プリオンを除去するための超音波処理の使用
【課題】プリオンの破壊または不活性化のために従来必要とされている厳しい条件を用いることなく、プリオンの除去に有効な殺菌方法を提供する。
【解決手段】超音波エネルギーと酵素処理との組み合わせを用いてプリオン分子を破壊する。本発明の方法は、プリオンタンパク質またはその代替物で汚染された表面を殺菌する方法であって、前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、前記表面を、前記プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ界面活性剤を実質的に含有しない分解組成物で処理するステップとを含むことを特徴とする。
【解決手段】超音波エネルギーと酵素処理との組み合わせを用いてプリオン分子を破壊する。本発明の方法は、プリオンタンパク質またはその代替物で汚染された表面を殺菌する方法であって、前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、前記表面を、前記プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ界面活性剤を実質的に含有しない分解組成物で処理するステップとを含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、表面を殺菌する方法に関し、特に、プリオン分子を破壊する方法に関する。より具体的には、本発明の方法は、超音波エネルギーと酵素処理との組み合わせを用いてプリオンを変性させかつ分解する。本発明の方法は、プリオンまたはその代替物で汚染された表面、懸濁液または溶液を処理するのに使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
バクテリア、真菌、寄生虫、ウイルス及びウイロイドなどの感染性因子の多くは、様々な形態の殺菌及び滅菌（例えば、蒸気滅菌、乾燥滅菌、低温滅菌、ろ過滅菌、エチレン酸化物、グルタルアルデヒド、フェノールまたは他の化学殺菌剤による処理、放射線照射など）を含む十分に確立された制御方法を有する。
【０００３】
ここ数年間、プリオン（タンパク性感染粒子）と呼ばれる新たな以前は未知であった新型病原体が出現し、科学刊行物に報告されている。プリオンが原因と思われる比較的類似する神経疾患が多数、ヒトと動物の両方において確認されている。これらの疾患は、一般的に、伝達性海綿状脳症（transmissible spongiform encephalopathy：ＴＳＥ）と呼ばれている。ＴＳＥには、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（Creutzfeldt-Jakob disease：ＣＪＤ）、変異型ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）、クールー（Ｋｕｒｕ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（Gerstmann-Straussler-Scheinker disease：ＧＳＳ）及び致死性家族性不眠症（fatal familial insomnia：ＦＦＩ）、ウシにおける牛海綿状脳症（bovine spongiform encephalopathy：ＢＳＥ）（「狂牛病」としても知られている）、ヒツジ及びヤギにおけるスクレピー（scrapie）、並びに、ヘラジカ及びシカにおける慢性消耗病（chronic wasting disease：ＣＷＤ）が含まれる。これらの疾患は全て、上記の特定の疾患に感染しやすい動物の神経器官を攻撃する。これらの疾患は、初期の長い潜伏期間、その後の短期間の神経症状（認知症及び協調運動障害を含む）、及び最終的な死によって特徴付けられる。
【０００４】
プリオンの構造についての研究が精力的に行われており、様々な異なる見解が示されている。プリオンが非常に小さいウイルスであると考えている科学者も一部いるが、現在、ほとんどの専門家は、実際のところプリオンはＤＮＡまたはＲＮＡコアを持たない感染性タンパク質であると考えている。より具体的には、感染性プリオンは、ホストにおいて通常見られるタンパク質（すなわち、「プロテアーゼ耐性タンパク質（protease-resistant protein：ＰｒＰ）」）の異常型であると考えられている。哺乳類のＰｒＰ遺伝子は、溶解性の非疾病性細胞型ＰｒＰＣまたは不溶性の疾病型ＰｒＰＳｃであり得るタンパク質を発現する。多くの証拠が、プリオン病が、正常な細胞型から異常型ＰｒＰＳｃへの形質転換に起因することを示している。前記２つの型のアミノ酸配列には、検出可能な差異はない。感染性プリオンは、主としてその３次元構造によって、細胞性プリオンタンパク質と区別される。特に、細胞性プリオンタンパク質は、主にαヘリックス構造から構成されており、βシートをほとんど含まない。しかし、ＰｒＰＳｃは、改変された立体構造を持ち、具体的には、厳しい条件以外の全ての条件下でＰｒＰＳｃの耐性を高める高レベルのβシート構造及び多数の分子内ジスルフィド結合を有する。
【０００５】
プリオン病の発症メカニズムは、正常な宿主コード化タンパク質の変化を伴うことが提唱されている。前記タンパク質は、自己増殖能力を有する異常型ＰｒＰＳｃへの構造変化を起こす。この変化のはっきりとした原因は、現時点では不明である。異常型タンパク質は、体内では効果的に破壊されず、特定の組織（特に神経細胞）中に蓄積し、最終的には細胞死などの組織損傷を引き起こす。一旦、神経組織の著しい損傷が生じると、臨床兆候が観察される。
【０００６】
一般的に、プリオン病は伝染性が高いと考えられていないにも関わらず、プリオン病は、或る種内で、及び特定の条件下で或る種から他の種へ、感染することができる。現在までに、プリオン病が、例えば脳、脊髄、脳脊髄液及び眼などの高リスク組織を介して感染し得ることが分かっている。硬膜移植、角膜移植、心膜同種移植、ヒトゴナドトロピン及びヒト成長ホルモン汚染を介しての感染を含む医原性感染もまた報告されている。医療用器具を介しての感染もまた報告されている。例えば、プリオンに感染した患者の手術処置後に、プリオンを含む残存物が、外科用器具（特に、脳神経外科用器具および眼科用器具）、深部電極、及び手術中に中枢神経系に極めて近接して使用される他の器具上に残留していることがある。また、主にヨーロッパでは、高リスク群に、ウシや牛肉と接触する、獣医、食肉処理場の作業員、精肉業者も含まれ得るという懸念もある。
【０００７】
現在、プリオンを破壊するための従来の汚染除去方法及び滅菌方法の効果について、多くの推測がなされている。上述したように、プリオンは、周知のことだが非常に耐性が高く、定期的な汚染除去方法及び滅菌方法に対して耐性を示す。エチレン酸化物、プロピオラクトン、過酸化水素、ヨードフォア、過酢酸、カオトロピック及びフェノールなどの従来の病院用殺菌剤は、プリオン感染にはほとんど効果がない。さらに、感染性プリオンは、ＵＶ照射、アルデヒド固定、煮沸、１２１℃での標準重力オートクレービング、及び洗浄可溶化に対して耐性を示す。また、プリオンは、比較的高い温度に非常に長期間曝すことによって不活性化させることができるが、バクテリアの殺滅及びウイルスの不活性化に一般的に使用される温度範囲及び期間はプリオンを不活性化させるには不十分である。さらに、プリオンは核酸を持たないので、ＤＮＡまたはＲＮＡの破壊または損傷により作用する従来の滅菌方法もまた、プリオンに対しては効果がない。
【０００８】
プリオンを不活性化させるためのいくつかの推奨方法には、焼却、長期間の蒸気オートクレービング、高濃度での水酸化ナトリウム処理及び次亜塩素酸ナトリウム処理が含まれる。しかしながら、これらの積極的な処理は、多くの場合、高価な医療用器具及び外科用器具（特に可撓性内視鏡）や、プラスチック部品、真ちゅう部品、アルミニウム部品または非金属製部品を有する他の器具には適合しない。そのような器具の多くは、高温に曝すと損傷を受ける。また、一般的に、強アルカリなどで化学的に処理すると、医療用器具の材料または表面に損傷を与える。
【０００９】
これらの制約により、外科用機器または歯科用機器におけるプリオン汚染除去は、多くの場合、ＣＪＤ感染の疑いがある患者の処置後にのみ行われる。通常は、他の全ての患者の処置後に器具を滅菌するのに使用されるような、例えば定期的なオートクレービングなどの標準的な手法では、プリオンを不活性化させることはできない。汚染除去に関する前記問題点のために、脳外科手術に用いられる外科用器具は、好ましくは、１回だけの使用にすべきである提案されている。しかし、これは、高価になることに加えて廃棄のリスクも意味するため、実用的ではない。プリオンの破壊に必要とされる前記厳しい条件はまた、例えば手術環境または食肉加工環境などにおいて、表面の清浄を困難にする。さらに、前記厳しい条件は、殺菌される器具を使用して作業する人員に対する特別な配慮及び安全な手順を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、プリオンの破壊または不活性化のために従来必要とされている厳しい条件を用いることなく、プリオンの除去に有効な清浄方法が明らかに必要である。そのような方法は、ＴＳＥの医原性感染を防止するために、全ての外科用器具におけるプリオンの定期的な汚染除去に、及び、プリオンに汚染された他の表面、懸濁液及び溶液の汚染除去に好適に使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、一般的に、表面を殺菌する方法に関する。より詳細には、本開示は、プリオン分子を破壊する方法に関する。具体的には、本発明の方法は、超音波エネルギーと酵素処理との組み合わせを用いて、プリオンを変性させかつ分解する。本発明の方法は、プリオンタンパク質またはその代替物で汚染された表面、懸濁液または溶液を処理するのに使用され得る。
【００１２】
ある態様では、本開示は、プリオンタンパク質またはその代替物で汚染された表面を殺菌する方法に関する。この方法は、前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、前記表面を、前記プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ界面活性剤を実質的に含有しない分解組成物で処理するステップとを含む。
【００１３】
他の態様では、本開示は、プリオンタンパク質またはその代替物で汚染された表面を殺菌する方法に関する。この方法は、前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、前記表面を、前記プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ約６ないし約８のｐＨを有する分解組成物で処理するステップとを含む。
【００１４】
さらなる他の態様では、本開示は、表面を殺菌する方法に関する。この方法は、前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、前記表面を、プロテアーゼ、タンパク質分解酵素及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ約６ないし約８のｐＨを有する分解組成物で処理するステップとを含む。
【００１５】
さらに別の態様では、本開示は、表面を殺菌する方法に関する。この方法は、前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、前記表面を、プロテアーゼ、タンパク質分解酵素及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ界面活性剤を実質的に含有しない分解組成物で処理するステップとを含む。
【００１６】
他の目的及び特徴は、以下に一部分において明らかにされ、一部分において指摘されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１で説明したようにして、０％（ｗ／ｖ）（レーン１）、１％（ｗ／ｖ）（レーン２）、４％（ｗ／ｖ）（レーン３）または８％（ｗ／ｖ）（レーン４）のドデシル硫酸ナトリウムで前処理した後に、プロテアーゼＫで消化したプリオン代替タンパク質（ＰＳＰ）のウェスタンブロットである。
【図２】実施例２で説明したようにして、ＰＳＰのみ（超音波処理なし、プロテイナーゼＫ消化なし）の場合（レーン１）、ＰＳＰを超音波処理し、その後にプロテイナーゼＫ消化した場合（レーン２）、ＰＳＰを超音波処理したが、プロテイナーゼＫ消化は行わなかった場合（レーン３）のウェスタンブロットである。
【図３】実施例３に記載した条件下で作成したＰＳＰ及び／またはプロテアーゼＫのサンプルのウェスタンブロットである。
【００１８】
全図面を通して、対応する参照番号は、対応する部分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、一般的に、プリオン分子を破壊するかまたはプリオンを非感染性にする方法に関する。特に、本発明の方法は、感染性プリオンで汚染された表面、溶液または懸濁液を殺菌するのに使用され得る。
【００２０】
本明細書中で使用される「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「感染性タンパク質」、「ＰｒＰＳｃタンパク質」などの用語は、ＰｒＰタンパク質の感染型ＰｒＰＳｃを指すのに互換的に使用される。本明細書中で使用される「プリオンの代替物」という用語は、βフォールディング（folding）の存在に起因して、感染性プリオンと同様に、プロテアーゼに対する耐性を有するタンパク質を指す。プリオン代替タンパク質（prion surrogate protein：ＰＳＰ）の一種は、米国ノースカロライナ州チャペルヒルのバイオリソースインターナショナル社（BioResource International, Inc.）からカタログ番号ＰＳＰ−００１として入手可能である。
【００２１】
上述したように、ＰｒＰＳｃプリオン型は、非常に高い温度、非常に高いｐＨまたは強力な化学薬品などの厳しい条件以外では、全ての条件下で破壊に対して高い耐性を有する。さらに、ＰｒＰＳｃタンパク質は、タンパク質分解酵素を含む酵素の攻撃に対して特徴的な耐性を示す。理論に拘束されることは望まないが、酵素の攻撃及びその他の一般的な殺菌方法に対するＰｒＰＳｃタンパク質の耐性は、感染性プリオンの改変されたフォールディング構造に起因すると考えられる。特に、ＰｒＰＳｃは、除去に対する耐性を高める、αヘリカル構造の数と比較して高レベルのβシート構造と、多数の分子内ジスルフィド結合とを有する。
【００２２】
多くのタンパク質は、その本来の三次元のフォールディングパターン（「二次及び三次構造」）を喪失して「変性」する傾向がある。変性には、分子内相互作用（特に水素結合及びジスルフィド結合）の崩壊と、それによる、実質的に全ての天然タンパク質が分子の少なくとも一部に有し一般的にタンパク質の活性に対して決定的に関与している二次構造の喪失が含まれる。一方、ＰｒＰＳｃタンパク質は、アンフォールディング（unfolding）に対して高い耐性を示し、それ故に、タンパク質分解酵素の攻撃に対して耐性を示す。本開示は、プリオン破壊手段を提供し、酵素がＰｒＰＳｃタンパク質にアクセスして非感染性で安全な大きさ（例えば、２７ｋＤａ以下の分子量）まで開裂するのに十分なほどにプリオンタンパク質を変性またはアンフォールディングさせることにより、この問題を解決する。
【００２３】
具体的には、本発明の方法は、プリオン分子をアンフォールディング（すなわち変性）させ、アンフォールディングさせたプリオンを非感染性断片に開裂するための、化学的作用因子と物理的作用因子との組み合わせの使用を開示する。より具体的には、本発明の方法は、超音波エネルギーと酵素処理との組み合わせを用いて、プリオンまたはプリオン代替物を変性させかつ分解する。
【００２４】
したがって、本開示の一態様では、プリオンまたはその代替物で汚染された表面などの表面（例えば外科用器具）を殺菌する方法が開示される。本明細書中では主に、プリオンで汚染された表面について説明するが、本明細書中で説明される本発明の方法は、プリオンで汚染された懸濁液や溶液などにも使用できることを理解されたい。さらに、本明細書中で説明される本発明の方法は、医療用、外科用及び食品加工用の機器を殺菌するための定期的な方法としても好適に適用される。例えば、主に、プリオンの除去に関して説明するが、本発明の方法は他の感染性微生物の除去にも有効であり得、医療用または外科用の器具もしくは機器や食品加工用装置（例えば食肉加工装置）などの表面の定期的な殺菌過程にも使用され得る。
【００２５】
具体的には、本発明の方法は、殺菌される表面を、プリオンタンパク質を変性させる手段と、プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有する分解組成物とで処理するステップを含む。前記表面は、変性手段と分解組成物とで同時に処理することができる。あるいは、前記表面は、まず変性手段で処理し、その後に、分解組成物で処理することができる。
【００２６】
有利には、プリオンで汚染された表面に、例えば超音波エネルギー、磁界、電界などのエネルギーを加えることは、プリオンの変性に有効であることが分かっている。この点において、本開示の方法を有効にするためには、プリオンの完全な変性は不要であることを理解されたい。むしろ、プリオンは、分解組成物に含まれる酵素がプリオンタンパク質にアクセスして非感染性断片に開裂するのに十分な程度まで変性させれば十分である。
【００２７】
特に好ましい実施形態では、変性は、超音波エネルギーの使用により達成される。より具体的には、処理中に、表面に超音波領域の音波を照射する。超音波処理は、高周波数の音波を利用して、液体溶液を分解する。理論に拘束されることは望まないが、この分解が微細気泡の形成及び崩壊を伴うキャビテーションを引き起こし、それにより殺菌する表面に付着しているプリオン粒子を前記表面から脱離させる大量のエネルギーが生成されると考えられている。超音波処理はまた、細胞内結合を破壊し、プリオンを変性させるように作用する。
【００２８】
超音波処理は、好ましくは少なくとも約２０ｋＨｚ、より好ましくは約２０ｋＨｚないし約３０ｋＨｚ、さらに好ましくは２４ｋＨｚの周波数で行われる。超音波処理は、好ましくは約１ワットないし約２０ワット、より好ましくは約７ワットないし約１０ワット、さらに好ましくは約８ワットないし約９ワットの出力で行われ、約３０ジュールないし約１４４０００ジュール、より好ましくは約５０００ジュールないし約３６０００ジュールのエネルギーを生成する。
【００２９】
超音波処理が行われる時間は生成されるエネルギー量に応じて様々であり得、超音波処理は、好ましくは約０．５分間ないし約１２０分間、より好ましくは約２０分間ないし約６０分間行われる。一般的に、超音波処理を行う必要がある時間は、エネルギー量の増加に伴い減少する。超音波処理は、所与の期間の連続的な超音波処理であり得るか、あるいは、所与の期間の不連続的な超音波処理であり得ることも理解されたい。不連続的な超音波処理は、オン／オフまたはオフ／オン、パルス照射とも呼ばれる。様々な適切な超音波処理装置が市販されており、とりわけ、例えば、米国コネチカット州ニュートンのソニックス社（Sonics, Inc.）から入手可能なビブラセル（Vibra Cell）ＶＣ５０５型が好適である。
【００３０】
超音波処理に加えて、プリオンの変性は、他の形態のエネルギー入力、例えば無線周波数スペクトルの放射線、磁気攪拌もしくは渦攪拌などの機械的手段からの電気機械的な放射線またはエネルギー的振動、電子ビーム照射、レーザー、電気分解などによって、または他の形態の音響エネルギーによっても誘導または補助され得る。特に好適な変性手段は、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００３１】
有利には、本明細書中で説明される本発明の方法の変性ステップは、処理される表面または器具を腐食するかまたは他の方法で損傷を与えるように作用し得るような、例えば高いまたは低いｐＨ、高温、または強力な殺菌剤もしくは化学薬品などの厳しい条件を用いることなく実施される。例えば、処理される表面（例えば、感染性プリオンで汚染された外科用器具）は、超音波処理中に、水、洗浄液、及び／または溶媒溶液、または他の非腐食性で低刺激性の薬剤の中に懸濁され得る。変性は、好ましくは約５ないし約９、より好ましくは約６ないし約８、さらに好ましくは約７．０のｐＨ、及び、約１０℃ないし約９５℃、より典型的には約２０℃ないし約５０℃、さらに典型的には約３０℃の温度で行われる。
【００３２】
上述したように、前記表面は、まず変性手段で処理され、その後に、分解組成物で処理され得る。あるいは、前記表面は、変性手段と分解組成物とで同時に処理され得る。例えば、処理される器具または表面は、変性処理前または変性処理中に、分解性組成物中に懸濁され得る。
【００３３】
上述したように、分解組成物は、プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有する。そのような活性を有する任意の酵素を使用し得る。前記酵素は、プロテアーゼ、他のタンパク質分解酵素及びそれらの組み合わせから成る群より選択するのが好ましい。適切なプロテアーゼの例には、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及びグルタミン酸プロテアーゼが含まれる。セリンプロテアーゼの具体例には、例えばプロテイナーゼＫ及びプロペラーゼ（PROPERASE）（登録商標）酵素（ジェネンコア・インターナショナル社（Genencor International, Inc）製）などのスブチリシンセリンプロテアーゼ、及び、例えばキモトリプシン、トリプシン及びエラスターゼなどのキモトリプシン様セリンプロテアーゼが含まれる。システインプロテアーゼの具体例には、パパインプロテアーゼ、カテプシンプロテアーゼ、カスパーゼプロテアーゼ及びカルパインプロテアーゼが含まれる。他の適切なプロテアーゼの例には、ケラチナーゼ及びコラゲナーゼが含まれる。ある実施形態では、前記酵素は、例えば耐熱性メタロプロテアーゼなどの耐熱性酵素であることが好ましい。随意的に、前記プロテアーゼは、シェワネラ属（Shewanella sp.）から単離させたセリンアルカリプロテアーゼなどの耐冷性プロテアーゼであり得る。
【００３４】
分解組成物は、約０．５μｇ／ｍＬないし約１５０μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１μｇ／ｍＬないし約８０μｇ／ｍＬのプロテアーゼ及び／または他のタンパク質分解酵素を含み得る。他の実施形態では、分解組成物は、約０．０１％（ｗ／ｗ）ないし約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１％（ｗ／ｗ）ないし約５％（ｗ／ｗ）、より好ましくは約３％（ｗ／ｗ）ないし約５％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ及び／または他のタンパク質分解酵素を含み得る。
【００３５】
ある好ましい実施形態では、分解組成物は、変性剤を実質的に含まない。「変性剤を実質的に含まない」とは、分解組成物に追加的な変性剤が肯定的に追加されないことを意味する。特に、特定の界面活性剤が、変性タンパク質として知られている。しかし、そのような界面活性剤は、繊細な医療用機器または殺菌される他の種類の機器に損傷を与えることもある。あるいは、そのような界面活性剤は、場合によっては、分解組成物中に存在するプロテアーゼまたはたのタンパク質分解酵素を変性させるように作用するので、酵素の効果をなくし得る。したがって、ある実施形態では、分解組成物が界面活性剤を実質的に含まないとは、分解組成物に界面活性剤が肯定的に追加されないことを意味する。
【００３６】
あるいは、場合によっては、プリオンのアンフォールディングをさらに補助するために、分解組成物中に変性を促進する薬剤を含めることが好ましいことがある。分解組成物中に追加的な変性剤を含める場合、前記追加的な変性剤は、プリオン分子を完全にアンフォールディングする必要はなく、その代わりに、上述した変性手段による処理によって達成されるアンフォールディングを補うように作用すべきである。したがって、代替実施形態では、分解組成物は、プリオンの変性を可能にする物質を含み得る。分解組成物に含有される変性剤の例には、例えば、界面活性剤、有機溶媒、無機塩、カオトロピック剤及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００３７】
適切なカオトロピック剤には、例えば、尿素、塩酸グアニジンなどが含まれる。
【００３８】
適切な有機剤には、タンパク質を変性、溶解または膨張させる傾向がある製品が含まれる。一般的に、前記製品は、完全にアンフォールディングされておらず、天然の状態とは異なる規則正しい構造を有する。ヘリカル構造（すなわち、アンフォールディング）に好適な溶媒は、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ホルムアミド、ｍ−クレゾール、ジオキサン、ＣＨＣｌ３、ピリジン、ジクロロエチレン及び２−クロロエタノールなどがある。また、このグループには、例えばアルコール、エタノール、ｎ−プロパノール、メタノール（特に０．０１％ＨＣｌとの混合物）などの、水素結合を形成する傾向が弱い溶媒も含まれる。また、例えば高濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸などの前記構造を破壊する傾向がある溶媒、並びに他の求電子性溶媒も使用することができる。
【００３９】
適切な無機塩には、タンパク質内の構造遷移を誘導することができるものが含まれる。例えば、ＬｉＢｒ、ＣａＣｌ２、ＫＳＣＮ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、ナトリウムアジドが、強力な変性剤である。これらの塩は必ずしもタンパク質を完全にアンフォールディングさせるわけではないが、残りの規則正しい構造は、例えば昇温などのエネルギー入力によって破壊され得る。ＣＮＳ−＞Ｉ−＞Ｂｒ−＞ＮＯ３−＞Ｃｌ−＞ＣＨ３ＣＯＯ−＞ＳＯ４−などのアニオンは、グアニジン塩やテトラアルキルアンモニウム塩と同様の特性を示す。しかし、（ＧｕＨ）２ＳＯ４は、特定のタンパク質を変性から保護することが分かっている。
【００４０】
ある特定の実施形態では、分解組成物は界面活性剤を含有する。界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。界面活性剤は、アニオン性界面活性剤であることが好ましい。
【００４１】
適切なアニオン性界面活性剤の例には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸、ノニルフェノールエトキシレート、アルファオレフィンスルホン酸、ラウレス硫酸アンモニウム、ラウレスエーテル硫酸アンモニウム、オクチル／デシルエーテル硫酸アンモニウム、ステアリン酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウム、硫酸オクチル、スルホン酸、スルホスクシニメイト、エーテル硫酸トリデシル、ラウレス硫酸トリエタノールアミン及びそれらの組み合わせが含まれる。アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウムであることが好ましい。
【００４２】
適切な非イオン性界面活性剤の例には、アルコキシル、エトキシレート、フタルアマート、トリグリセリド、アミド、エステル及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００４３】
適切なカチオン性界面活性剤の例には、ポリクワテルニウム１、エステル四級化合物、四級アンモニウム塩素化合物、四級アンモニウム硫酸メチル化合物及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００４４】
適切な両性イオン界面活性剤の例には、ココアミドプロピルベタイン、ラウレルアミドプロピルベタイン、ラウレルジメチルアミン酸化物、ココアミドプロピルジメチルアミン酸化物、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００４５】
分解組成物は、約０．１％（ｗ／ｗ）ないし約２０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約５％（ｗ／ｗ）ないし約１５％（ｗ／ｗ）の界面活性剤を含み得る。
【００４６】
プロテアーゼは、それ自体が酵素であることは理解されよう。しかし、前記表面の処理を本開示の変性手段と分解組成物とで同時に行った場合、あるいは、分解組成物が本明細書中に記載されているような変性剤を含有する場合、分解組成物中に存在するタンパク質分解酵素は変性手段または追加的な変性剤によって不活性化されないことが分かっている。このことは、実施例３で説明される結果に示されている。特定の理論に拘束されることは望まないが、分解組成物中に存在するタンパク質分解酵素は、分解されるプリオンと結合したときに安定化されると考えられる。
【００４７】
それでも、特定の実施形態では、変性手段または追加的な変性剤によって分解組成物中に存在する酵素が変性及び不活性化することを防止するために、分解組成物中に安定化剤を含めることが望ましい。適切な安定化剤の例には、カルシウム及びマグネシウムなどの二価金属、ホウ素、ジオキサン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ピリジン、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、サッカロース、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩など、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００４８】
一般的に、分解組成物は、水も含有する。分解組成物は、追加的な界面活性剤、防腐剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、芳香剤、酵素安定化剤、プロテアーゼ安定化剤、乳化剤など、及びそれらの組み合わせの他の成分をさらに含有することができる。ある特定の実施形態では、分解組成物は、約５％（ｗ／ｗ）ないし約１５％（ｗ／ｗ）の界面活性剤（例えばノニルフェノールエトキシレート）、約１５％（ｗ／ｗ）ないし約３０％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ安定化剤（例えばプロピレングリコール）、約５％（ｗ／ｗ）ないし約１０％（ｗ／ｗ）の乳化剤（例えばトリエタノールアミン）、約２％（ｗ／ｗ）ないし約５％（ｗ／ｗ）の酵素安定化剤（例えばホウ素）、約０％（ｗ／ｗ）ないし約３％（ｗ／ｗ）の防腐剤（例えば抗菌剤）、約３％（ｗ／ｗ）ないし約５％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ、約０％（ｗ／ｗ）ないし約０．１％（ｗ／ｗ）の芳香油、及び約７％（ｗ／ｗ）ないし約７．５％（ｗ／ｗ）のｐＨ調整剤（例えば酢酸）を含み、残りには水を含む。
【００４９】
分解組成物中に含有され得る追加的な乳化剤の例には、トリエタノールアミン、アルギン酸塩、酒石酸塩、カラギーナン、ソルビトール、ポリソルベートなど、及びそれらの組み合わせなどが含まれる。
【００５０】
一般的に、分解組成物のｐＨは、中性または中性付近であることが好ましい。上述したように、高いまたは低いｐＨを有する分解組成物が、プリオンの除去に効果的であり得るが、そのような組成物は、清浄される非金属製の基板及び医療用、外科用またはその他の器具を腐食する、脆弱にするかまたは他の方法で損傷を与え得る。強アルカリまたは強酸の消毒組成物の損傷効果は、それらの組成物が繰り返して長時間に渡って使用される場合に特に見られる。
【００５１】
有利には、本開示は、ｐＨが中性または中性付近の分解組成物を提供することにより、これらの懸念を解決する。したがって、本開示の分解組成物は、好ましくは約５ないし約９のｐＨ、より好ましくは約６ないし約８のｐＨ、さらに好ましくは約７．０のｐＨを有する。
【００５２】
典型的には、分解組成物の温度は、約１０℃ないし約９５℃、より典型的には約２０℃ないし約５０℃、さらに典型的には約３０℃である。
【００５３】
前記表面を分解組成物で処理する時間は様々であり得、典型的には約０．５分間ないし約１２０分間、より好ましくは約２０分間ないし約６０分間である。
【００５４】
本明細書中で説明した方法は、プリオンで汚染された表面、懸濁液、溶液などを殺菌する方法としてだけではなく、表面を殺菌する一般的な方法としても適用される。本明細書中で使用される「表面」という用語は、一般的に、金属及び非金属表面、並びに、医療用、外科用及び／または歯科用器具、機器、装置などの器具の表面を含むことを意味する。また、「表面」という用語は、食品加工面及び装置（例えば食肉加工装置）、並びに、処理される肉（例えば家畜及び野生動物の肉）も含む。
【００５５】
以上、本開示について詳細に説明したが、添付された特許請求の範囲に規定された本発明の範囲から逸脱しない範囲で種々の変更が可能であることは明らかである。
【実施例】
【００５６】
以下の非限定的な例は、本開示のさらなる説明のために提供される。
【００５７】
実施例１：プリオン代替タンパク質の安定性
【００５８】
この実施例では、プリオンモデルとしてのプリオン代替タンパク質（ＰＳＰ）の安定性を評価した。特に、ＰＳＰは、感染性哺乳類プリオンの構造的特徴を複製すると報告されている。この実施例では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）による感染性哺乳類プリオンの変性に好適であることが知られている条件下で、ＰＳＰの安定性を試験した。
【００５９】
５０μｇ／ｍｌのＰＳＰ（米国ノースカロライナ州チャペルヒルのバイオリソースインターナショナル社（BioResource International, Inc.）からカタログ番号ＰＳＰ−００１として入手可能）を、０％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）または８％（ｗ／ｖ）のいずれかのＳＤＳで２０分間処理した。ＰＳＰのみを含有するサンプル（０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に懸濁させた。その後、以下の手順を用いて、ＰＳＰサンプルをプロテイナーゼＫで消化した。
【００６０】
ＰＳＰ：プロテイナーゼＫを１００：１の比率にして、１０μｇの各サンプルをプロテイナーゼＫで消化した。プロテイナーゼＫでの消化は、３７℃で３０分間行った。３７℃に加熱した８μＬ、０．５Ｍのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を加えることによって、前記消化を停止させた。ウェスタンブロット法によってサンプルを可視化した。
【００６１】
ウェスタンブロット法は、イミュンスター（Immun-Star、登録商標）化学発光ブロッティングキット（米国カリフォルニア州ハーキュリーズのバイド・ラッド社（Bio-Rad）から入手可能）の取扱説明書に記載されている手順に従って実施される。特に指定がない限り、ウェスタンブロット法分析に使用された試薬は、イミュンスター化学発光ブロッティングキットに備え付けられているものである。
【００６２】
まず、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、サンプルを電気泳動させた。５μｇの各サンプルを、２×ＳＤＳサンプル緩衝液（ノベックス（Novex）・トリス・グリシンＳＤＳサンプル緩衝液（２×））（米国カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社（Invitrogen）から入手可能）で１：１に希釈し、その後、１００℃で１２分間煮沸した。サンプルを、４〜１２％のビス−トリスアクリルアミド・ゲル（米国カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社から入手可能）上に載置し、色素の先頭がゲルの底面に達するまで、３０ｍＡで電気泳動させた。支持板からゲルを取り出し、５０％メタノール・１０％酢酸・４０％水の混合液中に１５分間浸漬させ、その後、クマシーブルー染色液で染色し、その後、タンパク質結合が区別できるようになるまで４５％メタノール・１０％酢酸・４５％水で脱色した。
【００６３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質をニトロセルロース膜上に転写して一晩置いた。前記膜を、５％の脱脂乳とトリス緩衝食塩水／０．１％トウィーン（Tween）２０との混合溶液中に浸漬させ、１：３０００の比率で希釈した一次抗体（米国カリフォルニア州ハーキュリーズのバイド・ラッド・インターナショナル社製）と共に緩やかに攪拌しながら一晩培養した。翌日、前記膜を、トリス緩衝食塩水／０．１％トウィーン２０で各１０分間洗浄した（洗浄は６回行った）。各回の洗浄毎に洗浄液を交換した。前記膜を１：２００００の比率で希釈した二次抗体中で６０分間培養し、その後再び、前記膜を上述したような１０分間の洗浄を６回行った。前記膜を、イミュンスター（登録商標）キット（バイド・ラッド・インターナショナル社製）に備え付けられている化学発光基質と共に５分間培養し、米国カリフォルニア州サンリアンドロのアルファイノテック社（Alpha Innotech）製のソフトウエア及び装置を使用して画像化した。その結果を図１に示す。
【００６４】
図１から分かるように、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで前処理したサンプル（レーン２）には、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで前処理したサンプル（レーン３）よりも、多量のＰＳＰが残留した。一方、８％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで処理したサンプル（レーン４）にはＰＳＰは残留しなかった。ＰＳＰのみを含有するサンプル（０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）の結果は、レーン１に示す。４％（ｗ／ｖ）の最小濃度でのＳＤＳの使用は感染性プリオンを変性させるための信頼性が高い方法であると報告されているので、これらの結果は、ＳＤＳ変性の条件下でも、ＰＳＰが感染性プリオンと同様に反応することを示唆する。
【００６５】
実施例２：プリオン代替タンパク質の安定性に対する超音波処理の効果
【００６６】
この実施例では、プリオン代替タンパク質（ＰＳＰ）は、プリオン変性の誘導に対する超音波エネルギーの効果を実証するために使用した。特に、ＰＳＰを超音波エネルギーで連続的に処理し、その後、プロテイナーゼＫで処理した場合の、プリオンの破壊に対する効果を評価した。
【００６７】
５０μｇのＰＳＰ（米国ノースカロライナ州チャペルヒルのバイオリソースインターナショナル社からカタログ番号ＰＳＰ−００１として入手可能）を、２つの滅菌ポリスチレン製試験チューブ（５ｍＬ）に加え、米国コネチカット州ニュートンのソニックス社（Sonics, Inc.）から入手可能なビブラセル（Vibra Cell）ＶＣ５０５型を使用して超音波処理した。超音波処理は、３６％の出力で、６０分間行った（約９ワットで連続的に、３５９４０ジュールのエネルギー）。その後、ＰＳＰサンプルを、プロテイナーゼＫで消化するか、または、超音波に曝露させた後にプロテイナーゼＫで処理したサンプルと同量になるように十分な量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液と混合させた。プロテイナーゼＫでの消化は、以下の手順を用いて行った。
【００６８】
ＰＳＰ：プロテイナーゼＫを１００：１の比率にして、１０μｇの超音波処理されたＰＳＰをプロテイナーゼＫで消化した。プロテイナーゼＫでの消化は、３７℃で３０分間行った。３７℃に加熱した８μＬの０．５Ｍのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を加えることによって、前記消化を停止させた。実施例１で説明したようにして、ウェスタンブロット法によってサンプルを可視化した。
【００６９】
その結果を図２に示す。レーン１は、ＰＳＰのみの場合（超音波での前処理及びプロテイナーゼＫでの消化は行っていない）の結果を示す。レーン２は、ＰＳＰを超音波処理で１時間前処理し、その後、プロテイナーゼＫで消化した場合の結果を示す。レーン３は、ＰＳＰを超音波処理で１時間前処理し、その後、ＰＢＳを加えた場合の結果を示す。これらの結果から分かるように、レーン２（症音波照射＋プロテイナーゼＫ消化）にはＰＳＰは検出されなかった。このことは、ＰＳＰを超音波に曝露させると（約〜９ワットで連続的に、３５９４０ジュールのエネルギー）、プロテイナーゼＫ消化に対して敏感にするほど十分にＰＳＰを変性させることを示す。
【００７０】
実施例３：プリオン代替タンパク質の安定性に対する超音波処理の効果
【００７１】
この実施例では、プリオン代替タンパク質（ＰＳＰ）を超音波エネルギー及び／またはプロテアーゼで連続的または同時に処理した場合の、プリオンの破壊に対する効果を評価した。
【００７２】
ＰＳＰ（米国ノースカロライナ州チャペルヒルのバイオリソースインターナショナル社からカタログ番号ＰＳＰ−００１として入手可能）を使用して、ウェスタンブロット分析用のサンプルを１０個作成した。サンプルは、次のようにして作成した。超音波処理は、約８ワットで連続的に、９３４０ジュールのエネルギーで行った。特に指定がない限り、超音波処理及びプロテアーゼ消化の他の条件は、実施例２で説明したのと同様である。
【００７３】
サンプル１：未処理ＰＳＰ。
【００７４】
サンプル２：５０μｇのＰＳＰ。超音波処理を２０分間行った。プロテアーゼ処理は行わなかった。
【００７５】
サンプル３：５０μｇのＰＳＰ。超音波処理を２０分間行い、その後、プロテアーゼＫで消化した（ＰＳＰ：プロテアーゼＫの比率は１００：１）。
【００７６】
サンプル４：５０μｇのＰＳＰ。超音波処理を２０分間行った。超音波処理中にプロテアーゼＫ（ＰＳＰ：プロテアーゼＫの濃度は１００：１）を加えた。プロテアーゼ消化は３０分間継続した。
【００７７】
サンプル５：５０μｇのＰＳＰ。超音波処理を２０分間行った。超音波処理中にプロテアーゼＫ（ＰＳＰ：プロテアーゼＫの濃度は１００：１）を加えた。消化を停止させる前に、プロテアーゼ消化をさらに３０分間継続した。
【００７８】
サンプル６：５０μｇのＰＳＰ。超音波処理を２０分間行った。超音波処理中にプロテアーゼ（濃度は不明）を加えた。
【００７９】
サンプル７：ＰＳＰ無し。サンプルには、分子量マーカーである７μＬのベンチマーク（Bench Mark）（米国カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）が含有されていた。
【００８０】
実施例１に説明したようにして、ウェスタンブロット法によってサンプルを可視化した。その結果を図３及び表１に示す。表１において、「＋」はＰＳＰが検出されたことを示し、「−」はＰＳＰが検出されなかったことを示す。サンプル１〜７の結果は、図３のレーン１〜７にそれぞれ示す。
【００８１】
【表１】
【００８２】
これらの結果から分かるように、超音波とプロテアーゼで同時に処理したサンプル中（レーン４、５、６を参照）、または超音波とそれに続くプロテアーゼ消化で連続的に処理したサンプル中（レーン３参照）にはＰＳＰは検出されなかった。これらの結果は、ＰＳＰを超音波エネルギー及びプロテアーゼで同時に処理する方法も連続的に処理する方法も、プリオンの破壊に効果的であることを示す。
【００８３】
本開示またはその好適な実施形態の要素を説明するとき、「冠詞（a、an、the）」及び「前記（said）」は、１つまたはそれ以上の要素が存在し得ることを意味する。「含む、含有する（comprising、including）」及び「有する（having）」という用語は、包含的であることを意図し、記載されていない追加の要素が存在し得ることを意味する。
【００８４】
以上のことを考慮すると、本発明のいくかの目的が達成されたこと及び他の有利な結果が得られたことが分かるであろう。
【００８５】
本発明の範囲から逸脱しない範囲で種々の変更が可能であるので、上記の説明に含まれる及び添付図面に示される全ての事項は、例示的で非限定的な意味で解釈されるべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、表面を殺菌する方法に関し、特に、プリオン分子を破壊する方法に関する。より具体的には、本発明の方法は、超音波エネルギーと酵素処理との組み合わせを用いてプリオンを変性させかつ分解する。本発明の方法は、プリオンまたはその代替物で汚染された表面、懸濁液または溶液を処理するのに使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
バクテリア、真菌、寄生虫、ウイルス及びウイロイドなどの感染性因子の多くは、様々な形態の殺菌及び滅菌（例えば、蒸気滅菌、乾燥滅菌、低温滅菌、ろ過滅菌、エチレン酸化物、グルタルアルデヒド、フェノールまたは他の化学殺菌剤による処理、放射線照射など）を含む十分に確立された制御方法を有する。
【０００３】
ここ数年間、プリオン（タンパク性感染粒子）と呼ばれる新たな以前は未知であった新型病原体が出現し、科学刊行物に報告されている。プリオンが原因と思われる比較的類似する神経疾患が多数、ヒトと動物の両方において確認されている。これらの疾患は、一般的に、伝達性海綿状脳症（transmissible spongiform encephalopathy：ＴＳＥ）と呼ばれている。ＴＳＥには、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（Creutzfeldt-Jakob disease：ＣＪＤ）、変異型ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）、クールー（Ｋｕｒｕ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（Gerstmann-Straussler-Scheinker disease：ＧＳＳ）及び致死性家族性不眠症（fatal familial insomnia：ＦＦＩ）、ウシにおける牛海綿状脳症（bovine spongiform encephalopathy：ＢＳＥ）（「狂牛病」としても知られている）、ヒツジ及びヤギにおけるスクレピー（scrapie）、並びに、ヘラジカ及びシカにおける慢性消耗病（chronic wasting disease：ＣＷＤ）が含まれる。これらの疾患は全て、上記の特定の疾患に感染しやすい動物の神経器官を攻撃する。これらの疾患は、初期の長い潜伏期間、その後の短期間の神経症状（認知症及び協調運動障害を含む）、及び最終的な死によって特徴付けられる。
【０００４】
プリオンの構造についての研究が精力的に行われており、様々な異なる見解が示されている。プリオンが非常に小さいウイルスであると考えている科学者も一部いるが、現在、ほとんどの専門家は、実際のところプリオンはＤＮＡまたはＲＮＡコアを持たない感染性タンパク質であると考えている。より具体的には、感染性プリオンは、ホストにおいて通常見られるタンパク質（すなわち、「プロテアーゼ耐性タンパク質（protease-resistant protein：ＰｒＰ）」）の異常型であると考えられている。哺乳類のＰｒＰ遺伝子は、溶解性の非疾病性細胞型ＰｒＰＣまたは不溶性の疾病型ＰｒＰＳｃであり得るタンパク質を発現する。多くの証拠が、プリオン病が、正常な細胞型から異常型ＰｒＰＳｃへの形質転換に起因することを示している。前記２つの型のアミノ酸配列には、検出可能な差異はない。感染性プリオンは、主としてその３次元構造によって、細胞性プリオンタンパク質と区別される。特に、細胞性プリオンタンパク質は、主にαヘリックス構造から構成されており、βシートをほとんど含まない。しかし、ＰｒＰＳｃは、改変された立体構造を持ち、具体的には、厳しい条件以外の全ての条件下でＰｒＰＳｃの耐性を高める高レベルのβシート構造及び多数の分子内ジスルフィド結合を有する。
【０００５】
プリオン病の発症メカニズムは、正常な宿主コード化タンパク質の変化を伴うことが提唱されている。前記タンパク質は、自己増殖能力を有する異常型ＰｒＰＳｃへの構造変化を起こす。この変化のはっきりとした原因は、現時点では不明である。異常型タンパク質は、体内では効果的に破壊されず、特定の組織（特に神経細胞）中に蓄積し、最終的には細胞死などの組織損傷を引き起こす。一旦、神経組織の著しい損傷が生じると、臨床兆候が観察される。
【０００６】
一般的に、プリオン病は伝染性が高いと考えられていないにも関わらず、プリオン病は、或る種内で、及び特定の条件下で或る種から他の種へ、感染することができる。現在までに、プリオン病が、例えば脳、脊髄、脳脊髄液及び眼などの高リスク組織を介して感染し得ることが分かっている。硬膜移植、角膜移植、心膜同種移植、ヒトゴナドトロピン及びヒト成長ホルモン汚染を介しての感染を含む医原性感染もまた報告されている。医療用器具を介しての感染もまた報告されている。例えば、プリオンに感染した患者の手術処置後に、プリオンを含む残存物が、外科用器具（特に、脳神経外科用器具および眼科用器具）、深部電極、及び手術中に中枢神経系に極めて近接して使用される他の器具上に残留していることがある。また、主にヨーロッパでは、高リスク群に、ウシや牛肉と接触する、獣医、食肉処理場の作業員、精肉業者も含まれ得るという懸念もある。
【０００７】
現在、プリオンを破壊するための従来の汚染除去方法及び滅菌方法の効果について、多くの推測がなされている。上述したように、プリオンは、周知のことだが非常に耐性が高く、定期的な汚染除去方法及び滅菌方法に対して耐性を示す。エチレン酸化物、プロピオラクトン、過酸化水素、ヨードフォア、過酢酸、カオトロピック及びフェノールなどの従来の病院用殺菌剤は、プリオン感染にはほとんど効果がない。さらに、感染性プリオンは、ＵＶ照射、アルデヒド固定、煮沸、１２１℃での標準重力オートクレービング、及び洗浄可溶化に対して耐性を示す。また、プリオンは、比較的高い温度に非常に長期間曝すことによって不活性化させることができるが、バクテリアの殺滅及びウイルスの不活性化に一般的に使用される温度範囲及び期間はプリオンを不活性化させるには不十分である。さらに、プリオンは核酸を持たないので、ＤＮＡまたはＲＮＡの破壊または損傷により作用する従来の滅菌方法もまた、プリオンに対しては効果がない。
【０００８】
プリオンを不活性化させるためのいくつかの推奨方法には、焼却、長期間の蒸気オートクレービング、高濃度での水酸化ナトリウム処理及び次亜塩素酸ナトリウム処理が含まれる。しかしながら、これらの積極的な処理は、多くの場合、高価な医療用器具及び外科用器具（特に可撓性内視鏡）や、プラスチック部品、真ちゅう部品、アルミニウム部品または非金属製部品を有する他の器具には適合しない。そのような器具の多くは、高温に曝すと損傷を受ける。また、一般的に、強アルカリなどで化学的に処理すると、医療用器具の材料または表面に損傷を与える。
【０００９】
これらの制約により、外科用機器または歯科用機器におけるプリオン汚染除去は、多くの場合、ＣＪＤ感染の疑いがある患者の処置後にのみ行われる。通常は、他の全ての患者の処置後に器具を滅菌するのに使用されるような、例えば定期的なオートクレービングなどの標準的な手法では、プリオンを不活性化させることはできない。汚染除去に関する前記問題点のために、脳外科手術に用いられる外科用器具は、好ましくは、１回だけの使用にすべきである提案されている。しかし、これは、高価になることに加えて廃棄のリスクも意味するため、実用的ではない。プリオンの破壊に必要とされる前記厳しい条件はまた、例えば手術環境または食肉加工環境などにおいて、表面の清浄を困難にする。さらに、前記厳しい条件は、殺菌される器具を使用して作業する人員に対する特別な配慮及び安全な手順を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、プリオンの破壊または不活性化のために従来必要とされている厳しい条件を用いることなく、プリオンの除去に有効な清浄方法が明らかに必要である。そのような方法は、ＴＳＥの医原性感染を防止するために、全ての外科用器具におけるプリオンの定期的な汚染除去に、及び、プリオンに汚染された他の表面、懸濁液及び溶液の汚染除去に好適に使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、一般的に、表面を殺菌する方法に関する。より詳細には、本開示は、プリオン分子を破壊する方法に関する。具体的には、本発明の方法は、超音波エネルギーと酵素処理との組み合わせを用いて、プリオンを変性させかつ分解する。本発明の方法は、プリオンタンパク質またはその代替物で汚染された表面、懸濁液または溶液を処理するのに使用され得る。
【００１２】
ある態様では、本開示は、プリオンタンパク質またはその代替物で汚染された表面を殺菌する方法に関する。この方法は、前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、前記表面を、前記プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ界面活性剤を実質的に含有しない分解組成物で処理するステップとを含む。
【００１３】
他の態様では、本開示は、プリオンタンパク質またはその代替物で汚染された表面を殺菌する方法に関する。この方法は、前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、前記表面を、前記プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ約６ないし約８のｐＨを有する分解組成物で処理するステップとを含む。
【００１４】
さらなる他の態様では、本開示は、表面を殺菌する方法に関する。この方法は、前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、前記表面を、プロテアーゼ、タンパク質分解酵素及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ約６ないし約８のｐＨを有する分解組成物で処理するステップとを含む。
【００１５】
さらに別の態様では、本開示は、表面を殺菌する方法に関する。この方法は、前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、前記表面を、プロテアーゼ、タンパク質分解酵素及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ界面活性剤を実質的に含有しない分解組成物で処理するステップとを含む。
【００１６】
他の目的及び特徴は、以下に一部分において明らかにされ、一部分において指摘されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１で説明したようにして、０％（ｗ／ｖ）（レーン１）、１％（ｗ／ｖ）（レーン２）、４％（ｗ／ｖ）（レーン３）または８％（ｗ／ｖ）（レーン４）のドデシル硫酸ナトリウムで前処理した後に、プロテアーゼＫで消化したプリオン代替タンパク質（ＰＳＰ）のウェスタンブロットである。
【図２】実施例２で説明したようにして、ＰＳＰのみ（超音波処理なし、プロテイナーゼＫ消化なし）の場合（レーン１）、ＰＳＰを超音波処理し、その後にプロテイナーゼＫ消化した場合（レーン２）、ＰＳＰを超音波処理したが、プロテイナーゼＫ消化は行わなかった場合（レーン３）のウェスタンブロットである。
【図３】実施例３に記載した条件下で作成したＰＳＰ及び／またはプロテアーゼＫのサンプルのウェスタンブロットである。
【００１８】
全図面を通して、対応する参照番号は、対応する部分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、一般的に、プリオン分子を破壊するかまたはプリオンを非感染性にする方法に関する。特に、本発明の方法は、感染性プリオンで汚染された表面、溶液または懸濁液を殺菌するのに使用され得る。
【００２０】
本明細書中で使用される「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「感染性タンパク質」、「ＰｒＰＳｃタンパク質」などの用語は、ＰｒＰタンパク質の感染型ＰｒＰＳｃを指すのに互換的に使用される。本明細書中で使用される「プリオンの代替物」という用語は、βフォールディング（folding）の存在に起因して、感染性プリオンと同様に、プロテアーゼに対する耐性を有するタンパク質を指す。プリオン代替タンパク質（prion surrogate protein：ＰＳＰ）の一種は、米国ノースカロライナ州チャペルヒルのバイオリソースインターナショナル社（BioResource International, Inc.）からカタログ番号ＰＳＰ−００１として入手可能である。
【００２１】
上述したように、ＰｒＰＳｃプリオン型は、非常に高い温度、非常に高いｐＨまたは強力な化学薬品などの厳しい条件以外では、全ての条件下で破壊に対して高い耐性を有する。さらに、ＰｒＰＳｃタンパク質は、タンパク質分解酵素を含む酵素の攻撃に対して特徴的な耐性を示す。理論に拘束されることは望まないが、酵素の攻撃及びその他の一般的な殺菌方法に対するＰｒＰＳｃタンパク質の耐性は、感染性プリオンの改変されたフォールディング構造に起因すると考えられる。特に、ＰｒＰＳｃは、除去に対する耐性を高める、αヘリカル構造の数と比較して高レベルのβシート構造と、多数の分子内ジスルフィド結合とを有する。
【００２２】
多くのタンパク質は、その本来の三次元のフォールディングパターン（「二次及び三次構造」）を喪失して「変性」する傾向がある。変性には、分子内相互作用（特に水素結合及びジスルフィド結合）の崩壊と、それによる、実質的に全ての天然タンパク質が分子の少なくとも一部に有し一般的にタンパク質の活性に対して決定的に関与している二次構造の喪失が含まれる。一方、ＰｒＰＳｃタンパク質は、アンフォールディング（unfolding）に対して高い耐性を示し、それ故に、タンパク質分解酵素の攻撃に対して耐性を示す。本開示は、プリオン破壊手段を提供し、酵素がＰｒＰＳｃタンパク質にアクセスして非感染性で安全な大きさ（例えば、２７ｋＤａ以下の分子量）まで開裂するのに十分なほどにプリオンタンパク質を変性またはアンフォールディングさせることにより、この問題を解決する。
【００２３】
具体的には、本発明の方法は、プリオン分子をアンフォールディング（すなわち変性）させ、アンフォールディングさせたプリオンを非感染性断片に開裂するための、化学的作用因子と物理的作用因子との組み合わせの使用を開示する。より具体的には、本発明の方法は、超音波エネルギーと酵素処理との組み合わせを用いて、プリオンまたはプリオン代替物を変性させかつ分解する。
【００２４】
したがって、本開示の一態様では、プリオンまたはその代替物で汚染された表面などの表面（例えば外科用器具）を殺菌する方法が開示される。本明細書中では主に、プリオンで汚染された表面について説明するが、本明細書中で説明される本発明の方法は、プリオンで汚染された懸濁液や溶液などにも使用できることを理解されたい。さらに、本明細書中で説明される本発明の方法は、医療用、外科用及び食品加工用の機器を殺菌するための定期的な方法としても好適に適用される。例えば、主に、プリオンの除去に関して説明するが、本発明の方法は他の感染性微生物の除去にも有効であり得、医療用または外科用の器具もしくは機器や食品加工用装置（例えば食肉加工装置）などの表面の定期的な殺菌過程にも使用され得る。
【００２５】
具体的には、本発明の方法は、殺菌される表面を、プリオンタンパク質を変性させる手段と、プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有する分解組成物とで処理するステップを含む。前記表面は、変性手段と分解組成物とで同時に処理することができる。あるいは、前記表面は、まず変性手段で処理し、その後に、分解組成物で処理することができる。
【００２６】
有利には、プリオンで汚染された表面に、例えば超音波エネルギー、磁界、電界などのエネルギーを加えることは、プリオンの変性に有効であることが分かっている。この点において、本開示の方法を有効にするためには、プリオンの完全な変性は不要であることを理解されたい。むしろ、プリオンは、分解組成物に含まれる酵素がプリオンタンパク質にアクセスして非感染性断片に開裂するのに十分な程度まで変性させれば十分である。
【００２７】
特に好ましい実施形態では、変性は、超音波エネルギーの使用により達成される。より具体的には、処理中に、表面に超音波領域の音波を照射する。超音波処理は、高周波数の音波を利用して、液体溶液を分解する。理論に拘束されることは望まないが、この分解が微細気泡の形成及び崩壊を伴うキャビテーションを引き起こし、それにより殺菌する表面に付着しているプリオン粒子を前記表面から脱離させる大量のエネルギーが生成されると考えられている。超音波処理はまた、細胞内結合を破壊し、プリオンを変性させるように作用する。
【００２８】
超音波処理は、好ましくは少なくとも約２０ｋＨｚ、より好ましくは約２０ｋＨｚないし約３０ｋＨｚ、さらに好ましくは２４ｋＨｚの周波数で行われる。超音波処理は、好ましくは約１ワットないし約２０ワット、より好ましくは約７ワットないし約１０ワット、さらに好ましくは約８ワットないし約９ワットの出力で行われ、約３０ジュールないし約１４４０００ジュール、より好ましくは約５０００ジュールないし約３６０００ジュールのエネルギーを生成する。
【００２９】
超音波処理が行われる時間は生成されるエネルギー量に応じて様々であり得、超音波処理は、好ましくは約０．５分間ないし約１２０分間、より好ましくは約２０分間ないし約６０分間行われる。一般的に、超音波処理を行う必要がある時間は、エネルギー量の増加に伴い減少する。超音波処理は、所与の期間の連続的な超音波処理であり得るか、あるいは、所与の期間の不連続的な超音波処理であり得ることも理解されたい。不連続的な超音波処理は、オン／オフまたはオフ／オン、パルス照射とも呼ばれる。様々な適切な超音波処理装置が市販されており、とりわけ、例えば、米国コネチカット州ニュートンのソニックス社（Sonics, Inc.）から入手可能なビブラセル（Vibra Cell）ＶＣ５０５型が好適である。
【００３０】
超音波処理に加えて、プリオンの変性は、他の形態のエネルギー入力、例えば無線周波数スペクトルの放射線、磁気攪拌もしくは渦攪拌などの機械的手段からの電気機械的な放射線またはエネルギー的振動、電子ビーム照射、レーザー、電気分解などによって、または他の形態の音響エネルギーによっても誘導または補助され得る。特に好適な変性手段は、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００３１】
有利には、本明細書中で説明される本発明の方法の変性ステップは、処理される表面または器具を腐食するかまたは他の方法で損傷を与えるように作用し得るような、例えば高いまたは低いｐＨ、高温、または強力な殺菌剤もしくは化学薬品などの厳しい条件を用いることなく実施される。例えば、処理される表面（例えば、感染性プリオンで汚染された外科用器具）は、超音波処理中に、水、洗浄液、及び／または溶媒溶液、または他の非腐食性で低刺激性の薬剤の中に懸濁され得る。変性は、好ましくは約５ないし約９、より好ましくは約６ないし約８、さらに好ましくは約７．０のｐＨ、及び、約１０℃ないし約９５℃、より典型的には約２０℃ないし約５０℃、さらに典型的には約３０℃の温度で行われる。
【００３２】
上述したように、前記表面は、まず変性手段で処理され、その後に、分解組成物で処理され得る。あるいは、前記表面は、変性手段と分解組成物とで同時に処理され得る。例えば、処理される器具または表面は、変性処理前または変性処理中に、分解性組成物中に懸濁され得る。
【００３３】
上述したように、分解組成物は、プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有する。そのような活性を有する任意の酵素を使用し得る。前記酵素は、プロテアーゼ、他のタンパク質分解酵素及びそれらの組み合わせから成る群より選択するのが好ましい。適切なプロテアーゼの例には、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ及びグルタミン酸プロテアーゼが含まれる。セリンプロテアーゼの具体例には、例えばプロテイナーゼＫ及びプロペラーゼ（PROPERASE）（登録商標）酵素（ジェネンコア・インターナショナル社（Genencor International, Inc）製）などのスブチリシンセリンプロテアーゼ、及び、例えばキモトリプシン、トリプシン及びエラスターゼなどのキモトリプシン様セリンプロテアーゼが含まれる。システインプロテアーゼの具体例には、パパインプロテアーゼ、カテプシンプロテアーゼ、カスパーゼプロテアーゼ及びカルパインプロテアーゼが含まれる。他の適切なプロテアーゼの例には、ケラチナーゼ及びコラゲナーゼが含まれる。ある実施形態では、前記酵素は、例えば耐熱性メタロプロテアーゼなどの耐熱性酵素であることが好ましい。随意的に、前記プロテアーゼは、シェワネラ属（Shewanella sp.）から単離させたセリンアルカリプロテアーゼなどの耐冷性プロテアーゼであり得る。
【００３４】
分解組成物は、約０．５μｇ／ｍＬないし約１５０μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１μｇ／ｍＬないし約８０μｇ／ｍＬのプロテアーゼ及び／または他のタンパク質分解酵素を含み得る。他の実施形態では、分解組成物は、約０．０１％（ｗ／ｗ）ないし約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１％（ｗ／ｗ）ないし約５％（ｗ／ｗ）、より好ましくは約３％（ｗ／ｗ）ないし約５％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ及び／または他のタンパク質分解酵素を含み得る。
【００３５】
ある好ましい実施形態では、分解組成物は、変性剤を実質的に含まない。「変性剤を実質的に含まない」とは、分解組成物に追加的な変性剤が肯定的に追加されないことを意味する。特に、特定の界面活性剤が、変性タンパク質として知られている。しかし、そのような界面活性剤は、繊細な医療用機器または殺菌される他の種類の機器に損傷を与えることもある。あるいは、そのような界面活性剤は、場合によっては、分解組成物中に存在するプロテアーゼまたはたのタンパク質分解酵素を変性させるように作用するので、酵素の効果をなくし得る。したがって、ある実施形態では、分解組成物が界面活性剤を実質的に含まないとは、分解組成物に界面活性剤が肯定的に追加されないことを意味する。
【００３６】
あるいは、場合によっては、プリオンのアンフォールディングをさらに補助するために、分解組成物中に変性を促進する薬剤を含めることが好ましいことがある。分解組成物中に追加的な変性剤を含める場合、前記追加的な変性剤は、プリオン分子を完全にアンフォールディングする必要はなく、その代わりに、上述した変性手段による処理によって達成されるアンフォールディングを補うように作用すべきである。したがって、代替実施形態では、分解組成物は、プリオンの変性を可能にする物質を含み得る。分解組成物に含有される変性剤の例には、例えば、界面活性剤、有機溶媒、無機塩、カオトロピック剤及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００３７】
適切なカオトロピック剤には、例えば、尿素、塩酸グアニジンなどが含まれる。
【００３８】
適切な有機剤には、タンパク質を変性、溶解または膨張させる傾向がある製品が含まれる。一般的に、前記製品は、完全にアンフォールディングされておらず、天然の状態とは異なる規則正しい構造を有する。ヘリカル構造（すなわち、アンフォールディング）に好適な溶媒は、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ホルムアミド、ｍ−クレゾール、ジオキサン、ＣＨＣｌ３、ピリジン、ジクロロエチレン及び２−クロロエタノールなどがある。また、このグループには、例えばアルコール、エタノール、ｎ−プロパノール、メタノール（特に０．０１％ＨＣｌとの混合物）などの、水素結合を形成する傾向が弱い溶媒も含まれる。また、例えば高濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸などの前記構造を破壊する傾向がある溶媒、並びに他の求電子性溶媒も使用することができる。
【００３９】
適切な無機塩には、タンパク質内の構造遷移を誘導することができるものが含まれる。例えば、ＬｉＢｒ、ＣａＣｌ２、ＫＳＣＮ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、ナトリウムアジドが、強力な変性剤である。これらの塩は必ずしもタンパク質を完全にアンフォールディングさせるわけではないが、残りの規則正しい構造は、例えば昇温などのエネルギー入力によって破壊され得る。ＣＮＳ−＞Ｉ−＞Ｂｒ−＞ＮＯ３−＞Ｃｌ−＞ＣＨ３ＣＯＯ−＞ＳＯ４−などのアニオンは、グアニジン塩やテトラアルキルアンモニウム塩と同様の特性を示す。しかし、（ＧｕＨ）２ＳＯ４は、特定のタンパク質を変性から保護することが分かっている。
【００４０】
ある特定の実施形態では、分解組成物は界面活性剤を含有する。界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。界面活性剤は、アニオン性界面活性剤であることが好ましい。
【００４１】
適切なアニオン性界面活性剤の例には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸、ノニルフェノールエトキシレート、アルファオレフィンスルホン酸、ラウレス硫酸アンモニウム、ラウレスエーテル硫酸アンモニウム、オクチル／デシルエーテル硫酸アンモニウム、ステアリン酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウム、硫酸オクチル、スルホン酸、スルホスクシニメイト、エーテル硫酸トリデシル、ラウレス硫酸トリエタノールアミン及びそれらの組み合わせが含まれる。アニオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウムであることが好ましい。
【００４２】
適切な非イオン性界面活性剤の例には、アルコキシル、エトキシレート、フタルアマート、トリグリセリド、アミド、エステル及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００４３】
適切なカチオン性界面活性剤の例には、ポリクワテルニウム１、エステル四級化合物、四級アンモニウム塩素化合物、四級アンモニウム硫酸メチル化合物及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００４４】
適切な両性イオン界面活性剤の例には、ココアミドプロピルベタイン、ラウレルアミドプロピルベタイン、ラウレルジメチルアミン酸化物、ココアミドプロピルジメチルアミン酸化物、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００４５】
分解組成物は、約０．１％（ｗ／ｗ）ないし約２０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約５％（ｗ／ｗ）ないし約１５％（ｗ／ｗ）の界面活性剤を含み得る。
【００４６】
プロテアーゼは、それ自体が酵素であることは理解されよう。しかし、前記表面の処理を本開示の変性手段と分解組成物とで同時に行った場合、あるいは、分解組成物が本明細書中に記載されているような変性剤を含有する場合、分解組成物中に存在するタンパク質分解酵素は変性手段または追加的な変性剤によって不活性化されないことが分かっている。このことは、実施例３で説明される結果に示されている。特定の理論に拘束されることは望まないが、分解組成物中に存在するタンパク質分解酵素は、分解されるプリオンと結合したときに安定化されると考えられる。
【００４７】
それでも、特定の実施形態では、変性手段または追加的な変性剤によって分解組成物中に存在する酵素が変性及び不活性化することを防止するために、分解組成物中に安定化剤を含めることが望ましい。適切な安定化剤の例には、カルシウム及びマグネシウムなどの二価金属、ホウ素、ジオキサン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ピリジン、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、サッカロース、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩など、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００４８】
一般的に、分解組成物は、水も含有する。分解組成物は、追加的な界面活性剤、防腐剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、芳香剤、酵素安定化剤、プロテアーゼ安定化剤、乳化剤など、及びそれらの組み合わせの他の成分をさらに含有することができる。ある特定の実施形態では、分解組成物は、約５％（ｗ／ｗ）ないし約１５％（ｗ／ｗ）の界面活性剤（例えばノニルフェノールエトキシレート）、約１５％（ｗ／ｗ）ないし約３０％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ安定化剤（例えばプロピレングリコール）、約５％（ｗ／ｗ）ないし約１０％（ｗ／ｗ）の乳化剤（例えばトリエタノールアミン）、約２％（ｗ／ｗ）ないし約５％（ｗ／ｗ）の酵素安定化剤（例えばホウ素）、約０％（ｗ／ｗ）ないし約３％（ｗ／ｗ）の防腐剤（例えば抗菌剤）、約３％（ｗ／ｗ）ないし約５％（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ、約０％（ｗ／ｗ）ないし約０．１％（ｗ／ｗ）の芳香油、及び約７％（ｗ／ｗ）ないし約７．５％（ｗ／ｗ）のｐＨ調整剤（例えば酢酸）を含み、残りには水を含む。
【００４９】
分解組成物中に含有され得る追加的な乳化剤の例には、トリエタノールアミン、アルギン酸塩、酒石酸塩、カラギーナン、ソルビトール、ポリソルベートなど、及びそれらの組み合わせなどが含まれる。
【００５０】
一般的に、分解組成物のｐＨは、中性または中性付近であることが好ましい。上述したように、高いまたは低いｐＨを有する分解組成物が、プリオンの除去に効果的であり得るが、そのような組成物は、清浄される非金属製の基板及び医療用、外科用またはその他の器具を腐食する、脆弱にするかまたは他の方法で損傷を与え得る。強アルカリまたは強酸の消毒組成物の損傷効果は、それらの組成物が繰り返して長時間に渡って使用される場合に特に見られる。
【００５１】
有利には、本開示は、ｐＨが中性または中性付近の分解組成物を提供することにより、これらの懸念を解決する。したがって、本開示の分解組成物は、好ましくは約５ないし約９のｐＨ、より好ましくは約６ないし約８のｐＨ、さらに好ましくは約７．０のｐＨを有する。
【００５２】
典型的には、分解組成物の温度は、約１０℃ないし約９５℃、より典型的には約２０℃ないし約５０℃、さらに典型的には約３０℃である。
【００５３】
前記表面を分解組成物で処理する時間は様々であり得、典型的には約０．５分間ないし約１２０分間、より好ましくは約２０分間ないし約６０分間である。
【００５４】
本明細書中で説明した方法は、プリオンで汚染された表面、懸濁液、溶液などを殺菌する方法としてだけではなく、表面を殺菌する一般的な方法としても適用される。本明細書中で使用される「表面」という用語は、一般的に、金属及び非金属表面、並びに、医療用、外科用及び／または歯科用器具、機器、装置などの器具の表面を含むことを意味する。また、「表面」という用語は、食品加工面及び装置（例えば食肉加工装置）、並びに、処理される肉（例えば家畜及び野生動物の肉）も含む。
【００５５】
以上、本開示について詳細に説明したが、添付された特許請求の範囲に規定された本発明の範囲から逸脱しない範囲で種々の変更が可能であることは明らかである。
【実施例】
【００５６】
以下の非限定的な例は、本開示のさらなる説明のために提供される。
【００５７】
実施例１：プリオン代替タンパク質の安定性
【００５８】
この実施例では、プリオンモデルとしてのプリオン代替タンパク質（ＰＳＰ）の安定性を評価した。特に、ＰＳＰは、感染性哺乳類プリオンの構造的特徴を複製すると報告されている。この実施例では、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）による感染性哺乳類プリオンの変性に好適であることが知られている条件下で、ＰＳＰの安定性を試験した。
【００５９】
５０μｇ／ｍｌのＰＳＰ（米国ノースカロライナ州チャペルヒルのバイオリソースインターナショナル社（BioResource International, Inc.）からカタログ番号ＰＳＰ−００１として入手可能）を、０％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）または８％（ｗ／ｖ）のいずれかのＳＤＳで２０分間処理した。ＰＳＰのみを含有するサンプル（０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に懸濁させた。その後、以下の手順を用いて、ＰＳＰサンプルをプロテイナーゼＫで消化した。
【００６０】
ＰＳＰ：プロテイナーゼＫを１００：１の比率にして、１０μｇの各サンプルをプロテイナーゼＫで消化した。プロテイナーゼＫでの消化は、３７℃で３０分間行った。３７℃に加熱した８μＬ、０．５Ｍのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を加えることによって、前記消化を停止させた。ウェスタンブロット法によってサンプルを可視化した。
【００６１】
ウェスタンブロット法は、イミュンスター（Immun-Star、登録商標）化学発光ブロッティングキット（米国カリフォルニア州ハーキュリーズのバイド・ラッド社（Bio-Rad）から入手可能）の取扱説明書に記載されている手順に従って実施される。特に指定がない限り、ウェスタンブロット法分析に使用された試薬は、イミュンスター化学発光ブロッティングキットに備え付けられているものである。
【００６２】
まず、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、サンプルを電気泳動させた。５μｇの各サンプルを、２×ＳＤＳサンプル緩衝液（ノベックス（Novex）・トリス・グリシンＳＤＳサンプル緩衝液（２×））（米国カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社（Invitrogen）から入手可能）で１：１に希釈し、その後、１００℃で１２分間煮沸した。サンプルを、４〜１２％のビス−トリスアクリルアミド・ゲル（米国カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社から入手可能）上に載置し、色素の先頭がゲルの底面に達するまで、３０ｍＡで電気泳動させた。支持板からゲルを取り出し、５０％メタノール・１０％酢酸・４０％水の混合液中に１５分間浸漬させ、その後、クマシーブルー染色液で染色し、その後、タンパク質結合が区別できるようになるまで４５％メタノール・１０％酢酸・４５％水で脱色した。
【００６３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質をニトロセルロース膜上に転写して一晩置いた。前記膜を、５％の脱脂乳とトリス緩衝食塩水／０．１％トウィーン（Tween）２０との混合溶液中に浸漬させ、１：３０００の比率で希釈した一次抗体（米国カリフォルニア州ハーキュリーズのバイド・ラッド・インターナショナル社製）と共に緩やかに攪拌しながら一晩培養した。翌日、前記膜を、トリス緩衝食塩水／０．１％トウィーン２０で各１０分間洗浄した（洗浄は６回行った）。各回の洗浄毎に洗浄液を交換した。前記膜を１：２００００の比率で希釈した二次抗体中で６０分間培養し、その後再び、前記膜を上述したような１０分間の洗浄を６回行った。前記膜を、イミュンスター（登録商標）キット（バイド・ラッド・インターナショナル社製）に備え付けられている化学発光基質と共に５分間培養し、米国カリフォルニア州サンリアンドロのアルファイノテック社（Alpha Innotech）製のソフトウエア及び装置を使用して画像化した。その結果を図１に示す。
【００６４】
図１から分かるように、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで前処理したサンプル（レーン２）には、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで前処理したサンプル（レーン３）よりも、多量のＰＳＰが残留した。一方、８％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで処理したサンプル（レーン４）にはＰＳＰは残留しなかった。ＰＳＰのみを含有するサンプル（０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）の結果は、レーン１に示す。４％（ｗ／ｖ）の最小濃度でのＳＤＳの使用は感染性プリオンを変性させるための信頼性が高い方法であると報告されているので、これらの結果は、ＳＤＳ変性の条件下でも、ＰＳＰが感染性プリオンと同様に反応することを示唆する。
【００６５】
実施例２：プリオン代替タンパク質の安定性に対する超音波処理の効果
【００６６】
この実施例では、プリオン代替タンパク質（ＰＳＰ）は、プリオン変性の誘導に対する超音波エネルギーの効果を実証するために使用した。特に、ＰＳＰを超音波エネルギーで連続的に処理し、その後、プロテイナーゼＫで処理した場合の、プリオンの破壊に対する効果を評価した。
【００６７】
５０μｇのＰＳＰ（米国ノースカロライナ州チャペルヒルのバイオリソースインターナショナル社からカタログ番号ＰＳＰ−００１として入手可能）を、２つの滅菌ポリスチレン製試験チューブ（５ｍＬ）に加え、米国コネチカット州ニュートンのソニックス社（Sonics, Inc.）から入手可能なビブラセル（Vibra Cell）ＶＣ５０５型を使用して超音波処理した。超音波処理は、３６％の出力で、６０分間行った（約９ワットで連続的に、３５９４０ジュールのエネルギー）。その後、ＰＳＰサンプルを、プロテイナーゼＫで消化するか、または、超音波に曝露させた後にプロテイナーゼＫで処理したサンプルと同量になるように十分な量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液と混合させた。プロテイナーゼＫでの消化は、以下の手順を用いて行った。
【００６８】
ＰＳＰ：プロテイナーゼＫを１００：１の比率にして、１０μｇの超音波処理されたＰＳＰをプロテイナーゼＫで消化した。プロテイナーゼＫでの消化は、３７℃で３０分間行った。３７℃に加熱した８μＬの０．５Ｍのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を加えることによって、前記消化を停止させた。実施例１で説明したようにして、ウェスタンブロット法によってサンプルを可視化した。
【００６９】
その結果を図２に示す。レーン１は、ＰＳＰのみの場合（超音波での前処理及びプロテイナーゼＫでの消化は行っていない）の結果を示す。レーン２は、ＰＳＰを超音波処理で１時間前処理し、その後、プロテイナーゼＫで消化した場合の結果を示す。レーン３は、ＰＳＰを超音波処理で１時間前処理し、その後、ＰＢＳを加えた場合の結果を示す。これらの結果から分かるように、レーン２（症音波照射＋プロテイナーゼＫ消化）にはＰＳＰは検出されなかった。このことは、ＰＳＰを超音波に曝露させると（約〜９ワットで連続的に、３５９４０ジュールのエネルギー）、プロテイナーゼＫ消化に対して敏感にするほど十分にＰＳＰを変性させることを示す。
【００７０】
実施例３：プリオン代替タンパク質の安定性に対する超音波処理の効果
【００７１】
この実施例では、プリオン代替タンパク質（ＰＳＰ）を超音波エネルギー及び／またはプロテアーゼで連続的または同時に処理した場合の、プリオンの破壊に対する効果を評価した。
【００７２】
ＰＳＰ（米国ノースカロライナ州チャペルヒルのバイオリソースインターナショナル社からカタログ番号ＰＳＰ−００１として入手可能）を使用して、ウェスタンブロット分析用のサンプルを１０個作成した。サンプルは、次のようにして作成した。超音波処理は、約８ワットで連続的に、９３４０ジュールのエネルギーで行った。特に指定がない限り、超音波処理及びプロテアーゼ消化の他の条件は、実施例２で説明したのと同様である。
【００７３】
サンプル１：未処理ＰＳＰ。
【００７４】
サンプル２：５０μｇのＰＳＰ。超音波処理を２０分間行った。プロテアーゼ処理は行わなかった。
【００７５】
サンプル３：５０μｇのＰＳＰ。超音波処理を２０分間行い、その後、プロテアーゼＫで消化した（ＰＳＰ：プロテアーゼＫの比率は１００：１）。
【００７６】
サンプル４：５０μｇのＰＳＰ。超音波処理を２０分間行った。超音波処理中にプロテアーゼＫ（ＰＳＰ：プロテアーゼＫの濃度は１００：１）を加えた。プロテアーゼ消化は３０分間継続した。
【００７７】
サンプル５：５０μｇのＰＳＰ。超音波処理を２０分間行った。超音波処理中にプロテアーゼＫ（ＰＳＰ：プロテアーゼＫの濃度は１００：１）を加えた。消化を停止させる前に、プロテアーゼ消化をさらに３０分間継続した。
【００７８】
サンプル６：５０μｇのＰＳＰ。超音波処理を２０分間行った。超音波処理中にプロテアーゼ（濃度は不明）を加えた。
【００７９】
サンプル７：ＰＳＰ無し。サンプルには、分子量マーカーである７μＬのベンチマーク（Bench Mark）（米国カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン社製）が含有されていた。
【００８０】
実施例１に説明したようにして、ウェスタンブロット法によってサンプルを可視化した。その結果を図３及び表１に示す。表１において、「＋」はＰＳＰが検出されたことを示し、「−」はＰＳＰが検出されなかったことを示す。サンプル１〜７の結果は、図３のレーン１〜７にそれぞれ示す。
【００８１】
【表１】
【００８２】
これらの結果から分かるように、超音波とプロテアーゼで同時に処理したサンプル中（レーン４、５、６を参照）、または超音波とそれに続くプロテアーゼ消化で連続的に処理したサンプル中（レーン３参照）にはＰＳＰは検出されなかった。これらの結果は、ＰＳＰを超音波エネルギー及びプロテアーゼで同時に処理する方法も連続的に処理する方法も、プリオンの破壊に効果的であることを示す。
【００８３】
本開示またはその好適な実施形態の要素を説明するとき、「冠詞（a、an、the）」及び「前記（said）」は、１つまたはそれ以上の要素が存在し得ることを意味する。「含む、含有する（comprising、including）」及び「有する（having）」という用語は、包含的であることを意図し、記載されていない追加の要素が存在し得ることを意味する。
【００８４】
以上のことを考慮すると、本発明のいくかの目的が達成されたこと及び他の有利な結果が得られたことが分かるであろう。
【００８５】
本発明の範囲から逸脱しない範囲で種々の変更が可能であるので、上記の説明に含まれる及び添付図面に示される全ての事項は、例示的で非限定的な意味で解釈されるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリオンタンパク質またはその代替物で汚染された表面を殺菌する方法であって、
前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、
前記表面を、前記プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ界面活性剤を実質的に含有しない分解組成物で処理するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記酵素が、プロテアーゼ、タンパク質分解酵素及びそれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記変性手段が、超音波エネルギーであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記表面を約２０ｋＨｚないし約３０ｋＨｚの周波数の超音波エネルギーで処理することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記表面を前記変性手段で約０．５分間ないし約１２０分間処理することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記表面を前記分解組成物で約０．５分間ないし約１２０分間処理することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
前記表面を前記分解組成物で処理する前に、前記表面を前記変性手段で約０．５分間ないし約１２０分間処理することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記表面を前記変性手段と前記分解組成物とで同時に処理することを特徴とする方法。
【請求項１０】
プリオンタンパク質またはその代替物で汚染された表面を殺菌する方法であって、
前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、
前記表面を、前記プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ約６ないし約８のｐＨを有する分解組成物で処理するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記酵素が、プロテアーゼ、タンパク質分解酵素及びそれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法であって、
前記変性手段が、超音波エネルギーであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
前記表面を約２０ｋＨｚないし約３０ｋＨｚの周波数の超音波エネルギーで処理することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法であって、
前記表面を前記変性手段で約０．５分間ないし約１２０分間処理することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法であって、
前記表面を前記分解組成物で約０．５分間ないし約１２０分間処理することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法であって、
前記表面を前記分解組成物で処理する前に、前記表面を前記変性手段で約０．５分間ないし約１２０分間処理することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載の方法であって、
前記表面を前記変性手段と前記分解組成物とで同時に処理することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載の方法であって、
前記分解組成物が、変性を促進する少なくとも１つの変性促進剤をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１０に記載の方法であって、
該方法が約１０℃ないし約９５℃の温度で行われることを特徴とする方法。
【請求項１】
プリオンタンパク質またはその代替物で汚染された表面を殺菌する方法であって、
前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、
前記表面を、前記プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ界面活性剤を実質的に含有しない分解組成物で処理するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記酵素が、プロテアーゼ、タンパク質分解酵素及びそれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記変性手段が、超音波エネルギーであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記表面を約２０ｋＨｚないし約３０ｋＨｚの周波数の超音波エネルギーで処理することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記表面を前記変性手段で約０．５分間ないし約１２０分間処理することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記表面を前記分解組成物で約０．５分間ないし約１２０分間処理することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
前記表面を前記分解組成物で処理する前に、前記表面を前記変性手段で約０．５分間ないし約１２０分間処理することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記表面を前記変性手段と前記分解組成物とで同時に処理することを特徴とする方法。
【請求項１０】
プリオンタンパク質またはその代替物で汚染された表面を殺菌する方法であって、
前記表面を、超音波エネルギー、電界、磁界及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるプリオンタンパク質変性手段で処理するステップと、
前記表面を、前記プリオンタンパク質を非感染性断片に開裂するのに有効な１つ若しくは複数の酵素を含有しかつ約６ないし約８のｐＨを有する分解組成物で処理するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
前記酵素が、プロテアーゼ、タンパク質分解酵素及びそれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法であって、
前記変性手段が、超音波エネルギーであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
前記表面を約２０ｋＨｚないし約３０ｋＨｚの周波数の超音波エネルギーで処理することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法であって、
前記表面を前記変性手段で約０．５分間ないし約１２０分間処理することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法であって、
前記表面を前記分解組成物で約０．５分間ないし約１２０分間処理することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法であって、
前記表面を前記分解組成物で処理する前に、前記表面を前記変性手段で約０．５分間ないし約１２０分間処理することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載の方法であって、
前記表面を前記変性手段と前記分解組成物とで同時に処理することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載の方法であって、
前記分解組成物が、変性を促進する少なくとも１つの変性促進剤をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１０に記載の方法であって、
該方法が約１０℃ないし約９５℃の温度で行われることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５２６５５９（Ｐ２０１０−５２６５５９Ａ）
【公表日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０１６２２（Ｐ２０１０−５０１６２２）
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５１１２９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２０１４０
【国際公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【出願人】（５０４４６０４４１）キンバリー クラーク ワールドワイド インコーポレイテッド (396)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０５１１２９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２０１４０
【国際公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【出願人】（５０４４６０４４１）キンバリー クラーク ワールドワイド インコーポレイテッド (396)
【Ｆターム（参考）】
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