ターゲティング組成物及びその製造方法
本発明は、癌標的療法と腫瘍の画像化に関し、特に、小さなマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性ペプチドの新規誘導体に関する。この新規な誘導体とは、親水性ペプチドGRENYHGCTTHWGFTLCとその誘導体である。このペプチドの溶解性は増加しており、適切なリンカー分子、例えばＰＥＧ、と共にターゲティング組成物を製造するのに用いることができる。このようなターゲティング組成物は、癌の治療と診断のための治療用及び画像化用リポソーム組成物に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌標的療法と腫瘍の画像化に関し、特に、小さなマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性ペプチドの新規誘導体に関する。得られたペプチド誘導体は改良された特性を有し、適切なリンカー分子と共にターゲティング組成物を製造するのに用いることができる。このようなターゲティング組成物は、癌の治療と診断のための治療用及び画像化用リポソーム組成物に有用である。
【背景技術】
【０００２】
化学療法においては、薬物の一部のみが癌細胞に到達し、残りの薬物は正常な組織を損傷する可能性がある。副作用は、リポソームに封入した癌治療剤を投与することで低減することができる（Lasic et al., 1995）。安定性と循環器中での寿命を延ばすように改良したリポソーム組成物について報告されている（Tardi et al., 1996）。このような組成物の中では、モノメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合化したリン脂質が広く使用されているが、これは１９８４年にシアーズ（Sears）がアミド結合を介してカルボキシＰＥＧと精製大豆ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とのカップリングに成功して以来のことである（Sears, 1984）。リポソーム表面に付加したＰＥＧはリポソームの周りに水層を引き寄せる。この水層は種々の血漿タンパク質（オプソニン）がリポソーム表面に吸着されるのを防ぐので、リポソームが網内系によって認識されて取り込まれることはない。標的細胞の細胞膜抗原を認識する特異的な抗体や小さなペプチドをリポソーム表面に結合して、標的細胞によるリポソームの取り込みを増加することで選択性を向上することができる（Storm and Crommelin, 1998；Dagar et al., 2001；Penate Medina et al., 2001）。
【０００３】
マトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）は、基底膜と細胞外マトリックスを分解することができる酵素のファミリーを構成する。ＭＭＰはサブグループに分類することができ、その１つは、IV型コラゲナーゼ又はゲラチナーゼであるＭＭＰ−２とＭＭＰ−９からなる。ゲラチナーゼや他のＭＭＰの増加した又は未制御の発現は、腫瘍の血管新生と転移、慢性関節リウマチ、多発性硬化症及び歯周炎などの種々の疾患の発病の一因となり得る。このＭＭＰサブグループに対する選択的阻害剤を開発するためにランダムなファージペプチドライブラリーのスクリーニングを行った。誘導した中で最も活性の高いペプチド（ＣＴＴと称する）は、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性を選択的に阻害することが判明した（Koivunen et al., 1999）。腫瘍の異種移植片を有するマウスの実験は、ＣＴＴを提示したファージを静脈注射すると、レシピエントマウスの腫瘍血管系にファージが蓄積されることを示した。ファージの腫瘍へのターゲティングは、ＣＴＴペプチドの共投与によって阻害された（Koivunen et al., 1999）。ＭＭＰ−２（Toth et al., 1997）とＭＭＰ−９（Brooks et al., 1996）が共に特異的細胞表面受容体と結合することは、これら酵素が、腫瘍細胞や血管新生内皮細胞などの侵襲性細胞に対するリポソームターゲティングのための潜在的な受容体であることを示す。ＣＴＴペプチドをリポソームと混合することで、腫瘍ターゲティングを向上し、取り込みを増加することができる（Penate Medina et al., 2001）。
【０００４】
ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングは、標的に結合するペプチドの迅速な同定を可能にする。しかし、多くの場合、ファージ配列の機能分析とファージ配列を可溶性で安定なペプチドの形で再現することが、スクリーニングにおいて最も時間のかかる部分である。インテインを用いた方法（intein-directed methodology）をファージディスプレイで得られたペプチドの合成と設計に使用することができる（Bjorklund et al., 2003）。この技術を用いてペプチド誘導体のライブラリーを作製した。新規なＣＴＴペプチド誘導体（ＣＴＴ２＝ GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)-NH2）が同定された。このペプチドは生理的溶液における溶解性が向上しており、生物学的に活性である。
【０００５】
発明の概要
本明細書において、癌の治療及び腫瘍の画像化（イメージング；imaging）に用いることのできるＣＴＴ２ペプチドの種々の誘導体、並びに上記誘導体の製造方法について開示する。ＣＴＴ２ペプチドとその誘導体は、適切なリンカー分子、特に合成脂質、に共有結合することができる。ペプチド／脂質組成物は特異的な方法で精製する。この組成物は水溶液中でミセルを構成し、リポソームに導入することができる。使用するペプチドが標的特性を有するので、本発明は、医薬品及び画像化剤（imaging agent）となる色々な種類のリポソーム製剤のための新規で多目的なターゲティングツールを創出する。このターゲティングツールの使用で薬物製剤の生体内分布プロファイルと治療効果が向上することが明らかとなっている。ペプチド／脂質組成物そのものも、in vivoにおける腫瘍画像化機能を有する。ＣＴＴ２ペプチドの他の誘導体は、ペプチドの溶解性と腫瘍の画像化における有用性を向上させるために作製した。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、癌治療及び腫瘍の画像化に用いることのできる親水性ペプチドとその誘導体、並びにこれらペプチドを合成するための方法を開示する。本発明の最も好ましい態様においては、ペプチドはアミノ酸配列 GRENYHGCTTHWGFTLC（配列番号１）を有する環状ＣＴＴ２ペプチドであり、このペプチドを医薬品及び画像化剤となるリポソーム製剤のための効率的なターゲティングツールとして使用する。初めにペプチド（ＣＴＴ２）を、ＰＥＧリン脂質（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）のポリエチレングリコール鎖の末端基に共有結合（カップリング）する。水溶液中でミセルを形成するＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ懸濁液を、事前に作成しておいた、医薬又は画像化剤を内包するリポソームに組み込む。ＣＴＴ２ペプチドとその誘導体は標的特性を有するので、本発明では、医薬品及び画像化剤となる色々な種類のリポソーム製剤のための新規で多目的なターゲティングツールを創出する。このターゲティングツールの使用で薬物製剤の生体内分布プロファイルと治療効果が向上することが明らかとなっている。カップリング工程と組み込み工程とを分けることによってこのシステムはより汎用になる。従来のリポソーム作製工程がペプチドとそのＰＥＧリン脂質への結合に与えていた物理的負荷を防ぐことができる。本発明は、向上した溶解性と腫瘍画像化へのより高い適合性を示すＣＴＴ２ペプチドの誘導体も開示する。
【０００７】
原則的に、適切な標的能を有する限りいかなるペプチドも、いかなる組成物と共にリポソームに結合してもよく、リポソームは、いかなる物質を内包していてもかまわない。そのためリポソームは、医薬又は化学療法薬として、例えばドキソルビシン、シスプラチン又はパクリタキセル、を内包することができる。リポソームは、更に画像化剤も内包することができる。ペプチドは適切なナノ粒子にも結合することができる。
【０００８】
適切な標的能を有する有用なペプチドとしては、例えば、国際公開公報ＷＯ９９／４７５５０とＷＯ０２／０７２６１８に記載のマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性ペプチドが挙げられる。
【０００９】
具体的には、アミド化したＣＴＴ２ペプチド（即ち、GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)-NH2）と、本願に記載するその新規な誘導体（即ち、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2）が、ターゲティング組成物の作成に特に適している。
【００１０】
従って、本発明の総体的な目的は、適切な脂質に結合した、腫瘍標的能を有するペプチド、好ましくは上述したペプチドの１つ、を含むターゲティング組成物を提供することである。得られる組成物は、種々の医療用途及び診断用途においてリポソームを所望の標的に向かわせるためのターゲティング分子（targeting moiety）として使用することができる。腫瘍標的能を有するこのようなターゲティング組成物の製造方法は、親水性ペプチドをポリエチレングリコールの合成誘導体に共有結合することを包含する。
【００１１】
本発明の更なる目的は、環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体をポリエチレングリコールの合成誘導体に共有結合することによって得られたターゲティング組成物の精製方法を提供することである。この精製方法においては、得られたペプチド−脂質混合物を有機溶媒と共にインキュベートして沈殿物を得、得られた沈殿物を遠心分離に付し、有機溶媒で洗浄し、再度遠心分離に付すことでペレットを得、得られたペレットを適切な緩衝液に懸濁し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーを行って精製されたターゲティング組成物を得る。
【００１２】
本発明の更なる目的は、少なくとも一種の化学療法薬又は画像化剤を内包するリポソームを得、小さなマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性ペプチドをポリエチレングリコールの合成誘導体に共有結合させて、腫瘍標的能を有するターゲティング組成物を製造し、そして該リポソームと該ターゲティング組成物を組み合わせて懸濁液を形成することを包含する、治療用又は画像化用リポソーム組成物の製造方法を提供することである。
【００１３】
本発明の更なる目的は、少なくとも一種の化学療法薬を内包するリポソームを得、小さなマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性ペプチドの誘導体とポリエチレングリコールの合成誘導体を含むターゲティング組成物を得、該リポソームと該ターゲティング組成物を組み合わせて懸濁液を形成し、そして得られた懸濁液を患者に投与することを包含する、患者の癌を治療する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の更なる目的は、小さなマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性ペプチドの誘導体とポリエチレングリコールの合成誘導体を含むターゲティング組成物、及び少なくとも一種の画像化剤を内包するリポソームを包含する、診断用又は画像化用組成物あるいはこのような組成物を包含する診断試験キットを提供することである。
【００１５】
略語：
ＡＵＣ 曲線下面積
ＣＭＣ 臨界ミセル濃度
ＣＴＴ２ アミド化環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド
ＤＭＦ ジメチルフォルムアミド
ＤＯＴＡ 1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸
DoxilR/CaelyxR 市販の注射用塩酸ドキソルビシンリポソーム組成物
（Johnson & Johnson/Schering Plough Corporation
の子会社であるOrtho Biotech社製）
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ 1, 2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノール
アミン-n-[ポリ(エチレングリコール)]-N-ヒドロキシ
サクシナミジルカーボネート
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＭＭＰ マトリックスメタロプロティナーゼ
ＰＥＧ ポリ（エチレングリコール）
ＲＴ 室温
ＳＬ ステルスリポソーム
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
【実施例】
【００１６】
ペプチドのカップリング
この工程においては、ペプチドの末端アミンと、ＰＥＧリン脂質のポリ（エチレングリコール）ポリマー鎖の末端に存在する官能基であるＮＨＳ（ヒドロキシサクシニミジル）との化学反応によって、ＣＴＴ２ペプチドをＰＥＧリン脂質に共有結合させた。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性サクシニミジルエステルとの反応は安定なアミド結合を生じた。カップリング反応を最適化するために、反応時間と温度のみならず、ペプチドとＰＥＧリン脂質の種々のモル比を試験した。
【００１７】
ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）（BDH Laboratory Supplies製）のｐＨを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Merck製）で８．０に調整した。４ｍｇの合成アミド化GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２）(Neosystem S. A.製）と８．６ｍｇの1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-フォスフォエタノールアミン-n-[ポリ(エチレングリコール)3400]-N-ヒドロキシサクシナミジルカーボネート（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ ３４００）（Nektar Corporation製）を１ｍｌのＤＭＦ（ｐＨ８．０）に溶解した。得られた混合物（モル比は１：１）を＋３７℃、振とう下で２時間インキュベートした。
【００１８】
精製
生成物を精製するために２段階の精製方法を用いた。初めに、ジメチルエーテルを用いてＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥとＣＴＴ２を反応混合物から抽出した（図１）。次に、ＨＰＬＣゲルろ過法でＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥをＣＴＴ２から分離した（図２）。
【００１９】
反応混合物（１ｍｌ）を５ｍｌのジエチルエーテルと共に−２０℃で１時間インキュベートした。これを、事前に＋４℃まで冷却しておいた遠心分離機の中で１３，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離に付した。得られたペレットを５ｍｌの冷たいジメチルエーテルに再懸濁し、再び遠心分離に付した。得られたペレットは１時間凍結乾燥した。
【００２０】
ＨＰＬＣの移動相である、５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液に０．１％ＴＦＡを加えたもの（ｐＨ４．５）１００μｌにペレットを溶解した。５０μｌのサンプルを１回ごとに注入した。１ｍｌ／分の均一濃度溶離を、Superdex 75 10/300 GLゲルろ過カラム（Amersham製、１．５ｍｌ）を用いたＡＫＴＡピューリファイヤー１０（AKTA Purifier 10）(Amersham製）でカラム容積の１．５倍まで行った。検出波長は２２１ｎｍで、付加的な情報を得るために２３０ｎｍと２８０ｎｍでも検出した。生成物を含む画分を凍結乾燥し、次いで４００μｌの水に再懸濁し、再び凍結乾燥することで酢酸アンモニウムを除去した。
【００２１】
生成物の量は、後述するルーセル（Rousell）アッセイの変法によって求めた。生成物の純度と正体を確認するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を用いた（図３Ａ、図３Ｂと図３Ｃ）。ＣＴＴ２ペプチドの環状構造の健全性は、後述するエルマン試験（Ellman's test）によって裏付けた。長期保存のためには、凍結乾燥標品を−２０℃の乾燥した環境下で保存した。
【００２２】
カップリング効率の測定
生成したＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥはそれぞれ１分子のリン脂質ＤＳＰＥを含有する。従って、リン脂質ＤＳＰＥの濃度を測定することで、生成物の濃度を求めることができる。リン脂質濃度は、ルーセル（Rousell）アッセイの変法（Bottcher et al., 1961）によって求めた。
【００２３】
１０μｌの生成物を０．２ｍｌの過塩素酸の入ったガラス管に加え、１８０℃〜１９０℃で３０分間加熱した。標準リン酸系列を作製するために、０．２ｍｌの過塩素酸の入ったガラス管を８本用意し、０．４ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4溶液を０μｌ、１０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、１５０μｌ又は２００μｌ加えた。サンプルを加熱し冷ました後に、２ｍｌのモリブデン試薬（３．５ｍＭの（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24と１％のＨ2ＳＯ4）をサンプルの入ったガラス管と標準リン酸系列の入ったガラス管に加えた。０．２５ｍｌのアスコルビン酸も各ガラス管に加えた。ガラス管を沸騰水中で５分間インキュベートした後に冷ました。吸光度を８１２ｎｍで測定した。標準リン酸溶液の吸光度を用いて直線回帰関数を作製し、この関数を用いてサンプルの濃度を計算した。
【００２４】
生成物の量と出発材料の量とを比較することで、カップリング反応の収率を計算できる。平均してカップリング収率は約１５％であった。従って、１ｍｇのＣＴＴ２ペプチドと２．０５ｍｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳを出発材料とすると、約０．５ｍｇのＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥが製造できる。
【００２５】
エルマン試験
従来このアッセイは、１つのシステイン残基が存在するペプチド（３〜２６量体）について用いられていたが、複数のシステイン残基が存在するペプチドにも使用可能である。ＤＮＴＢと呼ばれる５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）を用いて溶液中の遊離スルフヒドリル基を定量することができる。この化合物の溶液は、遊離スルフヒドリル基と反応してジスルフィドと２−ニトロ−５−チオ安息香酸（ＴＮＢ）の混合物を生成する際に、定量可能な黄色い生成物を生じる。スルフヒドリル基は、ＤＮＴＢの消散係数に参照して定量することができる。環状ペプチドでは、システインがＳ−Ｓ結合を介して結合しているのでスルフヒドリル基は存在しない。環状ペプチドを還元すれば、スルフヒドリル基をエルマン試験によって定量することができる。この試験は、環状ペプチドが活性型であることを確認するために用いることができる。
【００２６】
エルマン試薬を製造者（Pierce社）の指示書に従って用い、試験を実施した。試験結果は、４１２ｎｍでの分光分析によって測定した。得られた値が０．０２０よりも大きい場合、ペプチドは活性を失っている。それ以外の場合は、ペプチドの環状構造は維持されている。カップリング工程はＣＴＴ２ペプチドの環状構造を乱すことはないことが示された。しかしこの試験は、結合ペプチドの新しいバッチを製造する度に、その品質を確認するために実施すべきである。
【００２７】
ＣＴＴ２被覆リポソーム性ドキソルビシン
ある種の脂質をリポソームと共にインキュベートすると、脂質がリポソームに組み込まれることが示されている（Kanda et al., 1982）。正確なメカニズムは未だ分っていない。この現象は、脂質濃度が臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超えている場合には水溶液中で自動的にミセルが形成され、そのミセルがリポソームに融合することによって生じるか、あるいは、ミセルとリポソームの間でリン脂質の交換が起こることによって生じると考えられる。一例として、事前に作製したリポソーム性ドキソルビシンをＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセルに組み込むことで、ＣＴＴ２ペプチドで被覆したリポソーム性ドキソルビシンを調製した。実験では、市販の注射用リポソーム性ドキソルビシン組成物（DoxilR/CaelyxR）と、発明者らの実験室で調製したリポソーム性ドキソルビシン（データは示さない）を使用した。更に、ＣＴＴ２ペプチド被覆DoxilR/CaelyxRの生体内分布プロファイルと治療効果の向上を実証した。
【００２８】
ＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxR
１ｍｇのＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを４００μｌの緩衝液（１００ｍＭヒスチジン、５５ｍＭショ糖、ｐＨ６．５）に懸濁した。１ｍｌのDoxilR/CaelyxR溶液（Ortho Biotech製）に１００μｌのＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセル懸濁液を加えた。この混合物を＋６０℃で３０分間インキュベートした。この懸濁液は、マウスやヒトに直ちに注射することができる。懸濁液は、＋４℃で最低３週間は保存可能である。
【００２９】
組み込み効率は放射性同位元素で標識したペプチドと、リポソームから未反応のミセルを分離するためのゲルろ過を用いて測定することができる。組み込み効率は、全活性に対するリポソーム画分中の活性のパーセントとして表すことができる。種々のインキュベーション時間と温度について試験したところ、＋６０℃で３０分のインキュベーションが至適反応条件であることが分った。この条件下での組み込み効率は１００％に近かった。リポソームの平均サイズと平均表面積に基づいて、リポソームあたりのＣＴＴ２ペプチド量を求めることができる。上述した反応条件では、１つのリポソームあたり約５００個のＣＴＴ２分子が存在する。従って、この量のＣＴＴ２ペプチドが結合すると、リポソームに十分に高い標的活性が付与される。
【００３０】
実験前と実験後の遊離ドキソルビシン量を比較することで、種々の反応時間や温度における組み込み実験後のリポソームからのドキソルビシンの漏れについて測定した。漏れは最小値（組み込む前の遊離ドキソルビシンが平均４．５％で、反応後が平均４．２％）であった。
【００３１】
ＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxRに関するin vivoの研究
ＣＴＴ２ペプチドの標的能を示すために、ＣＴＴ２被覆を施したDoxilR/CaelyxRと未被覆のものを注射した際の生体内分布プロファイルと治療効果を比較した。放射性同位元素で標識したＣＴＴ２ペプチドを用いた生体内分布研究を、初めに種々のヒト腫瘍の異種移植片を有するマウスで行った。このペプチドは、卵巣癌異種移植片に最も多く蓄積されていた。従って、Ａ２７８０卵巣癌モデルマウスを、続く生体内分布および治療に関する研究のために選んだ。
【００３２】
生体内分布研究
Ａ２７８０卵巣癌細胞を、１０％ウシ胎児血清（Biowhittaker製）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Biowhittaker製）で培養した。細胞を回収した後に、５．０×１０6個の細胞を５〜６週齢の雌のＮＭＲＩヌードマウスの後部脇腹に皮下注射した。腫瘍の大きさが直径約１０ｍｍになった時点で生体内分布研究を実施した。Ａ２７８０卵巣癌を有するマウスに、１ｋｇ当たりのドキソルビシン投与量が９ｍｇとなるようにリポソーム性ドキソルビシンを尾静脈に注射した。血液、心臓、肝臓、肺、筋肉、脳、脾臓及び腫瘍のサンプルを採取するために、マウスは注射後２時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間に屠殺した。血液は、血漿を得るために＋４℃、５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。組織は液体窒素中で凍結し、暗黒条件下で２日間凍結乾燥した。乾燥組織の重量を測定し、終濃度が２０ｍｇ／ｍｌとなるように酸アルコール（０．３ＭのＨＣｌを含む５０％のＥｔＯＨ）で抽出した。組織ホモジェネートを＋４℃、１３，０００×ｇで１０分の遠心分離に付した。残渣を取り除いた血漿と残渣を取り除いた細胞抽出液について、ドキソルビシンの蛍光を分光光度計（Varian製）で測定した。４７０ｎｍの励起波長を用いて５９０ｎｍにおける蛍光強度を観測し、既知量のドキソルビシを含有する、同様に処理した標準サンプルと比較することでドキソルビシンの蛍光を分析した。
【００３３】
９６時間で腫瘍に蓄積されるＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxR（ＣＴＴ−ＳＬ）のＡＵＣは、DoxilR/CaelyxR（ＳＬ）のＡＵＣよりも４６．２％高かった（図４）。これは、ＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxRにおいて腫瘍標的能が顕著に増加していることを示す。
【００３４】
異種移植マウスにおける治療効果
Ａ２７８０細胞を５０匹の雌のＮＭＲＩヌードマウスの後部脇腹に皮下注射した。マウスは無作為に５つの処置群に分けた。生存率に対する種々の治療の影響を調べるために、腫瘍の直径が５ｍｍ（６５ｍｍ3）になったら薬剤による処置を行った。この実験では、３日間隔で１ｋｇあたり９ｍｇのリポソーム性ドキソルビシン又は遊離ドキソルビシンを各マウスに３回注射した。ＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxR（ＣＴＴ−ＳＬ）、DoxilR/CaelyxR（ＳＬ）及び遊離製剤のいずれにおいてもドキソルビシン濃度は２ｍｇ／ｍｌなので、注射した容量は１２０〜１５０μｌの範囲で異なっていた。
【００３５】
処置を開始した後、マウスの体重と腫瘍の大きさを週２回測定した。腫瘍の大きさが１０００ｍｍ3を超えたら、マウスを屠殺した。
【００３６】
処置を開始してから５週間後には、緩衝液で処置した群とＣＴＴ２ミセル又は遊離ドキソルビシンで処理した群の全てのマウスが屠殺されており、DoxilR/CaelyxR処置マウスはたった３３％のみが生存していた。しかし、この時、ＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxR処置マウスの７５％が生存していた（図５）。平均生存時間は、ＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxR処置群では３８．６日であり、DoxilR/CaelyxR処置群では２７．９日だった。
【００３７】
ＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの生体内分布
ＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを上述のように製造した。ＣＴＴ２−ＰＥＧ３４００−ＤＳＰＥ分子の癌異種移植モデルにおける組織分布を研究するために、１０匹の免疫不全マウスにヒト卵巣癌細胞（ＯＶ−９０）を植え付けた。腫瘍異種移植片が完全に形成した時（異種移植から約３週間後）に、ヨウ素標識ＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（２００μｇ；〜１ＭＢｑ）を含む２００μｌのＰＢＳをマウスの尾静脈に注射して生体内分布研究を実施した。注射後６時間と２４時間にマウスを屠殺し、その血液と組織を解剖により採取し、ガンマ線を計測した。検討した両方の時点において、最も高い放射能の蓄積が腫瘍異種移植片に見られた（腫瘍／筋肉比：４３）（図６）。
【００３８】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体
ＣＴＴ２は、２つの特徴的な構造からなる部位を有すると見ることができる。ペプチドの環状（-CTTHWGFTLC) 部位は、ペプチドの直鎖状 GRENYHG- 部位より疎水性である。ＣＴＴ２ペプチドと何らかの分子構造との結合点（Ｎ末端 対 Ｃ末端）は、複合体の溶解性と生物活性に影響しているかもしれない。複合体の溶解性と生物活性を向上させるために、２つの異なるペプチド誘導体（表１のペプチド１とペプチド４）を合成した。
【００３９】
上記ペプチドは、in vivoの生理学的な状態や過程の画像化に用いることができる。ＣＴＴ２ペプチドは放射性ヨウ素で直接標識することができる。より高度な放射性画像化試薬、例えば、111Ｉｎや99mＴｃは、元のペプチドと複合化したキレーター分子を必要とする。ＣＴＴ２ペプチドのＤＯＴＡ誘導体（表１のペプチド２、ペプチド３とペプチド５）を合成し、その１つ（表１のペプチド３）を非放射性インジウムで標識した。ペプチド−ＤＯＴＡ複合体（表１のペプチド２とペプチド５）は、診断に用いる放射性同位元素（111Ｉｎ）や治療に用いる放射性同位元素（177Ｌｕ、90Ｙ）で標識することができる。
【００４０】
天然に存在しないアミノ酸であるフルオロトリプトファンを合成の際に導入することによって、２つのＣＴＴ２−ペプチド誘導体、即ち、６Ｆ−Trp ＣＴＴ２と５Ｆ−Trp ＣＴＴ２（表１のペプチド６とペプチド７）を得た。６Ｆ−Trp ＣＴＴ２は野生型ペプチドと比べて、血清安定性の増加と腫瘍に対する細胞遊走阻害能の向上を示した（「６Ｆ−Trp ＣＴＴ２ペプチドの生体内分布」の項を参照）。５−ＯＨ−Trp誘導体も調製した（表１のペプチド８）。
【００４１】
Applied Biosystems（カリフォルニア州、フォスターシティー）製のモデル４３３Ａでペプチドを合成した。合成には公知のＦｍｏｃ−化学（Koivunen et al., 1999）を用いたが、ジスルフィド結合の形成は過酸化水素を用いて行った。
【００４２】
簡単に説明すると、ペプチドを５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７．５）に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、１００ｍｇのペプチドに対して０．５ｍｌの３％過酸化水素を加えた。３０分間インキュベートした後、ｐＨを３．０に調製し、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル直線勾配（３０分間で０％〜７０％）を用いた逆相ＨＰＬＣで、環化したペプチドを精製した。
【００４３】
ＤＯＴＡ誘導ペプチドのインジウム標識： １．２ｍｇのK(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)を１００μｌの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した。ＩｎＣｌ3を酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した。２モル等量のＩｎＣｌ3溶液をペプチド溶液に加えた。反応混合物はＲＴで一晩放置した。インジウム標識ペプチドは、酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．５）とアセトニトリル溶液の混合液（５０％／５０％）を用いた逆相Ｃ−１８カートリッジで精製した。溶出液を凍結した後に凍結乾燥し、白い固体状のインジウム標識ペプチドを得た。インジウム標識ペプチドはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで同定した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
６Ｆ−Trp ＣＴＴ２ペプチドの生体内分布
６Ｆ−Trp ＣＴＴ２ペプチドを生体内分布の研究に用い、その動態と腫瘍標的特性を評価した。研究は、形成したヒト卵巣癌腫（ＯＶ−９０）を有するマウスで行った。６Ｆ−Trp ＣＴＴ２ペプチドをヨウ素−１２５で標識した。４０μｇの精製した標識ペプチド（〜１ＭＢｑ）をマウスの尾静脈に注射した。ペプチド注射から３０分後と１８０分後にマウスを屠殺し、血液と組織のサンプルを採取した。蓄積された放射能をガンマ線計測器で測定した。その結果、腫瘍組織に著しい放射能の蓄積が見られ、３０分後と１８０分後の放射能蓄積における腫瘍／筋肉比はそれぞれ１４．９と２３．３であった。一方、その他の全ての組織では、放射能の蓄積量は無視できる値であり、クリアランスは血液と同等であった（図８）。非天然のアミノ酸をペプチド合成に使用することが可能なので、腫瘍のターゲティングのための活性が高くより安定なペプチドを提供できるであろう。
【００４６】
参考文献
Bjorklund, M., Valtanen, H., Savilahti, H., and Koivunen, E. Use of intein-directed peptide biosynthesis to improve serum stability and bioactivity of a gelatinase inhibitory peptide. Comb Chem High Throughput Screen 6: 29-35, 2003.
Brooks, P., Stromblad, S., Sanders, L., von Schalscha, T., Aimes, R., Stetler-Stevenson, W., Quigley, J., and Cheresh, D. Localization of matrix metalloproteinase MMP-2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin αvβ3 Cell 85 : 683-693, 1996.
Bottcher, C.J.F., Van Gent, C. M., Pries, C. Anal. Chim. Acta 24: 203-204, 1961.
Dagar, S., Sekosan, M., Lee, B., Rubinstein, l., and Onyuksel, H. VIP receptors as molecular targets of breast cancer: implications for targeted imaging and drug delivery. Journal of Controlled Release 74: 129-134, 2001.
Kanda, S., Inoue, K., Nojima, S., Utsumi, H., and Wiegandt, H. Incorporation of ganglioside and spin-labelled ganglioside analogue into cell and liposome membranes. J. Biochem. 91: 2095-2098, 1982.
Koivunen, E., Arap, W., Valtanen, H., Raininsalo, A., Penate Medina, O., Heikkika, P., Kantor, C., Gahmberg, C., Salo, T., Konttinen, Y., Sorsa, T., Ruoslahti, E. and Pasqualini, R. Cancer therapy with a novel tumour-targeting gelatinase inhibitor selected by phage peptide display. Nature Biotechnol. 17: 768-774, 1999.
Lasic, D., Ceh, B., Stuart, M., Guo, L., Frederik, P., and Barenholz, Y. Transmembrane gradient driven phase transitions within vesicles: lessons for drug delivery. Biochim. Biophys. Acta 1239: 145-156, 1995
Penate Medina, O., Soderlund, T., Laakkonen, L., Tuominen, E., Koivunen, E., and Kinnunen, P. Binding of novel peptide inhibitors of type IV collagenases to phospholipid membranes and use in liposome targeting to tumour cells in vitro. Cancer Res. 61: 2978-2985, 2001.
Sears, B. D. (1984). Synthetic Phospholipid Compounds. US Patent 4,426,330.
Storm, G., and Crommelin, D. Liposomes: quo vadis? Pharm. Sci. & Tech. Today 1: 19-31, 1998.
Tardi, P., Boman, N., and Cullis, P. Liposomal doxorubicin. J. Drug Target. 4: 129-140, 1996.
Toth, M., Gervasi, D., and Fridman, R. Phorbol ester-induced cell surface association of matrix metalloproteinase-9 in human MCFIOA breast epithelial cells. Cancer Res. 57: 3159-3167, 1997.
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】カップリング反応の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析。レーン１，対照ＣＴＴ２ペプチド；レーン２，対照ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ；レーン５，ジエチルエーテル処理後の上清；レーン８，ジエチルエーテル処理後のペレット懸濁液。
【図２】ＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ化合物をＣＴＴ２ペプチドから分離するためのＨＰＬＣゲルろ過の結果。グラフ中の第一のピークが生成物であるＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含み、グラフ中の最後のピークがＣＴＴ２ペプチドを含んでいる。
【図３ａ】ＣＴＴ２ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析。
【図３ｂ】ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析。
【図３ｃ】ＨＰＬＣで精製した後のＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析。
【図４】卵巣癌異種移植マウスにおける、ＣＴＴ２−被覆DoxilR/CaelyxRとDoxilR/CaelyxRの９６時間にわたる腫瘍内蓄積。
【図５】種々の薬物／リポソーム製剤による処置を行った後の、腫瘍を有するマウスの生存率。
【図６】Ｉ−１２５−ＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの生体内分布研究。後部背面にヒト卵巣癌を有するＮＭＲＩ／ヌードマウスにおける、125Ｉ標識ミセルのin vivo 生体内分布を２つの時点で計測した。結果は組織１ｇあたりの注射量に対するパーセント（％ＩＤ／１ｇ）で表した。全ての結果を、５匹のマウスの平均±ＳＤで示した。
【図７ａ】アミド化ＣＴＴ２ペプチドの分子構造。
【図７ｂ】ＣＴＴ２ペプチドのＧ→Ｋ誘導体の分子構造。
【図７ｃ】ＣＴＴ２ペプチドのＧ→Ｋ（ＤＯＴＡ）誘導体の分子構造。
【図７ｄ】インジウム標識Ｇ→Ｋ（ＤＯＴＡ）−ＣＴＴ２ペプチドの分子構造。
【図７ｅ】Ａｃ−ＣＴＴ２−Ｋ−ＮＨ2ペプチドの分子構造。
【図７ｆ】Ａｃ−ＣＴＴ２−Ｋ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ2ペプチドの分子構造。
【図７ｇ】ＣＴＴ２ペプチドの６Ｆ−Trp誘導体の分子構造。
【図７ｈ】ＣＴＴ２ペプチドの５Ｆ−Trp誘導体の分子構造。
【図７ｉ】ＣＴＴ２ペプチドの５−ＯＨ−Trp誘導体の分子構造。
【図８】Ｉ−１２５標識６Ｆ−Trp ＣＴＴ２（GRENYHGCTTH[6-フルオロ]WGFTLC）ペプチドの生体内分布研究。後部背面にヒト卵巣癌を有するＮＭＲＩ／ヌードマウスにおける、125Ｉ標識ペプチドの in vivo 生体内分布を２つの時点で計測した。結果は組織１ｇあたりの注射量に対するパーセント（％ＩＤ／１ｇ）で表した。全ての結果を、５匹のマウスの平均±ＳＤで示した。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列番号１： ＣＴＴ２ペプチド
配列番号２： ＣＴＴ２ペプチドのLys置換体
配列番号３： ＣＴＴ２ペプチドのLys付加体
配列番号４： １２位にトリプトファン類似体を有するＣＴＴ２ペプチド
１２位のXaaは５−ＯＨ−Trp、５−Ｆ−Trp又は６−Ｆ−Trpである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌標的療法と腫瘍の画像化に関し、特に、小さなマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性ペプチドの新規誘導体に関する。得られたペプチド誘導体は改良された特性を有し、適切なリンカー分子と共にターゲティング組成物を製造するのに用いることができる。このようなターゲティング組成物は、癌の治療と診断のための治療用及び画像化用リポソーム組成物に有用である。
【背景技術】
【０００２】
化学療法においては、薬物の一部のみが癌細胞に到達し、残りの薬物は正常な組織を損傷する可能性がある。副作用は、リポソームに封入した癌治療剤を投与することで低減することができる（Lasic et al., 1995）。安定性と循環器中での寿命を延ばすように改良したリポソーム組成物について報告されている（Tardi et al., 1996）。このような組成物の中では、モノメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合化したリン脂質が広く使用されているが、これは１９８４年にシアーズ（Sears）がアミド結合を介してカルボキシＰＥＧと精製大豆ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とのカップリングに成功して以来のことである（Sears, 1984）。リポソーム表面に付加したＰＥＧはリポソームの周りに水層を引き寄せる。この水層は種々の血漿タンパク質（オプソニン）がリポソーム表面に吸着されるのを防ぐので、リポソームが網内系によって認識されて取り込まれることはない。標的細胞の細胞膜抗原を認識する特異的な抗体や小さなペプチドをリポソーム表面に結合して、標的細胞によるリポソームの取り込みを増加することで選択性を向上することができる（Storm and Crommelin, 1998；Dagar et al., 2001；Penate Medina et al., 2001）。
【０００３】
マトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）は、基底膜と細胞外マトリックスを分解することができる酵素のファミリーを構成する。ＭＭＰはサブグループに分類することができ、その１つは、IV型コラゲナーゼ又はゲラチナーゼであるＭＭＰ−２とＭＭＰ−９からなる。ゲラチナーゼや他のＭＭＰの増加した又は未制御の発現は、腫瘍の血管新生と転移、慢性関節リウマチ、多発性硬化症及び歯周炎などの種々の疾患の発病の一因となり得る。このＭＭＰサブグループに対する選択的阻害剤を開発するためにランダムなファージペプチドライブラリーのスクリーニングを行った。誘導した中で最も活性の高いペプチド（ＣＴＴと称する）は、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の活性を選択的に阻害することが判明した（Koivunen et al., 1999）。腫瘍の異種移植片を有するマウスの実験は、ＣＴＴを提示したファージを静脈注射すると、レシピエントマウスの腫瘍血管系にファージが蓄積されることを示した。ファージの腫瘍へのターゲティングは、ＣＴＴペプチドの共投与によって阻害された（Koivunen et al., 1999）。ＭＭＰ−２（Toth et al., 1997）とＭＭＰ−９（Brooks et al., 1996）が共に特異的細胞表面受容体と結合することは、これら酵素が、腫瘍細胞や血管新生内皮細胞などの侵襲性細胞に対するリポソームターゲティングのための潜在的な受容体であることを示す。ＣＴＴペプチドをリポソームと混合することで、腫瘍ターゲティングを向上し、取り込みを増加することができる（Penate Medina et al., 2001）。
【０００４】
ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングは、標的に結合するペプチドの迅速な同定を可能にする。しかし、多くの場合、ファージ配列の機能分析とファージ配列を可溶性で安定なペプチドの形で再現することが、スクリーニングにおいて最も時間のかかる部分である。インテインを用いた方法（intein-directed methodology）をファージディスプレイで得られたペプチドの合成と設計に使用することができる（Bjorklund et al., 2003）。この技術を用いてペプチド誘導体のライブラリーを作製した。新規なＣＴＴペプチド誘導体（ＣＴＴ２＝ GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)-NH2）が同定された。このペプチドは生理的溶液における溶解性が向上しており、生物学的に活性である。
【０００５】
発明の概要
本明細書において、癌の治療及び腫瘍の画像化（イメージング；imaging）に用いることのできるＣＴＴ２ペプチドの種々の誘導体、並びに上記誘導体の製造方法について開示する。ＣＴＴ２ペプチドとその誘導体は、適切なリンカー分子、特に合成脂質、に共有結合することができる。ペプチド／脂質組成物は特異的な方法で精製する。この組成物は水溶液中でミセルを構成し、リポソームに導入することができる。使用するペプチドが標的特性を有するので、本発明は、医薬品及び画像化剤（imaging agent）となる色々な種類のリポソーム製剤のための新規で多目的なターゲティングツールを創出する。このターゲティングツールの使用で薬物製剤の生体内分布プロファイルと治療効果が向上することが明らかとなっている。ペプチド／脂質組成物そのものも、in vivoにおける腫瘍画像化機能を有する。ＣＴＴ２ペプチドの他の誘導体は、ペプチドの溶解性と腫瘍の画像化における有用性を向上させるために作製した。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、癌治療及び腫瘍の画像化に用いることのできる親水性ペプチドとその誘導体、並びにこれらペプチドを合成するための方法を開示する。本発明の最も好ましい態様においては、ペプチドはアミノ酸配列 GRENYHGCTTHWGFTLC（配列番号１）を有する環状ＣＴＴ２ペプチドであり、このペプチドを医薬品及び画像化剤となるリポソーム製剤のための効率的なターゲティングツールとして使用する。初めにペプチド（ＣＴＴ２）を、ＰＥＧリン脂質（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）のポリエチレングリコール鎖の末端基に共有結合（カップリング）する。水溶液中でミセルを形成するＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ懸濁液を、事前に作成しておいた、医薬又は画像化剤を内包するリポソームに組み込む。ＣＴＴ２ペプチドとその誘導体は標的特性を有するので、本発明では、医薬品及び画像化剤となる色々な種類のリポソーム製剤のための新規で多目的なターゲティングツールを創出する。このターゲティングツールの使用で薬物製剤の生体内分布プロファイルと治療効果が向上することが明らかとなっている。カップリング工程と組み込み工程とを分けることによってこのシステムはより汎用になる。従来のリポソーム作製工程がペプチドとそのＰＥＧリン脂質への結合に与えていた物理的負荷を防ぐことができる。本発明は、向上した溶解性と腫瘍画像化へのより高い適合性を示すＣＴＴ２ペプチドの誘導体も開示する。
【０００７】
原則的に、適切な標的能を有する限りいかなるペプチドも、いかなる組成物と共にリポソームに結合してもよく、リポソームは、いかなる物質を内包していてもかまわない。そのためリポソームは、医薬又は化学療法薬として、例えばドキソルビシン、シスプラチン又はパクリタキセル、を内包することができる。リポソームは、更に画像化剤も内包することができる。ペプチドは適切なナノ粒子にも結合することができる。
【０００８】
適切な標的能を有する有用なペプチドとしては、例えば、国際公開公報ＷＯ９９／４７５５０とＷＯ０２／０７２６１８に記載のマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性ペプチドが挙げられる。
【０００９】
具体的には、アミド化したＣＴＴ２ペプチド（即ち、GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)-NH2）と、本願に記載するその新規な誘導体（即ち、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2）が、ターゲティング組成物の作成に特に適している。
【００１０】
従って、本発明の総体的な目的は、適切な脂質に結合した、腫瘍標的能を有するペプチド、好ましくは上述したペプチドの１つ、を含むターゲティング組成物を提供することである。得られる組成物は、種々の医療用途及び診断用途においてリポソームを所望の標的に向かわせるためのターゲティング分子（targeting moiety）として使用することができる。腫瘍標的能を有するこのようなターゲティング組成物の製造方法は、親水性ペプチドをポリエチレングリコールの合成誘導体に共有結合することを包含する。
【００１１】
本発明の更なる目的は、環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体をポリエチレングリコールの合成誘導体に共有結合することによって得られたターゲティング組成物の精製方法を提供することである。この精製方法においては、得られたペプチド−脂質混合物を有機溶媒と共にインキュベートして沈殿物を得、得られた沈殿物を遠心分離に付し、有機溶媒で洗浄し、再度遠心分離に付すことでペレットを得、得られたペレットを適切な緩衝液に懸濁し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーを行って精製されたターゲティング組成物を得る。
【００１２】
本発明の更なる目的は、少なくとも一種の化学療法薬又は画像化剤を内包するリポソームを得、小さなマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性ペプチドをポリエチレングリコールの合成誘導体に共有結合させて、腫瘍標的能を有するターゲティング組成物を製造し、そして該リポソームと該ターゲティング組成物を組み合わせて懸濁液を形成することを包含する、治療用又は画像化用リポソーム組成物の製造方法を提供することである。
【００１３】
本発明の更なる目的は、少なくとも一種の化学療法薬を内包するリポソームを得、小さなマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性ペプチドの誘導体とポリエチレングリコールの合成誘導体を含むターゲティング組成物を得、該リポソームと該ターゲティング組成物を組み合わせて懸濁液を形成し、そして得られた懸濁液を患者に投与することを包含する、患者の癌を治療する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の更なる目的は、小さなマトリックスメタロプロティナーゼ阻害性ペプチドの誘導体とポリエチレングリコールの合成誘導体を含むターゲティング組成物、及び少なくとも一種の画像化剤を内包するリポソームを包含する、診断用又は画像化用組成物あるいはこのような組成物を包含する診断試験キットを提供することである。
【００１５】
略語：
ＡＵＣ 曲線下面積
ＣＭＣ 臨界ミセル濃度
ＣＴＴ２ アミド化環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド
ＤＭＦ ジメチルフォルムアミド
ＤＯＴＡ 1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸
DoxilR/CaelyxR 市販の注射用塩酸ドキソルビシンリポソーム組成物
（Johnson & Johnson/Schering Plough Corporation
の子会社であるOrtho Biotech社製）
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ 1, 2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノール
アミン-n-[ポリ(エチレングリコール)]-N-ヒドロキシ
サクシナミジルカーボネート
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＭＭＰ マトリックスメタロプロティナーゼ
ＰＥＧ ポリ（エチレングリコール）
ＲＴ 室温
ＳＬ ステルスリポソーム
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
【実施例】
【００１６】
ペプチドのカップリング
この工程においては、ペプチドの末端アミンと、ＰＥＧリン脂質のポリ（エチレングリコール）ポリマー鎖の末端に存在する官能基であるＮＨＳ（ヒドロキシサクシニミジル）との化学反応によって、ＣＴＴ２ペプチドをＰＥＧリン脂質に共有結合させた。末端アミンとＰＥＧカルボン酸の活性サクシニミジルエステルとの反応は安定なアミド結合を生じた。カップリング反応を最適化するために、反応時間と温度のみならず、ペプチドとＰＥＧリン脂質の種々のモル比を試験した。
【００１７】
ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）（BDH Laboratory Supplies製）のｐＨを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Merck製）で８．０に調整した。４ｍｇの合成アミド化GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２）(Neosystem S. A.製）と８．６ｍｇの1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-フォスフォエタノールアミン-n-[ポリ(エチレングリコール)3400]-N-ヒドロキシサクシナミジルカーボネート（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ ３４００）（Nektar Corporation製）を１ｍｌのＤＭＦ（ｐＨ８．０）に溶解した。得られた混合物（モル比は１：１）を＋３７℃、振とう下で２時間インキュベートした。
【００１８】
精製
生成物を精製するために２段階の精製方法を用いた。初めに、ジメチルエーテルを用いてＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥとＣＴＴ２を反応混合物から抽出した（図１）。次に、ＨＰＬＣゲルろ過法でＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥをＣＴＴ２から分離した（図２）。
【００１９】
反応混合物（１ｍｌ）を５ｍｌのジエチルエーテルと共に−２０℃で１時間インキュベートした。これを、事前に＋４℃まで冷却しておいた遠心分離機の中で１３，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離に付した。得られたペレットを５ｍｌの冷たいジメチルエーテルに再懸濁し、再び遠心分離に付した。得られたペレットは１時間凍結乾燥した。
【００２０】
ＨＰＬＣの移動相である、５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液に０．１％ＴＦＡを加えたもの（ｐＨ４．５）１００μｌにペレットを溶解した。５０μｌのサンプルを１回ごとに注入した。１ｍｌ／分の均一濃度溶離を、Superdex 75 10/300 GLゲルろ過カラム（Amersham製、１．５ｍｌ）を用いたＡＫＴＡピューリファイヤー１０（AKTA Purifier 10）(Amersham製）でカラム容積の１．５倍まで行った。検出波長は２２１ｎｍで、付加的な情報を得るために２３０ｎｍと２８０ｎｍでも検出した。生成物を含む画分を凍結乾燥し、次いで４００μｌの水に再懸濁し、再び凍結乾燥することで酢酸アンモニウムを除去した。
【００２１】
生成物の量は、後述するルーセル（Rousell）アッセイの変法によって求めた。生成物の純度と正体を確認するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を用いた（図３Ａ、図３Ｂと図３Ｃ）。ＣＴＴ２ペプチドの環状構造の健全性は、後述するエルマン試験（Ellman's test）によって裏付けた。長期保存のためには、凍結乾燥標品を−２０℃の乾燥した環境下で保存した。
【００２２】
カップリング効率の測定
生成したＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥはそれぞれ１分子のリン脂質ＤＳＰＥを含有する。従って、リン脂質ＤＳＰＥの濃度を測定することで、生成物の濃度を求めることができる。リン脂質濃度は、ルーセル（Rousell）アッセイの変法（Bottcher et al., 1961）によって求めた。
【００２３】
１０μｌの生成物を０．２ｍｌの過塩素酸の入ったガラス管に加え、１８０℃〜１９０℃で３０分間加熱した。標準リン酸系列を作製するために、０．２ｍｌの過塩素酸の入ったガラス管を８本用意し、０．４ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4溶液を０μｌ、１０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、１５０μｌ又は２００μｌ加えた。サンプルを加熱し冷ました後に、２ｍｌのモリブデン試薬（３．５ｍＭの（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24と１％のＨ2ＳＯ4）をサンプルの入ったガラス管と標準リン酸系列の入ったガラス管に加えた。０．２５ｍｌのアスコルビン酸も各ガラス管に加えた。ガラス管を沸騰水中で５分間インキュベートした後に冷ました。吸光度を８１２ｎｍで測定した。標準リン酸溶液の吸光度を用いて直線回帰関数を作製し、この関数を用いてサンプルの濃度を計算した。
【００２４】
生成物の量と出発材料の量とを比較することで、カップリング反応の収率を計算できる。平均してカップリング収率は約１５％であった。従って、１ｍｇのＣＴＴ２ペプチドと２．０５ｍｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳを出発材料とすると、約０．５ｍｇのＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥが製造できる。
【００２５】
エルマン試験
従来このアッセイは、１つのシステイン残基が存在するペプチド（３〜２６量体）について用いられていたが、複数のシステイン残基が存在するペプチドにも使用可能である。ＤＮＴＢと呼ばれる５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）を用いて溶液中の遊離スルフヒドリル基を定量することができる。この化合物の溶液は、遊離スルフヒドリル基と反応してジスルフィドと２−ニトロ−５−チオ安息香酸（ＴＮＢ）の混合物を生成する際に、定量可能な黄色い生成物を生じる。スルフヒドリル基は、ＤＮＴＢの消散係数に参照して定量することができる。環状ペプチドでは、システインがＳ−Ｓ結合を介して結合しているのでスルフヒドリル基は存在しない。環状ペプチドを還元すれば、スルフヒドリル基をエルマン試験によって定量することができる。この試験は、環状ペプチドが活性型であることを確認するために用いることができる。
【００２６】
エルマン試薬を製造者（Pierce社）の指示書に従って用い、試験を実施した。試験結果は、４１２ｎｍでの分光分析によって測定した。得られた値が０．０２０よりも大きい場合、ペプチドは活性を失っている。それ以外の場合は、ペプチドの環状構造は維持されている。カップリング工程はＣＴＴ２ペプチドの環状構造を乱すことはないことが示された。しかしこの試験は、結合ペプチドの新しいバッチを製造する度に、その品質を確認するために実施すべきである。
【００２７】
ＣＴＴ２被覆リポソーム性ドキソルビシン
ある種の脂質をリポソームと共にインキュベートすると、脂質がリポソームに組み込まれることが示されている（Kanda et al., 1982）。正確なメカニズムは未だ分っていない。この現象は、脂質濃度が臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超えている場合には水溶液中で自動的にミセルが形成され、そのミセルがリポソームに融合することによって生じるか、あるいは、ミセルとリポソームの間でリン脂質の交換が起こることによって生じると考えられる。一例として、事前に作製したリポソーム性ドキソルビシンをＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセルに組み込むことで、ＣＴＴ２ペプチドで被覆したリポソーム性ドキソルビシンを調製した。実験では、市販の注射用リポソーム性ドキソルビシン組成物（DoxilR/CaelyxR）と、発明者らの実験室で調製したリポソーム性ドキソルビシン（データは示さない）を使用した。更に、ＣＴＴ２ペプチド被覆DoxilR/CaelyxRの生体内分布プロファイルと治療効果の向上を実証した。
【００２８】
ＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxR
１ｍｇのＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを４００μｌの緩衝液（１００ｍＭヒスチジン、５５ｍＭショ糖、ｐＨ６．５）に懸濁した。１ｍｌのDoxilR/CaelyxR溶液（Ortho Biotech製）に１００μｌのＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥミセル懸濁液を加えた。この混合物を＋６０℃で３０分間インキュベートした。この懸濁液は、マウスやヒトに直ちに注射することができる。懸濁液は、＋４℃で最低３週間は保存可能である。
【００２９】
組み込み効率は放射性同位元素で標識したペプチドと、リポソームから未反応のミセルを分離するためのゲルろ過を用いて測定することができる。組み込み効率は、全活性に対するリポソーム画分中の活性のパーセントとして表すことができる。種々のインキュベーション時間と温度について試験したところ、＋６０℃で３０分のインキュベーションが至適反応条件であることが分った。この条件下での組み込み効率は１００％に近かった。リポソームの平均サイズと平均表面積に基づいて、リポソームあたりのＣＴＴ２ペプチド量を求めることができる。上述した反応条件では、１つのリポソームあたり約５００個のＣＴＴ２分子が存在する。従って、この量のＣＴＴ２ペプチドが結合すると、リポソームに十分に高い標的活性が付与される。
【００３０】
実験前と実験後の遊離ドキソルビシン量を比較することで、種々の反応時間や温度における組み込み実験後のリポソームからのドキソルビシンの漏れについて測定した。漏れは最小値（組み込む前の遊離ドキソルビシンが平均４．５％で、反応後が平均４．２％）であった。
【００３１】
ＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxRに関するin vivoの研究
ＣＴＴ２ペプチドの標的能を示すために、ＣＴＴ２被覆を施したDoxilR/CaelyxRと未被覆のものを注射した際の生体内分布プロファイルと治療効果を比較した。放射性同位元素で標識したＣＴＴ２ペプチドを用いた生体内分布研究を、初めに種々のヒト腫瘍の異種移植片を有するマウスで行った。このペプチドは、卵巣癌異種移植片に最も多く蓄積されていた。従って、Ａ２７８０卵巣癌モデルマウスを、続く生体内分布および治療に関する研究のために選んだ。
【００３２】
生体内分布研究
Ａ２７８０卵巣癌細胞を、１０％ウシ胎児血清（Biowhittaker製）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Biowhittaker製）で培養した。細胞を回収した後に、５．０×１０6個の細胞を５〜６週齢の雌のＮＭＲＩヌードマウスの後部脇腹に皮下注射した。腫瘍の大きさが直径約１０ｍｍになった時点で生体内分布研究を実施した。Ａ２７８０卵巣癌を有するマウスに、１ｋｇ当たりのドキソルビシン投与量が９ｍｇとなるようにリポソーム性ドキソルビシンを尾静脈に注射した。血液、心臓、肝臓、肺、筋肉、脳、脾臓及び腫瘍のサンプルを採取するために、マウスは注射後２時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間に屠殺した。血液は、血漿を得るために＋４℃、５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。組織は液体窒素中で凍結し、暗黒条件下で２日間凍結乾燥した。乾燥組織の重量を測定し、終濃度が２０ｍｇ／ｍｌとなるように酸アルコール（０．３ＭのＨＣｌを含む５０％のＥｔＯＨ）で抽出した。組織ホモジェネートを＋４℃、１３，０００×ｇで１０分の遠心分離に付した。残渣を取り除いた血漿と残渣を取り除いた細胞抽出液について、ドキソルビシンの蛍光を分光光度計（Varian製）で測定した。４７０ｎｍの励起波長を用いて５９０ｎｍにおける蛍光強度を観測し、既知量のドキソルビシを含有する、同様に処理した標準サンプルと比較することでドキソルビシンの蛍光を分析した。
【００３３】
９６時間で腫瘍に蓄積されるＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxR（ＣＴＴ−ＳＬ）のＡＵＣは、DoxilR/CaelyxR（ＳＬ）のＡＵＣよりも４６．２％高かった（図４）。これは、ＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxRにおいて腫瘍標的能が顕著に増加していることを示す。
【００３４】
異種移植マウスにおける治療効果
Ａ２７８０細胞を５０匹の雌のＮＭＲＩヌードマウスの後部脇腹に皮下注射した。マウスは無作為に５つの処置群に分けた。生存率に対する種々の治療の影響を調べるために、腫瘍の直径が５ｍｍ（６５ｍｍ3）になったら薬剤による処置を行った。この実験では、３日間隔で１ｋｇあたり９ｍｇのリポソーム性ドキソルビシン又は遊離ドキソルビシンを各マウスに３回注射した。ＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxR（ＣＴＴ−ＳＬ）、DoxilR/CaelyxR（ＳＬ）及び遊離製剤のいずれにおいてもドキソルビシン濃度は２ｍｇ／ｍｌなので、注射した容量は１２０〜１５０μｌの範囲で異なっていた。
【００３５】
処置を開始した後、マウスの体重と腫瘍の大きさを週２回測定した。腫瘍の大きさが１０００ｍｍ3を超えたら、マウスを屠殺した。
【００３６】
処置を開始してから５週間後には、緩衝液で処置した群とＣＴＴ２ミセル又は遊離ドキソルビシンで処理した群の全てのマウスが屠殺されており、DoxilR/CaelyxR処置マウスはたった３３％のみが生存していた。しかし、この時、ＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxR処置マウスの７５％が生存していた（図５）。平均生存時間は、ＣＴＴ２被覆DoxilR/CaelyxR処置群では３８．６日であり、DoxilR/CaelyxR処置群では２７．９日だった。
【００３７】
ＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの生体内分布
ＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを上述のように製造した。ＣＴＴ２−ＰＥＧ３４００−ＤＳＰＥ分子の癌異種移植モデルにおける組織分布を研究するために、１０匹の免疫不全マウスにヒト卵巣癌細胞（ＯＶ−９０）を植え付けた。腫瘍異種移植片が完全に形成した時（異種移植から約３週間後）に、ヨウ素標識ＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（２００μｇ；〜１ＭＢｑ）を含む２００μｌのＰＢＳをマウスの尾静脈に注射して生体内分布研究を実施した。注射後６時間と２４時間にマウスを屠殺し、その血液と組織を解剖により採取し、ガンマ線を計測した。検討した両方の時点において、最も高い放射能の蓄積が腫瘍異種移植片に見られた（腫瘍／筋肉比：４３）（図６）。
【００３８】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体
ＣＴＴ２は、２つの特徴的な構造からなる部位を有すると見ることができる。ペプチドの環状（-CTTHWGFTLC) 部位は、ペプチドの直鎖状 GRENYHG- 部位より疎水性である。ＣＴＴ２ペプチドと何らかの分子構造との結合点（Ｎ末端 対 Ｃ末端）は、複合体の溶解性と生物活性に影響しているかもしれない。複合体の溶解性と生物活性を向上させるために、２つの異なるペプチド誘導体（表１のペプチド１とペプチド４）を合成した。
【００３９】
上記ペプチドは、in vivoの生理学的な状態や過程の画像化に用いることができる。ＣＴＴ２ペプチドは放射性ヨウ素で直接標識することができる。より高度な放射性画像化試薬、例えば、111Ｉｎや99mＴｃは、元のペプチドと複合化したキレーター分子を必要とする。ＣＴＴ２ペプチドのＤＯＴＡ誘導体（表１のペプチド２、ペプチド３とペプチド５）を合成し、その１つ（表１のペプチド３）を非放射性インジウムで標識した。ペプチド−ＤＯＴＡ複合体（表１のペプチド２とペプチド５）は、診断に用いる放射性同位元素（111Ｉｎ）や治療に用いる放射性同位元素（177Ｌｕ、90Ｙ）で標識することができる。
【００４０】
天然に存在しないアミノ酸であるフルオロトリプトファンを合成の際に導入することによって、２つのＣＴＴ２−ペプチド誘導体、即ち、６Ｆ−Trp ＣＴＴ２と５Ｆ−Trp ＣＴＴ２（表１のペプチド６とペプチド７）を得た。６Ｆ−Trp ＣＴＴ２は野生型ペプチドと比べて、血清安定性の増加と腫瘍に対する細胞遊走阻害能の向上を示した（「６Ｆ−Trp ＣＴＴ２ペプチドの生体内分布」の項を参照）。５−ＯＨ−Trp誘導体も調製した（表１のペプチド８）。
【００４１】
Applied Biosystems（カリフォルニア州、フォスターシティー）製のモデル４３３Ａでペプチドを合成した。合成には公知のＦｍｏｃ−化学（Koivunen et al., 1999）を用いたが、ジスルフィド結合の形成は過酸化水素を用いて行った。
【００４２】
簡単に説明すると、ペプチドを５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７．５）に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、１００ｍｇのペプチドに対して０．５ｍｌの３％過酸化水素を加えた。３０分間インキュベートした後、ｐＨを３．０に調製し、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル直線勾配（３０分間で０％〜７０％）を用いた逆相ＨＰＬＣで、環化したペプチドを精製した。
【００４３】
ＤＯＴＡ誘導ペプチドのインジウム標識： １．２ｍｇのK(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)を１００μｌの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した。ＩｎＣｌ3を酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した。２モル等量のＩｎＣｌ3溶液をペプチド溶液に加えた。反応混合物はＲＴで一晩放置した。インジウム標識ペプチドは、酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．５）とアセトニトリル溶液の混合液（５０％／５０％）を用いた逆相Ｃ−１８カートリッジで精製した。溶出液を凍結した後に凍結乾燥し、白い固体状のインジウム標識ペプチドを得た。インジウム標識ペプチドはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで同定した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
６Ｆ−Trp ＣＴＴ２ペプチドの生体内分布
６Ｆ−Trp ＣＴＴ２ペプチドを生体内分布の研究に用い、その動態と腫瘍標的特性を評価した。研究は、形成したヒト卵巣癌腫（ＯＶ−９０）を有するマウスで行った。６Ｆ−Trp ＣＴＴ２ペプチドをヨウ素−１２５で標識した。４０μｇの精製した標識ペプチド（〜１ＭＢｑ）をマウスの尾静脈に注射した。ペプチド注射から３０分後と１８０分後にマウスを屠殺し、血液と組織のサンプルを採取した。蓄積された放射能をガンマ線計測器で測定した。その結果、腫瘍組織に著しい放射能の蓄積が見られ、３０分後と１８０分後の放射能蓄積における腫瘍／筋肉比はそれぞれ１４．９と２３．３であった。一方、その他の全ての組織では、放射能の蓄積量は無視できる値であり、クリアランスは血液と同等であった（図８）。非天然のアミノ酸をペプチド合成に使用することが可能なので、腫瘍のターゲティングのための活性が高くより安定なペプチドを提供できるであろう。
【００４６】
参考文献
Bjorklund, M., Valtanen, H., Savilahti, H., and Koivunen, E. Use of intein-directed peptide biosynthesis to improve serum stability and bioactivity of a gelatinase inhibitory peptide. Comb Chem High Throughput Screen 6: 29-35, 2003.
Brooks, P., Stromblad, S., Sanders, L., von Schalscha, T., Aimes, R., Stetler-Stevenson, W., Quigley, J., and Cheresh, D. Localization of matrix metalloproteinase MMP-2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin αvβ3 Cell 85 : 683-693, 1996.
Bottcher, C.J.F., Van Gent, C. M., Pries, C. Anal. Chim. Acta 24: 203-204, 1961.
Dagar, S., Sekosan, M., Lee, B., Rubinstein, l., and Onyuksel, H. VIP receptors as molecular targets of breast cancer: implications for targeted imaging and drug delivery. Journal of Controlled Release 74: 129-134, 2001.
Kanda, S., Inoue, K., Nojima, S., Utsumi, H., and Wiegandt, H. Incorporation of ganglioside and spin-labelled ganglioside analogue into cell and liposome membranes. J. Biochem. 91: 2095-2098, 1982.
Koivunen, E., Arap, W., Valtanen, H., Raininsalo, A., Penate Medina, O., Heikkika, P., Kantor, C., Gahmberg, C., Salo, T., Konttinen, Y., Sorsa, T., Ruoslahti, E. and Pasqualini, R. Cancer therapy with a novel tumour-targeting gelatinase inhibitor selected by phage peptide display. Nature Biotechnol. 17: 768-774, 1999.
Lasic, D., Ceh, B., Stuart, M., Guo, L., Frederik, P., and Barenholz, Y. Transmembrane gradient driven phase transitions within vesicles: lessons for drug delivery. Biochim. Biophys. Acta 1239: 145-156, 1995
Penate Medina, O., Soderlund, T., Laakkonen, L., Tuominen, E., Koivunen, E., and Kinnunen, P. Binding of novel peptide inhibitors of type IV collagenases to phospholipid membranes and use in liposome targeting to tumour cells in vitro. Cancer Res. 61: 2978-2985, 2001.
Sears, B. D. (1984). Synthetic Phospholipid Compounds. US Patent 4,426,330.
Storm, G., and Crommelin, D. Liposomes: quo vadis? Pharm. Sci. & Tech. Today 1: 19-31, 1998.
Tardi, P., Boman, N., and Cullis, P. Liposomal doxorubicin. J. Drug Target. 4: 129-140, 1996.
Toth, M., Gervasi, D., and Fridman, R. Phorbol ester-induced cell surface association of matrix metalloproteinase-9 in human MCFIOA breast epithelial cells. Cancer Res. 57: 3159-3167, 1997.
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】カップリング反応の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析。レーン１，対照ＣＴＴ２ペプチド；レーン２，対照ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ；レーン５，ジエチルエーテル処理後の上清；レーン８，ジエチルエーテル処理後のペレット懸濁液。
【図２】ＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ化合物をＣＴＴ２ペプチドから分離するためのＨＰＬＣゲルろ過の結果。グラフ中の第一のピークが生成物であるＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含み、グラフ中の最後のピークがＣＴＴ２ペプチドを含んでいる。
【図３ａ】ＣＴＴ２ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析。
【図３ｂ】ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析。
【図３ｃ】ＨＰＬＣで精製した後のＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析。
【図４】卵巣癌異種移植マウスにおける、ＣＴＴ２−被覆DoxilR/CaelyxRとDoxilR/CaelyxRの９６時間にわたる腫瘍内蓄積。
【図５】種々の薬物／リポソーム製剤による処置を行った後の、腫瘍を有するマウスの生存率。
【図６】Ｉ−１２５−ＣＴＴ２−ＰＥＧ−ＤＳＰＥの生体内分布研究。後部背面にヒト卵巣癌を有するＮＭＲＩ／ヌードマウスにおける、125Ｉ標識ミセルのin vivo 生体内分布を２つの時点で計測した。結果は組織１ｇあたりの注射量に対するパーセント（％ＩＤ／１ｇ）で表した。全ての結果を、５匹のマウスの平均±ＳＤで示した。
【図７ａ】アミド化ＣＴＴ２ペプチドの分子構造。
【図７ｂ】ＣＴＴ２ペプチドのＧ→Ｋ誘導体の分子構造。
【図７ｃ】ＣＴＴ２ペプチドのＧ→Ｋ（ＤＯＴＡ）誘導体の分子構造。
【図７ｄ】インジウム標識Ｇ→Ｋ（ＤＯＴＡ）−ＣＴＴ２ペプチドの分子構造。
【図７ｅ】Ａｃ−ＣＴＴ２−Ｋ−ＮＨ2ペプチドの分子構造。
【図７ｆ】Ａｃ−ＣＴＴ２−Ｋ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ2ペプチドの分子構造。
【図７ｇ】ＣＴＴ２ペプチドの６Ｆ−Trp誘導体の分子構造。
【図７ｈ】ＣＴＴ２ペプチドの５Ｆ−Trp誘導体の分子構造。
【図７ｉ】ＣＴＴ２ペプチドの５−ＯＨ−Trp誘導体の分子構造。
【図８】Ｉ−１２５標識６Ｆ−Trp ＣＴＴ２（GRENYHGCTTH[6-フルオロ]WGFTLC）ペプチドの生体内分布研究。後部背面にヒト卵巣癌を有するＮＭＲＩ／ヌードマウスにおける、125Ｉ標識ペプチドの in vivo 生体内分布を２つの時点で計測した。結果は組織１ｇあたりの注射量に対するパーセント（％ＩＤ／１ｇ）で表した。全ての結果を、５匹のマウスの平均±ＳＤで示した。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列番号１： ＣＴＴ２ペプチド
配列番号２： ＣＴＴ２ペプチドのLys置換体
配列番号３： ＣＴＴ２ペプチドのLys付加体
配列番号４： １２位にトリプトファン類似体を有するＣＴＴ２ペプチド
１２位のXaaは５−ＯＨ−Trp、５−Ｆ−Trp又は６−Ｆ−Trpである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体をポリエチレングリコールの合成誘導体に共有結合させることを包含する、腫瘍標的能を有するターゲティング組成物の製造方法。
【請求項２】
ポリエチレングリコールの合成誘導体がＤＳＰＥ−ＰＥＧであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧがＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体が、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリエチレングリコールの合成誘導体がＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）少なくとも一種の化学療法薬又は画像化剤を内包するリポソームを得、
（ｂ）環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体をポリエチレングリコールの合成誘導体に共有結合させて、腫瘍標的能を有するターゲティング組成物を製造し、そして
（ｃ）該リポソームと該ターゲティング組成物を組み合わせて懸濁液を形成する
ことを包含する、治療用又は画像化用リポソーム組成物の製造方法。
【請求項７】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体が、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）少なくとも一種の化学療法薬を内包するリポソームを得、
（ｂ）以下の(1)と(2)：
(1) 環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体と
(2) ポリエチレングリコールの合成誘導体
を含むターゲティング組成物を得、
（ｃ）該リポソームと該ターゲティング組成物を組み合わせて懸濁液を形成し、そして
（ｄ）得られた懸濁液を患者に投与する
ことを包含する、患者の癌を治療する方法。
【請求項９】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体が、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
化学療法薬がドキソルビシンであることを特徴とする、請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
患者に存在すると考えられる腫瘍の検出を目的とした診断方法を実施するための診断用又は画像化用試験キットであって、
− 環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体と、ポリエチレングリコールの合成誘導体を含むターゲティング組成物、及び
− 少なくとも一種の画像化剤を内包するリポソーム
を包含する試験キット。
【請求項１２】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体が、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項１１に記載の試験キット。
【請求項１３】
− 環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体と、ポリエチレングリコールの合成誘導体を含むターゲティング組成物、及び
− 少なくとも一種の画像化剤を内包するリポソーム
を包含する、診断用又は画像化用組成物。
【請求項１４】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体が、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
（１）以下の(a)と(b)：
(a) 環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体と
(b) 上記(a)成分に共有結合したポリエチレングリコールの合成誘導体
を含むターゲティング組成物、及び
（２）少なくとも一種の化学療法薬を内包するリポソーム
を含有する懸濁液を用いて製造した医薬組成物。
【請求項１６】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体が、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチド。
【請求項１８】
環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体をポリエチレングリコールの合成誘導体に共有結合することによって得られるターゲティング組成物の精製方法であって、
（ａ）反応混合物を有機溶媒で処理して沈殿物を得、
（ｂ）得られた沈殿物を遠心分離に付し、有機溶媒で洗浄し、再度遠心分離に付すことでペレットを得、
（ｃ）得られたペレットを緩衝液に懸濁し、そして
（ｄ）サイズ排除クロマトグラフィーを行って精製されたターゲティング組成物を得る
ことを包含する精製方法。
【請求項１９】
工程（ａ）と工程（ｂ）で使用する有機溶媒がジエチルエーテルであり、工程（ｃ）で使用する緩衝液がｐＨ４．５の酢酸アンモニウム−ＴＦＡ緩衝液であることを特徴とする、請求項１８に記載の精製方法。
【請求項１】
環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体をポリエチレングリコールの合成誘導体に共有結合させることを包含する、腫瘍標的能を有するターゲティング組成物の製造方法。
【請求項２】
ポリエチレングリコールの合成誘導体がＤＳＰＥ−ＰＥＧであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧがＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体が、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリエチレングリコールの合成誘導体がＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）少なくとも一種の化学療法薬又は画像化剤を内包するリポソームを得、
（ｂ）環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体をポリエチレングリコールの合成誘導体に共有結合させて、腫瘍標的能を有するターゲティング組成物を製造し、そして
（ｃ）該リポソームと該ターゲティング組成物を組み合わせて懸濁液を形成する
ことを包含する、治療用又は画像化用リポソーム組成物の製造方法。
【請求項７】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体が、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）少なくとも一種の化学療法薬を内包するリポソームを得、
（ｂ）以下の(1)と(2)：
(1) 環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体と
(2) ポリエチレングリコールの合成誘導体
を含むターゲティング組成物を得、
（ｃ）該リポソームと該ターゲティング組成物を組み合わせて懸濁液を形成し、そして
（ｄ）得られた懸濁液を患者に投与する
ことを包含する、患者の癌を治療する方法。
【請求項９】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体が、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
化学療法薬がドキソルビシンであることを特徴とする、請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
患者に存在すると考えられる腫瘍の検出を目的とした診断方法を実施するための診断用又は画像化用試験キットであって、
− 環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体と、ポリエチレングリコールの合成誘導体を含むターゲティング組成物、及び
− 少なくとも一種の画像化剤を内包するリポソーム
を包含する試験キット。
【請求項１２】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体が、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項１１に記載の試験キット。
【請求項１３】
− 環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体と、ポリエチレングリコールの合成誘導体を含むターゲティング組成物、及び
− 少なくとも一種の画像化剤を内包するリポソーム
を包含する、診断用又は画像化用組成物。
【請求項１４】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体が、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
（１）以下の(a)と(b)：
(a) 環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体と
(b) 上記(a)成分に共有結合したポリエチレングリコールの合成誘導体
を含むターゲティング組成物、及び
（２）少なくとも一種の化学療法薬を内包するリポソーム
を含有する懸濁液を用いて製造した医薬組成物。
【請求項１６】
ＣＴＴ２ペプチドの誘導体が、KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチドであることを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
KRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA)RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、K(DOTA(In))RENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K-NH2、Ac-GRENYHG-シクロ(CTTHWGFTLC)K(DOTA)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-6-フルオロ-W)GFTLC)-NH2、GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-フルオロ-W)GFTLC)-NH2 及び GRENYHG-シクロ(CTTH(d,l-5-OH-W)GFTLC)-NH2 からなる群より選ばれるペプチド。
【請求項１８】
環状 GRENYHGCTTHWGFTLC ペプチド（ＣＴＴ２ペプチド）又はその誘導体をポリエチレングリコールの合成誘導体に共有結合することによって得られるターゲティング組成物の精製方法であって、
（ａ）反応混合物を有機溶媒で処理して沈殿物を得、
（ｂ）得られた沈殿物を遠心分離に付し、有機溶媒で洗浄し、再度遠心分離に付すことでペレットを得、
（ｃ）得られたペレットを緩衝液に懸濁し、そして
（ｄ）サイズ排除クロマトグラフィーを行って精製されたターゲティング組成物を得る
ことを包含する精製方法。
【請求項１９】
工程（ａ）と工程（ｂ）で使用する有機溶媒がジエチルエーテルであり、工程（ｃ）で使用する緩衝液がｐＨ４．５の酢酸アンモニウム−ＴＦＡ緩衝液であることを特徴とする、請求項１８に記載の精製方法。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図７ｄ】
【図７ｅ】
【図７ｆ】
【図７ｇ】
【図７ｈ】
【図７ｉ】
【図８】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図７ｄ】
【図７ｅ】
【図７ｆ】
【図７ｇ】
【図７ｈ】
【図７ｉ】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５０５０４９（Ｐ２００８−５０５０４９Ａ）
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３４７７７（Ｐ２００６−５３４７７７）
【出願日】平成１６年１０月１５日（２００４．１０．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００４／０５０１５０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３７８６２
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【出願人】（５０３３４８８４７）シーティーティー キャンサー ターゲッティング テクノロジーズ オイ (6)
【氏名又は名称原語表記】ＣＴＴ Ｃａｎｃｅｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｏｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月１５日（２００４．１０．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００４／０５０１５０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３７８６２
【国際公開日】平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）
【出願人】（５０３３４８８４７）シーティーティー キャンサー ターゲッティング テクノロジーズ オイ (6)
【氏名又は名称原語表記】ＣＴＴ Ｃａｎｃｅｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｏｙ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]