ヒアルロニダーゼ阻害剤
【課題】
皮膚の保湿等に寄与するヒアルロン酸に由来するアルロニダーゼ阻害剤と、該阻害剤を含むシワ形成抑制剤とを提供する。
【解決手段】
本発明は、ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体からなることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤を提供する。前記ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体は、ホスホリルコリンヒアルロン酸である場合がある。前記誘導体は、ヒアルロン酸の主要な機能である保湿性が維持されている上、ホスホリルコリン基の導入により親水性及び生体適合性が高められており、また、ヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼの活性を阻害する能力を有する。また本発明は、前記ヒアルロニダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするシワ形成抑制剤を提供する。
皮膚の保湿等に寄与するヒアルロン酸に由来するアルロニダーゼ阻害剤と、該阻害剤を含むシワ形成抑制剤とを提供する。
【解決手段】
本発明は、ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体からなることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤を提供する。前記ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体は、ホスホリルコリンヒアルロン酸である場合がある。前記誘導体は、ヒアルロン酸の主要な機能である保湿性が維持されている上、ホスホリルコリン基の導入により親水性及び生体適合性が高められており、また、ヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼの活性を阻害する能力を有する。また本発明は、前記ヒアルロニダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするシワ形成抑制剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体を含むヒアルロニダーゼ阻害剤と、該ヒアルロニダーゼ阻害剤を含むシワ形成抑制剤とを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸とが交互に結合してできた直鎖状の高分子多糖である。水分保持能力が非常に高く、皮膚、関節、脳等の生体内の細胞外マトリックスに存在し、細胞間隙への水分の保持、組織内へのゼリー状のマトリックス形成による細胞の保持、組織の潤滑性及び柔軟性の保持、機械的障害等の外力に対する抵抗力付与等、多くの機能を有する。
【０００３】
皮膚のヒアルロン酸量は加齢とともに減少し、それに伴い、小じわやかさつき等老化に伴う皮膚の外観の変化が現れるといわれる。このような背景からヒアルロン酸を配合した化粧料及び薬剤が多数提案されている。しかしヒアルロン酸を配合する従来の化粧料及び薬剤は、皮膚における保湿効果を発揮するが、本質的に皮膚の状態を改善し得るものではない。その理由は、皮膚のヒアルロン酸が迅速に分解されるためと考えられている。皮膚のヒアルロン酸の半減期は約１日であるとの報告がある（非特許文献１）。
【非特許文献１】Ｔａｍｍｉ Ｒ． ｅｔ．ａｌ．， Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９７，１２６−１３０（１９９１） ヒアルロニダーゼは、グリコシド結合を切断することによりヒアルロン酸を分解する酵素の総称である。ヒアルロニダーゼは生体内に広く分布し皮膚にも存在する。皮膚のヒアルロニダーゼが活性化されると、皮膚結合組織のヒアルロン酸が分解され、皮膚の弾力性及び保湿性低下、しわの発生等につながる。したがってヒアルロニダーゼ活性を阻害することが皮膚の弾力性及び保湿性の維持、しわの発生抑制等に寄与すると考えられる。
【０００４】
クロモグリク酸ナトリウム、トラニラストのような既存の抗アレルギー剤、アスピリン、インドメタシンのような抗炎症薬等はヒアルロニダーゼ活性阻害能を有し、該阻害能が治療効果の発揮に一定の役割を果たすことが示唆されている（非特許文献２及び３）。
【非特許文献２】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３３，６４２（１９８５）
【非特許文献３】掛川寿夫ら、炎症，４，４３７（１９８４） このような背景から種々のヒアルロニダーゼ阻害剤と、該阻害剤を含む化粧料及び薬剤等とが開発されている。例えば特許文献１では、グルクロン酸誘導体およびガラクトサミン誘導体から構成されるオリゴ糖を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤、抗アレルギー剤及び抗炎症剤が開示される。また特許文献２ではアセロラ種子の抽出物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤及び化粧料等が開示される。しかしこれらのヒアルロニダーゼ阻害剤は、化学的にヒアルロン酸と関連がなく、水分保持能力のようなヒアルロン酸の特性を共有しない。
【特許文献１】特開平５−１７８８７６号公開特許公報
【特許文献２】特開２００４−１７５８５６号公開特許公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
水分保持能力を有し皮膚の保湿等に寄与するヒアルロン酸自体の機能と、ヒアルロニダーゼ活性阻害能とを併せ持つ化合物は、化粧料又は薬剤の成分として有用であり、開発する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体からなることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤を提供する。
【０００７】
前記ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体は、ホスホリルコリンヒアルロン酸である場合がある。
【０００８】
本発明は、前記ヒアルロニダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするシワ形成抑制剤を提供する。
【０００９】
本発明の「ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体」とは、ヒアルロン酸又はその誘導体と、ホスホリルコリン基とを結合させた物質である。これによりヒアルロン酸の主要な機能である保湿性が維持されている上にホスホリルコリン基の導入により親水性及び生体適合性が高められている。
【００１０】
ホスホリルコリン基は、以下の化学式（１）で示される構造を有する官能基である。
【００１１】
【化１】
【００１２】
化学式（１）
本発明のホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体の製造方法は、特開２００３−３０１００１号公開特許公報に開示されている。すなわち、前記誘導体の製造方法は、（１）グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応を行うことによりホスホリルコリン基を有するアルデヒド体（以下、「ホスホリルコリンアルデヒド体」という。）を調製するステップと、（２）ヒアルロン酸とジアミンとのアミド化反応を行うことによりアミノ基を有するヒアルロン酸誘導体（以下、「アミノ基含有ヒアルロン酸誘導体」という。）を調製するステップと、（３）前記ホスホリルコリンアルデヒド体と前記アミノ基含有ヒアルロン酸誘導体との還元的アミノ化反応を行うステップとを含む。
【００１３】
前記製造方法により製造されるホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体は、以下の化学式（２）で示されるホスホリルコリンヒアルロン酸の場合がある。
【００１４】
【化２】
【００１５】
化学式（２）
化学式（２）においてｎは２以上の整数である。
【００１６】
本発明の「ヒアルロニダーゼ」とは、グリコシド結合を切断することによりヒアルロン酸を分解する酵素の総称である。切断されるグリコシド結合はグルクロニド結合又はＮ−アセチルグルコサミニド結合の場合がある。
【００１７】
本発明の「ヒアルロニダーゼ阻害剤」とは、ヒアルロニダーゼのヒアルロン酸分解活性（以下、「ヒアルロニダーゼ活性」という。）を阻害する薬剤をいう。
【００１８】
ヒアルロニダーゼ阻害剤のヒアルロニダーゼ活性を阻害する能力（以下、「ヒアルロニダーゼ活性阻害能」という。）の評価方法は、（１）ヒアルロニダーゼ阻害剤候補薬、ヒアルロニダーゼ及びヒアルロン酸を用意するステップと、（２）前記ヒアルロニダーゼ阻害剤候補薬の存在下又は非存在下で前記ヒアルロニダーゼ及び前記ヒアルロン酸を反応液中で混合し、一定時間前記ヒアルロン酸の分解反応を行わせるステップと、（３）前記ヒアルロン酸の分解反応による生成物を定量するステップと、（４）前記ヒアルロニダーゼ阻害剤候補薬の存在下と非存在下とにおける前記ヒアルロン酸の分解反応による生成物の定量値を比較するステップとを含むのが一般的である。
【００１９】
前記ヒアルロニダーゼ活性阻害能の評価方法におけるステップ（３）で定量される生成物は、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸とが交互に連結した四糖の場合がある。
【００２０】
前記ヒアルロニダーゼ活性阻害能の評価方法におけるステップ（３）における生成物の定量方法は、前記生成物を高速液体クロマトグラフィーにより定量する方法か、前記生成物の還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミンとエールリッヒ試薬との反応を利用して定量する方法かの場合がある。
【００２１】
前記ヒアルロニダーゼ活性阻害能の評価方法におけるステップ（４）では、前記ヒアルロニダーゼ阻害剤候補薬の存在下と非存在下とにおける前記ヒアルロン酸の分解反応による生成物の定量値の比較により、該候補薬によりヒアルロニダーゼ活性が阻害された度合いを評価できる。また、前記候補薬の存在下における生成物の定量値が前記候補薬の非存在下における生成物の定量値の５０％となるときの前記候補薬濃度を５０％阻害濃度（ＩＣ５０）といい、ヒアルロニダーゼ活性阻害能の指標として使用する場合がある。
【００２２】
本発明のシワ形成抑制剤は、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤を有効成分として含み、シワの発生抑制の効果を得ることを目的として使用することができる。本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤はホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体であり、好ましくはホスホリルコリンヒアルロン酸である。Ｂｏｓｎｉａｋ， Ｓ．ら、Ａｒｃｈ． Ｆａｃｉａｌ Ｐｌａｓｔ． Ｓｕｒｇ．，６；Ｎｏｖ／Ｄｅｃ， ３７９−３８３（２００４）が報告するように、ヒアルロン酸製剤、例えば、非動物性安定化ヒアルロン酸（ＮＡＳＨＡ）は顔のシワ（ｒｈｙｔｉｄｓ）の治療薬として欧米その他で承認されている。本発明のシワ形成抑制剤はヒアルロン酸の誘導体であり、保水能力の高いゲルを形成するので、前記ヒアルロン酸製剤と同様にシワ抑制作用があると考えられる。そのうえで本発明のシワ形成抑制剤にはヒアルロニダーゼ阻害活性があるため、ヒアルロニダーゼに対して難分解性であるのでシワ形成抑制効果が持続すると考えられる。
【００２３】
本発明のシワ形成抑制剤は、剤形に応じ通常の方法により製造することができる。その剤形は、本発明の効果を損なわないものであれば特に限定されない。例えば、ローション剤、ゲル剤、クリーム、軟膏、カプセル剤、エアゾール剤及びシート状製品等の任意の剤形を採用することができる。
【００２４】
また、本発明のシワ形成抑制剤には、他の有効成分や生理学的に許容可能な賦形剤、色素、香料等の添加物を組み合わせて配合することができる。例えば、本発明の効果を損なわない範囲で、化粧品又は薬剤に配合し得る油脂類、保湿剤、色素、香料、栄養素、抗菌剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤等を配合することができる。
【００２５】
本発明のシワ形成抑制剤において、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤の配合量は特に限定されないが、いずれも化粧料及び薬剤の全量中０．０００５〜２０重量％であることが好ましい。さらに好ましくは０．００１〜１０重量％である。
【００２６】
本発明のシワ形成抑制剤の使用方法は、皮膚へ直接塗布又は散布する経皮投与か、あるいは、局部皮下又は皮内注射による投与かを採用することができるがこれらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に実施例を示すが、これらは実施態様の例示を意図しており本発明の範囲を限定することは意図しない。
【実施例１】
【００２８】
１．ホスホリルコリンヒアルロン酸の調製
１．１．グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応によるホスホリルコリンアルデヒド体の調製
Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン（４５０ｍｇ）を蒸留水１５ｍＬに溶解し、氷水浴中で冷却する。過ヨウ素酸ナトリウム（７５０ｍｇ）を添加し、２時間攪拌した。更にエチレングリコール（１５０ｍｇ）を添加して１時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより目的物質を抽出した。構造式を化学式（３）に示す。
【００２９】
【化３】
【００３０】
化学式（３）
１．２．ヒアルロン酸とジアミンとのアミド化反応によるアミノ基含有ヒアルロン酸誘導体（アミノヒアルロン酸）の調製
ヒアルロン酸１ｇとエチレンジアミン（１０ｍｌ）を蒸留水１０ｍＬに溶解し、ｐＨ５に調整する。１｛３−（ジメチルアミノ）プロピル｝３−エチルカルボジイミド塩酸塩１．５ｇを徐添加した。室温で１晩攪拌した後、反応液を水中で透析し、凍結乾燥により目的物１．２ｇを得た。構造式を化学式（４）に示す。
【００３１】
【化４】
【００３２】
化学式（４）
１．３．ホスホリルコリンアルデヒド体とアミノヒアルロン酸との還元的アミノ化によるホスホリルコリンヒアルロン酸の調製
１．１のホスホリルコリンアルデヒド体１ｇを１．２のアミノヒアルロン酸（１ｇ）水溶液（１５ｍＬ）に添加し、５時間室温で攪拌した。水素化シアノホウ素酸ナトリウム５００ｍｇを添加し、一晩攪拌した。透析、凍結乾燥により精製し、目的物１．２ｇを得た。構造式を化学式（５）に示す。
【００３３】
【化５】
【００３４】
化学式（５）
【実施例２】
【００３５】
２．ホスホリルコリンヒアルロン酸のヒアルロニダーゼ活性阻害能の評価
２．１．ヒアルロン酸の分解反応
０．１％ヒアルロン酸（分子量約８６万）１００μＬと、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）と、ヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）２０Ｕとを混合した。前記混合物に、阻害剤としてコンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、アセチル化ヒアルロン酸（ＡｃＨＡ）及びホスホリルコリンヒアルロン酸（ＰＣ−ＨＡ）をそれぞれ、最終濃度が０、０．００５、０．０１５、０．０５、０．１５、０．５％となるように添加し反応液２００μLを得た。前記反応液を３７℃で８時間インキュベーションした。
【００３６】
２．２．ヒアルロン酸の分解反応液の分析
ＨＰＬＣシステム（ナノスペースＳＩ−２、資生堂）を使用して、前記各反応後液の分析を行った。分析条件は以下である。カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ １０／３００ＧＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、カラム温度：室温、注入量：３０μＬ、移動相：１０ｍＭ酢酸アンモニウム／メタノール（８：２）、流速：０．６ｍＬ／分、検出：ＵＶ（２１０ｎｍ）。
【００３７】
２．３．ヒアルロニダーゼ活性阻害能の評価
ヒアルロン酸の分解反応による生成物である四糖（以下「ＨＡ−四糖」という。）を指標とし、ヒアルロニダーゼ活性阻害能を評価した。阻害剤を添加せずに（最終濃度０％で）インキュベーションを行った反応後液をＨＰＬＣで分析した際のクロマトグラムにおけるＨＡ−四糖のピーク面積に対する、阻害剤を添加した反応後液についてのＨＡ−四糖のピーク面積の割合を算出し、該割合の減少度により活性阻害能を評価した。また活性阻害能の定量化のために、ＨＡ−四糖のピーク面積が阻害剤を添加しない水準の５０％となる阻害剤濃度を５０％阻害濃度（ＩＣ５０）として算出した。なお、阻害剤の陽性対照として、ヒアルロニダーゼ活性阻害能を有することが知られているコンドロイチン硫酸Ａ及びＣを使用した。
【００３８】
２．４．結果
図１に、各ヒアルロニダーゼ阻害剤のヒアルロニダーゼ活性阻害能の評価結果を示す。ＰＣ−ＨＡはコンドロイチン硫酸Ａと同様に濃度０．０５％でＨＡ−四糖のピーク面積を大幅に減少させ、０．１５％でほぼゼロにまで減少させた。表１に各阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。ＰＣ−ＨＡのＩＣ５０はコンドロイチン硫酸Ｃよりはやや高いが、コンドロイチン硫酸Ａと同等の５０μｇ／ｍＬであった。図１及び表１より、ホスホリルコリンヒアルロン酸は、コンドロイチン硫酸Ａと同程度のヒアルロニダーゼ活性阻害能を有することが確認された。
【００３９】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ヒアルロニダーゼ阻害剤の阻害活性を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体を含むヒアルロニダーゼ阻害剤と、該ヒアルロニダーゼ阻害剤を含むシワ形成抑制剤とを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸とが交互に結合してできた直鎖状の高分子多糖である。水分保持能力が非常に高く、皮膚、関節、脳等の生体内の細胞外マトリックスに存在し、細胞間隙への水分の保持、組織内へのゼリー状のマトリックス形成による細胞の保持、組織の潤滑性及び柔軟性の保持、機械的障害等の外力に対する抵抗力付与等、多くの機能を有する。
【０００３】
皮膚のヒアルロン酸量は加齢とともに減少し、それに伴い、小じわやかさつき等老化に伴う皮膚の外観の変化が現れるといわれる。このような背景からヒアルロン酸を配合した化粧料及び薬剤が多数提案されている。しかしヒアルロン酸を配合する従来の化粧料及び薬剤は、皮膚における保湿効果を発揮するが、本質的に皮膚の状態を改善し得るものではない。その理由は、皮膚のヒアルロン酸が迅速に分解されるためと考えられている。皮膚のヒアルロン酸の半減期は約１日であるとの報告がある（非特許文献１）。
【非特許文献１】Ｔａｍｍｉ Ｒ． ｅｔ．ａｌ．， Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９７，１２６−１３０（１９９１） ヒアルロニダーゼは、グリコシド結合を切断することによりヒアルロン酸を分解する酵素の総称である。ヒアルロニダーゼは生体内に広く分布し皮膚にも存在する。皮膚のヒアルロニダーゼが活性化されると、皮膚結合組織のヒアルロン酸が分解され、皮膚の弾力性及び保湿性低下、しわの発生等につながる。したがってヒアルロニダーゼ活性を阻害することが皮膚の弾力性及び保湿性の維持、しわの発生抑制等に寄与すると考えられる。
【０００４】
クロモグリク酸ナトリウム、トラニラストのような既存の抗アレルギー剤、アスピリン、インドメタシンのような抗炎症薬等はヒアルロニダーゼ活性阻害能を有し、該阻害能が治療効果の発揮に一定の役割を果たすことが示唆されている（非特許文献２及び３）。
【非特許文献２】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３３，６４２（１９８５）
【非特許文献３】掛川寿夫ら、炎症，４，４３７（１９８４） このような背景から種々のヒアルロニダーゼ阻害剤と、該阻害剤を含む化粧料及び薬剤等とが開発されている。例えば特許文献１では、グルクロン酸誘導体およびガラクトサミン誘導体から構成されるオリゴ糖を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤、抗アレルギー剤及び抗炎症剤が開示される。また特許文献２ではアセロラ種子の抽出物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤及び化粧料等が開示される。しかしこれらのヒアルロニダーゼ阻害剤は、化学的にヒアルロン酸と関連がなく、水分保持能力のようなヒアルロン酸の特性を共有しない。
【特許文献１】特開平５−１７８８７６号公開特許公報
【特許文献２】特開２００４−１７５８５６号公開特許公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
水分保持能力を有し皮膚の保湿等に寄与するヒアルロン酸自体の機能と、ヒアルロニダーゼ活性阻害能とを併せ持つ化合物は、化粧料又は薬剤の成分として有用であり、開発する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体からなることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤を提供する。
【０００７】
前記ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体は、ホスホリルコリンヒアルロン酸である場合がある。
【０００８】
本発明は、前記ヒアルロニダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするシワ形成抑制剤を提供する。
【０００９】
本発明の「ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体」とは、ヒアルロン酸又はその誘導体と、ホスホリルコリン基とを結合させた物質である。これによりヒアルロン酸の主要な機能である保湿性が維持されている上にホスホリルコリン基の導入により親水性及び生体適合性が高められている。
【００１０】
ホスホリルコリン基は、以下の化学式（１）で示される構造を有する官能基である。
【００１１】
【化１】
【００１２】
化学式（１）
本発明のホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体の製造方法は、特開２００３−３０１００１号公開特許公報に開示されている。すなわち、前記誘導体の製造方法は、（１）グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応を行うことによりホスホリルコリン基を有するアルデヒド体（以下、「ホスホリルコリンアルデヒド体」という。）を調製するステップと、（２）ヒアルロン酸とジアミンとのアミド化反応を行うことによりアミノ基を有するヒアルロン酸誘導体（以下、「アミノ基含有ヒアルロン酸誘導体」という。）を調製するステップと、（３）前記ホスホリルコリンアルデヒド体と前記アミノ基含有ヒアルロン酸誘導体との還元的アミノ化反応を行うステップとを含む。
【００１３】
前記製造方法により製造されるホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体は、以下の化学式（２）で示されるホスホリルコリンヒアルロン酸の場合がある。
【００１４】
【化２】
【００１５】
化学式（２）
化学式（２）においてｎは２以上の整数である。
【００１６】
本発明の「ヒアルロニダーゼ」とは、グリコシド結合を切断することによりヒアルロン酸を分解する酵素の総称である。切断されるグリコシド結合はグルクロニド結合又はＮ−アセチルグルコサミニド結合の場合がある。
【００１７】
本発明の「ヒアルロニダーゼ阻害剤」とは、ヒアルロニダーゼのヒアルロン酸分解活性（以下、「ヒアルロニダーゼ活性」という。）を阻害する薬剤をいう。
【００１８】
ヒアルロニダーゼ阻害剤のヒアルロニダーゼ活性を阻害する能力（以下、「ヒアルロニダーゼ活性阻害能」という。）の評価方法は、（１）ヒアルロニダーゼ阻害剤候補薬、ヒアルロニダーゼ及びヒアルロン酸を用意するステップと、（２）前記ヒアルロニダーゼ阻害剤候補薬の存在下又は非存在下で前記ヒアルロニダーゼ及び前記ヒアルロン酸を反応液中で混合し、一定時間前記ヒアルロン酸の分解反応を行わせるステップと、（３）前記ヒアルロン酸の分解反応による生成物を定量するステップと、（４）前記ヒアルロニダーゼ阻害剤候補薬の存在下と非存在下とにおける前記ヒアルロン酸の分解反応による生成物の定量値を比較するステップとを含むのが一般的である。
【００１９】
前記ヒアルロニダーゼ活性阻害能の評価方法におけるステップ（３）で定量される生成物は、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸とが交互に連結した四糖の場合がある。
【００２０】
前記ヒアルロニダーゼ活性阻害能の評価方法におけるステップ（３）における生成物の定量方法は、前記生成物を高速液体クロマトグラフィーにより定量する方法か、前記生成物の還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミンとエールリッヒ試薬との反応を利用して定量する方法かの場合がある。
【００２１】
前記ヒアルロニダーゼ活性阻害能の評価方法におけるステップ（４）では、前記ヒアルロニダーゼ阻害剤候補薬の存在下と非存在下とにおける前記ヒアルロン酸の分解反応による生成物の定量値の比較により、該候補薬によりヒアルロニダーゼ活性が阻害された度合いを評価できる。また、前記候補薬の存在下における生成物の定量値が前記候補薬の非存在下における生成物の定量値の５０％となるときの前記候補薬濃度を５０％阻害濃度（ＩＣ５０）といい、ヒアルロニダーゼ活性阻害能の指標として使用する場合がある。
【００２２】
本発明のシワ形成抑制剤は、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤を有効成分として含み、シワの発生抑制の効果を得ることを目的として使用することができる。本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤はホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体であり、好ましくはホスホリルコリンヒアルロン酸である。Ｂｏｓｎｉａｋ， Ｓ．ら、Ａｒｃｈ． Ｆａｃｉａｌ Ｐｌａｓｔ． Ｓｕｒｇ．，６；Ｎｏｖ／Ｄｅｃ， ３７９−３８３（２００４）が報告するように、ヒアルロン酸製剤、例えば、非動物性安定化ヒアルロン酸（ＮＡＳＨＡ）は顔のシワ（ｒｈｙｔｉｄｓ）の治療薬として欧米その他で承認されている。本発明のシワ形成抑制剤はヒアルロン酸の誘導体であり、保水能力の高いゲルを形成するので、前記ヒアルロン酸製剤と同様にシワ抑制作用があると考えられる。そのうえで本発明のシワ形成抑制剤にはヒアルロニダーゼ阻害活性があるため、ヒアルロニダーゼに対して難分解性であるのでシワ形成抑制効果が持続すると考えられる。
【００２３】
本発明のシワ形成抑制剤は、剤形に応じ通常の方法により製造することができる。その剤形は、本発明の効果を損なわないものであれば特に限定されない。例えば、ローション剤、ゲル剤、クリーム、軟膏、カプセル剤、エアゾール剤及びシート状製品等の任意の剤形を採用することができる。
【００２４】
また、本発明のシワ形成抑制剤には、他の有効成分や生理学的に許容可能な賦形剤、色素、香料等の添加物を組み合わせて配合することができる。例えば、本発明の効果を損なわない範囲で、化粧品又は薬剤に配合し得る油脂類、保湿剤、色素、香料、栄養素、抗菌剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤等を配合することができる。
【００２５】
本発明のシワ形成抑制剤において、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤の配合量は特に限定されないが、いずれも化粧料及び薬剤の全量中０．０００５〜２０重量％であることが好ましい。さらに好ましくは０．００１〜１０重量％である。
【００２６】
本発明のシワ形成抑制剤の使用方法は、皮膚へ直接塗布又は散布する経皮投与か、あるいは、局部皮下又は皮内注射による投与かを採用することができるがこれらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に実施例を示すが、これらは実施態様の例示を意図しており本発明の範囲を限定することは意図しない。
【実施例１】
【００２８】
１．ホスホリルコリンヒアルロン酸の調製
１．１．グリセロホスホリルコリンの酸化的開裂反応によるホスホリルコリンアルデヒド体の調製
Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン（４５０ｍｇ）を蒸留水１５ｍＬに溶解し、氷水浴中で冷却する。過ヨウ素酸ナトリウム（７５０ｍｇ）を添加し、２時間攪拌した。更にエチレングリコール（１５０ｍｇ）を添加して１時間攪拌した。反応液を減圧濃縮、減圧乾燥し、メタノールにより目的物質を抽出した。構造式を化学式（３）に示す。
【００２９】
【化３】
【００３０】
化学式（３）
１．２．ヒアルロン酸とジアミンとのアミド化反応によるアミノ基含有ヒアルロン酸誘導体（アミノヒアルロン酸）の調製
ヒアルロン酸１ｇとエチレンジアミン（１０ｍｌ）を蒸留水１０ｍＬに溶解し、ｐＨ５に調整する。１｛３−（ジメチルアミノ）プロピル｝３−エチルカルボジイミド塩酸塩１．５ｇを徐添加した。室温で１晩攪拌した後、反応液を水中で透析し、凍結乾燥により目的物１．２ｇを得た。構造式を化学式（４）に示す。
【００３１】
【化４】
【００３２】
化学式（４）
１．３．ホスホリルコリンアルデヒド体とアミノヒアルロン酸との還元的アミノ化によるホスホリルコリンヒアルロン酸の調製
１．１のホスホリルコリンアルデヒド体１ｇを１．２のアミノヒアルロン酸（１ｇ）水溶液（１５ｍＬ）に添加し、５時間室温で攪拌した。水素化シアノホウ素酸ナトリウム５００ｍｇを添加し、一晩攪拌した。透析、凍結乾燥により精製し、目的物１．２ｇを得た。構造式を化学式（５）に示す。
【００３３】
【化５】
【００３４】
化学式（５）
【実施例２】
【００３５】
２．ホスホリルコリンヒアルロン酸のヒアルロニダーゼ活性阻害能の評価
２．１．ヒアルロン酸の分解反応
０．１％ヒアルロン酸（分子量約８６万）１００μＬと、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）と、ヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）２０Ｕとを混合した。前記混合物に、阻害剤としてコンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、アセチル化ヒアルロン酸（ＡｃＨＡ）及びホスホリルコリンヒアルロン酸（ＰＣ−ＨＡ）をそれぞれ、最終濃度が０、０．００５、０．０１５、０．０５、０．１５、０．５％となるように添加し反応液２００μLを得た。前記反応液を３７℃で８時間インキュベーションした。
【００３６】
２．２．ヒアルロン酸の分解反応液の分析
ＨＰＬＣシステム（ナノスペースＳＩ−２、資生堂）を使用して、前記各反応後液の分析を行った。分析条件は以下である。カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ １０／３００ＧＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、カラム温度：室温、注入量：３０μＬ、移動相：１０ｍＭ酢酸アンモニウム／メタノール（８：２）、流速：０．６ｍＬ／分、検出：ＵＶ（２１０ｎｍ）。
【００３７】
２．３．ヒアルロニダーゼ活性阻害能の評価
ヒアルロン酸の分解反応による生成物である四糖（以下「ＨＡ−四糖」という。）を指標とし、ヒアルロニダーゼ活性阻害能を評価した。阻害剤を添加せずに（最終濃度０％で）インキュベーションを行った反応後液をＨＰＬＣで分析した際のクロマトグラムにおけるＨＡ−四糖のピーク面積に対する、阻害剤を添加した反応後液についてのＨＡ−四糖のピーク面積の割合を算出し、該割合の減少度により活性阻害能を評価した。また活性阻害能の定量化のために、ＨＡ−四糖のピーク面積が阻害剤を添加しない水準の５０％となる阻害剤濃度を５０％阻害濃度（ＩＣ５０）として算出した。なお、阻害剤の陽性対照として、ヒアルロニダーゼ活性阻害能を有することが知られているコンドロイチン硫酸Ａ及びＣを使用した。
【００３８】
２．４．結果
図１に、各ヒアルロニダーゼ阻害剤のヒアルロニダーゼ活性阻害能の評価結果を示す。ＰＣ−ＨＡはコンドロイチン硫酸Ａと同様に濃度０．０５％でＨＡ−四糖のピーク面積を大幅に減少させ、０．１５％でほぼゼロにまで減少させた。表１に各阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。ＰＣ−ＨＡのＩＣ５０はコンドロイチン硫酸Ｃよりはやや高いが、コンドロイチン硫酸Ａと同等の５０μｇ／ｍＬであった。図１及び表１より、ホスホリルコリンヒアルロン酸は、コンドロイチン硫酸Ａと同程度のヒアルロニダーゼ活性阻害能を有することが確認された。
【００３９】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ヒアルロニダーゼ阻害剤の阻害活性を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体からなることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項２】
前記ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体はホスホリルコリンヒアルロン酸であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするシワ形成抑制剤。
【請求項１】
ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体からなることを特徴とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項２】
前記ホスホリルコリン基を有するヒアルロン酸誘導体はホスホリルコリンヒアルロン酸であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のヒアルロニダーゼ阻害剤を含むことを特徴とするシワ形成抑制剤。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１１４０７３（Ｐ２００９−１１４０７３Ａ）
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２８５１８５（Ｐ２００７−２８５１８５）
【出願日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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