バイオリアクター用担体、バイオリアクター、及び分析方法
【課題】任意のパートナー（例えば、タンパク質又は核酸）に関して、分析に必要な量を高密度で内壁に固定化することが可能な、バイオリアクター用担体を提供する。
【解決手段】前記バイオリアクター用担体は、バイオリアクター用担体におけるプラスチック製内壁表面が、放射線照射処理されている。
【解決手段】前記バイオリアクター用担体は、バイオリアクター用担体におけるプラスチック製内壁表面が、放射線照射処理されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオリアクター用担体、及び前記担体にパートナー又は酵素を担持させたバイオリアクター、並びにこれらを用いる分析方法に関する。
本明細書における「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
動植物細胞・微生物などの生物の生体触媒（体内で様々な化学反応を担う酵素を含んだ細胞・組織・器官など）を利用して、物質の合成や分解を行う手段、あるいは、それを行う反応器として、バイオリアクターが知られている。例えば、下水処理場で、微生物が水中の有機物を食物として捕食し、汚泥に分解する働きを利用して排水中の有機物を浄化処理する方法もバイオリアクターの一つである。反応器は、微生物や細胞の培養により有用な物質を生産したり、生物が持つ酵素の特性を利用して物質の合成や分解を行う装置で、エネルギーの発生や、環境汚染物質の分解、特定の生体成分の微量定量による病気の診断など、様々な分野で応用されている。
【０００３】
酵素を固定化したバイオリアクターの具体例には、担子菌Coriolus versicolor及びPeurolus ostreatusの菌体外酵素とPycnoporus coccineus由来のラッカーゼを用いて内分泌撹乱化学物質（環境ホルモン）のうちノニルフェノール、オクチルフェノール、ビフェニールの酵素分解を行ったり、β−フルクトフラノシダーゼをグリシジルアクリレートを母体とする坦体に固定化し、基質に乳糖と蔗糖を通すことにより、乳化オリゴ糖（4-β-D-galactosylsucrose）の生産を行ったりするなど、物質の合成や分解を効率よく行う目的で応用されている。
【０００４】
イムノアッセイと称される測定法があり、その測定法では、測定対象物質に対して結合活性をもつ抗体などの物質を固相化した担体を用いる。担体の材料としては、シリカや炭素等の粉末、セファローズやセファデックス等の樹脂、あるいはガラス、プラスチック、又は金属等が用いられ、反応後に、担体を含む部分と担体を含まない部分とを分離し、担体に結合した標識物からの信号を測定する。ポリスチレン又はスチレン共重合体は、その成型のしやすさから、分析用基板として幅広く使用されている。
【０００５】
この担体表面に生理活性物質を固定化する方法には、物理吸着法、イオン結合法、及び化学結合法が知られている。イオン結合法は、結合させたい生理活性物質の荷電を利用する方法であり、担体表面へ生理活性物質と逆の荷電を持つ官能基を生じさせて固定化する。化学結合法は、結合活性をもつ官能基を担体の表面に生じさせて、生理活性物質のアミノ基などと共有結合させて固定化する。物理吸着法は、生理活性物質と担体とが相互に物理的に引きつけられる現象を利用するもので、それにはファンデルワールス力、疎水結合力、イオン結合力、又は水素結合力等が関与しているとされる。
【０００６】
化学結合法は、結合力が強固であり解離しにくい点や、結合部分を選択することができる点等にメリットを有するが、物理吸着に比べて絶対的結合量が少ない点、結合反応性官能基をもたない生理活性物質を結合することができない点、結合操作が複雑である点がデメリットである。イオン結合法は、環境のｐＨや塩濃度の変化によって、結合が解離することがある点がデメリットである。
一方、物理吸着法は、結合操作が簡単であるという大きなメリットがあるが、剥がれる可能性があることや、生理活性物質の種類によって吸着力が異なるために結合量の制御が困難であるなどのデメリットをもつ。
【０００７】
近年、μＴＡＳ（Micro Total Analytical System）という概念が構築され、分離・分析を小さな反応槽内で、分析対象物質を含む液体を送液することによって行うことが盛んに行われている（非特許文献１）。イムノアッセイにおいても、μＴＡＳの概念から、小さな基板上に１０〜１００μｍ程度の細い流路を作製し、その中で送液を行いながらイムノアッセイを行う、送液型生物学的分析方法が知られている。こうした基板は、送液用の注入／排出口を除いて、通常密閉型に設計されているため、流路内の表面改質処理は、改質剤を含む溶液の送液によるコーティング処理が一般的である（非特許文献１）。
【０００８】
一方、生理活性物質を分析するために用いられる担体として、アフィニティーカラムが挙げられる。アフィニティーカラムは、ガラス製、金属製、又はプラスチック製の管の中に、目的とする物質に対するリガンドを固定した担体を充填して使用することが多い。これとは別に、キャピラリーカラムのように、前記管の内壁へ直接リガンドを結合させる場合がある。この場合のカラム内壁への抗体のようなリガンドタンパク質の結合方法としても、物理吸着法、イオン結合法、又は化学結合法が用いられる。カラム内壁の改質法は、前述したように、改質剤を含む溶液の送液によるコーティング処理が一般的である。目的物質の分離・分析は、リガンドを固定したカラム内に目的物質を含む液体を送液することによって行われる。
【０００９】
近年、タンパク質の構造を認識して特異的に結合することのできるＤＮＡやＲＮＡが開発されており、これらはアプタマーと呼ばれている。イムノアッセイやアフィニティークロマトグラフィーによって特定のタンパク質を分析する場合においても、固相となる担体上へ分析対象物質となるタンパク質に特異的に結合することのできるアプタマーを結合させ、対象物質を分析する試みがなされている。固相となる担体表面上へのアプタマーの結合方法の一つとして、アビジン（又はストレプトアビジン）−ビオチンを用いて間接的に担体表面上に結合させる方法が挙げられる。これは、アプタマーをビオチン標識しておき、アビジン（又はストレプトアビジン）結合担体と反応させることにより、担体表面上へアプタマーを結合させる方法である。この場合には、担体表面上にアビジンを高密度に結合させることが望まれる。
【００１０】
【非特許文献１】多賀ら，「クロマトグラフィー（Chromatography）」，（日本），2001年，22巻，2号，69-83頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
密閉型容器や管の内壁を改質する目的で、改質剤を含む溶液の送液によるコーティング処理法は、様々な性質の改質法を選択することができるメリットを有するが、容器基板材質への改質剤の結合方法を綿密に検討する必要がある点、送液による改質操作が非常に煩雑である点など、デメリットも多い。
【００１２】
ポリスチレンは、タンパク質を物理吸着する性質も有しているため、従来から、固定化担体機能をもつ測定容器の材質として選択され、例えば、ＥＬＩＳＡプレートの素材などに広く用いられている。しかしながら、ポリスチレンは、異なる等電点や異なる疎水性をもつタンパク質の吸着力に差があるため、任意のタンパク質に関して、分析に必要な量を固定化することができるわけではなく、適用が制限されるという重大な欠点があった。
【００１３】
従って、本発明の課題は、任意の酵素又はパートナー（例えば、タンパク質又は核酸、特にはタンパク質）に関して、分析に必要な量を高密度で内壁に固定化することが可能な、バイオリアクター用担体（特には、独立した注入口及び排出口を有する容器又は管）を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記の課題は、本発明による、バイオリアクター用担体におけるプラスチック製内壁表面が、放射線照射処理又は放電処理されていることを特徴とする、バイオリアクター用担体によって解決することができる。
【００１５】
本発明によるバイオリアクター用担体の好ましい態様では、プラスチック製内壁表面がポリスチレン又はスチレン系共重合体である。
また、別の好ましい態様では、放射線がガンマ線である。
更に別の好ましい態様では、ガンマ線照射処理の線量が１〜１００ｋＧｙである。
更に別の好ましい態様では、ガンマ線がコバルト６０を線源とするガンマ線である。
更に別の好ましい態様では、バイオリアクター用担体が、独立した注入口及び排出口を有する容器又は管である。
【００１６】
また、本発明は、前記バイオリアクター用担体に、パートナーの一方又は酵素を接触させて固定化し、非固定化パートナー又は非固定化酵素を洗浄除去して得られることを特徴とする、バイオリアクターに関する。
【００１７】
また、本発明は、前記バイオリアクター用担体、あるいは、前記バイオリアクターを用いることを特徴とする、分析対象物質の分析方法に関する。
【００１８】
また、本発明は、バイオリアクター用担体のプラスチック製内壁表面を、放射線照射処理又は放電処理することを特徴とする、バイオリアクター用担体の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のバイオリアクター用担体においては、プラスチック製内壁表面を放射線照射処理又は放電処理によって表面改質を行っているので、種々の酵素やパートナー（例えば、等電点の異なる種々のタンパク質）を結合することができ、酵素やパートナーの性質の差に影響を受けにくい。
従って、本発明のバイオリアクター用担体によれば、改質剤を含む溶液の送液をする必要なしに、種々の酵素、パートナーに関して、充分な一定量を吸着して、固定化担体機能をもつバイオリアクターとすることができる。
【００２０】
このように、担体内側表面上へ酵素又はパートナーを効率的に固定化することができるので、生物学的分析方法などにおけるＢＦ分離操作を効率的に実施することができる。また、放射線照射処理又は放電処理は、安価に行うことができ、大量調製も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（１）バイオリアクター用担体及びパートナー担持バイオリアクター
本発明のバイオリアクター用担体は、その内部に、溶液を注入及び排出可能な反応室を有し、前記反応室の内壁表面がプラスチック製であるバイオリアクター用担体において、前記内壁表面（全面又はその一部）が放射線照射処理又は放電処理されている限り、特に限定されるものではなく、例えば、従来公知のプラスチック製担体（すなわち、放射線照射処理又は放電処理が行われていないプラスチック製担体）の表面に対して放射線照射処理又は放電処理を実施することによって製造することができる。
【００２２】
放射線照射処理又は放電処理の対象となる被処理出発担体としては、例えば、全体がプラスチックからなるプラスチック製担体、プラスチック又はそれ以外の材料（例えば、ガラス又は金属）からなる担体の内壁表面（全面又はその一部）をプラスチックでコートしたプラスチックコーティング担体などを挙げることができる。
担体材料として用いることのできる前記プラスチックとしては、バイオリアクター用担体の材料として一般的に使用されているプラスチック、例えば、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン）、ポリスチレン若しくはスチレン系共重合体［例えば、ポリ（α−メチルスチレン）］、ポリアセタール樹脂、又はフッ素系樹脂を挙げることができる。
【００２３】
前記担体材料の内、内壁表面の放射線照射処理又は放電処理を担体の外部から実施することができる点で、放射線（例えば、ガンマ線）や放電により産生される電子を透過させることができる材料、例えば、ポリスチレン又はスチレン系共重合体が好ましい。なお、放射線を透過しない材料であっても、例えば、注入口又は排出口から放射線照射装置を挿入し、担体内部から内壁表面の放射線照射を実施することができる。
【００２４】
放射線照射処理には、例えば、ガンマ線を用いることができる。ガンマ線照射線量は、好ましくは１〜１００ｋＧｙ、より好ましくは５〜５０ｋＧｙ、更に好ましくは１０〜３５ｋＧｙにわたって実施することができる。この放射線照射処理によって、プラスチック製担持表面の表面改質が行われるので、酵素やパートナー（例えば、タンパク質又は核酸）に対する吸着性が向上する。
【００２５】
放電処理には、例えば、プラズマ放電又はコロナ放電を用いることができる。
例えば、空気中でコロナ放電が起きると、発生した電子の衝突に加えて、二次的に発生するオゾンや紫外線による効果によって、樹脂などの表面に反応性や極性の高い官能基が発生し、表面の濡れ性や反応性を高めることができる。
また、プラズマ放電により産生される加速電子（中性粒子）の衝突に加えて、二次的に産生される酸素ラジカル、オゾン、ＯＨラジカル等が基板表面に衝突、反応し、表面上の炭素化合分子錯体切断を行い、それらをＣＯ２、Ｈ２として気化させることにより、表面処理が可能である。これらのエネルギーは、ＵＶ又はエキシマランプの分子錯体切断エネルギーよりも数倍高いことが知られている。
【００２６】
こうして放射線照射処理又は放電処理された本発明によるバイオリアクター用担体には、任意のパートナー（生物学的パートナー）の一方又は酵素を担持させることができる。本明細書において「パートナー」とは、相互に特異的に結合することのできる物質を意味し、例えば、抗原抗体反応によって相互に特異的に結合可能な抗原及び抗体、相補的結合により特異的にハイブリダイズ可能な核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、あるいは、相互に特異的に結合可能なアプタマー及びタンパク質を挙げることができ、好ましくはタンパク質である。なお、アプタマーとは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンから構成されるＤＮＡ（ＤＮＡアプタマー）、又はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルから構成されるＲＮＡ（ＲＮＡアプタマー）で、特定のタンパク質と特異的に結合することのできる核酸を意味する。
【００２７】
本発明においては、本発明のバイオリアクター用担体に、分析対象物質に応じて適宜選択した任意のパートナー又は酵素を担持させることにより作製した、本発明のバイオリアクターを用いて、分析対象物質の分析（生物学的分析）を実施することができる。本発明によるバイオリアクター用担体には、酵素や、分析対象物質に対して特異的に結合可能なパートナーを担持させるか、あるいは、分析対象物質それ自体をパートナーとして担持させることができる。
【００２８】
本発明のバイオリアクター用担体にパートナー又は酵素を担持させる方法は、予め放射線照射処理又は放電処理を実施しておくこと以外は、通常のバイオリアクターの作製方法（例えば、物理吸着法）をそのまま適用することができる。より具体的には、放射線照射処理又は放電処理したバイオリアクター用担体に、パートナーの一方又は酵素を含む水溶液を接触させて前記パートナー又は酵素を前記担体の内壁表面に固定化し、続いて、非固定化パートナー又は酵素を洗浄して除去し、必要があれば、更にブロッキング剤で処理することができる。
【００２９】
前記の洗浄液としては、例えば、緩衝液、蒸留水、若しくは生理食塩水、又は界面活性剤を含んだ緩衝液、蒸留水、若しくは生理食塩水を用いることができる。また、ブロッキング剤としては、例えば、牛血清アルブミン、スキムミルク、及び合成高分子などを用いることができる。パートナー又は酵素を担持したバイオリアクター用担体（すなわち、パートナー又は酵素担持バイオリアクター）の内壁表面をブロッキング剤で処理することにより、前記パートナー又は酵素以外のタンパク質の吸着を防止することができる。
【００３０】
本発明のバイオリアクター用担体の形状は、その内部に、溶液を自在に注入及び排出可能な反応室を有する限り、特に限定されるものではなく、例えば、独立した注入口及び排出口を有する容器又は管を挙げることができる。前記注入口及び排出口の数は、それぞれ、１又はそれ以上であることができる。また、反応室の数も、１又はそれ以上であることができる。反応室が複数の場合、隣接する反応室を結ぶ連絡路は、一方の反応室における排出口と、もう一方の反応室における注入口とを兼用する。
【００３１】
こうして得られたパートナー又は酵素担持バイオリアクターは、例えば、液体を送液しながら行う送液型生物学的分析法用基板又はアフィニティーカラムとして用いることができる。更に、アッセイ用基板として用いる際に、予め作製した複数の生物学的パートナー担持放射線照射処理又は放電処理担体を、生物学的パートナーを担持していない担体（ポリスチレン又はスチレン共重合体以外の材質のものでも構わない）を天板として貼り付けることにより、全体として１つの担体の異なった位置に複数の免疫学的パートナーを担持した、送液型生物学的分析法用タンパク質チップ（アレイ）として使用することもできる。
【００３２】
また、酵素を担持させたバイオリアクターは、生物が持つ酵素の特性を利用して物質の合成や分解を行う装置と利用することができ、例えば、エネルギーの発生や、環境汚染物質の分解、特定の生体成分の微量定量による病気の診断などに使用することができる。バイオリアクターに担持させることのできる酵素とその利用方法としては、例えば、担子菌Coriolus versicolor及びPeurolus ostreatusの菌体外酵素とPycnoporus coccineus由来のラッカーゼを用いて内分泌撹乱化学物質（環境ホルモン）のうちノニルフェノール、オクチルフェノール、又はビフェニールの酵素分解を行う利用方法、あるいは、β−フルクトフラノシダーゼをグリシジルアクリレートを母体とする坦体に固定化し、基質に乳糖と蔗糖を通すことにより、乳化オリゴ糖（4-β-D-galactosylsucrose）の生産を行う利用方法などを挙げることができる。
【００３３】
（２）分析方法
本発明のバイオリアクター用担体を用いて、各種分析を実施することもできる。例えば、本発明の分析方法の一態様として、分析対象物質が抗原であり、固定化用パートナー及び標識化パートナーとして、前記抗原に対する抗体を用いる態様（いわゆるサンドイッチ法）、すなわち、
（１）本発明のバイオリアクター用担体の内壁表面に、分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に対して特異的に結合可能な第１のパートナー（例えば、抗体Ｂ）を固定化する工程；
（２）前記第１パートナー（抗体Ｂ）を固定化して担持したバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記分析対象物質（抗原Ａ）を含む可能性のある被検試料とを接触させる工程；
（３）前記第１パートナー（抗体Ｂ）を固定化して担持し、更に前記被検試料に接触させたバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記分析対象物質（抗原Ａ）に対して特異的に結合可能で、標識化された第２のパートナー（例えば、抗体Ｃ）とを接触させる工程；
（４）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記第１パートナー（抗体Ｂ）に結合した前記分析対象物質（抗原Ａ）に対して未反応の標識化第２パートナー（抗体Ｃ）をバイオリアクター用担体の内壁表面から除去する工程；及び
（５）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記第１パートナー（抗体Ｂ）に結合した前記分析対象物質（抗原Ａ）に結合した標識化第２パートナー（抗体Ｃ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の免疫学的分析方法（以下、本発明の分析方法にける「第１態様」と称する）を挙げることができる。
【００３４】
前記第１態様におけるパートナーとして免疫学的パートナーを使用する場合には、第１免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）及び第２免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｃ）は、ポリクローナル抗体であるかあるいはモノクローナル抗体であることができる。両者がモノクローナル抗体である場合は、第１免疫学的パートナーと第２免疫学的パートナーとで異なるモノクローナル抗体を用いる。
【００３５】
前記第１態様における工程（１）において、第１パートナーを担体上に固定化する場合には、例えば、第１パートナーを担体上に直接、固定化することもできるし、あるいは、間接的に、例えば、適当な物質を介して固定化することもできる。例えば、第１パートナーがアプタマーである場合には、ビオチン−アビジン系を介して固定化することができる。より具体的には、例えば、アプタマーを予めビオチン化し、バイオリアクター用担体上にアビジン（又はストレプトアビジン）を固定化した後、ビオチン化アプタマーとアビジン固定化担体とを接触させることにより、前記担体上に、第１パートナーを間接的に固定化することができる。
【００３６】
本発明の分析方法の別の一態様として、分析対象物質が抗体（例えば、抗体Ｘ）であり、固定化用パートナーが前記抗体に対する抗原（例えば、抗原Ｙ）であり、標識化パートナーが前記抗原に対する抗体（例えば、抗体Ｚ）である態様（いわゆる２段階競合法）、すなわち、
（１）本発明のバイオリアクター用担体の内壁表面に、分析対象物質（例えば、抗体Ｘ）に対して特異的に結合可能な第１のパートナー（例えば、抗原Ｙ）を固定化する工程；
（２）前記第１パートナー（抗原Ｙ）を固定化して担持したバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記分析対象物質（抗体Ｘ）を含む可能性のある被検試料とを接触させる工程；
（３）前記第１パートナー（抗原Ｙ）を固定化して担持し、更に前記被検試料に接触させたバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記第１パートナー（抗原Ｙ）に対して特異的に結合可能で、標識化された第２のパートナー（例えば、抗体Ｚ）とを接触させる工程；
（４）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記第１パートナー（抗原Ｙ）に対して未反応の標識化第２パートナー（抗体Ｚ）をバイオリアクター用担体上から除去する工程；及び
（５）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記第１パートナー（抗原Ｙ）に結合した標識化第２パートナー（抗体Ｚ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の免疫学的分析方法（以下、本発明の分析方法にける「第２態様」と称する）を挙げることができる。
【００３７】
前記第２態様における工程（１）において、第１パートナーを担体上に固定化する場合には、例えば、第１パートナーを担体上に直接、固定化することもできるし、あるいは、間接的に、例えば、適当な物質を介して固定化することもできる。例えば、第１パートナーがアプタマーである場合には、ビオチン−アビジン系を介して固定化することができる。より具体的には、例えば、アプタマーを予めビオチン化し、バイオリアクター用担体上にアビジン（又はストレプトアビジン）を固定化した後、ビオチン化アプタマーとアビジン固定化担体とを接触させることにより、前記担体上に、第１パートナーを間接的に固定化することができる。
【００３８】
本発明の分析方法の更に別の一態様として、分析対象物質が抗原であり、１次抗体として前記抗原に対する抗体を、標識化２次抗体として前記１次抗体に対する抗体を用いる態様、すなわち、
（１）本発明のバイオリアクター用担体の内壁表面に、分析対象物質（抗原Ａ）を含む可能性のある被検試料を接触させる工程；
（２）前記被検試料を接触させたバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記分析対象物質（抗原Ａ）に対して結合可能な第１のパートナー（例えば、抗体Ｂ）とを接触させる工程；
（３）前記被検試料を接触させ、更に前記第１パートナー（抗体Ｂ）と接触させたバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記第１パートナー（抗体Ｂ）と特異的に結合可能で、標識化された第２のパートナー（例えば、抗体Ｃ）とを接触させる工程；
（４）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記分析対象物質（抗原Ａ）に結合した前記第１パートナー（抗体Ｂ）に対して未反応の標識化第２パートナー（抗体Ｃ）をバイオリアクター用担体の内壁表面から除去する工程；及び
（５）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記分析対象物質（抗原Ａ）に結合した前記第１パートナー（抗体Ｂ）に結合した標識化第２パートナー（抗体Ｃ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の免疫学的分析方法（以下、本発明の分析方法にける「第３態様」と称する）を挙げることができる。
【００３９】
本発明の分析方法の更に別の一態様として、分析対象物質を予め標識し、前記分析対象物質に対するパートナーを用いる態様、すなわち、
（１）本発明のバイオリアクター用担体の内壁表面に、分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に対して特異的に結合可能なパートナー（例えば、抗体Ｂ）を固定化する工程；
（２）前記パートナー（抗体Ｂ）を固定化して担持したバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記分析対象物質（抗原Ａ）を含む可能性のある被検試料とを接触させる工程；
（３）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記パートナー（抗体Ｂ）に対して未反応の被検試料をバイオリアクター用担体の内壁表面から除去する工程；及び
（４）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記パートナー（抗体Ｂ）に結合した前記分析対象物質（抗原Ａ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の免疫学的分析方法（以下、本発明の分析方法にける「第４態様」と称する）を挙げることができる。
【００４０】
本発明の分析方法の更に別の一態様として、分析対象物質を予め標識し、前記分析対象物質に対するパートナーと、解離剤とを使用する態様、すなわち、
（１）本発明のバイオリアクター用担体の内壁表面に、分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に対して特異的に結合可能なパートナー（例えば、抗体Ｂ）を固定化する工程；
（２）前記パートナー（抗体Ｂ）を固定化して担持したバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記分析対象物質（抗原Ａ）を含む可能性のある被検試料とを接触させる工程；
（３）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記パートナー（抗体Ｂ）に対して未反応の被検試料をバイオリアクター用担体の内壁表面から除去する工程；
（４）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記パートナー（抗体Ｂ）に結合した前記分析対象物質（抗原Ａ）を、解離剤により担体から溶出させる工程；
（５）溶出された分析対象物質（抗原Ａ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の免疫学的分析方法（以下、本発明の分析方法にける「第５態様」と称する）を挙げることができる。
【００４１】
前記第４態様又は第５態様において、分析対象物質が抗体である場合には、前記パートナーとして抗原を用いることができる。分析対象物質が核酸である場合には、前記パートナーとしてその相補的核酸を用いることができる。第４態様又は第５態様で用いる抗体は、ポリクローナル抗体であるかあるいはモノクローナル抗体であることができる。
【００４２】
第５態様で使用する解離剤としては、分析対象物質及びパートナーの組合せが抗原抗体の組合せである場合には、例えば、酸、アルカリ溶液、ドデシル硫酸Ｎａ（ＳＤＳ）、チオシサン酸塩、又はグアニジン塩酸を使用することができ、分析対象物質及びパートナーの組合せが核酸である場合には、例えば、アルカリ溶液を使用することができる。
【００４３】
前記第４態様又は第５態様における工程（１）において、パートナーを担体上に固定化する場合には、例えば、パートナーを担体上に直接、固定化することもできるし、あるいは、間接的に、例えば、適当な物質を介して固定化することもできる。例えば、パートナーがアプタマーである場合には、ビオチン−アビジン系を介して固定化することができる。より具体的には、例えば、アプタマーを予めビオチン化し、バイオリアクター用担体上にアビジン（又はストレプトアビジン）を固定化した後、ビオチン化アプタマーとアビジン固定化担体とを接触させることにより、前記担体上に、パートナーを間接的に固定化することができる。
【００４４】
本発明の分析方法で用いる標識物質としては、公知の標識物質、例えば、発色物質、発光物質、蛍光物質、又は酵素などを用いることができる。
【００４５】
本発明による分析方法で分析可能な対象物（すなわち、分析対象物質）は、それに特異的な結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質（例えば、抗原、抗体、又はレセプターなど）、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、又は生理活性を持つ化学物質などである。また、本発明による分析方法で分析可能な被検試料は、前記分析対象物質を含む可能性のある試料であれば、特に限定されず、特には生体試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、又は細胞若しくは組織破砕液などを挙げることができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例によってポリスチレン製担体表面の放射線照射処理による改質を行い、アレルゲン特異ＩｇＥ抗体測定系を用いる免疫学的分析方法において評価した。放射線照射処理されていないポリスチレン製担体に比べて、放射線照射処理された担体の方が、担体に結合した免疫学的に特異的結合可能な免疫学的パートナーの、その分析対象物質に対して免疫学的に結合活性の高い結果について具体的に説明する。
実施例においては、ポリスチレン製容器としての一例を示しているに過ぎず、ポリスチレン又はスチレン共重合体を原料とする容器又は管を使用することもできる。また、実施例では免疫学的測定法における標識体のシグナルを分析しているが、放射線照射ポリスチレン製容器内壁上に分析対象物質に対して特異的に結合することのできるパートナーを結合させ、分析対象物質を含む溶液を注入し、免疫学的結合を解離させることのできる条件にて分析対象物質を容器外へ溶出させ、分析対象物質を選択的に捕獲するアフィニティーカラムとしても使用することができる。また、容器内壁上へ酵素を結合させ、物質の合成や分解、特定の生体成分の微量定量なども行うことができる。
なお、実施例に示された内容および検出法は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
《実施例１：ポリスチレン製容器内でのアレルゲン特異ＩｇＥ抗体のイムノアッセイ》
（１）イムノアッセイ用ポリスチレン製容器の作製
図１及び図２に示すポリスチレン製容器を作製した。図１に示すように、ポリスチレン容器１（１ｃｍ×２ｃｍ×０．２ｃｍ）は、その内部に反応室１１が設けられている。反応室１１には、注入口１２から溶液を注入することができ、反応室１１内の溶液は、排出口１３から排液することができる。図２には、担体に結合させたいパートナーを含む溶液を容器内に送液した場合に、パートナーが容器内壁に結合する部分を着色して示している。
【００４８】
（２）ガンマ線照射
実施例１（１）で作製したポリスチレン製容器は、コバルト６０のガンマ線を用い、１５ｋＧｙの線量で放射線照射処理した。
【００４９】
（３）ガンマ線照射処理ポリスチレン製容器内壁へのアレルゲンの結合
実施例１（２）において調製したガンマ線照射処理ポリスチレン製容器内へ、免疫反応の固定化量には充分な量（１μｇ／ｍＬ）のアレルゲンを含むミルクアレルゲン水溶液２００μＬを注入し、恒湿槽内で、２５℃にて１時間静置し、アレルゲンを容器内壁上に結合させた。結合反応の終了後、０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０及び０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液を余剰のアレルゲン溶液を洗い流すのに充分な量を注入し、アレルゲン水溶液を除去した。次いで、０．２５％リピジュア（日本油脂社）を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２００μＬを注入し、３７℃で１時間静置し、ブロッキングを行った。容器はアッセイに用いるまで４℃で保存した。対照として、ガンマ線照射処理を行っていないポリスチレン製容器を用い、上記と同様に操作を行ってアレルゲン固定化容器を作製した。
【００５０】
（４）アレルゲン特異ＩｇＥ抗体の測定
（４−１）アレルゲン特異ＩｇＥ抗体のイムノアッセイ手順
前記実施例１（１）〜（３）で調製したアレルゲン結合ポリスチレン製容器へ、検体（アレルゲン特異ＩｇＥ抗体陰性ヒト血清及び陽性ヒト血清）２００μＬをそれぞれ別の容器へ注入して容器内に満たし、室温で１時間静置した。洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）を検体成分を洗い流すのに充分な量を容器内へ注入した後、抗ヒトＩｇＥ抗体標識ユーロピウム錯体封入ナノ粒子試薬２００μＬを注入して容器内に満たし、室温で１時間静置した。続いて、反応容器内へ上記洗浄液を標識ナノ粒子試薬を洗い流すのに充分な量を容器内へ注入した後、抗原抗体反応によって容器内壁上に結合したユーロピウム錯体の時間分解蛍光強度を測定し、アレルゲン特異ＩｇＥ抗体を分析した。
なお、前記の抗ヒトＩｇＥ抗体標識ユーロピウム錯体封入ナノ粒子試薬は、Matsuya et al., Anal. Chem., 2003, 75, 6124-6132に記載の抗体標識ユーロピウム錯体封入ナノ粒子の調製法に準じて調製した。
【００５１】
（４−２）時間分解蛍光測定条件
アレルゲン特異ＩｇＥ抗体のイムノアッセイにおける時間分解蛍光測定は、ＤＥＬＦＩＡ蛍光光度計（Ｗａｌｌａｃ製）を使用し、以下の条件で実施した。
待機時間：０．２０ｍｓ
測光時間：０．４０ｍｓ
測定波長：６１５ｎｍ
ＤＥＬＦＩＡ蛍光光度計は、９６穴マイクロプレート測定用の検出器であるが、上記ポリスチレン製容器の測定は、９６穴マイクロプレート大の枠を用いてポリスチレン製容器を固定して行われた。
【００５２】
（４−３）測定結果
１５ｋＧｙの線量でガンマ線照射処理を行ったポリスチレン製容器と、ガンマ線照射処理を行っていない対照用ポリスチレン製容器とに関して、ミルク特異ＩｇＥ抗体を測定した結果を図３に示す。
【００５３】
図３から明らかなように、ガンマ線照射処理されたポリスチレン製容器を用いた場合のミルク特異ＩｇＥ抗体陰性ヒト血清の測定値は、ガンマ線照射処理ポリスチレン製容器の方がガンマ線照射処理を行っていないポリスチレン製容器に比べて低かった。これは、ポリスチレン製容器をガンマ線照射処理することによって、標識ナノ粒子試薬が容器内壁表面上へ非特異的に吸着する量を減少させることができることを示している。一方、ミルク特異ＩｇＥ抗体陽性ヒト血清の測定値は、ポリスチレン製容器をガンマ線照射処理することにより、ガンマ線照射を行っていないポリスチレン製容器を用いた場合の測定値に比べて、有意に高値であった。これは、ポリスチレン製容器をガンマ線照射処理することによって、容器内壁表面の改質が起こり、免疫学的反応において好ましい状態でミルクアレルゲンが容器内壁表面上に固定化されたことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のバイオリアクター用担体は、生物学的分析、例えば、免疫学的分析の用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】実施例１で用いたポリスチレン製容器の構造を模式的に示す説明図である。
【図２】図１に示すポリスチレン製容器内に、分析対象物質に対して特異的に結合することのできるパートナーを含む溶液を送液した際に、容器内壁上に前記パートナーが結合される部分を示す説明図である。
【図３】ガンマ線照射処理又は未処理ポリスチレン製容器を用いたミルク特異ＩｇＥ抗体イムノアッセイの測定結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオリアクター用担体、及び前記担体にパートナー又は酵素を担持させたバイオリアクター、並びにこれらを用いる分析方法に関する。
本明細書における「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
動植物細胞・微生物などの生物の生体触媒（体内で様々な化学反応を担う酵素を含んだ細胞・組織・器官など）を利用して、物質の合成や分解を行う手段、あるいは、それを行う反応器として、バイオリアクターが知られている。例えば、下水処理場で、微生物が水中の有機物を食物として捕食し、汚泥に分解する働きを利用して排水中の有機物を浄化処理する方法もバイオリアクターの一つである。反応器は、微生物や細胞の培養により有用な物質を生産したり、生物が持つ酵素の特性を利用して物質の合成や分解を行う装置で、エネルギーの発生や、環境汚染物質の分解、特定の生体成分の微量定量による病気の診断など、様々な分野で応用されている。
【０００３】
酵素を固定化したバイオリアクターの具体例には、担子菌Coriolus versicolor及びPeurolus ostreatusの菌体外酵素とPycnoporus coccineus由来のラッカーゼを用いて内分泌撹乱化学物質（環境ホルモン）のうちノニルフェノール、オクチルフェノール、ビフェニールの酵素分解を行ったり、β−フルクトフラノシダーゼをグリシジルアクリレートを母体とする坦体に固定化し、基質に乳糖と蔗糖を通すことにより、乳化オリゴ糖（4-β-D-galactosylsucrose）の生産を行ったりするなど、物質の合成や分解を効率よく行う目的で応用されている。
【０００４】
イムノアッセイと称される測定法があり、その測定法では、測定対象物質に対して結合活性をもつ抗体などの物質を固相化した担体を用いる。担体の材料としては、シリカや炭素等の粉末、セファローズやセファデックス等の樹脂、あるいはガラス、プラスチック、又は金属等が用いられ、反応後に、担体を含む部分と担体を含まない部分とを分離し、担体に結合した標識物からの信号を測定する。ポリスチレン又はスチレン共重合体は、その成型のしやすさから、分析用基板として幅広く使用されている。
【０００５】
この担体表面に生理活性物質を固定化する方法には、物理吸着法、イオン結合法、及び化学結合法が知られている。イオン結合法は、結合させたい生理活性物質の荷電を利用する方法であり、担体表面へ生理活性物質と逆の荷電を持つ官能基を生じさせて固定化する。化学結合法は、結合活性をもつ官能基を担体の表面に生じさせて、生理活性物質のアミノ基などと共有結合させて固定化する。物理吸着法は、生理活性物質と担体とが相互に物理的に引きつけられる現象を利用するもので、それにはファンデルワールス力、疎水結合力、イオン結合力、又は水素結合力等が関与しているとされる。
【０００６】
化学結合法は、結合力が強固であり解離しにくい点や、結合部分を選択することができる点等にメリットを有するが、物理吸着に比べて絶対的結合量が少ない点、結合反応性官能基をもたない生理活性物質を結合することができない点、結合操作が複雑である点がデメリットである。イオン結合法は、環境のｐＨや塩濃度の変化によって、結合が解離することがある点がデメリットである。
一方、物理吸着法は、結合操作が簡単であるという大きなメリットがあるが、剥がれる可能性があることや、生理活性物質の種類によって吸着力が異なるために結合量の制御が困難であるなどのデメリットをもつ。
【０００７】
近年、μＴＡＳ（Micro Total Analytical System）という概念が構築され、分離・分析を小さな反応槽内で、分析対象物質を含む液体を送液することによって行うことが盛んに行われている（非特許文献１）。イムノアッセイにおいても、μＴＡＳの概念から、小さな基板上に１０〜１００μｍ程度の細い流路を作製し、その中で送液を行いながらイムノアッセイを行う、送液型生物学的分析方法が知られている。こうした基板は、送液用の注入／排出口を除いて、通常密閉型に設計されているため、流路内の表面改質処理は、改質剤を含む溶液の送液によるコーティング処理が一般的である（非特許文献１）。
【０００８】
一方、生理活性物質を分析するために用いられる担体として、アフィニティーカラムが挙げられる。アフィニティーカラムは、ガラス製、金属製、又はプラスチック製の管の中に、目的とする物質に対するリガンドを固定した担体を充填して使用することが多い。これとは別に、キャピラリーカラムのように、前記管の内壁へ直接リガンドを結合させる場合がある。この場合のカラム内壁への抗体のようなリガンドタンパク質の結合方法としても、物理吸着法、イオン結合法、又は化学結合法が用いられる。カラム内壁の改質法は、前述したように、改質剤を含む溶液の送液によるコーティング処理が一般的である。目的物質の分離・分析は、リガンドを固定したカラム内に目的物質を含む液体を送液することによって行われる。
【０００９】
近年、タンパク質の構造を認識して特異的に結合することのできるＤＮＡやＲＮＡが開発されており、これらはアプタマーと呼ばれている。イムノアッセイやアフィニティークロマトグラフィーによって特定のタンパク質を分析する場合においても、固相となる担体上へ分析対象物質となるタンパク質に特異的に結合することのできるアプタマーを結合させ、対象物質を分析する試みがなされている。固相となる担体表面上へのアプタマーの結合方法の一つとして、アビジン（又はストレプトアビジン）−ビオチンを用いて間接的に担体表面上に結合させる方法が挙げられる。これは、アプタマーをビオチン標識しておき、アビジン（又はストレプトアビジン）結合担体と反応させることにより、担体表面上へアプタマーを結合させる方法である。この場合には、担体表面上にアビジンを高密度に結合させることが望まれる。
【００１０】
【非特許文献１】多賀ら，「クロマトグラフィー（Chromatography）」，（日本），2001年，22巻，2号，69-83頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
密閉型容器や管の内壁を改質する目的で、改質剤を含む溶液の送液によるコーティング処理法は、様々な性質の改質法を選択することができるメリットを有するが、容器基板材質への改質剤の結合方法を綿密に検討する必要がある点、送液による改質操作が非常に煩雑である点など、デメリットも多い。
【００１２】
ポリスチレンは、タンパク質を物理吸着する性質も有しているため、従来から、固定化担体機能をもつ測定容器の材質として選択され、例えば、ＥＬＩＳＡプレートの素材などに広く用いられている。しかしながら、ポリスチレンは、異なる等電点や異なる疎水性をもつタンパク質の吸着力に差があるため、任意のタンパク質に関して、分析に必要な量を固定化することができるわけではなく、適用が制限されるという重大な欠点があった。
【００１３】
従って、本発明の課題は、任意の酵素又はパートナー（例えば、タンパク質又は核酸、特にはタンパク質）に関して、分析に必要な量を高密度で内壁に固定化することが可能な、バイオリアクター用担体（特には、独立した注入口及び排出口を有する容器又は管）を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記の課題は、本発明による、バイオリアクター用担体におけるプラスチック製内壁表面が、放射線照射処理又は放電処理されていることを特徴とする、バイオリアクター用担体によって解決することができる。
【００１５】
本発明によるバイオリアクター用担体の好ましい態様では、プラスチック製内壁表面がポリスチレン又はスチレン系共重合体である。
また、別の好ましい態様では、放射線がガンマ線である。
更に別の好ましい態様では、ガンマ線照射処理の線量が１〜１００ｋＧｙである。
更に別の好ましい態様では、ガンマ線がコバルト６０を線源とするガンマ線である。
更に別の好ましい態様では、バイオリアクター用担体が、独立した注入口及び排出口を有する容器又は管である。
【００１６】
また、本発明は、前記バイオリアクター用担体に、パートナーの一方又は酵素を接触させて固定化し、非固定化パートナー又は非固定化酵素を洗浄除去して得られることを特徴とする、バイオリアクターに関する。
【００１７】
また、本発明は、前記バイオリアクター用担体、あるいは、前記バイオリアクターを用いることを特徴とする、分析対象物質の分析方法に関する。
【００１８】
また、本発明は、バイオリアクター用担体のプラスチック製内壁表面を、放射線照射処理又は放電処理することを特徴とする、バイオリアクター用担体の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のバイオリアクター用担体においては、プラスチック製内壁表面を放射線照射処理又は放電処理によって表面改質を行っているので、種々の酵素やパートナー（例えば、等電点の異なる種々のタンパク質）を結合することができ、酵素やパートナーの性質の差に影響を受けにくい。
従って、本発明のバイオリアクター用担体によれば、改質剤を含む溶液の送液をする必要なしに、種々の酵素、パートナーに関して、充分な一定量を吸着して、固定化担体機能をもつバイオリアクターとすることができる。
【００２０】
このように、担体内側表面上へ酵素又はパートナーを効率的に固定化することができるので、生物学的分析方法などにおけるＢＦ分離操作を効率的に実施することができる。また、放射線照射処理又は放電処理は、安価に行うことができ、大量調製も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（１）バイオリアクター用担体及びパートナー担持バイオリアクター
本発明のバイオリアクター用担体は、その内部に、溶液を注入及び排出可能な反応室を有し、前記反応室の内壁表面がプラスチック製であるバイオリアクター用担体において、前記内壁表面（全面又はその一部）が放射線照射処理又は放電処理されている限り、特に限定されるものではなく、例えば、従来公知のプラスチック製担体（すなわち、放射線照射処理又は放電処理が行われていないプラスチック製担体）の表面に対して放射線照射処理又は放電処理を実施することによって製造することができる。
【００２２】
放射線照射処理又は放電処理の対象となる被処理出発担体としては、例えば、全体がプラスチックからなるプラスチック製担体、プラスチック又はそれ以外の材料（例えば、ガラス又は金属）からなる担体の内壁表面（全面又はその一部）をプラスチックでコートしたプラスチックコーティング担体などを挙げることができる。
担体材料として用いることのできる前記プラスチックとしては、バイオリアクター用担体の材料として一般的に使用されているプラスチック、例えば、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン）、ポリスチレン若しくはスチレン系共重合体［例えば、ポリ（α−メチルスチレン）］、ポリアセタール樹脂、又はフッ素系樹脂を挙げることができる。
【００２３】
前記担体材料の内、内壁表面の放射線照射処理又は放電処理を担体の外部から実施することができる点で、放射線（例えば、ガンマ線）や放電により産生される電子を透過させることができる材料、例えば、ポリスチレン又はスチレン系共重合体が好ましい。なお、放射線を透過しない材料であっても、例えば、注入口又は排出口から放射線照射装置を挿入し、担体内部から内壁表面の放射線照射を実施することができる。
【００２４】
放射線照射処理には、例えば、ガンマ線を用いることができる。ガンマ線照射線量は、好ましくは１〜１００ｋＧｙ、より好ましくは５〜５０ｋＧｙ、更に好ましくは１０〜３５ｋＧｙにわたって実施することができる。この放射線照射処理によって、プラスチック製担持表面の表面改質が行われるので、酵素やパートナー（例えば、タンパク質又は核酸）に対する吸着性が向上する。
【００２５】
放電処理には、例えば、プラズマ放電又はコロナ放電を用いることができる。
例えば、空気中でコロナ放電が起きると、発生した電子の衝突に加えて、二次的に発生するオゾンや紫外線による効果によって、樹脂などの表面に反応性や極性の高い官能基が発生し、表面の濡れ性や反応性を高めることができる。
また、プラズマ放電により産生される加速電子（中性粒子）の衝突に加えて、二次的に産生される酸素ラジカル、オゾン、ＯＨラジカル等が基板表面に衝突、反応し、表面上の炭素化合分子錯体切断を行い、それらをＣＯ２、Ｈ２として気化させることにより、表面処理が可能である。これらのエネルギーは、ＵＶ又はエキシマランプの分子錯体切断エネルギーよりも数倍高いことが知られている。
【００２６】
こうして放射線照射処理又は放電処理された本発明によるバイオリアクター用担体には、任意のパートナー（生物学的パートナー）の一方又は酵素を担持させることができる。本明細書において「パートナー」とは、相互に特異的に結合することのできる物質を意味し、例えば、抗原抗体反応によって相互に特異的に結合可能な抗原及び抗体、相補的結合により特異的にハイブリダイズ可能な核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、あるいは、相互に特異的に結合可能なアプタマー及びタンパク質を挙げることができ、好ましくはタンパク質である。なお、アプタマーとは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンから構成されるＤＮＡ（ＤＮＡアプタマー）、又はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルから構成されるＲＮＡ（ＲＮＡアプタマー）で、特定のタンパク質と特異的に結合することのできる核酸を意味する。
【００２７】
本発明においては、本発明のバイオリアクター用担体に、分析対象物質に応じて適宜選択した任意のパートナー又は酵素を担持させることにより作製した、本発明のバイオリアクターを用いて、分析対象物質の分析（生物学的分析）を実施することができる。本発明によるバイオリアクター用担体には、酵素や、分析対象物質に対して特異的に結合可能なパートナーを担持させるか、あるいは、分析対象物質それ自体をパートナーとして担持させることができる。
【００２８】
本発明のバイオリアクター用担体にパートナー又は酵素を担持させる方法は、予め放射線照射処理又は放電処理を実施しておくこと以外は、通常のバイオリアクターの作製方法（例えば、物理吸着法）をそのまま適用することができる。より具体的には、放射線照射処理又は放電処理したバイオリアクター用担体に、パートナーの一方又は酵素を含む水溶液を接触させて前記パートナー又は酵素を前記担体の内壁表面に固定化し、続いて、非固定化パートナー又は酵素を洗浄して除去し、必要があれば、更にブロッキング剤で処理することができる。
【００２９】
前記の洗浄液としては、例えば、緩衝液、蒸留水、若しくは生理食塩水、又は界面活性剤を含んだ緩衝液、蒸留水、若しくは生理食塩水を用いることができる。また、ブロッキング剤としては、例えば、牛血清アルブミン、スキムミルク、及び合成高分子などを用いることができる。パートナー又は酵素を担持したバイオリアクター用担体（すなわち、パートナー又は酵素担持バイオリアクター）の内壁表面をブロッキング剤で処理することにより、前記パートナー又は酵素以外のタンパク質の吸着を防止することができる。
【００３０】
本発明のバイオリアクター用担体の形状は、その内部に、溶液を自在に注入及び排出可能な反応室を有する限り、特に限定されるものではなく、例えば、独立した注入口及び排出口を有する容器又は管を挙げることができる。前記注入口及び排出口の数は、それぞれ、１又はそれ以上であることができる。また、反応室の数も、１又はそれ以上であることができる。反応室が複数の場合、隣接する反応室を結ぶ連絡路は、一方の反応室における排出口と、もう一方の反応室における注入口とを兼用する。
【００３１】
こうして得られたパートナー又は酵素担持バイオリアクターは、例えば、液体を送液しながら行う送液型生物学的分析法用基板又はアフィニティーカラムとして用いることができる。更に、アッセイ用基板として用いる際に、予め作製した複数の生物学的パートナー担持放射線照射処理又は放電処理担体を、生物学的パートナーを担持していない担体（ポリスチレン又はスチレン共重合体以外の材質のものでも構わない）を天板として貼り付けることにより、全体として１つの担体の異なった位置に複数の免疫学的パートナーを担持した、送液型生物学的分析法用タンパク質チップ（アレイ）として使用することもできる。
【００３２】
また、酵素を担持させたバイオリアクターは、生物が持つ酵素の特性を利用して物質の合成や分解を行う装置と利用することができ、例えば、エネルギーの発生や、環境汚染物質の分解、特定の生体成分の微量定量による病気の診断などに使用することができる。バイオリアクターに担持させることのできる酵素とその利用方法としては、例えば、担子菌Coriolus versicolor及びPeurolus ostreatusの菌体外酵素とPycnoporus coccineus由来のラッカーゼを用いて内分泌撹乱化学物質（環境ホルモン）のうちノニルフェノール、オクチルフェノール、又はビフェニールの酵素分解を行う利用方法、あるいは、β−フルクトフラノシダーゼをグリシジルアクリレートを母体とする坦体に固定化し、基質に乳糖と蔗糖を通すことにより、乳化オリゴ糖（4-β-D-galactosylsucrose）の生産を行う利用方法などを挙げることができる。
【００３３】
（２）分析方法
本発明のバイオリアクター用担体を用いて、各種分析を実施することもできる。例えば、本発明の分析方法の一態様として、分析対象物質が抗原であり、固定化用パートナー及び標識化パートナーとして、前記抗原に対する抗体を用いる態様（いわゆるサンドイッチ法）、すなわち、
（１）本発明のバイオリアクター用担体の内壁表面に、分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に対して特異的に結合可能な第１のパートナー（例えば、抗体Ｂ）を固定化する工程；
（２）前記第１パートナー（抗体Ｂ）を固定化して担持したバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記分析対象物質（抗原Ａ）を含む可能性のある被検試料とを接触させる工程；
（３）前記第１パートナー（抗体Ｂ）を固定化して担持し、更に前記被検試料に接触させたバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記分析対象物質（抗原Ａ）に対して特異的に結合可能で、標識化された第２のパートナー（例えば、抗体Ｃ）とを接触させる工程；
（４）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記第１パートナー（抗体Ｂ）に結合した前記分析対象物質（抗原Ａ）に対して未反応の標識化第２パートナー（抗体Ｃ）をバイオリアクター用担体の内壁表面から除去する工程；及び
（５）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記第１パートナー（抗体Ｂ）に結合した前記分析対象物質（抗原Ａ）に結合した標識化第２パートナー（抗体Ｃ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の免疫学的分析方法（以下、本発明の分析方法にける「第１態様」と称する）を挙げることができる。
【００３４】
前記第１態様におけるパートナーとして免疫学的パートナーを使用する場合には、第１免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）及び第２免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｃ）は、ポリクローナル抗体であるかあるいはモノクローナル抗体であることができる。両者がモノクローナル抗体である場合は、第１免疫学的パートナーと第２免疫学的パートナーとで異なるモノクローナル抗体を用いる。
【００３５】
前記第１態様における工程（１）において、第１パートナーを担体上に固定化する場合には、例えば、第１パートナーを担体上に直接、固定化することもできるし、あるいは、間接的に、例えば、適当な物質を介して固定化することもできる。例えば、第１パートナーがアプタマーである場合には、ビオチン−アビジン系を介して固定化することができる。より具体的には、例えば、アプタマーを予めビオチン化し、バイオリアクター用担体上にアビジン（又はストレプトアビジン）を固定化した後、ビオチン化アプタマーとアビジン固定化担体とを接触させることにより、前記担体上に、第１パートナーを間接的に固定化することができる。
【００３６】
本発明の分析方法の別の一態様として、分析対象物質が抗体（例えば、抗体Ｘ）であり、固定化用パートナーが前記抗体に対する抗原（例えば、抗原Ｙ）であり、標識化パートナーが前記抗原に対する抗体（例えば、抗体Ｚ）である態様（いわゆる２段階競合法）、すなわち、
（１）本発明のバイオリアクター用担体の内壁表面に、分析対象物質（例えば、抗体Ｘ）に対して特異的に結合可能な第１のパートナー（例えば、抗原Ｙ）を固定化する工程；
（２）前記第１パートナー（抗原Ｙ）を固定化して担持したバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記分析対象物質（抗体Ｘ）を含む可能性のある被検試料とを接触させる工程；
（３）前記第１パートナー（抗原Ｙ）を固定化して担持し、更に前記被検試料に接触させたバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記第１パートナー（抗原Ｙ）に対して特異的に結合可能で、標識化された第２のパートナー（例えば、抗体Ｚ）とを接触させる工程；
（４）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記第１パートナー（抗原Ｙ）に対して未反応の標識化第２パートナー（抗体Ｚ）をバイオリアクター用担体上から除去する工程；及び
（５）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記第１パートナー（抗原Ｙ）に結合した標識化第２パートナー（抗体Ｚ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の免疫学的分析方法（以下、本発明の分析方法にける「第２態様」と称する）を挙げることができる。
【００３７】
前記第２態様における工程（１）において、第１パートナーを担体上に固定化する場合には、例えば、第１パートナーを担体上に直接、固定化することもできるし、あるいは、間接的に、例えば、適当な物質を介して固定化することもできる。例えば、第１パートナーがアプタマーである場合には、ビオチン−アビジン系を介して固定化することができる。より具体的には、例えば、アプタマーを予めビオチン化し、バイオリアクター用担体上にアビジン（又はストレプトアビジン）を固定化した後、ビオチン化アプタマーとアビジン固定化担体とを接触させることにより、前記担体上に、第１パートナーを間接的に固定化することができる。
【００３８】
本発明の分析方法の更に別の一態様として、分析対象物質が抗原であり、１次抗体として前記抗原に対する抗体を、標識化２次抗体として前記１次抗体に対する抗体を用いる態様、すなわち、
（１）本発明のバイオリアクター用担体の内壁表面に、分析対象物質（抗原Ａ）を含む可能性のある被検試料を接触させる工程；
（２）前記被検試料を接触させたバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記分析対象物質（抗原Ａ）に対して結合可能な第１のパートナー（例えば、抗体Ｂ）とを接触させる工程；
（３）前記被検試料を接触させ、更に前記第１パートナー（抗体Ｂ）と接触させたバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記第１パートナー（抗体Ｂ）と特異的に結合可能で、標識化された第２のパートナー（例えば、抗体Ｃ）とを接触させる工程；
（４）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記分析対象物質（抗原Ａ）に結合した前記第１パートナー（抗体Ｂ）に対して未反応の標識化第２パートナー（抗体Ｃ）をバイオリアクター用担体の内壁表面から除去する工程；及び
（５）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記分析対象物質（抗原Ａ）に結合した前記第１パートナー（抗体Ｂ）に結合した標識化第２パートナー（抗体Ｃ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の免疫学的分析方法（以下、本発明の分析方法にける「第３態様」と称する）を挙げることができる。
【００３９】
本発明の分析方法の更に別の一態様として、分析対象物質を予め標識し、前記分析対象物質に対するパートナーを用いる態様、すなわち、
（１）本発明のバイオリアクター用担体の内壁表面に、分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に対して特異的に結合可能なパートナー（例えば、抗体Ｂ）を固定化する工程；
（２）前記パートナー（抗体Ｂ）を固定化して担持したバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記分析対象物質（抗原Ａ）を含む可能性のある被検試料とを接触させる工程；
（３）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記パートナー（抗体Ｂ）に対して未反応の被検試料をバイオリアクター用担体の内壁表面から除去する工程；及び
（４）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記パートナー（抗体Ｂ）に結合した前記分析対象物質（抗原Ａ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の免疫学的分析方法（以下、本発明の分析方法にける「第４態様」と称する）を挙げることができる。
【００４０】
本発明の分析方法の更に別の一態様として、分析対象物質を予め標識し、前記分析対象物質に対するパートナーと、解離剤とを使用する態様、すなわち、
（１）本発明のバイオリアクター用担体の内壁表面に、分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に対して特異的に結合可能なパートナー（例えば、抗体Ｂ）を固定化する工程；
（２）前記パートナー（抗体Ｂ）を固定化して担持したバイオリアクター用担体の内壁表面と、前記分析対象物質（抗原Ａ）を含む可能性のある被検試料とを接触させる工程；
（３）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記パートナー（抗体Ｂ）に対して未反応の被検試料をバイオリアクター用担体の内壁表面から除去する工程；
（４）バイオリアクター用担体の内壁表面に固定化された前記パートナー（抗体Ｂ）に結合した前記分析対象物質（抗原Ａ）を、解離剤により担体から溶出させる工程；
（５）溶出された分析対象物質（抗原Ａ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の免疫学的分析方法（以下、本発明の分析方法にける「第５態様」と称する）を挙げることができる。
【００４１】
前記第４態様又は第５態様において、分析対象物質が抗体である場合には、前記パートナーとして抗原を用いることができる。分析対象物質が核酸である場合には、前記パートナーとしてその相補的核酸を用いることができる。第４態様又は第５態様で用いる抗体は、ポリクローナル抗体であるかあるいはモノクローナル抗体であることができる。
【００４２】
第５態様で使用する解離剤としては、分析対象物質及びパートナーの組合せが抗原抗体の組合せである場合には、例えば、酸、アルカリ溶液、ドデシル硫酸Ｎａ（ＳＤＳ）、チオシサン酸塩、又はグアニジン塩酸を使用することができ、分析対象物質及びパートナーの組合せが核酸である場合には、例えば、アルカリ溶液を使用することができる。
【００４３】
前記第４態様又は第５態様における工程（１）において、パートナーを担体上に固定化する場合には、例えば、パートナーを担体上に直接、固定化することもできるし、あるいは、間接的に、例えば、適当な物質を介して固定化することもできる。例えば、パートナーがアプタマーである場合には、ビオチン−アビジン系を介して固定化することができる。より具体的には、例えば、アプタマーを予めビオチン化し、バイオリアクター用担体上にアビジン（又はストレプトアビジン）を固定化した後、ビオチン化アプタマーとアビジン固定化担体とを接触させることにより、前記担体上に、パートナーを間接的に固定化することができる。
【００４４】
本発明の分析方法で用いる標識物質としては、公知の標識物質、例えば、発色物質、発光物質、蛍光物質、又は酵素などを用いることができる。
【００４５】
本発明による分析方法で分析可能な対象物（すなわち、分析対象物質）は、それに特異的な結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質（例えば、抗原、抗体、又はレセプターなど）、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、又は生理活性を持つ化学物質などである。また、本発明による分析方法で分析可能な被検試料は、前記分析対象物質を含む可能性のある試料であれば、特に限定されず、特には生体試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、又は細胞若しくは組織破砕液などを挙げることができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例によってポリスチレン製担体表面の放射線照射処理による改質を行い、アレルゲン特異ＩｇＥ抗体測定系を用いる免疫学的分析方法において評価した。放射線照射処理されていないポリスチレン製担体に比べて、放射線照射処理された担体の方が、担体に結合した免疫学的に特異的結合可能な免疫学的パートナーの、その分析対象物質に対して免疫学的に結合活性の高い結果について具体的に説明する。
実施例においては、ポリスチレン製容器としての一例を示しているに過ぎず、ポリスチレン又はスチレン共重合体を原料とする容器又は管を使用することもできる。また、実施例では免疫学的測定法における標識体のシグナルを分析しているが、放射線照射ポリスチレン製容器内壁上に分析対象物質に対して特異的に結合することのできるパートナーを結合させ、分析対象物質を含む溶液を注入し、免疫学的結合を解離させることのできる条件にて分析対象物質を容器外へ溶出させ、分析対象物質を選択的に捕獲するアフィニティーカラムとしても使用することができる。また、容器内壁上へ酵素を結合させ、物質の合成や分解、特定の生体成分の微量定量なども行うことができる。
なお、実施例に示された内容および検出法は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
《実施例１：ポリスチレン製容器内でのアレルゲン特異ＩｇＥ抗体のイムノアッセイ》
（１）イムノアッセイ用ポリスチレン製容器の作製
図１及び図２に示すポリスチレン製容器を作製した。図１に示すように、ポリスチレン容器１（１ｃｍ×２ｃｍ×０．２ｃｍ）は、その内部に反応室１１が設けられている。反応室１１には、注入口１２から溶液を注入することができ、反応室１１内の溶液は、排出口１３から排液することができる。図２には、担体に結合させたいパートナーを含む溶液を容器内に送液した場合に、パートナーが容器内壁に結合する部分を着色して示している。
【００４８】
（２）ガンマ線照射
実施例１（１）で作製したポリスチレン製容器は、コバルト６０のガンマ線を用い、１５ｋＧｙの線量で放射線照射処理した。
【００４９】
（３）ガンマ線照射処理ポリスチレン製容器内壁へのアレルゲンの結合
実施例１（２）において調製したガンマ線照射処理ポリスチレン製容器内へ、免疫反応の固定化量には充分な量（１μｇ／ｍＬ）のアレルゲンを含むミルクアレルゲン水溶液２００μＬを注入し、恒湿槽内で、２５℃にて１時間静置し、アレルゲンを容器内壁上に結合させた。結合反応の終了後、０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０及び０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液を余剰のアレルゲン溶液を洗い流すのに充分な量を注入し、アレルゲン水溶液を除去した。次いで、０．２５％リピジュア（日本油脂社）を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２００μＬを注入し、３７℃で１時間静置し、ブロッキングを行った。容器はアッセイに用いるまで４℃で保存した。対照として、ガンマ線照射処理を行っていないポリスチレン製容器を用い、上記と同様に操作を行ってアレルゲン固定化容器を作製した。
【００５０】
（４）アレルゲン特異ＩｇＥ抗体の測定
（４−１）アレルゲン特異ＩｇＥ抗体のイムノアッセイ手順
前記実施例１（１）〜（３）で調製したアレルゲン結合ポリスチレン製容器へ、検体（アレルゲン特異ＩｇＥ抗体陰性ヒト血清及び陽性ヒト血清）２００μＬをそれぞれ別の容器へ注入して容器内に満たし、室温で１時間静置した。洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）を検体成分を洗い流すのに充分な量を容器内へ注入した後、抗ヒトＩｇＥ抗体標識ユーロピウム錯体封入ナノ粒子試薬２００μＬを注入して容器内に満たし、室温で１時間静置した。続いて、反応容器内へ上記洗浄液を標識ナノ粒子試薬を洗い流すのに充分な量を容器内へ注入した後、抗原抗体反応によって容器内壁上に結合したユーロピウム錯体の時間分解蛍光強度を測定し、アレルゲン特異ＩｇＥ抗体を分析した。
なお、前記の抗ヒトＩｇＥ抗体標識ユーロピウム錯体封入ナノ粒子試薬は、Matsuya et al., Anal. Chem., 2003, 75, 6124-6132に記載の抗体標識ユーロピウム錯体封入ナノ粒子の調製法に準じて調製した。
【００５１】
（４−２）時間分解蛍光測定条件
アレルゲン特異ＩｇＥ抗体のイムノアッセイにおける時間分解蛍光測定は、ＤＥＬＦＩＡ蛍光光度計（Ｗａｌｌａｃ製）を使用し、以下の条件で実施した。
待機時間：０．２０ｍｓ
測光時間：０．４０ｍｓ
測定波長：６１５ｎｍ
ＤＥＬＦＩＡ蛍光光度計は、９６穴マイクロプレート測定用の検出器であるが、上記ポリスチレン製容器の測定は、９６穴マイクロプレート大の枠を用いてポリスチレン製容器を固定して行われた。
【００５２】
（４−３）測定結果
１５ｋＧｙの線量でガンマ線照射処理を行ったポリスチレン製容器と、ガンマ線照射処理を行っていない対照用ポリスチレン製容器とに関して、ミルク特異ＩｇＥ抗体を測定した結果を図３に示す。
【００５３】
図３から明らかなように、ガンマ線照射処理されたポリスチレン製容器を用いた場合のミルク特異ＩｇＥ抗体陰性ヒト血清の測定値は、ガンマ線照射処理ポリスチレン製容器の方がガンマ線照射処理を行っていないポリスチレン製容器に比べて低かった。これは、ポリスチレン製容器をガンマ線照射処理することによって、標識ナノ粒子試薬が容器内壁表面上へ非特異的に吸着する量を減少させることができることを示している。一方、ミルク特異ＩｇＥ抗体陽性ヒト血清の測定値は、ポリスチレン製容器をガンマ線照射処理することにより、ガンマ線照射を行っていないポリスチレン製容器を用いた場合の測定値に比べて、有意に高値であった。これは、ポリスチレン製容器をガンマ線照射処理することによって、容器内壁表面の改質が起こり、免疫学的反応において好ましい状態でミルクアレルゲンが容器内壁表面上に固定化されたことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のバイオリアクター用担体は、生物学的分析、例えば、免疫学的分析の用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】実施例１で用いたポリスチレン製容器の構造を模式的に示す説明図である。
【図２】図１に示すポリスチレン製容器内に、分析対象物質に対して特異的に結合することのできるパートナーを含む溶液を送液した際に、容器内壁上に前記パートナーが結合される部分を示す説明図である。
【図３】ガンマ線照射処理又は未処理ポリスチレン製容器を用いたミルク特異ＩｇＥ抗体イムノアッセイの測定結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオリアクター用担体におけるプラスチック製内壁表面が、放射線照射処理又は放電処理されていることを特徴とする、バイオリアクター用担体。
【請求項２】
前記プラスチック製内壁表面がポリスチレン又はスチレン系共重合体である、請求項１に記載のバイオリアクター用担体。
【請求項３】
放射線がガンマ線である、請求項１又は２に記載のバイオリアクター用担体。
【請求項４】
ガンマ線照射処理の線量が１〜１００ｋＧｙである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオリアクター用担体。
【請求項５】
ガンマ線が、コバルト６０を線源とするガンマ線である、請求項４に記載のバイオリアクター用担体。
【請求項６】
バイオリアクター用担体が、独立した注入口及び排出口を有する容器又は管である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオリアクター用担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオリアクター用担体の内壁に、パートナーの一方又は酵素を接触させて固定化し、非固定化パートナー又は非固定化酵素を洗浄除去して得られることを特徴とする、バイオリアクター。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオリアクター用担体、あるいは、請求項７に記載のバイオリアクターを用いることを特徴とする、分析対象物質の分析方法。
【請求項９】
バイオリアクター用担体のプラスチック製内壁表面を、放射線照射処理又は放電処理することを特徴とする、バイオリアクター用担体の製造方法。
【請求項１】
バイオリアクター用担体におけるプラスチック製内壁表面が、放射線照射処理又は放電処理されていることを特徴とする、バイオリアクター用担体。
【請求項２】
前記プラスチック製内壁表面がポリスチレン又はスチレン系共重合体である、請求項１に記載のバイオリアクター用担体。
【請求項３】
放射線がガンマ線である、請求項１又は２に記載のバイオリアクター用担体。
【請求項４】
ガンマ線照射処理の線量が１〜１００ｋＧｙである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオリアクター用担体。
【請求項５】
ガンマ線が、コバルト６０を線源とするガンマ線である、請求項４に記載のバイオリアクター用担体。
【請求項６】
バイオリアクター用担体が、独立した注入口及び排出口を有する容器又は管である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオリアクター用担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオリアクター用担体の内壁に、パートナーの一方又は酵素を接触させて固定化し、非固定化パートナー又は非固定化酵素を洗浄除去して得られることを特徴とする、バイオリアクター。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオリアクター用担体、あるいは、請求項７に記載のバイオリアクターを用いることを特徴とする、分析対象物質の分析方法。
【請求項９】
バイオリアクター用担体のプラスチック製内壁表面を、放射線照射処理又は放電処理することを特徴とする、バイオリアクター用担体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−９４８１２（Ｐ２００６−９４８１２Ａ）
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２８６６７７（Ｐ２００４−２８６６７７）
【出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００１３８２７７）株式会社三菱化学ヤトロン (30)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００１３８２７７）株式会社三菱化学ヤトロン (30)
【Ｆターム（参考）】
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