フラゲリン関連ポリペプチドおよびその使用
アポトーシスの影響から哺乳動物を防護するためのフラゲリンおよびフラゲリン関連ポリペプチドの使用を記載する。薬学的有効量のフラゲリンを含む組成物を患者に投与する工程を含む、アポトーシスを誘発する１つまたは複数の治療または状態から哺乳動物を防護する方法が提供される。フラゲリンは、配列番号１、または配列番号１のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、誘導体、またはその組み合わせを含み得る。フラゲリンは、ＴＬＲ−５媒介活性を誘導し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００４年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／６３９，８２６号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／６３９，８２６号は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アポトーシスの影響から哺乳動物を防護するためのフラゲリン関連ポリペプチドの使用に関する。より詳細には、本発明は、放射線および癌治療などのストレスへの曝露から哺乳動物を防護するためのフラゲリン関連ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
正常細胞から腫瘍細胞への進行は、負の成長調節機構の喪失（成長阻害刺激に対する耐性が含まれる）ならびに成長因子およびホルモンへの依存の欠如を伴う。放射線または細胞障害薬に基づく従来の癌治療は、正常細胞および悪生細胞の成長調節の相違に依存する。従来の癌治療は、細胞を重篤な遺伝動性ストレスに供する。これらの状態下で、大部分の正常細胞は成長が停止するようになり、それにより、生き残る一方で、腫瘍細胞は分裂し続け、死滅する。
【０００４】
しかし、従来の癌治療ストラテジーは、正常な急速に分割する組織またはアポトーシス性組織を危険にさらす性質がある。これらの正常な急速に分割する細胞への損傷により、癌治療の周知の副作用（感受性組織：造血、小腸、毛包）が生じる。このような組織の天然の感受性は、癌細胞が頻繁に自殺（アポトーシス）機構を欠損し、治療手順が正常な感受性組織を死滅させるが癌細胞に損傷を与えなくなることがあるという事実によって複雑になる。癌療法の副作用を最小にするという従来の試みは、（ａ）腫瘍細胞の治療に対する感受性をより高めること、（ｂ）腫瘍細胞に対する癌療法の特異性をより高めること、または（ｃ）治療後（例えば、エリスロポイエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＫＧＦ）の正常細胞の再生を促進することに基づく。
【０００５】
癌治療における化学療法および放射線療法に関連する副作用を緩和するための治療薬が依然として必要とされている。本発明は、これらのニーズを満たし、他の関連する利点を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
薬学的有効量のフラゲリンを含む組成物を患者に投与する工程を含む、アポトーシスを誘発する１つまたは複数の治療または状態から哺乳動物を防護する方法。フラゲリンは、配列番号１、または配列番号１のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、誘導体、またはその組み合わせを含み得る。フラゲリンは、ＴＬＲ−５媒介活性を誘導し得る。
【０００７】
フラゲリンは、配列番号１のアミノ酸１〜１７４および４１８〜５０５と少なくとも３０％同一であり得る。フラゲリンは、８９位、９０位、９１位、９５位、９８位、１０１位、１１５位、４２２位、４２３位、４２６位、４３１位、４３６位、および４５２位からなる群から選択される少なくとも１０個の保存アミノ酸を含み得る。フラゲリンは、配列番号１、８、１０、１２、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、および５２からなる群から選択される配列を含み得る。
【０００８】
フラゲリンを使用して、癌治療（化学療法または放射線療法であり得る）を受けている哺乳動物を治療することができる。フラゲリンを使用して、放射線を被爆した哺乳動物を治療することができる。フラゲリンを、放射線防護剤と組み合わせて投与することができる。フラゲリンを使用して、哺乳動物の創傷、中毒、細菌感染、ウイルス感染、および温度衝撃を治療することができる。フラゲリンを使用して、組織（胃腸管、肺、腎臓、肝臓、心血管系、血管内皮、中枢神経系、末梢神経系、造血前駆細胞、免疫系、および毛包が含まれる）のアポトーシスを防護することができる。フラゲリンを使用して、哺乳動物の敗血症を予防することもできる。
【０００９】
本発明は、薬学的に許容可能な量のＮＦ−κＢを誘導する薬剤を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、構成性に活性なＮＦ−κＢ癌を罹患した哺乳動物の治療方法に関する。薬剤は、フラゲリンであり得る。薬剤を、癌治療前、同時、または癌治療後に投与することができる。治療は、化学療法または放射線療法であり得る。
【００１０】
本発明はまた、哺乳動物に薬学的に許容可能な量のＮＦ−κＢを誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、癌治療に起因する正常組織に損傷を受けた哺乳動物の治療方法に関する。薬剤は、フラゲリンであり得る。薬剤を、癌治療前、同時、または癌治療後に投与することができる。治療は、化学療法または放射線療法であり得る。
【００１１】
本発明はまた、哺乳動物に薬学的に許容可能な量のＮＦ−κＢを誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、ストレスに起因する正常組織に損傷を受けた哺乳動物の治療方法に関する。薬剤は、フラゲリンであり得る。薬剤を、哺乳動物が罹患した疾患の治療前、同時、または治療後に投与することができる。
【００１２】
本発明はまた、哺乳動物に薬学的に許容可能な量のＮＦ−κＢを誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、哺乳動物の細胞老化の調整方法に関する。薬剤は、フラゲリンであり得る。薬剤を、哺乳動物が罹患した疾患の治療前、同時、または治療後に投与することができる。
【００１３】
本発明はまた、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤、化学療法薬、および任意選択的に薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、またはキャリアを含む薬学的組成物に関する。薬剤は、フラゲリンであり得る。
【００１４】
本発明はまた、疑われる誘導因子をＮＦ−κＢ活性化発現系に添加する工程と、コントロールをＮＦ−κＢ活性化発現系に別で添加する工程と、それによりＮＦ−κＢ活性化発現系レベルを増加させる能力によってＮＦ−κＢの誘導因子を同定することとを含む、ＮＦ−κＢの誘導因子のスクリーニング方法に関する。
【００１５】
本発明はまた、哺乳動物に薬学的有効量のＮＦ−κＢを誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、哺乳動物を放射線の影響から防護する方法に関する。薬剤は、フラゲリンであってよく、これは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属に由来し得る。組成物を、放射線防護剤と組み合わせて投与することができる。放射線防護剤は、抗酸化剤であってよく、これは、アミホスチン（ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ）またはビタミンＥであり得る。放射線防護剤はまた、サイトカインであってよく、これは、幹細胞刺激因子であり得る。
【００１６】
本発明は、患者に薬学的有効量のＮＦ−κＢを誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、アポトーシスを誘発する１つまたは複数の治療または状態から患者を防護する方法に関する。薬剤は、フラゲリンであってよく、これは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属に由来し得る。治療は癌治療であってよく、これは、化学療法または放射線療法であり得る。状態はストレスであってよく、これは、放射線、創傷、中毒、感染、および温度衝撃であり得る。
【００１７】
本発明はまた、疑われるモジュレーターを細胞ベースのアポトーシス系に添加する工程と、コントロールを細胞ベースのアポトーシス系に別で添加する工程と、それによりアポトーシス率を変化させる能力によってアポトーシスのモジュレーターを同定することと、疑われるモジュレーターが哺乳動物の寄生虫または共生生物に由来することとを含む、アポトーシスのモジュレーターのスクリーニング方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、疑われるモジュレーターをＮＦ−κＢ活性化発現系に添加する工程と、コントロールをＮＦ−κＢ活性化発現系に別で添加する工程と、それによりＮＦ−κＢ活性化発現率を変化させる能力によってＮＦ−κＢのモジュレーターを同定することと、前記疑われるモジュレーターが、哺乳動物の寄生虫に由来することとを含む、ＮＦ−κＢのモジュレーターのスクリーニング方法に関する。寄生虫は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、マイコプラズマ属、およびクラミジア属に由来し得るが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明はまた、本明細書中に記載の任意のスクリーニング方法によって同定されるモジュレーターに関する。本発明はまた、本明細書中に記載のモジュレーターを含む組成物に関する。組成物は、薬学的に許容可能な量の本明細書中に記載のモジュレーターを含む薬学的組成物であり得る。
【００２０】
本発明はまた、アポトーシスを増強するモジュレーターを含む薬学的組成物をこのような治療を必要とする被験体に投与する工程を含む、癌の治療方法に関する。
【００２１】
本発明はまた、患者にアポトーシスを阻害するモジュレーターを含む薬学的組成物を投与する工程を含む、アポトーシスを誘発する１つまたは複数の治療から患者を防護する方法を提供する。１つまたは複数の治療は、癌治療であり得る。癌治療は、化学療法または
放射線療法であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（詳細な説明）
本発明は、ストレス（化学療法、放射線療法、および照射が含まれるが、これらに限定されない）によって生じたアポトーシスからの正常な細胞および組織の防護に関する。細胞におけるアポトーシスの調節には以下の２つの主な機構が存在する：ｐ５３経路（アポトーシス促進性）およびＮＦ−κＢ経路（抗アポトーシス性）。両経路は、腫瘍で頻繁に無秩序化する：通常ｐ５３が喪失する一方で、ＮＦ−κＢが構成性に活性になる。したがって、正常細胞におけるｐ５３の阻害およびＮＦ−κＢの活性化により、癌治療などのストレスによって生じる死滅から正常細胞を防護することができるが、腫瘍細胞はこれらの調節機構が無秩序化されているので、腫瘍細胞により高い治療耐性を持たせられないであろう。これは、ｐ５３およびＮＦ−κＢがそれぞれ活性化および抑制の標的と考えられているｐ５３およびＮＦ−κＢにおける従来の見解に矛盾する。
【００２３】
本発明は、アポトーシスから正常細胞を防護するためのＮＦ−κＢ活性の誘導に関する。哺乳動物におけるＮＦ−κＢ活性の誘導により、正常細胞を、癌治療および高熱、有害線量の放射線被爆（例えば、原子力発電所、防衛産業または放射性医薬品生産の労働者、および軍人）、および細胞の老化で生じる細胞ストレスに帰するアポトーシスから防護することができる。ＮＦ−κＢが多数の腫瘍細胞で構成性に活性であるので、ＮＦ−κＢ活性の誘導により、腫瘍細胞に有利な効果を与えることなく正常な細胞をアポトーシスから防護することができる。一旦正常な細胞が修復されると、ＮＦ−κＢ活性を正常レベルに修復することができる。造血系（免疫系が含まれる）、腸上皮、および毛包などの照射および化学療法感受性組織を防護するためにＮＦ−κＢ活性を誘導することができる。
【００２４】
ＮＦ−κＢ活性の誘導因子を、いくつかの他の適用に使用することもできる。種々の重篤な状態（照射、創傷、中毒、感染、老化、および温度ショックが含まれるが、これらに限定されない）への哺乳動物の被爆によって生じる病的結果および死は、ストレス応答の正常な生理学的機構の活性（プログラム細胞死（アポトーシス）の誘導または生体活性タンパク質（サイトカイン）の放出など）に起因し得る。
【００２５】
アポトーシスは、通常、創傷細胞および遺伝子損傷細胞由来の組織を「浄化する」ように機能する一方で、サイトカインは、病原体に対する生物の防護系を動員するように機能を果たす。しかし、重篤な損傷の条件下では、両ストレス応答機構自体が自滅の原因として作用し得る。例えば、照射による死亡は、造血系、免疫系、および消化系で起こる大規模なｐ５３媒介性アポトーシスに起因し得る。ＮＦ−κＢの妥当な薬理学的調節により、重篤なストレス条件下での生存率が増加し得る。これらの要因の調節により、損傷器官由来の細胞の炎症応答および生死の決断の両方を調節することが可能である。ＮＦ−κＢ誘導因子の投与によってアポトーシスから防護することができる組織には、胃腸管、肺、腎臓、肝臓、心血管系、血管内皮、中枢神経系、末梢神経系、造血前駆細胞、免疫系、および毛包が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
ＮＦ−κＢの防護的役割は、以下をコードする複数の遺伝子の転写活性化によって媒介される：ａ）両方の主なアポトーシス経路を遮断する抗アポトーシスタンパク質、ｂ）ＨＰおよび他の幹細胞の増殖および生存を誘導するサイトカインおよび成長因子、およびｃ）強力なＲＯＳ除去抗酸化タンパク質（ＭｎＳＯＤ（ＳＯＤ−２）など）。したがって、放射線防護のためのＮＦ−κＢの一過性活性化により、Ｔｏｌｌ様受容体の活性化を介してＮＦ−κＢの活性化が到達する場合に達成することができる同時免疫刺激効果によって癌患者のアポトーシスの抑制だけでなく、二次癌の発生率を減少させる能力を達成することが可能である。
【００２７】
標的としてのＮＦ−κＢ経路の別の魅力的な特性は、候補放射線防護剤と見なすことができる多数の天然因子によるその活性化である。これらのうちでは、複数の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）である。ＰＡＭＰは、宿主生物で見出されない分子であり、巨大な病原体群を特徴とし、容易に変異することができない。これらは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）（自然免疫の重要なセンサーエレメント）によって認識される。ＴＬＲは、直接またはサイトカイン放出を介した免疫細胞の移動および活性化の誘導による免疫系の第１の警告機構として作用する。ＴＬＲは、ホモ二量体およびヘテロ二量体として作用することが公知のＩ型膜タンパク質である。リガンド結合の際、ＴＬＲは、ＭｙＤ８８タンパク質（ほとんどのＴＬＲの不可欠なシグナル伝達アダプター）を補充する。次に起こるシグナル伝達カスケードにより、（ｉ）ＮＦ−κＢ経路の活性化、および（ｉｉ）ＭＡＰＫ（ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）が含まれる）の活性化が含まれる効果が導かれる。Ｔｏｌｌ様受容体リガンドによるＮＦ−κＢ経路の活性化により、リガンドが潜在的な放射線防護剤として魅力的になる。サイトカインと異なり、多数のＰＡＭＰはＴＬＲの活性化以外はほとんど効果がないので、副作用を生じる可能性が低い。さらに、多数のＰＡＭＰは、ヒトに存在する。
【００２８】
その免疫細胞活性化機能と一致して、全てのＴＬＲは、脾臓および末梢血白血球で発現し、他のリンパ器官およびリンパ球の一部でより多数のＴＬＲ特異的発現パターンが存在する。しかし、ＴＬＲは、体内の他の組織および器官でも発現する（例えば、ＴＬＲ１は遍在的に発現し、ＴＬＲ５は胃腸管上皮および内皮でも見出される一方で、ＴＬＲ２、６、７、および８は、肺で発現することが公知である）。
【００２９】
１．定義
本明細書中で使用される専門用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を制限しないと理解すべきである。明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈上で明確に別の記載を行わない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれることに留意しなければならない。
【００３０】
本明細書中で使用される、用語「投与」は、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤の投薬量を説明するために使用される場合、薬物の単回用量または複数回用量を意味する。
【００３１】
本明細書中で使用される、用語「アナログ」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用される場合、従来のアミノ酸組由来の１つまたは複数の非標準アミノ酸または他の構造変形形態を意味する。
【００３２】
本明細書中で使用される、用語「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体クラス、またはそのフラグメントもしくは誘導体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、および単鎖抗体が含まれる）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、二機能性抗体、およびその誘導体を意味する。抗体は、所望のエピトープまたはこれに由来する配列に対して十分な結合特異性を示すモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはその混合物であり得る。抗体はまた、キメラ抗体であり得る。抗体を、当該分野で公知の１つまたは複数の化学的部分、ペプチド部分、またはポリペプチド部分の結合によって誘導体化することができる。抗体を、化学部分と抱合することができる。
【００３３】
本明細書中で使用される、用語「アポトーシス」は、細胞小器官の完全性が保護される細胞容積の進行性の収縮、光学顕微鏡または電子顕微鏡によって認められるクロマチンの凝縮（すなわち、核凝縮）、および／または遠心分離沈殿アッセイによって決定されるヌクレオソームサイズのフラグメントへのＤＮＡの切断を含む細胞死の形態をいう。食細胞によるインタクトな細胞フラグメント（「アポトーシス小体」）の貪食によって細胞膜の完全性が失われた（例えば、膜小胞形成）場合に細胞死が起こる。
【００３４】
本明細書中で使用される、用語「癌」は、異常な無制御の細胞分裂に起因する任意の悪性の成長または腫瘍を意味し、リンパ系または血流を介して身体の他の部分に拡大し得る。
【００３５】
本明細書中で使用される、用語「癌治療」は、当該分野で公知の任意の癌治療（化学療法および放射線療法が含まれるが、これらに限定されない）を意味する。
【００３６】
本明細書中で使用される、用語「〜との組み合わせ」は、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤の投与およびさらなる治療を説明するために使用する場合、薬剤を、さらなる治療前、同時、治療後、または規則正しく（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ）投与することができることを意味する。本明細書中で使用される、用語「〜共に」、「同時の」、または「同時に」は、本発明のさらなる治療および薬剤を、４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらにより好ましくは６時間以内、最も好ましくは３時間以内またはそれ未満で施すことを意味する。本明細書中で使用される、用語「規則正しく」は、さらなる治療と異なる時点且つ反復投与および／またはさらなる治療と比較して一定の頻度での薬剤の投与を意味する。
【００３７】
薬剤を、さらなる治療前の任意の時点（さらなる治療の約４８時間前、４６時間前、４４時間前、４２時間前、４０時間前、３８時間前、３６時間前、３４時間前、３２時間前、３０時間前、２８時間前、２６時間前、２４時間前、２２時間前、２０時間前、１８時間前、１６時間前、１４時間前、１２時間前、１０時間前、８時間前、６時間前、４時間前、３時間前、２時間前、または１時間前が含まれるが、これらに限定されない）で投与することができる。薬剤を、さらなる治療後の一定の時点（被爆から約１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、２４時間後、２６時間後、２８時間後、３０時間後、３２時間後、３４時間後、３６時間後、３８時間後、４０時間後、４２時間後、４４時間後、４６時間後、または４８時間後が含まれるが、これらに限定されない）で投与することができる。
【００３８】
本明細書中で使用される、用語「誘導体」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用される場合、一次構造以外が異なるペプチドまたはポリペプチド（アミノ酸およびアミノ酸アナログ）を意味する。例として、誘導体は、グリコシル化（翻訳後修飾の一形態）が異なり得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、異種系における発現に起因するグリコシル化パターンを示し得る。少なくとも１つの生物活性が保持される場合、これらのペプチドまたはポリペプチドは、本発明の誘導体である。他の誘導体には、共有結合的に修飾されたＮ末端またはＣ末端を有するペプチドまたは融合ポリペプチド、ＰＥＧ化ペプチドまたはポリペプチド、脂質部分に会合したペプチドまたはポリペプチド、アルキル化ペプチドまたはポリペプチド、アミノ酸側鎖の官能基を介して他のペプチドに結合したペプチドまたはポリペプチド、ポリペプチドまたはキメラ、および当該分野で理解されているさらなる修飾物が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書中で使用される、用語「フラグメント」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用される場合、基準ペプチドまたはポリペプチドの一部を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用される、用語「ホモログ」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用される場合、共通の進化上の祖先を有するペプチドまたはポリペプチドを意味する。
【００４１】
本明細書中で使用される、用語「処置する」または「処置」は、状態からの哺乳動物の防護をいう場合、状態の予防、抑制、防止、または消失を意味する。状態の予防は、状態の発症前に本発明の組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。状態の抑制は、状態の誘導後であるがその臨床的外観前に哺乳動物に本発明の組成物を投与する工程を含む。状態の防止は、状態が軽減または維持されるように状態の臨床的外観後に哺乳動物に本発明の組成物を投与する工程を含む。溶媒の消失は、哺乳動物がもはや状態を罹患しないように状態の臨床的外観後に哺乳動物に本発明の組成物を投与する工程を含む。
【００４２】
本明細書中で使用される、用語「腫瘍細胞」は、癌に関連する任意の細胞を意味する。
【００４３】
本明細書中で使用される、用語「改変体」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用される場合、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味する。「生物活性」の代表例には、ＴＬＲ５に結合する能力および特異的抗体によって結合される能力が含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸の保存的置換（すなわち、アミノ酸の類似の性質（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）を有する異なるアミノ酸への置換）は、当該分野で典型的には小さな変化と認識されている。これらの小さな変化を、当該分野で理解されているように、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮することによって一部を同定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のヒドロパシー指標は、その疎水性および電荷の考慮に基づく。類似のヒドロパシー指標のアミノ酸を置換することができ、且つタンパク質機能を保持することができることが当該分野で公知である。１つの態様では、ヒドロパシー指標が±２のアミノ酸を置換する。アミノ酸の親水性を使用して置換することができ、これにより、生物機能が保持されたタンパク質が得られるであろう。ペプチドにおけるアミノ酸の親水性の考慮により、このペプチドの最も高い局所平均疎水性（抗原性および免疫原性と十分に相関すると報告されている有用な基準）を計算することが可能である（米国特許第４，５５４，１０１号（本明細書中で参考として援用される））。当該分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、生物活性（例えば、免疫原性）が保持されたペプチドを得ることができる。１つの態様では、互いに親水性値が±２以内のアミノ酸と置換することができる。アミノ酸の疎水性指標および親水性値は共に、そのアミノ酸の特定の側鎖に影響を受ける。その所見と一致して、生物機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の性質によって明らかとなるアミノ酸の相対的類似性、特に、そのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
【００４４】
２．治療方法
ａ．構成性に活性なＮＦ−κＢ腫瘍
本発明は、治療有効量のＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、構成性に活性なＮＦ−κＢ癌を罹患した哺乳動物を治療する方法に関する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を、癌治療（化学療法および放射線療法など）と組み合わせて投与することができる。
【００４５】
癌治療は、細胞傷害薬、細胞増殖抑制薬、またはその組み合わせの投与を含み得る。細胞傷害薬は、（１）細胞のＤＮＡ複製能力の妨害、および（２）癌細胞の細胞死および／またはアポトーシスの誘導によって癌細胞の増殖を予防する。細胞傷害薬は、細胞シグナル伝達過程の調整、妨害、または阻害を介して作用し、細胞増殖をしばしば低継続レベルで調節する。
【００４６】
細胞傷害薬として使用することができる化合物クラスには、以下が含まれるが、これらに限定されない：アルキル化薬（ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸、ニトロソ尿素、およびトリアゼンが含まれるが、これらに限定されない）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレン−メラミン、トリエチレンチオホスホラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｎｅ）、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、およびテモゾロミド；代謝拮抗薬（葉酸アンタゴニスト、ピロリジンアナログ、プリンアナログ、およびアデノシンデアミナーゼインヒビターが含まれるが、これらに限定されない）：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビン；天然物およびその誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、酵素、リンホカイン、およびエピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｓ））：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ａｒａ−ｃ、パクリタキセル（パクリタキセルは、タキソール（登録商標）として市販されている）、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−ｃ、１−アスパラギナーゼ、インターフェロン（好ましくは、インターフェロン−α）、エトポシド、およびテニポシド。他の増殖性細胞傷害薬は、ナベルベン（ｎａｖｅｌｂｅｎｅ）、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）、レトラゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、カペシタビン、レオキサフィン（ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）、シクロホスファミド、イフォスファミド、およびドロロキサフィン（ｄｒｏｌｏｘａｆｉｎｅ）である。
【００４７】
微小管作用薬は細胞の有糸分裂を妨害し、その細胞傷害活性が当該分野で周知である。本発明で有用な微小管作用薬には、アロコルヒチン（ａｌｌｏｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）（ＮＳＣ ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ ７５７）、コルヒチン誘導体（例えば、ＮＳＣ ３３４１０）、ドラスタチン１０（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ １０）（ＮＳＣ ３７６１２８）、マイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）（ＮＳＣ １５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ ３３２５９８）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）、ＮＳＣ １２５９７３）、タキソール（登録商標）誘導体（例えば、誘導体（例えば、ＮＳＣ ６０８８３２）、チオコルヒチン（ｔｈｉｏｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）（ＮＳＣ ３６１７９２）、トリチルシステイン（ＮＳＣ ８３２６５）、硫酸ビンブラスチン（ＮＳＣ ４９８４２）、硫酸ビンクリスチン（ＮＳＣ ６７５７４）、天然および合成エポシロン（エポシロンＡ、エポシロンＢ、およびディスコデルモリド（Ｓｅｒｖｉｃｅ，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：２００９を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない）、エストラムスチン、ノコダゾール、およびＭＡＰ４などが含まれるが、これらに限定されない。このような薬剤の例は、Ｂｕｌｉｎｓｋｉ（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１０：３０５５ ３０６４；Ｐａｎｄａ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０５６０−１０５６４；Ｍｕｈｌｒａｄｔ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：３３４４−３３４６；Ｎｉｃｏｌａｏｕ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：２６８−２７２；Ｖａｓｑｕｅｚ（１９９７）ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．８：９７３−９８５；およびＰａｎｄａ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１：２９８０７−２９８１２にも記載されている。
【００４８】
エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）などの細胞傷害薬；抗新生物酵素；トポイソメラーゼインヒビター；プロカルバジン；ミトキサントロン；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金配位複合体；生物学的応答調節物質；成長抑制物質；抗ホルモン治療薬；ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）；テガフール；および造血成長因子などの細胞傷害薬も適切である。
【００４９】
使用することができる細胞増殖抑制薬には、ホルモンおよびステロイド（合成アナログが含まれる）：１７α−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メゲストロラセテート（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌａｃｅｔａｔｅ）、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン（ｈｌｏｒｏｔｒｉａｎｉｓｅｎｅ）、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲストロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックス（ｚｏｌａｄｅｘ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
他の細胞増殖抑制薬は、マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビターなどの抗血管新生薬、抗ＶＥＧＦ抗体などの他のＶＥＧＦインヒビター、ＺＤ６４７４およびＳＵ６６６８などの小分子である。Ｇｅｎｅｔｅｃｈの抗Ｈｅｒ２抗体も使用することができる。適切なＥＧＦＲインヒビターは、ＥＫＢ−５６９（不可逆性インヒビター）である。ＥＧＦＲに免疫特異的なＩｍｃｌｏｎｅ抗体Ｃ２２５およびｓｒｃインヒビターも含まれる。
【００５１】
アンドロゲン依存性癌腫を非増殖性にするカソデックス（登録商標）（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ，Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）も細胞増殖抑制薬としての使用に適切である。細胞増殖抑制薬のさらに別の例は、エストロゲン依存性乳癌の増殖または成長を阻害する抗エストロゲンであるタモキシフェン（登録商標）である。細胞増殖シグナル伝達のインヒビターは、細胞増殖抑制薬である。代表例には、上皮細胞成長因子インヒビター、Ｈｅｒ−２インヒビター、ＭＥＫ−Ｉ キナーゼインヒビター、ＭＡＰＫキナーゼインヒビター、ＰＩ３インヒビター、Ｓｒｃキナーゼインヒビター、およびＰＤＧＦインヒビターが含まれる。
【００５２】
種々の癌を本発明にしたがって治療することができ、癌には、以下が含まれるが、これらに限定されない：膀胱（進行性および転移性膀胱癌が含まれる）、乳房、結腸（直腸結腸癌が含まれる）、腎臓、肝臓、肺（小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、卵巣、前立腺、精巣、尿生殖路、リンパ系、直腸、喉頭、膵臓（外分泌膵癌が含まれる）、食道、胃、胆嚢、頚部、甲状腺、皮膚（扁平上皮癌が含まれる）の癌腫；リンパ系の造血器腫瘍（白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非−ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、バーキットリンパ腫が含まれる）；骨髄細胞系列の造血器腫瘍（急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、および前骨髄球性白血病が含まれる）；中枢神経系および末梢神経系の腫瘍（星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、シュワン腫が含まれる）；間葉系起源の腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉縮、および骨肉腫が含まれる）；ならびに他の腫瘍（メラノーマ、色素性乾皮症（ｘｅｎｏｄｅｒｍａ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ）、ケラトアクタンソーマ（ｋｅｒａｔｏａｃｔａｎｔｈｏｍａ）、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、奇形癌腫、および胃腸管または腹骨盤腔の癌。
【００５３】
ｂ．癌治療由来の副作用の治療
本発明はまた、哺乳動物に治療有効量のＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、構成性に活性なＮＦ−κＢ癌の治療に起因する正常組織に対する損傷を被った哺乳動物の治療方法に関する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を、上記の癌治療と組み合わせて投与することができる。
【００５４】
ｃ．細胞老化の調節
本発明はまた、哺乳動物に治療有効量のＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を投与する工程を含む、哺乳動物の細胞老化を調整する方法に関する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を、他の治療と組み合わせて投与することができる。
【００５５】
ｄ．ストレスの治療
本発明はまた、哺乳動物に薬学的に治療有効量のＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、ストレスに起因する正常組織に損傷を受けた哺乳動物の治療方法に関する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を、他の治療と組み合わせて投与することができる。ストレスは、任意の起源（照射、創傷、中毒、感染、および温度ショックが含まれるが、これらに限定されない）に起因し得る。
【００５６】
ｅ．照射
本発明はまた、放射線の被爆効果からの細胞の防護に関する。電離放射線由来の正常細胞の損傷および死滅は、被爆細胞の直接的な照射誘導性損傷と自殺による死滅またはアポトーシスを引き起こす照射誘導性ストレスに対する活性な遺伝的プログラム細胞反応との組み合わせである。アポトーシスは、いくつかの放射線感受性器官（すなわち、造血系および免疫系、消化管の上皮など）で生じる大規模な細胞喪失で重要な役割を果たし、その不全が器官の一般的な放射線感受性を決定づける。
【００５７】
電離放射線（ＩＲ）への被爆は短期間でも長期間でもよく、単回または複数回の線量として、全身または局所に適用することができる。したがって、原発事故または軍事攻撃は、単回の高線量の全身被爆（時折、その後の放射性同位体での長期中毒）を含み得る。造血器官を宿主血液前駆体から「浄化する」ことによってドナー骨髄のために造血器官を調製することが必要である場合の骨髄移植患者の前処置（適用線量を厳格に調節した）についても同様である。癌治療は、全身照射として適用する場合致死線量を非常に超える局所照射の複数回線量を含み得る。放射性同位体での中毒または治療は、標的化器官（例えば、１２５Ｉ吸入の場合の甲状腺）の照射によって長期間局所被爆させる。最後に、生物学的影響の重症度が有意に異なる電離放射線の物理的形態が多数存在する。
【００５８】
分子レベルおよび細胞レベルで、放射粒子（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ）は、ＤＮＡ、タンパク質、細胞膜、および他の高分子構造中の破損および架橋を精製することができる。電離放射線はまた、フリーラジカルおよび活性酸素種（ＲＯＳ）の生成によって細胞成分に対する二次的損傷を誘導する。複数の修復系（ＤＮＡの完全性および忠実性を修復するいくつかのＤＮＡ修復経路ならびにフリーラジカルおよびＲＯＳを除去して酸化タンパク質および脂質を還元する抗酸化化学物質および酵素など）によってこの損傷を無効にする。細胞チェックポイント系（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）は、ＤＮＡの欠損を検出し、損傷が修復されるか、細胞に成長停止またはプログラム細胞死（アポトーシス）を実行させる決定に到達するまで細胞周期の進行を遅延させる。
【００５９】
照射により、哺乳動物の器官が低線量での軽度の変異誘発および発癌効果から高線量によるほとんど即時の死滅までの範囲の損傷を受け得る。成分の全放射線感受性を、いくつかの感受性組織（造血系、生殖系、および細胞代謝回転率が高い異なる上皮が含まれる）で生じた病理学的変化によって決定する。
【００６０】
死亡を誘導するγ線照射の急性の病理学的結果は、線量によって異なり、特定の各線量に対する生物の感受性の閾値を規定する一定の器官の不全によって決定される。したがって、低線量での死亡は骨髄形成不全から生じる一方で、中程度の線量では胃腸管（ＧＩ）症候群の誘導によってより早く死亡する。非常に高い線量の照射により、神経変性の誘発によってほぼ即死し得る。
【００６１】
照射による一定の急性毒性期間を生存する生物は、長期遠隔性の結果（照射から数ヵ月後および数年後の被爆器官（例えば、腎臓、肝臓、または肺）における照射誘導性発癌および線維症が含まれる）を罹患し得る。
【００６２】
細胞ＤＮＡは、直接および間接的（フリーラジカルベースの）機構による種々のＤＮＡ損傷型（遺伝毒性ストレス）を生じるＩＲの主な標的である。全生物は、照射損傷ＤＮＡの有効な回復が可能なＤＮＡ修復系を維持するが、ＤＮＡ修復過程のエラーによって変異し得る。
【００６３】
腫瘍は、一般に、γ線照射により感受性が高く、正常組織に対する損傷が比較的低い低線量で複数回処置することができる。それにもかかわらず、いくつかの例では、正常組織の損傷は、癌治療のためのγ線照射の適用を制限する因子である。従来の三次元原体照射またはさらにより集束したＢｅａｍＣａｔｈ送達による癌療法におけるγ線照射の使用はまた、照射の蓄積作用および急速に新生される正常組織（骨髄および胃腸（ＧＩ）管など）の幹細胞の損傷の誘導に起因する毒性のために線量が制限される。
【００６４】
高線量では、照射誘導性死亡は、いわゆる造血器および胃腸管の放射線症候群に関連する。造血器症候群は、血液およびリンパ系の再生を不可能にする造血細胞およびその前駆細胞の喪失によって特徴づけられる。通常、感染（免疫抑制の結果）、出血、および／または貧血の結果として死亡する。ＧＩ症候群は、主に小腸の腸上皮の大規模な細胞死およびその後の腸壁の崩壊ならびに菌血症および敗血症由来の死滅に起因する。造血器症候群は、通常、低線量の照射で発症し、ＧＩ症候群よりも遅れて死滅する。
【００６５】
以前は、放射線防護剤は、典型的には、抗酸化剤（合成および天然の両方）であった。最近になって、サイトカインおよび成長因子が放射線防護剤のリストに加わっている。その放射線防護剤の機構は、感受性組織の再生効果の促進の結果であるとみなされている。両放射線防護剤群の間に明確な機能の差は存在しないが、いくつかのサイトカインは、細胞抗酸化タンパク質（マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）およびメタロチオネインなど）の発現を誘導する。
【００６６】
特定の薬剤の防護基準を、線量修飾係数（ＤＭＦまたはＤＲＦ）によって示す。ＤＭＦは、放射線防護剤処置被験体および未処置コントロール被験体への一定範囲の放射線量での照射およびその後の生存またはいくつかの他の評価項目の比較によって決定される。ＤＭＦは、一般に、３０日生存（ＬＤ５０／３０薬物処置からＬＤ５０／３０賦形剤処置を割る）を計算し、造血系の防護を定量する。胃腸系防護を評価するために、６日生存または７日生存についてＬＤ５０およびＤＭＦを計算する。他で示さない限り、本明細書中に提供したＤＭＦ値は３０日である。
【００６７】
以下に示すように、ＮＦ−κＢの誘導因子は、細胞レベルおよび生物全体として強い生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）活性を有する。超致死線量の照射に応答して、ＮＦ−κＢの誘導因子は、胃腸系および造血系症候群の両方を阻害するが、これが急性放射線被爆による死亡の主な原因である。これらの特性の結果として、ＮＦ−κＢの誘導因子を使用して、天然の照射事象および原発事故の影響を治療することができる。さらに、ＮＦ−κＢの誘導因子が現在公知の全ての放射線防護剤と異なる機構を介して作用するので、これらを、他の放射線防護剤と組み合わせて使用し、それにより、電離放射線からの防護規模を劇的に増大させることができる。
【００６８】
従来の放射線防護剤（例えば、フリーラジカルの捕捉剤）と対照的に、ＮＦ−κＢ活性の誘導因子は、一次照射媒介性損傷を軽減することができないが、二次事象（一次損傷に対する活性細胞反応を含む）に対して作用することができるので、既存の一連の防護を補足することができる。ピフィスリンα（ｐ５３の薬理学的インヒビター）（哺乳動物細胞における照射反応の重要なメディエーター）は、この新規の放射線防護剤クラスの例である。しかし、ｐ５３インヒビターの活性は、造血系の防護に限定され、消化管（胃腸管症候群）に防護効果を示さないので、これらの化合物の治療価値が減少する。広範な活性を示す抗アポトーシス性医薬品が非常に必要とされている。
【００６９】
ＮＦ−κＢの誘導因子を放射線防護剤として使用して、現在利用可能な手段（遮蔽および既存の生物防護剤（ｂｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）の適用）によって達成可能なレベルを超える放射線耐性に増加させることによって許容照射範囲を拡大し、例えば、発電所内の原発事故または宇宙飛行中の大規模態様粒子現象における生存機会を増大させることができる。１．５を超えるほぼＤＭＦ（３０日生存）では、ＮＦ−κＢ誘導因子であるフラゲリンは、任意の現在報告されている天然化合物よりも有効である。
【００７０】
ＮＦ−κＢの誘導因子はまた、例えば、中枢神経系および生殖器官における低線量照射に起因する代替不可能な細胞の喪失の治療に有用であり得る。ＮＦ−κＢの誘導因子を、癌化学療法時に使用して、化学療法に関連する副作用（脱毛症が含まれる）を治療することもできる。
【００７１】
１つの実施形態では、治療有効量のＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物を哺乳動物に投与して被爆した哺乳動物を治療する。ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物を、１つまたは複数の放射線防護剤と組み合わせて投与することができる。１つまたは複数の放射線防護剤は、被爆の影響を処置する任意の薬剤（抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤、およびサイトカイン）であり得る。
【００７２】
ＮＦ−κＢの誘導因子は、ＤＮＡおよび他の細胞構造の損傷に応答した照射誘導性プログラム細胞死を阻害することができるが、ＮＦ−κＢの誘導因子は、細胞レベルでの損傷に対応することができず、変異を防止することができない。フリーラジカルおよび活性酸素種（ＲＯＳ）は、変異および他の細胞内損傷の主な原因である。抗酸化剤およびフリーラジカル捕捉剤は、フリーラジカルによる損傷の防止で有効である。ＮＦ−κＢの誘導因子と抗酸化剤またはフリーラジカル捕捉剤との組み合わせにより、被爆による損傷の拡大を減少させ、生存率を高め、健康を改善することができる。本発明の実施で使用することができる抗酸化剤およびフリーラジカル捕捉剤には、チオール（システイン、システアミン、グルタチオン、およびビリルビンなど）；アミフォスチン（ＷＲ−２７２１）；ビタミンＡ；ビタミンＣ；ビタミンＥ；およびフラボノイド（インディアンホリーバジル（オシマム・サンクタム（Ｏｃｉｍｕｍ ｓａｎｃｔｕｍ））由来のオリエンチン（ｏｒｉｅｎｔｉｎ）およびビセニン（ｖｉｃｅｎｉｎ）など）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
ＮＦ−κＢの誘導因子を、放射線感受性幹細胞集団の補充および／または防護によって放射線防護性を付与する多数のサイトカインおよび成長因子と組み合わせて投与することもできる。幹細胞因子（ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド）、Ｆｌｔ−３リガンド、およびインターロイキン１フラグメントであるＩＬ−１ｂ−ｒｄの使用によって副作用を最小にした放射線防護を達成することができる。幹細胞（記載の全サイトカイン）の増殖の誘導およびそのアポトーシス（ＳＣＦ）の防止によって防護を達成することができる。処置により、照射前に白血球およびその前駆体を蓄積することが可能であり、それにより、照射後に免疫系をより迅速に再構成することが可能である。ＳＣＦは、１．３〜１．３５の範囲のＤＭＦの致死線量照射マウスを有効に救出し、且つ胃腸管症候群にも有効である。Ｆｌｔ−３リガンドもまた、マウス（ＬＤ１００／３０で７０〜８０％の３０日生存、ＤＭＦ＞１．２に相当）およびウサギで強い防護を示す。
【００７４】
さらに、以下などのサイトカインの組み合わせによって放射線防護を増強することができる：インターロイキン４（ＩＬ−４）および／またはインターロイキン１１（ＩＬ−１１）と組み合わせたＴＰＯ；ＩＬ−３と組み合わせたＧＭ−ＣＳＦ；Ｆｌｔ−３リガンドと組み合わせたＧ−ＣＳＦ；４Ｆ組み合わせ：ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＴＰＯ、およびＩＬ−３；ならびに５Ｆ組み合わせ：ＳＤＦ−１を加えた４Ｆ。
【００７５】
さらに、胃腸管放射線防護剤（形質転換成長因子β３（ＴＧＦｂ３）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、および記載のケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）が含まれる）を使用することができる。これらの放射線防護剤も腸を防護するが、これらは、フラゲリンまたはフラゲリン関連ポリペプチドと相乗効果を示す可能性が高い。なぜなら、下記の結果がフラゲリンおよびフラゲリン関連ポリペプチドが内皮を防護する一方で、これらの胃腸管放射線防護剤がＧＩ管の上皮を防護することを示すからである。
【００７６】
いくつかの因子（本来はサイトカインではないが）は、免疫細胞の増殖を刺激し、ＮＦ−κＢの誘導因子と組み合わせて使用することができる。例えば、５−ＡＥＤ（５−アンドロステンジオール）は、サイトカインの発現を刺激して細菌感染およびウイルス感染への耐性を増加させるステロイドである。照射２４時間前のマウスへの５−ＡＥＤの皮下注射により、生存がＤＭＦ＝１．２６に改善された。合成化合物（アンモニウムトリクロロ（ジオキソエチレン−Ｏ，Ｏ’−）テルレート（ＡＳ−１０１）など）を使用して、多数のサイトカインの分泌を誘導し、ＮＦ−κＢの誘導因子と組み合わせることもできる。さらなる放射線防護剤には、成長ホルモン（ＧＨ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、および間質由来因子１（ｓｔｒｏｍａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１）（ＳＤＦ−１）が含まれる。
【００７７】
成長因子およびサイトカインを使用して、胃腸管症候群から防護することもできる。ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）は、腸粘膜の増殖および分化を促進し、腸陰窩中の照射後細胞生存を増加させる。造血サイトカインおよび放射線防護性ＳＣＦは、腸幹細胞の生存および関連する短期生物生存も増加させることができる。
【００７８】
ＮＦ−κＢの誘導因子は、胃腸（ＧＩ）症候群および造血器症候群からの防護を付与することができる。１５Ｇｙの全身致死線量照射を受けたマウスのほとんどがＧＩ症候群によって死亡するので、ＮＦ−κＢの誘導因子および１つまたは複数のＧＩ症候群のインヒビターを含む組成物はより有効であり得る。本発明の実施で使用することができるＧＩ症候群のインヒビターには、ＳＣＦおよびＫＧＦなどのサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物を、被爆前の任意の時点（被爆の約４８時間前、４６時間前、４４時間前、４２時間前、４０時間前、３８時間前、３６時間前、３４時間前、３２時間前、３０時間前、２８時間前、２６時間前、２４時間前、２２時間前、２０時間前、１８時間前、１６時間前、１４時間前、１２時間前、１０時間前、８時間前、６時間前、４時間前、３時間前、２時間前、または１時間前が含まれるが、これらに限定されない）で投与することができる。ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物を、被爆後の任意の時点（被爆から約１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、２４時間後、２６時間後、２８時間後、３０時間後、３２時間後、３４時間後、３６時間後、３８時間後、４０時間後、４２時間後、４４時間後、４６時間後、または４８時間後が含まれるが、これらに限定されない）で投与することができる。
【００８０】
ｆ．敗血症
本発明はまた、治療有効量のＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の敗血症の予防方法に関する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を、他の治療と組み合わせて投与することができる。
【００８１】
ウイルス感染または細菌感染は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドを介した自然免疫系を刺激し得る。マクロファージを、その表面上のＴＬＲ５の存在によるフラゲリンおよびフラゲリン関連ポリペプチドによって防護および／または刺激することができる。例えば、炭疽菌感染症の発症における重要段階は、炭疽菌内でのマクロファージの死滅である。フラゲリンおよびフラゲリン関連ポリペプチドを使用した種々のストレスからの腸内皮の防護により、ＧＩ細胞死を予防し、病原菌のＧＩ壁の透過を予防することもでき、それにより、エボラなどの感染によって生じるＧＩ出血を予防することができる。他の出血性ウイルス感染症を、内皮および胃腸管上皮の救出によって予防することもできる。
【００８２】
３．薬剤
本発明はまた、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤に関する。薬剤は、人工的に合成された化合物または天然に存在する化合物であり得る。薬剤は、低分子量の化合物、ポリペプチド、ペプチド、そのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体、または誘導体であり得る。
【００８３】
薬剤はまた、ＮＦ−κＢ誘導サイトカイン（ＩＬ１２、ＩＬ６、ＴＮＦ、およびＴＧＦβが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。薬剤はまた、プロスタグランジンであり得る。薬剤はまた、成長因子（ＫＧＦおよびＰＤＧＦが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。薬剤はまた、ＮＦ−κＢ活性を誘導する抗体であり得る。
【００８４】
ａ．フラゲリン
１つの実施形態では、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤はフラゲリンである。以下の実施例に示すように、フラゲリンおよびフラゲリン関連ポリペプチドは、細胞レベルおよび生物全体として強い生存促進活性を有する。興味深いことに、フラゲリンはまた、抗腫瘍免疫の主成分であるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴリンパ球を刺激する（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ Ｈ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｏｃｔ；７８（４）：８８８−９７；Ｃａｒｏｎ Ｇ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ａｕｇ ｌ；１７５（３）：１５５１−７；Ｈｏｎｋｏ ＡＮ ＆ Ｍｉｚｅｌ ＳＢ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２００５；３３（ｌ）：８３−１０１）。結果として、フラゲリンを、癌治療で放射線防護剤として使用することができる。
【００８５】
本発明はまた、フラゲリン関連ポリペプチド（本明細書中に記載のポリペプチドなど）に関する。本明細書中で使用される、用語「フラゲリン」は、任意の供給源（グラム陽性細菌種およびグラム陰性細菌種が含まれる）由来のフラゲリンまたはフラゲリン関連ポリペプチドを意味することを意図する。２３種の細菌由来のフラゲリンのアミノ酸配列は、米国特許出願番号２００３／００４４４２９号（その内容が本明細書中で参考として援用される）の図７に示されている。米国特許出願番号２００３／００４４４２９号の図７に列挙したフラゲリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、供給源（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベースが含まれる）から公的に利用可能である。
【００８６】
フラゲリンは、細菌鞭毛の主成分である。フラゲリンは、３つのドメインから構成される（図９）。ドメイン１（Ｄ１）およびドメイン（Ｄ２）は、不連続であり、アミノ末端およびカルボキシ末端中の残基がヘアピン構造の形成によって並列した場合に形成される。Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインを含むアミノ末端およびカルボキシ末端が最も保存されるのに対して、中間の超可変ドメイン（Ｄ３）は、可変性が非常に高い。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉヒンジによって分離されたアミノＤ１およびＤ２ならびにカルボキシＤ１およびＤ２を含む組換えタンパク質（ＮＤ１−２／ＥＣＨ／ＣＤ２）を使用した研究は、ＥＣＨエレメントと結合した場合にＤ１およびＤ２が生物活性を示すことを示す。このキメラ（ヒンジのみではない）は、２つの腸上皮細胞株においてＩκＢαの分解、ＮＦ−κＢ活性化、ならびにＮＯおよびＩＬ−８の産生を誘導した。非保存Ｄ３ドメインは、鞭毛フィラメントの表面上に存在し、主な抗原エピトープを含む。フラゲリンの強力な炎症促進活性は、高度に保存されたＮおよびＣのＤ１およびＤ２領域に存在し得る。
【００８７】
フラゲリンは、Ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）への結合によってＮＦ−κＢ活性を誘導する。ＴＬＲファミリーは、少なくとも１０メンバーから構成され、病原体に対する自然免疫防護で不可欠である。自然免疫系は、細菌病原体上で保存された病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識する。ＴＬＲは、細菌フラゲリンに特別な保存構造を認識し得る。保存構造は、アミノ酸含有量の変動がいくらか許容される巨大な残基群から構成され得る。Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１２４７−５３（２００３）は、ＴＬＲ５によって認識される保存構造の一部であるフラゲリン中の１３個の保存アミノ酸を同定した。ＴＬＲ５活性に重要なフラゲリンの１３個の保存アミノ酸を、図２４に示す。
【００８８】
好ましい実施形態では、フラゲリンは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属に由来し、その代表例は、Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８４９７２によってコードされる）（配列番号１）である。別の好ましい実施形態では、フラゲリン関連ポリペプチドは、ＴＬＲ５に結合してＴＬＲ５媒介活性（ＮＦ−κＢ活性の活性化など）を誘導する配列番号１のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、誘導体、またはその組み合わせである。フラゲリンのフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、または誘導体を、フラゲリンのドメイン構造およびＴＬＲ５によって認識される保存構造に基づいた理論ベースのデザインによって得ることができる。
【００８９】
より好ましい実施形態では、配列番号１のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、誘導体、またはその組み合わせは、図２４に示す少なくとも１０、１１、１２、または１３個の保存アミノ酸（８９位、９０位、９１位、９５位、９８位、１０１位、１１５位、４２２位、４２３位、４２６位、４３１位、４３６位、および４５２位）を含む。別のより好ましい実施形態では、配列番号１のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、誘導体、またはその組み合わせのアミノ末端およびカルボキシ末端は、配列番号１のアミノ酸１〜１７４および４１８〜５０５と少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である。図２６は、配列番号１と比較した既知のＴＬＲ−５刺激活性を有するフラゲリンのアミノ末端およびカルボキシ末端の同一率を列挙する。
【００９０】
フラゲリンホモログは、任意のグラム陽性細菌種およびグラム陰性細菌種由来のフラゲリンポリペプチド（米国特許出願番号２００３／００００４４４２９号（その内容が本明細書中で参考として援用される）に開示のフラゲリンポリペプチドおよび図２５に示すＢＬＡＳＴの結果に列挙したアクセッション番号に対応するフラゲリンペプチドが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。フラゲリンホモログのフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、および誘導体も意図される。
【００９１】
フラゲリンフラグメントは、ＴＬＲ５活性を刺激するフラゲリンポリペプチドの一部であり得る。少なくともいくらかのＴＬＲ５刺激活性を保持する多数のフラゲリンの欠失変異体が作製されている。本明細書中の実施例に開示の欠失変異体に加えて、代表的な欠失変異体には、アミノ酸１８５〜３０６または４４４〜４９２を欠くＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ１３６８９の翻訳物およびアミノ酸１７９〜４１５を欠くＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８４９７３の翻訳物が含まれる。フラゲリンフラグメントのホモログ、改変体、アナログ、および誘導体も意図される。
【００９２】
フラゲリン改変体には、トランスポゾンが挿入され、可変Ｄ３ドメインに変化したフラゲリンポリペプチドが含まれる。改変体がＴＬＲ５活性を刺激するようにＤ３ドメインの一部または全部をＤ１およびＤ２ドメインを適切に折り畳むことが可能なヒンジまたはリンカーポリペプチドに置換することができる。変異ヒンジエレメントの代表例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＭｕｋＢタンパク質ならびに配列番号３および４に見出すことができる。フラゲリン改変体のフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体も意図される。
【００９３】
４．組成物
本発明はまた、治療有効量のＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物に関する。組成物は、当該分野で周知の方法を使用して生成することができる薬学的組成物であり得る。上記のように、ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物を、アポトーシスに関連する状態（被爆、癌治療の副作用、ストレス、および細胞老化が含まれるが、これらに限定されない）の治療のために哺乳動物に投与することができる。組成物はまた、さらなる薬剤（放射線防護剤または化学療法薬が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。
【００９４】
ａ．投与
本発明の組成物を、任意の様式で（経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入、口腔投与、胸腔内、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）投与することができる。非経口投与には、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鞘内、および関節内が含まれるが、これらに限定されない。経粘膜投与には、鼻腔内投与が含まれるが、これらに限定されない。動物のために、組成物を、通常の獣医学診療に関する適切に許容可能な処方物として投与することができる。獣医は、特定の動物に最も適切な投与計画および投与経路を容易に決定することができる。
【００９５】
組成物を、アポトーシスを誘発するストレスまたはその組み合わせの前、後、または同時に投与することができる。組成物を、アポトーシスを誘発するストレスへの曝露の約１
〜約４８時間前または後に投与することができる。
【００９６】
ｂ．処方物
本発明の組成物は、従来の様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態であり得る。例えば、経口投与のための錠剤およびカプセルは、従来の賦形剤（結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、および湿潤剤が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。結合剤には、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプンの粘液、およびポリビニルピロリドンが含まれるが、これらに限定されない。充填剤には、ラクトース、糖、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、およびソルビトールが含まれるが、これらに限定されない。潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、およびシリカが含まれるが、これらに限定されない。崩壊剤には、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。湿潤剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。錠剤を、当該分野で周知の方法によってコーティングすることができる。
【００９７】
本発明の組成物はまた、液体処方物（水性または油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、およびエリキシルが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。組成物を、使用前に水または他の適切な賦形剤を使用して構成するための乾燥生成物として処方することもできる。このような液体調製物は、添加剤（懸濁剤、乳化剤、非水性賦形剤、および防腐剤が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。懸濁剤には、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および食用硬化脂肪が含まれるが、これらに限定されない。乳化剤には、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、およびアカシアが含まれるが、これらに限定されない。非水性賦形剤には、食用油、アーモンド油、分留ヤシ油、油性エステル、プロピレングリコール、およびエチルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。防腐剤には、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、およびソルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明の組成物を座剤として処方することもでき、この組成物は、座剤基剤（カカオバターまたはグリセリドが含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。本発明の組成物を吸入のために処方することもでき、この組成物は、乾燥粉末として投与することができるか、ジクロロジフルオロメタンまたはトリクロロフルオロメタンなどの噴射剤を使用したエアゾールの形態であり得る溶液、懸濁液、または乳濁液の形態（これらに限定されない）であり得る。本発明の組成物を、水性または非水性賦形剤（クリーム、軟膏、ローション、ペースト、薬用プラスター、パッチ、または膜が含まれるが、これらに限定されない）を含む経皮処方物として処方することができる。
【００９９】
本発明の組成物を、非経口投与（注射または持続注入が含まれるが、これらに限定されない）のために処方することもできる。注射用処方物は、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性賦形剤の乳濁液の形態であってよく、処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）（懸濁剤、安定剤、および分散剤が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。組成物を、適切な賦形剤（滅菌無発熱物質水が含まれるが、これらに限定されない）で再構成するための粉末形態で提供することもできる。
【０１００】
本発明の組成物を、移植または筋肉内注射によって投与することができるデポー調製物として処方することもできる。組成物を、適切な高分子または疎水性材料（例えば、許容可能なオイルの乳濁液として）、イオン交換樹脂、またはやや溶けにくい誘導体（例えば、やや溶けにくい塩として）を使用して処方することができる。
【０１０１】
ｃ．投薬量
治療に必要な薬剤の治療有効量は、治療条件、ＮＦ−κＢ活性の誘導に望ましい期間、ならびに患者の年齢および状態によって変化し、最終的に、担当医によって決定される。しかし、一般に、成人のヒトに使用される用量は、典型的には、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。用量は、約１μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ／日であり得る。望ましい用量を、単回用量で都合よく投与するか、適切な間隔で（例えば、１日に２回、３回、４回、またはそれ以上の分割用量）複数回用量として投与することができる。一旦薬剤を投与しなくなると正常細胞におけるＮＦ−κＢ活性が減少し得るので、しばしば、複数の用量が望ましいか必要である。
【０１０２】
ＮＦ−κＢの誘導因子の投薬量は、任意の投薬量（１μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１７５μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４２５μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、４７５μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５２５μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、５７５μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６２５μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、６７５μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７２５μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、７７５μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８２５μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、８７５μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９２５μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、９７５μｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。
【０１０３】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示される複数の態様を有する。
【実施例】
【０１０４】
（実施例１ マウスにおけるＧＩ症候群のｐ５３欠損促進性の発症）
哺乳動物の電離放射線（ＩＲ）に起因する主な死亡原因は、放射線量に依存する。９〜１０Ｇｙまでの線量で、マウスは、主に致死性骨髄減少造血器（ＨＰ）症候群（ｌｅｔｈａｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ（ＨＰ） ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のために１２〜２０日後に死亡する。この線量では、照射マウスを、骨髄移植によって死亡から救出することができる。１５Ｇｙ超を被爆した動物は、処置から７〜１２日後に（造血器症候群によって死亡し得る前に）、小腸−胃腸（ＧＩ）症候群に対する損傷による合併症によって死亡する。ＨＰおよびＧＩ症候群の両方では、組織の致死的損傷は、大規模なｐ５３依存性アポトーシスから開始される。この所見により、ｐ５３が照射誘導死の決定要因であり得るとより早く示唆することが可能である。常に、ｐ５３欠損マウスは、ＨＰ症候群によって死亡する放射線量に耐性を示し、６〜１１Ｇｙのγ線照射を受けた野生型動物の死亡を、小分子ｐ５３インヒビターであるピフィスリン（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ）−α（ＰＦＴ）によるｐ５３の一過性の薬理学的阻害によって減少させることができる（Ｋｏｍａｒｏｖ ｅｔ ａｌ １９９９）。遺伝毒性ストレスに対して組織を感作する因子としてのｐ５３の同定を、実験的化学療法または照射の結果として生じる抜け毛（脱毛症）のｐ５３依存性の証明によってさらに強化した。したがって、前の所見に基づいて、ｐ５３がより高い線量のＩＲ後の致死的ＧＩ症候群の発症に重要な役割を果たし続けると予想されるであろう。驚いたことに、ｐ５３欠損は、より高い線量のＩＲに対してマウスを感作し、致死的胃腸症候群を発症する（図１）。ＩＲ後のｐ５３欠損上皮の陰窩における連続的細胞増殖は、損傷陰窩細胞死の加速および絨毛の急速な破壊と相関する。ｐ５３は、小腸陰窩における成長停止を誘導し、それによって腸の完全性を保存することによって延命する（図２）。したがって、ｐ５３のアポトーシス促進機能が造血器症候群を促進する一方で、その成長停止機能が胃腸症候群の発症を遅延させる。
【０１０５】
小腸における細胞集団の動力学を、非常に詳細に分析した。腸上皮中の細胞増殖は、幹細胞および初期増殖前駆細胞が存在する陰窩に限定される。２回の細胞分裂後、既に分化した陰窩幹細胞の子孫は、絨毛に移動し、絨毛先端から吹き出す。マウスの小腸では、細胞の全「航海（ｔｒｉｐ）」（増殖性区画から絨毛先端への）は、通常、３〜５日を要する。γ線照射に対する小腸の反応が病理形態学的レベルで十分に試験されているにもかかわらず、ＧＩ死亡の正確な原因（一次事象が含まれる）が何であるかは不明確なままである。上皮陰窩細胞損傷およびその後の絨毛の露出を直接的結果とし、流動物と電解質との不均衡、菌血症、および内毒素血症を発症して死亡し得る。炎症および間質応答に加えて、内皮機能不全は死亡に寄与する重要な要因のようである。まとめると、ＩＲ誘導性ＨＰ症候群からの防護方法として非常に有効であることが示されたｐ５３の薬理学的抑制は、ＧＩ症候群に（有害ではないが）役立たない。したがって、別の機構（例えば、ＮＦ−κＢの活性化およびその後の細胞死の阻害など）に依存する小腸上皮の放射線防護に対する別のアプローチを開発する必要がある。
【０１０６】
（実施例２ フラゲリンはＩＲ誘導性ＧＩ症候群に起因するマウスの死亡を遅延する）
ＧＩ管損傷を誘導した従来の照射モデルの場合、１５Ｇｙのγ線照射を使用したマウスの全身照射により、ＧＩ症候群のために８日以内に死亡した。フラゲリンがＩＲからＧＩ上皮を防護することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、１５Ｇｙの照射後のマウスの致死性の動力学に対するｉ．ｖ．注射したフラゲリンの効果を試験した。本発明者らは、一定範囲のフラゲリン用量を使用し、その全ては文献から公知の最も高い許容用量（３００μｇ／マウス）よりも有意に低かった。処置から４時間後に照射した。代表例の結果を、図４に示す。予想通り、コントロール照射マウス（ＰＢＳをｉ．ｖ．投与した）は、処置から５日後と８日後との間に死亡した。フラゲリンを投与した動物は、有意により長く生存し、動物生存の延長はフラゲリンの用量と相関した。照射７日後の小腸の病理形態学的分析により、フラゲリン処置群とコントロール群との間の劇的な相違が明らかとなった（図５）。０．２ｍｇ／ｋｇのフラゲリンの静脈内、腹腔内、および皮下送達ならびにその後の１３Ｇｙの照射によって同程度に防護され、８５〜９０％のマウスが３０日間生存した（データ示さず）。理論に拘束されないが、フラゲリンは、ＮＦ−κＢの活性化による放射線防護剤であり得、恐らくアポトーシス死のインヒビターとして作用する。
【０１０７】
（実施例３ 致死性ＩＲ誘導性造血器症候群からのマウスのフラゲリン救出）
本発明者らは、次に、フラゲリンが、致死性ＧＩ毒性を生じることができないより低い放射線量（通常、１１Ｇｙまで）によって実験的に誘導されたＨＰ症候群由来のマウスのＩＲ誘導死に効果があるかどうかを試験した。上記実験と同様に実験を行ったが（図１４および１５）、１５Ｇｙの代わりに、マウスに１０Ｇｙ（１３日目までにコントロール群が１００％死亡する線量）を照射した（図６）。フラゲリン処置群（５μｇ／マウス）は、この線量のＩＲから完全に防護され、驚いたことに、フラゲリン媒介性放射線防護はＧＩだけでなくＨＰ ＩＲ誘導性症候群に対しても作用することを示す。
【０１０８】
（ 実施例４ フラゲリンの防護効果への時間の依存）
マウスに、次に、１３Ｇｙのγ線照射前の異なる時間にフラゲリンを投与した。このような実験の１つの結果を、図７に示す。得られた結果は、処置の１〜４時間前に注射した場合、フラゲリンが１３Ｇｙからの放射線防護剤として有効であることを示す。
【０１０９】
処置時間に対するフラゲリンの放射線防護活性の依存をさらに評価するために、γ線照射時に対していくつかの時点でマウスに注射した。５μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）の全長フラゲリン、またはコントロールマウスには５μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）の細菌ＲＮＡポリメラーゼの腹腔内注射を使用して、本質的に上記説明のように実験を行った。ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウス系統を使用して実験を行った。結果は、処置の１〜２時間前にフラゲリンを注射した場合、１３Ｇｙの照射後にフラゲリンによって約９０％が生存することを示す（図７）。明確にするために−１時間のグラフのみを示すが、両時点（−１時間および−２時間）は、類似の程度および動力学の生存を示す。４時間で、いくらかより低い防護を示す。照射の２４時間前に注射したフラゲリンは、１３Ｇｙで誘導される死に防護効果を示さなかった。
【０１１０】
興味深いことに、１０Ｇｙのγ線照射の２４時間前のフラゲリンの投与は１００％の防護を示した。マウスへの１３Ｇｙの照射によって主にＧＩ症候群に起因する死亡を誘導する一方で、１０Ｇｙで誘導される死は、ほとんど造血器症候群によって媒介される。したがって、このような１０Ｇｙ照射からの長期防護を、フラゲリンおよび／または長寿命二次サイトカインによって誘導される造血幹細胞の増殖または生存の増強によって媒介し得る。
【０１１１】
（実施例５ フラゲリンのＬＤ５０／３０、ＬＤ５０／７、およびＤＭＦの決定）
本発明者らは、次に、フラゲリンの放射線量依存性防護を評価した。上に示すように（図７）、フラゲリンでの処置は、１０Ｇｙのγ線照射に対する１００％防護に十分であり（この線量によって造血器症候群で死亡する）、１３Ｇｙで９０％が３０日間生存した（造血器症候群およびＧＩ症候群の両方）。照射の１時間前に腹腔内注射したフラゲリン５μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）を使用して、上記のように実験を行った。
【０１１２】
しかし、１５Ｇｙでは、１００％が７日間生存し、１３日後に死亡が遅延する一方で（３０日生存は０％）、コントロール群は７日目までにＧＩ症候群によって完全に死亡した（図８）。１５Ｇｙ照射後のフラゲリン処置群死亡率の動態は、１０Ｇｙのコントロール群に類似しており、造血器症候群に起因する死亡が示唆される。この結果により、フラゲリンのＬＤ５０／３０が１３．５〜１４Ｇｙであり、ＤＭＦ３０が約１．７５〜１．８であると評価される。この程度の放射線防護は、天然化合物についての任意の報告よりも有意に高かった。
【０１１３】
（実施例６ フラゲリンフラグメントの合理的デザインおよびクローニング）
ＦｌｉＣ遺伝子によってコードされるＳａｌｍｏｎｅｌｌａフラゲリン（配列番号２）は、生存促進ＮＦ−κＢ経路の強いアクチベーターである。これは、その放射線防護作用の最も可能性が高い機構である。以前の研究では、細胞表面上のＴｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）へのフラゲリンの結合がＮＦ−κＢの活性化に必要な工程であることが示されている。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａフラゲリンのドメイン構造は、文献に十分に詳細に記載されている（図９）。さらに、フラゲリン−ＴＬＲ５複合体の以前の構造研究（図１０）により、結合（すなわち、ＮＦ−κＢ活性化）に不可欠であるか重要でないドメインを区別することができる。タンパク質最小化により、フラゲリン関連ポリペプチドの反復投与後の免疫応答を減少させることができる。低分子量のタンパク質および少数の利用可能な免疫原性エピトープによる免疫原性の低下に一部起因して、これを達成することができる。
【０１１４】
ＴＬＲ５結合に必要なドメインを、進化的に保存された細菌フラゲリンのＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメイン中に排他的に配置することができる。超可変ドメイン（アミノ酸１７８〜４０２）は、ＴＬＲ５と密接に接触しなくなる。前に証明したように、このドメインの可動性リンカーペプチドへの置換は、ＴＬＲ５への結合を破壊しなかった。さらに、Ｎ末端およびＣ末端のコイルドコイル重合ドメイン（アミノ酸１〜５５、４５６〜５０５）は、ＴＬＲ５に結合せず、重要でない可能性が高い（それぞれ本明細書中に示す、修飾Ｎ末端およびＣ末端ＢおよびＢ’参照）。また、実質的にＴＬＲ５に結合する主なＮ末端のαヘリックス以外の全ドメインを欠く別のフラグメント末端（アミノ酸５６〜１００）は、結合に十分であり得る。
【０１１５】
したがって、ｐＧＥＸ−ＫＧクローニングベクター（配列番号５および６）から採取した可動性リンカー（配列番号３および４）と連結した３つのＮ末端型（Ａ、Ｂ、Ｃ）および２つのＣ末端型（Ａ’、Ｂ’）を発現構築物に組み合わせて、いくつかの可能なフラゲリンフラグメントを産生した（表１）。さらに、個別のＮ末端（Ａ、Ｂ、Ｃ）およびＣ末端のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合物（ＧＳＴ−Ａ’、ＧＳＴ−Ｂ’）を示す構築物を調製した。全構築物を、ｐＲＳＥＴｂ細菌発現ベクター中にクローン化し、６ｘＨｉｓタグ化タンパク質を産生し、さらなる実験のために精製した（図１１）。
【０１１６】
表１
【０１１７】
【表１】
（実施例７ 生物活性フラゲリンフラグメントの選択）
フラゲリンの放射線防護活性がＮＦ−κＢ依存性であるようであるので、本発明者らは、フラゲリンフラグメントが核にＮＦ−κＢを転位置し、ＤＮＡ中のその標的部位への結合を誘導する能力を試験した。フラゲリンおよびフラグメント処置Ａ５４９肺癌細胞由来の核抽出物および標識した合成ＮＦ−κＢ結合ｋＢオリゴヌクレオチドを使用した電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によってこれを試験した。
【０１１８】
フラゲリン自体ならびにフラグメントＡＡ’、ＡＢ’、およびＢＡ’のみでＮＦ−κＢ転位置を誘導することができた（図１２）。転位置レベルは、フラゲリンならびにフラグメントＡＡ’、ＡＢ’、およびＢＡ’で類似している。超可変ドメインは、ＮＦ−κＢ転位置に必要でないようである一方で、少なくとも１つの重合ドメイン、Ｎ末端、またはＣ末端が存在する必要がある。Ｎ末端およびＣ末端フラグメントの混合物（Ａ＋Ａ’、Ａ＋Ｂ’）は不活性であった。
【０１１９】
ＮＦ−κＢの核への転位置がアポトーシスのＮＦ−κＢ調節インヒビターの誘導における重要な工程である一方で、それ自体では十分でない。選択されたフラグメントがＮＦ−κＢ調節遺伝子の発現を誘導する能力を直接試験するために、本発明者らは、レポーターアッセイ実験を行った。フラゲリンならびにＡＡ’、ＢＢ’、Ａ’、およびＢ’フラグメントを、ＮＦ−κＢ応答性プロモーター下でのルシフェラーゼ遺伝子を保有するＨ１１６ヒト結腸癌細胞の処置のために使用した。レポーター構築物は、細胞のＮＦ−κＢ状態の検出のために日常的に使用されているＨｓｐ７０最小プロモーターを組み合わせたＥ選択プロモーター由来の３つのＮＦ−κＢ結合部位を含んでいた。フラゲリンまたはその短縮フラグメントの培地への添加から６時間後の細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を測定した。正のコントロールとしてＴＮＦを使用した。各実験結果を図１３に示し、フラゲリンおよびフラグメントＡＡ’がＮＦ−κＢを活性化することができるのに対して、フラグメントＢＢ’、ＧＳＴ−Ａ’、およびＧＳＴ−Ｂ’はできないことを示す。
【０１２０】
（実施例８ フラゲリンフラグメントのさらなる最適化）
本発明者らは、そのＮ末端の半分からペプチドフラグメントを段階的に除去することによるさらなるフラグメントの産生によってＡＡ’フラゲリンフラグメントをさらに最小化した（表２）。フラゲリンおよびフラグメント処置ＨＴ２９ヒト結腸癌細胞由来の核抽出物および標識した合成ＮＦ−κＢ結合κＢオリゴヌクレオチドを使用して、上記のように電気泳動移動度シフトアッセイを行った。ＨＴ２９細胞中のＮＦ−κＢ結合活性を、ＴＮＦａ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはフラゲリンフラグメント（１ｍｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。図１４に示すように、フラグメントＡＡ’ｎｌ−１７０、ＡＡ’ｎ５４−１７０、ＡＡ’ｎｌ−１６３、およびＡＡ’ｎ５４−１６３はそれぞれＮＦ−κＢ転位置を誘導し、そのレベルは、ＡＡ’ｎｌ−１７０、ＡＡ’ｎ５４−１７０、およびＡＡ’ｎｌ−１６３のフラゲリンに匹敵する。
【０１２１】
表２
【０１２２】
【表２】
ＡＡ’フラグメントをＮＦ−κＢ調節転写を直接活性化する能力を研究するために、本発明者らは、広範な濃度のフラゲリン、元のＡＡ’、およびＡＡ’誘導フラグメントについて上記のようにレポーターアッセイ実験を行った。上記のように、ＡＡ’およびＡＡ’ｎ１−１７０は、研究した濃度範囲にわたり、フラゲリンに匹敵するレベルでＮＦ−κＢ調節転写を誘導する（図１５の左）。ＡＡ’およびＡＡ’ｎ１−１７０は、非常に低濃度の範囲でフラゲリンよりも高い活性を示し（図１５の右）、このことは、おそらくその分子量の減少に起因する。フラグメントＡＡ’ｎ１−１７０を使用した結果は、有意に活性を喪失することなく除去されたＮ末端ドメインの一部を使用してＡＡ’誘導性フラゲリンフラグメントを作製することができ、これを有効な放射線防護剤として使用することができることを示す。
【０１２３】
上記実験（ＥＭＳＡおよびレポーター活性化アッセイ）を、３０分間のボイルおよび細胞への適用前の再生に供したフラゲリンおよびＡＡ’フラグメントを使用して繰り返した。結果は、ボイルしないで得た結果に匹敵した（データ示さず）。これは、認められたフラゲリンフラグメント活性の相違がタンパク質安定性の変化によって生じ得ないことを示す。
【０１２４】
（実施例９ フラゲリンおよびフラゲリンフラグメントの放射線防護性のｉｎ ｖｉｖｏでの比較）
上記のように、全長フラゲリンは造血器症候群および胃腸症候群の両方を防護する。１１Ｇｙ（マウスの造血器症候群関連死亡を誘導する線量）または１４Ｇｙ（ＧＩ症候群由来の死亡を生じる線量）でのγ線照射後に、フラゲリンフラグメントの放射線防護性を同様に試験した。マウス（１０匹／群）に、５．０μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）のフラゲリンおよびそのフラグメント（ＡＡ’またはＢＢ’）を皮下注射し、１時間後にγ線を照射した。
【０１２５】
ＡＡ’フラグメントによって示された放射線防護度は、少なくとも全長フラゲリンに匹敵する（図１６）。ＡＡ’フラグメントおよび全長フラゲリンの両方は、１１Ｇｙおよび１４Ｇｙで照射したマウスについて１００％の３０日生存を示した。一方で、ＢＢ’フラグメントを注射したマウスの３０日生存は０％であった。ＢＢ’フラグメントがｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＦ−κＢを誘導することができないので、このことは予想される。これらの結果は、放射線防護度を減少させることなくフラゲリンのサイズを有意に減少させることができる（約４０％の除去）ことを示す。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＦ−κＢ活性化の結果から放射線防護の可能性を予想することができることが確認される。
【０１２６】
（実施例１０ フラゲリン媒介性放射線防護の細胞標的の同定）
１４Ｇｙでの照射から５日後に、フラゲリンで前処置したマウスおよびコントロールマウスから腸粘膜の組織サンプルを採取した。コントロール動物を、５．０μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）の細菌ＲＮＡ−ポリメラーゼで処置した。小腸の病理形態学的分析により、コントロールマウスの陰窩および絨毛のサイズの減少ならびに多数の凝縮アポトーシス核を有する細胞ならびに処置マウスにおけるほぼ正常な形態が明らかとなった（データ示さず）。ＡＡ’フラグメントで処置したマウスからも組織サンプル（小腸および背中由来の皮膚）を得た。図１７に示す結果は、少なくとも３匹のマウス組で認められた典型的な形態の領域である。フラゲリンおよびＡＡ’フラグメントでの処置後、マウスは、絨毛／陰窩構造を保持したほぼ正常な腸形態を示した（図１７Ａ）。
【０１２７】
細胞の死および生存における純粋に組織学的な観察に加えて、本発明者らは、アポトーシス関連ＤＮＡ断片化を検出するＴＵＮＥＬアッセイを使用した腸組織におけるアポトーシス細胞死のより特殊化した試験を行った。これらの実験により、より高い確率で照射によって枯渇し、フラゲリンフラグメント処置によって救出された細胞集団を定義することができた。ＩＲ処置後の小腸で検出可能な最も迅速な照射誘導性変化は、絨毛の血管内皮細胞で生じるアポトーシスであり、これは、処置から５時間の速さで認められる（図１７Ｂ）。小腸の放射線感受性に重要であると考えられるこのアポトーシスは、ＡＡ’フラグメントで前処置したマウスではほとんど完全に遮断された（図１７Ｂの下のパネル）。処置から数日以内に生じ、フラグメントＡＡ’処置動物で非常に抑制される絨毛および陰窩の変性は、血管損傷の結果として起こる。フラゲリンフラグメントによる小腸内皮細胞の有効な防護は、これらの細胞中でのＴＬＲ５の発現に起因し得る。
【０１２８】
著しく、ＡＡ’フラグメントおよびフラゲリンも、体毛の毛包の基底に存在する脂腺の照射誘導性消失を予防した（図２７Ｃ）。これらの結果により、照射誘導性脱毛の放射線防護および予防に対するＡＡ’フラグメントの適切性がさらに確認される。
【０１２９】
（実施例１１ 超致死照射からの防護）
ＡＡ’フラグメントによって得られた放射線防護限度を調査するために、本発明者らは、マウスに、１７Ｇｙおよび２０Ｇｙの単回線量の全身γ線照射を行った。負のコントロールとして不活性フラゲリンフラグメント（ＣＢ）を使用して、上記のように実験を行った。
【０１３０】
予想通り、本発明者らは、１７Ｇｙおよび２０Ｇｙの両群で１００％の死亡を認めた（図１８）。しかし、ＡＡ’フラグメントの投与によってその両方で死亡が有意に遅延された。最も顕著には、コントロールマウスにおける１７Ｇｙでの死亡の動態はＧＩ症候群と一致する一方で（６〜７日での死亡）、ＡＡ’フラグメントで処置したマウスの死亡は造血器症候群に媒介されるようである（１０〜１５日で死亡）。これは、フラゲリンおよびフラゲリンフラグメントが１７Ｇｙもの線量でのＧＩ症候群から防護することができることを示す。さらに、これは、造血器放射線防護剤と組み合わせたフラゲリンおよびフラゲリンフラグメントによってなおさらなる放射線防護を得ることができることを示す。
【０１３１】
（実施例１２ 免疫原性および反復投与の研究）
タンパク質の全免疫原性は、反復使用に対するその適切性によって決定することができる。免疫系によって生成された抗体はタンパク質の治療活性を減少させることができ、タンパク質に対してＩｇＥ抗体が産生された場合には第２の曝露時にアナフィラキシー反応も誘導し得る。したがって、全長フラゲリンと比較した抗体の量および多様性の任意の減少によって改善する。したがって、フラゲリンおよびそのフラグメントの反復導入後、本発明者らは、ａ）第２の暴露後に得られる放射線防護の有効性、ｂ）局所および全身アレルギー反応、およびｃ）抗体力価をモニタリングした。
【０１３２】
本発明者らは、ＡＡ’がＡＡ’に曝露されたマウスを防護する能力を試験した。２０匹のＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウス群に、５μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）のＡＡ’を皮下注射した。等用量のＡＡ’の第２の注射を、２１日後（１０匹）および２８日後（別の１０匹）に行い、抗体形成に十分な時間を置いた。第２のＡＡ’注射後に、１３Ｇｙの全身γ照射を行った（注射から１時間後）。以前にＡＡ’に曝露していなかったマウスで認められたように、両群で１００％の３０日生存が認められた（データ示さず）。これらの結果は、長期にわたる反復投与でもＡＡ’の活性が減少せず、多目的適用の可能性が再確認されることを示す。また、フラゲリンまたはＡＡ’のいずれにおいても局所アレルギー反応またはアナフィラキシーは認められなかった。
【０１３３】
本発明者らは、ＡＡ’が生物の免疫状態に与える影響を定量するための抗体力価のＥＬＩＳＡによる決定も行った。９６ウェルプレートを、２０ｍｇ／ｍｌのフラゲリンまたはＡＡ’（５０ｍｌ／ウェル）でコーティングし、＋４℃で一晩インキュベートした。マウスから回収した血清サンプルを、数倍に希釈してウェルに添加し、一晩インキュベートし、その後、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＰＯ−抱合体抗体と６時間反応させた。４１４ｎｍのフィルターを使用した分光光度計を使用して測定を行った。各マウスについて決定した抗体力価および平均力価を、図１９および図２０に示す。
【０１３４】
ＡＡ’は、マウスで非常に低いレベルの抗体を誘導し（図１９）、２１日目に約０．８ｍｇ／ｍｌ血清および２８日目に約１０％超である。他方では（図２０）、フラゲリンは高力価の抗体を誘導し、２１日目および２８日目の両方で約２０ｍｇ／ｍｌである。概して、これは、超可変ドメインの除去が元のタンパク質と比較してＡＡ’の免疫原性を激しく減少させる（約２５倍）ことを示す。図１９は、大部分のＡＡ’特異的抗体がフラゲリンを認識することができることも示す。これにより、ＡＡ’の合理的デザインによって新規の免疫原性エピトープはあまり産生されない一方で、元のタンパク質の９５％を超える免疫原性が除去されることが確認される。
【０１３５】
（実施例１３ フラゲリンおよびＡＡ’の急性毒性研究）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａフラゲリンの致死用量は、１ｍｇ／ｋｇ（全身性炎症）と１０ｍｇ／ｋｇ（１００％死亡）との間である。本発明者らは、０．５、１、２、４、および８ｍｇ／ｋｇの漸増用量のＡＡ’をマウス（４匹／用量群）に皮下投与した。より低い（約６０％）分子量により、８ｍｇ／ｋｇのＡＡ’は、モル換算で１３．３ｍｇ／ｋｇのフラゲリンの用量に相当する。全用量の投与から数日後に、目に見える有害な影響（死亡率、罹患率、または活性の減少および熱などの全身性炎症の兆候など）は認められなかった。これは、全長フラゲリンと比較してＡＡ’の炎症促進効果を無視することができることを示し、特に、ＡＡ’が０．２ｍｇ／ｋｇで有効な放射線防護を示すと見なされる。毒性の減少は、ＡＡ’フラグメント中の主要な炎症促進ドメインの不在に起因し得る。
【０１３６】
（実施例１４ ＡＡ’による分割照射からの防護）
短期間内の反復照射は、例えば、宇宙照射事象および臨床的放射治療レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎ）と共通し得る。本発明者らは、ＡＡ’フラゲリンフラグメントがマウスを分割γ線照射の亜致死レジメン（３Ｇｙで４回の処置）および１００％致死レジメン（４Ｇｙで４回の処置）から防護する能力を試験した。フラグメントＡＡ’または生理食塩水を、各照射前に（１日１回を４日間）ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓ雌マウスに投与した。単回線量照射について上記のように、ＡＡ’を投与した（５μｇ／マウス、照射１時間前に皮下投与）。
【０１３７】
図２１の結果は、ＡＡ’が短い時間枠内の反復被爆量を有意に防護することを示す。ＡＡ’処置後の１００％３０日生存に依然として適合する分割照射の累積線量は、単回線量照射シナリオで得られた累積線量に匹敵する。
【０１３８】
（実施例１５ ＡＡ’は、照射の抗腫瘍治療効果を損なうことなく正常組織を防護する）
癌治療における潜在的な放射線防護剤の最終試験は、腫瘍選択性（腫瘍を全くまたはほとんど防護することなく正常組織を防護する能力）である。本発明者らは、１０匹のＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの両側腹（全部で２０腫瘍）に、２×１０６細胞の同系肉腫細胞株モデル（ＮＩＨ３Ｔ３に由来し、ドミナントネガティブインヒビターＧＳＥ５６によって不活化されたｐ５３で自発的に形質転換した肉腫）を皮下注射した。腫瘍の直径が５〜７ｍｍのサイズに到達した場合（５日目）、マウスに、０．２ｍｇ／ｋｇのＡＡ’または生理食塩水の賦形剤を皮下注射し、１時間後に４Ｇｙの全身γ線照射（３×４．３Ｇｙ＝１２．９Ｇｙの総線量）を行った。５、６、および７日目に注射および照射を行った。
【０１３９】
結果を図１１に示すように、ＡＡ’によって腫瘍の照射誘導性収縮が増強された。１８日目までに、全ての照射された腫瘍保有マウスが急性照射毒性によって死亡したのに対して、放射線療法およびＡＡ’の両方を受けたマウスの１００％が治癒し、治療を生き延びた。別の同系腫瘍モデル（Ｂ１６黒色腫細胞）を使用しても類似の結果が得られた（図１１、右のパネル）。驚いたことに、非照射マウスでさえ、ＡＡ’投与によって腫瘍の成長速度が減少した。これは、Ｔｏｌｌ様受容体の他のリガンドによって生じることが公知のＡＡ’誘導性免疫刺激に起因し得る。これらの結果は、ＡＡ’が２つの腫瘍型の放射線感受性に影響を与えずにマウスの照射耐性を増加させ、それにより、放射線療法とＡＡ’との組み合わせが治療結果を改善する可能性を切り開くことを示す。
【０１４０】
（実施例１６ ＡＡ’およびＬＰＳの放射線防護機構は異なる）
グラム陰性細菌のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）は、別のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ４）のリガンドである。ＬＰＳは、ＮＦ−κＢの強力な誘導因子であり、サイトカインのその後のカスケードである。ＬＰＳは、放射線防護化合物として公知であるが、その高い毒性により、その使用が不可能である（放射線防護用量が致死用量と非常に近い）。ＬＰＳによる放射線防護の基礎をなす主な機構の１つは、ＧＩ防護プロスタグランジンの合成を駆動するシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の活性化である。ＴＬＲ５による放射線防護もＣＯＸ−２活性に依存する可能性を、ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの照射の１時間前に、１ｍｇ／ｋｇのＮＳ３９８（合成ＣＯＸ−２インヒビター）または対応する賦形剤のｉ．ｐ．注射と組み合わせたＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）、ＡＡ’（０．２ｍｇ／ｋｇ）、または賦形剤のｓ．ｃ．投与によって試験した。次いで、マウスを、１３Ｇｙの全身γ線照射で処置した。ＮＳ３９８は、ＬＰＳ媒介性放射線防護を完全に除去したが、ＡＡ’の放射線防護は除去しなかった（図１２）。この結果は、ＡＡ’の活性がＣＯＸ−２に有意に依存せず、ＬＰＳ媒介性防護機構と異なる機構によって放射線防護を誘導することを示す。
【０１４１】
（実施例１７ ＡＡ’は複数のマウス系統を防護する）
本発明者らは、ＡＡ’がＮＩＨ−ＳｗｉｓｓマウスおよびＩＣＲマウスを照射から防護することを確認した。ＡＡ’の放射線防護活性が少数のマウス系統に制限されないことを確認するために、異なる起源のいくつかのさらなるマウス系統を、ＡＡ’：１２９／Ｓｖ、ＤＢＡ／２（比較的放射線抵抗性を示す）、Ｂａｌｂ／ｃ（比較的放射線感受性を示す）、およびＢａｌｂ／ｃ×ＤＢＡ／２ Ｆ１ハイブリッドＣＤ２Ｆ１によって防護について試験した。実験群に照射の３０分前に０．２ｍｇ／ｋｇのＡＡ’を注射する一方で、コントロール群に賦形剤（ＰＢＳ）を注射した。
【０１４２】
全マウス群（各８〜１０匹、８〜１２週齢の雌）に、１０Ｇｙの単回線量を全身γ線照射した。１０日目および３０日目のマウスの生存を示す。結果を、円錐グラフとして図２７に示す。１０日目に、Ｂａｌｂ／ｃマウスのみが死亡し、この死亡はＡＡ’投与によって劇的に減少する（０％生存対１００％生存）。３０日目に、全試験株は、ＡＡ’投与後に生存率が改善された（０〜２５％対５０〜１００％）。
【０１４３】
（実施例１８ ＡＡ’の薬物動態）
薬物動態パラメーター（生物中に存在する薬物の有効濃度および持続時間）は、薬物投与の経路、用量、および時間に重要であり得る。したがって、ＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）の薬物動態を、以下の４つの一般的な注射経路について試験した：静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、または筋肉内（ｉ．ｍ．）。ＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）の放射線防護用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）を、１２〜１５週齢のＩＣＲマウスに注射し、注射後の特定の時間に血漿サンプルを回収した（少なくとも３匹／測定点）。血漿中のＣＢＬＢ５０２レベルを、較正のためにコントロールＩＣＲ血漿中で急増させた既知濃度のＣＢＬＢ５０２を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。結果を、図２８および図２９に示す。
【０１４４】
結果は、筋肉内または腹腔内注射によって血漿中のＣＢＬＢ５０２が最も高いレベルおよび最も長い持続時間で存在することを示す。筋肉内注射後、３時間を超えてマウス血漿中に有意な（５ｎｇ／ｍｌ超）レベルのＣＢＬＢ５０２が認められる。静脈内注射により、血流からＣＢＬＢ５０２がより急速に消失する。
【０１４５】
（実施例１９ γ線照射に対するＡＡ’の影響は、Ａ５４９細胞の細胞死および成長阻害を誘導する）
Ａ５４９ヒト肺癌細胞株は、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性の活性化によってフラゲリンに応答すると報告されている（Ｔａｌｌａｎｔ Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４ Ａｕｇ ２３；４：３３）。本発明者らは、細胞成長阻害アッセイにおいてこの活性化がγ−ＩＲからの細胞の防護に変換されるかどうかをチェックすることを決定した。
【０１４６】
腫瘍細胞を、３つの異なる密度で（単一の細胞、予備、または半接触層を産生する０．５×１０４、１×１０４、および２×１０４細胞／ウェル）３つの９６ウェルプレートのウェルに播種した。細胞をプラスチックに付着させた後、ＣＢＬＢ５０２（２μｇ／ｍｌ）を非照射細胞または７Ｇｙもしくは１０Ｇｙのγ線照射の１５分前にウェルに添加した。コントロールウェルに、同体積の賦形剤（ＰＢＳ）を投与した。全ての時点を四連で行った。照射から７２時間後、培地をメチレンブルーを含む５０％メタノールに置換し、ウェル中の生細胞の相対数を、分光光度計を使用して６５０ｎｍで測定した。結果を図３０に示す。この実験を、固定用量の１×１０４Ａ５４９細胞／ウェルを使用しても繰り返し、５、１０、または１５Ｇｙのγ線照射の１時間前にＣＢＬＢ５０２を添加した（データ示さず）。全ての試験した実験条件で類似のフラゲリン効果が認められた。
【０１４７】
γ線照射により、３つ全ての密度でプレートしたＡ５４９細胞数の線量依存性の減少が誘導された（非照射コントロール群と比較して６０％まで）。ＣＢＬＢ５０２は、γ線照射使用の有無にかかわらず、細胞数に対する効果が無いかわずかであった。これは、腫瘍細胞がＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）によって照射から有意に防護されないことを示す。この効果は、構成性に活性なＮＦ−κＢ経路またはいくつかの他の機構を有する腫瘍細胞に起因し得る。
【０１４８】
（実施例２０ γ線照射に対するＡＡ’の影響は、複数の細胞株の細胞死および成長阻害を誘導する）
Ａ５４９細胞の結果に基づいて、いくつかのさらなる腫瘍細胞株（ヒト黒色腫Ｍｅｌ−７およびＭｅｌ−２９、結腸癌ＨＣＴ１１６、肺癌ＨＴ１０８０）、不死化腎臓上皮細胞（ＮＥＫ）および正常マウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）を、インタクトなコントロールと比較したＣＢＬＢ５０２で前処置を行うか行わない１０Ｇｙおよび１５Ｇｙのγ線照射後の成長阻害アッセイで試験した。処置の前日に、細胞を９６ウェルプレートに播種した。照射の４時間前、１時間前、または１０分前にＣＢＬＢ５０２（２μｇ／ｍｌ）をウェルに添加した（全ての時点を四連で行った）。４８時間後、メチレンブルー染色を行い、ウェル中の生細胞の相対量を決定した。３つ全ての時点で同一の結果を示した（照射の１時間前に添加したＣＢＬＢ５０２についての結果を図３１に示す）。成長阻害率を、コントロール非照射ウェルにおけるＯＤ６５０を０％阻害として計算した。
【０１４９】
ヒト黒色腫細胞株およびＭＡＥＣ細胞の両方は、むしろγ線照射対耐性を示し、インタクトな細胞（０Ｇｙ）と比較して、１０Ｇｙおよび１５Ｇｙ後にわずかな（２０％未満）成長阻害のみを示した。ＮＫＥ細胞、ＨＴ１０８０細胞、およびＨＣＴ１１６細胞は、γ線照射後に４０％までの成長阻害を示した。顕著には、ＣＢＬＢ５０２は、照射の有無にかかわらず腫瘍細胞成長に対する阻害効果は無いかわずかにあるのみであった。実験を２回繰り返した。さらに、肺癌Ｈ１２９９細胞および前立腺癌ＣＷＲ２２において類似の結果を得た（データ示さず）。これは、ＣＢＬＢ５０２によって腫瘍細胞株が照射誘導性細胞死から有意に防護されないことを示す。
【０１５０】
（実施例２１ 小腸陰窩へのＢｒｄＵ組み込みに対する照射およびＡＡ’の影響）
アポトーシスの直接阻害に加え、一過性の増殖の半減（ｈａｌｆ）およびその後の修復は、放射線防護の別の機構であり得、ＴＧＦ−β３などの他の放射線防護剤について記載されている（Ｂｏｏｔｈ Ｄ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０００ Ａｐｒ ｌ；８６（ｌ）：５３−９）。したがって、本発明者らは、最初の投与から数時間の小腸（照射するかしていない）中の細胞の増殖活性にＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）が影響を与える可能性を試験することを決定した（図３２）。ＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳをマウスにｉ．ｐ．注射し、３０分後に１５Ｇｙの照射を行った（使用する場合）。注射から２時間後（照射を適用した場合、照射から１．５時間後）、ＢｒｄＵを腹腔内注射した。さらに１．５時間後に小腸サンプルを得た。
【０１５１】
照射することなく、ＢｒｄＵが高レベルで非処置ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの腸陰窩中の細胞の核に組み込まれたのに対して（図３２の左上）、ＤＮＡ合成（ＢｒｄＵ組み込みによって測定）はＣＢＬＢ５０２処置マウスの陰窩でほぼ検出できなかった（図３２の右上）。賦形剤処置照射マウスでは、コントロールマウスよりもＢｒｄＵ組み込みが低かった。重要には、ＢｒｄＵ組み込みレベルはＣＢＬＢ５０２によって非常に減少し、おそらく、より後期の（Ｇ２期）照射誘導性成長停止と対照的に、早い（Ｓ期）成長停止を示す。したがって、ＣＢＬＢ５０２またはフラゲリンの細胞増殖抑制活性は、小腸のさらなる放射線防護機構であり得る。
【０１５２】
（実施例２２ ＡＡ’媒介性成長停止の持続時間およびＢｒｄＵ組み込みの減少）
本発明者らは、次に、小腸におけるＣＢＬＢ５０２誘導性細胞停止の持続時間を決定した。ＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳをマウスにｉ．ｐ．注射し、ＢｒｄＵを１時間後または４時間後に注射し、さらに１．５時間後にいくつかのマウスから小腸サンプルを得た（３匹のマウス由来のサンプルを示す）（図３３）。
【０１５３】
腸内のＢｒｄＵの組み込みは、１時間後にＢｒｄＵを注射した場合、（２時間後にＢｒｄＵを注射した前の実験で示すように）コントロールと比較して減少した。ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウス、ＩＣＲマウス、およびＢａｌｂ／ｃマウスは、類似の程度のＢｒｄＵ組み込みのＣＢＬＢ５０２媒介性遮断を示した（Ｂａｌｂ／ｃサンプルを、図３３に示す）。ＣＢＬＢ５０２注射から４時間後にＢｒｄＵを注射した場合、組み込み／ＤＮＡ合成レベルは、コントロールで依然として高かった。これは、ＣＢＬＢ５０２による腸幹細胞増殖の阻害が一過性のもので迅速に（４時間までに）解決することができ、その後増殖し得る（おそらく、細胞の部分的同期化に起因する）ことを示す。
【０１５４】
（実施例２３ 結腸陰窩へのＢｒｄＵ組み込みに対するＡＡ’の影響）
結腸は、小腸よりも放射線感受性がはるかに低い。小腸における増殖の減少と放射線防護との間の関係をさらに試験するために、本発明者らは、結腸へのＢｒｄＵ組み込みに対するＣＢＬＢ５０２の効果を決定した。ＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳをマウスにｉ．ｐ．注射し、１時間後にＢｒｄＵを注射し、さらに１．５時間後に小腸サンプルを得た（図３４）。
【０１５５】
小腸と異なり、ＣＢＬＢ５０２は結腸へのＢｒｄＵ組み込み効果がなかった。両器官中にＴＬＲ５が豊富であるので、これは驚くべきである。効果の相違は、ＣＢＬＢ５０２によって誘導されるさらなるＴＬＲ５シグナル伝達効果を隠し得る結腸中のより多い共生細菌量に起因し得る。
【０１５６】
（実施例２４ 投与経路による放射線防護可能性の比較）
本発明者らは、次に、以下のいくつかの経路を介して投与されたＦｌｉＣフラゲリンによる放射線防護を試験した：静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、および細管栄養（ｇａｖａｇｅ）。非経口（非細管栄養）経路のために、マウスにＰＢＳまたは賦形剤に溶解した０．２ｍｇ／ｋｇのＦｌｉＣフラゲリンを注射し、１時間後に１３Ｇｙの照射を行った。細管栄養送達実験では、１３Ｇｙのγ線照射の１時間前に、５匹のマウスに増加した用量（５０μｇ）のＦｌｉＣを含む５０μｌのＰＢＳを嚥下させた。８〜１０週齢のメスＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウス（５〜１０匹／群）で両実験を行った。
【０１５７】
細管栄養を加えた全ての試験経路は、類似の程度の防護を示し、８５〜９０％のマウスが３０日生存した（データ示さず）。細管栄養送達によって照射に対する防護は認められず、これは、胃腸環境によるタンパク質の消化に起因し得る。さらに、フラゲリン受容体（ＴＬＲ５）は、腸内容物に曝露された腸上皮の管腔部位に存在しない（Ｇｅｗｉｒｔｚ ＡＴ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ａｕｇ １５；１６７（４）：１８８２−５）。
【０１５８】
（実施例２５ 小腸の形態に対するＡＡ’の効果）
フラゲリン（およびＣＢＬＢ５０２）は、ＴＬＲ５への結合を介してＮＦ−κＢ活性を誘導し得る。したがって、ＣＢＬＢ５０２媒介性放射線防護は、ＴＬＲ５の存在および活性に依存し得る。ＭＯＬＦ／Ｅｉマウスは、ＴＬＲ５欠損の公知の天然モデルである（Ｓｅｂａｓｔｉａｎｉ Ｇ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０００ Ｍａｒ １５；６４（３）：２３０−４０）。ＣＢＬＢ５０２媒介性放射線防護が実際にＴＬＲ５依存性であることを検証するために、本発明者らは、ＭＯＬＦ／ＥｉマウスおよびＮＩＨ−ＳｗｉｓｓマウスにおけるＣＢＬＢ５０２による照射からの小腸の防護を試験した（図３５）。１５Ｇｙのγ線照射の０．５時間前に、両マウス系統に０．２ｍｇ／ｋｇのＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）またはＰＢＳを投与した。照射から４日後に小腸サンプルを得て、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、病理形態学的分析に供した。
【０１５９】
ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓ（ＴＬＲ５野生型）マウスでは、ＰＢＳ処置マウスにおける短い絨毛および正常な陰窩構造の消失と比較して、ＣＢＬＢ５０２の前処置によって腸の形態が保存された（長い絨毛、正常な陰窩）。その一方で、ＴＬＲ５欠損ＭＯＬＦ／Ｅｉマウスでは、ＣＢＬＢ５０２の投与によって１５Ｇｙのγ線照射後の腸の形態に対する影響は改善されず、ＣＢＬＢ５０２使用の有無にかかわらず短い絨毛および正常な陰窩構造の破壊が認められた。これは、ＴＬＲ５の存在が小腸におけるＣＢＬＢ５０２媒介性放射線防護に必要であり得ることを示す。
【０１６０】
（実施例２６ フラゲリン誘導体）
図３６に示すドメイン構造に基づいて、さらなるフラゲリン改変体を産生した。次いで、フラゲリン改変体を、上記で考察したいくつかの改変体と共に、ＮＦ−κＢ刺激活性について試験した（表３）。Ａ５４９細胞を、刺激しないままにするか、表示のＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）または１μｇ／ｍｌの精製フラゲリンもしくは種々の表示のフラゲリン誘導体で４５分間刺激し、全細胞抽出物を実施例７に記載のように調製した。ＥＭＳＡアッセイを行い、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ−タンパク質複合体を実施例７に記載のように検出した。
【０１６１】
表３
【０１６２】
【表３】
表３の結果は、アミノ末端領域（ａａ１〜１７６）およびカルボキシ末端領域（ａａ４０２〜５０５）内に含まれるドメインに結合した少なくとも１つの重合ドメイン（ａａ１〜５０またはａａ４５０〜５０５）を有するフラゲリン変異形がＮＦ−κＢを刺激することができ、それにより、放射線防護剤であると予想されることを示す。トランスで結合していないドメインはＮＦ−κＢを活性化できないので、認識ドメインの物理的結合は活性に必要であり得る。１つのポリペプチド中のドメインの結合の代替物として、ドメインを、２つの分子を連結するために使用される分子であるリンカーを使用して結合させることができる。リンカーは、両分子と共有結合または高親和性非共有結合を形成することができる。適切なリンカーは当業者に周知であり、直鎖または分枝鎖の炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定されない。リンカーを、その側鎖基を介して（例えば、システインへのジスルフィド結合を介して）成分アミノ酸に連結することができる。
【０１６３】
カルボキシル重合ドメイン（ａａ４５０〜５０５）が存在しない場合、活性にアミノ酸１６３と１７６との間の領域が必要であり得る。カルボキシル重合ドメインが存在する場合にこの領域は活性に重要でないので、この領域は誘導体の安定性に関与し得る。アミノ酸７０と１２９との間の領域は活性化に重要であり、誘導体の安定化に関与し得る。アミノ酸４０２と４５０との間の領域も活性に必要であり得る。上記で同定したドメインは、３つの巨大なα−ヘリックス内に存在し（アミノ酸５４〜１２９および４０２〜４５０内に存在する）、活性誘導体を産生するために、環様構造（重合ドメインを含むか含まない）を形成することが必要であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１は、ｐ５３欠損によってマウスのＧＩ症候群の発症が促進されることを示す。パネルＡ：ＰＦＴα（１０ｍｇ／ｋｇ）のＩ．Ｐ．注射によって、単回の９Ｇｙの線量のγ線および１２．５Ｇｙの分割された放射線の蓄積線量（５×２．５Ｇｙ）からＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス（他で示さない限り、ここおよび以下で６〜８週齢の雄を使用した）が防護される。ＰＦＴαは、単回の１２．５Ｇｙおよび２５Ｇｙ線量のＩＲで処置したマウスの生存に影響を与えない（各実験の結果を示す；４Ｇｙ／分の線量率でＳｈｅｐｈｅｒｄ ４０００Ｃｉセシウム１３７源を使用した）。パネルＢ：野生型およびｐ５３−ヌルＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスは、その相対感受性が低線量（１０Ｇｙ）と高線量（１５Ｇｙ）のγ線で異なる：野生型マウスは、ｐ５３−ヌルマウスと比較して１０Ｇｙに対してより感受性が高いが、１５Ｇｙに対してより耐性が高い。パネルＣ：１２時間後の１１Ｇｙの全身γ線照射で処置したマウスに、野生型またはｐ５３−ヌル同系Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウス由来の１．５×１０７個の骨髄細胞を注射した。（この線量により、非構成マウスコントロール群は１００％死亡した）。２ヶ月後、造血の完全な回収後、動物を、１５Ｇｙの全身γ線照射で処置し、その骨髄のｐ５３状態が異なる２群間の死亡率が異ならなかった。パネルＤ：１５Ｇｙのγ線照射後の表示の時点での野生型マウスおよびｐ５３−ヌルマウスの小腸に対する損傷の動力学の比較により、ｐ５３−ヌルマウスの損傷が加速される（ヘマトキシリン−エオシン染色パラフィン切片；１２５倍）。２４時間のパネルは、陰窩切片のＴＵＮＥＬ染色の画像を含む。巨大なアポトーシスが野生型では明らかであるが、ｐ５３欠損上皮では明らかでない。
【図２】図２は、野生型マウスおよびｐ５３−ヌルマウスの小腸における細胞増殖および生存の動力学を証明する。パネルＡ：ＩＲでの処置後の野生型マウスおよびｐ５３ヌルマウスの腸における増殖率の比較。（左）１５Ｇｙのγ線で処置しているか処置していない１４Ｃ−チミジン（１０μＣｉ／動物）を腹腔内注射した４週齢の野生型マウスおよびｐ５３ヌルマウスの全身切片（１．７倍）のオートラジオグラフ。矢印は腸を示す。（右）１５Ｇｙのγ線での処置後の異なる時点での野生型およびｐ５３−ヌルマウスの小腸中のＢｒｄＵ組み込みの比較。ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を、マウス屠殺の２時間前に注射し、その後に免疫染色を行った。９６時間のパネルの小部分は、高倍率（４００倍）を示す。パネルＢ：１５Ｇｙのγ線での処置後の異なる時点での野生型およびｐ５３−ヌルマウスの小腸中のＢｒｄＵ陽性細胞／陰窩数の比較。各時点で３匹の動物を分析し、各動物由来の５つの回腸の断面を調製し、顕微鏡で分析して陰窩および絨毛の数を評価した。陰窩中のＢｒｄＵ陽性細胞数を、２００倍での５つの無作為な視野（１００〜３０陰窩）で計数し、平均ＢｒｄＵ用生細胞数をプロットした。パネルＣ：１５Ｇｙのγ線照射後の異なる時点での野生型マウスおよびｐ５３−ヌルマウスの小腸中のＢｒｄＵ標識細胞の数および位置の軌跡。照射前にＢｒｄＵを３０分間注射し、マウスを表示の時点で屠殺した。ｐ５３−ヌルマウスにおいて標識細胞の陰窩から絨毛までの移動の加速およびその後の急速な消失が認められた。
【図３】図３は、組換えフラゲリンがＮＦ−κＢ活性化が可能であること証明する。
【図４】図４は、照射からマウスを防護するためのフラゲリンの能力を試験する各実験を示す。Ｃ５６ＢＬ６マウス（６週齢の雄、１０匹／群）に、２．０μｇ（０．１ｍｇ／ｋｇ）または５μｇ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）のフラゲリンを含むＰＢＳをｉ．ｖ．注射下。４時間後、マウスに、１５Ｇｙを照射し、マウスの生存率を毎日モニタリングした。
【図５】図５は、０．２５ｍｇ／ｋｇのフラゲリンのｉ．ｖ．注射を行ったか行っていない１５Ｇｙのγ線で処置したマウスの小腸上皮の組織学的切片（ＨＥ染色）を示す。コントロールマウスにおける陰窩および絨毛の完全な破壊は、フラゲリン処置マウス由来の組織の通常の形態と非常に対照的である。
【図６】図６は、１０Ｇｙの全身γ線照射に対するマウスの感受性に対するフラゲリンの効果を示す。
【図７】図７は、１３Ｇｙ（左）および１０Ｇｙ（右）の全身γ線照射に対するマウスの感受性に対する照射前の表示の時点でｉ．ｖ．注射したフラゲリンの効果を示す。
【図８】図８は、１０、１３、および１５Ｇｙの全身γ線照射に対するマウスの感受性に対するフラゲリンの効果を示す。
【図９】図９は、細菌フラゲリンのドメイン構造を示す。Ｆ４１のＣａ骨格の軌跡、疎水性コアの分布、および構造情報。ドメインＤ１、Ｄ２ａ、Ｄ２ｂ、およびＤ３を規定する４つの異なる疎水性コア。全疎水性側鎖の原子を、Ｃａ骨格と共に示す。側鎖原子を色分けしている：Ａｌａ、黄色；Ｌｅｕ、Ｌｌｅ、またはＶａｌ、橙色；ＰｈｅおよびＴｙｒ、紫色（炭素原子）および赤色（酸素原子）。ｃ、フラゲリンのアミノ酸配列中の種々の特徴的な構造の位置および領域。以下に示す（上から下）：Ｆ４１フラグメント（青色）、３つのｂ葉（ｂ−ｆｏｌｉｕｍ）折り畳み（褐色）；ａ−ヘリックスを有する二次構造の分布（黄色）、ｂ構造（緑色）、およびｂ−ターン（紫色）；５０番目の残基毎のチック（ｔｉｃ）マーク（青色）；ドメインＤ０、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３；プロト−エレメント（ｐｒｏｔｏ−ｅｌｅｍｅｎｔ）内の軸サブユニット接触領域（シアン）；十分に保存されたアミノ酸配列（赤色）および可変領域（紫色）；異なるスーパーコイルのエレメントを産生するＦ４１中の点変異。下の文字は、変異エレメントの形態を示す：Ｌ（Ｄ１０７Ｅ、Ｒ１２４Ａ、Ｒ１２４Ｓ、Ｇ４２６Ａ）、Ｌ型直線；Ｒ（Ａ４４９Ｖ）、Ｒ型直線；Ｃ（Ｄ３１３Ｙ、Ａ４１４Ｖ、Ａ４２７Ｖ、Ｎ４３３Ｄ）、ねじれた３３（ｃｕｒｌｙ３３）。
【図１０】図１０は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属フラゲリンドメイン、そのフラグメント、およびＴＬＲ５との相互作用を示す。暗色のバーは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ’、およびＢ’を含むフラグメントを構築するために使用したフラゲリン遺伝子の領域を示す。
【図１１】図１１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる断片化後の溶性フラゲリン（ＦｌｉＣ）および２つのフラグメント（ＡＡ’およびＢＢ’）を示し、分子量マーカーを左側に列挙した。
【図１２】図１２は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属フラゲリン（ＦｌｉＣ）およびフラゲリンフラグメントによるＮＦ−κＢ核転位置の誘導を示す。
【図１３】図１３は、Ｈ１１６細胞におけるフラゲリンおよびフラゲリンフラグメントによるＮＦ−κＢ調節ルシフェラーゼレポーター構築物の活性化を示す。タンパク質濃度を、μｇ／ｍｌで示す。
【図１４】図１４は、フラゲリンおよびフラゲリンフラグメントによって誘導されたＨＴ２９ヒト結腸癌細胞におけるＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合を示す。
【図１５】図１５は、全長フラゲリンおよびフラゲリンフラグメントによるＨＣＴ１１６レポーター細胞におけるＮＦ−κＢレポーターの活性化を示す。
【図１６】図１６は、フラゲリン（ＦｌｉＣ）およびフラグメントＡＡ’およびＢＢ’の放射線防護性の比較を示す。
【図１７】図１７は、ＡＡ’フラグメントが照射によって生じる変性から腸上皮を防護することを示す。Ａ：１４Ｇｙ照射から５日後のマウスの小腸上皮の組織学的切片（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）を示す。Ｂ：ＴＵＮＥＬアッセイによって決定したところ、ＡＡ’フラグメントでの処置により、照射から５時間後に持続している絨毛の内皮細胞中のアポトーシスが防止される（内皮マーカーＣＤ３１の免疫染色によって検出し、矢印で示す）。Ｃ：１４Ｇｙのγ線照射から５日後の皮膚の組織学的切片は、脂腺のＡＡ’フラグメントに対する防護効果を証明する（赤色の矢印）。
【図１８】図１８は、ＡＡ’フラグメントが１７Ｇｙおよび２０Ｇｙの全身γ線照射での超致死（ｓｕｐｒａｌｅｔｈａｌ）照射後のマウスの死亡を部分的に防護し、遅延することを示す。
【図１９】図１９は、フラゲリンおよびＡＡ’による２１日後および２８日後のマウスで誘導された抗フラゲリン抗体力価を示す。各マウスについて、２つの測定値の平均を示す。マウスに、Ｆ１：フラゲリンまたはＡＡ’を注射した。２１ｄおよび２８ｄｓ−マウスに２１日目に最初の投与を行い、２８日目に第２の投与をそれぞれ行う。ＰＢＳ：生理食塩水（血清なし）コントロール；ブランク：空のウェル読み取りコントロール。
【図２０】図２０は、フラゲリンおよびＡＡ’による２１日後および２８日後のマウスで誘導された抗フラゲリン力価を示す。各マウスについて、２つの測定値の平均を示す。マウスに、Ｆ１：フラゲリンまたはＡＡ’を注射した。２１ｄおよび２８ｄｓ−マウスに２１日目に最初の投与を行い、２８日目に第２の投与をそれぞれ行う。ＰＢＳ：生理食塩水（血清なし）コントロール；ブランク：空のウェル読み取りコントロール。
【図２１】図２１は、フラゲリンフラグメントＡＡ’が複数の連続的γ線照射からマウスが防護されることを示す。矢印は照射処置を示す（１〜４日目）。
【図２２】図２２は、照射処置に対する腫瘍感受性に対するＡＡ’の効果を示す。左のパネル：ＮＩＨ−ＳｗｉｓｓマウスにＮＩＨ３Ｔ３誘導性肉腫細胞をｓ．ｃ．注射した。腫瘍の直径が７〜１０ｍｍに到達した場合、ＡＡ’で前処置するかしないでマウスに３回の４．３Ｇｙの線量の全身照射を行った。照射処置後の腫瘍成長の動力学を示す。Ｕ／ｔ：未処置、ＡＡ’：照射しないでＡＡ’で処置、３×４Ｇｙ：照射のみ、３×４Ｇｙ＋ＡＡ’：ＡＡ’および照射。（曲線の形状は、このモデルに特徴的な遅い腫瘍成長を反映する）。最後の照射から７日後に測定した腫瘍体積に対して正規化した相対腫瘍体積として結果を示す。右のパネル：別の同系マウス腫瘍モデルを使用した同一の方法で試験を行った：Ｂ１６黒色腫（Ｃ５７ＢＬ６バックグラウンド）。腫瘍の直径が４〜５ｍｍに到達した場合に処置を適用し、この処置には、ＡＡ’で前処置（照射３０分前、５μｇ／マウス）するかしないその後の３回の４Ｇｙの線量の全身γ線照射が含まれた。
【図２３】図２３は、１３Ｇｙの全身γ線照射後のマウスにおけるＬＰＳおよびＡＡ’の放射線防護に対するＮＳ３９８の影響を示す。
【図２４】図２４は、２１種の細菌由来の保存アミノ酸末端（図２４Ａ）およびカルボキシ末端（図２４Ｂ）のアミノ酸配列の比較を示す。ＴＬＲ５活性に重要な１３の保存アミノ酸を、影をつけることによって示す。アミノ酸配列を、ＴｒＥＭＢＬ（最初の文字＝Ｑ）またはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（最初の文字＝Ｐ）由来のそのアクセッション番号によって識別する。
【図２５】図２５は、クエリー配列として配列番号１を使用したＢＬＡＳＴ検索の結果を示す。全検索で使用したパラメーターは以下であった：期待値カットオフ＝１０、行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２、存在のギャップペナルティ＝１１、および伸長＝１、フィルタリング＝なし。図２５Ａ：ＮＲ＿細菌（タンパク質−タンパク質）；図２５Ｂ：ＮＲ＿細菌（タンパク質−ＤＮＡ）；図２５Ｃ：細菌ゲノム（タンパク質−タンパク質）；図２５Ｄ：細菌ゲノム（タンパク質−ＤＮＡ）。
【図２６】図２６は、図２５と同一の検索パラメーターを使用してｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／からのＢＬＡＳＴの結果で示すように、配列番号１と比較して図２４に示すホモログのアミノ末端およびカルボキシ末端の同一率を示す。
【図２７】図２７は、ＡＡ’が１０Ｇｙの全身γＩＲ後の複数のマウス系統の救出（ｒｅｓｃｕｅ）を媒介することを証明する。
【図２８】図２８は、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射後のＡＡ’の薬物動態を証明する。
【図２９】図２９は、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射後のＡＡ’の薬物動態の拡大を証明する。
【図３０】図３０は、Ａ５４９細胞におけるγ線照射誘導性細胞死および成長阻害に対するＡＡ’の影響を証明する。
【図３１】図３１は、複数の細胞株におけるγ線照射誘導性細胞死および成長阻害に対するＡＡ’の影響を証明する。
【図３２】図３２は、ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの小腸陰窩におけるＢｒｄＵ組み込みに対する照射およびＡＡ’の影響を証明する。１５Ｇｙのγ線照射を行ったか行っていないコントロールおよびＡＡ’処置ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの小腸中のＢｒｄＵ組み込みの比較を示す。ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）をマウス屠殺の１．５時間前に注射し、以前に記載のように免疫染色を行った（Ｗａｔｓｏｎ ＡＪ ＆ Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ ＤＭ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００ Ｊａｎ；２７８（ｌ）：Ｇｌ−５）。画像の赤色チャネルを示す（陽性シグナルは暗色バックグラウンド上の明るい白色である）。
【図３３】図３３は、マウス小腸におけるＡＡ’媒介性成長停止およびＢｒｄＵ組み込みの減少の持続時間を示す。ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を、ＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）注射から１時間後または４時間後にＢａｌｂ／ｃマウスにｉ．ｐ．注射した。ＢｒｄＵ注射から１．５時間後に小腸サンプルを得た。以前に記載のように免疫染色を行った（Ｗａｔｓｏｎ ＡＪ ＆ Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ ＤＭ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００ Ｊａｎ；２７８（ｌ）：Ｇｌ−５）。倒立像を示す（陽性シグナルは明色バックグラウンド上の暗色である）。
【図３４】図３４は、ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの結腸陰窩へのＢｒｄＵ組み込みに対するＡＡ’の影響を証明する。ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を、ＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）注射から１時間後にＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスにｉ．ｐ．注射した。以前に記載のように免疫染色を行った（Ｗａｔｓｏｎ ＡＪ ＆ Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ ＤＭ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００ Ｊａｎ；２７８（ｌ）：Ｇｌ−５）。倒立像を示す（陽性シグナルは明色バックグラウンド上の暗色である）。下のパネルは、サンプルのより小さな倍率／大きな領域を示す。
【図３５】図３５は、ＡＡ’での処置後のＴＬＲ５欠損ＭＯＬＦ／ＥｉおよびＴＬＲ５ ｗｔＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの小腸の形態学を証明する。
【図３６】図３６は、フラゲリン誘導体を示す。選択されたフラゲリン誘導体のドメイン構造およびおおよその境界（アミノ酸座標）（右に列挙する）。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ・ｄｕｂｌｉｎのＦｌｉＣフラゲリンは、５０５アミノ酸（ａａ）内にコードされる。
【図３７】図３７は、ＮＦ−κＢ刺激活性について試験したさらなるフラゲリン誘導体の試験を示す。
【図３８−１】図３８は、以下のフラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号５３〜５４）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、斜体で示す（リーダーには、ＦｌｉＣのアミノ酸１であるＭｅｔが含まれる）。Ｎ末端定常ドメインに下線を引いている。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインに下線を引いている。存在する場合、ＧＳＴを強調している。
【図３８−２】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−３】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−４】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−５】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−６】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−７】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−８】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−９】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−１０】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−１１】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００４年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／６３９，８２６号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／６３９，８２６号は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アポトーシスの影響から哺乳動物を防護するためのフラゲリン関連ポリペプチドの使用に関する。より詳細には、本発明は、放射線および癌治療などのストレスへの曝露から哺乳動物を防護するためのフラゲリン関連ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
正常細胞から腫瘍細胞への進行は、負の成長調節機構の喪失（成長阻害刺激に対する耐性が含まれる）ならびに成長因子およびホルモンへの依存の欠如を伴う。放射線または細胞障害薬に基づく従来の癌治療は、正常細胞および悪生細胞の成長調節の相違に依存する。従来の癌治療は、細胞を重篤な遺伝動性ストレスに供する。これらの状態下で、大部分の正常細胞は成長が停止するようになり、それにより、生き残る一方で、腫瘍細胞は分裂し続け、死滅する。
【０００４】
しかし、従来の癌治療ストラテジーは、正常な急速に分割する組織またはアポトーシス性組織を危険にさらす性質がある。これらの正常な急速に分割する細胞への損傷により、癌治療の周知の副作用（感受性組織：造血、小腸、毛包）が生じる。このような組織の天然の感受性は、癌細胞が頻繁に自殺（アポトーシス）機構を欠損し、治療手順が正常な感受性組織を死滅させるが癌細胞に損傷を与えなくなることがあるという事実によって複雑になる。癌療法の副作用を最小にするという従来の試みは、（ａ）腫瘍細胞の治療に対する感受性をより高めること、（ｂ）腫瘍細胞に対する癌療法の特異性をより高めること、または（ｃ）治療後（例えば、エリスロポイエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＫＧＦ）の正常細胞の再生を促進することに基づく。
【０００５】
癌治療における化学療法および放射線療法に関連する副作用を緩和するための治療薬が依然として必要とされている。本発明は、これらのニーズを満たし、他の関連する利点を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
薬学的有効量のフラゲリンを含む組成物を患者に投与する工程を含む、アポトーシスを誘発する１つまたは複数の治療または状態から哺乳動物を防護する方法。フラゲリンは、配列番号１、または配列番号１のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、誘導体、またはその組み合わせを含み得る。フラゲリンは、ＴＬＲ−５媒介活性を誘導し得る。
【０００７】
フラゲリンは、配列番号１のアミノ酸１〜１７４および４１８〜５０５と少なくとも３０％同一であり得る。フラゲリンは、８９位、９０位、９１位、９５位、９８位、１０１位、１１５位、４２２位、４２３位、４２６位、４３１位、４３６位、および４５２位からなる群から選択される少なくとも１０個の保存アミノ酸を含み得る。フラゲリンは、配列番号１、８、１０、１２、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、および５２からなる群から選択される配列を含み得る。
【０００８】
フラゲリンを使用して、癌治療（化学療法または放射線療法であり得る）を受けている哺乳動物を治療することができる。フラゲリンを使用して、放射線を被爆した哺乳動物を治療することができる。フラゲリンを、放射線防護剤と組み合わせて投与することができる。フラゲリンを使用して、哺乳動物の創傷、中毒、細菌感染、ウイルス感染、および温度衝撃を治療することができる。フラゲリンを使用して、組織（胃腸管、肺、腎臓、肝臓、心血管系、血管内皮、中枢神経系、末梢神経系、造血前駆細胞、免疫系、および毛包が含まれる）のアポトーシスを防護することができる。フラゲリンを使用して、哺乳動物の敗血症を予防することもできる。
【０００９】
本発明は、薬学的に許容可能な量のＮＦ−κＢを誘導する薬剤を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、構成性に活性なＮＦ−κＢ癌を罹患した哺乳動物の治療方法に関する。薬剤は、フラゲリンであり得る。薬剤を、癌治療前、同時、または癌治療後に投与することができる。治療は、化学療法または放射線療法であり得る。
【００１０】
本発明はまた、哺乳動物に薬学的に許容可能な量のＮＦ−κＢを誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、癌治療に起因する正常組織に損傷を受けた哺乳動物の治療方法に関する。薬剤は、フラゲリンであり得る。薬剤を、癌治療前、同時、または癌治療後に投与することができる。治療は、化学療法または放射線療法であり得る。
【００１１】
本発明はまた、哺乳動物に薬学的に許容可能な量のＮＦ−κＢを誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、ストレスに起因する正常組織に損傷を受けた哺乳動物の治療方法に関する。薬剤は、フラゲリンであり得る。薬剤を、哺乳動物が罹患した疾患の治療前、同時、または治療後に投与することができる。
【００１２】
本発明はまた、哺乳動物に薬学的に許容可能な量のＮＦ−κＢを誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、哺乳動物の細胞老化の調整方法に関する。薬剤は、フラゲリンであり得る。薬剤を、哺乳動物が罹患した疾患の治療前、同時、または治療後に投与することができる。
【００１３】
本発明はまた、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤、化学療法薬、および任意選択的に薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、またはキャリアを含む薬学的組成物に関する。薬剤は、フラゲリンであり得る。
【００１４】
本発明はまた、疑われる誘導因子をＮＦ−κＢ活性化発現系に添加する工程と、コントロールをＮＦ−κＢ活性化発現系に別で添加する工程と、それによりＮＦ−κＢ活性化発現系レベルを増加させる能力によってＮＦ−κＢの誘導因子を同定することとを含む、ＮＦ−κＢの誘導因子のスクリーニング方法に関する。
【００１５】
本発明はまた、哺乳動物に薬学的有効量のＮＦ−κＢを誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、哺乳動物を放射線の影響から防護する方法に関する。薬剤は、フラゲリンであってよく、これは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属に由来し得る。組成物を、放射線防護剤と組み合わせて投与することができる。放射線防護剤は、抗酸化剤であってよく、これは、アミホスチン（ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ）またはビタミンＥであり得る。放射線防護剤はまた、サイトカインであってよく、これは、幹細胞刺激因子であり得る。
【００１６】
本発明は、患者に薬学的有効量のＮＦ−κＢを誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、アポトーシスを誘発する１つまたは複数の治療または状態から患者を防護する方法に関する。薬剤は、フラゲリンであってよく、これは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属に由来し得る。治療は癌治療であってよく、これは、化学療法または放射線療法であり得る。状態はストレスであってよく、これは、放射線、創傷、中毒、感染、および温度衝撃であり得る。
【００１７】
本発明はまた、疑われるモジュレーターを細胞ベースのアポトーシス系に添加する工程と、コントロールを細胞ベースのアポトーシス系に別で添加する工程と、それによりアポトーシス率を変化させる能力によってアポトーシスのモジュレーターを同定することと、疑われるモジュレーターが哺乳動物の寄生虫または共生生物に由来することとを含む、アポトーシスのモジュレーターのスクリーニング方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、疑われるモジュレーターをＮＦ−κＢ活性化発現系に添加する工程と、コントロールをＮＦ−κＢ活性化発現系に別で添加する工程と、それによりＮＦ−κＢ活性化発現率を変化させる能力によってＮＦ−κＢのモジュレーターを同定することと、前記疑われるモジュレーターが、哺乳動物の寄生虫に由来することとを含む、ＮＦ−κＢのモジュレーターのスクリーニング方法に関する。寄生虫は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、マイコプラズマ属、およびクラミジア属に由来し得るが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明はまた、本明細書中に記載の任意のスクリーニング方法によって同定されるモジュレーターに関する。本発明はまた、本明細書中に記載のモジュレーターを含む組成物に関する。組成物は、薬学的に許容可能な量の本明細書中に記載のモジュレーターを含む薬学的組成物であり得る。
【００２０】
本発明はまた、アポトーシスを増強するモジュレーターを含む薬学的組成物をこのような治療を必要とする被験体に投与する工程を含む、癌の治療方法に関する。
【００２１】
本発明はまた、患者にアポトーシスを阻害するモジュレーターを含む薬学的組成物を投与する工程を含む、アポトーシスを誘発する１つまたは複数の治療から患者を防護する方法を提供する。１つまたは複数の治療は、癌治療であり得る。癌治療は、化学療法または
放射線療法であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（詳細な説明）
本発明は、ストレス（化学療法、放射線療法、および照射が含まれるが、これらに限定されない）によって生じたアポトーシスからの正常な細胞および組織の防護に関する。細胞におけるアポトーシスの調節には以下の２つの主な機構が存在する：ｐ５３経路（アポトーシス促進性）およびＮＦ−κＢ経路（抗アポトーシス性）。両経路は、腫瘍で頻繁に無秩序化する：通常ｐ５３が喪失する一方で、ＮＦ−κＢが構成性に活性になる。したがって、正常細胞におけるｐ５３の阻害およびＮＦ−κＢの活性化により、癌治療などのストレスによって生じる死滅から正常細胞を防護することができるが、腫瘍細胞はこれらの調節機構が無秩序化されているので、腫瘍細胞により高い治療耐性を持たせられないであろう。これは、ｐ５３およびＮＦ−κＢがそれぞれ活性化および抑制の標的と考えられているｐ５３およびＮＦ−κＢにおける従来の見解に矛盾する。
【００２３】
本発明は、アポトーシスから正常細胞を防護するためのＮＦ−κＢ活性の誘導に関する。哺乳動物におけるＮＦ−κＢ活性の誘導により、正常細胞を、癌治療および高熱、有害線量の放射線被爆（例えば、原子力発電所、防衛産業または放射性医薬品生産の労働者、および軍人）、および細胞の老化で生じる細胞ストレスに帰するアポトーシスから防護することができる。ＮＦ−κＢが多数の腫瘍細胞で構成性に活性であるので、ＮＦ−κＢ活性の誘導により、腫瘍細胞に有利な効果を与えることなく正常な細胞をアポトーシスから防護することができる。一旦正常な細胞が修復されると、ＮＦ−κＢ活性を正常レベルに修復することができる。造血系（免疫系が含まれる）、腸上皮、および毛包などの照射および化学療法感受性組織を防護するためにＮＦ−κＢ活性を誘導することができる。
【００２４】
ＮＦ−κＢ活性の誘導因子を、いくつかの他の適用に使用することもできる。種々の重篤な状態（照射、創傷、中毒、感染、老化、および温度ショックが含まれるが、これらに限定されない）への哺乳動物の被爆によって生じる病的結果および死は、ストレス応答の正常な生理学的機構の活性（プログラム細胞死（アポトーシス）の誘導または生体活性タンパク質（サイトカイン）の放出など）に起因し得る。
【００２５】
アポトーシスは、通常、創傷細胞および遺伝子損傷細胞由来の組織を「浄化する」ように機能する一方で、サイトカインは、病原体に対する生物の防護系を動員するように機能を果たす。しかし、重篤な損傷の条件下では、両ストレス応答機構自体が自滅の原因として作用し得る。例えば、照射による死亡は、造血系、免疫系、および消化系で起こる大規模なｐ５３媒介性アポトーシスに起因し得る。ＮＦ−κＢの妥当な薬理学的調節により、重篤なストレス条件下での生存率が増加し得る。これらの要因の調節により、損傷器官由来の細胞の炎症応答および生死の決断の両方を調節することが可能である。ＮＦ−κＢ誘導因子の投与によってアポトーシスから防護することができる組織には、胃腸管、肺、腎臓、肝臓、心血管系、血管内皮、中枢神経系、末梢神経系、造血前駆細胞、免疫系、および毛包が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
ＮＦ−κＢの防護的役割は、以下をコードする複数の遺伝子の転写活性化によって媒介される：ａ）両方の主なアポトーシス経路を遮断する抗アポトーシスタンパク質、ｂ）ＨＰおよび他の幹細胞の増殖および生存を誘導するサイトカインおよび成長因子、およびｃ）強力なＲＯＳ除去抗酸化タンパク質（ＭｎＳＯＤ（ＳＯＤ−２）など）。したがって、放射線防護のためのＮＦ−κＢの一過性活性化により、Ｔｏｌｌ様受容体の活性化を介してＮＦ−κＢの活性化が到達する場合に達成することができる同時免疫刺激効果によって癌患者のアポトーシスの抑制だけでなく、二次癌の発生率を減少させる能力を達成することが可能である。
【００２７】
標的としてのＮＦ−κＢ経路の別の魅力的な特性は、候補放射線防護剤と見なすことができる多数の天然因子によるその活性化である。これらのうちでは、複数の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）である。ＰＡＭＰは、宿主生物で見出されない分子であり、巨大な病原体群を特徴とし、容易に変異することができない。これらは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）（自然免疫の重要なセンサーエレメント）によって認識される。ＴＬＲは、直接またはサイトカイン放出を介した免疫細胞の移動および活性化の誘導による免疫系の第１の警告機構として作用する。ＴＬＲは、ホモ二量体およびヘテロ二量体として作用することが公知のＩ型膜タンパク質である。リガンド結合の際、ＴＬＲは、ＭｙＤ８８タンパク質（ほとんどのＴＬＲの不可欠なシグナル伝達アダプター）を補充する。次に起こるシグナル伝達カスケードにより、（ｉ）ＮＦ−κＢ経路の活性化、および（ｉｉ）ＭＡＰＫ（ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）が含まれる）の活性化が含まれる効果が導かれる。Ｔｏｌｌ様受容体リガンドによるＮＦ−κＢ経路の活性化により、リガンドが潜在的な放射線防護剤として魅力的になる。サイトカインと異なり、多数のＰＡＭＰはＴＬＲの活性化以外はほとんど効果がないので、副作用を生じる可能性が低い。さらに、多数のＰＡＭＰは、ヒトに存在する。
【００２８】
その免疫細胞活性化機能と一致して、全てのＴＬＲは、脾臓および末梢血白血球で発現し、他のリンパ器官およびリンパ球の一部でより多数のＴＬＲ特異的発現パターンが存在する。しかし、ＴＬＲは、体内の他の組織および器官でも発現する（例えば、ＴＬＲ１は遍在的に発現し、ＴＬＲ５は胃腸管上皮および内皮でも見出される一方で、ＴＬＲ２、６、７、および８は、肺で発現することが公知である）。
【００２９】
１．定義
本明細書中で使用される専門用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を制限しないと理解すべきである。明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈上で明確に別の記載を行わない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形が含まれることに留意しなければならない。
【００３０】
本明細書中で使用される、用語「投与」は、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤の投薬量を説明するために使用される場合、薬物の単回用量または複数回用量を意味する。
【００３１】
本明細書中で使用される、用語「アナログ」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用される場合、従来のアミノ酸組由来の１つまたは複数の非標準アミノ酸または他の構造変形形態を意味する。
【００３２】
本明細書中で使用される、用語「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体クラス、またはそのフラグメントもしくは誘導体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、および単鎖抗体が含まれる）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、二機能性抗体、およびその誘導体を意味する。抗体は、所望のエピトープまたはこれに由来する配列に対して十分な結合特異性を示すモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはその混合物であり得る。抗体はまた、キメラ抗体であり得る。抗体を、当該分野で公知の１つまたは複数の化学的部分、ペプチド部分、またはポリペプチド部分の結合によって誘導体化することができる。抗体を、化学部分と抱合することができる。
【００３３】
本明細書中で使用される、用語「アポトーシス」は、細胞小器官の完全性が保護される細胞容積の進行性の収縮、光学顕微鏡または電子顕微鏡によって認められるクロマチンの凝縮（すなわち、核凝縮）、および／または遠心分離沈殿アッセイによって決定されるヌクレオソームサイズのフラグメントへのＤＮＡの切断を含む細胞死の形態をいう。食細胞によるインタクトな細胞フラグメント（「アポトーシス小体」）の貪食によって細胞膜の完全性が失われた（例えば、膜小胞形成）場合に細胞死が起こる。
【００３４】
本明細書中で使用される、用語「癌」は、異常な無制御の細胞分裂に起因する任意の悪性の成長または腫瘍を意味し、リンパ系または血流を介して身体の他の部分に拡大し得る。
【００３５】
本明細書中で使用される、用語「癌治療」は、当該分野で公知の任意の癌治療（化学療法および放射線療法が含まれるが、これらに限定されない）を意味する。
【００３６】
本明細書中で使用される、用語「〜との組み合わせ」は、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤の投与およびさらなる治療を説明するために使用する場合、薬剤を、さらなる治療前、同時、治療後、または規則正しく（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ）投与することができることを意味する。本明細書中で使用される、用語「〜共に」、「同時の」、または「同時に」は、本発明のさらなる治療および薬剤を、４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらにより好ましくは６時間以内、最も好ましくは３時間以内またはそれ未満で施すことを意味する。本明細書中で使用される、用語「規則正しく」は、さらなる治療と異なる時点且つ反復投与および／またはさらなる治療と比較して一定の頻度での薬剤の投与を意味する。
【００３７】
薬剤を、さらなる治療前の任意の時点（さらなる治療の約４８時間前、４６時間前、４４時間前、４２時間前、４０時間前、３８時間前、３６時間前、３４時間前、３２時間前、３０時間前、２８時間前、２６時間前、２４時間前、２２時間前、２０時間前、１８時間前、１６時間前、１４時間前、１２時間前、１０時間前、８時間前、６時間前、４時間前、３時間前、２時間前、または１時間前が含まれるが、これらに限定されない）で投与することができる。薬剤を、さらなる治療後の一定の時点（被爆から約１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、２４時間後、２６時間後、２８時間後、３０時間後、３２時間後、３４時間後、３６時間後、３８時間後、４０時間後、４２時間後、４４時間後、４６時間後、または４８時間後が含まれるが、これらに限定されない）で投与することができる。
【００３８】
本明細書中で使用される、用語「誘導体」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用される場合、一次構造以外が異なるペプチドまたはポリペプチド（アミノ酸およびアミノ酸アナログ）を意味する。例として、誘導体は、グリコシル化（翻訳後修飾の一形態）が異なり得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、異種系における発現に起因するグリコシル化パターンを示し得る。少なくとも１つの生物活性が保持される場合、これらのペプチドまたはポリペプチドは、本発明の誘導体である。他の誘導体には、共有結合的に修飾されたＮ末端またはＣ末端を有するペプチドまたは融合ポリペプチド、ＰＥＧ化ペプチドまたはポリペプチド、脂質部分に会合したペプチドまたはポリペプチド、アルキル化ペプチドまたはポリペプチド、アミノ酸側鎖の官能基を介して他のペプチドに結合したペプチドまたはポリペプチド、ポリペプチドまたはキメラ、および当該分野で理解されているさらなる修飾物が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書中で使用される、用語「フラグメント」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用される場合、基準ペプチドまたはポリペプチドの一部を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用される、用語「ホモログ」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用される場合、共通の進化上の祖先を有するペプチドまたはポリペプチドを意味する。
【００４１】
本明細書中で使用される、用語「処置する」または「処置」は、状態からの哺乳動物の防護をいう場合、状態の予防、抑制、防止、または消失を意味する。状態の予防は、状態の発症前に本発明の組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。状態の抑制は、状態の誘導後であるがその臨床的外観前に哺乳動物に本発明の組成物を投与する工程を含む。状態の防止は、状態が軽減または維持されるように状態の臨床的外観後に哺乳動物に本発明の組成物を投与する工程を含む。溶媒の消失は、哺乳動物がもはや状態を罹患しないように状態の臨床的外観後に哺乳動物に本発明の組成物を投与する工程を含む。
【００４２】
本明細書中で使用される、用語「腫瘍細胞」は、癌に関連する任意の細胞を意味する。
【００４３】
本明細書中で使用される、用語「改変体」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈で使用される場合、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味する。「生物活性」の代表例には、ＴＬＲ５に結合する能力および特異的抗体によって結合される能力が含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸の保存的置換（すなわち、アミノ酸の類似の性質（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）を有する異なるアミノ酸への置換）は、当該分野で典型的には小さな変化と認識されている。これらの小さな変化を、当該分野で理解されているように、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮することによって一部を同定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のヒドロパシー指標は、その疎水性および電荷の考慮に基づく。類似のヒドロパシー指標のアミノ酸を置換することができ、且つタンパク質機能を保持することができることが当該分野で公知である。１つの態様では、ヒドロパシー指標が±２のアミノ酸を置換する。アミノ酸の親水性を使用して置換することができ、これにより、生物機能が保持されたタンパク質が得られるであろう。ペプチドにおけるアミノ酸の親水性の考慮により、このペプチドの最も高い局所平均疎水性（抗原性および免疫原性と十分に相関すると報告されている有用な基準）を計算することが可能である（米国特許第４，５５４，１０１号（本明細書中で参考として援用される））。当該分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、生物活性（例えば、免疫原性）が保持されたペプチドを得ることができる。１つの態様では、互いに親水性値が±２以内のアミノ酸と置換することができる。アミノ酸の疎水性指標および親水性値は共に、そのアミノ酸の特定の側鎖に影響を受ける。その所見と一致して、生物機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の性質によって明らかとなるアミノ酸の相対的類似性、特に、そのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
【００４４】
２．治療方法
ａ．構成性に活性なＮＦ−κＢ腫瘍
本発明は、治療有効量のＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、構成性に活性なＮＦ−κＢ癌を罹患した哺乳動物を治療する方法に関する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を、癌治療（化学療法および放射線療法など）と組み合わせて投与することができる。
【００４５】
癌治療は、細胞傷害薬、細胞増殖抑制薬、またはその組み合わせの投与を含み得る。細胞傷害薬は、（１）細胞のＤＮＡ複製能力の妨害、および（２）癌細胞の細胞死および／またはアポトーシスの誘導によって癌細胞の増殖を予防する。細胞傷害薬は、細胞シグナル伝達過程の調整、妨害、または阻害を介して作用し、細胞増殖をしばしば低継続レベルで調節する。
【００４６】
細胞傷害薬として使用することができる化合物クラスには、以下が含まれるが、これらに限定されない：アルキル化薬（ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホン酸、ニトロソ尿素、およびトリアゼンが含まれるが、これらに限定されない）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレン−メラミン、トリエチレンチオホスホラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｎｅ）、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、およびテモゾロミド；代謝拮抗薬（葉酸アンタゴニスト、ピロリジンアナログ、プリンアナログ、およびアデノシンデアミナーゼインヒビターが含まれるが、これらに限定されない）：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビン；天然物およびその誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、酵素、リンホカイン、およびエピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｓ））：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ａｒａ−ｃ、パクリタキセル（パクリタキセルは、タキソール（登録商標）として市販されている）、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−ｃ、１−アスパラギナーゼ、インターフェロン（好ましくは、インターフェロン−α）、エトポシド、およびテニポシド。他の増殖性細胞傷害薬は、ナベルベン（ｎａｖｅｌｂｅｎｅ）、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）、レトラゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、カペシタビン、レオキサフィン（ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）、シクロホスファミド、イフォスファミド、およびドロロキサフィン（ｄｒｏｌｏｘａｆｉｎｅ）である。
【００４７】
微小管作用薬は細胞の有糸分裂を妨害し、その細胞傷害活性が当該分野で周知である。本発明で有用な微小管作用薬には、アロコルヒチン（ａｌｌｏｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）（ＮＳＣ ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ ７５７）、コルヒチン誘導体（例えば、ＮＳＣ ３３４１０）、ドラスタチン１０（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ １０）（ＮＳＣ ３７６１２８）、マイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）（ＮＳＣ １５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ ３３２５９８）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）、ＮＳＣ １２５９７３）、タキソール（登録商標）誘導体（例えば、誘導体（例えば、ＮＳＣ ６０８８３２）、チオコルヒチン（ｔｈｉｏｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）（ＮＳＣ ３６１７９２）、トリチルシステイン（ＮＳＣ ８３２６５）、硫酸ビンブラスチン（ＮＳＣ ４９８４２）、硫酸ビンクリスチン（ＮＳＣ ６７５７４）、天然および合成エポシロン（エポシロンＡ、エポシロンＢ、およびディスコデルモリド（Ｓｅｒｖｉｃｅ，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：２００９を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない）、エストラムスチン、ノコダゾール、およびＭＡＰ４などが含まれるが、これらに限定されない。このような薬剤の例は、Ｂｕｌｉｎｓｋｉ（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１０：３０５５ ３０６４；Ｐａｎｄａ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１０５６０−１０５６４；Ｍｕｈｌｒａｄｔ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：３３４４−３３４６；Ｎｉｃｏｌａｏｕ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：２６８−２７２；Ｖａｓｑｕｅｚ（１９９７）ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．８：９７３−９８５；およびＰａｎｄａ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１：２９８０７−２９８１２にも記載されている。
【００４８】
エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）などの細胞傷害薬；抗新生物酵素；トポイソメラーゼインヒビター；プロカルバジン；ミトキサントロン；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金配位複合体；生物学的応答調節物質；成長抑制物質；抗ホルモン治療薬；ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）；テガフール；および造血成長因子などの細胞傷害薬も適切である。
【００４９】
使用することができる細胞増殖抑制薬には、ホルモンおよびステロイド（合成アナログが含まれる）：１７α−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メゲストロラセテート（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌａｃｅｔａｔｅ）、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン（ｈｌｏｒｏｔｒｉａｎｉｓｅｎｅ）、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲストロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックス（ｚｏｌａｄｅｘ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
他の細胞増殖抑制薬は、マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビターなどの抗血管新生薬、抗ＶＥＧＦ抗体などの他のＶＥＧＦインヒビター、ＺＤ６４７４およびＳＵ６６６８などの小分子である。Ｇｅｎｅｔｅｃｈの抗Ｈｅｒ２抗体も使用することができる。適切なＥＧＦＲインヒビターは、ＥＫＢ−５６９（不可逆性インヒビター）である。ＥＧＦＲに免疫特異的なＩｍｃｌｏｎｅ抗体Ｃ２２５およびｓｒｃインヒビターも含まれる。
【００５１】
アンドロゲン依存性癌腫を非増殖性にするカソデックス（登録商標）（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ，Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）も細胞増殖抑制薬としての使用に適切である。細胞増殖抑制薬のさらに別の例は、エストロゲン依存性乳癌の増殖または成長を阻害する抗エストロゲンであるタモキシフェン（登録商標）である。細胞増殖シグナル伝達のインヒビターは、細胞増殖抑制薬である。代表例には、上皮細胞成長因子インヒビター、Ｈｅｒ−２インヒビター、ＭＥＫ−Ｉ キナーゼインヒビター、ＭＡＰＫキナーゼインヒビター、ＰＩ３インヒビター、Ｓｒｃキナーゼインヒビター、およびＰＤＧＦインヒビターが含まれる。
【００５２】
種々の癌を本発明にしたがって治療することができ、癌には、以下が含まれるが、これらに限定されない：膀胱（進行性および転移性膀胱癌が含まれる）、乳房、結腸（直腸結腸癌が含まれる）、腎臓、肝臓、肺（小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、卵巣、前立腺、精巣、尿生殖路、リンパ系、直腸、喉頭、膵臓（外分泌膵癌が含まれる）、食道、胃、胆嚢、頚部、甲状腺、皮膚（扁平上皮癌が含まれる）の癌腫；リンパ系の造血器腫瘍（白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非−ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、バーキットリンパ腫が含まれる）；骨髄細胞系列の造血器腫瘍（急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、および前骨髄球性白血病が含まれる）；中枢神経系および末梢神経系の腫瘍（星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、シュワン腫が含まれる）；間葉系起源の腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉縮、および骨肉腫が含まれる）；ならびに他の腫瘍（メラノーマ、色素性乾皮症（ｘｅｎｏｄｅｒｍａ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ）、ケラトアクタンソーマ（ｋｅｒａｔｏａｃｔａｎｔｈｏｍａ）、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、奇形癌腫、および胃腸管または腹骨盤腔の癌。
【００５３】
ｂ．癌治療由来の副作用の治療
本発明はまた、哺乳動物に治療有効量のＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、構成性に活性なＮＦ−κＢ癌の治療に起因する正常組織に対する損傷を被った哺乳動物の治療方法に関する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を、上記の癌治療と組み合わせて投与することができる。
【００５４】
ｃ．細胞老化の調節
本発明はまた、哺乳動物に治療有効量のＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を投与する工程を含む、哺乳動物の細胞老化を調整する方法に関する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を、他の治療と組み合わせて投与することができる。
【００５５】
ｄ．ストレスの治療
本発明はまた、哺乳動物に薬学的に治療有効量のＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を含む組成物を投与する工程を含む、ストレスに起因する正常組織に損傷を受けた哺乳動物の治療方法に関する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を、他の治療と組み合わせて投与することができる。ストレスは、任意の起源（照射、創傷、中毒、感染、および温度ショックが含まれるが、これらに限定されない）に起因し得る。
【００５６】
ｅ．照射
本発明はまた、放射線の被爆効果からの細胞の防護に関する。電離放射線由来の正常細胞の損傷および死滅は、被爆細胞の直接的な照射誘導性損傷と自殺による死滅またはアポトーシスを引き起こす照射誘導性ストレスに対する活性な遺伝的プログラム細胞反応との組み合わせである。アポトーシスは、いくつかの放射線感受性器官（すなわち、造血系および免疫系、消化管の上皮など）で生じる大規模な細胞喪失で重要な役割を果たし、その不全が器官の一般的な放射線感受性を決定づける。
【００５７】
電離放射線（ＩＲ）への被爆は短期間でも長期間でもよく、単回または複数回の線量として、全身または局所に適用することができる。したがって、原発事故または軍事攻撃は、単回の高線量の全身被爆（時折、その後の放射性同位体での長期中毒）を含み得る。造血器官を宿主血液前駆体から「浄化する」ことによってドナー骨髄のために造血器官を調製することが必要である場合の骨髄移植患者の前処置（適用線量を厳格に調節した）についても同様である。癌治療は、全身照射として適用する場合致死線量を非常に超える局所照射の複数回線量を含み得る。放射性同位体での中毒または治療は、標的化器官（例えば、１２５Ｉ吸入の場合の甲状腺）の照射によって長期間局所被爆させる。最後に、生物学的影響の重症度が有意に異なる電離放射線の物理的形態が多数存在する。
【００５８】
分子レベルおよび細胞レベルで、放射粒子（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ）は、ＤＮＡ、タンパク質、細胞膜、および他の高分子構造中の破損および架橋を精製することができる。電離放射線はまた、フリーラジカルおよび活性酸素種（ＲＯＳ）の生成によって細胞成分に対する二次的損傷を誘導する。複数の修復系（ＤＮＡの完全性および忠実性を修復するいくつかのＤＮＡ修復経路ならびにフリーラジカルおよびＲＯＳを除去して酸化タンパク質および脂質を還元する抗酸化化学物質および酵素など）によってこの損傷を無効にする。細胞チェックポイント系（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）は、ＤＮＡの欠損を検出し、損傷が修復されるか、細胞に成長停止またはプログラム細胞死（アポトーシス）を実行させる決定に到達するまで細胞周期の進行を遅延させる。
【００５９】
照射により、哺乳動物の器官が低線量での軽度の変異誘発および発癌効果から高線量によるほとんど即時の死滅までの範囲の損傷を受け得る。成分の全放射線感受性を、いくつかの感受性組織（造血系、生殖系、および細胞代謝回転率が高い異なる上皮が含まれる）で生じた病理学的変化によって決定する。
【００６０】
死亡を誘導するγ線照射の急性の病理学的結果は、線量によって異なり、特定の各線量に対する生物の感受性の閾値を規定する一定の器官の不全によって決定される。したがって、低線量での死亡は骨髄形成不全から生じる一方で、中程度の線量では胃腸管（ＧＩ）症候群の誘導によってより早く死亡する。非常に高い線量の照射により、神経変性の誘発によってほぼ即死し得る。
【００６１】
照射による一定の急性毒性期間を生存する生物は、長期遠隔性の結果（照射から数ヵ月後および数年後の被爆器官（例えば、腎臓、肝臓、または肺）における照射誘導性発癌および線維症が含まれる）を罹患し得る。
【００６２】
細胞ＤＮＡは、直接および間接的（フリーラジカルベースの）機構による種々のＤＮＡ損傷型（遺伝毒性ストレス）を生じるＩＲの主な標的である。全生物は、照射損傷ＤＮＡの有効な回復が可能なＤＮＡ修復系を維持するが、ＤＮＡ修復過程のエラーによって変異し得る。
【００６３】
腫瘍は、一般に、γ線照射により感受性が高く、正常組織に対する損傷が比較的低い低線量で複数回処置することができる。それにもかかわらず、いくつかの例では、正常組織の損傷は、癌治療のためのγ線照射の適用を制限する因子である。従来の三次元原体照射またはさらにより集束したＢｅａｍＣａｔｈ送達による癌療法におけるγ線照射の使用はまた、照射の蓄積作用および急速に新生される正常組織（骨髄および胃腸（ＧＩ）管など）の幹細胞の損傷の誘導に起因する毒性のために線量が制限される。
【００６４】
高線量では、照射誘導性死亡は、いわゆる造血器および胃腸管の放射線症候群に関連する。造血器症候群は、血液およびリンパ系の再生を不可能にする造血細胞およびその前駆細胞の喪失によって特徴づけられる。通常、感染（免疫抑制の結果）、出血、および／または貧血の結果として死亡する。ＧＩ症候群は、主に小腸の腸上皮の大規模な細胞死およびその後の腸壁の崩壊ならびに菌血症および敗血症由来の死滅に起因する。造血器症候群は、通常、低線量の照射で発症し、ＧＩ症候群よりも遅れて死滅する。
【００６５】
以前は、放射線防護剤は、典型的には、抗酸化剤（合成および天然の両方）であった。最近になって、サイトカインおよび成長因子が放射線防護剤のリストに加わっている。その放射線防護剤の機構は、感受性組織の再生効果の促進の結果であるとみなされている。両放射線防護剤群の間に明確な機能の差は存在しないが、いくつかのサイトカインは、細胞抗酸化タンパク質（マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）およびメタロチオネインなど）の発現を誘導する。
【００６６】
特定の薬剤の防護基準を、線量修飾係数（ＤＭＦまたはＤＲＦ）によって示す。ＤＭＦは、放射線防護剤処置被験体および未処置コントロール被験体への一定範囲の放射線量での照射およびその後の生存またはいくつかの他の評価項目の比較によって決定される。ＤＭＦは、一般に、３０日生存（ＬＤ５０／３０薬物処置からＬＤ５０／３０賦形剤処置を割る）を計算し、造血系の防護を定量する。胃腸系防護を評価するために、６日生存または７日生存についてＬＤ５０およびＤＭＦを計算する。他で示さない限り、本明細書中に提供したＤＭＦ値は３０日である。
【００６７】
以下に示すように、ＮＦ−κＢの誘導因子は、細胞レベルおよび生物全体として強い生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）活性を有する。超致死線量の照射に応答して、ＮＦ−κＢの誘導因子は、胃腸系および造血系症候群の両方を阻害するが、これが急性放射線被爆による死亡の主な原因である。これらの特性の結果として、ＮＦ−κＢの誘導因子を使用して、天然の照射事象および原発事故の影響を治療することができる。さらに、ＮＦ−κＢの誘導因子が現在公知の全ての放射線防護剤と異なる機構を介して作用するので、これらを、他の放射線防護剤と組み合わせて使用し、それにより、電離放射線からの防護規模を劇的に増大させることができる。
【００６８】
従来の放射線防護剤（例えば、フリーラジカルの捕捉剤）と対照的に、ＮＦ−κＢ活性の誘導因子は、一次照射媒介性損傷を軽減することができないが、二次事象（一次損傷に対する活性細胞反応を含む）に対して作用することができるので、既存の一連の防護を補足することができる。ピフィスリンα（ｐ５３の薬理学的インヒビター）（哺乳動物細胞における照射反応の重要なメディエーター）は、この新規の放射線防護剤クラスの例である。しかし、ｐ５３インヒビターの活性は、造血系の防護に限定され、消化管（胃腸管症候群）に防護効果を示さないので、これらの化合物の治療価値が減少する。広範な活性を示す抗アポトーシス性医薬品が非常に必要とされている。
【００６９】
ＮＦ−κＢの誘導因子を放射線防護剤として使用して、現在利用可能な手段（遮蔽および既存の生物防護剤（ｂｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）の適用）によって達成可能なレベルを超える放射線耐性に増加させることによって許容照射範囲を拡大し、例えば、発電所内の原発事故または宇宙飛行中の大規模態様粒子現象における生存機会を増大させることができる。１．５を超えるほぼＤＭＦ（３０日生存）では、ＮＦ−κＢ誘導因子であるフラゲリンは、任意の現在報告されている天然化合物よりも有効である。
【００７０】
ＮＦ−κＢの誘導因子はまた、例えば、中枢神経系および生殖器官における低線量照射に起因する代替不可能な細胞の喪失の治療に有用であり得る。ＮＦ−κＢの誘導因子を、癌化学療法時に使用して、化学療法に関連する副作用（脱毛症が含まれる）を治療することもできる。
【００７１】
１つの実施形態では、治療有効量のＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物を哺乳動物に投与して被爆した哺乳動物を治療する。ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物を、１つまたは複数の放射線防護剤と組み合わせて投与することができる。１つまたは複数の放射線防護剤は、被爆の影響を処置する任意の薬剤（抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤、およびサイトカイン）であり得る。
【００７２】
ＮＦ−κＢの誘導因子は、ＤＮＡおよび他の細胞構造の損傷に応答した照射誘導性プログラム細胞死を阻害することができるが、ＮＦ−κＢの誘導因子は、細胞レベルでの損傷に対応することができず、変異を防止することができない。フリーラジカルおよび活性酸素種（ＲＯＳ）は、変異および他の細胞内損傷の主な原因である。抗酸化剤およびフリーラジカル捕捉剤は、フリーラジカルによる損傷の防止で有効である。ＮＦ−κＢの誘導因子と抗酸化剤またはフリーラジカル捕捉剤との組み合わせにより、被爆による損傷の拡大を減少させ、生存率を高め、健康を改善することができる。本発明の実施で使用することができる抗酸化剤およびフリーラジカル捕捉剤には、チオール（システイン、システアミン、グルタチオン、およびビリルビンなど）；アミフォスチン（ＷＲ−２７２１）；ビタミンＡ；ビタミンＣ；ビタミンＥ；およびフラボノイド（インディアンホリーバジル（オシマム・サンクタム（Ｏｃｉｍｕｍ ｓａｎｃｔｕｍ））由来のオリエンチン（ｏｒｉｅｎｔｉｎ）およびビセニン（ｖｉｃｅｎｉｎ）など）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
ＮＦ−κＢの誘導因子を、放射線感受性幹細胞集団の補充および／または防護によって放射線防護性を付与する多数のサイトカインおよび成長因子と組み合わせて投与することもできる。幹細胞因子（ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド）、Ｆｌｔ−３リガンド、およびインターロイキン１フラグメントであるＩＬ−１ｂ−ｒｄの使用によって副作用を最小にした放射線防護を達成することができる。幹細胞（記載の全サイトカイン）の増殖の誘導およびそのアポトーシス（ＳＣＦ）の防止によって防護を達成することができる。処置により、照射前に白血球およびその前駆体を蓄積することが可能であり、それにより、照射後に免疫系をより迅速に再構成することが可能である。ＳＣＦは、１．３〜１．３５の範囲のＤＭＦの致死線量照射マウスを有効に救出し、且つ胃腸管症候群にも有効である。Ｆｌｔ−３リガンドもまた、マウス（ＬＤ１００／３０で７０〜８０％の３０日生存、ＤＭＦ＞１．２に相当）およびウサギで強い防護を示す。
【００７４】
さらに、以下などのサイトカインの組み合わせによって放射線防護を増強することができる：インターロイキン４（ＩＬ−４）および／またはインターロイキン１１（ＩＬ−１１）と組み合わせたＴＰＯ；ＩＬ−３と組み合わせたＧＭ−ＣＳＦ；Ｆｌｔ−３リガンドと組み合わせたＧ−ＣＳＦ；４Ｆ組み合わせ：ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＴＰＯ、およびＩＬ−３；ならびに５Ｆ組み合わせ：ＳＤＦ−１を加えた４Ｆ。
【００７５】
さらに、胃腸管放射線防護剤（形質転換成長因子β３（ＴＧＦｂ３）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、および記載のケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）が含まれる）を使用することができる。これらの放射線防護剤も腸を防護するが、これらは、フラゲリンまたはフラゲリン関連ポリペプチドと相乗効果を示す可能性が高い。なぜなら、下記の結果がフラゲリンおよびフラゲリン関連ポリペプチドが内皮を防護する一方で、これらの胃腸管放射線防護剤がＧＩ管の上皮を防護することを示すからである。
【００７６】
いくつかの因子（本来はサイトカインではないが）は、免疫細胞の増殖を刺激し、ＮＦ−κＢの誘導因子と組み合わせて使用することができる。例えば、５−ＡＥＤ（５−アンドロステンジオール）は、サイトカインの発現を刺激して細菌感染およびウイルス感染への耐性を増加させるステロイドである。照射２４時間前のマウスへの５−ＡＥＤの皮下注射により、生存がＤＭＦ＝１．２６に改善された。合成化合物（アンモニウムトリクロロ（ジオキソエチレン−Ｏ，Ｏ’−）テルレート（ＡＳ−１０１）など）を使用して、多数のサイトカインの分泌を誘導し、ＮＦ−κＢの誘導因子と組み合わせることもできる。さらなる放射線防護剤には、成長ホルモン（ＧＨ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、および間質由来因子１（ｓｔｒｏｍａｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１）（ＳＤＦ−１）が含まれる。
【００７７】
成長因子およびサイトカインを使用して、胃腸管症候群から防護することもできる。ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）は、腸粘膜の増殖および分化を促進し、腸陰窩中の照射後細胞生存を増加させる。造血サイトカインおよび放射線防護性ＳＣＦは、腸幹細胞の生存および関連する短期生物生存も増加させることができる。
【００７８】
ＮＦ−κＢの誘導因子は、胃腸（ＧＩ）症候群および造血器症候群からの防護を付与することができる。１５Ｇｙの全身致死線量照射を受けたマウスのほとんどがＧＩ症候群によって死亡するので、ＮＦ−κＢの誘導因子および１つまたは複数のＧＩ症候群のインヒビターを含む組成物はより有効であり得る。本発明の実施で使用することができるＧＩ症候群のインヒビターには、ＳＣＦおよびＫＧＦなどのサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物を、被爆前の任意の時点（被爆の約４８時間前、４６時間前、４４時間前、４２時間前、４０時間前、３８時間前、３６時間前、３４時間前、３２時間前、３０時間前、２８時間前、２６時間前、２４時間前、２２時間前、２０時間前、１８時間前、１６時間前、１４時間前、１２時間前、１０時間前、８時間前、６時間前、４時間前、３時間前、２時間前、または１時間前が含まれるが、これらに限定されない）で投与することができる。ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物を、被爆後の任意の時点（被爆から約１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、２４時間後、２６時間後、２８時間後、３０時間後、３２時間後、３４時間後、３６時間後、３８時間後、４０時間後、４２時間後、４４時間後、４６時間後、または４８時間後が含まれるが、これらに限定されない）で投与することができる。
【００８０】
ｆ．敗血症
本発明はまた、治療有効量のＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の敗血症の予防方法に関する。ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤を、他の治療と組み合わせて投与することができる。
【００８１】
ウイルス感染または細菌感染は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドを介した自然免疫系を刺激し得る。マクロファージを、その表面上のＴＬＲ５の存在によるフラゲリンおよびフラゲリン関連ポリペプチドによって防護および／または刺激することができる。例えば、炭疽菌感染症の発症における重要段階は、炭疽菌内でのマクロファージの死滅である。フラゲリンおよびフラゲリン関連ポリペプチドを使用した種々のストレスからの腸内皮の防護により、ＧＩ細胞死を予防し、病原菌のＧＩ壁の透過を予防することもでき、それにより、エボラなどの感染によって生じるＧＩ出血を予防することができる。他の出血性ウイルス感染症を、内皮および胃腸管上皮の救出によって予防することもできる。
【００８２】
３．薬剤
本発明はまた、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤に関する。薬剤は、人工的に合成された化合物または天然に存在する化合物であり得る。薬剤は、低分子量の化合物、ポリペプチド、ペプチド、そのフラグメント、アナログ、ホモログ、改変体、または誘導体であり得る。
【００８３】
薬剤はまた、ＮＦ−κＢ誘導サイトカイン（ＩＬ１２、ＩＬ６、ＴＮＦ、およびＴＧＦβが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。薬剤はまた、プロスタグランジンであり得る。薬剤はまた、成長因子（ＫＧＦおよびＰＤＧＦが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。薬剤はまた、ＮＦ−κＢ活性を誘導する抗体であり得る。
【００８４】
ａ．フラゲリン
１つの実施形態では、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤はフラゲリンである。以下の実施例に示すように、フラゲリンおよびフラゲリン関連ポリペプチドは、細胞レベルおよび生物全体として強い生存促進活性を有する。興味深いことに、フラゲリンはまた、抗腫瘍免疫の主成分であるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴリンパ球を刺激する（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ Ｈ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｏｃｔ；７８（４）：８８８−９７；Ｃａｒｏｎ Ｇ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ａｕｇ ｌ；１７５（３）：１５５１−７；Ｈｏｎｋｏ ＡＮ ＆ Ｍｉｚｅｌ ＳＢ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２００５；３３（ｌ）：８３−１０１）。結果として、フラゲリンを、癌治療で放射線防護剤として使用することができる。
【００８５】
本発明はまた、フラゲリン関連ポリペプチド（本明細書中に記載のポリペプチドなど）に関する。本明細書中で使用される、用語「フラゲリン」は、任意の供給源（グラム陽性細菌種およびグラム陰性細菌種が含まれる）由来のフラゲリンまたはフラゲリン関連ポリペプチドを意味することを意図する。２３種の細菌由来のフラゲリンのアミノ酸配列は、米国特許出願番号２００３／００４４４２９号（その内容が本明細書中で参考として援用される）の図７に示されている。米国特許出願番号２００３／００４４４２９号の図７に列挙したフラゲリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、供給源（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベースが含まれる）から公的に利用可能である。
【００８６】
フラゲリンは、細菌鞭毛の主成分である。フラゲリンは、３つのドメインから構成される（図９）。ドメイン１（Ｄ１）およびドメイン（Ｄ２）は、不連続であり、アミノ末端およびカルボキシ末端中の残基がヘアピン構造の形成によって並列した場合に形成される。Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインを含むアミノ末端およびカルボキシ末端が最も保存されるのに対して、中間の超可変ドメイン（Ｄ３）は、可変性が非常に高い。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉヒンジによって分離されたアミノＤ１およびＤ２ならびにカルボキシＤ１およびＤ２を含む組換えタンパク質（ＮＤ１−２／ＥＣＨ／ＣＤ２）を使用した研究は、ＥＣＨエレメントと結合した場合にＤ１およびＤ２が生物活性を示すことを示す。このキメラ（ヒンジのみではない）は、２つの腸上皮細胞株においてＩκＢαの分解、ＮＦ−κＢ活性化、ならびにＮＯおよびＩＬ−８の産生を誘導した。非保存Ｄ３ドメインは、鞭毛フィラメントの表面上に存在し、主な抗原エピトープを含む。フラゲリンの強力な炎症促進活性は、高度に保存されたＮおよびＣのＤ１およびＤ２領域に存在し得る。
【００８７】
フラゲリンは、Ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）への結合によってＮＦ−κＢ活性を誘導する。ＴＬＲファミリーは、少なくとも１０メンバーから構成され、病原体に対する自然免疫防護で不可欠である。自然免疫系は、細菌病原体上で保存された病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識する。ＴＬＲは、細菌フラゲリンに特別な保存構造を認識し得る。保存構造は、アミノ酸含有量の変動がいくらか許容される巨大な残基群から構成され得る。Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１２４７−５３（２００３）は、ＴＬＲ５によって認識される保存構造の一部であるフラゲリン中の１３個の保存アミノ酸を同定した。ＴＬＲ５活性に重要なフラゲリンの１３個の保存アミノ酸を、図２４に示す。
【００８８】
好ましい実施形態では、フラゲリンは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属に由来し、その代表例は、Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８４９７２によってコードされる）（配列番号１）である。別の好ましい実施形態では、フラゲリン関連ポリペプチドは、ＴＬＲ５に結合してＴＬＲ５媒介活性（ＮＦ−κＢ活性の活性化など）を誘導する配列番号１のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、誘導体、またはその組み合わせである。フラゲリンのフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、または誘導体を、フラゲリンのドメイン構造およびＴＬＲ５によって認識される保存構造に基づいた理論ベースのデザインによって得ることができる。
【００８９】
より好ましい実施形態では、配列番号１のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、誘導体、またはその組み合わせは、図２４に示す少なくとも１０、１１、１２、または１３個の保存アミノ酸（８９位、９０位、９１位、９５位、９８位、１０１位、１１５位、４２２位、４２３位、４２６位、４３１位、４３６位、および４５２位）を含む。別のより好ましい実施形態では、配列番号１のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、誘導体、またはその組み合わせのアミノ末端およびカルボキシ末端は、配列番号１のアミノ酸１〜１７４および４１８〜５０５と少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である。図２６は、配列番号１と比較した既知のＴＬＲ−５刺激活性を有するフラゲリンのアミノ末端およびカルボキシ末端の同一率を列挙する。
【００９０】
フラゲリンホモログは、任意のグラム陽性細菌種およびグラム陰性細菌種由来のフラゲリンポリペプチド（米国特許出願番号２００３／００００４４４２９号（その内容が本明細書中で参考として援用される）に開示のフラゲリンポリペプチドおよび図２５に示すＢＬＡＳＴの結果に列挙したアクセッション番号に対応するフラゲリンペプチドが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。フラゲリンホモログのフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、および誘導体も意図される。
【００９１】
フラゲリンフラグメントは、ＴＬＲ５活性を刺激するフラゲリンポリペプチドの一部であり得る。少なくともいくらかのＴＬＲ５刺激活性を保持する多数のフラゲリンの欠失変異体が作製されている。本明細書中の実施例に開示の欠失変異体に加えて、代表的な欠失変異体には、アミノ酸１８５〜３０６または４４４〜４９２を欠くＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ１３６８９の翻訳物およびアミノ酸１７９〜４１５を欠くＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ８４９７３の翻訳物が含まれる。フラゲリンフラグメントのホモログ、改変体、アナログ、および誘導体も意図される。
【００９２】
フラゲリン改変体には、トランスポゾンが挿入され、可変Ｄ３ドメインに変化したフラゲリンポリペプチドが含まれる。改変体がＴＬＲ５活性を刺激するようにＤ３ドメインの一部または全部をＤ１およびＤ２ドメインを適切に折り畳むことが可能なヒンジまたはリンカーポリペプチドに置換することができる。変異ヒンジエレメントの代表例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＭｕｋＢタンパク質ならびに配列番号３および４に見出すことができる。フラゲリン改変体のフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体も意図される。
【００９３】
４．組成物
本発明はまた、治療有効量のＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物に関する。組成物は、当該分野で周知の方法を使用して生成することができる薬学的組成物であり得る。上記のように、ＮＦ−κＢの誘導因子を含む組成物を、アポトーシスに関連する状態（被爆、癌治療の副作用、ストレス、および細胞老化が含まれるが、これらに限定されない）の治療のために哺乳動物に投与することができる。組成物はまた、さらなる薬剤（放射線防護剤または化学療法薬が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。
【００９４】
ａ．投与
本発明の組成物を、任意の様式で（経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入、口腔投与、胸腔内、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）投与することができる。非経口投与には、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鞘内、および関節内が含まれるが、これらに限定されない。経粘膜投与には、鼻腔内投与が含まれるが、これらに限定されない。動物のために、組成物を、通常の獣医学診療に関する適切に許容可能な処方物として投与することができる。獣医は、特定の動物に最も適切な投与計画および投与経路を容易に決定することができる。
【００９５】
組成物を、アポトーシスを誘発するストレスまたはその組み合わせの前、後、または同時に投与することができる。組成物を、アポトーシスを誘発するストレスへの曝露の約１
〜約４８時間前または後に投与することができる。
【００９６】
ｂ．処方物
本発明の組成物は、従来の様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態であり得る。例えば、経口投与のための錠剤およびカプセルは、従来の賦形剤（結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、および湿潤剤が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。結合剤には、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプンの粘液、およびポリビニルピロリドンが含まれるが、これらに限定されない。充填剤には、ラクトース、糖、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、およびソルビトールが含まれるが、これらに限定されない。潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、およびシリカが含まれるが、これらに限定されない。崩壊剤には、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。湿潤剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。錠剤を、当該分野で周知の方法によってコーティングすることができる。
【００９７】
本発明の組成物はまた、液体処方物（水性または油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、およびエリキシルが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。組成物を、使用前に水または他の適切な賦形剤を使用して構成するための乾燥生成物として処方することもできる。このような液体調製物は、添加剤（懸濁剤、乳化剤、非水性賦形剤、および防腐剤が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。懸濁剤には、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および食用硬化脂肪が含まれるが、これらに限定されない。乳化剤には、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、およびアカシアが含まれるが、これらに限定されない。非水性賦形剤には、食用油、アーモンド油、分留ヤシ油、油性エステル、プロピレングリコール、およびエチルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。防腐剤には、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、およびソルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明の組成物を座剤として処方することもでき、この組成物は、座剤基剤（カカオバターまたはグリセリドが含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。本発明の組成物を吸入のために処方することもでき、この組成物は、乾燥粉末として投与することができるか、ジクロロジフルオロメタンまたはトリクロロフルオロメタンなどの噴射剤を使用したエアゾールの形態であり得る溶液、懸濁液、または乳濁液の形態（これらに限定されない）であり得る。本発明の組成物を、水性または非水性賦形剤（クリーム、軟膏、ローション、ペースト、薬用プラスター、パッチ、または膜が含まれるが、これらに限定されない）を含む経皮処方物として処方することができる。
【００９９】
本発明の組成物を、非経口投与（注射または持続注入が含まれるが、これらに限定されない）のために処方することもできる。注射用処方物は、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性賦形剤の乳濁液の形態であってよく、処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）（懸濁剤、安定剤、および分散剤が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。組成物を、適切な賦形剤（滅菌無発熱物質水が含まれるが、これらに限定されない）で再構成するための粉末形態で提供することもできる。
【０１００】
本発明の組成物を、移植または筋肉内注射によって投与することができるデポー調製物として処方することもできる。組成物を、適切な高分子または疎水性材料（例えば、許容可能なオイルの乳濁液として）、イオン交換樹脂、またはやや溶けにくい誘導体（例えば、やや溶けにくい塩として）を使用して処方することができる。
【０１０１】
ｃ．投薬量
治療に必要な薬剤の治療有効量は、治療条件、ＮＦ−κＢ活性の誘導に望ましい期間、ならびに患者の年齢および状態によって変化し、最終的に、担当医によって決定される。しかし、一般に、成人のヒトに使用される用量は、典型的には、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。用量は、約１μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ／日であり得る。望ましい用量を、単回用量で都合よく投与するか、適切な間隔で（例えば、１日に２回、３回、４回、またはそれ以上の分割用量）複数回用量として投与することができる。一旦薬剤を投与しなくなると正常細胞におけるＮＦ−κＢ活性が減少し得るので、しばしば、複数の用量が望ましいか必要である。
【０１０２】
ＮＦ−κＢの誘導因子の投薬量は、任意の投薬量（１μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１７５μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４２５μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、４７５μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５２５μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、５７５μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６２５μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、６７５μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７２５μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、７７５μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８２５μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、８７５μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９２５μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、９７５μｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。
【０１０３】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示される複数の態様を有する。
【実施例】
【０１０４】
（実施例１ マウスにおけるＧＩ症候群のｐ５３欠損促進性の発症）
哺乳動物の電離放射線（ＩＲ）に起因する主な死亡原因は、放射線量に依存する。９〜１０Ｇｙまでの線量で、マウスは、主に致死性骨髄減少造血器（ＨＰ）症候群（ｌｅｔｈａｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ（ＨＰ） ｓｙｎｄｒｏｍｅ）のために１２〜２０日後に死亡する。この線量では、照射マウスを、骨髄移植によって死亡から救出することができる。１５Ｇｙ超を被爆した動物は、処置から７〜１２日後に（造血器症候群によって死亡し得る前に）、小腸−胃腸（ＧＩ）症候群に対する損傷による合併症によって死亡する。ＨＰおよびＧＩ症候群の両方では、組織の致死的損傷は、大規模なｐ５３依存性アポトーシスから開始される。この所見により、ｐ５３が照射誘導死の決定要因であり得るとより早く示唆することが可能である。常に、ｐ５３欠損マウスは、ＨＰ症候群によって死亡する放射線量に耐性を示し、６〜１１Ｇｙのγ線照射を受けた野生型動物の死亡を、小分子ｐ５３インヒビターであるピフィスリン（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ）−α（ＰＦＴ）によるｐ５３の一過性の薬理学的阻害によって減少させることができる（Ｋｏｍａｒｏｖ ｅｔ ａｌ １９９９）。遺伝毒性ストレスに対して組織を感作する因子としてのｐ５３の同定を、実験的化学療法または照射の結果として生じる抜け毛（脱毛症）のｐ５３依存性の証明によってさらに強化した。したがって、前の所見に基づいて、ｐ５３がより高い線量のＩＲ後の致死的ＧＩ症候群の発症に重要な役割を果たし続けると予想されるであろう。驚いたことに、ｐ５３欠損は、より高い線量のＩＲに対してマウスを感作し、致死的胃腸症候群を発症する（図１）。ＩＲ後のｐ５３欠損上皮の陰窩における連続的細胞増殖は、損傷陰窩細胞死の加速および絨毛の急速な破壊と相関する。ｐ５３は、小腸陰窩における成長停止を誘導し、それによって腸の完全性を保存することによって延命する（図２）。したがって、ｐ５３のアポトーシス促進機能が造血器症候群を促進する一方で、その成長停止機能が胃腸症候群の発症を遅延させる。
【０１０５】
小腸における細胞集団の動力学を、非常に詳細に分析した。腸上皮中の細胞増殖は、幹細胞および初期増殖前駆細胞が存在する陰窩に限定される。２回の細胞分裂後、既に分化した陰窩幹細胞の子孫は、絨毛に移動し、絨毛先端から吹き出す。マウスの小腸では、細胞の全「航海（ｔｒｉｐ）」（増殖性区画から絨毛先端への）は、通常、３〜５日を要する。γ線照射に対する小腸の反応が病理形態学的レベルで十分に試験されているにもかかわらず、ＧＩ死亡の正確な原因（一次事象が含まれる）が何であるかは不明確なままである。上皮陰窩細胞損傷およびその後の絨毛の露出を直接的結果とし、流動物と電解質との不均衡、菌血症、および内毒素血症を発症して死亡し得る。炎症および間質応答に加えて、内皮機能不全は死亡に寄与する重要な要因のようである。まとめると、ＩＲ誘導性ＨＰ症候群からの防護方法として非常に有効であることが示されたｐ５３の薬理学的抑制は、ＧＩ症候群に（有害ではないが）役立たない。したがって、別の機構（例えば、ＮＦ−κＢの活性化およびその後の細胞死の阻害など）に依存する小腸上皮の放射線防護に対する別のアプローチを開発する必要がある。
【０１０６】
（実施例２ フラゲリンはＩＲ誘導性ＧＩ症候群に起因するマウスの死亡を遅延する）
ＧＩ管損傷を誘導した従来の照射モデルの場合、１５Ｇｙのγ線照射を使用したマウスの全身照射により、ＧＩ症候群のために８日以内に死亡した。フラゲリンがＩＲからＧＩ上皮を防護することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、１５Ｇｙの照射後のマウスの致死性の動力学に対するｉ．ｖ．注射したフラゲリンの効果を試験した。本発明者らは、一定範囲のフラゲリン用量を使用し、その全ては文献から公知の最も高い許容用量（３００μｇ／マウス）よりも有意に低かった。処置から４時間後に照射した。代表例の結果を、図４に示す。予想通り、コントロール照射マウス（ＰＢＳをｉ．ｖ．投与した）は、処置から５日後と８日後との間に死亡した。フラゲリンを投与した動物は、有意により長く生存し、動物生存の延長はフラゲリンの用量と相関した。照射７日後の小腸の病理形態学的分析により、フラゲリン処置群とコントロール群との間の劇的な相違が明らかとなった（図５）。０．２ｍｇ／ｋｇのフラゲリンの静脈内、腹腔内、および皮下送達ならびにその後の１３Ｇｙの照射によって同程度に防護され、８５〜９０％のマウスが３０日間生存した（データ示さず）。理論に拘束されないが、フラゲリンは、ＮＦ−κＢの活性化による放射線防護剤であり得、恐らくアポトーシス死のインヒビターとして作用する。
【０１０７】
（実施例３ 致死性ＩＲ誘導性造血器症候群からのマウスのフラゲリン救出）
本発明者らは、次に、フラゲリンが、致死性ＧＩ毒性を生じることができないより低い放射線量（通常、１１Ｇｙまで）によって実験的に誘導されたＨＰ症候群由来のマウスのＩＲ誘導死に効果があるかどうかを試験した。上記実験と同様に実験を行ったが（図１４および１５）、１５Ｇｙの代わりに、マウスに１０Ｇｙ（１３日目までにコントロール群が１００％死亡する線量）を照射した（図６）。フラゲリン処置群（５μｇ／マウス）は、この線量のＩＲから完全に防護され、驚いたことに、フラゲリン媒介性放射線防護はＧＩだけでなくＨＰ ＩＲ誘導性症候群に対しても作用することを示す。
【０１０８】
（ 実施例４ フラゲリンの防護効果への時間の依存）
マウスに、次に、１３Ｇｙのγ線照射前の異なる時間にフラゲリンを投与した。このような実験の１つの結果を、図７に示す。得られた結果は、処置の１〜４時間前に注射した場合、フラゲリンが１３Ｇｙからの放射線防護剤として有効であることを示す。
【０１０９】
処置時間に対するフラゲリンの放射線防護活性の依存をさらに評価するために、γ線照射時に対していくつかの時点でマウスに注射した。５μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）の全長フラゲリン、またはコントロールマウスには５μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）の細菌ＲＮＡポリメラーゼの腹腔内注射を使用して、本質的に上記説明のように実験を行った。ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウス系統を使用して実験を行った。結果は、処置の１〜２時間前にフラゲリンを注射した場合、１３Ｇｙの照射後にフラゲリンによって約９０％が生存することを示す（図７）。明確にするために−１時間のグラフのみを示すが、両時点（−１時間および−２時間）は、類似の程度および動力学の生存を示す。４時間で、いくらかより低い防護を示す。照射の２４時間前に注射したフラゲリンは、１３Ｇｙで誘導される死に防護効果を示さなかった。
【０１１０】
興味深いことに、１０Ｇｙのγ線照射の２４時間前のフラゲリンの投与は１００％の防護を示した。マウスへの１３Ｇｙの照射によって主にＧＩ症候群に起因する死亡を誘導する一方で、１０Ｇｙで誘導される死は、ほとんど造血器症候群によって媒介される。したがって、このような１０Ｇｙ照射からの長期防護を、フラゲリンおよび／または長寿命二次サイトカインによって誘導される造血幹細胞の増殖または生存の増強によって媒介し得る。
【０１１１】
（実施例５ フラゲリンのＬＤ５０／３０、ＬＤ５０／７、およびＤＭＦの決定）
本発明者らは、次に、フラゲリンの放射線量依存性防護を評価した。上に示すように（図７）、フラゲリンでの処置は、１０Ｇｙのγ線照射に対する１００％防護に十分であり（この線量によって造血器症候群で死亡する）、１３Ｇｙで９０％が３０日間生存した（造血器症候群およびＧＩ症候群の両方）。照射の１時間前に腹腔内注射したフラゲリン５μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）を使用して、上記のように実験を行った。
【０１１２】
しかし、１５Ｇｙでは、１００％が７日間生存し、１３日後に死亡が遅延する一方で（３０日生存は０％）、コントロール群は７日目までにＧＩ症候群によって完全に死亡した（図８）。１５Ｇｙ照射後のフラゲリン処置群死亡率の動態は、１０Ｇｙのコントロール群に類似しており、造血器症候群に起因する死亡が示唆される。この結果により、フラゲリンのＬＤ５０／３０が１３．５〜１４Ｇｙであり、ＤＭＦ３０が約１．７５〜１．８であると評価される。この程度の放射線防護は、天然化合物についての任意の報告よりも有意に高かった。
【０１１３】
（実施例６ フラゲリンフラグメントの合理的デザインおよびクローニング）
ＦｌｉＣ遺伝子によってコードされるＳａｌｍｏｎｅｌｌａフラゲリン（配列番号２）は、生存促進ＮＦ−κＢ経路の強いアクチベーターである。これは、その放射線防護作用の最も可能性が高い機構である。以前の研究では、細胞表面上のＴｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）へのフラゲリンの結合がＮＦ−κＢの活性化に必要な工程であることが示されている。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａフラゲリンのドメイン構造は、文献に十分に詳細に記載されている（図９）。さらに、フラゲリン−ＴＬＲ５複合体の以前の構造研究（図１０）により、結合（すなわち、ＮＦ−κＢ活性化）に不可欠であるか重要でないドメインを区別することができる。タンパク質最小化により、フラゲリン関連ポリペプチドの反復投与後の免疫応答を減少させることができる。低分子量のタンパク質および少数の利用可能な免疫原性エピトープによる免疫原性の低下に一部起因して、これを達成することができる。
【０１１４】
ＴＬＲ５結合に必要なドメインを、進化的に保存された細菌フラゲリンのＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメイン中に排他的に配置することができる。超可変ドメイン（アミノ酸１７８〜４０２）は、ＴＬＲ５と密接に接触しなくなる。前に証明したように、このドメインの可動性リンカーペプチドへの置換は、ＴＬＲ５への結合を破壊しなかった。さらに、Ｎ末端およびＣ末端のコイルドコイル重合ドメイン（アミノ酸１〜５５、４５６〜５０５）は、ＴＬＲ５に結合せず、重要でない可能性が高い（それぞれ本明細書中に示す、修飾Ｎ末端およびＣ末端ＢおよびＢ’参照）。また、実質的にＴＬＲ５に結合する主なＮ末端のαヘリックス以外の全ドメインを欠く別のフラグメント末端（アミノ酸５６〜１００）は、結合に十分であり得る。
【０１１５】
したがって、ｐＧＥＸ−ＫＧクローニングベクター（配列番号５および６）から採取した可動性リンカー（配列番号３および４）と連結した３つのＮ末端型（Ａ、Ｂ、Ｃ）および２つのＣ末端型（Ａ’、Ｂ’）を発現構築物に組み合わせて、いくつかの可能なフラゲリンフラグメントを産生した（表１）。さらに、個別のＮ末端（Ａ、Ｂ、Ｃ）およびＣ末端のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合物（ＧＳＴ−Ａ’、ＧＳＴ−Ｂ’）を示す構築物を調製した。全構築物を、ｐＲＳＥＴｂ細菌発現ベクター中にクローン化し、６ｘＨｉｓタグ化タンパク質を産生し、さらなる実験のために精製した（図１１）。
【０１１６】
表１
【０１１７】
【表１】
（実施例７ 生物活性フラゲリンフラグメントの選択）
フラゲリンの放射線防護活性がＮＦ−κＢ依存性であるようであるので、本発明者らは、フラゲリンフラグメントが核にＮＦ−κＢを転位置し、ＤＮＡ中のその標的部位への結合を誘導する能力を試験した。フラゲリンおよびフラグメント処置Ａ５４９肺癌細胞由来の核抽出物および標識した合成ＮＦ−κＢ結合ｋＢオリゴヌクレオチドを使用した電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によってこれを試験した。
【０１１８】
フラゲリン自体ならびにフラグメントＡＡ’、ＡＢ’、およびＢＡ’のみでＮＦ−κＢ転位置を誘導することができた（図１２）。転位置レベルは、フラゲリンならびにフラグメントＡＡ’、ＡＢ’、およびＢＡ’で類似している。超可変ドメインは、ＮＦ−κＢ転位置に必要でないようである一方で、少なくとも１つの重合ドメイン、Ｎ末端、またはＣ末端が存在する必要がある。Ｎ末端およびＣ末端フラグメントの混合物（Ａ＋Ａ’、Ａ＋Ｂ’）は不活性であった。
【０１１９】
ＮＦ−κＢの核への転位置がアポトーシスのＮＦ−κＢ調節インヒビターの誘導における重要な工程である一方で、それ自体では十分でない。選択されたフラグメントがＮＦ−κＢ調節遺伝子の発現を誘導する能力を直接試験するために、本発明者らは、レポーターアッセイ実験を行った。フラゲリンならびにＡＡ’、ＢＢ’、Ａ’、およびＢ’フラグメントを、ＮＦ−κＢ応答性プロモーター下でのルシフェラーゼ遺伝子を保有するＨ１１６ヒト結腸癌細胞の処置のために使用した。レポーター構築物は、細胞のＮＦ−κＢ状態の検出のために日常的に使用されているＨｓｐ７０最小プロモーターを組み合わせたＥ選択プロモーター由来の３つのＮＦ−κＢ結合部位を含んでいた。フラゲリンまたはその短縮フラグメントの培地への添加から６時間後の細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を測定した。正のコントロールとしてＴＮＦを使用した。各実験結果を図１３に示し、フラゲリンおよびフラグメントＡＡ’がＮＦ−κＢを活性化することができるのに対して、フラグメントＢＢ’、ＧＳＴ−Ａ’、およびＧＳＴ−Ｂ’はできないことを示す。
【０１２０】
（実施例８ フラゲリンフラグメントのさらなる最適化）
本発明者らは、そのＮ末端の半分からペプチドフラグメントを段階的に除去することによるさらなるフラグメントの産生によってＡＡ’フラゲリンフラグメントをさらに最小化した（表２）。フラゲリンおよびフラグメント処置ＨＴ２９ヒト結腸癌細胞由来の核抽出物および標識した合成ＮＦ−κＢ結合κＢオリゴヌクレオチドを使用して、上記のように電気泳動移動度シフトアッセイを行った。ＨＴ２９細胞中のＮＦ−κＢ結合活性を、ＴＮＦａ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはフラゲリンフラグメント（１ｍｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。図１４に示すように、フラグメントＡＡ’ｎｌ−１７０、ＡＡ’ｎ５４−１７０、ＡＡ’ｎｌ−１６３、およびＡＡ’ｎ５４−１６３はそれぞれＮＦ−κＢ転位置を誘導し、そのレベルは、ＡＡ’ｎｌ−１７０、ＡＡ’ｎ５４−１７０、およびＡＡ’ｎｌ−１６３のフラゲリンに匹敵する。
【０１２１】
表２
【０１２２】
【表２】
ＡＡ’フラグメントをＮＦ−κＢ調節転写を直接活性化する能力を研究するために、本発明者らは、広範な濃度のフラゲリン、元のＡＡ’、およびＡＡ’誘導フラグメントについて上記のようにレポーターアッセイ実験を行った。上記のように、ＡＡ’およびＡＡ’ｎ１−１７０は、研究した濃度範囲にわたり、フラゲリンに匹敵するレベルでＮＦ−κＢ調節転写を誘導する（図１５の左）。ＡＡ’およびＡＡ’ｎ１−１７０は、非常に低濃度の範囲でフラゲリンよりも高い活性を示し（図１５の右）、このことは、おそらくその分子量の減少に起因する。フラグメントＡＡ’ｎ１−１７０を使用した結果は、有意に活性を喪失することなく除去されたＮ末端ドメインの一部を使用してＡＡ’誘導性フラゲリンフラグメントを作製することができ、これを有効な放射線防護剤として使用することができることを示す。
【０１２３】
上記実験（ＥＭＳＡおよびレポーター活性化アッセイ）を、３０分間のボイルおよび細胞への適用前の再生に供したフラゲリンおよびＡＡ’フラグメントを使用して繰り返した。結果は、ボイルしないで得た結果に匹敵した（データ示さず）。これは、認められたフラゲリンフラグメント活性の相違がタンパク質安定性の変化によって生じ得ないことを示す。
【０１２４】
（実施例９ フラゲリンおよびフラゲリンフラグメントの放射線防護性のｉｎ ｖｉｖｏでの比較）
上記のように、全長フラゲリンは造血器症候群および胃腸症候群の両方を防護する。１１Ｇｙ（マウスの造血器症候群関連死亡を誘導する線量）または１４Ｇｙ（ＧＩ症候群由来の死亡を生じる線量）でのγ線照射後に、フラゲリンフラグメントの放射線防護性を同様に試験した。マウス（１０匹／群）に、５．０μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）のフラゲリンおよびそのフラグメント（ＡＡ’またはＢＢ’）を皮下注射し、１時間後にγ線を照射した。
【０１２５】
ＡＡ’フラグメントによって示された放射線防護度は、少なくとも全長フラゲリンに匹敵する（図１６）。ＡＡ’フラグメントおよび全長フラゲリンの両方は、１１Ｇｙおよび１４Ｇｙで照射したマウスについて１００％の３０日生存を示した。一方で、ＢＢ’フラグメントを注射したマウスの３０日生存は０％であった。ＢＢ’フラグメントがｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＦ−κＢを誘導することができないので、このことは予想される。これらの結果は、放射線防護度を減少させることなくフラゲリンのサイズを有意に減少させることができる（約４０％の除去）ことを示す。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＦ−κＢ活性化の結果から放射線防護の可能性を予想することができることが確認される。
【０１２６】
（実施例１０ フラゲリン媒介性放射線防護の細胞標的の同定）
１４Ｇｙでの照射から５日後に、フラゲリンで前処置したマウスおよびコントロールマウスから腸粘膜の組織サンプルを採取した。コントロール動物を、５．０μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）の細菌ＲＮＡ−ポリメラーゼで処置した。小腸の病理形態学的分析により、コントロールマウスの陰窩および絨毛のサイズの減少ならびに多数の凝縮アポトーシス核を有する細胞ならびに処置マウスにおけるほぼ正常な形態が明らかとなった（データ示さず）。ＡＡ’フラグメントで処置したマウスからも組織サンプル（小腸および背中由来の皮膚）を得た。図１７に示す結果は、少なくとも３匹のマウス組で認められた典型的な形態の領域である。フラゲリンおよびＡＡ’フラグメントでの処置後、マウスは、絨毛／陰窩構造を保持したほぼ正常な腸形態を示した（図１７Ａ）。
【０１２７】
細胞の死および生存における純粋に組織学的な観察に加えて、本発明者らは、アポトーシス関連ＤＮＡ断片化を検出するＴＵＮＥＬアッセイを使用した腸組織におけるアポトーシス細胞死のより特殊化した試験を行った。これらの実験により、より高い確率で照射によって枯渇し、フラゲリンフラグメント処置によって救出された細胞集団を定義することができた。ＩＲ処置後の小腸で検出可能な最も迅速な照射誘導性変化は、絨毛の血管内皮細胞で生じるアポトーシスであり、これは、処置から５時間の速さで認められる（図１７Ｂ）。小腸の放射線感受性に重要であると考えられるこのアポトーシスは、ＡＡ’フラグメントで前処置したマウスではほとんど完全に遮断された（図１７Ｂの下のパネル）。処置から数日以内に生じ、フラグメントＡＡ’処置動物で非常に抑制される絨毛および陰窩の変性は、血管損傷の結果として起こる。フラゲリンフラグメントによる小腸内皮細胞の有効な防護は、これらの細胞中でのＴＬＲ５の発現に起因し得る。
【０１２８】
著しく、ＡＡ’フラグメントおよびフラゲリンも、体毛の毛包の基底に存在する脂腺の照射誘導性消失を予防した（図２７Ｃ）。これらの結果により、照射誘導性脱毛の放射線防護および予防に対するＡＡ’フラグメントの適切性がさらに確認される。
【０１２９】
（実施例１１ 超致死照射からの防護）
ＡＡ’フラグメントによって得られた放射線防護限度を調査するために、本発明者らは、マウスに、１７Ｇｙおよび２０Ｇｙの単回線量の全身γ線照射を行った。負のコントロールとして不活性フラゲリンフラグメント（ＣＢ）を使用して、上記のように実験を行った。
【０１３０】
予想通り、本発明者らは、１７Ｇｙおよび２０Ｇｙの両群で１００％の死亡を認めた（図１８）。しかし、ＡＡ’フラグメントの投与によってその両方で死亡が有意に遅延された。最も顕著には、コントロールマウスにおける１７Ｇｙでの死亡の動態はＧＩ症候群と一致する一方で（６〜７日での死亡）、ＡＡ’フラグメントで処置したマウスの死亡は造血器症候群に媒介されるようである（１０〜１５日で死亡）。これは、フラゲリンおよびフラゲリンフラグメントが１７Ｇｙもの線量でのＧＩ症候群から防護することができることを示す。さらに、これは、造血器放射線防護剤と組み合わせたフラゲリンおよびフラゲリンフラグメントによってなおさらなる放射線防護を得ることができることを示す。
【０１３１】
（実施例１２ 免疫原性および反復投与の研究）
タンパク質の全免疫原性は、反復使用に対するその適切性によって決定することができる。免疫系によって生成された抗体はタンパク質の治療活性を減少させることができ、タンパク質に対してＩｇＥ抗体が産生された場合には第２の曝露時にアナフィラキシー反応も誘導し得る。したがって、全長フラゲリンと比較した抗体の量および多様性の任意の減少によって改善する。したがって、フラゲリンおよびそのフラグメントの反復導入後、本発明者らは、ａ）第２の暴露後に得られる放射線防護の有効性、ｂ）局所および全身アレルギー反応、およびｃ）抗体力価をモニタリングした。
【０１３２】
本発明者らは、ＡＡ’がＡＡ’に曝露されたマウスを防護する能力を試験した。２０匹のＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウス群に、５μｇ／マウス（０．２ｍｇ／ｋｇ）のＡＡ’を皮下注射した。等用量のＡＡ’の第２の注射を、２１日後（１０匹）および２８日後（別の１０匹）に行い、抗体形成に十分な時間を置いた。第２のＡＡ’注射後に、１３Ｇｙの全身γ照射を行った（注射から１時間後）。以前にＡＡ’に曝露していなかったマウスで認められたように、両群で１００％の３０日生存が認められた（データ示さず）。これらの結果は、長期にわたる反復投与でもＡＡ’の活性が減少せず、多目的適用の可能性が再確認されることを示す。また、フラゲリンまたはＡＡ’のいずれにおいても局所アレルギー反応またはアナフィラキシーは認められなかった。
【０１３３】
本発明者らは、ＡＡ’が生物の免疫状態に与える影響を定量するための抗体力価のＥＬＩＳＡによる決定も行った。９６ウェルプレートを、２０ｍｇ／ｍｌのフラゲリンまたはＡＡ’（５０ｍｌ／ウェル）でコーティングし、＋４℃で一晩インキュベートした。マウスから回収した血清サンプルを、数倍に希釈してウェルに添加し、一晩インキュベートし、その後、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＰＯ−抱合体抗体と６時間反応させた。４１４ｎｍのフィルターを使用した分光光度計を使用して測定を行った。各マウスについて決定した抗体力価および平均力価を、図１９および図２０に示す。
【０１３４】
ＡＡ’は、マウスで非常に低いレベルの抗体を誘導し（図１９）、２１日目に約０．８ｍｇ／ｍｌ血清および２８日目に約１０％超である。他方では（図２０）、フラゲリンは高力価の抗体を誘導し、２１日目および２８日目の両方で約２０ｍｇ／ｍｌである。概して、これは、超可変ドメインの除去が元のタンパク質と比較してＡＡ’の免疫原性を激しく減少させる（約２５倍）ことを示す。図１９は、大部分のＡＡ’特異的抗体がフラゲリンを認識することができることも示す。これにより、ＡＡ’の合理的デザインによって新規の免疫原性エピトープはあまり産生されない一方で、元のタンパク質の９５％を超える免疫原性が除去されることが確認される。
【０１３５】
（実施例１３ フラゲリンおよびＡＡ’の急性毒性研究）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａフラゲリンの致死用量は、１ｍｇ／ｋｇ（全身性炎症）と１０ｍｇ／ｋｇ（１００％死亡）との間である。本発明者らは、０．５、１、２、４、および８ｍｇ／ｋｇの漸増用量のＡＡ’をマウス（４匹／用量群）に皮下投与した。より低い（約６０％）分子量により、８ｍｇ／ｋｇのＡＡ’は、モル換算で１３．３ｍｇ／ｋｇのフラゲリンの用量に相当する。全用量の投与から数日後に、目に見える有害な影響（死亡率、罹患率、または活性の減少および熱などの全身性炎症の兆候など）は認められなかった。これは、全長フラゲリンと比較してＡＡ’の炎症促進効果を無視することができることを示し、特に、ＡＡ’が０．２ｍｇ／ｋｇで有効な放射線防護を示すと見なされる。毒性の減少は、ＡＡ’フラグメント中の主要な炎症促進ドメインの不在に起因し得る。
【０１３６】
（実施例１４ ＡＡ’による分割照射からの防護）
短期間内の反復照射は、例えば、宇宙照射事象および臨床的放射治療レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎ）と共通し得る。本発明者らは、ＡＡ’フラゲリンフラグメントがマウスを分割γ線照射の亜致死レジメン（３Ｇｙで４回の処置）および１００％致死レジメン（４Ｇｙで４回の処置）から防護する能力を試験した。フラグメントＡＡ’または生理食塩水を、各照射前に（１日１回を４日間）ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓ雌マウスに投与した。単回線量照射について上記のように、ＡＡ’を投与した（５μｇ／マウス、照射１時間前に皮下投与）。
【０１３７】
図２１の結果は、ＡＡ’が短い時間枠内の反復被爆量を有意に防護することを示す。ＡＡ’処置後の１００％３０日生存に依然として適合する分割照射の累積線量は、単回線量照射シナリオで得られた累積線量に匹敵する。
【０１３８】
（実施例１５ ＡＡ’は、照射の抗腫瘍治療効果を損なうことなく正常組織を防護する）
癌治療における潜在的な放射線防護剤の最終試験は、腫瘍選択性（腫瘍を全くまたはほとんど防護することなく正常組織を防護する能力）である。本発明者らは、１０匹のＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの両側腹（全部で２０腫瘍）に、２×１０６細胞の同系肉腫細胞株モデル（ＮＩＨ３Ｔ３に由来し、ドミナントネガティブインヒビターＧＳＥ５６によって不活化されたｐ５３で自発的に形質転換した肉腫）を皮下注射した。腫瘍の直径が５〜７ｍｍのサイズに到達した場合（５日目）、マウスに、０．２ｍｇ／ｋｇのＡＡ’または生理食塩水の賦形剤を皮下注射し、１時間後に４Ｇｙの全身γ線照射（３×４．３Ｇｙ＝１２．９Ｇｙの総線量）を行った。５、６、および７日目に注射および照射を行った。
【０１３９】
結果を図１１に示すように、ＡＡ’によって腫瘍の照射誘導性収縮が増強された。１８日目までに、全ての照射された腫瘍保有マウスが急性照射毒性によって死亡したのに対して、放射線療法およびＡＡ’の両方を受けたマウスの１００％が治癒し、治療を生き延びた。別の同系腫瘍モデル（Ｂ１６黒色腫細胞）を使用しても類似の結果が得られた（図１１、右のパネル）。驚いたことに、非照射マウスでさえ、ＡＡ’投与によって腫瘍の成長速度が減少した。これは、Ｔｏｌｌ様受容体の他のリガンドによって生じることが公知のＡＡ’誘導性免疫刺激に起因し得る。これらの結果は、ＡＡ’が２つの腫瘍型の放射線感受性に影響を与えずにマウスの照射耐性を増加させ、それにより、放射線療法とＡＡ’との組み合わせが治療結果を改善する可能性を切り開くことを示す。
【０１４０】
（実施例１６ ＡＡ’およびＬＰＳの放射線防護機構は異なる）
グラム陰性細菌のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）は、別のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ４）のリガンドである。ＬＰＳは、ＮＦ−κＢの強力な誘導因子であり、サイトカインのその後のカスケードである。ＬＰＳは、放射線防護化合物として公知であるが、その高い毒性により、その使用が不可能である（放射線防護用量が致死用量と非常に近い）。ＬＰＳによる放射線防護の基礎をなす主な機構の１つは、ＧＩ防護プロスタグランジンの合成を駆動するシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の活性化である。ＴＬＲ５による放射線防護もＣＯＸ−２活性に依存する可能性を、ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの照射の１時間前に、１ｍｇ／ｋｇのＮＳ３９８（合成ＣＯＸ−２インヒビター）または対応する賦形剤のｉ．ｐ．注射と組み合わせたＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）、ＡＡ’（０．２ｍｇ／ｋｇ）、または賦形剤のｓ．ｃ．投与によって試験した。次いで、マウスを、１３Ｇｙの全身γ線照射で処置した。ＮＳ３９８は、ＬＰＳ媒介性放射線防護を完全に除去したが、ＡＡ’の放射線防護は除去しなかった（図１２）。この結果は、ＡＡ’の活性がＣＯＸ−２に有意に依存せず、ＬＰＳ媒介性防護機構と異なる機構によって放射線防護を誘導することを示す。
【０１４１】
（実施例１７ ＡＡ’は複数のマウス系統を防護する）
本発明者らは、ＡＡ’がＮＩＨ−ＳｗｉｓｓマウスおよびＩＣＲマウスを照射から防護することを確認した。ＡＡ’の放射線防護活性が少数のマウス系統に制限されないことを確認するために、異なる起源のいくつかのさらなるマウス系統を、ＡＡ’：１２９／Ｓｖ、ＤＢＡ／２（比較的放射線抵抗性を示す）、Ｂａｌｂ／ｃ（比較的放射線感受性を示す）、およびＢａｌｂ／ｃ×ＤＢＡ／２ Ｆ１ハイブリッドＣＤ２Ｆ１によって防護について試験した。実験群に照射の３０分前に０．２ｍｇ／ｋｇのＡＡ’を注射する一方で、コントロール群に賦形剤（ＰＢＳ）を注射した。
【０１４２】
全マウス群（各８〜１０匹、８〜１２週齢の雌）に、１０Ｇｙの単回線量を全身γ線照射した。１０日目および３０日目のマウスの生存を示す。結果を、円錐グラフとして図２７に示す。１０日目に、Ｂａｌｂ／ｃマウスのみが死亡し、この死亡はＡＡ’投与によって劇的に減少する（０％生存対１００％生存）。３０日目に、全試験株は、ＡＡ’投与後に生存率が改善された（０〜２５％対５０〜１００％）。
【０１４３】
（実施例１８ ＡＡ’の薬物動態）
薬物動態パラメーター（生物中に存在する薬物の有効濃度および持続時間）は、薬物投与の経路、用量、および時間に重要であり得る。したがって、ＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）の薬物動態を、以下の４つの一般的な注射経路について試験した：静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、または筋肉内（ｉ．ｍ．）。ＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）の放射線防護用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）を、１２〜１５週齢のＩＣＲマウスに注射し、注射後の特定の時間に血漿サンプルを回収した（少なくとも３匹／測定点）。血漿中のＣＢＬＢ５０２レベルを、較正のためにコントロールＩＣＲ血漿中で急増させた既知濃度のＣＢＬＢ５０２を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。結果を、図２８および図２９に示す。
【０１４４】
結果は、筋肉内または腹腔内注射によって血漿中のＣＢＬＢ５０２が最も高いレベルおよび最も長い持続時間で存在することを示す。筋肉内注射後、３時間を超えてマウス血漿中に有意な（５ｎｇ／ｍｌ超）レベルのＣＢＬＢ５０２が認められる。静脈内注射により、血流からＣＢＬＢ５０２がより急速に消失する。
【０１４５】
（実施例１９ γ線照射に対するＡＡ’の影響は、Ａ５４９細胞の細胞死および成長阻害を誘導する）
Ａ５４９ヒト肺癌細胞株は、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性の活性化によってフラゲリンに応答すると報告されている（Ｔａｌｌａｎｔ Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４ Ａｕｇ ２３；４：３３）。本発明者らは、細胞成長阻害アッセイにおいてこの活性化がγ−ＩＲからの細胞の防護に変換されるかどうかをチェックすることを決定した。
【０１４６】
腫瘍細胞を、３つの異なる密度で（単一の細胞、予備、または半接触層を産生する０．５×１０４、１×１０４、および２×１０４細胞／ウェル）３つの９６ウェルプレートのウェルに播種した。細胞をプラスチックに付着させた後、ＣＢＬＢ５０２（２μｇ／ｍｌ）を非照射細胞または７Ｇｙもしくは１０Ｇｙのγ線照射の１５分前にウェルに添加した。コントロールウェルに、同体積の賦形剤（ＰＢＳ）を投与した。全ての時点を四連で行った。照射から７２時間後、培地をメチレンブルーを含む５０％メタノールに置換し、ウェル中の生細胞の相対数を、分光光度計を使用して６５０ｎｍで測定した。結果を図３０に示す。この実験を、固定用量の１×１０４Ａ５４９細胞／ウェルを使用しても繰り返し、５、１０、または１５Ｇｙのγ線照射の１時間前にＣＢＬＢ５０２を添加した（データ示さず）。全ての試験した実験条件で類似のフラゲリン効果が認められた。
【０１４７】
γ線照射により、３つ全ての密度でプレートしたＡ５４９細胞数の線量依存性の減少が誘導された（非照射コントロール群と比較して６０％まで）。ＣＢＬＢ５０２は、γ線照射使用の有無にかかわらず、細胞数に対する効果が無いかわずかであった。これは、腫瘍細胞がＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）によって照射から有意に防護されないことを示す。この効果は、構成性に活性なＮＦ−κＢ経路またはいくつかの他の機構を有する腫瘍細胞に起因し得る。
【０１４８】
（実施例２０ γ線照射に対するＡＡ’の影響は、複数の細胞株の細胞死および成長阻害を誘導する）
Ａ５４９細胞の結果に基づいて、いくつかのさらなる腫瘍細胞株（ヒト黒色腫Ｍｅｌ−７およびＭｅｌ−２９、結腸癌ＨＣＴ１１６、肺癌ＨＴ１０８０）、不死化腎臓上皮細胞（ＮＥＫ）および正常マウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）を、インタクトなコントロールと比較したＣＢＬＢ５０２で前処置を行うか行わない１０Ｇｙおよび１５Ｇｙのγ線照射後の成長阻害アッセイで試験した。処置の前日に、細胞を９６ウェルプレートに播種した。照射の４時間前、１時間前、または１０分前にＣＢＬＢ５０２（２μｇ／ｍｌ）をウェルに添加した（全ての時点を四連で行った）。４８時間後、メチレンブルー染色を行い、ウェル中の生細胞の相対量を決定した。３つ全ての時点で同一の結果を示した（照射の１時間前に添加したＣＢＬＢ５０２についての結果を図３１に示す）。成長阻害率を、コントロール非照射ウェルにおけるＯＤ６５０を０％阻害として計算した。
【０１４９】
ヒト黒色腫細胞株およびＭＡＥＣ細胞の両方は、むしろγ線照射対耐性を示し、インタクトな細胞（０Ｇｙ）と比較して、１０Ｇｙおよび１５Ｇｙ後にわずかな（２０％未満）成長阻害のみを示した。ＮＫＥ細胞、ＨＴ１０８０細胞、およびＨＣＴ１１６細胞は、γ線照射後に４０％までの成長阻害を示した。顕著には、ＣＢＬＢ５０２は、照射の有無にかかわらず腫瘍細胞成長に対する阻害効果は無いかわずかにあるのみであった。実験を２回繰り返した。さらに、肺癌Ｈ１２９９細胞および前立腺癌ＣＷＲ２２において類似の結果を得た（データ示さず）。これは、ＣＢＬＢ５０２によって腫瘍細胞株が照射誘導性細胞死から有意に防護されないことを示す。
【０１５０】
（実施例２１ 小腸陰窩へのＢｒｄＵ組み込みに対する照射およびＡＡ’の影響）
アポトーシスの直接阻害に加え、一過性の増殖の半減（ｈａｌｆ）およびその後の修復は、放射線防護の別の機構であり得、ＴＧＦ−β３などの他の放射線防護剤について記載されている（Ｂｏｏｔｈ Ｄ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０００ Ａｐｒ ｌ；８６（ｌ）：５３−９）。したがって、本発明者らは、最初の投与から数時間の小腸（照射するかしていない）中の細胞の増殖活性にＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）が影響を与える可能性を試験することを決定した（図３２）。ＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳをマウスにｉ．ｐ．注射し、３０分後に１５Ｇｙの照射を行った（使用する場合）。注射から２時間後（照射を適用した場合、照射から１．５時間後）、ＢｒｄＵを腹腔内注射した。さらに１．５時間後に小腸サンプルを得た。
【０１５１】
照射することなく、ＢｒｄＵが高レベルで非処置ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの腸陰窩中の細胞の核に組み込まれたのに対して（図３２の左上）、ＤＮＡ合成（ＢｒｄＵ組み込みによって測定）はＣＢＬＢ５０２処置マウスの陰窩でほぼ検出できなかった（図３２の右上）。賦形剤処置照射マウスでは、コントロールマウスよりもＢｒｄＵ組み込みが低かった。重要には、ＢｒｄＵ組み込みレベルはＣＢＬＢ５０２によって非常に減少し、おそらく、より後期の（Ｇ２期）照射誘導性成長停止と対照的に、早い（Ｓ期）成長停止を示す。したがって、ＣＢＬＢ５０２またはフラゲリンの細胞増殖抑制活性は、小腸のさらなる放射線防護機構であり得る。
【０１５２】
（実施例２２ ＡＡ’媒介性成長停止の持続時間およびＢｒｄＵ組み込みの減少）
本発明者らは、次に、小腸におけるＣＢＬＢ５０２誘導性細胞停止の持続時間を決定した。ＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳをマウスにｉ．ｐ．注射し、ＢｒｄＵを１時間後または４時間後に注射し、さらに１．５時間後にいくつかのマウスから小腸サンプルを得た（３匹のマウス由来のサンプルを示す）（図３３）。
【０１５３】
腸内のＢｒｄＵの組み込みは、１時間後にＢｒｄＵを注射した場合、（２時間後にＢｒｄＵを注射した前の実験で示すように）コントロールと比較して減少した。ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウス、ＩＣＲマウス、およびＢａｌｂ／ｃマウスは、類似の程度のＢｒｄＵ組み込みのＣＢＬＢ５０２媒介性遮断を示した（Ｂａｌｂ／ｃサンプルを、図３３に示す）。ＣＢＬＢ５０２注射から４時間後にＢｒｄＵを注射した場合、組み込み／ＤＮＡ合成レベルは、コントロールで依然として高かった。これは、ＣＢＬＢ５０２による腸幹細胞増殖の阻害が一過性のもので迅速に（４時間までに）解決することができ、その後増殖し得る（おそらく、細胞の部分的同期化に起因する）ことを示す。
【０１５４】
（実施例２３ 結腸陰窩へのＢｒｄＵ組み込みに対するＡＡ’の影響）
結腸は、小腸よりも放射線感受性がはるかに低い。小腸における増殖の減少と放射線防護との間の関係をさらに試験するために、本発明者らは、結腸へのＢｒｄＵ組み込みに対するＣＢＬＢ５０２の効果を決定した。ＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳをマウスにｉ．ｐ．注射し、１時間後にＢｒｄＵを注射し、さらに１．５時間後に小腸サンプルを得た（図３４）。
【０１５５】
小腸と異なり、ＣＢＬＢ５０２は結腸へのＢｒｄＵ組み込み効果がなかった。両器官中にＴＬＲ５が豊富であるので、これは驚くべきである。効果の相違は、ＣＢＬＢ５０２によって誘導されるさらなるＴＬＲ５シグナル伝達効果を隠し得る結腸中のより多い共生細菌量に起因し得る。
【０１５６】
（実施例２４ 投与経路による放射線防護可能性の比較）
本発明者らは、次に、以下のいくつかの経路を介して投与されたＦｌｉＣフラゲリンによる放射線防護を試験した：静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、および細管栄養（ｇａｖａｇｅ）。非経口（非細管栄養）経路のために、マウスにＰＢＳまたは賦形剤に溶解した０．２ｍｇ／ｋｇのＦｌｉＣフラゲリンを注射し、１時間後に１３Ｇｙの照射を行った。細管栄養送達実験では、１３Ｇｙのγ線照射の１時間前に、５匹のマウスに増加した用量（５０μｇ）のＦｌｉＣを含む５０μｌのＰＢＳを嚥下させた。８〜１０週齢のメスＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウス（５〜１０匹／群）で両実験を行った。
【０１５７】
細管栄養を加えた全ての試験経路は、類似の程度の防護を示し、８５〜９０％のマウスが３０日生存した（データ示さず）。細管栄養送達によって照射に対する防護は認められず、これは、胃腸環境によるタンパク質の消化に起因し得る。さらに、フラゲリン受容体（ＴＬＲ５）は、腸内容物に曝露された腸上皮の管腔部位に存在しない（Ｇｅｗｉｒｔｚ ＡＴ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ａｕｇ １５；１６７（４）：１８８２−５）。
【０１５８】
（実施例２５ 小腸の形態に対するＡＡ’の効果）
フラゲリン（およびＣＢＬＢ５０２）は、ＴＬＲ５への結合を介してＮＦ−κＢ活性を誘導し得る。したがって、ＣＢＬＢ５０２媒介性放射線防護は、ＴＬＲ５の存在および活性に依存し得る。ＭＯＬＦ／Ｅｉマウスは、ＴＬＲ５欠損の公知の天然モデルである（Ｓｅｂａｓｔｉａｎｉ Ｇ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０００ Ｍａｒ １５；６４（３）：２３０−４０）。ＣＢＬＢ５０２媒介性放射線防護が実際にＴＬＲ５依存性であることを検証するために、本発明者らは、ＭＯＬＦ／ＥｉマウスおよびＮＩＨ−ＳｗｉｓｓマウスにおけるＣＢＬＢ５０２による照射からの小腸の防護を試験した（図３５）。１５Ｇｙのγ線照射の０．５時間前に、両マウス系統に０．２ｍｇ／ｋｇのＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）またはＰＢＳを投与した。照射から４日後に小腸サンプルを得て、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、病理形態学的分析に供した。
【０１５９】
ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓ（ＴＬＲ５野生型）マウスでは、ＰＢＳ処置マウスにおける短い絨毛および正常な陰窩構造の消失と比較して、ＣＢＬＢ５０２の前処置によって腸の形態が保存された（長い絨毛、正常な陰窩）。その一方で、ＴＬＲ５欠損ＭＯＬＦ／Ｅｉマウスでは、ＣＢＬＢ５０２の投与によって１５Ｇｙのγ線照射後の腸の形態に対する影響は改善されず、ＣＢＬＢ５０２使用の有無にかかわらず短い絨毛および正常な陰窩構造の破壊が認められた。これは、ＴＬＲ５の存在が小腸におけるＣＢＬＢ５０２媒介性放射線防護に必要であり得ることを示す。
【０１６０】
（実施例２６ フラゲリン誘導体）
図３６に示すドメイン構造に基づいて、さらなるフラゲリン改変体を産生した。次いで、フラゲリン改変体を、上記で考察したいくつかの改変体と共に、ＮＦ−κＢ刺激活性について試験した（表３）。Ａ５４９細胞を、刺激しないままにするか、表示のＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）または１μｇ／ｍｌの精製フラゲリンもしくは種々の表示のフラゲリン誘導体で４５分間刺激し、全細胞抽出物を実施例７に記載のように調製した。ＥＭＳＡアッセイを行い、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ−タンパク質複合体を実施例７に記載のように検出した。
【０１６１】
表３
【０１６２】
【表３】
表３の結果は、アミノ末端領域（ａａ１〜１７６）およびカルボキシ末端領域（ａａ４０２〜５０５）内に含まれるドメインに結合した少なくとも１つの重合ドメイン（ａａ１〜５０またはａａ４５０〜５０５）を有するフラゲリン変異形がＮＦ−κＢを刺激することができ、それにより、放射線防護剤であると予想されることを示す。トランスで結合していないドメインはＮＦ−κＢを活性化できないので、認識ドメインの物理的結合は活性に必要であり得る。１つのポリペプチド中のドメインの結合の代替物として、ドメインを、２つの分子を連結するために使用される分子であるリンカーを使用して結合させることができる。リンカーは、両分子と共有結合または高親和性非共有結合を形成することができる。適切なリンカーは当業者に周知であり、直鎖または分枝鎖の炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定されない。リンカーを、その側鎖基を介して（例えば、システインへのジスルフィド結合を介して）成分アミノ酸に連結することができる。
【０１６３】
カルボキシル重合ドメイン（ａａ４５０〜５０５）が存在しない場合、活性にアミノ酸１６３と１７６との間の領域が必要であり得る。カルボキシル重合ドメインが存在する場合にこの領域は活性に重要でないので、この領域は誘導体の安定性に関与し得る。アミノ酸７０と１２９との間の領域は活性化に重要であり、誘導体の安定化に関与し得る。アミノ酸４０２と４５０との間の領域も活性に必要であり得る。上記で同定したドメインは、３つの巨大なα−ヘリックス内に存在し（アミノ酸５４〜１２９および４０２〜４５０内に存在する）、活性誘導体を産生するために、環様構造（重合ドメインを含むか含まない）を形成することが必要であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１は、ｐ５３欠損によってマウスのＧＩ症候群の発症が促進されることを示す。パネルＡ：ＰＦＴα（１０ｍｇ／ｋｇ）のＩ．Ｐ．注射によって、単回の９Ｇｙの線量のγ線および１２．５Ｇｙの分割された放射線の蓄積線量（５×２．５Ｇｙ）からＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス（他で示さない限り、ここおよび以下で６〜８週齢の雄を使用した）が防護される。ＰＦＴαは、単回の１２．５Ｇｙおよび２５Ｇｙ線量のＩＲで処置したマウスの生存に影響を与えない（各実験の結果を示す；４Ｇｙ／分の線量率でＳｈｅｐｈｅｒｄ ４０００Ｃｉセシウム１３７源を使用した）。パネルＢ：野生型およびｐ５３−ヌルＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスは、その相対感受性が低線量（１０Ｇｙ）と高線量（１５Ｇｙ）のγ線で異なる：野生型マウスは、ｐ５３−ヌルマウスと比較して１０Ｇｙに対してより感受性が高いが、１５Ｇｙに対してより耐性が高い。パネルＣ：１２時間後の１１Ｇｙの全身γ線照射で処置したマウスに、野生型またはｐ５３−ヌル同系Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウス由来の１．５×１０７個の骨髄細胞を注射した。（この線量により、非構成マウスコントロール群は１００％死亡した）。２ヶ月後、造血の完全な回収後、動物を、１５Ｇｙの全身γ線照射で処置し、その骨髄のｐ５３状態が異なる２群間の死亡率が異ならなかった。パネルＤ：１５Ｇｙのγ線照射後の表示の時点での野生型マウスおよびｐ５３−ヌルマウスの小腸に対する損傷の動力学の比較により、ｐ５３−ヌルマウスの損傷が加速される（ヘマトキシリン−エオシン染色パラフィン切片；１２５倍）。２４時間のパネルは、陰窩切片のＴＵＮＥＬ染色の画像を含む。巨大なアポトーシスが野生型では明らかであるが、ｐ５３欠損上皮では明らかでない。
【図２】図２は、野生型マウスおよびｐ５３−ヌルマウスの小腸における細胞増殖および生存の動力学を証明する。パネルＡ：ＩＲでの処置後の野生型マウスおよびｐ５３ヌルマウスの腸における増殖率の比較。（左）１５Ｇｙのγ線で処置しているか処置していない１４Ｃ−チミジン（１０μＣｉ／動物）を腹腔内注射した４週齢の野生型マウスおよびｐ５３ヌルマウスの全身切片（１．７倍）のオートラジオグラフ。矢印は腸を示す。（右）１５Ｇｙのγ線での処置後の異なる時点での野生型およびｐ５３−ヌルマウスの小腸中のＢｒｄＵ組み込みの比較。ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を、マウス屠殺の２時間前に注射し、その後に免疫染色を行った。９６時間のパネルの小部分は、高倍率（４００倍）を示す。パネルＢ：１５Ｇｙのγ線での処置後の異なる時点での野生型およびｐ５３−ヌルマウスの小腸中のＢｒｄＵ陽性細胞／陰窩数の比較。各時点で３匹の動物を分析し、各動物由来の５つの回腸の断面を調製し、顕微鏡で分析して陰窩および絨毛の数を評価した。陰窩中のＢｒｄＵ陽性細胞数を、２００倍での５つの無作為な視野（１００〜３０陰窩）で計数し、平均ＢｒｄＵ用生細胞数をプロットした。パネルＣ：１５Ｇｙのγ線照射後の異なる時点での野生型マウスおよびｐ５３−ヌルマウスの小腸中のＢｒｄＵ標識細胞の数および位置の軌跡。照射前にＢｒｄＵを３０分間注射し、マウスを表示の時点で屠殺した。ｐ５３−ヌルマウスにおいて標識細胞の陰窩から絨毛までの移動の加速およびその後の急速な消失が認められた。
【図３】図３は、組換えフラゲリンがＮＦ−κＢ活性化が可能であること証明する。
【図４】図４は、照射からマウスを防護するためのフラゲリンの能力を試験する各実験を示す。Ｃ５６ＢＬ６マウス（６週齢の雄、１０匹／群）に、２．０μｇ（０．１ｍｇ／ｋｇ）または５μｇ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）のフラゲリンを含むＰＢＳをｉ．ｖ．注射下。４時間後、マウスに、１５Ｇｙを照射し、マウスの生存率を毎日モニタリングした。
【図５】図５は、０．２５ｍｇ／ｋｇのフラゲリンのｉ．ｖ．注射を行ったか行っていない１５Ｇｙのγ線で処置したマウスの小腸上皮の組織学的切片（ＨＥ染色）を示す。コントロールマウスにおける陰窩および絨毛の完全な破壊は、フラゲリン処置マウス由来の組織の通常の形態と非常に対照的である。
【図６】図６は、１０Ｇｙの全身γ線照射に対するマウスの感受性に対するフラゲリンの効果を示す。
【図７】図７は、１３Ｇｙ（左）および１０Ｇｙ（右）の全身γ線照射に対するマウスの感受性に対する照射前の表示の時点でｉ．ｖ．注射したフラゲリンの効果を示す。
【図８】図８は、１０、１３、および１５Ｇｙの全身γ線照射に対するマウスの感受性に対するフラゲリンの効果を示す。
【図９】図９は、細菌フラゲリンのドメイン構造を示す。Ｆ４１のＣａ骨格の軌跡、疎水性コアの分布、および構造情報。ドメインＤ１、Ｄ２ａ、Ｄ２ｂ、およびＤ３を規定する４つの異なる疎水性コア。全疎水性側鎖の原子を、Ｃａ骨格と共に示す。側鎖原子を色分けしている：Ａｌａ、黄色；Ｌｅｕ、Ｌｌｅ、またはＶａｌ、橙色；ＰｈｅおよびＴｙｒ、紫色（炭素原子）および赤色（酸素原子）。ｃ、フラゲリンのアミノ酸配列中の種々の特徴的な構造の位置および領域。以下に示す（上から下）：Ｆ４１フラグメント（青色）、３つのｂ葉（ｂ−ｆｏｌｉｕｍ）折り畳み（褐色）；ａ−ヘリックスを有する二次構造の分布（黄色）、ｂ構造（緑色）、およびｂ−ターン（紫色）；５０番目の残基毎のチック（ｔｉｃ）マーク（青色）；ドメインＤ０、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３；プロト−エレメント（ｐｒｏｔｏ−ｅｌｅｍｅｎｔ）内の軸サブユニット接触領域（シアン）；十分に保存されたアミノ酸配列（赤色）および可変領域（紫色）；異なるスーパーコイルのエレメントを産生するＦ４１中の点変異。下の文字は、変異エレメントの形態を示す：Ｌ（Ｄ１０７Ｅ、Ｒ１２４Ａ、Ｒ１２４Ｓ、Ｇ４２６Ａ）、Ｌ型直線；Ｒ（Ａ４４９Ｖ）、Ｒ型直線；Ｃ（Ｄ３１３Ｙ、Ａ４１４Ｖ、Ａ４２７Ｖ、Ｎ４３３Ｄ）、ねじれた３３（ｃｕｒｌｙ３３）。
【図１０】図１０は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属フラゲリンドメイン、そのフラグメント、およびＴＬＲ５との相互作用を示す。暗色のバーは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ’、およびＢ’を含むフラグメントを構築するために使用したフラゲリン遺伝子の領域を示す。
【図１１】図１１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる断片化後の溶性フラゲリン（ＦｌｉＣ）および２つのフラグメント（ＡＡ’およびＢＢ’）を示し、分子量マーカーを左側に列挙した。
【図１２】図１２は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属フラゲリン（ＦｌｉＣ）およびフラゲリンフラグメントによるＮＦ−κＢ核転位置の誘導を示す。
【図１３】図１３は、Ｈ１１６細胞におけるフラゲリンおよびフラゲリンフラグメントによるＮＦ−κＢ調節ルシフェラーゼレポーター構築物の活性化を示す。タンパク質濃度を、μｇ／ｍｌで示す。
【図１４】図１４は、フラゲリンおよびフラゲリンフラグメントによって誘導されたＨＴ２９ヒト結腸癌細胞におけるＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合を示す。
【図１５】図１５は、全長フラゲリンおよびフラゲリンフラグメントによるＨＣＴ１１６レポーター細胞におけるＮＦ−κＢレポーターの活性化を示す。
【図１６】図１６は、フラゲリン（ＦｌｉＣ）およびフラグメントＡＡ’およびＢＢ’の放射線防護性の比較を示す。
【図１７】図１７は、ＡＡ’フラグメントが照射によって生じる変性から腸上皮を防護することを示す。Ａ：１４Ｇｙ照射から５日後のマウスの小腸上皮の組織学的切片（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）を示す。Ｂ：ＴＵＮＥＬアッセイによって決定したところ、ＡＡ’フラグメントでの処置により、照射から５時間後に持続している絨毛の内皮細胞中のアポトーシスが防止される（内皮マーカーＣＤ３１の免疫染色によって検出し、矢印で示す）。Ｃ：１４Ｇｙのγ線照射から５日後の皮膚の組織学的切片は、脂腺のＡＡ’フラグメントに対する防護効果を証明する（赤色の矢印）。
【図１８】図１８は、ＡＡ’フラグメントが１７Ｇｙおよび２０Ｇｙの全身γ線照射での超致死（ｓｕｐｒａｌｅｔｈａｌ）照射後のマウスの死亡を部分的に防護し、遅延することを示す。
【図１９】図１９は、フラゲリンおよびＡＡ’による２１日後および２８日後のマウスで誘導された抗フラゲリン抗体力価を示す。各マウスについて、２つの測定値の平均を示す。マウスに、Ｆ１：フラゲリンまたはＡＡ’を注射した。２１ｄおよび２８ｄｓ−マウスに２１日目に最初の投与を行い、２８日目に第２の投与をそれぞれ行う。ＰＢＳ：生理食塩水（血清なし）コントロール；ブランク：空のウェル読み取りコントロール。
【図２０】図２０は、フラゲリンおよびＡＡ’による２１日後および２８日後のマウスで誘導された抗フラゲリン力価を示す。各マウスについて、２つの測定値の平均を示す。マウスに、Ｆ１：フラゲリンまたはＡＡ’を注射した。２１ｄおよび２８ｄｓ−マウスに２１日目に最初の投与を行い、２８日目に第２の投与をそれぞれ行う。ＰＢＳ：生理食塩水（血清なし）コントロール；ブランク：空のウェル読み取りコントロール。
【図２１】図２１は、フラゲリンフラグメントＡＡ’が複数の連続的γ線照射からマウスが防護されることを示す。矢印は照射処置を示す（１〜４日目）。
【図２２】図２２は、照射処置に対する腫瘍感受性に対するＡＡ’の効果を示す。左のパネル：ＮＩＨ−ＳｗｉｓｓマウスにＮＩＨ３Ｔ３誘導性肉腫細胞をｓ．ｃ．注射した。腫瘍の直径が７〜１０ｍｍに到達した場合、ＡＡ’で前処置するかしないでマウスに３回の４．３Ｇｙの線量の全身照射を行った。照射処置後の腫瘍成長の動力学を示す。Ｕ／ｔ：未処置、ＡＡ’：照射しないでＡＡ’で処置、３×４Ｇｙ：照射のみ、３×４Ｇｙ＋ＡＡ’：ＡＡ’および照射。（曲線の形状は、このモデルに特徴的な遅い腫瘍成長を反映する）。最後の照射から７日後に測定した腫瘍体積に対して正規化した相対腫瘍体積として結果を示す。右のパネル：別の同系マウス腫瘍モデルを使用した同一の方法で試験を行った：Ｂ１６黒色腫（Ｃ５７ＢＬ６バックグラウンド）。腫瘍の直径が４〜５ｍｍに到達した場合に処置を適用し、この処置には、ＡＡ’で前処置（照射３０分前、５μｇ／マウス）するかしないその後の３回の４Ｇｙの線量の全身γ線照射が含まれた。
【図２３】図２３は、１３Ｇｙの全身γ線照射後のマウスにおけるＬＰＳおよびＡＡ’の放射線防護に対するＮＳ３９８の影響を示す。
【図２４】図２４は、２１種の細菌由来の保存アミノ酸末端（図２４Ａ）およびカルボキシ末端（図２４Ｂ）のアミノ酸配列の比較を示す。ＴＬＲ５活性に重要な１３の保存アミノ酸を、影をつけることによって示す。アミノ酸配列を、ＴｒＥＭＢＬ（最初の文字＝Ｑ）またはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（最初の文字＝Ｐ）由来のそのアクセッション番号によって識別する。
【図２５】図２５は、クエリー配列として配列番号１を使用したＢＬＡＳＴ検索の結果を示す。全検索で使用したパラメーターは以下であった：期待値カットオフ＝１０、行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２、存在のギャップペナルティ＝１１、および伸長＝１、フィルタリング＝なし。図２５Ａ：ＮＲ＿細菌（タンパク質−タンパク質）；図２５Ｂ：ＮＲ＿細菌（タンパク質−ＤＮＡ）；図２５Ｃ：細菌ゲノム（タンパク質−タンパク質）；図２５Ｄ：細菌ゲノム（タンパク質−ＤＮＡ）。
【図２６】図２６は、図２５と同一の検索パラメーターを使用してｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／からのＢＬＡＳＴの結果で示すように、配列番号１と比較して図２４に示すホモログのアミノ末端およびカルボキシ末端の同一率を示す。
【図２７】図２７は、ＡＡ’が１０Ｇｙの全身γＩＲ後の複数のマウス系統の救出（ｒｅｓｃｕｅ）を媒介することを証明する。
【図２８】図２８は、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射後のＡＡ’の薬物動態を証明する。
【図２９】図２９は、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射後のＡＡ’の薬物動態の拡大を証明する。
【図３０】図３０は、Ａ５４９細胞におけるγ線照射誘導性細胞死および成長阻害に対するＡＡ’の影響を証明する。
【図３１】図３１は、複数の細胞株におけるγ線照射誘導性細胞死および成長阻害に対するＡＡ’の影響を証明する。
【図３２】図３２は、ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの小腸陰窩におけるＢｒｄＵ組み込みに対する照射およびＡＡ’の影響を証明する。１５Ｇｙのγ線照射を行ったか行っていないコントロールおよびＡＡ’処置ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの小腸中のＢｒｄＵ組み込みの比較を示す。ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）をマウス屠殺の１．５時間前に注射し、以前に記載のように免疫染色を行った（Ｗａｔｓｏｎ ＡＪ ＆ Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ ＤＭ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００ Ｊａｎ；２７８（ｌ）：Ｇｌ−５）。画像の赤色チャネルを示す（陽性シグナルは暗色バックグラウンド上の明るい白色である）。
【図３３】図３３は、マウス小腸におけるＡＡ’媒介性成長停止およびＢｒｄＵ組み込みの減少の持続時間を示す。ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を、ＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）注射から１時間後または４時間後にＢａｌｂ／ｃマウスにｉ．ｐ．注射した。ＢｒｄＵ注射から１．５時間後に小腸サンプルを得た。以前に記載のように免疫染色を行った（Ｗａｔｓｏｎ ＡＪ ＆ Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ ＤＭ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００ Ｊａｎ；２７８（ｌ）：Ｇｌ−５）。倒立像を示す（陽性シグナルは明色バックグラウンド上の暗色である）。
【図３４】図３４は、ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの結腸陰窩へのＢｒｄＵ組み込みに対するＡＡ’の影響を証明する。ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を、ＣＢＬＢ５０２（ＡＡ’）注射から１時間後にＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスにｉ．ｐ．注射した。以前に記載のように免疫染色を行った（Ｗａｔｓｏｎ ＡＪ ＆ Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ ＤＭ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００ Ｊａｎ；２７８（ｌ）：Ｇｌ−５）。倒立像を示す（陽性シグナルは明色バックグラウンド上の暗色である）。下のパネルは、サンプルのより小さな倍率／大きな領域を示す。
【図３５】図３５は、ＡＡ’での処置後のＴＬＲ５欠損ＭＯＬＦ／ＥｉおよびＴＬＲ５ ｗｔＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの小腸の形態学を証明する。
【図３６】図３６は、フラゲリン誘導体を示す。選択されたフラゲリン誘導体のドメイン構造およびおおよその境界（アミノ酸座標）（右に列挙する）。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ・ｄｕｂｌｉｎのＦｌｉＣフラゲリンは、５０５アミノ酸（ａａ）内にコードされる。
【図３７】図３７は、ＮＦ−κＢ刺激活性について試験したさらなるフラゲリン誘導体の試験を示す。
【図３８−１】図３８は、以下のフラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号５３〜５４）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、斜体で示す（リーダーには、ＦｌｉＣのアミノ酸１であるＭｅｔが含まれる）。Ｎ末端定常ドメインに下線を引いている。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインに下線を引いている。存在する場合、ＧＳＴを強調している。
【図３８−２】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−３】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−４】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−５】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−６】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−７】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−８】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−９】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−１０】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３８−１１】図３８は、フラゲリン改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシスを誘発する１つまたは複数の治療または状態から哺乳動物を防護する方法であって、薬学的有効量のフラゲリンを含む組成物を患者に投与する工程を包含し、該フラゲリンは、配列番号１、または配列番号１のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、誘導体、またはその組み合わせを含み、該フラゲリンはＴＬＲ−５媒介活性を誘導する、方法。
【請求項２】
前記フラゲリンが、配列番号１の１〜１７４および４１８〜５０５のアミノ酸と少なくとも３０％同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フラゲリンが、８９位、９０位、９１位、９５位、９８位、１０１位、１１５位、４２２位、４２３位、４２６位、４３１位、４３６位、および４５２位からなる群から選択される位置において、少なくとも１０個の保存アミノ酸を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記フラゲリンが、配列番号１、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、および配列番号５２からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記状態が、放射線への被爆である、請求項１〜請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記フラゲリンを、放射線防護剤と組み合わせて投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記治療が癌治療である、請求項１〜請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記治療が化学療法である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療が放射線療法である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記フラゲリンを、放射線防護剤と組み合わせて投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療が、創傷、中毒、細菌感染、ウイルス感染、および温度衝撃からなる群から選択されるストレスである、請求項１〜請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記アポトーシスが、胃腸管、肺、腎臓、肝臓、心血管系、血管内皮、中枢神経系、末梢神経系、造血前駆細胞、免疫系、および毛包からなる群から選択される組織において誘発される、請求項１〜請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物において、敗血症が予防される、請求項１〜請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
アポトーシスを誘発する１つまたは複数の治療または状態から哺乳動物を防護する方法であって、薬学的有効量のフラゲリンを含む組成物を患者に投与する工程を包含し、該フラゲリンは、配列番号１、または配列番号１のフラグメント、改変体、アナログ、ホモログ、誘導体、またはその組み合わせを含み、該フラゲリンはＴＬＲ−５媒介活性を誘導する、方法。
【請求項２】
前記フラゲリンが、配列番号１の１〜１７４および４１８〜５０５のアミノ酸と少なくとも３０％同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フラゲリンが、８９位、９０位、９１位、９５位、９８位、１０１位、１１５位、４２２位、４２３位、４２６位、４３１位、４３６位、および４５２位からなる群から選択される位置において、少なくとも１０個の保存アミノ酸を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記フラゲリンが、配列番号１、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、および配列番号５２からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記状態が、放射線への被爆である、請求項１〜請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記フラゲリンを、放射線防護剤と組み合わせて投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記治療が癌治療である、請求項１〜請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記治療が化学療法である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療が放射線療法である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記フラゲリンを、放射線防護剤と組み合わせて投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療が、創傷、中毒、細菌感染、ウイルス感染、および温度衝撃からなる群から選択されるストレスである、請求項１〜請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記アポトーシスが、胃腸管、肺、腎臓、肝臓、心血管系、血管内皮、中枢神経系、末梢神経系、造血前駆細胞、免疫系、および毛包からなる群から選択される組織において誘発される、請求項１〜請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物において、敗血症が予防される、請求項１〜請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４（Ａ）−１】
【図２４（Ａ）−２】
【図２４（Ｂ）】
【図２５Ａ−１】
【図２５Ａ−２】
【図２５Ａ−３】
【図２５Ａ−４】
【図２５Ａ−５】
【図２５Ａ−６】
【図２５Ａ−７】
【図２５Ａ−８】
【図２５Ａ−９】
【図２５Ａ−１０】
【図２５Ａ−１１】
【図２５Ａ−１２】
【図２５Ａ−１３】
【図２５Ａ−１４】
【図２５Ａ−１５】
【図２５Ａ−１６】
【図２５Ａ−１７】
【図２５Ａ−１８】
【図２５Ａ−１９】
【図２５Ａ−２０】
【図２５Ｂ−１】
【図２５Ｂ−２】
【図２５Ｂ−３】
【図２５Ｂ−４】
【図２５Ｂ−５】
【図２５Ｂ−６】
【図２５Ｂ−７】
【図２５Ｂ−８】
【図２５Ｂ−９】
【図２５Ｂ−１０】
【図２５Ｂ−１１】
【図２５Ｂ−１２】
【図２５Ｂ−１３】
【図２５Ｂ−１４】
【図２５Ｂ−１５】
【図２５Ｂ−１６】
【図２５Ｂ−１７】
【図２５Ｂ−１８】
【図２５Ｂ−１９】
【図２５Ｃ−１】
【図２５Ｃ−２】
【図２５Ｃ−３】
【図２５Ｃ−４】
【図２５Ｃ−５】
【図２５Ｃ−６】
【図２５Ｃ−７】
【図２５Ｄ−１】
【図２５Ｄ−２】
【図２５Ｄ−３】
【図２５Ｄ−４】
【図２５Ｄ−５】
【図２５Ｄ−６】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８−１】
【図３８−２】
【図３８−３】
【図３８−４】
【図３８−５】
【図３８−６】
【図３８−７】
【図３８−８】
【図３８−９】
【図３８−１０】
【図３８−１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４（Ａ）−１】
【図２４（Ａ）−２】
【図２４（Ｂ）】
【図２５Ａ−１】
【図２５Ａ−２】
【図２５Ａ−３】
【図２５Ａ−４】
【図２５Ａ−５】
【図２５Ａ−６】
【図２５Ａ−７】
【図２５Ａ−８】
【図２５Ａ−９】
【図２５Ａ−１０】
【図２５Ａ−１１】
【図２５Ａ−１２】
【図２５Ａ−１３】
【図２５Ａ−１４】
【図２５Ａ−１５】
【図２５Ａ−１６】
【図２５Ａ−１７】
【図２５Ａ−１８】
【図２５Ａ−１９】
【図２５Ａ−２０】
【図２５Ｂ−１】
【図２５Ｂ−２】
【図２５Ｂ−３】
【図２５Ｂ−４】
【図２５Ｂ−５】
【図２５Ｂ−６】
【図２５Ｂ−７】
【図２５Ｂ−８】
【図２５Ｂ−９】
【図２５Ｂ−１０】
【図２５Ｂ−１１】
【図２５Ｂ−１２】
【図２５Ｂ−１３】
【図２５Ｂ−１４】
【図２５Ｂ−１５】
【図２５Ｂ−１６】
【図２５Ｂ−１７】
【図２５Ｂ−１８】
【図２５Ｂ−１９】
【図２５Ｃ−１】
【図２５Ｃ−２】
【図２５Ｃ−３】
【図２５Ｃ−４】
【図２５Ｃ−５】
【図２５Ｃ−６】
【図２５Ｃ−７】
【図２５Ｄ−１】
【図２５Ｄ−２】
【図２５Ｄ−３】
【図２５Ｄ−４】
【図２５Ｄ−５】
【図２５Ｄ−６】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８−１】
【図３８−２】
【図３８−３】
【図３８−４】
【図３８−５】
【図３８−６】
【図３８−７】
【図３８−８】
【図３８−９】
【図３８−１０】
【図３８−１１】
【公表番号】特表２００８−５２５４７２（Ｐ２００８−５２５４７２Ａ）
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４８４５１（Ｐ２００７−５４８４５１）
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４６４８５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６９１９８
【国際公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５０２０９３８９６）クリーブランド クリニック ファウンデイション (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４６４８５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６９１９８
【国際公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（５０２０９３８９６）クリーブランド クリニック ファウンデイション (6)
【Ｆターム（参考）】
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