ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物ならびにそれらの調製および使用方法
本発明は、式（Ｉ）の化合物、それらを使用する方法、それらを調製するための方法およびピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を調製することができる単離された放線菌株に関する。
【図１】
【図１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物ならびにそれらの使用および調製方法に関する。本発明は、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を産生することができる単離された放線菌種にも関する。
【背景技術】
【０００２】
海生の植物および動物に由来する多環式芳香族アルカロイドは、様々な生物学的活性を示すことが明らかにされている。例えば、五環式ピロロアクリジン化合物であるプラキニジンは、バヌアツの赤い海綿、Ｐｌａｋｏｒｔｉｓに由来し、動物において駆虫活性を有することが明らかにされている（米国特許第４，９５９，３７０号）。
【０００３】
リンホスチンは、ストレプトマイセス属（ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する土壌細菌により産生されるピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミンであり、免疫抑制活性を有することが示唆されている（米国特許第５，８４３，９５５号および第６，８１５，４４９号）。リンホスチンは、下記の構造：
【０００４】
【化１】
を有する。
【０００５】
米国特許第６，８１５，４４９号は、リンホスチンから誘導される合成類似体について記載しており、それらの大部分は、分子の４位において修飾されている。リンホスチンの６位における唯一の変形は、リンパ球阻害活性に１０倍近い低下をもたらした（米国特許第６，８１５，４４９号の表３における化合物番号１を２７と比較されたい）。
【０００６】
出願者らは、驚いたことに、ｍＴＯＲの強力な阻害活性を示す新規ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を開発した。ｍＴＯＲは、細胞成長、細胞増殖、細胞運動、細胞生存、タンパク質合成、および転写を調節し、それ故に様々な癌経路に関与しているセリン／スレオニンキナーゼである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、癌などの異常細胞増殖を伴う疾患の治療において使用するための新規ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、式Ｉ：
【０００９】
【化２】
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３または（ＣＨ２）２ＯＨであり、
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、
ただし、Ｒ２が、メチルである場合、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨである）のピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、式Ｉの化合物もしくは互変異性体、立体異性体またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、式Ｉの単離された化合物、またはその互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を含む組成物を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、受託番号ＮＲＲＬ５０１６８またはＮＲＲＬ５０１６７を有する単離された放線菌株を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様は、受託番号ＮＲＲＬ５０１６８またはＮＲＲＬ５０１６７を有する放線菌株により産生され、ただし、リンホスチンではない単離されたピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物、該化合物の互変異性体、または該化合物もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様は、
発酵液を形成するための塩を含む成長培地中で寄託番号ＮＲＲＬ５０１６８またはＮＲＲＬ５０１６７を有する放線菌株を発酵させるステップであって、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物が発酵液中に形成されるステップと、
場合により、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を精製するステップとを含む、
（ａ）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を調製するための方法、または（ｂ）方法により調製され、ただし、リンホスチンではないピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物もしくは互変異性体、立体異性体またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様は、
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミドからなる群から選択される化合物；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様は、ｍＴＯＲを阻害する方法またはｍＴＯＲに関係している疾患、特に癌に罹患している患者を治療する方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、受託番号ＮＲＲＬ５０１６８またはＮＲＲＬ５０１６７を有する単離された放線菌株を提供する。本発明は、前記株により産生される化合物および組成物ならびに式Ｉの化合物を調製するための方法も提供する。
【００１８】
本発明の他の目的、特徴および利点は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲に包含される様々な変更形態および修正形態が、この詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示しているとはいえ、例示のみのために示されていると理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】放線菌株ＤＰＪ−００１９（受託番号ＮＲＲＬ５０１６８）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のほぼ完全なポリヌクレオチドＤＮＡ配列（配列番号１）を示す図である。
【図１Ｂ】ＤＰＪ−００２４（受託番号ＮＲＲＬ５０１６７）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のほぼ完全なポリヌクレオチドＤＮＡ配列（配列番号２）を示す図である。
【図１Ｃ】サリニスポラアレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）またはサリニスポラトロピカ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ）ｒＲＮＡ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列中には存在しない、ＤＰＪ−００２４の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子における保存ＤＮＡ配列（配列番号３）を示す図である。
【図２】ＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４の、２種の現在認められているサリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、サリニスポラアレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）およびサリニスポラトロピカ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ）の株との系統発生的関係を説明している図である。系統樹は、完全な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサーｒＤＮＡ配列で作成した。近隣結合法を使用して距離を計算した。ブートストラップ値は、１０００個の複製で計算されたが、その値が５０％以上である場合にそれらのそれぞれの節点に示されている。アクチノマズラマズレ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｍａｄｕｒａｅ）を外集団として使用した。
【図３】サリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、サリニスポラアレニコラ（Ｓ．ａｒｅｎｉｃｏｌａ）（配列番号６）およびサリニスポラトロピカ（Ｓ．ｔｒｏｐｉｃａ）（配列番号７）からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のポリヌクレオチドＤＮＡ配列をＤＰＪ−００２４（配列番号２）およびＤＰＪ−００１９（配列番号１）と比較するアラインメントの図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義：
「アルキル」とは、１〜６個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、好ましくは、１〜４個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）を有する一価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。この用語は、一例として、メチル（ＣＨ３−）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ−）、およびｔ−ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ−）などの直線または分岐したヒドロカルビル基を包含する。
【００２１】
「ヒドロキシ」とは、基−ＯＨを指す。
【００２２】
「メトキシ」とは、基−ＯＣＨ３を指す。
【００２３】
「立体異性体」とは、１つまたは複数の立体中心においてキラリティーまたは原子の接続性が異なる化合物を指す。立体異性体は、鏡像異性体、ジアステレオマーならびにシス−トランス（Ｅ／Ｚ）異性を包含する。
【００２４】
本明細書中の様々な場所において、化合物の置換基は、群または範囲で開示される。説明は、そのような群および範囲のメンバーの各々およびすべての個々のサブコンビネーションを包含することが具体的に意図されている。例えば、「Ｃ１〜４アルキル」という用語は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ１〜４、Ｃ１〜３、Ｃ１〜２、Ｃ２〜４、Ｃ２〜３およびＣ３〜４を個々に開示していることが具体的に意図されている。
【００２５】
「互変異性体」とは、エノール−ケトおよびイミン−エナミン互変異性体、またはイミダゾール、ベンゾイミダゾール、トリアゾール、およびテトラゾールなどの環−ＮＨ−部分および環＝Ｎ−部分に接続している環原子を含有するヘテロアリール基の互変異性形態などの、プロトンの位置が異なる化合物の交互に切り替わる形態を指す。
【００２６】
「患者」または「対象」とは、哺乳動物を指し、ヒトおよびイヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウサギおよびサルなどの非ヒト哺乳動物、好ましくは、ヒトを包含する。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「単離された」化合物は、例えば、約９５％純度を超える実質的に純粋な形態か、野生型放線菌株の存在もそれとの接触もないかのどちらかである化合物である。「単離された」株は、その自然の環境から取り出されかつ／または発酵用の成長培地中にある株を示す。
【００２８】
本明細書で使用されるように、細菌株の「発酵すること」または「発酵」という用語は、その株の培養および／またはピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物の放線菌産生などの、化合物の生合成産生の円滑化を指す。
【００２９】
「ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン」化合物は、下記のコア構造
【００３０】
【化３】
を有する。
【００３１】
「薬学的に許容できる塩」とは、化合物の薬学的に許容できる塩を指し、塩は、当技術分野においてよく知られている様々な有機および無機の対イオンから誘導され、ほんの一例として、ナトリウム、アルミニウム、リチウム、亜鉛、ジエタノールアミン塩、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、およびテトラアルキルアンモニウム；ならびに、分子が塩基性官能基を含有する場合に、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））塩などの有機または無機の酸の塩を包含する。本発明のある種の化合物は、様々なアミノ酸とも薬学的に許容できる塩を形成することができる。薬学的に許容できる塩に関する総説については、参照により本明細書に組み込まれているＢＥＲＧＥら、６６ Ｊ．ＰＨＲＭ．ＳＣＩ．１〜１９（１９７７）を参照されたい。
【００３２】
薬学的に許容できる塩は、式（Ｉ）の化合物などの化合物を、塩酸、臭化水素酸、酢酸、リン酸、ホウ酸、過塩素酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、アスコルビン酸、ヨウ化ナトリウムなどの酸または塩と接触させることにより調製される。用いられる溶媒は、アセトン、ジエチルケトン、メチルエチルケトンなどのケトンまたはそれらの混合物、メタノール、エタノール、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、ベンゼン、ジエチルアミン、ホルムアルデヒド、クロロホルム、ジクロロメタンまたはそれらの混合物から選択することができる。
【００３３】
対象における疾患の「治療すること」または「治療」とは、疾患を阻害するかその発生を止めること；疾患の症状を改善すること；または疾患の退行を引き起こすことを指す。したがって、本明細書で使用されるような「癌の治療」は、癌に関係している症状の改善を包含する。
【００３４】
「ｍＴＯＲ活性を変調すること」とは、ｍＴＯＲキナーゼに関係しているプロセスまたはシグナル伝達事象に影響を与えること（すなわち、阻害または刺激）を指す。
【００３５】
「ナトリウムの非存在」への言及は、ナトリウム金属それ自体か任意のナトリウム含有化合物（例えば、塩化ナトリウム）の非存在を示す。
【００３６】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容できる担体」とは、任意のタイプの無毒性で不活性な固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤化助剤を意味する。薬学的に許容できる担体の役割を果たすことができる材料の一部の例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびセルロースアセテートなどのその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油などの油；ベニバナ油；ゴマ油；オリーブ油；トウモロコシ油およびダイズ油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの無毒性の適合性滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、矯味剤および着香剤、保存剤および抗酸化剤であり、それらは、製剤者（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒ）の判断に従って組成物中に存在することもある。他の適当な薬学的に許容できる賦形剤は、参照により本明細書に組み込まれている「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９１に記載されている。
【００３７】
「ＤＰＪ−００１９」という株は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６８を割り当てられている。「ＤＰＪ−００２４」という株は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６７を割り当てられている。
【００３８】
本発明の一態様は、式Ｉ：
【００３９】
【化４】
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３または（ＣＨ２）２ＯＨであり、
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、
ただし、Ｒ２が、メチルである場合、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨである）の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００４０】
別の実施形態において、Ｒ１は、ＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３である。別の実施形態において、Ｒ１は、ＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３であり、Ｒ２は、エチル、イソプロピル、イソブチルおよびｓｅｃ−ブチルである。別の実施形態において、Ｒ２は、Ｃ２〜Ｃ４アルキルである。別の実施形態において、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨである。別の実施形態において、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨであり、Ｒ２は、メチルである。別の実施形態において、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨであり、Ｒ２は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチルおよびｓｅｃ−ブチルからなる群から選択される。別の実施形態において、Ｒ２は、イソプロピルである。別の実施形態において、Ｒ１は、ＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３であり、Ｒ２は、エチルまたはイソプロピルである。別の実施形態において、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨであり、Ｒ２は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチルまたはｓｅｃ−ブチルである。
【００４１】
本発明の別の態様は、
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミドからなる群から選択される化合物もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００４２】
本発明の別の態様は、薬学的に許容できる担体および本明細書に記載されている式Ｉの化合物；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物を提供する。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されている単離された式Ｉの化合物；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を含む組成物を提供する。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、配列番号１に対して少なくとも９９．９％の相同性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を特徴とする単離された放線菌株であって、ナトリウムの非存在下で成長することができる放線菌株を提供する。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６８を有する単離された放線菌を提供する。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６８を有する放線菌株により産生され、ただし、リンホスチンではない本明細書に記載の式Ｉの化合物、該化合物の互変異性体、または該化合物もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供し、化合物は、より詳細な実施形態において、式Ｉの化合物は、
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；および
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミド；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。
【００４７】
本発明の別の実施形態は、配列番号２に対して少なくとも９９．９％の相同性を含み、ただし、配列番号３を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を特徴とする単離された放線菌株を提供する。
【００４８】
本発明の別の実施形態は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６７を有する単離された放線菌株を提供する。
【００４９】
本発明の別の実施形態は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６７を有する放線菌株により産生され、ただし、リンホスチンではない単離されたピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物、該化合物の互変異性体、または該化合物もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００５０】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されている単離された式Ｉの化合物、該化合物の互変異性体、または該化合物もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供し、化合物は、本明細書に記載されている放線菌株により産生される。より詳細な実施形態において、式Ｉの化合物は、
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；および
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミド；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。
【００５１】
本発明の別の実施形態は、癌に罹患している患者を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載されている式Ｉの化合物、もしくは互変異性体または薬学的に許容できるそれらの塩を投与することを含む方法を提供する。より詳細な実施形態において、式Ｉの化合物は、
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；および
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミド；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。
【００５２】
別の実施形態において、患者は、結腸癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌腫、腎細胞癌腫、舌の癌、膀胱癌腫（ｃｉｌｉｕｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、繊毛癌腫、肝癌、前立腺癌、子宮癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、肉芽腫、カポジ肉腫、脳癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、精巣癌、膵癌、副腎腫、血管内皮腫、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または多発性骨髄腫に罹患している。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、ｍＴＯＲを阻害する方法であって、細胞を、本明細書に記載されているような式Ｉの化合物、その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩と接触させることを含む方法を提供する。
【００５４】
本発明の別の実施形態は、ｍＴＯＲにより仲介される状態に罹患している患者を治療する方法であって、本明細書に記載されているような式Ｉの化合物、その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を投与することを含む方法を提供する。
【００５５】
本発明の別の態様は、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を調製するための方法であって、
発酵液を形成するための塩を含む成長培地中でＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６８を有する放線菌株を発酵させるステップであり、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物が発酵液中で形成されるステップと、
場合により、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を精製するステップとを含む方法を提供する。
【００５６】
より詳細には、該方法は、接触液から化合物を抽出することをさらに含む。より詳細には、該方法は、
発酵液を遠心分離して上清およびペレットを形成させるステップと、
上清からペレットを分離するステップと、
ペレットからピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を抽出するステップとをさらに含む。
【００５７】
方法の別の態様において、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）ではない。より詳細には、塩は、塩化カリウム（ＫＣｌ）である。別の実施形態において、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。別の実施形態において、該方法は、接触ステップの前に、放線菌株からの細胞を含む組織サンプルをホモジナイズすることをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、分離ステップの直後に細胞を溶解するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、抽出ステップの前にペレットを水溶液で洗浄することをさらに含む。別の実施形態において、抽出ステップは、ペレットを有機溶液と接触させることを含む。別の実施形態において、有機溶液は、酢酸エチルを含む。
【００５８】
該方法のより詳細な実施形態は、精製ステップを含み、精製は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。より詳細には、精製ステップは、逆相ＨＰＬＣを含む。あるいはまたはさらに、精製ステップは、順相ＨＰＬＣを含む、より詳細には、順相ＨＰＬＣは、ジオールカラム上で行われる。より詳細には、順相は、トルエン／酢酸エチル混合物中にイソプロパノール約０％〜約１０％を含む溶媒グラジエントシステムを含む。別の実施形態において、逆相ＨＰＬＣは、ＯＤＳカラム上で行われる。より詳細には、逆相は、アセトニトリルおよび水を含む。
【００５９】
別の実施形態において、精製ステップは、ジオールカラム上で行われる順相ＨＰＬＣを含み、化合物は、
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；および
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミド
からなる群から選択される。
【００６０】
別の実施形態において、成長培地は、グルコースをさらに含む。別の実施形態において、成長培地は、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物に特異的な前駆体をさらに含む。
【００６１】
本発明の別の態様は、上に記載されている方法により調製され、ただし、リンホスチンではないピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を提供する。別の実施形態において、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物は、
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミド；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。
【００６２】
本発明の別の態様は、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を調製するための方法であって、
ホヤのディデムナムプロリフェルム（Ｄｉｄｅｍｎｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ）からの細胞を、接触液を形成するための塩を含む成長培地と接触させるステップと、
接触液を遠心分離して上清およびペレットを形成させるステップと、
上清からペレットを分離するステップと、
ペレットからピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を抽出するステップとを含む方法を提供する。
【００６３】
より詳細には、該方法は、抽出ステップの後にピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を精製するステップをさらに含む。
【００６４】
本発明の化合物は、望ましい場合に、従来の無毒性の薬学的に許容できる担体、補助剤、およびビヒクルを含有する用量単位製剤でヒトおよび他の動物に、経口で、非経口で、舌下で、エアゾール化または吸入スプレーにより、直腸に、大槽内に、膣内に、腹腔内に、口腔に、静脈内に、皮下に、髄腔内にまたは局所に投与することができる。局所投与は、経皮パッチ剤などの経皮投与またはイオン泳動装置の使用を含むこともある。本明細書で使用されるような非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射、または注入技法を包含する。
【００６５】
製剤化の方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、第１９版（１９９５）に開示されている。本発明において使用するための医薬組成物は、無菌の発熱物質を含まない液体の溶液剤もしくは懸濁剤、コーティングされたカプセル剤、坐剤、凍結乾燥散剤、経皮パッチ剤の形態または当技術分野において知られている他の形態であってよい。
【００６６】
注射用調製物、例えば、無菌の注射用水性または油性の懸濁剤は、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して知られている技術に従って製剤化することができる。無菌注射用調製物は、例えば、１，３−プロパンジオールまたは１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の無菌の注射用の溶液、懸濁液または乳濁液であってもよい。用いることができる許容できるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁化媒質として従来から用いられている。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを包含する任意の無刺激固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に使用される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通して濾過することにより、または使用に先立って無菌水もしくは他の無菌注射用媒質に溶解もしくは分散させることができる無菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み入れることにより滅菌することができる。
【００６７】
薬物の効果を延ばすために、皮下または筋肉内の注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましいことが多い。このことは、水溶性の乏しい結晶性または非晶性の材料の液体懸濁液の使用により達成することができる。その場合、薬物の吸収速度は、その溶解速度に左右され、結晶サイズおよび結晶形態に左右されることがある。あるいは、非経口で投与された薬物形態の遅延吸収は、油ビヒクル中に薬物を溶解または懸濁させることにより達成することができる。注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマー中で薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより製造することができる。薬物のポリマーに対する比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生体分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（アンヒドリド）を包含する。デポー注射用製剤は、体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することにより調製することもできる。
【００６８】
経口投与のための固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤を包含する。そのような固体剤形において、活性化合物は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容できる、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの賦形剤または担体および／またはａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの加湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶液緩染剤、ｆ）四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、アセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤、およびｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの滑沢剤と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を含むこともある。
【００６９】
類似のタイプの固体組成物は、ラクトースすなわち乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用する軟質および硬質の充填済みゼラチンカプセル剤において充填剤として用いられることもある。
【００７０】
錠剤、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティングおよび医薬製剤技術においてよく知られている他のコーティングなどのコーティングおよびシェルと共に調製することができる。それらは、乳白剤を含有していてもよく、場合により、遅延方式で、腸管のある種の部分において１つまたは複数の活性成分のみを、または優先的に放出する組成物であってもよい。使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを包含する。
【００７１】
活性化合物は、上に述べられているような１つまたは複数の賦形剤と共にマイクロカプセル化形態であってもよい。錠剤、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング、放出制御コーティングおよび医薬製剤技術においてよく知られている他のコーティングなどのコーティングおよびシェルと共に調製することができる。そのような固体剤形において、活性化合物は、スクロース、ラクトースまたはデンプンなどの少なくとも１つの不活性な希釈剤と混合されることがある。そのような剤形は、通常の実施におけるように、不活性な希釈剤以外の追加物質、例えば、錠剤化滑沢剤ならびにステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなどの他の錠剤化助剤を含むこともある。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を含むこともある。それらは、乳白剤を含有していてもよく、場合により、遅延方式で、腸管のある種の部分において１つまたは複数の活性成分のみを、または優先的に放出する組成物であってもよい。使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを包含する。
【００７２】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容できるエマルジョン剤、マイクロエマルジョン剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を包含する。活性化合物に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒などの当技術分野において一般的に使用される不活性な希釈剤、可溶化剤およびエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、ＥｔＯＡｃ、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などの乳化剤を含有することがある。不活性な希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、矯味剤、および着香剤を包含することもある。
【００７３】
本発明の化合物の局所または経皮投与のための剤形は、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、溶液剤、スプレー剤、吸入剤またはパッチ剤を包含する。活性成分は、必要に応じて、薬学的に許容できる担体および任意の必要とされる保存剤または緩衝液と共に無菌条件下で混合される。眼科用製剤、点耳剤なども、本発明の範囲内にあることが企図されている。
【００７４】
本発明の組成物は、液体エアゾールまたは吸入可能な乾燥粉末として送達するために製剤化することもできる。液体エアゾール製剤は、終末細気管支および呼吸細気管支へ送達することができる粒子サイズに大部分を噴霧化することができる。
【００７５】
本発明の化合物の有効量は、一般的に、ｍＴＯＲ活性を検出可能に変調する、またはｍＴＯＲ活性に関係しているかｍＴＯＲ活性変調を受けやすい疾患の症状を緩和するのに十分な任意の量を包含する。有効投与量は、一般的に、単一投与量または分割投与量で宿主に投与される１日総投与量であるはずであり、例えば、１日につき体重１ｋｇ当たり０．００１〜１０００ｍｇ、より好ましくは、１日につき体重１ｋｇ当たり１．０〜３０ｍｇであってよい。容量単位組成物は、１日投与量を構成するためのその約数のような量を含有することができる。一般に、本発明による治療レジメンは、単一投与量または複数投与量で１日当たり本発明の１つまたは複数の化合物約１０ｍｇ〜約２０００ｍｇをそのような治療を必要としている患者に投与することを含む。
【００７６】
単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される宿主および特定の投与様式に応じて異なるであろう。しかしながら、任意の特定の対象についての具体的な投与量レベルは、用いられる具体的な化合物、年齢、体重、一般的健康、性別、食事、投与の時間、投与の経路、排泄の速度、薬物組合せ、および治療を受けている特定の疾患の重症度を包含する様々な要因によって左右されるであろう。所与の状況についての治療有効量は、ルーチンな実験により容易に決定することができ、普通の臨床家の技術と判断の範囲内にある。
【００７７】
本発明の別の態様において、本発明の１つまたは複数の化合物を包含するキットが提供される。代表的なキットは、本発明のｍＴＯＲ阻害剤化合物（例えば、式Ｉの化合物）および有効量の本発明の化合物を投与することにより癌を治療するための指示書を包含する添付文書または他のラベリングを包含する。
【００７８】
本発明は、説明のために本明細書に記載されている実施形態に限定されないが、上の開示の範囲内に入るようなそれらのすべての形態を包含することが理解される。
【００７９】
実施例
寄託：放線菌株ＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４は、ブダペスト条約の条項により、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｔｉｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＣＡＵＲ）内にあるＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＡＲＳ）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに２００８年８月１４日に寄託された。ＮＣＡＵＲの住所は、１８１５ Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ、６１６０４である。ＤＰＪ−００１９株は、特許受託番号ＮＲＲＬ５０１６８を与えられた。ＤＰＪ−００２４株は、特許受託番号ＮＲＲＬ５０１６７を与えられた。
【実施例】
【００８０】
（実施例１）
海生放線菌株ＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９の単離および同定。
細菌株ＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９は、Ｓｈｉｓｈｉｊｉｍａ Ｉｓｌａｎｄ、Ｊａｐａｎにおいてスキューバにより集められたホヤのディデムナムプロリフェルム（Ｄｉｄｅｍｎｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ）Ｋｏｔｔから単離された。凍結サンプルから、内部コア組織１２０ｍｇを無菌海水１ｍＬ中で浸軟させた。得られたホモジナイズされたスラリーを、２種の選択培地上にプレートした。プレートを、放線菌コロニーの存在について定期的に調べた。分離株を新たな寒天培地に移した。
【００８１】
塩依存性成長試験を、ナトリウム、カリウム、セシウム、ルビジウム、およびリチウムを包含する異なる塩を添加した培地Ｍ１で行った。この試験の場合、ＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９株を、４日にわたって海塩を含有する液体培地中で成長させた。各株の菌糸を収集し、１０．３％グルコースで３回洗浄し、同じ溶液中に再懸濁させた。各株１０μＬを、異なる塩を添加したＭ１寒天プレート上に広げ、４〜８週にわたって２８℃にてインキュベートした。ＤＰＪ−００２４のみが、０．４または０．４５Ｍ ＮａＣｌを添加したＭ１上で成長し、それが偏性ナトリウム要求株であることを示唆した。ＤＰＪ−００１９の成長は、０．４５Ｍ ＫＣｌを添加したＭ１ならびに０．４または０．４５Ｍ ＮａＣｌを添加したＭ１上で観察された。０．４５Ｍ ＫＣｌのＭ１寒天からのＤＰＪ−００１９のさらなる継代培養は、０．４５Ｍ ＫＣｌの添加が、固体および液体のＭ１培地におけるＤＰＪ−００１９の成長を支えるのに十分であることを裏付けた。これらの結果は、ＤＰＪ−００１９が、偏性ナトリウム要求株ではないことを示している。
【００８２】
染色体ＤＮＡを、リゾチーム、ＳＤＳ細胞溶解と、続く、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール沈殿を使用してＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９の寒天成長培養物から単離した。ほぼ完全な１６Ｓ ｒＲＮＡを、８ＦＰＬおよび１４９２ＦＰＬの部分プライマーを使用してＰＣＲ増幅させた。株ＤＰＪ−００２４のほぼ完全な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（ｒＤＮＡ）は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるサリニスポラアレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）のそれと９９．２％の相同性およびサリニスポラトロピカ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ）のそれと９９．４％の相同性を共有していた（図３におけるアラインメントを参照）。しかしながら、ＤＰＪ−００２４ ｒＤＮＡは、すべての現在報告されているサリニスポラ属（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ）株において保存されている４つの独特な署名ヌクレオチドのうちの１つである１９８位（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の類似位置２０７に対応する）にアデノシンを有していない。ＤＰＪ−００１９の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるサリニスポラアレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）のそれと９９．２％の相同性およびサリニスポラトロピカ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ）のそれと９９．６％の相同性を共有し、４つのサリニスポラ属（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ）署名ヌクレオチドのすべてを有する（図３）。ＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域ｒＲＮＡ遺伝子も、プライマー１６Ｓ−１５２５Ｆ：ＧＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴ（配列番号４）および２３Ｓ−４０Ｒ：ＴＣＣＣＡＣＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣＧＧ（配列番号５）を使用することにより増幅させた。１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域ｒＤＮＡ配列のアラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＸで行われ、サリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐｅｃｉｅｓ）のいくつかの配列を包含していた。アラインメントから、系統樹を構築し、系統発生的関係を証明した。明確な区別が、サリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐ．）とＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４により構成される群の間に見いだされた（図２）。
【００８３】
生理学的成長試験、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列および１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサーｒＲＮＡ遺伝子配列比較の結果は、ＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９が、成長のためのナトリウムの偏性必要条件および４つの独特な１６Ｓ ｒＲＮＡ署名ヌクレオチドを示す今日公表されている属、サリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）と関連していることを示した。しかしながら、ＤＰＪ−００２４は、４つの独特な１６Ｓ ｒＲＮＡ署名ヌクレオチドのうちの１つ（Ａ２０７）を有していないという事実に基づき、これまでに報告されているサリニスポラ属（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ）株と明らかに区別可能である。ＤＰＪ−００１９は、サリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）に独特な４つの１６Ｓ ｒＲＮＡ署名ヌクレオチドのすべてを有するが、成長にとってのナトリウムの偏性必要条件を有していない。さらに、ＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４の１６Ｓ−２３Ｓ内部転写スペーサー配列は、これら２つの株が、報告されているサリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐｅｃｉｅｓ）と区別可能である独特な群を形成していることを示している。したがって、ＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４は、他のサリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐ．）と密接に関連しているが、それらと区別可能である群として分類学的に分類されているミクロモノスポラセエ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科に属している。
【００８４】
（実施例２）
株ＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９の発酵
種培養：寒天成長培養物のループまたは凍結保存培養物２０μＬを使用して無菌ＷＳＢ４ＹＥ１／２ＳＳ培地７ｍＬに接種し、７２〜９６時間にわたって２８℃および２００ｒｐｍにて回転振盪機で増殖させた。ＷＳＢ４ＹＥ１／２ＳＳ培地は、ｐＨ７．０においてグルコース２０ｇ／Ｌ、ＷＧＥ８０Ｍ（小麦加水分解産物）５ｇ／Ｌ、ＳＥ５０ＭＡＦ（大豆加水分解産物）１５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、可溶性デンプン１０ｇ／Ｌからなる。
【００８５】
発酵：十分に成長したＷＳＢ４ＹＥ１／２ＳＳ種培養からの接種の後、株ＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９を、Ｍ４８−９発酵培地５０ｍＬを含有する２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中で増殖させ、７〜１４日にわたって２８℃および２００ｒｐｍにて回転振盪機で成長させた。Ｍ４８−９培地は、ｐＨ７．０において可溶性デンプン３０ｇ／Ｌ、糖蜜２０ｇ／Ｌ、大豆ペプトン７．５ｇ／Ｌ、酵母エキス２．５ｇ／Ｌ、ＨＰ２０−１０％（ｗ／ｖ）からなる。
【００８６】
ＬＣＭＳ分析のためのサンプル処理：培養ブロス２ｍＬを遠心分離し、上清を捨て、ペレットを、酢酸エチルで２回（各２ｍＬ、合計４ｍＬ）抽出した（菌糸＋ＨＰ２０）。得られた抽出物を真空中で乾燥し、アセトニトリル２００μＬに再溶解し、小さなＥＰ管に移した。混合物を、約５分にわたって最高速度にて遠心分離し、あらゆる沈殿をペレット化した。澄明な抽出物約１００μＬを、ＬＣ／ＭＳ用の挿入部分のある小さなガラスバイアルに移した。
【００８７】
（実施例３）
ＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４により産生される三環式アルカロイド代謝産物の分析用ＬＣＭＳ分析。
サンプル（２μＬ）を、タンデムフォトダイオードアレーおよび質量スペクトル検出付きのＨＰ１１００型Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ液体クロマトグラフを使用して分析した。化合物を、１５分かけて移動相Ａ（水中０．０５％ギ酸）中の１０〜５０％移動相Ｂ（アセトニトリル中０．０５％ギ酸）の線形グラジエントを使用するＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ ２．０×１００ｍｍ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム上で分割した。流速は、０．３ｍｌ／分とした。トータルスキャンＵＶクロマトグラムを、２１０〜６００ナノメートルのスキャン範囲にわたって取得した。ＵＶスペクトルを、２ナノメートルのスキャンステップで２１０〜６００ナノメートルの実行を通じて取得した。ＵＶフローセルから出た後、流出流をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＤＥＣＡイオントラップ質量分析計に入れた。質量分析計にエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）プローブを取り付け、交互陽イオンおよび陰イオンフルスキャン（１５０〜１５００質量単位）モードで動作させた。スプレーニードル電圧は、陽極については４．５ｋＶおよび陰極については４．５ｋＶに設定した。キャピラリー電圧は、それぞれ陽極および陰極について２４Ｖおよび−４７Ｖに設定した。キャピラリー温度は、２７５℃に設定した。窒素を、４０単位に設定されたシースガスとして使用した。
【００８８】
（実施例４）
三環式アルカロイドの単離および精製のための一般的スキーム。
表１に列挙されている化合物番号１、２、３、４、５、６、７、８および９、ならびにリンホスチンを、ＤＰＪ−００１９の培養ブロスから精製した。発酵培養物を遠心分離し、化合物を、酢酸エチルを使用して発酵固体の水洗浄ペレットから抽出した。抽出物を減圧下で乾燥して残渣を形成させ、シリカゲル上に吸着させ、イソプロパノール：トルエン：酢酸エチル、５：３２：６３および１０：３０：６０からなる洗浄液で脱着させた。洗浄液を別々に乾燥し、５％および１０％の濃縮類似体混合物の残渣を形成させた。
【００８９】
５％イソプロパノール残渣は、化合物番号１、２、３、４、５、８、９およびリンホスチンからなっていた。水中アセトニトリルグラジエント（水中２０〜５０％および１０〜４０％アセトニトリルグラジエント）を使用するＯＤＳカラム（ＹＭＣ，Ｉｎｃ．からのＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ Ａ ２５０×２０ｍｍ Ｓ−５μｍ １２０Å）上の逆相高速液体クロマトグラフィー（流速８ｍｌ／分、検出２５４ｎｍ）により、きれいな化合物１および２ならびに化合物番号３、４、５、８および９を含有する３つの他の分画が得られた。１つの分画に対する２回目の逆相クロマトグラフィーにより、化合物番号４と５の混合物が得られた。他の２つの分画に対するトルエン：酢酸エチルの１：２混合物中イソプロパノールのグラジエント（トルエン：酢酸エチル１：２中０〜１０％イソプロパノール）を使用するＤｉｏｌカラムＨＰＬＣ（ＹＭＣ，Ｉｎｃ．からのＹＭＣ−Ｄｉｏｌ−１２０−ＮＰ ２５０×２０ｍｍ Ｓ−５μｍ）を取り付けた順相ＨＰＬＣ（流速：１０ｍｌ／分、検出４６０ｎｍ）により、純粋な化合物番号３および９が得られた。
【００９０】
１０％イソプロパノール分画は、同様に化合物番号６、７、８、９およびリンホスチンからなっていた。水中アセトニトリルグラジエントを使用するＯＤＳカラム上の初回逆相ＨＰＬＣ後に、３つの分画が生じた。そこで、これらの分画の各々を、トルエン：酢酸エチルの１：２混合物中イソプロパノールのグラジエントを使用するＤｉｏｌカラム上でクロマトグラフにかけると、純粋な化合物番号６、７および８が得られた。
【００９１】
（実施例５）
化合物の合成；
【００９２】
【化５】
スキームＡを参照すると、Ｐが、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢｚ）またはｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）などの適当な保護基である式１の化合物のエステル部分の還元と、続く、ベンジル位炭素の酸化により、式２のケトアルコールが得られる。この還元は、約０℃〜約６０℃の温度にて、エーテル、ＴＨＦなどの非プロトン性溶媒中で水素化ホウ素リチウムまたは水素化リチウムアルミニウムなどの別の適当な還元剤を使用して達成することができる。ベンジル位酸化は、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノン（ＤＤＱ）を使用して行うことができる。トリフルオロ酢酸タリウムなどの酸化剤を使用する式２のケトアルコールの芳香族酸化と、続く、ＤＭＦなどの溶媒中での硫酸銅による処理は、式３のフェノールを生成するであろう。
【００９３】
式４の化合物を形成するための式３のケトンの還元と、続く、式４の化合物のベンゾ環の酸化により、式５のキノンが得られる。還元は、約０℃〜約６０℃の温度にて、ＴＨＦまたはエーテルなどの非プロトン性溶媒中でシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化リチウムアルミニウムもしくは水素化ホウ素ナトリウムなどの別の適当な還元剤を使用して達成することができる。式４の化合物の酸化は、室温にて６．４〜７．０のｐＨの下に水性メタノールまたはアセトン中で（ＮＯ（ＳＯ３Ｋ）２）（カリウムニトロソジスルファネート（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｎｉｔｒｏｓｏｄｉｓｕｌｆａｎａｔｅ））を使用して達成することができる。
【００９４】
式６の化合物を形成するための式５の化合物の芳香族基へのアミンの選択的導入、およびそれに続く得られる式６の化合物の両アミノ基の脱保護により、式７のジアミノキノンが得られる。アミンの導入は、ベンジルアミンの付加を介して達成することができる。この反応は、典型的には、約０℃〜約６０℃の温度にてＴＨＦ、ピリジンなどの非プロトン性溶媒中で行われる。得られる式６の化合物の２つの保護されたアミノ基は、約１〜３気圧の圧力および約２０℃〜約８０℃の温度にて、当業者によく知られている標準的な水素化条件下、例えば、炭素上パラジウムの存在下で水素ガスとの反応を介して脱保護することができる。次いで、得られる式７のジアミノキノンは、約０℃〜約８０℃の温度にて酸素または酸素富化空気との反応にかけることにより式８の三環式アルコールに変換することができる。
【００９５】
式８の化合物の一級アルコール基は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（ＴＢＤＭＳＣｌ）またはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）トリフレートなどの適当な試薬、または別の適当なシリル化剤を使用して選択的に保護し、さらなる誘導化に利用可能な遊離アミノ基とすることができる。この反応は、約０℃〜約６０℃の温度にて、ジクロロメタンまたはＴＨＦなどの非水性溶媒中で行うことができる。遊離アミノ基のアシル化は、カルボン酸または酸塩化物などのアシル化剤を使用して達成することができる。この反応に適している溶媒は、酸塩化物の場合のジクロロメタンまたはＴＨＦおよび酸を使用するカップリング反応の場合のＤＭＦまたはＮＭＰなどの極性溶媒を包含する。温度は、約０℃〜約６０℃の範囲であってよい。１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）またはジシクロヘキシルジイミド（ＤＣＣ）などの適切なカップリング試薬により、Ｒ２が（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである式９の化合物が得られる。式９の化合物は、ピリジン中のトリフルオロメタンスルホン酸無水物（ｔｒｉｆｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）との反応と、続く、ジクロロメタンまたはＴＨＦなどの溶媒中でのアジ化テトラブチルアンモニウム（ｎＢｕ４ＮＮ３）またはアジ化ナトリウムとの反応により式１０のアジドに変換することができる。対応するアミノ化合物を得るための式１０のアジドの還元と、続く、当業者によく知られている方法を使用するノシル、Ｂｏｃおよびトシルなどの多くの保護基のうちのいずれかによるアミノ基の保護により、対応する式１１の化合物が得られる。アジド還元は、約０℃〜約６０℃の温度にてＴＨＦなどの非水性溶媒中で、水素化リチウムアルミニウムまたは当業者によく知られている別の適当な還元剤を使用して行うことができる。
【００９６】
式１１の保護された一級アルコールは、約０℃〜約６０℃の温度にてＴＨＦなどの溶媒中でフッ化テトラブチルアンモニウムまたはフッ化水素などのフッ素源を含有する試薬を使用するか塩酸などの鉱酸を使用して脱保護し、式１２のアルコールを製造することができる。約０℃〜約６０℃の温度にて、ジクロロメタンまたはピリジンなどの溶媒中でクロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）または三酸化クロムなどの試薬を使用する式１２のアルコールの酸化により、対応する式１３の化合物が得られる。
【００９７】
約−７８℃〜約６０℃の温度にて、エーテルまたはＴＨＦなどの非プロトン性溶媒中で式１３の化合物を適切に保護されたリチウムエチニル化合物と反応させると、対応する式１５のエチニルアルコールが得られ、次いで、酸化して式１６のエチニルケトンを形成させることができる。酸化は、約０℃〜約６０℃の温度にて、アセトンまたはジクロロメタンなどの溶媒中で二酸化マンガンまたはＰＣＣなどの別の適当な酸化剤を使用して行うことができる。
【００９８】
式１６のエチニルケトンは、例えば、炭酸カリウムまたは別の適当な塩基の存在下に、塩基性条件下でのメタノールとの反応を介して対応する式１７の化合物に変換することができる。この反応に適している溶媒は、メタノールを包含する。適当な温度は、約０℃〜約６０℃の範囲である。当業者によく知られている方法を使用する得られる式１７の化合物の脱保護により、式１８のアセタールが得られ、次いで、モレキュラーシーブなどの脱水剤にかけることにより望ましい式Ｉの化合物に変換することができる。
【００９９】
式Ｉのさらなる還元は、メタノールなどの溶媒中でＰｄ／ＣまたはＰｔ／Ｃのような試薬および水素ガスを使用する接触水素化を使用するかＴＨＦまたはエーテルなどの溶媒中で水素化リチウムアルミニウムなどの水素化物源を使用して行うことができる。
【０１００】
（実施例６）
ｍＴＯＲキナーゼアッセイ
精製酵素によるルーチンなヒトＴＯＲアッセイを、以下の通りＤＥＬＦＩＡフォーマットにより９６ウェルプレート中で行った。まず、酵素を、キナーゼアッセイ緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ β−グリセロホスフェート、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．２５μＭミクロシスチンＬＲ、および１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ）中で希釈した。各ウェルに、希釈酵素１２μＬを、試験阻害剤０．５μＬまたは対照ビヒクルジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と共に短時間混合した。キナーゼ反応を、ＡＴＰおよびＨｉｓ６−Ｓ６Ｋを含有するキナーゼアッセイ緩衝液１２．５μＬを加え、８００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＡＧ−ＴＯＲ、１００μＭ ＡＴＰおよび１．２５μＭ Ｈｉｓ６−Ｓ６Ｋを含有する２５μＬの最終反応体積とすることにより開始させた。反応プレートを、穏やかに振盪させながら室温にて２時間にわたって（１〜６時間にて直線的に）インキュベートし、次いで、停止緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＥＧＴＡ）２５μＬを加えることにより終了させた。リン酸化（Ｔｈｒ−３８９）Ｈｉｓ６−Ｓ６ＫのＤＥＬＦＩＡ検出は、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ−Ｎ１−ＩＴＣ（Ｅｕ）（１抗体当たり１０．４Ｅｕ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識されたモノクローナル抗Ｐ（Ｔ３８９）−ｐ７０Ｓ６Ｋ抗体（１Ａ５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用して室温にて行った。ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液およびＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ溶液は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから購入した。終了したキナーゼ反応混合物４５μＬを、ＰＢＳ５５μＬを含有するＭａｘｉＤｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。Ｈｉｓ６−Ｓ６Ｋを２時間にわたって接続させた後、ウェルを吸引し、ＰＢＳで１回洗浄した。４０ｎｇ／ｍＬ Ｅｕ−Ｐ（Ｔ３８９）−Ｓ６Ｋ抗体と共にＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液１００μＬを加えた。抗体結合を、穏やかにかき混ぜながら１時間にわたって続けた。次いで、ウェルを吸引し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。ＤＥＬＦＩＡ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ溶液１００μＬを各ウェルに加え、プレートを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒモデルプレートリーダーで読み取った。得られたデータを使用し、酵素活性および潜在的阻害剤による酵素阻害を計算した。ｍＴＯＲ ＩＣ５０データ（μＭで報告されている）は、表１に提供されている。
【０１０１】
【表１−１】
【０１０２】
【表１−２】
【０１０３】
（実施例７）
インビトロ細胞成長アッセイ
ヒト腫瘍系ＬＮＣａｐおよびＭＤＡ４６８の細胞を、１ウェル当たりおおよそ３０００細胞にて９６ウェル培養プレートにプレートした。プレートした翌日に、様々な投与量のｍＴＯＲ阻害剤を細胞に加えた。薬物処理から３日後に、生存細胞密度を、十分に確立された細胞増殖アッセイである色素ＭＴＳの代謝的変換（生存細胞による）により決定した。アッセイは、キットと併せて供給されるプロトコルに従ってＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入したアッセイキットを使用して行った。ＭＴＳアッセイ結果は、４９０ｎｍにおいて吸光度を測定することにより９６ウェルプレートリーダー中で読み取った。各処理の効果は、同じ培養プレート中で成長させたビヒクル処理細胞に対する成長の制御のパーセントとして計算した。成長の５０％阻害をもたらした薬物濃度をＩＣ５０（μＭ）として決定した。表１中の化合物をスクリーニングしたところ、化合物１、２および４は、２０〜３００ｎＭのＬＮＣａｐ ＩＣ５０を示した。
【０１０４】
（実施例８）
腫瘍細胞ｍＴＯＲ阻害アッセイ
ヒト癌細胞（ＬＮＣａｐ前立腺、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫）を、一晩にわたって成長培地中の６ウェルプレートにプレートした。細胞を、６時間にわたって様々な投与量のｍＴＯＲ阻害剤で処理した。総細胞溶解物を、ＮｕＰＡＧＥ−ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製し、超音波処理し、次いで、遠心分離により清澄化した。等量のタンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ電気泳動システムを使用する免疫ブロッティング分析にかけ、ＡＫＴ、Ｓ６Ｋ１、４ＥＢＰ１などのｍＴＯＲ経路マーカーに対するホスホ特異的（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体で探索した。表１中の化合物をスクリーニングしたところ、化合物１、２および４は、５０〜８００ｎＭのＭＤＡ４６８ ＩＣ５０を示した。
【受託番号】
【０１０５】
ＮＲＲＬ５０１６７
ＮＲＲＬ５０１６８
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物ならびにそれらの使用および調製方法に関する。本発明は、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を産生することができる単離された放線菌種にも関する。
【背景技術】
【０００２】
海生の植物および動物に由来する多環式芳香族アルカロイドは、様々な生物学的活性を示すことが明らかにされている。例えば、五環式ピロロアクリジン化合物であるプラキニジンは、バヌアツの赤い海綿、Ｐｌａｋｏｒｔｉｓに由来し、動物において駆虫活性を有することが明らかにされている（米国特許第４，９５９，３７０号）。
【０００３】
リンホスチンは、ストレプトマイセス属（ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する土壌細菌により産生されるピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミンであり、免疫抑制活性を有することが示唆されている（米国特許第５，８４３，９５５号および第６，８１５，４４９号）。リンホスチンは、下記の構造：
【０００４】
【化１】
を有する。
【０００５】
米国特許第６，８１５，４４９号は、リンホスチンから誘導される合成類似体について記載しており、それらの大部分は、分子の４位において修飾されている。リンホスチンの６位における唯一の変形は、リンパ球阻害活性に１０倍近い低下をもたらした（米国特許第６，８１５，４４９号の表３における化合物番号１を２７と比較されたい）。
【０００６】
出願者らは、驚いたことに、ｍＴＯＲの強力な阻害活性を示す新規ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を開発した。ｍＴＯＲは、細胞成長、細胞増殖、細胞運動、細胞生存、タンパク質合成、および転写を調節し、それ故に様々な癌経路に関与しているセリン／スレオニンキナーゼである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、癌などの異常細胞増殖を伴う疾患の治療において使用するための新規ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、式Ｉ：
【０００９】
【化２】
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３または（ＣＨ２）２ＯＨであり、
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、
ただし、Ｒ２が、メチルである場合、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨである）のピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、式Ｉの化合物もしくは互変異性体、立体異性体またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、式Ｉの単離された化合物、またはその互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を含む組成物を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、受託番号ＮＲＲＬ５０１６８またはＮＲＲＬ５０１６７を有する単離された放線菌株を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様は、受託番号ＮＲＲＬ５０１６８またはＮＲＲＬ５０１６７を有する放線菌株により産生され、ただし、リンホスチンではない単離されたピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物、該化合物の互変異性体、または該化合物もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様は、
発酵液を形成するための塩を含む成長培地中で寄託番号ＮＲＲＬ５０１６８またはＮＲＲＬ５０１６７を有する放線菌株を発酵させるステップであって、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物が発酵液中に形成されるステップと、
場合により、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を精製するステップとを含む、
（ａ）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を調製するための方法、または（ｂ）方法により調製され、ただし、リンホスチンではないピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物もしくは互変異性体、立体異性体またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様は、
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミドからなる群から選択される化合物；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様は、ｍＴＯＲを阻害する方法またはｍＴＯＲに関係している疾患、特に癌に罹患している患者を治療する方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、受託番号ＮＲＲＬ５０１６８またはＮＲＲＬ５０１６７を有する単離された放線菌株を提供する。本発明は、前記株により産生される化合物および組成物ならびに式Ｉの化合物を調製するための方法も提供する。
【００１８】
本発明の他の目的、特徴および利点は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲に包含される様々な変更形態および修正形態が、この詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示しているとはいえ、例示のみのために示されていると理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】放線菌株ＤＰＪ−００１９（受託番号ＮＲＲＬ５０１６８）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のほぼ完全なポリヌクレオチドＤＮＡ配列（配列番号１）を示す図である。
【図１Ｂ】ＤＰＪ−００２４（受託番号ＮＲＲＬ５０１６７）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のほぼ完全なポリヌクレオチドＤＮＡ配列（配列番号２）を示す図である。
【図１Ｃ】サリニスポラアレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）またはサリニスポラトロピカ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ）ｒＲＮＡ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列中には存在しない、ＤＰＪ−００２４の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子における保存ＤＮＡ配列（配列番号３）を示す図である。
【図２】ＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４の、２種の現在認められているサリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、サリニスポラアレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）およびサリニスポラトロピカ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ）の株との系統発生的関係を説明している図である。系統樹は、完全な１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサーｒＤＮＡ配列で作成した。近隣結合法を使用して距離を計算した。ブートストラップ値は、１０００個の複製で計算されたが、その値が５０％以上である場合にそれらのそれぞれの節点に示されている。アクチノマズラマズレ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｍａｄｕｒａｅ）を外集団として使用した。
【図３】サリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、サリニスポラアレニコラ（Ｓ．ａｒｅｎｉｃｏｌａ）（配列番号６）およびサリニスポラトロピカ（Ｓ．ｔｒｏｐｉｃａ）（配列番号７）からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のポリヌクレオチドＤＮＡ配列をＤＰＪ−００２４（配列番号２）およびＤＰＪ−００１９（配列番号１）と比較するアラインメントの図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義：
「アルキル」とは、１〜６個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、好ましくは、１〜４個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）を有する一価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。この用語は、一例として、メチル（ＣＨ３−）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ−）、およびｔ−ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ−）などの直線または分岐したヒドロカルビル基を包含する。
【００２１】
「ヒドロキシ」とは、基−ＯＨを指す。
【００２２】
「メトキシ」とは、基−ＯＣＨ３を指す。
【００２３】
「立体異性体」とは、１つまたは複数の立体中心においてキラリティーまたは原子の接続性が異なる化合物を指す。立体異性体は、鏡像異性体、ジアステレオマーならびにシス−トランス（Ｅ／Ｚ）異性を包含する。
【００２４】
本明細書中の様々な場所において、化合物の置換基は、群または範囲で開示される。説明は、そのような群および範囲のメンバーの各々およびすべての個々のサブコンビネーションを包含することが具体的に意図されている。例えば、「Ｃ１〜４アルキル」という用語は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ１〜４、Ｃ１〜３、Ｃ１〜２、Ｃ２〜４、Ｃ２〜３およびＣ３〜４を個々に開示していることが具体的に意図されている。
【００２５】
「互変異性体」とは、エノール−ケトおよびイミン−エナミン互変異性体、またはイミダゾール、ベンゾイミダゾール、トリアゾール、およびテトラゾールなどの環−ＮＨ−部分および環＝Ｎ−部分に接続している環原子を含有するヘテロアリール基の互変異性形態などの、プロトンの位置が異なる化合物の交互に切り替わる形態を指す。
【００２６】
「患者」または「対象」とは、哺乳動物を指し、ヒトおよびイヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウサギおよびサルなどの非ヒト哺乳動物、好ましくは、ヒトを包含する。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「単離された」化合物は、例えば、約９５％純度を超える実質的に純粋な形態か、野生型放線菌株の存在もそれとの接触もないかのどちらかである化合物である。「単離された」株は、その自然の環境から取り出されかつ／または発酵用の成長培地中にある株を示す。
【００２８】
本明細書で使用されるように、細菌株の「発酵すること」または「発酵」という用語は、その株の培養および／またはピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物の放線菌産生などの、化合物の生合成産生の円滑化を指す。
【００２９】
「ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン」化合物は、下記のコア構造
【００３０】
【化３】
を有する。
【００３１】
「薬学的に許容できる塩」とは、化合物の薬学的に許容できる塩を指し、塩は、当技術分野においてよく知られている様々な有機および無機の対イオンから誘導され、ほんの一例として、ナトリウム、アルミニウム、リチウム、亜鉛、ジエタノールアミン塩、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、およびテトラアルキルアンモニウム；ならびに、分子が塩基性官能基を含有する場合に、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））塩などの有機または無機の酸の塩を包含する。本発明のある種の化合物は、様々なアミノ酸とも薬学的に許容できる塩を形成することができる。薬学的に許容できる塩に関する総説については、参照により本明細書に組み込まれているＢＥＲＧＥら、６６ Ｊ．ＰＨＲＭ．ＳＣＩ．１〜１９（１９７７）を参照されたい。
【００３２】
薬学的に許容できる塩は、式（Ｉ）の化合物などの化合物を、塩酸、臭化水素酸、酢酸、リン酸、ホウ酸、過塩素酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、アスコルビン酸、ヨウ化ナトリウムなどの酸または塩と接触させることにより調製される。用いられる溶媒は、アセトン、ジエチルケトン、メチルエチルケトンなどのケトンまたはそれらの混合物、メタノール、エタノール、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、ベンゼン、ジエチルアミン、ホルムアルデヒド、クロロホルム、ジクロロメタンまたはそれらの混合物から選択することができる。
【００３３】
対象における疾患の「治療すること」または「治療」とは、疾患を阻害するかその発生を止めること；疾患の症状を改善すること；または疾患の退行を引き起こすことを指す。したがって、本明細書で使用されるような「癌の治療」は、癌に関係している症状の改善を包含する。
【００３４】
「ｍＴＯＲ活性を変調すること」とは、ｍＴＯＲキナーゼに関係しているプロセスまたはシグナル伝達事象に影響を与えること（すなわち、阻害または刺激）を指す。
【００３５】
「ナトリウムの非存在」への言及は、ナトリウム金属それ自体か任意のナトリウム含有化合物（例えば、塩化ナトリウム）の非存在を示す。
【００３６】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容できる担体」とは、任意のタイプの無毒性で不活性な固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤化助剤を意味する。薬学的に許容できる担体の役割を果たすことができる材料の一部の例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよびセルロースアセテートなどのその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油などの油；ベニバナ油；ゴマ油；オリーブ油；トウモロコシ油およびダイズ油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの無毒性の適合性滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、矯味剤および着香剤、保存剤および抗酸化剤であり、それらは、製剤者（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒ）の判断に従って組成物中に存在することもある。他の適当な薬学的に許容できる賦形剤は、参照により本明細書に組み込まれている「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９１に記載されている。
【００３７】
「ＤＰＪ−００１９」という株は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６８を割り当てられている。「ＤＰＪ−００２４」という株は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６７を割り当てられている。
【００３８】
本発明の一態様は、式Ｉ：
【００３９】
【化４】
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３または（ＣＨ２）２ＯＨであり、
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、
ただし、Ｒ２が、メチルである場合、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨである）の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００４０】
別の実施形態において、Ｒ１は、ＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３である。別の実施形態において、Ｒ１は、ＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３であり、Ｒ２は、エチル、イソプロピル、イソブチルおよびｓｅｃ−ブチルである。別の実施形態において、Ｒ２は、Ｃ２〜Ｃ４アルキルである。別の実施形態において、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨである。別の実施形態において、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨであり、Ｒ２は、メチルである。別の実施形態において、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨであり、Ｒ２は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチルおよびｓｅｃ−ブチルからなる群から選択される。別の実施形態において、Ｒ２は、イソプロピルである。別の実施形態において、Ｒ１は、ＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３であり、Ｒ２は、エチルまたはイソプロピルである。別の実施形態において、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨであり、Ｒ２は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチルまたはｓｅｃ−ブチルである。
【００４１】
本発明の別の態様は、
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミドからなる群から選択される化合物もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００４２】
本発明の別の態様は、薬学的に許容できる担体および本明細書に記載されている式Ｉの化合物；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物を提供する。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されている単離された式Ｉの化合物；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を含む組成物を提供する。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、配列番号１に対して少なくとも９９．９％の相同性を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を特徴とする単離された放線菌株であって、ナトリウムの非存在下で成長することができる放線菌株を提供する。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６８を有する単離された放線菌を提供する。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６８を有する放線菌株により産生され、ただし、リンホスチンではない本明細書に記載の式Ｉの化合物、該化合物の互変異性体、または該化合物もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供し、化合物は、より詳細な実施形態において、式Ｉの化合物は、
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；および
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミド；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。
【００４７】
本発明の別の実施形態は、配列番号２に対して少なくとも９９．９％の相同性を含み、ただし、配列番号３を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を特徴とする単離された放線菌株を提供する。
【００４８】
本発明の別の実施形態は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６７を有する単離された放線菌株を提供する。
【００４９】
本発明の別の実施形態は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６７を有する放線菌株により産生され、ただし、リンホスチンではない単離されたピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物、該化合物の互変異性体、または該化合物もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供する。
【００５０】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載されている単離された式Ｉの化合物、該化合物の互変異性体、または該化合物もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を提供し、化合物は、本明細書に記載されている放線菌株により産生される。より詳細な実施形態において、式Ｉの化合物は、
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；および
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミド；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。
【００５１】
本発明の別の実施形態は、癌に罹患している患者を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載されている式Ｉの化合物、もしくは互変異性体または薬学的に許容できるそれらの塩を投与することを含む方法を提供する。より詳細な実施形態において、式Ｉの化合物は、
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；および
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミド；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。
【００５２】
別の実施形態において、患者は、結腸癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌腫、腎細胞癌腫、舌の癌、膀胱癌腫（ｃｉｌｉｕｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、繊毛癌腫、肝癌、前立腺癌、子宮癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、肉芽腫、カポジ肉腫、脳癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、精巣癌、膵癌、副腎腫、血管内皮腫、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または多発性骨髄腫に罹患している。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、ｍＴＯＲを阻害する方法であって、細胞を、本明細書に記載されているような式Ｉの化合物、その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩と接触させることを含む方法を提供する。
【００５４】
本発明の別の実施形態は、ｍＴＯＲにより仲介される状態に罹患している患者を治療する方法であって、本明細書に記載されているような式Ｉの化合物、その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩を投与することを含む方法を提供する。
【００５５】
本発明の別の態様は、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を調製するための方法であって、
発酵液を形成するための塩を含む成長培地中でＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６８を有する放線菌株を発酵させるステップであり、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物が発酵液中で形成されるステップと、
場合により、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を精製するステップとを含む方法を提供する。
【００５６】
より詳細には、該方法は、接触液から化合物を抽出することをさらに含む。より詳細には、該方法は、
発酵液を遠心分離して上清およびペレットを形成させるステップと、
上清からペレットを分離するステップと、
ペレットからピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を抽出するステップとをさらに含む。
【００５７】
方法の別の態様において、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）ではない。より詳細には、塩は、塩化カリウム（ＫＣｌ）である。別の実施形態において、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。別の実施形態において、該方法は、接触ステップの前に、放線菌株からの細胞を含む組織サンプルをホモジナイズすることをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、分離ステップの直後に細胞を溶解するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、抽出ステップの前にペレットを水溶液で洗浄することをさらに含む。別の実施形態において、抽出ステップは、ペレットを有機溶液と接触させることを含む。別の実施形態において、有機溶液は、酢酸エチルを含む。
【００５８】
該方法のより詳細な実施形態は、精製ステップを含み、精製は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。より詳細には、精製ステップは、逆相ＨＰＬＣを含む。あるいはまたはさらに、精製ステップは、順相ＨＰＬＣを含む、より詳細には、順相ＨＰＬＣは、ジオールカラム上で行われる。より詳細には、順相は、トルエン／酢酸エチル混合物中にイソプロパノール約０％〜約１０％を含む溶媒グラジエントシステムを含む。別の実施形態において、逆相ＨＰＬＣは、ＯＤＳカラム上で行われる。より詳細には、逆相は、アセトニトリルおよび水を含む。
【００５９】
別の実施形態において、精製ステップは、ジオールカラム上で行われる順相ＨＰＬＣを含み、化合物は、
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；および
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミド
からなる群から選択される。
【００６０】
別の実施形態において、成長培地は、グルコースをさらに含む。別の実施形態において、成長培地は、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物に特異的な前駆体をさらに含む。
【００６１】
本発明の別の態様は、上に記載されている方法により調製され、ただし、リンホスチンではないピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を提供する。別の実施形態において、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物は、
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミド；もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩からなる群から選択される。
【００６２】
本発明の別の態様は、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を調製するための方法であって、
ホヤのディデムナムプロリフェルム（Ｄｉｄｅｍｎｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ）からの細胞を、接触液を形成するための塩を含む成長培地と接触させるステップと、
接触液を遠心分離して上清およびペレットを形成させるステップと、
上清からペレットを分離するステップと、
ペレットからピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を抽出するステップとを含む方法を提供する。
【００６３】
より詳細には、該方法は、抽出ステップの後にピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を精製するステップをさらに含む。
【００６４】
本発明の化合物は、望ましい場合に、従来の無毒性の薬学的に許容できる担体、補助剤、およびビヒクルを含有する用量単位製剤でヒトおよび他の動物に、経口で、非経口で、舌下で、エアゾール化または吸入スプレーにより、直腸に、大槽内に、膣内に、腹腔内に、口腔に、静脈内に、皮下に、髄腔内にまたは局所に投与することができる。局所投与は、経皮パッチ剤などの経皮投与またはイオン泳動装置の使用を含むこともある。本明細書で使用されるような非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射、または注入技法を包含する。
【００６５】
製剤化の方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、第１９版（１９９５）に開示されている。本発明において使用するための医薬組成物は、無菌の発熱物質を含まない液体の溶液剤もしくは懸濁剤、コーティングされたカプセル剤、坐剤、凍結乾燥散剤、経皮パッチ剤の形態または当技術分野において知られている他の形態であってよい。
【００６６】
注射用調製物、例えば、無菌の注射用水性または油性の懸濁剤は、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して知られている技術に従って製剤化することができる。無菌注射用調製物は、例えば、１，３−プロパンジオールまたは１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の無菌の注射用の溶液、懸濁液または乳濁液であってもよい。用いることができる許容できるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁化媒質として従来から用いられている。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを包含する任意の無刺激固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に使用される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通して濾過することにより、または使用に先立って無菌水もしくは他の無菌注射用媒質に溶解もしくは分散させることができる無菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み入れることにより滅菌することができる。
【００６７】
薬物の効果を延ばすために、皮下または筋肉内の注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましいことが多い。このことは、水溶性の乏しい結晶性または非晶性の材料の液体懸濁液の使用により達成することができる。その場合、薬物の吸収速度は、その溶解速度に左右され、結晶サイズおよび結晶形態に左右されることがある。あるいは、非経口で投与された薬物形態の遅延吸収は、油ビヒクル中に薬物を溶解または懸濁させることにより達成することができる。注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマー中で薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより製造することができる。薬物のポリマーに対する比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。他の生体分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（アンヒドリド）を包含する。デポー注射用製剤は、体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することにより調製することもできる。
【００６８】
経口投与のための固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤を包含する。そのような固体剤形において、活性化合物は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容できる、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの賦形剤または担体および／またはａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシアなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの加湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶液緩染剤、ｆ）四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、アセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤、およびｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの滑沢剤と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を含むこともある。
【００６９】
類似のタイプの固体組成物は、ラクトースすなわち乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用する軟質および硬質の充填済みゼラチンカプセル剤において充填剤として用いられることもある。
【００７０】
錠剤、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティングおよび医薬製剤技術においてよく知られている他のコーティングなどのコーティングおよびシェルと共に調製することができる。それらは、乳白剤を含有していてもよく、場合により、遅延方式で、腸管のある種の部分において１つまたは複数の活性成分のみを、または優先的に放出する組成物であってもよい。使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを包含する。
【００７１】
活性化合物は、上に述べられているような１つまたは複数の賦形剤と共にマイクロカプセル化形態であってもよい。錠剤、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング、放出制御コーティングおよび医薬製剤技術においてよく知られている他のコーティングなどのコーティングおよびシェルと共に調製することができる。そのような固体剤形において、活性化合物は、スクロース、ラクトースまたはデンプンなどの少なくとも１つの不活性な希釈剤と混合されることがある。そのような剤形は、通常の実施におけるように、不活性な希釈剤以外の追加物質、例えば、錠剤化滑沢剤ならびにステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなどの他の錠剤化助剤を含むこともある。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を含むこともある。それらは、乳白剤を含有していてもよく、場合により、遅延方式で、腸管のある種の部分において１つまたは複数の活性成分のみを、または優先的に放出する組成物であってもよい。使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを包含する。
【００７２】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容できるエマルジョン剤、マイクロエマルジョン剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を包含する。活性化合物に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒などの当技術分野において一般的に使用される不活性な希釈剤、可溶化剤およびエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、ＥｔＯＡｃ、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などの乳化剤を含有することがある。不活性な希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、矯味剤、および着香剤を包含することもある。
【００７３】
本発明の化合物の局所または経皮投与のための剤形は、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、溶液剤、スプレー剤、吸入剤またはパッチ剤を包含する。活性成分は、必要に応じて、薬学的に許容できる担体および任意の必要とされる保存剤または緩衝液と共に無菌条件下で混合される。眼科用製剤、点耳剤なども、本発明の範囲内にあることが企図されている。
【００７４】
本発明の組成物は、液体エアゾールまたは吸入可能な乾燥粉末として送達するために製剤化することもできる。液体エアゾール製剤は、終末細気管支および呼吸細気管支へ送達することができる粒子サイズに大部分を噴霧化することができる。
【００７５】
本発明の化合物の有効量は、一般的に、ｍＴＯＲ活性を検出可能に変調する、またはｍＴＯＲ活性に関係しているかｍＴＯＲ活性変調を受けやすい疾患の症状を緩和するのに十分な任意の量を包含する。有効投与量は、一般的に、単一投与量または分割投与量で宿主に投与される１日総投与量であるはずであり、例えば、１日につき体重１ｋｇ当たり０．００１〜１０００ｍｇ、より好ましくは、１日につき体重１ｋｇ当たり１．０〜３０ｍｇであってよい。容量単位組成物は、１日投与量を構成するためのその約数のような量を含有することができる。一般に、本発明による治療レジメンは、単一投与量または複数投与量で１日当たり本発明の１つまたは複数の化合物約１０ｍｇ〜約２０００ｍｇをそのような治療を必要としている患者に投与することを含む。
【００７６】
単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される宿主および特定の投与様式に応じて異なるであろう。しかしながら、任意の特定の対象についての具体的な投与量レベルは、用いられる具体的な化合物、年齢、体重、一般的健康、性別、食事、投与の時間、投与の経路、排泄の速度、薬物組合せ、および治療を受けている特定の疾患の重症度を包含する様々な要因によって左右されるであろう。所与の状況についての治療有効量は、ルーチンな実験により容易に決定することができ、普通の臨床家の技術と判断の範囲内にある。
【００７７】
本発明の別の態様において、本発明の１つまたは複数の化合物を包含するキットが提供される。代表的なキットは、本発明のｍＴＯＲ阻害剤化合物（例えば、式Ｉの化合物）および有効量の本発明の化合物を投与することにより癌を治療するための指示書を包含する添付文書または他のラベリングを包含する。
【００７８】
本発明は、説明のために本明細書に記載されている実施形態に限定されないが、上の開示の範囲内に入るようなそれらのすべての形態を包含することが理解される。
【００７９】
実施例
寄託：放線菌株ＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４は、ブダペスト条約の条項により、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｔｉｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＣＡＵＲ）内にあるＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＡＲＳ）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに２００８年８月１４日に寄託された。ＮＣＡＵＲの住所は、１８１５ Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ、６１６０４である。ＤＰＪ−００１９株は、特許受託番号ＮＲＲＬ５０１６８を与えられた。ＤＰＪ−００２４株は、特許受託番号ＮＲＲＬ５０１６７を与えられた。
【実施例】
【００８０】
（実施例１）
海生放線菌株ＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９の単離および同定。
細菌株ＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９は、Ｓｈｉｓｈｉｊｉｍａ Ｉｓｌａｎｄ、Ｊａｐａｎにおいてスキューバにより集められたホヤのディデムナムプロリフェルム（Ｄｉｄｅｍｎｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ）Ｋｏｔｔから単離された。凍結サンプルから、内部コア組織１２０ｍｇを無菌海水１ｍＬ中で浸軟させた。得られたホモジナイズされたスラリーを、２種の選択培地上にプレートした。プレートを、放線菌コロニーの存在について定期的に調べた。分離株を新たな寒天培地に移した。
【００８１】
塩依存性成長試験を、ナトリウム、カリウム、セシウム、ルビジウム、およびリチウムを包含する異なる塩を添加した培地Ｍ１で行った。この試験の場合、ＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９株を、４日にわたって海塩を含有する液体培地中で成長させた。各株の菌糸を収集し、１０．３％グルコースで３回洗浄し、同じ溶液中に再懸濁させた。各株１０μＬを、異なる塩を添加したＭ１寒天プレート上に広げ、４〜８週にわたって２８℃にてインキュベートした。ＤＰＪ−００２４のみが、０．４または０．４５Ｍ ＮａＣｌを添加したＭ１上で成長し、それが偏性ナトリウム要求株であることを示唆した。ＤＰＪ−００１９の成長は、０．４５Ｍ ＫＣｌを添加したＭ１ならびに０．４または０．４５Ｍ ＮａＣｌを添加したＭ１上で観察された。０．４５Ｍ ＫＣｌのＭ１寒天からのＤＰＪ−００１９のさらなる継代培養は、０．４５Ｍ ＫＣｌの添加が、固体および液体のＭ１培地におけるＤＰＪ−００１９の成長を支えるのに十分であることを裏付けた。これらの結果は、ＤＰＪ−００１９が、偏性ナトリウム要求株ではないことを示している。
【００８２】
染色体ＤＮＡを、リゾチーム、ＳＤＳ細胞溶解と、続く、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール沈殿を使用してＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９の寒天成長培養物から単離した。ほぼ完全な１６Ｓ ｒＲＮＡを、８ＦＰＬおよび１４９２ＦＰＬの部分プライマーを使用してＰＣＲ増幅させた。株ＤＰＪ−００２４のほぼ完全な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（ｒＤＮＡ）は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるサリニスポラアレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）のそれと９９．２％の相同性およびサリニスポラトロピカ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ）のそれと９９．４％の相同性を共有していた（図３におけるアラインメントを参照）。しかしながら、ＤＰＪ−００２４ ｒＤＮＡは、すべての現在報告されているサリニスポラ属（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ）株において保存されている４つの独特な署名ヌクレオチドのうちの１つである１９８位（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の類似位置２０７に対応する）にアデノシンを有していない。ＤＰＪ−００１９の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるサリニスポラアレニコラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）のそれと９９．２％の相同性およびサリニスポラトロピカ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ）のそれと９９．６％の相同性を共有し、４つのサリニスポラ属（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ）署名ヌクレオチドのすべてを有する（図３）。ＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域ｒＲＮＡ遺伝子も、プライマー１６Ｓ−１５２５Ｆ：ＧＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴ（配列番号４）および２３Ｓ−４０Ｒ：ＴＣＣＣＡＣＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣＧＧ（配列番号５）を使用することにより増幅させた。１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域ｒＤＮＡ配列のアラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＸで行われ、サリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐｅｃｉｅｓ）のいくつかの配列を包含していた。アラインメントから、系統樹を構築し、系統発生的関係を証明した。明確な区別が、サリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐ．）とＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４により構成される群の間に見いだされた（図２）。
【００８３】
生理学的成長試験、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列および１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサーｒＲＮＡ遺伝子配列比較の結果は、ＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９が、成長のためのナトリウムの偏性必要条件および４つの独特な１６Ｓ ｒＲＮＡ署名ヌクレオチドを示す今日公表されている属、サリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）と関連していることを示した。しかしながら、ＤＰＪ−００２４は、４つの独特な１６Ｓ ｒＲＮＡ署名ヌクレオチドのうちの１つ（Ａ２０７）を有していないという事実に基づき、これまでに報告されているサリニスポラ属（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ）株と明らかに区別可能である。ＤＰＪ−００１９は、サリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）に独特な４つの１６Ｓ ｒＲＮＡ署名ヌクレオチドのすべてを有するが、成長にとってのナトリウムの偏性必要条件を有していない。さらに、ＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４の１６Ｓ−２３Ｓ内部転写スペーサー配列は、これら２つの株が、報告されているサリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐｅｃｉｅｓ）と区別可能である独特な群を形成していることを示している。したがって、ＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４は、他のサリニスポラ属種（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｓｐ．）と密接に関連しているが、それらと区別可能である群として分類学的に分類されているミクロモノスポラセエ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科に属している。
【００８４】
（実施例２）
株ＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９の発酵
種培養：寒天成長培養物のループまたは凍結保存培養物２０μＬを使用して無菌ＷＳＢ４ＹＥ１／２ＳＳ培地７ｍＬに接種し、７２〜９６時間にわたって２８℃および２００ｒｐｍにて回転振盪機で増殖させた。ＷＳＢ４ＹＥ１／２ＳＳ培地は、ｐＨ７．０においてグルコース２０ｇ／Ｌ、ＷＧＥ８０Ｍ（小麦加水分解産物）５ｇ／Ｌ、ＳＥ５０ＭＡＦ（大豆加水分解産物）１５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、可溶性デンプン１０ｇ／Ｌからなる。
【００８５】
発酵：十分に成長したＷＳＢ４ＹＥ１／２ＳＳ種培養からの接種の後、株ＤＰＪ−００２４およびＤＰＪ−００１９を、Ｍ４８−９発酵培地５０ｍＬを含有する２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中で増殖させ、７〜１４日にわたって２８℃および２００ｒｐｍにて回転振盪機で成長させた。Ｍ４８−９培地は、ｐＨ７．０において可溶性デンプン３０ｇ／Ｌ、糖蜜２０ｇ／Ｌ、大豆ペプトン７．５ｇ／Ｌ、酵母エキス２．５ｇ／Ｌ、ＨＰ２０−１０％（ｗ／ｖ）からなる。
【００８６】
ＬＣＭＳ分析のためのサンプル処理：培養ブロス２ｍＬを遠心分離し、上清を捨て、ペレットを、酢酸エチルで２回（各２ｍＬ、合計４ｍＬ）抽出した（菌糸＋ＨＰ２０）。得られた抽出物を真空中で乾燥し、アセトニトリル２００μＬに再溶解し、小さなＥＰ管に移した。混合物を、約５分にわたって最高速度にて遠心分離し、あらゆる沈殿をペレット化した。澄明な抽出物約１００μＬを、ＬＣ／ＭＳ用の挿入部分のある小さなガラスバイアルに移した。
【００８７】
（実施例３）
ＤＰＪ−００１９およびＤＰＪ−００２４により産生される三環式アルカロイド代謝産物の分析用ＬＣＭＳ分析。
サンプル（２μＬ）を、タンデムフォトダイオードアレーおよび質量スペクトル検出付きのＨＰ１１００型Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ液体クロマトグラフを使用して分析した。化合物を、１５分かけて移動相Ａ（水中０．０５％ギ酸）中の１０〜５０％移動相Ｂ（アセトニトリル中０．０５％ギ酸）の線形グラジエントを使用するＹＭＣ ＯＤＳ−Ａ ２．０×１００ｍｍ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム上で分割した。流速は、０．３ｍｌ／分とした。トータルスキャンＵＶクロマトグラムを、２１０〜６００ナノメートルのスキャン範囲にわたって取得した。ＵＶスペクトルを、２ナノメートルのスキャンステップで２１０〜６００ナノメートルの実行を通じて取得した。ＵＶフローセルから出た後、流出流をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＤＥＣＡイオントラップ質量分析計に入れた。質量分析計にエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）プローブを取り付け、交互陽イオンおよび陰イオンフルスキャン（１５０〜１５００質量単位）モードで動作させた。スプレーニードル電圧は、陽極については４．５ｋＶおよび陰極については４．５ｋＶに設定した。キャピラリー電圧は、それぞれ陽極および陰極について２４Ｖおよび−４７Ｖに設定した。キャピラリー温度は、２７５℃に設定した。窒素を、４０単位に設定されたシースガスとして使用した。
【００８８】
（実施例４）
三環式アルカロイドの単離および精製のための一般的スキーム。
表１に列挙されている化合物番号１、２、３、４、５、６、７、８および９、ならびにリンホスチンを、ＤＰＪ−００１９の培養ブロスから精製した。発酵培養物を遠心分離し、化合物を、酢酸エチルを使用して発酵固体の水洗浄ペレットから抽出した。抽出物を減圧下で乾燥して残渣を形成させ、シリカゲル上に吸着させ、イソプロパノール：トルエン：酢酸エチル、５：３２：６３および１０：３０：６０からなる洗浄液で脱着させた。洗浄液を別々に乾燥し、５％および１０％の濃縮類似体混合物の残渣を形成させた。
【００８９】
５％イソプロパノール残渣は、化合物番号１、２、３、４、５、８、９およびリンホスチンからなっていた。水中アセトニトリルグラジエント（水中２０〜５０％および１０〜４０％アセトニトリルグラジエント）を使用するＯＤＳカラム（ＹＭＣ，Ｉｎｃ．からのＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ Ａ ２５０×２０ｍｍ Ｓ−５μｍ １２０Å）上の逆相高速液体クロマトグラフィー（流速８ｍｌ／分、検出２５４ｎｍ）により、きれいな化合物１および２ならびに化合物番号３、４、５、８および９を含有する３つの他の分画が得られた。１つの分画に対する２回目の逆相クロマトグラフィーにより、化合物番号４と５の混合物が得られた。他の２つの分画に対するトルエン：酢酸エチルの１：２混合物中イソプロパノールのグラジエント（トルエン：酢酸エチル１：２中０〜１０％イソプロパノール）を使用するＤｉｏｌカラムＨＰＬＣ（ＹＭＣ，Ｉｎｃ．からのＹＭＣ−Ｄｉｏｌ−１２０−ＮＰ ２５０×２０ｍｍ Ｓ−５μｍ）を取り付けた順相ＨＰＬＣ（流速：１０ｍｌ／分、検出４６０ｎｍ）により、純粋な化合物番号３および９が得られた。
【００９０】
１０％イソプロパノール分画は、同様に化合物番号６、７、８、９およびリンホスチンからなっていた。水中アセトニトリルグラジエントを使用するＯＤＳカラム上の初回逆相ＨＰＬＣ後に、３つの分画が生じた。そこで、これらの分画の各々を、トルエン：酢酸エチルの１：２混合物中イソプロパノールのグラジエントを使用するＤｉｏｌカラム上でクロマトグラフにかけると、純粋な化合物番号６、７および８が得られた。
【００９１】
（実施例５）
化合物の合成；
【００９２】
【化５】
スキームＡを参照すると、Ｐが、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢｚ）またはｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）などの適当な保護基である式１の化合物のエステル部分の還元と、続く、ベンジル位炭素の酸化により、式２のケトアルコールが得られる。この還元は、約０℃〜約６０℃の温度にて、エーテル、ＴＨＦなどの非プロトン性溶媒中で水素化ホウ素リチウムまたは水素化リチウムアルミニウムなどの別の適当な還元剤を使用して達成することができる。ベンジル位酸化は、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノン（ＤＤＱ）を使用して行うことができる。トリフルオロ酢酸タリウムなどの酸化剤を使用する式２のケトアルコールの芳香族酸化と、続く、ＤＭＦなどの溶媒中での硫酸銅による処理は、式３のフェノールを生成するであろう。
【００９３】
式４の化合物を形成するための式３のケトンの還元と、続く、式４の化合物のベンゾ環の酸化により、式５のキノンが得られる。還元は、約０℃〜約６０℃の温度にて、ＴＨＦまたはエーテルなどの非プロトン性溶媒中でシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化リチウムアルミニウムもしくは水素化ホウ素ナトリウムなどの別の適当な還元剤を使用して達成することができる。式４の化合物の酸化は、室温にて６．４〜７．０のｐＨの下に水性メタノールまたはアセトン中で（ＮＯ（ＳＯ３Ｋ）２）（カリウムニトロソジスルファネート（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｎｉｔｒｏｓｏｄｉｓｕｌｆａｎａｔｅ））を使用して達成することができる。
【００９４】
式６の化合物を形成するための式５の化合物の芳香族基へのアミンの選択的導入、およびそれに続く得られる式６の化合物の両アミノ基の脱保護により、式７のジアミノキノンが得られる。アミンの導入は、ベンジルアミンの付加を介して達成することができる。この反応は、典型的には、約０℃〜約６０℃の温度にてＴＨＦ、ピリジンなどの非プロトン性溶媒中で行われる。得られる式６の化合物の２つの保護されたアミノ基は、約１〜３気圧の圧力および約２０℃〜約８０℃の温度にて、当業者によく知られている標準的な水素化条件下、例えば、炭素上パラジウムの存在下で水素ガスとの反応を介して脱保護することができる。次いで、得られる式７のジアミノキノンは、約０℃〜約８０℃の温度にて酸素または酸素富化空気との反応にかけることにより式８の三環式アルコールに変換することができる。
【００９５】
式８の化合物の一級アルコール基は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（ＴＢＤＭＳＣｌ）またはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）トリフレートなどの適当な試薬、または別の適当なシリル化剤を使用して選択的に保護し、さらなる誘導化に利用可能な遊離アミノ基とすることができる。この反応は、約０℃〜約６０℃の温度にて、ジクロロメタンまたはＴＨＦなどの非水性溶媒中で行うことができる。遊離アミノ基のアシル化は、カルボン酸または酸塩化物などのアシル化剤を使用して達成することができる。この反応に適している溶媒は、酸塩化物の場合のジクロロメタンまたはＴＨＦおよび酸を使用するカップリング反応の場合のＤＭＦまたはＮＭＰなどの極性溶媒を包含する。温度は、約０℃〜約６０℃の範囲であってよい。１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）またはジシクロヘキシルジイミド（ＤＣＣ）などの適切なカップリング試薬により、Ｒ２が（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである式９の化合物が得られる。式９の化合物は、ピリジン中のトリフルオロメタンスルホン酸無水物（ｔｒｉｆｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）との反応と、続く、ジクロロメタンまたはＴＨＦなどの溶媒中でのアジ化テトラブチルアンモニウム（ｎＢｕ４ＮＮ３）またはアジ化ナトリウムとの反応により式１０のアジドに変換することができる。対応するアミノ化合物を得るための式１０のアジドの還元と、続く、当業者によく知られている方法を使用するノシル、Ｂｏｃおよびトシルなどの多くの保護基のうちのいずれかによるアミノ基の保護により、対応する式１１の化合物が得られる。アジド還元は、約０℃〜約６０℃の温度にてＴＨＦなどの非水性溶媒中で、水素化リチウムアルミニウムまたは当業者によく知られている別の適当な還元剤を使用して行うことができる。
【００９６】
式１１の保護された一級アルコールは、約０℃〜約６０℃の温度にてＴＨＦなどの溶媒中でフッ化テトラブチルアンモニウムまたはフッ化水素などのフッ素源を含有する試薬を使用するか塩酸などの鉱酸を使用して脱保護し、式１２のアルコールを製造することができる。約０℃〜約６０℃の温度にて、ジクロロメタンまたはピリジンなどの溶媒中でクロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）または三酸化クロムなどの試薬を使用する式１２のアルコールの酸化により、対応する式１３の化合物が得られる。
【００９７】
約−７８℃〜約６０℃の温度にて、エーテルまたはＴＨＦなどの非プロトン性溶媒中で式１３の化合物を適切に保護されたリチウムエチニル化合物と反応させると、対応する式１５のエチニルアルコールが得られ、次いで、酸化して式１６のエチニルケトンを形成させることができる。酸化は、約０℃〜約６０℃の温度にて、アセトンまたはジクロロメタンなどの溶媒中で二酸化マンガンまたはＰＣＣなどの別の適当な酸化剤を使用して行うことができる。
【００９８】
式１６のエチニルケトンは、例えば、炭酸カリウムまたは別の適当な塩基の存在下に、塩基性条件下でのメタノールとの反応を介して対応する式１７の化合物に変換することができる。この反応に適している溶媒は、メタノールを包含する。適当な温度は、約０℃〜約６０℃の範囲である。当業者によく知られている方法を使用する得られる式１７の化合物の脱保護により、式１８のアセタールが得られ、次いで、モレキュラーシーブなどの脱水剤にかけることにより望ましい式Ｉの化合物に変換することができる。
【００９９】
式Ｉのさらなる還元は、メタノールなどの溶媒中でＰｄ／ＣまたはＰｔ／Ｃのような試薬および水素ガスを使用する接触水素化を使用するかＴＨＦまたはエーテルなどの溶媒中で水素化リチウムアルミニウムなどの水素化物源を使用して行うことができる。
【０１００】
（実施例６）
ｍＴＯＲキナーゼアッセイ
精製酵素によるルーチンなヒトＴＯＲアッセイを、以下の通りＤＥＬＦＩＡフォーマットにより９６ウェルプレート中で行った。まず、酵素を、キナーゼアッセイ緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ β−グリセロホスフェート、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．２５μＭミクロシスチンＬＲ、および１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ）中で希釈した。各ウェルに、希釈酵素１２μＬを、試験阻害剤０．５μＬまたは対照ビヒクルジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と共に短時間混合した。キナーゼ反応を、ＡＴＰおよびＨｉｓ６−Ｓ６Ｋを含有するキナーゼアッセイ緩衝液１２．５μＬを加え、８００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＡＧ−ＴＯＲ、１００μＭ ＡＴＰおよび１．２５μＭ Ｈｉｓ６−Ｓ６Ｋを含有する２５μＬの最終反応体積とすることにより開始させた。反応プレートを、穏やかに振盪させながら室温にて２時間にわたって（１〜６時間にて直線的に）インキュベートし、次いで、停止緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＥＧＴＡ）２５μＬを加えることにより終了させた。リン酸化（Ｔｈｒ−３８９）Ｈｉｓ６−Ｓ６ＫのＤＥＬＦＩＡ検出は、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ−Ｎ１−ＩＴＣ（Ｅｕ）（１抗体当たり１０．４Ｅｕ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識されたモノクローナル抗Ｐ（Ｔ３８９）−ｐ７０Ｓ６Ｋ抗体（１Ａ５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用して室温にて行った。ＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液およびＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ溶液は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから購入した。終了したキナーゼ反応混合物４５μＬを、ＰＢＳ５５μＬを含有するＭａｘｉＤｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）に移した。Ｈｉｓ６−Ｓ６Ｋを２時間にわたって接続させた後、ウェルを吸引し、ＰＢＳで１回洗浄した。４０ｎｇ／ｍＬ Ｅｕ−Ｐ（Ｔ３８９）−Ｓ６Ｋ抗体と共にＤＥＬＦＩＡアッセイ緩衝液１００μＬを加えた。抗体結合を、穏やかにかき混ぜながら１時間にわたって続けた。次いで、ウェルを吸引し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。ＤＥＬＦＩＡ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ溶液１００μＬを各ウェルに加え、プレートを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒモデルプレートリーダーで読み取った。得られたデータを使用し、酵素活性および潜在的阻害剤による酵素阻害を計算した。ｍＴＯＲ ＩＣ５０データ（μＭで報告されている）は、表１に提供されている。
【０１０１】
【表１−１】
【０１０２】
【表１−２】
【０１０３】
（実施例７）
インビトロ細胞成長アッセイ
ヒト腫瘍系ＬＮＣａｐおよびＭＤＡ４６８の細胞を、１ウェル当たりおおよそ３０００細胞にて９６ウェル培養プレートにプレートした。プレートした翌日に、様々な投与量のｍＴＯＲ阻害剤を細胞に加えた。薬物処理から３日後に、生存細胞密度を、十分に確立された細胞増殖アッセイである色素ＭＴＳの代謝的変換（生存細胞による）により決定した。アッセイは、キットと併せて供給されるプロトコルに従ってＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入したアッセイキットを使用して行った。ＭＴＳアッセイ結果は、４９０ｎｍにおいて吸光度を測定することにより９６ウェルプレートリーダー中で読み取った。各処理の効果は、同じ培養プレート中で成長させたビヒクル処理細胞に対する成長の制御のパーセントとして計算した。成長の５０％阻害をもたらした薬物濃度をＩＣ５０（μＭ）として決定した。表１中の化合物をスクリーニングしたところ、化合物１、２および４は、２０〜３００ｎＭのＬＮＣａｐ ＩＣ５０を示した。
【０１０４】
（実施例８）
腫瘍細胞ｍＴＯＲ阻害アッセイ
ヒト癌細胞（ＬＮＣａｐ前立腺、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫）を、一晩にわたって成長培地中の６ウェルプレートにプレートした。細胞を、６時間にわたって様々な投与量のｍＴＯＲ阻害剤で処理した。総細胞溶解物を、ＮｕＰＡＧＥ−ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製し、超音波処理し、次いで、遠心分離により清澄化した。等量のタンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ電気泳動システムを使用する免疫ブロッティング分析にかけ、ＡＫＴ、Ｓ６Ｋ１、４ＥＢＰ１などのｍＴＯＲ経路マーカーに対するホスホ特異的（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体で探索した。表１中の化合物をスクリーニングしたところ、化合物１、２および４は、５０〜８００ｎＭのＭＤＡ４６８ ＩＣ５０を示した。
【受託番号】
【０１０５】
ＮＲＲＬ５０１６７
ＮＲＲＬ５０１６８
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３または（ＣＨ２）２ＯＨであり、
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、
ただし、Ｒ２が、メチルである場合、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨである）の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項２】
Ｒ１がＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３である請求項１に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項３】
Ｒ２がエチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、イソブチルまたはｓｅｃ−ブチルである請求項１または２に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項４】
Ｒ１が（ＣＨ２）２ＯＨである請求項１に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項５】
Ｒ２がメチルである請求項４に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項６】
Ｒ２がイソプロピルである請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項７】
Ｒ２がエチルである請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項８】
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミドからなる群から選択される請求項１に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項９】
薬学的に許容できる担体および前記請求項のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の単離された化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項１１】
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６８またはＮＲＲＬ５０１６７を有する単離された放線菌株。
【請求項１２】
放線菌株Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６８またはＮＲＲＬ５０１６７により産生され、
ただし、リンホスチンではないピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物、前記化合物の互変異性体、または前記化合物もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載の通りである請求項１２に記載のピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物。
【請求項１４】
癌の治療において使用するための請求項１から１０または１２のいずれか一項に記載の化合物または組成物。
【請求項１５】
癌を治療するための医薬品の製造における請求項１から１０または１２のいずれか一項に記載の化合物または組成物の使用。
【請求項１６】
癌が、結腸癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌腫、腎細胞癌腫、舌の癌、膀胱癌腫、繊毛癌腫、肝癌、前立腺癌、子宮癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、肉芽腫、カポジ肉腫、脳癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、精巣癌、膵癌、副腎腫、血管内皮腫、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または多発性骨髄腫である、請求項１４または１５に記載の化合物、組成物または使用。
【請求項１７】
ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を調製するための方法であって、
発酵液を形成するための塩を含む成長培地中でＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６７またはＮＲＲＬ５０１６８を有する放線菌株を発酵させるステップであり、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物が発酵液中で形成されるステップを含む方法。
【請求項１８】
発酵液を遠心分離して上清およびペレットを形成させるステップと、
上清からペレットを分離するステップと、
ペレットからピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を抽出するステップとをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）分離ステップ直後に細胞を溶解するステップ、
（ｂ）抽出ステップの前にペレットを水溶液で洗浄するステップ、または
（ｃ）抽出ステップ中にペレットを有機溶液と接触させるステップのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＯＤＳカラム上で場合により行われる逆相ＨＰＬＣおよび／またはジオールカラム上で場合により行われる順相ＨＰＬＣから選択される高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行うことを含む精製ステップをさらに含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物が請求項１から８のいずれか一項に記載の通りである、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
（式中、
Ｒ１は、ＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３または（ＣＨ２）２ＯＨであり、
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、
ただし、Ｒ２が、メチルである場合、Ｒ１は、（ＣＨ２）２ＯＨである）の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項２】
Ｒ１がＣＨ＝ＣＨ−ＯＣＨ３である請求項１に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項３】
Ｒ２がエチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、イソブチルまたはｓｅｃ−ブチルである請求項１または２に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項４】
Ｒ１が（ＣＨ２）２ＯＨである請求項１に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項５】
Ｒ２がメチルである請求項４に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項６】
Ｒ２がイソプロピルである請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項７】
Ｒ２がエチルである請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項８】
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−プロピオンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
（Ｅ）−Ｎ−（８−アミノ−４−（３−メトキシアクリロイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）イソブチルアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−３−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）−２−メチルブタンアミド；
Ｎ−（８−アミノ−４−（３−ヒドロキシプロパノイル）ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−６−イル）アセトアミドからなる群から選択される請求項１に記載の化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項９】
薬学的に許容できる担体および前記請求項のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項に記載の単離された化合物、もしくは
その互変異性体；その立体異性体；またはそのような化合物、立体異性体もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項１１】
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６８またはＮＲＲＬ５０１６７を有する単離された放線菌株。
【請求項１２】
放線菌株Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６８またはＮＲＲＬ５０１６７により産生され、
ただし、リンホスチンではないピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物、前記化合物の互変異性体、または前記化合物もしくは互変異性体の薬学的に許容できる塩。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載の通りである請求項１２に記載のピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物。
【請求項１４】
癌の治療において使用するための請求項１から１０または１２のいずれか一項に記載の化合物または組成物。
【請求項１５】
癌を治療するための医薬品の製造における請求項１から１０または１２のいずれか一項に記載の化合物または組成物の使用。
【請求項１６】
癌が、結腸癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌腫、腎細胞癌腫、舌の癌、膀胱癌腫、繊毛癌腫、肝癌、前立腺癌、子宮癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、肉芽腫、カポジ肉腫、脳癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、精巣癌、膵癌、副腎腫、血管内皮腫、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または多発性骨髄腫である、請求項１４または１５に記載の化合物、組成物または使用。
【請求項１７】
ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を調製するための方法であって、
発酵液を形成するための塩を含む成長培地中でＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）受託番号ＮＲＲＬ５０１６７またはＮＲＲＬ５０１６８を有する放線菌株を発酵させるステップであり、ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物が発酵液中で形成されるステップを含む方法。
【請求項１８】
発酵液を遠心分離して上清およびペレットを形成させるステップと、
上清からペレットを分離するステップと、
ペレットからピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物を抽出するステップとをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）分離ステップ直後に細胞を溶解するステップ、
（ｂ）抽出ステップの前にペレットを水溶液で洗浄するステップ、または
（ｃ）抽出ステップ中にペレットを有機溶液と接触させるステップのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＯＤＳカラム上で場合により行われる逆相ＨＰＬＣおよび／またはジオールカラム上で場合により行われる順相ＨＰＬＣから選択される高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行うことを含む精製ステップをさらに含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ピロロ［４，３，２−ｄｅ］キノリン−８−アミン化合物が請求項１から８のいずれか一項に記載の通りである、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【公表番号】特表２０１２−５００２０６（Ｐ２０１２−５００２０６Ａ）
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２３１３４（Ｐ２０１１−５２３１３４）
【出願日】平成２１年８月１２日（２００９．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３５４３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１９６５９
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（３０９０４０７０１）ワイス・エルエルシー (181)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１２日（２００９．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３５４３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１９６５９
【国際公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（３０９０４０７０１）ワイス・エルエルシー (181)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]