シリカ系メソ多孔体材料−ヘテロ蛋白質複合体及びその製造方法
【課題】シリカ系メソ多孔体材料−へテロ蛋白質内包複合体、その製造方法及び用途を提供する。
【解決手段】シリカ系メソ多孔体（ＦＳＭ）の細孔内部に性質の異なる少なくとも二種類のヘテロ蛋白質を備える蛋白質内包複合体であって、蛋白質が前記ＦＳＭの細孔内に吸着され、分散した状態で安定に固定されており、上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあり、高密度に集積した蛋白質として、前記ＦＳＭの細孔内に吸着されていることからなるヘテロ蛋白質複合体、その製造方法、及び該複合体からなり、機能性を有するヘテロ蛋白質をＦＳＭの細孔内に安定に、且つ分散した状態で吸着させ、その活性を安定に保持させた機能性部材。
【効果】蛍光性又は発光性等の機能性を有するヘテロ蛋白質の活性を安定に保持した新規ＦＳＭ−ヘテロ蛋白質複合体、その製造方法及び機能性部材としての用途を提供することができる。
【解決手段】シリカ系メソ多孔体（ＦＳＭ）の細孔内部に性質の異なる少なくとも二種類のヘテロ蛋白質を備える蛋白質内包複合体であって、蛋白質が前記ＦＳＭの細孔内に吸着され、分散した状態で安定に固定されており、上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあり、高密度に集積した蛋白質として、前記ＦＳＭの細孔内に吸着されていることからなるヘテロ蛋白質複合体、その製造方法、及び該複合体からなり、機能性を有するヘテロ蛋白質をＦＳＭの細孔内に安定に、且つ分散した状態で吸着させ、その活性を安定に保持させた機能性部材。
【効果】蛍光性又は発光性等の機能性を有するヘテロ蛋白質の活性を安定に保持した新規ＦＳＭ−ヘテロ蛋白質複合体、その製造方法及び機能性部材としての用途を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘテロ蛋白質複合体に関するものであり、更に詳しくは、表面を未処理あるいはアルコール処理したシリカ系メソ多孔体の細孔内部に蛍光性又は発光性蛋白質等の機能性ヘテロ蛋白質を備える蛋白質内包複合体、その製造方法及びその用途に関するものである。本発明は、表面を未処理あるいはアルコール処理したシリカ系メソ多孔体の細孔内部にヘテロ蛋白質を導入し、該ヘテロ蛋白質を分散した状態で安定に固定して、その機能を発揮させることを可能とする新規シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体、その製造方法、及び、その機能性部材としての用途に関する新技術を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
サブユニット蛋白質を代表とするヘテロ蛋白質は、生体内での様々な化学反応における反応経路を提供しており、この精細緻密な反応を人工的な蛋白質複合体を用いて再現する手法の開発が、例えば、バイオ技術分野における触媒反応等の化学反応プロセスへの応用に向けて期待されている。
【０００３】
一般に、酵素等の機能性蛋白質は、常温、常圧、中性付近のｐＨにおいて活性を発現するために、試験管内の実験系において、二種類以上の精製蛋白質を用いた複雑な反応経路を再構築する場合、活性酸素種や熱等の外部環境要因により蛋白質が失活し、反応が阻害されることが多い。
【０００４】
この問題を解決するための方法の一つとして、従来技術では、例えば、ＳＢＡ、ＭＣＭ、ＦＳＭタイプ等のシリカ系メソ多孔体材料の細孔内部に、一種類の蛋白質、すなわち、ホモ蛋白質を吸着させ、活性を安定に保持させること等の特徴を有する人工的な蛋白質複合体の開発が進められている（非特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、既往の研究では、シリカ系メソ多孔体材料−ホモ蛋白質複合体に関する報告が多数なされているが（特許文献１、非特許文献２、３）、シリカ系メソ多孔体材料の細孔内部に二種類以上の性質の異なるヘテロ蛋白質を集積するという、シリカ系メソ多孔体材料−ヘテロ蛋白質複合体に関する研究成果については未だ報告がない。そのため、当技術分野においては、シリカ系メソ多孔体の細孔内部において、ヘテロ蛋白質を集積させると同時に、それが達成されたことの実験的証明と証明手法の提案・開発が強く要請されていた。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１５８３５９号公報
【非特許文献１】Ｉ．Ｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，ｖｏｌ．１１０，１１１４−１１２０（２００６）
【非特許文献２】Ａ．Ｋａｔｉｙａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，ｖｏｌ．１０６９，１１９−１２６（２００５）
【非特許文献３】Ｓ．Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，ｖｏｌ．１０９，１９４９６−１９５０６（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況の中で、本発明者らは、前記従来技術に鑑みて、更に、ヘテロ蛋白質を安定に担持することが可能なシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、未処理あるは特定のアルコールによって表面を処理したシリカ系メソ多孔体の細孔内部に、少なくとも二種類のへテロ蛋白質を吸着させ、細孔内部にヘテロ蛋白質を内包させたシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を形成させることにより所期の目的を達成できることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は、前記従来技術を基礎としてなされたものであり、未処理又はアルコール処理したシリカ系メソ多孔体の細孔内部に蛍光性又は発光性等の機能性を有するヘテロ蛋白質を、安定に、活性を保持して、且つ大きな吸着量で吸着担持させた新規シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体、その製造方法、及び、その用途を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）シリカ系メソ多孔体の細孔内部に性質の異なる少なくとも二種類のヘテロ蛋白質を備える蛋白質内包複合体であって、蛋白質が前記シリカ系メソ多孔体の細孔内に吸着され、分散した状態で細孔内に安定に固定されており、上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にある、ことを特徴とするシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（２）前記シリカ系メソ多孔体（ＦＳＭ）が、１）ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体であり、２）細孔のサイズが直径で２〜５０ｎｍであり、３）全細孔容積が０．１〜１．５ｍＬ／ｇであり、４）比表面積が２００〜１５００ｍ２である、前記（１）に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（３）前記シリカ系メソ多孔体が、アルコールで熱処理されたアルコール処理ＦＳＭで、アルコキシ基を有している、前記（１）又は（２）に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（４）アルコール処理ＦＳＭの中心細孔直径が、２．６〜７．１ｎｍである、前記（３）に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（５）前記へテロ蛋白質が、蛍光性又は発光性蛋白質である、前記（１）から（４）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（６）前記へテロ蛋白質の相互作用が、ヘテロ蛋白質間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、又は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）である、前記（１）から（５）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（７）機能性を有するヘテロ蛋白質の活性を安定に保持する、前記（１）から（６）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（８）前記蛍光性へテロ蛋白質が、ドナーとしてのオワンクラゲ由来ＧＦＰ、アクセプターとしてのイソギンチャク由来ＤｓＲｅｄの組み合わせからなる、前記（６）に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（９）前記発光性へテロ蛋白質が、ドナーとしてのウミシイタケ由来ルシフェラーゼ、アクセプターとしての前記ＧＦＰ、又は、ドナーとしてのホタル由来ルシフェラーゼ、アクセプターとしての前記ＤｓＲｅｄの組み合わせからなる、前記（６）に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（１０）前記（６）に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の前記エネルギー移動によるＦＲＥＴ又はＢＲＥＴのシグナル強度を利用することによって、蛍光性又は発光性蛋白質を検出することを特徴とする当該蛋白質の検出方法。
（１１）アルコール処理又は未処理のシリカ系メソ多孔体の細孔内部に性質の異なる少なくとも二種類のへテロ蛋白質を吸着させ、分散した状態で細孔内に安定に固定させることにより上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあるヘテロ蛋白質内包複合体を作製することを特徴とするシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の製造方法。
（１２）シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径を変えることにより、ヘテロ蛋白質の向きを制御する、前記（１１）記載の製造方法。
（１３）前記（１）から（９）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体からなり、機能性を有するヘテロ蛋白質をシリカ系メソ多孔体の細孔内に安定に、且つ分散した状態で吸着、保持させたことを特徴とするヘテロ蛋白質内包機能性部材。
【００１０】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、未処理又はアルコール処理したシリカ系メソ多孔体の細孔内部に少なくとも二種類のヘテロ蛋白質を備える蛋白質内包複合体であって、蛋白質が前記未処理又はアルコール処理したシリカ系メソ多孔体の細孔内に吸着され、分散した状態で細孔内に安定に固定されていること、更には、上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあること、を特徴とするものである。
【００１１】
本発明において、ヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあるとは、蛍光性又は発光性等の機能性を有する二種類以上のヘテロ蛋白質がシリカ系メソ多孔体の細孔内において互いに近接して存在し、且つその機能の発現に相互に作用を及ぼす状態にあることを意味するものとして定義される。これは、例えば、蛍光性又は発光性ヘテロ蛋白質の場合、具体的には、（１）二種類のヘテロ蛋白質間の距離が１０ｎｍ以内に近接し、（２）ドナーの蛍光又は発光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルの重なりが大きく、（３）近接した二つの蛋白質の向きが平行に近づくほど、ＦＲＥＴ又はＢＲＥＴの効率が高くなり、その機能の発現に相互に作用を及ぼす状態にあることを意味する。
【００１２】
本発明で、シリカ系メソ多孔体とは、ＳＢＡ、ＭＣＭ、ＦＳＭタイプ等のシリカ系メソ多孔体のことを意味する。上記シリカ系メソ多孔体として、好適には、例えば、ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体であり、細孔のサイズがメソ孔であり、その中心細孔直径が２〜５０ｎｍであり、細孔容積が０．１〜１．５ｍＬ／ｇであり、比表面積が２００〜１５００ｍ２である、ことで特徴付けられる特定のシリカ系メソ多孔体が用いられるが、その他にも、ヘキサゴナル、又はキュービックの規則的細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体が好適なものとして例示される。
【００１３】
また、本発明では、前記へテロ蛋白質が、例えば、蛍光性又は発光性蛋白質であり、前記へテロ蛋白質の相互作用が、ヘテロ蛋白質間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）、又は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ：Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）であること、が好ましい実施の態様として例示される。
【００１４】
本発明では、上記シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合の構成として、例えば、前記蛍光性へテロ蛋白質が、ドナーとしてのオワンクラゲ由来ＧＦＰ、アクセプターとしてのイソギンチャク由来ＤｓＲｅｄの組み合わせからなること、前記発光性へテロ蛋白質が、ドナーとしてのウミシイタケ由来ルシフェラーゼ、アクセプターとしての前記ＧＦＰ、また、ドナーとしてのホタル由来ルシフェラーゼ、アクセプターとしての前記ＤｓＲｅｄの組み合わせからなること、が例示される。しかし、これらに制限されるものではなく、任意の機能性を持つヘテロ蛋白質を組み合わせることができる。
【００１５】
また、本発明は、未知の蛍光性又は発光性蛋白質の検出方法であって、上記シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の前記エネルギー移動によるＦＲＥＴ又はＢＲＥＴのシグナル強度を利用することによって、蛍光性又は発光性蛋白質を検出すること、を特徴とするものである。また、本発明は、シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の製造方法であって、アルコール処理又は未処理のシリカ系メソ多孔体の細孔内部に性質の異なる少なくとも二種類のへテロ蛋白質を吸着させ、分散した状態で細孔内に安定に固定させることにより、上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあるヘテロ蛋白質内包複合体を作製すること、を特徴とするものである。更に、本発明は、上記シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体からなり、機能性を有するヘテロ蛋白質をシリカ系メソ多孔体の細孔内に安定に、且つ分散した状態で吸着、保持させたことを特徴とするヘテロ蛋白質内包機能性部材、を提供するものである。
【００１６】
次に、本発明に係るシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を、シリカ系メソ多孔体−蛍光性へテロ蛋白質複合体を代表例として説明する。しかし、本発明で用いられるヘテロ蛋白質は、蛍光性へテロ蛋白質に限定されるものではなく、本発明では、シリカ系メソ多孔体−蛍光性へテロ蛋白質複合体に準じて、他の機能性を有する適宜のヘテロ蛋白質についても同様に作製及び利用することが可能である。
【００１７】
本発明では、シリカ系メソ多孔体の細孔内部に、例えば、二種類の蛍光性へテロ蛋白質である“ＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ”を備えるシリカ系メソ多孔体−蛍光性ヘテロ蛋白質複合体であって、前記細孔内部に前記へテロ蛋白質が分散した状態で安定に固定されていることを特徴とするヘテロ蛋白質内包複合体が例示される。
【００１８】
本発明のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体は、好適には、例えば、多孔質で表面積の非常に大きいアルコール処理シリカ系メソ多孔体を使用し、該アルコール処理シリカ系メソ多孔体の細孔内部に蛍光性へテロ蛋白質を吸着させたヘテロ蛋白質内包複合体が例示され、特に、アルコール処理シリカ系メソ多孔体を使用することにより、未処理のシリカ系メソ多孔体を使用した場合と比較して、ヘテロ蛋白質をより安定に集積させることが可能になる。
【００１９】
本発明では、未処理又はアルコール処理シリカ系メソ多孔体における細孔の中心細孔直径は、２〜１５ｎｍであることが望ましい。細孔の中心細孔直径を２〜１５ｎｍとすることにより、個々の蛋白質を容易にシリカ系メソ多孔体に内包することが可能となる。また、本発明のシリカ系メソ多孔体−蛍光性ヘテロ蛋白質複合体では、前記へテロ蛋白質の相互作用を、前記蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のシグナルとして検出することができる。一般に、ＦＲＥＴでは、（１）二種類の蛍光性ヘテロ蛋白質の間の距離が１０ｎｍ以内に近接し、（２）ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルの重なりが大きく、（３）近接した二つの蛋白質の向きが平行に近づくほど、エネルギー移動の効率が高くなる、ことが知られている。
【００２０】
本発明のシリカ系メソ多孔体−蛍光性ヘテロ蛋白質複合体において、ドナーとアクセプターの関係は、ＧＦＰとＤｓＲｅｄの関係に相当し、ＦＲＥＴシグナルの強度によって、シリカ系メソ多孔体の細孔内における前記へテロ蛋白質の集積の程度をモニタリングすることができる。また、細孔の中心細孔直径が、例えば、２、４、６ｎｍと異なるシリカ系メソ多孔体を使用した場合、各々の細孔径の違いにより、近接した二つのヘテロ蛋白質の向きを制御することができ、これによって、ＦＲＥＴ効率を制御することができる。このことは、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）についても同様である。
【００２１】
本発明において、シリカ系メソ多孔体としては、例えば、前記特定のシリカ系メソ多孔体であることが好ましく、有機基を有するシリカ系メソ多孔体、有機基を有しないシリカ系メソ多孔体が例示される。そして、いずれのシリカ系メソ多孔体の場合においても、ケイ素以外の金属元素、例えば、Ａｌ、Ｚｒ、Ｔｉ等を更に含むことができる。なお、いずれのシリカ系メソ多孔体であっても、蛋白質の包摂に適合するように、細孔壁の性質をアルコール処理で変える場合があり、このように処理したものをアルコール処理シリカ系メソ多孔体と称する。
【００２２】
有機基を有するシリカ系メソ多孔体とは、シリカ系メソ多孔体を構成するケイ素原子の少なくとも一部に、有機基が、炭素−ケイ素結合を介して結合しているものを意味する。有機基としては、例えば、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン、シクロアルカン等の炭化水素から１以上の水素がとれて生じる炭化水素基や、アミド基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、スルフォン基、カルボキシル基、エーテル基、アシル基、ビニル基等が挙げられる。
【００２３】
本発明の前記アルコール処理又は未処理のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の製造方法では、前記アルコール処理シリカ系メソ多孔体の場合、例えば、該シリカ系メソ多孔体の粉末と、蛍光性等を有するヘテロ蛋白質の水溶液（トリス緩衝溶液、ｐＨ ４．０〜８．０）とを混合し、４℃で数時間から一晩震盪させ、その後、遠心分離を行うことで、沈殿物として、シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を製造することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）アルコール処理又は未処理のシリカ系メソ多孔体の細孔内部に、二種類以上のヘテロ蛋白質を安定に、且つ多量に吸着させた、上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあるシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を提供することができる。
（２）シリカ系メソ多孔体の細孔内部に担持させるヘテロ蛋白質として、蛍光性蛋白質を用いた場合には、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のシグナル強度によって、蛍光性又は発光性蛋白質の組み合わせを用いた場合には、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のシグナル強度によって、シリカ系メソ多孔体の細孔内におけるヘテロ蛋白質の集積の程度をモニタリングすることができる。
（３）前記エネルギー移動によるＦＲＥＴ又はＢＲＥＴのシグナル強度を利用した新規の蛍光・発光機能性部材を提供することができる。
（４）シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径の違いによって、ヘテロ蛋白質の向きを制御できるため、エネルギー移動効率、すなわち、得られる蛍光の大きさを自在に制御することができる。
（５）前記エネルギー移動により、未知の蛍光性及び発光性蛋白質を検出可能な、新規の蛍光発光機能性部材を提供することができる。
（６）蛍光性及び発光性ヘテロ蛋白質と同様に、他の適宜のヘテロ蛋白質を同様の手法で複合化し、例えば、複数の蛋白質及び酵素を用いた多段階化学反応場を提供することができる。
（７）高濃度蛋白質の凝集による失活を抑制し、高密度集積させて比活性を高くしたシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を提供することができる。
（８）遠心分離操作により、容易に任意の緩衝溶液、又は反応溶液に交換可能なシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
（シリカ系メソ多孔体の合成）
水ガラス１号２７１．５９ｇを水８２８．４１ｇと混合した後、８０℃に加熱した。別途、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド８０ｇを７０℃の水１リットルに添加し、溶解後、トリイソピルベンゼン７０ｍｌ（６０ｇ）を更に添加し、ホモミキサーで３０分撹拌した。この乳化液を水ガラス溶液に瞬時に添加して、更に、５分撹拌した。これに２規定塩酸を約１時間かけて添加し、ｐＨ８．５の状態で約３時間撹拌した。これを吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散・濾過を繰り返し、濾液の伝導度が１００μＳ／ｃｍ以下であることを確認した。これを４５℃で３日間乾燥した後、５５０℃で６時間焼成することにより、中心細孔直径６．２ｎｍのシリカ系メソ多孔体（ＦＳＭ：ｆｏｌｄｅｄ−ｓｈｅｅｔ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）を得た。
【００２７】
上記ＦＳＭについて、粉末Ｘ線回折及び窒素吸着等温線の測定を行った。粉末Ｘ線回折は、理学ＲＡＤ−Ｂ装置を用いて測定し、窒素吸着等温線は、液体窒素温度において、定容積法により求めた。Ｘ線回折パターンにより、上記ＦＳＭは、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有していることが分かった。また、窒素吸着等温線からＣｒａｎｓｔｏｎ−Ｉｎｋｌａｙ法で計算した細孔分布曲線によると、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合は、６０％以上であることが分かった。
【００２８】
（ＦＳＭのエタノール処理）
エタノール溶媒中（１００ｍｌ）に、乾燥させたシリカ多孔体（１ｇ）を加えて撹拌し、分散させた後に、１００℃で２４時間還流を行った。その後、回収した試料は、４５℃で乾燥させた。孔径が均一なシリカ多孔体は、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを鋳型として用いて合成しており、二次元六方構造を有するシリカ多孔体である。これを未処理試料として取り扱うが、未処理体の窒素吸着測定から算出した比表面積は１２１１ｍ２ｇ−１、孔径は６．２ｎｍであった。粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）による分析から、得られた表面処理体は、二次元六方構造を保持していることが確認された。
【００２９】
また、ＩＲ測定により、アルコキシ基が表面に結合していることが確認された。更に、窒素吸着測定から、有機修飾に伴い得られた表面処理体の比表面積（１０５０ｍ２ｇ−１）、孔径（６ｎｍ）は、いずれも減少していることが示された。ここで、細孔容積は、メソ孔表面への処理を評価するため、相対圧９０％での窒素吸着量から算出した。以上から、アルコール処理することで孔表面を初め、シリカ多孔体の表面全てがアルコキシ基で覆われた表面処理体が生成したことが明らかとなった。
【００３０】
（エタノール処理シリカ系メソ多孔体−蛍光性ヘテロ蛋白質複合体の製造）
シリカ系メソ多孔体には、エタノール処理した中心細孔直径６．２ｎｍを有するシリカ系メソ多孔体（ＦＳＭ６．２（特願２００６−２１６１９８）。以下、単に「ＦＳＭ−６．２（ＦＳＭ：ｆｏｌｄｅｄ−ｓｈｅｅｔ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）」と記載する。）を、また、蛍光性ヘテロ蛋白質には、緑色蛍光蛋白質ｓＧＦＰと赤色蛍光蛋白質ＤｓＲｅｄを用いた。
【００３１】
まず、エタノール処理ＦＳＭ−６．２の粉末１０ｍｇと、２ｍｇ／ｍＬのｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを含んだ２０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ８．０）５００μＬとを混合し、４℃で２０時間震盪させた。その後、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い、上清を除き、得られた沈殿物を同じ緩衝溶液１，０００μＬに再懸濁した。更に、これを遠心分離し、緩衝溶液への沈殿物の再懸濁の操作を３〜４回繰り返し、最終的にエタノール処理ＦＳＭ−６．２とヘテロ蛋白質（ｓＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ）の複合体（以下、「ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２」と記載する。）を得た。
【００３２】
前記手法と同様にして、エタノール処理ＦＳＭ−６．２とｓＧＦＰの複合体（以下、「ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２」と記載する。）、また、エタノール処理ＦＳＭ−６．２とＤｓＲｅｄの複合体（以下、「ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２」と記載する。）を得た。図１に、ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２、ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、及び、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２を撮影した写真を示す。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−６．２、ｂはｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２、ｃはＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、ｄはｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、を示す。
【実施例２】
【００３３】
（１）窒素吸着の測定
エタノール処理ＦＳＭ−６．２ ５０ｍｇに対し、ｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを各々１ｍｇ吸着させた複合体を用いて、窒素吸着特性について調べた。図２の左図に、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２の窒素吸脱着等温線を示す。縦軸は、窒素の吸着量を示し、横軸は、その時の相対圧力を示す。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−６．２のみの場合、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、を示す。エタノール処理ＦＳＭ−６．２のみの場合と比較して、エタノール処理ＦＳＭ−６．２にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合に、窒素吸着量が減少しており、このことは、細孔の中にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されていることを示している。
【００３４】
（２）細孔分布の測定
前記窒素吸脱着等温線から細孔分布曲線を求めた。図２の右図に、エタノール処理ＦＳＭ−６．２、及び、ｓＧＦＰ− ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２の細孔分布曲線を示す。縦軸は、細孔容積を示し、横軸は、ＦＳＭ−６．２の中心細孔直径を示す。エタノール処理ＦＳＭ−６．２のみの場合（図中、ａ）と比較して、エタノール処理ＦＳＭ−６．２にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合（図中、ｂ）に、細孔容積が減少しており、このことは、細孔の中にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されていることを示している。また、どちらの場合も、６ｎｍ付近にシャープなピークが見られ、これは６ｎｍ程度の細孔があり、細孔が壊れずに保持されていることを示している。
【００３５】
（３）微分干渉像及び蛍光像の観察
次に、メソシリカ系多孔体及び複合体について、微分干渉像及び蛍光像を観察した。図３に、シリカ系メソ多孔体として、中心細孔直径７．５ｎｍを有するシリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５を用いて、該シリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５にｓＧＦＰを吸着させ、１００倍対物レンズの顕微鏡によって観察した微分干渉像（左図：シリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５のみの場合）及び蛍光像（右図：シリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５の細孔内部にｓＧＦＰを吸着させた場合）を示す。スケールバーは、２０μｍを示す。図３の微分干渉像にみられるひだ状の像は、シリカ系メソ多孔体の細孔の向きを示しており、蛍光像にみられる直線的な蛍光は、細孔内に吸着したｓＧＦＰを直接的に示している。
【実施例３】
【００３６】
実施例１及び実施例２と同様にして、得られたｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２ ２００μＬ分を低散乱セルに移し入れ、蛍光光度計（日立製、Ｆ−４５００）によりＦＲＥＴ観測を行った。図４に、中心細孔直径６．２ｎｍを有するエタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部において、光（ｈν）によって、蛍光性ヘテロ蛋白質としてｓＧＦＰとＤｓＲｅｄが相互作用して、ＦＲＥＴを起こす様子を模式的に示した説明図を示す。
【００３７】
（１）ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２のＦＲＥＴ観測
ｓＧＦＰの蛍光スペクトルを調べた。図５に、ＦＳＭ−６．２の細孔内に吸着させていないｓＧＦＰ及びｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ（上図）と、細孔内に吸着させたｓＧＦＰ及びｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ（下図）のｓＧＦＰの蛍光スペクトルを示す。縦軸は、ｓＧＦＰの蛍光強度を示し、横軸は、波長を示す。
【００３８】
４９０ｎｍで励起した場合、ＦＳＭ−６．２の細孔内に吸着させていないｓＧＦＰとｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄとのピーク強度比（ＦＲＥＴ効率に換算すると、０．１９）と比較して、細孔内に吸着させたｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄのｓＧＦＰ強度は、ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２のそれよりも著しく減少している（ＦＲＥＴ効率に換算すると、０．５１）。
【００３９】
このことは、細孔内において導入されたｓＧＦＰとＤｓＲｅｄがお互いに相互作用し、ＦＲＥＴを起こしたことを示唆している。ＦＲＥＴ効率は、次式によって算出した。
ＦＲＥＴ効率； Ｅ＝１−（Ｆｄ’／Ｆｄ）
Ｆｄ：ＤｓＲｅｄが存在しない時のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度、Ｆｄ’：ＤｓＲｅｄが存在する時のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度。
【００４０】
（２）ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２のＦＲＥＴ観測におけるＤｓＲｅｄ量の影響
次に、ｓＧＦＰの蛍光ピーク強度及びＦＲＥＴ効率について調べた。図６に、ＦＳＭ−６．２の細孔内に予め５０μｇのｓＧＦＰ吸着させ、ＤｓＲｅｄ量（横軸）を指標とした場合のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度（左縦軸）及びＦＲＥＴ効率（右縦軸）をプロットした結果を示す。ＦＲＥＴ効率は、次式によって算出した。
ＦＲＥＴ効率； Ｅ＝ １−（Ｆｄ’／Ｆｄ）
Ｆｄ：ＤｓＲｅｄが存在しない時のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度、 Ｆｄ’：ＤｓＲｅｄが存在する時のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度。
【００４１】
４９０ｎｍで励起した場合、ＦＳＭ−６．２の細孔内に吸着されたｓＧＦＰのピーク強度は、細孔内にＤｓＲｅｄが導入されるにつれて減少した。これに対応して、ＦＲＥＴ効率は、増大する傾向を示した。これらの結果は、細孔内に吸着されたｓＧＦＰに対して、導入されたＤｓＲｅｄが近接し、ヘテロ蛋白質の間でＦＲＥＴが生じたことを示唆している。
【実施例４】
【００４２】
本実施例では、ＦＳＭ−６．２の有無における、ｓＧＦＰの蛍光ピーク強度及びピーク波長に与えるｓＧＦＰ濃度の影響を調べた。その結果を図７に示す。図７より、ＦＳＭ−６．２に吸着させていないｓＧＦＰの場合、蛍光ピーク強度は、ｓＧＦＰ濃度とともに増大し、１ｍｇ／ｍＬをピークに、更に高い濃度領域において蛍光消光を示し、また、ピーク波長は、ｓＧＦＰ濃度の増大にともなって長波長側にシフト（レッドシフト）した（上図）。
【００４３】
ｓＧＦＰの高濃度領域における蛍光消光とレッドシフトは、蛋白質が凝集体を形成していることに起因する。一方、ＦＳＭ−６．２に吸着させたｓＧＦＰの場合、蛍光ピーク強度は、ｓＧＦＰ濃度とともに直線的に増大し、また、ピーク波長は、ｓＧＦＰ濃度の増大によってもほとんど変化せず、ｓＧＦＰ本来の蛍光波長を保持した（下図）。
【００４４】
以上の結果は、ＦＳＭ−６．２は、高濃度のｓＧＦＰの凝集を抑制し、分散した状態で細孔内に安定に固定できることを示唆している。同様の現象は、実施例３の場合にも当てはまる。図８に、凝集体を形成した高濃度の蛍光性ヘテロ蛋白質（ｓＧＦＰ、及びｓＧＦＰとＤｓＲｅｄ）が、エタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部に単分散して導入される様子を模式的に示した説明図を示す。
【実施例５】
【００４５】
（１）窒素吸着の測定
エタノール処理ＦＳＭ−５．４（中心細孔直径５．４ｎｍ）、エタノール処理ＦＳＭ−１６（中心細孔直径２．６ｎｍ）、エタノール処理ＦＳＭ−２２（中心細孔直径３．７ｎｍ）、また、エタノール処理ＦＳＭ−７．１（中心細孔直径７．１ｎｍ）５０ｍｇに対し、ｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを基本的には各々５ｍｇ吸着させた複合体を用いて、窒素吸着特性について調べた。
【００４６】
図９に、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／各種ＦＳＭの窒素吸脱着等温線を示す。縦軸は、窒素の吸着量を示し、横軸は、その時の相対圧力を示す。図中、左上図において、ａはエタノール処理ＦＳＭ−５．４のみの場合、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−５．４の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｃはエタノール処理ＦＳＭ−５．４の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを各々７．５ｍｇ吸着させた場合、を示す。
【００４７】
また、図中、右上図において、ｄはエタノール処理ＦＳＭ−１６のみの場合、ｅはエタノール処理ＦＳＭ−１６の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、左下図において、ｆはエタノール処理ＦＳＭ−２２のみの場合、ｇはエタノール処理ＦＳＭ−２２の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、右下図において、ｈはエタノール処理ＦＳＭ−７．１のみの場合、ｉはエタノール処理ＦＳＭ−７．１の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、を示す。どの中心細孔直径を有するＦＳＭの場合でも、エタノール処理ＦＳＭのみの場合と比較して、エタノール処理ＦＳＭにｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合に、窒素吸着量が減少しており、このことは、細孔の中にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されていることを示している。
【００４８】
（２）細孔分布の測定
次に、前記窒素吸脱着等温線から、細孔分布曲線を求めた。図１０に、エタノール処理ＦＳＭ−５．４、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−５．４、エタノール処理ＦＳＭ−１６、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−１６、エタノール処理ＦＳＭ−２２、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−２２、エタノール処理ＦＳＭ−７．１、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−７．１の細孔分布曲線を示す。縦軸は、細孔容積を示し、横軸は、各種ＦＳＭの中心細孔直径を示す。
【００４９】
どの中心細孔直径を有するＦＳＭの場合でも、エタノール処理ＦＳＭのみの場合（図中、ａ、ｃ、ｅ、ｇ）と比較して、エタノール処理ＦＳＭにｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合（図中、ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）に、細孔容積が減少しており、このことは、細孔の中にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されていることを示している。また、どちらの場合も、２．６ｎｍ、３．７ｎｍ、５．４ｎｍ、７．１ｎｍ付近にシャープなピークが見られ、これは、各種ＦＳＭに２．６ｎｍ、３．７ｎｍ、５．４ｎｍ、７．１ｎｍの細孔があり、細孔が壊れずに保持されていることを示している。
【００５０】
（３）ＦＲＥＴ効率に与えるＦＳＭの中心細孔直径サイズの影響
次に、シリカ系メソ多孔体ＦＳＭの中心細孔直径の違いが与えるＦＲＥＴ効率への影響を調べた。図１１に、中心細孔直径の異なる各種エタノール処理ＦＳＭ（ＦＳＭ−１６、ＦＳＭ−２２、ＦＳＭ−５．４、ＦＳＭ−７．１）１０ｍｇに対し、ｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを各々０．５ｍｇ（図中、ａ）、また、０．２５ｍｇ（図中、ｂ）を吸着させ、これらの複合体のＦＲＥＴ効率を求めた結果を示す。
【００５１】
縦軸は、ＦＲＥＴ効率を示し、横軸は、ＦＳＭの中心細孔直径サイズを示す。ＦＲＥＴ効率は、次式によって算出した。
ＦＲＥＴ効率； Ｅ＝ １−（Ｆｄ’／Ｆｄ）
Ｆｄ：ＤｓＲｅｄが存在しない時のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度、 Ｆｄ’：ＤｓＲｅｄが存在する時のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度。
【００５２】
４９０ｎｍで励起した場合、どの中心細孔直径を有するＦＳＭの場合でも、ｓＧＦＰとＤｓＲｅｄの量が増大すると、ＦＲＥＴ効率も増大し、これは、タンパク質濃度の増加によってタンパク質間の距離がより近接することでエネルギー移動効率が高くなることに起因する。また、ＦＳＭ−１６（中心細孔直径２．６ｎｍ）よりも、ＦＳＭ−２２（中心細孔直径３．７ｎｍ）の場合に、更にＦＲＥＴ効率が高くなり、細孔径が、ＦＳＭ−５．４（中心細孔直径５．４ｎｍ）、ＦＳＭ−７．１（中心細孔直径７．１ｎｍ）と大きくなるにつれて、ＦＲＥＴ効率が低下した。このことは、シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径の違いによって、ヘテロ蛋白質の向きを制御でき、エネルギー移動効率、すなわち、得られる蛍光の大きさを自在に制御することができる可能性があることを示唆している。
【００５３】
（４）微分干渉像及び蛍光像の観察
次に、メソシリカ系多孔体及び複合体について、微分干渉像及び蛍光像を観察した。図１２に、シリカ系メソ多孔体として、中心細孔直径５．４ｎｍを有するエタノール処理ＦＳＭ−５．４を用いて、該シリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４にｓＧＦＰ及びＤｓＲｅｄを同時に吸着させ、１００倍対物レンズの顕微鏡によって観察した微分干渉像（図中、ａ：シリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４のみの場合）を示す。
【００５４】
また、図１２に、蛍光像（図中、ｂ：シリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４の細孔内部に吸着させたｓＧＦＰの蛍光のみを検出した場合、ｃ：シリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４の細孔内部に吸着させたＤｓＲｅｄの蛍光のみを検出した場合）、また、ａ、ｂ、ｃの像を重ね合わせた画像（図中、ｄ）を示す。スケールバーは、１０μｍを示す。図１２の蛍光像にみられる一様に広がる蛍光は、シリカ系メソ多孔体の細孔内に吸着したｓＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの局在を直接的に示している。
【実施例６】
【００５５】
実施例１及び実施例２と同様にして、得られたレニラルシフェラーゼ−ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−８．０ ２００μＬ分を低散乱セルに移し入れ、蛍光光度計（日立製、Ｆ−４５００）によりＢＲＥＴ観測を行った。図１３に、中心細孔直径８．０ｎｍを有するエタノール処理ＦＳＭ−８．０の細孔内部において、基質の化学発光によって、発光性ヘテロ蛋白質としてレニラルシフェラーゼとｓＧＦＰが相互作用して、ＢＲＥＴを起こす様子を模式的に示した説明図を示す。
【００５６】
レニラルシフェラーゼ−ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−８．０のＢＲＥＴの有無を、発光スペクトルを観測することにより調べた。図１４に、ＦＳＭ−８．０の細孔内に吸着させた１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ（図中、ａ）、１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ−０．５ｍｇ／ｍＬ ｓＧＦＰ（図中、ｂ）、また、１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ−１ｍｇ／ｍＬ ｓＧＦＰ（図中、ｃ）の発光スペクトルを示す。縦軸は、発光強度を示し、横軸は、波長を示す。
【００５７】
基質を添加し、化学反応によってレニラルシフェラーゼを励起した時、発光ピーク波長は、１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ／ＦＳＭ−８．０の場合に４９３ｎｍであり、１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ−０．５ｍｇ／ｍＬｓＧＦＰ／ＦＳＭ−８．０の場合に５０６ｎｍを示し、１３ｎｍ分長波長側へシフトした。このシフトした発光波長は、ｓＧＦＰの蛍光が生じたことを示唆している。また、１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ−１ｍｇ／ｍＬ ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−８．０の場合も、同様のシフトを示し、発光強度の著しい増大も示された。
【００５８】
一方、ＦＳＭ−８．０の細孔内に吸着していない、レニラルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼ−ｓＧＦＰ混合溶液では、発光ピーク波長のシフトがみられなかった。以上のことは、細孔内において導入されたレニラルシフェラーゼとｓＧＦＰがお互いに相互作用し、ＢＲＥＴを起こしたことを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
以上詳述したように、本発明は、シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体及びその製造方法に係るものであり、本発明によれば、シリカ系メソ多孔体の細孔内部に性質の異なる二種類以上の機能性ヘテロ蛋白質、例えば、蛍光性及び発光性蛋白質を安定的に十分な吸着量で吸着させ、前記ＦＲＥＴ及びＢＲＥＴを利用した蛋白質間相互作用によって、未知の蛍光性及び発光性蛋白質の検出を可能とするシリカ系メソ多孔体材料−ヘテロ蛋白質複合体を提供することが可能となる。また、本発明のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の製造方法によれば、例えば、シリカ系メソ多孔体の細孔内部に安定に吸着させた機能性へテロ蛋白質を、効率的、且つ確実に製造することができる。本発明は、二種類以上のヘテロ蛋白質の活性を、安定、且つ有効に保持して、その多様な機能性を発揮させることが可能な新規機能性部材を提供することができることから、本発明は、例えば、前記アルコール処理シリカ系メソ多孔体と任意のヘテロ蛋白質を利用した新しい特殊反応場を実現するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】エタノール処理ＦＳＭ−６．２、ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２、ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、及び、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２を撮影した写真である。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−６．２、ｂはｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２、ｃはＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、ｄはｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、である。
【図２】蛍光性ヘテロ蛋白質としてＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されたエタノール処理シリカ系メソ多孔体の、窒素吸脱着等温線（左）と、細孔分布曲線（右）の図である。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−６．２のみの場合、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、である。
【図３】シリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５にｓＧＦＰを吸着させた複合体の微分干渉観察像（左）及び蛍光観察像（右）である。図中、ａはシリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５のみの場合、ｂはシリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５の細孔内部にｓＧＦＰを吸着させた場合、である。
【図４】エタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部に蛍光性ヘテロ蛋白質としてｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを備え、光（ｈν）によってｓＧＦＰからＤｓＲｅｄにＦＲＥＴが生じる様子を模式的に示す説明図である。
【図５】ＦＳＭ−６．２の細孔内に吸着させていないｓＧＦＰ、及びｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ（上）と、細孔内に吸着させたｓＧＦＰ、及びｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ（下）について蛍光観測を行った時のｓＧＦＰの蛍光スペクトルである。図中、ａはｓＧＦＰ（実線）及びｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ（破線）におけるｓＧＦＰの蛍光スペクトル、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部に吸着させたｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合のｓＧＦＰ（実線）及びｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ（破線）におけるｓＧＦＰの蛍光スペクトル、ｃはｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２の模式図（Ｄ：ｓＧＦＰ）、ｄはｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２の模式図（Ｄ：ｓＧＦＰ、Ａ：ＤｓＲｅｄ）、である。
【図６】ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２に対するＤｓＲｅｄ量の影響を、ｓＧＦＰの蛍光ピーク強度及びＦＲＥＴ効率の変化によって評価した図である。図中、ａはｓＧＦＰの蛍光ピーク強度（黒丸印）、ｂはＦＲＥＴ効率（白丸印）、である。
【図７】ＦＳＭ−６．２の有無における、ｓＧＦＰの蛍光ピーク強度及びピーク波長と、ｓＧＦＰ濃度との関係を示した図である。図中、ａはｓＧＦＰのみの場合、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部にｓＧＦＰを吸着させた場合、ｃはｓＧＦＰの蛍光ピーク強度（丸印）、ｄはｓＧＦＰのピーク波長（三角印）、ｅはｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２の蛍光ピーク強度（丸印）、ｆはｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２のピーク波長（三角印）、である。
【図８】蛍光性ヘテロ蛋白質（ｓＧＦＰ、及びｓＧＦＰとＤｓＲｅｄ）の凝集体が、エタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部に単分散して導入される様子を模式的に示す説明図である。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−６．２、ｂはｓＧＦＰの凝集体（Ｄ：ｓＧＦＰ）、ｃはＤｓＲｅｄの凝集体（Ａ：ＤｓＲｅｄ）、ｄはｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２、ｅはｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、である。
【図９】蛍光性ヘテロ蛋白質としてＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されたエタノール処理シリカ系メソ多孔体の、窒素吸脱着等温線の図である。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−５．４（中心細孔直径５．４ｎｍ）のみの場合、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−５．４の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｃはエタノール処理ＦＳＭ−５．４の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを各々７．５ｍｇ吸着させた場合、ｄはエタノール処理ＦＳＭ−１６（中心細孔直径２．６ｎｍ）のみの場合、ｅはエタノール処理ＦＳＭ−１６の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｆはエタノール処理ＦＳＭ−２２（中心細孔直径３．７ｎｍ）のみの場合、ｇはエタノール処理ＦＳＭ−２２の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｈはエタノール処理ＦＳＭ−７．１（中心細孔直径７．１ｎｍ）のみの場合、ｉはエタノール処理ＦＳＭ−７．１の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、である。
【図１０】蛍光性ヘテロ蛋白質としてＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されたエタノール処理シリカ系メソ多孔体の、細孔分布曲線の図である。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−５．４（中心細孔直径５．４ｎｍ）のみの場合、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−５．４の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｃはエタノール処理ＦＳＭ−１６（中心細孔直径２．６ｎｍ）のみの場合、ｄはエタノール処理ＦＳＭ−１６の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｅはエタノール処理ＦＳＭ−２２（中心細孔直径３．７ｎｍ）のみの場合、ｆはエタノール処理ＦＳＭ−２２の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｇはエタノール処理ＦＳＭ−７．１（中心細孔直径７．１ｎｍ）のみの場合、ｈはエタノール処理ＦＳＭ−７．１の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、である。
【図１１】ＦＲＥＴ効率に与えるＦＳＭの中心細孔直径サイズの影響について示した図である。図中、ａは中心細孔直径の異なる各種エタノール処理ＦＳＭ（ＦＳＭ−１６、ＦＳＭ−２２、ＦＳＭ−５．４、ＦＳＭ−７．１）１０ｍｇに対し、ｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを各々０．５ｍｇ吸着させた場合、図中、ｂはｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを各々０．２５ｍｇ吸着させた場合、である。
【図１２】シリカ系メソ多孔体であるエタノール処理ＦＳＭ−５．４にｓＧＦＰ及びＤｓＲｅｄを同時に吸着させた複合体の微分干渉観察像及び蛍光観察像である。図中、ａはシリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４のみの場合、ｂはシリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４の細孔内部に吸着させたｓＧＦＰの蛍光のみを検出した場合、ｃはシリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４の細孔内部に吸着させたＤｓＲｅｄの蛍光のみを検出した場合、ｄはａ、ｂ、ｃの像を重ね合わせた場合、である。
【図１３】エタノール処理ＦＳＭ−８．０の細孔内部に、発光性ヘテロ蛋白質としてレニラルシフェラーゼとｓＧＦＰを備え、基質の化学発光によってレニラルシフェラーゼからｓＧＦＰにＢＲＥＴが生じる様子を模式的に示す説明図である。
【図１４】エタノール処理ＦＳＭ−８．０の細孔内に吸着させたレニラルシフェラーゼ、及びレニラルシフェラーゼ−ｓＧＦＰについて発光観測を行った時の発光スペクトルである。図中、ａは１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ／ＦＳＭ−８．０の発光スペクトル、ｂは１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ−０．５ｍｇ／ｍＬ ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−８．０の発光スペクトル、ｃは１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ−１ｍｇ／ｍＬ ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−８．０の発光スペクトル、である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘテロ蛋白質複合体に関するものであり、更に詳しくは、表面を未処理あるいはアルコール処理したシリカ系メソ多孔体の細孔内部に蛍光性又は発光性蛋白質等の機能性ヘテロ蛋白質を備える蛋白質内包複合体、その製造方法及びその用途に関するものである。本発明は、表面を未処理あるいはアルコール処理したシリカ系メソ多孔体の細孔内部にヘテロ蛋白質を導入し、該ヘテロ蛋白質を分散した状態で安定に固定して、その機能を発揮させることを可能とする新規シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体、その製造方法、及び、その機能性部材としての用途に関する新技術を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
サブユニット蛋白質を代表とするヘテロ蛋白質は、生体内での様々な化学反応における反応経路を提供しており、この精細緻密な反応を人工的な蛋白質複合体を用いて再現する手法の開発が、例えば、バイオ技術分野における触媒反応等の化学反応プロセスへの応用に向けて期待されている。
【０００３】
一般に、酵素等の機能性蛋白質は、常温、常圧、中性付近のｐＨにおいて活性を発現するために、試験管内の実験系において、二種類以上の精製蛋白質を用いた複雑な反応経路を再構築する場合、活性酸素種や熱等の外部環境要因により蛋白質が失活し、反応が阻害されることが多い。
【０００４】
この問題を解決するための方法の一つとして、従来技術では、例えば、ＳＢＡ、ＭＣＭ、ＦＳＭタイプ等のシリカ系メソ多孔体材料の細孔内部に、一種類の蛋白質、すなわち、ホモ蛋白質を吸着させ、活性を安定に保持させること等の特徴を有する人工的な蛋白質複合体の開発が進められている（非特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、既往の研究では、シリカ系メソ多孔体材料−ホモ蛋白質複合体に関する報告が多数なされているが（特許文献１、非特許文献２、３）、シリカ系メソ多孔体材料の細孔内部に二種類以上の性質の異なるヘテロ蛋白質を集積するという、シリカ系メソ多孔体材料−ヘテロ蛋白質複合体に関する研究成果については未だ報告がない。そのため、当技術分野においては、シリカ系メソ多孔体の細孔内部において、ヘテロ蛋白質を集積させると同時に、それが達成されたことの実験的証明と証明手法の提案・開発が強く要請されていた。
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１５８３５９号公報
【非特許文献１】Ｉ．Ｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，ｖｏｌ．１１０，１１１４−１１２０（２００６）
【非特許文献２】Ａ．Ｋａｔｉｙａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，ｖｏｌ．１０６９，１１９−１２６（２００５）
【非特許文献３】Ｓ．Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，ｖｏｌ．１０９，１９４９６−１９５０６（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況の中で、本発明者らは、前記従来技術に鑑みて、更に、ヘテロ蛋白質を安定に担持することが可能なシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、未処理あるは特定のアルコールによって表面を処理したシリカ系メソ多孔体の細孔内部に、少なくとも二種類のへテロ蛋白質を吸着させ、細孔内部にヘテロ蛋白質を内包させたシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を形成させることにより所期の目的を達成できることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は、前記従来技術を基礎としてなされたものであり、未処理又はアルコール処理したシリカ系メソ多孔体の細孔内部に蛍光性又は発光性等の機能性を有するヘテロ蛋白質を、安定に、活性を保持して、且つ大きな吸着量で吸着担持させた新規シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体、その製造方法、及び、その用途を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）シリカ系メソ多孔体の細孔内部に性質の異なる少なくとも二種類のヘテロ蛋白質を備える蛋白質内包複合体であって、蛋白質が前記シリカ系メソ多孔体の細孔内に吸着され、分散した状態で細孔内に安定に固定されており、上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にある、ことを特徴とするシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（２）前記シリカ系メソ多孔体（ＦＳＭ）が、１）ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体であり、２）細孔のサイズが直径で２〜５０ｎｍであり、３）全細孔容積が０．１〜１．５ｍＬ／ｇであり、４）比表面積が２００〜１５００ｍ２である、前記（１）に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（３）前記シリカ系メソ多孔体が、アルコールで熱処理されたアルコール処理ＦＳＭで、アルコキシ基を有している、前記（１）又は（２）に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（４）アルコール処理ＦＳＭの中心細孔直径が、２．６〜７．１ｎｍである、前記（３）に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（５）前記へテロ蛋白質が、蛍光性又は発光性蛋白質である、前記（１）から（４）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（６）前記へテロ蛋白質の相互作用が、ヘテロ蛋白質間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、又は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）である、前記（１）から（５）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（７）機能性を有するヘテロ蛋白質の活性を安定に保持する、前記（１）から（６）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（８）前記蛍光性へテロ蛋白質が、ドナーとしてのオワンクラゲ由来ＧＦＰ、アクセプターとしてのイソギンチャク由来ＤｓＲｅｄの組み合わせからなる、前記（６）に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（９）前記発光性へテロ蛋白質が、ドナーとしてのウミシイタケ由来ルシフェラーゼ、アクセプターとしての前記ＧＦＰ、又は、ドナーとしてのホタル由来ルシフェラーゼ、アクセプターとしての前記ＤｓＲｅｄの組み合わせからなる、前記（６）に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
（１０）前記（６）に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の前記エネルギー移動によるＦＲＥＴ又はＢＲＥＴのシグナル強度を利用することによって、蛍光性又は発光性蛋白質を検出することを特徴とする当該蛋白質の検出方法。
（１１）アルコール処理又は未処理のシリカ系メソ多孔体の細孔内部に性質の異なる少なくとも二種類のへテロ蛋白質を吸着させ、分散した状態で細孔内に安定に固定させることにより上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあるヘテロ蛋白質内包複合体を作製することを特徴とするシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の製造方法。
（１２）シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径を変えることにより、ヘテロ蛋白質の向きを制御する、前記（１１）記載の製造方法。
（１３）前記（１）から（９）のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体からなり、機能性を有するヘテロ蛋白質をシリカ系メソ多孔体の細孔内に安定に、且つ分散した状態で吸着、保持させたことを特徴とするヘテロ蛋白質内包機能性部材。
【００１０】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、未処理又はアルコール処理したシリカ系メソ多孔体の細孔内部に少なくとも二種類のヘテロ蛋白質を備える蛋白質内包複合体であって、蛋白質が前記未処理又はアルコール処理したシリカ系メソ多孔体の細孔内に吸着され、分散した状態で細孔内に安定に固定されていること、更には、上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあること、を特徴とするものである。
【００１１】
本発明において、ヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあるとは、蛍光性又は発光性等の機能性を有する二種類以上のヘテロ蛋白質がシリカ系メソ多孔体の細孔内において互いに近接して存在し、且つその機能の発現に相互に作用を及ぼす状態にあることを意味するものとして定義される。これは、例えば、蛍光性又は発光性ヘテロ蛋白質の場合、具体的には、（１）二種類のヘテロ蛋白質間の距離が１０ｎｍ以内に近接し、（２）ドナーの蛍光又は発光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルの重なりが大きく、（３）近接した二つの蛋白質の向きが平行に近づくほど、ＦＲＥＴ又はＢＲＥＴの効率が高くなり、その機能の発現に相互に作用を及ぼす状態にあることを意味する。
【００１２】
本発明で、シリカ系メソ多孔体とは、ＳＢＡ、ＭＣＭ、ＦＳＭタイプ等のシリカ系メソ多孔体のことを意味する。上記シリカ系メソ多孔体として、好適には、例えば、ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体であり、細孔のサイズがメソ孔であり、その中心細孔直径が２〜５０ｎｍであり、細孔容積が０．１〜１．５ｍＬ／ｇであり、比表面積が２００〜１５００ｍ２である、ことで特徴付けられる特定のシリカ系メソ多孔体が用いられるが、その他にも、ヘキサゴナル、又はキュービックの規則的細孔配列構造を有するシリカ系メソ多孔体が好適なものとして例示される。
【００１３】
また、本発明では、前記へテロ蛋白質が、例えば、蛍光性又は発光性蛋白質であり、前記へテロ蛋白質の相互作用が、ヘテロ蛋白質間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）、又は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ：Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）であること、が好ましい実施の態様として例示される。
【００１４】
本発明では、上記シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合の構成として、例えば、前記蛍光性へテロ蛋白質が、ドナーとしてのオワンクラゲ由来ＧＦＰ、アクセプターとしてのイソギンチャク由来ＤｓＲｅｄの組み合わせからなること、前記発光性へテロ蛋白質が、ドナーとしてのウミシイタケ由来ルシフェラーゼ、アクセプターとしての前記ＧＦＰ、また、ドナーとしてのホタル由来ルシフェラーゼ、アクセプターとしての前記ＤｓＲｅｄの組み合わせからなること、が例示される。しかし、これらに制限されるものではなく、任意の機能性を持つヘテロ蛋白質を組み合わせることができる。
【００１５】
また、本発明は、未知の蛍光性又は発光性蛋白質の検出方法であって、上記シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の前記エネルギー移動によるＦＲＥＴ又はＢＲＥＴのシグナル強度を利用することによって、蛍光性又は発光性蛋白質を検出すること、を特徴とするものである。また、本発明は、シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の製造方法であって、アルコール処理又は未処理のシリカ系メソ多孔体の細孔内部に性質の異なる少なくとも二種類のへテロ蛋白質を吸着させ、分散した状態で細孔内に安定に固定させることにより、上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあるヘテロ蛋白質内包複合体を作製すること、を特徴とするものである。更に、本発明は、上記シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体からなり、機能性を有するヘテロ蛋白質をシリカ系メソ多孔体の細孔内に安定に、且つ分散した状態で吸着、保持させたことを特徴とするヘテロ蛋白質内包機能性部材、を提供するものである。
【００１６】
次に、本発明に係るシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を、シリカ系メソ多孔体−蛍光性へテロ蛋白質複合体を代表例として説明する。しかし、本発明で用いられるヘテロ蛋白質は、蛍光性へテロ蛋白質に限定されるものではなく、本発明では、シリカ系メソ多孔体−蛍光性へテロ蛋白質複合体に準じて、他の機能性を有する適宜のヘテロ蛋白質についても同様に作製及び利用することが可能である。
【００１７】
本発明では、シリカ系メソ多孔体の細孔内部に、例えば、二種類の蛍光性へテロ蛋白質である“ＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ”を備えるシリカ系メソ多孔体−蛍光性ヘテロ蛋白質複合体であって、前記細孔内部に前記へテロ蛋白質が分散した状態で安定に固定されていることを特徴とするヘテロ蛋白質内包複合体が例示される。
【００１８】
本発明のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体は、好適には、例えば、多孔質で表面積の非常に大きいアルコール処理シリカ系メソ多孔体を使用し、該アルコール処理シリカ系メソ多孔体の細孔内部に蛍光性へテロ蛋白質を吸着させたヘテロ蛋白質内包複合体が例示され、特に、アルコール処理シリカ系メソ多孔体を使用することにより、未処理のシリカ系メソ多孔体を使用した場合と比較して、ヘテロ蛋白質をより安定に集積させることが可能になる。
【００１９】
本発明では、未処理又はアルコール処理シリカ系メソ多孔体における細孔の中心細孔直径は、２〜１５ｎｍであることが望ましい。細孔の中心細孔直径を２〜１５ｎｍとすることにより、個々の蛋白質を容易にシリカ系メソ多孔体に内包することが可能となる。また、本発明のシリカ系メソ多孔体−蛍光性ヘテロ蛋白質複合体では、前記へテロ蛋白質の相互作用を、前記蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のシグナルとして検出することができる。一般に、ＦＲＥＴでは、（１）二種類の蛍光性ヘテロ蛋白質の間の距離が１０ｎｍ以内に近接し、（２）ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルの重なりが大きく、（３）近接した二つの蛋白質の向きが平行に近づくほど、エネルギー移動の効率が高くなる、ことが知られている。
【００２０】
本発明のシリカ系メソ多孔体−蛍光性ヘテロ蛋白質複合体において、ドナーとアクセプターの関係は、ＧＦＰとＤｓＲｅｄの関係に相当し、ＦＲＥＴシグナルの強度によって、シリカ系メソ多孔体の細孔内における前記へテロ蛋白質の集積の程度をモニタリングすることができる。また、細孔の中心細孔直径が、例えば、２、４、６ｎｍと異なるシリカ系メソ多孔体を使用した場合、各々の細孔径の違いにより、近接した二つのヘテロ蛋白質の向きを制御することができ、これによって、ＦＲＥＴ効率を制御することができる。このことは、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）についても同様である。
【００２１】
本発明において、シリカ系メソ多孔体としては、例えば、前記特定のシリカ系メソ多孔体であることが好ましく、有機基を有するシリカ系メソ多孔体、有機基を有しないシリカ系メソ多孔体が例示される。そして、いずれのシリカ系メソ多孔体の場合においても、ケイ素以外の金属元素、例えば、Ａｌ、Ｚｒ、Ｔｉ等を更に含むことができる。なお、いずれのシリカ系メソ多孔体であっても、蛋白質の包摂に適合するように、細孔壁の性質をアルコール処理で変える場合があり、このように処理したものをアルコール処理シリカ系メソ多孔体と称する。
【００２２】
有機基を有するシリカ系メソ多孔体とは、シリカ系メソ多孔体を構成するケイ素原子の少なくとも一部に、有機基が、炭素−ケイ素結合を介して結合しているものを意味する。有機基としては、例えば、アルカン、アルケン、アルキン、ベンゼン、シクロアルカン等の炭化水素から１以上の水素がとれて生じる炭化水素基や、アミド基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、スルフォン基、カルボキシル基、エーテル基、アシル基、ビニル基等が挙げられる。
【００２３】
本発明の前記アルコール処理又は未処理のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の製造方法では、前記アルコール処理シリカ系メソ多孔体の場合、例えば、該シリカ系メソ多孔体の粉末と、蛍光性等を有するヘテロ蛋白質の水溶液（トリス緩衝溶液、ｐＨ ４．０〜８．０）とを混合し、４℃で数時間から一晩震盪させ、その後、遠心分離を行うことで、沈殿物として、シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を製造することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）アルコール処理又は未処理のシリカ系メソ多孔体の細孔内部に、二種類以上のヘテロ蛋白質を安定に、且つ多量に吸着させた、上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあるシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を提供することができる。
（２）シリカ系メソ多孔体の細孔内部に担持させるヘテロ蛋白質として、蛍光性蛋白質を用いた場合には、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のシグナル強度によって、蛍光性又は発光性蛋白質の組み合わせを用いた場合には、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のシグナル強度によって、シリカ系メソ多孔体の細孔内におけるヘテロ蛋白質の集積の程度をモニタリングすることができる。
（３）前記エネルギー移動によるＦＲＥＴ又はＢＲＥＴのシグナル強度を利用した新規の蛍光・発光機能性部材を提供することができる。
（４）シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径の違いによって、ヘテロ蛋白質の向きを制御できるため、エネルギー移動効率、すなわち、得られる蛍光の大きさを自在に制御することができる。
（５）前記エネルギー移動により、未知の蛍光性及び発光性蛋白質を検出可能な、新規の蛍光発光機能性部材を提供することができる。
（６）蛍光性及び発光性ヘテロ蛋白質と同様に、他の適宜のヘテロ蛋白質を同様の手法で複合化し、例えば、複数の蛋白質及び酵素を用いた多段階化学反応場を提供することができる。
（７）高濃度蛋白質の凝集による失活を抑制し、高密度集積させて比活性を高くしたシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を提供することができる。
（８）遠心分離操作により、容易に任意の緩衝溶液、又は反応溶液に交換可能なシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
（シリカ系メソ多孔体の合成）
水ガラス１号２７１．５９ｇを水８２８．４１ｇと混合した後、８０℃に加熱した。別途、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド８０ｇを７０℃の水１リットルに添加し、溶解後、トリイソピルベンゼン７０ｍｌ（６０ｇ）を更に添加し、ホモミキサーで３０分撹拌した。この乳化液を水ガラス溶液に瞬時に添加して、更に、５分撹拌した。これに２規定塩酸を約１時間かけて添加し、ｐＨ８．５の状態で約３時間撹拌した。これを吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散・濾過を繰り返し、濾液の伝導度が１００μＳ／ｃｍ以下であることを確認した。これを４５℃で３日間乾燥した後、５５０℃で６時間焼成することにより、中心細孔直径６．２ｎｍのシリカ系メソ多孔体（ＦＳＭ：ｆｏｌｄｅｄ−ｓｈｅｅｔ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）を得た。
【００２７】
上記ＦＳＭについて、粉末Ｘ線回折及び窒素吸着等温線の測定を行った。粉末Ｘ線回折は、理学ＲＡＤ−Ｂ装置を用いて測定し、窒素吸着等温線は、液体窒素温度において、定容積法により求めた。Ｘ線回折パターンにより、上記ＦＳＭは、２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有していることが分かった。また、窒素吸着等温線からＣｒａｎｓｔｏｎ−Ｉｎｋｌａｙ法で計算した細孔分布曲線によると、全細孔容積に占める、中心細孔直径の±４０％の範囲内の直径を有する細孔の全容積の割合は、６０％以上であることが分かった。
【００２８】
（ＦＳＭのエタノール処理）
エタノール溶媒中（１００ｍｌ）に、乾燥させたシリカ多孔体（１ｇ）を加えて撹拌し、分散させた後に、１００℃で２４時間還流を行った。その後、回収した試料は、４５℃で乾燥させた。孔径が均一なシリカ多孔体は、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを鋳型として用いて合成しており、二次元六方構造を有するシリカ多孔体である。これを未処理試料として取り扱うが、未処理体の窒素吸着測定から算出した比表面積は１２１１ｍ２ｇ−１、孔径は６．２ｎｍであった。粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）による分析から、得られた表面処理体は、二次元六方構造を保持していることが確認された。
【００２９】
また、ＩＲ測定により、アルコキシ基が表面に結合していることが確認された。更に、窒素吸着測定から、有機修飾に伴い得られた表面処理体の比表面積（１０５０ｍ２ｇ−１）、孔径（６ｎｍ）は、いずれも減少していることが示された。ここで、細孔容積は、メソ孔表面への処理を評価するため、相対圧９０％での窒素吸着量から算出した。以上から、アルコール処理することで孔表面を初め、シリカ多孔体の表面全てがアルコキシ基で覆われた表面処理体が生成したことが明らかとなった。
【００３０】
（エタノール処理シリカ系メソ多孔体−蛍光性ヘテロ蛋白質複合体の製造）
シリカ系メソ多孔体には、エタノール処理した中心細孔直径６．２ｎｍを有するシリカ系メソ多孔体（ＦＳＭ６．２（特願２００６−２１６１９８）。以下、単に「ＦＳＭ−６．２（ＦＳＭ：ｆｏｌｄｅｄ−ｓｈｅｅｔ ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｅｒｉａｌ）」と記載する。）を、また、蛍光性ヘテロ蛋白質には、緑色蛍光蛋白質ｓＧＦＰと赤色蛍光蛋白質ＤｓＲｅｄを用いた。
【００３１】
まず、エタノール処理ＦＳＭ−６．２の粉末１０ｍｇと、２ｍｇ／ｍＬのｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを含んだ２０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ８．０）５００μＬとを混合し、４℃で２０時間震盪させた。その後、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い、上清を除き、得られた沈殿物を同じ緩衝溶液１，０００μＬに再懸濁した。更に、これを遠心分離し、緩衝溶液への沈殿物の再懸濁の操作を３〜４回繰り返し、最終的にエタノール処理ＦＳＭ−６．２とヘテロ蛋白質（ｓＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ）の複合体（以下、「ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２」と記載する。）を得た。
【００３２】
前記手法と同様にして、エタノール処理ＦＳＭ−６．２とｓＧＦＰの複合体（以下、「ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２」と記載する。）、また、エタノール処理ＦＳＭ−６．２とＤｓＲｅｄの複合体（以下、「ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２」と記載する。）を得た。図１に、ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２、ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、及び、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２を撮影した写真を示す。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−６．２、ｂはｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２、ｃはＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、ｄはｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、を示す。
【実施例２】
【００３３】
（１）窒素吸着の測定
エタノール処理ＦＳＭ−６．２ ５０ｍｇに対し、ｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを各々１ｍｇ吸着させた複合体を用いて、窒素吸着特性について調べた。図２の左図に、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２の窒素吸脱着等温線を示す。縦軸は、窒素の吸着量を示し、横軸は、その時の相対圧力を示す。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−６．２のみの場合、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、を示す。エタノール処理ＦＳＭ−６．２のみの場合と比較して、エタノール処理ＦＳＭ−６．２にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合に、窒素吸着量が減少しており、このことは、細孔の中にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されていることを示している。
【００３４】
（２）細孔分布の測定
前記窒素吸脱着等温線から細孔分布曲線を求めた。図２の右図に、エタノール処理ＦＳＭ−６．２、及び、ｓＧＦＰ− ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２の細孔分布曲線を示す。縦軸は、細孔容積を示し、横軸は、ＦＳＭ−６．２の中心細孔直径を示す。エタノール処理ＦＳＭ−６．２のみの場合（図中、ａ）と比較して、エタノール処理ＦＳＭ−６．２にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合（図中、ｂ）に、細孔容積が減少しており、このことは、細孔の中にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されていることを示している。また、どちらの場合も、６ｎｍ付近にシャープなピークが見られ、これは６ｎｍ程度の細孔があり、細孔が壊れずに保持されていることを示している。
【００３５】
（３）微分干渉像及び蛍光像の観察
次に、メソシリカ系多孔体及び複合体について、微分干渉像及び蛍光像を観察した。図３に、シリカ系メソ多孔体として、中心細孔直径７．５ｎｍを有するシリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５を用いて、該シリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５にｓＧＦＰを吸着させ、１００倍対物レンズの顕微鏡によって観察した微分干渉像（左図：シリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５のみの場合）及び蛍光像（右図：シリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５の細孔内部にｓＧＦＰを吸着させた場合）を示す。スケールバーは、２０μｍを示す。図３の微分干渉像にみられるひだ状の像は、シリカ系メソ多孔体の細孔の向きを示しており、蛍光像にみられる直線的な蛍光は、細孔内に吸着したｓＧＦＰを直接的に示している。
【実施例３】
【００３６】
実施例１及び実施例２と同様にして、得られたｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２ ２００μＬ分を低散乱セルに移し入れ、蛍光光度計（日立製、Ｆ−４５００）によりＦＲＥＴ観測を行った。図４に、中心細孔直径６．２ｎｍを有するエタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部において、光（ｈν）によって、蛍光性ヘテロ蛋白質としてｓＧＦＰとＤｓＲｅｄが相互作用して、ＦＲＥＴを起こす様子を模式的に示した説明図を示す。
【００３７】
（１）ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２のＦＲＥＴ観測
ｓＧＦＰの蛍光スペクトルを調べた。図５に、ＦＳＭ−６．２の細孔内に吸着させていないｓＧＦＰ及びｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ（上図）と、細孔内に吸着させたｓＧＦＰ及びｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ（下図）のｓＧＦＰの蛍光スペクトルを示す。縦軸は、ｓＧＦＰの蛍光強度を示し、横軸は、波長を示す。
【００３８】
４９０ｎｍで励起した場合、ＦＳＭ−６．２の細孔内に吸着させていないｓＧＦＰとｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄとのピーク強度比（ＦＲＥＴ効率に換算すると、０．１９）と比較して、細孔内に吸着させたｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄのｓＧＦＰ強度は、ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２のそれよりも著しく減少している（ＦＲＥＴ効率に換算すると、０．５１）。
【００３９】
このことは、細孔内において導入されたｓＧＦＰとＤｓＲｅｄがお互いに相互作用し、ＦＲＥＴを起こしたことを示唆している。ＦＲＥＴ効率は、次式によって算出した。
ＦＲＥＴ効率； Ｅ＝１−（Ｆｄ’／Ｆｄ）
Ｆｄ：ＤｓＲｅｄが存在しない時のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度、Ｆｄ’：ＤｓＲｅｄが存在する時のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度。
【００４０】
（２）ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２のＦＲＥＴ観測におけるＤｓＲｅｄ量の影響
次に、ｓＧＦＰの蛍光ピーク強度及びＦＲＥＴ効率について調べた。図６に、ＦＳＭ−６．２の細孔内に予め５０μｇのｓＧＦＰ吸着させ、ＤｓＲｅｄ量（横軸）を指標とした場合のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度（左縦軸）及びＦＲＥＴ効率（右縦軸）をプロットした結果を示す。ＦＲＥＴ効率は、次式によって算出した。
ＦＲＥＴ効率； Ｅ＝ １−（Ｆｄ’／Ｆｄ）
Ｆｄ：ＤｓＲｅｄが存在しない時のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度、 Ｆｄ’：ＤｓＲｅｄが存在する時のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度。
【００４１】
４９０ｎｍで励起した場合、ＦＳＭ−６．２の細孔内に吸着されたｓＧＦＰのピーク強度は、細孔内にＤｓＲｅｄが導入されるにつれて減少した。これに対応して、ＦＲＥＴ効率は、増大する傾向を示した。これらの結果は、細孔内に吸着されたｓＧＦＰに対して、導入されたＤｓＲｅｄが近接し、ヘテロ蛋白質の間でＦＲＥＴが生じたことを示唆している。
【実施例４】
【００４２】
本実施例では、ＦＳＭ−６．２の有無における、ｓＧＦＰの蛍光ピーク強度及びピーク波長に与えるｓＧＦＰ濃度の影響を調べた。その結果を図７に示す。図７より、ＦＳＭ−６．２に吸着させていないｓＧＦＰの場合、蛍光ピーク強度は、ｓＧＦＰ濃度とともに増大し、１ｍｇ／ｍＬをピークに、更に高い濃度領域において蛍光消光を示し、また、ピーク波長は、ｓＧＦＰ濃度の増大にともなって長波長側にシフト（レッドシフト）した（上図）。
【００４３】
ｓＧＦＰの高濃度領域における蛍光消光とレッドシフトは、蛋白質が凝集体を形成していることに起因する。一方、ＦＳＭ−６．２に吸着させたｓＧＦＰの場合、蛍光ピーク強度は、ｓＧＦＰ濃度とともに直線的に増大し、また、ピーク波長は、ｓＧＦＰ濃度の増大によってもほとんど変化せず、ｓＧＦＰ本来の蛍光波長を保持した（下図）。
【００４４】
以上の結果は、ＦＳＭ−６．２は、高濃度のｓＧＦＰの凝集を抑制し、分散した状態で細孔内に安定に固定できることを示唆している。同様の現象は、実施例３の場合にも当てはまる。図８に、凝集体を形成した高濃度の蛍光性ヘテロ蛋白質（ｓＧＦＰ、及びｓＧＦＰとＤｓＲｅｄ）が、エタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部に単分散して導入される様子を模式的に示した説明図を示す。
【実施例５】
【００４５】
（１）窒素吸着の測定
エタノール処理ＦＳＭ−５．４（中心細孔直径５．４ｎｍ）、エタノール処理ＦＳＭ−１６（中心細孔直径２．６ｎｍ）、エタノール処理ＦＳＭ−２２（中心細孔直径３．７ｎｍ）、また、エタノール処理ＦＳＭ−７．１（中心細孔直径７．１ｎｍ）５０ｍｇに対し、ｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを基本的には各々５ｍｇ吸着させた複合体を用いて、窒素吸着特性について調べた。
【００４６】
図９に、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／各種ＦＳＭの窒素吸脱着等温線を示す。縦軸は、窒素の吸着量を示し、横軸は、その時の相対圧力を示す。図中、左上図において、ａはエタノール処理ＦＳＭ−５．４のみの場合、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−５．４の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｃはエタノール処理ＦＳＭ−５．４の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを各々７．５ｍｇ吸着させた場合、を示す。
【００４７】
また、図中、右上図において、ｄはエタノール処理ＦＳＭ−１６のみの場合、ｅはエタノール処理ＦＳＭ−１６の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、左下図において、ｆはエタノール処理ＦＳＭ−２２のみの場合、ｇはエタノール処理ＦＳＭ−２２の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、右下図において、ｈはエタノール処理ＦＳＭ−７．１のみの場合、ｉはエタノール処理ＦＳＭ−７．１の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、を示す。どの中心細孔直径を有するＦＳＭの場合でも、エタノール処理ＦＳＭのみの場合と比較して、エタノール処理ＦＳＭにｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合に、窒素吸着量が減少しており、このことは、細孔の中にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されていることを示している。
【００４８】
（２）細孔分布の測定
次に、前記窒素吸脱着等温線から、細孔分布曲線を求めた。図１０に、エタノール処理ＦＳＭ−５．４、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−５．４、エタノール処理ＦＳＭ−１６、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−１６、エタノール処理ＦＳＭ−２２、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−２２、エタノール処理ＦＳＭ−７．１、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−７．１の細孔分布曲線を示す。縦軸は、細孔容積を示し、横軸は、各種ＦＳＭの中心細孔直径を示す。
【００４９】
どの中心細孔直径を有するＦＳＭの場合でも、エタノール処理ＦＳＭのみの場合（図中、ａ、ｃ、ｅ、ｇ）と比較して、エタノール処理ＦＳＭにｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合（図中、ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）に、細孔容積が減少しており、このことは、細孔の中にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されていることを示している。また、どちらの場合も、２．６ｎｍ、３．７ｎｍ、５．４ｎｍ、７．１ｎｍ付近にシャープなピークが見られ、これは、各種ＦＳＭに２．６ｎｍ、３．７ｎｍ、５．４ｎｍ、７．１ｎｍの細孔があり、細孔が壊れずに保持されていることを示している。
【００５０】
（３）ＦＲＥＴ効率に与えるＦＳＭの中心細孔直径サイズの影響
次に、シリカ系メソ多孔体ＦＳＭの中心細孔直径の違いが与えるＦＲＥＴ効率への影響を調べた。図１１に、中心細孔直径の異なる各種エタノール処理ＦＳＭ（ＦＳＭ−１６、ＦＳＭ−２２、ＦＳＭ−５．４、ＦＳＭ−７．１）１０ｍｇに対し、ｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを各々０．５ｍｇ（図中、ａ）、また、０．２５ｍｇ（図中、ｂ）を吸着させ、これらの複合体のＦＲＥＴ効率を求めた結果を示す。
【００５１】
縦軸は、ＦＲＥＴ効率を示し、横軸は、ＦＳＭの中心細孔直径サイズを示す。ＦＲＥＴ効率は、次式によって算出した。
ＦＲＥＴ効率； Ｅ＝ １−（Ｆｄ’／Ｆｄ）
Ｆｄ：ＤｓＲｅｄが存在しない時のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度、 Ｆｄ’：ＤｓＲｅｄが存在する時のｓＧＦＰの蛍光ピーク強度。
【００５２】
４９０ｎｍで励起した場合、どの中心細孔直径を有するＦＳＭの場合でも、ｓＧＦＰとＤｓＲｅｄの量が増大すると、ＦＲＥＴ効率も増大し、これは、タンパク質濃度の増加によってタンパク質間の距離がより近接することでエネルギー移動効率が高くなることに起因する。また、ＦＳＭ−１６（中心細孔直径２．６ｎｍ）よりも、ＦＳＭ−２２（中心細孔直径３．７ｎｍ）の場合に、更にＦＲＥＴ効率が高くなり、細孔径が、ＦＳＭ−５．４（中心細孔直径５．４ｎｍ）、ＦＳＭ−７．１（中心細孔直径７．１ｎｍ）と大きくなるにつれて、ＦＲＥＴ効率が低下した。このことは、シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径の違いによって、ヘテロ蛋白質の向きを制御でき、エネルギー移動効率、すなわち、得られる蛍光の大きさを自在に制御することができる可能性があることを示唆している。
【００５３】
（４）微分干渉像及び蛍光像の観察
次に、メソシリカ系多孔体及び複合体について、微分干渉像及び蛍光像を観察した。図１２に、シリカ系メソ多孔体として、中心細孔直径５．４ｎｍを有するエタノール処理ＦＳＭ−５．４を用いて、該シリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４にｓＧＦＰ及びＤｓＲｅｄを同時に吸着させ、１００倍対物レンズの顕微鏡によって観察した微分干渉像（図中、ａ：シリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４のみの場合）を示す。
【００５４】
また、図１２に、蛍光像（図中、ｂ：シリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４の細孔内部に吸着させたｓＧＦＰの蛍光のみを検出した場合、ｃ：シリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４の細孔内部に吸着させたＤｓＲｅｄの蛍光のみを検出した場合）、また、ａ、ｂ、ｃの像を重ね合わせた画像（図中、ｄ）を示す。スケールバーは、１０μｍを示す。図１２の蛍光像にみられる一様に広がる蛍光は、シリカ系メソ多孔体の細孔内に吸着したｓＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの局在を直接的に示している。
【実施例６】
【００５５】
実施例１及び実施例２と同様にして、得られたレニラルシフェラーゼ−ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−８．０ ２００μＬ分を低散乱セルに移し入れ、蛍光光度計（日立製、Ｆ−４５００）によりＢＲＥＴ観測を行った。図１３に、中心細孔直径８．０ｎｍを有するエタノール処理ＦＳＭ−８．０の細孔内部において、基質の化学発光によって、発光性ヘテロ蛋白質としてレニラルシフェラーゼとｓＧＦＰが相互作用して、ＢＲＥＴを起こす様子を模式的に示した説明図を示す。
【００５６】
レニラルシフェラーゼ−ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−８．０のＢＲＥＴの有無を、発光スペクトルを観測することにより調べた。図１４に、ＦＳＭ−８．０の細孔内に吸着させた１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ（図中、ａ）、１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ−０．５ｍｇ／ｍＬ ｓＧＦＰ（図中、ｂ）、また、１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ−１ｍｇ／ｍＬ ｓＧＦＰ（図中、ｃ）の発光スペクトルを示す。縦軸は、発光強度を示し、横軸は、波長を示す。
【００５７】
基質を添加し、化学反応によってレニラルシフェラーゼを励起した時、発光ピーク波長は、１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ／ＦＳＭ−８．０の場合に４９３ｎｍであり、１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ−０．５ｍｇ／ｍＬｓＧＦＰ／ＦＳＭ−８．０の場合に５０６ｎｍを示し、１３ｎｍ分長波長側へシフトした。このシフトした発光波長は、ｓＧＦＰの蛍光が生じたことを示唆している。また、１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ−１ｍｇ／ｍＬ ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−８．０の場合も、同様のシフトを示し、発光強度の著しい増大も示された。
【００５８】
一方、ＦＳＭ−８．０の細孔内に吸着していない、レニラルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼ−ｓＧＦＰ混合溶液では、発光ピーク波長のシフトがみられなかった。以上のことは、細孔内において導入されたレニラルシフェラーゼとｓＧＦＰがお互いに相互作用し、ＢＲＥＴを起こしたことを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
以上詳述したように、本発明は、シリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体及びその製造方法に係るものであり、本発明によれば、シリカ系メソ多孔体の細孔内部に性質の異なる二種類以上の機能性ヘテロ蛋白質、例えば、蛍光性及び発光性蛋白質を安定的に十分な吸着量で吸着させ、前記ＦＲＥＴ及びＢＲＥＴを利用した蛋白質間相互作用によって、未知の蛍光性及び発光性蛋白質の検出を可能とするシリカ系メソ多孔体材料−ヘテロ蛋白質複合体を提供することが可能となる。また、本発明のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の製造方法によれば、例えば、シリカ系メソ多孔体の細孔内部に安定に吸着させた機能性へテロ蛋白質を、効率的、且つ確実に製造することができる。本発明は、二種類以上のヘテロ蛋白質の活性を、安定、且つ有効に保持して、その多様な機能性を発揮させることが可能な新規機能性部材を提供することができることから、本発明は、例えば、前記アルコール処理シリカ系メソ多孔体と任意のヘテロ蛋白質を利用した新しい特殊反応場を実現するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】エタノール処理ＦＳＭ−６．２、ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２、ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、及び、ｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２を撮影した写真である。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−６．２、ｂはｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２、ｃはＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、ｄはｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、である。
【図２】蛍光性ヘテロ蛋白質としてＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されたエタノール処理シリカ系メソ多孔体の、窒素吸脱着等温線（左）と、細孔分布曲線（右）の図である。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−６．２のみの場合、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、である。
【図３】シリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５にｓＧＦＰを吸着させた複合体の微分干渉観察像（左）及び蛍光観察像（右）である。図中、ａはシリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５のみの場合、ｂはシリカ系メソ多孔体ＳＢＡ−１５の細孔内部にｓＧＦＰを吸着させた場合、である。
【図４】エタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部に蛍光性ヘテロ蛋白質としてｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを備え、光（ｈν）によってｓＧＦＰからＤｓＲｅｄにＦＲＥＴが生じる様子を模式的に示す説明図である。
【図５】ＦＳＭ−６．２の細孔内に吸着させていないｓＧＦＰ、及びｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ（上）と、細孔内に吸着させたｓＧＦＰ、及びｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ（下）について蛍光観測を行った時のｓＧＦＰの蛍光スペクトルである。図中、ａはｓＧＦＰ（実線）及びｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ（破線）におけるｓＧＦＰの蛍光スペクトル、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部に吸着させたｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合のｓＧＦＰ（実線）及びｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ（破線）におけるｓＧＦＰの蛍光スペクトル、ｃはｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２の模式図（Ｄ：ｓＧＦＰ）、ｄはｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２の模式図（Ｄ：ｓＧＦＰ、Ａ：ＤｓＲｅｄ）、である。
【図６】ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２に対するＤｓＲｅｄ量の影響を、ｓＧＦＰの蛍光ピーク強度及びＦＲＥＴ効率の変化によって評価した図である。図中、ａはｓＧＦＰの蛍光ピーク強度（黒丸印）、ｂはＦＲＥＴ効率（白丸印）、である。
【図７】ＦＳＭ−６．２の有無における、ｓＧＦＰの蛍光ピーク強度及びピーク波長と、ｓＧＦＰ濃度との関係を示した図である。図中、ａはｓＧＦＰのみの場合、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部にｓＧＦＰを吸着させた場合、ｃはｓＧＦＰの蛍光ピーク強度（丸印）、ｄはｓＧＦＰのピーク波長（三角印）、ｅはｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２の蛍光ピーク強度（丸印）、ｆはｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２のピーク波長（三角印）、である。
【図８】蛍光性ヘテロ蛋白質（ｓＧＦＰ、及びｓＧＦＰとＤｓＲｅｄ）の凝集体が、エタノール処理ＦＳＭ−６．２の細孔内部に単分散して導入される様子を模式的に示す説明図である。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−６．２、ｂはｓＧＦＰの凝集体（Ｄ：ｓＧＦＰ）、ｃはＤｓＲｅｄの凝集体（Ａ：ＤｓＲｅｄ）、ｄはｓＧＦＰ／ＦＳＭ−６．２、ｅはｓＧＦＰ−ＤｓＲｅｄ／ＦＳＭ−６．２、である。
【図９】蛍光性ヘテロ蛋白質としてＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されたエタノール処理シリカ系メソ多孔体の、窒素吸脱着等温線の図である。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−５．４（中心細孔直径５．４ｎｍ）のみの場合、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−５．４の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｃはエタノール処理ＦＳＭ−５．４の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを各々７．５ｍｇ吸着させた場合、ｄはエタノール処理ＦＳＭ−１６（中心細孔直径２．６ｎｍ）のみの場合、ｅはエタノール処理ＦＳＭ−１６の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｆはエタノール処理ＦＳＭ−２２（中心細孔直径３．７ｎｍ）のみの場合、ｇはエタノール処理ＦＳＭ−２２の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｈはエタノール処理ＦＳＭ−７．１（中心細孔直径７．１ｎｍ）のみの場合、ｉはエタノール処理ＦＳＭ−７．１の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、である。
【図１０】蛍光性ヘテロ蛋白質としてＧＦＰとＤｓＲｅｄが導入されたエタノール処理シリカ系メソ多孔体の、細孔分布曲線の図である。図中、ａはエタノール処理ＦＳＭ−５．４（中心細孔直径５．４ｎｍ）のみの場合、ｂはエタノール処理ＦＳＭ−５．４の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｃはエタノール処理ＦＳＭ−１６（中心細孔直径２．６ｎｍ）のみの場合、ｄはエタノール処理ＦＳＭ−１６の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｅはエタノール処理ＦＳＭ−２２（中心細孔直径３．７ｎｍ）のみの場合、ｆはエタノール処理ＦＳＭ−２２の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、ｇはエタノール処理ＦＳＭ−７．１（中心細孔直径７．１ｎｍ）のみの場合、ｈはエタノール処理ＦＳＭ−７．１の細孔内部にｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを吸着させた場合、である。
【図１１】ＦＲＥＴ効率に与えるＦＳＭの中心細孔直径サイズの影響について示した図である。図中、ａは中心細孔直径の異なる各種エタノール処理ＦＳＭ（ＦＳＭ−１６、ＦＳＭ−２２、ＦＳＭ−５．４、ＦＳＭ−７．１）１０ｍｇに対し、ｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを各々０．５ｍｇ吸着させた場合、図中、ｂはｓＧＦＰとＤｓＲｅｄを各々０．２５ｍｇ吸着させた場合、である。
【図１２】シリカ系メソ多孔体であるエタノール処理ＦＳＭ−５．４にｓＧＦＰ及びＤｓＲｅｄを同時に吸着させた複合体の微分干渉観察像及び蛍光観察像である。図中、ａはシリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４のみの場合、ｂはシリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４の細孔内部に吸着させたｓＧＦＰの蛍光のみを検出した場合、ｃはシリカ系メソ多孔体ＦＳＭ−５．４の細孔内部に吸着させたＤｓＲｅｄの蛍光のみを検出した場合、ｄはａ、ｂ、ｃの像を重ね合わせた場合、である。
【図１３】エタノール処理ＦＳＭ−８．０の細孔内部に、発光性ヘテロ蛋白質としてレニラルシフェラーゼとｓＧＦＰを備え、基質の化学発光によってレニラルシフェラーゼからｓＧＦＰにＢＲＥＴが生じる様子を模式的に示す説明図である。
【図１４】エタノール処理ＦＳＭ−８．０の細孔内に吸着させたレニラルシフェラーゼ、及びレニラルシフェラーゼ−ｓＧＦＰについて発光観測を行った時の発光スペクトルである。図中、ａは１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ／ＦＳＭ−８．０の発光スペクトル、ｂは１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ−０．５ｍｇ／ｍＬ ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−８．０の発光スペクトル、ｃは１ｍｇ／ｍＬ レニラルシフェラーゼ−１ｍｇ／ｍＬ ｓＧＦＰ／ＦＳＭ−８．０の発光スペクトル、である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ系メソ多孔体の細孔内部に性質の異なる少なくとも二種類のヘテロ蛋白質を備える蛋白質内包複合体であって、蛋白質が前記シリカ系メソ多孔体の細孔内に吸着され、分散した状態で細孔内に安定に固定されており、上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にある、ことを特徴とするシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項２】
前記シリカ系メソ多孔体（ＦＳＭ）が、（１）ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体であり、（２）細孔のサイズが直径で２〜５０ｎｍであり、（３）全細孔容積が０．１〜１．５ｍＬ／ｇであり、（４）比表面積が２００〜１５００ｍ２である、請求項１に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項３】
前記シリカ系メソ多孔体が、アルコールで熱処理されたアルコール処理ＦＳＭで、アルコキシ基を有している、請求項１又は２に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項４】
アルコール処理ＦＳＭの中心細孔直径が、２．６〜７．１ｎｍである、請求項３に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項５】
前記へテロ蛋白質が、蛍光性又は発光性蛋白質である、請求項１から４のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項６】
前記へテロ蛋白質の相互作用が、ヘテロ蛋白質間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、又は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）である、請求項１から５のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項７】
機能性を有するヘテロ蛋白質の活性を安定に保持する、請求項１から６のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項８】
前記蛍光性へテロ蛋白質が、ドナーとしてのオワンクラゲ由来ＧＦＰ、アクセプターとしてのイソギンチャク由来ＤｓＲｅｄの組み合わせからなる、請求項６に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項９】
前記発光性へテロ蛋白質が、ドナーとしてのウミシイタケ由来ルシフェラーゼ、アクセプターとしての前記ＧＦＰ、又は、ドナーとしてのホタル由来ルシフェラーゼ、アクセプターとしての前記ＤｓＲｅｄの組み合わせからなる、請求項６に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項１０】
請求項６に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の前記エネルギー移動によるＦＲＥＴ又はＢＲＥＴのシグナル強度を利用することによって、蛍光性又は発光性蛋白質を検出することを特徴とする当該蛋白質の検出方法。
【請求項１１】
アルコール処理又は未処理のシリカ系メソ多孔体の細孔内部に性質の異なる少なくとも二種類のへテロ蛋白質を吸着させ、分散した状態で細孔内に安定に固定させることにより上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあるヘテロ蛋白質内包複合体を作製することを特徴とするシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の製造方法。
【請求項１２】
シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径を変えることにより、ヘテロ蛋白質の向きを制御する、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１から９のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体からなり、機能性を有するヘテロ蛋白質をシリカ系メソ多孔体の細孔内に安定に、且つ分散した状態で吸着、保持させたことを特徴とするヘテロ蛋白質内包機能性部材。
【請求項１】
シリカ系メソ多孔体の細孔内部に性質の異なる少なくとも二種類のヘテロ蛋白質を備える蛋白質内包複合体であって、蛋白質が前記シリカ系メソ多孔体の細孔内に吸着され、分散した状態で細孔内に安定に固定されており、上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にある、ことを特徴とするシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項２】
前記シリカ系メソ多孔体（ＦＳＭ）が、（１）ケイ素原子と酸素原子を必須成分として含む化合物の多孔体であり、（２）細孔のサイズが直径で２〜５０ｎｍであり、（３）全細孔容積が０．１〜１．５ｍＬ／ｇであり、（４）比表面積が２００〜１５００ｍ２である、請求項１に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項３】
前記シリカ系メソ多孔体が、アルコールで熱処理されたアルコール処理ＦＳＭで、アルコキシ基を有している、請求項１又は２に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項４】
アルコール処理ＦＳＭの中心細孔直径が、２．６〜７．１ｎｍである、請求項３に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項５】
前記へテロ蛋白質が、蛍光性又は発光性蛋白質である、請求項１から４のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項６】
前記へテロ蛋白質の相互作用が、ヘテロ蛋白質間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、又は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）である、請求項１から５のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項７】
機能性を有するヘテロ蛋白質の活性を安定に保持する、請求項１から６のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項８】
前記蛍光性へテロ蛋白質が、ドナーとしてのオワンクラゲ由来ＧＦＰ、アクセプターとしてのイソギンチャク由来ＤｓＲｅｄの組み合わせからなる、請求項６に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項９】
前記発光性へテロ蛋白質が、ドナーとしてのウミシイタケ由来ルシフェラーゼ、アクセプターとしての前記ＧＦＰ、又は、ドナーとしてのホタル由来ルシフェラーゼ、アクセプターとしての前記ＤｓＲｅｄの組み合わせからなる、請求項６に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体。
【請求項１０】
請求項６に記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の前記エネルギー移動によるＦＲＥＴ又はＢＲＥＴのシグナル強度を利用することによって、蛍光性又は発光性蛋白質を検出することを特徴とする当該蛋白質の検出方法。
【請求項１１】
アルコール処理又は未処理のシリカ系メソ多孔体の細孔内部に性質の異なる少なくとも二種類のへテロ蛋白質を吸着させ、分散した状態で細孔内に安定に固定させることにより上記二種類のヘテロ蛋白質がヘテロ蛋白質間で相互作用を示すように近接した状態にあるヘテロ蛋白質内包複合体を作製することを特徴とするシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体の製造方法。
【請求項１２】
シリカ系メソ多孔体の中心細孔直径を変えることにより、ヘテロ蛋白質の向きを制御する、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１から９のいずれかに記載のシリカ系メソ多孔体−ヘテロ蛋白質複合体からなり、機能性を有するヘテロ蛋白質をシリカ系メソ多孔体の細孔内に安定に、且つ分散した状態で吸着、保持させたことを特徴とするヘテロ蛋白質内包機能性部材。
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００８−１４３８９２（Ｐ２００８−１４３８９２Ａ）
【公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９７３０８（Ｐ２００７−２９７３０８）
【出願日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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