ニガナ及び／又はニガナの発酵処理物を含有する医薬品組成物
【課題】 生理活性を有するニガナ及び／又はニガナの発酵処理物の有効利用を図り、生体に安全で副作用の少ない、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有する医薬組成物や機能性食品を提供すること。
【解決手段】 ニガナ及び／又はニガナの発酵処理物を含有し、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌による発酵処理物であることが好ましい。
【解決手段】 ニガナ及び／又はニガナの発酵処理物を含有し、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌による発酵処理物であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、沖縄に生育するニガナ植物由来の活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有する医薬組成物や機能性食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、蕁麻疹等の炎症性又はアレルギー性疾患が、深刻な社会問題となっている。これらの疾患では、かゆみを伴う症状が現れることから、患者の肉体的又は精神的な消耗を招き、症状によっては日常生活に支障を来すほど、重篤となるケースも見られる。
【０００３】
アレルギー反応とは、細菌やウイルス、或いは異物の侵入に対する生体防御反応の過剰発現を伴う生体に不利益な免疫反応であり、発症の機構から４つの型（Ｉ型〜IV型）に分類される。Ｉ型アレルギー反応は、主として免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体が関与する反応である。Ｉ型アレルギー反応は、即時型反応で肥満細胞や好塩基球表面のＦｃ受容体と結合しているＩｇＥ抗体に、抗原が再度体内に侵入すると、細胞表面のＩｇＥ抗体と反応し抗体間に架橋が形成され、これが引き金となり、肥満細胞や好塩基球の脱顆粒が起こり、顆粒中に含まれたヒスタミン、セロトニン、ＳＲＳ−Ａ、ＥＣＦ−Ａ、セロトニン、プロスタグラジン等の化学伝達物質が放出されて組織障害を起こすものである。Ｉ型アレルギー反応によって、発症する疾患には、アナフィラキシーショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎などがある。
【０００４】
また、II型アレルギー反応は、細胞膜そのもの、または細胞膜に付着した抗原に対してＩｇＧ又はＩｇＭ抗体が結合し、さらに補体の作用により細胞に穴を開けて細胞を溶かすものである。II型アレルギー反応によって、発症する疾患には、溶血性貧血、突発性血小板減少症、重症筋無力症、グットパスチャー症候群、臓器移植拒絶反応などがある。III型アレルギー反応は、抗原とＩｇＧ抗体が結合した免疫複合体が食細胞に処理されきれずに組織に沈着し、そこへ補体やマクロファージ、好中球などが集まり炎症を起こし組織障害が生じるものである。III型アレルギー反応によって、発症する疾患には、急性糸球体腎炎、関節リウマチ、ウイルス性肝炎、全身性エリテマトーデス、クリオグロブリン血症などがある。ＩＶ型アレルギー反応は、遅延型反応で抗原に感作されたＴ細胞がリホカイン等を放出し、リンパ球、マクロファージなどによる組織障害を起こすものである。IV型アレルギー反応によって、発症する疾患には、接触性皮膚炎、結核、悪性腫瘍、臓器移植後の拒絶反応などがある。これらのアレルギー反応のうち、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体が関与するＩ型アレルギーは、発生頻度が最も多いアレルギーである。
【０００５】
他方、植物及び／又はその抽出物には、様々な生理活性成分が含まれていることが知られており、生体に対する安全性が高いことから医薬品への応用がなされている。アレルギー反応による疾患の予防又は治療にも利用されており、具体的には、シソ種子のアルコール抽出物中のアピゲニン、クリソエリオール、ルテオリンおよびロスマリン酸から選ばれる１種または２種以上を有効成分とするヒスタミン遊離抑制剤（例えば、特許文献１参照）や、ツリフネソウ（Impatiens textori Miq.）の花弁の抽出エキスを含有することを特徴とする抗アレルギー組成物（例えば、特許文献２参照）や、カテキン類及び／又はその配糖体、フラボン類及び／又はその配糖体、フラボノール類及び／又はその配糖体、フラバノン類及び／又はその配糖体、イソフラボン類及び／又はその配糖体、クマリン類及び／又はその配糖体、アガリクス属等に属するきのこ、ビチス属、プランタゴ属、リナム属、シナピス属、カーサマス属、ペリラ属、ゴシピウム属、リシナス属、オエノセラ属、ローズマリー属、カメリア属、バンザクロ属、ユーカリ属、ベリス属、グナファリウム属、アルクトスタフィロス属、セントーレ属、ユーフラシア属、リスラム属等に属する植物の抽出物、赤ワイン乾燥粉末の群より１種又は２種以上からなるＩｇＥ産生抑制剤を配合することを特徴とする化粧料（例えば、特許文献３参照）等を挙げることができる。
【０００６】
ところで、ニガナはキク科ニガナ属に属する多年草で、葉や茎に苦味のある白い乳液を含み、山地や野原にごく普通に植生し、沖縄でもよく見られる。ニガナは血液中に存在するペプチドのアンジオテイシンＩが酵素の作用によりアンジオテイシンIIへ変換されるのを抑制する機能（ＡＣＥ活性阻害機能）を有する成分を含有し、これにより血圧上昇抑制効果を奏することが知られている。このようなニガナが有する機能を利用したものとして、例えば、アブラナ花、イタリアンパスレー葉、ウド葉、カキドウシ葉、カラハナソウ葉、クサボケ花、クズ葉花、シシウド花実、シュプレット葉、スイバ葉、デイル葉、ニガナ全草、ニリン草全草、ヒメジオン花、ペパーミント葉、マスタード葉、ワレモコウ葉、矢車草花葉、ヤマフジ花から成る群より選択した少なくとも１種を凍結乾燥後粉砕し、その粉砕物を水抽出して得られた抽出物を含み、且つアンジオテイシン変換酵素の存在下において、アンジオテイシン１からアンジオテイシン２への変換抑制機能（ＡＣＥ活性阻害機能）を有する食品添加剤（例えば、特許文献４参照）等が知られている。
【０００７】
また、本発明者らは、以前にニガナを乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌を用いて発酵させることを特徴とする発酵処理物の製造方法（例えば、特許文献５参照）や、ニガナ（Crepidiastrum lanceolatum Nakai）及び／又は前記発酵方法を利用したニガナ発酵処理物を有効成分とすることを特徴とするリポキシゲナーゼ阻害剤（例えば、特許文献６参照）を提案している。
【０００８】
このリポキシゲナーゼ阻害剤は、５−ヒドロペルオキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸（５−ＨＰＥＴＥ）等のアラキドン酸代謝物の生成を抑えることで、アラキドン酸代謝物に起因する疾患、例えば、アレルギー性疾患、炎症、喘息等の予防・治療剤に利用することができるものである。
【０００９】
しかし、これまでニガナやニガナ発酵処理物にリポキシゲナーゼ阻害活性が有することは知られていたものの、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有することについては、全く知られていなかった。
【００１０】
【特許文献１】特開２０００−８６５１０号公報
【特許文献２】特開２００１−２７８７９６号公報
【特許文献３】特開２００３−２８１１号公報
【特許文献４】特開平０６−２２５７２３号公報
【特許文献５】特開２００４−７３０５０号公報
【特許文献６】特開２００５−０８９３８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、生理活性を有するニガナ及び／又はニガナの発酵処理物の有効利用を図り、生体に安全で副作用の少ない、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有する医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、沖縄に生育するニガナ植物の有効活用を目的とし、ニガナ植物の生理活性について鋭意研究した結果、ニガナの抽出物に活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有することを見い出し、さらに、ニガナの発酵処理物は、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性がニガナに比べ増加することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、（１）活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性のうち少なくともいずれか１種以上の活性を有する、ニガナ（Crepidiastrum lanceolatum Nakai）及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有する、活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤や、（２）ニガナの葉を粒径０．１〜３．０ｍｍまで粉砕処理後、粉砕処理物１重量部に対し、２〜１０重量部の水を添加し、さらに、微生物群を添加することにより発酵処理し、発酵処理物を溶媒で抽出した抽出物を含有することを特徴とする前記（１）記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤や、（３）ニガナの発酵処理物が、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌により発酵させて得られることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤や、（４）ニガナの重量に対し、１〜１０重量％の微生物群を添加することを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤や、（５）抽出溶媒として、メタノール、エタノール、酢酸エチル又はこれらの混合溶媒の少なくとも１種以上を用いて得られるニガナ及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤に関する。
【００１４】
また本発明は、（６）活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性のうち少なくともいずれか１種以上の活性を有する、ニガナ（Crepidiastrum lanceolatum Nakai）及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有することを特徴とし、これらの諸活性による炎症・アレルギー性疾患の改善のために用いられる旨の表示を付した機能性食品や、（７）ニガナの葉を粒径０．１〜３．０ｍｍまで粉砕処理後、粉砕処理物１重量部に対し、２〜１０重量部の水を添加し、さらに、微生物群を添加することにより発酵処理し、発酵処理物を溶媒で抽出した抽出物を含有することを特徴とする前記（６）記載の機能性食品や、（８）ニガナの発酵処理物が、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌により発酵させて得られることを特徴とする前記（６）又は（７）に記載の機能性食品や、（９）ニガナの重量に対し、１〜１０重量％の微生物群を添加することを特徴とする前記（６）〜（８）のいずれかに記載の機能性食品や、（１０）抽出溶媒として、メタノール、エタノール、酢酸エチル又はこれらの混合溶媒の少なくとも１種以上を用いて得られるニガナ及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有することを特徴とする前記（６）〜（９）のいずれかに記載の機能性食品に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、ニガナ及び／又はニガナの発酵処理物を含有することで、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有し、副作用が少なく安全なアレルギー性疾患、炎症性疾患等の予防・治療薬や、アレルギー性疾患、炎症性疾患等の予防・治療用の機能性食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性のうち少なくともいずれか１種以上の活性を有する、ニガナ及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有する、活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤であれば特に制限されるものではなく、具体的には、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有する活性酸素生成阻害剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有するロイコトリエン類生成阻害剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有するヒスタミン遊離抑制剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有するＩＬ−１β遊離阻害剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有するＩＬ−６遊離阻害剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有する活性酸素生成阻害・ロイコトリエン類生成阻害の複合活性剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有する活性酸素生成阻害・ロイコトリエン類生成阻害・ヒスタミン遊離抑制の複合活性剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有する活性酸素生成阻害・ロイコトリエン類生成阻害・ヒスタミン遊離抑制・ＩＬ−１β遊離阻害・ＩＬ−６遊離阻害の複合活性剤等の複合活性剤（これらを総称して「医薬組成物」ということがある。）を例示することができる。また、本発明の機能性食品としては、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性のうち少なくともいずれか１種以上の活性を有する、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有することを特徴とし、これらの諸活性による炎症・アレルギー性疾患の改善のために用いられる旨の表示を付した食品であれば特に制限されるものではない。
【００１７】
本発明において用いられるニガナ植物は、キク科（Asteraceae）に属する植物であり、使用部位は、根等の地下部や、茎、葉、花等の地上部であってよく、また、これら２種以上の混合物や、全草であってもよい。これらのうちで、特に葉が好ましい。かかるニガナの発酵処理物の処理としては、発酵処理前に、ニガナを粉砕処理することが、発酵菌との接地面積を十分に確保でき、発酵を効果的に進行させることができることから、好ましい。具体的には、粒径３ｍｍ以下、好ましくは０．５ｍｍ〜１．０ｍｍの粒径まで粉砕する処理が好ましい。
【００１８】
さらに、上記発酵処理は、ニガナの粉砕処理物に、発酵の進行を促進するため、乾物１重量部に対し、２〜１０重量部、特に５重量部程度の水分を添加することが好ましい。かかる粉砕処理物に微生物を添加する。微生物は培養後、培地へ添加する前に予め混合し、乾燥体である場合の植物の重量に対して、１〜１０重量％添加することが好ましい。発酵は、温度２０〜５０℃、好ましくは４０℃であり、発酵時間はｐＨや、菌数等の条件による発酵の進行状況等により適宜選択することができ、例えば、ｐＨ４〜５、菌数１０６以上であれば、約７２時間とすることができる。発酵処理時、必要に応じてエアレーションや脱酸素処理を行うことができるが、脱酸素処理後に静置培養において発酵させることができる。発酵形式は、液体培養でなく固体培養が好ましい。
【００１９】
上記発酵処理に使用する微生物としては、乳酸菌、酵母、枯草菌を使用することができ、これらを単独又は２種以上を適宜組み合わせることもできるが、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌との組み合わせが特に好ましい。
【００２０】
上記発酵処理に使用される乳酸菌としては、ストレプトコッカス属（Storeptococcus）、ラクトバシルス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）又はテトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）のいずれかに属する菌が好ましく、特にラクトバシルス属が好ましい。上記ストレプトコッカス属に属する菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）であることが好ましく、ストレプトコッカス・サーモフィルスＩＦＯ１３９５７菌株を具体的に例示することができる。また、ラクトバシルス属に属する菌としては、ラクトバシルス・プランタリム（L. plantrum）、ラクトバシルス・デルブリッキ（L. delbruckii）、ラクトバシルス・ペントサス（L. pentosus）又はラクトバシルス・カセイ（L. casei）のいずれかに属する菌であることが好ましく、これらの菌のうち、特にラクトバシルス・プランタリムが好ましい。かかるラクトバシルス・プランタリムとしてＩＦＯ１４７１２菌株やＩＦＯ１４７１３菌株を、ラクトバシルス・デルブリッキとしてＩＦＯ１３９５３菌株を、ラクトバシルス・ペントサスとしてＩＦＯ１２０１１菌株を、ラクトバシルス・カセイとしてＩＦＯ１５８８３菌株を、それぞれ具体的に例示することができる。また、テトラジェノコッカス属に属する菌としては、テトラジェノ・ハロフィルス（T. halophilus）であることが好ましく、テトラジェノ・ハロフィルスＩＦＯ１２１７２菌株を具体的に例示することができる。これら乳酸菌は、ニガナ植物の乾物１ｇあたり、通常１０３〜１０７個、特に１０６〜１０７個用いることが好ましい。
【００２１】
上記発酵処理に用いられる酵母は、カンジダ属（Candida）又はサッカロマイセス属（Saccharomyces）に属する菌が好ましい。かかるカンジダ属に属する菌として、カンジダ・ビルサチルス（Candida versatilis）であることが好ましく、カンジダ・ビルサチルスとしてＩＦＯ１００３８菌株を具体的に例示することができる。サッカロマイセス属に属する菌として、サッカロマイセス・セレビシアエ（S. cerevisiae）であることが好ましく、サッカロマイセス・セレビシアエとしてＩＦＯ０５５５菌株を具体的に例示することができる。これら酵母菌は、ニガナ植物の乾物１ｇあたり、通常１０３〜１０７個、特に１０６〜１０７個用いることが好ましい。
【００２２】
さらに、上記発酵処理において用いられる枯草菌としては、バシルス・ズブチルス（B. subtilis）ＩＦＯ３０１３菌株を具体的に例示することができる。これら枯草菌は、ニガナ植物の乾物１ｇあたり、通常１０３〜１０７個、特に１０６〜１０７個用いることが好ましい。
【００２３】
上記発酵処理において、好ましく用いられる微生物群としては、乳酸菌、酵母及び枯草菌を含む微生物群が好ましく、これら微生物群の中でも、ラクトバシルス・プランタリム、ストレプトコッカス・サーモフィルス、バシルス・ズブチルスの混合菌であることが好ましく、これらはニガナ植物の乾物に対し、菌数として同数を使用することが好ましい。このような菌数の組合せにおいて菌を使用することにより、発酵時間の短縮を図り、ひいては雑菌の繁殖を抑制することができる。
【００２４】
なお、発酵終了後、乾燥機により水分値が１０重量％以下となるように乾燥することが好ましく、乾燥方法としては、加熱乾燥や凍結乾燥によることができ、加熱乾燥の場合は、品温が１００℃以下で行われることが、生理活性成分の失活を防止することができるため好ましい。乾燥後、必要に応じて加熱等公知の方法により滅菌処理を行ない、本発明の医薬組成物（ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有する活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、ＩＬ−６遊離阻害剤、活性酸素生成阻害・ロイコトリエン類生成阻害の複合活性剤、活性酸素生成阻害・ロイコトリエン類生成阻害・ヒスタミン遊離抑制の複合活性剤、活性酸素生成阻害・ロイコトリエン類生成阻害・ヒスタミン遊離抑制・ＩＬ−１β遊離阻害・ＩＬ−６遊離阻害の複合活性剤）に好適に使用することができるニガナの発酵処理物が得られる。
【００２５】
本発明のニガナ及び／又はその発酵処理物は、抽出溶媒を用いて得られるニガナ及び／又はその発酵処理物の抽出物とすることもでき、前記抽出溶媒としては、水、メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコールや、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコールや、ヘキサン等の非極性溶媒や、酢酸エチル等の極性溶媒の一種又は二種以上を用いることができる。この中でも、メタノール、エタノール、酢酸エチルが好ましい。
【００２６】
本発明の医薬組成物には必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤の製剤とすることができる。またこれら製剤は、経口又は非経口に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができるほか、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。また、投与量は、疾病の種類、患者の体重、投与形態等により適宜選定することができる。かかる製剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが、一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。尚、投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有することから、これらが関与する疾病の予防及び治療剤として利用することができる。具体的には、活性酸素生成阻害活性を有することから、活性酸素が関与する種々の病態や疾患、例えば動脈硬化、脳梗塞、脳虚血−再潅流障害、潰瘍、悪性腫瘍、糖尿病、てんかん、老化、炎症等の予防及び治療剤として利用することができ、ロイコトリエン類生成阻害活性を有することから、ロイコトリエン類の増加に起因する炎症およびその他の疾病に対する治療効果を発揮し、ヒスタミン遊離抑制活性を有することから、ヒスタミン遊離が関与する疾患、例えば花粉症、喘息、枯れ草熱、鼻炎、蕁麻疹、薬物アレルギー等の予防及び治療剤として利用することができる。さらに、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有することから、癌、動脈硬化、慢性リンパ節炎、慢性関節リウマチ、大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患等の予防及び治療剤として利用することができる。
【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
[発酵ニガナの調整]
乾燥したニガナの葉３０ｇを０．１〜３ｍｍの粒径に粉砕し容器に入れた。ニガナを入れた容器に水１５０ｇ、糖蜜０．９ｇ、米ぬか０．９ｇを添加した。かかる粉砕ニガナを収納した容器に、ラクトバシルス・プランタリム（ＩＦＯ１４７１２菌株、ＩＦＯ１４７１３菌株）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＩＦＯ１３９５７菌株）、バシルス・ズブチルス（ＩＦＯ３０１３菌株）の各々の菌を培養後、菌数１：１：１の割合で混合し、ニガナの重量に対し、１０重量％を添加し、容器を密閉し、静置培養により発酵を行った。発酵温度は４０℃、発酵時間は７２時間とした。その後、乾燥機により水分値が１０重量％以下になるまで、６０℃で乾燥した後、滅菌処理（１３０℃蒸気、５〜１５秒）を行い、発酵ニガナ３１ｇを得た。
【実施例２】
【００３０】
［サンプルの調製］
(ｉ)ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉、及び実施例１で得られた発酵ニガナ、各１ｇあたりメタノール１０ｍｌを添加し、静置で１２時間抽出し、ろ過後残渣にメタノールを１０ｍｌ添加して同様に抽出し、メタノール抽出物を得た。このメタノール抽出物をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）で希釈することにより最終濃度２５μｇ／ｍＬのサンプルを調製した。
(ii)ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉、及び実施例１で得られた発酵ニガナ、各１ｇあたり酢酸エチル１０ｍｌを添加し、静置で１２時間抽出し、ろ過後残渣に酢酸エチルを１０ｍｌ添加して同様に抽出し、酢酸エチル抽出物を得た。この酢酸エチル抽出物をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）で希釈することにより最終濃度２５μｇ／ｍＬのサンプルを調製した。
【実施例３】
【００３１】
[ニガナ及び発酵ニガナの活性酸素生成阻害活性の評価]
ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉及び実施例２で得られた発酵ニガナの抽出物について、それぞれ活性酸素生成量を測定し、活性酸素生成阻害活性を評価した。ＨＬ−６０細胞の濃度を４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、ジメチルスルフォキシドを終濃度（final conc.）が１．２５％になるように加え、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで前記細胞を培養した。好中性顆粒球に分化した細胞を回収し、ＨＢＳＳ（Hanks’ Balanced Salt Solution）で洗浄後、再懸濁して１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。実施例２で調製したサンプル（終濃度；２５μｇ／ｍｌ）あるいは１μｌのジメチルスルフォキシド（コントロール）と細胞懸濁液１ｍｌを混合し、３７℃の水浴で１５分インキュベートした。ＨＢＳＳで洗浄後１ｍｌに再懸濁して３７℃の水浴で５分インキュベートした。終濃度が２μＭ（ＥｔＯＨ希釈）になるようにＴＰＡ（Phorbol 12-Myristate 13-Acetate）を添加し、９０秒後にシトクロムＣ(Cytochrome C)（２０ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌ添加（終濃度；７６μＭ）した。３７℃の水浴で１５分インキュベートした後、氷中に５分間静置させ、遠心分離（６６００ｒｐｍ，５分）して、５５０ｎｍにおける上澄みの吸光度を分光光度計（ＵＶ−２２００ＡＩ：島津社製）で測定した。各々のサンプルにおいてＴＰＡ有無による吸光度の差をＡ５５０とし、下記の式により（Meth.Enzymol:, 105,358-365,1984）、スーパーオキサイドアニオンラジカル（・Ｏ２−）の量を算出した。メタノール抽出物及び酢酸エチル抽出物における・Ｏ２−の産生量の結果をそれぞれ図１及び図２に示した。
【００３２】
・Ｏ２−（ｎｍｏｌ／ｍｌ）＝４７．７×Ａ５５０
メタノール抽出物及び酢酸エチルのいずれにおいても、活性酸素生成阻害活性を示した。また、いずれについても発酵後に活性酸素生成阻害活性が増強した。このことから、ニガナ及び／又はその発酵処理物は、活性酸素生成阻害活性を有することが明らかとなった。
【実施例４】
【００３３】
[ニガナ及び発酵ニガナのロイコトリエン類生成阻害活性の測定]
ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉及び実施例２の(ii)で得られた発酵ニガナの抽出物について、それぞれロイコトリエン（ＬＴ）類生成阻害活性を測定した。
【００３４】
[試薬]
（１）１０×ＰＢＳの調整
０．２ＭのＮａＨ２ＰＯ４および０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４を混合しｐＨ７．０に調整後、３．０ＭのＮａＣｌを溶解させ、２倍量にメスアップし、１２０℃で２０分間オートクレーブさせ、０．１ＭのＰＢＳ（phosphate buffer containing ０．１５Ｍ NaCl）を調整した（１０×ＰＢＳ）。
（２）１×ＰＢＳの調整
１０×ＰＢＳ溶液を１０倍に希釈し、１２０℃で２０分間オートクレーブさせ、０．０１ＭのＰＢＳを調整した（１×ＰＢＳ）。
（３）ＣａＣｌ２溶液の調整
終濃度１ｍＭになるように、１．４７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを１００ｍｌの１×ＰＢＳに溶解し、１２０℃で２０分間オートクレーブさせ、ＣａＣｌ２溶液を調整した。このＣａＣｌ２溶液を４℃で保存した。
（４）カルシウムイオノファＡ２３１８７の調整
１ｍｇのＡ２３１８７（Ｓｉｇｍａ社製）に３８２μｌのメタノールを加え、５ｍＭのストックソルーション（Stock Solution）とし、−２０℃で保存した。このストックソルーションを１×ＰＢＳで１０倍希釈し、最終濃度５μＭとなるよう使用時に調製した。
（５）０．４％ジキトニン（digitonin）溶液の調整
４００ｍｇのジキトニン、４００ｍｇのトリトロンＸ−１００、１００ｍｌのMillQ水を混合し、０．４％のジキトニン溶液を調整した。
【００３５】
ＲＢＬ２Ｈ３細胞（北里大学薬学部衛生化学研究室より入手）を６穴プレート（培地３ｍｌ／穴）に１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播き、２日間培養した。培地を除去し、新しい培地１ｍｌに対し、実施例２（ii）で調整したサンプルを終濃度２５μｇ／ｍｌになるように添加した。その後３７℃で１時間インキュベーションさせ、培地を除去し、１ｍｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した。新たに１×ＰＢＳを１ｍｌ加え、ＣａＣｌ２溶液を１０μｌ添加後（最終濃度１ｍＭ）、３７℃で５分間インキュベーションした。続いてＡ２３１８７を１０μｌ添加（最終濃度５μＭ）し、３７℃で５分間インキュベーションして刺激した。反応後、直ちに培養上澄みをエッペンに回収し、浮いた細胞を除去するために遠心分離（４℃、２０００ｒｐｍ、３分間）し、上澄みをＬＴＣ４ ＥＩＡキット（Cayman社製）、及びＣｙｓｔｅｉｎｙｌ−ＬＴ ＥＩＡキット（Cayman社製）に供した。また、上清回収後の細胞について、０．４％のジキトニン溶液を加え、３７℃で１０分間振とうしてエッペンに回収し、遠心分離した（４℃、５０００ｒｐｍ、５分間）。その上澄みを用い、以下に示したＢＣＡ法によりタンパク質を定量した。ＥＩＡキットにより得られた結果をタンパク質量当たりの値として補正し、ＬＴＣ４及びCysteinyl−ＬＴｓ量を算出した。
【００３６】
[ＢＣＡ法によるタンパク質の定量]
回収した細胞サンプルを９６穴マイクロプレートに１０μｌずつ３連で分注した。検量線として０．２ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを同様に添加した。ＢＣＡ Protein Assay Reagent Ａ（Pierce社製）、及びＢＣＡProtein Assay ReagentＢ（Pierce社製）を５０：１の割合で混合後、１９５μｌずつマイクロプレートにすばやく添加した。３７℃で３０分間インキュベートし、５６２ｎｍの吸光度を測定した。検量線を作成し、サンプルのタンパク質濃度を算出した。
【００３７】
ニガナ及びその発酵処理物の酢酸エチル抽出物（ＤＭＳＯで希釈）におけるＬＴＣ４及びCysteinyl−ＬＴｓ量を図３及び４に示す。ニガナ及びその発酵処理物の酢酸エチル抽出物に代えて１μｌのＤＭＳＯを用いた場合をコントロールとした。ニガナ及びその発酵処理物の抽出物のいずれについても、ＬＴＣ４及びCysteinyl−ＬＴｓ量が抑制された。特に、発酵処理物の阻害活性が顕著であった。このことから、ニガナ及び／又はその発酵処理物は、ロイコトリエン類生成阻害活性を有することが明らかとなった。
【実施例５】
【００３８】
[ニガナ及び発酵ニガナのヒスタミン遊離抑制の評価]
実施例２の(ｉ)で得られたニガナ及び発酵ニガナの抽出物について、それぞれヒスタミン遊離抑制活性を測定した。
【００３９】
[タイロードバッファー（Tyrode buffer；ｐＨ７．２)の調整]
１３７ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）１．６ｇと、２．７ｍＭの塩化カリウム４０．３ｍｇと、１．８ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）４０．７ｍｇと、５．６ｍＭのグルコース２０１．８ｍｇとを超純粋水に溶解した。溶解液を１２ｍＭの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）２０１．６ｍｇ又は０．４ｍＭのリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）２８．７ｍｇでｐＨを７．２とし、タイロードバッファー（Tyrode buffer；ｐＨ７．２)を調整した。このバッファーは常温で保存した。
【００４０】
ＫＵ８１２細胞（ヒト好塩基球由来培養細胞）は、（財）ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクより入手した。ＫＵ８１２細胞は１０％のＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ＫＵ８１２細胞（５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌ）を３５ｍｍのｄｉｓｈに播種し、実施例２（ｉ）で調整したサンプルを被験物質として３０分間処理した。細胞をエッペンドルフチューブに回収後、ＰＢＳで２回洗浄した。上清を除き、２００μｌのタイロードバッファーで細胞を懸濁後、ＣＲＡ−１（１ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。冷却により反応を停止させ、遠心分離（４℃、３００ｇ、５分）し、上清１００μｌ中のヒスタミン遊離量を蛍光測定（Ｅｍ；３５５ｎｍ、Ｅｘ；４６０ｎｍ）により定量した。ヒスタミン遊離量の測定スキーム及びヒスタミン遊離量の結果を図５に示した。
【００４１】
図５に示すように、ニガナ及び／又はその発酵処理物は、いずれについても濃度依存的にヒスタミン遊離抑制を示すことが明らかとなった。
【実施例６】
【００４２】
[デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）で刺激したマウス腹腔マクロファージにおけるニガナ及び発酵ニガナの炎症性サイトカインＩＬ−１ｂ生成抑制の評価]
ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉、実施例１で得られたニガナ及び発酵ニガナについて、それぞれデキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）で刺激したマウスの単球由来腹腔マクロファージにおけるＩＬ−１ｂ産生を測定した。
【００４３】
単球由来の腹腔マクロファージは論文に記載（Kwon 2002）の通りに準備した。腹腔滲出細胞を９６穴プレートに１×１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；Gibco BRL社製）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Gibco BRL社製）中に蒔き、３７℃、５％ＣＯ２下で前記細胞をインキュベートした。２４時間インキュベートした後、腹腔マクロファージを、１０ mｇ／ｍｌのＤＳＳで刺激させ、種々濃度のニガナ及び発酵ニガナのＤＭＳＯ溶液（４mｇ／ｍｌ〜１００mｇ／ｍｌ）を被験物質として２４時間処理した。その後、遠心分離（１９００ｇ，４℃，１５分間）し、上澄中（希釈係数＝２０）のＩＬ−１βとＩＬ−６の濃度を、製造者の指示に従い、エライザキットを用いて測定した。
【００４４】
図６に示されるように、実施例１で得られたニガナ及び発酵ニガナが、マウス腹腔マクロファージにおけるＩＬ−１ｂ産生に対して抑制効果を示した。
【実施例７】
【００４５】
[デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）投与によるマウス大腸粘膜におけるニガナ、発酵ニガナ及びルテオリンの炎症性サイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−６生成抑制の評価]
ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉、実施例１で得られた発酵ニガナ及びニガナ中に含まれるルテオリン（ＬＴ）、ルテオリン−６−グルコシド（ＬＴ−Ｇ）について、それぞれデキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）を投与したマウスの大腸粘膜におけるＩＬ−１ｂ及びＩＬ−６産生量を測定した。
【００４６】
マウスの大腸炎発生の誘導は、図７に示すように行った。すなわち、飲料水及び餌（ＭＦペレット；オリエンタル酵母社製）を自由に与えられるマウス（Ｇｒｏｕｐ１）をコントロールマウスとした。最初の７日間は通常の飲料水を与え、後の７日間は３％（w/v）のＤＳＳを添加した飲料水を与え、餌は自由に与えられるマウス（Ｇｒｏｕｐ２）をＤＳＳ投与における大腸炎モデルマウスとした。最初の７日間は通常の飲料水を与え、後の７日間は３％（w/v）のＤＳＳを添加した飲料水を与え、餌には被験物質として、ニガナ又は発酵ニガナを添加したものを最初から試験終了（１４日間）まで与えられたマウス（Ｇｒｏｕｐ３又は４）を治験マウスとした。
【００４７】
上記大腸炎発生プロトコール後のグループ１〜４のマウス（各グループｎ＝３）から、それぞれ虫垂のない大腸を取り除いた。氷冷したＰＢＳで洗浄後、標本をフィルターペーパー上に置き、大腸の長さを測定した（図８参照）。外科用はさみで大腸を開き、内容物を取り出した。大腸粘膜剥離は標本が液体窒素で凍結状態の間にかみそりを使用し擦り取った。大腸粘膜剥離標本を外科用はさみで細かく刻み、さらにホモジナイザーを使用し、氷冷ＰＢＳ中で検体破砕した。上澄みを入手するために、ホモジェネートした組織を遠心分離（１９００ｇ，４℃，１５分間）した。大腸剥離粘膜から遠心分離で得た上澄み中（希釈係数＝２０）のＩＬ−１βとＩＬ−６の濃度を、製造者の指示に従い、エライザキットを用いて測定した。結果をタンパク質量当たりの値として補正した。なお、組織の上澄み液中の総タンパク質濃度は、製造者の指示に従い、γ−グロブリンを内部標準として用い、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Bio-Rad Laboratories社製）を使用することで決定した。結果を図９及び１０に示す。
【００４８】
これらの結果から、グループ３のマウス（ニガナ）やグループ４のマウス（醗酵ニガナ）における大腸の長さは、グループ２のマウス（大腸炎モデルマウス；ＤＳＳ）に比べて変化が少なく、グループ１のマウス（コントロール；ＣＴ）に近かった。また、グループ３のマウス（ニガナ）や、グループ４のマウス（醗酵ニガナ）におけるＩＬ−１β及びＩＬ−６の産生量は、グループ２のマウス（大腸炎モデルマウス；ＤＳＳ）におけるＩＬ−１β及びＩＬ−６の産生量よりも少なく、ニガナや醗酵ニガナがインビボでも、ＩＬ−１βやＩＬ−６等の大腸膜粘膜における炎症性サイトカイン産生抑制効果を示すことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明のニガナ及び発酵ニガナのメタノール抽出物における活性酸素生成量を測定した結果を示す図である。
【図２】本発明のニガナ及び発酵ニガナの酢酸エチル抽出物における活性酸素生成量を測定した結果を示す図である。
【図３】本発明のニガナ及び発酵ニガナの酢酸エチル抽出物におけるＬＴＣ４量を測定した結果を示す図である。
【図４】本発明のニガナ及び発酵ニガナの酢酸エチル抽出物におけるCysteinyl−ＬＴｓ量を測定した結果を示す図である。
【図５】本発明のニガナ及び発酵ニガナにおけるヒスタミン遊離量を測定した結果及びヒスタミン遊離量の測定スキームを示す図である。
【図６】本発明のニガナ及び発酵ニガナにおけるＤＳＳ刺激したマウス腹腔マクロファージにおけるＩＬ−１β産生量を測定した結果を示す図である。
【図７】本発明のニガナ及び発酵ニガナにおけるＤＳＳ投与マウスの大腸炎症発生プロトコールを示す図である。
【図８】本発明のニガナ及び発酵ニガナにおけるＤＳＳ投与マウスの大腸長変化の結果を示す図である。
【図９】本発明のニガナ及び発酵ニガナにおけるＤＳＳ投与マウスの大腸粘膜におけるＩＬ−β産生量の結果を示す図である。
【図１０】本発明のニガナ及び発酵ニガナにおけるＤＳＳ投与マウスの大腸粘膜におけるＩＬ−６産生量の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、沖縄に生育するニガナ植物由来の活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有する医薬組成物や機能性食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、蕁麻疹等の炎症性又はアレルギー性疾患が、深刻な社会問題となっている。これらの疾患では、かゆみを伴う症状が現れることから、患者の肉体的又は精神的な消耗を招き、症状によっては日常生活に支障を来すほど、重篤となるケースも見られる。
【０００３】
アレルギー反応とは、細菌やウイルス、或いは異物の侵入に対する生体防御反応の過剰発現を伴う生体に不利益な免疫反応であり、発症の機構から４つの型（Ｉ型〜IV型）に分類される。Ｉ型アレルギー反応は、主として免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体が関与する反応である。Ｉ型アレルギー反応は、即時型反応で肥満細胞や好塩基球表面のＦｃ受容体と結合しているＩｇＥ抗体に、抗原が再度体内に侵入すると、細胞表面のＩｇＥ抗体と反応し抗体間に架橋が形成され、これが引き金となり、肥満細胞や好塩基球の脱顆粒が起こり、顆粒中に含まれたヒスタミン、セロトニン、ＳＲＳ−Ａ、ＥＣＦ−Ａ、セロトニン、プロスタグラジン等の化学伝達物質が放出されて組織障害を起こすものである。Ｉ型アレルギー反応によって、発症する疾患には、アナフィラキシーショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎などがある。
【０００４】
また、II型アレルギー反応は、細胞膜そのもの、または細胞膜に付着した抗原に対してＩｇＧ又はＩｇＭ抗体が結合し、さらに補体の作用により細胞に穴を開けて細胞を溶かすものである。II型アレルギー反応によって、発症する疾患には、溶血性貧血、突発性血小板減少症、重症筋無力症、グットパスチャー症候群、臓器移植拒絶反応などがある。III型アレルギー反応は、抗原とＩｇＧ抗体が結合した免疫複合体が食細胞に処理されきれずに組織に沈着し、そこへ補体やマクロファージ、好中球などが集まり炎症を起こし組織障害が生じるものである。III型アレルギー反応によって、発症する疾患には、急性糸球体腎炎、関節リウマチ、ウイルス性肝炎、全身性エリテマトーデス、クリオグロブリン血症などがある。ＩＶ型アレルギー反応は、遅延型反応で抗原に感作されたＴ細胞がリホカイン等を放出し、リンパ球、マクロファージなどによる組織障害を起こすものである。IV型アレルギー反応によって、発症する疾患には、接触性皮膚炎、結核、悪性腫瘍、臓器移植後の拒絶反応などがある。これらのアレルギー反応のうち、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体が関与するＩ型アレルギーは、発生頻度が最も多いアレルギーである。
【０００５】
他方、植物及び／又はその抽出物には、様々な生理活性成分が含まれていることが知られており、生体に対する安全性が高いことから医薬品への応用がなされている。アレルギー反応による疾患の予防又は治療にも利用されており、具体的には、シソ種子のアルコール抽出物中のアピゲニン、クリソエリオール、ルテオリンおよびロスマリン酸から選ばれる１種または２種以上を有効成分とするヒスタミン遊離抑制剤（例えば、特許文献１参照）や、ツリフネソウ（Impatiens textori Miq.）の花弁の抽出エキスを含有することを特徴とする抗アレルギー組成物（例えば、特許文献２参照）や、カテキン類及び／又はその配糖体、フラボン類及び／又はその配糖体、フラボノール類及び／又はその配糖体、フラバノン類及び／又はその配糖体、イソフラボン類及び／又はその配糖体、クマリン類及び／又はその配糖体、アガリクス属等に属するきのこ、ビチス属、プランタゴ属、リナム属、シナピス属、カーサマス属、ペリラ属、ゴシピウム属、リシナス属、オエノセラ属、ローズマリー属、カメリア属、バンザクロ属、ユーカリ属、ベリス属、グナファリウム属、アルクトスタフィロス属、セントーレ属、ユーフラシア属、リスラム属等に属する植物の抽出物、赤ワイン乾燥粉末の群より１種又は２種以上からなるＩｇＥ産生抑制剤を配合することを特徴とする化粧料（例えば、特許文献３参照）等を挙げることができる。
【０００６】
ところで、ニガナはキク科ニガナ属に属する多年草で、葉や茎に苦味のある白い乳液を含み、山地や野原にごく普通に植生し、沖縄でもよく見られる。ニガナは血液中に存在するペプチドのアンジオテイシンＩが酵素の作用によりアンジオテイシンIIへ変換されるのを抑制する機能（ＡＣＥ活性阻害機能）を有する成分を含有し、これにより血圧上昇抑制効果を奏することが知られている。このようなニガナが有する機能を利用したものとして、例えば、アブラナ花、イタリアンパスレー葉、ウド葉、カキドウシ葉、カラハナソウ葉、クサボケ花、クズ葉花、シシウド花実、シュプレット葉、スイバ葉、デイル葉、ニガナ全草、ニリン草全草、ヒメジオン花、ペパーミント葉、マスタード葉、ワレモコウ葉、矢車草花葉、ヤマフジ花から成る群より選択した少なくとも１種を凍結乾燥後粉砕し、その粉砕物を水抽出して得られた抽出物を含み、且つアンジオテイシン変換酵素の存在下において、アンジオテイシン１からアンジオテイシン２への変換抑制機能（ＡＣＥ活性阻害機能）を有する食品添加剤（例えば、特許文献４参照）等が知られている。
【０００７】
また、本発明者らは、以前にニガナを乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌を用いて発酵させることを特徴とする発酵処理物の製造方法（例えば、特許文献５参照）や、ニガナ（Crepidiastrum lanceolatum Nakai）及び／又は前記発酵方法を利用したニガナ発酵処理物を有効成分とすることを特徴とするリポキシゲナーゼ阻害剤（例えば、特許文献６参照）を提案している。
【０００８】
このリポキシゲナーゼ阻害剤は、５−ヒドロペルオキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸（５−ＨＰＥＴＥ）等のアラキドン酸代謝物の生成を抑えることで、アラキドン酸代謝物に起因する疾患、例えば、アレルギー性疾患、炎症、喘息等の予防・治療剤に利用することができるものである。
【０００９】
しかし、これまでニガナやニガナ発酵処理物にリポキシゲナーゼ阻害活性が有することは知られていたものの、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有することについては、全く知られていなかった。
【００１０】
【特許文献１】特開２０００−８６５１０号公報
【特許文献２】特開２００１−２７８７９６号公報
【特許文献３】特開２００３−２８１１号公報
【特許文献４】特開平０６−２２５７２３号公報
【特許文献５】特開２００４−７３０５０号公報
【特許文献６】特開２００５−０８９３８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、生理活性を有するニガナ及び／又はニガナの発酵処理物の有効利用を図り、生体に安全で副作用の少ない、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有する医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、沖縄に生育するニガナ植物の有効活用を目的とし、ニガナ植物の生理活性について鋭意研究した結果、ニガナの抽出物に活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有することを見い出し、さらに、ニガナの発酵処理物は、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性がニガナに比べ増加することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、（１）活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性のうち少なくともいずれか１種以上の活性を有する、ニガナ（Crepidiastrum lanceolatum Nakai）及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有する、活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤や、（２）ニガナの葉を粒径０．１〜３．０ｍｍまで粉砕処理後、粉砕処理物１重量部に対し、２〜１０重量部の水を添加し、さらに、微生物群を添加することにより発酵処理し、発酵処理物を溶媒で抽出した抽出物を含有することを特徴とする前記（１）記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤や、（３）ニガナの発酵処理物が、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌により発酵させて得られることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤や、（４）ニガナの重量に対し、１〜１０重量％の微生物群を添加することを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤や、（５）抽出溶媒として、メタノール、エタノール、酢酸エチル又はこれらの混合溶媒の少なくとも１種以上を用いて得られるニガナ及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤に関する。
【００１４】
また本発明は、（６）活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性のうち少なくともいずれか１種以上の活性を有する、ニガナ（Crepidiastrum lanceolatum Nakai）及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有することを特徴とし、これらの諸活性による炎症・アレルギー性疾患の改善のために用いられる旨の表示を付した機能性食品や、（７）ニガナの葉を粒径０．１〜３．０ｍｍまで粉砕処理後、粉砕処理物１重量部に対し、２〜１０重量部の水を添加し、さらに、微生物群を添加することにより発酵処理し、発酵処理物を溶媒で抽出した抽出物を含有することを特徴とする前記（６）記載の機能性食品や、（８）ニガナの発酵処理物が、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌により発酵させて得られることを特徴とする前記（６）又は（７）に記載の機能性食品や、（９）ニガナの重量に対し、１〜１０重量％の微生物群を添加することを特徴とする前記（６）〜（８）のいずれかに記載の機能性食品や、（１０）抽出溶媒として、メタノール、エタノール、酢酸エチル又はこれらの混合溶媒の少なくとも１種以上を用いて得られるニガナ及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有することを特徴とする前記（６）〜（９）のいずれかに記載の機能性食品に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、ニガナ及び／又はニガナの発酵処理物を含有することで、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有し、副作用が少なく安全なアレルギー性疾患、炎症性疾患等の予防・治療薬や、アレルギー性疾患、炎症性疾患等の予防・治療用の機能性食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性のうち少なくともいずれか１種以上の活性を有する、ニガナ及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有する、活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤であれば特に制限されるものではなく、具体的には、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有する活性酸素生成阻害剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有するロイコトリエン類生成阻害剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有するヒスタミン遊離抑制剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有するＩＬ−１β遊離阻害剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有するＩＬ−６遊離阻害剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有する活性酸素生成阻害・ロイコトリエン類生成阻害の複合活性剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有する活性酸素生成阻害・ロイコトリエン類生成阻害・ヒスタミン遊離抑制の複合活性剤、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有する活性酸素生成阻害・ロイコトリエン類生成阻害・ヒスタミン遊離抑制・ＩＬ−１β遊離阻害・ＩＬ−６遊離阻害の複合活性剤等の複合活性剤（これらを総称して「医薬組成物」ということがある。）を例示することができる。また、本発明の機能性食品としては、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性のうち少なくともいずれか１種以上の活性を有する、ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有することを特徴とし、これらの諸活性による炎症・アレルギー性疾患の改善のために用いられる旨の表示を付した食品であれば特に制限されるものではない。
【００１７】
本発明において用いられるニガナ植物は、キク科（Asteraceae）に属する植物であり、使用部位は、根等の地下部や、茎、葉、花等の地上部であってよく、また、これら２種以上の混合物や、全草であってもよい。これらのうちで、特に葉が好ましい。かかるニガナの発酵処理物の処理としては、発酵処理前に、ニガナを粉砕処理することが、発酵菌との接地面積を十分に確保でき、発酵を効果的に進行させることができることから、好ましい。具体的には、粒径３ｍｍ以下、好ましくは０．５ｍｍ〜１．０ｍｍの粒径まで粉砕する処理が好ましい。
【００１８】
さらに、上記発酵処理は、ニガナの粉砕処理物に、発酵の進行を促進するため、乾物１重量部に対し、２〜１０重量部、特に５重量部程度の水分を添加することが好ましい。かかる粉砕処理物に微生物を添加する。微生物は培養後、培地へ添加する前に予め混合し、乾燥体である場合の植物の重量に対して、１〜１０重量％添加することが好ましい。発酵は、温度２０〜５０℃、好ましくは４０℃であり、発酵時間はｐＨや、菌数等の条件による発酵の進行状況等により適宜選択することができ、例えば、ｐＨ４〜５、菌数１０６以上であれば、約７２時間とすることができる。発酵処理時、必要に応じてエアレーションや脱酸素処理を行うことができるが、脱酸素処理後に静置培養において発酵させることができる。発酵形式は、液体培養でなく固体培養が好ましい。
【００１９】
上記発酵処理に使用する微生物としては、乳酸菌、酵母、枯草菌を使用することができ、これらを単独又は２種以上を適宜組み合わせることもできるが、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌との組み合わせが特に好ましい。
【００２０】
上記発酵処理に使用される乳酸菌としては、ストレプトコッカス属（Storeptococcus）、ラクトバシルス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）又はテトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）のいずれかに属する菌が好ましく、特にラクトバシルス属が好ましい。上記ストレプトコッカス属に属する菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）であることが好ましく、ストレプトコッカス・サーモフィルスＩＦＯ１３９５７菌株を具体的に例示することができる。また、ラクトバシルス属に属する菌としては、ラクトバシルス・プランタリム（L. plantrum）、ラクトバシルス・デルブリッキ（L. delbruckii）、ラクトバシルス・ペントサス（L. pentosus）又はラクトバシルス・カセイ（L. casei）のいずれかに属する菌であることが好ましく、これらの菌のうち、特にラクトバシルス・プランタリムが好ましい。かかるラクトバシルス・プランタリムとしてＩＦＯ１４７１２菌株やＩＦＯ１４７１３菌株を、ラクトバシルス・デルブリッキとしてＩＦＯ１３９５３菌株を、ラクトバシルス・ペントサスとしてＩＦＯ１２０１１菌株を、ラクトバシルス・カセイとしてＩＦＯ１５８８３菌株を、それぞれ具体的に例示することができる。また、テトラジェノコッカス属に属する菌としては、テトラジェノ・ハロフィルス（T. halophilus）であることが好ましく、テトラジェノ・ハロフィルスＩＦＯ１２１７２菌株を具体的に例示することができる。これら乳酸菌は、ニガナ植物の乾物１ｇあたり、通常１０３〜１０７個、特に１０６〜１０７個用いることが好ましい。
【００２１】
上記発酵処理に用いられる酵母は、カンジダ属（Candida）又はサッカロマイセス属（Saccharomyces）に属する菌が好ましい。かかるカンジダ属に属する菌として、カンジダ・ビルサチルス（Candida versatilis）であることが好ましく、カンジダ・ビルサチルスとしてＩＦＯ１００３８菌株を具体的に例示することができる。サッカロマイセス属に属する菌として、サッカロマイセス・セレビシアエ（S. cerevisiae）であることが好ましく、サッカロマイセス・セレビシアエとしてＩＦＯ０５５５菌株を具体的に例示することができる。これら酵母菌は、ニガナ植物の乾物１ｇあたり、通常１０３〜１０７個、特に１０６〜１０７個用いることが好ましい。
【００２２】
さらに、上記発酵処理において用いられる枯草菌としては、バシルス・ズブチルス（B. subtilis）ＩＦＯ３０１３菌株を具体的に例示することができる。これら枯草菌は、ニガナ植物の乾物１ｇあたり、通常１０３〜１０７個、特に１０６〜１０７個用いることが好ましい。
【００２３】
上記発酵処理において、好ましく用いられる微生物群としては、乳酸菌、酵母及び枯草菌を含む微生物群が好ましく、これら微生物群の中でも、ラクトバシルス・プランタリム、ストレプトコッカス・サーモフィルス、バシルス・ズブチルスの混合菌であることが好ましく、これらはニガナ植物の乾物に対し、菌数として同数を使用することが好ましい。このような菌数の組合せにおいて菌を使用することにより、発酵時間の短縮を図り、ひいては雑菌の繁殖を抑制することができる。
【００２４】
なお、発酵終了後、乾燥機により水分値が１０重量％以下となるように乾燥することが好ましく、乾燥方法としては、加熱乾燥や凍結乾燥によることができ、加熱乾燥の場合は、品温が１００℃以下で行われることが、生理活性成分の失活を防止することができるため好ましい。乾燥後、必要に応じて加熱等公知の方法により滅菌処理を行ない、本発明の医薬組成物（ニガナ及び／又はその発酵処理物を含有する活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、ＩＬ−６遊離阻害剤、活性酸素生成阻害・ロイコトリエン類生成阻害の複合活性剤、活性酸素生成阻害・ロイコトリエン類生成阻害・ヒスタミン遊離抑制の複合活性剤、活性酸素生成阻害・ロイコトリエン類生成阻害・ヒスタミン遊離抑制・ＩＬ−１β遊離阻害・ＩＬ−６遊離阻害の複合活性剤）に好適に使用することができるニガナの発酵処理物が得られる。
【００２５】
本発明のニガナ及び／又はその発酵処理物は、抽出溶媒を用いて得られるニガナ及び／又はその発酵処理物の抽出物とすることもでき、前記抽出溶媒としては、水、メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコールや、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコールや、ヘキサン等の非極性溶媒や、酢酸エチル等の極性溶媒の一種又は二種以上を用いることができる。この中でも、メタノール、エタノール、酢酸エチルが好ましい。
【００２６】
本発明の医薬組成物には必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤の製剤とすることができる。またこれら製剤は、経口又は非経口に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができるほか、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。また、投与量は、疾病の種類、患者の体重、投与形態等により適宜選定することができる。かかる製剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが、一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。尚、投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有することから、これらが関与する疾病の予防及び治療剤として利用することができる。具体的には、活性酸素生成阻害活性を有することから、活性酸素が関与する種々の病態や疾患、例えば動脈硬化、脳梗塞、脳虚血−再潅流障害、潰瘍、悪性腫瘍、糖尿病、てんかん、老化、炎症等の予防及び治療剤として利用することができ、ロイコトリエン類生成阻害活性を有することから、ロイコトリエン類の増加に起因する炎症およびその他の疾病に対する治療効果を発揮し、ヒスタミン遊離抑制活性を有することから、ヒスタミン遊離が関与する疾患、例えば花粉症、喘息、枯れ草熱、鼻炎、蕁麻疹、薬物アレルギー等の予防及び治療剤として利用することができる。さらに、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性を有することから、癌、動脈硬化、慢性リンパ節炎、慢性関節リウマチ、大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患等の予防及び治療剤として利用することができる。
【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
[発酵ニガナの調整]
乾燥したニガナの葉３０ｇを０．１〜３ｍｍの粒径に粉砕し容器に入れた。ニガナを入れた容器に水１５０ｇ、糖蜜０．９ｇ、米ぬか０．９ｇを添加した。かかる粉砕ニガナを収納した容器に、ラクトバシルス・プランタリム（ＩＦＯ１４７１２菌株、ＩＦＯ１４７１３菌株）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＩＦＯ１３９５７菌株）、バシルス・ズブチルス（ＩＦＯ３０１３菌株）の各々の菌を培養後、菌数１：１：１の割合で混合し、ニガナの重量に対し、１０重量％を添加し、容器を密閉し、静置培養により発酵を行った。発酵温度は４０℃、発酵時間は７２時間とした。その後、乾燥機により水分値が１０重量％以下になるまで、６０℃で乾燥した後、滅菌処理（１３０℃蒸気、５〜１５秒）を行い、発酵ニガナ３１ｇを得た。
【実施例２】
【００３０】
［サンプルの調製］
(ｉ)ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉、及び実施例１で得られた発酵ニガナ、各１ｇあたりメタノール１０ｍｌを添加し、静置で１２時間抽出し、ろ過後残渣にメタノールを１０ｍｌ添加して同様に抽出し、メタノール抽出物を得た。このメタノール抽出物をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）で希釈することにより最終濃度２５μｇ／ｍＬのサンプルを調製した。
(ii)ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉、及び実施例１で得られた発酵ニガナ、各１ｇあたり酢酸エチル１０ｍｌを添加し、静置で１２時間抽出し、ろ過後残渣に酢酸エチルを１０ｍｌ添加して同様に抽出し、酢酸エチル抽出物を得た。この酢酸エチル抽出物をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）で希釈することにより最終濃度２５μｇ／ｍＬのサンプルを調製した。
【実施例３】
【００３１】
[ニガナ及び発酵ニガナの活性酸素生成阻害活性の評価]
ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉及び実施例２で得られた発酵ニガナの抽出物について、それぞれ活性酸素生成量を測定し、活性酸素生成阻害活性を評価した。ＨＬ−６０細胞の濃度を４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、ジメチルスルフォキシドを終濃度（final conc.）が１．２５％になるように加え、４日間３７℃のＣＯ２インキュベーターで前記細胞を培養した。好中性顆粒球に分化した細胞を回収し、ＨＢＳＳ（Hanks’ Balanced Salt Solution）で洗浄後、再懸濁して１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。実施例２で調製したサンプル（終濃度；２５μｇ／ｍｌ）あるいは１μｌのジメチルスルフォキシド（コントロール）と細胞懸濁液１ｍｌを混合し、３７℃の水浴で１５分インキュベートした。ＨＢＳＳで洗浄後１ｍｌに再懸濁して３７℃の水浴で５分インキュベートした。終濃度が２μＭ（ＥｔＯＨ希釈）になるようにＴＰＡ（Phorbol 12-Myristate 13-Acetate）を添加し、９０秒後にシトクロムＣ(Cytochrome C)（２０ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌ添加（終濃度；７６μＭ）した。３７℃の水浴で１５分インキュベートした後、氷中に５分間静置させ、遠心分離（６６００ｒｐｍ，５分）して、５５０ｎｍにおける上澄みの吸光度を分光光度計（ＵＶ−２２００ＡＩ：島津社製）で測定した。各々のサンプルにおいてＴＰＡ有無による吸光度の差をＡ５５０とし、下記の式により（Meth.Enzymol:, 105,358-365,1984）、スーパーオキサイドアニオンラジカル（・Ｏ２−）の量を算出した。メタノール抽出物及び酢酸エチル抽出物における・Ｏ２−の産生量の結果をそれぞれ図１及び図２に示した。
【００３２】
・Ｏ２−（ｎｍｏｌ／ｍｌ）＝４７．７×Ａ５５０
メタノール抽出物及び酢酸エチルのいずれにおいても、活性酸素生成阻害活性を示した。また、いずれについても発酵後に活性酸素生成阻害活性が増強した。このことから、ニガナ及び／又はその発酵処理物は、活性酸素生成阻害活性を有することが明らかとなった。
【実施例４】
【００３３】
[ニガナ及び発酵ニガナのロイコトリエン類生成阻害活性の測定]
ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉及び実施例２の(ii)で得られた発酵ニガナの抽出物について、それぞれロイコトリエン（ＬＴ）類生成阻害活性を測定した。
【００３４】
[試薬]
（１）１０×ＰＢＳの調整
０．２ＭのＮａＨ２ＰＯ４および０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４を混合しｐＨ７．０に調整後、３．０ＭのＮａＣｌを溶解させ、２倍量にメスアップし、１２０℃で２０分間オートクレーブさせ、０．１ＭのＰＢＳ（phosphate buffer containing ０．１５Ｍ NaCl）を調整した（１０×ＰＢＳ）。
（２）１×ＰＢＳの調整
１０×ＰＢＳ溶液を１０倍に希釈し、１２０℃で２０分間オートクレーブさせ、０．０１ＭのＰＢＳを調整した（１×ＰＢＳ）。
（３）ＣａＣｌ２溶液の調整
終濃度１ｍＭになるように、１．４７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを１００ｍｌの１×ＰＢＳに溶解し、１２０℃で２０分間オートクレーブさせ、ＣａＣｌ２溶液を調整した。このＣａＣｌ２溶液を４℃で保存した。
（４）カルシウムイオノファＡ２３１８７の調整
１ｍｇのＡ２３１８７（Ｓｉｇｍａ社製）に３８２μｌのメタノールを加え、５ｍＭのストックソルーション（Stock Solution）とし、−２０℃で保存した。このストックソルーションを１×ＰＢＳで１０倍希釈し、最終濃度５μＭとなるよう使用時に調製した。
（５）０．４％ジキトニン（digitonin）溶液の調整
４００ｍｇのジキトニン、４００ｍｇのトリトロンＸ−１００、１００ｍｌのMillQ水を混合し、０．４％のジキトニン溶液を調整した。
【００３５】
ＲＢＬ２Ｈ３細胞（北里大学薬学部衛生化学研究室より入手）を６穴プレート（培地３ｍｌ／穴）に１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播き、２日間培養した。培地を除去し、新しい培地１ｍｌに対し、実施例２（ii）で調整したサンプルを終濃度２５μｇ／ｍｌになるように添加した。その後３７℃で１時間インキュベーションさせ、培地を除去し、１ｍｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した。新たに１×ＰＢＳを１ｍｌ加え、ＣａＣｌ２溶液を１０μｌ添加後（最終濃度１ｍＭ）、３７℃で５分間インキュベーションした。続いてＡ２３１８７を１０μｌ添加（最終濃度５μＭ）し、３７℃で５分間インキュベーションして刺激した。反応後、直ちに培養上澄みをエッペンに回収し、浮いた細胞を除去するために遠心分離（４℃、２０００ｒｐｍ、３分間）し、上澄みをＬＴＣ４ ＥＩＡキット（Cayman社製）、及びＣｙｓｔｅｉｎｙｌ−ＬＴ ＥＩＡキット（Cayman社製）に供した。また、上清回収後の細胞について、０．４％のジキトニン溶液を加え、３７℃で１０分間振とうしてエッペンに回収し、遠心分離した（４℃、５０００ｒｐｍ、５分間）。その上澄みを用い、以下に示したＢＣＡ法によりタンパク質を定量した。ＥＩＡキットにより得られた結果をタンパク質量当たりの値として補正し、ＬＴＣ４及びCysteinyl−ＬＴｓ量を算出した。
【００３６】
[ＢＣＡ法によるタンパク質の定量]
回収した細胞サンプルを９６穴マイクロプレートに１０μｌずつ３連で分注した。検量線として０．２ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを同様に添加した。ＢＣＡ Protein Assay Reagent Ａ（Pierce社製）、及びＢＣＡProtein Assay ReagentＢ（Pierce社製）を５０：１の割合で混合後、１９５μｌずつマイクロプレートにすばやく添加した。３７℃で３０分間インキュベートし、５６２ｎｍの吸光度を測定した。検量線を作成し、サンプルのタンパク質濃度を算出した。
【００３７】
ニガナ及びその発酵処理物の酢酸エチル抽出物（ＤＭＳＯで希釈）におけるＬＴＣ４及びCysteinyl−ＬＴｓ量を図３及び４に示す。ニガナ及びその発酵処理物の酢酸エチル抽出物に代えて１μｌのＤＭＳＯを用いた場合をコントロールとした。ニガナ及びその発酵処理物の抽出物のいずれについても、ＬＴＣ４及びCysteinyl−ＬＴｓ量が抑制された。特に、発酵処理物の阻害活性が顕著であった。このことから、ニガナ及び／又はその発酵処理物は、ロイコトリエン類生成阻害活性を有することが明らかとなった。
【実施例５】
【００３８】
[ニガナ及び発酵ニガナのヒスタミン遊離抑制の評価]
実施例２の(ｉ)で得られたニガナ及び発酵ニガナの抽出物について、それぞれヒスタミン遊離抑制活性を測定した。
【００３９】
[タイロードバッファー（Tyrode buffer；ｐＨ７．２)の調整]
１３７ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）１．６ｇと、２．７ｍＭの塩化カリウム４０．３ｍｇと、１．８ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）４０．７ｍｇと、５．６ｍＭのグルコース２０１．８ｍｇとを超純粋水に溶解した。溶解液を１２ｍＭの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）２０１．６ｍｇ又は０．４ｍＭのリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）２８．７ｍｇでｐＨを７．２とし、タイロードバッファー（Tyrode buffer；ｐＨ７．２)を調整した。このバッファーは常温で保存した。
【００４０】
ＫＵ８１２細胞（ヒト好塩基球由来培養細胞）は、（財）ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクより入手した。ＫＵ８１２細胞は１０％のＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ＫＵ８１２細胞（５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌ）を３５ｍｍのｄｉｓｈに播種し、実施例２（ｉ）で調整したサンプルを被験物質として３０分間処理した。細胞をエッペンドルフチューブに回収後、ＰＢＳで２回洗浄した。上清を除き、２００μｌのタイロードバッファーで細胞を懸濁後、ＣＲＡ−１（１ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。冷却により反応を停止させ、遠心分離（４℃、３００ｇ、５分）し、上清１００μｌ中のヒスタミン遊離量を蛍光測定（Ｅｍ；３５５ｎｍ、Ｅｘ；４６０ｎｍ）により定量した。ヒスタミン遊離量の測定スキーム及びヒスタミン遊離量の結果を図５に示した。
【００４１】
図５に示すように、ニガナ及び／又はその発酵処理物は、いずれについても濃度依存的にヒスタミン遊離抑制を示すことが明らかとなった。
【実施例６】
【００４２】
[デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）で刺激したマウス腹腔マクロファージにおけるニガナ及び発酵ニガナの炎症性サイトカインＩＬ−１ｂ生成抑制の評価]
ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉、実施例１で得られたニガナ及び発酵ニガナについて、それぞれデキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）で刺激したマウスの単球由来腹腔マクロファージにおけるＩＬ−１ｂ産生を測定した。
【００４３】
単球由来の腹腔マクロファージは論文に記載（Kwon 2002）の通りに準備した。腹腔滲出細胞を９６穴プレートに１×１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；Gibco BRL社製）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Gibco BRL社製）中に蒔き、３７℃、５％ＣＯ２下で前記細胞をインキュベートした。２４時間インキュベートした後、腹腔マクロファージを、１０ mｇ／ｍｌのＤＳＳで刺激させ、種々濃度のニガナ及び発酵ニガナのＤＭＳＯ溶液（４mｇ／ｍｌ〜１００mｇ／ｍｌ）を被験物質として２４時間処理した。その後、遠心分離（１９００ｇ，４℃，１５分間）し、上澄中（希釈係数＝２０）のＩＬ−１βとＩＬ−６の濃度を、製造者の指示に従い、エライザキットを用いて測定した。
【００４４】
図６に示されるように、実施例１で得られたニガナ及び発酵ニガナが、マウス腹腔マクロファージにおけるＩＬ−１ｂ産生に対して抑制効果を示した。
【実施例７】
【００４５】
[デキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）投与によるマウス大腸粘膜におけるニガナ、発酵ニガナ及びルテオリンの炎症性サイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−６生成抑制の評価]
ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉、実施例１で得られた発酵ニガナ及びニガナ中に含まれるルテオリン（ＬＴ）、ルテオリン−６−グルコシド（ＬＴ−Ｇ）について、それぞれデキストラン硫酸塩（ＤＳＳ）を投与したマウスの大腸粘膜におけるＩＬ−１ｂ及びＩＬ−６産生量を測定した。
【００４６】
マウスの大腸炎発生の誘導は、図７に示すように行った。すなわち、飲料水及び餌（ＭＦペレット；オリエンタル酵母社製）を自由に与えられるマウス（Ｇｒｏｕｐ１）をコントロールマウスとした。最初の７日間は通常の飲料水を与え、後の７日間は３％（w/v）のＤＳＳを添加した飲料水を与え、餌は自由に与えられるマウス（Ｇｒｏｕｐ２）をＤＳＳ投与における大腸炎モデルマウスとした。最初の７日間は通常の飲料水を与え、後の７日間は３％（w/v）のＤＳＳを添加した飲料水を与え、餌には被験物質として、ニガナ又は発酵ニガナを添加したものを最初から試験終了（１４日間）まで与えられたマウス（Ｇｒｏｕｐ３又は４）を治験マウスとした。
【００４７】
上記大腸炎発生プロトコール後のグループ１〜４のマウス（各グループｎ＝３）から、それぞれ虫垂のない大腸を取り除いた。氷冷したＰＢＳで洗浄後、標本をフィルターペーパー上に置き、大腸の長さを測定した（図８参照）。外科用はさみで大腸を開き、内容物を取り出した。大腸粘膜剥離は標本が液体窒素で凍結状態の間にかみそりを使用し擦り取った。大腸粘膜剥離標本を外科用はさみで細かく刻み、さらにホモジナイザーを使用し、氷冷ＰＢＳ中で検体破砕した。上澄みを入手するために、ホモジェネートした組織を遠心分離（１９００ｇ，４℃，１５分間）した。大腸剥離粘膜から遠心分離で得た上澄み中（希釈係数＝２０）のＩＬ−１βとＩＬ−６の濃度を、製造者の指示に従い、エライザキットを用いて測定した。結果をタンパク質量当たりの値として補正した。なお、組織の上澄み液中の総タンパク質濃度は、製造者の指示に従い、γ−グロブリンを内部標準として用い、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Bio-Rad Laboratories社製）を使用することで決定した。結果を図９及び１０に示す。
【００４８】
これらの結果から、グループ３のマウス（ニガナ）やグループ４のマウス（醗酵ニガナ）における大腸の長さは、グループ２のマウス（大腸炎モデルマウス；ＤＳＳ）に比べて変化が少なく、グループ１のマウス（コントロール；ＣＴ）に近かった。また、グループ３のマウス（ニガナ）や、グループ４のマウス（醗酵ニガナ）におけるＩＬ−１β及びＩＬ−６の産生量は、グループ２のマウス（大腸炎モデルマウス；ＤＳＳ）におけるＩＬ−１β及びＩＬ−６の産生量よりも少なく、ニガナや醗酵ニガナがインビボでも、ＩＬ−１βやＩＬ−６等の大腸膜粘膜における炎症性サイトカイン産生抑制効果を示すことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明のニガナ及び発酵ニガナのメタノール抽出物における活性酸素生成量を測定した結果を示す図である。
【図２】本発明のニガナ及び発酵ニガナの酢酸エチル抽出物における活性酸素生成量を測定した結果を示す図である。
【図３】本発明のニガナ及び発酵ニガナの酢酸エチル抽出物におけるＬＴＣ４量を測定した結果を示す図である。
【図４】本発明のニガナ及び発酵ニガナの酢酸エチル抽出物におけるCysteinyl−ＬＴｓ量を測定した結果を示す図である。
【図５】本発明のニガナ及び発酵ニガナにおけるヒスタミン遊離量を測定した結果及びヒスタミン遊離量の測定スキームを示す図である。
【図６】本発明のニガナ及び発酵ニガナにおけるＤＳＳ刺激したマウス腹腔マクロファージにおけるＩＬ−１β産生量を測定した結果を示す図である。
【図７】本発明のニガナ及び発酵ニガナにおけるＤＳＳ投与マウスの大腸炎症発生プロトコールを示す図である。
【図８】本発明のニガナ及び発酵ニガナにおけるＤＳＳ投与マウスの大腸長変化の結果を示す図である。
【図９】本発明のニガナ及び発酵ニガナにおけるＤＳＳ投与マウスの大腸粘膜におけるＩＬ−β産生量の結果を示す図である。
【図１０】本発明のニガナ及び発酵ニガナにおけるＤＳＳ投与マウスの大腸粘膜におけるＩＬ−６産生量の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性のうち少なくともいずれか１種以上の活性を有する、ニガナ（Crepidiastrum lanceolatum Nakai）及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有する、活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤。
【請求項２】
ニガナの葉を粒径０．１〜３．０ｍｍまで粉砕処理後、粉砕処理物１重量部に対し、２〜１０重量部の水を添加し、さらに、微生物群を添加することにより発酵処理し、発酵処理物を溶媒で抽出した抽出物を含有することを特徴とする請求項１記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤。
【請求項３】
ニガナの発酵処理物が、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌により発酵させて得られることを特徴とする請求項１又は２に記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤。
【請求項４】
ニガナの重量に対し、１〜１０重量％の微生物群を添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤。
【請求項５】
抽出溶媒として、メタノール、エタノール、酢酸エチル又はこれらの混合溶媒の少なくとも１種以上を用いて得られるニガナ及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤。
【請求項６】
活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性のうち少なくともいずれか１種以上の活性を有する、ニガナ（Crepidiastrum lanceolatum Nakai）及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有することを特徴とし、これらの諸活性による炎症・アレルギー性疾患の改善のために用いられる旨の表示を付した機能性食品。
【請求項７】
ニガナの葉を粒径０．１〜３．０ｍｍまで粉砕処理後、粉砕処理物１重量部に対し、２〜１０重量部の水を添加し、さらに、微生物群を添加することにより発酵処理し、発酵処理物を溶媒で抽出した抽出物を含有することを特徴とする請求項６記載の機能性食品。
【請求項８】
ニガナの発酵処理物が、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌により発酵させて得られることを特徴とする請求項６又は７に記載の機能性食品。
【請求項９】
ニガナの重量に対し、１〜１０重量％の微生物群を添加することを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の機能性食品。
【請求項１０】
抽出溶媒として、メタノール、エタノール、酢酸エチル又はこれらの混合溶媒の少なくとも１種以上を用いて得られるニガナ及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有することを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載の機能性食品。
【請求項１】
活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性のうち少なくともいずれか１種以上の活性を有する、ニガナ（Crepidiastrum lanceolatum Nakai）及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有する、活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤。
【請求項２】
ニガナの葉を粒径０．１〜３．０ｍｍまで粉砕処理後、粉砕処理物１重量部に対し、２〜１０重量部の水を添加し、さらに、微生物群を添加することにより発酵処理し、発酵処理物を溶媒で抽出した抽出物を含有することを特徴とする請求項１記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤。
【請求項３】
ニガナの発酵処理物が、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌により発酵させて得られることを特徴とする請求項１又は２に記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤。
【請求項４】
ニガナの重量に対し、１〜１０重量％の微生物群を添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤。
【請求項５】
抽出溶媒として、メタノール、エタノール、酢酸エチル又はこれらの混合溶媒の少なくとも１種以上を用いて得られるニガナ及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の活性酸素生成阻害剤、ロイコトリエン類生成阻害剤、ヒスタミン遊離抑制剤、ＩＬ−１β遊離阻害剤、若しくはＩＬ−６遊離阻害剤、又は前記２以上の活性を備えた複合活性剤。
【請求項６】
活性酸素生成阻害活性、ロイコトリエン類生成阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、ＩＬ−１β遊離阻害活性、ＩＬ−６遊離阻害活性のうち少なくともいずれか１種以上の活性を有する、ニガナ（Crepidiastrum lanceolatum Nakai）及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有することを特徴とし、これらの諸活性による炎症・アレルギー性疾患の改善のために用いられる旨の表示を付した機能性食品。
【請求項７】
ニガナの葉を粒径０．１〜３．０ｍｍまで粉砕処理後、粉砕処理物１重量部に対し、２〜１０重量部の水を添加し、さらに、微生物群を添加することにより発酵処理し、発酵処理物を溶媒で抽出した抽出物を含有することを特徴とする請求項６記載の機能性食品。
【請求項８】
ニガナの発酵処理物が、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌により発酵させて得られることを特徴とする請求項６又は７に記載の機能性食品。
【請求項９】
ニガナの重量に対し、１〜１０重量％の微生物群を添加することを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の機能性食品。
【請求項１０】
抽出溶媒として、メタノール、エタノール、酢酸エチル又はこれらの混合溶媒の少なくとも１種以上を用いて得られるニガナ及び／又はその発酵処理物の抽出物を含有することを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載の機能性食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−３４７９８５（Ｐ２００６−３４７９８５Ａ）
【公開日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１７８３６６（Ｐ２００５−１７８３６６）
【出願日】平成１７年６月１７日（２００５．６．１７）
【出願人】（３９７０３１７８４）株式会社琉球バイオリソース開発 (21)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月２８日（２００６．１２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月１７日（２００５．６．１７）
【出願人】（３９７０３１７８４）株式会社琉球バイオリソース開発 (21)
【Ｆターム（参考）】
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