ストレプトミセス属細菌のＰａｐＭポリペプチドの新規な変異体
本発明は、野生型ポリペプチドと比較して、基質選択性及び／又は増大した活性を有するストレプトミセス属細菌のＰａｐＭポリペプチドの新規な変異体に関するものである。本発明はまた、当該変異体をコードする核酸、その核酸を組み込んだ微生物、及びストレプトグラミンＢ成分を生成するためのそれらの使用に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトミセス属細菌のPapＭポリペプチドの新規な変異体に関するものであり、それは野生型ポリペプチドと比較して、基質特異性及び／又は改良した活性を有している。本発明は、更に、これらの変異体をコードする核酸、その核酸を組み込む微生物、及び、ストレプトグラミン（Streptogramin）のＢ構成成分の生成のための微生物の使用にも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プリスチナマイシン（Pristinamycin）は、ストレプトグラミン類に属する抗生物質であり、ビルジニアマイシン（virginiamycin）及びミカマイシン（mikamycin）もまた本類に属している。ストレプトグラミン類は、化学的には極めて異なる二種類の分子の組合せから成る抗生物質の小さな、均質で、そして独自の類を形成する：ストレプトグラミン類Ａは、ポリ不飽和マクロラクトンであり、そしてストレプトグラミン類Ｂは、デプシペプチドである（Cocito C.G.(1979) Microbil. Rev., 43:145-198）(Cocito C.G.(1983) In Antibiotics 6:(Ed. F.E.Hahn), 296-332)。プリスチナマイシンの場合は、化合物Ａ及びＢは、それぞれ、プリスチナマイシンII（PII）及びプリスチナマイシンＩ（PＩ）と命名されており、そしてそれらの化学構造式は図１及び２に表示されている。
【０００３】
化合物Ａ及びＢは、特にスタフィロコカス(Staphylococci) 及びエンテロコカス(Enterococci) のようなグラム陽性細菌に対して相乗的で殺菌的な抗細菌活性を有している（Cocito、1979)。これらの化合物は、標的細胞のリボソームの５０Ｓサブユニットに接触することにより作用して、蛋白質合成阻害を引き起こす（Cocito、1979)；（Di Giambattista M., Chinali G. and Cocito C.G.(1989) J. Antim. Chemother., 24:485-507）。
【０００４】
ストレプトグラミン類は、主として放線菌（Actinomycetes）により生成される。特に、プリスチナマイシンは、糸状細菌であるストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）により、ＰＩ３０％とＰII７０％から成る天然の混合物として生成される（Blanc et al., (1995), J. Bacteriol. 177(18):5206-14）。どちらの分子にも、数種類の異性体が副生されるが、それらは天然の代謝物について普通に見られるものである。
【０００５】
プリスチナマイシンＰＩ（プリスチナマイシンのＢ構成成分）の場合は、生成される主要な型はＰＩＡであり、アミノ結合及びエステル結合により互いに結合している以下の７残基から成る（図２）：３−ヒドロキシピコリン酸、Ｌ−トレオニン、Ｄ−アミノ酪酸、Ｌ−プロリン、４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−オキソ−Ｌ−ピペコリン酸、及びＬ−フェニルグリシン。数種類の天然の異性体がＰＩＡと共に副生されて、そして主に以下の残基に関する構造的修飾に対応する：Ｄ−アミノ酪酸、４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−ＤＭＰＡＰＡ）及び、４−オキソ−Ｌ−ピペコリン酸（Thibaut et al., (1997) J. Bacteriol. 170(3):697-704)。これらの希少型は、ストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）の菌株に依存して種々の割合で合成されるが、全体として数パーセント程度であり、ＰＩＡが、生成されたＰＩのうちの９０％〜９５％であった。ストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）の数種類の菌株は、マクロサイクルの４−位における４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−ＭＭＰＡＰＡ）の存在によりＰＩＡとは異なるＰＩＢ（図２）を約５％合成することは特に注目すべきことである。少数のことながら、ＰＩＢはその種々の薬理学的特性が極めて優れた分子であることが分かっている（ＷＯ９６／０５２１９）。
【０００６】
４−位における４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンの存在により異なる他のＰＩＡ類似体であるＰＩＮＨ２（図２参照）は、半合成による独創的な生産物開発の価値を有するものである。これまでのところ、ストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）の培地に、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンを添加する方法でＰＩＮＨ２を得ることが唯一可能であった（ＷＯ９６／０１９０１）。
【０００７】
ストレプトグラミン類の生成の改良のため種々の方法が考えられているが、最初の試みは生成されるＢ構成成分（プリスチナマイシンＩ）に対するＡ構成成分（プリスチナマイシンII）の全体的な割合を変える方向でのものであり、他の試みは、Ａ又はＢ構成成分それぞれに存在する種々の異性体の割合を変える方向でのものである。しかしながら、今日までのところ、プリスチナマイシンＰＩＢを満足のいくように生成することを可能とするには至らず、未だプリスチナマイシンのＢ構成成分（プリスチナマイシンＩ）の希少型のままである。
【０００８】
最初の試みは、ＷＯ９３／２０１８２の特許出願中に記載されているが、ストレプトグラミンのＡ構成成分又はＢ構成成分を特異的に生成することを可能とする微生物の選択から成るものである。これらの微生物は、場合によって行われる、ストレプトグラミンを生成する微生物の突然変異に関する第一工程、及びストレプトグラミンのＡ又はＢ構成成分のどちらかを選択的に生成する微生物を同定する第二工程から成る従来の選択的技術によって得ることができる。この技術により、特に、プリスチナマイシンＰII（Ａ構成成分）又はプリスチナマイシンＰＩ（Ｂ構成成分）を選択的に生成するストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）の菌株を得ることができる。しかしながら、その文献は、常に主要型であり続けるＰＩＡに比べてＰＩＢが優先されるように変更された異性体比を有するプリスチナマイシンＰＩを選択的に生成する如何なる菌株についても記載していない。
【０００９】
特許出願ＷＯ９４／０８０１４は、ストレプトグラミンのＡ構成成分の生合成経路に関与し、またＢ構成成分の生合成経路にも関与する酵素をコードする遺伝子の単離及び同定について記載している。当該出願はまた、Ａ又はＢ構成成分の生成レベルを増強する目的でこれらの遺伝子を発現すること、またこれらの遺伝子を、Ａ又はＢ構成成分の生合成経路の種々の段階を阻害して、その結果これらの生合成経路の或る中間体の蓄積をもたらす突然変異を構築するのに用いることについても記載している。更に具体的には、当該出願ＷＯ９４／０８０１４は、ストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）のゲノムＤＮＡライブラリーから単離した１２種類の遺伝子、snaＡ、snaＢ、snaＣ、snaＤ、papＡ、papＭ、samＳ、snbＡ、snbＣ、snbＤ、snbＥ及びsnbＲの単離及び特性決定について記載しており、またＡ構成成分の生合成経路におけるsnaＡ、snaＢ、snaＣ及びsnaＤ遺伝子の関与について、及びＢ構成成分の生合成経路におけるpapＡ、papＭ、samＳ、snbＡ、snbＣ、snbＤ、snbＥ及びsnbＲ遺伝子の関与について実証している。
【００１０】
このように、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の菌株におけるsnaＡ遺伝子の不活性化は、もはやＰIIＡ（プリスチナマイシンのＡ構成成分の異性体の一つ）を生成することなく、ＰIIＢ（プリスチナマイシンのＡ構成成分の他の異性体）のみを、snaA遺伝子の野生型を持つ対照菌株により生成されるＰIIＡ及びＰIIＢの合計に匹敵する量だけ生成する菌株を得ることを可能とする。ＰＩ（プリスチナマイシンのＢ構成成分の全ての異性体）の生成は、snaＡ遺伝子が不活性化された菌株及び対照菌株においては、同様に維持されている。
【００１１】
samＳ遺伝子の不活性化は、対照菌株に比べて、ＰＩＡ（プリスチナマイシンのＢ構成
成分の異性体の一つ）を３５％少なく、そしてＰＩＢ（プリスチナマイシンのＢ構成成分の他の異性体）を約１０倍多く生成し、その結果、ＰＩＢレベルは生成した全Ｉ型のプリスチナマイシン（ＰＩ）総量の２０％にも達するような菌株の作成をもたらす。これらの菌株においてＰＩＢの生成は改良されてはいるが、しかし、ＰＩＢの生成は主要ではなく、ＰＩＡよりも少なく留まっている。
papＡ遺伝子又はsnbＡ遺伝子の不活性化は、ＰII型（Ａ構成成分）のプリスチナマイシンのみを生成し、そしてＰＩ型（Ｂ構成成分）のプリスチナマイシンはもはや生成しない菌株の作成をもたらす。
snaＤ遺伝子の不活性化は、これとは逆に、ＰＩ型のプリスチナマイシンのみを生成し、そしてＰII型のプリスチナマイシンはもはや生成しない菌株の作成をもたらす。
【００１２】
特許出願ＷＯ９６／０１９０１は、ストレプトグラミンのＢ構成成分に関連するが、しかしストレプトグラミン生成微生物によって天然に生成されるＢ構成成分とは異なる新規な化合物を製造する独創的な方法について記載している。この方法で使用している微生物菌株は、ストレプトブラミンのＢ構成成分の前駆体の生合成が突然変異により変異している。突然変異菌株として、Ｂ構成成分の前駆体の生合成経路が、papＡ、又はpipＡ、又はhpaＡ遺伝子の破壊によって変異しているＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）菌株を特に用いている。これらの菌株は、もはやプリスチナマイシンＰＩ（Ｂ構成成分）を生成することなく、プリスチナマイシンＰII（Ａ構成成分）を生成している。この突然変異菌株を、合成が変異した前駆体とは異なる独創的な前駆体を補足した培地中で培養する。この独創的な前駆体がデプシペプチド中に取り込まれ、そして天然の前駆体に置き換わることにより、ストレプトグラミンのＢ構成成分に関連した、有利な治療特性を示す新規化合物の生成がもたらされることとなる。
【００１３】
上記のアプローチ（ＷＯ９６／０１９０１）はＢ構成成分の内、希少型として天然に生成される異性体を主に生成する微生物菌株の入手を可能とする。しかしながら、その方法では、微生物菌株の天然の状態では存在しない特別な前駆体を培地に補足することが必要である。
【００１４】
プリスチナマイシンの生合成経路の基本的な生化学的及び遺伝学的研究により、ＰＩに関して観察される多くの異性体の起源を明らかとすることが可能となった。更に具体的には、ＰＩＢは、ＰＩＡのマクロサイクルに取り込まれるＬ−ＤＭＰＡＰＡの生合成中間体であるＬ−ＭＭＰＡＰＡが、SnbDEペプチドシンテターゼによってマクロサイクルへ取り込まれることに起源することが明らかとなった（Blanc et al., Mol. Microbiol (1997),23(2):191-202); Thibaut et al., J. Bacteriol. (1997), 179(3):697-704）。コリスメートからのＬ−ＭＭＰＡＰＡ及びＬ−ＤＭＰＡＰＡの生合成に関与するものとして、papＡ、papＢ、papＣ及びpapＭの４個の遺伝子が同定されている（Blanc et al.,1997)。
【００１５】
papＭ遺伝子は、図３に記載したスキームのように、Ｌ−ＭＭＰＡＰＡ経由で、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンからＬ−ＤＭＰＡＰＡを生成することを可能とする２つの連続したメチル化反応を触媒する蛋白質をコードする。これらの２個のメチル化反応は、極めてよく似た動力学的パラメター（反応速度及び結合定数）でもって、PapＭで触媒される（Blanc et al., 1997)。Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）のpapＭ遺伝子配列及びそれに対応するポリペプチド（４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（フェニルＮ）−メチルトランスフェラーゼ）の配列は、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１中に存在している。
【００１６】
本発明は、papＭ遺伝子産物の酵素活性を改変することによって、ストレプトグラミンのＢ構成成分の或る種の希少型異性体の生成を増大することを可能とする発見に基づくものである。
更に具体的には、本発明は、野生型ポリペプチドに比較して基質選択及び／又は改良された有効性を有するPapＭポリペプチドの新規な変異体の同定に基づくものである。本発明者らは、papＭ遺伝子に突然変異を起こして、対応する蛋白質が第一のメチル化反応に対しては十分な活性を保存しているが、しかしながら同時に、第二のメチル化反応を触媒することはもはやできないようにするか、または最低限でも第二のメチル化反応が第一のメチル化反応に比べて極度に阻害されるようにすることが可能であるということを実際に明らかとした。
【００１７】
Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）菌株のようなストレプトグラミン生成微生物における当該酵素の存在は、Ｌ−ＭＭＰＡＰＡの蓄積及びそれ故にＰＩＢの好適な生成を導くものである（図３）。これとは逆に、対応する蛋白質が、第一メチル化反応よりも極めて効率的に第二メチル化反応を触媒するように、papＭ遺伝子に突然変異を起こさせることも可能であり、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）菌株における当該酵素の存在は、Ｌ−ＤＭＰＡＰＡの蓄積及びそれ故にＰＩＡの生成の増大を導くものである。
【００１８】
本発明はまた、PapＭポリペプチドの不活性型を生成する微生物、またはpapＭ遺伝子の発現をもはやすることができない突然変異体が、野生型微生物では天然に合成することができるが、しかし単離するには余りにも微量であるストレプトグラミンのＢ構成成分の蓄積を可能とするという発見に基づくものである。このように、本発明は、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の多くの野生型菌株では合成することができず、また４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンをマクロサイクルの第４位に取込んだものに対応するものである、ＰＩＮＨ２と呼ばれるＰＩファミリーの化合物（図２）を主として生成する、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の組換え菌株の構築について記載するものである。
【００１９】
本発明の第一の課題は、野生型PapＭポリペプチドのメチル化基質に対するメチル化活性と比較して、同一のメチル化基質に対する異なる（増加又は減少）メチル化活性を示すPapＭポリペプチドの変異体に関するものである。
【００２０】
PapＭポリペプチドの変異体は、野生型PapＭポリペプチドとは異なる、メチル化基質１に対するＫcat1／Ｋm1比率で定義されるメチル化１の活性及び／又はメチル化基質２に対するＫcat2／Ｋm2比率で定義されるメチル化２の活性を示す。好ましくは、本発明に係るPapＭポリペプチドの変異体は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１に存在するPapＭポリペプチドのメチル化活性とは異なる、ＫcatPAPA／ＫmPAPA比率で定義されるＬ−ＭＭＰＡＰＡに対するＬ−ＰＡＰＡのメチル化１の活性、及び／又は、ＫcatMMPAPA／ＫmMMPAPA比率で定義されるＬ−ＤＭＰＡＰＡに対するＬ−ＭＭＰＡＰＡのメチル化２の活性を示すことである。
【００２１】
第一の実施例のように、本発明に係るPapＭポリペプチドの変異体は、Ｌ−ＤＭＰＡＰＡに対するＬ−ＭＭＰＡＰＡのメチル化２の活性よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、更に好ましくは少なくとも１０倍大きいＬ−ＭＭＰＡＰＡに対するＬ−ＰＡＰＡのメチル化１の活性を示す。そのような変異体は、ＰＩＢの生成に特に有利である。好ましくは、本発明に係る変異体は、野生型PapＭポリペプチドの配列のGly 249残基
(ａ)、Thr 192残基 (ｂ)、及び相同ポリペプチドにおいて(ａ)又は(ｂ)に相当する残基から選択された一つ又はそれ以上のアミノ酸を置換することによって得られるものである。
【００２２】
本発明の目的のために、「相同PapＭポリペプチド」の表現は、特に、Streptomyces olivaceus、Streptomyces ostreogriseus、Streptomyces mitakaensis、Streptomyces loidensis、Streptomyces graminofaciens、Streptomyces diastaticusのようなストレプトミセス属の細菌又は一つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠損及び／又は挿入により、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１とは異なるアミノ酸配列ではあるが、生物学的作用はPapＭポリペプチドと類似する他の微生物に起源する又は由来するポリペプチドを意味することを意図したものである。そのような相同ポリペプチド配列は、少なくとも配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１の６０％、好ましくは少なくとも７０％、更に好ましくは少なくとも８０％、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１と類似するものである。
【００２３】
他の実施例において、本発明に係る変異体は、ポリペプチ配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１に由来するものであり、そして、少なくとも一つの置換、第２４９位のグリシンのセリンによる置換を示している。
また、他の実施例においては、本発明に係る変異体は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１に由来するものであり、そして、少なくとも一つの置換、第１９２位のトレオニンのイソロイシンによる置換を示している。
【００２４】
最後に、他の実施例においては、本発明に係る変異体は、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１に由来するものであり、そして、少なくとも一つの置換、第２４９位のグリシンのセリンによる置換、及び、第１９２位のトレオニンのイソロイシンによる置換を示している。
尚、他の実施例においては、本発明に係るPapＭ変異体は、Ｌ−ＰＡＰＡのＬ−ＭＭＰＡＰＡへのメチル化１の活性よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、更に好ましくは少なくとも１０倍大きいＬ−ＭＭＰＡＰＡのＬ−ＤＭＰＡＰＡへのメチル化２の活性を示す。そのような変異体は、ＰＩＡの生成を増進するために特に有利である。
【００２５】
本発明は、更に、上記に定義したポリペプチドの変異体をコードする核酸に関するものである。好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１に存在するヌクレオチド配列、又はその遺伝子コードの縮重により得られる配列から突然変異により得られる核酸である。有利には、本発明に係る核酸は、少なくとも一つのミスセンス突然変異を第１９３から１９６位に位置しているＮＰＰＹモチーフの上流領域に含み、そして好ましくは、このミスセンス突然変異が、例えば第６５８位のシトシンをチミンで置換するような（Ｃ６５８Ｔ）（突然変異対立遺伝子６６）非保存型アミノ酸変化を誘導する。他の有利な実施例は、第８２８位のグアニンがアデニンで置換される（Ｇ８２８Ａ）（突然変異対立遺伝子４９）少なくとも一つの置換を含む核酸に関する。最後に、更に有利な他の形態は、第８２８位のグアニンがアデニンで置換される（Ｇ８２８Ａ）少なくとも一つの置換、及び、第６５８位のシトシンがチミンで置換される（Ｃ６５８Ｔ）少なくとも一つの置換を含む核酸（突然変異対立遺伝子４９／６６）に関する。
【００２６】
本発明の課題はまた、上記に定義した核酸を、ストレプトグラミン生成菌株におけるＢ構成成分異性体の比率を変動するために使用することである。ストレプトグラミン生成菌株は、本発明に関連して用いることができ、特に、ストレプトミセス オリバセウス(Streptomyces olivaceus)、ストレプトミセス オストレオグリセウス(Streptomyces ostreogriseus)、ストレプトミセス ミタカエンシス(Streptomyces mitakaensis)、ストレプトミセス ロイデンシス(Streptomyces loidensis)、ストレプトミセス グラミノファシエンス(Streptomyces graminofaciens)、ストレプトミセス デイアスタチカス(Streptomyces diastaticus)等のような菌株について言及することができる。ＭＭＰＡＰＡのＤＭＰＡＰＡへのメチル化２の活性よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、更に好ましくは少なくとも１０倍以上であるＰＡＰＡのＭＭＰＡＰＡへのメチル化１の活性を示すPapＭ変異体をコードする核酸は、特に、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の菌株中で発現した場合には、ＰＩＢの生成にとって更に有用である。ＰＡＰＡのＭＭＰＡＰＡへのメチル化１の活性よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、更に好ましくは少なくとも１０倍以上であるＭＭＰＡＰＡのＤＭＰＡＰＡへのメチル化２の活性を示すPapＭ変異体をコードする核酸は、特に、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の菌株において発現した場合には、ＰＩＡの生成にとって更に有
用である。
【００２７】
本発明の課題はまた、上記に定義した核酸を含む如何なる組換えＤＮＡに関するものである。
本発明はまた、特に、図１１において示されるベクターｐＶＲＣ１３０６の全部又は部分を含むベクターのような、上記に定義した核酸又は組換えＤＮＡを含んでいる、自律的に複製する及び／又は組み込む、如何なる発現ベクターに関するものでもある。
【００２８】
本発明の課題はまた、上記に定義した核酸及び／又は組換えＤＮＡ、及び／又は発現ベクターを含む宿主細胞に関するものである。本発明に係る宿主細胞は、真核細胞及び原核細胞の双方である。真核細胞中で適当なものとしては、動物細胞、酵母又は真菌を挙げることができる。特に、酵母では、サッカロミセス属（Saccharomyces）、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ピシア属(Pichia)、シュワンニオミセス属(Schwanniomyces)、ハンセヌラ属(Hansenula) を挙げることができる。動物細胞では、ＣＯＳ，ＣＨＯ及びＣ１２７細胞、アフリカツメガエル卵（Xenopus eggs）等である。真菌では、特に、ミクロモノスポラ種(Micromonospora spp.)、アスペルギルス種(Aspergillus spp.)、又はトリコデルマ種(Trichoderma spp.) を挙げることができる。原核細胞としては、好ましくは、以下のような細菌が用いられる：放線菌(Actinomycetes)、そして特に好ましくは、ストレプトミセス属（Streptomyces）、大腸菌（E.coli）(実施例７)、バチルス(Bacillus)。好ましくは、本願発明に係る組換え細胞は、ストレプトグラミン生成細胞、特に好ましくは、ストレプトミセス オリバセウス(Streptomyces olivaceus)、ストレプトミセス オストレオグリセウス(Streptomyces ostreogriseus)、ストレプトミセス ミタカエンシス(Streptomyces mitakaensis)、ストレプトミセス ロイデンシス(Streptomyces loidensis)、ストレプトミセス グラミノファシエンス(Streptomyces graminofaciens)、及びストレプトミセス デイアスタチカス(Streptomyces diastaticus)から選択される。本発明に係る組換え細胞は、外来ヌクレオチド配列を細胞中へ取り込ませる如何なる方法によってでも得ることができる。特に、形質転換、電気穿孔、接合、プロトプラスト融合、又は当業者に既知の如何なる他の技術であってもよい。
【００２９】
本発明の課題はまた、上記に定義した宿主細胞が培養され、そして生成したポリペプチドが回収される、本発明に係るPapＭポリペプチド変異体を生成する方法に関するものである。
本発明はまた、上記に定義され、そして本発明に係るPapＭポリペプチド変異体を発現する宿主細胞を、生物変換反応において使用することに関するものでもある。特に、これらの細胞は、芳香族アミンをモノメチル化アミンに変換することを可能とし、特に、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンを４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンに変換する。これらの生物変換は、当該細胞の全細胞又は無細胞抽出物を用いて行なうことができる。
【００３０】
本発明の他の課題は、ストレプトグラミンのＢ構成成分を生成する方法に関するもので、以下の工程を含むものである：
― papＭ遺伝子が、ストレプトグラミンを生成する又は潜在的にストレプトグラミンを生成する菌株において不活性化され、そして、上記に定義されたpapＭ変異体をコードする核酸の一つ又はそれ以上のコピーが誘導され、
― 当該菌株を、ストレプトグラミンを生成する条件下で培養し、そして、
― 生成したストレプトグラミンのＢ構成成分を回収すること。
好ましくは、ストレプトグラミンを生成する菌株は、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）に由来するプリスチナマイシン生成菌株であり、更に好ましくは、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ９２菌株、又はＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＡＴＣＣ２５４８６菌株に由来するものである
。また、次の菌株からも選択することができる：ストレプトミセス オリバセウス(Streptomyces olivaceus)ＡＴＣＣ１２０１９、ストレプトミセス オストレオグリセウス(Streptomyces ostreogriseus)ＡＴＣＣ２７４５５、ストレプトミセス ミタカエンシス(Streptomyces mitakaensis)ＡＴＣＣ１５２９７、ストレプトミセス ロイデンシス(Streptomyces loidensis)ＡＴＣＣ１１４１５、ストレプトミセス グラミノファシエンス(Streptomyces graminofaciens)、及びストレプトミセス デイアスタチカス(Streptomyces diastaticus)。
【００３１】
有利には、ストレプトグラミン生成菌株は、ストレプトグラミンのＡ構成成分を微量又は測定不可能な量しか生成しない菌株である。ストレプトグラミンのＡ構成成分を生成しない菌株としては、特に、特許出願ＷＯ９３／２０１８２に記載されているＳ．オステオグリセウス(S. osteogriseus)Pr4Q031/CBS142.93菌株を指摘することができる。ストレプトグラミンのＡ構成成分を生成しないＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）菌株の例としては、化学的突然変異によるＳＰ９２由来のＳＰ２１３菌株（Blanc et al., 1994）、又は、特許出願ＷＯ９３／２０１８２に記載されているＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）Pr4R31(寄託番号CBS182.92)菌株を指摘することができる。菌株ＳＰ２１３及びPr4R31は、プリスチナマイシンＰＩを特異的に生成するが、プリスチナマイシンＰII（Ａ構成成分）は、もはや測定不可能な量しか生成しない。
【００３２】
好ましい変異体において、本発明に係るPapＭ変異体をコードする核酸の導入は、papＭ遺伝子の野生型の置換によって行われる。導入された核酸により発現した変異体に依存して、ストレプトグラミンの種々のＢ構成成分の生成を促進することが可能となる。このようにして、ＫcatPAPA・ＫmMMPAPA／ＫcatMMPAPA・ＫmPAPA比率が、野生型のポリペプチドに比較して増大している変異体を発現するＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）菌株がＰＩＢの好ましい生成を誘導する。これとは逆に、この比率が減少している変異体は、ＰＩＡの生成を増大することができる。好ましくは、ＰＩＢの生成のために、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）菌株は、少なくとも突然変異（Ｇ８２８Ａ）若しくは突然変異（Ｃ６５８Ｔ）又は二重突然変異（Ｃ８２８Ａ）（Ｃ６５８Ｔ）を示すpapＭ遺伝子を含む。
【００３３】
本発明はまた、ＰＩＮＨ２を生成する方法に関するものであり、そこにおいては、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）のpapＭ遺伝子の野生型を不活性化した、及び／又は不活性型PapＭポリペプチドをコードする核酸により置換した菌株が使用されている。
【００３４】
本発明の他の課題は、本発明に係るPapＭポリペプチドの変異体をコードする核酸を含んでいる、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の突然変異菌株に関するものである。そのような菌株は、特に、野生型papＭ遺伝子を破壊して、カセットΩ−Ｋｍ（実施例８参照）がpapＭの突然変異した対立遺伝子の一つと交換できるようにする自殺プラスミドを用いて、該カセットΩ−Ｋｍで置換されている組換え菌株を形質転換することによって得ることができる。説明のために、本発明は、突然変異Ｃ６５８Ｔ（突然変異対立遺伝子６６）を有する核酸を含んでいる、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ２１７菌株、又は二重突然変異Ｃ６５８Ｔ及びＧ８２８Ａ（突然変異対立遺伝子４９／６６）を含んでいる、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ２１８菌株について記載している。これらの突然変異は、前もってpapＭ遺伝子を破壊して、カセットΩ−Ｋｍで置換してある、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ２１３菌株に導入した。同様なアプローチで、突然変異対立遺伝子６６を菌株ＳＰ９２に導入して、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ１０１菌株を構築することもできる。本発明に係るpapＭ変異体を合成する、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ１０１、ＳＰ２１８及びＳＰ２１７菌株は、主としてＰＩＢを生成する。
【００３５】
本発明の課題はまた、ＰＩＮＨ２を生成するための菌株Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の使用に関するものである。そのような菌株は、特に、papＭ遺伝子を不活性化した後の菌株ＳＰ２１３から誘導され、そして主としてＰＩＮＨ２を生成する菌株ＳＰ２１６によって説明する。
【００３６】
本発明はまた、PapＭポリペプチドの変異体、又は相同遺伝子によってコードされるポリペプチドの変異体を選択するための以下の方法に関するものである。
(a) 化学的突然変異誘導の工程は、プラスミドにクローンしたpapＭ遺伝子又は相同遺伝子に対して行ない、
(b) ライブラリーは、工程(a)で行われた突然変異誘導を受けたプラスミドを受容菌株に形質転換することにより調製し、
(c) 初期速度条件下の、時間単位当たり変換されるメチル化基質の量の比率「ｒ」が、ｒ＝基質１／（基質１＋基質２）で表され、これが野生型ポリペプチドに比較して少なくとも２０％増大し、そして好ましくは０.６より大きいか又はそれに等しくあるようなメチル化活性を示すクローンを選択する。
【００３７】
この点に関して、本発明は、プラスミドにクローンしたpapＭ遺伝子に、試験管内（in vitro）において、いかにしてヒドロキシルアミンを用いて化学的突然変異を誘導し、そしてその結果、突然変異体のライブラリーを構築し、そしてこのライブラリーから、微小酵素的スクリーニングにより、対応する蛋白質が上記に記載した触媒特性を有するような突然変異papＭ遺伝子を発現し、かつ、上記に定義した比率「ｒ」が、０.６より大きいか又はそれに等しい大腸菌（E.coli) クローンを選択するかを明らかにしている。
本発明は、以下の実施例を用いて説明しているが、これらの実施例は、非限定的な説明として考慮されるべきである。
【実施例】
【００３８】
〔実施例１〕酵素スクリーニングのための方法論及びプロトコール
本実施例は、ヒドロキシルアミンによる突然変異処理により得られた酵素集団（実施例２及び３参照）を用いた、新規な動力学的特性を示すPapＭ酵素の突然変異型のスクリーニングを説明している。特に、本実施例は、当該酵素の二種類の天然基質に対して改変された選択性を有するPapＭ変異型の生成を説明している。
【００３９】
１.１. 方法論
papＭメチラーゼは、以前に既にクローン化され、精製され、そして特性決定がされている（Blanc et al., 1994; Blanc et al., 1997）。PapＭは、Ｌ−ＰＡＰＡのＮ−メチル化によるＬ−ＭＭＰＡＰＡへの変換、及びＬ−ＭＭＰＡＰＡのＮ−メチル化によるＬ−ＤＭＰＡＰＡへの変換の双方を触媒する二機能性酵素である（図４参照）。
Ｌ−ＰＡＰＡ及びＬ−ＭＭＰＡＰＡは、PapＭの二種類の競合的基質であり、それぞれミカエリス定数（Km）２４０及び５３０μMを有し、そして、PapＭの最大速度（Vmax）は、時間当たり及びPapＭのmg当たり、それぞれ５５及び７１μmolである（Blanc et al., 1997）。
【００４０】
Ｌ−ＰＡＰＡ及びＬ−ＭＭＰＡＰＡのメチル化のそれぞれの速度V1及びV2の比率は、PapＭの動力学的パラメター（Ｌ−ＰＡＰＡのKm１及びVmax１、Ｌ−ＭＭＰＡＰＡのKm２及びVmax２）に依存し、かつ、Ｌ−ＰＡＰＡ及びＬ−ＭＭＰＡＰＡのそれぞれの濃度S1及びS2にも依存し、以下の式に従う。
Ｖ１／Ｖ２=（Ｖmax／Ｋｍ１）[Ｓ１]／（Ｖmax２／Ｋｍ２）[Ｓ２]
固定濃度S1及びS2における二種類のメチル化速度V1及びV2の同時測定により、Ｌ−ＰＡ
ＰＡ及びＬ−ＭＭＰＡＰＡについてのPapＭの反応動力学定数の比率を求めることができ
る。この比率は、当該検定に使用するPapＭの量には依存しない。突然変異PapＭ酵素の選択性がＬ−ＰＡＰＡに対して増大すれば、V1／V2比率は増大し、これとは逆に、突然変異PapＭ酵素が好適にＬ−ＭＭＰＡＰＡをメチル化するときは、この比率は減少する。
最後に、Kmにおける微小な変異を除き、逆にKmにおける大きな変異、又はVmax値における改変を促進するために、Ｌ−ＰＡＰＡ及びＬ−ＭＭＰＡＰＡの濃度は、飽和条件を維持するため、Kmの約６倍に固定される。そのような条件下では、野生型PapＭ酵素を用いた場合、メチル化１の速度及びメチル化２の速度は、実質的には同一である。
PapＭの二種類のメチル化活性の同時測定は、実施例7.1.に記載されている。このPapＭのメチラーゼ活性の測定は、Ｌ−ＰＡＰＡ１.５ｍＭ、Ｌ−ＭＭＰＡＰＡ３ｍＭ、及びSAM７０μｌの存在下で行なった。
【００４１】
１.２. 突然変異PapＭ酵素集団のスクリーニング
実施例３の記載のようにして調製した、突然変異PapＭ酵素を生成する大腸菌（E.coli)
クローンのライブラリーの９６穴プレートを２３℃で解凍した。次に、混合物Ａの２５μｌを、各穴のＬＢ培地中の培養２００μｌに添加した。混合物Ａは、（１）二塩化水素化物型のＬ−ＰＡＰＡの１２mg及び（ＤＬ）−ＭＭＰＡＰＡの７１mgを溶解し、ＷＯ９６／０１９０１−Ａ１の記載のようにして調製した、５０ｍＭのBis-Tris-プロパン緩衝液、ｐＨ１０を３ml、（２）４ｍＭのＳＡＭ水溶液を０.７ｍｌ、（３）２５μＣｉ／ml及び６０ｍＣｉ／mmolの [14Ｃ−Ｍe ]−ＳＡＭを０.７ml（ＡＭＥＲＳＨＡＭ製）、（４）１００ｍＭのBis-Tris-プロパン緩衝液、ｐＨ６.８を０.６ml、及び（５）ＥＤＴＡの二ナトリウム塩５６mgを連続的に加えて得ることができる。添加量は、混合物Ａの５ml量の調製に必要な量として表示している。プレートを接着フィルムで密閉し、その後２７℃で２時間インキュベートした。反応は、終止溶液を４０μｌ添加して終止させた。終止溶液（４ml量当たり）は、２４mg／mlのヘプタン硫酸ナトリウム水溶液２.２ml及び濃塩酸１.８mlを混合して得ることができる。プレートを３０００ｇで５分間遠心分離した後、各穴の上清画分の約１００μｌを実施例7.1.に記載した系でＨＰＬＣにより分析した。
各穴について、放射化学検出記録から得られるＭＭＰＡＰＡ及びＤＭＰＡＰＡピークのそれぞれのＡ１及びＡ２領域を積分した。そして比率ｒを次式により計算した。
ｒ＝Ａ１／（Ａ１＋Ａ２）
野生型PapＭメチラーゼの場合、ｒ＝０.５０±０.０５。
メチル化２よりもメチル化１に対して有意に活性の高い突然変異PapＭ酵素に対して定めた比率ｒの閾値は、凡そ０.６０であった。
【００４２】
〔実施例２〕ヒドロキシルアミンを用いたpapＭ遺伝子の突然変異誘導
本実施例２は、大腸菌（E.coli)中で複製することができるプラスミドにクローンされたストレプトミセス属（Streptomyces）のプラスミドＤＮＡを用いる、papＭ遺伝子の突然変異誘導について説明している。
２.１. 突然変異誘導試薬の選択
化学的突然変異誘導は、シトシン残基に特異的に結合して、その結果アデニン残基と対になることができるＮ４−ヒドロキシシトシンを形成するヒドロキシルアミン（ＮＨ2ＯＨ）を用いて行なった。ヒドロキシルアミンは、それ故、Ｇ：Ｃ＞Ａ：Ｔ変換をもたらす。この突然変異誘導試薬の選択は、特に、７０から７５％のＧＣ残基を含んでいるストレプトミセス属（Streptomyces）のＤＮＡのような、ＧＣ−豊富なＤＮＡの突然変異の誘発に有利である。
【００４３】
２.２. 突然変異誘導を起こさせるプラスミドの選択
突然変異誘導は、二種類の異なるプラスミド、プラスミドｐＶＲＣ７０６及びプラスミドｐＵＣ４Ｋ上で同時に行なった。
プラスミドｐＶＲＣ７０６（図５）は、ｐＭＴＬ２３（Chambers et al.,1988) の誘導
体であり、ｐＭＴＬ２３中に、当該突然変異誘導が行なわれたpapＭ遺伝子を運搬するプ
ラスミドｐＶＲＣ４０９に由来する１.７ｋｂのＭluＩ−ＳtuＩフラグメント（Blanc et al., 1994; Blanc et al., 1997）が、唯一のＭluＩ及びＢamＨＩ部位間にクローン化されている（ＢamＨＩで切断した末端は、Sambrook et al., (1989) のプロトコールの通り、クレノウ酵素の作用により平滑末端化されている）。ＳtuＩ末端のｐＭＴＬ２３のＢamＨＩ部位へのクローニングは、クレノウ酵素を用いて補充されて、次のクローニングに再利用できるＢamＨＩ部位を再構築することを可能とする。ＭluＩ部位におけるクローニングは、プラスミドｐＭＴＬ２３のlacZ遺伝子によりコードされるβ−ガラクトシダーゼの最初の３２アミノ酸とpapＭ遺伝子の上流に位置するpapＢ遺伝子の最後の１１アミノ酸との間のインフェーズ融合を得ることを可能とする。このことにより、当該ヌクレオチド配列を考慮してこれら二つの遺伝子間に存在すると思われる翻訳カップリングが保存される（Blanc et al., 1994）。この構築において、papＭ遺伝子の発現は、ＩＰＴＧの１ｍＭの添加により誘導されるlacZ遺伝子のＰlacプロモーターにより調節される。そのような発現システムは、大腸菌（E.coli)において、総蛋白質の約０.５％に相当する活性型可溶性蛋白質形態のPapＭメチラーゼの生成を可能とする（Blanc et al., 1994）。
プラスミドｐＵＣ４Ｋ（図６）は、アンピシリン及びカナマイシンに対する耐性を付与する二つの遺伝子を運ぶベクターｐＵＣ４の誘導体である（Vieira and Messing, 1982）。このプラスミドは、次の理由により突然変異誘導対照として選択した：（１）大きさ（３.９ｋｂ）が、プラスミドｐＶＲＣ７０６（４.４ｋｂ）に近く、（２）二つのプラスミドｐＵＣ４ＫとｐＶＲＣ７０６は、共にベクターｐＵＣシリーズに由来しているため、極めてよく似た構造及び特性を有していて、（３）ｐＵＣ４Ｋにより運搬される二つの耐性遺伝子、ampP及びkanRの存在により、これらの遺伝子の一つにおける突然変異誘導が起こったクローンの百分率を、選択した抗生物質に感受性なクローンを計測することにより、容易に計算することができる。
【００４４】
２.３. 突然変異誘導プロトコール
ヒドロキシルアミンを用いた二つの突然変異誘導を、Humprey et al.,(1976) のプロトコールにより、インキュベーション温度を変えて（８０℃及び８５℃）行なった。塩化セシウム勾配で精製したプラスミドＤＮＡ５ｍｇを、０.０５Ｍの燐酸ナトリウム及び０.５ｍＭのＥＤＴＡを含んでいる緩衝液中で、最終容量１００ｍｌ中の０.４Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ６）と、３５分間、所定の温度（８０℃及び８５℃）で接触させた。突然変異誘導反応は、０.１Ｍの燐酸ナトリウム及び１ｍＭのＥＤＴＡを含んでいる緩衝液１００ｍｌを添加して終止させ、そして、ヒドロキシルアミンは、２リットルのＴＥＳ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７.５、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１００ｍＭのＮａＣｌ）を用い、８回連続の透析により除去した。このように処理したＤＮＡを、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ８）及び２.５容量の９５％エタノールを添加して沈殿させた。ＤＮＡペレットをリンスし、乾燥し、そして１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、及び１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.５）に移した。それぞれのプラスミドについて、ヒドロキシルアミンの不存在下で調べた温度において、突然変異誘導反応の対照実験を行った。
【００４５】
２.４. 突然変異誘導処理をしたプラスミドを受容する大腸菌（E.coli)菌株の調製
大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株（supE44 DlacU169 (f80 lacZDM15) hsdR17 recA1 endA1
gyrA96 thi-1 relA1）、(Hanahan, 1990)を、上記のプロトコールに基づいて突然変異誘導処理をしたプラスミドｐＶＲＣ７０６及びｐＵＣＫ４を用いた形質転換後における突然変異誘導を評価するために使用した。
電気穿孔による形質転換の受容能を有する大腸菌（E.coli)ＤＨ５αの細胞は、次のプロトコールに基づいて調製した：ＬＢ培地中の１リットル培養を３７℃で、O.D.(600nm)値が０.５から０.８に達するまで行なった。その後、成長を停止させるために細胞を氷中に３０分間置いた後、４０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。細胞ペレットを１リッ
トルの冷却した滅菌水、０.５リットルの冷水、及び１０％グリセロールを含んでいる冷
却溶液２０ｍｌで連続してリンスした。各リンスのたびに、細胞は４０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。最後に、細胞ペレットを１０％濃度のグリセロール２ｍｌに溶解した。このようにして調製した細胞を、直ちに電気穿孔に用いるか、又はその後の使用に用いるため、４０ｍｌごとに小分けして、−８０℃で冷凍保存した。エレクトロコンピテント細胞の形質転換効率は、ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡのμｇ当たり、１０9個のコロニー数の程度であった。
【００４６】
このようにして調製した大腸菌（E.coli)ＤＨ５α細胞は、試験用プラスミドの５ｎｇ量に相当する量で電気穿孔に用いた。このためには、エレクトロコンピテント細胞の４０μｌを、プラスミドＤＮＡの５ｎｇを含んでいる溶液１〜２μｌと、４℃で１分間接触させた。電気穿孔機(Bio-Rad)を２５ｍＦパルス、２５００Ｖにセットした。パルス制御器の抵抗は、２００Ωにセットした。細胞／ＤＮＡ混合物を、０.２ｃｍ幅の電気穿孔キュベトに入れてから、電気パルスを掛けた。パルス時間は通常通り４.５から５ｍｓであった。パルスの後に１ｍｌのＳＯＣ培地（バクトアガー２％、１０ｍＭのＮａＣｌ、２.５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、２０ｍＭのグルコース）を直ちに細胞に添加し、そして混合物全体を５ｍｌのポリプロピレン管に移し、３７℃で１時間インキュベートした。この操作により細胞は回復し、そして細胞中に透過したプラスミドに存在している耐性遺伝子の発現を開始することができる。このインキュベーションの最後に、細胞培養を適当に希釈し（希釈係数は、通常の１０-1から１０-4）、そして形質転換したコロニーを選択用抗生物質（アンピシリンの５０μｇ／ｍｌ又はカナマイシンの５０μｇ／ｍｌ）を含んでいるＬＢ固体培地上で選択した。
【００４７】
２.５. 突然変異誘導の評価及び選択温度条件の決定
試験した二種の突然変異誘導の温度条件は、次の二種の基準に従って評価した。第一に、突然変異誘導を行なったプラスミドの大腸菌（E.coli)菌株への形質転換能力、第二に、突然変異誘導を行なったｐＵＣ４Ｋプラスミドで形質転換した大腸菌（E.coli)で、プラスミドによりコードされる二種の耐性のうち一種を失ったクローンの百分率。
二種類のプラスミドｐＶＲＣ７０６及びｐＵＣＫ４について、ヒドロキシルアミンを用いた突然変異誘導を行なったプラスミドの大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株への形質転換能力を測定した。この能力を、ヒドロキシルアミンの不存在下で、培養温度について対照として調製した、突然変異誘導を行なっていないプラスミドの能力と比較した。ヒドロキシルアミンの作用は、特にプラスミドにおいて、更に特には、組換えクローンの選択を可能とする耐性遺伝子において、また複製起点を保持している領域においても、致死突然変異を引き起こした。それ故、突然変異誘導処理が効率的であればあるほど、プラスミドの形質転換能力の損失は大きくなると考えることができる。突然変異誘導処理をした二種のプラスミドの形質転換能力を、突然変異誘導処理をしなかった対照プラスミドの形質転換能力に対する百分率（％）で示したものを、下記の表に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
統計的に１０倍あったプラスミドが変化して、大腸菌（E.coli)ＤＨ５αのエレクトロコンピテント細胞を形質転換し、複製し、そして得られたクローンにアンピシリン耐性を付与することが可能であるプラスミドはわずか１.５％を残すのみであったことから、これらの結果は、８５℃における突然変異誘導が二種のプラスミドｐＶＲＣ７０６及びｐＵＣ４Ｋにとって明らかにより有効であることを明確に示している。更に、ｐＵＣ４Ｋについて得られた結果は、（AmpiR）又は(KanaR)のいずれを選択しようとも極めて均一であり、このことより、これら二種の耐性を発現するのに必須の領域において、ヒドロキシルアミンの作用は均一に起こることが示された。
評価のための第二の基準は、突然変異誘導処理をしたプラスミドｐＵＣ４Ｋにおいて、アンピシリン耐性（AmpiR）のクローン中のカナマイシン感受性(KanaS)のクローン、又はその逆の場合の百分率（％）を計算することである。これらの百分率は、当該耐性遺伝子(ampＲ又はkanＲ)においてヒドロキシルアミンの作用によって生じ、そして完全な阻害（転写又は翻訳の阻止）により、又は不完全な及び／もしくは不活性な蛋白質の合成を引き起こすことにより、発現を妨げる突然変異の頻度を反映する。
これらの百分率を推測するため、突然変異誘導処理をした又は処理をしていないプラスミドｐＵＣ４Ｋで、大腸菌（E.coli)ＤＨ５αのエレクトロコンピテント細胞を形質転換して得られるクローンから選択された２００個の(KanaR)又は（AmpiR）クローンを、それぞれアンピシリン又はカナマイシンを含んでいる固形ＬＢ培地上で培養した。二種の抗生物質の一つに対して感受性なクローンを、培養２４時間後に計測した。ヒドロキシルアミンにより突然変異誘導処理をした又は処理をしていないプラスミドｐＵＣ４Ｋで形質転換したクローン中の、アンピシリン又はカナマイシン感受性なクローンの百分率は、下記の表の通りである。
【００５０】
【表２】
【００５１】
これらの結果から、ヒドロキシルアミン処理したもののみが、ｐＵＣ４Ｋの二種の耐性遺伝子のうち一つの発現に影響を与える突然変異を明らかに引き起こすと結論付けることができる。更に、８５℃で行なった突然変異誘導は、８０℃で行なった突然変異誘導に比べて、プラスミドｐＵＣ４Ｋの二種の耐性遺伝子にとって、３〜４倍も効果的であったと結論付けることができる。最後に、これらの試料からヒドロキシルアミンの作用は、二種の耐性遺伝子ampR及びKanRにとって比較的均一であったことも明らかとなった。
それ故、ヒドロキシルアミンの作用は、二種のプラスミドｐＵＣ４Ｋ及びｐＶＲＣ７０６の全てにおいて働くこと、及び、８５℃で行なった突然変異誘導は、プラスミドｐＶＲＣ７０６によって運ばれるpapM遺伝子におそらく最も影響を与えたことが推測できる。この突然変異誘導条件の比較から、８５℃で行われるヒドロキシルアミンによる突然変異誘導に由来するプラスミドｐＶＲＣ７０６を用いて、大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株のエレクトロコンピテント細胞の形質転換により得られるクローンのみを、当該研究のその他において選択すればよいことが分かった。
【００５２】
〔実施例３〕プラスミドｐＶＲＣ７０６を保持している大腸菌（E.coli)ＤＨ５αのライ
ブラリーの構築と開発
本実施例は、８５℃で行なったヒドロキシルアミンによる化学的突然変異誘導を受けたプラスミドを保持している大腸菌（E.coli)ＤＨ５αの６０００個のクローンのライブラリーの構築と開発について説明するものである。
上記のpapM遺伝子を運ぶプラスミドｐＶＲＣ７０６に対して８５℃で行なったヒドロキシルアミンによる化学的突然変異誘導の場合は、ヒドロキシルアミンの作用が全プラスミドｐＶＲＣ７０６に全体的に及ぶ（実施例２参照）という仮説を推し進めることによって、これらのプラスミドを保持している６０００個の大腸菌（E.coli)クローンのライブラリーは、何％かのクローンが突然変異papM遺伝子を発現している突然変異ライブラリーを表わしているということができる。相当するPapＭ蛋白質によって触媒される二種のメチル化活性を同時に測定することによる当該ライブラリーの６０００個のクローン分析はこの仮説を確認している（実施例４参照）。
【００５３】
本ライブラリーを構築するため、大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株のエレクトロコンピテント細胞への形質転換の後、アンピシリン５０ｍｇ／ｍｌを含んでいるＬＢ培地の試験皿上で選択した６０００個のクローンを、それぞれアンピシリン１００μｇ／ｍｌを補足したホグネス培地及び保存培地（Sambrook et al., 1989）２００ｍｌを含んでいる９６穴の微量滴定プレートの穴中で培養した。このように構成した保存用プレートを、１６０ｒｐｍの低速撹拌で、３７℃で２４時間インキュベートした結果、クローンは増幅し、そして定常増殖期に達した細菌の飽和懸濁液を形成した。その後、保存用プレートの各穴の培地の一定量を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及び１ｍＭのＩＰＴＧを補足したＬＢ培地２００ｍｌを含んでいる２個の９６穴プレートの各穴にそれぞれ再播種して、保存用プレートを二連に複製した。こうして得たプレートは検定用プレートと呼ぶが、２４時間（３７℃、１６０ｒｐｍ）培養した結果、クローンは増幅し、そして定常増殖期に達した細菌の飽和懸濁液を形成した。細菌細胞中のプラスミドｐＶＲＣ７０６の存在は、アンピシリンを用いて選択し、これらのプラスミドにより運搬されるpapＭメチラーゼ遺伝子の発現は培養開始時点にＩＰＴＧを添加して誘導した。これらのプレートは、その後、細菌粗懸濁液を用いたメチル化活性の測定前に−８０℃で凍結した（実施例１参照）。
一旦二連に複製した保存用プレートは、−８０℃に保存し、そして分析のための６０００クローンの長期用保存とした。
【００５４】
〔実施例４〕突然変異誘導処理をしたプラスミドｐＶＲＣ７０６を保持する大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株のライブラリーのスクリーニング結果
本実施例は、有利な特性を有する酵素をコードする突然変異遺伝子を保持するクローンを選択するための小規模の活性検定法を用いる、６０００クローンのライブラリーの迅速分析について説明する。
４.１. ６０００クローンの簡略なスクリーニング結果
実施例１に記載したようにして行った第一スクリーニングの終点において、実施例３で調製したライブラリーの６０００クローンについて、以下のものを選択した。
−メチル化活性がゼロ又は測定不可能な４４１個のクローン、即ち、レベル７.３％；
−第二反応に比較して第一メチル化反応が優先されている９個のクローン、即ち、比率ｒ（実施例1.2で定義）が０.６より大きいクローン。それ故、このような突然変異の発生頻度は極めて低く、０.１５％であった。
これらの第一結果は、以下に記載のように実証した。
【００５５】
４.２. 選択したクローンの確認方法
第一スクリーニングによって選択した全クローンのメチル化活性は、実施例３で調製した複製プレートを用いて、また第一検定結果を確認するため、同一のプロトコールに従って体系的に再検定した。大多数のクローンについては、検定結果の確認ができたものと思われる。
このようにして、以下のことが確認された。
−メチル化活性が零を示す、３６０個のクローン、即ち、レベル６％。
−第二反応に比較して第一メチル化反応が優先されている８個のクローン、即ち、比率ｒ（実施例１.２で定義）が０.６より大きいクローン。それ故、そのような突然変異の発生頻度は極めて低く、０.１３％であった。
酵素活性の比率が、ｒ＞０.６０である８個のクローンについて、他の２つの確認工程を行なった。
（１）これらクローンのプラスミドＤＮＡを標準的技術（Sambrook et al., 1989）を用いて単離し、そして、大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株の新しいエレクトロコンピテント細
胞中へ再導入した。この工程により、８個のクローンについて観察されたメチル化活性比率ｒの変化は、クローンの染色体状況に関連するのではなく、選択したクローンに起源するプラスミドにのみ依存することが確認された。
（２）次の確認工程は、選択したクローンに存在するpapM遺伝子を、新しい発現ベクターｐＭＴＬ２３中へ再クローニングすることである。このため、papM遺伝子を運搬する１.７ｋｂのMluI-BamHI フラグメントを、選択したクローンから抽出したプラスミドＤＮＡから単離し、ｐＭＴＬ２３の唯一のMluI 及び BamHI部位間に再クローニングする。これらのクローニングに必要な工程（プラスミドＤＮＡの単離、プラスミドＤＮＡの制限酵素による消化、酵素消化物のアガロースゲル電気泳動による泳動と分析、電気泳動後のＤＮＡフラグメントの調製、連結反応）は、Sambrook et al.(1989)により記載された標準的プロトコールに従って行なうことができる。
【００５６】
得られたプラスミドは、ｐＶＲＣ７０６（図５）とよく似た構造をしており、papM遺伝子の８個の突然変異対立遺伝子の一つを保持している点が相異していた。これらはｐＶＲＣ７１０〜ｐＶＲＣ７１７と呼ばれ、それぞれの番号は８個の突然変異対立遺伝子の一つに由来するが、これを大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株の新しいエレクトロコンピテント細胞中へ再導入した。得られたクローンのメチル化活性は、上記のようにして、再検定した。この工程により、これらのクローンについて観察されたメチル化活性比率ｒの変化は、papM遺伝子の外側のｐＶＲＣ７０６領域で生じる一つ（又はそれ以上）の突然変異に関連するのではなく、papM遺伝子に位置している一つ（又はそれ以上）の突然変異にのみ関連することを確認することができた。
これら全ての確認工程により、前もって選択した８個の突然変異のうち、７個の表現型を確認することが可能となった。例えば、実施例１.２で記載したように計算した二種のメチル化活性の比率は、突然変異４９（クローン４９Ｃ９）では０.６３、そして突然変異６６（クローン６６Ａ９）では０.６７であったが、一方、同様の実験において、野生型papM遺伝子を発現するクローンでは、わずかに０.４０であることが観察された。
【００５７】
〔実施例５〕プラスミドｐＶＲＣ７０６に８５℃でヒドロキシルアミンを処理した突然変異誘導に由来する突然変異papM遺伝子の遺伝的特性
本実施例は、化学的突然変異誘導を受けた遺伝子の遺伝的特性について説明している。遺伝的特性の決定は、それらの配列を野生型遺伝子と比較するために、及び観察された表現型の原因となる突然変異を実証するために、突然変異した遺伝子をクローン化し、そして配列決定することにより行なうことができる。本遺伝的特性の決定は、観察されるアミノ酸変化を、これらの酵素について見られる触媒特性の変化と関連付けるため、突然変異した遺伝子によりコードされる蛋白質の生化学的特性の決定と並行して行なわれる（実施例７参照）。
【００５８】
５.１. 方法
プラスミドｐＶＲＣ７０６に８５℃でヒドロキシルアミンを処理した突然変異誘導に由来する突然変異papM遺伝子の場合、７個の選択クローンのpapM遺伝子をサブクローン化し、そして配列決定をした。突然変異誘導を受けたプラスミドｐＶＲＣ７０６の１.７ｋｂのMluI-BamHI 領域部分は、突然変異papM遺伝子を保持しているが、これをサンガー法（Sambrook et al.,１９８９）によるＤＮＡ配列決定に適するＭ１３ファージ（Messing et al., 1981）に由来するベクター中へ、２個のサブインサートとしてサブクローン化した。papM遺伝子の３’部分を含んでいる０.７ｋｂのSmaI-AgeI フラグメントをベクターＭ13mp18のSmaI部位にクローン化し、そして、５’部分を含んでいる０.４ｋｂのSalI-PstI フラグメントをベクターＭ13mp18とベクターＭ13mp19のSalIとPstI部位の間にクローン化した（図５）。これらのサブクローン化に必要な工程は、Sambrook et al., (1989) により記載された標準的プロトコールに従って行なった。これら２個のインサートは、Applied Biosystems 社が販売しているＰＲＩＳＭ ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kitシステムの蛍光ジデオキシヌクレオチドを用いた「サンガー」鎖終結法(“Sanger”chain termination method) により、２重鎖で配列決定した。この配列決定反応は、合成プライマーとして、ユニヴァーサルプライマー（Sambrook et al.,1989)、又は配列決定される当該インサートの２０ヌクレオチド配列に相補的であり、そして自動シンテサイザー Biosearch 8600 (Blanc et al., 1995) により合成されるオリゴヌクレオチドを用いて、一重鎖ＤＮＡ上で、ＰＣＲ機により行なった。これらの反応の生成物は、配列の電気泳動を行ない、それを読み取ることができる自動シークエンサー Applied Biosystems 370A により分析した。その後、配列は、特に配列の連結、蛋白質への翻訳及び野生型配列との比較を可能とするInfobiogen bioinoformatics center のＢＩＳＡＮＣＥサーバーのプログラムを使用して処理した（Dessen et al., 1990）。
【００５９】
５.２. 結果
最初に、次の７個のクローンを一重鎖で配列決定し、そして比率ｒを再測定した（これについての実験において、野生型PapＭ酵素の比率は０.４０に等しいことが分かった）。
【００６０】
突然変異株 比率 突然変異 突然変異（核酸）
45 0.52 Thr274 ＞ Ile ACC ＞ ATC
49 0.63 Gly249 ＞ Ser GGC ＞ AGC
52 0.66 Gly249 ＞ Asp GGC ＞ GAC
66 0.67 Thr192 ＞ Ile ACC ＞ ATC
69 0.51 Met226 ＞ Ile ATG ＞ ATA
74D4 0.63 Gly249 ＞ Ser GGC ＞ AGC
74D5 0.52 Met226 ＞ Ile ATG ＞ ATA
【００６１】
プラスミドｐＶＲＣ７０６に８５℃でヒドロキシルアミンを処理した突然変異誘導に由来する突然変異papM遺伝子によりコードされる蛋白質の配列を、野生型papM遺伝子（Blanc et al., 1994；Blanc et al., 1997）によりコードされる蛋白質の配列と比較した結果は、図７に表示してあり、そして次の表には、７個の選択したクローンのうち２個について、両鎖において確認した配列を表示してある。
【００６２】
【表３】
【００６３】
この表においては、対応する蛋白質におけるアミノ酸変化を引き起こす突然変異のみを表示した。いくつかのクローンでは、特に突然変異株６６と命名したクローン６６Ａ９では、遺伝暗号の縮重によりアミノ酸配列における変化を引き起こさない他のサイレント突然変異が観察された。
選択し、配列決定をした７個のクローンのそれぞれについて、一個のアミノ酸変化を誘導し、そしてヒドロキシルアミン処理後に期待されるＣ＞Ｔ又はＧ＞Ａ変化型に効果的に対応する、papM遺伝子における点突然変異を明らかに示すことが可能である、という点は注目すべきことである。分析した７個のクローンの内、これらの突然変異の幾つかは数回観察されたため、これらの７個のクローンを、影響を受けた部位に従って４つの突然変異クラスに分類した。上記のクローンは、このようにして構築した４つのクラスのうち２つを代表するものである。
【００６４】
当該２つの突然変異、即ち配列SEQ ID No.1を参照して、第一に、６５８位のシトシンのチミンによる置換（C658T）（突然変異対立遺伝子６６）、第二に、８２８位のグアニンのアデニンによる置換（G828A）（突然変異対立遺伝子４９）の効果について、本研究の残りの部分において、更に詳細に研究した。
この遺伝的特性決定と並行して、実施例７に記載した突然変異遺伝子によりコードされる蛋白質の生化学的特性決定を行い、その結果、野生型papM遺伝子によりコードされる蛋白質に比較した場合、これらの酵素の触媒特性における変化が観察された。
このように、観察されたアミノ酸変化は、これらの酵素について見られる触媒特性の変化と関連付けることができる。
【００６５】
突然変異株６６において変化したアミノ酸は、１９３から１９６位に位置しているＮＰＰＹモチーフ直前の１９２位のトレオニンであったことは注目すべき点である（図７）。このモチーフは、全てのＮ−メチラーゼ中に、特にＤＮＡ Ｎ−メチラーゼ（アデニンの６位及びシトシンの４位のメチル化）中に保存されていて、そしてこれら酵素の触媒ドメインの一部であると思われている（Schluckebier et al., 1995）。それ故、極性アミノ
酸であるトレオニン残基の、疎水性であるイソロイシン残基への変換は、対応する蛋白質の触媒特性にとっておそらく重要なことである。突然変異遺伝子６６によりコードされる酵素の触媒特性におけるかなりの変化、更に特定には、第二メチル化反応（実施例７参照）に関する変化に実際注目した。
【００６６】
〔実施例６〕プラスミドｐＶＲＣ７０６に処理した突然変異誘導に由来する突然変異papM遺伝子を用いた、二重突然変異papM遺伝子の遺伝子工学による構築
本実施例は、プラスミドDNAにヒドロキシルアミンを処理した突然変異誘導の後に得られ（実施例２参照）、酵素スクリーニングにより選択され（実施例４参照）、及び配列決定により特性決定された（実施例５参照）単一突然変異を示す遺伝子を用いた、二重突然変異遺伝子の遺伝子工学による構築について説明している。驚くべきことに、この方法により、単一突然変異体中に観察された特性を蓄積している、より有利な突然変異遺伝子を得ることが可能となる。
【００６７】
対になって起こる突然変異の複数の組合せが成立した。その実例として、突然変異４９及び６６の組合せを以下に詳細に説明する。この趣旨で、キメラ遺伝子が、突然変異papM遺伝子６６の５’部分を、突然変異papM遺伝子４９の３’部分に結合することによって生成された。これを行なうため、次のDNAフラグメントを単離した。
−０.６５ｋｂのＭluＩ-ＸhoＩ フラグメントは、突然変異papM遺伝子６６を運搬するプラスミドｐＶＲＣ７１３から単離した（実施例４参照）。このフラグメントは、ＡＴＣコドンを含んでいる対立遺伝子６６の最初の部分を含んでいたが、それは突然変異を受け、そして改変されたメチラーゼ６６の１９２位に見出されたイソロイシンをコードするものである（図７参照）。
−１.０５ｋｂのＸhoＩ-BamHI フラグメントは、突然変異papM遺伝子４９を運搬するプラスミドｐＶＲＣ７１１から単離した（実施例４参照）。このフラグメントは、ＡＧＣコドンを含んでいる対立遺伝子４９の最後の部分を含んでいたが、それは、突然変異を受け、そして改変されたメチラーゼ４９の２４９位に見出されたセリンをコードするものである（図７参照）。
【００６８】
１９２及び２４９位で変異した蛋白質をコードするpapM遺伝子の二重突然変異対立遺伝子を保持しているという点では相違するが、ｐＶＲＣ７０６（図５）とよく似た構造を持つプラスミドを構築するため、これら２つのフラグメントは、Sambrook et al.,（1989）の標準的プロトコールに従って、プラスミドｐMTL２３（Chambers et al., 1988）の唯一のＭluＩ-BamHI部位間に共クローンした。得られたプラスミド（ｐＶＲＣ７１８と命名）は、大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株のエレクトロコンピテント細胞の形質転換、及び１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＰlacプロモーターの誘導後、二重突然変異遺伝子４９／６６を発現した。
二重突然変異対立遺伝子４９／６６は、その後、Ｔ７ファージRNAポリメラーゼにより認識される強力なPT７プロモーターを用いる第二発現ベクターｐET１１ｃ（Novagen）中に移した。これを行なうために、papM遺伝子４９／６６を保持している１.８ｋｂのＢglII-BamHI フラグメントは、プラスミドｐＶＲＣ７１８から単離し、ｐET１１ｃの唯一BamHI部位にクローン化した。挿入方向に対応して、Ｔ７ファージの遺伝子１０とpapＭ遺伝子上流に位置しているpapB遺伝子との間で翻訳融合を生成する、図８に記載してあるｐＶＲＣ７２１と命名した組換えプラスミドを単離した。その後、このプラスミドを、T７ファージRNAポリメラーゼを発現して、そしてそれ故にT７プロモーターから転写したpapM遺伝子４９／６６を発現することができる大腸菌（E.coli)の発現菌株Bl２１（DE３）中へと導入した。
Ｔ７ファージ発現システムを用いた同様の構築により、プラスミドｐＶＲＣ７０６で得られる生成の１０倍以上もの野生型PapＭ蛋白質の過剰生成が観察された（Blanc et al.,
1997）。Ｔ７ファージを用いた当該システムは、同様に、二重突然変異遺伝子４９／６６によりコードされる変異したメチラーゼを、実施例７に記載したように精製して特性決定するために、過剰生成することを可能とする。
【００６９】
〔実施例７〕大腸菌（E.coli)菌株において発現したＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）のpapM遺伝子（野生型又は変異体）の生成物の生化学的特性決定
本実施例は、PapＭ蛋白質（変異体又は野生型）により触媒される反応の反応動力学定数の測定について説明している。PapＭ蛋白質は、２つの反応を触媒する。第一は、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ-ＰＡＰＡ）の４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ-ＭＭＰＡＰＡ）へのメチル化、そして第二は、４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ-ＤＭＰＡＰＡ）へのメチル化である。
【００７０】
７.１. ４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへのメチル化活性、及び、４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへのメチル化活性の検定
本実施例は、プリスチナマイシンＩａの構成成分である４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへの生合成の二種類の最終活性の検定について説明している。その第一は、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへのメチル化（メチル化１）、そしてその第二は、４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへのメチル化（メチル化２）であり、これらの二種類の活性は、SAMをメチル基ドナーとして用いている（図４）。
検定すべき酵素画分（１から２０ユニット）は、メチル基を炭素１４同位体（２Ci／mo
l）で放射線標識したSAM（２００μM）を含んでいる５０ｍMのbis-tris−プロパン緩衝液、ｐH６.８の総容量２００μｌ中、メチル化１の検定には、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（１ｍＭ）、又は、メチル化２の検定には、４−メチルアミノ−Ｌ−アラニン（２.５ｍＭ）の存在下で、２７℃で３０分間インキュベートした。
反応は、３７％塩酸の１６μｌを添加し、その後、ヘプタン硫酸ナトリウム（２４０ｇ／ｌ）の２０μｌを添加して終止させた。遠心分離の後、上清画分の１５０μを、次の勾配様式のHPLCシステム中に注入した。
【００７１】
― 移動相：溶離液Ａ＝ヘプタンスルホネート（１.２ｇ）＋氷酢酸（２.５ｍｌ）＋水（総量を1000mlとする量）。溶離液Ｂ＝ヘプタン硫酸ナトリウム（１.２ｇ）＋氷酢酸（２.５ｍｌ）＋アセトニトリル（３００ｍｌ）＋水（総量を1000mlとする量）。勾配は、次のようにして作成した。ｔ＝０で、溶離液Ｂの３０％；ｔ＝１６（分）で、溶離液Ｂの３０％；ｔ＝１７（分）で、溶離液Ｂの１００％；ｔ＝２０分で、溶離液Ｂの１００％；ｔ＝２１分で、溶離液Ｂの３０％；ｔ＝２５（分）で、溶離液Ｂの３０％。
― 固定相：Nucleosil(R) C 18 5μm × 4.6 mm カラム (Macherey-Nagel)
カラムから溶離する酵素反応の基質と生成物は、２５４ｎｍにおける吸光度で定量した。この測定は、GT400−U4型の固体シンチレーションセルを備えたBerthold LB506検出器を用いたオン−ライン放射化学測定と連動させた。このことにより、放射性メチル基の反応生成物への取込みを特異的に追うことができる。
メチル化１（及びメチル化２）の酵素活性のユニットは、メチル基１nmolを、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（又は、４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン）へ取り込むのに必要な酵素量として定義した。
【００７２】
７.２. ４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへのメチル化、及び４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへのメチル化を触媒するＳＡＭ−依存性Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）（野生型又は変異体）の組換え蛋白質の精製
本実施例は、突然変異papM遺伝子のクローン化により大腸菌（E.coli)で発現した、プ
リスチナマイシンＩＡの生合成経路に関与するＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）SP９２の酵素の精製について説明している。
【００７３】
７.２.ａ. 突然変異PapＭ酵素４９／６６の精製
前述の実施例7.1において記載した検定法を用いて、ＳＡＭ−依存性Ｎ−メチルトランスフェラーゼを下記の通り精製し、必要な場合は、各工程間の活性画分を−７０℃で凍結して保存した。
ＩＰＴＧによる誘導の後にPapＭ突然変異体４９／６６を過剰生成する大腸菌（E.coli)BL21(DE3)::pVRC721（実施例６参照）の培養から遠心分離したペレットを、１ｍMのPMSF、５ｍMのEDTA、５ｍMのEGTA、０.５MのＫＣl及び１０容量％のグリセロールを含んでいる１００ｍMの燐酸緩衝液、ｐH７.２で洗浄した。この洗浄したペレットの２グラムを、４ｍMのDTE、５ｍMのベンズアミジン、０.２ｍMのペファブロック(Pefabloc)、１００μｇ／ｌのE-64、２ｍｇ／ｌのロイペプチン、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、２ｍｇ／ｌのアプロチニン、２０％のグリセロール及び２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含んでいる０.１MのTris-HCl緩衝液、ｐH８の２０ｍｌ中に懸濁した。この緩衝液は、＋４℃で保存した。このようにして得られた懸濁液は、＋４℃で激しく撹拌した。３０分間の撹拌の後、０.２ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩ及び５ｍＭのＭｇＣｌ2を添加した。９０分間の撹拌の後、抽出物を、５００００ｇで１時間遠心分離した。当該上清画分を、２.５ｍｌのアリコートにおいて、４ｍMのDTE、５ｍMのベンズアミジン、０.２ｍMのペファブロック(Pefabloc)、１００μｇ／ｌのE-64、２ｍｇ／ｌのレプチン、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、２ｍｇ／ｌのＳＴＩ、２ｍｇ／ｌのアプロチニン、２０容量％のグリセロールを含んでいる２０ｍMのbis-tris緩衝液、ｐH６.８で平衡化した、PD-10カラム(Pharmacia) のゲル浸透により脱塩した。溶離した蛋白質の一部（蛋白質３４mg）は、ＭonoＱ ＨＲ(R) １０／１０カラムを用いて、４ｍMのDTE、２ｍMのベンズアミジン、１００μｇ／ｌのE-64、２ｍｇ／ｌのロイペプチン及び２０容量％のグリセロールを含んでいる２０ｍMのbis-tris緩衝液（ｐH６.８）中で、塩化ナトリウムの増大する直線勾配（０から０.３M）の流速３ｍｌ／分で、クロマト展開した。カラムから溶離した画分は、４ｍMのDTE、３０ｍMのベンズアミジン、２ｍMのペファブロック(Pefabloc)、１００μｇ／ｌのE-64、２ｍｇ／ｌのロイペプチン、５ｍMのEDTA、５ｍMのEGTA、１０ｍｇ／ｌのSTI、１０ｍｇ／ｌのアプロチニン及び２０容量％のグリセロールを含んでいる２０ｍMのbis-tris緩衝液（ｐH６.８）の１０容量％とした。これらの条件下では、二種類のメチル化活性（１及び２）が、排除画分(exclusion fraction)及び最初の溶離画分(elution fraction)中に、同一の態様で検出された。これらの画分を合わせて、Centriprep(R)10、次いで Centricon(R)10の超遠心分離により濃縮した。この濃縮液を、０.８５Mの硫酸アンモニウムに懸濁し、そして、Phenyl-Superose ＨＲ(R)５／５カラムを用いて、４ｍMのDTE、２ｍMのベンズアミジン、１００μｇ／ｌのE-64、２ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA及び１０容量％のグリセロールを含んでいる５０ｍMのbis-tris緩衝液（ｐH６.８）中で、硫酸アンモニウムの減少する直線勾配（０.８５から０Ｍ）の流速０.５ｍｌ／分で、クロマト展開した（一展開当たり２０から８０ｍｇ）。カラムから溶離した画分は、４ｍMのDTE、３０ｍMのベンズアミジン、２ｍMのペファブロック(Pefabloc)、１００μｇ／ｌのE-64、２ｍｇ／ｌのロイペプチン、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、１０ｍｇ／ｌのSTI、１０ｍｇ／ｌのアプロチニン及び１０％のグリセロールを含んでいる５０ｍMのbis-tris緩衝液（ｐH６.８）の１０容量％とした。これらの条件下では、二種類のメチル化活性（１及び２）が、約０.１５Ｍの硫酸アンモニウムに対応する溶離画分(elution fraction)中に、同一の態様で検出された。
この工程の後に得られた酵素は純品であった。SDS-PAGE電気泳動により収束した単一のバンドの分子量は、３２０００の領域であることが分かった。
【００７４】
【表４】
表４：大腸菌（E.coli)菌株BL21(DE3)：：pVRC721からの、変異４９／６６ ４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（フェニルＮ−）メチルトランスフェラーゼ酵素の精製。精製係数は、精製中の画分の比活性の増大に従って計算した。
【００７５】
７.２.ｂ. 野生型、突然変異４９及び突然変異６６PapＭ酵素の精製
PapＭ wt、PapＭ ４９及びPapＭ ６６酵素は、それぞれプラスミドｐＶＲＣ７０６、ｐＶＲＣ７１１及びｐＶＲＣ７１３で形質転換し（実施例４参照）、そしてIPTGで誘導した大腸菌（E.coli)ＤＨ５αの培養から精製した。使用した精製プロトコールは、実施例7.2.a.で記載したものと同様である。
【００７６】
７.３. 精製したPapＭ（野生型及び変異体）メチラーゼのKｍ及びVmax反応動力学定数の測定
メチル化活性の検定条件は、SAMの２mＭ濃度を除いては、実施例7.1 に記載したものと同様であり、メチル基は、炭素１４同位体（２Ci／mol）で放射能標識されている。濃度範囲は、メチル化１の基質４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン及びメチル化２の基質４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンのそれぞれについて０.１から６０mＭまで変化させて調製した。各基質の各濃度について反応速度を測定し、そして時間当たり、及び蛋白質ｍｇ当たりに換算して、nmol 単位で表示した。
反応動力学定数の値は、Enzfiterソフトウエアーを使用してプロットしたミカエリス・メンテン曲線から求めた。
野生型PapＭ酵素、及び突然変異型PapＭ４９、PapＭ６６及びPapＭ４９／６６について得られた値は、下記の表に示した通りである。
【００７７】
【表５】
【００７８】
これらの結果から、この方法により、天然の酵素と比較して新規な触媒特性を示す新規な酵素を得ることができることが明らかとなった。この酵素の各突然変異型について、各メチル化反応（メチル化１及び２）の酵素活性を測定した。その活性は、比率Vm1／Km１（メチル化１）又はVm２／Km２（メチル化２）で定義した。
【００７９】
次に、各突然変異型について酵素活性の比率（メチル化反応１／メチル化反応２）を測定した。この比率は、Vm１・Km２／Vm２・Km１と同一である。
野生型PapＭ酵素から得られた当該比率は、１.１であった。
酵素活性の比率が２.５より大きいPapＭ変異体を選択した。最良の変異体は７より大きい比率を示し、そして好ましくはほぼ１０を示した。
【００８０】
【表６】
【００８１】
７.４. 二種の基質４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン及び４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン間の競合検定法
本実施例は、PIB生成にとって最も活性の高いメチラーゼ、即ち、Ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンをＰ−メチル−Ｌ−フェニルアラニンに変換する第一メチル化反応を、Ｐ−メチル−Ｌ−アミノフェニルアラニンをＰ−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンに変換する第二メチル化反応と比較して、最も良く触媒するメチラーゼを、いかにして識別することができるかについて説明するものである。
【００８２】
この二種の競合基質の変換速度の比率は、次の式で与えられる。
V1／V2＝(Kcat1／Km1)[S1]／(Kcat2／Km2)[S2]
Kcatは、酵素の代謝回転、即ち、酵素のモル数及び単位時間当たりメチル化される基質のモル数である。
この式は、S1及びS2の全ての濃度に対して有効である。
実際、いかなるS1及びS2濃度であっても、この酵素反応は、まるで二種の別々の酵素、即ちS1に作用しS2により競合的に阻害される酵素、及び、S2に作用しS１により競合的に阻害される酵素により触媒されるかのように、二種の要素の合計として表される。
【００８３】
二種の基質のうちの一つのKm及び／又はVmaxの如何なる変化も他の変換速度に影響し、そして比率V1／V2の変動をもたらす。
従って、各基質の２％より多くが変換されることがないように気を付けることによって、基質と酵素の量が影響を与えるということは避けることができる。
【００８４】
SAM濃度が２mＭであって、そのメチル基が炭素１４同位体（２.５Ci／mol）で放射能標識されていることを除いては、実施例７−１に記載したのと同様なメチル化活性の検定条件を用いて、そして、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンには、１ｍＭ、及び４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンには２ｍＭの濃度の、二種の基質の同時存在下で、それぞれの反応速度を測定することができる。
検定は、実施例４〜６に記載した突然変異体について、同様の基質溶液を用いて、同時に行なった。
これらの条件下では、二重突然変異メチラーゼ４９／６６は最も選択的であり、天然の酵素が二種の反応を同様に触媒するのに対し、これは第一メチル化反応を第二メチル化反応よりも７倍も良く触媒していた。
【００８５】
〔実施例８〕papＭ遺伝子を破壊したＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）組換え菌株の構築
本実施例は、papＭ遺伝子を破壊したＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の組換え菌株の構築について説明するものである。当該菌株は、野生型papＭ遺伝子
が、前述の実施例において記載したようにして取得し、特性決定した突然変異対立遺伝子の一つによって置換されている組換え菌株の構築についての第一工程を構成する。加えて、これらの菌株は、野生型papＭ遺伝子を有する菌株は天然では合成しないＰＩファミリーの化合物、ＰＩＮＨ２（図３）を主として生成する。それ故、これらの菌株は、papＭ遺伝子を破壊していない菌株から単離することが不可能なＰＩＮＨ２を得るための経路を示す。
【００８６】
８.１. papＭ遺伝子を破壊した組換え菌株の構築
papＭ遺伝子の破壊は、以下のようなＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の幾つかの菌株で行なった。
−PＩ及びPIIの混合物を生成する上述のＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）SP９２菌株（Blanc et al., 1994）。
−化学的突然変異誘導によってSP９２から誘導したSP２１３菌株。この菌株は、特異的にPＩを生成する。
papＭ遺伝子を破壊した組換え菌株の構築の方法は、これら二種類に対するものと同様である。SP２１３菌株について得られた結果を、当該実験の残部において詳述する。
本構築は、大腸菌（E.coli)中でのみ複製することができ、かつ、ストレプトミセス属（Streptomyces）中で発現する耐性遺伝子を運搬する自殺ベクターｐＤＨ５（Hillemann et al., 1991）から誘導したプラスミドｐＶＲＣ１３０３（図９参照）を用いて調製した。
【００８７】
８.１.１. プラスミドｐＶＲＣ１３０３の構築
プラスミドｐＶＲＣ１３０３は、以下のものを用いて、図９に記載した４つの主要なクローン化工程により構築した。
― 大腸菌（E.coli)中で作用する複製起点、大腸菌（E.coli)中で発現するアンピシリン耐性遺伝子、並びに、ストレプトミセス属（Streptomyces）中で発現するチオストレプトン及びノシヘプチド耐性遺伝子を運搬するベクターｐＤＨ５（Hillemann et al., 1991）；
−papＭ遺伝子の下流領域に位置しているプリスチナマイシンのクラスター遺伝子の一部を運搬する、２.５ｋｂのBsiWI-PstI フラグメント調製のためのプラスミドｐＶＲＣ４０９（Blanc et al., 1994）。
−papＭ遺伝子の上流領域に位置しているプリスチナマイシンのクラスター遺伝子の一部を運搬する、３.３ｋｂのPvuII-PvuII フラグメント調製のためのプラスミドｐＶＲＣ９００（Blanc et al., 1994; Blanc et al., 1997）。
−大腸菌（E.coli)中、及びストレプトミセス属（Streptomyces）中で発現するカナマイシン耐性遺伝子を基本的に運搬する３.７ｋｂのEcoRI-EcoRI フラグメントを中間クローン化工程の後に調製するためのプラスミドｐＨＰ４５Ω−Ｋｍ(Fellay et al., 1987) 及びｐＩＪ７０２(Hopwood et al., 1985)。このカナマイシン耐性遺伝子を運搬するΩ−Ｋｍカセットは、papＭ遺伝子の上流及び下流領域の間に導入され、ｐＶＲＣ１３０３にクローン化され、そして欠損したpapＭ遺伝子に置き換わる（図９）。
これらのクローン化に要求される全ての工程（プラスミドDNA単離、制限酵素によるプラスミドDNAの消化、クレノウ酵素処理による突出した５’末端の充填、アガロースゲル電気泳動による酵素消化の泳動と分析、電気泳動後のDNAフラグメントの調製、連結反応、大腸菌（E.coli)の形質転換、組換えクローンの選択及び分析）は、Sambrook et al.,（1989）により記載された標準的プロトコールに従って行なった。
【００８８】
８.１.２. プラスミドｐＶＲＣ１３０３を用いた相同的組換えによってpapＭ遺伝子を破壊したＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の組換え菌株の構築
当該組換え菌株は、プラスミドｐＶＲＣ１３０３を用いた、ＳＰ２１３菌株の形質転換の後に単離した。
これら菌株のプロトプラスト調製、及びＰＥＧを用いた方法によるそれらの形質転換は、Hopwood et al.（1985)の記載のようにして行なった。ｐＶＲＣ１３０３の１μｇを５回形質転換した後、プロトプラストを、Ｒ２ＹＥ培地（Hopwood et al., 1985)の上に撒き、そしてカナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるSNA培地３ｍｌを積層して、一晩再生させた後に選択した。
５回行なった形質転換から、３７個のカナマイシン耐性クローンを単離した。これらの組換え体は、以下のいずれかの結果に基づくものである。
−papＭの上流又は下流領域に位置する染色体及びプラスミド領域間における単一の相同的組換えに続く、プラスミドｐＶＲＣ１３０３の染色体への組込み（単一の乗換えの場合）；
−又は、papＭ遺伝子の上流又は下流領域に位置する染色体及びプラスミド領域間における二重の相同的組換えに続く、カナマイシン耐性遺伝子を運搬するプラスミドΩ−Ｋｍカセット、及び染色体のpapＭ遺伝子間における交換（図１０に表示した二重の乗換えの場合）。
【００８９】
これら二種の場合、Ω−Ｋｍカセットは、組換え菌株の染色体へ運搬されて、カナマイシン耐性を付与する。一方では、単一の乗換えの場合のみ、プラスミドｐＶＲＣ１３０３（図９）に存在している遺伝子が、組換え菌株の染色体へ運搬されて、チオストレプトン及び／又はノシヘプチド耐性を付与する（Hillemann et al., 1991）。それ故、これら二種の乗換え状態（単一又は二重の乗換え）は、ノシヘプチドに対する耐性又は感受性の表現型を分析することにより識別できる。
これを行なうため、上記に記載したように、プラスミドｐＶＲＣ１３０３を用いて５回行なった形質転換から由来し、及びカナマイシン１０μｇ／ｍｌに対する耐性で選択した組換えクローンを、カナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるHT培地（Hopwood et al., 1985)上に、パッチ状に継代培養し、そして、ノシヘプチド４００μｇ／ｍｌを含んでいるHT培地上で試験した。二重乗換えが生じた場合に対応する故に、表現型（ＫanaR, ＮosiS）を示すクローンのみを選択した。その後、これらの組換えクローンを以下の工程で精製した。これらのクローンを、カナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるHT培地上に撒きそして生育させ、単離したコロニーを得るためにそれを希釈してそして同じ培地上に再度撒いた後に、胞子保存を、Hopwood et al.（1985)の方法により調製した。これらのコロニーは、選択したクローンの純粋なサブクローンより成る。次に、５個の異なるクローンから誘導した２つのサブクローンについて分析した。
【００９０】
これらのサブクローンの染色体構造を確認するために、それらのゲノムＤＮＡを、カナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるＹＥＭＥ液体培地中で培養した後に、Hopwood et al.（1985)記載の、リゾチーム溶解とフェノール／クロロホルム抽出の技術に基づいて抽出した。これらの種々のクローンの全ＤＮＡをEcoRI 及び SphIで消化し、プラスミドｐＶＲＣ１３０３をEcoRIで直線化して、（α−32Ｐ）ｄＣＴＰ及びＡｍｅｒｓｈａｍにより市販されている標識キット（ランダムプライム DNA 標識キット）を用いて行われるランダムプライミングによる標識の後、プローブとして用いてハイブリダイズして、サザンブロットを数回行った。使用した技術は、Sambrook et al.(1989) に記載されているものである。ハイブリダイゼーションの結果から、サブクローンは、図１０の記載のように、ベクターｐＶＲＣ１３０３と菌株ＳＰ２１３の染色体との間の二重乗換えにより得られたものであることが明らかとなった。サブクローン中では、当該プローブとハイブリダイズする９.９ｋｂのEcoRIフラグメントが存在するが、これは野生型菌株ＳＰ２１３中には存在せず、ハイブリダイズするEcoRIフラグメントの大きさは、６.８ｋｂであることを特に確認した。
遺伝子型ＳＰ213ΔpapＭ::ΩkanaＲを有するクローンの一つをＳＰ２１６と命名した。このクローンを、その生成分析のために、そして、上述した実施例に記載したように、野生型papＭ遺伝子が、papＭの突然変異又は二重突然変異対立遺伝子の一つで置換されてい
る組換え菌株を得る観点から、遺伝子の構築を継続するために選択した。
【００９１】
８.２. 突然変異株ＳＰ２１６によるプリスチナマイシンの生成
本実施例は、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）のpapＭ遺伝子が破壊された突然変異株ＳＰ２１６が、いかにして標準的な培養条件下で、主にＰＩＮＨ２[４ξ−アミノ−デ（４ξ−ジメチルアミノ）プリスチナマイシンＩＡ]を生成することを決定するかについて説明するものである。ＰＩＮＨ２の構造は、図２に示してある。
突然変異株ＳＰ２１６及び対照としての野生型菌株ＳＰ２１３を、液体生産培地中で培養した。培養は次のようにして行なった。上記の菌株の胞子の懸濁液０.５ｍｌを、撹拌しながら、３００ｍｌの遮蔽板付きエーレンマイヤーフラスコ(baffled Erlenmeyer flask)中で、播種培地４０ｍｌに添加した。播種培地は、コーンスチープ(Corn Steep) １０ｇ／ｌ、蔗糖１５ｇ／ｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4を１０ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4を１ｇ／ｌ、ＮａＣｌを３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを０.２ｇ／ｌ、及びＣａＣＯ3を１.２５ｇ／ｌから成る。ｐＨは、炭酸カルシウムを添加する前に、水酸化ナトリウムで６.９に調節した。エーレンマイヤーフラスコは、３２５ｒｐｍで回転シェーカー上で２７℃で４４時間、振とうした。４４時間前培養した培養液２.５ｍｌを、３００ｍｌのエーレンマイヤーフラスコ中の生産培地３０ｍｌに滅菌的に添加した。生産培地は、大豆粉２５ｇ／ｌ、デンプン７.５ｇ／ｌ、グルコース２２.５ｇ／ｌ、飼料酵母３.５ｇ／ｌ、硫酸亜鉛０.５ｇ／ｌ、及び炭酸カルシウム６ｇ／ｌ、から成る。ｐＨは、炭酸カルシウムを添加する前に、塩酸で６.０に調節した。
【００９２】
エーレンマイヤーフラスコは２７℃で５０時間振とうした。培養が終了した後直ちに、培養液の容量を測定し、その２倍量のアセトニトリル３４％及び０.１ＭのＫＨ2ＰＯ4溶液６６％から成る移動相（濃Ｈ3ＰＯ4でｐＨ２.９に調節）を、プリスチナマイシンの抽出のために添加した。振とう後、全混合物を濾過した。プリスチナマイシンは上清に含まれていた。その上清はＨＰＬＣを用いて次のようにして検定した。遠心分離した上清画分の１５０μｌをNucleosil 5-C8(R)カラム、４.６×１５０ｍｍに注入し、アセトニトリル４０％及び０.１Ｍの燐酸緩衝液、ｐＨ２.９、６０％の混合物で溶出した。プリスチナマイシンは、２０６ｎｍのＵＶ吸収、場合によっては蛍光発光（３７０ｎｍフィルター、３０６ｎｍで励起）で検出した。プリスチナマイシンの生成は下記の表の通りであった。
【００９３】
【表７】
【００９４】
これらの結果から、生産培養条件下では、対照菌株ＳＰ２１３は、主にＰＩＡを含んでいるＰＩの標準量を生成するのに対して、突然変異株ＳＰ２１６は主にＰＩＮＨ２を生成することが明らかとなった。
【００９５】
〔実施例９〕対立遺伝子４９／６６papＭ又は対立遺伝子６６papＭを含んでいるＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の組換え菌株の構築
本実施例は、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）のpapＭ遺伝子が変異した組換え菌株が、ＰＩファミリーの化合物、ＰＩＢ（図２）を選択的に生成する能力について説明するものである。ＰＩＢは野生型papＭ遺伝子を有する菌株によって天然
に合成されるが、しかし、その量は極めて少なく、最高でも約５％である。それ故、これらの菌株は大規模にそして極めて特異的にＰＩＢを入手する経路を示す。
【００９６】
９.１ papＭ遺伝子において変異した組換え菌株の構築
突然変異papＭ遺伝子４９／６６を、上述したようにＰＩ及びＰIIの混合物を生成するＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ９２菌株へ(Blanc et al., 1994)、及び、化学的突然変異誘導によりＳＰ９２から誘導したＳＰ２１３菌株へ導入した。ＳＰ２１３菌株は特異的にＰＩを生成した。
突然変異papＭ遺伝子６６は、ＳＰ９２から誘導した菌株ＳＰ２１３へ導入した。
papＭ遺伝子の突然変異対立遺伝子の一つを運搬する組換え菌株を構築する方法は、papＭ遺伝子の対立遺伝子の変異型がいずれであれ（４９／６６又は６６）、また選択した菌株がいずれであれ同様である。当該方法は、野生型papＭ遺伝子が破壊され、そしてpapＭの突然変異対立遺伝子の一つを当該カセットと交換することができる自殺プラスミドを用いて、Ω−Ｋｍカセット（図８参照）により置換された組換え菌株の形質転換から成るものである。
【００９７】
説明のため、詳細は、papＭ遺伝子の突然変異した対立遺伝子４９／６６の、菌株ＳＰ２１６（菌株ＳＰ２１６の作成は図８に記載）への導入について、下記に記す。この構築は、大腸菌（E.coli)中でのみ複製することができ、かつ、ストレプトミセス属（Streptomyces）中で発現する、チオストレプトンまたはノシヘプチド耐性遺伝子を運搬する自殺ベクターｐＤＨ５（Hillemann et al., 1991）から誘導したプラスミドｐＶＲＣ１３０６（図１１参照）を用いて行った。
実施例９.２は、ＳＰ９２又はＳＰ２１３から誘導し、突然変異papＭ遺伝子６６又は突然変異papＭ遺伝子４９／６６のいずれかを発現する数種の組換え菌株について得られたプリスチナマイシンの生成結果を示すものである。
【００９８】
９.１.１. プラスミドｐＶＲＣ１３０６の構築
対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子を運搬するプラスミドｐＶＲＣ１３０６は、papＭ遺伝子の欠失を運搬するプラスミドｐＶＲＣ１３０３から構築されている。この構築は、図１１に記載した通り、三工程で行なった。これらのクローン化のため、以下のプラスミドを使用した。
−プラスミドｐＢＲ３２２は、大腸菌（E.coli)におけるクローン化のためのベクターであるが、これを、実施例8.1.1. に記載し、そして特に、カナマイシン耐性遺伝子を運搬するＷ−Ｋｍカセットにより欠失したpapＭ遺伝子を含んでいるｐＶＲＣ１３０３の８.９ｋｂのEcoRIフラグメントを転移するための中間ベクターとして使用した。クローン化は、ｐＢＲ３２２のEcoRI部位で行ない、そして得られたプラスミドは、ｐＶＲＣ１３０４と命名した。
−実施例６（図６）に記載したプラスミドｐＶＲＣ７２１を、対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子を含んでいる１ｋｂのMluI／AgeI インサートを調製するために使用した。このインサートは、ｐＶＲＣ１３０４の４ｋｂのMluI／AgeIフラグメントと交換し、こうして得られたプラスミドは、ｐＶＲＣ１３０５と命名した。
−プラスミドｐＶＲＣ１３０３は、８.９ｋｂのEcoRIフラグメントを、対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子を含んでいるｐＶＲＣ１３０５の５.８３ｋｂのEcoRIフラグメントにより交換することを可能とする。
それ故、最後のプラスミド、ｐＶＲＣ１３０６（図１１）は、対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子並びに当該遺伝子の上流領域及び下流領域の一部、実施例8.1.1. に記載したベクターｐＤＨ５中へクローン化される全構成要素を含んでいる。
【００９９】
９.１.２. プラスミドｐＶＲＣ１３０６を用いた相同的組換えによる対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子中で変異したＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）組換え菌株の構築
本組換え菌株は、実施例８で記載した菌株ＳＰ２１６を、プラスミドｐＶＲＣ１３０６で形質転換した後に単離した。このためには、二種類の工程が必要である。第一工程は、表現型（ＫanaR, ＮosiR）の分析による、papＭ遺伝子の上流に位置している染色体とプラスミド領域間の単一の相同的組換えに由来する菌株の選択から成る（図１２）。第二工程は、菌株（ＫanaR, ＮosiR）を使用して、得られたクローンの表現型（ＫanaS, ＮosiS）の分析による、第二相同的組換えの選択から成る（図１３）。
これら二種類の工程は、以下のようにして行なうことができる。
【０１００】
これらの菌株のプロトプラストの調製及びＰＥＧを用いた方法によるそれらの形質転換は、Hopwood et al.（1985)の記載のようにして行なった。独立に１０回の形質転換を行ない、毎回、１μｇのｐＶＲＣ１３０６を用いた。プロトプラストは、Ｒ２ＹＥ培地（Hopwood et al., 1985)上に播種し、そして一夜再生させた後に、ノシヘプチド４００μｇ／ｍｌを含んでいるＳＮＡ培地の３ｍｌを積層することにより選択した。
１０回の形質転換を行なった結果、ノシヘプチド耐性（Hillemann et al., 1991）の７個のクローンが単離できた。これらの組換え体は、papＭ遺伝子の上流に位置している染色体とプラスミド領域間の単一の相同的組換えに続く、プラスミドｐＶＲＣ１３０６の染色体への組み込みの結果得られたものであり、これらのクローンに、カナマイシン（形質転換した菌株に基づく）及びチオストレプトン（プラスミドの組換えに基づく）双方に対する、二重耐性を付与するものである。それ故、これら７個の組換えクローンを、カナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるＨＴ培地、及びノシヘプチド４００μｇ／ｍｌを含んでいるＨＴ培地上に継代培養した。これら全てのクローンは、予想通り、表現型（ＫanaR, ＮosiR）を示した。これらのクローンは、以下の方法により２回精製した。これらのクローンの胞子保存をHopwood et al.（1985)の方法により調製し、そして、ノシヘプチド４００μｇ／ｍｌを含んでいるＨＴ培地上に、この胞子保存の様々な希釈液を培養して単離コロニーを得た。これらのコロニーは、選択したクローンの純粋なサブクローンより成る。２個のクローンに由来する２個のサブクローンの染色体構造はサザンブロット法で分析した。
【０１０１】
ゲノムＤＮＡは、ノシヘプチド４μｇ／ｍｌを含んでいるＹＥＭＥ液体培地中で培養した後に抽出した。ＤＮＡは、Hopwood et al.(1985)記載の技術に基づいて、リゾチーム処理及びフェノール／クロロホルム抽出により抽出した。EcoRI 及び AseI制限酵素で消化した、これら種々のサブクローンの全ＤＮＡについて、サザンブロット法を数回行なった。EcoRI で消化した、ｐＶＲＣ１３０３由来の８.９ｋｂフラグメントを、（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰ及びＡｍｅｒｓｈａｍにより市販されている標識キット（ランダムプライム DNA 標準キット）を用いて得た、ランダムプライミング法による標識の後、プローブとして使用した。使用した技術は、Sambrook et al.(1989) に記載されているものである。ハイブリダイゼーションの結果（６.８３、３.４２、３.１２５及び２.０６ｋｂに対応するバンド）から、サブクローンは、ベクターｐＶＲＣ１３０６と菌株ＳＰ２１６の染色体との間の単一乗換えにより得られたものであることが明らかとなった。菌株ＳＰ２１６のＤＮＡは、４.４２、３.１２５及び２.０６ｋｂに対応するバンドを示したが、しかしながら６.８３ｋｂに対応するバンドは示さなかった。
これらのクローンの一つを、ＳＰ２１６::ｐＶＲＣ１３０６と命名した。
【０１０２】
第二工程は、papＭ遺伝子の下流に位置している染色体とプラスミド領域間の第二相同的組換えを、菌株ＳＰ２１６::ｐＶＲＣ１３０６を用いて、選択することである（図１３参照）。この工程は、Ω−Ｋｍカセットにより、欠失したpapＭ遺伝子を対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子で交換した組換えクローンの選択へと導く。予想される組換えクローンの表現型は、（ＫanaS, ＮosiS）である。
クローンSP216::pVRC1306を用いて第二組換えの発生を促進するため、２回の成長サイ
クルを回転培養機上で回転速度３２５ｒｐｍ、３０℃で行なった。第一回のサイクルは、ＹＥＭＥ培地１０ｍｌ中のSP216::pVRC1306胞子保存２００μｌを用いて行い（培養条件：３０℃、２８０ｒｐｍ、７２時間）、第二回のサイクルは、ＹＥＭＥ培地４０ｍｌ中の第一回サイクルの懸濁液８００μｌを用いて行った（培養条件：３０℃、２８０ｒｐｍ、７２時間）。第二回の培養を３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、ペレットを水＋０.０１％ ツウィーン(Tween) の６００μｌ中に懸濁し、そして胞子層を得るために、この懸濁液をＨＴ培地上に播種した。この液体培養から誘導した組換えクローンを精製するため、胞子を収集し、そして単離コロニーを得るために、この胞子の懸濁希釈液をＨＴ培地上に播種した。
【０１０３】
所望する表現型（ＫanaS, ＮosiS）を有するクローンを選択するため、１０００個の単離コロニーを継代培養し、そしてスクリーニングした。これらのコロニーは、自動的に、抗生物質を含んでいないＨＴ培地、及びカナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるＨＴ培地上で継代培養した。この第一工程により、１８個の組換えＫanaSクローンを選択することができた。抗生物質を含んでいないＨＴ培地からこれらの、１８個のクローンを手で拾い上げ、抗生物質を含んでいないＨＴ培地、カナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるＨＴ培地、及びノシヘプチド４００μｇ／ｍｌを含んでいるＨＴ培地上で継代培養した。表現型（ＫanaS, ＮosiS）を有する３個の組換えクローンを、二重乗換えの発生に由来している可能性のあるものとして選択した。これらのクローンを精製し、胞子保存を胞子層から調製し、そしてゲノム分析を、上記の方法により行なった。
【０１０４】
組換えサブクローンの染色体分析を二工程で行なった。第一工程は、対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子が存在していること、及びこの遺伝子の上流及び下流の染色体領域に変化がないことを確認することである。第二工程は、Ｗ−Ｋｍカセット及びプラスミドｐＤＨ５に対応するＤＮＡフラグメントが存在していないことを確認することである。
第一工程のため、組換えクローンのゲノムＤＮＡの調製を行い、そして全ＤＮＡ分析を、上記の方法に従って、サザンブロット法により行なった。全ＤＮＡを、EcoRI及びAseI 制限酵素で消化した。プラスミドｐＶＲＣ７２１は、ＭluI（対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子を含んでいる１.７ｋｂインサート）で消化した。この標識したフラグメントを、６.８３ｋｂバンドに対応するフラグメントとハイブリダイズするプローブとして使用した。
更に、全ＤＮＡを、SalIで消化した。ｐＶＲＣ４０９及びｐＶＲＣ８０３（菌株２１３のpapＭ遺伝子の上流及び下流領域を含んでいる、Blanc et al., 1994；Blanc et al., 1997) から誘導した標識フラグメントをプローブとして使用した。これらのフラグメントにより、ハイブリダイゼーションの後に、７個のバンド（２.４５、０.１９０、２.１５０、０.７２５、１.５５、０.４及び０.５５ｋｂ）が明らかに見えるようになった。
【０１０５】
第二工程は、Ω−Ｋｍカセット又はプラスミドｐＤＨ５に対応するＤＮＡフラグメントがこれ以上存在していないことを確認することである。全ＤＮＡを、EcoRI及びAseIで消化した。ｐＨＰ４５Ω−Ｋｍ(Felley et al., 1987)及びｐＤＨ５の２.２ｋｂのHindIII フラグメント（Ω−Ｋｍカセット）をプローブとして使用した。
３個の組換えクローンが、対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子の存在、並びにカナマイシン耐性遺伝子及びプラスミドｐＤＨ５に対応するフラグメントの不存在を確認する染色体像を示した（図１３）。これらの要素より、対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子のゲノム環境は完全無傷であることが示される。これらのクローンの一つを選択し、菌株ＳＰ２１７と命名した。
同様な方法で、対立遺伝子４９／６６突然変異papＭ遺伝子又は対立遺伝子６６papＭ遺伝子を組み込むＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の他の菌株も構築した。これらの菌株は：
― 対立遺伝子４９／６６突然変異papＭ遺伝子を運搬するプラスミドｐＶＲＣ１３０６
を用いた菌株ＳＰ９２の形質転換から誘導したＳＰ１０１；
― 対立遺伝子４９／６６突然変異papＭ遺伝子が対立遺伝子６６突然変異papＭ遺伝子で置換されている以外はｐＶＲＣ１３０６と等しいプラスミドを用いて、菌株ＳＰ２１６の形質転換から誘導したＳＰ２１８。
【０１０６】
９.２. Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の菌株ＳＰ２１３、ＳＰ２１７、ＳＰ２１８、ＳＰ１００及びＳＰ１０１によるプリスチナマイシンの生成
本実施例は、種々の突然変異株を用いたプリスチナマイシンの生成を示している。特に、対照papＭのｗｔ菌株（菌株ＳＰ２１３）と比較した、対立遺伝子４９／６６突然変異papＭ変異体（菌株ＳＰ２１７）及び対立遺伝子６６papＭ変異体（菌株ＳＰ２１８）のＰＩＢ生成における増大を示している。また、対立遺伝子４９／６６突然変異papＭ遺伝子
（菌株ＳＰ１０１）の影響についても、対照papＭのｗｔ菌株（菌株ＳＰ９２）を考慮した比較を行なった。
プリスチナマイシンの生成、抽出、及び検定の技術は、実施例8.2.に記載したものと同様である。
対照菌株（菌株ＳＰ２１３及びＳＰ９２）のＰＩＡ量との相対値で表した種々のプリスチナマイシンの生成レベルは、下記の表の通りである。
【０１０７】
【表８】
【０１０８】
これらの結果から、本発明に係るpapMポリペプチドの変異体を発現する遺伝子が、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の菌株に対し、ＰＩＢ生成の優れた選択性を付与していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】プリスチナマイシンIIの構造の例。
【図２】プリスチナマイシンＩの構造の例。
【図３】ＰＩＢ及びＰＩＡの各々の前駆体であるＭＭＰＡＰＡ及びＤＭＰＡＰＡの生合成経路。
【図４】ＰａｐＭ突然変異株をスクリーニングするために用いられる酵素検定試験の原理：［14Ｃ−Ｍｅ］−ＳＡＭ存在下における、ＰＡＰＡ及びＭＭＰＡＰＡの各々からのＭＭＰＡＰＡ及びＤＭＰＡＰＡの同時メチル化による標識。
【図５】プラスミドｐＶＲＣ７０６の図解。
【図６】プラスミドｐＵＣ４Ｋの図解。
【図７】野生型papＭ遺伝子の配列及び翻訳。突然変異クローン４９及び６６について同定された突然変異の位置。
【図８】プラスミドｐＶＲＣ７２１の図解。
【図９】プラスミドｐＶＲＣ１３０３を構築するための方法。
【図１０】プラスミドｐＶＲＣ１３０３とＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の染色体間における二重乗換え実例の図解。組換え菌株の染色体構造。
【図１１】プラスミドｐＶＲＣ１３０６を構築する方法。
【図１２】プラスミドｐＶＲＣ１３０６と組換え菌株ＳＰ２１６の染色体間において選択された単一乗換え実例の図解。
【図１３】papＭ遺伝子の突然変異対立遺伝子の一つを示している組換え菌株を生成する第二組換え現象の実例の図解。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトミセス属細菌のPapＭポリペプチドの新規な変異体に関するものであり、それは野生型ポリペプチドと比較して、基質特異性及び／又は改良した活性を有している。本発明は、更に、これらの変異体をコードする核酸、その核酸を組み込む微生物、及び、ストレプトグラミン（Streptogramin）のＢ構成成分の生成のための微生物の使用にも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プリスチナマイシン（Pristinamycin）は、ストレプトグラミン類に属する抗生物質であり、ビルジニアマイシン（virginiamycin）及びミカマイシン（mikamycin）もまた本類に属している。ストレプトグラミン類は、化学的には極めて異なる二種類の分子の組合せから成る抗生物質の小さな、均質で、そして独自の類を形成する：ストレプトグラミン類Ａは、ポリ不飽和マクロラクトンであり、そしてストレプトグラミン類Ｂは、デプシペプチドである（Cocito C.G.(1979) Microbil. Rev., 43:145-198）(Cocito C.G.(1983) In Antibiotics 6:(Ed. F.E.Hahn), 296-332)。プリスチナマイシンの場合は、化合物Ａ及びＢは、それぞれ、プリスチナマイシンII（PII）及びプリスチナマイシンＩ（PＩ）と命名されており、そしてそれらの化学構造式は図１及び２に表示されている。
【０００３】
化合物Ａ及びＢは、特にスタフィロコカス(Staphylococci) 及びエンテロコカス(Enterococci) のようなグラム陽性細菌に対して相乗的で殺菌的な抗細菌活性を有している（Cocito、1979)。これらの化合物は、標的細胞のリボソームの５０Ｓサブユニットに接触することにより作用して、蛋白質合成阻害を引き起こす（Cocito、1979)；（Di Giambattista M., Chinali G. and Cocito C.G.(1989) J. Antim. Chemother., 24:485-507）。
【０００４】
ストレプトグラミン類は、主として放線菌（Actinomycetes）により生成される。特に、プリスチナマイシンは、糸状細菌であるストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）により、ＰＩ３０％とＰII７０％から成る天然の混合物として生成される（Blanc et al., (1995), J. Bacteriol. 177(18):5206-14）。どちらの分子にも、数種類の異性体が副生されるが、それらは天然の代謝物について普通に見られるものである。
【０００５】
プリスチナマイシンＰＩ（プリスチナマイシンのＢ構成成分）の場合は、生成される主要な型はＰＩＡであり、アミノ結合及びエステル結合により互いに結合している以下の７残基から成る（図２）：３−ヒドロキシピコリン酸、Ｌ−トレオニン、Ｄ−アミノ酪酸、Ｌ−プロリン、４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−オキソ−Ｌ−ピペコリン酸、及びＬ−フェニルグリシン。数種類の天然の異性体がＰＩＡと共に副生されて、そして主に以下の残基に関する構造的修飾に対応する：Ｄ−アミノ酪酸、４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−ＤＭＰＡＰＡ）及び、４−オキソ−Ｌ−ピペコリン酸（Thibaut et al., (1997) J. Bacteriol. 170(3):697-704)。これらの希少型は、ストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）の菌株に依存して種々の割合で合成されるが、全体として数パーセント程度であり、ＰＩＡが、生成されたＰＩのうちの９０％〜９５％であった。ストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）の数種類の菌株は、マクロサイクルの４−位における４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−ＭＭＰＡＰＡ）の存在によりＰＩＡとは異なるＰＩＢ（図２）を約５％合成することは特に注目すべきことである。少数のことながら、ＰＩＢはその種々の薬理学的特性が極めて優れた分子であることが分かっている（ＷＯ９６／０５２１９）。
【０００６】
４−位における４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンの存在により異なる他のＰＩＡ類似体であるＰＩＮＨ２（図２参照）は、半合成による独創的な生産物開発の価値を有するものである。これまでのところ、ストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）の培地に、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンを添加する方法でＰＩＮＨ２を得ることが唯一可能であった（ＷＯ９６／０１９０１）。
【０００７】
ストレプトグラミン類の生成の改良のため種々の方法が考えられているが、最初の試みは生成されるＢ構成成分（プリスチナマイシンＩ）に対するＡ構成成分（プリスチナマイシンII）の全体的な割合を変える方向でのものであり、他の試みは、Ａ又はＢ構成成分それぞれに存在する種々の異性体の割合を変える方向でのものである。しかしながら、今日までのところ、プリスチナマイシンＰＩＢを満足のいくように生成することを可能とするには至らず、未だプリスチナマイシンのＢ構成成分（プリスチナマイシンＩ）の希少型のままである。
【０００８】
最初の試みは、ＷＯ９３／２０１８２の特許出願中に記載されているが、ストレプトグラミンのＡ構成成分又はＢ構成成分を特異的に生成することを可能とする微生物の選択から成るものである。これらの微生物は、場合によって行われる、ストレプトグラミンを生成する微生物の突然変異に関する第一工程、及びストレプトグラミンのＡ又はＢ構成成分のどちらかを選択的に生成する微生物を同定する第二工程から成る従来の選択的技術によって得ることができる。この技術により、特に、プリスチナマイシンＰII（Ａ構成成分）又はプリスチナマイシンＰＩ（Ｂ構成成分）を選択的に生成するストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）の菌株を得ることができる。しかしながら、その文献は、常に主要型であり続けるＰＩＡに比べてＰＩＢが優先されるように変更された異性体比を有するプリスチナマイシンＰＩを選択的に生成する如何なる菌株についても記載していない。
【０００９】
特許出願ＷＯ９４／０８０１４は、ストレプトグラミンのＡ構成成分の生合成経路に関与し、またＢ構成成分の生合成経路にも関与する酵素をコードする遺伝子の単離及び同定について記載している。当該出願はまた、Ａ又はＢ構成成分の生成レベルを増強する目的でこれらの遺伝子を発現すること、またこれらの遺伝子を、Ａ又はＢ構成成分の生合成経路の種々の段階を阻害して、その結果これらの生合成経路の或る中間体の蓄積をもたらす突然変異を構築するのに用いることについても記載している。更に具体的には、当該出願ＷＯ９４／０８０１４は、ストレプトミセス プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）のゲノムＤＮＡライブラリーから単離した１２種類の遺伝子、snaＡ、snaＢ、snaＣ、snaＤ、papＡ、papＭ、samＳ、snbＡ、snbＣ、snbＤ、snbＥ及びsnbＲの単離及び特性決定について記載しており、またＡ構成成分の生合成経路におけるsnaＡ、snaＢ、snaＣ及びsnaＤ遺伝子の関与について、及びＢ構成成分の生合成経路におけるpapＡ、papＭ、samＳ、snbＡ、snbＣ、snbＤ、snbＥ及びsnbＲ遺伝子の関与について実証している。
【００１０】
このように、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の菌株におけるsnaＡ遺伝子の不活性化は、もはやＰIIＡ（プリスチナマイシンのＡ構成成分の異性体の一つ）を生成することなく、ＰIIＢ（プリスチナマイシンのＡ構成成分の他の異性体）のみを、snaA遺伝子の野生型を持つ対照菌株により生成されるＰIIＡ及びＰIIＢの合計に匹敵する量だけ生成する菌株を得ることを可能とする。ＰＩ（プリスチナマイシンのＢ構成成分の全ての異性体）の生成は、snaＡ遺伝子が不活性化された菌株及び対照菌株においては、同様に維持されている。
【００１１】
samＳ遺伝子の不活性化は、対照菌株に比べて、ＰＩＡ（プリスチナマイシンのＢ構成
成分の異性体の一つ）を３５％少なく、そしてＰＩＢ（プリスチナマイシンのＢ構成成分の他の異性体）を約１０倍多く生成し、その結果、ＰＩＢレベルは生成した全Ｉ型のプリスチナマイシン（ＰＩ）総量の２０％にも達するような菌株の作成をもたらす。これらの菌株においてＰＩＢの生成は改良されてはいるが、しかし、ＰＩＢの生成は主要ではなく、ＰＩＡよりも少なく留まっている。
papＡ遺伝子又はsnbＡ遺伝子の不活性化は、ＰII型（Ａ構成成分）のプリスチナマイシンのみを生成し、そしてＰＩ型（Ｂ構成成分）のプリスチナマイシンはもはや生成しない菌株の作成をもたらす。
snaＤ遺伝子の不活性化は、これとは逆に、ＰＩ型のプリスチナマイシンのみを生成し、そしてＰII型のプリスチナマイシンはもはや生成しない菌株の作成をもたらす。
【００１２】
特許出願ＷＯ９６／０１９０１は、ストレプトグラミンのＢ構成成分に関連するが、しかしストレプトグラミン生成微生物によって天然に生成されるＢ構成成分とは異なる新規な化合物を製造する独創的な方法について記載している。この方法で使用している微生物菌株は、ストレプトブラミンのＢ構成成分の前駆体の生合成が突然変異により変異している。突然変異菌株として、Ｂ構成成分の前駆体の生合成経路が、papＡ、又はpipＡ、又はhpaＡ遺伝子の破壊によって変異しているＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）菌株を特に用いている。これらの菌株は、もはやプリスチナマイシンＰＩ（Ｂ構成成分）を生成することなく、プリスチナマイシンＰII（Ａ構成成分）を生成している。この突然変異菌株を、合成が変異した前駆体とは異なる独創的な前駆体を補足した培地中で培養する。この独創的な前駆体がデプシペプチド中に取り込まれ、そして天然の前駆体に置き換わることにより、ストレプトグラミンのＢ構成成分に関連した、有利な治療特性を示す新規化合物の生成がもたらされることとなる。
【００１３】
上記のアプローチ（ＷＯ９６／０１９０１）はＢ構成成分の内、希少型として天然に生成される異性体を主に生成する微生物菌株の入手を可能とする。しかしながら、その方法では、微生物菌株の天然の状態では存在しない特別な前駆体を培地に補足することが必要である。
【００１４】
プリスチナマイシンの生合成経路の基本的な生化学的及び遺伝学的研究により、ＰＩに関して観察される多くの異性体の起源を明らかとすることが可能となった。更に具体的には、ＰＩＢは、ＰＩＡのマクロサイクルに取り込まれるＬ−ＤＭＰＡＰＡの生合成中間体であるＬ−ＭＭＰＡＰＡが、SnbDEペプチドシンテターゼによってマクロサイクルへ取り込まれることに起源することが明らかとなった（Blanc et al., Mol. Microbiol (1997),23(2):191-202); Thibaut et al., J. Bacteriol. (1997), 179(3):697-704）。コリスメートからのＬ−ＭＭＰＡＰＡ及びＬ−ＤＭＰＡＰＡの生合成に関与するものとして、papＡ、papＢ、papＣ及びpapＭの４個の遺伝子が同定されている（Blanc et al.,1997)。
【００１５】
papＭ遺伝子は、図３に記載したスキームのように、Ｌ−ＭＭＰＡＰＡ経由で、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンからＬ−ＤＭＰＡＰＡを生成することを可能とする２つの連続したメチル化反応を触媒する蛋白質をコードする。これらの２個のメチル化反応は、極めてよく似た動力学的パラメター（反応速度及び結合定数）でもって、PapＭで触媒される（Blanc et al., 1997)。Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）のpapＭ遺伝子配列及びそれに対応するポリペプチド（４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（フェニルＮ）−メチルトランスフェラーゼ）の配列は、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１中に存在している。
【００１６】
本発明は、papＭ遺伝子産物の酵素活性を改変することによって、ストレプトグラミンのＢ構成成分の或る種の希少型異性体の生成を増大することを可能とする発見に基づくものである。
更に具体的には、本発明は、野生型ポリペプチドに比較して基質選択及び／又は改良された有効性を有するPapＭポリペプチドの新規な変異体の同定に基づくものである。本発明者らは、papＭ遺伝子に突然変異を起こして、対応する蛋白質が第一のメチル化反応に対しては十分な活性を保存しているが、しかしながら同時に、第二のメチル化反応を触媒することはもはやできないようにするか、または最低限でも第二のメチル化反応が第一のメチル化反応に比べて極度に阻害されるようにすることが可能であるということを実際に明らかとした。
【００１７】
Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）菌株のようなストレプトグラミン生成微生物における当該酵素の存在は、Ｌ−ＭＭＰＡＰＡの蓄積及びそれ故にＰＩＢの好適な生成を導くものである（図３）。これとは逆に、対応する蛋白質が、第一メチル化反応よりも極めて効率的に第二メチル化反応を触媒するように、papＭ遺伝子に突然変異を起こさせることも可能であり、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）菌株における当該酵素の存在は、Ｌ−ＤＭＰＡＰＡの蓄積及びそれ故にＰＩＡの生成の増大を導くものである。
【００１８】
本発明はまた、PapＭポリペプチドの不活性型を生成する微生物、またはpapＭ遺伝子の発現をもはやすることができない突然変異体が、野生型微生物では天然に合成することができるが、しかし単離するには余りにも微量であるストレプトグラミンのＢ構成成分の蓄積を可能とするという発見に基づくものである。このように、本発明は、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の多くの野生型菌株では合成することができず、また４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンをマクロサイクルの第４位に取込んだものに対応するものである、ＰＩＮＨ２と呼ばれるＰＩファミリーの化合物（図２）を主として生成する、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の組換え菌株の構築について記載するものである。
【００１９】
本発明の第一の課題は、野生型PapＭポリペプチドのメチル化基質に対するメチル化活性と比較して、同一のメチル化基質に対する異なる（増加又は減少）メチル化活性を示すPapＭポリペプチドの変異体に関するものである。
【００２０】
PapＭポリペプチドの変異体は、野生型PapＭポリペプチドとは異なる、メチル化基質１に対するＫcat1／Ｋm1比率で定義されるメチル化１の活性及び／又はメチル化基質２に対するＫcat2／Ｋm2比率で定義されるメチル化２の活性を示す。好ましくは、本発明に係るPapＭポリペプチドの変異体は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１に存在するPapＭポリペプチドのメチル化活性とは異なる、ＫcatPAPA／ＫmPAPA比率で定義されるＬ−ＭＭＰＡＰＡに対するＬ−ＰＡＰＡのメチル化１の活性、及び／又は、ＫcatMMPAPA／ＫmMMPAPA比率で定義されるＬ−ＤＭＰＡＰＡに対するＬ−ＭＭＰＡＰＡのメチル化２の活性を示すことである。
【００２１】
第一の実施例のように、本発明に係るPapＭポリペプチドの変異体は、Ｌ−ＤＭＰＡＰＡに対するＬ−ＭＭＰＡＰＡのメチル化２の活性よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、更に好ましくは少なくとも１０倍大きいＬ−ＭＭＰＡＰＡに対するＬ−ＰＡＰＡのメチル化１の活性を示す。そのような変異体は、ＰＩＢの生成に特に有利である。好ましくは、本発明に係る変異体は、野生型PapＭポリペプチドの配列のGly 249残基
(ａ)、Thr 192残基 (ｂ)、及び相同ポリペプチドにおいて(ａ)又は(ｂ)に相当する残基から選択された一つ又はそれ以上のアミノ酸を置換することによって得られるものである。
【００２２】
本発明の目的のために、「相同PapＭポリペプチド」の表現は、特に、Streptomyces olivaceus、Streptomyces ostreogriseus、Streptomyces mitakaensis、Streptomyces loidensis、Streptomyces graminofaciens、Streptomyces diastaticusのようなストレプトミセス属の細菌又は一つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠損及び／又は挿入により、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１とは異なるアミノ酸配列ではあるが、生物学的作用はPapＭポリペプチドと類似する他の微生物に起源する又は由来するポリペプチドを意味することを意図したものである。そのような相同ポリペプチド配列は、少なくとも配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１の６０％、好ましくは少なくとも７０％、更に好ましくは少なくとも８０％、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１と類似するものである。
【００２３】
他の実施例において、本発明に係る変異体は、ポリペプチ配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１に由来するものであり、そして、少なくとも一つの置換、第２４９位のグリシンのセリンによる置換を示している。
また、他の実施例においては、本発明に係る変異体は、ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１に由来するものであり、そして、少なくとも一つの置換、第１９２位のトレオニンのイソロイシンによる置換を示している。
【００２４】
最後に、他の実施例においては、本発明に係る変異体は、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１に由来するものであり、そして、少なくとも一つの置換、第２４９位のグリシンのセリンによる置換、及び、第１９２位のトレオニンのイソロイシンによる置換を示している。
尚、他の実施例においては、本発明に係るPapＭ変異体は、Ｌ−ＰＡＰＡのＬ−ＭＭＰＡＰＡへのメチル化１の活性よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、更に好ましくは少なくとも１０倍大きいＬ−ＭＭＰＡＰＡのＬ−ＤＭＰＡＰＡへのメチル化２の活性を示す。そのような変異体は、ＰＩＡの生成を増進するために特に有利である。
【００２５】
本発明は、更に、上記に定義したポリペプチドの変異体をコードする核酸に関するものである。好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１に存在するヌクレオチド配列、又はその遺伝子コードの縮重により得られる配列から突然変異により得られる核酸である。有利には、本発明に係る核酸は、少なくとも一つのミスセンス突然変異を第１９３から１９６位に位置しているＮＰＰＹモチーフの上流領域に含み、そして好ましくは、このミスセンス突然変異が、例えば第６５８位のシトシンをチミンで置換するような（Ｃ６５８Ｔ）（突然変異対立遺伝子６６）非保存型アミノ酸変化を誘導する。他の有利な実施例は、第８２８位のグアニンがアデニンで置換される（Ｇ８２８Ａ）（突然変異対立遺伝子４９）少なくとも一つの置換を含む核酸に関する。最後に、更に有利な他の形態は、第８２８位のグアニンがアデニンで置換される（Ｇ８２８Ａ）少なくとも一つの置換、及び、第６５８位のシトシンがチミンで置換される（Ｃ６５８Ｔ）少なくとも一つの置換を含む核酸（突然変異対立遺伝子４９／６６）に関する。
【００２６】
本発明の課題はまた、上記に定義した核酸を、ストレプトグラミン生成菌株におけるＢ構成成分異性体の比率を変動するために使用することである。ストレプトグラミン生成菌株は、本発明に関連して用いることができ、特に、ストレプトミセス オリバセウス(Streptomyces olivaceus)、ストレプトミセス オストレオグリセウス(Streptomyces ostreogriseus)、ストレプトミセス ミタカエンシス(Streptomyces mitakaensis)、ストレプトミセス ロイデンシス(Streptomyces loidensis)、ストレプトミセス グラミノファシエンス(Streptomyces graminofaciens)、ストレプトミセス デイアスタチカス(Streptomyces diastaticus)等のような菌株について言及することができる。ＭＭＰＡＰＡのＤＭＰＡＰＡへのメチル化２の活性よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、更に好ましくは少なくとも１０倍以上であるＰＡＰＡのＭＭＰＡＰＡへのメチル化１の活性を示すPapＭ変異体をコードする核酸は、特に、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の菌株中で発現した場合には、ＰＩＢの生成にとって更に有用である。ＰＡＰＡのＭＭＰＡＰＡへのメチル化１の活性よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、更に好ましくは少なくとも１０倍以上であるＭＭＰＡＰＡのＤＭＰＡＰＡへのメチル化２の活性を示すPapＭ変異体をコードする核酸は、特に、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の菌株において発現した場合には、ＰＩＡの生成にとって更に有
用である。
【００２７】
本発明の課題はまた、上記に定義した核酸を含む如何なる組換えＤＮＡに関するものである。
本発明はまた、特に、図１１において示されるベクターｐＶＲＣ１３０６の全部又は部分を含むベクターのような、上記に定義した核酸又は組換えＤＮＡを含んでいる、自律的に複製する及び／又は組み込む、如何なる発現ベクターに関するものでもある。
【００２８】
本発明の課題はまた、上記に定義した核酸及び／又は組換えＤＮＡ、及び／又は発現ベクターを含む宿主細胞に関するものである。本発明に係る宿主細胞は、真核細胞及び原核細胞の双方である。真核細胞中で適当なものとしては、動物細胞、酵母又は真菌を挙げることができる。特に、酵母では、サッカロミセス属（Saccharomyces）、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ピシア属(Pichia)、シュワンニオミセス属(Schwanniomyces)、ハンセヌラ属(Hansenula) を挙げることができる。動物細胞では、ＣＯＳ，ＣＨＯ及びＣ１２７細胞、アフリカツメガエル卵（Xenopus eggs）等である。真菌では、特に、ミクロモノスポラ種(Micromonospora spp.)、アスペルギルス種(Aspergillus spp.)、又はトリコデルマ種(Trichoderma spp.) を挙げることができる。原核細胞としては、好ましくは、以下のような細菌が用いられる：放線菌(Actinomycetes)、そして特に好ましくは、ストレプトミセス属（Streptomyces）、大腸菌（E.coli）(実施例７)、バチルス(Bacillus)。好ましくは、本願発明に係る組換え細胞は、ストレプトグラミン生成細胞、特に好ましくは、ストレプトミセス オリバセウス(Streptomyces olivaceus)、ストレプトミセス オストレオグリセウス(Streptomyces ostreogriseus)、ストレプトミセス ミタカエンシス(Streptomyces mitakaensis)、ストレプトミセス ロイデンシス(Streptomyces loidensis)、ストレプトミセス グラミノファシエンス(Streptomyces graminofaciens)、及びストレプトミセス デイアスタチカス(Streptomyces diastaticus)から選択される。本発明に係る組換え細胞は、外来ヌクレオチド配列を細胞中へ取り込ませる如何なる方法によってでも得ることができる。特に、形質転換、電気穿孔、接合、プロトプラスト融合、又は当業者に既知の如何なる他の技術であってもよい。
【００２９】
本発明の課題はまた、上記に定義した宿主細胞が培養され、そして生成したポリペプチドが回収される、本発明に係るPapＭポリペプチド変異体を生成する方法に関するものである。
本発明はまた、上記に定義され、そして本発明に係るPapＭポリペプチド変異体を発現する宿主細胞を、生物変換反応において使用することに関するものでもある。特に、これらの細胞は、芳香族アミンをモノメチル化アミンに変換することを可能とし、特に、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンを４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンに変換する。これらの生物変換は、当該細胞の全細胞又は無細胞抽出物を用いて行なうことができる。
【００３０】
本発明の他の課題は、ストレプトグラミンのＢ構成成分を生成する方法に関するもので、以下の工程を含むものである：
― papＭ遺伝子が、ストレプトグラミンを生成する又は潜在的にストレプトグラミンを生成する菌株において不活性化され、そして、上記に定義されたpapＭ変異体をコードする核酸の一つ又はそれ以上のコピーが誘導され、
― 当該菌株を、ストレプトグラミンを生成する条件下で培養し、そして、
― 生成したストレプトグラミンのＢ構成成分を回収すること。
好ましくは、ストレプトグラミンを生成する菌株は、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）に由来するプリスチナマイシン生成菌株であり、更に好ましくは、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ９２菌株、又はＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＡＴＣＣ２５４８６菌株に由来するものである
。また、次の菌株からも選択することができる：ストレプトミセス オリバセウス(Streptomyces olivaceus)ＡＴＣＣ１２０１９、ストレプトミセス オストレオグリセウス(Streptomyces ostreogriseus)ＡＴＣＣ２７４５５、ストレプトミセス ミタカエンシス(Streptomyces mitakaensis)ＡＴＣＣ１５２９７、ストレプトミセス ロイデンシス(Streptomyces loidensis)ＡＴＣＣ１１４１５、ストレプトミセス グラミノファシエンス(Streptomyces graminofaciens)、及びストレプトミセス デイアスタチカス(Streptomyces diastaticus)。
【００３１】
有利には、ストレプトグラミン生成菌株は、ストレプトグラミンのＡ構成成分を微量又は測定不可能な量しか生成しない菌株である。ストレプトグラミンのＡ構成成分を生成しない菌株としては、特に、特許出願ＷＯ９３／２０１８２に記載されているＳ．オステオグリセウス(S. osteogriseus)Pr4Q031/CBS142.93菌株を指摘することができる。ストレプトグラミンのＡ構成成分を生成しないＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）菌株の例としては、化学的突然変異によるＳＰ９２由来のＳＰ２１３菌株（Blanc et al., 1994）、又は、特許出願ＷＯ９３／２０１８２に記載されているＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）Pr4R31(寄託番号CBS182.92)菌株を指摘することができる。菌株ＳＰ２１３及びPr4R31は、プリスチナマイシンＰＩを特異的に生成するが、プリスチナマイシンＰII（Ａ構成成分）は、もはや測定不可能な量しか生成しない。
【００３２】
好ましい変異体において、本発明に係るPapＭ変異体をコードする核酸の導入は、papＭ遺伝子の野生型の置換によって行われる。導入された核酸により発現した変異体に依存して、ストレプトグラミンの種々のＢ構成成分の生成を促進することが可能となる。このようにして、ＫcatPAPA・ＫmMMPAPA／ＫcatMMPAPA・ＫmPAPA比率が、野生型のポリペプチドに比較して増大している変異体を発現するＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）菌株がＰＩＢの好ましい生成を誘導する。これとは逆に、この比率が減少している変異体は、ＰＩＡの生成を増大することができる。好ましくは、ＰＩＢの生成のために、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）菌株は、少なくとも突然変異（Ｇ８２８Ａ）若しくは突然変異（Ｃ６５８Ｔ）又は二重突然変異（Ｃ８２８Ａ）（Ｃ６５８Ｔ）を示すpapＭ遺伝子を含む。
【００３３】
本発明はまた、ＰＩＮＨ２を生成する方法に関するものであり、そこにおいては、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）のpapＭ遺伝子の野生型を不活性化した、及び／又は不活性型PapＭポリペプチドをコードする核酸により置換した菌株が使用されている。
【００３４】
本発明の他の課題は、本発明に係るPapＭポリペプチドの変異体をコードする核酸を含んでいる、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の突然変異菌株に関するものである。そのような菌株は、特に、野生型papＭ遺伝子を破壊して、カセットΩ−Ｋｍ（実施例８参照）がpapＭの突然変異した対立遺伝子の一つと交換できるようにする自殺プラスミドを用いて、該カセットΩ−Ｋｍで置換されている組換え菌株を形質転換することによって得ることができる。説明のために、本発明は、突然変異Ｃ６５８Ｔ（突然変異対立遺伝子６６）を有する核酸を含んでいる、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ２１７菌株、又は二重突然変異Ｃ６５８Ｔ及びＧ８２８Ａ（突然変異対立遺伝子４９／６６）を含んでいる、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ２１８菌株について記載している。これらの突然変異は、前もってpapＭ遺伝子を破壊して、カセットΩ−Ｋｍで置換してある、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ２１３菌株に導入した。同様なアプローチで、突然変異対立遺伝子６６を菌株ＳＰ９２に導入して、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ１０１菌株を構築することもできる。本発明に係るpapＭ変異体を合成する、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ１０１、ＳＰ２１８及びＳＰ２１７菌株は、主としてＰＩＢを生成する。
【００３５】
本発明の課題はまた、ＰＩＮＨ２を生成するための菌株Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の使用に関するものである。そのような菌株は、特に、papＭ遺伝子を不活性化した後の菌株ＳＰ２１３から誘導され、そして主としてＰＩＮＨ２を生成する菌株ＳＰ２１６によって説明する。
【００３６】
本発明はまた、PapＭポリペプチドの変異体、又は相同遺伝子によってコードされるポリペプチドの変異体を選択するための以下の方法に関するものである。
(a) 化学的突然変異誘導の工程は、プラスミドにクローンしたpapＭ遺伝子又は相同遺伝子に対して行ない、
(b) ライブラリーは、工程(a)で行われた突然変異誘導を受けたプラスミドを受容菌株に形質転換することにより調製し、
(c) 初期速度条件下の、時間単位当たり変換されるメチル化基質の量の比率「ｒ」が、ｒ＝基質１／（基質１＋基質２）で表され、これが野生型ポリペプチドに比較して少なくとも２０％増大し、そして好ましくは０.６より大きいか又はそれに等しくあるようなメチル化活性を示すクローンを選択する。
【００３７】
この点に関して、本発明は、プラスミドにクローンしたpapＭ遺伝子に、試験管内（in vitro）において、いかにしてヒドロキシルアミンを用いて化学的突然変異を誘導し、そしてその結果、突然変異体のライブラリーを構築し、そしてこのライブラリーから、微小酵素的スクリーニングにより、対応する蛋白質が上記に記載した触媒特性を有するような突然変異papＭ遺伝子を発現し、かつ、上記に定義した比率「ｒ」が、０.６より大きいか又はそれに等しい大腸菌（E.coli) クローンを選択するかを明らかにしている。
本発明は、以下の実施例を用いて説明しているが、これらの実施例は、非限定的な説明として考慮されるべきである。
【実施例】
【００３８】
〔実施例１〕酵素スクリーニングのための方法論及びプロトコール
本実施例は、ヒドロキシルアミンによる突然変異処理により得られた酵素集団（実施例２及び３参照）を用いた、新規な動力学的特性を示すPapＭ酵素の突然変異型のスクリーニングを説明している。特に、本実施例は、当該酵素の二種類の天然基質に対して改変された選択性を有するPapＭ変異型の生成を説明している。
【００３９】
１.１. 方法論
papＭメチラーゼは、以前に既にクローン化され、精製され、そして特性決定がされている（Blanc et al., 1994; Blanc et al., 1997）。PapＭは、Ｌ−ＰＡＰＡのＮ−メチル化によるＬ−ＭＭＰＡＰＡへの変換、及びＬ−ＭＭＰＡＰＡのＮ−メチル化によるＬ−ＤＭＰＡＰＡへの変換の双方を触媒する二機能性酵素である（図４参照）。
Ｌ−ＰＡＰＡ及びＬ−ＭＭＰＡＰＡは、PapＭの二種類の競合的基質であり、それぞれミカエリス定数（Km）２４０及び５３０μMを有し、そして、PapＭの最大速度（Vmax）は、時間当たり及びPapＭのmg当たり、それぞれ５５及び７１μmolである（Blanc et al., 1997）。
【００４０】
Ｌ−ＰＡＰＡ及びＬ−ＭＭＰＡＰＡのメチル化のそれぞれの速度V1及びV2の比率は、PapＭの動力学的パラメター（Ｌ−ＰＡＰＡのKm１及びVmax１、Ｌ−ＭＭＰＡＰＡのKm２及びVmax２）に依存し、かつ、Ｌ−ＰＡＰＡ及びＬ−ＭＭＰＡＰＡのそれぞれの濃度S1及びS2にも依存し、以下の式に従う。
Ｖ１／Ｖ２=（Ｖmax／Ｋｍ１）[Ｓ１]／（Ｖmax２／Ｋｍ２）[Ｓ２]
固定濃度S1及びS2における二種類のメチル化速度V1及びV2の同時測定により、Ｌ−ＰＡ
ＰＡ及びＬ−ＭＭＰＡＰＡについてのPapＭの反応動力学定数の比率を求めることができ
る。この比率は、当該検定に使用するPapＭの量には依存しない。突然変異PapＭ酵素の選択性がＬ−ＰＡＰＡに対して増大すれば、V1／V2比率は増大し、これとは逆に、突然変異PapＭ酵素が好適にＬ−ＭＭＰＡＰＡをメチル化するときは、この比率は減少する。
最後に、Kmにおける微小な変異を除き、逆にKmにおける大きな変異、又はVmax値における改変を促進するために、Ｌ−ＰＡＰＡ及びＬ−ＭＭＰＡＰＡの濃度は、飽和条件を維持するため、Kmの約６倍に固定される。そのような条件下では、野生型PapＭ酵素を用いた場合、メチル化１の速度及びメチル化２の速度は、実質的には同一である。
PapＭの二種類のメチル化活性の同時測定は、実施例7.1.に記載されている。このPapＭのメチラーゼ活性の測定は、Ｌ−ＰＡＰＡ１.５ｍＭ、Ｌ−ＭＭＰＡＰＡ３ｍＭ、及びSAM７０μｌの存在下で行なった。
【００４１】
１.２. 突然変異PapＭ酵素集団のスクリーニング
実施例３の記載のようにして調製した、突然変異PapＭ酵素を生成する大腸菌（E.coli)
クローンのライブラリーの９６穴プレートを２３℃で解凍した。次に、混合物Ａの２５μｌを、各穴のＬＢ培地中の培養２００μｌに添加した。混合物Ａは、（１）二塩化水素化物型のＬ−ＰＡＰＡの１２mg及び（ＤＬ）−ＭＭＰＡＰＡの７１mgを溶解し、ＷＯ９６／０１９０１−Ａ１の記載のようにして調製した、５０ｍＭのBis-Tris-プロパン緩衝液、ｐＨ１０を３ml、（２）４ｍＭのＳＡＭ水溶液を０.７ｍｌ、（３）２５μＣｉ／ml及び６０ｍＣｉ／mmolの [14Ｃ−Ｍe ]−ＳＡＭを０.７ml（ＡＭＥＲＳＨＡＭ製）、（４）１００ｍＭのBis-Tris-プロパン緩衝液、ｐＨ６.８を０.６ml、及び（５）ＥＤＴＡの二ナトリウム塩５６mgを連続的に加えて得ることができる。添加量は、混合物Ａの５ml量の調製に必要な量として表示している。プレートを接着フィルムで密閉し、その後２７℃で２時間インキュベートした。反応は、終止溶液を４０μｌ添加して終止させた。終止溶液（４ml量当たり）は、２４mg／mlのヘプタン硫酸ナトリウム水溶液２.２ml及び濃塩酸１.８mlを混合して得ることができる。プレートを３０００ｇで５分間遠心分離した後、各穴の上清画分の約１００μｌを実施例7.1.に記載した系でＨＰＬＣにより分析した。
各穴について、放射化学検出記録から得られるＭＭＰＡＰＡ及びＤＭＰＡＰＡピークのそれぞれのＡ１及びＡ２領域を積分した。そして比率ｒを次式により計算した。
ｒ＝Ａ１／（Ａ１＋Ａ２）
野生型PapＭメチラーゼの場合、ｒ＝０.５０±０.０５。
メチル化２よりもメチル化１に対して有意に活性の高い突然変異PapＭ酵素に対して定めた比率ｒの閾値は、凡そ０.６０であった。
【００４２】
〔実施例２〕ヒドロキシルアミンを用いたpapＭ遺伝子の突然変異誘導
本実施例２は、大腸菌（E.coli)中で複製することができるプラスミドにクローンされたストレプトミセス属（Streptomyces）のプラスミドＤＮＡを用いる、papＭ遺伝子の突然変異誘導について説明している。
２.１. 突然変異誘導試薬の選択
化学的突然変異誘導は、シトシン残基に特異的に結合して、その結果アデニン残基と対になることができるＮ４−ヒドロキシシトシンを形成するヒドロキシルアミン（ＮＨ2ＯＨ）を用いて行なった。ヒドロキシルアミンは、それ故、Ｇ：Ｃ＞Ａ：Ｔ変換をもたらす。この突然変異誘導試薬の選択は、特に、７０から７５％のＧＣ残基を含んでいるストレプトミセス属（Streptomyces）のＤＮＡのような、ＧＣ−豊富なＤＮＡの突然変異の誘発に有利である。
【００４３】
２.２. 突然変異誘導を起こさせるプラスミドの選択
突然変異誘導は、二種類の異なるプラスミド、プラスミドｐＶＲＣ７０６及びプラスミドｐＵＣ４Ｋ上で同時に行なった。
プラスミドｐＶＲＣ７０６（図５）は、ｐＭＴＬ２３（Chambers et al.,1988) の誘導
体であり、ｐＭＴＬ２３中に、当該突然変異誘導が行なわれたpapＭ遺伝子を運搬するプ
ラスミドｐＶＲＣ４０９に由来する１.７ｋｂのＭluＩ−ＳtuＩフラグメント（Blanc et al., 1994; Blanc et al., 1997）が、唯一のＭluＩ及びＢamＨＩ部位間にクローン化されている（ＢamＨＩで切断した末端は、Sambrook et al., (1989) のプロトコールの通り、クレノウ酵素の作用により平滑末端化されている）。ＳtuＩ末端のｐＭＴＬ２３のＢamＨＩ部位へのクローニングは、クレノウ酵素を用いて補充されて、次のクローニングに再利用できるＢamＨＩ部位を再構築することを可能とする。ＭluＩ部位におけるクローニングは、プラスミドｐＭＴＬ２３のlacZ遺伝子によりコードされるβ−ガラクトシダーゼの最初の３２アミノ酸とpapＭ遺伝子の上流に位置するpapＢ遺伝子の最後の１１アミノ酸との間のインフェーズ融合を得ることを可能とする。このことにより、当該ヌクレオチド配列を考慮してこれら二つの遺伝子間に存在すると思われる翻訳カップリングが保存される（Blanc et al., 1994）。この構築において、papＭ遺伝子の発現は、ＩＰＴＧの１ｍＭの添加により誘導されるlacZ遺伝子のＰlacプロモーターにより調節される。そのような発現システムは、大腸菌（E.coli)において、総蛋白質の約０.５％に相当する活性型可溶性蛋白質形態のPapＭメチラーゼの生成を可能とする（Blanc et al., 1994）。
プラスミドｐＵＣ４Ｋ（図６）は、アンピシリン及びカナマイシンに対する耐性を付与する二つの遺伝子を運ぶベクターｐＵＣ４の誘導体である（Vieira and Messing, 1982）。このプラスミドは、次の理由により突然変異誘導対照として選択した：（１）大きさ（３.９ｋｂ）が、プラスミドｐＶＲＣ７０６（４.４ｋｂ）に近く、（２）二つのプラスミドｐＵＣ４ＫとｐＶＲＣ７０６は、共にベクターｐＵＣシリーズに由来しているため、極めてよく似た構造及び特性を有していて、（３）ｐＵＣ４Ｋにより運搬される二つの耐性遺伝子、ampP及びkanRの存在により、これらの遺伝子の一つにおける突然変異誘導が起こったクローンの百分率を、選択した抗生物質に感受性なクローンを計測することにより、容易に計算することができる。
【００４４】
２.３. 突然変異誘導プロトコール
ヒドロキシルアミンを用いた二つの突然変異誘導を、Humprey et al.,(1976) のプロトコールにより、インキュベーション温度を変えて（８０℃及び８５℃）行なった。塩化セシウム勾配で精製したプラスミドＤＮＡ５ｍｇを、０.０５Ｍの燐酸ナトリウム及び０.５ｍＭのＥＤＴＡを含んでいる緩衝液中で、最終容量１００ｍｌ中の０.４Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ６）と、３５分間、所定の温度（８０℃及び８５℃）で接触させた。突然変異誘導反応は、０.１Ｍの燐酸ナトリウム及び１ｍＭのＥＤＴＡを含んでいる緩衝液１００ｍｌを添加して終止させ、そして、ヒドロキシルアミンは、２リットルのＴＥＳ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７.５、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１００ｍＭのＮａＣｌ）を用い、８回連続の透析により除去した。このように処理したＤＮＡを、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ８）及び２.５容量の９５％エタノールを添加して沈殿させた。ＤＮＡペレットをリンスし、乾燥し、そして１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、及び１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７.５）に移した。それぞれのプラスミドについて、ヒドロキシルアミンの不存在下で調べた温度において、突然変異誘導反応の対照実験を行った。
【００４５】
２.４. 突然変異誘導処理をしたプラスミドを受容する大腸菌（E.coli)菌株の調製
大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株（supE44 DlacU169 (f80 lacZDM15) hsdR17 recA1 endA1
gyrA96 thi-1 relA1）、(Hanahan, 1990)を、上記のプロトコールに基づいて突然変異誘導処理をしたプラスミドｐＶＲＣ７０６及びｐＵＣＫ４を用いた形質転換後における突然変異誘導を評価するために使用した。
電気穿孔による形質転換の受容能を有する大腸菌（E.coli)ＤＨ５αの細胞は、次のプロトコールに基づいて調製した：ＬＢ培地中の１リットル培養を３７℃で、O.D.(600nm)値が０.５から０.８に達するまで行なった。その後、成長を停止させるために細胞を氷中に３０分間置いた後、４０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。細胞ペレットを１リッ
トルの冷却した滅菌水、０.５リットルの冷水、及び１０％グリセロールを含んでいる冷
却溶液２０ｍｌで連続してリンスした。各リンスのたびに、細胞は４０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。最後に、細胞ペレットを１０％濃度のグリセロール２ｍｌに溶解した。このようにして調製した細胞を、直ちに電気穿孔に用いるか、又はその後の使用に用いるため、４０ｍｌごとに小分けして、−８０℃で冷凍保存した。エレクトロコンピテント細胞の形質転換効率は、ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡのμｇ当たり、１０9個のコロニー数の程度であった。
【００４６】
このようにして調製した大腸菌（E.coli)ＤＨ５α細胞は、試験用プラスミドの５ｎｇ量に相当する量で電気穿孔に用いた。このためには、エレクトロコンピテント細胞の４０μｌを、プラスミドＤＮＡの５ｎｇを含んでいる溶液１〜２μｌと、４℃で１分間接触させた。電気穿孔機(Bio-Rad)を２５ｍＦパルス、２５００Ｖにセットした。パルス制御器の抵抗は、２００Ωにセットした。細胞／ＤＮＡ混合物を、０.２ｃｍ幅の電気穿孔キュベトに入れてから、電気パルスを掛けた。パルス時間は通常通り４.５から５ｍｓであった。パルスの後に１ｍｌのＳＯＣ培地（バクトアガー２％、１０ｍＭのＮａＣｌ、２.５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、２０ｍＭのグルコース）を直ちに細胞に添加し、そして混合物全体を５ｍｌのポリプロピレン管に移し、３７℃で１時間インキュベートした。この操作により細胞は回復し、そして細胞中に透過したプラスミドに存在している耐性遺伝子の発現を開始することができる。このインキュベーションの最後に、細胞培養を適当に希釈し（希釈係数は、通常の１０-1から１０-4）、そして形質転換したコロニーを選択用抗生物質（アンピシリンの５０μｇ／ｍｌ又はカナマイシンの５０μｇ／ｍｌ）を含んでいるＬＢ固体培地上で選択した。
【００４７】
２.５. 突然変異誘導の評価及び選択温度条件の決定
試験した二種の突然変異誘導の温度条件は、次の二種の基準に従って評価した。第一に、突然変異誘導を行なったプラスミドの大腸菌（E.coli)菌株への形質転換能力、第二に、突然変異誘導を行なったｐＵＣ４Ｋプラスミドで形質転換した大腸菌（E.coli)で、プラスミドによりコードされる二種の耐性のうち一種を失ったクローンの百分率。
二種類のプラスミドｐＶＲＣ７０６及びｐＵＣＫ４について、ヒドロキシルアミンを用いた突然変異誘導を行なったプラスミドの大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株への形質転換能力を測定した。この能力を、ヒドロキシルアミンの不存在下で、培養温度について対照として調製した、突然変異誘導を行なっていないプラスミドの能力と比較した。ヒドロキシルアミンの作用は、特にプラスミドにおいて、更に特には、組換えクローンの選択を可能とする耐性遺伝子において、また複製起点を保持している領域においても、致死突然変異を引き起こした。それ故、突然変異誘導処理が効率的であればあるほど、プラスミドの形質転換能力の損失は大きくなると考えることができる。突然変異誘導処理をした二種のプラスミドの形質転換能力を、突然変異誘導処理をしなかった対照プラスミドの形質転換能力に対する百分率（％）で示したものを、下記の表に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
統計的に１０倍あったプラスミドが変化して、大腸菌（E.coli)ＤＨ５αのエレクトロコンピテント細胞を形質転換し、複製し、そして得られたクローンにアンピシリン耐性を付与することが可能であるプラスミドはわずか１.５％を残すのみであったことから、これらの結果は、８５℃における突然変異誘導が二種のプラスミドｐＶＲＣ７０６及びｐＵＣ４Ｋにとって明らかにより有効であることを明確に示している。更に、ｐＵＣ４Ｋについて得られた結果は、（AmpiR）又は(KanaR)のいずれを選択しようとも極めて均一であり、このことより、これら二種の耐性を発現するのに必須の領域において、ヒドロキシルアミンの作用は均一に起こることが示された。
評価のための第二の基準は、突然変異誘導処理をしたプラスミドｐＵＣ４Ｋにおいて、アンピシリン耐性（AmpiR）のクローン中のカナマイシン感受性(KanaS)のクローン、又はその逆の場合の百分率（％）を計算することである。これらの百分率は、当該耐性遺伝子(ampＲ又はkanＲ)においてヒドロキシルアミンの作用によって生じ、そして完全な阻害（転写又は翻訳の阻止）により、又は不完全な及び／もしくは不活性な蛋白質の合成を引き起こすことにより、発現を妨げる突然変異の頻度を反映する。
これらの百分率を推測するため、突然変異誘導処理をした又は処理をしていないプラスミドｐＵＣ４Ｋで、大腸菌（E.coli)ＤＨ５αのエレクトロコンピテント細胞を形質転換して得られるクローンから選択された２００個の(KanaR)又は（AmpiR）クローンを、それぞれアンピシリン又はカナマイシンを含んでいる固形ＬＢ培地上で培養した。二種の抗生物質の一つに対して感受性なクローンを、培養２４時間後に計測した。ヒドロキシルアミンにより突然変異誘導処理をした又は処理をしていないプラスミドｐＵＣ４Ｋで形質転換したクローン中の、アンピシリン又はカナマイシン感受性なクローンの百分率は、下記の表の通りである。
【００５０】
【表２】
【００５１】
これらの結果から、ヒドロキシルアミン処理したもののみが、ｐＵＣ４Ｋの二種の耐性遺伝子のうち一つの発現に影響を与える突然変異を明らかに引き起こすと結論付けることができる。更に、８５℃で行なった突然変異誘導は、８０℃で行なった突然変異誘導に比べて、プラスミドｐＵＣ４Ｋの二種の耐性遺伝子にとって、３〜４倍も効果的であったと結論付けることができる。最後に、これらの試料からヒドロキシルアミンの作用は、二種の耐性遺伝子ampR及びKanRにとって比較的均一であったことも明らかとなった。
それ故、ヒドロキシルアミンの作用は、二種のプラスミドｐＵＣ４Ｋ及びｐＶＲＣ７０６の全てにおいて働くこと、及び、８５℃で行なった突然変異誘導は、プラスミドｐＶＲＣ７０６によって運ばれるpapM遺伝子におそらく最も影響を与えたことが推測できる。この突然変異誘導条件の比較から、８５℃で行われるヒドロキシルアミンによる突然変異誘導に由来するプラスミドｐＶＲＣ７０６を用いて、大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株のエレクトロコンピテント細胞の形質転換により得られるクローンのみを、当該研究のその他において選択すればよいことが分かった。
【００５２】
〔実施例３〕プラスミドｐＶＲＣ７０６を保持している大腸菌（E.coli)ＤＨ５αのライ
ブラリーの構築と開発
本実施例は、８５℃で行なったヒドロキシルアミンによる化学的突然変異誘導を受けたプラスミドを保持している大腸菌（E.coli)ＤＨ５αの６０００個のクローンのライブラリーの構築と開発について説明するものである。
上記のpapM遺伝子を運ぶプラスミドｐＶＲＣ７０６に対して８５℃で行なったヒドロキシルアミンによる化学的突然変異誘導の場合は、ヒドロキシルアミンの作用が全プラスミドｐＶＲＣ７０６に全体的に及ぶ（実施例２参照）という仮説を推し進めることによって、これらのプラスミドを保持している６０００個の大腸菌（E.coli)クローンのライブラリーは、何％かのクローンが突然変異papM遺伝子を発現している突然変異ライブラリーを表わしているということができる。相当するPapＭ蛋白質によって触媒される二種のメチル化活性を同時に測定することによる当該ライブラリーの６０００個のクローン分析はこの仮説を確認している（実施例４参照）。
【００５３】
本ライブラリーを構築するため、大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株のエレクトロコンピテント細胞への形質転換の後、アンピシリン５０ｍｇ／ｍｌを含んでいるＬＢ培地の試験皿上で選択した６０００個のクローンを、それぞれアンピシリン１００μｇ／ｍｌを補足したホグネス培地及び保存培地（Sambrook et al., 1989）２００ｍｌを含んでいる９６穴の微量滴定プレートの穴中で培養した。このように構成した保存用プレートを、１６０ｒｐｍの低速撹拌で、３７℃で２４時間インキュベートした結果、クローンは増幅し、そして定常増殖期に達した細菌の飽和懸濁液を形成した。その後、保存用プレートの各穴の培地の一定量を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及び１ｍＭのＩＰＴＧを補足したＬＢ培地２００ｍｌを含んでいる２個の９６穴プレートの各穴にそれぞれ再播種して、保存用プレートを二連に複製した。こうして得たプレートは検定用プレートと呼ぶが、２４時間（３７℃、１６０ｒｐｍ）培養した結果、クローンは増幅し、そして定常増殖期に達した細菌の飽和懸濁液を形成した。細菌細胞中のプラスミドｐＶＲＣ７０６の存在は、アンピシリンを用いて選択し、これらのプラスミドにより運搬されるpapＭメチラーゼ遺伝子の発現は培養開始時点にＩＰＴＧを添加して誘導した。これらのプレートは、その後、細菌粗懸濁液を用いたメチル化活性の測定前に−８０℃で凍結した（実施例１参照）。
一旦二連に複製した保存用プレートは、−８０℃に保存し、そして分析のための６０００クローンの長期用保存とした。
【００５４】
〔実施例４〕突然変異誘導処理をしたプラスミドｐＶＲＣ７０６を保持する大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株のライブラリーのスクリーニング結果
本実施例は、有利な特性を有する酵素をコードする突然変異遺伝子を保持するクローンを選択するための小規模の活性検定法を用いる、６０００クローンのライブラリーの迅速分析について説明する。
４.１. ６０００クローンの簡略なスクリーニング結果
実施例１に記載したようにして行った第一スクリーニングの終点において、実施例３で調製したライブラリーの６０００クローンについて、以下のものを選択した。
−メチル化活性がゼロ又は測定不可能な４４１個のクローン、即ち、レベル７.３％；
−第二反応に比較して第一メチル化反応が優先されている９個のクローン、即ち、比率ｒ（実施例1.2で定義）が０.６より大きいクローン。それ故、このような突然変異の発生頻度は極めて低く、０.１５％であった。
これらの第一結果は、以下に記載のように実証した。
【００５５】
４.２. 選択したクローンの確認方法
第一スクリーニングによって選択した全クローンのメチル化活性は、実施例３で調製した複製プレートを用いて、また第一検定結果を確認するため、同一のプロトコールに従って体系的に再検定した。大多数のクローンについては、検定結果の確認ができたものと思われる。
このようにして、以下のことが確認された。
−メチル化活性が零を示す、３６０個のクローン、即ち、レベル６％。
−第二反応に比較して第一メチル化反応が優先されている８個のクローン、即ち、比率ｒ（実施例１.２で定義）が０.６より大きいクローン。それ故、そのような突然変異の発生頻度は極めて低く、０.１３％であった。
酵素活性の比率が、ｒ＞０.６０である８個のクローンについて、他の２つの確認工程を行なった。
（１）これらクローンのプラスミドＤＮＡを標準的技術（Sambrook et al., 1989）を用いて単離し、そして、大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株の新しいエレクトロコンピテント細
胞中へ再導入した。この工程により、８個のクローンについて観察されたメチル化活性比率ｒの変化は、クローンの染色体状況に関連するのではなく、選択したクローンに起源するプラスミドにのみ依存することが確認された。
（２）次の確認工程は、選択したクローンに存在するpapM遺伝子を、新しい発現ベクターｐＭＴＬ２３中へ再クローニングすることである。このため、papM遺伝子を運搬する１.７ｋｂのMluI-BamHI フラグメントを、選択したクローンから抽出したプラスミドＤＮＡから単離し、ｐＭＴＬ２３の唯一のMluI 及び BamHI部位間に再クローニングする。これらのクローニングに必要な工程（プラスミドＤＮＡの単離、プラスミドＤＮＡの制限酵素による消化、酵素消化物のアガロースゲル電気泳動による泳動と分析、電気泳動後のＤＮＡフラグメントの調製、連結反応）は、Sambrook et al.(1989)により記載された標準的プロトコールに従って行なうことができる。
【００５６】
得られたプラスミドは、ｐＶＲＣ７０６（図５）とよく似た構造をしており、papM遺伝子の８個の突然変異対立遺伝子の一つを保持している点が相異していた。これらはｐＶＲＣ７１０〜ｐＶＲＣ７１７と呼ばれ、それぞれの番号は８個の突然変異対立遺伝子の一つに由来するが、これを大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株の新しいエレクトロコンピテント細胞中へ再導入した。得られたクローンのメチル化活性は、上記のようにして、再検定した。この工程により、これらのクローンについて観察されたメチル化活性比率ｒの変化は、papM遺伝子の外側のｐＶＲＣ７０６領域で生じる一つ（又はそれ以上）の突然変異に関連するのではなく、papM遺伝子に位置している一つ（又はそれ以上）の突然変異にのみ関連することを確認することができた。
これら全ての確認工程により、前もって選択した８個の突然変異のうち、７個の表現型を確認することが可能となった。例えば、実施例１.２で記載したように計算した二種のメチル化活性の比率は、突然変異４９（クローン４９Ｃ９）では０.６３、そして突然変異６６（クローン６６Ａ９）では０.６７であったが、一方、同様の実験において、野生型papM遺伝子を発現するクローンでは、わずかに０.４０であることが観察された。
【００５７】
〔実施例５〕プラスミドｐＶＲＣ７０６に８５℃でヒドロキシルアミンを処理した突然変異誘導に由来する突然変異papM遺伝子の遺伝的特性
本実施例は、化学的突然変異誘導を受けた遺伝子の遺伝的特性について説明している。遺伝的特性の決定は、それらの配列を野生型遺伝子と比較するために、及び観察された表現型の原因となる突然変異を実証するために、突然変異した遺伝子をクローン化し、そして配列決定することにより行なうことができる。本遺伝的特性の決定は、観察されるアミノ酸変化を、これらの酵素について見られる触媒特性の変化と関連付けるため、突然変異した遺伝子によりコードされる蛋白質の生化学的特性の決定と並行して行なわれる（実施例７参照）。
【００５８】
５.１. 方法
プラスミドｐＶＲＣ７０６に８５℃でヒドロキシルアミンを処理した突然変異誘導に由来する突然変異papM遺伝子の場合、７個の選択クローンのpapM遺伝子をサブクローン化し、そして配列決定をした。突然変異誘導を受けたプラスミドｐＶＲＣ７０６の１.７ｋｂのMluI-BamHI 領域部分は、突然変異papM遺伝子を保持しているが、これをサンガー法（Sambrook et al.,１９８９）によるＤＮＡ配列決定に適するＭ１３ファージ（Messing et al., 1981）に由来するベクター中へ、２個のサブインサートとしてサブクローン化した。papM遺伝子の３’部分を含んでいる０.７ｋｂのSmaI-AgeI フラグメントをベクターＭ13mp18のSmaI部位にクローン化し、そして、５’部分を含んでいる０.４ｋｂのSalI-PstI フラグメントをベクターＭ13mp18とベクターＭ13mp19のSalIとPstI部位の間にクローン化した（図５）。これらのサブクローン化に必要な工程は、Sambrook et al., (1989) により記載された標準的プロトコールに従って行なった。これら２個のインサートは、Applied Biosystems 社が販売しているＰＲＩＳＭ ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kitシステムの蛍光ジデオキシヌクレオチドを用いた「サンガー」鎖終結法(“Sanger”chain termination method) により、２重鎖で配列決定した。この配列決定反応は、合成プライマーとして、ユニヴァーサルプライマー（Sambrook et al.,1989)、又は配列決定される当該インサートの２０ヌクレオチド配列に相補的であり、そして自動シンテサイザー Biosearch 8600 (Blanc et al., 1995) により合成されるオリゴヌクレオチドを用いて、一重鎖ＤＮＡ上で、ＰＣＲ機により行なった。これらの反応の生成物は、配列の電気泳動を行ない、それを読み取ることができる自動シークエンサー Applied Biosystems 370A により分析した。その後、配列は、特に配列の連結、蛋白質への翻訳及び野生型配列との比較を可能とするInfobiogen bioinoformatics center のＢＩＳＡＮＣＥサーバーのプログラムを使用して処理した（Dessen et al., 1990）。
【００５９】
５.２. 結果
最初に、次の７個のクローンを一重鎖で配列決定し、そして比率ｒを再測定した（これについての実験において、野生型PapＭ酵素の比率は０.４０に等しいことが分かった）。
【００６０】
突然変異株 比率 突然変異 突然変異（核酸）
45 0.52 Thr274 ＞ Ile ACC ＞ ATC
49 0.63 Gly249 ＞ Ser GGC ＞ AGC
52 0.66 Gly249 ＞ Asp GGC ＞ GAC
66 0.67 Thr192 ＞ Ile ACC ＞ ATC
69 0.51 Met226 ＞ Ile ATG ＞ ATA
74D4 0.63 Gly249 ＞ Ser GGC ＞ AGC
74D5 0.52 Met226 ＞ Ile ATG ＞ ATA
【００６１】
プラスミドｐＶＲＣ７０６に８５℃でヒドロキシルアミンを処理した突然変異誘導に由来する突然変異papM遺伝子によりコードされる蛋白質の配列を、野生型papM遺伝子（Blanc et al., 1994；Blanc et al., 1997）によりコードされる蛋白質の配列と比較した結果は、図７に表示してあり、そして次の表には、７個の選択したクローンのうち２個について、両鎖において確認した配列を表示してある。
【００６２】
【表３】
【００６３】
この表においては、対応する蛋白質におけるアミノ酸変化を引き起こす突然変異のみを表示した。いくつかのクローンでは、特に突然変異株６６と命名したクローン６６Ａ９では、遺伝暗号の縮重によりアミノ酸配列における変化を引き起こさない他のサイレント突然変異が観察された。
選択し、配列決定をした７個のクローンのそれぞれについて、一個のアミノ酸変化を誘導し、そしてヒドロキシルアミン処理後に期待されるＣ＞Ｔ又はＧ＞Ａ変化型に効果的に対応する、papM遺伝子における点突然変異を明らかに示すことが可能である、という点は注目すべきことである。分析した７個のクローンの内、これらの突然変異の幾つかは数回観察されたため、これらの７個のクローンを、影響を受けた部位に従って４つの突然変異クラスに分類した。上記のクローンは、このようにして構築した４つのクラスのうち２つを代表するものである。
【００６４】
当該２つの突然変異、即ち配列SEQ ID No.1を参照して、第一に、６５８位のシトシンのチミンによる置換（C658T）（突然変異対立遺伝子６６）、第二に、８２８位のグアニンのアデニンによる置換（G828A）（突然変異対立遺伝子４９）の効果について、本研究の残りの部分において、更に詳細に研究した。
この遺伝的特性決定と並行して、実施例７に記載した突然変異遺伝子によりコードされる蛋白質の生化学的特性決定を行い、その結果、野生型papM遺伝子によりコードされる蛋白質に比較した場合、これらの酵素の触媒特性における変化が観察された。
このように、観察されたアミノ酸変化は、これらの酵素について見られる触媒特性の変化と関連付けることができる。
【００６５】
突然変異株６６において変化したアミノ酸は、１９３から１９６位に位置しているＮＰＰＹモチーフ直前の１９２位のトレオニンであったことは注目すべき点である（図７）。このモチーフは、全てのＮ−メチラーゼ中に、特にＤＮＡ Ｎ−メチラーゼ（アデニンの６位及びシトシンの４位のメチル化）中に保存されていて、そしてこれら酵素の触媒ドメインの一部であると思われている（Schluckebier et al., 1995）。それ故、極性アミノ
酸であるトレオニン残基の、疎水性であるイソロイシン残基への変換は、対応する蛋白質の触媒特性にとっておそらく重要なことである。突然変異遺伝子６６によりコードされる酵素の触媒特性におけるかなりの変化、更に特定には、第二メチル化反応（実施例７参照）に関する変化に実際注目した。
【００６６】
〔実施例６〕プラスミドｐＶＲＣ７０６に処理した突然変異誘導に由来する突然変異papM遺伝子を用いた、二重突然変異papM遺伝子の遺伝子工学による構築
本実施例は、プラスミドDNAにヒドロキシルアミンを処理した突然変異誘導の後に得られ（実施例２参照）、酵素スクリーニングにより選択され（実施例４参照）、及び配列決定により特性決定された（実施例５参照）単一突然変異を示す遺伝子を用いた、二重突然変異遺伝子の遺伝子工学による構築について説明している。驚くべきことに、この方法により、単一突然変異体中に観察された特性を蓄積している、より有利な突然変異遺伝子を得ることが可能となる。
【００６７】
対になって起こる突然変異の複数の組合せが成立した。その実例として、突然変異４９及び６６の組合せを以下に詳細に説明する。この趣旨で、キメラ遺伝子が、突然変異papM遺伝子６６の５’部分を、突然変異papM遺伝子４９の３’部分に結合することによって生成された。これを行なうため、次のDNAフラグメントを単離した。
−０.６５ｋｂのＭluＩ-ＸhoＩ フラグメントは、突然変異papM遺伝子６６を運搬するプラスミドｐＶＲＣ７１３から単離した（実施例４参照）。このフラグメントは、ＡＴＣコドンを含んでいる対立遺伝子６６の最初の部分を含んでいたが、それは突然変異を受け、そして改変されたメチラーゼ６６の１９２位に見出されたイソロイシンをコードするものである（図７参照）。
−１.０５ｋｂのＸhoＩ-BamHI フラグメントは、突然変異papM遺伝子４９を運搬するプラスミドｐＶＲＣ７１１から単離した（実施例４参照）。このフラグメントは、ＡＧＣコドンを含んでいる対立遺伝子４９の最後の部分を含んでいたが、それは、突然変異を受け、そして改変されたメチラーゼ４９の２４９位に見出されたセリンをコードするものである（図７参照）。
【００６８】
１９２及び２４９位で変異した蛋白質をコードするpapM遺伝子の二重突然変異対立遺伝子を保持しているという点では相違するが、ｐＶＲＣ７０６（図５）とよく似た構造を持つプラスミドを構築するため、これら２つのフラグメントは、Sambrook et al.,（1989）の標準的プロトコールに従って、プラスミドｐMTL２３（Chambers et al., 1988）の唯一のＭluＩ-BamHI部位間に共クローンした。得られたプラスミド（ｐＶＲＣ７１８と命名）は、大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株のエレクトロコンピテント細胞の形質転換、及び１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＰlacプロモーターの誘導後、二重突然変異遺伝子４９／６６を発現した。
二重突然変異対立遺伝子４９／６６は、その後、Ｔ７ファージRNAポリメラーゼにより認識される強力なPT７プロモーターを用いる第二発現ベクターｐET１１ｃ（Novagen）中に移した。これを行なうために、papM遺伝子４９／６６を保持している１.８ｋｂのＢglII-BamHI フラグメントは、プラスミドｐＶＲＣ７１８から単離し、ｐET１１ｃの唯一BamHI部位にクローン化した。挿入方向に対応して、Ｔ７ファージの遺伝子１０とpapＭ遺伝子上流に位置しているpapB遺伝子との間で翻訳融合を生成する、図８に記載してあるｐＶＲＣ７２１と命名した組換えプラスミドを単離した。その後、このプラスミドを、T７ファージRNAポリメラーゼを発現して、そしてそれ故にT７プロモーターから転写したpapM遺伝子４９／６６を発現することができる大腸菌（E.coli)の発現菌株Bl２１（DE３）中へと導入した。
Ｔ７ファージ発現システムを用いた同様の構築により、プラスミドｐＶＲＣ７０６で得られる生成の１０倍以上もの野生型PapＭ蛋白質の過剰生成が観察された（Blanc et al.,
1997）。Ｔ７ファージを用いた当該システムは、同様に、二重突然変異遺伝子４９／６６によりコードされる変異したメチラーゼを、実施例７に記載したように精製して特性決定するために、過剰生成することを可能とする。
【００６９】
〔実施例７〕大腸菌（E.coli)菌株において発現したＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）のpapM遺伝子（野生型又は変異体）の生成物の生化学的特性決定
本実施例は、PapＭ蛋白質（変異体又は野生型）により触媒される反応の反応動力学定数の測定について説明している。PapＭ蛋白質は、２つの反応を触媒する。第一は、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ-ＰＡＰＡ）の４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ-ＭＭＰＡＰＡ）へのメチル化、そして第二は、４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ-ＤＭＰＡＰＡ）へのメチル化である。
【００７０】
７.１. ４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへのメチル化活性、及び、４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへのメチル化活性の検定
本実施例は、プリスチナマイシンＩａの構成成分である４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへの生合成の二種類の最終活性の検定について説明している。その第一は、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへのメチル化（メチル化１）、そしてその第二は、４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへのメチル化（メチル化２）であり、これらの二種類の活性は、SAMをメチル基ドナーとして用いている（図４）。
検定すべき酵素画分（１から２０ユニット）は、メチル基を炭素１４同位体（２Ci／mo
l）で放射線標識したSAM（２００μM）を含んでいる５０ｍMのbis-tris−プロパン緩衝液、ｐH６.８の総容量２００μｌ中、メチル化１の検定には、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（１ｍＭ）、又は、メチル化２の検定には、４−メチルアミノ−Ｌ−アラニン（２.５ｍＭ）の存在下で、２７℃で３０分間インキュベートした。
反応は、３７％塩酸の１６μｌを添加し、その後、ヘプタン硫酸ナトリウム（２４０ｇ／ｌ）の２０μｌを添加して終止させた。遠心分離の後、上清画分の１５０μを、次の勾配様式のHPLCシステム中に注入した。
【００７１】
― 移動相：溶離液Ａ＝ヘプタンスルホネート（１.２ｇ）＋氷酢酸（２.５ｍｌ）＋水（総量を1000mlとする量）。溶離液Ｂ＝ヘプタン硫酸ナトリウム（１.２ｇ）＋氷酢酸（２.５ｍｌ）＋アセトニトリル（３００ｍｌ）＋水（総量を1000mlとする量）。勾配は、次のようにして作成した。ｔ＝０で、溶離液Ｂの３０％；ｔ＝１６（分）で、溶離液Ｂの３０％；ｔ＝１７（分）で、溶離液Ｂの１００％；ｔ＝２０分で、溶離液Ｂの１００％；ｔ＝２１分で、溶離液Ｂの３０％；ｔ＝２５（分）で、溶離液Ｂの３０％。
― 固定相：Nucleosil(R) C 18 5μm × 4.6 mm カラム (Macherey-Nagel)
カラムから溶離する酵素反応の基質と生成物は、２５４ｎｍにおける吸光度で定量した。この測定は、GT400−U4型の固体シンチレーションセルを備えたBerthold LB506検出器を用いたオン−ライン放射化学測定と連動させた。このことにより、放射性メチル基の反応生成物への取込みを特異的に追うことができる。
メチル化１（及びメチル化２）の酵素活性のユニットは、メチル基１nmolを、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（又は、４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン）へ取り込むのに必要な酵素量として定義した。
【００７２】
７.２. ４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへのメチル化、及び４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンの４−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンへのメチル化を触媒するＳＡＭ−依存性Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）（野生型又は変異体）の組換え蛋白質の精製
本実施例は、突然変異papM遺伝子のクローン化により大腸菌（E.coli)で発現した、プ
リスチナマイシンＩＡの生合成経路に関与するＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）SP９２の酵素の精製について説明している。
【００７３】
７.２.ａ. 突然変異PapＭ酵素４９／６６の精製
前述の実施例7.1において記載した検定法を用いて、ＳＡＭ−依存性Ｎ−メチルトランスフェラーゼを下記の通り精製し、必要な場合は、各工程間の活性画分を−７０℃で凍結して保存した。
ＩＰＴＧによる誘導の後にPapＭ突然変異体４９／６６を過剰生成する大腸菌（E.coli)BL21(DE3)::pVRC721（実施例６参照）の培養から遠心分離したペレットを、１ｍMのPMSF、５ｍMのEDTA、５ｍMのEGTA、０.５MのＫＣl及び１０容量％のグリセロールを含んでいる１００ｍMの燐酸緩衝液、ｐH７.２で洗浄した。この洗浄したペレットの２グラムを、４ｍMのDTE、５ｍMのベンズアミジン、０.２ｍMのペファブロック(Pefabloc)、１００μｇ／ｌのE-64、２ｍｇ／ｌのロイペプチン、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、２ｍｇ／ｌのアプロチニン、２０％のグリセロール及び２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含んでいる０.１MのTris-HCl緩衝液、ｐH８の２０ｍｌ中に懸濁した。この緩衝液は、＋４℃で保存した。このようにして得られた懸濁液は、＋４℃で激しく撹拌した。３０分間の撹拌の後、０.２ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩ及び５ｍＭのＭｇＣｌ2を添加した。９０分間の撹拌の後、抽出物を、５００００ｇで１時間遠心分離した。当該上清画分を、２.５ｍｌのアリコートにおいて、４ｍMのDTE、５ｍMのベンズアミジン、０.２ｍMのペファブロック(Pefabloc)、１００μｇ／ｌのE-64、２ｍｇ／ｌのレプチン、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、２ｍｇ／ｌのＳＴＩ、２ｍｇ／ｌのアプロチニン、２０容量％のグリセロールを含んでいる２０ｍMのbis-tris緩衝液、ｐH６.８で平衡化した、PD-10カラム(Pharmacia) のゲル浸透により脱塩した。溶離した蛋白質の一部（蛋白質３４mg）は、ＭonoＱ ＨＲ(R) １０／１０カラムを用いて、４ｍMのDTE、２ｍMのベンズアミジン、１００μｇ／ｌのE-64、２ｍｇ／ｌのロイペプチン及び２０容量％のグリセロールを含んでいる２０ｍMのbis-tris緩衝液（ｐH６.８）中で、塩化ナトリウムの増大する直線勾配（０から０.３M）の流速３ｍｌ／分で、クロマト展開した。カラムから溶離した画分は、４ｍMのDTE、３０ｍMのベンズアミジン、２ｍMのペファブロック(Pefabloc)、１００μｇ／ｌのE-64、２ｍｇ／ｌのロイペプチン、５ｍMのEDTA、５ｍMのEGTA、１０ｍｇ／ｌのSTI、１０ｍｇ／ｌのアプロチニン及び２０容量％のグリセロールを含んでいる２０ｍMのbis-tris緩衝液（ｐH６.８）の１０容量％とした。これらの条件下では、二種類のメチル化活性（１及び２）が、排除画分(exclusion fraction)及び最初の溶離画分(elution fraction)中に、同一の態様で検出された。これらの画分を合わせて、Centriprep(R)10、次いで Centricon(R)10の超遠心分離により濃縮した。この濃縮液を、０.８５Mの硫酸アンモニウムに懸濁し、そして、Phenyl-Superose ＨＲ(R)５／５カラムを用いて、４ｍMのDTE、２ｍMのベンズアミジン、１００μｇ／ｌのE-64、２ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA及び１０容量％のグリセロールを含んでいる５０ｍMのbis-tris緩衝液（ｐH６.８）中で、硫酸アンモニウムの減少する直線勾配（０.８５から０Ｍ）の流速０.５ｍｌ／分で、クロマト展開した（一展開当たり２０から８０ｍｇ）。カラムから溶離した画分は、４ｍMのDTE、３０ｍMのベンズアミジン、２ｍMのペファブロック(Pefabloc)、１００μｇ／ｌのE-64、２ｍｇ／ｌのロイペプチン、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、１０ｍｇ／ｌのSTI、１０ｍｇ／ｌのアプロチニン及び１０％のグリセロールを含んでいる５０ｍMのbis-tris緩衝液（ｐH６.８）の１０容量％とした。これらの条件下では、二種類のメチル化活性（１及び２）が、約０.１５Ｍの硫酸アンモニウムに対応する溶離画分(elution fraction)中に、同一の態様で検出された。
この工程の後に得られた酵素は純品であった。SDS-PAGE電気泳動により収束した単一のバンドの分子量は、３２０００の領域であることが分かった。
【００７４】
【表４】
表４：大腸菌（E.coli)菌株BL21(DE3)：：pVRC721からの、変異４９／６６ ４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（フェニルＮ−）メチルトランスフェラーゼ酵素の精製。精製係数は、精製中の画分の比活性の増大に従って計算した。
【００７５】
７.２.ｂ. 野生型、突然変異４９及び突然変異６６PapＭ酵素の精製
PapＭ wt、PapＭ ４９及びPapＭ ６６酵素は、それぞれプラスミドｐＶＲＣ７０６、ｐＶＲＣ７１１及びｐＶＲＣ７１３で形質転換し（実施例４参照）、そしてIPTGで誘導した大腸菌（E.coli)ＤＨ５αの培養から精製した。使用した精製プロトコールは、実施例7.2.a.で記載したものと同様である。
【００７６】
７.３. 精製したPapＭ（野生型及び変異体）メチラーゼのKｍ及びVmax反応動力学定数の測定
メチル化活性の検定条件は、SAMの２mＭ濃度を除いては、実施例7.1 に記載したものと同様であり、メチル基は、炭素１４同位体（２Ci／mol）で放射能標識されている。濃度範囲は、メチル化１の基質４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン及びメチル化２の基質４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンのそれぞれについて０.１から６０mＭまで変化させて調製した。各基質の各濃度について反応速度を測定し、そして時間当たり、及び蛋白質ｍｇ当たりに換算して、nmol 単位で表示した。
反応動力学定数の値は、Enzfiterソフトウエアーを使用してプロットしたミカエリス・メンテン曲線から求めた。
野生型PapＭ酵素、及び突然変異型PapＭ４９、PapＭ６６及びPapＭ４９／６６について得られた値は、下記の表に示した通りである。
【００７７】
【表５】
【００７８】
これらの結果から、この方法により、天然の酵素と比較して新規な触媒特性を示す新規な酵素を得ることができることが明らかとなった。この酵素の各突然変異型について、各メチル化反応（メチル化１及び２）の酵素活性を測定した。その活性は、比率Vm1／Km１（メチル化１）又はVm２／Km２（メチル化２）で定義した。
【００７９】
次に、各突然変異型について酵素活性の比率（メチル化反応１／メチル化反応２）を測定した。この比率は、Vm１・Km２／Vm２・Km１と同一である。
野生型PapＭ酵素から得られた当該比率は、１.１であった。
酵素活性の比率が２.５より大きいPapＭ変異体を選択した。最良の変異体は７より大きい比率を示し、そして好ましくはほぼ１０を示した。
【００８０】
【表６】
【００８１】
７.４. 二種の基質４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン及び４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニン間の競合検定法
本実施例は、PIB生成にとって最も活性の高いメチラーゼ、即ち、Ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンをＰ−メチル−Ｌ−フェニルアラニンに変換する第一メチル化反応を、Ｐ−メチル−Ｌ−アミノフェニルアラニンをＰ−ジメチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンに変換する第二メチル化反応と比較して、最も良く触媒するメチラーゼを、いかにして識別することができるかについて説明するものである。
【００８２】
この二種の競合基質の変換速度の比率は、次の式で与えられる。
V1／V2＝(Kcat1／Km1)[S1]／(Kcat2／Km2)[S2]
Kcatは、酵素の代謝回転、即ち、酵素のモル数及び単位時間当たりメチル化される基質のモル数である。
この式は、S1及びS2の全ての濃度に対して有効である。
実際、いかなるS1及びS2濃度であっても、この酵素反応は、まるで二種の別々の酵素、即ちS1に作用しS2により競合的に阻害される酵素、及び、S2に作用しS１により競合的に阻害される酵素により触媒されるかのように、二種の要素の合計として表される。
【００８３】
二種の基質のうちの一つのKm及び／又はVmaxの如何なる変化も他の変換速度に影響し、そして比率V1／V2の変動をもたらす。
従って、各基質の２％より多くが変換されることがないように気を付けることによって、基質と酵素の量が影響を与えるということは避けることができる。
【００８４】
SAM濃度が２mＭであって、そのメチル基が炭素１４同位体（２.５Ci／mol）で放射能標識されていることを除いては、実施例７−１に記載したのと同様なメチル化活性の検定条件を用いて、そして、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンには、１ｍＭ、及び４−メチルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンには２ｍＭの濃度の、二種の基質の同時存在下で、それぞれの反応速度を測定することができる。
検定は、実施例４〜６に記載した突然変異体について、同様の基質溶液を用いて、同時に行なった。
これらの条件下では、二重突然変異メチラーゼ４９／６６は最も選択的であり、天然の酵素が二種の反応を同様に触媒するのに対し、これは第一メチル化反応を第二メチル化反応よりも７倍も良く触媒していた。
【００８５】
〔実施例８〕papＭ遺伝子を破壊したＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）組換え菌株の構築
本実施例は、papＭ遺伝子を破壊したＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の組換え菌株の構築について説明するものである。当該菌株は、野生型papＭ遺伝子
が、前述の実施例において記載したようにして取得し、特性決定した突然変異対立遺伝子の一つによって置換されている組換え菌株の構築についての第一工程を構成する。加えて、これらの菌株は、野生型papＭ遺伝子を有する菌株は天然では合成しないＰＩファミリーの化合物、ＰＩＮＨ２（図３）を主として生成する。それ故、これらの菌株は、papＭ遺伝子を破壊していない菌株から単離することが不可能なＰＩＮＨ２を得るための経路を示す。
【００８６】
８.１. papＭ遺伝子を破壊した組換え菌株の構築
papＭ遺伝子の破壊は、以下のようなＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の幾つかの菌株で行なった。
−PＩ及びPIIの混合物を生成する上述のＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）SP９２菌株（Blanc et al., 1994）。
−化学的突然変異誘導によってSP９２から誘導したSP２１３菌株。この菌株は、特異的にPＩを生成する。
papＭ遺伝子を破壊した組換え菌株の構築の方法は、これら二種類に対するものと同様である。SP２１３菌株について得られた結果を、当該実験の残部において詳述する。
本構築は、大腸菌（E.coli)中でのみ複製することができ、かつ、ストレプトミセス属（Streptomyces）中で発現する耐性遺伝子を運搬する自殺ベクターｐＤＨ５（Hillemann et al., 1991）から誘導したプラスミドｐＶＲＣ１３０３（図９参照）を用いて調製した。
【００８７】
８.１.１. プラスミドｐＶＲＣ１３０３の構築
プラスミドｐＶＲＣ１３０３は、以下のものを用いて、図９に記載した４つの主要なクローン化工程により構築した。
― 大腸菌（E.coli)中で作用する複製起点、大腸菌（E.coli)中で発現するアンピシリン耐性遺伝子、並びに、ストレプトミセス属（Streptomyces）中で発現するチオストレプトン及びノシヘプチド耐性遺伝子を運搬するベクターｐＤＨ５（Hillemann et al., 1991）；
−papＭ遺伝子の下流領域に位置しているプリスチナマイシンのクラスター遺伝子の一部を運搬する、２.５ｋｂのBsiWI-PstI フラグメント調製のためのプラスミドｐＶＲＣ４０９（Blanc et al., 1994）。
−papＭ遺伝子の上流領域に位置しているプリスチナマイシンのクラスター遺伝子の一部を運搬する、３.３ｋｂのPvuII-PvuII フラグメント調製のためのプラスミドｐＶＲＣ９００（Blanc et al., 1994; Blanc et al., 1997）。
−大腸菌（E.coli)中、及びストレプトミセス属（Streptomyces）中で発現するカナマイシン耐性遺伝子を基本的に運搬する３.７ｋｂのEcoRI-EcoRI フラグメントを中間クローン化工程の後に調製するためのプラスミドｐＨＰ４５Ω−Ｋｍ(Fellay et al., 1987) 及びｐＩＪ７０２(Hopwood et al., 1985)。このカナマイシン耐性遺伝子を運搬するΩ−Ｋｍカセットは、papＭ遺伝子の上流及び下流領域の間に導入され、ｐＶＲＣ１３０３にクローン化され、そして欠損したpapＭ遺伝子に置き換わる（図９）。
これらのクローン化に要求される全ての工程（プラスミドDNA単離、制限酵素によるプラスミドDNAの消化、クレノウ酵素処理による突出した５’末端の充填、アガロースゲル電気泳動による酵素消化の泳動と分析、電気泳動後のDNAフラグメントの調製、連結反応、大腸菌（E.coli)の形質転換、組換えクローンの選択及び分析）は、Sambrook et al.,（1989）により記載された標準的プロトコールに従って行なった。
【００８８】
８.１.２. プラスミドｐＶＲＣ１３０３を用いた相同的組換えによってpapＭ遺伝子を破壊したＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の組換え菌株の構築
当該組換え菌株は、プラスミドｐＶＲＣ１３０３を用いた、ＳＰ２１３菌株の形質転換の後に単離した。
これら菌株のプロトプラスト調製、及びＰＥＧを用いた方法によるそれらの形質転換は、Hopwood et al.（1985)の記載のようにして行なった。ｐＶＲＣ１３０３の１μｇを５回形質転換した後、プロトプラストを、Ｒ２ＹＥ培地（Hopwood et al., 1985)の上に撒き、そしてカナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるSNA培地３ｍｌを積層して、一晩再生させた後に選択した。
５回行なった形質転換から、３７個のカナマイシン耐性クローンを単離した。これらの組換え体は、以下のいずれかの結果に基づくものである。
−papＭの上流又は下流領域に位置する染色体及びプラスミド領域間における単一の相同的組換えに続く、プラスミドｐＶＲＣ１３０３の染色体への組込み（単一の乗換えの場合）；
−又は、papＭ遺伝子の上流又は下流領域に位置する染色体及びプラスミド領域間における二重の相同的組換えに続く、カナマイシン耐性遺伝子を運搬するプラスミドΩ−Ｋｍカセット、及び染色体のpapＭ遺伝子間における交換（図１０に表示した二重の乗換えの場合）。
【００８９】
これら二種の場合、Ω−Ｋｍカセットは、組換え菌株の染色体へ運搬されて、カナマイシン耐性を付与する。一方では、単一の乗換えの場合のみ、プラスミドｐＶＲＣ１３０３（図９）に存在している遺伝子が、組換え菌株の染色体へ運搬されて、チオストレプトン及び／又はノシヘプチド耐性を付与する（Hillemann et al., 1991）。それ故、これら二種の乗換え状態（単一又は二重の乗換え）は、ノシヘプチドに対する耐性又は感受性の表現型を分析することにより識別できる。
これを行なうため、上記に記載したように、プラスミドｐＶＲＣ１３０３を用いて５回行なった形質転換から由来し、及びカナマイシン１０μｇ／ｍｌに対する耐性で選択した組換えクローンを、カナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるHT培地（Hopwood et al., 1985)上に、パッチ状に継代培養し、そして、ノシヘプチド４００μｇ／ｍｌを含んでいるHT培地上で試験した。二重乗換えが生じた場合に対応する故に、表現型（ＫanaR, ＮosiS）を示すクローンのみを選択した。その後、これらの組換えクローンを以下の工程で精製した。これらのクローンを、カナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるHT培地上に撒きそして生育させ、単離したコロニーを得るためにそれを希釈してそして同じ培地上に再度撒いた後に、胞子保存を、Hopwood et al.（1985)の方法により調製した。これらのコロニーは、選択したクローンの純粋なサブクローンより成る。次に、５個の異なるクローンから誘導した２つのサブクローンについて分析した。
【００９０】
これらのサブクローンの染色体構造を確認するために、それらのゲノムＤＮＡを、カナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるＹＥＭＥ液体培地中で培養した後に、Hopwood et al.（1985)記載の、リゾチーム溶解とフェノール／クロロホルム抽出の技術に基づいて抽出した。これらの種々のクローンの全ＤＮＡをEcoRI 及び SphIで消化し、プラスミドｐＶＲＣ１３０３をEcoRIで直線化して、（α−32Ｐ）ｄＣＴＰ及びＡｍｅｒｓｈａｍにより市販されている標識キット（ランダムプライム DNA 標識キット）を用いて行われるランダムプライミングによる標識の後、プローブとして用いてハイブリダイズして、サザンブロットを数回行った。使用した技術は、Sambrook et al.(1989) に記載されているものである。ハイブリダイゼーションの結果から、サブクローンは、図１０の記載のように、ベクターｐＶＲＣ１３０３と菌株ＳＰ２１３の染色体との間の二重乗換えにより得られたものであることが明らかとなった。サブクローン中では、当該プローブとハイブリダイズする９.９ｋｂのEcoRIフラグメントが存在するが、これは野生型菌株ＳＰ２１３中には存在せず、ハイブリダイズするEcoRIフラグメントの大きさは、６.８ｋｂであることを特に確認した。
遺伝子型ＳＰ213ΔpapＭ::ΩkanaＲを有するクローンの一つをＳＰ２１６と命名した。このクローンを、その生成分析のために、そして、上述した実施例に記載したように、野生型papＭ遺伝子が、papＭの突然変異又は二重突然変異対立遺伝子の一つで置換されてい
る組換え菌株を得る観点から、遺伝子の構築を継続するために選択した。
【００９１】
８.２. 突然変異株ＳＰ２１６によるプリスチナマイシンの生成
本実施例は、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）のpapＭ遺伝子が破壊された突然変異株ＳＰ２１６が、いかにして標準的な培養条件下で、主にＰＩＮＨ２[４ξ−アミノ−デ（４ξ−ジメチルアミノ）プリスチナマイシンＩＡ]を生成することを決定するかについて説明するものである。ＰＩＮＨ２の構造は、図２に示してある。
突然変異株ＳＰ２１６及び対照としての野生型菌株ＳＰ２１３を、液体生産培地中で培養した。培養は次のようにして行なった。上記の菌株の胞子の懸濁液０.５ｍｌを、撹拌しながら、３００ｍｌの遮蔽板付きエーレンマイヤーフラスコ(baffled Erlenmeyer flask)中で、播種培地４０ｍｌに添加した。播種培地は、コーンスチープ(Corn Steep) １０ｇ／ｌ、蔗糖１５ｇ／ｌ、(ＮＨ4)2ＳＯ4を１０ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4を１ｇ／ｌ、ＮａＣｌを３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを０.２ｇ／ｌ、及びＣａＣＯ3を１.２５ｇ／ｌから成る。ｐＨは、炭酸カルシウムを添加する前に、水酸化ナトリウムで６.９に調節した。エーレンマイヤーフラスコは、３２５ｒｐｍで回転シェーカー上で２７℃で４４時間、振とうした。４４時間前培養した培養液２.５ｍｌを、３００ｍｌのエーレンマイヤーフラスコ中の生産培地３０ｍｌに滅菌的に添加した。生産培地は、大豆粉２５ｇ／ｌ、デンプン７.５ｇ／ｌ、グルコース２２.５ｇ／ｌ、飼料酵母３.５ｇ／ｌ、硫酸亜鉛０.５ｇ／ｌ、及び炭酸カルシウム６ｇ／ｌ、から成る。ｐＨは、炭酸カルシウムを添加する前に、塩酸で６.０に調節した。
【００９２】
エーレンマイヤーフラスコは２７℃で５０時間振とうした。培養が終了した後直ちに、培養液の容量を測定し、その２倍量のアセトニトリル３４％及び０.１ＭのＫＨ2ＰＯ4溶液６６％から成る移動相（濃Ｈ3ＰＯ4でｐＨ２.９に調節）を、プリスチナマイシンの抽出のために添加した。振とう後、全混合物を濾過した。プリスチナマイシンは上清に含まれていた。その上清はＨＰＬＣを用いて次のようにして検定した。遠心分離した上清画分の１５０μｌをNucleosil 5-C8(R)カラム、４.６×１５０ｍｍに注入し、アセトニトリル４０％及び０.１Ｍの燐酸緩衝液、ｐＨ２.９、６０％の混合物で溶出した。プリスチナマイシンは、２０６ｎｍのＵＶ吸収、場合によっては蛍光発光（３７０ｎｍフィルター、３０６ｎｍで励起）で検出した。プリスチナマイシンの生成は下記の表の通りであった。
【００９３】
【表７】
【００９４】
これらの結果から、生産培養条件下では、対照菌株ＳＰ２１３は、主にＰＩＡを含んでいるＰＩの標準量を生成するのに対して、突然変異株ＳＰ２１６は主にＰＩＮＨ２を生成することが明らかとなった。
【００９５】
〔実施例９〕対立遺伝子４９／６６papＭ又は対立遺伝子６６papＭを含んでいるＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の組換え菌株の構築
本実施例は、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）のpapＭ遺伝子が変異した組換え菌株が、ＰＩファミリーの化合物、ＰＩＢ（図２）を選択的に生成する能力について説明するものである。ＰＩＢは野生型papＭ遺伝子を有する菌株によって天然
に合成されるが、しかし、その量は極めて少なく、最高でも約５％である。それ故、これらの菌株は大規模にそして極めて特異的にＰＩＢを入手する経路を示す。
【００９６】
９.１ papＭ遺伝子において変異した組換え菌株の構築
突然変異papＭ遺伝子４９／６６を、上述したようにＰＩ及びＰIIの混合物を生成するＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）ＳＰ９２菌株へ(Blanc et al., 1994)、及び、化学的突然変異誘導によりＳＰ９２から誘導したＳＰ２１３菌株へ導入した。ＳＰ２１３菌株は特異的にＰＩを生成した。
突然変異papＭ遺伝子６６は、ＳＰ９２から誘導した菌株ＳＰ２１３へ導入した。
papＭ遺伝子の突然変異対立遺伝子の一つを運搬する組換え菌株を構築する方法は、papＭ遺伝子の対立遺伝子の変異型がいずれであれ（４９／６６又は６６）、また選択した菌株がいずれであれ同様である。当該方法は、野生型papＭ遺伝子が破壊され、そしてpapＭの突然変異対立遺伝子の一つを当該カセットと交換することができる自殺プラスミドを用いて、Ω−Ｋｍカセット（図８参照）により置換された組換え菌株の形質転換から成るものである。
【００９７】
説明のため、詳細は、papＭ遺伝子の突然変異した対立遺伝子４９／６６の、菌株ＳＰ２１６（菌株ＳＰ２１６の作成は図８に記載）への導入について、下記に記す。この構築は、大腸菌（E.coli)中でのみ複製することができ、かつ、ストレプトミセス属（Streptomyces）中で発現する、チオストレプトンまたはノシヘプチド耐性遺伝子を運搬する自殺ベクターｐＤＨ５（Hillemann et al., 1991）から誘導したプラスミドｐＶＲＣ１３０６（図１１参照）を用いて行った。
実施例９.２は、ＳＰ９２又はＳＰ２１３から誘導し、突然変異papＭ遺伝子６６又は突然変異papＭ遺伝子４９／６６のいずれかを発現する数種の組換え菌株について得られたプリスチナマイシンの生成結果を示すものである。
【００９８】
９.１.１. プラスミドｐＶＲＣ１３０６の構築
対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子を運搬するプラスミドｐＶＲＣ１３０６は、papＭ遺伝子の欠失を運搬するプラスミドｐＶＲＣ１３０３から構築されている。この構築は、図１１に記載した通り、三工程で行なった。これらのクローン化のため、以下のプラスミドを使用した。
−プラスミドｐＢＲ３２２は、大腸菌（E.coli)におけるクローン化のためのベクターであるが、これを、実施例8.1.1. に記載し、そして特に、カナマイシン耐性遺伝子を運搬するＷ−Ｋｍカセットにより欠失したpapＭ遺伝子を含んでいるｐＶＲＣ１３０３の８.９ｋｂのEcoRIフラグメントを転移するための中間ベクターとして使用した。クローン化は、ｐＢＲ３２２のEcoRI部位で行ない、そして得られたプラスミドは、ｐＶＲＣ１３０４と命名した。
−実施例６（図６）に記載したプラスミドｐＶＲＣ７２１を、対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子を含んでいる１ｋｂのMluI／AgeI インサートを調製するために使用した。このインサートは、ｐＶＲＣ１３０４の４ｋｂのMluI／AgeIフラグメントと交換し、こうして得られたプラスミドは、ｐＶＲＣ１３０５と命名した。
−プラスミドｐＶＲＣ１３０３は、８.９ｋｂのEcoRIフラグメントを、対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子を含んでいるｐＶＲＣ１３０５の５.８３ｋｂのEcoRIフラグメントにより交換することを可能とする。
それ故、最後のプラスミド、ｐＶＲＣ１３０６（図１１）は、対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子並びに当該遺伝子の上流領域及び下流領域の一部、実施例8.1.1. に記載したベクターｐＤＨ５中へクローン化される全構成要素を含んでいる。
【００９９】
９.１.２. プラスミドｐＶＲＣ１３０６を用いた相同的組換えによる対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子中で変異したＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）組換え菌株の構築
本組換え菌株は、実施例８で記載した菌株ＳＰ２１６を、プラスミドｐＶＲＣ１３０６で形質転換した後に単離した。このためには、二種類の工程が必要である。第一工程は、表現型（ＫanaR, ＮosiR）の分析による、papＭ遺伝子の上流に位置している染色体とプラスミド領域間の単一の相同的組換えに由来する菌株の選択から成る（図１２）。第二工程は、菌株（ＫanaR, ＮosiR）を使用して、得られたクローンの表現型（ＫanaS, ＮosiS）の分析による、第二相同的組換えの選択から成る（図１３）。
これら二種類の工程は、以下のようにして行なうことができる。
【０１００】
これらの菌株のプロトプラストの調製及びＰＥＧを用いた方法によるそれらの形質転換は、Hopwood et al.（1985)の記載のようにして行なった。独立に１０回の形質転換を行ない、毎回、１μｇのｐＶＲＣ１３０６を用いた。プロトプラストは、Ｒ２ＹＥ培地（Hopwood et al., 1985)上に播種し、そして一夜再生させた後に、ノシヘプチド４００μｇ／ｍｌを含んでいるＳＮＡ培地の３ｍｌを積層することにより選択した。
１０回の形質転換を行なった結果、ノシヘプチド耐性（Hillemann et al., 1991）の７個のクローンが単離できた。これらの組換え体は、papＭ遺伝子の上流に位置している染色体とプラスミド領域間の単一の相同的組換えに続く、プラスミドｐＶＲＣ１３０６の染色体への組み込みの結果得られたものであり、これらのクローンに、カナマイシン（形質転換した菌株に基づく）及びチオストレプトン（プラスミドの組換えに基づく）双方に対する、二重耐性を付与するものである。それ故、これら７個の組換えクローンを、カナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるＨＴ培地、及びノシヘプチド４００μｇ／ｍｌを含んでいるＨＴ培地上に継代培養した。これら全てのクローンは、予想通り、表現型（ＫanaR, ＮosiR）を示した。これらのクローンは、以下の方法により２回精製した。これらのクローンの胞子保存をHopwood et al.（1985)の方法により調製し、そして、ノシヘプチド４００μｇ／ｍｌを含んでいるＨＴ培地上に、この胞子保存の様々な希釈液を培養して単離コロニーを得た。これらのコロニーは、選択したクローンの純粋なサブクローンより成る。２個のクローンに由来する２個のサブクローンの染色体構造はサザンブロット法で分析した。
【０１０１】
ゲノムＤＮＡは、ノシヘプチド４μｇ／ｍｌを含んでいるＹＥＭＥ液体培地中で培養した後に抽出した。ＤＮＡは、Hopwood et al.(1985)記載の技術に基づいて、リゾチーム処理及びフェノール／クロロホルム抽出により抽出した。EcoRI 及び AseI制限酵素で消化した、これら種々のサブクローンの全ＤＮＡについて、サザンブロット法を数回行なった。EcoRI で消化した、ｐＶＲＣ１３０３由来の８.９ｋｂフラグメントを、（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰ及びＡｍｅｒｓｈａｍにより市販されている標識キット（ランダムプライム DNA 標準キット）を用いて得た、ランダムプライミング法による標識の後、プローブとして使用した。使用した技術は、Sambrook et al.(1989) に記載されているものである。ハイブリダイゼーションの結果（６.８３、３.４２、３.１２５及び２.０６ｋｂに対応するバンド）から、サブクローンは、ベクターｐＶＲＣ１３０６と菌株ＳＰ２１６の染色体との間の単一乗換えにより得られたものであることが明らかとなった。菌株ＳＰ２１６のＤＮＡは、４.４２、３.１２５及び２.０６ｋｂに対応するバンドを示したが、しかしながら６.８３ｋｂに対応するバンドは示さなかった。
これらのクローンの一つを、ＳＰ２１６::ｐＶＲＣ１３０６と命名した。
【０１０２】
第二工程は、papＭ遺伝子の下流に位置している染色体とプラスミド領域間の第二相同的組換えを、菌株ＳＰ２１６::ｐＶＲＣ１３０６を用いて、選択することである（図１３参照）。この工程は、Ω−Ｋｍカセットにより、欠失したpapＭ遺伝子を対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子で交換した組換えクローンの選択へと導く。予想される組換えクローンの表現型は、（ＫanaS, ＮosiS）である。
クローンSP216::pVRC1306を用いて第二組換えの発生を促進するため、２回の成長サイ
クルを回転培養機上で回転速度３２５ｒｐｍ、３０℃で行なった。第一回のサイクルは、ＹＥＭＥ培地１０ｍｌ中のSP216::pVRC1306胞子保存２００μｌを用いて行い（培養条件：３０℃、２８０ｒｐｍ、７２時間）、第二回のサイクルは、ＹＥＭＥ培地４０ｍｌ中の第一回サイクルの懸濁液８００μｌを用いて行った（培養条件：３０℃、２８０ｒｐｍ、７２時間）。第二回の培養を３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、ペレットを水＋０.０１％ ツウィーン(Tween) の６００μｌ中に懸濁し、そして胞子層を得るために、この懸濁液をＨＴ培地上に播種した。この液体培養から誘導した組換えクローンを精製するため、胞子を収集し、そして単離コロニーを得るために、この胞子の懸濁希釈液をＨＴ培地上に播種した。
【０１０３】
所望する表現型（ＫanaS, ＮosiS）を有するクローンを選択するため、１０００個の単離コロニーを継代培養し、そしてスクリーニングした。これらのコロニーは、自動的に、抗生物質を含んでいないＨＴ培地、及びカナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるＨＴ培地上で継代培養した。この第一工程により、１８個の組換えＫanaSクローンを選択することができた。抗生物質を含んでいないＨＴ培地からこれらの、１８個のクローンを手で拾い上げ、抗生物質を含んでいないＨＴ培地、カナマイシン１０μｇ／ｍｌを含んでいるＨＴ培地、及びノシヘプチド４００μｇ／ｍｌを含んでいるＨＴ培地上で継代培養した。表現型（ＫanaS, ＮosiS）を有する３個の組換えクローンを、二重乗換えの発生に由来している可能性のあるものとして選択した。これらのクローンを精製し、胞子保存を胞子層から調製し、そしてゲノム分析を、上記の方法により行なった。
【０１０４】
組換えサブクローンの染色体分析を二工程で行なった。第一工程は、対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子が存在していること、及びこの遺伝子の上流及び下流の染色体領域に変化がないことを確認することである。第二工程は、Ｗ−Ｋｍカセット及びプラスミドｐＤＨ５に対応するＤＮＡフラグメントが存在していないことを確認することである。
第一工程のため、組換えクローンのゲノムＤＮＡの調製を行い、そして全ＤＮＡ分析を、上記の方法に従って、サザンブロット法により行なった。全ＤＮＡを、EcoRI及びAseI 制限酵素で消化した。プラスミドｐＶＲＣ７２１は、ＭluI（対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子を含んでいる１.７ｋｂインサート）で消化した。この標識したフラグメントを、６.８３ｋｂバンドに対応するフラグメントとハイブリダイズするプローブとして使用した。
更に、全ＤＮＡを、SalIで消化した。ｐＶＲＣ４０９及びｐＶＲＣ８０３（菌株２１３のpapＭ遺伝子の上流及び下流領域を含んでいる、Blanc et al., 1994；Blanc et al., 1997) から誘導した標識フラグメントをプローブとして使用した。これらのフラグメントにより、ハイブリダイゼーションの後に、７個のバンド（２.４５、０.１９０、２.１５０、０.７２５、１.５５、０.４及び０.５５ｋｂ）が明らかに見えるようになった。
【０１０５】
第二工程は、Ω−Ｋｍカセット又はプラスミドｐＤＨ５に対応するＤＮＡフラグメントがこれ以上存在していないことを確認することである。全ＤＮＡを、EcoRI及びAseIで消化した。ｐＨＰ４５Ω−Ｋｍ(Felley et al., 1987)及びｐＤＨ５の２.２ｋｂのHindIII フラグメント（Ω−Ｋｍカセット）をプローブとして使用した。
３個の組換えクローンが、対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子の存在、並びにカナマイシン耐性遺伝子及びプラスミドｐＤＨ５に対応するフラグメントの不存在を確認する染色体像を示した（図１３）。これらの要素より、対立遺伝子４９／６６papＭ遺伝子のゲノム環境は完全無傷であることが示される。これらのクローンの一つを選択し、菌株ＳＰ２１７と命名した。
同様な方法で、対立遺伝子４９／６６突然変異papＭ遺伝子又は対立遺伝子６６papＭ遺伝子を組み込むＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の他の菌株も構築した。これらの菌株は：
― 対立遺伝子４９／６６突然変異papＭ遺伝子を運搬するプラスミドｐＶＲＣ１３０６
を用いた菌株ＳＰ９２の形質転換から誘導したＳＰ１０１；
― 対立遺伝子４９／６６突然変異papＭ遺伝子が対立遺伝子６６突然変異papＭ遺伝子で置換されている以外はｐＶＲＣ１３０６と等しいプラスミドを用いて、菌株ＳＰ２１６の形質転換から誘導したＳＰ２１８。
【０１０６】
９.２. Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の菌株ＳＰ２１３、ＳＰ２１７、ＳＰ２１８、ＳＰ１００及びＳＰ１０１によるプリスチナマイシンの生成
本実施例は、種々の突然変異株を用いたプリスチナマイシンの生成を示している。特に、対照papＭのｗｔ菌株（菌株ＳＰ２１３）と比較した、対立遺伝子４９／６６突然変異papＭ変異体（菌株ＳＰ２１７）及び対立遺伝子６６papＭ変異体（菌株ＳＰ２１８）のＰＩＢ生成における増大を示している。また、対立遺伝子４９／６６突然変異papＭ遺伝子
（菌株ＳＰ１０１）の影響についても、対照papＭのｗｔ菌株（菌株ＳＰ９２）を考慮した比較を行なった。
プリスチナマイシンの生成、抽出、及び検定の技術は、実施例8.2.に記載したものと同様である。
対照菌株（菌株ＳＰ２１３及びＳＰ９２）のＰＩＡ量との相対値で表した種々のプリスチナマイシンの生成レベルは、下記の表の通りである。
【０１０７】
【表８】
【０１０８】
これらの結果から、本発明に係るpapMポリペプチドの変異体を発現する遺伝子が、Ｓ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の菌株に対し、ＰＩＢ生成の優れた選択性を付与していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】プリスチナマイシンIIの構造の例。
【図２】プリスチナマイシンＩの構造の例。
【図３】ＰＩＢ及びＰＩＡの各々の前駆体であるＭＭＰＡＰＡ及びＤＭＰＡＰＡの生合成経路。
【図４】ＰａｐＭ突然変異株をスクリーニングするために用いられる酵素検定試験の原理：［14Ｃ−Ｍｅ］−ＳＡＭ存在下における、ＰＡＰＡ及びＭＭＰＡＰＡの各々からのＭＭＰＡＰＡ及びＤＭＰＡＰＡの同時メチル化による標識。
【図５】プラスミドｐＶＲＣ７０６の図解。
【図６】プラスミドｐＵＣ４Ｋの図解。
【図７】野生型papＭ遺伝子の配列及び翻訳。突然変異クローン４９及び６６について同定された突然変異の位置。
【図８】プラスミドｐＶＲＣ７２１の図解。
【図９】プラスミドｐＶＲＣ１３０３を構築するための方法。
【図１０】プラスミドｐＶＲＣ１３０３とＳ．プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis）の染色体間における二重乗換え実例の図解。組換え菌株の染色体構造。
【図１１】プラスミドｐＶＲＣ１３０６を構築する方法。
【図１２】プラスミドｐＶＲＣ１３０６と組換え菌株ＳＰ２１６の染色体間において選択された単一乗換え実例の図解。
【図１３】papＭ遺伝子の突然変異対立遺伝子の一つを示している組換え菌株を生成する第二組換え現象の実例の図解。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ．プリスチナエスピラリスの野生型ＰａｐＭポリペプチドの配列、又は下記：
(ａ) Ｓ．プリスチナエスピラリスのＰａｐＭポリペプチドのＧｌｙ２４９残基
(ｂ) Ｓ．プリスチナエスピラリスのＰａｐＭポリペプチドのＴｈｒ１９２残基
(ｃ) 相同ペプチドにおいて(ａ)又は(ｂ)に相当する残基
から選択された一つ又はそれ以上のアミノ酸の置換による相同ポリペプチドの配列から誘導したストレプトミセス属細菌のＰａｐＭポリペプチドの変異体。
【請求項２】
ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２に由来し、そして、２４９位のグリシンがセリンで置換された少なくとも一つの置換を示す請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２に由来し、そして、１９２位のトレオニンがイソロイシンで置換された少なくとも一つの置換を示す請求項１に記載の変異体。
【請求項４】
ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２に由来し、そして、２４９位のグリシンがセリンで置換された少なくとも一つの置換、及び１９２位のトレオニンがイソロイシンで置換された一つの置換を示す請求項１に記載の変異体。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載された変異体をコードする核酸。
【請求項６】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１に存在するヌクレオチド配列、又は、当該遺伝子コードの縮重によって得られた配列から誘導した請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
１９３位から１９６位に位置するＮＰＰＹモチーフの上流に少なくとも一つのミスセンス突然変異を含んでいる請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
ミスセンス突然変異が非保存的アミノ酸変化を誘導する請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
６５８位のシトシンがチミンで置換された（Ｃ６５８Ｔ）少なくとも一つの置換を含んでいる請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
８２８位のグアニンがアデニンで置換された（Ｇ８２８Ａ）少なくとも一つの置換を含んでいる請求項６に記載の核酸。
【請求項１１】
８２８位のグアニンがアデニンで置換された（Ｇ８２８Ａ）少なくとも一つの置換、及び６５８位のシトシンがチミンで置換された（Ｃ６５８Ｔ）少なくとも一つの置換を含んでいる請求項８に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項５〜１１の何れか一項に記載された核酸を含んでいる組換えＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項５〜１１の何れか一項に記載された核酸を含んでいるか、又は請求項１２に記載された組換えＤＮＡを含んでいる、自律的に複製し及び／又は組み込む発現ベクター。
【請求項１４】
図１１に表示したベクターｐＶＲＣ１３０６の全部又は一部を含んでいる請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項５〜１１の何れか一項に記載された核酸、及び／又は、請求項１２に記載された
組換えＤＮＡ、及び／又は、請求項１３又は１４に記載された発現ベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項１６】
大腸菌、Ｓ．プリスチナエスピラリス、ストレプトミセス オリバセウス ＡＴＣＣ１２０１９、ストレプトミセス オストレオグリセウス ＡＴＣＣ２７４５５、ストレプトミセス ミタカエンシス ＡＴＣＣ１５２９７、ストレプトミセス ロイデンシス ＡＴＣＣ１１４１５、ストレプトミセス グラミノファシエンス及びストレプトミセス デイアスタチカスから選択された請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載した宿主細胞を培養し、そして生成したポリペプチドを回収することから成る、請求項１〜４の何れか一項に記載した変異体を生成する方法。
【請求項１８】
生物変換反応において、請求項１〜４の何れか一項に記載した変異体を発現する、請求項１５又は１６に記載した宿主細胞の使用。
【請求項１９】
ストレプトグラミン生産菌株におけるストレプトグラミンの種々のＢ構成成分の比率を改変するための、請求項５〜１１の何れか一項に記載した核酸の使用。
【請求項２０】
使用した核酸が、請求項１〜４の何れか一項に記載した変異体をコードする核酸であり、そして、ストレプトグラミン生産菌株がＳ．プリスチナエスピラリスの菌株である、ＰＩＢの生成のための請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
使用した核酸が、請求項８に記載した変異体をコードする核酸であり、そして、ストレプトグラミン生産菌株がＳ．プリスチナエスピラリスの菌株である、ＰＩＡの生成のための請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
以下の工程：
−ｐａｐＭ遺伝子が、ストレプトグラミン生産菌株又は潜在的ストレプトグラミン生産菌株において不活性化され、そして、請求項１〜４の何れか一項に定義されたｐａｐＭ変異体をコードする核酸の一つ又はそれ以上のコピーが導入され、
−当該菌株を、ストレプトグラミン生産条件下で培養し、そして
−生成したストレプトグラミンのＢ構成成分を回収する
から成る、一つ又はそれ以上のストレプトグラミンのＢ構成成分を生成する方法。
【請求項２３】
ストレプトグラミン生産菌株が、Ｓ．プリスチナエスピラリスから誘導した、そして、好ましくは、Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ９２菌株から誘導した、又は、ストレプトミセス オリバセウス ＡＴＣＣ１２０１９、ストレプトミセス オストレオグリセウス ＡＴＣＣ２７４５５、ストレプトミセス ミタカエンシス ＡＴＣＣ１５２９７、ストレプトミセス ロイデンシス ＡＴＣＣ１１４１５、ストレプトミセス グラミノファシエンス及びストレプトミセス デイアスタチカス菌株から誘導したプリスチナマイシン生産菌株である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ストレプトグラミン生産菌株が、ストレプトグラミンのＡ構成成分を微量又は検出不可能な量しか生成しない菌株である請求項２２又は２３に記載した方法。
【請求項２５】
Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ２１３から誘導した菌株を含む請求項２３に記載した方法。
【請求項２６】
請求項１〜４の何れか一項に記載したＰａｐＭ変異体をコードする核酸の導入が、ｐａｐＭ遺伝子の野生型の置換によって行われる請求項２２〜２５の何れか一項に記載した方法。
【請求項２７】
ｐａｐＭ遺伝子の野生型が、請求項１〜４の何れか一項に記載した変異体をコードする核酸によって置換される、ＰＩＢを生成するために有用な請求項２６に記載した方法。
【請求項２８】
ｐａｐＭ遺伝子の野生型が、ｐａｐＭポリペプチドの不活性型をコードする核酸によって置換される、ＰＩＮＨ２を生成するために有用な請求項２２〜２７の何れか一項に記載した方法。
【請求項２９】
使用した菌株が二重突然変異（Ｇ８２８Ａ）（Ｃ６５８Ｔ）を示すｐａｐＭ遺伝子を含んでいる請求項２７に記載した方法。
【請求項３０】
使用した菌株が突然変異（Ｇ８２８Ａ）を示すｐａｐＭ遺伝子を含んでいる請求項２７に記載した方法。
【請求項３１】
使用した菌株が突然変異（Ｃ６５８Ｔ）を示すｐａｐＭ遺伝子を含んでいる請求項２７に記載した方法。
【請求項３２】
請求項５〜１１の何れか一項に記載した核酸を含んでいるＳ．プリスチナエスピラリスの突然変異菌株。
【請求項３３】
Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ２１７である、請求項３２に記載の菌株。
【請求項３４】
Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ１０１である、請求項３２に記載の菌株。
【請求項３５】
Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ２１８である、請求項３２に記載の菌株。
【請求項３６】
ＰＩＢを生成するための菌株Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ２１７の使用。
【請求項３７】
ＰＩＢを生成するための菌株Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ１０１の使用。
【請求項３８】
ＰＩＢを生成するための菌株Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ２１８の使用。
【請求項３９】
ＰＩＮＨ２を生成するための菌株Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ２１６の使用。
【請求項４０】
以下の工程：
(ａ) Ｓ．プリスチナエスピラリスのｐａｐＭ遺伝子又はプラスミドにクローン化した相同遺伝子に対して化学的突然変異誘導を行う工程、
(ｂ) 工程(ａ)で行った突然変異誘導を受けたプラスミドで受容菌株を形質転換することによりライブラリーを調製する工程、
(ｃ) 時間単位当たり変換されるメチル化基質の量の比率「ｒ」が、ｒ＝基質１／（基質１＋基質２）で表され、０.６より大きいか又はそれに等しい比率を示すメチル化活性を示すクローンを選択する工程、
から成る請求項１〜４の何れか一項に記載したＰａｐＭポリペプチド変異体を選択するための方法。
【請求項１】
Ｓ．プリスチナエスピラリスの野生型ＰａｐＭポリペプチドの配列、又は下記：
(ａ) Ｓ．プリスチナエスピラリスのＰａｐＭポリペプチドのＧｌｙ２４９残基
(ｂ) Ｓ．プリスチナエスピラリスのＰａｐＭポリペプチドのＴｈｒ１９２残基
(ｃ) 相同ペプチドにおいて(ａ)又は(ｂ)に相当する残基
から選択された一つ又はそれ以上のアミノ酸の置換による相同ポリペプチドの配列から誘導したストレプトミセス属細菌のＰａｐＭポリペプチドの変異体。
【請求項２】
ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２に由来し、そして、２４９位のグリシンがセリンで置換された少なくとも一つの置換を示す請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２に由来し、そして、１９２位のトレオニンがイソロイシンで置換された少なくとも一つの置換を示す請求項１に記載の変異体。
【請求項４】
ポリペプチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２に由来し、そして、２４９位のグリシンがセリンで置換された少なくとも一つの置換、及び１９２位のトレオニンがイソロイシンで置換された一つの置換を示す請求項１に記載の変異体。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載された変異体をコードする核酸。
【請求項６】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１に存在するヌクレオチド配列、又は、当該遺伝子コードの縮重によって得られた配列から誘導した請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
１９３位から１９６位に位置するＮＰＰＹモチーフの上流に少なくとも一つのミスセンス突然変異を含んでいる請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
ミスセンス突然変異が非保存的アミノ酸変化を誘導する請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
６５８位のシトシンがチミンで置換された（Ｃ６５８Ｔ）少なくとも一つの置換を含んでいる請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
８２８位のグアニンがアデニンで置換された（Ｇ８２８Ａ）少なくとも一つの置換を含んでいる請求項６に記載の核酸。
【請求項１１】
８２８位のグアニンがアデニンで置換された（Ｇ８２８Ａ）少なくとも一つの置換、及び６５８位のシトシンがチミンで置換された（Ｃ６５８Ｔ）少なくとも一つの置換を含んでいる請求項８に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項５〜１１の何れか一項に記載された核酸を含んでいる組換えＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項５〜１１の何れか一項に記載された核酸を含んでいるか、又は請求項１２に記載された組換えＤＮＡを含んでいる、自律的に複製し及び／又は組み込む発現ベクター。
【請求項１４】
図１１に表示したベクターｐＶＲＣ１３０６の全部又は一部を含んでいる請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項５〜１１の何れか一項に記載された核酸、及び／又は、請求項１２に記載された
組換えＤＮＡ、及び／又は、請求項１３又は１４に記載された発現ベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項１６】
大腸菌、Ｓ．プリスチナエスピラリス、ストレプトミセス オリバセウス ＡＴＣＣ１２０１９、ストレプトミセス オストレオグリセウス ＡＴＣＣ２７４５５、ストレプトミセス ミタカエンシス ＡＴＣＣ１５２９７、ストレプトミセス ロイデンシス ＡＴＣＣ１１４１５、ストレプトミセス グラミノファシエンス及びストレプトミセス デイアスタチカスから選択された請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載した宿主細胞を培養し、そして生成したポリペプチドを回収することから成る、請求項１〜４の何れか一項に記載した変異体を生成する方法。
【請求項１８】
生物変換反応において、請求項１〜４の何れか一項に記載した変異体を発現する、請求項１５又は１６に記載した宿主細胞の使用。
【請求項１９】
ストレプトグラミン生産菌株におけるストレプトグラミンの種々のＢ構成成分の比率を改変するための、請求項５〜１１の何れか一項に記載した核酸の使用。
【請求項２０】
使用した核酸が、請求項１〜４の何れか一項に記載した変異体をコードする核酸であり、そして、ストレプトグラミン生産菌株がＳ．プリスチナエスピラリスの菌株である、ＰＩＢの生成のための請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
使用した核酸が、請求項８に記載した変異体をコードする核酸であり、そして、ストレプトグラミン生産菌株がＳ．プリスチナエスピラリスの菌株である、ＰＩＡの生成のための請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
以下の工程：
−ｐａｐＭ遺伝子が、ストレプトグラミン生産菌株又は潜在的ストレプトグラミン生産菌株において不活性化され、そして、請求項１〜４の何れか一項に定義されたｐａｐＭ変異体をコードする核酸の一つ又はそれ以上のコピーが導入され、
−当該菌株を、ストレプトグラミン生産条件下で培養し、そして
−生成したストレプトグラミンのＢ構成成分を回収する
から成る、一つ又はそれ以上のストレプトグラミンのＢ構成成分を生成する方法。
【請求項２３】
ストレプトグラミン生産菌株が、Ｓ．プリスチナエスピラリスから誘導した、そして、好ましくは、Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ９２菌株から誘導した、又は、ストレプトミセス オリバセウス ＡＴＣＣ１２０１９、ストレプトミセス オストレオグリセウス ＡＴＣＣ２７４５５、ストレプトミセス ミタカエンシス ＡＴＣＣ１５２９７、ストレプトミセス ロイデンシス ＡＴＣＣ１１４１５、ストレプトミセス グラミノファシエンス及びストレプトミセス デイアスタチカス菌株から誘導したプリスチナマイシン生産菌株である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ストレプトグラミン生産菌株が、ストレプトグラミンのＡ構成成分を微量又は検出不可能な量しか生成しない菌株である請求項２２又は２３に記載した方法。
【請求項２５】
Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ２１３から誘導した菌株を含む請求項２３に記載した方法。
【請求項２６】
請求項１〜４の何れか一項に記載したＰａｐＭ変異体をコードする核酸の導入が、ｐａｐＭ遺伝子の野生型の置換によって行われる請求項２２〜２５の何れか一項に記載した方法。
【請求項２７】
ｐａｐＭ遺伝子の野生型が、請求項１〜４の何れか一項に記載した変異体をコードする核酸によって置換される、ＰＩＢを生成するために有用な請求項２６に記載した方法。
【請求項２８】
ｐａｐＭ遺伝子の野生型が、ｐａｐＭポリペプチドの不活性型をコードする核酸によって置換される、ＰＩＮＨ２を生成するために有用な請求項２２〜２７の何れか一項に記載した方法。
【請求項２９】
使用した菌株が二重突然変異（Ｇ８２８Ａ）（Ｃ６５８Ｔ）を示すｐａｐＭ遺伝子を含んでいる請求項２７に記載した方法。
【請求項３０】
使用した菌株が突然変異（Ｇ８２８Ａ）を示すｐａｐＭ遺伝子を含んでいる請求項２７に記載した方法。
【請求項３１】
使用した菌株が突然変異（Ｃ６５８Ｔ）を示すｐａｐＭ遺伝子を含んでいる請求項２７に記載した方法。
【請求項３２】
請求項５〜１１の何れか一項に記載した核酸を含んでいるＳ．プリスチナエスピラリスの突然変異菌株。
【請求項３３】
Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ２１７である、請求項３２に記載の菌株。
【請求項３４】
Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ１０１である、請求項３２に記載の菌株。
【請求項３５】
Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ２１８である、請求項３２に記載の菌株。
【請求項３６】
ＰＩＢを生成するための菌株Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ２１７の使用。
【請求項３７】
ＰＩＢを生成するための菌株Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ１０１の使用。
【請求項３８】
ＰＩＢを生成するための菌株Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ２１８の使用。
【請求項３９】
ＰＩＮＨ２を生成するための菌株Ｓ．プリスチナエスピラリスＳＰ２１６の使用。
【請求項４０】
以下の工程：
(ａ) Ｓ．プリスチナエスピラリスのｐａｐＭ遺伝子又はプラスミドにクローン化した相同遺伝子に対して化学的突然変異誘導を行う工程、
(ｂ) 工程(ａ)で行った突然変異誘導を受けたプラスミドで受容菌株を形質転換することによりライブラリーを調製する工程、
(ｃ) 時間単位当たり変換されるメチル化基質の量の比率「ｒ」が、ｒ＝基質１／（基質１＋基質２）で表され、０.６より大きいか又はそれに等しい比率を示すメチル化活性を示すクローンを選択する工程、
から成る請求項１〜４の何れか一項に記載したＰａｐＭポリペプチド変異体を選択するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００６−５０６０４８（Ｐ２００６−５０６０４８Ａ）
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５１６８５３（Ｐ２００４−５１６８５３）
【出願日】平成１５年６月２３日（２００３．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／００１９２６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００３０１２
【国際公開日】平成１６年１月８日（２００４．１．８）
【出願人】（５９８００６２２２）アベンティス・ファーマ・ソシエテ・アノニム (30)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年６月２３日（２００３．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／００１９２６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００３０１２
【国際公開日】平成１６年１月８日（２００４．１．８）
【出願人】（５９８００６２２２）アベンティス・ファーマ・ソシエテ・アノニム (30)
【Ｆターム（参考）】
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