グリセロールから１，３−プロパンジオールを高収量で生物学的に製造する方法
本発明によれば、酪酸、乳酸、ブタノールおよびエタノールからなる群から選択されるグリセロール代謝の他の生成物を実質的に生産しないクロストリジウム株を、炭素源としてグリセロールを含んでなる適切な培養培地で培養すること、および１，３−プロパンジオールを回収することによる、１，３−プロパンジオールの嫌気的製造のための方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、代謝的に操作されたクロストリジウムにより、グリセロールを１，３−プロパンジオールへ高収量で生物変換する方法を含む。
【０００２】
背景技術
１，３−プロパンジオールはポリエステル繊維の生産に用いられるモノマーであり、ポリウレタンおよび環状化合物の生産に有用である可能性もある。
【０００３】
１，３−プロパンジオールは、ｉ）アクロレイン水と水素から、ｉｉ）ホスフィンの存在下でエチレンオキシド一酸化炭素と水から、また、一酸化炭素の存在下でグリセロールと水素から、という異なる化学経路によって製造することができる。これらの方法は総て、一般にコストが高く、汚染物質を含有する廃流が生成する。
【０００４】
１，３−プロパンジオールは、種々のクロストリディア（Clostridia）によるグリセロールの発酵によって、酢酸／酪酸／乳酸／１，３−プロパンジオールの混合物として生産することができる。クロストリディア（Clostridia）におけるグリセロールの一般的な代謝を図１に示す。
【０００５】
１つの経路では、グリセロールは二段階の酵素反応で１，３−プロパンジオールへ変換される。第一段階では、グリセロールデヒドラターゼがグリセロールから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）と水への変換を触媒する。第二段階では、３−ＨＰＡがＮＡＤＨ依存性１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼによって１，３−プロパンジオールへと還元される。１，３−プロパンジオールを生産するクロストリディア（Clostridia）のほとんどは、ｄｈａＢ１Ｂ２Ｂ３構造遺伝子によりコードされているＢ１２依存性グリセロールデヒドラターゼを用いるが、クロストリジウム(Clostridum)・ブチリカムはｄｈａＢ１構造遺伝子によりコードされているＢ１２非依存性酵素を用いる。Ｂ１２依存性グリセロールデヒドラターゼでは、ｏｒｆＸおよびｏｒｆＺがグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードし、他方、唯一の既知Ｂ１２非依存性酵素では、ｄｈａＢ２がＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）依存性活性化因子をコードする。これらの構造因子および活性化因子をコードする遺伝子の近くには１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子も存在する。グリセロールからの１，３−プロパンジオール生産はＮＡＤＨを消費する。
【０００６】
別の経路では、グリセロールが１，３−プロパンジオールへ変換されない場合には、それは、それぞれｇｌｐｋおよびｇｌｐＡによりコードされているグリセロールキナーゼおよびグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼか、それぞれｄｈａＤおよびｄｈａＫ１Ｋ２によりコードされているグリセロールデヒドロゲナーゼの後にＤＨＡキナーゼのいずれかによってジヒドロキシアセトンリン酸(dihydrohycetone-phosphate)（ＤＨＡＰ）へと酸化され、ＮＡＤＨの生産を伴う。次に、ＤＨＡＰは解糖系へ入り、鍵となる中間体であるピルビン酸とアセチル−ＣｏＡの生成を伴う。ピルビン酸とアセチル−ＣｏＡは、それぞれｌｄｈ遺伝子によりコードされている乳酸デヒドロゲナーゼとａｄｈＥによりコードされている二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼによって乳酸およびエタノールへ還元される。また、アセチル−ＣｏＡは、
ｉ）それぞれｐｔｂおよびｂｕｋ遺伝子によりコードされているホスホトランスブチリラーゼおよび酪酸キナーゼによって酪酸へ変換可能であるか、または
ｉｉ）ａｄｈＥによりコードされている二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼによってブタノールへ還元可能である、
中間生成物ブチリル−ＣｏＡへの変換も可能である。
【０００７】
溶媒生成性のクロストリディア（Clostridia）では、アセトンは、アセト−アセチル−ＣｏＡ（ブチリル−ＣｏＡ生産の中間体）から、それぞれｃｔｆＡＢおよびａｄｃ遺伝子によりコードされているＣｏＡ−トランスフェラーゼおよびアセト酢酸デカルボキシラーゼによって生産される。水素はｈｙｄＡ遺伝子によりコードされている鉄単独ヒドロゲナーゼによって生産される。
【０００８】
天然クロストリディア（Clostridia）も組換えクロストリディア（Clostridia）も、酪酸（酪酸塩）、乳酸（乳酸塩）、エタノールまたはブタノールなどの還元化合物が同時に生成するために、１，３−プロパンジオールの最大収量はグリセロール１ｇ当たり０．５５ｇである。１，３−プロパンジオール生産の収量を高めるためには、総ての還元副生成物の生産を回避し、１，３−プロパンジオールの生産を酸化副生成物へ結びつけることが必要である。
【０００９】
酪酸を生産することができないクロストリジウム・アセトブチリカム株は既に文献に記載されている(Green et al., 1996)。この酪酸の形成は、非複製プラスミドとの１回の交叉によって得られるｂｕｋ遺伝子の不活性化のために劇的に低減されている。この変異株は、(Gonzalez-Pajuelo, 2005, Metabolic Engineering)に示されているように、１，３−プロパンジオールの生産に関して試験された。この組換え株は、主要な発酵生成物として１，３−プロパンジオールを効率的に生産するが、１，３−プロパンジオールの収量を低下させるブタノールも生産する。
【００１０】
クロストリディア（Clostridia）によるグリセロールの１，３−プロパンジオール発酵は、バッチ培養、フェッドバッチ培養または連続培養で行うことができる。
【００１１】
本発明により解決される課題は、グリセロールから１，３プロパンジオールを、酪酸、乳酸またはアルコールなどの還元化合物を同時に生成することなく、高収量で生物学的に製造することである。この製造はクロストリディア（Clostridia）による嫌気性発酵によって行われる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは上述の課題を解決した。本発明によれば、酪酸、乳酸、ブタノールおよびエタノールからなる群から選択されるグリセロール代謝の他の生成物を実質的に生産しないクロストリジウム株を、炭素源としてグリセロールを含んでなる適切な培養培地で培養すること、および１，３−プロパンジオールを回収することによる、１，３−プロパンジオールの嫌気的製造のための方法が提供される。
【００１３】
１，３−プロパンジオールは、グリセロール代謝の単一の酸化生成物とともに生産され得る。
【００１４】
本発明の特定の態様では、クロストリジウム株は、グリセロールからの１，３−プロパンジオール以外の代謝産物の生産（この生合成経路はＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを消費する）を制限するように改変されたものとされる。
【００１５】
本発明の一つの態様では、１，３−プロパンジオールを自然状態で生産するクロストリジウムが、
ｉ）酪酸の生産を回避するために酪酸キナーゼをコードする遺伝子（ｂｕｋ）またはホスホトランスブチリラーゼをコードする遺伝子（ｐｔｂ）、
ｉｉ）所望により、乳酸の生産を回避するために乳酸デヒドロゲナーゼをコードする（ｌｄｈ）遺伝子の全て、
ｉｉｉ）所望により、アルコールの形成を回避するために二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）をコードする遺伝子
を削除することにより、１，３−プロパンジオールを高収量で産生するように遺伝的に改変される。
【００１６】
本発明の別の態様では、自然状態で酪酸を生産するが、１，３−プロパンジオールを生産することができないクロストリジウムが、１，３−プロパンジオールを高収量で生産するように遺伝的に改変される。これは、酪酸経路に関与する酵素をコードするｐｔｂまたはｂｕｋ遺伝子を、Ｂ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードするＣ．ブチリカムのオペロンで置換し、
ｉ）所望により、乳酸の生産を回避するために乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）の全て、
ｉｉ）所望により、アルコールの生成を回避するために二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ）
を削除することによって達成される。
【００１７】
本発明のさらなる態様では、自然状態でエタノールを生産するが、１，３−プロパンジオールを生産することができないクロストリジウム(Clostridum)が、１，３−プロパンジオールを高収量で生産するように遺伝的に改変される。これは、エタノール経路に関与する酵素をコードするａｄｈＥ遺伝子の１つをＢ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードするＣ．ブチリカムのオペロンで置換し、
ｉ）所望により、乳酸の生産を回避するために乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）の全て、
ｉｉ）所望により、アルコールの生成を回避するために二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする残りの遺伝子（ａｄｈＥ）の全て
を削除することによって達成される。
【００１８】
本発明の別の態様では、ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｈｙｄＡ）を減弱することにより、水素生産のフラックスが低減され、そして、還元当量のフラックスが１，３−プロパンジオールの生産にふり向けられる。
【００１９】
本発明の別の態様では、１，３−プロパンジオール生産のフラックスが、Ｃ．ブチリカム由来の１，３−プロパンジオールオペロン（Ｂ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする）の追加のコピーを導入することにより増強される。
【００２０】
本発明の目的はまた、１，３−プロパンジオールの高収量での製造方法に有用な組換えクロストリジウム株を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本明細書に組み込まれ、その一部をなす添付図面は、本発明を具体的に例示するものであり、本明細書とともに本発明の原理を説明するものである。
【００２２】
【図１】種々のクロストリディア（Clostridia）の中枢代謝を示す。１：ピルビン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼ；２：チオラーゼ；３：β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；４：クロトナーゼ；５：ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；６：乳酸デヒドロゲナーゼ；７：ホスホトランスアセチラーゼ；８：酢酸キナーゼ；９：アセトアルデヒドエタノールデスヒドロゲナーゼ；１０：ヒドロゲナーゼ．；１１：ＣｏＡトランスフェラーゼ（アセトアセチル−ＣｏＡ：酢酸／酪酸：ＣｏＡトランスフェラーゼ）；１２：アセト酢酸デカルボキシラーゼ；１３：ホスホトランスブチリラーゼ；１４：酪酸キナーゼ；１５：ブチルアルデヒド−ブタノールデヒドロゲナーゼ；１６：グリセロールデヒドラターゼ；１７：１，３プロパンジオールデヒドロゲナーゼ
【発明の具体的説明】
【００２３】
本明細書において、特許請求の範囲および明細書の解説のために下記の用語を用いることがある。
【００２４】
「クロストリジウム」または「クロストリディア」とは、この科に属するあらゆる種類の細菌を指す。
【００２５】
適切な培養培地とは、具体的に用いるクロストリジウム株の増殖およびジオール生産のために最適化された培養培地を指す。
【００２６】
「炭素基質」または「炭素源」とは、基質が少なくとも１つの炭素原子を含む微生物によって代謝され得る任意の炭素源を意味する。本発明において、グリセロールが単一の炭素源である。
【００２７】
「微生物が改変されている」とは、その株がその遺伝的特徴を変化させることを目的に形質転換されていることを意味する。内在する遺伝子を減弱、削除または過剰発現させることができる。外来の遺伝子を導入したり、プラスミドによって運ばせたり、あるいはその株のゲノムに組み込み、細胞内で発現させたりすることができる。
【００２８】
「減弱」とは、遺伝子の発現の低下、または遺伝子の産物であるタンパク質の活性の低下を指す。当業者ならばこの結果を得るための多くの手段を知っており、例えば、
・遺伝子への、この遺伝子の発現レベルまたはコードされているタンパク質の活性レベルを低下させる変異の導入
・その遺伝子の天然プロモーターの、低い発現をもたらす低強度プロモーターとの置換
・対応するメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質を脱安定化する要素の使用
・発現が必要なければ、その遺伝子の欠失
がある。
【００２９】
「削除されている遺伝子」とは、その遺伝子のコード配列の実質的部分が除去されていることを意味する。好ましくは、コード配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％が除去されている。
【００３０】
本明細書において「プラスミド」または「ベクター」とは、細胞の中枢代謝の一部ではない遺伝子を、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態で運ぶことが多い染色体外要素を指す。
【００３１】
本発明の説明において、酵素はそれらの特異的活性によって同定される。従って、この定義には、他の生物、より詳しくは他の微生物にも存在する定義された特異的活性を有するあらゆるポリペプチドが含まれる。多くの場合、類似の活性を有する酵素は、ＰＦＡＭまたはＣＯＧとして定義される特定のファミリーへの分類によって同定することができる。
【００３２】
ＰＦＡＭ(protein families database of alignments and hidden Markov models; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列アラインメントの大きなコレクションを表す。各ＰＦＡＭは複数のアライメントの表示、タンパク質ドメインの表示、生物間の分布の評価、他のデータベースへのアクセス、および既知のタンパク質構造の表示を可能とする。
【００３３】
ＣＯＧ（clusters of orthologous groups of proteins; http://www.ncbi.nlm.nih. gov/COG/）は、３０の主要な系統発生的ラインを表す４３の完全に配列決定されたゲノムに由来するタンパク質配列を比較することによって得られる。各ＣＯＧは少なくとも３つのラインから定義され、これによりこれらによって保存されているドメインの同定が可能となる。
【００３４】
相同配列とそれらの相同％を特定する手段は当業者によく知られており、特に、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から使用可能なＢＬＡＳＴプログラム（このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターを使用）が挙げられる。次に、得られた配列を、例えば、プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.cbi.ac.uk/clustalw/)またはＭＵＬＴＡＬＩＮ(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)を用いて（これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターを使用）、活用（例えば、アライメント）することができる。
【００３５】
当業者ならば、既知の遺伝子に関してＧｅｎＢａｎｋで得られた参照番号を用い、他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおいて等価な遺伝子を決定することもできる。この慣用手段は、他の微生物から得られた遺伝子との配列アライメントを行い、別の生物で対応する遺伝子をクローニングするための縮重プローブをデザインすることによって決定できるコンセンサス配列を用いて行うのが有利である。これらの分子生物学の常法は当業者によく知られており、例えば、Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)に記載されている。
【００３６】
本発明によれば、酪酸、乳酸、ブタノールおよびエタノールからなる群から選択されるグリセロール代謝の他の生成物を実質的に生産しないクロストリジウム株を、炭素源としてグリセロールを含んでなる適切な培養培地で培養すること、および１，３−プロパンジオールを回収することによる、１，３−プロパンジオールの嫌気的製造のための方法が提供される。
【００３７】
「実質的に」とは、培養培地中にごく微量のグリセロールの生成物または還元物しか見られないことを意味する。微量とは、好ましくは１，３−プロパンジオールの回収方法を妨げない量、より好ましくは１０ｍＭ未満の量を意味する。
【００３８】
「グリセロール代謝」とは、細菌内で起こるグリセロールのあらゆる生化学的修飾を指す。これには有機の生合成（同化作用）およびそれらの分解（異化作用）が含まれる。ある代謝反応はＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨを消費し、またある代謝反応はＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨを生成する。クロストリジウム株におけるグリセロール代謝を図１に示す。代謝反応の中間体ならびに最終生成物を代謝産物と呼ぶ。
【００３９】
本発明の方法は、グリセロール代謝が１，３−プロパンジオール生産に向けられ、クロストリジウムによって１，３−プロパンジオールとともに酪酸、乳酸、ブタノール、エタノールなどのこの代謝経路からの他の還元生成物が生産されないことを特徴とする。実際、これらの還元生成物の生産は細胞のＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨストックを消費する。この消費を制限すれば、その還元力を１，３−プロパンジオールの生産にふり向けることができる。
【００４０】
本発明の特定の実施態様では、１，３−プロパンジオールは、酢酸、アセトンまたは二酸化炭素などのグリセロール代謝の単一の酸化生成物とともに生産される。「酸化生成物」とは、細胞のＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨストックを消費せずに産生される生成物を指す。
【００４１】
有利には、本方法で用いられるクロストリジウム株は、１，３−プロパンジオールと酢酸のみを生産するものとされる。
【００４２】
本発明によれば、クロストリジウム株は、その生合成経路がＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを消費する、１，３−プロパンジオール以外のグリセロール由来の代謝産物の生産を制限するように改変することができる。
【００４３】
有利には、この改変は、該代謝産物の生産に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の削除からなる。
【００４４】
特に、この酵素は、酪酸、乳酸、ブタノールおよびエタノールからなる群から選択される代謝産物の生産に関与するものとされる。
【００４５】
本発明の特定の実施態様では、クロストリジウムは、１，３−プロパンジオールの生合成に関与する酵素をコードする機能的内在遺伝子を含むので、自然状態で１，３−プロパンジオールを生産する。これらの遺伝子は、特に、グリセロールデヒドラターゼおよび１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼである。
【００４６】
この株は、ブチリル−ＣｏＡから酪酸への変換を遮断するためにホスホトランスブチリラーゼ（ｐｔｂ）または酪酸キナーゼ（ｂｕｋ）をコードする少なくとも１つの遺伝子を削除することにより、１，３−プロパンジオールを主生成物として生産するように遺伝的に改変することができる。
【００４７】
別の特定の実施態様では、クロストリジウムはまた、乳酸の生産を遮断するために乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）の全てが削除されている。
【００４８】
別の特定の実施態様では、クロストリジウムはまた、アルコールの生産を遮断するために二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ）の全てが削除されている。
【００４９】
クロストリディア（Clostridia）における遺伝子の削除は、ｉ）削除する遺伝子をエリスロマイシン耐性遺伝子で置換し、ｉｉ）ＦＬＰレコンビナーゼを発現させることによってそのエリスロマイシン耐性遺伝子を除去することを可能とする、最近、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載された方法を用いて行うことができる。
【００５０】
有利には、クロストリジウム株はＣ．ブチリカム(C. butyricum)およびＣ．パスツリアナム(C. pasteurianum)からなる群から選択される。
【００５１】
本発明の特定の実施態様では、クロストリジウム株は、１，３−プロパンジオールを生産可能なように改変されなければならない。この改変は、Ｂ−１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の導入からなる。これらの遺伝子としては限定されるものではないが、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＴであり得る。
【００５２】
有利には、この株は、Ｂ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードするクロストリジウム・ブチリカムのオペロンを導入することにより改変される。染色体へのオペロンの挿入は、最近、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載された方法を用いて行うことができる。
【００５３】
本発明の特定の実施態様では、用いるクロストリジウム(Clostridum)株は自然状態で酪酸を生産するが、改変前には１，３−プロパンジオールを生産することができないものであり、この特定のクロストリジウムが、
ブチリル−ＣｏＡから酪酸への変換を遮断し、
この株においてグリセロールから１，３−プロパンジオールの生産を可能とする
目的で、酪酸の形成に関与する酵素、特にホスホトランスブチリラーゼ（ｐｔｂ）または酪酸キナーゼ（ｂｕｋ）をコードする少なくとも１つの遺伝子を、Ｂ−１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする１つの異種遺伝子で置換することによって１，３−プロパンジオールを生産するように遺伝的に改変される。染色体へのオペロンの挿入およびこれらの遺伝子の削除は、最近、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載された方法を用いて行うことができる。
【００５４】
好ましくは、このクロストリジウム株において、乳酸の生産を遮断するために乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）の全てが削除されている。
【００５５】
好ましくは、このクロストリジウム株において、アルコールの生産を阻害するために二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ）の全てが削除されている。
【００５６】
有利には、このクロストリジウム株は、Ｃ．アセトブチリカム(C. acetobutylicum)、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii)、Ｃ．サッカロペルブチルアセトニカム(C. saccharoperbutylacetonicum)、Ｃ．サッカロブチリカム(C. saccharobutylicum)、Ｃ．ブチリカムまたはＣ．セルロリチカム(C. cellulolyticum)からなる群から選択される。
【００５７】
本発明の特定の実施態様では、クロストリジウム(Clostridum)は自然状態でエタノールを生産するが、改変前には１，３−プロパンジオールを生産することができないものであり、この株が、二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子（ａｄｈＥ）をＢ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子で置換することによって１，３−プロパンジオールを生産するように遺伝的に改変される。好ましくは、この異種遺伝子はＢ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードするＣ．ブチリカムのオペロンである。
【００５８】
この置換は、
アセチル−ＣｏＡからエタノールへの変換の低下、および
グリセロールからの１，３−プロパンジオールの生産
をもたらす。
【００５９】
好ましくは、このクロストリジウム株において、乳酸の生産を阻害するために乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）の全てが削除されている。
【００６０】
好ましくは、このクロストリジウム株において、アルコールの生産を遮断するために二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ）の全てが削除されている。
【００６１】
クロストリジウム染色体へのオペロンの挿入および従前に挙げた遺伝子の削除は、最近、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載された方法を用いて行うことができる。
【００６２】
有利には、このクロストリジウム株は、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)、クロストリジウム・サッカロリチカム（現サーモアナエロバクター・サッカロリチカム(Thermoanaerobacter saccharolyticum)）、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス(Clostridium thermosulfurogenes)（現サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス(Thermoanaerobacter thermosulfurigenes)）またはクロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricum)（現サーモアナエロバクター・エタノリカス(Thermoanaerobacter ethanolicus)）からなる群から選択される。
【００６３】
本発明の特定の実施態様では、クロストリジウム株において、水素生産のフラックスが低減され、その結果、還元当量のフラックスが１，３−プロパンジオール生産にふり向けられる。これは、種々の手段、特に、水素生産の形での還元当量のシンクを提供する酵素であるヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｈｙｄＡ）を減弱することにより行うことができる。ｈｙｄＡの減弱は、天然プロモーターを低強度プロモーターで置換するか、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化する要素を用いることによって行うことができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列の部分的または完全な削除によって、遺伝子の完全な減弱を行うこともできる。
【００６４】
本発明の別の実施態様では、使用するクロストリジウム株は、１，３−プロパンジオール生産のフラックスの増強をもたらし、これは、Ｃ．ブチリカム由来の１，３−プロパンジオールオペロン（Ｂ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする）の追加のコピーを導入するか、プラスミドにより過剰発現させるか、または組換えクロストリジウムの染色体に組み込むことによって達成される。１，３−プロパンジオールオペロンの過剰発現のためには、例えば、ｐＳＰＤ５プラスミドを使用することができる。
【００６５】
本発明の別の態様において、クロストリジウム株は、酢酸からアセトンへの変換が可能なように改変される。この改変は、それぞれチオラーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼおよびアセト酢酸デカルボキシラーゼ（これらの酵素はＣ．アセトブチリカムおよびＣ．ベイジェリンキにおけるアセトンの形成に関与する）をコードするｔｈｌ、ｃｔｆＡＢおよびａｄｃ遺伝子を含む人工「アセトンオペロン」を微生物に導入することによって得ることができる。この人工オペロンはプラスミドに運ばせることもできるし、あるいは形質転換されたクロストリジウムの染色体に組み込むこともできる。
【００６６】
別の実施態様では、本発明により、
（ａ）発酵工程として、クロストリジウム株をグリセロールと接触させ、それにより１，３−プロパンジオールを生産すること、
（ｂ）１，３−プロパンジオールおよび所望によりグリセロール代謝の単一の酸化生成物を、蒸留によって単離すること
を含んでなる、１，３−プロパンジオールを高収量で発酵製造する方法が提供される。この発酵は一般に、少なくともグリセロールおよび必要であれば代謝産物の生産に必要な補助基質を含有する、用いる細菌に適合した既知の定義された組成の無機培養培地の入った発酵槽で行われる。
【００６７】
この方法はバッチ法ならびに連続法で実現可能である。当業者ならば、これらの各実験条件をどのように管理すればよいか、また、本発明の微生物のための培養条件をどのように定義すればよいかが分かる。特に、クロストリディア（Clostridia）は２０℃〜６０℃、好ましくは、中温性クロストリディア（Clostridia）では２５℃〜４０℃、好熱性クロストリディア（Clostridia）では４５〜６０℃で発酵させる。
【００６８】
本発明はまた、上記に記載されたような微生物に関する。好ましくは、この微生物は、Ｃ．ブチリカム、Ｃ．パスツリアナム、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．サッカロペルブチルアセトニカム、Ｃ．サッカロブチリカム、Ｃ．ブチリカム、Ｃ．セルロリチカム、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・サッカロリチカム（現サーモアナエロバクター・サッカロリチカム）、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス（現サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス）またはクロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム（現サーモアナエロバクター・エタノリカス）からなる群から選択される。
【実施例】
【００６９】
実施例１：
１，３−プロパンジオールを生産するが、酪酸およびブタノールを生産することができない組換えクロストリジウム・アセトブチリカム：Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯの構築
遺伝的に操作可能であり、ブタノールおよびアセトンを生産することができない株を得るために、本発明者らはまず、ｉ）グルコースＭＳ培地で２０回の継代培養を行い、寒天プレート（Sabathe et al (2003)が記載しているようにデンプン（２％）およびグルコース（０．２％）を含有する）上でデンプン加水分解の小さなハローを生じるクローンを選択してＣ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５１５Δｕｐｐ株を同定することで、Ｃ．アセトブチリカムΔｃａｃ１５１５Δｕｐｐ株（特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載）からｐＳＯＬ１メガプラスミドを救済した。ｂｕｋ遺伝子を削除し、Ｃ．ブチリカム由来の１，３−プロパンジオールオペロンを導入するために、Croux & Soucaille (2006)が特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載している相同組換え戦略を用いる。ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐベクターにおいてＣ．ブチリカム由来の１，３−プロパンジオールを組み込むｂｕｋ削除カセットは次のようにして構築した。
【００７０】
ｂｕｋ前後の２つのＤＮＡ断片を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＢＵＫ １−ＢＵＫ ２１とＢＵＫ ３１−ＢＵＫ ４を用い、２つのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。両プライマーＢＵＫ １およびＢＵＫ ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＢＵＫ ２１およびＢＵＫ ３１はｐｖｕＩＩ部位およびＮｒｕＩ部位を導入する相補的領域を有する。ＤＮＡ断片ＢＵＫ １−ＢＵＫ ２１とＢＵＫ ３１−ＢＵＫ ４を、プライマーＢＵＫ １およびＢＵＫ ４を用いたＰＣＲ融合実験で連結し、得られた断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、ｐＴＯＰＯ：ｂｕｋを得た。ｐＴＯＰＯ：ｂｕｋのユニークなｎｒｕＩ部位に、ｐＵＣ１８−ＦＲＴ−ＭＬＳ２の１３７２ｂｐのＳｔｕＩ断片から、両側にＦＲＴ配列を有する抗生物質耐性ＭＬＳ遺伝子を導入した。得られたプラスミドのＢａｍＨＩ消化の後に得られたＢＵＫ削除カセットをｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＲＥＰΔＢＵＫ：：ｕｐｐプラスミドを得た。ｐＲＥＰΔＢＵＫ：：ｕｐｐのユニークなｐｖｕＩＩ部位に、１，３−プロパンジオールオペロンを、ｐＳＰＤ５プラスミドの、４８５４ｂｐの平滑末端クレノウ処理したＳａｌＩ断片として導入した。
【００７１】
このｐＲＥＰΔＢＵＫ：：ＰＤＯ：：ｕｐｐプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５Δｕｐｐ株を形質転換した。ペトリプレート上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むグリセロール液体合成培地で２４時間培養し、１００μｌの非希釈培養物をエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌと５−ＦＵ ４００μＭを含むＲＣＧＡ（炭素源としてデンプンおよびグルコースがグリセロールで置換された強化クロストリジウム培地(Reinforced Clostridium medium where starch and glucose are replaced by glycerol as a carbon source)）上にプレーティングした。エリスロマイシンと５−ＦＵの双方に耐性のあるコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングし、５−ＦＵ耐性にチアムフェニコール感受性も伴っているクローンを選択した。エリスロマイシン耐性で、チアムフェニコール感受性であるクローンの遺伝子型をＰＣＲ分析（ｂｕｋ削除カセットの外側に位置するプライマーＢＵＫ ０およびＢＵＫ ５を使用）により確認した。ｐＲＥＰΔｂｕｋ：：ｕｐｐが欠失したΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯ：：ｍｌｓＲ株を単離した。
【００７２】
ΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯ：：ｍｌｓＲを、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)由来のＦｌｐレコンビナーをコードするＦｌｐ１遺伝子を発現するｐＣＬＦ１．１ベクターで形質転換した。形質転換し、ペトリプレート上でチアムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した後、１つのコロニーを、チアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含む合成液体培地で培養し、適当な希釈物をチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡ上にプレーティングした。チアムフェニコール耐性クローンを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングした。エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるクローンの遺伝子型を、プライマーＢＵＫ ０とＢＵＫ ５を用いたＰＣＲ分析により確認した。ｐＣＬＦ１．１を消失させるため、エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ株の２連続の２４時間培養を行った。ｐＣＬＦ１．１を消失したΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯ株を、エリスロマイシンとチアムフェニコールの双方に対するその感受性に従って単離した。
【００７３】
【表１】
【００７４】
実施例２：
酪酸、アセトンおよび乳酸を生産することができない株：Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈの構築
ｌｄｈ遺伝子を削除するために、Croux & Soucaille (2006)が特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載している相同組換え戦略を用いる。この戦略によって、関連する遺伝子の大部分が削除されるとともにエリスロマイシン耐性カセットの挿入が可能となる。ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐにおけるｌｄｈ削除カセットは次のようにして構築した。
【００７５】
ｌｄｈ（ＣＡＣ２６７）前後の２つのＤＮＡ断片を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＬＤＨ １−ＬＤＨ ２とＬＤＨ ３−ＬＤＨ ４を用い、１１３５ｂｐと１１７７ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。両プライマーＬＤＨ １およびＬＤＨ ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＬＤＨ ２およびＬＤＨ ３はＳｔｕＩ部位を導入する相補的領域を有する。ＤＮＡ断片ＬＤＨ １−ＬＤＨ ２とＬＤＨ ３−ＬＤＨ ４を、プライマーＬＤＨ １およびＬＤＨ ４を用いたＰＣＲ融合実験で連結し、得られた断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、ｐＴＯＰＯ：ＬＤＨを得た。ｐＴＯＰＯ：ＬＤＨのユニークなＳｔｕＩ部位に、ｐＵＣ１８−ＦＲＴ−ＭＬＳ２の１３７２ｂｐのＳｔｕＩ断片から、両側にＦＲＴ配列を有する抗生物質耐性ＭＬＳ遺伝子を導入した。得られたプラスミドのＢａｍＨＩ消化の後に得られたＵＰＰ削除カセットをｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＲＥＰΔＬＤＨ：：ｕｐｐプラスミドを得た。
【００７６】
このｐＲＥＰΔＬＤＨ：：ｕｐｐプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯ株を形質転換した。ペトリプレート（ＲＣＧＡ）上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含む液体グリセロール合成培地で２４時間培養し、１００μｌの非希釈培養物をエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌと５−ＦＵ ４００μＭを含むＲＣＧＡ上にプレーティングした。エリスロマイシンと５−ＦＵの双方に耐性のあるコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＧＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＧＣＡの双方にレプリカプレーティングし、５−ＦＵ耐性にチアムフェニコール感受性も伴っているクローンを選択した。エリスロマイシン耐性で、チアムフェニコール感受性であるクローンの遺伝子型をＰＣＲ分析（ｌｄｈ削除カセットの外側に位置するプライマーＬＤＨ ０およびＬＤＨ ５を使用）により確認した。ｐＲＥＰΔＬＤＨ：：ｕｐｐが欠失したΔΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ：：ｍｌｓＲ株を単離した。
【００７７】
ΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ：：ｍｌｓＲ株を、Ｓ．セレビシエ由来のＦｌｐレコンビナーをコードするＦｌｐ１遺伝子を発現するｐＣＬＦ１．１ベクターで形質転換した。形質転換し、ペトリプレート上でチアムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した後、１つのコロニーを、チアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含む合成液体培地で培養し、適当な希釈物をチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡ上にプレーティングした。チアムフェニコール耐性クローンを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングした。エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるクローンの遺伝子型を、プライマーＬＤＨ ０とＬＤＨ ５を用いたＰＣＲ分析により確認した。ｐＣＬＦ１．１を消失させるため、エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ株の２連続の２４時間培養を行った。ｐＣＬＦ１．１を消失したΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ株を、エリスロマイシンとチアムフェニコールの双方に対するその感受性に従って単離した。
【００７８】
【表２】
【００７９】
実施例３：
低水素生産株：Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈΔｈｙｄＡの構築
ｈｙｄＡ遺伝子を削除するために、Croux & Soucaille (2006)が特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載している相同組換え戦略を用いる。この戦略によって、関連する遺伝子の大部分が削除されるとともにエリスロマイシン耐性カセットの挿入が可能となる。ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐにおけるｈｙｄＡ削除カセットは次のようにして構築した。
【００８０】
ｈｙｄＡ（ＣＡＣ０２８）前後の２つのＤＮＡ断片を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＨＹＤ １−ＨＹＤ ２とＨＹＤ ３−ＨＹＤ ４を用い、１２６９ｂｐと１３１７ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。両プライマーＨＹＤ １およびＨＹＤ ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＨＹＤ ２およびＨＹＤ ３はＳｔｕＩ部位を導入する相補的領域を有する。ＤＮＡ断片ＨＹＤ １−ＨＹＤ ２とＨＹＤ ３−ＨＹＤ ４を、プライマーＨＹＤ １およびＨＹＤ ４を用いたＰＣＲ融合実験で連結し、得られた断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、ｐＴＯＰＯ：ＨＹＤを得た。ｐＴＯＰＯ：ＨＹＤのユニークなＳｔｕＩ部位に、ｐＵＣ１８−ＦＲＴ−ＭＬＳ２の１３７２ｂｐのＳｔｕＩ断片から、両側にＦＲＴ配列を有する抗生物質耐性ＭＬＳ遺伝子を導入した。得られたプラスミドのＢａｍＨＩ消化の後に得られたＵＰＰ削除カセットをｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＲＥＰΔＨＹＤ：：ｕｐｐプラスミドを得た。
【００８１】
このｐＲＥＰΔＨＹＤ：：ｕｐｐプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯ株を形質転換した。ペトリプレート（ＲＣＧＡ）上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むグリセロール液体合成培地で２４時間培養し、１００μｌの非希釈培養物をエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌと５−ＦＵ ４００μＭを含むＲＣＡ上にプレーティングした。エリスロマイシンと５−ＦＵの双方に耐性のあるコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＧＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングし、５−ＦＵ耐性にチアムフェニコール感受性も伴っているクローンを選択した。エリスロマイシン耐性で、チアムフェニコール感受性であるクローンの遺伝子型をＰＣＲ分析（ｈｙｄＡ削除カセットの外側に位置するプライマーＨＹＤ ０およびＨＹＤ ５を使用）により確認した。ｐＲＥＰΔＨＹＤ：：ｕｐｐが欠失したΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈΔｈｙｄＡ：：ｍｌｓＲ株を単離した。
【００８２】
ΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈΔｈｙｄＡ：：ｍｌｓＲを、Ｓ．セレビシエ由来のＦｌｐレコンビナーをコードするＦｌｐ１遺伝子を発現するｐＣＬＦ１．１ベクターで形質転換した。形質転換し、ペトリプレート上でチアムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した後、１つのコロニーを、チアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含む合成液体培地で培養し、適当な希釈物をチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡ上にプレーティングした。チアムフェニコール耐性クローンを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングした。エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるクローンの遺伝子型を、プライマーＨＹＤ ０とＨＹＤ ５を用いたＰＣＲ分析により確認した。ｐＣＬＦ１．１を消失させるため、エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈΔｈｙｄＡ株の２連続の２４時間培養を行った。ｐＣＬＦ１．１を消失したΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈΔｈｙｄＡ株を、エリスロマイシンとチアムフェニコールの双方に対するその感受性に従って単離した。
【００８３】
【表３】
【００８４】
実施例４：
１，３−プロパンジオール経路のフラックスが増強された株：Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ ｐＳＰＤ５の構築
より高いフラックスでグリセロールを１，３−プロパンジオールと酢酸へ変換する株を構築するために、本発明者らはオペロンとしてＣ．ブチリカム由来のＢ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路を発現するｐＳＰＤ５プラスミド（特許出願ＷＯ０１／０４３２４に記載）を導入する。このｐＳＰＤ５プラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：ＰＤＯΔｌｄｈ株を形質転換した。ペトリプレート（ＲＣＧＡ）上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）に耐性のあるクローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むグリセロール液体合成培地で２４時間培養し、ｐＳＰＤ５プラスミドの抽出に用い、その制限プロフィールにより特性決定した。
【００８５】
実施例５：
１，３−プロパンジオールとアセトンを生産する株：Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ ｐＳＯＳ９５ｔｈｌの構築
酢酸をアセトンへ変換する株を構築するために、合成アセトンオペロンを発現するｐＳＯＳ ９５ ｔｈｌプラスミドを構築した。この目的で、チオラーゼをコードするｔｈｌ遺伝子（Ｃ．アセトブチリカム由来）を、合成オペロンとしてｃｔｆＡＢ遺伝子とａｄｃ遺伝子を既に発現するｐＳＯＳ９５ベクター（ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ１８７６８６）のＢａｍＨＩ部位に導入した。このｔｈｌ遺伝子を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＴＨＬ １−ＴＨＬ ２を用い、１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、それぞれプライマーＴＨＬ １およびＴＨＬ ２によって２つの制限部位が導入された。ＢａｍｈＩで消化したｐＳＯＳ９５と連結した後、ｐＳＯＳ９５−ｔｈｌプラスミドを得た。
【００８６】
このｐＳＯＳ９５−ｔｈｌプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ株を形質転換した。ペトリプレート（ＲＣＧＡ）上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）に耐性のあるクローンを選択した後、１つのコロニーをエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むグリセロール液体合成培地で２４時間培養し、ｐＳＯＳ９５−ｔｈｌプラスミドの抽出に用い、その制限プロフィールにより特性決定した。
【００８７】
【表４】
【００８８】
実施例６：
１，３−プロパンジオール生産株のバッチ発酵
株をまず、嫌気性フラスコ培養のSoni et al (Soni et al, 1986, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:120-128)が記載している合成培地に２．５ｇ／ｌの酢酸アンモニウムを添加し、グルコースをグリセロールに置き換えたものにて分析した。３５℃での一晩培養物を用い、３０ｍｌ培養物をＯＤ６００が０．０５となるまで接種した。培養物を３５℃で３日間インキュベートした後、グリセロール、有機酸および１，３−プロパンジオールを、分離にＢｉｏｒａｄ ＨＰＸ ９７Ｈカラム、検出に屈折計を用い、ＨＰＬＣにより分析した。
【００８９】
次に、適当な表現型を有する株を、嫌気性バッチプロトコールを用い、３００ｍｌの発酵槽（ＤＡＳＧＩＰ）での生産条件下で試験した。
【００９０】
この目的で、発酵槽に２５０ｍｌの合成培地を満たし、窒素で３０分スパージし、２５ｍｌの前培地物を０．０５〜０．１の間の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）まで接種した。
【００９１】
培養温度は３５℃に一定維持し、ｐＨはＮＨ４ＯＨ溶液を用い、常に５．５に調節した。発酵中、振盪速度は３００ｒｐｍで維持した。
【００９２】
実施例７：
１，３−プロパンジオールおよび酢酸生産株の連続発酵
【００９３】
最良の１，３−プロパンジオールおよび酢酸生産株を、グルコースをグリセロールに置き換えたこと以外はSoni et al (Soni et al, 1987, Appl. Microbiol. Biotechnol.)が記載している合成培地中のケモスタット培養にて分析した。３５℃での一晩培養物を用い、嫌気性ケモスタットプロトコールを用いて、３００ｍｌの発酵槽（ＤＡＳＧＩＰ）に接種した。
【００９４】
この目的で、発酵槽に２５０ｍｌの合成培地を満たし、窒素で３０分スパージし、２５ｍｌの前培地物を０．０５〜０．１の間の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）まで接種した。３５℃、ｐＨ５．５（ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて調節）および振盪速度３００ｒｐｍで１２時間のバッチ培養の後、発酵培地を連続的に除去することにより容量を維持しつつ、希釈率０．０５ｈ−１で酸素不含合成培地を発酵槽に連続的に供給した。培養の安定性を、これまでに記載されているＨＰＬＣプロトコールを用いた生成物分析によって追跡した。
【００９５】
参照文献
Gonzalez-Pajuelo M, Meynial-Salles I, Mendes F, Andrade JC, Vasconcelos I, Soucaille P.
Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the industrial production of 1,3-propanediol from glycerol.
Metab Eng. 2005,;7:329-36..
Green EM, Boynton ZL, Harris LM, Rudolph FB, Papoutsakis ET, Bennett GN.
Genetic manipulation of acid formation pathways by gene inactivation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824.
Microbiology. 1996,142 :2079-86.
Soni B. K., Soucaille P. Goma G.
Continuous acetone butanol fermentation : influence of vitamins on the metabolic activity of Clostridium acetobutylicum.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. 27 : 1-5.
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、代謝的に操作されたクロストリジウムにより、グリセロールを１，３−プロパンジオールへ高収量で生物変換する方法を含む。
【０００２】
背景技術
１，３−プロパンジオールはポリエステル繊維の生産に用いられるモノマーであり、ポリウレタンおよび環状化合物の生産に有用である可能性もある。
【０００３】
１，３−プロパンジオールは、ｉ）アクロレイン水と水素から、ｉｉ）ホスフィンの存在下でエチレンオキシド一酸化炭素と水から、また、一酸化炭素の存在下でグリセロールと水素から、という異なる化学経路によって製造することができる。これらの方法は総て、一般にコストが高く、汚染物質を含有する廃流が生成する。
【０００４】
１，３−プロパンジオールは、種々のクロストリディア（Clostridia）によるグリセロールの発酵によって、酢酸／酪酸／乳酸／１，３−プロパンジオールの混合物として生産することができる。クロストリディア（Clostridia）におけるグリセロールの一般的な代謝を図１に示す。
【０００５】
１つの経路では、グリセロールは二段階の酵素反応で１，３−プロパンジオールへ変換される。第一段階では、グリセロールデヒドラターゼがグリセロールから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）と水への変換を触媒する。第二段階では、３−ＨＰＡがＮＡＤＨ依存性１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼによって１，３−プロパンジオールへと還元される。１，３−プロパンジオールを生産するクロストリディア（Clostridia）のほとんどは、ｄｈａＢ１Ｂ２Ｂ３構造遺伝子によりコードされているＢ１２依存性グリセロールデヒドラターゼを用いるが、クロストリジウム(Clostridum)・ブチリカムはｄｈａＢ１構造遺伝子によりコードされているＢ１２非依存性酵素を用いる。Ｂ１２依存性グリセロールデヒドラターゼでは、ｏｒｆＸおよびｏｒｆＺがグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードし、他方、唯一の既知Ｂ１２非依存性酵素では、ｄｈａＢ２がＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）依存性活性化因子をコードする。これらの構造因子および活性化因子をコードする遺伝子の近くには１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子も存在する。グリセロールからの１，３−プロパンジオール生産はＮＡＤＨを消費する。
【０００６】
別の経路では、グリセロールが１，３−プロパンジオールへ変換されない場合には、それは、それぞれｇｌｐｋおよびｇｌｐＡによりコードされているグリセロールキナーゼおよびグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼか、それぞれｄｈａＤおよびｄｈａＫ１Ｋ２によりコードされているグリセロールデヒドロゲナーゼの後にＤＨＡキナーゼのいずれかによってジヒドロキシアセトンリン酸(dihydrohycetone-phosphate)（ＤＨＡＰ）へと酸化され、ＮＡＤＨの生産を伴う。次に、ＤＨＡＰは解糖系へ入り、鍵となる中間体であるピルビン酸とアセチル−ＣｏＡの生成を伴う。ピルビン酸とアセチル−ＣｏＡは、それぞれｌｄｈ遺伝子によりコードされている乳酸デヒドロゲナーゼとａｄｈＥによりコードされている二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼによって乳酸およびエタノールへ還元される。また、アセチル−ＣｏＡは、
ｉ）それぞれｐｔｂおよびｂｕｋ遺伝子によりコードされているホスホトランスブチリラーゼおよび酪酸キナーゼによって酪酸へ変換可能であるか、または
ｉｉ）ａｄｈＥによりコードされている二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼによってブタノールへ還元可能である、
中間生成物ブチリル−ＣｏＡへの変換も可能である。
【０００７】
溶媒生成性のクロストリディア（Clostridia）では、アセトンは、アセト−アセチル−ＣｏＡ（ブチリル−ＣｏＡ生産の中間体）から、それぞれｃｔｆＡＢおよびａｄｃ遺伝子によりコードされているＣｏＡ−トランスフェラーゼおよびアセト酢酸デカルボキシラーゼによって生産される。水素はｈｙｄＡ遺伝子によりコードされている鉄単独ヒドロゲナーゼによって生産される。
【０００８】
天然クロストリディア（Clostridia）も組換えクロストリディア（Clostridia）も、酪酸（酪酸塩）、乳酸（乳酸塩）、エタノールまたはブタノールなどの還元化合物が同時に生成するために、１，３−プロパンジオールの最大収量はグリセロール１ｇ当たり０．５５ｇである。１，３−プロパンジオール生産の収量を高めるためには、総ての還元副生成物の生産を回避し、１，３−プロパンジオールの生産を酸化副生成物へ結びつけることが必要である。
【０００９】
酪酸を生産することができないクロストリジウム・アセトブチリカム株は既に文献に記載されている(Green et al., 1996)。この酪酸の形成は、非複製プラスミドとの１回の交叉によって得られるｂｕｋ遺伝子の不活性化のために劇的に低減されている。この変異株は、(Gonzalez-Pajuelo, 2005, Metabolic Engineering)に示されているように、１，３−プロパンジオールの生産に関して試験された。この組換え株は、主要な発酵生成物として１，３−プロパンジオールを効率的に生産するが、１，３−プロパンジオールの収量を低下させるブタノールも生産する。
【００１０】
クロストリディア（Clostridia）によるグリセロールの１，３−プロパンジオール発酵は、バッチ培養、フェッドバッチ培養または連続培養で行うことができる。
【００１１】
本発明により解決される課題は、グリセロールから１，３プロパンジオールを、酪酸、乳酸またはアルコールなどの還元化合物を同時に生成することなく、高収量で生物学的に製造することである。この製造はクロストリディア（Clostridia）による嫌気性発酵によって行われる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは上述の課題を解決した。本発明によれば、酪酸、乳酸、ブタノールおよびエタノールからなる群から選択されるグリセロール代謝の他の生成物を実質的に生産しないクロストリジウム株を、炭素源としてグリセロールを含んでなる適切な培養培地で培養すること、および１，３−プロパンジオールを回収することによる、１，３−プロパンジオールの嫌気的製造のための方法が提供される。
【００１３】
１，３−プロパンジオールは、グリセロール代謝の単一の酸化生成物とともに生産され得る。
【００１４】
本発明の特定の態様では、クロストリジウム株は、グリセロールからの１，３−プロパンジオール以外の代謝産物の生産（この生合成経路はＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを消費する）を制限するように改変されたものとされる。
【００１５】
本発明の一つの態様では、１，３−プロパンジオールを自然状態で生産するクロストリジウムが、
ｉ）酪酸の生産を回避するために酪酸キナーゼをコードする遺伝子（ｂｕｋ）またはホスホトランスブチリラーゼをコードする遺伝子（ｐｔｂ）、
ｉｉ）所望により、乳酸の生産を回避するために乳酸デヒドロゲナーゼをコードする（ｌｄｈ）遺伝子の全て、
ｉｉｉ）所望により、アルコールの形成を回避するために二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）をコードする遺伝子
を削除することにより、１，３−プロパンジオールを高収量で産生するように遺伝的に改変される。
【００１６】
本発明の別の態様では、自然状態で酪酸を生産するが、１，３−プロパンジオールを生産することができないクロストリジウムが、１，３−プロパンジオールを高収量で生産するように遺伝的に改変される。これは、酪酸経路に関与する酵素をコードするｐｔｂまたはｂｕｋ遺伝子を、Ｂ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードするＣ．ブチリカムのオペロンで置換し、
ｉ）所望により、乳酸の生産を回避するために乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）の全て、
ｉｉ）所望により、アルコールの生成を回避するために二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ）
を削除することによって達成される。
【００１７】
本発明のさらなる態様では、自然状態でエタノールを生産するが、１，３−プロパンジオールを生産することができないクロストリジウム(Clostridum)が、１，３−プロパンジオールを高収量で生産するように遺伝的に改変される。これは、エタノール経路に関与する酵素をコードするａｄｈＥ遺伝子の１つをＢ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードするＣ．ブチリカムのオペロンで置換し、
ｉ）所望により、乳酸の生産を回避するために乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）の全て、
ｉｉ）所望により、アルコールの生成を回避するために二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする残りの遺伝子（ａｄｈＥ）の全て
を削除することによって達成される。
【００１８】
本発明の別の態様では、ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｈｙｄＡ）を減弱することにより、水素生産のフラックスが低減され、そして、還元当量のフラックスが１，３−プロパンジオールの生産にふり向けられる。
【００１９】
本発明の別の態様では、１，３−プロパンジオール生産のフラックスが、Ｃ．ブチリカム由来の１，３−プロパンジオールオペロン（Ｂ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする）の追加のコピーを導入することにより増強される。
【００２０】
本発明の目的はまた、１，３−プロパンジオールの高収量での製造方法に有用な組換えクロストリジウム株を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本明細書に組み込まれ、その一部をなす添付図面は、本発明を具体的に例示するものであり、本明細書とともに本発明の原理を説明するものである。
【００２２】
【図１】種々のクロストリディア（Clostridia）の中枢代謝を示す。１：ピルビン酸−フェレドキシンオキシドレダクターゼ；２：チオラーゼ；３：β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；４：クロトナーゼ；５：ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；６：乳酸デヒドロゲナーゼ；７：ホスホトランスアセチラーゼ；８：酢酸キナーゼ；９：アセトアルデヒドエタノールデスヒドロゲナーゼ；１０：ヒドロゲナーゼ．；１１：ＣｏＡトランスフェラーゼ（アセトアセチル−ＣｏＡ：酢酸／酪酸：ＣｏＡトランスフェラーゼ）；１２：アセト酢酸デカルボキシラーゼ；１３：ホスホトランスブチリラーゼ；１４：酪酸キナーゼ；１５：ブチルアルデヒド−ブタノールデヒドロゲナーゼ；１６：グリセロールデヒドラターゼ；１７：１，３プロパンジオールデヒドロゲナーゼ
【発明の具体的説明】
【００２３】
本明細書において、特許請求の範囲および明細書の解説のために下記の用語を用いることがある。
【００２４】
「クロストリジウム」または「クロストリディア」とは、この科に属するあらゆる種類の細菌を指す。
【００２５】
適切な培養培地とは、具体的に用いるクロストリジウム株の増殖およびジオール生産のために最適化された培養培地を指す。
【００２６】
「炭素基質」または「炭素源」とは、基質が少なくとも１つの炭素原子を含む微生物によって代謝され得る任意の炭素源を意味する。本発明において、グリセロールが単一の炭素源である。
【００２７】
「微生物が改変されている」とは、その株がその遺伝的特徴を変化させることを目的に形質転換されていることを意味する。内在する遺伝子を減弱、削除または過剰発現させることができる。外来の遺伝子を導入したり、プラスミドによって運ばせたり、あるいはその株のゲノムに組み込み、細胞内で発現させたりすることができる。
【００２８】
「減弱」とは、遺伝子の発現の低下、または遺伝子の産物であるタンパク質の活性の低下を指す。当業者ならばこの結果を得るための多くの手段を知っており、例えば、
・遺伝子への、この遺伝子の発現レベルまたはコードされているタンパク質の活性レベルを低下させる変異の導入
・その遺伝子の天然プロモーターの、低い発現をもたらす低強度プロモーターとの置換
・対応するメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質を脱安定化する要素の使用
・発現が必要なければ、その遺伝子の欠失
がある。
【００２９】
「削除されている遺伝子」とは、その遺伝子のコード配列の実質的部分が除去されていることを意味する。好ましくは、コード配列の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％が除去されている。
【００３０】
本明細書において「プラスミド」または「ベクター」とは、細胞の中枢代謝の一部ではない遺伝子を、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態で運ぶことが多い染色体外要素を指す。
【００３１】
本発明の説明において、酵素はそれらの特異的活性によって同定される。従って、この定義には、他の生物、より詳しくは他の微生物にも存在する定義された特異的活性を有するあらゆるポリペプチドが含まれる。多くの場合、類似の活性を有する酵素は、ＰＦＡＭまたはＣＯＧとして定義される特定のファミリーへの分類によって同定することができる。
【００３２】
ＰＦＡＭ(protein families database of alignments and hidden Markov models; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列アラインメントの大きなコレクションを表す。各ＰＦＡＭは複数のアライメントの表示、タンパク質ドメインの表示、生物間の分布の評価、他のデータベースへのアクセス、および既知のタンパク質構造の表示を可能とする。
【００３３】
ＣＯＧ（clusters of orthologous groups of proteins; http://www.ncbi.nlm.nih. gov/COG/）は、３０の主要な系統発生的ラインを表す４３の完全に配列決定されたゲノムに由来するタンパク質配列を比較することによって得られる。各ＣＯＧは少なくとも３つのラインから定義され、これによりこれらによって保存されているドメインの同定が可能となる。
【００３４】
相同配列とそれらの相同％を特定する手段は当業者によく知られており、特に、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から使用可能なＢＬＡＳＴプログラム（このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターを使用）が挙げられる。次に、得られた配列を、例えば、プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.cbi.ac.uk/clustalw/)またはＭＵＬＴＡＬＩＮ(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)を用いて（これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターを使用）、活用（例えば、アライメント）することができる。
【００３５】
当業者ならば、既知の遺伝子に関してＧｅｎＢａｎｋで得られた参照番号を用い、他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおいて等価な遺伝子を決定することもできる。この慣用手段は、他の微生物から得られた遺伝子との配列アライメントを行い、別の生物で対応する遺伝子をクローニングするための縮重プローブをデザインすることによって決定できるコンセンサス配列を用いて行うのが有利である。これらの分子生物学の常法は当業者によく知られており、例えば、Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)に記載されている。
【００３６】
本発明によれば、酪酸、乳酸、ブタノールおよびエタノールからなる群から選択されるグリセロール代謝の他の生成物を実質的に生産しないクロストリジウム株を、炭素源としてグリセロールを含んでなる適切な培養培地で培養すること、および１，３−プロパンジオールを回収することによる、１，３−プロパンジオールの嫌気的製造のための方法が提供される。
【００３７】
「実質的に」とは、培養培地中にごく微量のグリセロールの生成物または還元物しか見られないことを意味する。微量とは、好ましくは１，３−プロパンジオールの回収方法を妨げない量、より好ましくは１０ｍＭ未満の量を意味する。
【００３８】
「グリセロール代謝」とは、細菌内で起こるグリセロールのあらゆる生化学的修飾を指す。これには有機の生合成（同化作用）およびそれらの分解（異化作用）が含まれる。ある代謝反応はＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨを消費し、またある代謝反応はＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨを生成する。クロストリジウム株におけるグリセロール代謝を図１に示す。代謝反応の中間体ならびに最終生成物を代謝産物と呼ぶ。
【００３９】
本発明の方法は、グリセロール代謝が１，３−プロパンジオール生産に向けられ、クロストリジウムによって１，３−プロパンジオールとともに酪酸、乳酸、ブタノール、エタノールなどのこの代謝経路からの他の還元生成物が生産されないことを特徴とする。実際、これらの還元生成物の生産は細胞のＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨストックを消費する。この消費を制限すれば、その還元力を１，３−プロパンジオールの生産にふり向けることができる。
【００４０】
本発明の特定の実施態様では、１，３−プロパンジオールは、酢酸、アセトンまたは二酸化炭素などのグリセロール代謝の単一の酸化生成物とともに生産される。「酸化生成物」とは、細胞のＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨストックを消費せずに産生される生成物を指す。
【００４１】
有利には、本方法で用いられるクロストリジウム株は、１，３−プロパンジオールと酢酸のみを生産するものとされる。
【００４２】
本発明によれば、クロストリジウム株は、その生合成経路がＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを消費する、１，３−プロパンジオール以外のグリセロール由来の代謝産物の生産を制限するように改変することができる。
【００４３】
有利には、この改変は、該代謝産物の生産に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の削除からなる。
【００４４】
特に、この酵素は、酪酸、乳酸、ブタノールおよびエタノールからなる群から選択される代謝産物の生産に関与するものとされる。
【００４５】
本発明の特定の実施態様では、クロストリジウムは、１，３−プロパンジオールの生合成に関与する酵素をコードする機能的内在遺伝子を含むので、自然状態で１，３−プロパンジオールを生産する。これらの遺伝子は、特に、グリセロールデヒドラターゼおよび１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼである。
【００４６】
この株は、ブチリル−ＣｏＡから酪酸への変換を遮断するためにホスホトランスブチリラーゼ（ｐｔｂ）または酪酸キナーゼ（ｂｕｋ）をコードする少なくとも１つの遺伝子を削除することにより、１，３−プロパンジオールを主生成物として生産するように遺伝的に改変することができる。
【００４７】
別の特定の実施態様では、クロストリジウムはまた、乳酸の生産を遮断するために乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）の全てが削除されている。
【００４８】
別の特定の実施態様では、クロストリジウムはまた、アルコールの生産を遮断するために二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ）の全てが削除されている。
【００４９】
クロストリディア（Clostridia）における遺伝子の削除は、ｉ）削除する遺伝子をエリスロマイシン耐性遺伝子で置換し、ｉｉ）ＦＬＰレコンビナーゼを発現させることによってそのエリスロマイシン耐性遺伝子を除去することを可能とする、最近、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載された方法を用いて行うことができる。
【００５０】
有利には、クロストリジウム株はＣ．ブチリカム(C. butyricum)およびＣ．パスツリアナム(C. pasteurianum)からなる群から選択される。
【００５１】
本発明の特定の実施態様では、クロストリジウム株は、１，３−プロパンジオールを生産可能なように改変されなければならない。この改変は、Ｂ−１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子の導入からなる。これらの遺伝子としては限定されるものではないが、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＴであり得る。
【００５２】
有利には、この株は、Ｂ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードするクロストリジウム・ブチリカムのオペロンを導入することにより改変される。染色体へのオペロンの挿入は、最近、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載された方法を用いて行うことができる。
【００５３】
本発明の特定の実施態様では、用いるクロストリジウム(Clostridum)株は自然状態で酪酸を生産するが、改変前には１，３−プロパンジオールを生産することができないものであり、この特定のクロストリジウムが、
ブチリル−ＣｏＡから酪酸への変換を遮断し、
この株においてグリセロールから１，３−プロパンジオールの生産を可能とする
目的で、酪酸の形成に関与する酵素、特にホスホトランスブチリラーゼ（ｐｔｂ）または酪酸キナーゼ（ｂｕｋ）をコードする少なくとも１つの遺伝子を、Ｂ−１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする１つの異種遺伝子で置換することによって１，３−プロパンジオールを生産するように遺伝的に改変される。染色体へのオペロンの挿入およびこれらの遺伝子の削除は、最近、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載された方法を用いて行うことができる。
【００５４】
好ましくは、このクロストリジウム株において、乳酸の生産を遮断するために乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）の全てが削除されている。
【００５５】
好ましくは、このクロストリジウム株において、アルコールの生産を阻害するために二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ）の全てが削除されている。
【００５６】
有利には、このクロストリジウム株は、Ｃ．アセトブチリカム(C. acetobutylicum)、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii)、Ｃ．サッカロペルブチルアセトニカム(C. saccharoperbutylacetonicum)、Ｃ．サッカロブチリカム(C. saccharobutylicum)、Ｃ．ブチリカムまたはＣ．セルロリチカム(C. cellulolyticum)からなる群から選択される。
【００５７】
本発明の特定の実施態様では、クロストリジウム(Clostridum)は自然状態でエタノールを生産するが、改変前には１，３−プロパンジオールを生産することができないものであり、この株が、二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子（ａｄｈＥ）をＢ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子で置換することによって１，３−プロパンジオールを生産するように遺伝的に改変される。好ましくは、この異種遺伝子はＢ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードするＣ．ブチリカムのオペロンである。
【００５８】
この置換は、
アセチル−ＣｏＡからエタノールへの変換の低下、および
グリセロールからの１，３−プロパンジオールの生産
をもたらす。
【００５９】
好ましくは、このクロストリジウム株において、乳酸の生産を阻害するために乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）の全てが削除されている。
【００６０】
好ましくは、このクロストリジウム株において、アルコールの生産を遮断するために二機能性アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ａｄｈＥ）の全てが削除されている。
【００６１】
クロストリジウム染色体へのオペロンの挿入および従前に挙げた遺伝子の削除は、最近、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載された方法を用いて行うことができる。
【００６２】
有利には、このクロストリジウム株は、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)、クロストリジウム・サッカロリチカム（現サーモアナエロバクター・サッカロリチカム(Thermoanaerobacter saccharolyticum)）、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス(Clostridium thermosulfurogenes)（現サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス(Thermoanaerobacter thermosulfurigenes)）またはクロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricum)（現サーモアナエロバクター・エタノリカス(Thermoanaerobacter ethanolicus)）からなる群から選択される。
【００６３】
本発明の特定の実施態様では、クロストリジウム株において、水素生産のフラックスが低減され、その結果、還元当量のフラックスが１，３−プロパンジオール生産にふり向けられる。これは、種々の手段、特に、水素生産の形での還元当量のシンクを提供する酵素であるヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｈｙｄＡ）を減弱することにより行うことができる。ｈｙｄＡの減弱は、天然プロモーターを低強度プロモーターで置換するか、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化する要素を用いることによって行うことができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列の部分的または完全な削除によって、遺伝子の完全な減弱を行うこともできる。
【００６４】
本発明の別の実施態様では、使用するクロストリジウム株は、１，３−プロパンジオール生産のフラックスの増強をもたらし、これは、Ｃ．ブチリカム由来の１，３−プロパンジオールオペロン（Ｂ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする）の追加のコピーを導入するか、プラスミドにより過剰発現させるか、または組換えクロストリジウムの染色体に組み込むことによって達成される。１，３−プロパンジオールオペロンの過剰発現のためには、例えば、ｐＳＰＤ５プラスミドを使用することができる。
【００６５】
本発明の別の態様において、クロストリジウム株は、酢酸からアセトンへの変換が可能なように改変される。この改変は、それぞれチオラーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼおよびアセト酢酸デカルボキシラーゼ（これらの酵素はＣ．アセトブチリカムおよびＣ．ベイジェリンキにおけるアセトンの形成に関与する）をコードするｔｈｌ、ｃｔｆＡＢおよびａｄｃ遺伝子を含む人工「アセトンオペロン」を微生物に導入することによって得ることができる。この人工オペロンはプラスミドに運ばせることもできるし、あるいは形質転換されたクロストリジウムの染色体に組み込むこともできる。
【００６６】
別の実施態様では、本発明により、
（ａ）発酵工程として、クロストリジウム株をグリセロールと接触させ、それにより１，３−プロパンジオールを生産すること、
（ｂ）１，３−プロパンジオールおよび所望によりグリセロール代謝の単一の酸化生成物を、蒸留によって単離すること
を含んでなる、１，３−プロパンジオールを高収量で発酵製造する方法が提供される。この発酵は一般に、少なくともグリセロールおよび必要であれば代謝産物の生産に必要な補助基質を含有する、用いる細菌に適合した既知の定義された組成の無機培養培地の入った発酵槽で行われる。
【００６７】
この方法はバッチ法ならびに連続法で実現可能である。当業者ならば、これらの各実験条件をどのように管理すればよいか、また、本発明の微生物のための培養条件をどのように定義すればよいかが分かる。特に、クロストリディア（Clostridia）は２０℃〜６０℃、好ましくは、中温性クロストリディア（Clostridia）では２５℃〜４０℃、好熱性クロストリディア（Clostridia）では４５〜６０℃で発酵させる。
【００６８】
本発明はまた、上記に記載されたような微生物に関する。好ましくは、この微生物は、Ｃ．ブチリカム、Ｃ．パスツリアナム、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．サッカロペルブチルアセトニカム、Ｃ．サッカロブチリカム、Ｃ．ブチリカム、Ｃ．セルロリチカム、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・サッカロリチカム（現サーモアナエロバクター・サッカロリチカム）、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス（現サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス）またはクロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム（現サーモアナエロバクター・エタノリカス）からなる群から選択される。
【実施例】
【００６９】
実施例１：
１，３−プロパンジオールを生産するが、酪酸およびブタノールを生産することができない組換えクロストリジウム・アセトブチリカム：Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯの構築
遺伝的に操作可能であり、ブタノールおよびアセトンを生産することができない株を得るために、本発明者らはまず、ｉ）グルコースＭＳ培地で２０回の継代培養を行い、寒天プレート（Sabathe et al (2003)が記載しているようにデンプン（２％）およびグルコース（０．２％）を含有する）上でデンプン加水分解の小さなハローを生じるクローンを選択してＣ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５１５Δｕｐｐ株を同定することで、Ｃ．アセトブチリカムΔｃａｃ１５１５Δｕｐｐ株（特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載）からｐＳＯＬ１メガプラスミドを救済した。ｂｕｋ遺伝子を削除し、Ｃ．ブチリカム由来の１，３−プロパンジオールオペロンを導入するために、Croux & Soucaille (2006)が特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載している相同組換え戦略を用いる。ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐベクターにおいてＣ．ブチリカム由来の１，３−プロパンジオールを組み込むｂｕｋ削除カセットは次のようにして構築した。
【００７０】
ｂｕｋ前後の２つのＤＮＡ断片を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＢＵＫ １−ＢＵＫ ２１とＢＵＫ ３１−ＢＵＫ ４を用い、２つのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。両プライマーＢＵＫ １およびＢＵＫ ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＢＵＫ ２１およびＢＵＫ ３１はｐｖｕＩＩ部位およびＮｒｕＩ部位を導入する相補的領域を有する。ＤＮＡ断片ＢＵＫ １−ＢＵＫ ２１とＢＵＫ ３１−ＢＵＫ ４を、プライマーＢＵＫ １およびＢＵＫ ４を用いたＰＣＲ融合実験で連結し、得られた断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、ｐＴＯＰＯ：ｂｕｋを得た。ｐＴＯＰＯ：ｂｕｋのユニークなｎｒｕＩ部位に、ｐＵＣ１８−ＦＲＴ−ＭＬＳ２の１３７２ｂｐのＳｔｕＩ断片から、両側にＦＲＴ配列を有する抗生物質耐性ＭＬＳ遺伝子を導入した。得られたプラスミドのＢａｍＨＩ消化の後に得られたＢＵＫ削除カセットをｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＲＥＰΔＢＵＫ：：ｕｐｐプラスミドを得た。ｐＲＥＰΔＢＵＫ：：ｕｐｐのユニークなｐｖｕＩＩ部位に、１，３−プロパンジオールオペロンを、ｐＳＰＤ５プラスミドの、４８５４ｂｐの平滑末端クレノウ処理したＳａｌＩ断片として導入した。
【００７１】
このｐＲＥＰΔＢＵＫ：：ＰＤＯ：：ｕｐｐプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５Δｕｐｐ株を形質転換した。ペトリプレート上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むグリセロール液体合成培地で２４時間培養し、１００μｌの非希釈培養物をエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌと５−ＦＵ ４００μＭを含むＲＣＧＡ（炭素源としてデンプンおよびグルコースがグリセロールで置換された強化クロストリジウム培地(Reinforced Clostridium medium where starch and glucose are replaced by glycerol as a carbon source)）上にプレーティングした。エリスロマイシンと５−ＦＵの双方に耐性のあるコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングし、５−ＦＵ耐性にチアムフェニコール感受性も伴っているクローンを選択した。エリスロマイシン耐性で、チアムフェニコール感受性であるクローンの遺伝子型をＰＣＲ分析（ｂｕｋ削除カセットの外側に位置するプライマーＢＵＫ ０およびＢＵＫ ５を使用）により確認した。ｐＲＥＰΔｂｕｋ：：ｕｐｐが欠失したΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯ：：ｍｌｓＲ株を単離した。
【００７２】
ΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯ：：ｍｌｓＲを、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)由来のＦｌｐレコンビナーをコードするＦｌｐ１遺伝子を発現するｐＣＬＦ１．１ベクターで形質転換した。形質転換し、ペトリプレート上でチアムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した後、１つのコロニーを、チアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含む合成液体培地で培養し、適当な希釈物をチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡ上にプレーティングした。チアムフェニコール耐性クローンを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングした。エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるクローンの遺伝子型を、プライマーＢＵＫ ０とＢＵＫ ５を用いたＰＣＲ分析により確認した。ｐＣＬＦ１．１を消失させるため、エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるΔｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ株の２連続の２４時間培養を行った。ｐＣＬＦ１．１を消失したΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯ株を、エリスロマイシンとチアムフェニコールの双方に対するその感受性に従って単離した。
【００７３】
【表１】
【００７４】
実施例２：
酪酸、アセトンおよび乳酸を生産することができない株：Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈの構築
ｌｄｈ遺伝子を削除するために、Croux & Soucaille (2006)が特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載している相同組換え戦略を用いる。この戦略によって、関連する遺伝子の大部分が削除されるとともにエリスロマイシン耐性カセットの挿入が可能となる。ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐにおけるｌｄｈ削除カセットは次のようにして構築した。
【００７５】
ｌｄｈ（ＣＡＣ２６７）前後の２つのＤＮＡ断片を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＬＤＨ １−ＬＤＨ ２とＬＤＨ ３−ＬＤＨ ４を用い、１１３５ｂｐと１１７７ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。両プライマーＬＤＨ １およびＬＤＨ ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＬＤＨ ２およびＬＤＨ ３はＳｔｕＩ部位を導入する相補的領域を有する。ＤＮＡ断片ＬＤＨ １−ＬＤＨ ２とＬＤＨ ３−ＬＤＨ ４を、プライマーＬＤＨ １およびＬＤＨ ４を用いたＰＣＲ融合実験で連結し、得られた断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、ｐＴＯＰＯ：ＬＤＨを得た。ｐＴＯＰＯ：ＬＤＨのユニークなＳｔｕＩ部位に、ｐＵＣ１８−ＦＲＴ−ＭＬＳ２の１３７２ｂｐのＳｔｕＩ断片から、両側にＦＲＴ配列を有する抗生物質耐性ＭＬＳ遺伝子を導入した。得られたプラスミドのＢａｍＨＩ消化の後に得られたＵＰＰ削除カセットをｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＲＥＰΔＬＤＨ：：ｕｐｐプラスミドを得た。
【００７６】
このｐＲＥＰΔＬＤＨ：：ｕｐｐプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯ株を形質転換した。ペトリプレート（ＲＣＧＡ）上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含む液体グリセロール合成培地で２４時間培養し、１００μｌの非希釈培養物をエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌと５−ＦＵ ４００μＭを含むＲＣＧＡ上にプレーティングした。エリスロマイシンと５−ＦＵの双方に耐性のあるコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＧＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＧＣＡの双方にレプリカプレーティングし、５−ＦＵ耐性にチアムフェニコール感受性も伴っているクローンを選択した。エリスロマイシン耐性で、チアムフェニコール感受性であるクローンの遺伝子型をＰＣＲ分析（ｌｄｈ削除カセットの外側に位置するプライマーＬＤＨ ０およびＬＤＨ ５を使用）により確認した。ｐＲＥＰΔＬＤＨ：：ｕｐｐが欠失したΔΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ：：ｍｌｓＲ株を単離した。
【００７７】
ΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ：：ｍｌｓＲ株を、Ｓ．セレビシエ由来のＦｌｐレコンビナーをコードするＦｌｐ１遺伝子を発現するｐＣＬＦ１．１ベクターで形質転換した。形質転換し、ペトリプレート上でチアムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した後、１つのコロニーを、チアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含む合成液体培地で培養し、適当な希釈物をチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡ上にプレーティングした。チアムフェニコール耐性クローンを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングした。エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるクローンの遺伝子型を、プライマーＬＤＨ ０とＬＤＨ ５を用いたＰＣＲ分析により確認した。ｐＣＬＦ１．１を消失させるため、エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ株の２連続の２４時間培養を行った。ｐＣＬＦ１．１を消失したΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ株を、エリスロマイシンとチアムフェニコールの双方に対するその感受性に従って単離した。
【００７８】
【表２】
【００７９】
実施例３：
低水素生産株：Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈΔｈｙｄＡの構築
ｈｙｄＡ遺伝子を削除するために、Croux & Soucaille (2006)が特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６９９７に記載している相同組換え戦略を用いる。この戦略によって、関連する遺伝子の大部分が削除されるとともにエリスロマイシン耐性カセットの挿入が可能となる。ｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐにおけるｈｙｄＡ削除カセットは次のようにして構築した。
【００８０】
ｈｙｄＡ（ＣＡＣ０２８）前後の２つのＤＮＡ断片を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＨＹＤ １−ＨＹＤ ２とＨＹＤ ３−ＨＹＤ ４を用い、１２６９ｂｐと１３１７ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ得た。両プライマーＨＹＤ １およびＨＹＤ ４はＢａｍＨＩ部位を導入し、プライマーＨＹＤ ２およびＨＹＤ ３はＳｔｕＩ部位を導入する相補的領域を有する。ＤＮＡ断片ＨＹＤ １−ＨＹＤ ２とＨＹＤ ３−ＨＹＤ ４を、プライマーＨＹＤ １およびＨＹＤ ４を用いたＰＣＲ融合実験で連結し、得られた断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、ｐＴＯＰＯ：ＨＹＤを得た。ｐＴＯＰＯ：ＨＹＤのユニークなＳｔｕＩ部位に、ｐＵＣ１８−ＦＲＴ−ＭＬＳ２の１３７２ｂｐのＳｔｕＩ断片から、両側にＦＲＴ配列を有する抗生物質耐性ＭＬＳ遺伝子を導入した。得られたプラスミドのＢａｍＨＩ消化の後に得られたＵＰＰ削除カセットをｐＣｏｎｓ：：ｕｐｐのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＲＥＰΔＨＹＤ：：ｕｐｐプラスミドを得た。
【００８１】
このｐＲＥＰΔＨＹＤ：：ｕｐｐプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯ株を形質転換した。ペトリプレート（ＲＣＧＡ）上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むグリセロール液体合成培地で２４時間培養し、１００μｌの非希釈培養物をエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌと５−ＦＵ ４００μＭを含むＲＣＡ上にプレーティングした。エリスロマイシンと５−ＦＵの双方に耐性のあるコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＧＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングし、５−ＦＵ耐性にチアムフェニコール感受性も伴っているクローンを選択した。エリスロマイシン耐性で、チアムフェニコール感受性であるクローンの遺伝子型をＰＣＲ分析（ｈｙｄＡ削除カセットの外側に位置するプライマーＨＹＤ ０およびＨＹＤ ５を使用）により確認した。ｐＲＥＰΔＨＹＤ：：ｕｐｐが欠失したΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈΔｈｙｄＡ：：ｍｌｓＲ株を単離した。
【００８２】
ΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈΔｈｙｄＡ：：ｍｌｓＲを、Ｓ．セレビシエ由来のＦｌｐレコンビナーをコードするＦｌｐ１遺伝子を発現するｐＣＬＦ１．１ベクターで形質転換した。形質転換し、ペトリプレート上でチアムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した後、１つのコロニーを、チアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含む合成液体培地で培養し、適当な希釈物をチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡ上にプレーティングした。チアムフェニコール耐性クローンを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡとチアムフェニコール５０μｇ／ｍｌを含むＲＣＡの双方にレプリカプレーティングした。エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるクローンの遺伝子型を、プライマーＨＹＤ ０とＨＹＤ ５を用いたＰＣＲ分析により確認した。ｐＣＬＦ１．１を消失させるため、エリスロマイシン感受性で、チアムフェニコール耐性であるΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈΔｈｙｄＡ株の２連続の２４時間培養を行った。ｐＣＬＦ１．１を消失したΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈΔｈｙｄＡ株を、エリスロマイシンとチアムフェニコールの双方に対するその感受性に従って単離した。
【００８３】
【表３】
【００８４】
実施例４：
１，３−プロパンジオール経路のフラックスが増強された株：Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ ｐＳＰＤ５の構築
より高いフラックスでグリセロールを１，３−プロパンジオールと酢酸へ変換する株を構築するために、本発明者らはオペロンとしてＣ．ブチリカム由来のＢ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路を発現するｐＳＰＤ５プラスミド（特許出願ＷＯ０１／０４３２４に記載）を導入する。このｐＳＰＤ５プラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：ＰＤＯΔｌｄｈ株を形質転換した。ペトリプレート（ＲＣＧＡ）上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）に耐性のあるクローンを選択した後、１つのコロニーを、エリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むグリセロール液体合成培地で２４時間培養し、ｐＳＰＤ５プラスミドの抽出に用い、その制限プロフィールにより特性決定した。
【００８５】
実施例５：
１，３−プロパンジオールとアセトンを生産する株：Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ ｐＳＯＳ９５ｔｈｌの構築
酢酸をアセトンへ変換する株を構築するために、合成アセトンオペロンを発現するｐＳＯＳ ９５ ｔｈｌプラスミドを構築した。この目的で、チオラーゼをコードするｔｈｌ遺伝子（Ｃ．アセトブチリカム由来）を、合成オペロンとしてｃｔｆＡＢ遺伝子とａｄｃ遺伝子を既に発現するｐＳＯＳ９５ベクター（ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ１８７６８６）のＢａｍＨＩ部位に導入した。このｔｈｌ遺伝子を、鋳型としてのＣ．アセトブチリカム由来の全ＤＮＡと２つの特異的オリゴヌクレオチド対とともにＰｗｏポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対ＴＨＬ １−ＴＨＬ ２を用い、１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、それぞれプライマーＴＨＬ １およびＴＨＬ ２によって２つの制限部位が導入された。ＢａｍｈＩで消化したｐＳＯＳ９５と連結した後、ｐＳＯＳ９５−ｔｈｌプラスミドを得た。
【００８６】
このｐＳＯＳ９５−ｔｈｌプラスミドを用い、エレクトロポレーションにより、Ｃ．アセトブチリカムΔｐＳＯＬ１Δｃａｃ１５ΔｕｐｐΔｂｕｋ：：ＰＤＯΔｌｄｈ株を形質転換した。ペトリプレート（ＲＣＧＡ）上でエリスロマイシン（４０μｇ／ｍｌ）に耐性のあるクローンを選択した後、１つのコロニーをエリスロマイシン４０μｇ／ｍｌを含むグリセロール液体合成培地で２４時間培養し、ｐＳＯＳ９５−ｔｈｌプラスミドの抽出に用い、その制限プロフィールにより特性決定した。
【００８７】
【表４】
【００８８】
実施例６：
１，３−プロパンジオール生産株のバッチ発酵
株をまず、嫌気性フラスコ培養のSoni et al (Soni et al, 1986, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:120-128)が記載している合成培地に２．５ｇ／ｌの酢酸アンモニウムを添加し、グルコースをグリセロールに置き換えたものにて分析した。３５℃での一晩培養物を用い、３０ｍｌ培養物をＯＤ６００が０．０５となるまで接種した。培養物を３５℃で３日間インキュベートした後、グリセロール、有機酸および１，３−プロパンジオールを、分離にＢｉｏｒａｄ ＨＰＸ ９７Ｈカラム、検出に屈折計を用い、ＨＰＬＣにより分析した。
【００８９】
次に、適当な表現型を有する株を、嫌気性バッチプロトコールを用い、３００ｍｌの発酵槽（ＤＡＳＧＩＰ）での生産条件下で試験した。
【００９０】
この目的で、発酵槽に２５０ｍｌの合成培地を満たし、窒素で３０分スパージし、２５ｍｌの前培地物を０．０５〜０．１の間の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）まで接種した。
【００９１】
培養温度は３５℃に一定維持し、ｐＨはＮＨ４ＯＨ溶液を用い、常に５．５に調節した。発酵中、振盪速度は３００ｒｐｍで維持した。
【００９２】
実施例７：
１，３−プロパンジオールおよび酢酸生産株の連続発酵
【００９３】
最良の１，３−プロパンジオールおよび酢酸生産株を、グルコースをグリセロールに置き換えたこと以外はSoni et al (Soni et al, 1987, Appl. Microbiol. Biotechnol.)が記載している合成培地中のケモスタット培養にて分析した。３５℃での一晩培養物を用い、嫌気性ケモスタットプロトコールを用いて、３００ｍｌの発酵槽（ＤＡＳＧＩＰ）に接種した。
【００９４】
この目的で、発酵槽に２５０ｍｌの合成培地を満たし、窒素で３０分スパージし、２５ｍｌの前培地物を０．０５〜０．１の間の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）まで接種した。３５℃、ｐＨ５．５（ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて調節）および振盪速度３００ｒｐｍで１２時間のバッチ培養の後、発酵培地を連続的に除去することにより容量を維持しつつ、希釈率０．０５ｈ−１で酸素不含合成培地を発酵槽に連続的に供給した。培養の安定性を、これまでに記載されているＨＰＬＣプロトコールを用いた生成物分析によって追跡した。
【００９５】
参照文献
Gonzalez-Pajuelo M, Meynial-Salles I, Mendes F, Andrade JC, Vasconcelos I, Soucaille P.
Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the industrial production of 1,3-propanediol from glycerol.
Metab Eng. 2005,;7:329-36..
Green EM, Boynton ZL, Harris LM, Rudolph FB, Papoutsakis ET, Bennett GN.
Genetic manipulation of acid formation pathways by gene inactivation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824.
Microbiology. 1996,142 :2079-86.
Soni B. K., Soucaille P. Goma G.
Continuous acetone butanol fermentation : influence of vitamins on the metabolic activity of Clostridium acetobutylicum.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. 27 : 1-5.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，３−プロパンジオールの嫌気的製造のための方法であって、
酪酸、乳酸、ブタノールおよびエタノールからなる群から選択されるグリセロール代謝の他の生成物を実質的に生産しないクロストリジウム株を、炭素源としてグリセロールを含んでなる適切な培養培地で培養すること、および１，３−プロパンジオールを回収することによる、方法。
【請求項２】
１，３−プロパンジオールがグリセロール代謝の単一の酸化生成物とともに生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グリセロール代謝の単一の酸化生成物が、酢酸、アセトンまたは二酸化炭素からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
クロストリジウム株が、グリセロールから１，３−プロパンジオールと酢酸のみを生産するものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
クロストリジウム株が、グリセロールからの１，３−プロパンジオール以外の代謝産物の生産（この生合成経路はＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを消費する）を制限するように改変されたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記代謝産物の生産に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が削除されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子が、酪酸、乳酸、ブタノールおよびエタノールからなる群から選択される代謝産物の生産に関与する酵素をコードするものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
クロストリジウム株が、１，３−プロパンジオールの生産のための機能的内因性遺伝子を含むものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
クロストリジウムが、酪酸の形成に関与する下記：
・ホスホトランスブチリラーゼをコードするｐｔｂ
・酪酸キナーゼをコードするｂｕｋ
から選択される少なくとも１つの遺伝子を与えるものであり、それが削除されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
乳酸デヒドロゲナーゼをコードする全てのｌｄｈ遺伝子が削除されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする全てのａｄｈＥ遺伝子が削除されている、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
クロストリジウム株がＣ．ブチリカムおよびＣ．パスツリアナムからなる群から選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
クロストリジウム株が、Ｂ−１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を導入することによって、１，３−プロパンジオールを生産するように改変されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記株が、Ｂ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードするクロストリジウム・ブチリカムのオペロンを導入することによって改変されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
改変前のクロストリジウム株が酪酸を生産することができるものであり、酪酸の形成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を置換するために少なくとも１つの前記異種遺伝子が導入される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
酪酸の形成に関与する酵素をコードする遺伝子が、
・ホスホトランスブチリラーゼをコードするｐｔｂ
・酪酸キナーゼをコードするｂｕｋ
から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
乳酸デヒドロゲナーゼをコードする全てのｌｄｈ遺伝子が削除されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする全てのａｄｈＥ遺伝子が削除されている、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
クロストリジウム株が、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．サッカロペルブチルアセトニカム、Ｃ．サッカロブチリカム、Ｃ．ブチリカムまたはＣ．セルロリチカムからなる群から選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
改変前のクロストリジウム株がエタノールを生産することができるものであり、エタノールの形成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を置換するために少なくとも１つの前記異種遺伝子が導入される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項２１】
エタノールの形成に関与する酵素をコードする遺伝子が、アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードするａｄｈＥ遺伝子から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
乳酸デヒドロゲナーゼをコードする全てのｌｄｈ遺伝子が削除されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする残りの全てのａｄｈＥ遺伝子が削除されている、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
クロストリジウム株が、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・サッカロリチカム（現サーモアナエロバクター・サッカロリチカム）、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス（現サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス）またはクロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム（現サーモアナエロバクター・エタノリカス）からなる群から選択される、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
水素フラックスが低減され、その還元力が１，３プロパンジオールの生産にふり向けられる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ｈｙｄＡ遺伝子が減弱されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
微生物が、酢酸をアセトンへ変換するように改変されている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
アセトンの形成に関与する酵素をコードする遺伝子が外因性であり、クロストリジウム株に導入されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
・１，３プロパンジオールを生産する微生物を発酵させる工程、
・１，３プロパンジオールおよび所望によりグリセロール代謝の単一の酸化生成物を、蒸留により単離する工程
を含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の１，３プロパンジオールの発酵製造のための方法。
【請求項３０】
培養が連続的である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
培養がバッチでなされる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜２８のいずれか一項において定義されている、微生物。
【請求項１】
１，３−プロパンジオールの嫌気的製造のための方法であって、
酪酸、乳酸、ブタノールおよびエタノールからなる群から選択されるグリセロール代謝の他の生成物を実質的に生産しないクロストリジウム株を、炭素源としてグリセロールを含んでなる適切な培養培地で培養すること、および１，３−プロパンジオールを回収することによる、方法。
【請求項２】
１，３−プロパンジオールがグリセロール代謝の単一の酸化生成物とともに生産される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グリセロール代謝の単一の酸化生成物が、酢酸、アセトンまたは二酸化炭素からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
クロストリジウム株が、グリセロールから１，３−プロパンジオールと酢酸のみを生産するものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
クロストリジウム株が、グリセロールからの１，３−プロパンジオール以外の代謝産物の生産（この生合成経路はＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを消費する）を制限するように改変されたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記代謝産物の生産に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が削除されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子が、酪酸、乳酸、ブタノールおよびエタノールからなる群から選択される代謝産物の生産に関与する酵素をコードするものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
クロストリジウム株が、１，３−プロパンジオールの生産のための機能的内因性遺伝子を含むものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
クロストリジウムが、酪酸の形成に関与する下記：
・ホスホトランスブチリラーゼをコードするｐｔｂ
・酪酸キナーゼをコードするｂｕｋ
から選択される少なくとも１つの遺伝子を与えるものであり、それが削除されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
乳酸デヒドロゲナーゼをコードする全てのｌｄｈ遺伝子が削除されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする全てのａｄｈＥ遺伝子が削除されている、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
クロストリジウム株がＣ．ブチリカムおよびＣ．パスツリアナムからなる群から選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
クロストリジウム株が、Ｂ−１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を導入することによって、１，３−プロパンジオールを生産するように改変されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記株が、Ｂ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードするクロストリジウム・ブチリカムのオペロンを導入することによって改変されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
改変前のクロストリジウム株が酪酸を生産することができるものであり、酪酸の形成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を置換するために少なくとも１つの前記異種遺伝子が導入される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
酪酸の形成に関与する酵素をコードする遺伝子が、
・ホスホトランスブチリラーゼをコードするｐｔｂ
・酪酸キナーゼをコードするｂｕｋ
から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
乳酸デヒドロゲナーゼをコードする全てのｌｄｈ遺伝子が削除されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする全てのａｄｈＥ遺伝子が削除されている、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
クロストリジウム株が、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．サッカロペルブチルアセトニカム、Ｃ．サッカロブチリカム、Ｃ．ブチリカムまたはＣ．セルロリチカムからなる群から選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
改変前のクロストリジウム株がエタノールを生産することができるものであり、エタノールの形成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を置換するために少なくとも１つの前記異種遺伝子が導入される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項２１】
エタノールの形成に関与する酵素をコードする遺伝子が、アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードするａｄｈＥ遺伝子から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
乳酸デヒドロゲナーゼをコードする全てのｌｄｈ遺伝子が削除されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードする残りの全てのａｄｈＥ遺伝子が削除されている、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
クロストリジウム株が、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・サッカロリチカム（現サーモアナエロバクター・サッカロリチカム）、クロストリジウム・サーモスルフロゲネス（現サーモアナエロバクター・サーモスルフリゲネス）またはクロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム（現サーモアナエロバクター・エタノリカス）からなる群から選択される、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
水素フラックスが低減され、その還元力が１，３プロパンジオールの生産にふり向けられる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ｈｙｄＡ遺伝子が減弱されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
微生物が、酢酸をアセトンへ変換するように改変されている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
アセトンの形成に関与する酵素をコードする遺伝子が外因性であり、クロストリジウム株に導入されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
・１，３プロパンジオールを生産する微生物を発酵させる工程、
・１，３プロパンジオールおよび所望によりグリセロール代謝の単一の酸化生成物を、蒸留により単離する工程
を含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の１，３プロパンジオールの発酵製造のための方法。
【請求項３０】
培養が連続的である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
培養がバッチでなされる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜２８のいずれか一項において定義されている、微生物。
【図１】
【公表番号】特表２０１０−５０８０１３（Ｐ２０１０−５０８０１３Ａ）
【公表日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３３６６９（Ｐ２００９−５３３６６９）
【出願日】平成１８年１０月３１日（２００６．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６７９８７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５２５９５
【国際公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【出願人】（５０５３１１９１７）メタボリック エクスプローラー (26)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月３１日（２００６．１０．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６７９８７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５２５９５
【国際公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【出願人】（５０５３１１９１７）メタボリック エクスプローラー (26)
【Ｆターム（参考）】
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