ヒトＣ型肝炎ウイルスの全長ゲノムを含む核酸構築物及び該核酸構築物を導入した組換え全長ウイルスゲノム複製細胞、並びにＣ型肝炎ウイルス粒子の作製方法
本発明は、ＨＣＶ全長ゲノム配列を含むＲＮＡを効率良く複製する方法、及び全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを含有するＨＣＶウイルス粒子を細胞培養系により製造する方法を提供する。また本発明は、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスの全長ゲノムＲＮＡ配列と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列とを含む塩基配列からなるレプリコンＲＮＡ、あるいは遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスの全長ゲノムＲＮＡを導入した細胞を培養して、培養物中にウイルス粒子を産生させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法に関する。さらに本発明は、Ｃ型肝炎ワクチン及びＣ型肝炎ウイルス粒子に対する抗体にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの全長ゲノムを含む核酸構築物、Ｃ型肝炎ウイルス粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの作製方法、及び作製したＣ型肝炎ウイルス粒子の使用に関する。
【背景技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ、ＨＣＶ）は、フラビウイルス科に属する、一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡをゲノムとするウイルスであり、Ｃ型肝炎の原因となることが知られている。
ＨＣＶは持続的に感染することにより慢性肝炎を引き起こす。現在、世界的規模で認められる慢性肝炎の主たる原因がＨＣＶ持続感染である。実際、持続感染者の５０％程度が慢性肝炎を発症し、そのうち約２０％の患者が１０年〜２０年を経て肝硬変に移行し、さらにその一部は肝癌といった致死的な病態へと進展する。
Ｃ型肝炎に対する現在の主な治療は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、及びインターフェロン−αとプリン−ヌクレオシド誘導体であるリバビリンとの併用療法により行われている。しかしながら、これらの治療を行っても、全治療者の約６０％に治療効果が認められるだけであり、効果が出た後に治療を中止すると半分以上の患者が再燃する。
工業国において罹患率が高く、最終的に深刻な結果を招き、かつ現在は原因治療法が存在しないＣ型肝炎に対する効果的な治療薬又は予防薬の開発は重要な目標である。そのため、ＨＣＶ特異的な化学療法、ワクチン療法の発展が切望されている。抗ＨＣＶ薬開発のターゲットとしては、ＨＣＶの複製抑制やＨＣＶの細胞感染の抑制が考えられる。
最近になって、ＨＣＶ由来の自律複製能を有するＲＮＡとして、ＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンシステムが作製された（特許文献１、２及び３、非特許文献１〜４）。ＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンシステムは、ＨＣＶゲノムの構造遺伝子を取り除いて代わりに選択薬剤マーカー遺伝子を挿入したＨＣＶレプリコンＲＮＡを作製し、そのレプリコンＲＮＡを培養細胞内に導入し、細胞内でレプリコンＲＮＡを自律的に複製させるシステムである。これにより、培養細胞を用いてＨＣＶの複製機構を解析することが可能になったが、これはＨＣＶウイルスの増殖複製過程におけるウイルスＲＮＡ複製のみを評価することが可能な実験系であり、ＨＣＶウイルス粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程は解析できない。
現在、ＨＣＶウイルス粒子の形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程を評価する方法としては、チンパンジーなどの動物を用いた実験系しかない（非特許文献５）。しかしながら、動物という生体をそのまま用いた実験系は、煩雑で解析が極めて困難である。したがって、ＨＣＶウイルス粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程を解析および、これらの過程の阻害を作用メカニズムとした抗ＨＣＶ薬を作製するには、これらの過程を再現できる極めて単純化した実験系、すなわち、培養実験系でのＨＣＶウイルス粒子の作製系を構築する必要がある。
また、細胞培養系を用いて安定してＨＣＶウイルス粒子を供給可能になれば、ウイルスを弱毒化したり、分子生物学的手法を用いて非感染性のＨＣＶウイルスを作製したりして、それをワクチンに用いることができる。
【特許文献１】 特開２００１−１７１８７号公報
【特許文献２】 国際出願ＰＣＴ／ＪＰ０３／１５０３８
【特許文献３】 特願２００３−３２９０８２
【非特許文献１】 Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９）２８５，ｐ．１１０−１１３
【非特許文献２】 Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０００）２９０，ｐ．１９７２−１９７４
【非特許文献３】 Ｆｒｉｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００１）７５（２４）：ｐ．１２０４７−１２０５７
【非特許文献４】 Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００２）７６（６）：ｐ．２９９７−３００６
【非特許文献５】 Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９７）２７７，ｐ．５７０−５７４
【非特許文献６】 Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，（２００３）１２５，ｐ．１８０８−１８１７
【非特許文献７】 Ｙａｎａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（１９９７）９６（１６）：ｐ．８７３８−８７４３
【非特許文献８】 Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，（１９９１）７３，ｐ ２６９７−２６７０４
【非特許文献９】 Ａｏｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（１９９９）３７（６）：ｐ．１８０２−１８０５
【発明の開示】
本発明は、これまで成功していない、ＨＣＶ全長ゲノム配列を含むＲＮＡを効率良く複製する方法、及び全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを含有するＨＣＶウイルス粒子を細胞培養系により製造する方法、を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ＨＣＶウイルス粒子を細胞培養系で作製する方法を開発した。すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡの、５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列と、を含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡ。
このレプリコンＲＮＡにおいては、好ましくは、前記塩基配列が、前記の５’非翻訳領域、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域を、５’から３’方向へこの順番で含む。
このレプリコンＲＮＡのより好ましい実施形態では、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡが、配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡである。
このレプリコンＲＮＡのさらに好ましい実施形態では、５’非翻訳領域が配列番号１に示す塩基配列からなり、ｃｏｒｅタンパク質コード配列が配列番号２に示す塩基配列からなり、Ｅ１タンパク質コード配列が配列番号３に示す塩基配列からなり、Ｅ２タンパク質コード配列が配列番号４に示す塩基配列からなり、ＮＳ２タンパク質コード配列が配列番号５に示す塩基配列からなり、ＮＳ３タンパク質コード配列が配列番号６に示す塩基配列からなり、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列が配列番号７に示す塩基配列からなり、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列が配列番号８に示す塩基配列からなり、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列が配列番号９に示す塩基配列からなり、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列が配列番号１０に示す塩基配列からなり、３’非翻訳領域が配列番号１１に示す塩基配列からなる。
［２］以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡ。
（ａ）配列番号１３に示す塩基配列からなるＲＮＡ。
（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列において１〜１００個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＲＮＡであって、自律複製能及びウイルス粒子産生能を有するＲＮＡ。
［３］上記［１］又は［２］記載のいずれかのレプリコンＲＮＡを細胞に導入することを含む、該レプリコンＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生する細胞を製造する方法。
この方法では、細胞が増殖性細胞であることが好ましい。あるいは、この方法における細胞は、真核細胞であることが好ましい。
この方法では、好ましくは、真核細胞はヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞である。さらに好ましくは、真核細胞がＨｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞である。
［４］上記［３］記載の方法により製造される、レプリコンＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生する細胞。
［５］上記［４］記載の細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法。
［６］上記［５］記載の方法により製造される、Ｃ型肝炎ウイルス粒子。
［７］上記［４］記載の細胞を培養し、培養物中のウイルス粒子を他の細胞に感染させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞を製造する方法。
［８］上記［７］記載の方法によって製造される、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞。
［９］被験物質の存在下で、下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）上記［４］記載の細胞
（ｂ）上記［８］記載のＣ型肝炎ウイルス感染細胞、並びに
（ｃ）上記［６］記載のＣ型肝炎ウイルス粒子及びＣ型肝炎ウイルス感受性細胞、
のうちの少なくとも１つを培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡ又はウイルス粒子を検出することを含む、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。
［１０］上記［６］記載のＣ型肝炎ウイルス粒子又はその一部分を含有するＣ型肝炎ワクチン。
［１１］上記［６］記載のＣ型肝炎ウイルス粒子又はその一部分を抗原として使用して、Ｃ型肝炎ワクチンを製造する方法。
［１２］上記［１］又は［２］記載のいずれかのレプリコンＲＮＡを使用して、遺伝子治療のための肝細胞指向性ウイルスベクターを製造する方法。
［１３］上記［１２］に記載の方法により製造される、肝細胞指向性ウイルスベクター。
［１４］外来遺伝子をコードするＲＮＡを上記［１］又は［２］記載のいずれかのレプリコンＲＮＡ中に挿入し、それを細胞中に導入することを含む、該細胞内で外来遺伝子を複製及び／又は発現させる方法。
［１５］配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡを細胞に導入することを含む、該ＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生する細胞を製造する方法。
［１６］配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡを細胞に導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法。
［１７］細胞が増殖性細胞である、上記［１５］又は［１６］記載の方法。
［１８］配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡに外来遺伝子をコードするＲＮＡを挿入し、それを細胞に導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、外来遺伝子を含有するウイルスベクターを製造する方法。
［１９］上記［６］記載のＣ型肝炎ウイルス粒子に対する抗体。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−０４５４８９号の明細書及び図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを作製するための鋳型ＤＮＡの構築手順を示す概略図である。図１の上段は、Ｔ７プロモーターの下流に全長ＨＣＶゲノムを挿入して作製したプラスミドクローンｐＪＦＨ１の構造を示す。図１の下段は、ｐＪＦＨ１のＴ７プロモーターと５’非翻訳領域の下流にネオマイシン耐性遺伝子とＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含むＤＮＡ断片を挿入した、全長ＨＣＶゲノム配列を含むプラスミドクローンｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の構造を示す。図中の記号は以下のとおりである。Ｔ７：Ｔ７ＲＮＡプロモーター、５’ＵＴＲ：５’非翻訳領域、Ｃ：コアタンパク質、Ｅ１、Ｅ２：エンベロープタンパク質。ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、４Ａ、４Ｂ：非構造タンパク質。３’ＵＴＲ：３’非翻訳領域。Ａｇｅ Ｉ、Ｐｍｅ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ：制限酵素Ａｇｅ Ｉ、Ｐｍｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉの切断部位。ＧＤＤ：ＮＳ５Ｂタンパク質の活性中心に相当するアミノ酸モチーフＧＤＤの位置。ｎｅｏ：ネオマイシン耐性遺伝子、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位）。
図２は、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡであるｒＪＦＨ−１を導入したＨｕｈ７細胞におけるｒＪＦＨ−１の複製を示すノーザンブロット解析の結果を示す写真である。
図３は、培地中のＨＣＶコアタンパク質の定量の結果を示す。白抜きの円はｒＪＦＨ１を導入した細胞、黒塗りの円はｒＪＦＨ１／ＧＮＤを導入した細胞を示す。
図４は、ｒＪＦＨ−１を導入したＨｕｈ７細胞の培養上清をショ糖密度勾配により分画した各画分についての、ＨＣＶコアタンパク質量及び全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ量、並びに比重を示すグラフである。黒塗りの円はＨＣＶコア（ｃｏｒｅ）タンパク質、白抜きの円は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ、網掛けの円は比重を示す。
図５は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡであるｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞のコロニー形成を示す写真である。
図６は、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＨｕｈ７細胞へのトランスフェクションにより樹立した全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンにおける、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製を示す写真である。
図７は、ゲノムＤＮＡ中へのネオマイシン耐性遺伝子の組み込みの有無を確認するための、宿主細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ネオマイシン耐性遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した結果を示す写真である。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー、Ｐ：陽性対照、Ｎ：Ｈｕｈ７細胞。
図８は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡであるｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７細胞におけるｃｏｒｅタンパク質の発現を示すウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図９は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡであるｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７細胞におけるＮＳ３タンパク質の発現を示すウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図１０は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡであるｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質の発現を示すウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図１１は、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７細胞の培養上清をショ糖密度勾配により分画した各画分についての、ＨＣＶ ｃｏｒｅタンパク質の量及び全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ量、並びに比重を示すグラフである。黒塗りの円はＨＣＶコア（ｃｏｒｅ）タンパク質、白抜きの円は全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ、網掛けの円は比重を示す。
図１２は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞の培養上清に含まれるウイルス粒子を添加したＨｕｈ７細胞のコロニー形成を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のゲノムは、約９６００ヌクレオチドからなる（＋）鎖の一本鎖ＲＮＡである。このゲノムＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ又は５’ＵＴＲとも表記する）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ又は３’ＵＴＲとも表記する）からなる。その構造領域にはＨＣＶの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
このようなＨＣＶの構造タンパク質（ｃｏｒｅ、Ｅ１、及びＥ２）と非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質（すなわち、ＨＣＶのウイルスタンパク質）のうち、ｃｏｒｅはコアタンパク質であり、Ｅ１及びＥ２はエンベロープタンパク質である。非構造タンパク質はウイルス自身の複製に関与するタンパク質であり、ＮＳ２はメタロプロテアーゼ活性、ＮＳ３はセリンプロテアーゼ活性（Ｎ末端側の３分の１）とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有することが知られている。さらに、ＮＳ４ＡはＮＳ３のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有することも報告されている。
本発明者らは、ＨＣＶゲノムＲＮＡを用いて、自律的に複製可能であり、かつウイルス粒子産生能を有するレプリコンＲＮＡを構築した。
本明細書では、自律複製能を有しておりＨＣＶゲノムＲＮＡを改変して作製されたＲＮＡを、「レプリコンＲＮＡ」又は「ＲＮＡレプリコン」と称する。本明細書においてＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡは、ＨＣＶ−ＲＮＡレプリコンとも称する。本明細書では、ＨＣＶゲノムＲＮＡの全長を含む本発明のレプリコンＲＮＡを、「全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ」と呼ぶ。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、ウイルス粒子産生能を有する。
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの好適な実施形態では、Ｃ型肝炎ウイルスは、限定するものではないが、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスであることが好ましい。本発明において、「遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルス」「遺伝子型２ａのＨＣＶ」とは、Ｓｉｍｍｏｎｄｓら（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，（１９９４）１０，ｐ．１３２１−１３２４を参照）による国際分類に従って遺伝子型２ａと同定されるＣ型肝炎ウイルスを意味する。本発明における「遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルス」「遺伝子型２ａのＨＣＶ」には、天然由来のＨＣＶゲノムＲＮＡを有するウイルスだけでなく、天然由来のＨＣＶゲノム配列に人為的な改変を加えたゲノムＲＮＡを有するウイルスも包含する。遺伝子型２ａのＨＣＶの具体例としては、ＪＦＨ−１株（特開２００２−１７１９７８号公報を参照）が挙げられる。
本明細書において「Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ」とは、Ｃ型肝炎ウイルスの一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡからなるゲノムの全長にわたる塩基配列を有するＲＮＡを意味する。限定するものではないが、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡとしては、配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡが好ましい。
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの一つの実施形態は、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列と、を含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡである。
限定するものではないが、好ましくは、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、５’非翻訳領域、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域を、５’から３’方向へこの順番で含む。
本明細書において、「５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ又は５’ＵＴＲ）」、「ｃｏｒｅタンパク質コード配列（ｃｏｒｅ領域又はＣ領域）」、「Ｅ１タンパク質コード配列（Ｅ１領域）」、「Ｅ２タンパク質コード配列（Ｅ２領域）」、「Ｎ２タンパク質コード配列（ＮＳ２領域）」、「ＮＳ３タンパク質コード配列（ＮＳ３領域）」、「ＮＳ４Ａタンパク質コード配列（ＮＳ４Ａ領域）」、「ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列（ＮＳ４Ｂ領域）」、「ＮＳ５Ａタンパク質コード配列（ＮＳ５Ａ領域）」、「ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列（ＮＳ５Ｂ領域）」、及び「３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ又は３’ＵＴＲ）」、並びにその他の特定の領域若しくは部位は、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスであるＪＦＨ−１株（特開２００２−１７１９７８号公報）のゲノムの全領域からなる全長ゲノムＲＮＡ（配列番号１２）を基準として定めることができる。
あるいは、本願発明におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム中の部分領域又はその部位は、ＪＦＨ−１株のゲノムＲＮＡ（配列番号１２）の部分塩基配列である配列番号１〜１１に示す配列を基準として定めることもできる。ＪＦＨ−１株の全長ゲノムＲＮＡ（ＪＦＨ−１クローン由来）（配列番号１２）の「５’非翻訳領域」は、配列番号１に示す塩基配列からなる。また、「ｃｏｒｅタンパク質コード配列」は配列番号２に示す塩基配列からなる。「Ｅ１タンパク質コード配列」は、配列番号３に示す塩基配列からなる。「Ｅ２タンパク質コード配列」は、配列番号４に示す塩基配列からなる。「ＮＳ２タンパク質コード配列」は、配列番号５に示す塩基配列からなる。「ＮＳ３タンパク質コード配列」は、配列番号６に示す塩基配列からなる。「ＮＳ４Ａタンパク質コード配列」は、配列番号７に示す塩基配列からなる。「ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列」は、配列番号８に示す塩基配列からなる。「ＮＳ５Ａタンパク質コード配列」は、配列番号９に示す塩基配列からなる。「ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列」は、配列番号１０に示す塩基配列からなる。「３’非翻訳領域」は、配列番号１１に示す塩基配列からなる。
例えば、ＨＣＶ由来のＲＮＡ配列中の領域又は部位は、そのＲＮＡ配列を配列番号１〜１２に示す塩基配列に対してアラインメントし、配列番号１〜１２の配列中の塩基番号を基準として定めてもよい。このようなアラインメントにおいては、配列間でギャップ、付加、欠失、置換等が存在していてもよい。
本発明のさらなる好適な実施形態では、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡに含まれる５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域が、それぞれ配列番号１〜１１に示す塩基配列を有することが好ましい。
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの好適な実施形態は、配列番号１〜１１に示す塩基配列と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列と、からなるレプリコンＲＮＡである。
本発明において「選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現された細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。但し本発明における選択マーカー遺伝子はこれらに限定されるものではない。
また本発明において「リポーター遺伝子」とは、その遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。リポーター遺伝子の一般的な例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ若しくはβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のエクオリン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。但し本発明におけるリポーター遺伝子はこれらに限定されるものではない。
上記の選択マーカー遺伝子やリポーター遺伝子は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡに１つ含まれていてもよいし、２つ以上含まれていてもよい。
本発明における「ＩＲＥＳ配列」とは、ＲＮＡの内部にリボソームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。本発明におけるＩＲＥＳ配列の好適な例としては、以下に限定するものではないがＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、ＦＭＤＶ ＩＲＥＳ、ＨＣＶ ＩＲＥＳ、等が挙げられるが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、及びＨＣＶ ＩＲＥＳがより好ましく、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳが最も好ましい。
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡのさらに好ましい１つの実施形態は、配列番号１３に示す塩基配列からなるＲＮＡである。さらに、この配列番号１３に示す塩基配列において、１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜６個、最も好ましくは１〜数個（２〜５個）の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＲＮＡであって、かつ、自律複製能及びウイルス粒子産生能を有するＲＮＡも、好適な実施形態として本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの範囲に含まれる。
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、その全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを導入する細胞内で発現させたい任意の外来遺伝子をコードするＲＮＡをさらに含んでもよい。外来遺伝子をコードするＲＮＡは、５’非翻訳領域の下流に連結してもよいし、選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子の上流又は下流に連結させてもよいし、３’非翻訳領域の上流に連結してもよい。また、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、及びＮＳ５Ｂタンパク質コード配列のいずれかの間に挿入してもよい。
外来遺伝子をコードするＲＮＡを含む全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、導入された細胞内で翻訳される際に、該外来遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現することができる。従って外来遺伝子をコードするＲＮＡを含む全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、外来遺伝子の遺伝子産物を細胞内で生成させることを目的とする場合にも、好適に使用することができる。
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、リボザイムを含んでいてもよい。全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子の下流にリボザイムを連結しておき、そのリボザイムの自己切断活性によって、選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子が、ＩＲＥＳ配列、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域から切り離されるようにすることもできる。
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡにおいては、上述したような選択マーカー遺伝子及び／若しくはリポーター遺伝子、ウイルスタンパク質をコードする配列、並びに外来遺伝子又はリボザイム等が、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡから正しい読み枠で翻訳されるように連結される。全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡにコードされるタンパク質は、一続きのポリペプチドとして翻訳され発現された後でプロテアーゼによって各タンパク質へと切断され、遊離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させることが好ましい。
本発明はまた、本願発明のレプリコンＲＮＡをコードするＤＮＡベクター、好ましくは発現ベクターにも関する。
なお、本発明においてＲＮＡが「自律複製能を有する」とは、ＲＮＡを細胞中に導入したときに、そのＲＮＡが自己増殖することを意味する。限定するものではないが、ＲＮＡの自律複製能は、例えば、対象とするＲＮＡをＨｕｈ７細胞中にトランスフェクションし、そのＨｕｈ７細胞を培養し、得られる培養物中の細胞から抽出したＲＮＡについて、導入したＲＮＡを特異的に検出可能なプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションによりＲＮＡを検出することによって、確認することができる。自律複製能を確認するための具体的な操作は、本明細書の実施例に記載されたコロニー形成能の測定、ＨＣＶタンパク質の発現確認、レプリコンＲＮＡの検出等の記載に例示されている。
さらに本発明において、ＲＮＡが「ウイルス粒子産生能を有する」とは、そのＲＮＡを細胞（例えば、Ｈｕｈ７細胞などの培養細胞）に導入したときに、該細胞中でウイルス粒子が産生されることを意味する。ウイルス粒子産生能は、例えば、対象とするＲＮＡを導入した細胞の培養上清について、そのＲＮＡに特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法での検出を行う方法、又はその培養上清をショ糖濃度勾配法にかけてウイルス粒子を分離し、ＨＣＶタンパク質を検出する方法などにより、確認することができる。これらの具体的な操作は、本明細書の実施例に記載されたコロニー形成能の測定、ＨＣＶタンパク質の発現確認、レプリコンＲＮＡの検出等の記載に例示されている。
２．全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの作製
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、当業者に公知である任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。限定するものではないが、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、例えば遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスとしてＪＦＨ−１株を用いる場合には以下のような方法で作製することができる。
まず、ＪＦＨ−１株のゲノム全領域のＲＮＡ（配列番号１２）に対応するＤＮＡ（この配列は、国際ＤＮＡデータバンクにアクセッション番号ＡＢ０４７６３９として登録されている）を、常法により再構築してＲＮＡプロモーターの下流に挿入して、ＤＮＡクローンを作製する。ここで、「ＲＮＡに対応するＤＮＡ」とは、当該ＲＮＡの塩基配列のＵ（ウラシル）をＴ（チミン）に置き換えた塩基配列からなるＤＮＡを意味する。前記ＲＮＡプロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。好適なＲＮＡプロモーターとしては、限定するものではないが、Ｔ７ ＲＮＡプロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡプロモーター、ＳＰ３ ＲＮＡプロモーターが挙げられるが、Ｔ７ ＲＮＡプロモーターが特に好ましい。
次に、選択マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子、並びにＩＲＥＳ配列をコードするＤＮＡを上記ＤＮＡクローンに挿入する。５’非翻訳領域の下流に、選択マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子を、さらにその下流にＩＲＥＳ配列を、挿入することが好ましい。
次いで、以上のようにして作製されたＤＮＡクローンを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。ＲＮＡ合成は、５’非翻訳領域から、常法により開始させることができる。ＤＮＡクローンがプラスミドクローンの場合には、プラスミドクローンから制限酵素によって切り出したＤＮＡ断片を鋳型として用いてＲＮＡを合成することもできる。なお、合成されるＲＮＡの３’末端がウイルスゲノムＲＮＡの３’非翻訳領域の末端と一致しており、他の配列が付加されたり削除されたりしないことが好ましい。このようにして合成されるＲＮＡが、本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡである。
３．ＨＣＶ粒子の作製
上記のようにして作製される全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを細胞に導入することにより、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを複製することができ、好ましくは持続的に複製することができる（すなわち、レプリコンＲＮＡの複製能を有する）組換え細胞を得ることができる。本明細書では、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを複製している組換え細胞を「全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞」と称する。
この全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞は、ウイルス粒子を産生することができる。産生されたウイルス粒子は、ＨＣＶのウイルスタンパク質から構成されるウイルス殻中に全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを含有する。従って本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞から産生されるウイルス粒子は、ＨＣＶ粒子である。すなわち本発明では、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞を培養することにより、ＨＣＶ粒子を細胞培養系にて作製することができる。好ましくは、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞を培養し、その培養物（好ましくは培養上清）中に産生されたウイルス粒子を採取することにより、ＨＣＶ粒子を取得することができる。
あるいは、ＨＣＶ粒子は、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを導入して得られる組換え細胞によっても産生される。本発明に係る全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ（好ましくはＪＦＨ−１クローン由来の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ、より好ましくは配列番号１２に示す塩基配列を有するＲＮＡ）を導入した細胞では、その全長ＨＣＶゲノムＲＮＡが高効率で複製される。本明細書では、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを複製している組換え細胞を「全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞」と称する。この全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞によって産生されるウイルス粒子は、ＨＣＶのウイルスタンパク質から構成されるウイルス殻中に全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを含有する。すなわち、本発明の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを導入した細胞から産生されるウイルス粒子は、ＨＣＶ粒子である。限定するものではないが、好ましくは、ＪＦＨ−１クローン由来の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ（例えば、配列番号１２に示す塩基配列を有するＲＮＡ）を導入した細胞を培養することによって、ＨＣＶ粒子を細胞培養系にて作製することができる。例えば、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ（例えば、配列番号１２に示す塩基配列を有するＲＮＡ）を導入した細胞を培養し、その培養物（好ましくは、培養上清）中に産生されたＨＣＶ粒子を採取することにより、ＨＣＶ粒子を取得することができる。
上記の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを導入する細胞としては、継代培養することが可能な細胞であれば任意の細胞を用いることができるが、真核細胞であることが好ましく、ヒト細胞であることがより好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがさらに好ましい。これらの細胞としては、癌細胞株や幹細胞株などを含む増殖性細胞が好ましく、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞等がさらに好ましい。これらの細胞は、市販のものを利用してもよいし、細胞寄託機関から入手して使用してもよいし、任意の細胞（例えば癌細胞又は幹細胞）から株化した細胞を使用してもよい。
全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの細胞内への導入は、当業者には公知の任意の技術を使用して行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥセファロース法等が挙げられるが、エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡは、単独で導入してもよいし、他の核酸と混合させたものを導入してもよい。導入するＲＮＡ量を一定にしながら全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの導入量を変更したい場合には、所望の導入量の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを、導入する細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して一定のＲＮＡ総量とし、それを細胞内導入に用いればよい。細胞内導入に用いるレプリコンＲＮＡの量は、使用する導入法に応じて決めればよいが、好ましくは１ピコグラム〜１００マイクログラム、より好ましくは１０ピコグラム〜１０マイクログラムの量を使用する。
全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡに含まれる選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現を利用して、選択することができる。具体的には、例えば、そのような全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの細胞内導入処理を施した細胞を、選択マーカー遺伝子の発現により選択可能となる培地において培養すればよい。あるいは、そのような全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの細胞内導入処理を施した細胞を培養した後、リポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質）の発現について検出すればよい。
一例として、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡにネオマイシン耐性遺伝子が選択マーカー遺伝子として含まれる場合には、その全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを用いてエレクトロポレーション処理した細胞を培養ディッシュに播種し、１２〜７２時間、好ましくは１６〜４８時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を０．０５ミリグラム／ミリリットル〜３．０ミリグラム／ミリリットルの濃度で添加し、その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続し、播種時から好ましくは１０日間〜４０日間、より好ましくは１４日間〜２８日間培養した後にクリスタルバイオレットで生存細胞を染色することにより、導入された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製されている細胞を、コロニーとして選択することができる。
形成されたコロニーからは、常法により細胞をクローン化することができる。こうして得られる全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを複製している細胞クローンを、本明細書では「全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローン」と称する。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンを包含する。
全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞については、複製された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを検出し、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子が細胞の宿主ゲノムＤＮＡに組み込まれていないことを確認し、さらにＨＣＶタンパク質の検出を行うことにより、実際に該細胞又は細胞クローンが全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを複製していることを確認することができる。
複製された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの検出は、当業者には公知の任意のＲＮＡ検出法に従って行えばよいが、例えば、細胞から抽出したトータルＲＮＡについて、導入された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡに対して特異的なＤＮＡ断片をプローブとして用いるノーザンハイブリダイゼーション法を実施することにより検出することができる。
また全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子が細胞の宿主ゲノムＤＮＡに組み込まれていないことの確認は、限定するものではないが、例えば、細胞から抽出したゲノムＤＮＡについて該選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の少なくとも一部を増幅するＰＣＲを行い、その増幅産物の有無を確認することによって行うことができる。増幅産物が確認された細胞では、宿主ゲノム中に選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子が組み込まれていると判断されることから、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ自体は複製されていない可能性がある。この場合、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製されているか否かを、次に説明するＨＣＶタンパク質の検出によって、さらに確認することができる。
ＨＣＶタンパク質の検出は、例えば、導入された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡから発現されるべきＨＣＶタンパク質に対する抗体を、細胞から抽出したタンパク質と反応させることによって行うことができる。この方法は、当業者には公知の任意のタンパク質検出法によって行うことができるが、具体的には、例えば、細胞から抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗ＨＣＶタンパク質抗体（例えば、抗ＮＳ３特異的抗体、又はＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗ＨＣＶタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。細胞から抽出したタンパク質中からＨＣＶタンパク質が検出されれば、その細胞は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを複製し、ＨＣＶタンパク質を発現しているものと判断することができる。
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞のウイルス粒子産生能は、当業者には公知の任意のウイルス検出法に従って確認すればよい。例えば、ウイルス粒子を産生していると思われる細胞の培養上清をショ糖密度勾配により分画し、各分画の密度、ＨＣＶコアタンパク質濃度、及び全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの量を測定した結果、ＨＣＶコアタンパク質と全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡのピークが一致し、しかもそのピークが検出される画分の密度が、培養上清を２５％ＮＰ４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ Ｅｔｈｅｒ］）で処理してから分画した場合の同画分の密度と比較して軽い（例えば、１．１８〜１．２０ｍｇ）場合には、該細胞はウイルス粒子産生能を有すると判定することができる。
培養上清中に放出されたＨＣＶウイルス粒子は、例えば、ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、又はＥ２タンパク質に対する抗体を用いて検出することもできる。また、培養上清中の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを、特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により増幅して検出することによって、ＨＣＶウイルス粒子の存在を間接的に検出することもできる。
４．本発明のＨＣＶ粒子の他の細胞への感染
本発明のＨＣＶウイルス粒子は、細胞（好ましくはＨＣＶ感受性細胞）への感染能を有する。本発明は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を培養し、得られた培養物（好ましくは、培養上清）中のウイルス粒子を他の細胞（好ましくはＨＣＶ感受性細胞）に感染させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞を製造する方法にも関する。本発明において、ＨＣＶ感受性細胞とは、ＨＣＶに対し感染性を有する細胞であり、好ましくは肝臓細胞またはリンパ球系細胞であるが、これらに限定されるものでは無い。具体的には、肝臓細胞としては初代肝臓細胞や、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、２０３細胞などが挙げられ、リンパ球系細胞としてはＭｏｌｔ４細胞や、ＨＰＢ−Ｍａ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものでは無い。
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶ粒子を細胞（例えば、ＨＣＶ感受性細胞）に感染させると、その感染細胞中では全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製され、さらにウイルス粒子が形成される。全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞において産生されたウイルス粒子に感染した細胞は、選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子を発現するので、その発現を利用して選択及び／又は検出することが可能である。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞において産生されたウイルス粒子を細胞に感染させることにより、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが細胞内で複製され、ウイルス粒子をさらに製造することができる。
さらに、本発明の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶ粒子を細胞（例えば、ＨＣＶ感受性細胞）に感染させることにより、その感染細胞中で全長ＨＣＶゲノムＲＮＡが複製され、ウイルス粒子が形成される。本発明の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたウイルス粒子を細胞に感染させることにより、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡが細胞内で複製され、ウイルス粒子をさらに製造することができる。
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶウイルス粒子は、チンパンジーなどのＨＣＶウイルスに感染しうる動物に感染して、ＨＣＶ由来の肝炎を引き起こすことができる。
５．本発明の他の実施形態
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞では、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが高効率で複製される。また本発明の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞でも、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡが高効率で複製される。従って、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を用いて、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを高効率で製造することができる。
本発明では、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞を培養し、培養物（培養細胞及び／又は培養培地）からＲＮＡを抽出し、それを電気泳動法にかけ、分離された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを単離精製することによって、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを製造することができる。全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を用いた場合にも、同様の方法で全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを製造することができる。このようにして製造されるＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルスの全長ゲノム配列を含む。この場合、Ｃ型肝炎ウイルスの全長ゲノム配列は、選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子並びにＩＲＥＳ配列によって分断されていてもよい。Ｃ型肝炎ウイルスの全長ゲノム配列を含むＲＮＡの製造方法が提供されることにより、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムに関してより詳細な分析が可能となる。
さらに本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞は、ＨＣＶタンパク質を製造するために好適に使用することができる。ＨＣＶタンパク質の製造は、当業者に周知の任意の方法によって行えばよいが、例えば、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを細胞に導入して組換え細胞を作製し、該組換え細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び／又は培養培地）から常法によりタンパク質を回収することによって行えばよい。
また本発明のＨＣＶウイルス粒子は、肝細胞指向性を有しうる。そのため本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを使用して、肝細胞指向性ウイルスベクターを製造することができる。このウイルスベクターは、遺伝子治療用に好適に用いられる。本発明では、外来遺伝子をコードするＲＮＡを全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡに組み込み、そのＲＮＡを細胞に導入することにより、該外来遺伝子を細胞中に導入し、細胞内で複製させ、さらに発現させることができる。さらに、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ中のＥ１タンパク質コード配列、及び／又はＥ２タンパク質コード配列を、他の生物種由来のウイルスの外殻タンパク質に変換したＲＮＡを作製することにより、そのＲＮＡを様々な生物種の細胞に感染させることも可能となる。この場合にも、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡにさらに外来遺伝子を組み込んで、それを、該外来遺伝子を肝細胞で発現させるための肝細胞指向性ウイルスベクターとして使用することができる。
本発明は、配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡに外来遺伝子をコードするＲＮＡを挿入し、それを細胞に導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、外来遺伝子を含有するウイルスベクターを製造する方法にも関する。
本発明は、本発明に係るＨＣＶ粒子又はその一部分をワクチン抗原として含有するＣ型肝炎ワクチン、及び本発明に係るＨＣＶ粒子又はその一部分を抗原として用いてＣ型肝炎ワクチンを製造する方法も、提供する。
具体的には、作製されたＨＣＶ粒子を直接ワクチンとして使用することもできるし、当該分野で既知の方法により弱毒化または不活化して用いることもできる。例えば、調製したＨＣＶ粒子を、カラムクロマトグラフィー、ろ過、遠心等により精製することにより、ＨＣＶワクチン原液を得た後、かかる原液から、弱毒生ＨＣＶワクチンあるいは不活化ＨＣＶワクチンを調製すればよい。尚、ウイルスの不活化は、ホルマリン、β−プロピオラクトン、グルタルジアルデヒド等の不活化剤を、例えば、ウイルス浮遊液に添加して混合し、ウイルスと反応させることによって達成することができる（Ａｐｐａｉａｈｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，（２００４）２２（２７−２８），ｐ．３６６９−３６７５）。
本発明のワクチンの製造には、ＨＣＶレプリコンＲＮＡに公知の技術を用いて変異を導入し病原性を原弱もしくは消失させたものを使用することも可能である。
本発明のワクチンは、溶液または懸濁液のいずれかとして、投与可能に調製される。液体中の溶解または懸濁に適した固形物の形態で調製することができる。調製物は乳濁され、またはリポソームにカプセル化され得る。ＨＣＶ粒子などの活性免疫原性成分は、医薬上許容される、活性成分に適合した賦形剤がしばしば混合される。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの混合物がある。さらに、所望であれば、ワクチンは、少量の補助剤（例えば加湿剤または乳化剤）、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効能を高めるアジュバントを含有し得る。有効であり得るアジュバントの例は、限定されないが、以下を包含する。水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称せられる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称せられる）、およびＲＩＢＩ。ＲＩＢＩは、バクテリアから抽出した３成分、すなわちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＨＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルジョン中に含有している。アジュバントの効能は、ＨＣＶ粒子から構成されるワクチンを投与することにより生じるこの免疫原性ＨＣＶ粒子に対する抗体の量を測定することにより、決定され得る。
本ワクチンは、通常非経口的に、例えば皮下注射または筋内注射のような注射により投与される。他の投与経路に適した別の剤形として、坐薬、および場合により経口製剤が挙げられる。
所望により、アジュバント活性を有する１以上の化合物をＨＣＶワクチンに加えることができる。アジュバントは、該免疫系の非特異的刺激因子である。それらは、ＨＣＶワクチンに対する宿主の免疫応答を増強する。当技術分野で公知のアジュバントの具体例としては、フロイント完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、サポニン、鉱油、植物油およびＣａｒｂｏｐｏｌが挙げられる。粘膜適用に特に適したアジュバントとしては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）またはコレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）毒素（ＣＴ）が挙げられる。他の適当なアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、油性乳剤（例えば、Ｂａｙｏｌ（登録商標）またはＭａｒｃｏｌ ５２（登録商標）のもの）、サポニンまたはビタミンＥソリュビリゼートが挙げられる。好ましい形態においては、本発明のワクチンはアジュバントを含む。
例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内に投与する注射剤において、本発明のＨＣＶワクチンとともに含められる医薬上許容される担体または希釈剤の他の具体例としては、安定化剤、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清または脱脂乳などのタンパク質含有物質、およびバッファー（例えば、リン酸バッファー）などが挙げられる。
坐薬に使用される従来の結合剤および担体には、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが包含され得る。坐薬は、活性成分を０．５％から５０％までの範囲で、好ましくは１％から２０％までの範囲で含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、通常用いられる賦形剤を含有してもよい。この賦形剤としては、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
本発明のワクチンは、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤、または粉剤の剤形をとることができ、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分（ウイルス粒子又はその一部分）を含有する。
本ワクチンは、投与剤形に適した方法で、そして予防および／または治療効果があるような量で投与される。投与されるべき量は、通常１回の投与当たり抗原を０．０１μｇから１００，０００μｇまでの範囲であり、これは、処置される患者、その患者の免疫系での抗体合成能、および所望の防御の程度に依存し、経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内経路などの投与経路にも依存する。
本ワクチンは、単独投与スケジュールで、または好ましくは複合投与スケジュールで与えられ得る。複合投与スケジュールでは、接種の開始時期に１〜１０回の個別の投与を行い、続いて免疫応答を維持するおよびまたは強化するのに必要とされる時間間隔で、例えば２回目の投与として１〜４ヵ月後に、別の投与を行い得る。必要であれば、数ヶ月後に引続き投与を行い得る。投与レジメもまた、少なくとも部分的には、個々の患者の必要性により決定され、医師の判断に依存する。
さらに、免疫原性ＨＣＶ粒子を含有するワクチンは、他の免疫制御剤（例えば、免疫グロブリン）と共に投与してもよい。
ＨＣＶ粒子ワクチンは、健常人に投与して、健常人にＨＣＶに対する免疫応答を誘導することにより、新たに生じ得るＨＣＶ感染に対して予防的に使用することもできる。更に、ＨＣＶ粒子ワクチンをＨＣＶに感染した患者に投与し、生体内にＨＣＶに対する強い免疫反応を誘導することにより、ＨＣＶを排除する治療的ワクチンとして使用することもできる。
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞、又はそれらの細胞において産生されるウイルス粒子を感染させたＣ型肝炎ウイルス感染細胞を、例えばＣ型肝炎ウイルスの複製、ウイルス粒子の再構築、ウイルス粒子の放出を促進又は抑制する物質（抗Ｃ型肝炎ウイルス物質）をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には、例えば、被験物質の存在下でそれらの細胞を培養し、得られる培養物中の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ又はウイルス粒子を検出し、その被験物質がレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの複製又はウイルス粒子の形成若しくは放出を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。この場合、培養物中の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの検出は、上記細胞から抽出したＲＮＡ中の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの量、割合若しくは有無を測定することによるものであってよい。培養物（主として培養上清）中のウイルス粒子の検出は、培養上清中に含まれるＨＣＶタンパク質の量、割合若しくは有無を検出するものであってよい。
また本培養物中のウイルス粒子を検出することにより、ＨＣＶ感染患者血清から精製した免疫グロブリンが本発明によるＨＣＶウイルス粒子の感染を阻止する能力を有するかどうかを検討することができる。この試験においては、本発明のＨＣＶウイルス粒子により免疫したマウス、ラット、ウサギなどの血清を用いても良い。ＨＣＶの部分蛋白質、ＨＣＶ遺伝子などによる免疫を利用してもよい。抗体分子以外の、感染を阻止できる他の物質についても、この試験を同様に適用することができる。
本発明のＨＣＶウイルス粒子に対して産生される本発明の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を包含する。ポリクローナル抗体が望ましい場合、まず、選択された哺乳類（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマなど）を、本発明のＨＣＶ粒子で免疫感作する。感作動物由来の血清を採集し、既知の手法に従って処理する。ＨＣＶエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合には、このポリクローナル抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製すればよい。ポリクローナル抗血清を産生させる方法およびそれを処理する方法は当該分野で既知である。ポリクローナル抗体は、既にＨＣＶに感染した哺乳類から単離してもよい。
ＨＣＶエピトープに対するモノクローナル抗体もまた、当業者により容易に製造され得る。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造する一般的な方法は、周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載された方法を用いることができる。
モノクローナル抗体産生細胞株は、細胞融合により生成してもよく、また、腫瘍遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換またはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスでの形質移入のような他の方法によっても生成してもよい。
これらの方法によって得られたモノクローナル抗体や、ポリクローナル抗体は、ＨＣＶの診断や治療、予防に有用である。
本発明のＨＣＶ粒子を用いて作製された抗体は、医薬上許容される、溶解剤、添加剤、安定化剤、バッファーなどともに投与される。投与経路は、いずれの投与経路でも良いが、好ましくは、皮下、皮内、筋肉内投与であり、より好ましくは、静脈内投与が好ましい。
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶ粒子とＨＣＶ感受性細胞とを、ＨＣＶの細胞への結合を促進又は抑制する物質をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には例えば、被験物質の存在下で、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶ粒子とともにＨＣＶ感受性細胞を培養し、得られる培養物中の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又はウイルス粒子を検出し、その被験物質がレプリコンＲＮＡの複製又はウイルス粒子の形成を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。
このような全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ又はウイルス粒子の検出は、上述の手法又は後述の実施例に従って行うことができる。上記試験系は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の予防剤、治療剤若しくは診断剤の製造又は評価のためにも使用することができる。
具体的には、本発明の上記試験系の利用例としては以下が挙げられる。
（１）ＨＣＶの増殖及び感染を抑制する物質の探索
ＨＣＶの増殖及び感染を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的にＨＣＶの増殖及び感染に影響を及ぼす有機化合物、あるいはＨＣＶゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりＨＣＶの増殖若しくはＨＣＶタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
（２）細胞培養中で抗ウイルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、合理的ドラッグデザイン又はハイスループットスクリーニングを用いて得られた物質（例えば単離精製された酵素）等が挙げられる。
（３）ＨＣＶに感染した患者の治療のための、新規攻撃標的の同定
例えばＨＣＶウイルス増殖のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパク質を同定するために、本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を使用することができる。
（４）ＨＣＶウイルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる変異の同定
（５）Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断薬又は治療薬の開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質の製造
（６）Ｃ型肝炎ウイルス感染のワクチンの開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質及び弱毒化ＨＣＶの製造
（７）Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断又は治療用のポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の製造。
本発明を、以下の実施例及び図面に基づいてさらに具体的に説明する。但し本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ由来の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの作製
（Ａ）発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスであるＪＦＨ−１株（遺伝子型２ａ）のゲノム全長ｃＤＮＡを含むＤＮＡ（ＪＦＨ−１クローン）を、ｐＵＣ１９プラスミド中でＴ７ ＲＮＡプロモーター配列の下流に挿入したプラスミドＤＮＡを作製した。
具体的には、ＪＦＨ−１株のウイルスＲＮＡを増幅したＲＴ−ＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングしてｐＧＥＭ１−２５８、ｐＧＥＭ４４−４８６、ｐＧＥＭ３１７−８４９、ｐＧＥＭ６１７−１３２３、ｐＧＥＭ１１４１−２３６７、ｐＧＥＭ２２８５−３５０９、ｐＧＥＭ３４７１−４６６５、ｐＧＥＭ４５４７−５９７０、ｐＧＥＭ５８８３−７００３、ｐＧＥＭ６９５０−８０３５、ｐＧＥＭ７９８４−８８９２、ｐＧＥＭ８６８０−９２８３、ｐＧＥＭ９２３１−９６３４及びｐＧＥＭ９５９４−９６７８の各プラスミドＤＮＡを得た（非特許文献６を参照）。各プラスミドに含まれるウイルスゲノムＲＮＡ由来のｃＤＮＡをＰＣＲ法および制限酵素を用いてつなぎ合わせて、全長のウイルスゲノムｃＤＮＡをクローニングした。全長のウイルスゲノムの上流にＴ７Ｒ ＲＮＡプロモーター配列を挿入した。このようにして構築されたプラスミドＤＮＡを、以下、ｐＪＦＨ１と称する（図１上段）。なお、上記ＪＦＨ−１クローンの作製については、特許文献１及び非特許文献３に記載されている。またＪＦＨ−１クローンの全長ｃＤＮＡの塩基配列は、国際ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）のアクセッション番号：ＡＢ０４７６３９に登録されている。
次に、プラスミドＤＮＡであるｐＪＦＨ１の５’非翻訳領域とｃｏｒｅ領域の間に、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）及びネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とも称する）を挿入して、プラスミドＤＮＡであるｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を構築した（図１の下段）。この構築手順は、既報（非特許文献４）に従った。また、ｐＪＦＨ１及びｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１中のＮＳ５Ｂ領域について、該領域にコードされるＲＮＡポリメラーゼの活性中心に相当するアミノ酸モチーフＧＤＤをＧＮＤに変異させる突然変異を導入して、突然変異プラスミドクローンｐＪＦＨ１／ＧＮＤ、及びｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤも作製した。突然変異クローンｐＪＦＨ１／ＧＮＤ及びｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤは、それにコードされるＮＳ５Ｂタンパク質の活性部位のアミノ酸配列が変異しているため、レプリコンＲＮＡを複製するのに必要な活性ＮＳ５Ｂタンパク質を発現することができない。
さらに、レポーター遺伝子導入発現ベクターとして、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の４１５から４２０番のＭｌｕＩサイトと２０７５から２０８２番のＰｍｅＩサイトの間にルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のネオマイシン耐性遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子に置換したｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃを作製した。また、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃの１０９３３番をＧからＡに変異させ、ＮＳ５ｂのＲＮＡポリメラーゼの活性中心のＧＤＤモチーフをＧＮＤに変えた変異体ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ／ＧＮＤを作製した。
ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の４１５から４２０番のＭｌｕＩサイトと１１４２から１１４９番のＰｍｅＩサイトの間に緑色蛍光タンパク質遺伝子を導入し、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のネオマイシン耐性遺伝子を緑色蛍光タンパク質遺伝子に置換したｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰを作製した。さらに、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰの１００００番をＧからＡに変異させ、ＮＳ５ｂのＲＮＡポリメラーゼの活性中心のＧＤＤモチーフをＧＮＤに変えた変異体ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ／ＧＮＤを作製した。
ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の４１５から４２０番のＭｌｕＩサイトと１９８２から１９８９番のＰｍｅＩサイトの間に分泌型胎盤アルカリ性フォスファターゼ遺伝子を導入し、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のネオマイシン耐性遺伝子を分泌型胎盤アルカリ性フォスファターゼ遺伝子に置換したｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰを作製した。また、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰの１０８４０番をＧからＡに変異させ、ＮＳ５ｂのＲＮＡポリメラーゼの活性中心のＧＤＤモチーフをＧＮＤに変えた変異体ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ／ＧＮＤを作製した。
（Ｂ）全長ＨＣＶゲノムＲＮＡと全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの作製
全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ合成及び全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ合成に用いる鋳型ＤＮＡを作製するために、上記のとおり構築した発現ベクターｐＪＦＨ１、ｐＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤを、それぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断した。次いで、これらのＸｂａＩ切断断片のそれぞれについて、１０〜２０μｇを５０μｌの反応液中に含有させ、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ２０ Ｕを用いて３０℃で３０分間インキュベートすることにより、さらに処理した。Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅは、二本鎖ＤＮＡ中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記ＸｂａＩ切断断片をそのまま鋳型として用いてＲＮＡ合成を行うと、ＸｂａＩの認識配列の一部であるＣＵＧＡの４塩基が３’末端に余分に付加されたレプリコンＲＮＡが合成されてしまう。そこで本実施例では、ＸｂａＩ切断断片をＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅで処理することにより、ＸｂａＩ切断断片からＣＵＧＡの４塩基を除去した。この後、ＸｂａＩ切断断片を含むＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理後の溶液について、通常法に従ったタンパク質除去処理により、ＣＵＧＡの４塩基が除去されたＸｂａＩ切断断片を精製して、これを鋳型ＤＮＡとした。
次に、この鋳型ＤＮＡから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ合成した。このＲＮＡ合成にはＡｍｂｉｏｎ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを用いた。鋳型ＤＮＡを０．５〜１．０マイクログラム含む反応液２０μｌを製造業者の使用説明書に従って反応させた。
ＲＮＡ合成終了後、反応溶液にＤＮａｓｅ（２Ｕ）を添加して３７℃で１５分間反応させた後、さらに酸性フェノールによるＲＮＡ抽出を行って、鋳型ＤＮＡを除去した。このようにしてｐＪＦＨ１、ｐＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤに由来する上述の鋳型ＤＮＡから合成したＲＮＡを、それぞれｒＪＦＨ１、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤと命名した。これらのＲＮＡの塩基配列を、ｒＪＦＨ−１、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１については配列番号１２及び１３、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤについては配列番号１４及び１５にそれぞれ示す。ｒＪＦＨ１は、ＪＦＨ−１株の全長ＨＣＶゲノムと同じ配列構造をもつ、本発明の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの一例である。ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１は、本発明における全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの一例である。
続いて、上述の通り作製した発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ／ＧＮＤ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ／ＧＮＤ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ／ＧＮＤをそれぞれ鋳型として用いて、ＨＣＶレプリコンＲＮＡであるｒＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ（配列番号２１）、ｒＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ／ＧＮＤ（配列番号２２）、ｒＦＧＲ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ（配列番号２３）、ｒＦＧＲ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ／ＧＮＤ（配列番号２４）、ｒＦＧＲ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ（配列番号２５）、ｒＦＧＲ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ／ＧＮＤ（配列番号２６）を上記と同様の方法で製造した。
【実施例２】
細胞内における全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞とウイルス粒子産生
（Ｃ）細胞内における全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの複製とウイルス粒子の産生
上記の通り合成した全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ（ｒＪＦＨ１、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤ）のそれぞれを、様々な量で、Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して、ＲＮＡ総量が１０μｇとなるように調製した。次いでその混合ＲＮＡをエレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１２時間、２４時間、４８時間及び７２時間培養した後に、細胞を回収して、細胞からＲＮＡを抽出して、ノーザンブロットで解析した。ノーザンブロット解析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）の記載に従って行った。具体的には、培養後の細胞から抽出したＲＮＡを変性アガロース電気泳動に供し、泳動終了後にＲＮＡをポジティブチャージナイロン膜に転写した。ｐＪＦＨ１から作製した３２ＰラベルしたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、前記のとおり膜に転写したＲＮＡに対しハイブリダイゼーションさせ、次いでその膜を洗浄し、それをフィルムに感光させることにより、ＪＦＨ−１クローンの全長ＨＣＶゲノムＲＮＡに特異的なＲＮＡバンドを検出した。
図２に示すように、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤをトランスフェクションした場合、トランスフェクション４時間後において、導入したＲＮＡバンドは弱いシグナルとして確認できたが、時間の経過とともにシグナルは減弱し、２４時間後にはほとんどバンドのシグナルが確認できなかった。一方、ｒＪＦＨ１をトランスフェクションした場合、トランスフェクションの４時間後〜１２時間後には、導入したＲＮＡバンドのシグナルの強さはｒＪＦＨ１／ＧＮＤを導入した場合と同様にいったん減弱したが、２４時間以降にははっきりとしたＲＮＡバンドのシグナルが確認できた。確認されたシグナルはＨＣＶゲノムＲＮＡに特異的であった。つまり導入した全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの一部が複製増殖したものと考えられた。ＲＮＡ複製酵素であるＮＳ５Ｂの活性モチーフを変異させたｒＪＦＨ１／ＧＮＤでは複製はみられず、ＮＳ５Ｂの活性が全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの複製に重要であることが示された。一方、これまでに分離されたＨ７７株（非特許文献７）、Ｊ６株（非特許文献８）や本発明者らが慢性肝炎から分離したＪＣＨ１株（非特許文献６）などのＣ型肝炎ウイルス株に由来する全長ＨＣＶゲノムＲＮＡについても同様の実験をおこなったが、これらの株では全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの複製は全く確認できなかった。
（Ｄ）トランスフェクション細胞培養液中のＨＣＶウイルス粒子の検出
上記に従ってエレクトロポレーション処理を行ったＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間培養した後、培養上清中のＨＣＶコアタンパク質を測定した。測定はオーソＨＣＶ抗原ＩＲＭＡテストによって行った（非特許文献９）。図３に示す通り、ｒＪＦＨ１をトランスフェクションして４８時間後及び７２時間後の培養上清中にコアタンパク質が検出された。このコアタンパク質がウイルス粒子として分泌されているかどうかを確認するため、ｒＪＦＨ１をトランスフェクションした７２時間後の培養液をショ糖密度勾配により分画した。６０％（重量／重量）ショ糖溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５／０．１Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解）２ｍｌ、５０％ショ糖溶液１ｍｌ、４０％ショ糖溶液１ｍｌ、３０％ショ糖溶液１ｍｌ、２０％ショ糖溶液１ｍｌ、１０％ショ糖溶液１ｍｌを遠心チューブに重層し、さらにその上にサンプルの培養上清を４ｍｌ重層した。これをベックマンローターＳ Ｗ４１Ｔｉで４００，０００ＲＰＭ、４℃、１６時間遠心した。遠心終了後遠心チューブの底から０．５ｍｌずつ分画回収した。各分画の密度、ＨＣＶコア蛋白濃度、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ量を定量した。全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる検出は、Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｔ，Ｋａｔｓｕｍｅ Ａ，Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ａｂｅ Ａ，Ｉｎｏｕｅ Ｋ，Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ Ｋ，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｒ，Ｔａｎａｋａ Ｓ，Ｋｏｈａｒａ Ｍ．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１６：６３６−６４２（１９９９）に従い、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの５’非翻訳領域のＲＮＡを検出することによって行った。具体的には、細胞から抽出したＲＮＡに含まれる全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを、合成プライマー、Ｒ６−１３０−Ｓ１７：５’−ＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧ−３’（配列番号１６）、Ｒ６−２９０−Ｒ１９：５’−ＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧ−３’（配列番号１７）、ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ：Ｒ６−１４８−Ｓ２１ＦＴ，５’−ＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣ−３’（配列番号１８）とＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔを用いてＰＣＲ増幅し、次いでＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍにより検出した。
図４に示すように１１番のフラクションでコアタンパク質と全長ＨＣＶゲノムＲＮＡのピークが一致した。このフラクションの密度は約１．１８ｍｇ／ｍｌであり、これまで報告されているコアタンパク質と核酸の結合物よりも軽い比重であった。さらに培養上清を０．２５％ ＮＰ４０で処理した後に同様の分画を行うと、コアタンパク質と全長ＨＣＶゲノムＲＮＡのピークは比重約１．２８ｍｇ／ｍｌへとシフトした。つまり、ＮＰ４０処理により、脂質を含む比重の軽い表面膜がウイルス粒子から剥離して、核酸とコアタンパク質のみのコア粒子となった結果、比重が重くなったと考えられた。以上の結果から、ｒＪＦＨ１をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションすることにより細胞内で全長ＨＣＶゲノムＲＮＡが複製されたこと、さらにウイルス粒子が形成され、培養上清中に分泌されたことが明らかになった。
【実施例３】
（Ｅ）全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞の作製及び細胞クローンの樹立
実施例１で作製したｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１及びｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤを、実施例２と同様にしてＨｕｈ７細胞へトランスフェクションして全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞の作製を行い、さらに全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンの樹立を試みた。
まず、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１及びｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤのそれぞれをＨｕｈ７細胞へトランスフェクションした後、培養ディッシュにその細胞を播種した。１６時間から２４時間培養した後にＧ４１８を様々な濃度で添加した。週に２回培養液を交換しながら培養を継続した。２１日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。染色されるコロニー数を計測し、トランスフェクションしたＲＮＡ重量あたりに得られたコロニー数を計算した。また、一部の培養ディッシュでは生存細胞のコロニーをクローン化して培養を継続した。クローン化された細胞からＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、タンパク質をそれぞれ抽出した後、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの検出、ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムＤＮＡへの組み込みの有無、ＨＣＶタンパク質の発現を検討した。これらの結果の詳細は下記に示す。
（Ｆ）コロニー形成能
上記のトランスフェクションの結果、トランスフェクションしたレプリコンＲＮＡ １μｇ当たりのコロニー形成能は、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞では、Ｇ４１８濃度が１．０ｍｇ／ｍｌの場合、３６８ ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ；コロニー形成単位）／μｇ・ＲＮＡであった（図５の左側）。これに対して、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤをトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞では、コロニー形成が認められなかった（図５の右側）。このことは、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１レプリコンＲＮＡをトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞のコロニー形成能は、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１から発現されるＮＳ５Ｂ（ＲＮＡポリメラーゼ）の活性に依存することを示した。つまり、コロニーを形成した細胞では、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１から発現されるＮＳ５ＢのはたらきによりｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１レプリコンＲＮＡが自律複製することによって、ネオマイシン耐性遺伝子が持続的に発現されＧ４１８耐性が維持される結果、細胞増殖が可能になったものと考えられた。
（Ｇ）樹立した細胞クローンにおける全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの検出
上記（Ｅ）に従ってｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＨｕｈ７細胞へのトランスフェクションにより樹立した全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンから、酸性フェノール抽出法によりトータルＲＮＡを抽出した。次いでこのトータルＲＮＡをノーザンブロット法により解析した。プローブとしてはｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブを用いた。対照としては、トランスフェクションを行っていないＨｕｈ７細胞から同様に抽出したトータルＲＮＡ（図６中、「Ｈｕｈ７」として示す）、Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の７乗コピー加えたサンプル（図６中、「１０７」として示す）、及びＨｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の８乗コピー加えたサンプル（図６中、「１０８」として示す）を用いた。図６中、１〜４は細胞クローンの番号である。
この結果、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１と同程度の大きさのＲＮＡがｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブにより検出された（図６）。これにより、トランスフェクションしたｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１レプリコンＲＮＡが細胞クローン内で複製増殖していることが確認された。また細胞クローン間で、レプリコンＲＮＡの量に差があることが示された。図６中、例えば、クローン２はレプリコンＲＮＡの量が他のクローンに比べて少なかった。
（Ｈ）ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認
（Ｅ）に従って得られた細胞クローン１〜８（図７中ではＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−１〜ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−８と表記）について、その細胞クローンのＧ４１８に対する耐性がネオマイシン耐性遺伝子の宿主細胞ゲノムへの組み込みによるものでないことを確認するために、ネオマイシン耐性遺伝子特異的プライマー（センスプライマー、ＮＥＯ−Ｓ３：５’−ＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡ−３’（配列番号１９），アンチセンスプライマー、ＮＥＯ−Ｒ：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号２０））を用いて、細胞クローンから抽出した宿主細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅を行った。この結果、図７に示すとおり、ネオマイシン耐性遺伝子の増幅が示された陽性クローンは認められなかった。
この（Ｈ）の結果から、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡをトランスフェクションし樹立した細胞クローンでは、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製されていることが確認された。
（Ｉ）ＨＣＶタンパク質の検出
ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションし樹立した細胞クローンから常法によりタンパク質を抽出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法による解析を行った。調べた細胞クローンは、上記（Ｇ）で用いたものと同じである。合成した全長ＨＣＶゲノムＲＮＡをＨｕｈ７細胞に一過性にトランスフェクションして得られた細胞抽出液を陽性対照とした（図８、図９及び図１０中、ＪＦＨ−１として示す）。ＨＣＶのサブジェノミックＲＮＡレプリコン（ＳＧＲ−ＪＦＨ１）をトランスフェクションして得られたクローン細胞抽出液をｃｏｒｅタンパク質の陰性対照として、及びＮＳ３、ＮＳ５ａタンパク質の陽性対照として用いた（図８、図９及び図１０中、ＳＧＲ−ＪＦＨ１として示す）。トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞抽出液は全ての陰性対照として用いた（図８、図９及び図１０中、Ｈｕｈ７として示す）。それぞれの細胞クローンから抽出したタンパク質試料をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にブロッティングし、抗ｃｏｒｅ特異的抗体及び抗ＮＳ３特異的抗体（Ｄｒ．Ｍｏｒａｄｐｏｕｒより分与されたもの；Ｗｏｌｋ Ｂ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０００；７４：２２９３−２３０４）を用いて、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡにコードされているｃｏｒｅタンパク質及びＮＳ３タンパク質を検出した。図８及び図９に示される通り、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションし樹立した細胞クローン１〜４では、それぞれのタンパク質について陽性対照と同じ大きさのタンパク質が検出された。トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞ではｃｏｒｅタンパク質、及びＮＳ３タンパク質も検出されなかったため、細胞クローン１〜４では、トランスフェクションされた全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが自律複製し、さらにｃｏｒｅタンパク質やＮＳ３タンパク質が発現されていることが確認された。
なお、Ｃ型肝炎患者の血清を抗体として用いることにより、上記でＮＳ３タンパク質の発現が確認された各細胞クローンについて、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡからのＮＳ５Ａタンパク質の発現も同様に確認した（図１０）。
以上の（Ｈ）及び（Ｉ）の結果から、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡをトランスフェクションし樹立した細胞クローンでは、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製され、さらにウイルスタンパク質が発現されていることが確認された。
（Ｊ）全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞におけるウイルス粒子産生
上記（Ｅ）に従ってｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションし、樹立した全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローン２及び３（ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３）（７）培養上清を回収して、上記（Ｄ）と同様の方法で、培養上清中のＨＣＶウイルス粒子を測定した。この結果を図１１に示す。図１１中、網掛けの円は各フラクション（画分）の比重（ｇ／ｍｌ）を示す。また黒塗りの円は、ｃｏｒｅタンパク質の量（ｆｍｏｌ／Ｌ）を示す。白抜きの円は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの力価（×０．１コピー／ｍＬ）を示す。
図１１に示すように、比重が約１．１８〜１．２０ｍｇ／ｍｌとなるフラクションで、ｃｏｒｅタンパク質と全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡのピークは一致していた。またそれよりも軽い分画にも小さなピークを認めた。以上の結果から、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１１をトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞中では、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製されたこと、及びウイルス粒子が形成されて培養上清中に分泌されたことが示された。
【実施例４】
（Ｋ）培養上清中のウイルス粒子の感染実験
（Ｈ）で用いた細胞クローン１〜８（ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−１、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−２、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−４、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−５、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−６、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−７、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−８）のそれぞれの培養上清をＨｕｈ７細胞に添加して、培養上清中のウイルス粒子をＨｕｈ７細胞に感染させた。感染翌日に感染させたＨｕｈ７細胞の培養液にＧ４１８を０．３ｍｇ／ｍｌ添加し、さらに２１日間培養した。培養終了後に細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色したところ、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−５、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−６の培養上清を用いて感染させた細胞についてコロニー形成が観察された。一方、対照に用いたサブジェノミックレプリコン細胞ＳＧＲ−ＪＦＨ１／４−１（非特許文献６記載）の培養上清を用いて感染させた細胞ではコロニー形成はみられなかった。図１２に、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３とＳＧＲ−ＪＦＨ１／４−１の培養上清４ｍｌまたは８ｍｌをＨｕｈ７細胞に添加し、２１日間培養した後に染色した培養ディッシュの写真を示す。ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３の培養上清４ｍｌを添加した細胞を播種したディッシュには３コロニー、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３の培養上清８ｍｌを添加した細胞を播種したディッシュには９コロニーの形成を確認した。しかし、ＳＧＲ−ＪＦＨ１／４−１の培養上清を添加した細胞を播種したディッシュではコロニー形成はみられなかった。
ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−５の培養上清を用いてＣ型肝炎ウイルスに感染させ、形成されたコロニーを、次いでクローン化した。ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３の培養上清を用いた培養ディッシュから、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１１、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１２、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１３の３クローンを樹立した。ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５の培養上清を用いた培養ディッシュから、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１１、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１２の２クローンを樹立した。
ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１１、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１２、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１３、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１１、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１２の各細胞クローンの培養上清を用いて再度Ｈｕｈ７細胞を感染させると、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１２、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１２の培養上清を用いた培養ディッシュではコロニーの形成が観察された。ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１２の培養上清を用いて感染させた細胞から、さらにＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１２−１，ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１２−２の２クローンを樹立した。ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１２の培養上清を用いて感染させた細胞から、さらにＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１２−１、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１２−２の２クローンを樹立した。
以上の通り全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞の培養上清を用いて感染させ、その感染細胞より樹立したこれらの細胞クローンから、ＲＮＡ、タンパク質、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでネオマイシン耐性遺伝子の組み込みの有無を検討したところ、いずれも陰性であった。また、ＲＮＡを鋳型とする定量的ＰＣＲ法により、細胞内で複製している全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを検出することができた。さらに培養上清中にｃｏｒｅタンパク質を検出することができた。この結果は、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞から産生された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを含むウイルス粒子が、新たな細胞に感染することができることを示している。
【産業上の利用可能性】
本発明の方法により、ＨＣＶウイルス粒子を細胞培養系で作製することができる。本発明のレプリコンＲＮＡを用いれば、細胞培養系においてＨＣＶの全長ゲノムＲＮＡを含有するＲＮＡを効率よく製造することができる。また本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを導入した細胞を用いれば、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを複製し、本発明のＨＣＶウイルス粒子を細胞培養系で持続的に産生させることができる。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを導入した細胞は、ＨＣＶの複製過程、ウイルス粒子形成過程、ウイルス粒子の細胞外放出過程に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として利用することもできる。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ及び全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ並びにウイルス粒子は、外来遺伝子のウイルスベクターとしても有用である。本発明のウイルス粒子又はその一部分はまた、Ｃ型肝炎ウイルスに対するワクチン抗原としてワクチンに含有させることができる。さらに、本発明のウイルス粒子と他の細胞とを一緒に培養する系を、ウイルス粒子の細胞への感染に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として利用することができる。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡはまた、ＨＣＶの全長ゲノム配列を容易に複製することができる鋳型としても有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願の全体を参照として本明細書に組み入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡの５’非翻訳領域を示す。
配列番号２の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのｃｏｒｅタンパク質コード配列を示す。
配列番号３の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＥ１タンパク質コード配列を示す。
配列番号４の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＥ２タンパク質コード配列を示す。
配列番号５の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＮＳ２タンパク質コード配列を示す。
配列番号６の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＮＳ３タンパク質コード配列を示す。
配列番号７の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＮＳ４Ａタンパク質コード配列を示す。
配列番号８の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＮＳ４Ｂタンパク質コード配列を示す。
配列番号９の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＮＳ５Ａタンパク質コード配列を示す。
配列番号１０の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＮＳ５Ｂタンパク質コード配列を示す。
配列番号１１の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡの３’非翻訳領域を示す。
配列番号１２の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを示す。
配列番号１３の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを含むレプリコンＲＮＡを示す。
配列番号１４の配列は、アミノ酸モチーフＧＤＤをＧＮＤに変異させた、ＪＦＨ−１クローン由来の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを示す。
配列番号１５の配列は、アミノ酸モチーフＧＤＤをＧＮＤに変異させた、ＪＦＨ−１クローン由来の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを含むレプリコンＲＮＡを示す。
配列番号１６〜２０の配列は、プライマーを示す。
配列願号２１の配列は、発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ由来のレプリコンＲＮＡを示す。
配列願号２２の配列は、発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ／ＧＮＤ由来のレプリコンＲＮＡを示す。
配列願号２３の配列は、発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ由来のレプリコンＲＮＡを示す。
配列願号２４の配列は、発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ／ＧＮＤ由来のレプリコンＲＮＡを示す。
配列願号２５の配列は、発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ由来のレプリコンＲＮＡを示す。
配列願号２６の配列は、発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ／ＧＮＤ由来のレプリコンＲＮＡを示す。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【技術分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの全長ゲノムを含む核酸構築物、Ｃ型肝炎ウイルス粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの作製方法、及び作製したＣ型肝炎ウイルス粒子の使用に関する。
【背景技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ、ＨＣＶ）は、フラビウイルス科に属する、一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡをゲノムとするウイルスであり、Ｃ型肝炎の原因となることが知られている。
ＨＣＶは持続的に感染することにより慢性肝炎を引き起こす。現在、世界的規模で認められる慢性肝炎の主たる原因がＨＣＶ持続感染である。実際、持続感染者の５０％程度が慢性肝炎を発症し、そのうち約２０％の患者が１０年〜２０年を経て肝硬変に移行し、さらにその一部は肝癌といった致死的な病態へと進展する。
Ｃ型肝炎に対する現在の主な治療は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、及びインターフェロン−αとプリン−ヌクレオシド誘導体であるリバビリンとの併用療法により行われている。しかしながら、これらの治療を行っても、全治療者の約６０％に治療効果が認められるだけであり、効果が出た後に治療を中止すると半分以上の患者が再燃する。
工業国において罹患率が高く、最終的に深刻な結果を招き、かつ現在は原因治療法が存在しないＣ型肝炎に対する効果的な治療薬又は予防薬の開発は重要な目標である。そのため、ＨＣＶ特異的な化学療法、ワクチン療法の発展が切望されている。抗ＨＣＶ薬開発のターゲットとしては、ＨＣＶの複製抑制やＨＣＶの細胞感染の抑制が考えられる。
最近になって、ＨＣＶ由来の自律複製能を有するＲＮＡとして、ＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンシステムが作製された（特許文献１、２及び３、非特許文献１〜４）。ＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンシステムは、ＨＣＶゲノムの構造遺伝子を取り除いて代わりに選択薬剤マーカー遺伝子を挿入したＨＣＶレプリコンＲＮＡを作製し、そのレプリコンＲＮＡを培養細胞内に導入し、細胞内でレプリコンＲＮＡを自律的に複製させるシステムである。これにより、培養細胞を用いてＨＣＶの複製機構を解析することが可能になったが、これはＨＣＶウイルスの増殖複製過程におけるウイルスＲＮＡ複製のみを評価することが可能な実験系であり、ＨＣＶウイルス粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程は解析できない。
現在、ＨＣＶウイルス粒子の形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程を評価する方法としては、チンパンジーなどの動物を用いた実験系しかない（非特許文献５）。しかしながら、動物という生体をそのまま用いた実験系は、煩雑で解析が極めて困難である。したがって、ＨＣＶウイルス粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、さらに新たな細胞への感染という過程を解析および、これらの過程の阻害を作用メカニズムとした抗ＨＣＶ薬を作製するには、これらの過程を再現できる極めて単純化した実験系、すなわち、培養実験系でのＨＣＶウイルス粒子の作製系を構築する必要がある。
また、細胞培養系を用いて安定してＨＣＶウイルス粒子を供給可能になれば、ウイルスを弱毒化したり、分子生物学的手法を用いて非感染性のＨＣＶウイルスを作製したりして、それをワクチンに用いることができる。
【特許文献１】 特開２００１−１７１８７号公報
【特許文献２】 国際出願ＰＣＴ／ＪＰ０３／１５０３８
【特許文献３】 特願２００３−３２９０８２
【非特許文献１】 Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９）２８５，ｐ．１１０−１１３
【非特許文献２】 Ｂｌｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０００）２９０，ｐ．１９７２−１９７４
【非特許文献３】 Ｆｒｉｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００１）７５（２４）：ｐ．１２０４７−１２０５７
【非特許文献４】 Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００２）７６（６）：ｐ．２９９７−３００６
【非特許文献５】 Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９７）２７７，ｐ．５７０−５７４
【非特許文献６】 Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，（２００３）１２５，ｐ．１８０８−１８１７
【非特許文献７】 Ｙａｎａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（１９９７）９６（１６）：ｐ．８７３８−８７４３
【非特許文献８】 Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，（１９９１）７３，ｐ ２６９７−２６７０４
【非特許文献９】 Ａｏｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（１９９９）３７（６）：ｐ．１８０２−１８０５
【発明の開示】
本発明は、これまで成功していない、ＨＣＶ全長ゲノム配列を含むＲＮＡを効率良く複製する方法、及び全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを含有するＨＣＶウイルス粒子を細胞培養系により製造する方法、を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ＨＣＶウイルス粒子を細胞培養系で作製する方法を開発した。すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡの、５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列と、を含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡ。
このレプリコンＲＮＡにおいては、好ましくは、前記塩基配列が、前記の５’非翻訳領域、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域を、５’から３’方向へこの順番で含む。
このレプリコンＲＮＡのより好ましい実施形態では、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡが、配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡである。
このレプリコンＲＮＡのさらに好ましい実施形態では、５’非翻訳領域が配列番号１に示す塩基配列からなり、ｃｏｒｅタンパク質コード配列が配列番号２に示す塩基配列からなり、Ｅ１タンパク質コード配列が配列番号３に示す塩基配列からなり、Ｅ２タンパク質コード配列が配列番号４に示す塩基配列からなり、ＮＳ２タンパク質コード配列が配列番号５に示す塩基配列からなり、ＮＳ３タンパク質コード配列が配列番号６に示す塩基配列からなり、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列が配列番号７に示す塩基配列からなり、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列が配列番号８に示す塩基配列からなり、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列が配列番号９に示す塩基配列からなり、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列が配列番号１０に示す塩基配列からなり、３’非翻訳領域が配列番号１１に示す塩基配列からなる。
［２］以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡ。
（ａ）配列番号１３に示す塩基配列からなるＲＮＡ。
（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列において１〜１００個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＲＮＡであって、自律複製能及びウイルス粒子産生能を有するＲＮＡ。
［３］上記［１］又は［２］記載のいずれかのレプリコンＲＮＡを細胞に導入することを含む、該レプリコンＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生する細胞を製造する方法。
この方法では、細胞が増殖性細胞であることが好ましい。あるいは、この方法における細胞は、真核細胞であることが好ましい。
この方法では、好ましくは、真核細胞はヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞である。さらに好ましくは、真核細胞がＨｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞である。
［４］上記［３］記載の方法により製造される、レプリコンＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生する細胞。
［５］上記［４］記載の細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法。
［６］上記［５］記載の方法により製造される、Ｃ型肝炎ウイルス粒子。
［７］上記［４］記載の細胞を培養し、培養物中のウイルス粒子を他の細胞に感染させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞を製造する方法。
［８］上記［７］記載の方法によって製造される、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞。
［９］被験物質の存在下で、下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）上記［４］記載の細胞
（ｂ）上記［８］記載のＣ型肝炎ウイルス感染細胞、並びに
（ｃ）上記［６］記載のＣ型肝炎ウイルス粒子及びＣ型肝炎ウイルス感受性細胞、
のうちの少なくとも１つを培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡ又はウイルス粒子を検出することを含む、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。
［１０］上記［６］記載のＣ型肝炎ウイルス粒子又はその一部分を含有するＣ型肝炎ワクチン。
［１１］上記［６］記載のＣ型肝炎ウイルス粒子又はその一部分を抗原として使用して、Ｃ型肝炎ワクチンを製造する方法。
［１２］上記［１］又は［２］記載のいずれかのレプリコンＲＮＡを使用して、遺伝子治療のための肝細胞指向性ウイルスベクターを製造する方法。
［１３］上記［１２］に記載の方法により製造される、肝細胞指向性ウイルスベクター。
［１４］外来遺伝子をコードするＲＮＡを上記［１］又は［２］記載のいずれかのレプリコンＲＮＡ中に挿入し、それを細胞中に導入することを含む、該細胞内で外来遺伝子を複製及び／又は発現させる方法。
［１５］配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡを細胞に導入することを含む、該ＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生する細胞を製造する方法。
［１６］配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡを細胞に導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法。
［１７］細胞が増殖性細胞である、上記［１５］又は［１６］記載の方法。
［１８］配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡに外来遺伝子をコードするＲＮＡを挿入し、それを細胞に導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、外来遺伝子を含有するウイルスベクターを製造する方法。
［１９］上記［６］記載のＣ型肝炎ウイルス粒子に対する抗体。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−０４５４８９号の明細書及び図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを作製するための鋳型ＤＮＡの構築手順を示す概略図である。図１の上段は、Ｔ７プロモーターの下流に全長ＨＣＶゲノムを挿入して作製したプラスミドクローンｐＪＦＨ１の構造を示す。図１の下段は、ｐＪＦＨ１のＴ７プロモーターと５’非翻訳領域の下流にネオマイシン耐性遺伝子とＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含むＤＮＡ断片を挿入した、全長ＨＣＶゲノム配列を含むプラスミドクローンｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の構造を示す。図中の記号は以下のとおりである。Ｔ７：Ｔ７ＲＮＡプロモーター、５’ＵＴＲ：５’非翻訳領域、Ｃ：コアタンパク質、Ｅ１、Ｅ２：エンベロープタンパク質。ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、４Ａ、４Ｂ：非構造タンパク質。３’ＵＴＲ：３’非翻訳領域。Ａｇｅ Ｉ、Ｐｍｅ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ：制限酵素Ａｇｅ Ｉ、Ｐｍｅ Ｉ及びＸｂａ Ｉの切断部位。ＧＤＤ：ＮＳ５Ｂタンパク質の活性中心に相当するアミノ酸モチーフＧＤＤの位置。ｎｅｏ：ネオマイシン耐性遺伝子、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム結合部位）。
図２は、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡであるｒＪＦＨ−１を導入したＨｕｈ７細胞におけるｒＪＦＨ−１の複製を示すノーザンブロット解析の結果を示す写真である。
図３は、培地中のＨＣＶコアタンパク質の定量の結果を示す。白抜きの円はｒＪＦＨ１を導入した細胞、黒塗りの円はｒＪＦＨ１／ＧＮＤを導入した細胞を示す。
図４は、ｒＪＦＨ−１を導入したＨｕｈ７細胞の培養上清をショ糖密度勾配により分画した各画分についての、ＨＣＶコアタンパク質量及び全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ量、並びに比重を示すグラフである。黒塗りの円はＨＣＶコア（ｃｏｒｅ）タンパク質、白抜きの円は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ、網掛けの円は比重を示す。
図５は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡであるｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞のコロニー形成を示す写真である。
図６は、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＨｕｈ７細胞へのトランスフェクションにより樹立した全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンにおける、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製を示す写真である。
図７は、ゲノムＤＮＡ中へのネオマイシン耐性遺伝子の組み込みの有無を確認するための、宿主細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ネオマイシン耐性遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した結果を示す写真である。Ｍ：ＤＮＡサイズマーカー、Ｐ：陽性対照、Ｎ：Ｈｕｈ７細胞。
図８は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡであるｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７細胞におけるｃｏｒｅタンパク質の発現を示すウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図９は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡであるｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７細胞におけるＮＳ３タンパク質の発現を示すウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図１０は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡであるｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７細胞におけるＮＳ５Ａタンパク質の発現を示すウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。
図１１は、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を導入したＨｕｈ７細胞の培養上清をショ糖密度勾配により分画した各画分についての、ＨＣＶ ｃｏｒｅタンパク質の量及び全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ量、並びに比重を示すグラフである。黒塗りの円はＨＣＶコア（ｃｏｒｅ）タンパク質、白抜きの円は全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ、網掛けの円は比重を示す。
図１２は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞の培養上清に含まれるウイルス粒子を添加したＨｕｈ７細胞のコロニー形成を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のゲノムは、約９６００ヌクレオチドからなる（＋）鎖の一本鎖ＲＮＡである。このゲノムＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ又は５’ＵＴＲとも表記する）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ又は３’ＵＴＲとも表記する）からなる。その構造領域にはＨＣＶの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
このようなＨＣＶの構造タンパク質（ｃｏｒｅ、Ｅ１、及びＥ２）と非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質（すなわち、ＨＣＶのウイルスタンパク質）のうち、ｃｏｒｅはコアタンパク質であり、Ｅ１及びＥ２はエンベロープタンパク質である。非構造タンパク質はウイルス自身の複製に関与するタンパク質であり、ＮＳ２はメタロプロテアーゼ活性、ＮＳ３はセリンプロテアーゼ活性（Ｎ末端側の３分の１）とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有することが知られている。さらに、ＮＳ４ＡはＮＳ３のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有することも報告されている。
本発明者らは、ＨＣＶゲノムＲＮＡを用いて、自律的に複製可能であり、かつウイルス粒子産生能を有するレプリコンＲＮＡを構築した。
本明細書では、自律複製能を有しておりＨＣＶゲノムＲＮＡを改変して作製されたＲＮＡを、「レプリコンＲＮＡ」又は「ＲＮＡレプリコン」と称する。本明細書においてＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡは、ＨＣＶ−ＲＮＡレプリコンとも称する。本明細書では、ＨＣＶゲノムＲＮＡの全長を含む本発明のレプリコンＲＮＡを、「全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ」と呼ぶ。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、ウイルス粒子産生能を有する。
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの好適な実施形態では、Ｃ型肝炎ウイルスは、限定するものではないが、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスであることが好ましい。本発明において、「遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルス」「遺伝子型２ａのＨＣＶ」とは、Ｓｉｍｍｏｎｄｓら（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，（１９９４）１０，ｐ．１３２１−１３２４を参照）による国際分類に従って遺伝子型２ａと同定されるＣ型肝炎ウイルスを意味する。本発明における「遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルス」「遺伝子型２ａのＨＣＶ」には、天然由来のＨＣＶゲノムＲＮＡを有するウイルスだけでなく、天然由来のＨＣＶゲノム配列に人為的な改変を加えたゲノムＲＮＡを有するウイルスも包含する。遺伝子型２ａのＨＣＶの具体例としては、ＪＦＨ−１株（特開２００２−１７１９７８号公報を参照）が挙げられる。
本明細書において「Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ」とは、Ｃ型肝炎ウイルスの一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡからなるゲノムの全長にわたる塩基配列を有するＲＮＡを意味する。限定するものではないが、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡとしては、配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡが好ましい。
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの一つの実施形態は、Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列と、を含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡである。
限定するものではないが、好ましくは、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、５’非翻訳領域、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域を、５’から３’方向へこの順番で含む。
本明細書において、「５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ又は５’ＵＴＲ）」、「ｃｏｒｅタンパク質コード配列（ｃｏｒｅ領域又はＣ領域）」、「Ｅ１タンパク質コード配列（Ｅ１領域）」、「Ｅ２タンパク質コード配列（Ｅ２領域）」、「Ｎ２タンパク質コード配列（ＮＳ２領域）」、「ＮＳ３タンパク質コード配列（ＮＳ３領域）」、「ＮＳ４Ａタンパク質コード配列（ＮＳ４Ａ領域）」、「ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列（ＮＳ４Ｂ領域）」、「ＮＳ５Ａタンパク質コード配列（ＮＳ５Ａ領域）」、「ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列（ＮＳ５Ｂ領域）」、及び「３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ又は３’ＵＴＲ）」、並びにその他の特定の領域若しくは部位は、遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスであるＪＦＨ−１株（特開２００２−１７１９７８号公報）のゲノムの全領域からなる全長ゲノムＲＮＡ（配列番号１２）を基準として定めることができる。
あるいは、本願発明におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム中の部分領域又はその部位は、ＪＦＨ−１株のゲノムＲＮＡ（配列番号１２）の部分塩基配列である配列番号１〜１１に示す配列を基準として定めることもできる。ＪＦＨ−１株の全長ゲノムＲＮＡ（ＪＦＨ−１クローン由来）（配列番号１２）の「５’非翻訳領域」は、配列番号１に示す塩基配列からなる。また、「ｃｏｒｅタンパク質コード配列」は配列番号２に示す塩基配列からなる。「Ｅ１タンパク質コード配列」は、配列番号３に示す塩基配列からなる。「Ｅ２タンパク質コード配列」は、配列番号４に示す塩基配列からなる。「ＮＳ２タンパク質コード配列」は、配列番号５に示す塩基配列からなる。「ＮＳ３タンパク質コード配列」は、配列番号６に示す塩基配列からなる。「ＮＳ４Ａタンパク質コード配列」は、配列番号７に示す塩基配列からなる。「ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列」は、配列番号８に示す塩基配列からなる。「ＮＳ５Ａタンパク質コード配列」は、配列番号９に示す塩基配列からなる。「ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列」は、配列番号１０に示す塩基配列からなる。「３’非翻訳領域」は、配列番号１１に示す塩基配列からなる。
例えば、ＨＣＶ由来のＲＮＡ配列中の領域又は部位は、そのＲＮＡ配列を配列番号１〜１２に示す塩基配列に対してアラインメントし、配列番号１〜１２の配列中の塩基番号を基準として定めてもよい。このようなアラインメントにおいては、配列間でギャップ、付加、欠失、置換等が存在していてもよい。
本発明のさらなる好適な実施形態では、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡに含まれる５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域が、それぞれ配列番号１〜１１に示す塩基配列を有することが好ましい。
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの好適な実施形態は、配列番号１〜１１に示す塩基配列と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列と、からなるレプリコンＲＮＡである。
本発明において「選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現された細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。但し本発明における選択マーカー遺伝子はこれらに限定されるものではない。
また本発明において「リポーター遺伝子」とは、その遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。リポーター遺伝子の一般的な例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ若しくはβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のエクオリン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。但し本発明におけるリポーター遺伝子はこれらに限定されるものではない。
上記の選択マーカー遺伝子やリポーター遺伝子は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡに１つ含まれていてもよいし、２つ以上含まれていてもよい。
本発明における「ＩＲＥＳ配列」とは、ＲＮＡの内部にリボソームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。本発明におけるＩＲＥＳ配列の好適な例としては、以下に限定するものではないがＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、ＦＭＤＶ ＩＲＥＳ、ＨＣＶ ＩＲＥＳ、等が挙げられるが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、及びＨＣＶ ＩＲＥＳがより好ましく、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳが最も好ましい。
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡのさらに好ましい１つの実施形態は、配列番号１３に示す塩基配列からなるＲＮＡである。さらに、この配列番号１３に示す塩基配列において、１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜６個、最も好ましくは１〜数個（２〜５個）の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＲＮＡであって、かつ、自律複製能及びウイルス粒子産生能を有するＲＮＡも、好適な実施形態として本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの範囲に含まれる。
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、その全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを導入する細胞内で発現させたい任意の外来遺伝子をコードするＲＮＡをさらに含んでもよい。外来遺伝子をコードするＲＮＡは、５’非翻訳領域の下流に連結してもよいし、選択マーカー遺伝子若しくはリポーター遺伝子の上流又は下流に連結させてもよいし、３’非翻訳領域の上流に連結してもよい。また、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、及びＮＳ５Ｂタンパク質コード配列のいずれかの間に挿入してもよい。
外来遺伝子をコードするＲＮＡを含む全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、導入された細胞内で翻訳される際に、該外来遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現することができる。従って外来遺伝子をコードするＲＮＡを含む全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、外来遺伝子の遺伝子産物を細胞内で生成させることを目的とする場合にも、好適に使用することができる。
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、リボザイムを含んでいてもよい。全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子の下流にリボザイムを連結しておき、そのリボザイムの自己切断活性によって、選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子が、ＩＲＥＳ配列、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域から切り離されるようにすることもできる。
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡにおいては、上述したような選択マーカー遺伝子及び／若しくはリポーター遺伝子、ウイルスタンパク質をコードする配列、並びに外来遺伝子又はリボザイム等が、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡから正しい読み枠で翻訳されるように連結される。全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡにコードされるタンパク質は、一続きのポリペプチドとして翻訳され発現された後でプロテアーゼによって各タンパク質へと切断され、遊離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させることが好ましい。
本発明はまた、本願発明のレプリコンＲＮＡをコードするＤＮＡベクター、好ましくは発現ベクターにも関する。
なお、本発明においてＲＮＡが「自律複製能を有する」とは、ＲＮＡを細胞中に導入したときに、そのＲＮＡが自己増殖することを意味する。限定するものではないが、ＲＮＡの自律複製能は、例えば、対象とするＲＮＡをＨｕｈ７細胞中にトランスフェクションし、そのＨｕｈ７細胞を培養し、得られる培養物中の細胞から抽出したＲＮＡについて、導入したＲＮＡを特異的に検出可能なプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションによりＲＮＡを検出することによって、確認することができる。自律複製能を確認するための具体的な操作は、本明細書の実施例に記載されたコロニー形成能の測定、ＨＣＶタンパク質の発現確認、レプリコンＲＮＡの検出等の記載に例示されている。
さらに本発明において、ＲＮＡが「ウイルス粒子産生能を有する」とは、そのＲＮＡを細胞（例えば、Ｈｕｈ７細胞などの培養細胞）に導入したときに、該細胞中でウイルス粒子が産生されることを意味する。ウイルス粒子産生能は、例えば、対象とするＲＮＡを導入した細胞の培養上清について、そのＲＮＡに特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法での検出を行う方法、又はその培養上清をショ糖濃度勾配法にかけてウイルス粒子を分離し、ＨＣＶタンパク質を検出する方法などにより、確認することができる。これらの具体的な操作は、本明細書の実施例に記載されたコロニー形成能の測定、ＨＣＶタンパク質の発現確認、レプリコンＲＮＡの検出等の記載に例示されている。
２．全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの作製
本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、当業者に公知である任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。限定するものではないが、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、例えば遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスとしてＪＦＨ−１株を用いる場合には以下のような方法で作製することができる。
まず、ＪＦＨ−１株のゲノム全領域のＲＮＡ（配列番号１２）に対応するＤＮＡ（この配列は、国際ＤＮＡデータバンクにアクセッション番号ＡＢ０４７６３９として登録されている）を、常法により再構築してＲＮＡプロモーターの下流に挿入して、ＤＮＡクローンを作製する。ここで、「ＲＮＡに対応するＤＮＡ」とは、当該ＲＮＡの塩基配列のＵ（ウラシル）をＴ（チミン）に置き換えた塩基配列からなるＤＮＡを意味する。前記ＲＮＡプロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。好適なＲＮＡプロモーターとしては、限定するものではないが、Ｔ７ ＲＮＡプロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡプロモーター、ＳＰ３ ＲＮＡプロモーターが挙げられるが、Ｔ７ ＲＮＡプロモーターが特に好ましい。
次に、選択マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子、並びにＩＲＥＳ配列をコードするＤＮＡを上記ＤＮＡクローンに挿入する。５’非翻訳領域の下流に、選択マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子を、さらにその下流にＩＲＥＳ配列を、挿入することが好ましい。
次いで、以上のようにして作製されたＤＮＡクローンを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。ＲＮＡ合成は、５’非翻訳領域から、常法により開始させることができる。ＤＮＡクローンがプラスミドクローンの場合には、プラスミドクローンから制限酵素によって切り出したＤＮＡ断片を鋳型として用いてＲＮＡを合成することもできる。なお、合成されるＲＮＡの３’末端がウイルスゲノムＲＮＡの３’非翻訳領域の末端と一致しており、他の配列が付加されたり削除されたりしないことが好ましい。このようにして合成されるＲＮＡが、本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡである。
３．ＨＣＶ粒子の作製
上記のようにして作製される全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを細胞に導入することにより、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを複製することができ、好ましくは持続的に複製することができる（すなわち、レプリコンＲＮＡの複製能を有する）組換え細胞を得ることができる。本明細書では、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを複製している組換え細胞を「全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞」と称する。
この全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞は、ウイルス粒子を産生することができる。産生されたウイルス粒子は、ＨＣＶのウイルスタンパク質から構成されるウイルス殻中に全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを含有する。従って本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞から産生されるウイルス粒子は、ＨＣＶ粒子である。すなわち本発明では、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞を培養することにより、ＨＣＶ粒子を細胞培養系にて作製することができる。好ましくは、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞を培養し、その培養物（好ましくは培養上清）中に産生されたウイルス粒子を採取することにより、ＨＣＶ粒子を取得することができる。
あるいは、ＨＣＶ粒子は、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを導入して得られる組換え細胞によっても産生される。本発明に係る全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ（好ましくはＪＦＨ−１クローン由来の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ、より好ましくは配列番号１２に示す塩基配列を有するＲＮＡ）を導入した細胞では、その全長ＨＣＶゲノムＲＮＡが高効率で複製される。本明細書では、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを複製している組換え細胞を「全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞」と称する。この全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞によって産生されるウイルス粒子は、ＨＣＶのウイルスタンパク質から構成されるウイルス殻中に全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを含有する。すなわち、本発明の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを導入した細胞から産生されるウイルス粒子は、ＨＣＶ粒子である。限定するものではないが、好ましくは、ＪＦＨ−１クローン由来の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ（例えば、配列番号１２に示す塩基配列を有するＲＮＡ）を導入した細胞を培養することによって、ＨＣＶ粒子を細胞培養系にて作製することができる。例えば、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ（例えば、配列番号１２に示す塩基配列を有するＲＮＡ）を導入した細胞を培養し、その培養物（好ましくは、培養上清）中に産生されたＨＣＶ粒子を採取することにより、ＨＣＶ粒子を取得することができる。
上記の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを導入する細胞としては、継代培養することが可能な細胞であれば任意の細胞を用いることができるが、真核細胞であることが好ましく、ヒト細胞であることがより好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがさらに好ましい。これらの細胞としては、癌細胞株や幹細胞株などを含む増殖性細胞が好ましく、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞等がさらに好ましい。これらの細胞は、市販のものを利用してもよいし、細胞寄託機関から入手して使用してもよいし、任意の細胞（例えば癌細胞又は幹細胞）から株化した細胞を使用してもよい。
全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの細胞内への導入は、当業者には公知の任意の技術を使用して行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥセファロース法等が挙げられるが、エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡは、単独で導入してもよいし、他の核酸と混合させたものを導入してもよい。導入するＲＮＡ量を一定にしながら全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの導入量を変更したい場合には、所望の導入量の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを、導入する細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して一定のＲＮＡ総量とし、それを細胞内導入に用いればよい。細胞内導入に用いるレプリコンＲＮＡの量は、使用する導入法に応じて決めればよいが、好ましくは１ピコグラム〜１００マイクログラム、より好ましくは１０ピコグラム〜１０マイクログラムの量を使用する。
全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡに含まれる選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現を利用して、選択することができる。具体的には、例えば、そのような全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの細胞内導入処理を施した細胞を、選択マーカー遺伝子の発現により選択可能となる培地において培養すればよい。あるいは、そのような全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの細胞内導入処理を施した細胞を培養した後、リポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質）の発現について検出すればよい。
一例として、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡにネオマイシン耐性遺伝子が選択マーカー遺伝子として含まれる場合には、その全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを用いてエレクトロポレーション処理した細胞を培養ディッシュに播種し、１２〜７２時間、好ましくは１６〜４８時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を０．０５ミリグラム／ミリリットル〜３．０ミリグラム／ミリリットルの濃度で添加し、その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続し、播種時から好ましくは１０日間〜４０日間、より好ましくは１４日間〜２８日間培養した後にクリスタルバイオレットで生存細胞を染色することにより、導入された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製されている細胞を、コロニーとして選択することができる。
形成されたコロニーからは、常法により細胞をクローン化することができる。こうして得られる全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを複製している細胞クローンを、本明細書では「全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローン」と称する。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンを包含する。
全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞については、複製された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを検出し、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子が細胞の宿主ゲノムＤＮＡに組み込まれていないことを確認し、さらにＨＣＶタンパク質の検出を行うことにより、実際に該細胞又は細胞クローンが全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを複製していることを確認することができる。
複製された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの検出は、当業者には公知の任意のＲＮＡ検出法に従って行えばよいが、例えば、細胞から抽出したトータルＲＮＡについて、導入された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡに対して特異的なＤＮＡ断片をプローブとして用いるノーザンハイブリダイゼーション法を実施することにより検出することができる。
また全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子が細胞の宿主ゲノムＤＮＡに組み込まれていないことの確認は、限定するものではないが、例えば、細胞から抽出したゲノムＤＮＡについて該選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の少なくとも一部を増幅するＰＣＲを行い、その増幅産物の有無を確認することによって行うことができる。増幅産物が確認された細胞では、宿主ゲノム中に選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子が組み込まれていると判断されることから、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ自体は複製されていない可能性がある。この場合、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製されているか否かを、次に説明するＨＣＶタンパク質の検出によって、さらに確認することができる。
ＨＣＶタンパク質の検出は、例えば、導入された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡから発現されるべきＨＣＶタンパク質に対する抗体を、細胞から抽出したタンパク質と反応させることによって行うことができる。この方法は、当業者には公知の任意のタンパク質検出法によって行うことができるが、具体的には、例えば、細胞から抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗ＨＣＶタンパク質抗体（例えば、抗ＮＳ３特異的抗体、又はＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗ＨＣＶタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。細胞から抽出したタンパク質中からＨＣＶタンパク質が検出されれば、その細胞は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを複製し、ＨＣＶタンパク質を発現しているものと判断することができる。
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞のウイルス粒子産生能は、当業者には公知の任意のウイルス検出法に従って確認すればよい。例えば、ウイルス粒子を産生していると思われる細胞の培養上清をショ糖密度勾配により分画し、各分画の密度、ＨＣＶコアタンパク質濃度、及び全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの量を測定した結果、ＨＣＶコアタンパク質と全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡのピークが一致し、しかもそのピークが検出される画分の密度が、培養上清を２５％ＮＰ４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ Ｅｔｈｅｒ］）で処理してから分画した場合の同画分の密度と比較して軽い（例えば、１．１８〜１．２０ｍｇ）場合には、該細胞はウイルス粒子産生能を有すると判定することができる。
培養上清中に放出されたＨＣＶウイルス粒子は、例えば、ｃｏｒｅタンパク質、Ｅ１タンパク質、又はＥ２タンパク質に対する抗体を用いて検出することもできる。また、培養上清中の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを、特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により増幅して検出することによって、ＨＣＶウイルス粒子の存在を間接的に検出することもできる。
４．本発明のＨＣＶ粒子の他の細胞への感染
本発明のＨＣＶウイルス粒子は、細胞（好ましくはＨＣＶ感受性細胞）への感染能を有する。本発明は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を培養し、得られた培養物（好ましくは、培養上清）中のウイルス粒子を他の細胞（好ましくはＨＣＶ感受性細胞）に感染させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞を製造する方法にも関する。本発明において、ＨＣＶ感受性細胞とは、ＨＣＶに対し感染性を有する細胞であり、好ましくは肝臓細胞またはリンパ球系細胞であるが、これらに限定されるものでは無い。具体的には、肝臓細胞としては初代肝臓細胞や、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、２０３細胞などが挙げられ、リンパ球系細胞としてはＭｏｌｔ４細胞や、ＨＰＢ−Ｍａ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものでは無い。
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶ粒子を細胞（例えば、ＨＣＶ感受性細胞）に感染させると、その感染細胞中では全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製され、さらにウイルス粒子が形成される。全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞において産生されたウイルス粒子に感染した細胞は、選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子を発現するので、その発現を利用して選択及び／又は検出することが可能である。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞において産生されたウイルス粒子を細胞に感染させることにより、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが細胞内で複製され、ウイルス粒子をさらに製造することができる。
さらに、本発明の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶ粒子を細胞（例えば、ＨＣＶ感受性細胞）に感染させることにより、その感染細胞中で全長ＨＣＶゲノムＲＮＡが複製され、ウイルス粒子が形成される。本発明の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたウイルス粒子を細胞に感染させることにより、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡが細胞内で複製され、ウイルス粒子をさらに製造することができる。
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶウイルス粒子は、チンパンジーなどのＨＣＶウイルスに感染しうる動物に感染して、ＨＣＶ由来の肝炎を引き起こすことができる。
５．本発明の他の実施形態
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞では、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが高効率で複製される。また本発明の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞でも、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡが高効率で複製される。従って、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を用いて、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを高効率で製造することができる。
本発明では、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞を培養し、培養物（培養細胞及び／又は培養培地）からＲＮＡを抽出し、それを電気泳動法にかけ、分離された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを単離精製することによって、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを製造することができる。全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を用いた場合にも、同様の方法で全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを製造することができる。このようにして製造されるＲＮＡは、Ｃ型肝炎ウイルスの全長ゲノム配列を含む。この場合、Ｃ型肝炎ウイルスの全長ゲノム配列は、選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子並びにＩＲＥＳ配列によって分断されていてもよい。Ｃ型肝炎ウイルスの全長ゲノム配列を含むＲＮＡの製造方法が提供されることにより、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムに関してより詳細な分析が可能となる。
さらに本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞は、ＨＣＶタンパク質を製造するために好適に使用することができる。ＨＣＶタンパク質の製造は、当業者に周知の任意の方法によって行えばよいが、例えば、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを細胞に導入して組換え細胞を作製し、該組換え細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び／又は培養培地）から常法によりタンパク質を回収することによって行えばよい。
また本発明のＨＣＶウイルス粒子は、肝細胞指向性を有しうる。そのため本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを使用して、肝細胞指向性ウイルスベクターを製造することができる。このウイルスベクターは、遺伝子治療用に好適に用いられる。本発明では、外来遺伝子をコードするＲＮＡを全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡに組み込み、そのＲＮＡを細胞に導入することにより、該外来遺伝子を細胞中に導入し、細胞内で複製させ、さらに発現させることができる。さらに、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ中のＥ１タンパク質コード配列、及び／又はＥ２タンパク質コード配列を、他の生物種由来のウイルスの外殻タンパク質に変換したＲＮＡを作製することにより、そのＲＮＡを様々な生物種の細胞に感染させることも可能となる。この場合にも、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡにさらに外来遺伝子を組み込んで、それを、該外来遺伝子を肝細胞で発現させるための肝細胞指向性ウイルスベクターとして使用することができる。
本発明は、配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡに外来遺伝子をコードするＲＮＡを挿入し、それを細胞に導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、外来遺伝子を含有するウイルスベクターを製造する方法にも関する。
本発明は、本発明に係るＨＣＶ粒子又はその一部分をワクチン抗原として含有するＣ型肝炎ワクチン、及び本発明に係るＨＣＶ粒子又はその一部分を抗原として用いてＣ型肝炎ワクチンを製造する方法も、提供する。
具体的には、作製されたＨＣＶ粒子を直接ワクチンとして使用することもできるし、当該分野で既知の方法により弱毒化または不活化して用いることもできる。例えば、調製したＨＣＶ粒子を、カラムクロマトグラフィー、ろ過、遠心等により精製することにより、ＨＣＶワクチン原液を得た後、かかる原液から、弱毒生ＨＣＶワクチンあるいは不活化ＨＣＶワクチンを調製すればよい。尚、ウイルスの不活化は、ホルマリン、β−プロピオラクトン、グルタルジアルデヒド等の不活化剤を、例えば、ウイルス浮遊液に添加して混合し、ウイルスと反応させることによって達成することができる（Ａｐｐａｉａｈｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，（２００４）２２（２７−２８），ｐ．３６６９−３６７５）。
本発明のワクチンの製造には、ＨＣＶレプリコンＲＮＡに公知の技術を用いて変異を導入し病原性を原弱もしくは消失させたものを使用することも可能である。
本発明のワクチンは、溶液または懸濁液のいずれかとして、投与可能に調製される。液体中の溶解または懸濁に適した固形物の形態で調製することができる。調製物は乳濁され、またはリポソームにカプセル化され得る。ＨＣＶ粒子などの活性免疫原性成分は、医薬上許容される、活性成分に適合した賦形剤がしばしば混合される。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの混合物がある。さらに、所望であれば、ワクチンは、少量の補助剤（例えば加湿剤または乳化剤）、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効能を高めるアジュバントを含有し得る。有効であり得るアジュバントの例は、限定されないが、以下を包含する。水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称せられる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称せられる）、およびＲＩＢＩ。ＲＩＢＩは、バクテリアから抽出した３成分、すなわちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＨＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルジョン中に含有している。アジュバントの効能は、ＨＣＶ粒子から構成されるワクチンを投与することにより生じるこの免疫原性ＨＣＶ粒子に対する抗体の量を測定することにより、決定され得る。
本ワクチンは、通常非経口的に、例えば皮下注射または筋内注射のような注射により投与される。他の投与経路に適した別の剤形として、坐薬、および場合により経口製剤が挙げられる。
所望により、アジュバント活性を有する１以上の化合物をＨＣＶワクチンに加えることができる。アジュバントは、該免疫系の非特異的刺激因子である。それらは、ＨＣＶワクチンに対する宿主の免疫応答を増強する。当技術分野で公知のアジュバントの具体例としては、フロイント完全および不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、サポニン、鉱油、植物油およびＣａｒｂｏｐｏｌが挙げられる。粘膜適用に特に適したアジュバントとしては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）またはコレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）毒素（ＣＴ）が挙げられる。他の適当なアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは酸化アルミニウム、油性乳剤（例えば、Ｂａｙｏｌ（登録商標）またはＭａｒｃｏｌ ５２（登録商標）のもの）、サポニンまたはビタミンＥソリュビリゼートが挙げられる。好ましい形態においては、本発明のワクチンはアジュバントを含む。
例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内に投与する注射剤において、本発明のＨＣＶワクチンとともに含められる医薬上許容される担体または希釈剤の他の具体例としては、安定化剤、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清または脱脂乳などのタンパク質含有物質、およびバッファー（例えば、リン酸バッファー）などが挙げられる。
坐薬に使用される従来の結合剤および担体には、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが包含され得る。坐薬は、活性成分を０．５％から５０％までの範囲で、好ましくは１％から２０％までの範囲で含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、通常用いられる賦形剤を含有してもよい。この賦形剤としては、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
本発明のワクチンは、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤、または粉剤の剤形をとることができ、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分（ウイルス粒子又はその一部分）を含有する。
本ワクチンは、投与剤形に適した方法で、そして予防および／または治療効果があるような量で投与される。投与されるべき量は、通常１回の投与当たり抗原を０．０１μｇから１００，０００μｇまでの範囲であり、これは、処置される患者、その患者の免疫系での抗体合成能、および所望の防御の程度に依存し、経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内経路などの投与経路にも依存する。
本ワクチンは、単独投与スケジュールで、または好ましくは複合投与スケジュールで与えられ得る。複合投与スケジュールでは、接種の開始時期に１〜１０回の個別の投与を行い、続いて免疫応答を維持するおよびまたは強化するのに必要とされる時間間隔で、例えば２回目の投与として１〜４ヵ月後に、別の投与を行い得る。必要であれば、数ヶ月後に引続き投与を行い得る。投与レジメもまた、少なくとも部分的には、個々の患者の必要性により決定され、医師の判断に依存する。
さらに、免疫原性ＨＣＶ粒子を含有するワクチンは、他の免疫制御剤（例えば、免疫グロブリン）と共に投与してもよい。
ＨＣＶ粒子ワクチンは、健常人に投与して、健常人にＨＣＶに対する免疫応答を誘導することにより、新たに生じ得るＨＣＶ感染に対して予防的に使用することもできる。更に、ＨＣＶ粒子ワクチンをＨＣＶに感染した患者に投与し、生体内にＨＣＶに対する強い免疫反応を誘導することにより、ＨＣＶを排除する治療的ワクチンとして使用することもできる。
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞、又はそれらの細胞において産生されるウイルス粒子を感染させたＣ型肝炎ウイルス感染細胞を、例えばＣ型肝炎ウイルスの複製、ウイルス粒子の再構築、ウイルス粒子の放出を促進又は抑制する物質（抗Ｃ型肝炎ウイルス物質）をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には、例えば、被験物質の存在下でそれらの細胞を培養し、得られる培養物中の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ又はウイルス粒子を検出し、その被験物質がレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの複製又はウイルス粒子の形成若しくは放出を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。この場合、培養物中の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの検出は、上記細胞から抽出したＲＮＡ中の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの量、割合若しくは有無を測定することによるものであってよい。培養物（主として培養上清）中のウイルス粒子の検出は、培養上清中に含まれるＨＣＶタンパク質の量、割合若しくは有無を検出するものであってよい。
また本培養物中のウイルス粒子を検出することにより、ＨＣＶ感染患者血清から精製した免疫グロブリンが本発明によるＨＣＶウイルス粒子の感染を阻止する能力を有するかどうかを検討することができる。この試験においては、本発明のＨＣＶウイルス粒子により免疫したマウス、ラット、ウサギなどの血清を用いても良い。ＨＣＶの部分蛋白質、ＨＣＶ遺伝子などによる免疫を利用してもよい。抗体分子以外の、感染を阻止できる他の物質についても、この試験を同様に適用することができる。
本発明のＨＣＶウイルス粒子に対して産生される本発明の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を包含する。ポリクローナル抗体が望ましい場合、まず、選択された哺乳類（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマなど）を、本発明のＨＣＶ粒子で免疫感作する。感作動物由来の血清を採集し、既知の手法に従って処理する。ＨＣＶエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合には、このポリクローナル抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製すればよい。ポリクローナル抗血清を産生させる方法およびそれを処理する方法は当該分野で既知である。ポリクローナル抗体は、既にＨＣＶに感染した哺乳類から単離してもよい。
ＨＣＶエピトープに対するモノクローナル抗体もまた、当業者により容易に製造され得る。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造する一般的な方法は、周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載された方法を用いることができる。
モノクローナル抗体産生細胞株は、細胞融合により生成してもよく、また、腫瘍遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換またはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスでの形質移入のような他の方法によっても生成してもよい。
これらの方法によって得られたモノクローナル抗体や、ポリクローナル抗体は、ＨＣＶの診断や治療、予防に有用である。
本発明のＨＣＶ粒子を用いて作製された抗体は、医薬上許容される、溶解剤、添加剤、安定化剤、バッファーなどともに投与される。投与経路は、いずれの投与経路でも良いが、好ましくは、皮下、皮内、筋肉内投与であり、より好ましくは、静脈内投与が好ましい。
本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶ粒子とＨＣＶ感受性細胞とを、ＨＣＶの細胞への結合を促進又は抑制する物質をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には例えば、被験物質の存在下で、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞において産生されたＨＣＶ粒子とともにＨＣＶ感受性細胞を培養し、得られる培養物中の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又はウイルス粒子を検出し、その被験物質がレプリコンＲＮＡの複製又はウイルス粒子の形成を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。
このような全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ若しくは全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ又はウイルス粒子の検出は、上述の手法又は後述の実施例に従って行うことができる。上記試験系は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の予防剤、治療剤若しくは診断剤の製造又は評価のためにも使用することができる。
具体的には、本発明の上記試験系の利用例としては以下が挙げられる。
（１）ＨＣＶの増殖及び感染を抑制する物質の探索
ＨＣＶの増殖及び感染を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的にＨＣＶの増殖及び感染に影響を及ぼす有機化合物、あるいはＨＣＶゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりＨＣＶの増殖若しくはＨＣＶタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
（２）細胞培養中で抗ウイルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、合理的ドラッグデザイン又はハイスループットスクリーニングを用いて得られた物質（例えば単離精製された酵素）等が挙げられる。
（３）ＨＣＶに感染した患者の治療のための、新規攻撃標的の同定
例えばＨＣＶウイルス増殖のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパク質を同定するために、本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞を使用することができる。
（４）ＨＣＶウイルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる変異の同定
（５）Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断薬又は治療薬の開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質の製造
（６）Ｃ型肝炎ウイルス感染のワクチンの開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質及び弱毒化ＨＣＶの製造
（７）Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断又は治療用のポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の製造。
本発明を、以下の実施例及び図面に基づいてさらに具体的に説明する。但し本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ由来の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの作製
（Ａ）発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスであるＪＦＨ−１株（遺伝子型２ａ）のゲノム全長ｃＤＮＡを含むＤＮＡ（ＪＦＨ−１クローン）を、ｐＵＣ１９プラスミド中でＴ７ ＲＮＡプロモーター配列の下流に挿入したプラスミドＤＮＡを作製した。
具体的には、ＪＦＨ−１株のウイルスＲＮＡを増幅したＲＴ−ＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングしてｐＧＥＭ１−２５８、ｐＧＥＭ４４−４８６、ｐＧＥＭ３１７−８４９、ｐＧＥＭ６１７−１３２３、ｐＧＥＭ１１４１−２３６７、ｐＧＥＭ２２８５−３５０９、ｐＧＥＭ３４７１−４６６５、ｐＧＥＭ４５４７−５９７０、ｐＧＥＭ５８８３−７００３、ｐＧＥＭ６９５０−８０３５、ｐＧＥＭ７９８４−８８９２、ｐＧＥＭ８６８０−９２８３、ｐＧＥＭ９２３１−９６３４及びｐＧＥＭ９５９４−９６７８の各プラスミドＤＮＡを得た（非特許文献６を参照）。各プラスミドに含まれるウイルスゲノムＲＮＡ由来のｃＤＮＡをＰＣＲ法および制限酵素を用いてつなぎ合わせて、全長のウイルスゲノムｃＤＮＡをクローニングした。全長のウイルスゲノムの上流にＴ７Ｒ ＲＮＡプロモーター配列を挿入した。このようにして構築されたプラスミドＤＮＡを、以下、ｐＪＦＨ１と称する（図１上段）。なお、上記ＪＦＨ−１クローンの作製については、特許文献１及び非特許文献３に記載されている。またＪＦＨ−１クローンの全長ｃＤＮＡの塩基配列は、国際ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）のアクセッション番号：ＡＢ０４７６３９に登録されている。
次に、プラスミドＤＮＡであるｐＪＦＨ１の５’非翻訳領域とｃｏｒｅ領域の間に、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）及びネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とも称する）を挿入して、プラスミドＤＮＡであるｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１を構築した（図１の下段）。この構築手順は、既報（非特許文献４）に従った。また、ｐＪＦＨ１及びｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１中のＮＳ５Ｂ領域について、該領域にコードされるＲＮＡポリメラーゼの活性中心に相当するアミノ酸モチーフＧＤＤをＧＮＤに変異させる突然変異を導入して、突然変異プラスミドクローンｐＪＦＨ１／ＧＮＤ、及びｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤも作製した。突然変異クローンｐＪＦＨ１／ＧＮＤ及びｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤは、それにコードされるＮＳ５Ｂタンパク質の活性部位のアミノ酸配列が変異しているため、レプリコンＲＮＡを複製するのに必要な活性ＮＳ５Ｂタンパク質を発現することができない。
さらに、レポーター遺伝子導入発現ベクターとして、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の４１５から４２０番のＭｌｕＩサイトと２０７５から２０８２番のＰｍｅＩサイトの間にルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のネオマイシン耐性遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子に置換したｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃを作製した。また、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃの１０９３３番をＧからＡに変異させ、ＮＳ５ｂのＲＮＡポリメラーゼの活性中心のＧＤＤモチーフをＧＮＤに変えた変異体ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ／ＧＮＤを作製した。
ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の４１５から４２０番のＭｌｕＩサイトと１１４２から１１４９番のＰｍｅＩサイトの間に緑色蛍光タンパク質遺伝子を導入し、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のネオマイシン耐性遺伝子を緑色蛍光タンパク質遺伝子に置換したｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰを作製した。さらに、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰの１００００番をＧからＡに変異させ、ＮＳ５ｂのＲＮＡポリメラーゼの活性中心のＧＤＤモチーフをＧＮＤに変えた変異体ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ／ＧＮＤを作製した。
ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１の４１５から４２０番のＭｌｕＩサイトと１９８２から１９８９番のＰｍｅＩサイトの間に分泌型胎盤アルカリ性フォスファターゼ遺伝子を導入し、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のネオマイシン耐性遺伝子を分泌型胎盤アルカリ性フォスファターゼ遺伝子に置換したｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰを作製した。また、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰの１０８４０番をＧからＡに変異させ、ＮＳ５ｂのＲＮＡポリメラーゼの活性中心のＧＤＤモチーフをＧＮＤに変えた変異体ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ／ＧＮＤを作製した。
（Ｂ）全長ＨＣＶゲノムＲＮＡと全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの作製
全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ合成及び全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ合成に用いる鋳型ＤＮＡを作製するために、上記のとおり構築した発現ベクターｐＪＦＨ１、ｐＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤを、それぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断した。次いで、これらのＸｂａＩ切断断片のそれぞれについて、１０〜２０μｇを５０μｌの反応液中に含有させ、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ２０ Ｕを用いて３０℃で３０分間インキュベートすることにより、さらに処理した。Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅは、二本鎖ＤＮＡ中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記ＸｂａＩ切断断片をそのまま鋳型として用いてＲＮＡ合成を行うと、ＸｂａＩの認識配列の一部であるＣＵＧＡの４塩基が３’末端に余分に付加されたレプリコンＲＮＡが合成されてしまう。そこで本実施例では、ＸｂａＩ切断断片をＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅで処理することにより、ＸｂａＩ切断断片からＣＵＧＡの４塩基を除去した。この後、ＸｂａＩ切断断片を含むＭｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理後の溶液について、通常法に従ったタンパク質除去処理により、ＣＵＧＡの４塩基が除去されたＸｂａＩ切断断片を精製して、これを鋳型ＤＮＡとした。
次に、この鋳型ＤＮＡから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ合成した。このＲＮＡ合成にはＡｍｂｉｏｎ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを用いた。鋳型ＤＮＡを０．５〜１．０マイクログラム含む反応液２０μｌを製造業者の使用説明書に従って反応させた。
ＲＮＡ合成終了後、反応溶液にＤＮａｓｅ（２Ｕ）を添加して３７℃で１５分間反応させた後、さらに酸性フェノールによるＲＮＡ抽出を行って、鋳型ＤＮＡを除去した。このようにしてｐＪＦＨ１、ｐＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤに由来する上述の鋳型ＤＮＡから合成したＲＮＡを、それぞれｒＪＦＨ１、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤと命名した。これらのＲＮＡの塩基配列を、ｒＪＦＨ−１、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１については配列番号１２及び１３、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤ、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤについては配列番号１４及び１５にそれぞれ示す。ｒＪＦＨ１は、ＪＦＨ−１株の全長ＨＣＶゲノムと同じ配列構造をもつ、本発明の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの一例である。ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１は、本発明における全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの一例である。
続いて、上述の通り作製した発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ／ＧＮＤ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ／ＧＮＤ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ、ｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ／ＧＮＤをそれぞれ鋳型として用いて、ＨＣＶレプリコンＲＮＡであるｒＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ（配列番号２１）、ｒＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ／ＧＮＤ（配列番号２２）、ｒＦＧＲ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ（配列番号２３）、ｒＦＧＲ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ／ＧＮＤ（配列番号２４）、ｒＦＧＲ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ（配列番号２５）、ｒＦＧＲ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ／ＧＮＤ（配列番号２６）を上記と同様の方法で製造した。
【実施例２】
細胞内における全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ複製細胞とウイルス粒子産生
（Ｃ）細胞内における全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの複製とウイルス粒子の産生
上記の通り合成した全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ（ｒＪＦＨ１、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤ）のそれぞれを、様々な量で、Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して、ＲＮＡ総量が１０μｇとなるように調製した。次いでその混合ＲＮＡをエレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１２時間、２４時間、４８時間及び７２時間培養した後に、細胞を回収して、細胞からＲＮＡを抽出して、ノーザンブロットで解析した。ノーザンブロット解析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）の記載に従って行った。具体的には、培養後の細胞から抽出したＲＮＡを変性アガロース電気泳動に供し、泳動終了後にＲＮＡをポジティブチャージナイロン膜に転写した。ｐＪＦＨ１から作製した３２ＰラベルしたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、前記のとおり膜に転写したＲＮＡに対しハイブリダイゼーションさせ、次いでその膜を洗浄し、それをフィルムに感光させることにより、ＪＦＨ−１クローンの全長ＨＣＶゲノムＲＮＡに特異的なＲＮＡバンドを検出した。
図２に示すように、ｒＪＦＨ１／ＧＮＤをトランスフェクションした場合、トランスフェクション４時間後において、導入したＲＮＡバンドは弱いシグナルとして確認できたが、時間の経過とともにシグナルは減弱し、２４時間後にはほとんどバンドのシグナルが確認できなかった。一方、ｒＪＦＨ１をトランスフェクションした場合、トランスフェクションの４時間後〜１２時間後には、導入したＲＮＡバンドのシグナルの強さはｒＪＦＨ１／ＧＮＤを導入した場合と同様にいったん減弱したが、２４時間以降にははっきりとしたＲＮＡバンドのシグナルが確認できた。確認されたシグナルはＨＣＶゲノムＲＮＡに特異的であった。つまり導入した全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの一部が複製増殖したものと考えられた。ＲＮＡ複製酵素であるＮＳ５Ｂの活性モチーフを変異させたｒＪＦＨ１／ＧＮＤでは複製はみられず、ＮＳ５Ｂの活性が全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの複製に重要であることが示された。一方、これまでに分離されたＨ７７株（非特許文献７）、Ｊ６株（非特許文献８）や本発明者らが慢性肝炎から分離したＪＣＨ１株（非特許文献６）などのＣ型肝炎ウイルス株に由来する全長ＨＣＶゲノムＲＮＡについても同様の実験をおこなったが、これらの株では全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの複製は全く確認できなかった。
（Ｄ）トランスフェクション細胞培養液中のＨＣＶウイルス粒子の検出
上記に従ってエレクトロポレーション処理を行ったＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１２時間、２４時間、４８時間、及び７２時間培養した後、培養上清中のＨＣＶコアタンパク質を測定した。測定はオーソＨＣＶ抗原ＩＲＭＡテストによって行った（非特許文献９）。図３に示す通り、ｒＪＦＨ１をトランスフェクションして４８時間後及び７２時間後の培養上清中にコアタンパク質が検出された。このコアタンパク質がウイルス粒子として分泌されているかどうかを確認するため、ｒＪＦＨ１をトランスフェクションした７２時間後の培養液をショ糖密度勾配により分画した。６０％（重量／重量）ショ糖溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５／０．１Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡに溶解）２ｍｌ、５０％ショ糖溶液１ｍｌ、４０％ショ糖溶液１ｍｌ、３０％ショ糖溶液１ｍｌ、２０％ショ糖溶液１ｍｌ、１０％ショ糖溶液１ｍｌを遠心チューブに重層し、さらにその上にサンプルの培養上清を４ｍｌ重層した。これをベックマンローターＳ Ｗ４１Ｔｉで４００，０００ＲＰＭ、４℃、１６時間遠心した。遠心終了後遠心チューブの底から０．５ｍｌずつ分画回収した。各分画の密度、ＨＣＶコア蛋白濃度、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ量を定量した。全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる検出は、Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｔ，Ｋａｔｓｕｍｅ Ａ，Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ａｂｅ Ａ，Ｉｎｏｕｅ Ｋ，Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ Ｋ，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｒ，Ｔａｎａｋａ Ｓ，Ｋｏｈａｒａ Ｍ．Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１６：６３６−６４２（１９９９）に従い、全長ＨＣＶゲノムＲＮＡの５’非翻訳領域のＲＮＡを検出することによって行った。具体的には、細胞から抽出したＲＮＡに含まれる全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを、合成プライマー、Ｒ６−１３０−Ｓ１７：５’−ＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧ−３’（配列番号１６）、Ｒ６−２９０−Ｒ１９：５’−ＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＧ−３’（配列番号１７）、ＴａｑＭａｎ Ｐｒｏｂｅ：Ｒ６−１４８−Ｓ２１ＦＴ，５’−ＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣ−３’（配列番号１８）とＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔを用いてＰＣＲ増幅し、次いでＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍにより検出した。
図４に示すように１１番のフラクションでコアタンパク質と全長ＨＣＶゲノムＲＮＡのピークが一致した。このフラクションの密度は約１．１８ｍｇ／ｍｌであり、これまで報告されているコアタンパク質と核酸の結合物よりも軽い比重であった。さらに培養上清を０．２５％ ＮＰ４０で処理した後に同様の分画を行うと、コアタンパク質と全長ＨＣＶゲノムＲＮＡのピークは比重約１．２８ｍｇ／ｍｌへとシフトした。つまり、ＮＰ４０処理により、脂質を含む比重の軽い表面膜がウイルス粒子から剥離して、核酸とコアタンパク質のみのコア粒子となった結果、比重が重くなったと考えられた。以上の結果から、ｒＪＦＨ１をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションすることにより細胞内で全長ＨＣＶゲノムＲＮＡが複製されたこと、さらにウイルス粒子が形成され、培養上清中に分泌されたことが明らかになった。
【実施例３】
（Ｅ）全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞の作製及び細胞クローンの樹立
実施例１で作製したｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１及びｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤを、実施例２と同様にしてＨｕｈ７細胞へトランスフェクションして全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞の作製を行い、さらに全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンの樹立を試みた。
まず、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１及びｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤのそれぞれをＨｕｈ７細胞へトランスフェクションした後、培養ディッシュにその細胞を播種した。１６時間から２４時間培養した後にＧ４１８を様々な濃度で添加した。週に２回培養液を交換しながら培養を継続した。２１日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。染色されるコロニー数を計測し、トランスフェクションしたＲＮＡ重量あたりに得られたコロニー数を計算した。また、一部の培養ディッシュでは生存細胞のコロニーをクローン化して培養を継続した。クローン化された細胞からＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、タンパク質をそれぞれ抽出した後、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの検出、ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムＤＮＡへの組み込みの有無、ＨＣＶタンパク質の発現を検討した。これらの結果の詳細は下記に示す。
（Ｆ）コロニー形成能
上記のトランスフェクションの結果、トランスフェクションしたレプリコンＲＮＡ １μｇ当たりのコロニー形成能は、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞では、Ｇ４１８濃度が１．０ｍｇ／ｍｌの場合、３６８ ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ；コロニー形成単位）／μｇ・ＲＮＡであった（図５の左側）。これに対して、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＧＮＤをトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞では、コロニー形成が認められなかった（図５の右側）。このことは、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１レプリコンＲＮＡをトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞のコロニー形成能は、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１から発現されるＮＳ５Ｂ（ＲＮＡポリメラーゼ）の活性に依存することを示した。つまり、コロニーを形成した細胞では、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１から発現されるＮＳ５ＢのはたらきによりｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１レプリコンＲＮＡが自律複製することによって、ネオマイシン耐性遺伝子が持続的に発現されＧ４１８耐性が維持される結果、細胞増殖が可能になったものと考えられた。
（Ｇ）樹立した細胞クローンにおける全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの検出
上記（Ｅ）に従ってｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１のＨｕｈ７細胞へのトランスフェクションにより樹立した全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローンから、酸性フェノール抽出法によりトータルＲＮＡを抽出した。次いでこのトータルＲＮＡをノーザンブロット法により解析した。プローブとしてはｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブを用いた。対照としては、トランスフェクションを行っていないＨｕｈ７細胞から同様に抽出したトータルＲＮＡ（図６中、「Ｈｕｈ７」として示す）、Ｈｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の７乗コピー加えたサンプル（図６中、「１０７」として示す）、及びＨｕｈ７細胞から抽出したトータルＲＮＡに試験管内で合成したレプリコンＲＮＡを１０の８乗コピー加えたサンプル（図６中、「１０８」として示す）を用いた。図６中、１〜４は細胞クローンの番号である。
この結果、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１と同程度の大きさのＲＮＡがｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１特異的プローブにより検出された（図６）。これにより、トランスフェクションしたｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１レプリコンＲＮＡが細胞クローン内で複製増殖していることが確認された。また細胞クローン間で、レプリコンＲＮＡの量に差があることが示された。図６中、例えば、クローン２はレプリコンＲＮＡの量が他のクローンに比べて少なかった。
（Ｈ）ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認
（Ｅ）に従って得られた細胞クローン１〜８（図７中ではＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−１〜ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−８と表記）について、その細胞クローンのＧ４１８に対する耐性がネオマイシン耐性遺伝子の宿主細胞ゲノムへの組み込みによるものでないことを確認するために、ネオマイシン耐性遺伝子特異的プライマー（センスプライマー、ＮＥＯ−Ｓ３：５’−ＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡ−３’（配列番号１９），アンチセンスプライマー、ＮＥＯ−Ｒ：５’−ＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＧ−３’（配列番号２０））を用いて、細胞クローンから抽出した宿主細胞のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅を行った。この結果、図７に示すとおり、ネオマイシン耐性遺伝子の増幅が示された陽性クローンは認められなかった。
この（Ｈ）の結果から、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡをトランスフェクションし樹立した細胞クローンでは、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製されていることが確認された。
（Ｉ）ＨＣＶタンパク質の検出
ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションし樹立した細胞クローンから常法によりタンパク質を抽出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法による解析を行った。調べた細胞クローンは、上記（Ｇ）で用いたものと同じである。合成した全長ＨＣＶゲノムＲＮＡをＨｕｈ７細胞に一過性にトランスフェクションして得られた細胞抽出液を陽性対照とした（図８、図９及び図１０中、ＪＦＨ−１として示す）。ＨＣＶのサブジェノミックＲＮＡレプリコン（ＳＧＲ−ＪＦＨ１）をトランスフェクションして得られたクローン細胞抽出液をｃｏｒｅタンパク質の陰性対照として、及びＮＳ３、ＮＳ５ａタンパク質の陽性対照として用いた（図８、図９及び図１０中、ＳＧＲ−ＪＦＨ１として示す）。トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞抽出液は全ての陰性対照として用いた（図８、図９及び図１０中、Ｈｕｈ７として示す）。それぞれの細胞クローンから抽出したタンパク質試料をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にブロッティングし、抗ｃｏｒｅ特異的抗体及び抗ＮＳ３特異的抗体（Ｄｒ．Ｍｏｒａｄｐｏｕｒより分与されたもの；Ｗｏｌｋ Ｂ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０００；７４：２２９３−２３０４）を用いて、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡにコードされているｃｏｒｅタンパク質及びＮＳ３タンパク質を検出した。図８及び図９に示される通り、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をトランスフェクションし樹立した細胞クローン１〜４では、それぞれのタンパク質について陽性対照と同じ大きさのタンパク質が検出された。トランスフェクションしていないＨｕｈ７細胞ではｃｏｒｅタンパク質、及びＮＳ３タンパク質も検出されなかったため、細胞クローン１〜４では、トランスフェクションされた全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが自律複製し、さらにｃｏｒｅタンパク質やＮＳ３タンパク質が発現されていることが確認された。
なお、Ｃ型肝炎患者の血清を抗体として用いることにより、上記でＮＳ３タンパク質の発現が確認された各細胞クローンについて、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡからのＮＳ５Ａタンパク質の発現も同様に確認した（図１０）。
以上の（Ｈ）及び（Ｉ）の結果から、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡをトランスフェクションし樹立した細胞クローンでは、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製され、さらにウイルスタンパク質が発現されていることが確認された。
（Ｊ）全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞におけるウイルス粒子産生
上記（Ｅ）に従ってｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１をＨｕｈ７細胞へトランスフェクションし、樹立した全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞クローン２及び３（ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３）（７）培養上清を回収して、上記（Ｄ）と同様の方法で、培養上清中のＨＣＶウイルス粒子を測定した。この結果を図１１に示す。図１１中、網掛けの円は各フラクション（画分）の比重（ｇ／ｍｌ）を示す。また黒塗りの円は、ｃｏｒｅタンパク質の量（ｆｍｏｌ／Ｌ）を示す。白抜きの円は、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡの力価（×０．１コピー／ｍＬ）を示す。
図１１に示すように、比重が約１．１８〜１．２０ｍｇ／ｍｌとなるフラクションで、ｃｏｒｅタンパク質と全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡのピークは一致していた。またそれよりも軽い分画にも小さなピークを認めた。以上の結果から、ｒＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１１をトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞中では、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡが複製されたこと、及びウイルス粒子が形成されて培養上清中に分泌されたことが示された。
【実施例４】
（Ｋ）培養上清中のウイルス粒子の感染実験
（Ｈ）で用いた細胞クローン１〜８（ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−１、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−２、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−４、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−５、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−６、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−７、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−８）のそれぞれの培養上清をＨｕｈ７細胞に添加して、培養上清中のウイルス粒子をＨｕｈ７細胞に感染させた。感染翌日に感染させたＨｕｈ７細胞の培養液にＧ４１８を０．３ｍｇ／ｍｌ添加し、さらに２１日間培養した。培養終了後に細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色したところ、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−５、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−６の培養上清を用いて感染させた細胞についてコロニー形成が観察された。一方、対照に用いたサブジェノミックレプリコン細胞ＳＧＲ−ＪＦＨ１／４−１（非特許文献６記載）の培養上清を用いて感染させた細胞ではコロニー形成はみられなかった。図１２に、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３とＳＧＲ−ＪＦＨ１／４−１の培養上清４ｍｌまたは８ｍｌをＨｕｈ７細胞に添加し、２１日間培養した後に染色した培養ディッシュの写真を示す。ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３の培養上清４ｍｌを添加した細胞を播種したディッシュには３コロニー、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３の培養上清８ｍｌを添加した細胞を播種したディッシュには９コロニーの形成を確認した。しかし、ＳＧＲ−ＪＦＨ１／４−１の培養上清を添加した細胞を播種したディッシュではコロニー形成はみられなかった。
ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−５の培養上清を用いてＣ型肝炎ウイルスに感染させ、形成されたコロニーを、次いでクローン化した。ＦＧＲ−ＪＦＨ１／２−３の培養上清を用いた培養ディッシュから、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１１、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１２、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１３の３クローンを樹立した。ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５の培養上清を用いた培養ディッシュから、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１１、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１２の２クローンを樹立した。
ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１１、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１２、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１３、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１１、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１２の各細胞クローンの培養上清を用いて再度Ｈｕｈ７細胞を感染させると、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１２、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１２の培養上清を用いた培養ディッシュではコロニーの形成が観察された。ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１２の培養上清を用いて感染させた細胞から、さらにＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１２−１，ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−３−１２−２の２クローンを樹立した。ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１２の培養上清を用いて感染させた細胞から、さらにＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１２−１、ＦＧＲ−ＪＦＨ１／Ｃ２−５−１２−２の２クローンを樹立した。
以上の通り全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞の培養上清を用いて感染させ、その感染細胞より樹立したこれらの細胞クローンから、ＲＮＡ、タンパク質、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲでネオマイシン耐性遺伝子の組み込みの有無を検討したところ、いずれも陰性であった。また、ＲＮＡを鋳型とする定量的ＰＣＲ法により、細胞内で複製している全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを検出することができた。さらに培養上清中にｃｏｒｅタンパク質を検出することができた。この結果は、本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ複製細胞から産生された全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡを含むウイルス粒子が、新たな細胞に感染することができることを示している。
【産業上の利用可能性】
本発明の方法により、ＨＣＶウイルス粒子を細胞培養系で作製することができる。本発明のレプリコンＲＮＡを用いれば、細胞培養系においてＨＣＶの全長ゲノムＲＮＡを含有するＲＮＡを効率よく製造することができる。また本発明に係る全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを導入した細胞を用いれば、全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを複製し、本発明のＨＣＶウイルス粒子を細胞培養系で持続的に産生させることができる。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを導入した細胞は、ＨＣＶの複製過程、ウイルス粒子形成過程、ウイルス粒子の細胞外放出過程に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として利用することもできる。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ及び全長ＨＣＶゲノムＲＮＡ並びにウイルス粒子は、外来遺伝子のウイルスベクターとしても有用である。本発明のウイルス粒子又はその一部分はまた、Ｃ型肝炎ウイルスに対するワクチン抗原としてワクチンに含有させることができる。さらに、本発明のウイルス粒子と他の細胞とを一緒に培養する系を、ウイルス粒子の細胞への感染に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として利用することができる。本発明の全長ＨＣＶレプリコンＲＮＡ又は全長ＨＣＶゲノムＲＮＡはまた、ＨＣＶの全長ゲノム配列を容易に複製することができる鋳型としても有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願の全体を参照として本明細書に組み入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡの５’非翻訳領域を示す。
配列番号２の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのｃｏｒｅタンパク質コード配列を示す。
配列番号３の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＥ１タンパク質コード配列を示す。
配列番号４の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＥ２タンパク質コード配列を示す。
配列番号５の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＮＳ２タンパク質コード配列を示す。
配列番号６の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＮＳ３タンパク質コード配列を示す。
配列番号７の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＮＳ４Ａタンパク質コード配列を示す。
配列番号８の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＮＳ４Ｂタンパク質コード配列を示す。
配列番号９の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＮＳ５Ａタンパク質コード配列を示す。
配列番号１０の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡのＮＳ５Ｂタンパク質コード配列を示す。
配列番号１１の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来のＨＣＶゲノムＲＮＡの３’非翻訳領域を示す。
配列番号１２の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを示す。
配列番号１３の配列は、ＪＦＨ−１クローン由来の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを含むレプリコンＲＮＡを示す。
配列番号１４の配列は、アミノ酸モチーフＧＤＤをＧＮＤに変異させた、ＪＦＨ−１クローン由来の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを示す。
配列番号１５の配列は、アミノ酸モチーフＧＤＤをＧＮＤに変異させた、ＪＦＨ−１クローン由来の全長ＨＣＶゲノムＲＮＡを含むレプリコンＲＮＡを示す。
配列番号１６〜２０の配列は、プライマーを示す。
配列願号２１の配列は、発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ由来のレプリコンＲＮＡを示す。
配列願号２２の配列は、発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／Ｌｕｃ／ＧＮＤ由来のレプリコンＲＮＡを示す。
配列願号２３の配列は、発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ由来のレプリコンＲＮＡを示す。
配列願号２４の配列は、発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＥＧＦＰ／ＧＮＤ由来のレプリコンＲＮＡを示す。
配列願号２５の配列は、発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ由来のレプリコンＲＮＡを示す。
配列願号２６の配列は、発現ベクターｐＦＧＲＥＰ−ＪＦＨ１／ＳＥＡＰ／ＧＮＤ由来のレプリコンＲＮＡを示す。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡの、５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列と、を含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡ。
【請求項２】
前記塩基配列が、前記の５’非翻訳領域、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域を、５’から３’方向へこの順番で含む、請求項１記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項３】
遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡが、配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡである、請求項１又は２記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項４】
５’非翻訳領域が配列番号１に示す塩基配列からなり、ｃｏｒｅタンパク質コード配列が配列番号２に示す塩基配列からなり、Ｅ１タンパク質コード配列が配列番号３に示す塩基配列からなり、Ｅ２タンパク質コード配列が配列番号４に示す塩基配列からなり、ＮＳ２タンパク質コード配列が配列番号５に示す塩基配列からなり、ＮＳ３タンパク質コード配列が配列番号６に示す塩基配列からなり、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列が配列番号７に示す塩基配列からなり、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列が配列番号８に示す塩基配列からなり、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列が配列番号９に示す塩基配列からなり、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列が配列番号１０に示す塩基配列からなり、３’非翻訳領域が配列番号１１に示す塩基配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡ。
（ａ）配列番号１３に示す塩基配列からなるＲＮＡ。
（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列において１〜１００個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＲＮＡであって、自律複製能及びウイルス粒子産生能を有するＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡを細胞に導入することを含む、該レプリコンＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生する細胞を製造する方法。
【請求項７】
細胞が増殖性細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
細胞が真核細胞である、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
真核細胞がヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
真核細胞がＨｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法により製造される、レプリコンＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生する細胞。
【請求項１２】
請求項１１記載の細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法により製造される、Ｃ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項１４】
請求項１１記載の細胞を培養し、培養物中のウイルス粒子を他の細胞に感染させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞を製造する方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法によって製造される、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞。
【請求項１６】
被験物質の存在下で、下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）請求項１１記載の細胞
（ｂ）請求項１５記載のＣ型肝炎ウイルス感染細胞、並びに
（ｃ）請求項１３記載のＣ型肝炎ウイルス粒子及びＣ型肝炎ウイルス感受性細胞、
のうちの少なくとも１つを培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡ又はウイルス粒子を検出することを含む、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
請求項１３記載のＣ型肝炎ウイルス粒子又はその一部分を含有する、Ｃ型肝炎ワクチン。
【請求項１８】
請求項１３記載のＣ型肝炎ウイルス粒子又はその一部分を抗原として使用して、Ｃ型肝炎ワクチンを製造する方法。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡを使用して、遺伝子治療のための肝細胞指向性ウイルスベクターを製造する方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法により製造される、肝細胞指向性ウイルスベクター。
【請求項２１】
外来遺伝子をコードするＲＮＡを請求項１〜５のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡ中に挿入し、それを細胞中に導入することを含む、該細胞内で外来遺伝子を複製及び／又は発現させる方法。
【請求項２２】
配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡを細胞に導入することを含む、該ＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生する細胞を製造する方法。
【請求項２３】
配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡを細胞に導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法。
【請求項２４】
細胞が増殖性細胞である、請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２５】
配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡに外来遺伝子をコードするＲＮＡを挿入し、それを細胞に導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、外来遺伝子を含有するウイルスベクターを製造する方法。
【請求項２６】
請求項１３記載のＣ型肝炎ウイルス粒子に対する抗体。
【請求項１】
遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡの、５’非翻訳領域、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列と、を含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡ。
【請求項２】
前記塩基配列が、前記の５’非翻訳領域、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又は少なくとも１つのリポーター遺伝子、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列、ｃｏｒｅタンパク質コード配列、Ｅ１タンパク質コード配列、Ｅ２タンパク質コード配列、ＮＳ２タンパク質コード配列、ＮＳ３タンパク質コード配列、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列、及び３’非翻訳領域を、５’から３’方向へこの順番で含む、請求項１記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項３】
遺伝子型２ａのＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡが、配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡである、請求項１又は２記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項４】
５’非翻訳領域が配列番号１に示す塩基配列からなり、ｃｏｒｅタンパク質コード配列が配列番号２に示す塩基配列からなり、Ｅ１タンパク質コード配列が配列番号３に示す塩基配列からなり、Ｅ２タンパク質コード配列が配列番号４に示す塩基配列からなり、ＮＳ２タンパク質コード配列が配列番号５に示す塩基配列からなり、ＮＳ３タンパク質コード配列が配列番号６に示す塩基配列からなり、ＮＳ４Ａタンパク質コード配列が配列番号７に示す塩基配列からなり、ＮＳ４Ｂタンパク質コード配列が配列番号８に示す塩基配列からなり、ＮＳ５Ａタンパク質コード配列が配列番号９に示す塩基配列からなり、ＮＳ５Ｂタンパク質コード配列が配列番号１０に示す塩基配列からなり、３’非翻訳領域が配列番号１１に示す塩基配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡ。
（ａ）配列番号１３に示す塩基配列からなるＲＮＡ。
（ｂ）配列番号１３に示す塩基配列において１〜１００個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるＲＮＡであって、自律複製能及びウイルス粒子産生能を有するＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡを細胞に導入することを含む、該レプリコンＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生する細胞を製造する方法。
【請求項７】
細胞が増殖性細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
細胞が真核細胞である、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
真核細胞がヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
真核細胞がＨｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法により製造される、レプリコンＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生する細胞。
【請求項１２】
請求項１１記載の細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法により製造される、Ｃ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項１４】
請求項１１記載の細胞を培養し、培養物中のウイルス粒子を他の細胞に感染させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞を製造する方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法によって製造される、Ｃ型肝炎ウイルス感染細胞。
【請求項１６】
被験物質の存在下で、下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）請求項１１記載の細胞
（ｂ）請求項１５記載のＣ型肝炎ウイルス感染細胞、並びに
（ｃ）請求項１３記載のＣ型肝炎ウイルス粒子及びＣ型肝炎ウイルス感受性細胞、
のうちの少なくとも１つを培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡ又はウイルス粒子を検出することを含む、抗Ｃ型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
請求項１３記載のＣ型肝炎ウイルス粒子又はその一部分を含有する、Ｃ型肝炎ワクチン。
【請求項１８】
請求項１３記載のＣ型肝炎ウイルス粒子又はその一部分を抗原として使用して、Ｃ型肝炎ワクチンを製造する方法。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡを使用して、遺伝子治療のための肝細胞指向性ウイルスベクターを製造する方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法により製造される、肝細胞指向性ウイルスベクター。
【請求項２１】
外来遺伝子をコードするＲＮＡを請求項１〜５のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡ中に挿入し、それを細胞中に導入することを含む、該細胞内で外来遺伝子を複製及び／又は発現させる方法。
【請求項２２】
配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡを細胞に導入することを含む、該ＲＮＡを複製しかつウイルス粒子を産生する細胞を製造する方法。
【請求項２３】
配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡを細胞に導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、Ｃ型肝炎ウイルス粒子の製造方法。
【請求項２４】
細胞が増殖性細胞である、請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２５】
配列番号１２に示す塩基配列からなるＲＮＡに外来遺伝子をコードするＲＮＡを挿入し、それを細胞に導入し、その細胞を培養してウイルス粒子を産生させることを含む、外来遺伝子を含有するウイルスベクターを製造する方法。
【請求項２６】
請求項１３記載のＣ型肝炎ウイルス粒子に対する抗体。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８０５７５
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【発行日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１０３３５（Ｐ２００６−５１０３３５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３２３２
【国際出願日】平成１７年２月２１日（２００５．２．２１）
【出願人】（５９１０６３３９４）財団法人 東京都医学研究機構 (69)
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【発行日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３２３２
【国際出願日】平成１７年２月２１日（２００５．２．２１）
【出願人】（５９１０６３３９４）財団法人 東京都医学研究機構 (69)
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]