バチルス属細菌の簡易測定法
【課題】汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させる方法を提供する。また、汚泥中のバチルス属細菌数を簡単、迅速に測定する方法を提供する。また、これらを利用した生物的排水処理方法を提供する。
【解決手段】生物的排水処理設備の汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させる方法であって、汚泥中の細菌に芽胞を形成させる芽胞形成ステップと、芽胞形成ステップ後の汚泥を殺菌する殺菌ステップとを含む方法、及び、生物的排水処理設備の汚泥中のバチルス属細菌数を測定する方法であって、汚泥中の細菌に芽胞を形成させる芽胞形成ステップと、芽胞形成ステップ後の汚泥を殺菌する殺菌ステップと、殺菌ステップ後の汚泥を培養してバチルス属細菌のコロニーを形成させる培養ステップと、コロニー数を測定して汚泥中のバチルス属細菌数を算出する算出ステップとを含む方法。
【解決手段】生物的排水処理設備の汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させる方法であって、汚泥中の細菌に芽胞を形成させる芽胞形成ステップと、芽胞形成ステップ後の汚泥を殺菌する殺菌ステップとを含む方法、及び、生物的排水処理設備の汚泥中のバチルス属細菌数を測定する方法であって、汚泥中の細菌に芽胞を形成させる芽胞形成ステップと、芽胞形成ステップ後の汚泥を殺菌する殺菌ステップと、殺菌ステップ後の汚泥を培養してバチルス属細菌のコロニーを形成させる培養ステップと、コロニー数を測定して汚泥中のバチルス属細菌数を算出する算出ステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス属細菌の簡易測定法に関する。より詳細には、生物的排水処理設備の汚泥において、バチルス属細菌の割合を増加させる方法、バチルス属細菌数を測定する方法及びこれらを利用した生物的排水処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物的排水処理設備の汚泥中には様々な細菌が存在しているが、それらの菌種の一つにＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属細菌がある。バチルス属細菌は土壌細菌の１種であり、棒状の形状をした桿菌である。
【０００３】
汚泥構成細菌群の中でもバチルス属細菌は非常に有用である。バチルス属細菌は、栄養源の除去能力だけではなく、強力な脱臭能力を持つ。また、排水中のバチルス属細菌を含む浮遊物質を凝集させる、固液分離作用に優れている。さらに、ＢＯＤ（生物化学的酸素要求量）からの汚泥転換率が低いため、余剰汚泥を低減できるとされている。悪臭が少なく、固液分離が安定している汚泥中には、バチルス属細菌の割合が増加していることが知られている。
【０００４】
したがって、バチルス属細菌の割合を人為的に増加させれば、排水処理能力、経済性の両面において、優れた排水処理が可能となる。また、バチルス属細菌がどの程度存在しているかを測定できれば、バチルス属細菌数が少ない場合には、バチルス属細菌数を増加させる対策を講じることが可能となる。以上のことから、排水処理施設において、バチルス属細菌の割合を増加させることと、バチルス属細菌数を測定することは重要である。
【０００５】
バチルス属細菌の性質として、貧栄養や低温、高温、低酸素などの悪条件下において芽胞を形成し、休眠状態に入ることが挙げられる。そして、活動可能な条件下に戻ると再び発芽して栄養細胞を形成し、活発に活動を開始する。芽胞とは、一部の細菌が形成する、極めて耐久性の高い細胞構造である。
【０００６】
特許文献１には、バチルス属細菌数を測定する方法が開示されている。それによると、多種多様な細菌群が必要とする栄養源を配合した寒天培地に、段階希釈した汚泥を塗布し、約４８時間培養する。続いて形成されたコロニーの形状及び胞子形成の有無を肉眼及び顕微鏡を用いて観察し、バチルス属細菌のコロニーであるか否かを視覚的に判定する。次いでバチルス属細菌のコロニー数を測定する。
【０００７】
非特許文献１には、全細菌中のバチルス属細菌の割合を求める方法が記載されている。それによると、段階希釈した汚泥サンプルを培地上に塗布し、３２℃の恒温槽で１週間培養して、全細菌のコロニーを形成させる。ここで、バチルス属細菌のコロニーは放射状に増殖するため、真円に近い形状を呈する他の細菌のコロニーと見分けることができるとされている。形成された全細菌のコロニー数及びバチルス属細菌のコロニー数を測定し、バチルス属細菌の優占化率を算出する。
【特許文献１】特開平１０−１５５４９８
【非特許文献１】青井透、「群馬県内各下水処理施設におけるバチルス菌分布調査と県内新活性汚泥法適用事例の実態調査」、新活性汚泥技術研究会、平成１５年研究助成報告書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１や非特許文献１の方法では、コロニーの形状でバチルス属細菌か否かを判断し、バチルス属細菌数を測定する必要があった。このため、ある程度訓練した人間でなければ検査できないという問題があった。また、バチルス属細菌とそれ以外の細菌のコロニーが混在している培地上で、バチルス属細菌を測定する必要があり、手間や時間がかかるという問題があった。
【０００９】
そこで本発明の目的は、汚泥中のバチルス属細菌数を簡単、迅速に測定する方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させる方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、上記のバチルス属細菌の割合を増加させる方法を利用した生物的排水処理方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、上記のバチルス属細菌数を測定する方法を利用した生物的排水処理方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
バチルス属細菌が他の細菌と際立って異なる性質は芽胞の形成能力を有する点である。バチルス菌は貧栄養や低温、高温、低酸素などの悪条件下で芽胞を形成し休眠状態に入ると考えられている。そこで、採取した汚泥サンプルを悪条件下に置き、バチルス属細菌に芽胞を形成させる（芽胞形成ステップ）。続いて汚泥サンプルを殺菌条件下に置くと、芽胞を形成したバチルス属細菌は生存し、芽胞を形成しなかった他の細菌は死滅する（殺菌ステップ）。この汚泥中ではバチルス属細菌の割合が増加している。また、この汚泥サンプルを寒天培地などの上で培養しコロニーを形成させることにより、バチルス属細菌のみの数を測定することが可能となる。
【００１１】
芽胞を形成する細菌には、バチルス属細菌の他にもクロストリジウム属細菌、スポロサルシナ属細菌などが知られている。しかしながら、クロストリジウム属細菌やスポロサルシナ属細菌は嫌気性細菌であるため、バチルス属細菌と同じ培地ではコロニーを形成しない。また、発明者らは、汚泥中にはバチルス属細菌以外の芽胞を作る細菌がほとんど存在せず、本発明の方法により、ほぼバチルス属細菌のみの数を測定可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
１つの態様において、本発明は、生物的排水処理設備の汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させる方法であって、汚泥中の細菌に芽胞を形成させる芽胞形成ステップと、芽胞形成ステップ後の汚泥を殺菌する殺菌ステップとを含む方法を提供する。
【００１３】
上述したように、バチルス属細菌は、栄養源の除去、脱臭、固液分離作用、余剰汚泥の低減などに優れた効果を発揮するため、生物的排水処理設備の汚泥においてバチルス属細菌の割合を増加させることにより、高い排水処理能力と優れた経済性を実現することができる。
【００１４】
また、芽胞形成ステップを含むことにより、バチルス属細菌を確実に芽胞化することができるため、より効率よくバチルス属細菌の割合を増加させることが可能である。
【００１５】
別の態様において、本発明は、生物的排水処理設備の汚泥中のバチルス属細菌数を測定する方法であって、汚泥中の細菌に芽胞を形成させる芽胞形成ステップと、芽胞形成ステップ後の汚泥を殺菌する殺菌ステップと、殺菌ステップ後の汚泥を培養してバチルス属細菌のコロニーを形成させる培養ステップと、コロニー数を測定して汚泥中のバチルス属細菌数を算出する算出ステップとを含む方法を提供する。
【００１６】
この方法により培地上に形成されるコロニーは、ほとんどバチルス属細菌のもののみである。したがってコロニーの形状からバチルス属細菌であるか否かを判断する必要がないため、特定の訓練を受けていない人間でも簡便に測定を行うことが可能である。また、出現するコロニーはバチルス属細菌のコロニーのみであるため、効率よく測定を行うことができる。
【００１７】
また、芽胞形成ステップを含むことにより、バチルス属細菌を確実に芽胞化することができるため、より正確にバチルス属細菌数を測定することが可能である。
【００１８】
バチルス属細菌がどの程度存在しているかを測定できれば、バチルス属細菌数が少ない場合には、生物的排水処理設備における曝気量、汚泥の返送量又は投入排水量などを調整することにより、或いはバチルス属細菌を多く含む汚泥を移入するなどの対策を講じることにより、バチルス属細菌数を増加させ、汚泥の排水処理能力と経済性を向上させることが可能となる。
【００１９】
上記の培養ステップにおいては、殺菌ステップ後の汚泥を２５〜３８℃で４〜２４時間培養することが好ましい。
【００２０】
バチルス属細菌はその他の細菌と比較して成長が速いため、万一バチルス属細菌以外の菌が混入していた場合でも、上記の条件で形成されるコロニーはほとんどバチルス属細菌のものである。このため、より正確にバチルス属細菌数を測定することが可能である。また、上記の条件で形成させたコロニーが大きさや形状などの点で測定しやすい。
【００２１】
上記の芽胞形成ステップは、０〜１２℃、１〜２４時間の低温処理によるものであり、上記の殺菌ステップは、８０〜９５℃、０．５〜１時間の高温処理によるものであることが好ましい。
【００２２】
芽胞形成ステップには、後述するように多様な手段が存在するが、０〜１２℃、１〜２４時間の低温処理は、簡単な設備により低コストで実施することが可能であるため好ましい。同様に、殺菌ステップには、後述するように多様な手段が存在するが、８０〜９５℃、０．５〜１時間の高温処理は簡単な設備で低コストに実施可能であるため好ましい。
【００２３】
別の態様において、本発明は、上記の方法により、汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させた汚泥を、生物的排水処理設備に導入するステップを含む、生物的排水処理方法を提供する。
【００２４】
この方法によれば、生物的排水処理設備の汚泥中のバチルス属細菌の割合を人為的に増加させ、排水処理能力、経済性の両面において、優れた排水処理を行なうことが可能である。
【００２５】
別の態様において、本発明は、上記の方法により、生物的排水処理設備の汚泥中のバチルス属細菌数を測定するステップと、測定されたバチルス属細菌数に基づいて、生物的排水処理設備における曝気量、汚泥の返送量及び投入排水量からなる群から選択される１つ以上の因子を変化させるステップとを含む、生物的排水処理方法を提供する。
【００２６】
この方法により、生物的排水処理設備における曝気量、汚泥の返送量又は投入排水量などの因子を適切に調整することにより、バチルス属細菌数を増加させ、汚泥の排水処理能力と経済性を向上させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
１つの態様において、本発明は、生物的排水処理設備の汚泥中の、バチルス属細菌の割合を増加させる方法を提供する。
【００２８】
まず、バチルス属細菌の割合を増加させたい汚泥を生物的排水処理設備から採取する。生物的排水処理設備は、その構成によって、脱窒槽、硝化槽、２次脱窒槽、再曝気槽などを含む場合があるが、いずれの処理槽においてもこの方法を適用することができる。採取する汚泥の量は対象とする処理槽中の汚泥全量であってもよいし、その一部であってもよい。後者の場合には、バチルス属細菌の割合を増加させた汚泥を処理槽に戻す操作を繰り返すことにより、バチルス属細菌の割合をさらに高めることが可能である。
【００２９】
続いて、採取した汚泥を芽胞形成ステップに供する。芽胞形成ステップは、バチルス属細菌に芽胞を形成させる条件であれば特に限定されない。例えば、酸素濃度を０〜１体積％にする低酸素処理、０〜１２℃、１〜２４時間の低温処理、５０〜６０℃、１〜６時間の高温処理、水分含量を０〜５質量％にする乾燥処理などによって実施することができる。しかしながら、設備が簡単で、低コストに実施することが可能である点で０〜１２℃、１〜２４時間、より好ましくは４〜１２℃、５〜２４時間、特に好ましくは４℃、２４時間の低温処理により実施することが好ましい。低温処理は、例えば汚泥を入れた容器を冷蔵庫や冷蔵室内に放置することで行ってもよいし、汚泥の入った容器中に冷却装置を投入して行ってもよい。
【００３０】
続いて、芽胞形成ステップ後の汚泥を殺菌ステップに供する。殺菌ステップはバチルス属細菌の芽胞が死滅せず、それ以外の細菌が死滅する条件であれば特に限定されない。例えば、８０〜９５℃、０．５〜１時間の高温処理などによって実施することができる。しかしながら、設備が簡単で、低コストに実施することが可能である点で８０〜９５℃、０．５〜１時間、より好ましくは８０〜８５℃、０．５〜１時間、特に好ましくは８０℃、０．５時間の高温処理により実施することが好ましい。高温処理は、例えば汚泥を入れた容器を８０℃に調整したウォーターバスに浸して行ってもよいし、汚泥の入った容器中に加熱装置を投入して行ってもよい。
【００３１】
殺菌処理後の汚泥中には芽胞を形成したバチルス属細菌が生存し、それ以外の細菌がほとんど死滅しているため、バチルス属細菌の割合が高まっている。殺菌処理後の汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合は、汚泥の排水処理能力が高い点で、３〜３０％となっていることが好ましい。
【００３２】
続いてバチルス属細菌の割合を増加させた汚泥を生物的排水処理設備に移入する。芽胞を形成していたバチルス属細菌は再び活発に活動を開始し、排水処理が可能な状態となる。
【００３３】
別の態様において、本発明は、生物的排水処理設備の汚泥中の、バチルス属細菌数を測定する方法を提供する。
【００３４】
まず、バチルス属細菌数を測定したい汚泥を生物的排水処理設備から採取する。生物的排水処理設備は、その構成によって、脱窒槽、硝化槽、２次脱窒槽、再曝気槽などを含む場合があるが、いずれの処理槽においてもこの方法を適用することができる。汚泥の採取量は５〜２０ｍＬ程度でよい。
【００３５】
続いて、採取した汚泥を上記と同様にして、芽胞形成ステップ及び殺菌ステップに供する。
【００３６】
殺菌ステップ後の汚泥中には芽胞を形成したバチルス属細菌が生存し、それ以外の細菌がほとんど死滅している。この汚泥を段階希釈して、一定容量、例えば２００μＬを寒天培地上に塗布し、インキュベーター内で培養してバチルス属細菌のコロニーを形成させる。培地は一般的なものでよく、例えば本願実施例１に示した培地でよい。どの希釈段階がコロニー数の測定に適しているかわからないため、数段階の希釈した汚泥を寒天培地で培養することが好ましい。およそ１０万倍に希釈すると適当なコロニー数が得られる場合が多い。寒天培地に塗布した細菌は、２５〜３８℃で４〜２４時間、より好ましくは３５〜３８℃で６〜１２時間、特に好ましくは３７℃で１２時間培養することが好ましい。
【００３７】
バチルス属細菌はその他の細菌と比較して成長が速いため、バチルス属細菌以外の菌が混入していた場合でも、上記の条件で形成されるコロニーはほとんどバチルス属細菌のものである。このため、より正確にバチルス属細菌数を測定することが可能である。また、上記の条件で形成させたコロニーが大きさや形状などの点で測定しやすい。
【００３８】
続いて、測定した寒天培地上のコロニー数、寒天培地に塗布した容量及び希釈倍率をもとに、汚泥原液中のバチルス属細菌数（個／ｍＬ）を算出することができる。
【００３９】
また、芽胞形成ステップ及び殺菌ステップを行なわず、採取した汚泥を上記と同様にして寒天培地上に塗布して培養し、コロニー数を測定することにより、汚泥中の全細菌数を測定することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。
【００４１】
（実施例１）
（寒天培地の作製）
肉エキス（Ｌａｂ−Ｌｅｍｃｏ社、ＬＰ００２９）１０ｇ、ペプトン（Ｌａｂ−Ｌｅｍｃｏ社、ＬＰ００３７）１０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、寒天２０ｇを蒸留水に溶解後、塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．０に調整し、１Ｌにメスアップした。この溶液を三角フラスコに入れてシリコン栓をセットし、オートクレーブを用いて１２１℃３０分滅菌した。オートクレーブ後、培地が冷めて固まる前に、クリーンベンチ内で滅菌シャーレに分注した。寒天が固まるまでシャーレのふたを開け、室温で固化させた。培地が固化したらビニール袋に入れ、冷蔵庫中で保存した。
【００４２】
（汚泥サンプルの採取）
生物的排水処理設備の硝化槽より、２５ｍＬの汚泥サンプルを試験管に採取した。
【００４３】
（芽胞形成ステップ）
採取した汚泥サンプルを冷蔵庫に入れ、４℃で２４時間静置し、バチルス属細菌に芽胞を形成させた。
【００４４】
（殺菌ステップ）
芽胞形成ステップ後の汚泥サンプルを８０℃に設定したウォーターバス中に設置し、３０分間放置した。これにより芽胞を形成しなかった細菌を死滅させた。
【００４５】
（バチルス属細菌のコロニーの形成）
上記の殺菌ステップ後の汚泥サンプルをホモジナイザーで１０秒間撹拌し、均一に懸濁した。４．５ｍＬの滅菌した０．５％塩化ナトリウム溶液に、汚泥サンプル０．５ｍＬを加えて撹拌し、１０倍希釈サンプルを調製した。この操作を繰り返し、汚泥サンプルを段階希釈した。１０−２、１０−４、１０−６、１０−８倍に段階希釈した汚泥サンプル各２００μＬをそれぞれ上記の寒天培地に塗布後、３７℃に設定したインキュベーター内で１２時間培養した。図１に、出現したバチルス属細菌のコロニーの写真を示す。図１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）はそれぞれ１０−２、１０−４、１０−６、１０−８倍に希釈したサンプルを培養した結果である。出現したコロニー数を測定し、希釈倍率と培地に塗布した容量（２００μＬ）をもとに、汚泥サンプル原液１ｍＬあたりのバチルス属細菌数を算出した。その結果、汚泥サンプル原液中に、１．０×１０９個／ｍＬのバチルス属細菌が存在することが明らかとなった。
【００４６】
図１の写真において、形成されたコロニーの形状から、ほとんどがバチルス属細菌のコロニーであることが判断できる。この結果から、上記の芽胞形成ステップ及び殺菌ステップによって、汚泥中のバチルス属細菌の割合を増加させることができたことが示される。
【００４７】
（全細菌のコロニーの形成）
上記の芽胞形成ステップ及び殺菌ステップを行なっていない汚泥サンプルを、上記と同様の方法により０．５％塩化ナトリウム溶液を用いて１０−２、１０−４、１０−６、１０−８倍に段階希釈した。各希釈段階のサンプル２００μＬを上記の寒天培地に塗布後、３７℃に設定したインキュベーター内で１２時間培養した。出現したコロニー数を測定した。希釈倍率と培地に塗布した容量（２００μＬ）をもとに、汚泥サンプル原液１ｍＬあたりの全細菌数を算出した。その結果、汚泥サンプル原液中に、３．０×１０９個／ｍＬのバチルス属細菌が存在することが明らかとなった。
【００４８】
（実施例２）
第１系統の生物的排水処理設備の脱窒槽、硝化槽、２次脱窒槽及び再曝気槽並びに第２系統の生物的排水処理設備の硝化槽から定期的に汚泥サンプルを採取し、実施例１と同様の方法により、全細菌数及びバチルス属細菌数を測定した。表１及び図２（ａ）に汚泥サンプル原液１ｍＬあたりの全細菌数の測定値及びグラフを示し、表２及び図２（ｂ）に汚泥サンプル原液１ｍＬあたりのバチルス属細菌数の測定値及びグラフを示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
（比較例１）
特許文献１の記載に基づいて、従来法によるバチルス属細菌数の測定を行った。
【００５２】
（寒天培地の作製）
ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製ＣＭ−１）８ｇ、ぶどう糖８ｇ、ＮａＣｌ ６ｇ、寒天１５ｇを蒸留水に溶解後、１Ｌにメスアップした。この溶液を実施例１の寒天培地と同様にオートクレーブし、滅菌シャーレ中で固化させた。培地が固化したらビニール袋に入れ、冷蔵庫中で保存した。
【００５３】
（汚泥サンプルの採取）
実施例２と同様にして生物的排水処理設備から定期的に汚泥サンプルを採取した。
【００５４】
（コロニーの形成）
回収した汚泥サンプルを実施例１と同様にして段階希釈し、上記の寒天培地に塗布した。３７℃に設定したインキュベーター内で２４時間培養し、全細菌のコロニーを形成させた。
【００５５】
（コロニーの測定）
コロニーの形状をもとにバチルス属細菌のコロニーであるか否かを判断し、バチルス属細菌のコロニー数を測定した。コロニーの色調が白色であること、周辺が鮮明であること、表面が艶なしであり、皺状であることをバチルス属細菌のコロニーであると判断する指標とした。また、全コロニー数を測定し、全細菌のコロニー数とした。表３及び図３（ａ）に汚泥サンプル原液１ｍＬあたりの全細菌数の測定値及びこれをプロットしたグラフを示し、表４及び図３（ｂ）に汚泥サンプル原液１ｍＬあたりのバチルス属細菌数の測定値及びこれをプロットしたグラフを示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例１のバチルス属細菌のコロニーの写真を示す。
【図２】実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】比較例１の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス属細菌の簡易測定法に関する。より詳細には、生物的排水処理設備の汚泥において、バチルス属細菌の割合を増加させる方法、バチルス属細菌数を測定する方法及びこれらを利用した生物的排水処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物的排水処理設備の汚泥中には様々な細菌が存在しているが、それらの菌種の一つにＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属細菌がある。バチルス属細菌は土壌細菌の１種であり、棒状の形状をした桿菌である。
【０００３】
汚泥構成細菌群の中でもバチルス属細菌は非常に有用である。バチルス属細菌は、栄養源の除去能力だけではなく、強力な脱臭能力を持つ。また、排水中のバチルス属細菌を含む浮遊物質を凝集させる、固液分離作用に優れている。さらに、ＢＯＤ（生物化学的酸素要求量）からの汚泥転換率が低いため、余剰汚泥を低減できるとされている。悪臭が少なく、固液分離が安定している汚泥中には、バチルス属細菌の割合が増加していることが知られている。
【０００４】
したがって、バチルス属細菌の割合を人為的に増加させれば、排水処理能力、経済性の両面において、優れた排水処理が可能となる。また、バチルス属細菌がどの程度存在しているかを測定できれば、バチルス属細菌数が少ない場合には、バチルス属細菌数を増加させる対策を講じることが可能となる。以上のことから、排水処理施設において、バチルス属細菌の割合を増加させることと、バチルス属細菌数を測定することは重要である。
【０００５】
バチルス属細菌の性質として、貧栄養や低温、高温、低酸素などの悪条件下において芽胞を形成し、休眠状態に入ることが挙げられる。そして、活動可能な条件下に戻ると再び発芽して栄養細胞を形成し、活発に活動を開始する。芽胞とは、一部の細菌が形成する、極めて耐久性の高い細胞構造である。
【０００６】
特許文献１には、バチルス属細菌数を測定する方法が開示されている。それによると、多種多様な細菌群が必要とする栄養源を配合した寒天培地に、段階希釈した汚泥を塗布し、約４８時間培養する。続いて形成されたコロニーの形状及び胞子形成の有無を肉眼及び顕微鏡を用いて観察し、バチルス属細菌のコロニーであるか否かを視覚的に判定する。次いでバチルス属細菌のコロニー数を測定する。
【０００７】
非特許文献１には、全細菌中のバチルス属細菌の割合を求める方法が記載されている。それによると、段階希釈した汚泥サンプルを培地上に塗布し、３２℃の恒温槽で１週間培養して、全細菌のコロニーを形成させる。ここで、バチルス属細菌のコロニーは放射状に増殖するため、真円に近い形状を呈する他の細菌のコロニーと見分けることができるとされている。形成された全細菌のコロニー数及びバチルス属細菌のコロニー数を測定し、バチルス属細菌の優占化率を算出する。
【特許文献１】特開平１０−１５５４９８
【非特許文献１】青井透、「群馬県内各下水処理施設におけるバチルス菌分布調査と県内新活性汚泥法適用事例の実態調査」、新活性汚泥技術研究会、平成１５年研究助成報告書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１や非特許文献１の方法では、コロニーの形状でバチルス属細菌か否かを判断し、バチルス属細菌数を測定する必要があった。このため、ある程度訓練した人間でなければ検査できないという問題があった。また、バチルス属細菌とそれ以外の細菌のコロニーが混在している培地上で、バチルス属細菌を測定する必要があり、手間や時間がかかるという問題があった。
【０００９】
そこで本発明の目的は、汚泥中のバチルス属細菌数を簡単、迅速に測定する方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させる方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、上記のバチルス属細菌の割合を増加させる方法を利用した生物的排水処理方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、上記のバチルス属細菌数を測定する方法を利用した生物的排水処理方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
バチルス属細菌が他の細菌と際立って異なる性質は芽胞の形成能力を有する点である。バチルス菌は貧栄養や低温、高温、低酸素などの悪条件下で芽胞を形成し休眠状態に入ると考えられている。そこで、採取した汚泥サンプルを悪条件下に置き、バチルス属細菌に芽胞を形成させる（芽胞形成ステップ）。続いて汚泥サンプルを殺菌条件下に置くと、芽胞を形成したバチルス属細菌は生存し、芽胞を形成しなかった他の細菌は死滅する（殺菌ステップ）。この汚泥中ではバチルス属細菌の割合が増加している。また、この汚泥サンプルを寒天培地などの上で培養しコロニーを形成させることにより、バチルス属細菌のみの数を測定することが可能となる。
【００１１】
芽胞を形成する細菌には、バチルス属細菌の他にもクロストリジウム属細菌、スポロサルシナ属細菌などが知られている。しかしながら、クロストリジウム属細菌やスポロサルシナ属細菌は嫌気性細菌であるため、バチルス属細菌と同じ培地ではコロニーを形成しない。また、発明者らは、汚泥中にはバチルス属細菌以外の芽胞を作る細菌がほとんど存在せず、本発明の方法により、ほぼバチルス属細菌のみの数を測定可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
１つの態様において、本発明は、生物的排水処理設備の汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させる方法であって、汚泥中の細菌に芽胞を形成させる芽胞形成ステップと、芽胞形成ステップ後の汚泥を殺菌する殺菌ステップとを含む方法を提供する。
【００１３】
上述したように、バチルス属細菌は、栄養源の除去、脱臭、固液分離作用、余剰汚泥の低減などに優れた効果を発揮するため、生物的排水処理設備の汚泥においてバチルス属細菌の割合を増加させることにより、高い排水処理能力と優れた経済性を実現することができる。
【００１４】
また、芽胞形成ステップを含むことにより、バチルス属細菌を確実に芽胞化することができるため、より効率よくバチルス属細菌の割合を増加させることが可能である。
【００１５】
別の態様において、本発明は、生物的排水処理設備の汚泥中のバチルス属細菌数を測定する方法であって、汚泥中の細菌に芽胞を形成させる芽胞形成ステップと、芽胞形成ステップ後の汚泥を殺菌する殺菌ステップと、殺菌ステップ後の汚泥を培養してバチルス属細菌のコロニーを形成させる培養ステップと、コロニー数を測定して汚泥中のバチルス属細菌数を算出する算出ステップとを含む方法を提供する。
【００１６】
この方法により培地上に形成されるコロニーは、ほとんどバチルス属細菌のもののみである。したがってコロニーの形状からバチルス属細菌であるか否かを判断する必要がないため、特定の訓練を受けていない人間でも簡便に測定を行うことが可能である。また、出現するコロニーはバチルス属細菌のコロニーのみであるため、効率よく測定を行うことができる。
【００１７】
また、芽胞形成ステップを含むことにより、バチルス属細菌を確実に芽胞化することができるため、より正確にバチルス属細菌数を測定することが可能である。
【００１８】
バチルス属細菌がどの程度存在しているかを測定できれば、バチルス属細菌数が少ない場合には、生物的排水処理設備における曝気量、汚泥の返送量又は投入排水量などを調整することにより、或いはバチルス属細菌を多く含む汚泥を移入するなどの対策を講じることにより、バチルス属細菌数を増加させ、汚泥の排水処理能力と経済性を向上させることが可能となる。
【００１９】
上記の培養ステップにおいては、殺菌ステップ後の汚泥を２５〜３８℃で４〜２４時間培養することが好ましい。
【００２０】
バチルス属細菌はその他の細菌と比較して成長が速いため、万一バチルス属細菌以外の菌が混入していた場合でも、上記の条件で形成されるコロニーはほとんどバチルス属細菌のものである。このため、より正確にバチルス属細菌数を測定することが可能である。また、上記の条件で形成させたコロニーが大きさや形状などの点で測定しやすい。
【００２１】
上記の芽胞形成ステップは、０〜１２℃、１〜２４時間の低温処理によるものであり、上記の殺菌ステップは、８０〜９５℃、０．５〜１時間の高温処理によるものであることが好ましい。
【００２２】
芽胞形成ステップには、後述するように多様な手段が存在するが、０〜１２℃、１〜２４時間の低温処理は、簡単な設備により低コストで実施することが可能であるため好ましい。同様に、殺菌ステップには、後述するように多様な手段が存在するが、８０〜９５℃、０．５〜１時間の高温処理は簡単な設備で低コストに実施可能であるため好ましい。
【００２３】
別の態様において、本発明は、上記の方法により、汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させた汚泥を、生物的排水処理設備に導入するステップを含む、生物的排水処理方法を提供する。
【００２４】
この方法によれば、生物的排水処理設備の汚泥中のバチルス属細菌の割合を人為的に増加させ、排水処理能力、経済性の両面において、優れた排水処理を行なうことが可能である。
【００２５】
別の態様において、本発明は、上記の方法により、生物的排水処理設備の汚泥中のバチルス属細菌数を測定するステップと、測定されたバチルス属細菌数に基づいて、生物的排水処理設備における曝気量、汚泥の返送量及び投入排水量からなる群から選択される１つ以上の因子を変化させるステップとを含む、生物的排水処理方法を提供する。
【００２６】
この方法により、生物的排水処理設備における曝気量、汚泥の返送量又は投入排水量などの因子を適切に調整することにより、バチルス属細菌数を増加させ、汚泥の排水処理能力と経済性を向上させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
１つの態様において、本発明は、生物的排水処理設備の汚泥中の、バチルス属細菌の割合を増加させる方法を提供する。
【００２８】
まず、バチルス属細菌の割合を増加させたい汚泥を生物的排水処理設備から採取する。生物的排水処理設備は、その構成によって、脱窒槽、硝化槽、２次脱窒槽、再曝気槽などを含む場合があるが、いずれの処理槽においてもこの方法を適用することができる。採取する汚泥の量は対象とする処理槽中の汚泥全量であってもよいし、その一部であってもよい。後者の場合には、バチルス属細菌の割合を増加させた汚泥を処理槽に戻す操作を繰り返すことにより、バチルス属細菌の割合をさらに高めることが可能である。
【００２９】
続いて、採取した汚泥を芽胞形成ステップに供する。芽胞形成ステップは、バチルス属細菌に芽胞を形成させる条件であれば特に限定されない。例えば、酸素濃度を０〜１体積％にする低酸素処理、０〜１２℃、１〜２４時間の低温処理、５０〜６０℃、１〜６時間の高温処理、水分含量を０〜５質量％にする乾燥処理などによって実施することができる。しかしながら、設備が簡単で、低コストに実施することが可能である点で０〜１２℃、１〜２４時間、より好ましくは４〜１２℃、５〜２４時間、特に好ましくは４℃、２４時間の低温処理により実施することが好ましい。低温処理は、例えば汚泥を入れた容器を冷蔵庫や冷蔵室内に放置することで行ってもよいし、汚泥の入った容器中に冷却装置を投入して行ってもよい。
【００３０】
続いて、芽胞形成ステップ後の汚泥を殺菌ステップに供する。殺菌ステップはバチルス属細菌の芽胞が死滅せず、それ以外の細菌が死滅する条件であれば特に限定されない。例えば、８０〜９５℃、０．５〜１時間の高温処理などによって実施することができる。しかしながら、設備が簡単で、低コストに実施することが可能である点で８０〜９５℃、０．５〜１時間、より好ましくは８０〜８５℃、０．５〜１時間、特に好ましくは８０℃、０．５時間の高温処理により実施することが好ましい。高温処理は、例えば汚泥を入れた容器を８０℃に調整したウォーターバスに浸して行ってもよいし、汚泥の入った容器中に加熱装置を投入して行ってもよい。
【００３１】
殺菌処理後の汚泥中には芽胞を形成したバチルス属細菌が生存し、それ以外の細菌がほとんど死滅しているため、バチルス属細菌の割合が高まっている。殺菌処理後の汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合は、汚泥の排水処理能力が高い点で、３〜３０％となっていることが好ましい。
【００３２】
続いてバチルス属細菌の割合を増加させた汚泥を生物的排水処理設備に移入する。芽胞を形成していたバチルス属細菌は再び活発に活動を開始し、排水処理が可能な状態となる。
【００３３】
別の態様において、本発明は、生物的排水処理設備の汚泥中の、バチルス属細菌数を測定する方法を提供する。
【００３４】
まず、バチルス属細菌数を測定したい汚泥を生物的排水処理設備から採取する。生物的排水処理設備は、その構成によって、脱窒槽、硝化槽、２次脱窒槽、再曝気槽などを含む場合があるが、いずれの処理槽においてもこの方法を適用することができる。汚泥の採取量は５〜２０ｍＬ程度でよい。
【００３５】
続いて、採取した汚泥を上記と同様にして、芽胞形成ステップ及び殺菌ステップに供する。
【００３６】
殺菌ステップ後の汚泥中には芽胞を形成したバチルス属細菌が生存し、それ以外の細菌がほとんど死滅している。この汚泥を段階希釈して、一定容量、例えば２００μＬを寒天培地上に塗布し、インキュベーター内で培養してバチルス属細菌のコロニーを形成させる。培地は一般的なものでよく、例えば本願実施例１に示した培地でよい。どの希釈段階がコロニー数の測定に適しているかわからないため、数段階の希釈した汚泥を寒天培地で培養することが好ましい。およそ１０万倍に希釈すると適当なコロニー数が得られる場合が多い。寒天培地に塗布した細菌は、２５〜３８℃で４〜２４時間、より好ましくは３５〜３８℃で６〜１２時間、特に好ましくは３７℃で１２時間培養することが好ましい。
【００３７】
バチルス属細菌はその他の細菌と比較して成長が速いため、バチルス属細菌以外の菌が混入していた場合でも、上記の条件で形成されるコロニーはほとんどバチルス属細菌のものである。このため、より正確にバチルス属細菌数を測定することが可能である。また、上記の条件で形成させたコロニーが大きさや形状などの点で測定しやすい。
【００３８】
続いて、測定した寒天培地上のコロニー数、寒天培地に塗布した容量及び希釈倍率をもとに、汚泥原液中のバチルス属細菌数（個／ｍＬ）を算出することができる。
【００３９】
また、芽胞形成ステップ及び殺菌ステップを行なわず、採取した汚泥を上記と同様にして寒天培地上に塗布して培養し、コロニー数を測定することにより、汚泥中の全細菌数を測定することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。
【００４１】
（実施例１）
（寒天培地の作製）
肉エキス（Ｌａｂ−Ｌｅｍｃｏ社、ＬＰ００２９）１０ｇ、ペプトン（Ｌａｂ−Ｌｅｍｃｏ社、ＬＰ００３７）１０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、寒天２０ｇを蒸留水に溶解後、塩酸又は水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．０に調整し、１Ｌにメスアップした。この溶液を三角フラスコに入れてシリコン栓をセットし、オートクレーブを用いて１２１℃３０分滅菌した。オートクレーブ後、培地が冷めて固まる前に、クリーンベンチ内で滅菌シャーレに分注した。寒天が固まるまでシャーレのふたを開け、室温で固化させた。培地が固化したらビニール袋に入れ、冷蔵庫中で保存した。
【００４２】
（汚泥サンプルの採取）
生物的排水処理設備の硝化槽より、２５ｍＬの汚泥サンプルを試験管に採取した。
【００４３】
（芽胞形成ステップ）
採取した汚泥サンプルを冷蔵庫に入れ、４℃で２４時間静置し、バチルス属細菌に芽胞を形成させた。
【００４４】
（殺菌ステップ）
芽胞形成ステップ後の汚泥サンプルを８０℃に設定したウォーターバス中に設置し、３０分間放置した。これにより芽胞を形成しなかった細菌を死滅させた。
【００４５】
（バチルス属細菌のコロニーの形成）
上記の殺菌ステップ後の汚泥サンプルをホモジナイザーで１０秒間撹拌し、均一に懸濁した。４．５ｍＬの滅菌した０．５％塩化ナトリウム溶液に、汚泥サンプル０．５ｍＬを加えて撹拌し、１０倍希釈サンプルを調製した。この操作を繰り返し、汚泥サンプルを段階希釈した。１０−２、１０−４、１０−６、１０−８倍に段階希釈した汚泥サンプル各２００μＬをそれぞれ上記の寒天培地に塗布後、３７℃に設定したインキュベーター内で１２時間培養した。図１に、出現したバチルス属細菌のコロニーの写真を示す。図１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）はそれぞれ１０−２、１０−４、１０−６、１０−８倍に希釈したサンプルを培養した結果である。出現したコロニー数を測定し、希釈倍率と培地に塗布した容量（２００μＬ）をもとに、汚泥サンプル原液１ｍＬあたりのバチルス属細菌数を算出した。その結果、汚泥サンプル原液中に、１．０×１０９個／ｍＬのバチルス属細菌が存在することが明らかとなった。
【００４６】
図１の写真において、形成されたコロニーの形状から、ほとんどがバチルス属細菌のコロニーであることが判断できる。この結果から、上記の芽胞形成ステップ及び殺菌ステップによって、汚泥中のバチルス属細菌の割合を増加させることができたことが示される。
【００４７】
（全細菌のコロニーの形成）
上記の芽胞形成ステップ及び殺菌ステップを行なっていない汚泥サンプルを、上記と同様の方法により０．５％塩化ナトリウム溶液を用いて１０−２、１０−４、１０−６、１０−８倍に段階希釈した。各希釈段階のサンプル２００μＬを上記の寒天培地に塗布後、３７℃に設定したインキュベーター内で１２時間培養した。出現したコロニー数を測定した。希釈倍率と培地に塗布した容量（２００μＬ）をもとに、汚泥サンプル原液１ｍＬあたりの全細菌数を算出した。その結果、汚泥サンプル原液中に、３．０×１０９個／ｍＬのバチルス属細菌が存在することが明らかとなった。
【００４８】
（実施例２）
第１系統の生物的排水処理設備の脱窒槽、硝化槽、２次脱窒槽及び再曝気槽並びに第２系統の生物的排水処理設備の硝化槽から定期的に汚泥サンプルを採取し、実施例１と同様の方法により、全細菌数及びバチルス属細菌数を測定した。表１及び図２（ａ）に汚泥サンプル原液１ｍＬあたりの全細菌数の測定値及びグラフを示し、表２及び図２（ｂ）に汚泥サンプル原液１ｍＬあたりのバチルス属細菌数の測定値及びグラフを示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
（比較例１）
特許文献１の記載に基づいて、従来法によるバチルス属細菌数の測定を行った。
【００５２】
（寒天培地の作製）
ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製ＣＭ−１）８ｇ、ぶどう糖８ｇ、ＮａＣｌ ６ｇ、寒天１５ｇを蒸留水に溶解後、１Ｌにメスアップした。この溶液を実施例１の寒天培地と同様にオートクレーブし、滅菌シャーレ中で固化させた。培地が固化したらビニール袋に入れ、冷蔵庫中で保存した。
【００５３】
（汚泥サンプルの採取）
実施例２と同様にして生物的排水処理設備から定期的に汚泥サンプルを採取した。
【００５４】
（コロニーの形成）
回収した汚泥サンプルを実施例１と同様にして段階希釈し、上記の寒天培地に塗布した。３７℃に設定したインキュベーター内で２４時間培養し、全細菌のコロニーを形成させた。
【００５５】
（コロニーの測定）
コロニーの形状をもとにバチルス属細菌のコロニーであるか否かを判断し、バチルス属細菌のコロニー数を測定した。コロニーの色調が白色であること、周辺が鮮明であること、表面が艶なしであり、皺状であることをバチルス属細菌のコロニーであると判断する指標とした。また、全コロニー数を測定し、全細菌のコロニー数とした。表３及び図３（ａ）に汚泥サンプル原液１ｍＬあたりの全細菌数の測定値及びこれをプロットしたグラフを示し、表４及び図３（ｂ）に汚泥サンプル原液１ｍＬあたりのバチルス属細菌数の測定値及びこれをプロットしたグラフを示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例１のバチルス属細菌のコロニーの写真を示す。
【図２】実施例２の結果を示すグラフである。
【図３】比較例１の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物的排水処理設備の汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させる方法であって、
当該汚泥中の細菌に芽胞を形成させる芽胞形成ステップと、
芽胞形成ステップ後の当該汚泥を殺菌する殺菌ステップと
を含む方法。
【請求項２】
生物的排水処理設備の汚泥中のバチルス属細菌数を測定する方法であって、
当該汚泥中の細菌に芽胞を形成させる芽胞形成ステップと、
芽胞形成ステップ後の当該汚泥を殺菌する殺菌ステップと、
殺菌ステップ後の当該汚泥を培養してバチルス属細菌のコロニーを形成させる培養ステップと、
当該コロニー数を測定して汚泥中のバチルス属細菌数を算出する算出ステップと
を含む方法。
【請求項３】
前記培養ステップにおいて、前記殺菌ステップ後の汚泥を２５〜３８℃で４〜２４時間培養する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記芽胞形成ステップが０〜１２℃、１〜２４時間の低温処理によるものであり、前記殺菌ステップが８０〜９５℃、０．５〜１時間の高温処理によるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法により、汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させた汚泥を、生物的排水処理設備に導入するステップを含む、生物的排水処理方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法により、生物的排水処理設備の汚泥中のバチルス属細菌数を測定するステップと、
測定されたバチルス属細菌数に基づいて、生物的排水処理設備における曝気量、汚泥の返送量及び投入排水量からなる群から選択される１つ以上の因子を変化させるステップと
を含む、生物的排水処理方法。
【請求項１】
生物的排水処理設備の汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させる方法であって、
当該汚泥中の細菌に芽胞を形成させる芽胞形成ステップと、
芽胞形成ステップ後の当該汚泥を殺菌する殺菌ステップと
を含む方法。
【請求項２】
生物的排水処理設備の汚泥中のバチルス属細菌数を測定する方法であって、
当該汚泥中の細菌に芽胞を形成させる芽胞形成ステップと、
芽胞形成ステップ後の当該汚泥を殺菌する殺菌ステップと、
殺菌ステップ後の当該汚泥を培養してバチルス属細菌のコロニーを形成させる培養ステップと、
当該コロニー数を測定して汚泥中のバチルス属細菌数を算出する算出ステップと
を含む方法。
【請求項３】
前記培養ステップにおいて、前記殺菌ステップ後の汚泥を２５〜３８℃で４〜２４時間培養する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記芽胞形成ステップが０〜１２℃、１〜２４時間の低温処理によるものであり、前記殺菌ステップが８０〜９５℃、０．５〜１時間の高温処理によるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法により、汚泥中の全細菌に対するバチルス属細菌の割合を増加させた汚泥を、生物的排水処理設備に導入するステップを含む、生物的排水処理方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法により、生物的排水処理設備の汚泥中のバチルス属細菌数を測定するステップと、
測定されたバチルス属細菌数に基づいて、生物的排水処理設備における曝気量、汚泥の返送量及び投入排水量からなる群から選択される１つ以上の因子を変化させるステップと
を含む、生物的排水処理方法。
【図２】
【図３】
【図１】
【図３】
【図１】
【公開番号】特開２０１０−８２５９０（Ｐ２０１０−８２５９０Ａ）
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２５６７１４（Ｐ２００８−２５６７１４）
【出願日】平成２０年１０月１日（２００８．１０．１）
【出願人】（５９８０６７６０３）住重環境エンジニアリング株式会社 (36)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１日（２００８．１０．１）
【出願人】（５９８０６７６０３）住重環境エンジニアリング株式会社 (36)
【Ｆターム（参考）】
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