トリインターフェロンを産生する組換え植物
【課題】トリへの外来性サイトカイン応用の一環として、植物においてトリインターフェロンを発現できる、生物活性を示し、保存安定性がよい組換え植物を提供すること。
【解決手段】トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれてなることを特徴とするトリインターフェロンを産生する組換え植物。トリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）をコードする遺伝子が植物細胞小胞体内タンパク蓄積に優れた特定のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子であり、植物発現タンパク質の発現量を高くする特定のトランスファーベクター；プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨを用いるのが好ましい。
【解決手段】トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれてなることを特徴とするトリインターフェロンを産生する組換え植物。トリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）をコードする遺伝子が植物細胞小胞体内タンパク蓄積に優れた特定のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子であり、植物発現タンパク質の発現量を高くする特定のトランスファーベクター；プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨを用いるのが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリインターフェロンを産生する組換え植物、その継代育成植物、それら植物からトリインターフェロンタンパク質を採取するトリインターフェロンの製造方法、その方法で製造されたトリインターフェロンを有効成分とする発育鶏卵用抗トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）作用剤、前記植物によるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現を確認するために用いる抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナルウサギ抗体、および植物形質転換用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
畜産業は戦後急成長し、それに伴い家畜の飼育頭羽数は増大している。この間、経営体数が減少する一方で経営規模が急拡大し、かつてのように農家の庭先で数頭（数羽）飼っている状態から、専業の大規模経営が生産の大部分を担っている構造になった。特にこの傾向は豚、採卵鶏、ブロイラーで顕著であり、生産量に占める法人経営の割合はそれぞれ50.3％、72.4％、49.5％（95年）に達している。
【０００３】
現在、畜産業が大規模経営になってきていることから、飼料、ワクチン、抗生物質などで、安価で良質、そして多数の家畜への効率的な投与が望まれている。しかし、実際には成長促進を目的とした抗菌性飼料添加物や疾病治療のための動物用医薬品が多量に使用されており、これによる薬剤耐性菌の発生等が危惧されている。このため、抗菌性飼料添加物及び動物用医薬品の使用量を低減させる減投薬飼養管理システムの構築に向けて、家畜の免疫機能を活性化させる飼料及び飼料添加物の利用技術の開発、また、動物用医薬品の使用低減のため、微量の薬剤を特定部位（臓器・組織）に効率的、選択的に作用発現させるドラッグデリバリーシステム（薬剤運搬システム）技術の開発が必要とされている。
【０００４】
さらに、ワクチンなどの動物医薬品は、家畜の感染症を防御するために有効であるが、その多くは個体ごとに注射器で接種されており、多大な労力を要するばかりでなく、家畜へのストレス、感染症侵入の機会の増大等、生産性を阻害している。以上のことをふまえ、これらの問題を解消する手段として経口ワクチンがあるが、抗原量の低減化および腸管への確実な抗原送達が課題となっている。そこで、ドラッグデリバリーシステム技術を用いて、確実な粘膜免疫の誘導に有効な経口ワクチンが重要となってくる。
【０００５】
粘膜免疫システムとは、現在までに解明の進んできた胸腺、骨髄をメルクマールとしてきた全身系・末梢系免疫システムとは異なった誘導・制御機構のもとに作動していることがわかってきた。例えば、頻繁に使用されてきた方法である注射による抗原投与では、全身免疫には効果的に抗原特異的免疫応答が誘導されてきているが、粘膜免疫系には抗原に特異的な抗体誘導を含めて免疫応答が全く誘導されない。しかし、抗原を食べさせる、飲ませる、つまり経口免疫といわれる粘膜免疫システムを介した抗原投与によって、的確に抗原特異的免疫応答を腸管や呼吸器を覆っている粘膜面に誘導、成立させることができる。さらに、同時に全身免疫機構にも抗原特異的免疫応答を誘導するため、二段構えの免疫を宿主側に成立させる利点がある。
【０００６】
この粘膜免疫の利点である粘膜系と全身系の両方の免疫を活性化できるという事実は、実際に感染症の予防という観点から臨床への応用が推進されている。ワクチン抗原を経口免疫することで、粘膜系には分泌型ＩｇＡを中心とした、そして全身系ではＩｇＧを主体とする免疫応答が誘導できる。このとき、効果的な経口ワクチンを期待するには、抗原特異的免疫応答を賦活する粘膜免疫調節因子、粘膜アジュバントの開発とその併用が必要である。タンパク抗原を単独で経口投与しても効果的に抗原特異的ＩｇＡ抗体は誘導されてこない。そこで、経口免疫の効果を上げるために粘膜免疫調節因子、粘膜アジュバントの開発を考えなければならない。その一つとして、野生型毒素が粘膜アジュバントとしての可能性を秘めている。しかし、毒性を考えた場合、臨床応用が困難である。そこで、本発明者らは、もともと生体内の免疫活性化物質であるサイトカインが応用できるのではないだろうかと考えた。
【０００７】
免疫系は自然免疫系と適応免疫系に分けられて考えられている。病原体に曝された直後は自然免疫が働き、その後効果的な防御である適応免疫へと移行する。適応免疫には大きく分けて液性免疫（液性免疫応答：Ｔｈ２応答）と細胞性免疫（細胞性免疫応答：Ｔｈ１応答）の二つがある。液性免疫の中心的存在として抗体がある。抗体は成熟したＢ細胞が抗原刺激を受けて分化した形質細胞において合成・分泌される物質で、抗原が侵入してきたときに抗原に取り付き、その働きを失わせ排除する作用を持つ。細胞性免疫はＴリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ細胞などが主役の免疫である。細胞性免疫の働きは、病原体に感染した細胞を殺してしまうのと同時に病原体の増殖を止めることである。
【０００８】
これら免疫応答はサイトカインによって調節されている。サイトカインは免疫応答における細胞間相互作用に関与する一群の分子の呼び名であり、抗体のような特異性を持たないものの総称である。サイトカインはすべてタンパク質あるいはペプチドでしばしば多糖を結合している糖タンパク質からなる。サイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）そして他のサイトカイン群（例えば、ＴＮＦ−αなど）の４つのカテゴリーに大きく分類できる。ＩＬと総称されているものは、主としてＴ細胞が作り出す一群のサイトカイン（ＩＬ−２〜ＩＬ-６、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１３、ＩＬ-１４、ＩＬ−１６そしてＩＬ−１７）であるが、一部は他の単球（例えば、ＩＬ−８、ＩＬ−１２そしてＩＬ−１５など）や組織細胞（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５そしてＩＬ−１８など）によっても作り出される。これらのタンパク質は上述したとおり、多種多様な機能を持っているが、多くは他の細胞に働きかけて分裂や分化を引き起こす。それぞれのＩＬは、対応する受容体を発現した限られた細胞にだけ特異的に働く。ＩＦＮはある種のウイルス感染の広がりを抑える重要な分子群である。ＩＦＮは、多くのウイルス感染における第一線での防御に働き、そのため感染のきわめて初期に作り出される分子である。
【０００９】
サイトカインの役割として、免疫のうち細胞性免疫反応の発現の調節に関与するもの（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γなど）、抗体産生に関与するもの（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３など）、炎症の発現や調節に関与するもの（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８（:ＩＬ−８は単球・リンパ球由来の多核白血球及び単球の局所集積作用による炎症メディエーターである）、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ−α)、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３など）、アレルギー反応機構に関与するもの（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２など）、造血機構に関与するもの（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、エリスロポエチン、トロンボポエチン、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、マクロファージ・コロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ，ＣＳＦ−１)、造血幹細胞因子(ＳＣＦ)など）などがある。その多くは直接的あるいは間接的に感染や腫瘍に対する生体防御機構において重要な役割を持つことが明らかになっている。
【００１０】
哺乳類では、抗ウイルス活性を持つサイトカインは１型、２型ＩＦＮとしてクラス分けされている。多面的な作用を示すサイトカインの一群であるＩＦＮは、低分子タンパク質（分子量20,000〜25,000）である。また、ウイルス、細菌、原虫、サイトカイン、マイトジェン、天然および合成の二重鎖ＲＮＡや他の既知の物質に反応して脊椎動物細胞に誘導される。その作用は一般的に抗ウイルス、抗増殖作用、免疫調節が知られ、宿主の防御機構や恒常性において、先天性および後天性の免疫反応をともに強く媒介するとされている。
【００１１】
ＩＦＮは現在までにＩＦＮ−α、β、γ、δ、ε、κ、λ、ω、τが報告されている。１型ＩＦＮｓはウイルス性として知られ、ＩＦＮ−α（白血球由来）、ＩＦＮ−β（ファイブロブラスト由来）、ＩＦＮ−τ（トロホブラスト由来）、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−ωなどを含み、ウイルス感染によって産生される。また、２型ＩＦＮは免疫性ＩＦＮ（ＩＦＮ−γ）として知られ、マイトジェン刺激や抗原刺激によって産生される。ウイルスに感染したほとんどのタイプの細胞は培養時にＩＦＮ−α／βを産生可能であるが、ＩＦＮ−γはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ＣＤ４陽性１型ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞）、ＣＤ８陽性細胞傷害性サプレッサー細胞（ＣＤ８＋Ｔｃ細胞）を含む免疫系のある特定の細胞によってのみ合成される。
【００１２】
１９７２年に、Tom Schaferらが、ＩＦＮ誘発剤を注射したマウスの乳の中にＩＦＮが見出され、泌乳している母マウスの乳の中に誘発されたＩＦＮが存在している時は新生仔が致死的ウイルス感染から有意に多く生き残ることを報告した。同時に、ヒト及びウシ、ネコの咽頭洗浄液、唾液、鼻腔洗浄液、鼻汁中にＩＦＮが分泌されていて、ウイルス感染時、ＩＦＮ誘発剤投与時にはその量が増えることが分かったことから、ＩＦＮの経口投与に興味をもたれるようになった。経口投与されたＩＦＮは、ヒト及び他の動物において生物学的活性を示し、投薬の最も良い効果は、呼吸器感染中の鼻汁分泌物の中に天然に分泌される濃度と同じ一定の濃度（１０2〜１０3ＩＵ、ＩＵ：International Unit 国際単位）のＩＦＮを口腔粘膜へ与えたときに起こる。これに対して、非経口投与では、経口投与より投与量は１０6ＩＵと多く、そのために、高用量非経口投与による副作用も危惧されていることから、経口低用量療法の可能性が示唆されている。そして、ＩＦＮを低用量経口投与することによって全身的に効果が現れるというメカニズムは多くの研究所で活発に研究されているところである。
【００１３】
ShaferらによりＩＦＮが経口投与でも有効であることが証明されると、ヒトおよび牛、豚、犬、猫、鶏において天然型ヒトＩＦＮ−α（ｎＨｕＩＦＮ−α）の様々な臨床報告が数多くなされるようになった。近年、ｎＨｕＩＦＮ−αはＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス性疾患、カポジ肉腫、非Hodgkin'sリンパ腫、悪性黒色腫などの腫瘍性疾患において、サイトカイン療法として注目を集め、動物においてもサイトカインの治療への使用が、クローニングや新技術の進歩により可能となってきている。実際に、現在では動物用医薬品としてｎＨｕＩＦＮ−αの経口投与剤が発売されるようになっている（ビムロン、バイオベット株式会社、東京都）。また、鶏ではニワトリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）の経口投与はニューカッスル病の病状を改善し、マレック病にも細胞学的に効果を表した（非特許文献１：Jarosinski, K. W.ら,J. Interferon Cytokine Res. 21:287-296、非特許文献２：Marcus, P. I.ら, J. Interferon Cytokine Res. 19:881-885）。
【００１４】
経口用ＩＦＮ−αは、口腔内の粘膜細胞表面のＩＦＮ受容体と物理的に結合し、免疫細胞に対し体内にある炎症部位に移動するように情報を与える。この情報を受けた免疫細胞は、リンパ節に入り、速やかに炎症部に移動する。一方、受容体に結合しなかったＩＦＮ−αは、その後消化管内でアミノ酸にまで分解され、吸収、あるいは排泄される。タンパク質分解酵素により消化された時点で、ＩＦＮ−αが持っていた情報は失われる。炎症部位では細菌、ウイルスの種類に関係なく免疫細胞は貪食を行い、免疫細胞はその情報を他の免疫細胞に伝えることにより、体内に侵入した細菌やウイルスに特異的に反応する抗体の産生を誘導したり、感染した細胞を破壊したりする。その結果として、炎症部位で起きている感染を抑制することができる。つまり、経口投与されたＩＦＮ−αは口腔内に存在する免疫細胞を刺激するだけであり、それに引き続いて起きる免疫反応は、本来、生体が持っている免疫システムに基づいている。
【００１５】
宿主細胞の免疫システムのうち、ヘルパー１型Ｔ細胞（Ｔｈ１）応答が重要とされており、哺乳類においてＩＦＮ−αはＩＬ−１８と相乗的にＩＦＮ−γ発現を誘導し、Ｔｈ１の分化誘導を促すことが知られている。また、ＩＦＮ−αはＩＦＮ−γと違い、熱およびｐＨに対して安定である。このようなことから、粘膜アジュバントとして、ＩＦＮ−αは適していると言える。
【００１６】
現在、医薬品として用いられているワクチンや生理活性物質の多くは、大腸菌やバキュロウイルスや酵母などの外来遺伝子発現系を用いて生産されている（非特許文献３：McCall, E. J.ら, Protein Expr Purif. 42:29-36；2005、非特許文献４：Smith, G. E.ら, Mol.Cell Biol. 3:2156-2165；1983）。しかし、近年、遺伝子工学の発展により植物に外来遺伝子を導入、発現させることが可能になってきた。植物発現系は、既存の方法に比べて多くの利点がある。植物発現系は発酵タンク培養系に比較して経済的であるため、既存の方法に比して低コストである。また、植物細胞が目的のタンパク質を生産するので精製工程を必要としない。さらに、植物を用いてワクチンなどの機能性タンパク質を生産する場合、動物ウイルスなどのヒトに感染する病原体による汚染の可能性がないことや、弱毒化されたワクチン株による副作用の心配がないことなどの安定性の面でも極めて優れている（非特許文献５：Daniell, H.ら, Trends Plant Sci 6:219-226 ；2001）。
【００１７】
そして、作出した作物は、そのまま飼料として経口的に投与することが可能であり、投与の際家畜に与えるストレスを無くすことができる等の利点があり、獣医学領域における有用性は極めて高いと考えられる。
１９９０年、CurtissとCarneauは、Salmonella, Typhimurium. mutansの表面タンパク質ＳｐａＡをタバコに発現させ、これをマウスに食べさせることで抗原特異的粘膜免疫応答を誘導することに成功した（特許文献１：Curtiss, R.ら, Patent application ＷＯ ９０／０２４８４）。この実験は植物ワクチンを用いた「食べるワクチン」の可能性を初めて示した実験となった。この実験のあと、病原性微生物の感染やその他の病気に対して特異的な免疫活性化を促す機能を持つ植物ワクチンの開発がされている。大腸菌易熱性毒素抗原のタバコ、ジャガイモおよびトウモロコシでの発現（非特許文献６：Haq, T. A.ら, Science 5:268(5211):658,660；1995、非特許文献７：Streatfield, S. J.ら, Vaccine 19(2742-2748)；2001）、コレラ毒素抗原のジャガイモでの発現（非特許文献８：Arakawa, T.ら, Nat Biotechnol 16(292-297)；1998）、Ｂ型肝炎ウイルス抗原のレタスやジャガイモでの発現（非特許文献９：Kapuata, J.ら, FASEB J 13:1796-1799；1999、非特許文献１０：Richter, L. J.ら, Nat Biotechnol 18:1167-1171；2000）、ノーウオークウイルス抗原のタバコ及びジャガイモでの発現（非特許文献１１：Mason, H. S.ら, Proc .Natl. Acad. Sci. USA 93:5335-5340；1996）等が行なわれた。現在では動物実験や臨床試験により、その安全性と有効性が示されている。また、発現させる植物として、例えばトウモロコシのような穀物種子を使えば、長期間安定でかつ室温での輸送可能なワクチンの開発が可能になる。
【００１８】
【特許文献１】Curtiss, R.ら, Patent application ＷＯ ９０／０２４８４
【非特許文献１】Jarosinski, K. W.ら,J. Interferon Cytokine Res. 21:287-296
【非特許文献２】Marcus, P. I.ら, J. Interferon Cytokine Res. 19:881-885
【非特許文献３】McCall, E. J.ら, Protein Expr Purif. 42:29-36；2005
【非特許文献４】Smith, G. E.ら, Mol.Cell Biol. 3:2156-2165；1983
【非特許文献５】Daniell, H.ら, Trends Plant Sci 6:219-226 ；2001
【非特許文献６】Haq, T. A.ら, Science 5:268(5211):658,660；1995
【非特許文献７】Streatfield, S. J.ら, Vaccine 19(2742-2748)；2001
【非特許文献８】Arakawa, T.ら, Nat Biotechnol 16(292-297)；1998
【非特許文献９】Kapuata, J.ら, FASEB J 13:1796-1799；1999
【非特許文献１０】Richter, L. J.ら, Nat Biotechnol 18:1167-1171；2000
【非特許文献１１】Mason, H. S.ら, Proc .Natl. Acad. Sci. USA 93:5335-5340；1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
Ruttanapummaらは、ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子をクローニングし、バキュロウイルス発現系で発現させ、本来のＩＦＮ−αの特徴である抗ウイルス活性を得ている。比較的高率に精製ができることから、in vivo実験としてはサイトカインを供給可能であるが、家禽への応用となると、より低コストで精製段階も不要な発現系の開発が必要となる。
そこで、本発明者らは、植物においてトリインターフェロン、典型的にはＣｈＩＦＮ−αを発現し、葉の中から鶏インターフェロンαを含む葉液を抽出し、生物活性を調べ、飼料として保存するサイトカイン組換え植物の保存法を検討した。
【００２０】
１型インターフェロンとして知られるインターフェロンα（ＩＦＮ−α）は、強い抗ウイルス活性を有するとともに、免疫応答に重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。近年、有効性が臨床的にも証明され、動物用ＩＦＮ−α製剤が市販されている。
また、現在、植物発現系は、従来の系に比べ、低コスト、安全、精製が不要など多くの利点があり注目されている。そして、作出した作物は、そのまま飼料として経口的に投与することが可能であり、投与の際家畜に与えるストレスを無くすことができることから、獣医学領域における有用性は極めて高いと考えられる。そこで、本発明者らは、トリへの外来性サイトカイン応用の一環として、典型的には、植物でニワトリＩＦＮ−α（ＣｈＩＦＮ−α）を発現させ、性状を調べた。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、典型的には、すでにクローニング済みのＣｈＩＦＮ−α遺伝子の塩基配列を元に、植物細胞内での発現を視野に入れ、３’末端に小胞体局在シグナルであるＫＤＥＬ配列を付加するようにプライマーを設計し、ＰＣＲを行い、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を得た。同遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターであるｐＭＬＨプラスミドに挿入し、アグロバクテリウム法を用いて、イネに形質導入し、初代イネの葉からタンパク質を抽出後、ウエスタンブロッティング解析と抗ウイルス活性によりスクリーニングし、陽性個体から採種し、２代目のイネを培養した。さらに、陽性個体中のＣｈＩＦＮ−αの安定性を調べた。
【００２２】
前記遺伝子導入初代イネ４２個体のスクリーニングでは、植物タンパク質抽出液中に、抗ＣｈＩＦＮ−αウサギ血清で約２７ｋＤａのタンパク質として検出され、強陽性を示した８個体から稲籾を得、播種した。２代目イネについて各親株から１０個体をスクリーニングし、陽性個体を選抜した。得られた陽性個体の葉におけるＣｈＩＦＮ−αの安定性を調べるため、陽性を示したイネ個体の葉を４℃、２０℃、３７℃の環境下で１日、７日、２８日保存し、抗ウイルス活性について測定した。その結果、３７℃２８日間の保存においても、抗ウイルス価の減少は認められなかった。
【００２３】
すなわち、本発明は、以下に示されるトリインターフェロンを産生する組換え植物、その継代育成植物、それら植物からトリインターフェロンタンパク質を採取するトリインターフェロンの製造方法、その方法で製造されたトリインターフェロンを有効成分とする発育鶏卵用抗トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）作用剤、前記植物によるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現を確認するために用いる抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナルウサギ抗体、および植物形質転換用ベクターの発明である。
１.トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれてなることを特徴とするトリインターフェロンを産生する組換え植物。
２.トリインターフェロンタンパク質がトリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）である前記１に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
３.トリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）をコードする遺伝子が、ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され、このＰＣＲによりＣｈＩＦＮ−αＨｉｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端側でヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）配列が除去され、ＫＤＥＬコード配列が付加されたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子である前記２に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
４.リバースプライマーとしてＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬＲ；
5'-gcgagctcctaaagttcatccttagtgccgtgttgcctgt-3'（配列番号１；5'側下線部制限酵素ＳａｃＩ認識部位、3'側下線部ＫＤＥＬ部位）を用い、
フォワードプライマーとしてＣｈＩＦＮ−αＦ；
5'-cgagatctcccaccatggctgtgcctg-3'（配列番号２；下線部制限酵素ＢｇｌII認識部位）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）させる前記３に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
５.前記３に記載のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにライゲーションしたプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをトランスファーベクターとして用いるトリインターフェロンを産生する組換え植物。
６．アグロバクテリウムのノパリン合成酵素(ｎｏｓ)の転写終結配列（ターミネーター）、およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写物のプロモーター融合（インゲンPhasolin遺伝子第一イントロン、及びタバコモザイクウイルスΩ配列を含む）として構成されているキメラプロモーターシリーズの配列を含むプラスミドであるAgrobacteriumへの形質導入用トランスファーベクターｐＭＬＨのＧＵＳ部分にＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬを挿入したトランスファーベクターを用いる前記５に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
７.植物が、前記プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをAgrobacterium tumefaciens（以下：A. tumefaciens）に形質導入させた後、前記A. tumefaciensを植物細胞に感染させ、前記植物細胞核ゲノムへ遺伝子導入した組換え植物である前記５に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
８.組換え植物がイネ科植物である前記１〜７のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
９.イネ科植物が、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、またはトウモロコシである前記１〜８のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
１０.イネ科植物がイネである前記１〜９のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
１１.前記１〜１０のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物の継代育成植物。
１２.前記１〜１１のいずれかに記載の植物からトリインターフェロンタンパク質を採取するトリインターフェロンの製造方法。
１３.前記植物の葉からトリインターフェロンタンパク質を採取する前記１２に記載のトリインターフェロンの製造方法。
１４.前記１２または１３に記載の方法で製造されたトリインターフェロンを有効成分とする発育鶏卵用抗トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）作用剤。
１５.前記１〜１１のいずれかに記載の植物によるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現を確認するために用いる、精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓをウサギに免疫して得られる抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナルウサギ抗体。
１６.トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにライゲーションしたプラスミドをトランスファーベクターとすることを特徴とする植物形質転換用ベクター。
１７.トリインターフェロンタンパク質がトリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）である前記１６に記載の植物形質転換用ベクター。
１８.トリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）をコードする遺伝子が、ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され、このＰＣＲによりＣｈＩＦＮ−αＨｉｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端側でヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）配列が除去され、ＫＤＥＬコード配列が付加されたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子である前記１７に記載の植物形質転換用ベクター。
１９.リバースプライマーとしてＣｈＩＦＮ-αＫＤＥＬＲ；
5'-gcgagctcctaaagttcatccttagtgccgtgttgcctgt-3'（配列番号１；5'側下線部制限酵素ＳａｃＩ認識部位、3'側下線部ＫＤＥＬ部位）を用い、
フォワードプライマーとしてＣｈＩＦＮ−αＦ；
5'-cgagatctcccaccatggctgtgcctg-3'（配列番号２；下線部制限酵素ＢｇｌII認識部位）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）させる前記１８に記載の植物形質転換用ベクター。
２０.前記１８に記載のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにライゲーションしたプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをトランスファーベクターとして用いる植物形質転換用ベクター。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によって、トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれた組換え植物が産生するトリインターフェロンは安定な抗ウイルス活性を示すことが確認された。また、これにより、サイトカイン組換え植物の発現・培養系および評価系が確立され、現実にトリ特に鶏への投与が可能となった。本発明によれば、トリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）をコードする遺伝子を、植物細胞小胞体内タンパク蓄積に優れた特定のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子とすることができるし、植物発現タンパク質の発現量を高くする特定のトランスファーベクター；プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨを用いることができるので、植物での発現量が高い優れた植物ワクチンを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれてなることを特徴とするトリインターフェロンを産生する組換え植物、およびこれに関する発明である。本発明のトリインターフェロンとしては、経口ワクチンのアジュバントに適しているトリインターフェロン−α（特にＣｈＩＦＮ−α）が好ましい。植物は、トリインターフェロンの遺伝子を導入できるものであれば、いずれのものでもよい。植物への遺伝子導入は、自体公知の遺伝子導入方法によればよい。前記遺伝子導入の主な方法としては、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等が挙げられる。
【００２６】
現在、動物において、抗菌性飼料添加物及び動物用医薬品が多量に使用されており、これによる薬剤耐性菌の発生等が危惧されている。このため、抗菌性飼料添加物及び動物用医薬品の使用量低減のため、微量の薬剤を特定部位に効率的、選択的に作用させるドラッグデリバリーシステム（薬剤運搬システム）技術を用いた、確実な粘膜免疫の誘導に有効な経口ワクチンが重要とされている。また、経口ワクチンアジュバントとして、微量で効果があり、生体内物質であり残留性の問題のないサイトカインに注目した。なかでも、細胞内寄生菌の問題もあることから、Ｔｈ１応答を促すＩＦＮ−αが経口ワクチンのアジュバントに適していると考え、経口ワクチンの発現法として、飼料として経口的に投与でき、投与の際のストレスの軽減ができるなどの利点があり、獣医学領域における有用性が極めて高いとされる植物ワクチンを選択し、典型的には、植物においてＣｈＩＦＮ−αを発現して、ＩＦＮ−αの抗ウイルス活性を調べ、今後、植物発現トリインターフェロン（ＣｈＩＦＮ）がサイトカイン療法として治療の応用につながっていくことを確認した。
【００２７】
まず、植物発現用に、発現対象であるＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子の改変を行った。Ruttanapummaら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）がクローニングしたＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子の塩基配列を元に、植物細胞内での発現を視野に入れ３’末端にＫＤＥＬ配列を付加するようにプライマーを設計した。また、本発明では、精製のために付加されていたＨｉｓ−Ｔａｇを除去した。タンパク質のＣ末端に付加されるＫＤＥＬ配列は、例えば、実施例の［材料及び方法］６．ＣｈＩＦＮ−α遺伝子の改変１）プライマーの設計に記述した通り、小胞体にタンパク質を保持するためのシグナルであり、発現タンパク質に付加することにより小胞体内タンパク蓄積量が約４倍になる。バキュロウイルス発現系の場合には、発現タンパク質を細胞から培養上清中に分泌させ精製するが、植物発現系の場合,植物細胞内に留めておいた発現タンパク質を植物細胞ごと動物に給与する方法が主と考えられる。そこで、発現タンパク質にＫＤＥＬ配列を付加し、小胞体内へ蓄積させる方法を選択した。なお、植物細胞小胞体に発現タンパク質を輸送させるために、ＣｈＩＦＮ−αに本来備わっているＮ末端側のシグナル配列はそのまま用いた。またKozakのコンセンサス配列（Kozak, M. Nucleic Acids Res. 9:5233-52;1981、Kozak, M. J. Mol Biol. 156:807-20;1982、およびKozak, M. Gene. 234:187-208;1999）に従って、開始コドンであるＡＴＧの３塩基上流と１塩基下流をともにＡもしくはＧにすることにより開始コドンが効率よく働くように配慮し、さらに開始コドン上流および終了コドン下流の非翻訳領域を出来るだけ含めないように設計し、ＰＣＲを行った。得られたｃＤＮＡをシークエンスしたところ、ＫＤＥＬの付加、６つのシステイン残基、４ヶ所の推定糖鎖付加部位の存在を確認した。このＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を操作し、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現に成功した。
【００２８】
植物発現系を用いて発現を行う場合、発現タンパク質の発現量を上げることが重要となる。植物そのものまたは抽出分画を用いるにしても、タンパク質の発現量が高い場合は感染防御免疫を誘導するのに必要な量の抗原あるいはサイトカインを容易に経口投与できる。発現のレベルは使われる抗原タンパク質や発現に使われる植物種に依存するが、使われる発現系にも大きく依存する。つまり発現に使われるプロモーターの強さや組織特異性、選択されたリーダー配列、抗原遺伝子の起源などである（Mason, H. S.ら, Vaccine 16(13):1336-43；1998）。本発明では、用いたのは、植物における外来遺伝子の高レベル発現のためのキメラプロモーターシリーズであり、ノパリン合成酵素(ｎｏｓ)の転写終結配列、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写物プロモーターの融合として構成されている。これは、塩基上流からＥ７（エンハンサー、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの上流配列−９４０から−２９０と−２９０から−９０を７回繰り返し）、３５Ｓプロモーター（−９０塩基から−１塩基）、ｍＲＮＡ成熟を効率化する事によりＧＵＳ遺伝子発現を強調するイントロン、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳効率を向上させるタバコモザイクウイルスΩ塩基、ＧＵＳ、Ｔｉプラスミドにおけるノパリン合成酵素のためのポリアデニル化シグナル遺伝子であるＴｎｏｓの順に並んでいる（Mitsuhara, I.ら, Plant Cell Physiol 37(1):49-59;1996）。本発明では、アグロバクテリウムのノパリン合成酵素(ｎｏｓ)の転写終結配列（ターミネーター）、およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写物のプロモーター融合（インゲンPhasolin遺伝子第一イントロン、及びタバコモザイクウイルスΩ配列を含む）として構成されているキメラプロモーターシリーズの配列を含むプラスミドであるAgrobacteriumへの形質導入用トランスファーベクターｐＭＬＨ（文献：Mochizuki et al. 1999. Entomologia Experimentalis et Applicata 93: 173-178）のＧＵＳ部分にＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬを挿入し、大量培養・精製をした。
【００２９】
得られたプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨを植物形質転換用ベクターとして用いる。例えば、アグロバクテリウム法では、土中生息細菌の一種であるアグロバクテリウムが植物に感染して植物細胞に自らの遺伝子を移動させる性質を利用し、アグロバクテリウムの遺伝子にトリインターフェロンの遺伝子を結合させ、アグロバクテリウムの感染能力を利用して、トリインターフェロンの遺伝子を植物へ導入する。すなわち、前記プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをAgrobacterium tumefaciens（以下：A. tumefaciens）に形質導入させたA. tumefaciensを培養植物細胞に感染させることにより、ｐＭＬＨ上の高発現プロモーターＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ融合遺伝子を植物細胞核ゲノムへ遺伝子導入させることができる。エレクトロポレーション法では、植物細胞に電気ショックを与えることにより植物細胞に穴をあけ、そこからトリインターフェロンの遺伝子を植物へ導入する。パーティクルガン法では、例えば、金の微粒子にトリインターフェロンの遺伝子を付着させ、この微粒子を高圧ガス等の力により、葉等の植物組織に撃ち込んで遺伝子を導入する。これらのうち、アグロバクテリウム法は利点が多く、植物の遺伝子組み換えで主流になっている。よく知られているように、双子葉植物はアグロバクテリウムが容易に感染することができるが、単子葉植物にとってアグロバクテリウムは宿主範囲外であり、単子葉植物にアグロバクテリウム法は適用しにくい。しかし、これは、イネ科植物等の単子葉植物は、アセトシリンゴン等の低分子フェノール化合物を自身で合成しないためであり、現在では、アグロバクテリウムの感染時にアセトシリンゴンを添加することにより、単子葉植物への遺伝子導入が可能となっている。本発明における植物へのトリインターフェロン遺伝子の導入では、アグロバクテリウム法による導入が好ましい。
【００３０】
従って、トリインターフェロンを産生する組換え植物は、単子葉植物でも、双子葉植物でもよく、単子葉植物の例としては、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、またはトウモロコシ等のイネ科植物等が挙げられ、双子葉植物の例としては、ダイズ等のマメ科植物、タバコ、ジャガイモ、レタス等が挙げられる。これらのうち、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、またはトウモロコシ等のイネ科植物が好ましい。なかでも、イネが特に好ましい。
【００３１】
特定のタンパク質の同定、定量等を行うためには、タンパク質に対する特異的抗血清が必要であり、その際に抗原として用いるタンパク質は、高度に精製されている必要がある。本発明者らは、精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓを用いてウサギに免疫し抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナル抗体を作製した。作製した抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓウサギ抗体は５０００倍希釈した状態でも精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓを検出することが可能であった。植物発現のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬが生物活性を有していたことから、植物発現の立体構造は天然型に近いと考えられ、特異抗体は天然のＣｈＩＦＮ−αを認識すると考えられる。初代組換えイネ葉におけるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現の確認として、抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティング解析を行なった際に、植物発現タンパク質抽出液において、約２７ｋＤａのバンドが認められた。Ruttanapummaらの、約２７ｋＤａでは糖鎖付加しているという報告（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28；2005）から、組換え植物におけるＣｈＩＦＮ−αの発現では、糖鎖が付加されていると考えられた。
【００３２】
組換えイネ葉におけるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現を例にとると、トリインターフェロンを産生する組換え植物の継代育成については、初代組換えイネの葉からトリインターフェロンタンパク質を例えば抽出により採取後、ウエスタンブロッティング解析と抗ウイルス活性によりスクリーニングし、ウエスタンブロッティング解析強陽性を示す個体から稲籾を得、播種すればよい。前記ウエスタンブロッティング解析強陽性を示した８個体から稲籾を得、播種して得られた２代目イネについて各親株から１０個体以内をスクリーニングし、陽性個体を選抜した。スクリーニングして得られた陽性個体の葉におけるＣｈＩＦＮ−αの安定性を調べるため、鶏胎仔由来細胞であるＣＥＦ細胞を用いてバイオアッセイを行った。陽性を示したイネ個体の葉を−２０℃、４℃、室温、３７℃の環境下で１日、７日、２８日保存し、抗ウイルス活性について測定した。その結果、３７℃の保存においても、力価の低下はまったく認められなかった。３７℃２８日間の保存においても、抗ウイルス価の減少は認められなかったことは十分「食べるワクチン」の実現を可能とさせる結果であった。
【００３３】
植物ワクチンの開発は、実用化という点で抜本的に優れていると考えられる。実際、アメリカでは植物ワクチンの低価格性、安全性、および有効性などに着目し、研究開発を進めている。このような状況下で、今日までタバコやジャガイモなどの双子葉類に属する植物がアグロバクテリウム法を用いた形質転換の技術で比較的容易にトランスフォームでき（Mitsuhara, I.ら, Plant Cell Physiol 37(1):49-59;1996）、また動物実験の際、ジャガイモはマウスが生でも好んで食べるので植物ワクチンのモデル植物として研究者の間で広く使われてきた。
【００３４】
現在、畜産業が大型化する中、ウシやブタ、ニワトリなどの家畜動物に対する安価な感染予防機能性タンパク質の生産は、畜産分野におけるウイルス、寄生虫、および細菌感染症がもたらす経済的な打撃を考慮すると、実用化を目指して開発を進めていく必要がある。家畜向けの感染予防機能性タンパク質の飼料用作物による生産は、これまですでに確立されたジャガイモなどの植物組換え技術を適用することで、ヒト向けの組換え農作物を含んだ食品の開発と同様、技術的に十分可能性のあるものである。ジャガイモに生理・免疫活性機能を持つタンパク質を発現させ、ヒトへの利用を目指す場合、熱処理によって組換えタンパク質の機能を損なうおそれがある。しかし、家畜動物を対象とした場合、乾燥させたジャガイモの断片や粉末などを一般的に家畜に用いられているトウモロコシなどの飼料と混ぜて与えることが可能である。さらに今までの口蹄疫に対する機能性タンパク質の発現（Dus Santos, M. J.ら, Rev.Sci.Tech. 24:175-187;2005）だけではなく、豚コレラや鳥類一般特にニワトリのニューカッスル病など様々な家畜に被害をもたらす危険性のある病気や、豚の日本脳炎など家畜動物がヒトの感染に関与しているような病気に対して、感染防御の機能をもつ飼料用作物を作ることが可能である。
【００３５】
また、近年、サイトカイン発現植物の開発と粘膜アジュバントとしての利用が注目されている。獣医学領域では、輸送等のストレスにより免疫力が低下し、下痢等の粘膜を侵入門戸とする病原体に感染してしまうことが重要な問題となっている。動物は種々のサイトカインを産生して免疫系の調節（増強・抑制）を行っている。そこで、粘膜面にサイトカインを投与し、粘膜面の免疫系を活性化させるアジュバントとして利用することは、家畜衛生上非常に有用であると考えられる。これまでにアグロバクテリウム法を用いて、ＩＦＮ−α（Ohya, K.ら, J.Interferon.Cytokine.Res. 21:595-602;2001）、ＴＮＦ−α（Ohya, K.ら, J.Interferon.Cytokine.Res. 22:371-378;2002）、インターロイキン２（ＩＬ−２）（Park, Y.ら, Protein Expression and Purification. 25:160-165;2002）などを発現する植物（ジャガイモ、タバコ）の作出に成功したと報告がある。発現された組換え体は本来の生物活性を保持している。今後、種々のサイトカイン発現植物を経口的に投与し、それらの粘膜アジュバント効果についての検討に期待が高まる。本発明では、本発明者らは、典型的には、ＣｈＩＦＮ−αのイネでの発現を実証し、イネの葉で、比較的生物活性が長期間安定であること示し、これにより、イネの葉をトリ特に鶏に給与することによる、サイトカインデリバリー系の実現を可能とした。
【００３６】
さらに、本発明によると、トリインターフェロンを有効成分とする発育鶏卵用抗トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）作用剤が得られる。本発明では、発育鶏卵におけるＩＦＮ−α投与によるＡＩＶ感染抑制が認められた。ＩＦＮ−αは、抗ウイルス活性および免疫応答に重要な役割を持つサイトカインである。現在、タンパク質発現系として従来の系に比べ、低コスト、安全性、精製が不要など多くの利点があり、そのまま飼料として経口的に投与が可能な植物発現系が注目されている。そこでトリへの外来性サイトカイン応用の一環として、典型的には、植物でニワトリＩＦＮ−α(ＣｈＩＦＮ−α)を発現させ、性状を調べ、これを利用して発育鶏卵（in ovo）でトリインフルエンザウイルス（avian influenza virus）(ＡＩＶ）に対する効果を調べた。植物発現したＣｈＩＦＮ−αを抽出し、抽出したＣｈＩＦＮ−αを発育鶏卵に投与し、次の日ＡＩＶで攻撃し、検卵した。また、漿尿液を回収し、漿尿液中のウイルスの有無を鶏赤血球凝集試験（ＨＡ試験）により判定した。検卵、およびＨＡ試験の結果から、ＩＦＮ−α投与群は、各ウイルスＨ３Ｎ８、Ｈ６Ｎ２、Ｈ７Ｎ１に対し抗ウイルス作用があり、ＩＦＮ-αはin OvoでＡＩＶに対して抗ウイルス活性があることがわかった。このように、本発明の組換え植物から抽出したトリインターフェロン（ＣｈＩＦＮ）を投与された卵はウイルスに対して防御されることが確認された。
【実施例】
【００３７】
［材料及び方法］
１．ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子
当研究室のRuttanapumma ら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）がクローニング、作製したＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子に対するｃＤＮＡを用いた。
【００３８】
２．植物発現ベクター
Agrobacteriumへの形質導入用トランスファーベクターであるプラスミドｐＭＬＨは独立行政法人農業生物資源研究所（つくば市、茨城県）から分与された。制限酵素地図並びにコード遺伝子の模式図は（図１)に示した。図１は、Agrobacteriumへの形質導入用トランスファーベクターである、植物用高発現ベクターｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳの制限酵素地図並びにコード遺伝子の模式図である。発現させたい遺伝子をＧＵＳ遺伝子の代わりに挿入させる。本発明においては、ＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、ＧＵＳの部分に、ＢｇｌＩＩ（ＢａｍＨＩと切り口が同じ）とＳａｃＩで切断したＩＦＮ−α遺伝子を導入し、組換えプラスミドを作製した。
【００３９】
３．制限酵素
制限酵素は、ＢｇｌII、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ（宝酒造株式会社、京都市、京都府）を用いた。認識配列及び切断部位（：）はそれぞれ、Ａ:ＧＡＴＣＴ、Ｇ:ＡＧＣＴＣ、Ｇ:ＡＡＴＴＣ及びＴ:ＣＴＡＧＡである。制限酵素は製品マニュアルに基づいて使用した。
【００４０】
４．遺伝子操作
遺伝子操作は、Molecular Cloning（Sambrook, J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harber Laboratory, N. Y.1989.）に従って行った。
【００４１】
５．アガロースゲル電気泳動
アガロースゲル電気泳動には、ＴＢＥ緩衝液（0.1Ｍ Ｔｒｉｓ, ２ｍＭ ＥＤＴＡ, ８５ｍＭ Boric acid）にＳeaＫem ＧＴＧ Ａgarose（宝酒造株式会社）を１％濃度で加え、加熱溶解後、エチジウムブロマイドを最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬになるように加え、室温にてゲル化し作製した。試料を１００Ｖの定電圧で３０分から１時間泳動し、紫外線照射により核酸を検出した。
【００４２】
６．ＣｈＩＦＮ−α遺伝子の改変
１）プライマーの設計
ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端側では、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）配列を除去し、ＫＤＥＬコード配列を付加するよう設計した。Ｈｉｓ−Ｔａｇは得られるタンパク質の精製を考慮して付加された配列であるが（Ruttanapumma ら，J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）、本発明では精製工程を必要としないので不要であった。ＫＤＥＬ配列は、小胞体にタンパク質を保持するためのシグナルで、この配列を付加することにより、小胞体内タンパク蓄積量が約４倍になる（Torres, E.ら, Tansgenic Research 8:441-449；1999）。ＣｈＩＦＮ−α遺伝子配列を参考に、リバースプライマー（Reverse primer）としてＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬＲ；5'-gcgagctcctaaagttcatccttagtgccgtgttgcctgt-3'（5'側下線部制限酵素ＳａｃＩ認識部位、3'側下線部ＫＤＥＬ部位）を設計した(図２)。図２は、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬクローニングのためのＰＣＲプライマーの塩基配列を示す。ＣｈＩＦＮ−α遺伝子のＣ末端に小胞体保留シグナル（ＫＤＥＬ）配列を付加するよう、プライマー（Forward primerとReverse primer）を設計し、既にクローニングされているＣｈＩＦＮ−α遺伝子を鋳型にＰＣＲ法で遺伝子を改変した。フォワードプライマー（Forward primer）は、ＣｈＩＦＮ−αのシグナル配列を活かせる様、Ruttanapumma ら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）がｃＤＮＡクローニングの際に設計したＣｈＩＦＮ−αＦ；5'-cgagatctcccaccatggctgtgcctg-3' （下線部制限酵素ＢｇｌII認識部位）を用いた。プライマーの合成はグライナージャパン株式会社（東京）に依頼した。
【００４３】
２）ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子の増幅
ＰＣＲ Ｃore Ｋit(Perkin-Elmer, MA, USA)を用いて、上記ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（Ｐolymerase Ｃhain Ｒeaction；ＰＣＲ）法を行った。ＣｈＩＦＮ−αＦとＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬＲをプライマーに用いて、Ｓｔｅｐ１（９５℃×５分間）を１サイクル、Ｓｔｅｐ２（９５℃×１分間、５３℃×１分間、７２℃×１分間）を３０サイクル、Ｓｔｅｐ３（７２℃×３分間）を１サイクル行った。
【００４４】
３）ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子のクローニング・配列決定
ＰＣＲ法で増幅させたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子をＴＡ Ｃloning Ｋit（Invitrogen, CA,USA）を用いて、プラスミドベクターであるｐＣＲ２．１にライゲーションさせた。これをHeat Shock法により宿主大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造株式会社）に形質導入させ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、0.12％Ｘ−ｇａｌ（５-Bromo-４-Chloro-３-indolyl-β-d-Galactoside）添加ＴＹＭ寒天培地（２％bacto-tryptone,0.5％yeast extract、0.1％ glucose、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、1.5％ bacto agar）上で３７℃において一晩培養した。β-ガラクトシダーゼはＸ−ｇａｌを代謝し、青色の色素を生成するが、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子がベクターのlac-Z領域に挿入された場合、β-ガラクトシダーゼが産生させず、白色のコロニーが認められる。このWhite-Blue Selectionを利用して、白色コロニーを選択し、一晩ＴＹＭ液体培地（２％bacto-tryptone,0.5％yeast extract、0.1％ glucose、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）中で培養し、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＣＲ２．１を得た。これからプラスミドを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化後にアガロースゲル電気泳動によりＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子挿入の確認を行った。挿入の確認されたプラスミドを用いてDideoxy Terminator法によりシーケンス反応を行った。反応には標識蛍光ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を用いたDye Terminator Cycle Sequencing Kit FS（Perkin-Elmer）を使用した。９６℃×４５秒間、５０℃×３０秒間、６０℃×４分間の反応を２５サイクル行い、スピンカラムによる精製後、ABI PRISM310 Genetic Analyzer（Perkin-Elmer）にかけ塩基配列を決定した。
【００４５】
７．ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの植物での発現
１）植物発現トランスファーベクターの作製
クローニングで得られたプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＣＲ２．１をＢｇｌII、ＳａｃＩで消化後、アガロースゲル電気泳動で展開し、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子フラグメントをゲルごと切り出した。フェノール処理後エタノール沈殿によりＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を精製した。植物発現ベクターであるｐＭＬＨについては、ＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化し、３５Ｓプロモーター(高発現プロモーターの開発を目的としてカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを改変したもの)下流のＧＵＳ遺伝子を除去した。なお、ＧＵＳはβ-グルクロニダーゼタンパク質のコード領域であり、除去しても、プラスミドの増殖性に影響はない。上記で得られたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子フラグメントをプラスミドｐＭＬＨのＢａｍＨＩとＳａｃＩサイトにＴakara ＤＮＡ Ｌigation Ｋit（宝酒造株式会社）を用いてライゲーションした。次いでHeat Shock法により宿主大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造株式会社）に形質導入させ、これを５０μｇ／ｍＬカナマイシン添加ＴＹＭ寒天培地上で一晩培養した。出現コロニーから５０μｇ／ｍＬカナマイシン添加ＴＹＭ液体培地にて培養しプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨを得た。ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子フラグメントの挿入は、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ消化後アガロースゲル電気泳動により確認した。１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌadder（宝酒造株式会社）を同時に泳動し、サンプルＤＮＡの長さを推定した。プラスミドを大量培養・精製後、組換え植物を得るため（独）農業生物資源研究所へ送付した。
【００４６】
２）組換え植物の作製（形質導入）
（独）農業生物資源研究所において、プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをAgrobacterium tumefaciens（以下：A. tumefaciens）に形質導入させた後、A. tumefaciensを培養植物細胞に感染させ、植物細胞核ゲノムへ遺伝子導入した。なお、A. tumefaciensは、植物に感染するグラム陰性の植物病原性の土壌細菌である。A. tumefaciensは、植物への感染過程でＴ−ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡ断片を植物ゲノムに導入する。このプロセスを利用して、Ｔｉプラスミドと呼ばれるＴ−ＤＮＡを含むタンパク遺伝子を植物ゲノムに組み込み、カルス（植物の種子または未熟胚組織は、栄養分を含む培地で培養すると脱分化した細胞魂であるカルスとなる）にして、目的遺伝子を含む組換えA. tumefaciensの共培養を通じて、この細菌から植物へタンパク遺伝子の導入を行った（Brencic, A.ら, Mol Microbiol. 57(6):1522-1531;2005、Fukuoka, H.ら, Plant Cell Reports 19:815-820;2000、Mitsuhara, I.ら, Plant Cell Physiol 37(1):49-59;1996）。この後、培養して初代組換えイネを作出した（図５）。図５は、組換え植物の作製（形質導入）を図で表したものである。プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをAgrobacterium tumefaciensに形質導入させた後、Agrobacteriumを培養植物細胞に感染させ、植物細胞核ゲノムへ遺伝子導入し培養してイネを作出した。選別は、ハイグロマイシン耐性により、遺伝子導入個体を選別し、組換えイネを作出した。なお、遺伝子導入植物の選別は、抗生物質耐性を利用する方法に限られず、特定の除草剤に対する抵抗性を利用する方法等の他の公知の方法によっても実施することができる。
【００４７】
３）植物発現タンパク質の抽出
組換え体として個々に作出・管理されたイネ（ＮＯ．１〜４２：３５は欠番）の葉の一部を刈り取り、液体窒素で凍結させ、冷凍状態で当研究室へ輸送した。そのイネを滅菌ハサミで細かく切り刻み、Digital Homogenaizer（AS ONE株式会社、大阪）備え付けのチューブに入れ、イネの重量と同量のリン酸緩衝生理食塩水（Phospfate Buffered Saline：1.37Ｍ NaCl, ２ｍＭ KCl, ３ｍＭ Na2HPO4, 1.5ｍＭ KH2PO4，ｐＨ7.4：以下ＰＢＳ）を加えDigital Homogenaizerで、6,000ｒｐｍ １０秒間の磨り潰しを氷中で約２０回繰り返し、磨り潰し葉液をマイクロチューブに採取した。その葉液を17,400ｇ、５分間遠心し、上清を新たなマイクロチューブに回収し、植物発現タンパク質抽出液として−２０℃に保存した。
【００４８】
４）ウェスタンブロッティング解析
組換えイネによるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現を確認するために、ウエスタンブロッティング解析を行った。上記、植物発現タンパク質抽出液に、Laemmli（Nature 277:680-685;1970）の４ｘサンプルバッファー（62.5ｍＭ Tris-HCl ｐＨ6.8, ２％ＳＤＳ, １０%Glycerol, 0.02% Bromophenol blue, ５％ ２-メルカプトエタノール；２Ｍｅ＋Buffer）を３：１の割合で混合した。各試料を１００℃で５分間煮沸し、ＳＤＳを含む12.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により展開した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、ゲルを転写緩衝液（0.02Ｍ Tris, 0.15Ｍ Glycine, 0.01% ＳＤＳ, ５％ Methanol）で洗浄し、ウエスタンブロッティング装置ホライズブロット（アトー株式会社、東京）を用いて、ニトロセルロース膜Hybond C Extra（Amersham, Amersham, UK）に１００ｍＡで1.5時間転写した。転写後、ニトロセルロース膜未結合部分をブロック液（１％Skim Milk Powder, 0.1％ Tween-20をＰＢＳに溶解）をＰＢＳでブロッキングした。ついで一次抗体として抗ＣｈＩＦＮ−α−Ｈｉｓポリクローナルウサギ血清を用い、室温で３時間反応させた。反応後、ブロック液で３回洗浄し、二次抗体を３７℃で２時間反応させた。二次抗体は、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ血清（BD Biosciens Pharmingen,San Jose,CA,USA）を希釈して用いた。反応後、ＰＢＳで３回洗浄し、BM blue POD substrate (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)用いて発色させた。
【００４９】
５）２代目イネの作製
初代イネ葉からタンパク質を抽出後、ウエスタンブロッティング解析と抗ウイルス活性によりスクリーニングし、陽性であった組換えイネ番号から子孫用の種子を（独）農業生物資源研究所において採取し、同研究所において、得られた種子を用土に播種し、２代目を生産した。２代目の発現を上記４）の方法及び生物活性として抗ウイルス活性で確認した。
【００５０】
８．抗ＣｈＩＦＮ−α抗体の作製
バキュロウイルス発現ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓをRuttanapumma ら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）の方法で精製した。精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ４４０μｇ／ｍＬの1.5ｍＬを同量のFreund's complete adjuvant（FCA；株式会社ヤトロン、東京）と混合、ゲル化させ、日本白色種ウサギ２羽に1.5ｍＬずつ頚部に免疫し、ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓに対するモノスペシフィックポリクローナル抗体を作製した。ウサギに１週おきに免疫し、初回免疫から４週後に心臓採血、血清を分離し、抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓウサギ血清（抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナル抗体）とした。精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓを抗原とし、作製したそれぞれの抗血清を一次抗体として用い、それぞれペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ血清（BD Biosciens Pharmingen）を用いてウエスタンブロッティング解析を行い、抗体価を測定した。
【００５１】
９．イネ葉中でのＩＦＮ−αの安定性評価
作出された２代目のイネ葉を刈り取り、液体窒素で凍結させ、冷凍状態で当研究室へ輸送されてきたイネの葉を0.6ｇずつシャーレに入れ、−２０℃、４℃、室温、３７℃の環境下で１日、７日、２８日保存した。上述の方法でイネ葉からタンパク質抽出液を採取して、抗ウイルス活性を調べた。
【００５２】
１０．鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）を用いた抗ウイルス活性の測定
抗ウイルス活性は、Ruttanapumma ら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）の方法で行った。保存しておいたイネの葉のタンパク質抽出液の抗ウイルス活性を鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ；chicken embryo fibroblast）を用いて測定した。１０日齢発育鶏卵からのＣＥＦの作製はTakeharaら（Avian Dis. 31:125-129;1986）の方法に基づいて行った。ＣＥＦを1.0×１05cells/１００μｌ/wellで９６穴プレートに播きフルシート後、培養上清を除去した。イーグルＭＥＭで１０倍階段希釈した葉から抽出したＣｈＩＦＮ−αを１００μｌ/wellで添加し、約２４時間感作させ、１００ ＴＣＩＤ50（５０％ tissue culture infective dose）/１０μｌ/wellでVesicular stomatitis virus（ＶＳＶ）を接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）を経時的に観察した。抗ウイルス活性は、光学顕微鏡下でＣＰＥ抑制が認められた最大希釈倍数の逆数を抗ウイルス活性値（ＥＵ／ｍＬ）とした。
【００５３】
［結果］
１．ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子の作製
当研究室のRuttanapumma ら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）がクローニング、作製したＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子に対するｃＤＮＡに対し、遺伝子改変用にプライマーＣｈＩＦＮ−αＦとＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬＲを設計した(図２)。これらを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅遺伝子の一部を用いて１％アガロースゲル電気泳動で展開したところ、約６００ｂｐの特異的増幅を確認した。
ＰＣＲ産物をTA Cloning Kitを用いてｐＣＲ２．１にライゲーションし、コンピテント細胞である大腸菌ＪＭ１０９へトランスフォーメーションした。White-Blue Selectionを利用して目的遺伝子の挿入されているホワイトコロニーを選択し、増菌培養を行った。得られた大腸菌からプラスミドを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化後、１％アガロースゲル電気泳動で展開した。１００ｂｐ ＤＮＡ Ladderと比較したところ、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子と推定される約６００ｂｐとベクターと推定される約３，９００ｂｐの２本のバンドが認められた。
【００５４】
ＰＣＲにより、Ｈｉｓ−が除去され、ＫＤＥＬ配列が付加されたことを確認するため、クローン化した遺伝子の配列を決定した。その結果、鋳型に用いたＣｈＩＦＮ−α遺伝子配列と同じであり、さらに終了コドン直前に、ＫＤＥＬコード配列が挿入されていることを確認した（図３）。図３は、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ塩基配列及び推定アミノ酸配列を示す。ＫＤＥＬ配列を付加させるようにＰＣＲ法で増幅させた遺伝子をクローニング後、配列決定した。ＣｈＩＦＮ−α本来の小胞体への移行シグナル配列を維持させたまま、Ｃ末端の終了コドン直前にＫＤＥＬ配列が付加されたことを確認した。糖鎖付加部位を推定し、５'末端と３'末端にそれぞれＢｇｌＩＩとＳａｃＩの制限酵素認識配列を確認した。ＯＲＦは、Ｃ末端にＫＤＥＬを含む５９１ヌクレオチドからなり１９７の推定アミノ酸がコードされている。推定シグナルペプチドは３１残基からなり、タンパク質の高次構造の形成に重要なシステイン残基は６つ存在した。さらに、アミノ酸残基６５−６７（ＮＡＳ）、７１−７３（ＮＤＴ）、１０８−１１０（ＮＤＳ）、１８６−１８８（ＮＬＴ）での4つの重要なＮ−グリコシル基形成部位を示した(図３）。
【００５５】
２．トランスファーベクターの構築
塩基配列決定を行い、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子と確認されたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ＰＣＲ２．１をＢｇｌII、ＳａｃＩで消化し、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を含む断片をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにTakara DNA Ligation Kitを用いてライゲーションした。さらにコンピテントセルにトランスフォーメーションし（図４）、大腸菌からプラスミドを抽出した。この抽出したプラスミドをＳａｃＩ、ＸｂａｒＩで消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行ったところ、約６００ｂｐの挿入遺伝子と約１２，０００ｂｐのｐＭＬＨベクターのＤＮＡが確認された。図４は、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ導入植物作製を図で表したフローチャートである。まず、ＰＣＲ法によりＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬを増幅し、プラスミドｐＣＲ２．１にクローニングした。配列確認後、ｐＣＲ２．１から制限酵素ＢｇｌＩＩとSａｃＩを用いてプラスミドを消化し、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を取り出した。得られたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を、制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化してＧＵＳ遺伝子を除去された植物用高発現ベクターｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳに挿入した。本プラスミドをAgrobacteriumに導入させ、続いて植物細胞に感染させることにより、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を植物細胞染色体に組み込んだ。
【００５６】
３．ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ発現組換え植物の作製
ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨを（独）農業生物資源研究所に送付した。そこで、アグロバクテリウム法を用いて、A. tumefaciensから植物細胞核ゲノムに遺伝子導入し、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ組換え植物である初代イネを作出した（図５）。
【００５７】
４．抗ＣｈＩＦＮ−αポリクローナル抗体の作製
Ruttanapummaら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）の方法で精製したバキュロウイルス発現ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓをウサギに免疫し抗ＣｈＩＦＮ−αウサギ血清を得た。ウエスタンブロッティング法により抗体価を測定したところ、１：５，０００倍希釈まで精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓを検出することが出来た(図６)。図６は、ウエスタンブロッティング法による抗血清の確認を図で表したものである。バキュロウイルス発現系でＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ（Ｃ末端にヒスチジンタグ：Ｈｉｓ−ｔａｇを付加させ、精製を容易にしたＣｈＩＦＮ−α）を発現させ、ニッケルキレートカラムで精製した。ウサギに免疫し、ウエスタンブロッティング法により抗血清の抗体価を測定した。ウサギ血清を1：５０００倍希釈した場合においても、図６のように特異的なバンドが認められ、ＣｈＩＦＮ−αに対して高度免疫血清が作製できた。すなわち、抗原に精製したＣｈＩＦＮ−αＨｉｓを用い、一次抗体に作製した抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓウサギ血清を希釈して用いたウエスタンブロッティング法（Western-Blotting法）により抗体価を測定し（二次抗体にはＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を用いた）、ウサギ血清は１：５０００倍希釈まで精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓを検出することができた。なお、この時点においても精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓは６本のバンドとして確認することができる。約１７ｋＤａ、１９ｋＤａ、２３ｋＤａ、および２７ｋＤａのバンドは、前記Ruttanapummaらの報告と一致している。このように、本血清で精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓに対してウエスタンブロッティング解析を行うと、図６のようにバンドが６本認められるが、これは、ウサギに免疫した際に混入した異物かと考えられた（前記Ruttanapummaらの報告では、精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓに対するウエスタンブロッティング解析では抗ヒスチジン抗体を用いたところバンドは４本であった）。
【００５８】
５．ＣｈＩＦＮ−α−ＫＤＥＬ組換え植物の発現の確認
冷凍状態で（独）農業生物資源研究所から送付されてきた初代イネ（ＮＯ．１〜４２：３５は欠番）の葉をDigital Homogenaizer（AS ONE株式会社）で磨り潰し、タンパク質抽出液を採取した後、抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティング解析を行った。ＣｈＩＦＮ−α−ＫＤＥＬ組換えイネは約２７ｋＤａの位置にバンドが認められた。強陽性を示した検体はＮＯ．２３〜２７、３４、３６、３８の８個体であった(データは示していない)。対照として用いた遺伝子組換えしていないイネ“日本晴”には抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナル抗体で認識されるバンドが認められなかった。
【００５９】
この後、強陽性を示した８個体の組換えイネの育成状況を（独）農業生物資源研究所で調べた。その結果、表１（：Table 1.ＣｈＩＦＮ−α組換えイネの育成状況）に示すように、それぞれＮＯ．２３はコメ粒数１２２個から５３個体育成し、ＮＯ．２４は、１２４個から４９個体、ＮＯ．２５は３０個から２２個体、ＮＯ．２６は１１個から７個体、ＮＯ．２７は１０個から２個体、ＮＯ．３４は１００個から３個体、ＮＯ．３６は５１個から３４個体、ＮＯ．３８は９４個から４２個体を育成した（表１）。
【００６０】
【表１】
【００６１】
陽性個体から育成した２代目イネについて各親株から１０個体以内を、上述の方法でウエスタンブロッティング解析をした（図７）。図７は、ＣｈＩＦＮ-αＫＤＥＬの確認を図で表したものである。組換えイネが目的のタンパク質を発現しているかどうか、ウエスタンブロッティング法で調べた。異なるイネ個体の葉から抽出した資料をＳＤＳ-ＰＡＧＥで展開後、ニトロセルロース膜に転写し、抗ＣｈＩＦＮ-αＨｉｓウサギ血清を用いて抗原抗体反応を行った。約２７ｋＤaの位置にバンドが検出された個体があり、この分子量は、ＣｈＩＦＮ-αＨｉｓ発現で得られた最も分子量が高いタンパク質と一致したことから、糖鎖付加されていると推察された。すなわち、１代目に発現が認められた２代目イネをスクリーニングして得られた陽性固体の発現について抗ＣｈＩＦＮ−α抗体を用いてウエスタンブロッティング（Western-Blotting）法により発現の確認をしたところ、約２７ｋＤａの位置に推定糖鎖付加部位としてバンドが認められた。
【００６２】
６．イネ葉中でのＩＦＮ−αの安定性評価
（独）農業生物資源研究所から冷凍状態で送付されてきた、２代目でスクリーニングした陽性個体の葉を用い、植物細胞内におけるＣｈＩＦＮ−αの生物活性の安定性を調べた。収穫した組換えイネの葉を切り、４℃、２０℃、３７℃の環境下で１日、７日、２８日保存した。それらのタンパク質を抽出し、ＣＥＦ細胞を用いて既述の方法で抗ウイルス活性を用いてバイオアッセイを行った。その結果、表２（：Table 2.イネ葉中ＩＦＮ−αの生物活性）に示すように、−２０℃では、７日保存では1.0×１０5倍希釈、２８日保存では1.0×１０6倍希釈までＶＳＶによるＣＰＥを抑制し、それぞれ、−２０℃環境下７日保存は1.0×１０5ＥＵ／１００μｌ、２８日保存は1.0×１０6ＥＵ／１００μｌの生物活性が認められた。４℃では、１日保存では1.0×１０7倍希釈、７日保存では1.0×１０8倍希釈、２８日保存では1.0×１０8倍希釈までＶＳＶによるＣＰＥを抑制し、それぞれ、４℃環境下１日保存は1.0×１０7ＥＵ／１００μｌ、７日保存は1.0×１０8ＥＵ／１００μｌ、２８日保存は1.0×１０8ＥＵ／１００μｌの生物活性が認められた。室温では、１日保存では1.0×１０8倍希釈、７日保存では1.0×１０8倍希釈までＶＳＶによるＣＰＥを抑制し、それぞれ、室温環境下１日保存は1.0×１０8ＥＵ／１００μｌ、７日保存は1.0×１０8ＥＵ／１００μｌの生物活性が認められた。室温２８日保存もこれらと同様の生物活性が認められた。３７℃では、１日保存では1.0×１０8倍希釈、７日保存では1.0×１０7倍希釈、２８日保存では1.0×１０8倍希釈までＶＳＶによるＣＰＥを抑制し、それぞれ、３７℃環境下１日保存は1.0×１０8ＥＵ／１００μｌ、７日保存は1.0×１０7ＥＵ／１００μｌ、２８日保存は1.0×１０8ＥＵ／１００μｌの生物活性が認められた。これに対し、対照として用いた“日本晴”は、時間・温度に関わらず、抗ウイルス活性は認められなかった（表２）。
【００６３】
【表２】
【００６４】
［発育鶏卵におけるＩＦＮ−α投与によるＡＩＶ感染抑制］
１．目的
ＩＦＮ−αは、抗ウイルス活性および免疫応答に重要な役割を持つサイトカインである。現在、タンパク質発現系として従来の系に比べ、低コスト、安全性、精製が不要など多くの利点があり、そのまま飼料として経口的に投与が可能な植物発現系が注目されている。そこでトリへの外来性サイトカイン応用の一環として、典型的には、植物でニワトリＩＦＮ−α(ＣｈＩＦＮ−α)を発現させ、性状を調べ、これを利用して発育鶏卵（in Ovo）でトリインフルエンザウイルス（avian influenza virus）(ＡＩＶ）に対する効果を調べる。
２．方法
植物発現したＣｈＩＦＮ−αをホモジナイズにより抽出し、力価測定をした。抽出したＣｈＩＦＮ−αを発育鶏卵（１０日齢）に投与し、次の日ＡＩＶで攻撃し、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９８ｈごとに検卵した。死亡した卵は４℃に保存した。９８ｈ後卵をすべて４℃に保存して２４ｈ後、漿尿液を回収しＨＡ試験を行った。
植物：イネ（葉）
植物抽出(0.1ｍＬ／卵)：ＩＦＮ−α（１０Ｕ）、Control
Virus：Ｈ３Ｎ８，Ｈ６Ｎ２，Ｈ７Ｎ１(１０ＥＩＤ５０／0.1ｍＬ／卵)
各ウイルスに対しα群、Ｃ群（Control群）それぞれ１０個の卵を使用。
３．結果・考察
【００６５】
【表３】
【００６６】
検卵の結果から、各ウイルスは、α群（ＩＦＮ−α群）とＣ群(Contorol群)を比較すると、α群（ＩＦＮ−α群）は抗ウイルス作用があることがわかる。ＨＡ試験の結果をみると、検卵による生死の判定にほぼ一致しており、検卵で生きていた卵もウイルス感染していることがわかった。また、胎児を卵から取り出してα群とＣ群を比較すると、どのウイルスもＣ群のほうが胎児が小さく赤く充血していた。一方、α群は正常だった。これにより、ＩＦＮ-αはin OvoでＡＩＶに対して抗ウイルス活性があることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】Agrobacteriumへの形質導入用トランスファーベクターであるプラスミドｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳの制限酵素地図並びにコード遺伝子の模式図。
【図２】ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬクローニングのためのＰＣＲプライマーの塩基配列図。
【図３】ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ塩基配列及び推定アミノ酸配列図。
【図４】ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ導入植物作製図（フローチャート）。
【図５】組換え植物の作製（形質導入）図。
【図６】ウエスタンブロッティング法による抗血清の確認図。
【図７】ＣｈＩＦＮ-αＫＤＥＬの確認図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリインターフェロンを産生する組換え植物、その継代育成植物、それら植物からトリインターフェロンタンパク質を採取するトリインターフェロンの製造方法、その方法で製造されたトリインターフェロンを有効成分とする発育鶏卵用抗トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）作用剤、前記植物によるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現を確認するために用いる抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナルウサギ抗体、および植物形質転換用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
畜産業は戦後急成長し、それに伴い家畜の飼育頭羽数は増大している。この間、経営体数が減少する一方で経営規模が急拡大し、かつてのように農家の庭先で数頭（数羽）飼っている状態から、専業の大規模経営が生産の大部分を担っている構造になった。特にこの傾向は豚、採卵鶏、ブロイラーで顕著であり、生産量に占める法人経営の割合はそれぞれ50.3％、72.4％、49.5％（95年）に達している。
【０００３】
現在、畜産業が大規模経営になってきていることから、飼料、ワクチン、抗生物質などで、安価で良質、そして多数の家畜への効率的な投与が望まれている。しかし、実際には成長促進を目的とした抗菌性飼料添加物や疾病治療のための動物用医薬品が多量に使用されており、これによる薬剤耐性菌の発生等が危惧されている。このため、抗菌性飼料添加物及び動物用医薬品の使用量を低減させる減投薬飼養管理システムの構築に向けて、家畜の免疫機能を活性化させる飼料及び飼料添加物の利用技術の開発、また、動物用医薬品の使用低減のため、微量の薬剤を特定部位（臓器・組織）に効率的、選択的に作用発現させるドラッグデリバリーシステム（薬剤運搬システム）技術の開発が必要とされている。
【０００４】
さらに、ワクチンなどの動物医薬品は、家畜の感染症を防御するために有効であるが、その多くは個体ごとに注射器で接種されており、多大な労力を要するばかりでなく、家畜へのストレス、感染症侵入の機会の増大等、生産性を阻害している。以上のことをふまえ、これらの問題を解消する手段として経口ワクチンがあるが、抗原量の低減化および腸管への確実な抗原送達が課題となっている。そこで、ドラッグデリバリーシステム技術を用いて、確実な粘膜免疫の誘導に有効な経口ワクチンが重要となってくる。
【０００５】
粘膜免疫システムとは、現在までに解明の進んできた胸腺、骨髄をメルクマールとしてきた全身系・末梢系免疫システムとは異なった誘導・制御機構のもとに作動していることがわかってきた。例えば、頻繁に使用されてきた方法である注射による抗原投与では、全身免疫には効果的に抗原特異的免疫応答が誘導されてきているが、粘膜免疫系には抗原に特異的な抗体誘導を含めて免疫応答が全く誘導されない。しかし、抗原を食べさせる、飲ませる、つまり経口免疫といわれる粘膜免疫システムを介した抗原投与によって、的確に抗原特異的免疫応答を腸管や呼吸器を覆っている粘膜面に誘導、成立させることができる。さらに、同時に全身免疫機構にも抗原特異的免疫応答を誘導するため、二段構えの免疫を宿主側に成立させる利点がある。
【０００６】
この粘膜免疫の利点である粘膜系と全身系の両方の免疫を活性化できるという事実は、実際に感染症の予防という観点から臨床への応用が推進されている。ワクチン抗原を経口免疫することで、粘膜系には分泌型ＩｇＡを中心とした、そして全身系ではＩｇＧを主体とする免疫応答が誘導できる。このとき、効果的な経口ワクチンを期待するには、抗原特異的免疫応答を賦活する粘膜免疫調節因子、粘膜アジュバントの開発とその併用が必要である。タンパク抗原を単独で経口投与しても効果的に抗原特異的ＩｇＡ抗体は誘導されてこない。そこで、経口免疫の効果を上げるために粘膜免疫調節因子、粘膜アジュバントの開発を考えなければならない。その一つとして、野生型毒素が粘膜アジュバントとしての可能性を秘めている。しかし、毒性を考えた場合、臨床応用が困難である。そこで、本発明者らは、もともと生体内の免疫活性化物質であるサイトカインが応用できるのではないだろうかと考えた。
【０００７】
免疫系は自然免疫系と適応免疫系に分けられて考えられている。病原体に曝された直後は自然免疫が働き、その後効果的な防御である適応免疫へと移行する。適応免疫には大きく分けて液性免疫（液性免疫応答：Ｔｈ２応答）と細胞性免疫（細胞性免疫応答：Ｔｈ１応答）の二つがある。液性免疫の中心的存在として抗体がある。抗体は成熟したＢ細胞が抗原刺激を受けて分化した形質細胞において合成・分泌される物質で、抗原が侵入してきたときに抗原に取り付き、その働きを失わせ排除する作用を持つ。細胞性免疫はＴリンパ球、ＮＫ細胞、マクロファージ細胞などが主役の免疫である。細胞性免疫の働きは、病原体に感染した細胞を殺してしまうのと同時に病原体の増殖を止めることである。
【０００８】
これら免疫応答はサイトカインによって調節されている。サイトカインは免疫応答における細胞間相互作用に関与する一群の分子の呼び名であり、抗体のような特異性を持たないものの総称である。サイトカインはすべてタンパク質あるいはペプチドでしばしば多糖を結合している糖タンパク質からなる。サイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）そして他のサイトカイン群（例えば、ＴＮＦ−αなど）の４つのカテゴリーに大きく分類できる。ＩＬと総称されているものは、主としてＴ細胞が作り出す一群のサイトカイン（ＩＬ−２〜ＩＬ-６、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１３、ＩＬ-１４、ＩＬ−１６そしてＩＬ−１７）であるが、一部は他の単球（例えば、ＩＬ−８、ＩＬ−１２そしてＩＬ−１５など）や組織細胞（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５そしてＩＬ−１８など）によっても作り出される。これらのタンパク質は上述したとおり、多種多様な機能を持っているが、多くは他の細胞に働きかけて分裂や分化を引き起こす。それぞれのＩＬは、対応する受容体を発現した限られた細胞にだけ特異的に働く。ＩＦＮはある種のウイルス感染の広がりを抑える重要な分子群である。ＩＦＮは、多くのウイルス感染における第一線での防御に働き、そのため感染のきわめて初期に作り出される分子である。
【０００９】
サイトカインの役割として、免疫のうち細胞性免疫反応の発現の調節に関与するもの（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γなど）、抗体産生に関与するもの（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３など）、炎症の発現や調節に関与するもの（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８（:ＩＬ−８は単球・リンパ球由来の多核白血球及び単球の局所集積作用による炎症メディエーターである）、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ−α)、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３など）、アレルギー反応機構に関与するもの（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２など）、造血機構に関与するもの（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、エリスロポエチン、トロンボポエチン、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、マクロファージ・コロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ，ＣＳＦ−１)、造血幹細胞因子(ＳＣＦ)など）などがある。その多くは直接的あるいは間接的に感染や腫瘍に対する生体防御機構において重要な役割を持つことが明らかになっている。
【００１０】
哺乳類では、抗ウイルス活性を持つサイトカインは１型、２型ＩＦＮとしてクラス分けされている。多面的な作用を示すサイトカインの一群であるＩＦＮは、低分子タンパク質（分子量20,000〜25,000）である。また、ウイルス、細菌、原虫、サイトカイン、マイトジェン、天然および合成の二重鎖ＲＮＡや他の既知の物質に反応して脊椎動物細胞に誘導される。その作用は一般的に抗ウイルス、抗増殖作用、免疫調節が知られ、宿主の防御機構や恒常性において、先天性および後天性の免疫反応をともに強く媒介するとされている。
【００１１】
ＩＦＮは現在までにＩＦＮ−α、β、γ、δ、ε、κ、λ、ω、τが報告されている。１型ＩＦＮｓはウイルス性として知られ、ＩＦＮ−α（白血球由来）、ＩＦＮ−β（ファイブロブラスト由来）、ＩＦＮ−τ（トロホブラスト由来）、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−ωなどを含み、ウイルス感染によって産生される。また、２型ＩＦＮは免疫性ＩＦＮ（ＩＦＮ−γ）として知られ、マイトジェン刺激や抗原刺激によって産生される。ウイルスに感染したほとんどのタイプの細胞は培養時にＩＦＮ−α／βを産生可能であるが、ＩＦＮ−γはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ＣＤ４陽性１型ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞）、ＣＤ８陽性細胞傷害性サプレッサー細胞（ＣＤ８＋Ｔｃ細胞）を含む免疫系のある特定の細胞によってのみ合成される。
【００１２】
１９７２年に、Tom Schaferらが、ＩＦＮ誘発剤を注射したマウスの乳の中にＩＦＮが見出され、泌乳している母マウスの乳の中に誘発されたＩＦＮが存在している時は新生仔が致死的ウイルス感染から有意に多く生き残ることを報告した。同時に、ヒト及びウシ、ネコの咽頭洗浄液、唾液、鼻腔洗浄液、鼻汁中にＩＦＮが分泌されていて、ウイルス感染時、ＩＦＮ誘発剤投与時にはその量が増えることが分かったことから、ＩＦＮの経口投与に興味をもたれるようになった。経口投与されたＩＦＮは、ヒト及び他の動物において生物学的活性を示し、投薬の最も良い効果は、呼吸器感染中の鼻汁分泌物の中に天然に分泌される濃度と同じ一定の濃度（１０2〜１０3ＩＵ、ＩＵ：International Unit 国際単位）のＩＦＮを口腔粘膜へ与えたときに起こる。これに対して、非経口投与では、経口投与より投与量は１０6ＩＵと多く、そのために、高用量非経口投与による副作用も危惧されていることから、経口低用量療法の可能性が示唆されている。そして、ＩＦＮを低用量経口投与することによって全身的に効果が現れるというメカニズムは多くの研究所で活発に研究されているところである。
【００１３】
ShaferらによりＩＦＮが経口投与でも有効であることが証明されると、ヒトおよび牛、豚、犬、猫、鶏において天然型ヒトＩＦＮ−α（ｎＨｕＩＦＮ−α）の様々な臨床報告が数多くなされるようになった。近年、ｎＨｕＩＦＮ−αはＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス性疾患、カポジ肉腫、非Hodgkin'sリンパ腫、悪性黒色腫などの腫瘍性疾患において、サイトカイン療法として注目を集め、動物においてもサイトカインの治療への使用が、クローニングや新技術の進歩により可能となってきている。実際に、現在では動物用医薬品としてｎＨｕＩＦＮ−αの経口投与剤が発売されるようになっている（ビムロン、バイオベット株式会社、東京都）。また、鶏ではニワトリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）の経口投与はニューカッスル病の病状を改善し、マレック病にも細胞学的に効果を表した（非特許文献１：Jarosinski, K. W.ら,J. Interferon Cytokine Res. 21:287-296、非特許文献２：Marcus, P. I.ら, J. Interferon Cytokine Res. 19:881-885）。
【００１４】
経口用ＩＦＮ−αは、口腔内の粘膜細胞表面のＩＦＮ受容体と物理的に結合し、免疫細胞に対し体内にある炎症部位に移動するように情報を与える。この情報を受けた免疫細胞は、リンパ節に入り、速やかに炎症部に移動する。一方、受容体に結合しなかったＩＦＮ−αは、その後消化管内でアミノ酸にまで分解され、吸収、あるいは排泄される。タンパク質分解酵素により消化された時点で、ＩＦＮ−αが持っていた情報は失われる。炎症部位では細菌、ウイルスの種類に関係なく免疫細胞は貪食を行い、免疫細胞はその情報を他の免疫細胞に伝えることにより、体内に侵入した細菌やウイルスに特異的に反応する抗体の産生を誘導したり、感染した細胞を破壊したりする。その結果として、炎症部位で起きている感染を抑制することができる。つまり、経口投与されたＩＦＮ−αは口腔内に存在する免疫細胞を刺激するだけであり、それに引き続いて起きる免疫反応は、本来、生体が持っている免疫システムに基づいている。
【００１５】
宿主細胞の免疫システムのうち、ヘルパー１型Ｔ細胞（Ｔｈ１）応答が重要とされており、哺乳類においてＩＦＮ−αはＩＬ−１８と相乗的にＩＦＮ−γ発現を誘導し、Ｔｈ１の分化誘導を促すことが知られている。また、ＩＦＮ−αはＩＦＮ−γと違い、熱およびｐＨに対して安定である。このようなことから、粘膜アジュバントとして、ＩＦＮ−αは適していると言える。
【００１６】
現在、医薬品として用いられているワクチンや生理活性物質の多くは、大腸菌やバキュロウイルスや酵母などの外来遺伝子発現系を用いて生産されている（非特許文献３：McCall, E. J.ら, Protein Expr Purif. 42:29-36；2005、非特許文献４：Smith, G. E.ら, Mol.Cell Biol. 3:2156-2165；1983）。しかし、近年、遺伝子工学の発展により植物に外来遺伝子を導入、発現させることが可能になってきた。植物発現系は、既存の方法に比べて多くの利点がある。植物発現系は発酵タンク培養系に比較して経済的であるため、既存の方法に比して低コストである。また、植物細胞が目的のタンパク質を生産するので精製工程を必要としない。さらに、植物を用いてワクチンなどの機能性タンパク質を生産する場合、動物ウイルスなどのヒトに感染する病原体による汚染の可能性がないことや、弱毒化されたワクチン株による副作用の心配がないことなどの安定性の面でも極めて優れている（非特許文献５：Daniell, H.ら, Trends Plant Sci 6:219-226 ；2001）。
【００１７】
そして、作出した作物は、そのまま飼料として経口的に投与することが可能であり、投与の際家畜に与えるストレスを無くすことができる等の利点があり、獣医学領域における有用性は極めて高いと考えられる。
１９９０年、CurtissとCarneauは、Salmonella, Typhimurium. mutansの表面タンパク質ＳｐａＡをタバコに発現させ、これをマウスに食べさせることで抗原特異的粘膜免疫応答を誘導することに成功した（特許文献１：Curtiss, R.ら, Patent application ＷＯ ９０／０２４８４）。この実験は植物ワクチンを用いた「食べるワクチン」の可能性を初めて示した実験となった。この実験のあと、病原性微生物の感染やその他の病気に対して特異的な免疫活性化を促す機能を持つ植物ワクチンの開発がされている。大腸菌易熱性毒素抗原のタバコ、ジャガイモおよびトウモロコシでの発現（非特許文献６：Haq, T. A.ら, Science 5:268(5211):658,660；1995、非特許文献７：Streatfield, S. J.ら, Vaccine 19(2742-2748)；2001）、コレラ毒素抗原のジャガイモでの発現（非特許文献８：Arakawa, T.ら, Nat Biotechnol 16(292-297)；1998）、Ｂ型肝炎ウイルス抗原のレタスやジャガイモでの発現（非特許文献９：Kapuata, J.ら, FASEB J 13:1796-1799；1999、非特許文献１０：Richter, L. J.ら, Nat Biotechnol 18:1167-1171；2000）、ノーウオークウイルス抗原のタバコ及びジャガイモでの発現（非特許文献１１：Mason, H. S.ら, Proc .Natl. Acad. Sci. USA 93:5335-5340；1996）等が行なわれた。現在では動物実験や臨床試験により、その安全性と有効性が示されている。また、発現させる植物として、例えばトウモロコシのような穀物種子を使えば、長期間安定でかつ室温での輸送可能なワクチンの開発が可能になる。
【００１８】
【特許文献１】Curtiss, R.ら, Patent application ＷＯ ９０／０２４８４
【非特許文献１】Jarosinski, K. W.ら,J. Interferon Cytokine Res. 21:287-296
【非特許文献２】Marcus, P. I.ら, J. Interferon Cytokine Res. 19:881-885
【非特許文献３】McCall, E. J.ら, Protein Expr Purif. 42:29-36；2005
【非特許文献４】Smith, G. E.ら, Mol.Cell Biol. 3:2156-2165；1983
【非特許文献５】Daniell, H.ら, Trends Plant Sci 6:219-226 ；2001
【非特許文献６】Haq, T. A.ら, Science 5:268(5211):658,660；1995
【非特許文献７】Streatfield, S. J.ら, Vaccine 19(2742-2748)；2001
【非特許文献８】Arakawa, T.ら, Nat Biotechnol 16(292-297)；1998
【非特許文献９】Kapuata, J.ら, FASEB J 13:1796-1799；1999
【非特許文献１０】Richter, L. J.ら, Nat Biotechnol 18:1167-1171；2000
【非特許文献１１】Mason, H. S.ら, Proc .Natl. Acad. Sci. USA 93:5335-5340；1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
Ruttanapummaらは、ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子をクローニングし、バキュロウイルス発現系で発現させ、本来のＩＦＮ−αの特徴である抗ウイルス活性を得ている。比較的高率に精製ができることから、in vivo実験としてはサイトカインを供給可能であるが、家禽への応用となると、より低コストで精製段階も不要な発現系の開発が必要となる。
そこで、本発明者らは、植物においてトリインターフェロン、典型的にはＣｈＩＦＮ−αを発現し、葉の中から鶏インターフェロンαを含む葉液を抽出し、生物活性を調べ、飼料として保存するサイトカイン組換え植物の保存法を検討した。
【００２０】
１型インターフェロンとして知られるインターフェロンα（ＩＦＮ−α）は、強い抗ウイルス活性を有するとともに、免疫応答に重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。近年、有効性が臨床的にも証明され、動物用ＩＦＮ−α製剤が市販されている。
また、現在、植物発現系は、従来の系に比べ、低コスト、安全、精製が不要など多くの利点があり注目されている。そして、作出した作物は、そのまま飼料として経口的に投与することが可能であり、投与の際家畜に与えるストレスを無くすことができることから、獣医学領域における有用性は極めて高いと考えられる。そこで、本発明者らは、トリへの外来性サイトカイン応用の一環として、典型的には、植物でニワトリＩＦＮ−α（ＣｈＩＦＮ−α）を発現させ、性状を調べた。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、典型的には、すでにクローニング済みのＣｈＩＦＮ−α遺伝子の塩基配列を元に、植物細胞内での発現を視野に入れ、３’末端に小胞体局在シグナルであるＫＤＥＬ配列を付加するようにプライマーを設計し、ＰＣＲを行い、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を得た。同遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターであるｐＭＬＨプラスミドに挿入し、アグロバクテリウム法を用いて、イネに形質導入し、初代イネの葉からタンパク質を抽出後、ウエスタンブロッティング解析と抗ウイルス活性によりスクリーニングし、陽性個体から採種し、２代目のイネを培養した。さらに、陽性個体中のＣｈＩＦＮ−αの安定性を調べた。
【００２２】
前記遺伝子導入初代イネ４２個体のスクリーニングでは、植物タンパク質抽出液中に、抗ＣｈＩＦＮ−αウサギ血清で約２７ｋＤａのタンパク質として検出され、強陽性を示した８個体から稲籾を得、播種した。２代目イネについて各親株から１０個体をスクリーニングし、陽性個体を選抜した。得られた陽性個体の葉におけるＣｈＩＦＮ−αの安定性を調べるため、陽性を示したイネ個体の葉を４℃、２０℃、３７℃の環境下で１日、７日、２８日保存し、抗ウイルス活性について測定した。その結果、３７℃２８日間の保存においても、抗ウイルス価の減少は認められなかった。
【００２３】
すなわち、本発明は、以下に示されるトリインターフェロンを産生する組換え植物、その継代育成植物、それら植物からトリインターフェロンタンパク質を採取するトリインターフェロンの製造方法、その方法で製造されたトリインターフェロンを有効成分とする発育鶏卵用抗トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）作用剤、前記植物によるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現を確認するために用いる抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナルウサギ抗体、および植物形質転換用ベクターの発明である。
１.トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれてなることを特徴とするトリインターフェロンを産生する組換え植物。
２.トリインターフェロンタンパク質がトリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）である前記１に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
３.トリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）をコードする遺伝子が、ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され、このＰＣＲによりＣｈＩＦＮ−αＨｉｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端側でヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）配列が除去され、ＫＤＥＬコード配列が付加されたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子である前記２に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
４.リバースプライマーとしてＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬＲ；
5'-gcgagctcctaaagttcatccttagtgccgtgttgcctgt-3'（配列番号１；5'側下線部制限酵素ＳａｃＩ認識部位、3'側下線部ＫＤＥＬ部位）を用い、
フォワードプライマーとしてＣｈＩＦＮ−αＦ；
5'-cgagatctcccaccatggctgtgcctg-3'（配列番号２；下線部制限酵素ＢｇｌII認識部位）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）させる前記３に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
５.前記３に記載のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにライゲーションしたプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをトランスファーベクターとして用いるトリインターフェロンを産生する組換え植物。
６．アグロバクテリウムのノパリン合成酵素(ｎｏｓ)の転写終結配列（ターミネーター）、およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写物のプロモーター融合（インゲンPhasolin遺伝子第一イントロン、及びタバコモザイクウイルスΩ配列を含む）として構成されているキメラプロモーターシリーズの配列を含むプラスミドであるAgrobacteriumへの形質導入用トランスファーベクターｐＭＬＨのＧＵＳ部分にＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬを挿入したトランスファーベクターを用いる前記５に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
７.植物が、前記プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをAgrobacterium tumefaciens（以下：A. tumefaciens）に形質導入させた後、前記A. tumefaciensを植物細胞に感染させ、前記植物細胞核ゲノムへ遺伝子導入した組換え植物である前記５に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
８.組換え植物がイネ科植物である前記１〜７のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
９.イネ科植物が、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、またはトウモロコシである前記１〜８のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
１０.イネ科植物がイネである前記１〜９のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
１１.前記１〜１０のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物の継代育成植物。
１２.前記１〜１１のいずれかに記載の植物からトリインターフェロンタンパク質を採取するトリインターフェロンの製造方法。
１３.前記植物の葉からトリインターフェロンタンパク質を採取する前記１２に記載のトリインターフェロンの製造方法。
１４.前記１２または１３に記載の方法で製造されたトリインターフェロンを有効成分とする発育鶏卵用抗トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）作用剤。
１５.前記１〜１１のいずれかに記載の植物によるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現を確認するために用いる、精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓをウサギに免疫して得られる抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナルウサギ抗体。
１６.トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにライゲーションしたプラスミドをトランスファーベクターとすることを特徴とする植物形質転換用ベクター。
１７.トリインターフェロンタンパク質がトリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）である前記１６に記載の植物形質転換用ベクター。
１８.トリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）をコードする遺伝子が、ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され、このＰＣＲによりＣｈＩＦＮ−αＨｉｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端側でヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）配列が除去され、ＫＤＥＬコード配列が付加されたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子である前記１７に記載の植物形質転換用ベクター。
１９.リバースプライマーとしてＣｈＩＦＮ-αＫＤＥＬＲ；
5'-gcgagctcctaaagttcatccttagtgccgtgttgcctgt-3'（配列番号１；5'側下線部制限酵素ＳａｃＩ認識部位、3'側下線部ＫＤＥＬ部位）を用い、
フォワードプライマーとしてＣｈＩＦＮ−αＦ；
5'-cgagatctcccaccatggctgtgcctg-3'（配列番号２；下線部制限酵素ＢｇｌII認識部位）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）させる前記１８に記載の植物形質転換用ベクター。
２０.前記１８に記載のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにライゲーションしたプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをトランスファーベクターとして用いる植物形質転換用ベクター。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によって、トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれた組換え植物が産生するトリインターフェロンは安定な抗ウイルス活性を示すことが確認された。また、これにより、サイトカイン組換え植物の発現・培養系および評価系が確立され、現実にトリ特に鶏への投与が可能となった。本発明によれば、トリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）をコードする遺伝子を、植物細胞小胞体内タンパク蓄積に優れた特定のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子とすることができるし、植物発現タンパク質の発現量を高くする特定のトランスファーベクター；プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨを用いることができるので、植物での発現量が高い優れた植物ワクチンを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれてなることを特徴とするトリインターフェロンを産生する組換え植物、およびこれに関する発明である。本発明のトリインターフェロンとしては、経口ワクチンのアジュバントに適しているトリインターフェロン−α（特にＣｈＩＦＮ−α）が好ましい。植物は、トリインターフェロンの遺伝子を導入できるものであれば、いずれのものでもよい。植物への遺伝子導入は、自体公知の遺伝子導入方法によればよい。前記遺伝子導入の主な方法としては、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等が挙げられる。
【００２６】
現在、動物において、抗菌性飼料添加物及び動物用医薬品が多量に使用されており、これによる薬剤耐性菌の発生等が危惧されている。このため、抗菌性飼料添加物及び動物用医薬品の使用量低減のため、微量の薬剤を特定部位に効率的、選択的に作用させるドラッグデリバリーシステム（薬剤運搬システム）技術を用いた、確実な粘膜免疫の誘導に有効な経口ワクチンが重要とされている。また、経口ワクチンアジュバントとして、微量で効果があり、生体内物質であり残留性の問題のないサイトカインに注目した。なかでも、細胞内寄生菌の問題もあることから、Ｔｈ１応答を促すＩＦＮ−αが経口ワクチンのアジュバントに適していると考え、経口ワクチンの発現法として、飼料として経口的に投与でき、投与の際のストレスの軽減ができるなどの利点があり、獣医学領域における有用性が極めて高いとされる植物ワクチンを選択し、典型的には、植物においてＣｈＩＦＮ−αを発現して、ＩＦＮ−αの抗ウイルス活性を調べ、今後、植物発現トリインターフェロン（ＣｈＩＦＮ）がサイトカイン療法として治療の応用につながっていくことを確認した。
【００２７】
まず、植物発現用に、発現対象であるＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子の改変を行った。Ruttanapummaら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）がクローニングしたＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子の塩基配列を元に、植物細胞内での発現を視野に入れ３’末端にＫＤＥＬ配列を付加するようにプライマーを設計した。また、本発明では、精製のために付加されていたＨｉｓ−Ｔａｇを除去した。タンパク質のＣ末端に付加されるＫＤＥＬ配列は、例えば、実施例の［材料及び方法］６．ＣｈＩＦＮ−α遺伝子の改変１）プライマーの設計に記述した通り、小胞体にタンパク質を保持するためのシグナルであり、発現タンパク質に付加することにより小胞体内タンパク蓄積量が約４倍になる。バキュロウイルス発現系の場合には、発現タンパク質を細胞から培養上清中に分泌させ精製するが、植物発現系の場合,植物細胞内に留めておいた発現タンパク質を植物細胞ごと動物に給与する方法が主と考えられる。そこで、発現タンパク質にＫＤＥＬ配列を付加し、小胞体内へ蓄積させる方法を選択した。なお、植物細胞小胞体に発現タンパク質を輸送させるために、ＣｈＩＦＮ−αに本来備わっているＮ末端側のシグナル配列はそのまま用いた。またKozakのコンセンサス配列（Kozak, M. Nucleic Acids Res. 9:5233-52;1981、Kozak, M. J. Mol Biol. 156:807-20;1982、およびKozak, M. Gene. 234:187-208;1999）に従って、開始コドンであるＡＴＧの３塩基上流と１塩基下流をともにＡもしくはＧにすることにより開始コドンが効率よく働くように配慮し、さらに開始コドン上流および終了コドン下流の非翻訳領域を出来るだけ含めないように設計し、ＰＣＲを行った。得られたｃＤＮＡをシークエンスしたところ、ＫＤＥＬの付加、６つのシステイン残基、４ヶ所の推定糖鎖付加部位の存在を確認した。このＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を操作し、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現に成功した。
【００２８】
植物発現系を用いて発現を行う場合、発現タンパク質の発現量を上げることが重要となる。植物そのものまたは抽出分画を用いるにしても、タンパク質の発現量が高い場合は感染防御免疫を誘導するのに必要な量の抗原あるいはサイトカインを容易に経口投与できる。発現のレベルは使われる抗原タンパク質や発現に使われる植物種に依存するが、使われる発現系にも大きく依存する。つまり発現に使われるプロモーターの強さや組織特異性、選択されたリーダー配列、抗原遺伝子の起源などである（Mason, H. S.ら, Vaccine 16(13):1336-43；1998）。本発明では、用いたのは、植物における外来遺伝子の高レベル発現のためのキメラプロモーターシリーズであり、ノパリン合成酵素(ｎｏｓ)の転写終結配列、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写物プロモーターの融合として構成されている。これは、塩基上流からＥ７（エンハンサー、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの上流配列−９４０から−２９０と−２９０から−９０を７回繰り返し）、３５Ｓプロモーター（−９０塩基から−１塩基）、ｍＲＮＡ成熟を効率化する事によりＧＵＳ遺伝子発現を強調するイントロン、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳効率を向上させるタバコモザイクウイルスΩ塩基、ＧＵＳ、Ｔｉプラスミドにおけるノパリン合成酵素のためのポリアデニル化シグナル遺伝子であるＴｎｏｓの順に並んでいる（Mitsuhara, I.ら, Plant Cell Physiol 37(1):49-59;1996）。本発明では、アグロバクテリウムのノパリン合成酵素(ｎｏｓ)の転写終結配列（ターミネーター）、およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写物のプロモーター融合（インゲンPhasolin遺伝子第一イントロン、及びタバコモザイクウイルスΩ配列を含む）として構成されているキメラプロモーターシリーズの配列を含むプラスミドであるAgrobacteriumへの形質導入用トランスファーベクターｐＭＬＨ（文献：Mochizuki et al. 1999. Entomologia Experimentalis et Applicata 93: 173-178）のＧＵＳ部分にＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬを挿入し、大量培養・精製をした。
【００２９】
得られたプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨを植物形質転換用ベクターとして用いる。例えば、アグロバクテリウム法では、土中生息細菌の一種であるアグロバクテリウムが植物に感染して植物細胞に自らの遺伝子を移動させる性質を利用し、アグロバクテリウムの遺伝子にトリインターフェロンの遺伝子を結合させ、アグロバクテリウムの感染能力を利用して、トリインターフェロンの遺伝子を植物へ導入する。すなわち、前記プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをAgrobacterium tumefaciens（以下：A. tumefaciens）に形質導入させたA. tumefaciensを培養植物細胞に感染させることにより、ｐＭＬＨ上の高発現プロモーターＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ融合遺伝子を植物細胞核ゲノムへ遺伝子導入させることができる。エレクトロポレーション法では、植物細胞に電気ショックを与えることにより植物細胞に穴をあけ、そこからトリインターフェロンの遺伝子を植物へ導入する。パーティクルガン法では、例えば、金の微粒子にトリインターフェロンの遺伝子を付着させ、この微粒子を高圧ガス等の力により、葉等の植物組織に撃ち込んで遺伝子を導入する。これらのうち、アグロバクテリウム法は利点が多く、植物の遺伝子組み換えで主流になっている。よく知られているように、双子葉植物はアグロバクテリウムが容易に感染することができるが、単子葉植物にとってアグロバクテリウムは宿主範囲外であり、単子葉植物にアグロバクテリウム法は適用しにくい。しかし、これは、イネ科植物等の単子葉植物は、アセトシリンゴン等の低分子フェノール化合物を自身で合成しないためであり、現在では、アグロバクテリウムの感染時にアセトシリンゴンを添加することにより、単子葉植物への遺伝子導入が可能となっている。本発明における植物へのトリインターフェロン遺伝子の導入では、アグロバクテリウム法による導入が好ましい。
【００３０】
従って、トリインターフェロンを産生する組換え植物は、単子葉植物でも、双子葉植物でもよく、単子葉植物の例としては、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、またはトウモロコシ等のイネ科植物等が挙げられ、双子葉植物の例としては、ダイズ等のマメ科植物、タバコ、ジャガイモ、レタス等が挙げられる。これらのうち、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、またはトウモロコシ等のイネ科植物が好ましい。なかでも、イネが特に好ましい。
【００３１】
特定のタンパク質の同定、定量等を行うためには、タンパク質に対する特異的抗血清が必要であり、その際に抗原として用いるタンパク質は、高度に精製されている必要がある。本発明者らは、精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓを用いてウサギに免疫し抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナル抗体を作製した。作製した抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓウサギ抗体は５０００倍希釈した状態でも精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓを検出することが可能であった。植物発現のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬが生物活性を有していたことから、植物発現の立体構造は天然型に近いと考えられ、特異抗体は天然のＣｈＩＦＮ−αを認識すると考えられる。初代組換えイネ葉におけるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現の確認として、抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティング解析を行なった際に、植物発現タンパク質抽出液において、約２７ｋＤａのバンドが認められた。Ruttanapummaらの、約２７ｋＤａでは糖鎖付加しているという報告（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28；2005）から、組換え植物におけるＣｈＩＦＮ−αの発現では、糖鎖が付加されていると考えられた。
【００３２】
組換えイネ葉におけるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現を例にとると、トリインターフェロンを産生する組換え植物の継代育成については、初代組換えイネの葉からトリインターフェロンタンパク質を例えば抽出により採取後、ウエスタンブロッティング解析と抗ウイルス活性によりスクリーニングし、ウエスタンブロッティング解析強陽性を示す個体から稲籾を得、播種すればよい。前記ウエスタンブロッティング解析強陽性を示した８個体から稲籾を得、播種して得られた２代目イネについて各親株から１０個体以内をスクリーニングし、陽性個体を選抜した。スクリーニングして得られた陽性個体の葉におけるＣｈＩＦＮ−αの安定性を調べるため、鶏胎仔由来細胞であるＣＥＦ細胞を用いてバイオアッセイを行った。陽性を示したイネ個体の葉を−２０℃、４℃、室温、３７℃の環境下で１日、７日、２８日保存し、抗ウイルス活性について測定した。その結果、３７℃の保存においても、力価の低下はまったく認められなかった。３７℃２８日間の保存においても、抗ウイルス価の減少は認められなかったことは十分「食べるワクチン」の実現を可能とさせる結果であった。
【００３３】
植物ワクチンの開発は、実用化という点で抜本的に優れていると考えられる。実際、アメリカでは植物ワクチンの低価格性、安全性、および有効性などに着目し、研究開発を進めている。このような状況下で、今日までタバコやジャガイモなどの双子葉類に属する植物がアグロバクテリウム法を用いた形質転換の技術で比較的容易にトランスフォームでき（Mitsuhara, I.ら, Plant Cell Physiol 37(1):49-59;1996）、また動物実験の際、ジャガイモはマウスが生でも好んで食べるので植物ワクチンのモデル植物として研究者の間で広く使われてきた。
【００３４】
現在、畜産業が大型化する中、ウシやブタ、ニワトリなどの家畜動物に対する安価な感染予防機能性タンパク質の生産は、畜産分野におけるウイルス、寄生虫、および細菌感染症がもたらす経済的な打撃を考慮すると、実用化を目指して開発を進めていく必要がある。家畜向けの感染予防機能性タンパク質の飼料用作物による生産は、これまですでに確立されたジャガイモなどの植物組換え技術を適用することで、ヒト向けの組換え農作物を含んだ食品の開発と同様、技術的に十分可能性のあるものである。ジャガイモに生理・免疫活性機能を持つタンパク質を発現させ、ヒトへの利用を目指す場合、熱処理によって組換えタンパク質の機能を損なうおそれがある。しかし、家畜動物を対象とした場合、乾燥させたジャガイモの断片や粉末などを一般的に家畜に用いられているトウモロコシなどの飼料と混ぜて与えることが可能である。さらに今までの口蹄疫に対する機能性タンパク質の発現（Dus Santos, M. J.ら, Rev.Sci.Tech. 24:175-187;2005）だけではなく、豚コレラや鳥類一般特にニワトリのニューカッスル病など様々な家畜に被害をもたらす危険性のある病気や、豚の日本脳炎など家畜動物がヒトの感染に関与しているような病気に対して、感染防御の機能をもつ飼料用作物を作ることが可能である。
【００３５】
また、近年、サイトカイン発現植物の開発と粘膜アジュバントとしての利用が注目されている。獣医学領域では、輸送等のストレスにより免疫力が低下し、下痢等の粘膜を侵入門戸とする病原体に感染してしまうことが重要な問題となっている。動物は種々のサイトカインを産生して免疫系の調節（増強・抑制）を行っている。そこで、粘膜面にサイトカインを投与し、粘膜面の免疫系を活性化させるアジュバントとして利用することは、家畜衛生上非常に有用であると考えられる。これまでにアグロバクテリウム法を用いて、ＩＦＮ−α（Ohya, K.ら, J.Interferon.Cytokine.Res. 21:595-602;2001）、ＴＮＦ−α（Ohya, K.ら, J.Interferon.Cytokine.Res. 22:371-378;2002）、インターロイキン２（ＩＬ−２）（Park, Y.ら, Protein Expression and Purification. 25:160-165;2002）などを発現する植物（ジャガイモ、タバコ）の作出に成功したと報告がある。発現された組換え体は本来の生物活性を保持している。今後、種々のサイトカイン発現植物を経口的に投与し、それらの粘膜アジュバント効果についての検討に期待が高まる。本発明では、本発明者らは、典型的には、ＣｈＩＦＮ−αのイネでの発現を実証し、イネの葉で、比較的生物活性が長期間安定であること示し、これにより、イネの葉をトリ特に鶏に給与することによる、サイトカインデリバリー系の実現を可能とした。
【００３６】
さらに、本発明によると、トリインターフェロンを有効成分とする発育鶏卵用抗トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）作用剤が得られる。本発明では、発育鶏卵におけるＩＦＮ−α投与によるＡＩＶ感染抑制が認められた。ＩＦＮ−αは、抗ウイルス活性および免疫応答に重要な役割を持つサイトカインである。現在、タンパク質発現系として従来の系に比べ、低コスト、安全性、精製が不要など多くの利点があり、そのまま飼料として経口的に投与が可能な植物発現系が注目されている。そこでトリへの外来性サイトカイン応用の一環として、典型的には、植物でニワトリＩＦＮ−α(ＣｈＩＦＮ−α)を発現させ、性状を調べ、これを利用して発育鶏卵（in ovo）でトリインフルエンザウイルス（avian influenza virus）(ＡＩＶ）に対する効果を調べた。植物発現したＣｈＩＦＮ−αを抽出し、抽出したＣｈＩＦＮ−αを発育鶏卵に投与し、次の日ＡＩＶで攻撃し、検卵した。また、漿尿液を回収し、漿尿液中のウイルスの有無を鶏赤血球凝集試験（ＨＡ試験）により判定した。検卵、およびＨＡ試験の結果から、ＩＦＮ−α投与群は、各ウイルスＨ３Ｎ８、Ｈ６Ｎ２、Ｈ７Ｎ１に対し抗ウイルス作用があり、ＩＦＮ-αはin OvoでＡＩＶに対して抗ウイルス活性があることがわかった。このように、本発明の組換え植物から抽出したトリインターフェロン（ＣｈＩＦＮ）を投与された卵はウイルスに対して防御されることが確認された。
【実施例】
【００３７】
［材料及び方法］
１．ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子
当研究室のRuttanapumma ら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）がクローニング、作製したＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子に対するｃＤＮＡを用いた。
【００３８】
２．植物発現ベクター
Agrobacteriumへの形質導入用トランスファーベクターであるプラスミドｐＭＬＨは独立行政法人農業生物資源研究所（つくば市、茨城県）から分与された。制限酵素地図並びにコード遺伝子の模式図は（図１)に示した。図１は、Agrobacteriumへの形質導入用トランスファーベクターである、植物用高発現ベクターｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳの制限酵素地図並びにコード遺伝子の模式図である。発現させたい遺伝子をＧＵＳ遺伝子の代わりに挿入させる。本発明においては、ＢａｍＨＩとＳａｃＩで切断し、ＧＵＳの部分に、ＢｇｌＩＩ（ＢａｍＨＩと切り口が同じ）とＳａｃＩで切断したＩＦＮ−α遺伝子を導入し、組換えプラスミドを作製した。
【００３９】
３．制限酵素
制限酵素は、ＢｇｌII、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ（宝酒造株式会社、京都市、京都府）を用いた。認識配列及び切断部位（：）はそれぞれ、Ａ:ＧＡＴＣＴ、Ｇ:ＡＧＣＴＣ、Ｇ:ＡＡＴＴＣ及びＴ:ＣＴＡＧＡである。制限酵素は製品マニュアルに基づいて使用した。
【００４０】
４．遺伝子操作
遺伝子操作は、Molecular Cloning（Sambrook, J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harber Laboratory, N. Y.1989.）に従って行った。
【００４１】
５．アガロースゲル電気泳動
アガロースゲル電気泳動には、ＴＢＥ緩衝液（0.1Ｍ Ｔｒｉｓ, ２ｍＭ ＥＤＴＡ, ８５ｍＭ Boric acid）にＳeaＫem ＧＴＧ Ａgarose（宝酒造株式会社）を１％濃度で加え、加熱溶解後、エチジウムブロマイドを最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬになるように加え、室温にてゲル化し作製した。試料を１００Ｖの定電圧で３０分から１時間泳動し、紫外線照射により核酸を検出した。
【００４２】
６．ＣｈＩＦＮ−α遺伝子の改変
１）プライマーの設計
ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端側では、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）配列を除去し、ＫＤＥＬコード配列を付加するよう設計した。Ｈｉｓ−Ｔａｇは得られるタンパク質の精製を考慮して付加された配列であるが（Ruttanapumma ら，J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）、本発明では精製工程を必要としないので不要であった。ＫＤＥＬ配列は、小胞体にタンパク質を保持するためのシグナルで、この配列を付加することにより、小胞体内タンパク蓄積量が約４倍になる（Torres, E.ら, Tansgenic Research 8:441-449；1999）。ＣｈＩＦＮ−α遺伝子配列を参考に、リバースプライマー（Reverse primer）としてＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬＲ；5'-gcgagctcctaaagttcatccttagtgccgtgttgcctgt-3'（5'側下線部制限酵素ＳａｃＩ認識部位、3'側下線部ＫＤＥＬ部位）を設計した(図２)。図２は、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬクローニングのためのＰＣＲプライマーの塩基配列を示す。ＣｈＩＦＮ−α遺伝子のＣ末端に小胞体保留シグナル（ＫＤＥＬ）配列を付加するよう、プライマー（Forward primerとReverse primer）を設計し、既にクローニングされているＣｈＩＦＮ−α遺伝子を鋳型にＰＣＲ法で遺伝子を改変した。フォワードプライマー（Forward primer）は、ＣｈＩＦＮ−αのシグナル配列を活かせる様、Ruttanapumma ら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）がｃＤＮＡクローニングの際に設計したＣｈＩＦＮ−αＦ；5'-cgagatctcccaccatggctgtgcctg-3' （下線部制限酵素ＢｇｌII認識部位）を用いた。プライマーの合成はグライナージャパン株式会社（東京）に依頼した。
【００４３】
２）ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子の増幅
ＰＣＲ Ｃore Ｋit(Perkin-Elmer, MA, USA)を用いて、上記ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（Ｐolymerase Ｃhain Ｒeaction；ＰＣＲ）法を行った。ＣｈＩＦＮ−αＦとＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬＲをプライマーに用いて、Ｓｔｅｐ１（９５℃×５分間）を１サイクル、Ｓｔｅｐ２（９５℃×１分間、５３℃×１分間、７２℃×１分間）を３０サイクル、Ｓｔｅｐ３（７２℃×３分間）を１サイクル行った。
【００４４】
３）ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子のクローニング・配列決定
ＰＣＲ法で増幅させたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子をＴＡ Ｃloning Ｋit（Invitrogen, CA,USA）を用いて、プラスミドベクターであるｐＣＲ２．１にライゲーションさせた。これをHeat Shock法により宿主大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造株式会社）に形質導入させ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、0.12％Ｘ−ｇａｌ（５-Bromo-４-Chloro-３-indolyl-β-d-Galactoside）添加ＴＹＭ寒天培地（２％bacto-tryptone,0.5％yeast extract、0.1％ glucose、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、1.5％ bacto agar）上で３７℃において一晩培養した。β-ガラクトシダーゼはＸ−ｇａｌを代謝し、青色の色素を生成するが、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子がベクターのlac-Z領域に挿入された場合、β-ガラクトシダーゼが産生させず、白色のコロニーが認められる。このWhite-Blue Selectionを利用して、白色コロニーを選択し、一晩ＴＹＭ液体培地（２％bacto-tryptone,0.5％yeast extract、0.1％ glucose、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）中で培養し、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＣＲ２．１を得た。これからプラスミドを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化後にアガロースゲル電気泳動によりＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子挿入の確認を行った。挿入の確認されたプラスミドを用いてDideoxy Terminator法によりシーケンス反応を行った。反応には標識蛍光ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）を用いたDye Terminator Cycle Sequencing Kit FS（Perkin-Elmer）を使用した。９６℃×４５秒間、５０℃×３０秒間、６０℃×４分間の反応を２５サイクル行い、スピンカラムによる精製後、ABI PRISM310 Genetic Analyzer（Perkin-Elmer）にかけ塩基配列を決定した。
【００４５】
７．ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの植物での発現
１）植物発現トランスファーベクターの作製
クローニングで得られたプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＣＲ２．１をＢｇｌII、ＳａｃＩで消化後、アガロースゲル電気泳動で展開し、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子フラグメントをゲルごと切り出した。フェノール処理後エタノール沈殿によりＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を精製した。植物発現ベクターであるｐＭＬＨについては、ＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化し、３５Ｓプロモーター(高発現プロモーターの開発を目的としてカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを改変したもの)下流のＧＵＳ遺伝子を除去した。なお、ＧＵＳはβ-グルクロニダーゼタンパク質のコード領域であり、除去しても、プラスミドの増殖性に影響はない。上記で得られたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子フラグメントをプラスミドｐＭＬＨのＢａｍＨＩとＳａｃＩサイトにＴakara ＤＮＡ Ｌigation Ｋit（宝酒造株式会社）を用いてライゲーションした。次いでHeat Shock法により宿主大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造株式会社）に形質導入させ、これを５０μｇ／ｍＬカナマイシン添加ＴＹＭ寒天培地上で一晩培養した。出現コロニーから５０μｇ／ｍＬカナマイシン添加ＴＹＭ液体培地にて培養しプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨを得た。ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子フラグメントの挿入は、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ消化後アガロースゲル電気泳動により確認した。１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌadder（宝酒造株式会社）を同時に泳動し、サンプルＤＮＡの長さを推定した。プラスミドを大量培養・精製後、組換え植物を得るため（独）農業生物資源研究所へ送付した。
【００４６】
２）組換え植物の作製（形質導入）
（独）農業生物資源研究所において、プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをAgrobacterium tumefaciens（以下：A. tumefaciens）に形質導入させた後、A. tumefaciensを培養植物細胞に感染させ、植物細胞核ゲノムへ遺伝子導入した。なお、A. tumefaciensは、植物に感染するグラム陰性の植物病原性の土壌細菌である。A. tumefaciensは、植物への感染過程でＴ−ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡ断片を植物ゲノムに導入する。このプロセスを利用して、Ｔｉプラスミドと呼ばれるＴ−ＤＮＡを含むタンパク遺伝子を植物ゲノムに組み込み、カルス（植物の種子または未熟胚組織は、栄養分を含む培地で培養すると脱分化した細胞魂であるカルスとなる）にして、目的遺伝子を含む組換えA. tumefaciensの共培養を通じて、この細菌から植物へタンパク遺伝子の導入を行った（Brencic, A.ら, Mol Microbiol. 57(6):1522-1531;2005、Fukuoka, H.ら, Plant Cell Reports 19:815-820;2000、Mitsuhara, I.ら, Plant Cell Physiol 37(1):49-59;1996）。この後、培養して初代組換えイネを作出した（図５）。図５は、組換え植物の作製（形質導入）を図で表したものである。プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをAgrobacterium tumefaciensに形質導入させた後、Agrobacteriumを培養植物細胞に感染させ、植物細胞核ゲノムへ遺伝子導入し培養してイネを作出した。選別は、ハイグロマイシン耐性により、遺伝子導入個体を選別し、組換えイネを作出した。なお、遺伝子導入植物の選別は、抗生物質耐性を利用する方法に限られず、特定の除草剤に対する抵抗性を利用する方法等の他の公知の方法によっても実施することができる。
【００４７】
３）植物発現タンパク質の抽出
組換え体として個々に作出・管理されたイネ（ＮＯ．１〜４２：３５は欠番）の葉の一部を刈り取り、液体窒素で凍結させ、冷凍状態で当研究室へ輸送した。そのイネを滅菌ハサミで細かく切り刻み、Digital Homogenaizer（AS ONE株式会社、大阪）備え付けのチューブに入れ、イネの重量と同量のリン酸緩衝生理食塩水（Phospfate Buffered Saline：1.37Ｍ NaCl, ２ｍＭ KCl, ３ｍＭ Na2HPO4, 1.5ｍＭ KH2PO4，ｐＨ7.4：以下ＰＢＳ）を加えDigital Homogenaizerで、6,000ｒｐｍ １０秒間の磨り潰しを氷中で約２０回繰り返し、磨り潰し葉液をマイクロチューブに採取した。その葉液を17,400ｇ、５分間遠心し、上清を新たなマイクロチューブに回収し、植物発現タンパク質抽出液として−２０℃に保存した。
【００４８】
４）ウェスタンブロッティング解析
組換えイネによるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現を確認するために、ウエスタンブロッティング解析を行った。上記、植物発現タンパク質抽出液に、Laemmli（Nature 277:680-685;1970）の４ｘサンプルバッファー（62.5ｍＭ Tris-HCl ｐＨ6.8, ２％ＳＤＳ, １０%Glycerol, 0.02% Bromophenol blue, ５％ ２-メルカプトエタノール；２Ｍｅ＋Buffer）を３：１の割合で混合した。各試料を１００℃で５分間煮沸し、ＳＤＳを含む12.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により展開した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、ゲルを転写緩衝液（0.02Ｍ Tris, 0.15Ｍ Glycine, 0.01% ＳＤＳ, ５％ Methanol）で洗浄し、ウエスタンブロッティング装置ホライズブロット（アトー株式会社、東京）を用いて、ニトロセルロース膜Hybond C Extra（Amersham, Amersham, UK）に１００ｍＡで1.5時間転写した。転写後、ニトロセルロース膜未結合部分をブロック液（１％Skim Milk Powder, 0.1％ Tween-20をＰＢＳに溶解）をＰＢＳでブロッキングした。ついで一次抗体として抗ＣｈＩＦＮ−α−Ｈｉｓポリクローナルウサギ血清を用い、室温で３時間反応させた。反応後、ブロック液で３回洗浄し、二次抗体を３７℃で２時間反応させた。二次抗体は、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ血清（BD Biosciens Pharmingen,San Jose,CA,USA）を希釈して用いた。反応後、ＰＢＳで３回洗浄し、BM blue POD substrate (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)用いて発色させた。
【００４９】
５）２代目イネの作製
初代イネ葉からタンパク質を抽出後、ウエスタンブロッティング解析と抗ウイルス活性によりスクリーニングし、陽性であった組換えイネ番号から子孫用の種子を（独）農業生物資源研究所において採取し、同研究所において、得られた種子を用土に播種し、２代目を生産した。２代目の発現を上記４）の方法及び生物活性として抗ウイルス活性で確認した。
【００５０】
８．抗ＣｈＩＦＮ−α抗体の作製
バキュロウイルス発現ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓをRuttanapumma ら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）の方法で精製した。精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ４４０μｇ／ｍＬの1.5ｍＬを同量のFreund's complete adjuvant（FCA；株式会社ヤトロン、東京）と混合、ゲル化させ、日本白色種ウサギ２羽に1.5ｍＬずつ頚部に免疫し、ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓに対するモノスペシフィックポリクローナル抗体を作製した。ウサギに１週おきに免疫し、初回免疫から４週後に心臓採血、血清を分離し、抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓウサギ血清（抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナル抗体）とした。精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓを抗原とし、作製したそれぞれの抗血清を一次抗体として用い、それぞれペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ血清（BD Biosciens Pharmingen）を用いてウエスタンブロッティング解析を行い、抗体価を測定した。
【００５１】
９．イネ葉中でのＩＦＮ−αの安定性評価
作出された２代目のイネ葉を刈り取り、液体窒素で凍結させ、冷凍状態で当研究室へ輸送されてきたイネの葉を0.6ｇずつシャーレに入れ、−２０℃、４℃、室温、３７℃の環境下で１日、７日、２８日保存した。上述の方法でイネ葉からタンパク質抽出液を採取して、抗ウイルス活性を調べた。
【００５２】
１０．鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）を用いた抗ウイルス活性の測定
抗ウイルス活性は、Ruttanapumma ら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）の方法で行った。保存しておいたイネの葉のタンパク質抽出液の抗ウイルス活性を鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ；chicken embryo fibroblast）を用いて測定した。１０日齢発育鶏卵からのＣＥＦの作製はTakeharaら（Avian Dis. 31:125-129;1986）の方法に基づいて行った。ＣＥＦを1.0×１05cells/１００μｌ/wellで９６穴プレートに播きフルシート後、培養上清を除去した。イーグルＭＥＭで１０倍階段希釈した葉から抽出したＣｈＩＦＮ−αを１００μｌ/wellで添加し、約２４時間感作させ、１００ ＴＣＩＤ50（５０％ tissue culture infective dose）/１０μｌ/wellでVesicular stomatitis virus（ＶＳＶ）を接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）を経時的に観察した。抗ウイルス活性は、光学顕微鏡下でＣＰＥ抑制が認められた最大希釈倍数の逆数を抗ウイルス活性値（ＥＵ／ｍＬ）とした。
【００５３】
［結果］
１．ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子の作製
当研究室のRuttanapumma ら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）がクローニング、作製したＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子に対するｃＤＮＡに対し、遺伝子改変用にプライマーＣｈＩＦＮ−αＦとＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬＲを設計した(図２)。これらを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅遺伝子の一部を用いて１％アガロースゲル電気泳動で展開したところ、約６００ｂｐの特異的増幅を確認した。
ＰＣＲ産物をTA Cloning Kitを用いてｐＣＲ２．１にライゲーションし、コンピテント細胞である大腸菌ＪＭ１０９へトランスフォーメーションした。White-Blue Selectionを利用して目的遺伝子の挿入されているホワイトコロニーを選択し、増菌培養を行った。得られた大腸菌からプラスミドを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化後、１％アガロースゲル電気泳動で展開した。１００ｂｐ ＤＮＡ Ladderと比較したところ、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子と推定される約６００ｂｐとベクターと推定される約３，９００ｂｐの２本のバンドが認められた。
【００５４】
ＰＣＲにより、Ｈｉｓ−が除去され、ＫＤＥＬ配列が付加されたことを確認するため、クローン化した遺伝子の配列を決定した。その結果、鋳型に用いたＣｈＩＦＮ−α遺伝子配列と同じであり、さらに終了コドン直前に、ＫＤＥＬコード配列が挿入されていることを確認した（図３）。図３は、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ塩基配列及び推定アミノ酸配列を示す。ＫＤＥＬ配列を付加させるようにＰＣＲ法で増幅させた遺伝子をクローニング後、配列決定した。ＣｈＩＦＮ−α本来の小胞体への移行シグナル配列を維持させたまま、Ｃ末端の終了コドン直前にＫＤＥＬ配列が付加されたことを確認した。糖鎖付加部位を推定し、５'末端と３'末端にそれぞれＢｇｌＩＩとＳａｃＩの制限酵素認識配列を確認した。ＯＲＦは、Ｃ末端にＫＤＥＬを含む５９１ヌクレオチドからなり１９７の推定アミノ酸がコードされている。推定シグナルペプチドは３１残基からなり、タンパク質の高次構造の形成に重要なシステイン残基は６つ存在した。さらに、アミノ酸残基６５−６７（ＮＡＳ）、７１−７３（ＮＤＴ）、１０８−１１０（ＮＤＳ）、１８６−１８８（ＮＬＴ）での4つの重要なＮ−グリコシル基形成部位を示した(図３）。
【００５５】
２．トランスファーベクターの構築
塩基配列決定を行い、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子と確認されたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ＰＣＲ２．１をＢｇｌII、ＳａｃＩで消化し、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を含む断片をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにTakara DNA Ligation Kitを用いてライゲーションした。さらにコンピテントセルにトランスフォーメーションし（図４）、大腸菌からプラスミドを抽出した。この抽出したプラスミドをＳａｃＩ、ＸｂａｒＩで消化後、１％アガロースゲル電気泳動を行ったところ、約６００ｂｐの挿入遺伝子と約１２，０００ｂｐのｐＭＬＨベクターのＤＮＡが確認された。図４は、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ導入植物作製を図で表したフローチャートである。まず、ＰＣＲ法によりＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬを増幅し、プラスミドｐＣＲ２．１にクローニングした。配列確認後、ｐＣＲ２．１から制限酵素ＢｇｌＩＩとSａｃＩを用いてプラスミドを消化し、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を取り出した。得られたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を、制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化してＧＵＳ遺伝子を除去された植物用高発現ベクターｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳに挿入した。本プラスミドをAgrobacteriumに導入させ、続いて植物細胞に感染させることにより、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子を植物細胞染色体に組み込んだ。
【００５６】
３．ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ発現組換え植物の作製
ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨを（独）農業生物資源研究所に送付した。そこで、アグロバクテリウム法を用いて、A. tumefaciensから植物細胞核ゲノムに遺伝子導入し、ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ組換え植物である初代イネを作出した（図５）。
【００５７】
４．抗ＣｈＩＦＮ−αポリクローナル抗体の作製
Ruttanapummaら（J.Vet.Med.Sci 67(1):25-28;2005）の方法で精製したバキュロウイルス発現ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓをウサギに免疫し抗ＣｈＩＦＮ−αウサギ血清を得た。ウエスタンブロッティング法により抗体価を測定したところ、１：５，０００倍希釈まで精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓを検出することが出来た(図６)。図６は、ウエスタンブロッティング法による抗血清の確認を図で表したものである。バキュロウイルス発現系でＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ（Ｃ末端にヒスチジンタグ：Ｈｉｓ−ｔａｇを付加させ、精製を容易にしたＣｈＩＦＮ−α）を発現させ、ニッケルキレートカラムで精製した。ウサギに免疫し、ウエスタンブロッティング法により抗血清の抗体価を測定した。ウサギ血清を1：５０００倍希釈した場合においても、図６のように特異的なバンドが認められ、ＣｈＩＦＮ−αに対して高度免疫血清が作製できた。すなわち、抗原に精製したＣｈＩＦＮ−αＨｉｓを用い、一次抗体に作製した抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓウサギ血清を希釈して用いたウエスタンブロッティング法（Western-Blotting法）により抗体価を測定し（二次抗体にはＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を用いた）、ウサギ血清は１：５０００倍希釈まで精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓを検出することができた。なお、この時点においても精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓは６本のバンドとして確認することができる。約１７ｋＤａ、１９ｋＤａ、２３ｋＤａ、および２７ｋＤａのバンドは、前記Ruttanapummaらの報告と一致している。このように、本血清で精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓに対してウエスタンブロッティング解析を行うと、図６のようにバンドが６本認められるが、これは、ウサギに免疫した際に混入した異物かと考えられた（前記Ruttanapummaらの報告では、精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓに対するウエスタンブロッティング解析では抗ヒスチジン抗体を用いたところバンドは４本であった）。
【００５８】
５．ＣｈＩＦＮ−α−ＫＤＥＬ組換え植物の発現の確認
冷凍状態で（独）農業生物資源研究所から送付されてきた初代イネ（ＮＯ．１〜４２：３５は欠番）の葉をDigital Homogenaizer（AS ONE株式会社）で磨り潰し、タンパク質抽出液を採取した後、抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティング解析を行った。ＣｈＩＦＮ−α−ＫＤＥＬ組換えイネは約２７ｋＤａの位置にバンドが認められた。強陽性を示した検体はＮＯ．２３〜２７、３４、３６、３８の８個体であった(データは示していない)。対照として用いた遺伝子組換えしていないイネ“日本晴”には抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナル抗体で認識されるバンドが認められなかった。
【００５９】
この後、強陽性を示した８個体の組換えイネの育成状況を（独）農業生物資源研究所で調べた。その結果、表１（：Table 1.ＣｈＩＦＮ−α組換えイネの育成状況）に示すように、それぞれＮＯ．２３はコメ粒数１２２個から５３個体育成し、ＮＯ．２４は、１２４個から４９個体、ＮＯ．２５は３０個から２２個体、ＮＯ．２６は１１個から７個体、ＮＯ．２７は１０個から２個体、ＮＯ．３４は１００個から３個体、ＮＯ．３６は５１個から３４個体、ＮＯ．３８は９４個から４２個体を育成した（表１）。
【００６０】
【表１】
【００６１】
陽性個体から育成した２代目イネについて各親株から１０個体以内を、上述の方法でウエスタンブロッティング解析をした（図７）。図７は、ＣｈＩＦＮ-αＫＤＥＬの確認を図で表したものである。組換えイネが目的のタンパク質を発現しているかどうか、ウエスタンブロッティング法で調べた。異なるイネ個体の葉から抽出した資料をＳＤＳ-ＰＡＧＥで展開後、ニトロセルロース膜に転写し、抗ＣｈＩＦＮ-αＨｉｓウサギ血清を用いて抗原抗体反応を行った。約２７ｋＤaの位置にバンドが検出された個体があり、この分子量は、ＣｈＩＦＮ-αＨｉｓ発現で得られた最も分子量が高いタンパク質と一致したことから、糖鎖付加されていると推察された。すなわち、１代目に発現が認められた２代目イネをスクリーニングして得られた陽性固体の発現について抗ＣｈＩＦＮ−α抗体を用いてウエスタンブロッティング（Western-Blotting）法により発現の確認をしたところ、約２７ｋＤａの位置に推定糖鎖付加部位としてバンドが認められた。
【００６２】
６．イネ葉中でのＩＦＮ−αの安定性評価
（独）農業生物資源研究所から冷凍状態で送付されてきた、２代目でスクリーニングした陽性個体の葉を用い、植物細胞内におけるＣｈＩＦＮ−αの生物活性の安定性を調べた。収穫した組換えイネの葉を切り、４℃、２０℃、３７℃の環境下で１日、７日、２８日保存した。それらのタンパク質を抽出し、ＣＥＦ細胞を用いて既述の方法で抗ウイルス活性を用いてバイオアッセイを行った。その結果、表２（：Table 2.イネ葉中ＩＦＮ−αの生物活性）に示すように、−２０℃では、７日保存では1.0×１０5倍希釈、２８日保存では1.0×１０6倍希釈までＶＳＶによるＣＰＥを抑制し、それぞれ、−２０℃環境下７日保存は1.0×１０5ＥＵ／１００μｌ、２８日保存は1.0×１０6ＥＵ／１００μｌの生物活性が認められた。４℃では、１日保存では1.0×１０7倍希釈、７日保存では1.0×１０8倍希釈、２８日保存では1.0×１０8倍希釈までＶＳＶによるＣＰＥを抑制し、それぞれ、４℃環境下１日保存は1.0×１０7ＥＵ／１００μｌ、７日保存は1.0×１０8ＥＵ／１００μｌ、２８日保存は1.0×１０8ＥＵ／１００μｌの生物活性が認められた。室温では、１日保存では1.0×１０8倍希釈、７日保存では1.0×１０8倍希釈までＶＳＶによるＣＰＥを抑制し、それぞれ、室温環境下１日保存は1.0×１０8ＥＵ／１００μｌ、７日保存は1.0×１０8ＥＵ／１００μｌの生物活性が認められた。室温２８日保存もこれらと同様の生物活性が認められた。３７℃では、１日保存では1.0×１０8倍希釈、７日保存では1.0×１０7倍希釈、２８日保存では1.0×１０8倍希釈までＶＳＶによるＣＰＥを抑制し、それぞれ、３７℃環境下１日保存は1.0×１０8ＥＵ／１００μｌ、７日保存は1.0×１０7ＥＵ／１００μｌ、２８日保存は1.0×１０8ＥＵ／１００μｌの生物活性が認められた。これに対し、対照として用いた“日本晴”は、時間・温度に関わらず、抗ウイルス活性は認められなかった（表２）。
【００６３】
【表２】
【００６４】
［発育鶏卵におけるＩＦＮ−α投与によるＡＩＶ感染抑制］
１．目的
ＩＦＮ−αは、抗ウイルス活性および免疫応答に重要な役割を持つサイトカインである。現在、タンパク質発現系として従来の系に比べ、低コスト、安全性、精製が不要など多くの利点があり、そのまま飼料として経口的に投与が可能な植物発現系が注目されている。そこでトリへの外来性サイトカイン応用の一環として、典型的には、植物でニワトリＩＦＮ−α(ＣｈＩＦＮ−α)を発現させ、性状を調べ、これを利用して発育鶏卵（in Ovo）でトリインフルエンザウイルス（avian influenza virus）(ＡＩＶ）に対する効果を調べる。
２．方法
植物発現したＣｈＩＦＮ−αをホモジナイズにより抽出し、力価測定をした。抽出したＣｈＩＦＮ−αを発育鶏卵（１０日齢）に投与し、次の日ＡＩＶで攻撃し、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９８ｈごとに検卵した。死亡した卵は４℃に保存した。９８ｈ後卵をすべて４℃に保存して２４ｈ後、漿尿液を回収しＨＡ試験を行った。
植物：イネ（葉）
植物抽出(0.1ｍＬ／卵)：ＩＦＮ−α（１０Ｕ）、Control
Virus：Ｈ３Ｎ８，Ｈ６Ｎ２，Ｈ７Ｎ１(１０ＥＩＤ５０／0.1ｍＬ／卵)
各ウイルスに対しα群、Ｃ群（Control群）それぞれ１０個の卵を使用。
３．結果・考察
【００６５】
【表３】
【００６６】
検卵の結果から、各ウイルスは、α群（ＩＦＮ−α群）とＣ群(Contorol群)を比較すると、α群（ＩＦＮ−α群）は抗ウイルス作用があることがわかる。ＨＡ試験の結果をみると、検卵による生死の判定にほぼ一致しており、検卵で生きていた卵もウイルス感染していることがわかった。また、胎児を卵から取り出してα群とＣ群を比較すると、どのウイルスもＣ群のほうが胎児が小さく赤く充血していた。一方、α群は正常だった。これにより、ＩＦＮ-αはin OvoでＡＩＶに対して抗ウイルス活性があることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】Agrobacteriumへの形質導入用トランスファーベクターであるプラスミドｐＭＬＨ７１３３−ＧＵＳの制限酵素地図並びにコード遺伝子の模式図。
【図２】ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬクローニングのためのＰＣＲプライマーの塩基配列図。
【図３】ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ塩基配列及び推定アミノ酸配列図。
【図４】ＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ導入植物作製図（フローチャート）。
【図５】組換え植物の作製（形質導入）図。
【図６】ウエスタンブロッティング法による抗血清の確認図。
【図７】ＣｈＩＦＮ-αＫＤＥＬの確認図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれてなることを特徴とするトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項２】
トリインターフェロンタンパク質がトリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）である請求項１に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項３】
トリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）をコードする遺伝子が、ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され、このＰＣＲによりＣｈＩＦＮ−αＨｉｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端側でヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）配列が除去され、ＫＤＥＬコード配列が付加されたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子である請求項２に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項４】
リバースプライマーとしてＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬＲ；
5'-gcgagctcctaaagttcatccttagtgccgtgttgcctgt-3'（配列番号１；5'側下線部制限酵素ＳａｃＩ認識部位、3'側下線部ＫＤＥＬ部位）を用い、
フォワードプライマーとしてＣｈＩＦＮ−αＦ；
5'-cgagatctcccaccatggctgtgcctg-3'（配列番号２；下線部制限酵素ＢｇｌII認識部位）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）させる請求項３に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項５】
請求項３に記載のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにライゲーションしたプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをトランスファーベクターとして用いるトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項６】
アグロバクテリウムのノパリン合成酵素(ｎｏｓ)の転写終結配列（ターミネーター）、およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写物のプロモーター融合（インゲンPhasolin遺伝子第一イントロン、及びタバコモザイクウイルスΩ配列を含む）として構成されているキメラプロモーターシリーズの配列を含むプラスミドであるAgrobacteriumへの形質導入用トランスファーベクターｐＭＬＨのＧＵＳ部分にＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬを挿入したトランスファーベクターを用いる請求項５に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項７】
植物が、前記プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをAgrobacterium tumefaciens（以下：A. tumefaciens）に形質導入させた後、前記A. tumefaciensを植物細胞に感染させ、前記植物細胞核ゲノムへ遺伝子導入した組換え植物である請求項５に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項８】
組換え植物がイネ科植物である請求項１〜７のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項９】
イネ科植物が、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、またはトウモロコシである請求項１〜８のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項１０】
イネ科植物がイネである請求項１〜９のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物の継代育成植物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の植物からトリインターフェロンタンパク質を採取するトリインターフェロンの製造方法。
【請求項１３】
前記植物の葉からトリインターフェロンタンパク質を採取する請求項１２に記載のトリインターフェロンの製造方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法で製造されたトリインターフェロンを有効成分とする発育鶏卵用抗トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）作用剤。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれかに記載の植物によるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現を確認するために用いる、精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓをウサギに免疫して得られる抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナルウサギ抗体。
【請求項１６】
トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにライゲーションしたプラスミドをトランスファーベクターとすることを特徴とする植物形質転換用ベクター。
【請求項１７】
トリインターフェロンタンパク質がトリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）である請求項１６に記載の植物形質転換用ベクター。
【請求項１８】
トリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）をコードする遺伝子が、ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され、このＰＣＲによりＣｈＩＦＮ−αＨｉｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端側でヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）配列が除去され、ＫＤＥＬコード配列が付加されたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子である請求項１７に記載の植物形質転換用ベクター。
【請求項１９】
リバースプライマーとしてＣｈＩＦＮ-αＫＤＥＬＲ；
5'-gcgagctcctaaagttcatccttagtgccgtgttgcctgt-3'（配列番号１；5'側下線部制限酵素ＳａｃＩ認識部位、3'側下線部ＫＤＥＬ部位）を用い、
フォワードプライマーとしてＣｈＩＦＮ−αＦ；
5'-cgagatctcccaccatggctgtgcctg-3'（配列番号２；下線部制限酵素ＢｇｌII認識部位）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）させる請求項１８に記載の植物形質転換用ベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにライゲーションしたプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをトランスファーベクターとして用いる植物形質転換用ベクター。
【請求項１】
トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれてなることを特徴とするトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項２】
トリインターフェロンタンパク質がトリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）である請求項１に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項３】
トリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）をコードする遺伝子が、ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され、このＰＣＲによりＣｈＩＦＮ−αＨｉｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端側でヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）配列が除去され、ＫＤＥＬコード配列が付加されたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子である請求項２に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項４】
リバースプライマーとしてＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬＲ；
5'-gcgagctcctaaagttcatccttagtgccgtgttgcctgt-3'（配列番号１；5'側下線部制限酵素ＳａｃＩ認識部位、3'側下線部ＫＤＥＬ部位）を用い、
フォワードプライマーとしてＣｈＩＦＮ−αＦ；
5'-cgagatctcccaccatggctgtgcctg-3'（配列番号２；下線部制限酵素ＢｇｌII認識部位）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）させる請求項３に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項５】
請求項３に記載のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにライゲーションしたプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをトランスファーベクターとして用いるトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項６】
アグロバクテリウムのノパリン合成酵素(ｎｏｓ)の転写終結配列（ターミネーター）、およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写物のプロモーター融合（インゲンPhasolin遺伝子第一イントロン、及びタバコモザイクウイルスΩ配列を含む）として構成されているキメラプロモーターシリーズの配列を含むプラスミドであるAgrobacteriumへの形質導入用トランスファーベクターｐＭＬＨのＧＵＳ部分にＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬを挿入したトランスファーベクターを用いる請求項５に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項７】
植物が、前記プラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをAgrobacterium tumefaciens（以下：A. tumefaciens）に形質導入させた後、前記A. tumefaciensを植物細胞に感染させ、前記植物細胞核ゲノムへ遺伝子導入した組換え植物である請求項５に記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項８】
組換え植物がイネ科植物である請求項１〜７のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項９】
イネ科植物が、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、またはトウモロコシである請求項１〜８のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項１０】
イネ科植物がイネである請求項１〜９のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のトリインターフェロンを産生する組換え植物の継代育成植物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の植物からトリインターフェロンタンパク質を採取するトリインターフェロンの製造方法。
【請求項１３】
前記植物の葉からトリインターフェロンタンパク質を採取する請求項１２に記載のトリインターフェロンの製造方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法で製造されたトリインターフェロンを有効成分とする発育鶏卵用抗トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）作用剤。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれかに記載の植物によるＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬの発現を確認するために用いる、精製ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓをウサギに免疫して得られる抗ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓポリクローナルウサギ抗体。
【請求項１６】
トリインターフェロンタンパク質をコードする遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにライゲーションしたプラスミドをトランスファーベクターとすることを特徴とする植物形質転換用ベクター。
【請求項１７】
トリインターフェロンタンパク質がトリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）である請求項１６に記載の植物形質転換用ベクター。
【請求項１８】
トリインターフェロン−α（ＣｈＩＦＮ−α）をコードする遺伝子が、ＣｈＩＦＮ−αＨｉｓ遺伝子を含むプラスミドを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され、このＰＣＲによりＣｈＩＦＮ−αＨｉｓオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端側でヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）配列が除去され、ＫＤＥＬコード配列が付加されたＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子である請求項１７に記載の植物形質転換用ベクター。
【請求項１９】
リバースプライマーとしてＣｈＩＦＮ-αＫＤＥＬＲ；
5'-gcgagctcctaaagttcatccttagtgccgtgttgcctgt-3'（配列番号１；5'側下線部制限酵素ＳａｃＩ認識部位、3'側下線部ＫＤＥＬ部位）を用い、
フォワードプライマーとしてＣｈＩＦＮ−αＦ；
5'-cgagatctcccaccatggctgtgcctg-3'（配列番号２；下線部制限酵素ＢｇｌII認識部位）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）させる請求項１８に記載の植物形質転換用ベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載のＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ遺伝子をAgrobacteriumトランスファーベクターｐＭＬＨにライゲーションしたプラスミドＣｈＩＦＮ−αＫＤＥＬ−ｐＭＬＨをトランスファーベクターとして用いる植物形質転換用ベクター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−７２９４８（Ｐ２００８−７２９４８Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５５５１４（Ｐ２００６−２５５５１４）
【出願日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第１４２回日本獣医学会学術集会、日本獣医学会主催、２００６年９月２２〜２４日開催（講演要旨集発行：２００６年８月３１日）
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里学園 (180)
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第１４２回日本獣医学会学術集会、日本獣医学会主催、２００６年９月２２〜２４日開催（講演要旨集発行：２００６年８月３１日）
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里学園 (180)
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【Ｆターム（参考）】
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