．３、ＤＰＩ−４．２．４、ＤＰＩ−４．２．５、ＤＰＩ−５．１、ＤＰＩ−５．２、ＤＰＩ−６．１、ＤＰＩ−６．２の群から選択された参照配列にアミノ酸配列がさらに似ている、プラスミン阻害蛋白質。
【請求項４】
残基１８がＰｈｅであり、残基１５がＡｒｇであり、残基１６がＡｌａであり、そして残基１７がＡｒｇである請求項３記載の蛋白質。
【請求項５】
前記蛋白質が１００ｐＭ以下のヒトプラスミンに対するＫｉを有する請求項１たは３記載の蛋白質。
【請求項６】
そこから利益を得るヒトまたは動物の対象に対して、請求項１または３記載の蛋白質のプラスミン阻害量を投与することからなる過剰のプラスミン活性に帰する障害を防止または治療する方法。
【請求項７】
標識しまたは不溶化した形態で請求項１または３記載の蛋白質を提供し、前記蛋白質と試料中のプラスミンのコンプレックスが形成されるかどうかを決定することから成るプラスミンに対するアッセイ方法。
【請求項８】
混合物を請求項１または３記載の蛋白質または類似体と、不溶化形態で接触させ、プラスミンを結合させてなる混合物からプラスミンを精製する方法。
【請求項９】
親のクニッツドメインがヒト起源であり、蛋白質がヒトプラスミンを約３００ピコモル以下のＫｉで阻害する請求項３記載の蛋白質。
【請求項１０】
蛋白質が表１５に示される各位置で表１５におけるその位置に対して示されるアミノ酸タイプを有する請求項３記載の蛋白質。
【請求項１１】
約１００ｐＭ以下のＫｉを有するプラスミン阻害蛋白質。
【公開番号】特開２０１２−１１１７７９（Ｐ２０１２−１１１７７９Ａ）
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−４４０５１（Ｐ２０１２−４４０５１）
【出願日】平成２４年２月２９日（２０１２．２．２９）
【分割の表示】特願２００８−２９５６１０（Ｐ２００８−２９５６１０）の分割
【原出願日】平成７年１月１１日（１９９５．１．１１）
【出願人】（５００２１４４３９）
【氏名又は名称原語表記】ＤＹＡＸ ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月２９日（２０１２．２．２９）
【分割の表示】特願２００８−２９５６１０（Ｐ２００８−２９５６１０）の分割
【原出願日】平成７年１月１１日（１９９５．１．１１）
【出願人】（５００２１４４３９）
【氏名又は名称原語表記】ＤＹＡＸ ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
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