シクロスポリンアルキンおよびそれらの医用薬剤としての有用性
本発明の化合物は、本明細書において定義されるX、R0、およびR1を有する、式（I）において見出される化学構造またはその薬学的に許容される塩によって示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規なシクロスポリンアルキンならびに免疫抑制剤としておよびその他の疾患の処置に対する薬学的薬剤としてのそれらの有用性を開示する。そのような化合物の調製に対する方法も開示される。なお、本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2004年10月6日に出願された米国特許仮出願第60/616,591号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
真菌トリポクラジウム・インフラタム（Tolypocladium inflatum）から単離され、ネオラル（登録商標）およびサンディミュン（登録商標）（Novartis, Basel, Switzerland）として現在販売されている、中性環式ウンデカペプチドであるシクロスポリンA（CsA）は、器官移植拒絶の予防に対して広範に使用されている。シクロスポリンAは、シクロフィリンペプチジプロリルシス/トランスイソメラーゼに結合することによって分子レベルでその免疫抑制効果を発揮する。結果として生じるシクロスポリンAおよびシクロフィリンの複合体は、Ca2+/カルモジュリン依存性ホスファターゼであるカルシニューリンに結合し、そのホスファターゼ活性を阻害する。カルシニューリンは、転写因子、活性化T細胞の核因子（NFAT）の移動およびT細胞増殖に必要な初期遺伝子のその後の発現を調節する。シクロスポリンA-シクロフィリン複合体によるカルシニューリンのホスファターゼ活性の阻害は、NFAT核局在を妨げ、IL-2などの遺伝子の発現を抑制し、最終的に免疫抑制をもたらす（Matsuda et al.,「Mechanisms of Action of Cyclosporin」, Immunopharmacology, 47:119-125 (2000)（非特許文献1））。
【０００３】
シクロスポリンAは、慢性関節リウマチ、クローン病、乾癬などの自己免疫疾患、および喘息などの慢性炎症性疾患の処置における潜在的な治療的応用も有する。残念ながら、これらの兆候に対する臨床的実用性は、シクロスポリンAの臨床的有効用量とともに生じる腎臓毒性、高血圧、肝毒性、貧血、および胃腸過敏症などの副作用のために、実現されていない。シクロスポリンAに関連する毒性は、免疫抑制治療領域で働く多くの専門家によって、メカニズムに基づいていると信じられている（Lazarova et al.,「Cyclosporin A Analogues: Recent Advances」, Expert Opin. Ther. Patents, 13:1327-1332 (2003)（非特許文献2））。実際、改善された治療指数を有する新規なシクロスポリン類縁体を発見する目標は、この30年にわたるこの薬物発見領域における顕著な努力にもかかわらず、まだ達成されていない（Bollinger et al.の米国特許第5,525,590号（特許文献1）；Boelsterli et al.の米国特許第5,643,870号（特許文献2）；Rich et al.の米国特許第5,639,852号（特許文献3）；Duretteの米国特許第5,236,899号（特許文献4）；Patchett et al.の米国特許第5,122,511号（特許文献5）；Dumont et al.の米国特許第4,914,188号（特許文献6）；Seebachの米国特許第4,771,122号（特許文献7）；Wengerの米国特許第4,764,503号（特許文献8）；Wengerの米国特許第4,396,542号（特許文献9）；Ruegger et al.の米国特許第4,210,581号（特許文献10））。
【０００４】
強力な免疫抑制活性および減少した毒性を有する新規なシクロスポリン類縁体を見出すためのより最近の試みは、進行中であり、ISATX247などの化合物をもたらした。前臨床観測は、ISATX247が、移植拒絶の予防に対して市場においてすでに利用できるそのクラスにおけるその他の免疫抑制剤よりも有意により強力でかつ毒性が低いという潜在性を有することを示す。ISATX247は、移植手術後の器官拒絶の予防および乾癬の処置に対するフェーズII臨床試験にある（Abel et al.,「ISATX247: A Novel Calcineurin Inhibitor」, J. Heart Lung Transplant, 20:161 (2001)（非特許文献3）; Aspeslet et al.,「ISATX247: A Novel Calcineurin Inhibitor」, Transplantation Proceedings, 33:1048-1051 (2001)（非特許文献4）; Naicker et al.の米国特許第6,605,593号（特許文献11）および第6,613,739号（特許文献12））。
【０００５】
自己免疫疾患（Or et al.の国際公開公報第03/033010号（特許文献13））および喘息などの呼吸器疾患（Or et al.の国際公開公報第02/069902号（特許文献14））の処置に対して使用される免疫抑制性シクロスポリンA誘導体の毒性を最小にしようとする「ソフトな」薬物アプローチ（Lazarova et al.,「Synthesis and Biological Evaluation of Cyclosporin A Analogues: Potential Soft Drugs for the Treatment of Autoimmune Diseases」, J. Med. Chem., 46:674-676 (2003)（非特許文献5））も、最近記載されている。
【０００６】
改善された治療指標を有する新規なシクロスポリン類縁体が、いまだに大いに必要とされている。
【０００７】
本発明は、これらの目的を達成することを目的とする。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,525,590号
【特許文献２】米国特許第5,643,870号
【特許文献３】米国特許第5,639,852号
【特許文献４】米国特許第5,236,899号
【特許文献５】米国特許第5,122,511号
【特許文献６】米国特許第4,914,188号
【特許文献７】米国特許第4,771,122号
【特許文献８】米国特許第4,764,503号
【特許文献９】米国特許第4,396,542号
【特許文献１０】米国特許第4,210,581号
【特許文献１１】米国特許第6,605,593号
【特許文献１２】米国特許第6,613,739号
【特許文献１３】国際公開公報第03/033010号
【特許文献１４】国際公開公報第02/069902号
【非特許文献１】Matsuda et al.,「Mechanisms of Action of Cyclosporin」, Immunopharmacology, 47:119-125 (2000)
【非特許文献２】Lazarova et al.,「Cyclosporin A Analogues: Recent Advances」, Expert Opin. Ther. Patents, 13:1327-1332 (2003)
【非特許文献３】Abel et al.,「ISATX247: A Novel Calcineurin Inhibitor」, J. Heart Lung Transplant, 20:161 (2001)
【非特許文献４】Aspeslet et al.,「ISATX247: A Novel Calcineurin Inhibitor」, Transplantation Proceedings, 33:1048-1051 (2001)
【非特許文献５】Lazarova et al.,「Synthesis and Biological Evaluation of Cyclosporin A Analogues: Potential Soft Drugs for the Treatment of Autoimmune Diseases」, J. Med. Chem., 46:674-676 (2003)
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明の化合物は下記の式Iまたはその薬学的に許容される塩によって表される：
式I
式中、
XはOHまたはOAcであり；
R0はH、CH2OH、またはCH2OR2であり；
R1は下記からなる群より選択され：
水素；
ハロゲン；
C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
一つまたは複数の重水素、ハロゲン、窒素、硫黄、およびケイ素原子からなる群より選択される一つまたは複数の置換を含む、C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
アルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸エステル、およびアミドからなる群より選択される一つまたは複数の官能基を含む、C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
アリールまたはヘテロアリールを含む、C2-C4飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6置換および無置換シクロアルキル；
置換および無置換アリール；
置換および無置換ヘテロアリール；
-CH2OH；
-CHO；
-CH=N-OR3；および
-CH=N-NR3R4；
R2は下記からなる群より選択され：
アルカノイル；
アルケノイル；
アルキノイル；
アリーロイル；
アリールアルカノイル；
アルキルアミノカルボニル；
アリールアミノカルボニル；
アリールアルキルアミノカルボニル；
アルキルオキシカルボニル；
アリールオキシカルボニル；および
アリールアルキルオキシカルボニル；
R3またはR4は同じまたは異なり、下記からなる群より独立に選択され：
水素；
C1-C6飽和の直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6不飽和の直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6-置換および無置換シクロアルキル；
アリールまたはヘテロアリールを含むC1-C4炭素鎖；
置換および無置換アリール；
置換および無置換ヘテロアリール；
アルカノイル：
アルケノイル；
アルキノイル；
アリーロイル；
アリールアルカノイル；
アルキルアミノカルボニル；
アリールアミノカルボニル；
アリールアルキルアミノカルボニル；
アルキルオキシカルボニル；
アリールオキシカルボニル；および
アリールアルキルオキシカルボニル；ならびに
R3はR4と一緒になって、一つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよいC2-C6の環状部分を形成する。
【００１０】
本発明は、シクロスポリンAの一位アミノ酸の側鎖上に炭素-炭素三重結合および任意で三位アミノ酸上に置換を含む化学的に修飾されたシクロスポリン類縁体を開示する。特に、本発明は、アリールとの炭素-炭素三重結合、炭素-窒素二重結合、または他の炭素-炭素三重結合の共役系を含む新規なシクロスポリンアルキン類縁体を開示する。
【００１１】
本発明は、免疫抑制剤として効果的である新規なシクロスポリン類縁体を提供する。本発明のいくつかの化合物は、シクロスポリンAよりも強化された免疫抑制活性を保有する。これらの化合物は、眼アレルギーおよびドライアイ、ならびに喘息、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、および潰瘍性大腸炎などの自己免疫および慢性炎症性疾患の処置における実用性も保有する。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の化合物は下記の式Iまたはその薬学的に許容される塩によって表される：
式I
式中、
XはOHまたはOAcであり；
R0はH、CH2OH、またはCH2OR2であり；
R1は下記からなる群より選択され：
水素；
ハロゲン；
C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
一つまたは複数の重水素、ハロゲン、窒素、硫黄、およびケイ素原子からなる群より選択される一つまたは複数の置換を含む、C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
アルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸エステル、およびアミドからなる群より選択される一つまたは複数の官能基を含む、C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
アリールまたはヘテロアリールを含む、C2-C4飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6置換および無置換シクロアルキル；
置換および無置換アリール；
置換および無置換ヘテロアリール；
-CH2OH；
-CHO；
-CH=N-OR3；および
-CH=N-NR3R4；
R2は下記からなる群より選択され：
アルカノイル；
アルケノイル；
アルキノイル；
アリーロイル；
アリールアルカノイル；
アルキルアミノカルボニル；
アリールアミノカルボニル；
アリールアルキルアミノカルボニル；
アルキルオキシカルボニル；
アリールオキシカルボニル；および
アリールアルキルオキシカルボニル；
R3またはR4は同じまたは異なり、下記からなる群より独立に選択され：
水素；
C1-C6飽和の直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6不飽和の直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6-置換および無置換シクロアルキル；
アリールまたはヘテロアリールを含むC1-C4炭素鎖；
置換および無置換アリール；
置換および無置換ヘテロアリール；
アルカノイル：
アルケノイル；
アルキノイル；
アリーロイル；
アリールアルカノイル；
アルキルアミノカルボニル；
アリールアミノカルボニル；
アリールアルキルアミノカルボニル；
アルキルオキシカルボニル；
アリールオキシカルボニル；および
アリールアルキルオキシカルボニル；ならびに
R3はR4と一緒になって、一つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよいC2-C6の環状部分を形成する。
【００１３】
本発明の一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がHである、前述の式Iの化合物である。
【００１４】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がF、Cl、Br、およびIからなる群より選択される、前述の式Iの化合物である。
【００１５】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がCH=CH2、CH=CHCH3、CH=CHCH2CH3、C(CH3)=CH2、CH=CD2、CH=CHCD3、およびCH=CDCD3からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、前述の式Iの化合物である。
【００１６】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がCH=CHF、CH=CHCl、CH=CHBr、CH=CHI、CH=CF2、およびCH=CCl2からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、前述の式Iの化合物である。
【００１７】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がC≡CH、C≡CCH3、C≡CCD3、C≡CCH2CH3、C≡CCH2CH2CH3、およびC≡C-シクロプロピルからなる群より選択される、前述の式Iの化合物である。
【００１８】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がCH2C≡CH、CH2C≡CCH3、CH2C≡CCH2CH3、CH2CH=CH2、CH2CH=CHCH3、およびCH2CH=CHCH2CH3からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、前述の式Iの化合物である。
【００１９】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がC≡C-C≡CH、C≡C-C≡CCH3、C≡CCH=CH2、C≡CCH=CHCH3、CH=CHC≡CH、CH=CHC≡CCH3、CH=CHCH=CH2、およびCH=CHCH=CHCH3からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、前述の式Iの化合物である。
【００２０】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がシクロプロピルである、前述の式Iの化合物である。
【００２１】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がCH2OH、-CHO、CH(OH)CH3、C(=O)CH3、CH=N-OCH3、CH=N-OCH2CH3、CH=N-NHCH3、およびCH=N-N(CH3)2からなる群より選択される、前述の式Iの化合物である。
【００２２】
本発明の他の態様は、X=OHまたはOAc；R0=H；かつR1がH、C6H5-、p-FC6H4-、p-CH3OC6H4-、2-チオフェニル、CH2Ph、CH2CH=CH2、CH2C≡CH、CH2C≡CHCH3、CH2C≡CHSi(CH3)3、Br、CH2Cl、CH=CH2、CH=CHCH3（トランス）、CH=CHCH3（シス）、CH=CHCl（トランス）、CH=CHCl（シス）、CH=CHSi(CH3)3（トランス）、C(CH3)=CH2、CH=CHPh、CH=CHCO2Et（シス）、CH=C=CH2、C≡CH、C≡CCH3、C≡CCD3、C≡CCH2CH3、C≡CC4H9、C≡CSi(CH3)3、C≡C-3-チオフェン、C≡C-Ph、C≡CBr、C≡C-シクロプロピル、C≡C-シクロヘキシル、C≡CCH2OH、C≡CCH2OCH3、C≡CCH2SCH2CH3、C≡CCH2N(CH3)2、C≡CCH=CH2、C≡CC(CH3)=CH2、C≡CCH=CHCH3（シス）、C≡CCH=CHCH3（トランス）、CH=CHC≡CH、CH=CHC≡CCH2CH2CH3、CH=CHC≡C-シクロプロピル、CH2OH、CHO、C=N-OCH3、およびC=N-N(CH3)2からなる群より選択される、前述の式Iの化合物を含む。
【００２３】
本発明の他の態様は、X=OHまたはOAc；R0=CH2OHまたはCH2OAc；かつR1がH、CH=CH2、CH=CHCH3（シス）、CH=CHCH3（トランス）、およびCH=CHCl（シス）からなる群より選択される、前述の式Iの化合物を含む。
【００２４】
特に、本発明は、シクロスポリンAの1位アミノ酸の側鎖に炭素-炭素三重結合と、任意で3位アミノ酸に置換を含む、新規シクロスポリン類縁体に関する。特に、本発明は、アリール、もしくはヘテロアリール、もしくは炭素-炭素二重結合、もしくは炭素-窒素二重結合、もしくは別の炭素-炭素三重結合と共役している炭素-炭素三重結合が組み込まれている、新規シクロスポリンアルキン類縁体に関する。
【００２５】
炭素-炭素三重結合は多くの天然物中に存在する（Gung et al, 「Total Synthesis of (S)-(-)-(E)-15,16-Dihydrominquartynoic Acid: A Highly Potent Anticancer Agent」, J. Org. Chem., 69:3488-3492 (2004)；Ito et al., 「Cytotoxic Polyacetylenes from the Twigs of Ochanostachys amentacea」, J. Nat. Prod., 64:246-248 (2001)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。アルキンを医用薬剤として用いることは周知である。しかし、シクロスポリンAの1位アミノ酸の側鎖における炭素-炭素二重結合が炭素-炭素三重結合で置き換えられている、一つのシクロスポリンアルキンだけが文献で知られている。残念なことに、この改変はシクロスポリンAの免疫抑制活性を著しく低下させ、この公知のシクロスポリンアルキンは、シクロスポリンAに比べてわずか10％の相対免疫抑制活性しか示さない（Rich et al., 「Synthesis, Conformation, and Immunosuppressive Activities of Three Analogues of Cyclosporin A Modified in the 1-Position」, J. Med. Chem., 33:999-1009 (1990)。これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。これとは対照的に、炭素-炭素三重結合と炭素-炭素二重結合または炭素-炭素三重結合との共役系を含む、本発明の新規シクロスポリンアルキン類縁体は、シクロスポリンAよりも高い免疫抑制活性を有する。
【００２６】
本発明は、式Iで表される化合物の調製法も開示する。
【００２７】
本発明の化合物調製のための出発原料はシクロスポリンAである。シクロウンデカペプチドであるシクロスポリンAの構造、および環内の各アミノ酸の位置の番号づけを以下に示す：
シクロスポリンA（CsA）
【００２８】
シクロスポリンAは下記の式IIaで表すこともできる：
式IIa
【００２９】
本発明の新規シクロスポリン類縁体は、シクロスポリンAまたはシクロスポリンAの3位アミノ酸での改変により調製された鍵となる中間体であるシクロスポリンジオール（式IIb）から誘導される。スキーム1に示すとおり、シクロスポリンジオール中間体は、シクロスポリンAのリチウムジイソプロピルアミド（LDA）による脱プロトン化と、続くホルムアルデヒド処理により調製することができる（Seebach et al, 「Modification of Cyclosporin A: Generation of an Enolate at the Sarcosine Residue and Reaction with Electrophiles」, Helv. Chim. Acta, 76:1564-1590 (1993)。これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
スキーム1
【００３０】
本発明の一つの態様に従い、新規シクロスポリン類縁体は、シクロスポリンAの1位アミノ酸の側鎖における炭素-炭素二重結合を炭素-炭素三重結合で置き換えることにより調製することができる。スキーム2に示すとおり、シクロスポリンA（式IIa）または式IIbのシクロスポリンジオール中間体の無水酢酸によるアセチル化と、続く二重結合のオゾンによる酸化的切断により、式IIIのシクロスポリンアルデヒドを順調に生成する。式IIIのシクロスポリンアルデヒドをメタノール中、炭酸カリウム存在下、(1-ジアゾ-2-オキソプロピル)ホスホン酸ジメチルで処理することにより、シクロスポリンアルキン（式I、X=OH）を良好な収率で生成する（Muller et al, 「An Improved One-Pot Procedure for the Synthesis of Alkynes from Aldehydes」, Synlett, 521-522 (1996)。これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。アセチル保護基をこれらの反応条件下で除去して、遊離アルコールを直接得ることができる。
スキーム2
【００３１】
式IIIのシクロスポリンアルデヒドを、別法により式Iのシクロスポリンアルキン（X=OHまたはOAc）に変換することもできる（スキーム2）。シクロスポリンアルデヒドのリチオトリメチルシリルジアゾメタン処理により、式Iのシクロスポリンアルキン（X=OH、R0=HまたはCH2OH）が良好な収率で生成する（Ohira et al, 「Generation of Alkylidenecarbenes by the Alkenation of Carbonyl Compounds with Lithiotrimethylsilyldiazomethane」, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 721-722 (1992)。これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）一方、シクロスポリンアルデヒドのリチオトリメチルシリルジアゾメタンとの反応と、続く酸性後処理（Ac2O）により、式Iのアセチルシクロスポリンアルキン（X=OAc、R0=HまたはCH2OAc）が生じる。
【００３２】
前述のシクロスポリンアルキン（式I、X=OH）を鍵となる中間体として用いて、多くのシクロスポリンアルキン誘導体をパラジウムまたはニッケル仲介性カップリングにより調製することができる。スキーム3に示すとおり、シクロスポリンアルキン（式I）と、様々なハロゲン化アリール、ハロゲン化ヘテロアリール、およびハロゲン化ビニルとのソノガシラカップリングにより、それぞれ式IVの新規シクロスポリンアリール化アルキンおよび式Vのシクロスポリンイン-エン類縁体が生成する。同様に、パラジウム触媒カップリングを同じ鍵となる中間体、シクロスポリンアルキン（式I）とハロゲン化アルキルに適用すると、式VIの新規シクロスポリンジインの調製につながる。この方法を用い、炭素-炭素三重結合を段階的に導入して、トリインおよびテトラインなどの複数の炭素-炭素三重結合の共役系を生成することができた。
スキーム3
【００３３】
スキーム4に示すとおり、式VIのシクロスポリンジインを別のアプローチを用いて調製することができる。シクロスポリンアルキン（式I、X=OAc、R1=H）を硝酸銀存在下でN-ブロモスクシンイミドにより臭素化して、シクロスポリン臭化アルキニル（式VIII）を生成する。この方法を用い、N-ブロモスクシンイミドの代わりにN-ヨードスクシンイミドにより、シクロスポリンヨウ化アルキニルなどの他のシクロスポリンハロゲン化アルキニルを得ることもできる。シクロスポリン臭化アルキニル（またはシクロスポリンヨウ化アルキニル）の様々なアルキンとのパラジウム触媒カップリングにより、式VIのシクロスポリンジインを順調に生成する。
スキーム4
【００３４】
本発明のもう一つの態様は、シクロスポリンアルキン（式I、R1=H）のアルキル化に関する。スキーム5に示すとおり、シクロスポリンアルキン（式I、R1=H）を塩基（炭酸セシウム、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム、または他の強塩基）存在下、ハロゲン化アルキルまたはアルデヒドで処理して、アルキル化シクロスポリンアルキン（式IX）を生成する。
スキーム5
【００３５】
本発明のもう一つの態様は、式Iのシクロスポリンアルキンにおける炭素-窒素二重結合（C=N）の組込みに関する。スキーム6に示すとおり、シクロスポリンアルキン（式I、R1=H）をホルムアルデヒドと、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウムを塩基として用いて反応させ、式Xのシクロスポリンジオールを生成する。シクロスポリンジオールの一級アルコールを塩化tert-ブチルジメチルシリルで選択的に保護した後、二級アルコールを無水酢酸でアセチル化し、次いでフッ化テトラブチルアンモニウムにより脱シリル化して、モノアルコール（式XI）を順調に生成する。モノアルコールのスワン酸化により、式XIIのシクロスポリンアルデヒドを生じる。アルデヒドをヒドロキシルアミン、アルキルオキシアミン（RONH2）、またはヒドラジン（R2NNH2）で処理して、それぞれ対応する式VIIのシクロスポリンオキシム（CH=N-OR）およびヒドラゾン（CH=N-NR2）を生成する。
スキーム6
【００３６】
本発明において開示する化合物は、免疫抑制剤として特に有用である。これらの化合物の投与は、臓器移植患者の免疫応答を抑制し、したがって、同種移植片拒絶を予防する。本発明の化合物はシクロスポリンAに比べてほぼ同等、またはそれよりも高い免疫抑制活性を有する。例えば、図1に示すとおり、コンカナバリンA（ConA）刺激マウス脾細胞アッセイにおいて、実施例25に開示するシクロスポリンアルキン類縁体化合物はシクロスポリンAよりも2倍強力な免疫抑制活性を示す一方で、実施例10に開示するシクロスポリンアルキン類縁体化合物はシクロスポリンAとほぼ同等の効力を示す。表1は、本出願において開示するいくつかの新規シクロスポリンアルキン類縁体化合物の免疫抑制活性を示す。（表1の三番目のカラムは、比較のためにシクロスポリンA陽性対照の値を含む。）
【００３７】
（表１）本発明の新規シクロスポリンアルキン類縁体化合物の免疫抑制活性
【００３８】
本発明において開示される化合物は、いくつかを挙げると、喘息、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、および潰瘍性大腸炎などの自己免疫および慢性炎症性疾患の処置における有用性も保有する。
【００３９】
加えて、本発明において開示される化合物は、眼アレルギーおよびドライアイの処置に対して有用である。Allerganは、涙液産生が眼炎症のために抑制されていると推定される患者における乾性角結膜炎または慢性ドライアイ症候群の処置のためのレスタシス（商標）（シクロスポリン点眼乳液）と呼ばれるシクロスポリンAの局所製剤を現在販売している。レスタシス（商標）の正確なメカニズムは未知であるが、抗炎症効果を有する免疫賦活剤として作用すると考えられる（「Annual Update 2003: Ophthalmic Drugs」, Drugs of the Future, 28(3): 287-307 (2003); Clark et al.,「Ophthalmic Drug Discovery」, Nature Reviews in Drug Discovery, 2:448-459 (2003)、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【００４０】
上述の疾患の処置に対して、本発明の化合物の治療的有効用量は、従来的な非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、および媒体を含む投薬単位製剤において、経口で、局所的に、非経口で、吸入スプレーによって、または経直腸的に投与され得る。本明細書において使用されるような非経口という語は、皮下注射、静脈内、筋内、胸骨内注射、または輸液技術を含む。
【００４１】
活性成分を含む薬学的組成物は、例えば錠剤、トローチ、薬用キャンディー、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、乳液、硬もしくは軟カプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤としてなど、経口使用に適した形態であり得る。本発明の薬学的組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容される担体と共に製剤される活性成分を含む。本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」という語は、非毒性、不活性固体、半固体、もしくは液体充填剤、希釈剤、封入物質、または任意の型の製剤補助剤を意味する。薬学的に許容される担体のいくつかの例は、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；コーンスターチまたはポテトスターチなどのスターチ；セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのその誘導体；粉末トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；アガー；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；ピロゲンフリー水；等張生理食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸バッファー溶液；ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの非毒性、適合潤滑剤；ならびに着色剤、放出剤、甘味剤、ならびに香味および香料剤である。エチルまたはn-プロピルp-ヒドロキシベンゾエートなどの保存剤および抗酸化剤が、薬学的組成物に含まれてもよい。
【００４２】
本発明において開示される化合物の局所または経皮的投与に対する投薬形態は、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、硬膏、パップ、粉末、溶液、スプレー、吸入、またはパッチを含む。活性構成要素は、必要とされ得るように、薬学的に許容される担体および任意の必要とされる保存剤またはバッファーと滅菌条件下で混和される。軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、スターチ、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、ならびに酸化亜鉛、またはその混合物などの賦形剤を含み得る。
【００４３】
鼻腔投与に対して、本発明において開示される化合物は、鼻腔アプリケーターから、適した液体または粉末形態で投与され得る。眼科使用に適した形態は、当技術分野において公知のように、ローション、チンキ剤、ゲル、軟膏、および眼科挿入剤（inserts）を含むと思われる。直腸投与（結腸の局所治療）に対して、本発明の化合物は、坐薬または浣腸剤形態で、特に溶液において、例えば停留浣腸としての使用に対する植物油においてまたは油性システムにおいて投与され得る。
【００４４】
本発明において開示される化合物は、ネブライザー形態でまたは乾燥粉末として、吸入経路によって肺に送達され得る。喘息ならびに気道閉塞および/または慢性鼻腔炎のその他の疾患の処置における、全身経路を超える吸入経路の利点は、患者が非常に少ない量の薬物に曝露され、かつ化合物が作用の部位に直接的に送達されることである。
【００４５】
本発明において同定される病弊の処置に対して採用される本発明の化合物の投薬は、処置の部位、処置される特定の状態、状態の重症度、処置される被験者（体重、年齢、全般的健康、性別、およびその他の因子において変化し得る）、ならびに望ましい効果に依存して変化すると思われる。
【００４６】
1日あたり、体重のキログラムあたり約0.05 mg〜約50 mgの範囲である投薬レベルが、本発明において同定される状態または疾患の処置に対して有用である。これは、投与される本発明において開示される化合物の量が、1日あたり、患者あたり2.5 mg〜約2.5 gmの範囲であると思われることを意味する。
【００４７】
単一の投薬形態を産生するために薬学的担体物質と組み合わせられ得る活性成分の量は、処置される宿主および投与の特定の様式に依存して変化すると思われる。例えば、ヒトの経口投与を目的とする製剤は、総組成物の約5〜95パーセントまで変化し得る適当かつ好都合な量の担体物質と調合される、2.5 mg〜2.5gmの本発明の活性化合物を含み得る。投薬単位形態は、概して、約5 mg〜約500 mgの間の本発明の活性化合物を含むと思われる。局所調製の投薬量は、概して、経口調製物に対して必要とされる用量よりも少ないと思われる（10分の1〜100分の1）。
【００４８】
実施例
実施例1 - シクロスポリンアセテートの調製
塩化メチレン（40 mL）におけるシクロスポリンA（5.0 g、4.16 mmol）、無水酢酸（7.80 mL、83.2 mmol）、およびDMAP（760 mg、6.2 mmol）の溶液を、N2空気下で室温でオーバーナイトで攪拌した。飽和重炭酸ナトリウム溶液（200 mL）を溶液に添加し、さらに2時間攪拌した。混合物を、エーテルで抽出し、1 N HClで洗浄し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で中和し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空で濃縮し、白色固体としてシクロスポリンアセテート（4.92 g、95％）を得た。
【００４９】
実施例2 - アセチルシクロスポリンアルデヒドの調製
オゾンを、青色が発色するまで、-78℃で塩化メチレン（70 mL）における実施例1からのシクロスポリンアセテート（3.0 g、2.4 mmol）の溶液に通気した。混合物を、数分間窒素で脱気し、ジメチルスルフィド（3 mL）を、-78℃で添加した。反応混合物を、室温まで戻し、3時間攪拌した。反応混合物を、真空で濃縮し、残留物は酢酸エチル（300 mL）に溶解し、水（2×70 mL）およびブライン（70 mL）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空で濃縮し、白色固体としてアセチルシクロスポリンアルデヒド（2.79 g、94％）を得た。粗製産物は、さらなる精製をともなわずに次の段階へ持ち越された。
【００５０】
実施例3 - シクロスポリンアルキンの調製
メタノール（20mL）中の実施例2からのアセチルシクロスポリンアルデヒド（1.94g、1.57mmol）の溶液を撹拌しながら、これにメタノール（10mL）中の(1-ジアゾ-2-オキソプロピル)ホスホン酸ジメチル（3.01g、15.7mmol）の溶液と、続いて炭酸カリウム（2.17g、15.7mmol）を加えた。得られた緑色懸濁液を室温で終夜撹拌した。溶液を珪藻土を通してろ過し、ろ液を濃縮した。残渣を酢酸エチル（300mL）に溶解し、水（2×100mL）で洗浄した。合わせた水層を酢酸エチル（100mL）で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮乾固した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキン（848mg、45％）を白色固体で得た。
【００５１】
実施例4 - シクロスポリンアルキンの調製
THF（5mL）中の(トリメチルシリル)ジアゾメタン（4.6mL、Et2O中2.0M溶液、9.2mmol）の溶液を-78℃まで冷却し、これにn-BuLi（3.4mL、ヘキサン中2.5M溶液、8.4mmol）を滴下した。得られた黄色懸濁液を30分間撹拌し、次いでTHF（5mL）中の実施例2からのアセチルシクロスポリンアルデヒド（1.03g、0.84mmol）の溶液を滴下した。混合物を-78℃で30分間撹拌し、次いで15分間で0℃まで温めた。反応を飽和NH4Clで停止した。混合物をEtOAcとH2Oとの間で分配した。水層をEtOAcで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキン（364mg、37％）を白色固体で得た。
【００５２】
実施例5 - シクロスポリンアルキンの酢酸エステルの調製
THF（10mL）中の(トリメチルシリル)ジアゾメタン（4.5mL、Et2O中2.0M溶液、8.9mmol）の溶液を-78℃まで冷却し、これにn-BuLi（3.2mL、ヘキサン中2.5M溶液、8.1mmol）を滴下した。得られた黄色懸濁液を30分間撹拌し、次いでTHF（5mL）中の実施例2からのアセチルシクロスポリンアルデヒド（1.00g、0.81mmol）の溶液を滴下した。混合物を-78℃で5分間撹拌した。反応をTHF（5mL）中の無水酢酸（1.5mL、4.1mmol）およびピリジン（1.4mL、4.9mmol）の混合物で停止し、次いで15分間で室温まで温めた。反応を飽和NH4Clで停止した。混合物をEt2OとH2Oとの間で分配した。水層をEt2Oで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキンの酢酸エステル（389mg、40％）を白色固体で得た。
【００５３】
実施例6 - シクロスポリンアルキンの酢酸エステルの調製
塩化メチレン（5mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（0.44g、0.37mmol）の溶液にピリジン（0.90mL、11.1mmol）と、続いてDMAP（68mg、0.55mmol）および無水酢酸（0.70mL、7.4mmol）を加え、次いで混合物を室温で1.5日間撹拌した。反応混合物をエチルエーテル（100mL）で希釈し、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（30mL）および食塩水（30mL）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキンの酢酸エステル（0.23g、51％）を白色固体で得た。
【００５４】
実施例7 - シクロスポリンイン-エンの調製
トリエチルアミン（2mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（55mg、0.046mmol）、ヨウ化銅(I)（4mg、0.023mmol）、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（16mg、0.023mmol）の混合物にヨウ化ビニル（34μL、0.46mmol）を加え、次いで混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンイン-エン（24mg、43％）を白色固体で得た。
【００５５】
実施例8 - トランス-シクロスポリンイン-エンの調製
トリエチルアミン（2mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（65mg、0.055mmol）、ヨウ化銅(I)（5mg、0.028mmol）、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（20mg、0.028mmol）の混合物にトランス-1,2-ジクロロエチレン（85μL、1.1mmol）を加え、次いで混合物を室温で4時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、トランス-シクロスポリンイン-エン（13mg、19％）を白色固体で得た。
【００５６】
実施例9 - シス-シクロスポリンイン-エンの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（4mL）中の実施例6からのシクロスポリンアルキンの酢酸エステル（166mg、0.14mmol）、ヨウ化銅(I)（13mg、0.068mmol）、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（48mg、0.068mmol）の混合物にシス-1,2-ジクロロエチレン（0.20mL、2.7mmol）を加え、次いで混合物を室温で12時間撹拌した。シス-1,2-ジクロロエチレン（0.10mL、1.3mmol）を補充し、混合物を5時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シス-シクロスポリンイン-エンの酢酸エステル（22mg、13％）を白色固体で得た。
【００５７】
実施例10 - シス-シクロスポリンイン-エンの調製
MeOH（3mL）中の実施例9からのシス-シクロスポリンイン-エンの酢酸エステル（22mg、0.017mmol）の溶液に炭酸カリウム（47mg、0.34mmol）を加え、次いで混合物を室温で8時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（30mL）で希釈し、次いで水（10mL）で洗浄した。水層を分離し、酢酸エチル（30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シス-シクロスポリンイン-エン（16mg、76％）を白色固体で得た。
【００５８】
実施例11 - トランス-シクロスポリンイン-エンの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（2mL）中の実施例6からのシクロスポリンアルキンの酢酸エステル（74mg、0.06mmol）、ヨウ化銅(I)（6mg、0.03mmol）、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（21mg、0.03mmol）の混合物に(2-ブロモビニル)トリメチルシラン（0.18mL、1.2mmol）を加え、次いで混合物を室温で12時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、トランス-シクロスポリンイン-エンの酢酸エステル（16mg、20％）を白色固体で得た。
【００５９】
実施例12 - トランス-シクロスポリンイン-エンの調製
MeOH（2mL）中の実施例11からのトランス-シクロスポリンイン-エンの酢酸エステル（16mg、0.012mmol）の溶液に炭酸カリウム（41mg、0.30mmol）を加え、次いで混合物を室温で8時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（30mL）で希釈し、次いで水（10mL）で洗浄した。水層を分離し、酢酸エチル（30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、トランス-シクロスポリンイン-エン（6mg、40％）を白色固体で得た。
【００６０】
実施例13 - トランス-シクロスポリンイン-エンの調製
トリエチルアミン（2mL）およびテトラヒドロフラン（1mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（40mg、0.03mmol）の混合物にジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（15mg、0.02mmol）、ヨウ化銅(I)（4mg、0.02mmol）およびトランス-1-ブロモプロペン（50μL、0.6mmol）を加え、次いで混合物を室温で3時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。半調製用HPLCで二回精製して、トランス-シクロスポリンイン-エン（5.5mg、15％）を黄色固体で得た。
【００６１】
実施例14 - シス-シクロスポリンイン-エンの調製
トリエチルアミン（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（80mg、0.07mmol）、シス-1-ブロモプロペン（300μL、3.5mmol）およびヨウ化銅(I)（14mg、0.07mmol）の混合物を澄明溶液が生成するまで撹拌した。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（51mg、0.07mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン/酢酸エチル7:3から酢酸エチル）で精製して、褐色固体を得た。固体をさらに半調製用HPLCで二回精製して、シス-シクロスポリンイン-エン（29mg、35％）を白色固体で得た。
【００６２】
実施例15 - シクロスポリンイン-エンの調製
トリエチルアミン（2mL）およびテトラヒドロフラン（1mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（40mg、0.03mmol）の混合物にジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（15mg、0.02mmol）、ヨウ化銅(I)（4mg、0.02mmol）および2-ブロモプロペン（50μL、0.6mmol）を加え、次いで混合物を室温で5時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。半調製用HPLCで二回精製して、シクロスポリンイン-エン（4.5mg、12％）を白色固体で得た。
【００６３】
実施例16 - シクロスポリンイン-エンの調製
トリエチルアミン（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（80mg、0.07mmol）およびヨウ化銅(I)（13mg、0.07mmol）の混合物にブロモスチレン（シスおよびトランス異性体の混合物、180μL、1.4mmol）を加え、次いで混合物を澄明溶液が生成するまで撹拌した。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（50mg、0.07mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン/酢酸エチル7:3から酢酸エチル）で精製して、褐色固体を得た。固体をさらに半調製用HPLCで二回精製して、シクロスポリンイン-エン（17mg、19％）を異性体の混合物（1H NMRによりシス/トランス約1:4）として白色固体で得た。
【００６４】
実施例17 - フェニルシクロスポリンアルキンの調製
トリエチルアミン（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（80mg、0.07mmol）の混合物をN2で5分間脱気した。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（28mg、0.04mmol）、ヨウ化銅(I)（8mg、0.04mmol）およびヨードベンゼン（80μL、0.70mmol）を加え、次いで混合物を室温で1.5時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンフェニルアルキン（7mg、8％）を褐色固体で得た。
【００６５】
実施例18 - 4-メトキシフェニルシクロスポリンアルキンの調製
トリエチルアミン（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（80mg、0.07mmol）、1-ヨード-4-メトキシベンゼン（150μL、1.4mmol）およびヨウ化銅(I)（13mg、0.07mmol）の混合物を澄明溶液が生成するまで撹拌した。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（50mg、0.07mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン/酢酸エチル7:3から酢酸エチル）で精製して、褐色固体を得た。固体をさらに半調製用HPLCで二回精製して、4-メトキシフェニルシクロスポリンアルキン（23mg、26％）を白色固体で得た。
【００６６】
実施例19 - 4-フルオロフェニルシクロスポリンアルキンの調製
トリエチルアミン（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（80mg、0.07mmol）、4-フルオロ-1-ヨードベンゼン（160μL、1.4mmol）およびヨウ化銅(I)（14mg、0.07mmol）の混合物を澄明溶液が生成するまで撹拌した。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（50mg、0.07mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン/酢酸エチル7:3から酢酸エチル）で精製して、褐色固体を得た。固体をさらに半調製用HPLCで二回精製して、4-フルオロフェニルシクロスポリンアルキン（8.9mg、10％）を白色固体で得た。
【００６７】
実施例20 - チオフェン-2-イルシクロスポリンアルキンの調製
トリエチルアミン（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（80mg、0.07mmol）、2-ヨードチオフェン（328mg、1.4mmol）およびヨウ化銅(I)（13mg、0.07mmol）の混合物を澄明溶液が生成するまで撹拌した。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（50mg、0.07mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン/酢酸エチル7:3から酢酸エチル）で精製して、淡褐色固体を得た。固体をさらに半調製用HPLCで二回精製して、チオフェン-2-イルシクロスポリンアルキン（10.7mg、12％）を白色固体で得た。
【００６８】
実施例21 - シクロスポリンジインの酢酸エステルの調製
ピロリジン（1mL）中の実施例6からのシクロスポリンアルキンの酢酸エステル（90mg、0.073mmol）の溶液にヨウ化銅(I)（7mg、0.037mmol）およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（26mg、0.037mmol）を加え、次いで混合物を室温で5分間撹拌した。ヨウ化1-ブチニル（145μL、1.46mmol）を滴下し、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（40mL）で希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液（20mL）で洗浄した。水層を酢酸エチル（2×20mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、所望のシクロスポリンジインの酢酸エステル（15mg、16％）を褐色固体で得た。
【００６９】
実施例22 - シクロスポリンジインの調製
MeOH（2mL）中の実施例21からのシクロスポリンジインの酢酸エステル（18mg、0.014mmol）の溶液に炭酸カリウム（39mg、0.28mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を塩化アンモニウムの飽和溶液で反応停止し、次いで酢酸エチル（3×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンジイン（9mg、53％）を白色固体で得た。
【００７０】
実施例23 - シクロスポリン臭化アルキニルの酢酸エステルの調製
アセトン（5mL）中の実施例6からのシクロスポリンアルキンの酢酸エステル（0.22g、0.18mmol）の溶液にN-ブロモスクシンイミド（64mg、0.36mmol）と、続いて硝酸銀（6mg、0.036mmol）を加えた。反応フラスコをアルミニウムホイルで包んだ。反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いで氷水（20mL）中に注ぎ、酢酸エチル（3×40mL）で抽出した。合わせた有機層を食塩水（30mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリン臭化アルキニルの酢酸エステル（0.23g、98％）を白色固体で得た。
【００７１】
実施例24 - シクロスポリン(トリメチルシリル)ジインの酢酸エステルの調製
ピロリジン（1mL）中の実施例23からのシクロスポリン臭化アルキニルの酢酸エステル（20mg、0.015mmol）の溶液に(トリメチルシリル)アセチレン（42μL、0.30mmol）と、続いてヨウ化銅(I)（3mg、0.015mmol）およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（6mg、0.008mmol）を加え、次いで混合物を室温で1時間撹拌した。反応を塩化アンモニウムの飽和溶液で停止し、次いで酢酸エチル（3×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリン(トリメチルシリル)ジインの酢酸エステル（6mg、30％）を淡褐色固体で得た。
【００７２】
実施例25 - シクロスポリンジインの調製
MeOH（2mL）中の実施例24からのシクロスポリン(トリメチルシリル)ジインの酢酸エステル（9mg、0.007mmol）の溶液に炭酸カリウム（19mg、0.14mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を塩化アンモニウムの飽和溶液で反応停止し、次いで酢酸エチル（3×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンジイン（6mg、71％）を白色固体で得た。
【００７３】
実施例26 - シクロスポリンジインの酢酸エステルの調製
THF（1mL）中の臭化1-プロピニルマグネシウム（0.54mL、THF中0.5M、0.27mmol）の氷冷溶液に塩化亜鉛の溶液（0.27mL、エチルエーテル中1M、0.27mmol）を加えた。反応混合物を0℃で10分間撹拌し、次いで室温まで温めた。THF（1mL）中の実施例23からのシクロスポリン臭化アルキニルの酢酸エステル（35mg、0.027mmol）の溶液を反応混合物に加え、続いてジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（10mg、0.014mmol）を加えた。得られた反応混合物を室温で1.5時間撹拌し、次いで塩化アンモニウムの飽和溶液（10mL）で反応停止した。水層を酢酸エチル（3×20mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンジインの酢酸エステル（14mg、41％）を淡褐色固体で得た。
【００７４】
実施例27 - シクロスポリンジインの調製
MeOH（2mL）中の実施例26からのシクロスポリンジインの酢酸エステル（14mg、0.011mmol）の溶液に炭酸カリウム（30mg、0.22mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を塩化アンモニウムの飽和溶液で反応停止し、次いで酢酸エチル（3×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンジイン（8mg、62％）を白色固体で得た。
【００７５】
実施例28 - シクロスポリンシクロプロピルジインの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（1mL）中のシクロプロピル(トリメチルシリル)アセチレン（37mg、0.27mmol）の氷冷溶液にフッ化テトラブチルアンモニウム（0.32mL、THF中1M、0.32mmol）を加え、次いで混合物を10分間撹拌した。反応混合物を室温まで温め、次いでトリエチルアミン（1mL）中の実施例23からのシクロスポリン臭化アルキニルの酢酸エステル（35mg、0.027mmol）の溶液を混合物に加え、続いてヨウ化銅(I)（3mg、0.014mmol）およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（10mg、0.014mmol）を加えた。得られた反応混合物を室温で5時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（30mL）で希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液（10mL）で洗浄した。水層を酢酸エチル（2×20mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンシクロプロピルジインの酢酸エステル（23mg、66％）を淡褐色固体で得た。
【００７６】
実施例29 - シクロスポリンシクロプロピルジインの調製
MeOH（2mL）中の実施例28からのシクロスポリンシクロプロピルジインの酢酸エステル（20mg、0.015mmol）の溶液に炭酸カリウム（41mg、0.30mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を塩化アンモニウムの飽和溶液で反応停止し、次いで酢酸エチル（3×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンシクロプロピルジイン（16mg、84％）を白色固体で得た。
【００７７】
実施例30 - シクロスポリンジインの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（2mL）中の実施例23からのシクロスポリン臭化アルキニルの酢酸エステル（40mg、0.03mmol）、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（14mg、0.02mmol）、ヨウ化銅(I)（4mg、0.02mmol）およびフェニルアセチレン（30μL、0.30mmol）の混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィ（シリカゲル、100％ヘキサンの後、100％ EtOAc）と、続いて半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンジインの酢酸エステル（11mg、27％）を褐色固体で得た。
【００７８】
実施例31 - シクロスポリンジインの調製
MeOH（1mL）中の実施例30からのシクロスポリンジインの酢酸エステル（11mg、0.008mmol）の溶液に炭酸カリウム（11mg、0.08mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をEtOAcで希釈し、H2O（×2）、食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンジイン（6.6mg、64％）を褐色固体で得た。
【００７９】
実施例32 - シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（1mL）中の実施例24からのシクロスポリン(トリメチルシリル)ジインの酢酸エステル（25mg、0.019mmol）の氷冷溶液にフッ化テトラブチルアンモニウム（95μL、THF中1M、0.095mmol）を加え、次いで混合物を10分間撹拌した。反応混合物を室温まで温め、次いでヨウ化銅(I)（4mg、0.019mmol）およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（13mg、0.019mmol）を混合物に加え、続いてヨウ化ビニル（30μL、0.38mmol）を加えた。得られた反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、所望のシクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステル（6mg、25％）を褐色油状物で得た。
【００８０】
実施例33 - シクロスポリンイン-イン-エンの調製
MeOH（2mL）中の実施例32からのシクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステル（14mg、0.011mmol）の溶液に炭酸カリウム（30mg、0.22mmol）を加え、次いで混合物を室温で12時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（30mL）で希釈し、次いで塩化アンモニウムの飽和溶液（15mL）で洗浄した。水層を分離し、酢酸エチル（2×20mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンイン-イン-エン（10mg、72％）を白色固体で得た。
【００８１】
実施例34 - シス-シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（1mL）中の実施例24からのシクロスポリン(トリメチルシリル)ジインの酢酸エステル（53mg、0.040mmol）の氷冷溶液にフッ化テトラブチルアンモニウム（0.20mL、THF中1M、0.20mmol）を加え、次いで混合物を10分間撹拌した。反応混合物を室温まで温め、次いでヨウ化銅(I)（4mg、0.02mmol）およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（14mg、0.02mmol）を混合物に加え、続いてシス-1-ブロモ-1-プロペン（68μL、0.80mmol）を加えた。得られた反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、所望のシス-シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステル（19mg、37％）を淡褐色固体で得た。
【００８２】
実施例35 - シス-シクロスポリンイン-イン-エンの調製
MeOH（2mL）中の実施例34からのシス-シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステル（19mg、0.015mmol）の溶液に炭酸カリウム（41mg、0.30mmol）を加え、次いで混合物を室温で6時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（40mL）で希釈し、次いで塩化アンモニウムの飽和溶液（20mL）で洗浄した。水層を分離し、酢酸エチル（2×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シス-シクロスポリンイン-イン-エン（10mg、53％）を白色固体で得た。
【００８３】
実施例36 - トランス-シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（1mL）中の実施例24からのシクロスポリン(トリメチルシリル)ジインの酢酸エステル（60mg、0.045mmol）の氷冷溶液にフッ化テトラブチルアンモニウム（0.23mL、THF中1M、0.23mmol）を加え、次いで混合物を10分間撹拌した。反応混合物を室温まで温め、次いでヨウ化銅(I)（4mg、0.02mmol）およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（16mg、0.02mmol）を混合物に加え、続いてトランス-1-ブロモ-1-プロペン（77μL、0.90mmol）を加えた。得られた反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、所望のトランス-シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステル（26mg、45％）を淡褐色固体で得た。
【００８４】
実施例37 - トランス-シクロスポリンイン-イン-エンの調製
MeOH（3mL）中の実施例36からのトランス-シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステル（25mg、0.019mmol）の溶液に炭酸カリウム（52mg、0.38mmol）を加え、次いで混合物を室温で12時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（40mL）で希釈し、次いで塩化アンモニウムの飽和溶液（20mL）で洗浄した。水層を分離し、酢酸エチル（2×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、トランス-シクロスポリンイン-イン-エン（15mg、63％）を白色固体で得た。
【００８５】
実施例38 - シクロスポリンアルキンの調製
DMF（2mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（50mg、0.04mmol）、炭酸セシウム（325mg、1.0mmol）、ヨウ化ナトリウム（150mg、1.0mmol）およびヨウ化銅(I)（190mg、1.0mmol）の懸濁液を室温で30分間撹拌した。臭化アリル（70μL、0.80mmol）を滴下し、得られた混合物を室温で終夜撹拌した。青色の懸濁液をEt2Oで希釈し、ろ過した。ろ液をH2Oで二回洗浄した。合わせた水層をEt2Oで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキン（25mg、52％）をオフホワイト固体で得た。
【００８６】
実施例39 - シクロスポリンアルキンの調製
DMF（2mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（50mg、0.04mmol）、炭酸セシウム（326mg、1.0mmol）、ヨウ化ナトリウム（152mg、1.0mmol）およびヨウ化銅(I)（190mg、1.0mmol）の懸濁液を室温で30分間撹拌した。臭化ベンジル（100μL、0.8mmol）を滴下し、得られた混合物を室温で終夜撹拌した。青色の懸濁液をEt2Oで希釈し、ろ過した。ろ液をH2Oで二回洗浄した。合わせた水層をEt2Oで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキン（8mg、17％）をオフホワイト固体で得た。
【００８７】
実施例40 - 1-(トリメチルシリル)プロピン-3-イルシクロスポリンアルキンの調製
DMF（2mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（50mg、0.04mmol）、炭酸セシウム（326mg、1.0mmol）、ヨウ化ナトリウム（152mg、1.0mmol）およびヨウ化銅(I)（190mg、1.0mmol）の懸濁液を室温で30分間撹拌した。3-ブロモ-1-(トリメチルシリル)-1-プロピン（0.11mL、0.8mmol）を滴下し、得られた混合物を室温で15分間撹拌した。青色の懸濁液をEt2Oで希釈し、ろ過した。ろ液をH2Oで二回洗浄した。合わせた水層をEt2Oで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、1-(トリメチルシリル)プロピン-3-イルシクロスポリンアルキン（26mg、50％）をオフホワイト固体で得た。
【００８８】
実施例41 - シクロスポリン非共役ジインの調製
MeOH（1mL）中の実施例40からのシクロスポリンアルキン（18mg、0.01mmol）の溶液に炭酸カリウム（20mg、0.14mmol）を加え、次いで混合物を室温で1.5時間撹拌した。反応混合物をEtOAcで希釈し、H2O（2×）、食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリン非共役ジイン（8mg、43％）
を白色固体で得、シクロスポリンアルキニルアレン（6.7mg、36％）
を白色固体で得た。
【００８９】
実施例42 - シクロスポリン非共役ジインの酢酸エステルの調製
DMF（2mL）中の実施例6からのシクロスポリンアルキンの酢酸エステル（50mg、0.05mmol）、炭酸セシウム（326mg、1.0mmol）、ヨウ化ナトリウム（150mg、1.0mmol）およびヨウ化銅(I)（190mg、1.0mmol）の懸濁液を室温で30分間撹拌した。1-ブロモ-2-ブチン（90μL、1.0mmol）を滴下し、得られた混合物を室温で終夜撹拌した。青色の懸濁液をEt2Oで希釈し、ろ過した。ろ液をH2Oで二回洗浄した。合わせた水層をEt2Oで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリン非共役ジインの酢酸エステル（47mg、73％）を淡褐色固体で得た。
【００９０】
実施例43 - シクロスポリン非共役ジインの調製
MeOH（2mL）中の実施例42からのシクロスポリン非共役ジインの酢酸エステル（47mg、0.04mmol）の溶液に炭酸カリウム（55mg、0.4mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をEtOAcで希釈し、H2O（2×）、食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリン非共役ジイン（23mg、46％）を褐色固体で得た。
【００９１】
実施例44 - シクロスポリンアルキニルアルコールの調製
DMSO（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（100mg、0.081mmol）およびパラホルムアルデヒド（133mg、0.81mmol）の溶液に水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム（372μL、メタノール中40％溶液、0.81mmol）を10分かけて滴下した。得られた溶液を室温で14時間撹拌した。反応を水で停止し、ジエチルエーテル（4×25mL）で抽出した。合わせた有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキニルアルコール（23mg、23％）を白色固体で得た。
【００９２】
実施例45 - シクロスポリンジオールの調製
-78℃でTHF（50 mL）におけるジイソプロピルアミン（2.6 mL、18 mmol）の機械的に攪拌した溶液に、n-ブチルリチウム（6.6 mL、ヘキサンにおける2.5 M、17 mmol）を滴下形式で添加し、次いで、混合物を、0.5時間攪拌した。THF（8 mL）におけるシクロスポリンA（1.0 g、0.83 mmol）の溶液を添加し、次いで、混合物を、-78℃で2時間攪拌した。パラホルムアルデヒド（8.0 g）は、170℃まで加熱し、結果として生じたホルムアルデヒドガスを、2時間にわたって、綿およびアルミホイルでラップされたガラスチューブを介して反応物に移した。-78℃でさらに1時間攪拌した後、反応混合物は、水（10 mL）で反応停止した。混合物を、室温に戻し、酢酸エチル（150 mL）で希釈し、水（2×50 mL）で洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮した。粗物質を、セミ分取HPLCによって精製し、白色固体としてシクロスポリンジオール（0.45 g、44％）を得た。
【００９３】
実施例46 - シクロスポリンジアセテートの調製
塩化メチレン（5 mL）における実施例45からのシクロスポリンジオール（0.43 g、0.35 mmol）の溶液に、ピリジン（0.57 mL、7.0 mmol）、その後4-(ジメチルアミノ)ピリジン（86 mg、0.70 mmol）および無水酢酸（1.0 mL、10.5 mmol）を添加した。反応混合物は、室温で2日間攪拌された。反応物を、エチルエーテル（150 mL）で希釈し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液（30 mL）、1N HCl溶液（30 mL）、およびブライン（30 mL）で洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮した。粗物質を、セミ分取HPLCによって精製し、白色固体としてシクロスポリンジアセテート（0.23 g、50％）を得た。
【００９４】
実施例47 - シクロスポリンアルデヒドの調製
オゾンを、青色が発色するまで、-78℃で塩化メチレン（10 mL）における実施例46からのシクロスポリンジアセテート（0.22 g、0.17 mmol）の溶液に通気した。混合物を、数分間窒素で脱気し、ジメチルスルフィド（0.4 mL）を、-78℃で添加した。反応混合物を、室温まで戻し、3時間攪拌した。反応混合物を、真空で濃縮し、残留物は酢酸エチル（120 mL）に溶解し、水（2×20 mL）およびブライン（30 mL）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空で濃縮し、白色固体としてシクロスポリンアルデヒド（0.19 g、86％）を得た。粗製材料は、さらなる精製をともわずに次の段階へ持ち越された。
【００９５】
実施例48 - シクロスポリンアルキンの調製
メタノール（7.5mL）中の実施例47からのシクロスポリンアルデヒド（715mg、0.55mmol）の溶液に炭酸カリウム（760mg、5.5mmol）と、続いてメタノール（4.5mL）中の(1-ジアゾ-2-オキソプロピル)ホスホン酸ジメチル（1.06g、5.5mmol）の溶液を加えた。得られた混合物を室温で終夜撹拌した。溶液を減圧下で濃縮し、次いで酢酸エチル（100mL）で希釈した。有機層を水（40mL）で洗浄した。水層を酢酸エチル（3×50mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキン（106mg、16％）を白色固体で得た。
【００９６】
実施例49 - シクロスポリンインーエンの調製
トリエチルアミン（1.5mL）中の実施例48からのシクロスポリンアルキン（43mg、0.04mmol）の溶液にヨウ化銅(I)（4mg、0.02mmol）と、続いてジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（14mg、0.02mmol）およびヨウ化ビニル（123mg、0.8mmol）を加えた。得られた混合物を室温で2時間撹拌した。溶液をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンイン-エン（106mg、16％）を白色固体で得た。
【００９７】
実施例50 - コンカナバリンA-刺激脾細胞アッセイ
5〜7週齢のオスBALB/cマウスを、CO2吸入によって屠殺した。脾臓が除去し、ナイロン細胞ストレイナーを介して押すことによって解離させた。脾細胞を、RPMI 1640/5％ウシ胎仔血清（FCS）において洗浄し、400×gでペレット化した。次いで、赤血球を、室温で10分間、ACK溶解バッファー（150 mM NH4Cl、1 mM KHCO3、0.1 mM EDTA、脾臓あたり3 mL）に細胞ペレットを再懸濁することによって溶解した。400×gでペレットした後、細胞を、RPMI 1640/5％FCSにおける再懸濁および再ペレットによって洗浄した。細胞ペレットを、RPMI 1640/5％FCSに再懸濁し、細胞凝集体を除去するために、再度細胞ストレイナーに通した。次いで、細胞を計数し、RPMI 1640/10％FCS/50μM 2-メルカプトエタノールにおいて2×106 cells/mlに調整した。細胞生存率を、トリパンブルー染色によって査定した。シクロスポリンAまたはテスト化合物および2マイクログラムのコンカナバリンAを、2×105脾細胞の添加に先行して、96ウェルプレートのウェルに添加した。細胞を、2日間37℃ CO2インキュベーターにおいて培養し、次いで、6時間1μCiの[3H]チミジンでパルスした。細胞を、TomTec 96ウェルプレートハーベスターでフィルターマット上へ採取し、H2Oで溶解した。フィルターマットおよびシンチレーション液を、プラスチックスリーブに密封した。[3H]チミジン取り込みは、Wallac Triluxプレートカウンターで測定した。初めのスクリーニングを、100 ng/mlテスト化合物の固定値で行なった。IC50を、GraphPadソフトウェアを使用して、7ポイント濃度-応答曲線から計算した。
【００９８】
実施例51 - マウスエクスビボ薬力学的アッセイ
インビボ免疫抑制活性は、以下に記載されるように、シクロスポリンAおよび開示されるシクロスポリン類縁体化合物に対して決定され得る。コンカナバリンA-刺激脾細胞活性は、Peterson et al.（Peterson et al.,「A Tacrolimus-Related Immunosuppressant with Biochemical Properties Distinct from Those of Tacrolimus」, Transplantation, 65:10-18 (1998)、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）によって以前に記載される方法またはそのわずかに改変されたバージョンを使用して、インビボで査定され得る。
【００９９】
シクロスポリンAまたは本発明の免疫抑制化合物の最適な用量（テスト薬物の4つの異なる用量プラス薬物をともなわない動物の対照セット）は、オスBALB/cまたはメスC57BLマウスに経口でまたは静脈内に投与された。3匹のマウスが、各々の用量でテストされた。コンカナバリンAは、シクロスポリンAまたは免疫抑制化合物の投与の4時間後に、マウスの尾静脈に注射された。コンカナバリンA注射の1時間後、マウスは安楽死させられ、脾臓が滅菌条件下で除去され、脾細胞増殖の程度が、実施例50において記載されるのと同じ様式で測定された。対照に対するパーセント阻害が、免疫抑制化合物の用量に対して図式的にプロットされ、ED50値が決定された。本発明の化合物に対する各々の用量-応答アッセイは、ED50と等しい単一用量でシクロスポリン対照を伴った。
【０１００】
本発明は、例証を目的として詳細に記載されているが、そのような詳細は、単にその目的のためであり、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、これらに変化が起こり得ることが当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図1は、コンカナバリンA（ConA）刺激マウス脾細胞アッセイの結果を示す図であり、本発明の新規シクロスポリン類縁体化合物（実施例25および10に開示）は、シクロスポリンAに比べて、高いまたはほぼ同等の免疫抑制効力を有することが示されている。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規なシクロスポリンアルキンならびに免疫抑制剤としておよびその他の疾患の処置に対する薬学的薬剤としてのそれらの有用性を開示する。そのような化合物の調製に対する方法も開示される。なお、本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2004年10月6日に出願された米国特許仮出願第60/616,591号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
真菌トリポクラジウム・インフラタム（Tolypocladium inflatum）から単離され、ネオラル（登録商標）およびサンディミュン（登録商標）（Novartis, Basel, Switzerland）として現在販売されている、中性環式ウンデカペプチドであるシクロスポリンA（CsA）は、器官移植拒絶の予防に対して広範に使用されている。シクロスポリンAは、シクロフィリンペプチジプロリルシス/トランスイソメラーゼに結合することによって分子レベルでその免疫抑制効果を発揮する。結果として生じるシクロスポリンAおよびシクロフィリンの複合体は、Ca2+/カルモジュリン依存性ホスファターゼであるカルシニューリンに結合し、そのホスファターゼ活性を阻害する。カルシニューリンは、転写因子、活性化T細胞の核因子（NFAT）の移動およびT細胞増殖に必要な初期遺伝子のその後の発現を調節する。シクロスポリンA-シクロフィリン複合体によるカルシニューリンのホスファターゼ活性の阻害は、NFAT核局在を妨げ、IL-2などの遺伝子の発現を抑制し、最終的に免疫抑制をもたらす（Matsuda et al.,「Mechanisms of Action of Cyclosporin」, Immunopharmacology, 47:119-125 (2000)（非特許文献1））。
【０００３】
シクロスポリンAは、慢性関節リウマチ、クローン病、乾癬などの自己免疫疾患、および喘息などの慢性炎症性疾患の処置における潜在的な治療的応用も有する。残念ながら、これらの兆候に対する臨床的実用性は、シクロスポリンAの臨床的有効用量とともに生じる腎臓毒性、高血圧、肝毒性、貧血、および胃腸過敏症などの副作用のために、実現されていない。シクロスポリンAに関連する毒性は、免疫抑制治療領域で働く多くの専門家によって、メカニズムに基づいていると信じられている（Lazarova et al.,「Cyclosporin A Analogues: Recent Advances」, Expert Opin. Ther. Patents, 13:1327-1332 (2003)（非特許文献2））。実際、改善された治療指数を有する新規なシクロスポリン類縁体を発見する目標は、この30年にわたるこの薬物発見領域における顕著な努力にもかかわらず、まだ達成されていない（Bollinger et al.の米国特許第5,525,590号（特許文献1）；Boelsterli et al.の米国特許第5,643,870号（特許文献2）；Rich et al.の米国特許第5,639,852号（特許文献3）；Duretteの米国特許第5,236,899号（特許文献4）；Patchett et al.の米国特許第5,122,511号（特許文献5）；Dumont et al.の米国特許第4,914,188号（特許文献6）；Seebachの米国特許第4,771,122号（特許文献7）；Wengerの米国特許第4,764,503号（特許文献8）；Wengerの米国特許第4,396,542号（特許文献9）；Ruegger et al.の米国特許第4,210,581号（特許文献10））。
【０００４】
強力な免疫抑制活性および減少した毒性を有する新規なシクロスポリン類縁体を見出すためのより最近の試みは、進行中であり、ISATX247などの化合物をもたらした。前臨床観測は、ISATX247が、移植拒絶の予防に対して市場においてすでに利用できるそのクラスにおけるその他の免疫抑制剤よりも有意により強力でかつ毒性が低いという潜在性を有することを示す。ISATX247は、移植手術後の器官拒絶の予防および乾癬の処置に対するフェーズII臨床試験にある（Abel et al.,「ISATX247: A Novel Calcineurin Inhibitor」, J. Heart Lung Transplant, 20:161 (2001)（非特許文献3）; Aspeslet et al.,「ISATX247: A Novel Calcineurin Inhibitor」, Transplantation Proceedings, 33:1048-1051 (2001)（非特許文献4）; Naicker et al.の米国特許第6,605,593号（特許文献11）および第6,613,739号（特許文献12））。
【０００５】
自己免疫疾患（Or et al.の国際公開公報第03/033010号（特許文献13））および喘息などの呼吸器疾患（Or et al.の国際公開公報第02/069902号（特許文献14））の処置に対して使用される免疫抑制性シクロスポリンA誘導体の毒性を最小にしようとする「ソフトな」薬物アプローチ（Lazarova et al.,「Synthesis and Biological Evaluation of Cyclosporin A Analogues: Potential Soft Drugs for the Treatment of Autoimmune Diseases」, J. Med. Chem., 46:674-676 (2003)（非特許文献5））も、最近記載されている。
【０００６】
改善された治療指標を有する新規なシクロスポリン類縁体が、いまだに大いに必要とされている。
【０００７】
本発明は、これらの目的を達成することを目的とする。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,525,590号
【特許文献２】米国特許第5,643,870号
【特許文献３】米国特許第5,639,852号
【特許文献４】米国特許第5,236,899号
【特許文献５】米国特許第5,122,511号
【特許文献６】米国特許第4,914,188号
【特許文献７】米国特許第4,771,122号
【特許文献８】米国特許第4,764,503号
【特許文献９】米国特許第4,396,542号
【特許文献１０】米国特許第4,210,581号
【特許文献１１】米国特許第6,605,593号
【特許文献１２】米国特許第6,613,739号
【特許文献１３】国際公開公報第03/033010号
【特許文献１４】国際公開公報第02/069902号
【非特許文献１】Matsuda et al.,「Mechanisms of Action of Cyclosporin」, Immunopharmacology, 47:119-125 (2000)
【非特許文献２】Lazarova et al.,「Cyclosporin A Analogues: Recent Advances」, Expert Opin. Ther. Patents, 13:1327-1332 (2003)
【非特許文献３】Abel et al.,「ISATX247: A Novel Calcineurin Inhibitor」, J. Heart Lung Transplant, 20:161 (2001)
【非特許文献４】Aspeslet et al.,「ISATX247: A Novel Calcineurin Inhibitor」, Transplantation Proceedings, 33:1048-1051 (2001)
【非特許文献５】Lazarova et al.,「Synthesis and Biological Evaluation of Cyclosporin A Analogues: Potential Soft Drugs for the Treatment of Autoimmune Diseases」, J. Med. Chem., 46:674-676 (2003)
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明の化合物は下記の式Iまたはその薬学的に許容される塩によって表される：
式I
式中、
XはOHまたはOAcであり；
R0はH、CH2OH、またはCH2OR2であり；
R1は下記からなる群より選択され：
水素；
ハロゲン；
C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
一つまたは複数の重水素、ハロゲン、窒素、硫黄、およびケイ素原子からなる群より選択される一つまたは複数の置換を含む、C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
アルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸エステル、およびアミドからなる群より選択される一つまたは複数の官能基を含む、C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
アリールまたはヘテロアリールを含む、C2-C4飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6置換および無置換シクロアルキル；
置換および無置換アリール；
置換および無置換ヘテロアリール；
-CH2OH；
-CHO；
-CH=N-OR3；および
-CH=N-NR3R4；
R2は下記からなる群より選択され：
アルカノイル；
アルケノイル；
アルキノイル；
アリーロイル；
アリールアルカノイル；
アルキルアミノカルボニル；
アリールアミノカルボニル；
アリールアルキルアミノカルボニル；
アルキルオキシカルボニル；
アリールオキシカルボニル；および
アリールアルキルオキシカルボニル；
R3またはR4は同じまたは異なり、下記からなる群より独立に選択され：
水素；
C1-C6飽和の直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6不飽和の直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6-置換および無置換シクロアルキル；
アリールまたはヘテロアリールを含むC1-C4炭素鎖；
置換および無置換アリール；
置換および無置換ヘテロアリール；
アルカノイル：
アルケノイル；
アルキノイル；
アリーロイル；
アリールアルカノイル；
アルキルアミノカルボニル；
アリールアミノカルボニル；
アリールアルキルアミノカルボニル；
アルキルオキシカルボニル；
アリールオキシカルボニル；および
アリールアルキルオキシカルボニル；ならびに
R3はR4と一緒になって、一つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよいC2-C6の環状部分を形成する。
【００１０】
本発明は、シクロスポリンAの一位アミノ酸の側鎖上に炭素-炭素三重結合および任意で三位アミノ酸上に置換を含む化学的に修飾されたシクロスポリン類縁体を開示する。特に、本発明は、アリールとの炭素-炭素三重結合、炭素-窒素二重結合、または他の炭素-炭素三重結合の共役系を含む新規なシクロスポリンアルキン類縁体を開示する。
【００１１】
本発明は、免疫抑制剤として効果的である新規なシクロスポリン類縁体を提供する。本発明のいくつかの化合物は、シクロスポリンAよりも強化された免疫抑制活性を保有する。これらの化合物は、眼アレルギーおよびドライアイ、ならびに喘息、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、および潰瘍性大腸炎などの自己免疫および慢性炎症性疾患の処置における実用性も保有する。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の化合物は下記の式Iまたはその薬学的に許容される塩によって表される：
式I
式中、
XはOHまたはOAcであり；
R0はH、CH2OH、またはCH2OR2であり；
R1は下記からなる群より選択され：
水素；
ハロゲン；
C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
一つまたは複数の重水素、ハロゲン、窒素、硫黄、およびケイ素原子からなる群より選択される一つまたは複数の置換を含む、C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
アルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸エステル、およびアミドからなる群より選択される一つまたは複数の官能基を含む、C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
アリールまたはヘテロアリールを含む、C2-C4飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6置換および無置換シクロアルキル；
置換および無置換アリール；
置換および無置換ヘテロアリール；
-CH2OH；
-CHO；
-CH=N-OR3；および
-CH=N-NR3R4；
R2は下記からなる群より選択され：
アルカノイル；
アルケノイル；
アルキノイル；
アリーロイル；
アリールアルカノイル；
アルキルアミノカルボニル；
アリールアミノカルボニル；
アリールアルキルアミノカルボニル；
アルキルオキシカルボニル；
アリールオキシカルボニル；および
アリールアルキルオキシカルボニル；
R3またはR4は同じまたは異なり、下記からなる群より独立に選択され：
水素；
C1-C6飽和の直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6不飽和の直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6-置換および無置換シクロアルキル；
アリールまたはヘテロアリールを含むC1-C4炭素鎖；
置換および無置換アリール；
置換および無置換ヘテロアリール；
アルカノイル：
アルケノイル；
アルキノイル；
アリーロイル；
アリールアルカノイル；
アルキルアミノカルボニル；
アリールアミノカルボニル；
アリールアルキルアミノカルボニル；
アルキルオキシカルボニル；
アリールオキシカルボニル；および
アリールアルキルオキシカルボニル；ならびに
R3はR4と一緒になって、一つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよいC2-C6の環状部分を形成する。
【００１３】
本発明の一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がHである、前述の式Iの化合物である。
【００１４】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がF、Cl、Br、およびIからなる群より選択される、前述の式Iの化合物である。
【００１５】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がCH=CH2、CH=CHCH3、CH=CHCH2CH3、C(CH3)=CH2、CH=CD2、CH=CHCD3、およびCH=CDCD3からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、前述の式Iの化合物である。
【００１６】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がCH=CHF、CH=CHCl、CH=CHBr、CH=CHI、CH=CF2、およびCH=CCl2からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、前述の式Iの化合物である。
【００１７】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がC≡CH、C≡CCH3、C≡CCD3、C≡CCH2CH3、C≡CCH2CH2CH3、およびC≡C-シクロプロピルからなる群より選択される、前述の式Iの化合物である。
【００１８】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がCH2C≡CH、CH2C≡CCH3、CH2C≡CCH2CH3、CH2CH=CH2、CH2CH=CHCH3、およびCH2CH=CHCH2CH3からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、前述の式Iの化合物である。
【００１９】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がC≡C-C≡CH、C≡C-C≡CCH3、C≡CCH=CH2、C≡CCH=CHCH3、CH=CHC≡CH、CH=CHC≡CCH3、CH=CHCH=CH2、およびCH=CHCH=CHCH3からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、前述の式Iの化合物である。
【００２０】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がシクロプロピルである、前述の式Iの化合物である。
【００２１】
本発明のもう一つの態様は、XがOHまたはOAcであり；R0がH、CH2OH、またはCH2OAcであり；かつR1がCH2OH、-CHO、CH(OH)CH3、C(=O)CH3、CH=N-OCH3、CH=N-OCH2CH3、CH=N-NHCH3、およびCH=N-N(CH3)2からなる群より選択される、前述の式Iの化合物である。
【００２２】
本発明の他の態様は、X=OHまたはOAc；R0=H；かつR1がH、C6H5-、p-FC6H4-、p-CH3OC6H4-、2-チオフェニル、CH2Ph、CH2CH=CH2、CH2C≡CH、CH2C≡CHCH3、CH2C≡CHSi(CH3)3、Br、CH2Cl、CH=CH2、CH=CHCH3（トランス）、CH=CHCH3（シス）、CH=CHCl（トランス）、CH=CHCl（シス）、CH=CHSi(CH3)3（トランス）、C(CH3)=CH2、CH=CHPh、CH=CHCO2Et（シス）、CH=C=CH2、C≡CH、C≡CCH3、C≡CCD3、C≡CCH2CH3、C≡CC4H9、C≡CSi(CH3)3、C≡C-3-チオフェン、C≡C-Ph、C≡CBr、C≡C-シクロプロピル、C≡C-シクロヘキシル、C≡CCH2OH、C≡CCH2OCH3、C≡CCH2SCH2CH3、C≡CCH2N(CH3)2、C≡CCH=CH2、C≡CC(CH3)=CH2、C≡CCH=CHCH3（シス）、C≡CCH=CHCH3（トランス）、CH=CHC≡CH、CH=CHC≡CCH2CH2CH3、CH=CHC≡C-シクロプロピル、CH2OH、CHO、C=N-OCH3、およびC=N-N(CH3)2からなる群より選択される、前述の式Iの化合物を含む。
【００２３】
本発明の他の態様は、X=OHまたはOAc；R0=CH2OHまたはCH2OAc；かつR1がH、CH=CH2、CH=CHCH3（シス）、CH=CHCH3（トランス）、およびCH=CHCl（シス）からなる群より選択される、前述の式Iの化合物を含む。
【００２４】
特に、本発明は、シクロスポリンAの1位アミノ酸の側鎖に炭素-炭素三重結合と、任意で3位アミノ酸に置換を含む、新規シクロスポリン類縁体に関する。特に、本発明は、アリール、もしくはヘテロアリール、もしくは炭素-炭素二重結合、もしくは炭素-窒素二重結合、もしくは別の炭素-炭素三重結合と共役している炭素-炭素三重結合が組み込まれている、新規シクロスポリンアルキン類縁体に関する。
【００２５】
炭素-炭素三重結合は多くの天然物中に存在する（Gung et al, 「Total Synthesis of (S)-(-)-(E)-15,16-Dihydrominquartynoic Acid: A Highly Potent Anticancer Agent」, J. Org. Chem., 69:3488-3492 (2004)；Ito et al., 「Cytotoxic Polyacetylenes from the Twigs of Ochanostachys amentacea」, J. Nat. Prod., 64:246-248 (2001)、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。アルキンを医用薬剤として用いることは周知である。しかし、シクロスポリンAの1位アミノ酸の側鎖における炭素-炭素二重結合が炭素-炭素三重結合で置き換えられている、一つのシクロスポリンアルキンだけが文献で知られている。残念なことに、この改変はシクロスポリンAの免疫抑制活性を著しく低下させ、この公知のシクロスポリンアルキンは、シクロスポリンAに比べてわずか10％の相対免疫抑制活性しか示さない（Rich et al., 「Synthesis, Conformation, and Immunosuppressive Activities of Three Analogues of Cyclosporin A Modified in the 1-Position」, J. Med. Chem., 33:999-1009 (1990)。これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。これとは対照的に、炭素-炭素三重結合と炭素-炭素二重結合または炭素-炭素三重結合との共役系を含む、本発明の新規シクロスポリンアルキン類縁体は、シクロスポリンAよりも高い免疫抑制活性を有する。
【００２６】
本発明は、式Iで表される化合物の調製法も開示する。
【００２７】
本発明の化合物調製のための出発原料はシクロスポリンAである。シクロウンデカペプチドであるシクロスポリンAの構造、および環内の各アミノ酸の位置の番号づけを以下に示す：
シクロスポリンA（CsA）
【００２８】
シクロスポリンAは下記の式IIaで表すこともできる：
式IIa
【００２９】
本発明の新規シクロスポリン類縁体は、シクロスポリンAまたはシクロスポリンAの3位アミノ酸での改変により調製された鍵となる中間体であるシクロスポリンジオール（式IIb）から誘導される。スキーム1に示すとおり、シクロスポリンジオール中間体は、シクロスポリンAのリチウムジイソプロピルアミド（LDA）による脱プロトン化と、続くホルムアルデヒド処理により調製することができる（Seebach et al, 「Modification of Cyclosporin A: Generation of an Enolate at the Sarcosine Residue and Reaction with Electrophiles」, Helv. Chim. Acta, 76:1564-1590 (1993)。これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
スキーム1
【００３０】
本発明の一つの態様に従い、新規シクロスポリン類縁体は、シクロスポリンAの1位アミノ酸の側鎖における炭素-炭素二重結合を炭素-炭素三重結合で置き換えることにより調製することができる。スキーム2に示すとおり、シクロスポリンA（式IIa）または式IIbのシクロスポリンジオール中間体の無水酢酸によるアセチル化と、続く二重結合のオゾンによる酸化的切断により、式IIIのシクロスポリンアルデヒドを順調に生成する。式IIIのシクロスポリンアルデヒドをメタノール中、炭酸カリウム存在下、(1-ジアゾ-2-オキソプロピル)ホスホン酸ジメチルで処理することにより、シクロスポリンアルキン（式I、X=OH）を良好な収率で生成する（Muller et al, 「An Improved One-Pot Procedure for the Synthesis of Alkynes from Aldehydes」, Synlett, 521-522 (1996)。これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。アセチル保護基をこれらの反応条件下で除去して、遊離アルコールを直接得ることができる。
スキーム2
【００３１】
式IIIのシクロスポリンアルデヒドを、別法により式Iのシクロスポリンアルキン（X=OHまたはOAc）に変換することもできる（スキーム2）。シクロスポリンアルデヒドのリチオトリメチルシリルジアゾメタン処理により、式Iのシクロスポリンアルキン（X=OH、R0=HまたはCH2OH）が良好な収率で生成する（Ohira et al, 「Generation of Alkylidenecarbenes by the Alkenation of Carbonyl Compounds with Lithiotrimethylsilyldiazomethane」, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 721-722 (1992)。これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）一方、シクロスポリンアルデヒドのリチオトリメチルシリルジアゾメタンとの反応と、続く酸性後処理（Ac2O）により、式Iのアセチルシクロスポリンアルキン（X=OAc、R0=HまたはCH2OAc）が生じる。
【００３２】
前述のシクロスポリンアルキン（式I、X=OH）を鍵となる中間体として用いて、多くのシクロスポリンアルキン誘導体をパラジウムまたはニッケル仲介性カップリングにより調製することができる。スキーム3に示すとおり、シクロスポリンアルキン（式I）と、様々なハロゲン化アリール、ハロゲン化ヘテロアリール、およびハロゲン化ビニルとのソノガシラカップリングにより、それぞれ式IVの新規シクロスポリンアリール化アルキンおよび式Vのシクロスポリンイン-エン類縁体が生成する。同様に、パラジウム触媒カップリングを同じ鍵となる中間体、シクロスポリンアルキン（式I）とハロゲン化アルキルに適用すると、式VIの新規シクロスポリンジインの調製につながる。この方法を用い、炭素-炭素三重結合を段階的に導入して、トリインおよびテトラインなどの複数の炭素-炭素三重結合の共役系を生成することができた。
スキーム3
【００３３】
スキーム4に示すとおり、式VIのシクロスポリンジインを別のアプローチを用いて調製することができる。シクロスポリンアルキン（式I、X=OAc、R1=H）を硝酸銀存在下でN-ブロモスクシンイミドにより臭素化して、シクロスポリン臭化アルキニル（式VIII）を生成する。この方法を用い、N-ブロモスクシンイミドの代わりにN-ヨードスクシンイミドにより、シクロスポリンヨウ化アルキニルなどの他のシクロスポリンハロゲン化アルキニルを得ることもできる。シクロスポリン臭化アルキニル（またはシクロスポリンヨウ化アルキニル）の様々なアルキンとのパラジウム触媒カップリングにより、式VIのシクロスポリンジインを順調に生成する。
スキーム4
【００３４】
本発明のもう一つの態様は、シクロスポリンアルキン（式I、R1=H）のアルキル化に関する。スキーム5に示すとおり、シクロスポリンアルキン（式I、R1=H）を塩基（炭酸セシウム、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム、または他の強塩基）存在下、ハロゲン化アルキルまたはアルデヒドで処理して、アルキル化シクロスポリンアルキン（式IX）を生成する。
スキーム5
【００３５】
本発明のもう一つの態様は、式Iのシクロスポリンアルキンにおける炭素-窒素二重結合（C=N）の組込みに関する。スキーム6に示すとおり、シクロスポリンアルキン（式I、R1=H）をホルムアルデヒドと、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウムを塩基として用いて反応させ、式Xのシクロスポリンジオールを生成する。シクロスポリンジオールの一級アルコールを塩化tert-ブチルジメチルシリルで選択的に保護した後、二級アルコールを無水酢酸でアセチル化し、次いでフッ化テトラブチルアンモニウムにより脱シリル化して、モノアルコール（式XI）を順調に生成する。モノアルコールのスワン酸化により、式XIIのシクロスポリンアルデヒドを生じる。アルデヒドをヒドロキシルアミン、アルキルオキシアミン（RONH2）、またはヒドラジン（R2NNH2）で処理して、それぞれ対応する式VIIのシクロスポリンオキシム（CH=N-OR）およびヒドラゾン（CH=N-NR2）を生成する。
スキーム6
【００３６】
本発明において開示する化合物は、免疫抑制剤として特に有用である。これらの化合物の投与は、臓器移植患者の免疫応答を抑制し、したがって、同種移植片拒絶を予防する。本発明の化合物はシクロスポリンAに比べてほぼ同等、またはそれよりも高い免疫抑制活性を有する。例えば、図1に示すとおり、コンカナバリンA（ConA）刺激マウス脾細胞アッセイにおいて、実施例25に開示するシクロスポリンアルキン類縁体化合物はシクロスポリンAよりも2倍強力な免疫抑制活性を示す一方で、実施例10に開示するシクロスポリンアルキン類縁体化合物はシクロスポリンAとほぼ同等の効力を示す。表1は、本出願において開示するいくつかの新規シクロスポリンアルキン類縁体化合物の免疫抑制活性を示す。（表1の三番目のカラムは、比較のためにシクロスポリンA陽性対照の値を含む。）
【００３７】
（表１）本発明の新規シクロスポリンアルキン類縁体化合物の免疫抑制活性
【００３８】
本発明において開示される化合物は、いくつかを挙げると、喘息、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、および潰瘍性大腸炎などの自己免疫および慢性炎症性疾患の処置における有用性も保有する。
【００３９】
加えて、本発明において開示される化合物は、眼アレルギーおよびドライアイの処置に対して有用である。Allerganは、涙液産生が眼炎症のために抑制されていると推定される患者における乾性角結膜炎または慢性ドライアイ症候群の処置のためのレスタシス（商標）（シクロスポリン点眼乳液）と呼ばれるシクロスポリンAの局所製剤を現在販売している。レスタシス（商標）の正確なメカニズムは未知であるが、抗炎症効果を有する免疫賦活剤として作用すると考えられる（「Annual Update 2003: Ophthalmic Drugs」, Drugs of the Future, 28(3): 287-307 (2003); Clark et al.,「Ophthalmic Drug Discovery」, Nature Reviews in Drug Discovery, 2:448-459 (2003)、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【００４０】
上述の疾患の処置に対して、本発明の化合物の治療的有効用量は、従来的な非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、および媒体を含む投薬単位製剤において、経口で、局所的に、非経口で、吸入スプレーによって、または経直腸的に投与され得る。本明細書において使用されるような非経口という語は、皮下注射、静脈内、筋内、胸骨内注射、または輸液技術を含む。
【００４１】
活性成分を含む薬学的組成物は、例えば錠剤、トローチ、薬用キャンディー、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、乳液、硬もしくは軟カプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤としてなど、経口使用に適した形態であり得る。本発明の薬学的組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容される担体と共に製剤される活性成分を含む。本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」という語は、非毒性、不活性固体、半固体、もしくは液体充填剤、希釈剤、封入物質、または任意の型の製剤補助剤を意味する。薬学的に許容される担体のいくつかの例は、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；コーンスターチまたはポテトスターチなどのスターチ；セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのその誘導体；粉末トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；アガー；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；ピロゲンフリー水；等張生理食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸バッファー溶液；ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの非毒性、適合潤滑剤；ならびに着色剤、放出剤、甘味剤、ならびに香味および香料剤である。エチルまたはn-プロピルp-ヒドロキシベンゾエートなどの保存剤および抗酸化剤が、薬学的組成物に含まれてもよい。
【００４２】
本発明において開示される化合物の局所または経皮的投与に対する投薬形態は、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、硬膏、パップ、粉末、溶液、スプレー、吸入、またはパッチを含む。活性構成要素は、必要とされ得るように、薬学的に許容される担体および任意の必要とされる保存剤またはバッファーと滅菌条件下で混和される。軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、スターチ、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、ならびに酸化亜鉛、またはその混合物などの賦形剤を含み得る。
【００４３】
鼻腔投与に対して、本発明において開示される化合物は、鼻腔アプリケーターから、適した液体または粉末形態で投与され得る。眼科使用に適した形態は、当技術分野において公知のように、ローション、チンキ剤、ゲル、軟膏、および眼科挿入剤（inserts）を含むと思われる。直腸投与（結腸の局所治療）に対して、本発明の化合物は、坐薬または浣腸剤形態で、特に溶液において、例えば停留浣腸としての使用に対する植物油においてまたは油性システムにおいて投与され得る。
【００４４】
本発明において開示される化合物は、ネブライザー形態でまたは乾燥粉末として、吸入経路によって肺に送達され得る。喘息ならびに気道閉塞および/または慢性鼻腔炎のその他の疾患の処置における、全身経路を超える吸入経路の利点は、患者が非常に少ない量の薬物に曝露され、かつ化合物が作用の部位に直接的に送達されることである。
【００４５】
本発明において同定される病弊の処置に対して採用される本発明の化合物の投薬は、処置の部位、処置される特定の状態、状態の重症度、処置される被験者（体重、年齢、全般的健康、性別、およびその他の因子において変化し得る）、ならびに望ましい効果に依存して変化すると思われる。
【００４６】
1日あたり、体重のキログラムあたり約0.05 mg〜約50 mgの範囲である投薬レベルが、本発明において同定される状態または疾患の処置に対して有用である。これは、投与される本発明において開示される化合物の量が、1日あたり、患者あたり2.5 mg〜約2.5 gmの範囲であると思われることを意味する。
【００４７】
単一の投薬形態を産生するために薬学的担体物質と組み合わせられ得る活性成分の量は、処置される宿主および投与の特定の様式に依存して変化すると思われる。例えば、ヒトの経口投与を目的とする製剤は、総組成物の約5〜95パーセントまで変化し得る適当かつ好都合な量の担体物質と調合される、2.5 mg〜2.5gmの本発明の活性化合物を含み得る。投薬単位形態は、概して、約5 mg〜約500 mgの間の本発明の活性化合物を含むと思われる。局所調製の投薬量は、概して、経口調製物に対して必要とされる用量よりも少ないと思われる（10分の1〜100分の1）。
【００４８】
実施例
実施例1 - シクロスポリンアセテートの調製
塩化メチレン（40 mL）におけるシクロスポリンA（5.0 g、4.16 mmol）、無水酢酸（7.80 mL、83.2 mmol）、およびDMAP（760 mg、6.2 mmol）の溶液を、N2空気下で室温でオーバーナイトで攪拌した。飽和重炭酸ナトリウム溶液（200 mL）を溶液に添加し、さらに2時間攪拌した。混合物を、エーテルで抽出し、1 N HClで洗浄し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で中和し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空で濃縮し、白色固体としてシクロスポリンアセテート（4.92 g、95％）を得た。
【００４９】
実施例2 - アセチルシクロスポリンアルデヒドの調製
オゾンを、青色が発色するまで、-78℃で塩化メチレン（70 mL）における実施例1からのシクロスポリンアセテート（3.0 g、2.4 mmol）の溶液に通気した。混合物を、数分間窒素で脱気し、ジメチルスルフィド（3 mL）を、-78℃で添加した。反応混合物を、室温まで戻し、3時間攪拌した。反応混合物を、真空で濃縮し、残留物は酢酸エチル（300 mL）に溶解し、水（2×70 mL）およびブライン（70 mL）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空で濃縮し、白色固体としてアセチルシクロスポリンアルデヒド（2.79 g、94％）を得た。粗製産物は、さらなる精製をともなわずに次の段階へ持ち越された。
【００５０】
実施例3 - シクロスポリンアルキンの調製
メタノール（20mL）中の実施例2からのアセチルシクロスポリンアルデヒド（1.94g、1.57mmol）の溶液を撹拌しながら、これにメタノール（10mL）中の(1-ジアゾ-2-オキソプロピル)ホスホン酸ジメチル（3.01g、15.7mmol）の溶液と、続いて炭酸カリウム（2.17g、15.7mmol）を加えた。得られた緑色懸濁液を室温で終夜撹拌した。溶液を珪藻土を通してろ過し、ろ液を濃縮した。残渣を酢酸エチル（300mL）に溶解し、水（2×100mL）で洗浄した。合わせた水層を酢酸エチル（100mL）で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮乾固した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキン（848mg、45％）を白色固体で得た。
【００５１】
実施例4 - シクロスポリンアルキンの調製
THF（5mL）中の(トリメチルシリル)ジアゾメタン（4.6mL、Et2O中2.0M溶液、9.2mmol）の溶液を-78℃まで冷却し、これにn-BuLi（3.4mL、ヘキサン中2.5M溶液、8.4mmol）を滴下した。得られた黄色懸濁液を30分間撹拌し、次いでTHF（5mL）中の実施例2からのアセチルシクロスポリンアルデヒド（1.03g、0.84mmol）の溶液を滴下した。混合物を-78℃で30分間撹拌し、次いで15分間で0℃まで温めた。反応を飽和NH4Clで停止した。混合物をEtOAcとH2Oとの間で分配した。水層をEtOAcで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキン（364mg、37％）を白色固体で得た。
【００５２】
実施例5 - シクロスポリンアルキンの酢酸エステルの調製
THF（10mL）中の(トリメチルシリル)ジアゾメタン（4.5mL、Et2O中2.0M溶液、8.9mmol）の溶液を-78℃まで冷却し、これにn-BuLi（3.2mL、ヘキサン中2.5M溶液、8.1mmol）を滴下した。得られた黄色懸濁液を30分間撹拌し、次いでTHF（5mL）中の実施例2からのアセチルシクロスポリンアルデヒド（1.00g、0.81mmol）の溶液を滴下した。混合物を-78℃で5分間撹拌した。反応をTHF（5mL）中の無水酢酸（1.5mL、4.1mmol）およびピリジン（1.4mL、4.9mmol）の混合物で停止し、次いで15分間で室温まで温めた。反応を飽和NH4Clで停止した。混合物をEt2OとH2Oとの間で分配した。水層をEt2Oで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキンの酢酸エステル（389mg、40％）を白色固体で得た。
【００５３】
実施例6 - シクロスポリンアルキンの酢酸エステルの調製
塩化メチレン（5mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（0.44g、0.37mmol）の溶液にピリジン（0.90mL、11.1mmol）と、続いてDMAP（68mg、0.55mmol）および無水酢酸（0.70mL、7.4mmol）を加え、次いで混合物を室温で1.5日間撹拌した。反応混合物をエチルエーテル（100mL）で希釈し、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（30mL）および食塩水（30mL）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキンの酢酸エステル（0.23g、51％）を白色固体で得た。
【００５４】
実施例7 - シクロスポリンイン-エンの調製
トリエチルアミン（2mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（55mg、0.046mmol）、ヨウ化銅(I)（4mg、0.023mmol）、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（16mg、0.023mmol）の混合物にヨウ化ビニル（34μL、0.46mmol）を加え、次いで混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンイン-エン（24mg、43％）を白色固体で得た。
【００５５】
実施例8 - トランス-シクロスポリンイン-エンの調製
トリエチルアミン（2mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（65mg、0.055mmol）、ヨウ化銅(I)（5mg、0.028mmol）、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（20mg、0.028mmol）の混合物にトランス-1,2-ジクロロエチレン（85μL、1.1mmol）を加え、次いで混合物を室温で4時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、トランス-シクロスポリンイン-エン（13mg、19％）を白色固体で得た。
【００５６】
実施例9 - シス-シクロスポリンイン-エンの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（4mL）中の実施例6からのシクロスポリンアルキンの酢酸エステル（166mg、0.14mmol）、ヨウ化銅(I)（13mg、0.068mmol）、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（48mg、0.068mmol）の混合物にシス-1,2-ジクロロエチレン（0.20mL、2.7mmol）を加え、次いで混合物を室温で12時間撹拌した。シス-1,2-ジクロロエチレン（0.10mL、1.3mmol）を補充し、混合物を5時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シス-シクロスポリンイン-エンの酢酸エステル（22mg、13％）を白色固体で得た。
【００５７】
実施例10 - シス-シクロスポリンイン-エンの調製
MeOH（3mL）中の実施例9からのシス-シクロスポリンイン-エンの酢酸エステル（22mg、0.017mmol）の溶液に炭酸カリウム（47mg、0.34mmol）を加え、次いで混合物を室温で8時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（30mL）で希釈し、次いで水（10mL）で洗浄した。水層を分離し、酢酸エチル（30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シス-シクロスポリンイン-エン（16mg、76％）を白色固体で得た。
【００５８】
実施例11 - トランス-シクロスポリンイン-エンの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（2mL）中の実施例6からのシクロスポリンアルキンの酢酸エステル（74mg、0.06mmol）、ヨウ化銅(I)（6mg、0.03mmol）、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（21mg、0.03mmol）の混合物に(2-ブロモビニル)トリメチルシラン（0.18mL、1.2mmol）を加え、次いで混合物を室温で12時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、トランス-シクロスポリンイン-エンの酢酸エステル（16mg、20％）を白色固体で得た。
【００５９】
実施例12 - トランス-シクロスポリンイン-エンの調製
MeOH（2mL）中の実施例11からのトランス-シクロスポリンイン-エンの酢酸エステル（16mg、0.012mmol）の溶液に炭酸カリウム（41mg、0.30mmol）を加え、次いで混合物を室温で8時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（30mL）で希釈し、次いで水（10mL）で洗浄した。水層を分離し、酢酸エチル（30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、トランス-シクロスポリンイン-エン（6mg、40％）を白色固体で得た。
【００６０】
実施例13 - トランス-シクロスポリンイン-エンの調製
トリエチルアミン（2mL）およびテトラヒドロフラン（1mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（40mg、0.03mmol）の混合物にジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（15mg、0.02mmol）、ヨウ化銅(I)（4mg、0.02mmol）およびトランス-1-ブロモプロペン（50μL、0.6mmol）を加え、次いで混合物を室温で3時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。半調製用HPLCで二回精製して、トランス-シクロスポリンイン-エン（5.5mg、15％）を黄色固体で得た。
【００６１】
実施例14 - シス-シクロスポリンイン-エンの調製
トリエチルアミン（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（80mg、0.07mmol）、シス-1-ブロモプロペン（300μL、3.5mmol）およびヨウ化銅(I)（14mg、0.07mmol）の混合物を澄明溶液が生成するまで撹拌した。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（51mg、0.07mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン/酢酸エチル7:3から酢酸エチル）で精製して、褐色固体を得た。固体をさらに半調製用HPLCで二回精製して、シス-シクロスポリンイン-エン（29mg、35％）を白色固体で得た。
【００６２】
実施例15 - シクロスポリンイン-エンの調製
トリエチルアミン（2mL）およびテトラヒドロフラン（1mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（40mg、0.03mmol）の混合物にジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（15mg、0.02mmol）、ヨウ化銅(I)（4mg、0.02mmol）および2-ブロモプロペン（50μL、0.6mmol）を加え、次いで混合物を室温で5時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。半調製用HPLCで二回精製して、シクロスポリンイン-エン（4.5mg、12％）を白色固体で得た。
【００６３】
実施例16 - シクロスポリンイン-エンの調製
トリエチルアミン（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（80mg、0.07mmol）およびヨウ化銅(I)（13mg、0.07mmol）の混合物にブロモスチレン（シスおよびトランス異性体の混合物、180μL、1.4mmol）を加え、次いで混合物を澄明溶液が生成するまで撹拌した。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（50mg、0.07mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン/酢酸エチル7:3から酢酸エチル）で精製して、褐色固体を得た。固体をさらに半調製用HPLCで二回精製して、シクロスポリンイン-エン（17mg、19％）を異性体の混合物（1H NMRによりシス/トランス約1:4）として白色固体で得た。
【００６４】
実施例17 - フェニルシクロスポリンアルキンの調製
トリエチルアミン（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（80mg、0.07mmol）の混合物をN2で5分間脱気した。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（28mg、0.04mmol）、ヨウ化銅(I)（8mg、0.04mmol）およびヨードベンゼン（80μL、0.70mmol）を加え、次いで混合物を室温で1.5時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンフェニルアルキン（7mg、8％）を褐色固体で得た。
【００６５】
実施例18 - 4-メトキシフェニルシクロスポリンアルキンの調製
トリエチルアミン（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（80mg、0.07mmol）、1-ヨード-4-メトキシベンゼン（150μL、1.4mmol）およびヨウ化銅(I)（13mg、0.07mmol）の混合物を澄明溶液が生成するまで撹拌した。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（50mg、0.07mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン/酢酸エチル7:3から酢酸エチル）で精製して、褐色固体を得た。固体をさらに半調製用HPLCで二回精製して、4-メトキシフェニルシクロスポリンアルキン（23mg、26％）を白色固体で得た。
【００６６】
実施例19 - 4-フルオロフェニルシクロスポリンアルキンの調製
トリエチルアミン（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（80mg、0.07mmol）、4-フルオロ-1-ヨードベンゼン（160μL、1.4mmol）およびヨウ化銅(I)（14mg、0.07mmol）の混合物を澄明溶液が生成するまで撹拌した。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（50mg、0.07mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン/酢酸エチル7:3から酢酸エチル）で精製して、褐色固体を得た。固体をさらに半調製用HPLCで二回精製して、4-フルオロフェニルシクロスポリンアルキン（8.9mg、10％）を白色固体で得た。
【００６７】
実施例20 - チオフェン-2-イルシクロスポリンアルキンの調製
トリエチルアミン（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（80mg、0.07mmol）、2-ヨードチオフェン（328mg、1.4mmol）およびヨウ化銅(I)（13mg、0.07mmol）の混合物を澄明溶液が生成するまで撹拌した。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（50mg、0.07mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン/酢酸エチル7:3から酢酸エチル）で精製して、淡褐色固体を得た。固体をさらに半調製用HPLCで二回精製して、チオフェン-2-イルシクロスポリンアルキン（10.7mg、12％）を白色固体で得た。
【００６８】
実施例21 - シクロスポリンジインの酢酸エステルの調製
ピロリジン（1mL）中の実施例6からのシクロスポリンアルキンの酢酸エステル（90mg、0.073mmol）の溶液にヨウ化銅(I)（7mg、0.037mmol）およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（26mg、0.037mmol）を加え、次いで混合物を室温で5分間撹拌した。ヨウ化1-ブチニル（145μL、1.46mmol）を滴下し、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（40mL）で希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液（20mL）で洗浄した。水層を酢酸エチル（2×20mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、所望のシクロスポリンジインの酢酸エステル（15mg、16％）を褐色固体で得た。
【００６９】
実施例22 - シクロスポリンジインの調製
MeOH（2mL）中の実施例21からのシクロスポリンジインの酢酸エステル（18mg、0.014mmol）の溶液に炭酸カリウム（39mg、0.28mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を塩化アンモニウムの飽和溶液で反応停止し、次いで酢酸エチル（3×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンジイン（9mg、53％）を白色固体で得た。
【００７０】
実施例23 - シクロスポリン臭化アルキニルの酢酸エステルの調製
アセトン（5mL）中の実施例6からのシクロスポリンアルキンの酢酸エステル（0.22g、0.18mmol）の溶液にN-ブロモスクシンイミド（64mg、0.36mmol）と、続いて硝酸銀（6mg、0.036mmol）を加えた。反応フラスコをアルミニウムホイルで包んだ。反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いで氷水（20mL）中に注ぎ、酢酸エチル（3×40mL）で抽出した。合わせた有機層を食塩水（30mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリン臭化アルキニルの酢酸エステル（0.23g、98％）を白色固体で得た。
【００７１】
実施例24 - シクロスポリン(トリメチルシリル)ジインの酢酸エステルの調製
ピロリジン（1mL）中の実施例23からのシクロスポリン臭化アルキニルの酢酸エステル（20mg、0.015mmol）の溶液に(トリメチルシリル)アセチレン（42μL、0.30mmol）と、続いてヨウ化銅(I)（3mg、0.015mmol）およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（6mg、0.008mmol）を加え、次いで混合物を室温で1時間撹拌した。反応を塩化アンモニウムの飽和溶液で停止し、次いで酢酸エチル（3×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリン(トリメチルシリル)ジインの酢酸エステル（6mg、30％）を淡褐色固体で得た。
【００７２】
実施例25 - シクロスポリンジインの調製
MeOH（2mL）中の実施例24からのシクロスポリン(トリメチルシリル)ジインの酢酸エステル（9mg、0.007mmol）の溶液に炭酸カリウム（19mg、0.14mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を塩化アンモニウムの飽和溶液で反応停止し、次いで酢酸エチル（3×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンジイン（6mg、71％）を白色固体で得た。
【００７３】
実施例26 - シクロスポリンジインの酢酸エステルの調製
THF（1mL）中の臭化1-プロピニルマグネシウム（0.54mL、THF中0.5M、0.27mmol）の氷冷溶液に塩化亜鉛の溶液（0.27mL、エチルエーテル中1M、0.27mmol）を加えた。反応混合物を0℃で10分間撹拌し、次いで室温まで温めた。THF（1mL）中の実施例23からのシクロスポリン臭化アルキニルの酢酸エステル（35mg、0.027mmol）の溶液を反応混合物に加え、続いてジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（10mg、0.014mmol）を加えた。得られた反応混合物を室温で1.5時間撹拌し、次いで塩化アンモニウムの飽和溶液（10mL）で反応停止した。水層を酢酸エチル（3×20mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンジインの酢酸エステル（14mg、41％）を淡褐色固体で得た。
【００７４】
実施例27 - シクロスポリンジインの調製
MeOH（2mL）中の実施例26からのシクロスポリンジインの酢酸エステル（14mg、0.011mmol）の溶液に炭酸カリウム（30mg、0.22mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を塩化アンモニウムの飽和溶液で反応停止し、次いで酢酸エチル（3×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンジイン（8mg、62％）を白色固体で得た。
【００７５】
実施例28 - シクロスポリンシクロプロピルジインの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（1mL）中のシクロプロピル(トリメチルシリル)アセチレン（37mg、0.27mmol）の氷冷溶液にフッ化テトラブチルアンモニウム（0.32mL、THF中1M、0.32mmol）を加え、次いで混合物を10分間撹拌した。反応混合物を室温まで温め、次いでトリエチルアミン（1mL）中の実施例23からのシクロスポリン臭化アルキニルの酢酸エステル（35mg、0.027mmol）の溶液を混合物に加え、続いてヨウ化銅(I)（3mg、0.014mmol）およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（10mg、0.014mmol）を加えた。得られた反応混合物を室温で5時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（30mL）で希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液（10mL）で洗浄した。水層を酢酸エチル（2×20mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンシクロプロピルジインの酢酸エステル（23mg、66％）を淡褐色固体で得た。
【００７６】
実施例29 - シクロスポリンシクロプロピルジインの調製
MeOH（2mL）中の実施例28からのシクロスポリンシクロプロピルジインの酢酸エステル（20mg、0.015mmol）の溶液に炭酸カリウム（41mg、0.30mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を塩化アンモニウムの飽和溶液で反応停止し、次いで酢酸エチル（3×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンシクロプロピルジイン（16mg、84％）を白色固体で得た。
【００７７】
実施例30 - シクロスポリンジインの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（2mL）中の実施例23からのシクロスポリン臭化アルキニルの酢酸エステル（40mg、0.03mmol）、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（14mg、0.02mmol）、ヨウ化銅(I)（4mg、0.02mmol）およびフェニルアセチレン（30μL、0.30mmol）の混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィ（シリカゲル、100％ヘキサンの後、100％ EtOAc）と、続いて半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンジインの酢酸エステル（11mg、27％）を褐色固体で得た。
【００７８】
実施例31 - シクロスポリンジインの調製
MeOH（1mL）中の実施例30からのシクロスポリンジインの酢酸エステル（11mg、0.008mmol）の溶液に炭酸カリウム（11mg、0.08mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をEtOAcで希釈し、H2O（×2）、食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンジイン（6.6mg、64％）を褐色固体で得た。
【００７９】
実施例32 - シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（1mL）中の実施例24からのシクロスポリン(トリメチルシリル)ジインの酢酸エステル（25mg、0.019mmol）の氷冷溶液にフッ化テトラブチルアンモニウム（95μL、THF中1M、0.095mmol）を加え、次いで混合物を10分間撹拌した。反応混合物を室温まで温め、次いでヨウ化銅(I)（4mg、0.019mmol）およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（13mg、0.019mmol）を混合物に加え、続いてヨウ化ビニル（30μL、0.38mmol）を加えた。得られた反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、所望のシクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステル（6mg、25％）を褐色油状物で得た。
【００８０】
実施例33 - シクロスポリンイン-イン-エンの調製
MeOH（2mL）中の実施例32からのシクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステル（14mg、0.011mmol）の溶液に炭酸カリウム（30mg、0.22mmol）を加え、次いで混合物を室温で12時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（30mL）で希釈し、次いで塩化アンモニウムの飽和溶液（15mL）で洗浄した。水層を分離し、酢酸エチル（2×20mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンイン-イン-エン（10mg、72％）を白色固体で得た。
【００８１】
実施例34 - シス-シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（1mL）中の実施例24からのシクロスポリン(トリメチルシリル)ジインの酢酸エステル（53mg、0.040mmol）の氷冷溶液にフッ化テトラブチルアンモニウム（0.20mL、THF中1M、0.20mmol）を加え、次いで混合物を10分間撹拌した。反応混合物を室温まで温め、次いでヨウ化銅(I)（4mg、0.02mmol）およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（14mg、0.02mmol）を混合物に加え、続いてシス-1-ブロモ-1-プロペン（68μL、0.80mmol）を加えた。得られた反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、所望のシス-シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステル（19mg、37％）を淡褐色固体で得た。
【００８２】
実施例35 - シス-シクロスポリンイン-イン-エンの調製
MeOH（2mL）中の実施例34からのシス-シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステル（19mg、0.015mmol）の溶液に炭酸カリウム（41mg、0.30mmol）を加え、次いで混合物を室温で6時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（40mL）で希釈し、次いで塩化アンモニウムの飽和溶液（20mL）で洗浄した。水層を分離し、酢酸エチル（2×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シス-シクロスポリンイン-イン-エン（10mg、53％）を白色固体で得た。
【００８３】
実施例36 - トランス-シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステルの調製
トリエチルアミン（1mL）中の実施例24からのシクロスポリン(トリメチルシリル)ジインの酢酸エステル（60mg、0.045mmol）の氷冷溶液にフッ化テトラブチルアンモニウム（0.23mL、THF中1M、0.23mmol）を加え、次いで混合物を10分間撹拌した。反応混合物を室温まで温め、次いでヨウ化銅(I)（4mg、0.02mmol）およびジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（16mg、0.02mmol）を混合物に加え、続いてトランス-1-ブロモ-1-プロペン（77μL、0.90mmol）を加えた。得られた反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応混合物をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、所望のトランス-シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステル（26mg、45％）を淡褐色固体で得た。
【００８４】
実施例37 - トランス-シクロスポリンイン-イン-エンの調製
MeOH（3mL）中の実施例36からのトランス-シクロスポリンイン-イン-エンの酢酸エステル（25mg、0.019mmol）の溶液に炭酸カリウム（52mg、0.38mmol）を加え、次いで混合物を室温で12時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（40mL）で希釈し、次いで塩化アンモニウムの飽和溶液（20mL）で洗浄した。水層を分離し、酢酸エチル（2×30mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、トランス-シクロスポリンイン-イン-エン（15mg、63％）を白色固体で得た。
【００８５】
実施例38 - シクロスポリンアルキンの調製
DMF（2mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（50mg、0.04mmol）、炭酸セシウム（325mg、1.0mmol）、ヨウ化ナトリウム（150mg、1.0mmol）およびヨウ化銅(I)（190mg、1.0mmol）の懸濁液を室温で30分間撹拌した。臭化アリル（70μL、0.80mmol）を滴下し、得られた混合物を室温で終夜撹拌した。青色の懸濁液をEt2Oで希釈し、ろ過した。ろ液をH2Oで二回洗浄した。合わせた水層をEt2Oで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキン（25mg、52％）をオフホワイト固体で得た。
【００８６】
実施例39 - シクロスポリンアルキンの調製
DMF（2mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（50mg、0.04mmol）、炭酸セシウム（326mg、1.0mmol）、ヨウ化ナトリウム（152mg、1.0mmol）およびヨウ化銅(I)（190mg、1.0mmol）の懸濁液を室温で30分間撹拌した。臭化ベンジル（100μL、0.8mmol）を滴下し、得られた混合物を室温で終夜撹拌した。青色の懸濁液をEt2Oで希釈し、ろ過した。ろ液をH2Oで二回洗浄した。合わせた水層をEt2Oで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキン（8mg、17％）をオフホワイト固体で得た。
【００８７】
実施例40 - 1-(トリメチルシリル)プロピン-3-イルシクロスポリンアルキンの調製
DMF（2mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（50mg、0.04mmol）、炭酸セシウム（326mg、1.0mmol）、ヨウ化ナトリウム（152mg、1.0mmol）およびヨウ化銅(I)（190mg、1.0mmol）の懸濁液を室温で30分間撹拌した。3-ブロモ-1-(トリメチルシリル)-1-プロピン（0.11mL、0.8mmol）を滴下し、得られた混合物を室温で15分間撹拌した。青色の懸濁液をEt2Oで希釈し、ろ過した。ろ液をH2Oで二回洗浄した。合わせた水層をEt2Oで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、1-(トリメチルシリル)プロピン-3-イルシクロスポリンアルキン（26mg、50％）をオフホワイト固体で得た。
【００８８】
実施例41 - シクロスポリン非共役ジインの調製
MeOH（1mL）中の実施例40からのシクロスポリンアルキン（18mg、0.01mmol）の溶液に炭酸カリウム（20mg、0.14mmol）を加え、次いで混合物を室温で1.5時間撹拌した。反応混合物をEtOAcで希釈し、H2O（2×）、食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリン非共役ジイン（8mg、43％）
を白色固体で得、シクロスポリンアルキニルアレン（6.7mg、36％）
を白色固体で得た。
【００８９】
実施例42 - シクロスポリン非共役ジインの酢酸エステルの調製
DMF（2mL）中の実施例6からのシクロスポリンアルキンの酢酸エステル（50mg、0.05mmol）、炭酸セシウム（326mg、1.0mmol）、ヨウ化ナトリウム（150mg、1.0mmol）およびヨウ化銅(I)（190mg、1.0mmol）の懸濁液を室温で30分間撹拌した。1-ブロモ-2-ブチン（90μL、1.0mmol）を滴下し、得られた混合物を室温で終夜撹拌した。青色の懸濁液をEt2Oで希釈し、ろ過した。ろ液をH2Oで二回洗浄した。合わせた水層をEt2Oで抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリン非共役ジインの酢酸エステル（47mg、73％）を淡褐色固体で得た。
【００９０】
実施例43 - シクロスポリン非共役ジインの調製
MeOH（2mL）中の実施例42からのシクロスポリン非共役ジインの酢酸エステル（47mg、0.04mmol）の溶液に炭酸カリウム（55mg、0.4mmol）を加え、次いで混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物をEtOAcで希釈し、H2O（2×）、食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濃縮した。半調製用HPLCで精製して、シクロスポリン非共役ジイン（23mg、46％）を褐色固体で得た。
【００９１】
実施例44 - シクロスポリンアルキニルアルコールの調製
DMSO（3mL）中の実施例3からのシクロスポリンアルキン（100mg、0.081mmol）およびパラホルムアルデヒド（133mg、0.81mmol）の溶液に水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム（372μL、メタノール中40％溶液、0.81mmol）を10分かけて滴下した。得られた溶液を室温で14時間撹拌した。反応を水で停止し、ジエチルエーテル（4×25mL）で抽出した。合わせた有機層を水、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキニルアルコール（23mg、23％）を白色固体で得た。
【００９２】
実施例45 - シクロスポリンジオールの調製
-78℃でTHF（50 mL）におけるジイソプロピルアミン（2.6 mL、18 mmol）の機械的に攪拌した溶液に、n-ブチルリチウム（6.6 mL、ヘキサンにおける2.5 M、17 mmol）を滴下形式で添加し、次いで、混合物を、0.5時間攪拌した。THF（8 mL）におけるシクロスポリンA（1.0 g、0.83 mmol）の溶液を添加し、次いで、混合物を、-78℃で2時間攪拌した。パラホルムアルデヒド（8.0 g）は、170℃まで加熱し、結果として生じたホルムアルデヒドガスを、2時間にわたって、綿およびアルミホイルでラップされたガラスチューブを介して反応物に移した。-78℃でさらに1時間攪拌した後、反応混合物は、水（10 mL）で反応停止した。混合物を、室温に戻し、酢酸エチル（150 mL）で希釈し、水（2×50 mL）で洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮した。粗物質を、セミ分取HPLCによって精製し、白色固体としてシクロスポリンジオール（0.45 g、44％）を得た。
【００９３】
実施例46 - シクロスポリンジアセテートの調製
塩化メチレン（5 mL）における実施例45からのシクロスポリンジオール（0.43 g、0.35 mmol）の溶液に、ピリジン（0.57 mL、7.0 mmol）、その後4-(ジメチルアミノ)ピリジン（86 mg、0.70 mmol）および無水酢酸（1.0 mL、10.5 mmol）を添加した。反応混合物は、室温で2日間攪拌された。反応物を、エチルエーテル（150 mL）で希釈し、重炭酸ナトリウムの飽和溶液（30 mL）、1N HCl溶液（30 mL）、およびブライン（30 mL）で洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮した。粗物質を、セミ分取HPLCによって精製し、白色固体としてシクロスポリンジアセテート（0.23 g、50％）を得た。
【００９４】
実施例47 - シクロスポリンアルデヒドの調製
オゾンを、青色が発色するまで、-78℃で塩化メチレン（10 mL）における実施例46からのシクロスポリンジアセテート（0.22 g、0.17 mmol）の溶液に通気した。混合物を、数分間窒素で脱気し、ジメチルスルフィド（0.4 mL）を、-78℃で添加した。反応混合物を、室温まで戻し、3時間攪拌した。反応混合物を、真空で濃縮し、残留物は酢酸エチル（120 mL）に溶解し、水（2×20 mL）およびブライン（30 mL）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空で濃縮し、白色固体としてシクロスポリンアルデヒド（0.19 g、86％）を得た。粗製材料は、さらなる精製をともわずに次の段階へ持ち越された。
【００９５】
実施例48 - シクロスポリンアルキンの調製
メタノール（7.5mL）中の実施例47からのシクロスポリンアルデヒド（715mg、0.55mmol）の溶液に炭酸カリウム（760mg、5.5mmol）と、続いてメタノール（4.5mL）中の(1-ジアゾ-2-オキソプロピル)ホスホン酸ジメチル（1.06g、5.5mmol）の溶液を加えた。得られた混合物を室温で終夜撹拌した。溶液を減圧下で濃縮し、次いで酢酸エチル（100mL）で希釈した。有機層を水（40mL）で洗浄した。水層を酢酸エチル（3×50mL）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンアルキン（106mg、16％）を白色固体で得た。
【００９６】
実施例49 - シクロスポリンインーエンの調製
トリエチルアミン（1.5mL）中の実施例48からのシクロスポリンアルキン（43mg、0.04mmol）の溶液にヨウ化銅(I)（4mg、0.02mmol）と、続いてジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)（14mg、0.02mmol）およびヨウ化ビニル（123mg、0.8mmol）を加えた。得られた混合物を室温で2時間撹拌した。溶液をマイクロフィルターを通してろ過し、減圧下で濃縮した。粗製材料を半調製用HPLCで精製して、シクロスポリンイン-エン（106mg、16％）を白色固体で得た。
【００９７】
実施例50 - コンカナバリンA-刺激脾細胞アッセイ
5〜7週齢のオスBALB/cマウスを、CO2吸入によって屠殺した。脾臓が除去し、ナイロン細胞ストレイナーを介して押すことによって解離させた。脾細胞を、RPMI 1640/5％ウシ胎仔血清（FCS）において洗浄し、400×gでペレット化した。次いで、赤血球を、室温で10分間、ACK溶解バッファー（150 mM NH4Cl、1 mM KHCO3、0.1 mM EDTA、脾臓あたり3 mL）に細胞ペレットを再懸濁することによって溶解した。400×gでペレットした後、細胞を、RPMI 1640/5％FCSにおける再懸濁および再ペレットによって洗浄した。細胞ペレットを、RPMI 1640/5％FCSに再懸濁し、細胞凝集体を除去するために、再度細胞ストレイナーに通した。次いで、細胞を計数し、RPMI 1640/10％FCS/50μM 2-メルカプトエタノールにおいて2×106 cells/mlに調整した。細胞生存率を、トリパンブルー染色によって査定した。シクロスポリンAまたはテスト化合物および2マイクログラムのコンカナバリンAを、2×105脾細胞の添加に先行して、96ウェルプレートのウェルに添加した。細胞を、2日間37℃ CO2インキュベーターにおいて培養し、次いで、6時間1μCiの[3H]チミジンでパルスした。細胞を、TomTec 96ウェルプレートハーベスターでフィルターマット上へ採取し、H2Oで溶解した。フィルターマットおよびシンチレーション液を、プラスチックスリーブに密封した。[3H]チミジン取り込みは、Wallac Triluxプレートカウンターで測定した。初めのスクリーニングを、100 ng/mlテスト化合物の固定値で行なった。IC50を、GraphPadソフトウェアを使用して、7ポイント濃度-応答曲線から計算した。
【００９８】
実施例51 - マウスエクスビボ薬力学的アッセイ
インビボ免疫抑制活性は、以下に記載されるように、シクロスポリンAおよび開示されるシクロスポリン類縁体化合物に対して決定され得る。コンカナバリンA-刺激脾細胞活性は、Peterson et al.（Peterson et al.,「A Tacrolimus-Related Immunosuppressant with Biochemical Properties Distinct from Those of Tacrolimus」, Transplantation, 65:10-18 (1998)、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）によって以前に記載される方法またはそのわずかに改変されたバージョンを使用して、インビボで査定され得る。
【００９９】
シクロスポリンAまたは本発明の免疫抑制化合物の最適な用量（テスト薬物の4つの異なる用量プラス薬物をともなわない動物の対照セット）は、オスBALB/cまたはメスC57BLマウスに経口でまたは静脈内に投与された。3匹のマウスが、各々の用量でテストされた。コンカナバリンAは、シクロスポリンAまたは免疫抑制化合物の投与の4時間後に、マウスの尾静脈に注射された。コンカナバリンA注射の1時間後、マウスは安楽死させられ、脾臓が滅菌条件下で除去され、脾細胞増殖の程度が、実施例50において記載されるのと同じ様式で測定された。対照に対するパーセント阻害が、免疫抑制化合物の用量に対して図式的にプロットされ、ED50値が決定された。本発明の化合物に対する各々の用量-応答アッセイは、ED50と等しい単一用量でシクロスポリン対照を伴った。
【０１００】
本発明は、例証を目的として詳細に記載されているが、そのような詳細は、単にその目的のためであり、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、これらに変化が起こり得ることが当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図1は、コンカナバリンA（ConA）刺激マウス脾細胞アッセイの結果を示す図であり、本発明の新規シクロスポリン類縁体化合物（実施例25および10に開示）は、シクロスポリンAに比べて、高いまたはほぼ同等の免疫抑制効力を有することが示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩：
式中、
XはOHまたはOAcであり；
R0はH、CH2OH、またはCH2OR2であり；
R1は下記からなる群より選択され：
水素；
ハロゲン；
C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
一つまたは複数の重水素、ハロゲン、窒素、硫黄、およびケイ素原子からなる群より選択される一つまたは複数の置換を含む、C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
アルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸エステル、およびアミドからなる群より選択される一つまたは複数の官能基を含む、C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
アリールまたはヘテロアリールを含む、C2-C4飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6置換および無置換シクロアルキル；
置換および無置換アリール；
置換および無置換ヘテロアリール；
-CH2OH；
-CHO；
-CH=N-OR3；および
-CH=N-NR3R4；
R2は下記からなる群より選択され：
アルカノイル；
アルケノイル；
アルキノイル；
アリーロイル；
アリールアルカノイル；
アルキルアミノカルボニル；
アリールアミノカルボニル；
アリールアルキルアミノカルボニル；
アルキルオキシカルボニル；
アリールオキシカルボニル；および
アリールアルキルオキシカルボニル；
R3またはR4は同じまたは異なり、下記からなる群より独立に選択され：
水素；
C1-C6飽和の直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6不飽和の直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6-置換および無置換シクロアルキル；
アリールまたはヘテロアリールを含むC1-C4炭素鎖；
置換および無置換アリール；
置換および無置換ヘテロアリール；
アルカノイル：
アルケノイル；
アルキノイル；
アリーロイル；
アリールアルカノイル；
アルキルアミノカルボニル；
アリールアミノカルボニル；
アリールアルキルアミノカルボニル；
アルキルオキシカルボニル；
アリールオキシカルボニル；および
アリールアルキルオキシカルボニル；ならびに
R3はR4と一緒になって、一つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよいC2-C6の環状部分を形成する。
【請求項２】
XがOHまたはOAcであり、かつR0がH、CH2OH、またはCH2OAcである、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
R1がHである、請求項2記載の化合物。
【請求項４】
R1がF、Cl、Br、およびIからなる群より選択される、請求項2記載の化合物。
【請求項５】
R1がCH=CH2、CH=CHCH3、CH=CHCH2CH3、C(CH3)=CH2、CH=CD2、CH=CHCD3、およびCH=CDCD3からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、請求項2記載の化合物。
【請求項６】
R1がCH=CHF、CH=CHCl、CH=CHBr、CH=CHI、CH=CF2、およびCH=CCl2からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、請求項2記載の化合物。
【請求項７】
R1がC≡CH、C≡CCH3、C≡CCD3、C≡CCH2CH3、C≡CCH2CH2CH3、およびC≡C-シクロプロピルからなる群より選択される、請求項2記載の化合物。
【請求項８】
R1がCH2C≡CH、CH2C≡CCH3、CH2C≡CCH2CH3、CH2CH=CH2、CH2CH=CHCH3、およびCH2CH=CHCH2CH3からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、請求項2記載の化合物。
【請求項９】
R1がC≡C-C≡CH、C≡C-C≡CCH3、C≡CCH=CH2、C≡CCH=CHCH3、CH=CHC≡CH、CH=CHC≡CCH3、CH=CHCH=CH2、およびCH=CHCH=CHCH3からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、請求項2記載の化合物。
【請求項１０】
R1がシクロプロピルである、請求項2記載の化合物。
【請求項１１】
R1がCH2OH、-CHO、CH(OH)CH3、C(=O)CH3、CH=N-OCH3、CH=N-OCH2CH3、CH=N-NHCH3、およびCH=N-N(CH3)2からなる群より選択される、請求項2記載の化合物。
【請求項１２】
薬学的に許容される担体と、請求項1記載の化合物の治療上有効な量とを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
哺乳動物における免疫応答の抑制または軽減法であって、
請求項1記載の化合物の治療上有効な量を哺乳動物に、哺乳動物の免疫応答を抑制するのに有効な条件下で投与する段階を含む方法。
【請求項１４】
慢性炎症または自己免疫疾患を有する哺乳動物の治療法であって、
請求項1記載の化合物の治療上有効な量を哺乳動物に、慢性炎症または自己免疫疾患を治療するのに有効な条件下で投与する段階を含む方法。
【請求項１５】
慢性炎症または自己免疫疾患が喘息、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
眼アレルギーおよびドライアイを有する哺乳動物の治療法であって、
請求項1記載の化合物の治療上有効な量を哺乳動物に、眼アレルギーおよびドライアイを治療するのに有効な条件下で投与する段階を含む方法。
【請求項１】
式Iの化合物またはその薬学的に許容される塩：
式中、
XはOHまたはOAcであり；
R0はH、CH2OH、またはCH2OR2であり；
R1は下記からなる群より選択され：
水素；
ハロゲン；
C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
一つまたは複数の重水素、ハロゲン、窒素、硫黄、およびケイ素原子からなる群より選択される一つまたは複数の置換を含む、C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
アルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、カルボン酸エステル、およびアミドからなる群より選択される一つまたは複数の官能基を含む、C2-C6飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
アリールまたはヘテロアリールを含む、C2-C4飽和または不飽和の、直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6置換および無置換シクロアルキル；
置換および無置換アリール；
置換および無置換ヘテロアリール；
-CH2OH；
-CHO；
-CH=N-OR3；および
-CH=N-NR3R4；
R2は下記からなる群より選択され：
アルカノイル；
アルケノイル；
アルキノイル；
アリーロイル；
アリールアルカノイル；
アルキルアミノカルボニル；
アリールアミノカルボニル；
アリールアルキルアミノカルボニル；
アルキルオキシカルボニル；
アリールオキシカルボニル；および
アリールアルキルオキシカルボニル；
R3またはR4は同じまたは異なり、下記からなる群より独立に選択され：
水素；
C1-C6飽和の直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6不飽和の直鎖または分枝炭素鎖；
C3-C6-置換および無置換シクロアルキル；
アリールまたはヘテロアリールを含むC1-C4炭素鎖；
置換および無置換アリール；
置換および無置換ヘテロアリール；
アルカノイル：
アルケノイル；
アルキノイル；
アリーロイル；
アリールアルカノイル；
アルキルアミノカルボニル；
アリールアミノカルボニル；
アリールアルキルアミノカルボニル；
アルキルオキシカルボニル；
アリールオキシカルボニル；および
アリールアルキルオキシカルボニル；ならびに
R3はR4と一緒になって、一つまたは複数のヘテロ原子を含んでもよいC2-C6の環状部分を形成する。
【請求項２】
XがOHまたはOAcであり、かつR0がH、CH2OH、またはCH2OAcである、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
R1がHである、請求項2記載の化合物。
【請求項４】
R1がF、Cl、Br、およびIからなる群より選択される、請求項2記載の化合物。
【請求項５】
R1がCH=CH2、CH=CHCH3、CH=CHCH2CH3、C(CH3)=CH2、CH=CD2、CH=CHCD3、およびCH=CDCD3からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、請求項2記載の化合物。
【請求項６】
R1がCH=CHF、CH=CHCl、CH=CHBr、CH=CHI、CH=CF2、およびCH=CCl2からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、請求項2記載の化合物。
【請求項７】
R1がC≡CH、C≡CCH3、C≡CCD3、C≡CCH2CH3、C≡CCH2CH2CH3、およびC≡C-シクロプロピルからなる群より選択される、請求項2記載の化合物。
【請求項８】
R1がCH2C≡CH、CH2C≡CCH3、CH2C≡CCH2CH3、CH2CH=CH2、CH2CH=CHCH3、およびCH2CH=CHCH2CH3からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、請求項2記載の化合物。
【請求項９】
R1がC≡C-C≡CH、C≡C-C≡CCH3、C≡CCH=CH2、C≡CCH=CHCH3、CH=CHC≡CH、CH=CHC≡CCH3、CH=CHCH=CH2、およびCH=CHCH=CHCH3からなる群より選択され、ここで炭素-炭素二重結合はシスもしくはトランス幾何異性体またはシスおよびトランス幾何異性体両方の混合物である、請求項2記載の化合物。
【請求項１０】
R1がシクロプロピルである、請求項2記載の化合物。
【請求項１１】
R1がCH2OH、-CHO、CH(OH)CH3、C(=O)CH3、CH=N-OCH3、CH=N-OCH2CH3、CH=N-NHCH3、およびCH=N-N(CH3)2からなる群より選択される、請求項2記載の化合物。
【請求項１２】
薬学的に許容される担体と、請求項1記載の化合物の治療上有効な量とを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
哺乳動物における免疫応答の抑制または軽減法であって、
請求項1記載の化合物の治療上有効な量を哺乳動物に、哺乳動物の免疫応答を抑制するのに有効な条件下で投与する段階を含む方法。
【請求項１４】
慢性炎症または自己免疫疾患を有する哺乳動物の治療法であって、
請求項1記載の化合物の治療上有効な量を哺乳動物に、慢性炎症または自己免疫疾患を治療するのに有効な条件下で投与する段階を含む方法。
【請求項１５】
慢性炎症または自己免疫疾患が喘息、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
眼アレルギーおよびドライアイを有する哺乳動物の治療法であって、
請求項1記載の化合物の治療上有効な量を哺乳動物に、眼アレルギーおよびドライアイを治療するのに有効な条件下で投与する段階を含む方法。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５１５８８６（Ｐ２００８−５１５８８６Ａ）
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３５６９５（Ｐ２００７−５３５６９５）
【出願日】平成１７年９月２１日（２００５．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３３７７０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４１６３１
【国際公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【出願人】（５０６１９０５４４）エーエムアール テクノロジー インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２１日（２００５．９．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３３７７０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４１６３１
【国際公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【出願人】（５０６１９０５４４）エーエムアール テクノロジー インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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