プロテインキナーゼＣイプシロン（ＰＫＣ−イプシロン）タンパク質レベルの、アルツハイマー病に特異的な変化
本発明は、対照対象のＰＫＣイプシロンレベルと比較したヒト患者のＰＫＣイプシロンタンパク質レベルの比の変化を検出することにより、ヒト患者においてアルツハイマー病を診断する方法に関する。本明細書中に開示されているアルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーは、アルツハイマー病の診断およびアルツハイマー病を治療または予防するための化合物を同定するためのスクリーニング法に有用である。本発明はまた、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるための方法であって、１以上のヒト細胞を、無接触のヒト細胞と比較してＰＫＣイプシロンレベルを上げるために効果的な、ある量のＰＫＣアクチベーターと接触させるステップを含む方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示全体が本明細書によって参照により本明細書中に組み込まれている、１０１０年２月２２日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／３０６，９２２号、および２０１０年７月８日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／３６２，５１２号、および２０１０年７月９日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／３６２，８９３号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、対照対象のＰＫＣイプシロンレベルと比較したヒト患者におけるＰＫＣイプシロンタンパク質レベルの比の変化を検出することにより、ヒト患者においてアルツハイマー病を診断する方法に関する。本明細書中に開示されているアルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーは、アルツハイマー病の診断およびアルツハイマー病を治療または予防するための化合物を同定するためのスクリーニング法に有用である。本発明はまた、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるための方法であって、１以上のヒト細胞を、無接触のヒト細胞と比較してＰＫＣイプシロンレベルを上げるために効果的な、ある量のＰＫＣアクチベーターと接触させるステップを含む方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
認知症の最も多くみられる形態であるアルツハイマー病（ＡＤ）は、近時記憶の喪失と共に始まり、脳における２つの主な病理学的特徴：細胞外アミロイド斑および細胞内の神経原線維変化を伴う。これらは通常、シナプシスの顕著な損失を伴う。アミロイド斑は、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼ経路によるアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の切断により生成されるＡβペプチドオリゴマーの凝集により形成され、αセクレターゼは、無毒性のシナプス形成性の可溶性ＡＰＰ−αを生成する。蓄積された監察結果により、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アイソザイム−αおよび−εは、直接的にＡＰＰのα−セクレターゼ媒介性切断を直接的に活性化し（Ｓｌａｃｋら、１９９３年；Ｋｉｎｏｕｃｈｉら、１９９５；Ｊｏｌｌｙ−ＴｏｒｎｅｔｔａおよびＷｏｌｆ、２０００年；Ｙｅｏｎら、２００１年、Ｌａｎｎｉら、２００４年）、および／または細胞外シグナル調節キナーゼのリン酸化を介して間接的に活性化する（ＥＲＫ１／２）（Ｄｅｖａｒｉら、２００６年、Ａｌｋｏｎら、２００７年）ことが示されている。ＰＫＣシグナル伝達経路は、ＡＤの神経変性病態生理における重要な事象、例えば、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）媒介性のＡβの分解などを調節していることも多くの観察結果により示されている（Ｎｅｌｓｏｎら、２００９年）。ＡＤ−遺伝子組み換えマウスにおけるＰＫＣ−εのインビボでの過剰発現は、アミロイド斑を減少させた（Ｃｈｏｉら、２００６年）。他の研究では、ＡＤに特異的な病理学的異常を、血液、皮膚線維芽細胞および眼組織を含めた脳以外の組織において発見することができるという証拠が提供された（Ｇｕｒｒｅｉｒｏら、２００７年、Ｒａｙら、２００７年）。ＡＤの皮膚線維芽細胞において、例えば、特定のＫ＋チャネル（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、１９９３年；１９９４年）、ＰＫＣアイソザイム（Ｇｏｖｏｎｉら、１９９３年、Ｆａｖｉｔら、１９９８年）、Ｃａ＋シグナル伝達（Ｉｔｏら、１９９４年）、ＭＡＰキナーゼＥｒｋｌ／２リン酸化（Ｚｈａｏら、２００２年；ＫｈａｎおよびＡｌｋｏｎ、２００６年）、およびＰＰ２Ａ（Ｚｈａｏら、２００３年）の欠陥が発見された。家族性ＡＤ患者に関して、皮膚線維芽細胞はＡβ分泌の強化を示したが（Ｃｉｔｒｏｎら、１９９４年；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、１９９４年）、その一方で、健常なヒト線維芽細胞では、特定のＫ＋チャネルのＡＤ特異的な減少が、Ａβ１−４０により誘発された（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、１９９３年；１９９４年）。最近、皮膚線維芽細胞における、病理解剖により確認された内部対照のリン酸化Ｅｒｋ１／２末梢バイオマーカーが、有望な感度および特異性を有することを示した（ＫｈａｎおよびＡｌｋｏｎ、２００６年；２０１０年）。さらなる他の研究は、ＡＤ患者の脳の特定領域におけるＰＫＣの欠損を示唆した（Ｍａｓｌｉａｈら、１９９１年）。最後に、ＰＫＣ−αおよび−εの薬理学的アクチベーターは、ＡＤのすべての病理学的および認知の異常特性から、２つの異なる系統のＡＤマウスを保護することができることも最近実証された（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、２０１１年）。これらの観察結果と一致して、ＰＫＣ−αおよび−εは、ＡＤ遺伝子組み換えマウスにおいて顕著に減少していることが判明し、ＰＫＣ−αおよび−εの薬理学的アクチベーターを用いた治療により正常レベルまで回復した（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、２０１１年）。
【０００４】
総合的に、これらおよび他の以前の研究は、２つの重要な意味を有する：Ｉ．ＡＤは、症候の因果関係が脳機能に限られる全身の病態発現であり、ＩＩ．ＰＫＣアイソザイム、特に−αおよび−εは、シナプシスの損失、Ａβおよびアミロイド斑の生成、ならびに神経原線維変化におけるタウのＧＳＫ−３β媒介性過リン酸化を含むＡＤ病態の主要な側面の調節において重要な役割を果たしている。これらの理由から、本発明者らは、定常状態レベルで、ＡＤ、年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）およびＡＤ認知症でない（非ＡＤＤ）患者の皮膚線維芽細胞のＰＫＣ−εを分析した。この報告は、可溶性Ａβオリゴマーの適用により誘発されるＰＫＣ−εならびにこれらのレベルの変化が、末梢組織におけるＡＤのための診断の基礎を提供することができることを明らかにする。
【０００５】
アルツハイマー病を診断するため、およびアルツハイマー病の治療および予防に有用な化合物をスクリーニングするための、高度に感受性で高度に特異的な試験に対する必要性が存在する。本発明者らは、これまでに知られている診断用試験と比較して高度に感受性で高度に特異的なアルツハイマー病の診断に有用な、アルツハイマー病に特異的な独自の分子バイオマーカーを初めて同定した。したがって、本明細書中に開示されている独自のアルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーは、アルツハイマー病の検出および診断に対して高度な感受性および特異性を有する診断法の基礎となる。本発明の、アルツハイマー病に特異的な独自の分子バイオマーカーはまた、アルツハイマー病の治療および予防において治療薬として使用することができる化合物を同定するためのスクリーニング法において有用である。本発明者らはまた、ヒト患者においてＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるための方法を発見した。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＰＫＣイプシロンレベルが、年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）よりも、アルツハイマー病対象（ＡＤ）において低いという驚くべき所見に基づく。特定の実施形態において、本発明は、ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、ａ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、ｂ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを、対照対象のＰＫＣイプシロンレベルと比較するステップとを含み、前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルが前記対照対象のＰＫＣイプシロンレベルより低い場合、前記方法は、前記ヒト対象におけるアルツハイマー病を示す方法を対象とする。
【０００７】
診断方法の特定の実施形態において、前記ＰＫＣイプシロンレベルは、１以上の細胞において測定される。特定の実施形態において前記ＰＫＣイプシロンレベルは、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである。特定の実施形態において、ＰＫＣイプシロンレベルは、ＲＴ−ＰＣＲにより測定される。特定の実施形態において、対照対象は、アルツハイマー病を有さない。特定の実施形態において、本発明の診断方法は、インビトロで行われる。
【０００８】
本発明の特定の好ましい実施形態において、前記１以上の細胞は、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である。
【０００９】
特定の実施形態において、ＰＫＣイプシロンステップのレベルを測定または判定するステップは、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む。
【００１０】
特定の実施形態において、前記ヒト対象の前記ＰＫＣイプシロンレベルが前記対照対象のＰＫＣイプシロンレベル以上である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される。
【００１１】
特定の好ましい実施形態において、本発明は、ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、ａ）ヒト対象から１以上の細胞を得るステップと、ｂ）前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、ｃ）ステップ（ａ）の前記１以上の細胞を、ＰＫＣイプシロンアクチベーターである薬剤と接触させるステップと、ｄ）ステップ（ｃ）の前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを、ステップ（ｃ）における前記接触の後に判定するステップとを含み、ステップ（ｄ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルより大きい場合、アルツハイマー病が前記ヒト対象において示される方法を対象とする。
【００１２】
特定の実施形態において、ステップ（ｄ）で判定された前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベル以下である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される。
【００１３】
特定の実施形態において、本発明は、ヒト対象におけるアルツハイマー病の進行を判定またはモニターする方法であって、ａ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、ｂ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを、対照対象のＰＫＣイプシロンレベルと比較するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）における前記比較に基づいて、前記アルツハイマー病の進行を判定またはモニターするステップとを含む方法を対象とする。
【００１４】
特定の実施形態において、時間と共にアルツハイマー病が進行するにつれて、前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルは低下する。
【００１５】
特定の実施形態において、アルツハイマー病の進行が逆行するにつれて、ＰＫＣイプシロンレベルは前記ヒト対象において増加する。
【００１６】
特定の好ましい実施形態において、本発明は、細胞のＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるための方法であって、１以上のヒト細胞を、無接触のヒト細胞と比較して前記細胞のＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるために効果的なある量のＰＫＣアクチベーターと接触させるステップを含む方法を対象とする。
【００１７】
特定の実施形態において、前記ヒト細胞は、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である。特定の実施形態において前記ＰＫＣアクチベーターは大環状ラクトンである。特定の実施形態において、前記大環状ラクトンはブリオスタチンである。特定の実施形態において、前記ブリオスタチンはブリオスタチン１である。特定の実施形態において、前記ＰＫＣイプシロンレベルは、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明は、ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、ａ）ヒト対象から１以上の細胞を得るステップと、ｂ）前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、ｃ）ステップ（ａ）の前記１以上の細胞をＡβペプチドと接触させるステップと、ｄ）ステップ（ｃ）の前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを、ステップ（ｃ）における前記接触の後に判定するステップとを含み、ステップ（ｄ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルと有意に異ならない場合、アルツハイマー病が前記ヒト対象において示される方法を対象とする。
【００１９】
特定の実施形態において、ステップ（ｄ）で判定された前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベル未満である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明は、ＰＫＣイプシロンに特異的な１以上の抗体を含むキットを対象とする。特定の実施形態において前記キットは、ＰＫＣアクチベーターを含み得る。特定の実施形態において、前記キットは、ＰＫＣイプシロンアクチベーターを含み得る。特定の実施形態において、前記キットは、ＰＫＣイプシロンをコードしている遺伝子に特異的な１以上のオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明は、ＰＫＣイプシロンをコードしている遺伝子に特異的な１以上のオリゴヌクレオチドを含むキットを対象とする。特定の実施形態において、前記キットは、ＰＫＣアクチベーターを含み得る。特定の実施形態において、前記キットは、ＰＫＣイプシロンアクチベーターを含み得る。
【００２２】
特定の実施形態において、本発明は、アルツハイマー病の治療に有用な化合物を同定する方法であって、ａ）アルツハイマー病対象から１以上の細胞を得ることと、ｂ）前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定することと、ｃ）前記細胞を候補化合物と接触させることと、ｄ）前記接触させるステップ（ｃ）の後に前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定することとを含み、ステップ（ｄ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルより大きい場合、前記候補化合物がアルツハイマー病の治療に有用な化合物であると同定される方法を対象とする。
【００２３】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アイソザイム、特に−αおよび−εは、シナプシスの損失、Ａβおよびアミロイド斑の生成、ならびに神経原線維変化におけるタウのＧＳＫ−３β媒介性過リン酸化を含む、ＡＤ病態の主要な側面の調節において重大な役割を果たしている。ＡＤ特異的シグナル伝達の欠損の証拠が、例えば、血液、皮膚線維芽細胞、および眼組織などの末梢組織においてこれまで発見されている。ＡＤ皮膚線維芽細胞において、ＰＫＣ−εは、正確なＡＤバイオマーカーである。
【００２４】
特定の実施形態において、ＰＫＣ−εの基本タンパク質レベルは、ＡＤ患者、年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）の症例、および非ＡＤ認知症患者の培養した皮膚線維芽細胞において、ウエスタンブロット法、蛍光抗体法によって、および転写レベルでＲＴ−ＰＣＲによって測定することができる。１１名のＡＣ、および１０名のＡＤ対象が、病理解剖において脳内にアミロイド斑および神経原線維変化が存在する散発性と家族性の両方の症例から選択される（１０例のＡＤ症例のうち９例が病理解剖で確認された）。非ＡＤの特徴の遺伝学的徴候を有する８名の遺伝性ハンチントン病（ＨＤ）患者、１名のパーキンソン病患者、および１名の前頭側頭型認知症患者を含めることによって、ＰＫＣ−εの欠如は、ＡＤ病態のみによるものであることを確証する。
【００２５】
すべてのＡＤ線維芽細胞のＰＫＣ−εレベルは、ＡＣおよび非ＡＤ認知症の線維芽細胞よりも低いことが見出される。ＡＤ（０．５０１±０．０２１、Ａ．Ｕ．）における平均ＰＫＣ−εは、βチューブリンに対して正規化した場合、ウエスタンブロット法において、ＡＣ（０．８５７±０．０３６、Ａ．Ｕ．）よりも約４０％低く、非ＡＤ認知症（１．０４０±０．２８８、Ａ．Ｕ．）の症例よりも非常に低いことが見出される。同様の変化が、免疫蛍光分析後においても見出される。ＰＫＣ−εのｍＲＮＡレベル（ＡＣ：０．９０４±０．１０３、ＡＤ：０．５３０±０．０６１）もまた、ＡＤ患者のものより低くなっていることが見出される。オリゴマーＡβを皮膚線維芽細胞に適用後、ＰＫＣ−εレベルは、ＡＣの線維芽細胞では低下しているが、ＡＤ患者では低下しておらず、これは、ＰＫＣ−εに対する病態生理学的Ａβの作用を示している。
【００２６】
本発明者らは、ＰＫＣ−εレベルが、健常なＡＣおよび非ＡＤ認知症の症例と比較して、培養したＡＤの皮膚線維芽細胞で顕著に低くなっていることを発見している。ＰＫＣ−εは、診断用の抹消バイオマーカーであり、ＡＤのための治療標的である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂ：年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、および非ＡＤ認知症の培養されたヒト線維芽細胞におけるＰＫＣ−εの発現。値は、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭである。
【００２８】
図１Ａ：ＡＣ、ＡＤ、および非ＡＤ認知症線維芽細胞におけるＰＫＣ−εおよびβ−チューブリンの免疫反応性。それぞれ、ＡＣ１、ＡＣ２、およびＡＣ３（ＡＧ０７７１４、ＡＧ１１７３４およびＡＧ１２９２７）は年齢をマッチさせた対照の線維芽細胞であり、ＡＤｌ、ＡＤ２およびＡＤ３（ＡＧ０６８４４、ＡＧ０４１５９およびＡＧ０８２４５）はアルツハイマー病の線維芽細胞であり、ＨＤ１およびＨＤ２（ＧＭ０６２７４、ＧＭ０４１９８）はハンチントン病線維芽細胞である。
【００２９】
図１Ｂ：１１のＡＣ、１０のＡＤ、８のＨＤ、１つのパーキンソン病（ＰＤ）および１つの前頭側頭型認知症（ＦＴ）におけるＰＫＣ−εとβ−チューブリンとの、正規化した濃度比のグラフによる提示。ＡＣ細胞において、比は、０．７〜１．２（Ｙ軸）の間で変化し、非ＡＤ認知症において、この比は、０．７２〜１．３の間で変化した（２つの例外がＨＤ６およびＨＤ８）が、その一方で、ＡＤにおけるすべての細胞株の比は、０．６以下であった。パネルＢの挿入図：ＡＣ細胞の平均値は、０．８５７±０．０３６１（ＳＥＭ）であり、非ＡＤ認知症の平均値は、１．０４０±０．２８８であり、ＡＤ細胞の平均値は、０．５０１±０．０２１であった。ＰＫＣ−εは、ＡＤにおいて、ＡＣ（ｐ＜０．０００１）および非ＡＤ認知症（ｐ＝０．０３９４）と比較して有意に低かった。ＡＣ１１（０．６２１３±０．０４０）の平均値は、ＡＣの中で最低であった。しかし、すべてのＡＤ症例と比較した場合にもまた有意に異なっていた（Ｐ＝０．０１６２）。
【図２】図２Ａおよび２Ｂ：年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）線維芽細胞の培養されたヒト線維芽細胞におけるＰＫＣ−εの免疫蛍光検出。
【００３０】
図２Ａ：年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）、およびアルツハイマー病線維芽細胞（ＡＤ）の共焦点顕微鏡像。緑色のチャネル（ＦＩＴＣ）は、ＰＫＣ−εを表し、青色のチャネルは、（ＤＡＰＩ）核染色指標であり、第３のチャネルは、融合した画像を示す。緑色（ＰＫＣ−εに対する）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、５つのＡＣおよびＡＤ線維芽細胞のそれぞれの５つの異なる視野についてすべての細胞から測定する。値は平均値±ＳＥＭである。
【００３１】
図２Ｂ：５つのＡＣ症例（ＡＧ０７７１４、ＡＧ１１７３４、ＡＧ０５８４０、ＡＧ０６２４２およびＡＧ１２９２７）および５つのＡＤ症例（ＡＧ０６８４４、ＡＧ０４１５９、ＡＧ０６８４０、ＡＧ０５７７０およびＡＧ０８２４５）のＰＫＣ−εのＭＦＩ（平均値蛍光強度）のグラフによる提示。ＡＣ細胞において、ＭＦＩは１５〜２０Ａ．Ｕ．の間で変化したが（Ｙ軸）、その一方でＡＤにおいては、領域は、７〜１０の間である。ＡＣおよびＡＤにおけるＰＫＣ−εの平均強度は、それぞれ１８．０９２±２．０８７および９．１１０±１．４２０であった。
【図３】図３Ａおよび３Ｂ：ＰＫＣ−εのＲＴ−ＰＣＲ分析。
【００３２】
図３Ａ：ｍＲＮＡを３つのＡＣ、３つのＡＤおよび２つのＨＤの症例から単離した。ＰＫＣ−ε、およびβ−チューブリンのＲＴ−ＰＣＲアンプリコンを、Ｅ−Ｇｅｌで作動し、Ｆｕｊｉゲルスキャナーで撮像した。（ＡＣｌ、ＡＣ２およびＡＣ３：それぞれＡＧ１１３６３、ＡＧ０９９７７およびＡＧ１２９９８；ＡＤ１、ＡＤ２およびＡＤ３：それぞれＡＧ０６２６３、ＡＧ１０７８８およびＡＧ０８２５９；ＨＤ１およびＨＤ２：それぞれＧＭ０２１６５およびＧＭ０４２２６）。
【００３３】
図３Ｂ：（ａ）３つのＡＣ、３つのＡＤおよび２つのＨＤに対するβ−チューブリンに関するＰＫＣεの正規化数を表しているヒストグラム。値は、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。（ｂ）ＡＤ細胞の平均ＰＫＣ−εｍＲＮＡレベルは、ＡＣ細胞（ＡＣ：０．９０４±０．１０３、ＡＤ：０．５３０±０．０６１およびＨＤ：０．７０１±０．１４３）より有意に（ｐ＜０．００３３）低かった。
【図４】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ：可溶性Ａβオリゴマーは、アルツハイマーのＰＫＣ−ε表現型ヒト線維芽細胞を誘発する。
【００３４】
図４Ａ：Ａβ１−４２の、合成したＡβオリゴマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー、レーンｏＡβ：可溶性Ａβオリゴマー。
【００３５】
図４Ｂ：すべての年齢をマッチさせた対照の皮膚線維芽細胞（５つのＡＤおよび５つのＡＣ症例）において、可溶性Ａβオリゴマー（５００ｎＭ）での処理は、ＰＫＣ−εを低下させる。ＰＫＣ−εの正規化した濃度の平均値を５つの異なる細胞株（Ａβオリゴマーで処理した皮膚線維芽細胞および未処理の皮膚線維芽細胞）から算出した。いずれの場合も、ＡＣ値は、ＡＤ平均値を１つの値としてみなして算出した。ＡＣは、Ａβ治療後、ＰＫＣ−ε発現の有意な低下を示した（ｐ値は、それぞれＡＣ１、ＡＣ２、ＡＣ３、ＡＣ４およびＡＣ５に対して、０．００４４、０．００３５、０．０００５、０．０３３０および０．０２５３である）が、ＡＤ症例は、発現において低下を示さなかった。
【００３６】
図４Ｃ：Ａβオリゴマーでの処理は、ＡＣをＡＤ表現型に変えた。ＰＫＣ−εレベルは、Ａβオリゴマーで処理したＡＣおよびＡＤ細胞において有意な差を示さなかったが、未処理の細胞においてＡＤは、ＡＣと比較して発現が４０％減少したことを示した（Ｐ＝０．０２９２）。
【図５】ＰＫＣ−εとＡβとの相互作用、アルツハイマー病との関係。ＡＤ病態において、より高いβ−、γ−セクレターゼ活性によるＡβの過剰生産およびより低いα−セクレターゼ活性は、ＰＫＣ−εの量を低下させる。他方ではＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εは、α−セクレターゼ活性を増加させ、ＰＫＣ−εはまたＡβ分解酵素、特にＥＣＥ（エンドセリン変換酵素）の活性を増加させる。
【図６】本発明による使用に対して予期される分子の構造体（ＢＲ−１０１からＢＲ−１１８）。
【図７】アルツハイマー病の進行、または認知障害の重症度、または疾患持続時間の関数としての、時間の経過によるＰＫＣイプシロンレベルの減少の概略図。ＰＫＣイプシロンレベルは、活性レベル、例えばＲＴ−ＰＣＲにより測定される、１以上の細胞のタンパク質レベルまたは転写レベルであってよい。
【図８】ブリオスタチンは、Ｔｇ２５７６マウス（５×ＦＡＤ）における穿孔した線維中のＰＫＣεの損失を防止する。
【図９】ブリオスタチンを有するおよび有さない穿孔した線維中のＰＫＣε。
【発明の詳細な説明】
【００３７】
本明細書で使用する場合、「ＰＫＣイプシロンレベル」という用語は、これらに限らないが、以下のうちのいずれか１つ以上を含む：ＰＫＣイプシロンの酵素活性、ＰＫＣイプシロンタンパク質の量、またはＰＫＣイプシロンをコードしているＲＮＡの量。
【００３８】
「脂肪酸」は、およそ４〜３０個の炭素を含有する非分枝の脂肪族鎖を有するカルボン酸であり、最も長い鎖の脂肪酸は、１０〜２４個の炭素を含有する。脂肪酸は、飽和または不飽和であってよい。飽和脂肪酸は、鎖に沿っていかなる二重結合または他の官能基も含有しない。不飽和脂肪酸は、１以上のアルケニル官能基を含有する。すなわち、鎖に沿って二重結合を含有する。「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」という用語は、１より多くの二重結合を含有する脂肪酸を意味する。３種類のＰＵＦＡが存在する：オメガ−３ＰＵＦＡ、オメガ−６ＰＵＦＡ、およびオメガ−９ＰＵＦＡである。オメガ−３ＰＵＦＡにおいて、第１の二重結合は、鎖内の最後の炭素から３個離れた炭素に見出される（オメガ炭素）。オメガ−６ＰＵＦＡにおいて、第１の二重結合は、鎖から６個離れた炭素において見出され、オメガ−９ＰＵＦＡにおいて、第１の二重結合は、オメガ炭素から９個目の炭素である。
【００３９】
ＰＵＦＡはまた、「ポリエン脂肪酸」とも呼ばれる。本明細書で使用する場合、ＰＵＦＡという用語は、天然に生じた脂肪酸と合成脂肪酸との両方を含む。ＰＵＦＡの主要な供給源は、海産魚および脂肪種子作物由来の植物油であるが、商業的に開発された植物油において見出されるＰＵＦＡは、通常リノール酸およびリノレン酸に限られる（１８：３デルタ９，１２，１５）。
【００４０】
「ｃｉｓ−ＰＵＦＡ」は、隣接する炭素原子が、二重結合と同じ側にあるものである。
【００４１】
略語Ｘ：Ｙは、Ｘの炭素原子とＹの二重結合とを含有するアシル基を示す。例えば、リノール酸は、１８：２に短縮される。
【００４２】
「メチレン遮断されたポリエン」とは、単一のメチレン群により互いに分離している２つ以上のｃｉｓ二重結合を有するＰＵＦＡを指す。
【００４３】
「非メチレン遮断されたポリエン」または「ポリメチレン遮断された脂肪酸」とは、１つより多いメチレン基により分離された２つ以上のｃｉｓ二重結合を有するＰＵＦＡを指す。
【００４４】
「単不飽和脂肪酸」（ＭＵＦＡ）は、脂肪酸鎖内に単一の二重結合を有する脂肪酸であり、鎖内の残りのすべての炭素原子が一重結合されている。例示的ＭＵＦＡとして、オレイン酸、ミリストレイン酸およびパルミトレイン酸が挙げられる。
【００４５】
「ｃｉｓ単不飽和脂肪酸」とは、隣接する水素原子が、二重結合の同じ側にあることを意味する。
【００４６】
共役した脂肪酸、例えば、共役したリノール酸（９−シス、１１−ｔｒａｎｓ−オクタデカジエン酸）などは、隣接する炭素上の２つの二重結合である共役ジエンを有する。一部の証拠は、共役リノール酸は、抗腫瘍活性を有することを示唆している。
【００４７】
例示的ＰＵＦＡとして、リノレン酸（９，１２−オクタデカジエン酸）；γ−リノレン酸（ＧＬＡ；６，９，１２−オクタデカトリエン酸）；α−リノレン酸（９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）；アラキドン酸（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）；エイコサペンタン酸（ＥＰＡ；５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタン酸）；ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ；７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）；ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）；およびステアリドン酸（６，９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）が挙げられる。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「シクロプロパン」という用語は、環を形成するために互いに連結された３個の炭素原子からなり、各炭素原子が２個の水素原子を保持している、分子式Ｃ３Ｈ６を有するシクロアルカン分子を指す。
【００４９】
「エポキシド」とは、３個の環原子を有する環状鎖エーテルを指す。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「ＰＵＦＡ誘導体」とは、二重結合のうちの少なくとも１つが、シクロプロパン化またはエポキシ化している、ＰＵＦＡ、またはアルコールまたはそのエステルを指す。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「ＭＵＦＡ誘導体」とは、二重結合がシクロプロパン化またはエポキシ化している、ＭＵＦＡ、またはアルコールまたはそのエステルを指す。
【００５２】
ＰＫＣεの「選択的活性化」とは、本発明のＰＵＦＡ誘導体化合物が、いかなる他のＰＫＣアイソザイムよりも検出可能な程度までＰＫＣεを活性化することを意味する。具体的な実施形態において、ＰＵＦＡ誘導体は、例えば、本明細書中に記載されているＰＫＣ活性化アッセイを使用して測定した場合、他のＰＫＣアイソザイムよりも、ＰＫＣεを、少なくとも１倍、２倍または５倍活性化する。活性化の際に、プロテインキナーゼＣ酵素は、ＲＡＣＫタンパク質（活性化されるプロテインキナーゼＣタンパク質に対する膜結合受容体）により原形質膜へと移動する。一般的に、活性化の際に、プロテインキナーゼＣ酵素は、ＲＡＣＫタンパク質により原形質膜へと移動する。ＰＫＣ活性化の他の兆しとして、ホスファチジルイノシトール−トリスリン酸依存性キナーゼ（ＰＤＫｌ）による特定のＣ末端セリン／トレオニン残基でのリン酸化が挙げられ、ＰＫＣファミリーの各酵素においてよく保存された配列の少なくとも２つの追加のリン酸化および／または自己リン酸化が起こる。ＰＫＣの活性化は、ＳｕｎおよびＡｌｋｏｎ、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔｅｎｔｓ ＣＮＳ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００６年；１（２）：１４７〜５６頁において記載されている。
【００５３】
「神経変性」とは、神経細胞死を含めた、神経細胞の構造または機能の進行性の損失を指す。
【００５４】
本発明の目的のため、「神経系疾患」とは、ＡＰＰのβ−アミロイド形成過程を伴う任意の中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）疾患を指す。これは、これらだけには限らないが、神経細胞の損失、神経細胞の変性、神経細胞の脱髄、グリオーシス（すなわち、アストログリオーシス）、または異常なタンパク質または毒素（例えばＡβ）の神経細胞または神経細胞以外での蓄積を含めた、神経細胞またはグリア細胞の欠陥を結果として生じ得る。
【００５５】
１つの例示的神経系疾患はアルツハイマー病（ＡＤ）である。別の例示的神経系疾患は、脳アミロイド血管症とも呼ばれる、コンゴーレッド親和性血管障害（ＣＡＡ）である。
【００５６】
「アルツハイマー病」または「ＡＤ」という用語は、Ａβ堆積が中枢神経系の細胞内に最終的に蓄積することになるあらゆる状態を指す。１つの、非限定的実施形態では、Ａβ、特にＡβ１−４２ペプチドは、ＡＰＰのβ−アミロイド形成の代謝から形成される。ＡＤは、家族性の発現において遺伝性であるか、または散発性であることもある。本明細書中では、ＡＤには、表現型の発現に基づき、家族性、散発性、ならびにその中間およびサブグループが含まれる。
【００５７】
別の神経系疾患は、ダウン症候群（ＤＳ）である。ＤＳを有する対象は、ＡＤの特徴的病変である大脳アミロイド（Ａβ）プラークおよび神経原線維変化（ＮＦＴ）を常に発症する（３０代または４０代に）。最近の研究は、Ａβ４２は、ダウン症候群の脳内に堆積されたこのタンパク質の最も早期の形態であり、１２才の若い年齢の対象に見ることができ、可溶性Ａβは、Ａβプラークの形成よりもずっと前に、つまり妊娠第２１週には早くもＤＳ対象の脳内で検出することができることを示された。Ｇｙｕｒｅら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０００年；１２５巻：．４８９〜９２頁。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、哺乳動物を含む。
【００５９】
「薬学的に許容される」という句は、生理学的に許容され、対象に投与された場合に有害な反応物を通常産生しない分子的実体および組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、連邦または州政府の監督官庁により認可されている、または動物、より特定するとヒトにおける使用に対して米国薬局方または他の一般的に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。「薬学的に許容される担体」という用語は、有効成分と併用することができ、併用に続いて、これを使用して有効成分を対象に投与することができ、化合物が共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指し得る化学組成物を意味する。
【００６０】
「治療有効量」および「有効量」という用語は、測定可能な治療反応を生じることになる治療薬の量を指す。治療反応は、ユーザー（例えば、臨床医）が、療法に効果的な反応として認めたあらゆる反応であり、症状の改善および代理の臨床上のマーカーを含めたものであってよい。したがって、治療反応とは一般的に、疾患または状態、例えば、ＡＤの１以上の症状の回復または阻害である。測定可能な治療反応には、治療薬によって、症状または疾患が予防され、または発症が遅延され、またはさもなければ弱毒化するという所見も含まれる。
【００６１】
「およそ」および「約」という用語は、測定の性質または精密さを前提として、測定した量に対する許容可能な程度の誤差を一般的に意味するものとする。典型的な、例示的な程度の誤差は、所与の値または値の領域の２０パーセント（％）内、好ましくは１０％内、より好ましくは５％内である。あるいは、および特に生体系において、「およそ」および「約」という用語は、桁内であり、所与の値の好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書中に与えられている数値的な量はおおよそであり、別途述べられていない限り、明示により述べられていない場合、「およそ」または「約」という用語は、推測することができることを意味する。
【００６２】
ＰＫＣ−εレベルは、ＡＤ線維芽細胞においてより低い
この研究集団において、本発明者らは、ＰＫＣ−εが、散発性と家族性の両方の症例において機能不全であり、ＡＤ病理学的なシグナル伝達の特徴であることを試験するため、ＡＤの６つの散発性（後期発症型、家族歴なし）および４つの家族性の（早期発症型）症例を含めた。１０のＡＤ細胞株、１１の年齢ＡＣ細胞株および１０の非ＡＤ認知症線維芽細胞の免疫ブロット分析により、ＡＤ試料におけるＰＫＣ−εレベルは、ＡＣと比較して約４０％低いことが明らかになった（図１）。ＰＫＣ−εとβ−チューブリンとの平均の正規化比は、ＡＣ症例（ｎ＝１１）において０．８５７±０．０３６（ＳＥＭ）であり、非ＡＤ認知症（ｎ＝１０）において１．０４０±０．２８８であり、ＡＤ細胞（ｎ＝１０）において０．５０１±０．０２１であった。ＰＫＣ−εレベルは、ＡＣ症例と比較して、ＡＤ線維芽細胞（ｐ＜Ｏ．０００１）において有意に低かった。ＡＣの１１の症例（０．６２１３±０．０４０）に対する平均のＰＫＣ−ε基本レベルは、すべてのＡＣの中で最低であった（図１Ｂ）。しかし、ＡＣの１１のＰＫＣ−ε基本レベルはまた、すべてのＡＤ症例と別々に比較した場合、統計学的に有意であった（Ｐ＝０．０１６２）。
【００６３】
ウエスタンブロット法分析のデータは、ＡＣとＡＤ細胞との間での、ＦＩＴＣタグしたＰＫＣ−εの強度における明確な差を実証した着色した線維芽細胞の免疫蛍光分析により支持された（図２）。ＡＣおよびＡＤ細胞におけるＰＫＣ−εの平均強度は、それぞれ１８．０９２±２．０８７および９．１１０±１．４２０であった。転写レベルでの機能不全のＰＫＣ−εを試験するため、ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。３つのＡＤ、３つのＡＣおよび２つのＨＤ細胞株の平均ｍＲＮＡレベルを測定した（図３）。すべてのＰＫＣ−εのｍＲＮＡレベルを対応する細胞株のβ−チューブリンｍＲＮＡレベルで正規化した。ＡＤ細胞の平均の正規化ｍＲＮＡレベルは、ＡＣおよびＨＤ細胞より有意に低かった（ｐ＜０．００３）（ＡＣ：０．９０４±０．１０３、ＡＤ：０．５３０±０．０６１およびＨＤ：０．７０１±０．１４３）（図３）。
【００６４】
オリゴマーＡβを用いた皮膚線維芽細胞の処理
以前に記載した方法により合成したオリゴマーＡβは、１００ｋＤａを超えるサイズの分子量を有する高分子量オリゴマーを生産した（図４Ａ）。これらオリゴマーは、極めて有毒であり、ＡＤ脳内で発見されたものと類似であることが報告された（Ｎｏｕｇｕｃｈｉら、２００９年）。ＡＤの病態生理学的関連性を確証するため、外部からの毒素性オリゴマーＡβ１−４２を正常な線維芽細胞（ＡＣ）に添加し、ＰＫＣ−ε発現レベルに対する衝撃を基本的状態で評価した。オリゴマーＡβでの処理後、ＰＫＣ−εレベルは、ＡＣ症例において低下したことがわかったが、ＡＤ症例は統計的差を示さなかった。５つの異なるＡＣおよびＡＤ患者の３つの独立した実験の中間値の平均を、オリゴマーＡβ処理に続いて算出し、未治療の細胞と比較した。未治療のＡＣおよびＡＤ細胞は、これらの中で約４０％の差を示したが、治療したＡＣおよびＡＤ細胞は、ＰＫＣ−εの発現において差を実証しないか、またはＡＤ症例についてはＡβ治療後により高いこともあった。
【００６５】
本発明は、特定の態様において、試験および診断に対して特定された対象から採取したヒト細胞においてアルツハイマー病を診断する方法に関する。診断は、独自のアルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーの発見に基づく。特定の態様において、本発明は、アルツハイマー病の進行をモニターする方法およびアルツハイマー病を治療または予防するためのリード化合物の同定のためのスクリーニング法を対象とする。
【００６６】
生存しているヒトの脳内の神経細胞に直接アクセスすることは不可能なので、アルツハイマー病の初期診断は極度に困難である。本明細書中に開示されている、アルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーを測定することによって、本発明は、アルツハイマー病の初期診断のための高度な実用性、高度な特異性、および高度な選択性のある試験を提供する。さらに、本明細書中に記載されている、アルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーは、病気の進行を追跡するための、およびアルツハイマー病の治療および予防を標的とする創薬のために治療薬を特定するための基礎を提供する。
【００６７】
本発明者らは、アルツハイマー病の診断に対して高度に感受性で高度に特異的な診断用アッセイにおいて有用な末梢（非ＣＮＳ）組織を使用して、アルツハイマー病のための独自の分子バイオマーカーを発見した。本発明の大きな利点は、最小の侵襲性処置を使用して、すなわち脊椎穿刺を使用することなく、本明細書中に開示されているアッセイおよび方法で使用する組織を対象から得られることである。したがって、本発明の一態様は、アルツハイマー病の早期検出のためのアッセイまたは試験を対象とする。
【００６８】
一実施形態において本発明は、アルツハイマー病の治療または予防に有用な試験化合物（またはリード化合物）をスクリーニングするための方法であって、インビトロアッセイを含む方法を対象とする。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態では、プロテインキナーゼＣアクチベーターは、ブラジキニン、ブリオスタチン、ボンベシン、コレシストキニン、トロンビン、プロスタグランジンＦ２アルファおよびバソプレッシンからなる群から選択される。本発明さらなる実施形態において、細胞は末梢細胞である。本発明のまたさらなる実施形態において、末梢細胞は、皮膚細胞、皮膚線維芽細胞、血液細胞および口腔の粘膜細胞からなる群から選択される。本発明のまたさらなる実施形態において、細胞は、脳脊髄液から単離しない。本発明のまたさらなる実施形態において、細胞は、脳脊髄液を含まない。本発明のまたさらなる実施形態において、細胞は、脊椎穿刺または腰椎穿刺により取得しない。本発明のまたさらなる実施形態において、プロテインキナーゼＣアクチベーターを、血清を含む培地内の前記細胞と接触させる。本発明のまたさらなる実施形態において、プロテインキナーゼＣアクチベーターを、血清を含まない培地内の前記細胞と接触させる。本発明のまたさらなる実施形態において、ＰＫＣイプシロンタンパク質は、免疫アッセイによって検出される。本発明のまたさらなる実施形態において、免疫アッセイは、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫電気泳動アッセイ、ドットブロットアッセイ、またはスロットブロットアッセイである。本発明のまたさらなる実施形態において、測定は、タンパク質アレイ、ペプチドアレイ、またはタンパク質マイクロアレイを使用して行われる。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態において、ＰＫＣアクチベーターまたは医薬組成物は、以下からなる群から選択される以下の化合物のいずれかを含む：ＤＣＰ−ＬＡ；ＤＣＰＬＡメチルエステル、ＤＨＡ−ＣＰ６メチルエステル（ＢＲ−１１１）；ＥＰＡ−ＣＰ５メチルエステル（ＢＲ−１１４）；ＡＡ−ＣＰ４メチルエステル（ＢＲ−１１５）；ＤＨＡ−ＣＰ６；ＥＰＡ−ＣＰ５；ＡＡ−ＣＰ４；シクロプロパン化リノレニルアルコール（ＢＲ−１０４）；シクロプロパン化リノレイックアルコール（ＢＲ−１０５）；シクロプロパン化エライジックアルコール（ＢＲ−１０６）；シクロプロパン化エライジン酸（ＢＲ−１０７）；シクロプロパン化オレイルアルコール（ＢＲ−１０８）；シクロプロパン化ベルノール酸メチルエステル（ＢＲ−１０９）；シクロプロパン化リノレン酸（ＢＲ−１１８）；シクロプロパン化エライジン酸メチルエステル；シクロプロパン化ベルノール酸；シクロプロパン化リノレン酸メチルエステル；
８−（２（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）；
メチル３−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）プロパノエート
メチル３−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）プロパノエート（ＤＨＡ−ＣＰ６メチルエステル）
メチル４−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）−メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）ブタノエート
メチル４−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）−メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）ブタノエート（ＥＰＡ−ＣＰ５メチルエステル）
メチル４−（２−（（２−（（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）ブタノエート
メチル４−（２−（（２−（（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）ブタノエート（ＡＡ−ＣＰ４メチルエステル）
本発明の方法において、個体または患者から採取する細胞は、任意の生細胞であってよい。好ましくは、これらの細胞は皮膚線維芽細胞であるが、任意の他の末梢組織細胞（すなわち中枢神経系の外側）も、このような細胞が入手または処理するのにより便利である場合には、本発明の試験において使用することができる。他の適切な細胞として、これらに限らないが、血液細胞、例えば、赤血球およびリンパ球など、口腔粘膜細胞、神経細胞、例えば、嗅覚神経細胞など、脳脊髄液、尿および任意の他の末梢細胞の種類が挙げられる。加えて、比較目的のために使用される細胞は、必ずしも健常な提供者からものでなくてもよい。
【００７１】
細胞は、得たばかりの状態のものでも、または培養されたものであってよい（その全体が本明細書中に参照により組み込まれている米国特許第６，１０７，０５０号を参照）。具体的な実施形態では、パンチ皮膚生検を使用して、対象から皮膚線維芽細胞を得ることができる。これらの線維芽細胞は、本明細書中に記載されている技法を使用して直接分析するか、または細胞培養条件下に導入する。次いで、生成した培養線維芽細胞は、実施例および明細書全体を通して記載されているように分析する。分析に使用し得る他の種類の細胞、例えば口腔粘膜細胞、嗅覚細胞などの神経細胞、赤血球およびリンパ球などの血液細胞などを準備するための他のステップが必要となることもある。例えば、血液細胞は、末梢静脈から血液を取り出すことで容易に得ることができる。次いで細胞を、標準的な手順（例えばセルソータ、遠心分離などを使用）により分離し、後で分析することができる。
【００７２】
したがって、本発明は、特定の態様において、対象におけるアルツハイマー病の診断および治療のための方法に関する。本発明はまた、特定の実施形態において、アルツハイマー病の検出または診断に有用な試薬を含有するキットを対象とする。特定の態様において、本発明は、アルツハイマー病を治療するのに有用なリード化合物を同定するためのスクリーニングのための方法ならびにそれを必要とする対象においてアルツハイマー病を治療または予防するために、医薬製剤内においてこれらの化合物またはリード化合物の化学的誘導体を使用する方法を対象とする。
【００７３】
診断法、診断用キットおよび本発明の化合物を同定するためのスクリーニング法において使用することを特異的に想定したプロテインキナーゼＣアクチベーターとして、これらに限らないが、以下が挙げられる：ブラジキニン；ε−ΑΡΡモジュレーター；ブリオスタチン１；ブリオスタチン２；ＤＨＩ；１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール；ＦＴＴ；グニジマクリン、ステレラ・カマエヤスメ（Ｓｔｅｌｌｅｒａ ｃｈａｍａｅｊａｓｍｅ）Ｌ．；（−）−インドラクタムＶ；リポキシンＡ４；リングビアトキシンＡ、ミクロモノスポラ属；オレイン酸；ｌ−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール；４α−ホルボール；ホルボール−１２，１３−ジブチレート；ホルボール−１２，１３−ジデカノエート；４α−ホルボール−１２，１３−ジデカノエート；ホルボール−１２−ミリスチン酸−１３−アセテート；Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスホスフェート、ジパルミトイル−、ペンタアンモニウム塩；Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート、ジパルミトイル−、ペンタアンモニウム塩；Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスリン酸、ジパルミトイル−、ヘプタアンモニウム塩；１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロール；チメレアトキシン、チメレア・ヒルスタ（Ｔｈｙｍｅｌｅａ ｈｉｒｓｕｔａ）Ｌ．；インスリン、ホルボールエステル、リゾホスファチジルコリン、リポ多糖、アントラサイクリンダウノルビシンおよび硫酸バナジル。同様に含まれているのは、「ブリオログ」として知られている化合物である。ブリオログは、例えば、Ｗｅｎｄｅｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ ｌｅｔｔｅｒｓ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）２００５年５月１２日、７巻（１０）ｌ９９５〜８頁；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ ｌｅｔｔｅｒｓ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）２００５年３月１７日、７巻（６）１１７７〜８０頁；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）２００４年１２月１６日、４７巻（２６）６６３８〜４４頁に記載されている。プロテインキナーゼＣアクチベーターは、本明細書中に開示されている診断法、キットおよび化合物のスクリーニング法において、単独でまたは任意の他のプロテインキナーゼＣアクチベーターと併用して使用することができる。
【００７４】
ブラジキニンは、様々な炎症状態の過程で生成する強力な血管作用性ノナペプチドである。ブラジキニンは、特定の細胞膜ブラジキニン受容体（複数可）に結合し、これを活性化し、よって細胞内事象のカスケードを引き起こし、「マイトジェン活性化されたタンパク質キナーゼ」（ＭＡＰＫ）として知られているタンパク質のリン酸化を引き起こす。タンパク質のリン酸化、すなわちＳｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒ残基へのホスフェート基の付加は、タンパク質キナーゼとして総合的に知られた多数の酵素により媒介される。リン酸化は、通常タンパク質の機能を修正し、普通タンパク質を活性化する。ホメオスタシスは、リン酸化は一時的な処理であることを必要とし、これは基質を脱リン酸化するホスファターゼ酵素により逆転される。リン酸化または脱リン酸化において任意の逸脱があることで、生化学的経路および細胞機能が崩壊し得る。
【００７５】
タンパク質の検出のための本発明の免疫アッセイは、免疫蛍光アッセイ、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットまたはスロットブロットアッセイなどであってよい。（「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」（１９９１年）Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｐ．Ｐｒｉｃｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｎｅｏｍａｎ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。検出は、当業者に知られている比色分析法または放射能法または任意の他の従来の方法であってよい。ＥＬＩＳＡに関した当技術分野で知られている標準的な技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ、第２版、Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｂｉｇａｚｚｉ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９８０年およびＣａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｉｎｃ．、１９６４年、に記載されており、これら両方ともが本明細書に参照により組み込まれている。このようなアッセイは、当技術分野で記載されているような直接的、間接的、競合的、または非競合的免疫アッセイであってよい（「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」（１９９１年）Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｐ．Ｐｒｉｃｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｎｅｏｍａｎ編、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓ、ＮＹ、ＮＹ；Ｏｅｌｌｉｒｉｃｈ、Ｍ．、１９８４年；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：８９５〜９０４頁、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
【００７６】
これまでに述べたように、診断が行われている患者から採取した細胞は、任意の細胞であってよい。使用することができる細胞の例として、これらに限らないが、皮膚細胞、皮膚線維芽細胞、口腔粘膜細胞、血液細胞、例えば、赤血球、リンパ球およびリンパ芽細胞など、ならびに神経細胞およびＰＫＣイプシロンタンパク質を発現する任意の他の細胞が挙げられる。剖検試料および病態試料も使用することができる。脳組織または脳細胞を含めたこれらの細胞を含む組織もまた使用することができる。細胞は、得たばかりの状態のもの、培養されたものまたは凍結したものであってよい。細胞または組織から単離したタンパク質試料は、診断用アッセイまたは化合物をスクリーニングするための方法で即時に使用することができるか、または後で使用するため凍結することができる。好ましい実施形態において線維芽細胞が使用される。線維芽細胞は、パンチ皮膚生検により得ることができる。
【００７７】
タンパク質は、当業者に知られている従来の方法により細胞から単離することができる。好ましい方法において、患者から単離した細胞を洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でペレットにする。次いでペレットを５０ｎＭのＮａＦ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、５０μｇ／ｍｌのペプスタチン、１０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４を含む「均質化緩衝液」で洗浄し、遠心分離でペレットにする。上清を廃棄し、「均質化緩衝液」をペレットに添加し、続いてペレットを超音波処理する。このタンパク質抽出物は、得たばかりの状態で使用することもでき、または後で分析するために−８０℃で保存することもできる。
【００７８】
本発明の方法において、開示した免疫アッセイで使用される抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル起源であってよい。抗体を生成するために使用された、全部のＰＫＣイプシロンタンパク質またはその一部分は、天然のまたは組換え供給源からのもの、または化学合成で生成したものであってよい。天然のＥｒｋ１／２タンパク質は、従来の方法で生体試料から単離することができる。ＰＫＣイプシロンタンパク質を単離するために使用することができる生体試料の例として、これらに限らないが、皮膚細胞、例えば、線維芽細胞、線維芽細胞の細胞株、例えばアルツハイマー病線維芽細胞の細胞株および対照線維芽細胞の細胞株が挙げられ、これらは、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｍｄｅｎ、Ｎ．Ｊ．を介して市販されており、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｉｎｇ １９９１年の細胞株カタログ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９２／１９９３年、細胞株カタログ［（ＮＩＨ公開９２−２０１１（１９９２年）］に列挙されている。
【００７９】
本発明はまた、アルツハイマー病の治療または予防に有用な物質をスクリーニングし、同定する方法を対象とする。本実施形態によると、本明細書中に記載されているアルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーを逆行させるまたは向上させる（すなわち正常細胞において見出されるレベルに戻す）物質は、アルツハイマー病の治療または予防に対して潜在的に有用な物質として同定および選択される。
【００８０】
例として、治療物質を同定するためのスクリーニングの、１つのこのような方法は、アルツハイマー病の患者の試料細胞を、本明細書中に開示されているプロテインキナーゼＣアクチベーターのいずれかの存在下で、スクリーニングされている物質と接触させ、次いで本明細書中に開示されているアルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーのいずれかを測定するステップを含む。アルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーを逆行または向上させて、正常細胞に見出されるレベルに戻す（すなわち、アルツハイマー病を有さない対象から摂取した細胞）薬剤は、アルツハイマー病の治療または予防に対して潜在的に有用な物質として同定および選択される。
【００８１】
本発明はまた、アルツハイマー病の治療または予防に有用な組成物を対象とする。本明細書中に記載されているスクリーニング法を使用して同定された化合物は、それを必要とする対象への投与のための医薬組成物として製剤化することができる。
【００８２】
本発明の医薬組成物または本明細書中に開示されているスクリーニング法を使用して同定された化合物（またはリード化合物の化学的誘導体）は、経口、皮下、経皮、皮膚を通したまたは非経口（例えば、局所的、直腸または静脈内）投与のための、例えば、錠剤（糖コーティング錠および膜コーティング錠を含めて）、散剤、粒剤、カプセル剤（軟カプセル剤を含む）、液剤、注射剤、坐剤、持続放出薬剤などの医薬組成物を与えるための既知の方法により、例えば薬理学的に許容される担体と混和することにより安全に投与することができる。
【００８３】
本発明の医薬組成物内での使用のための薬理学的に許容される担体の例として、これらに限らないが、様々な従来からの有機または無機の担体が挙げられ、これには、固体製剤用の賦形剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤、ならびに液体製剤用の溶媒、可溶化剤、懸濁剤、等張剤、緩衝液、緩和剤などが含まれる。必要な場合、従来の添加剤、例えば、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸収剤、湿潤剤などを適切な量で適切に使用することができる。
【００８４】
ＰＫＣシグナル伝達欠損は、ＡＤの病態を引き起こす主要な要素の１つであることを増々多くの証拠が示唆している（Ａｌｋｏｎら、２００７年、Ｌｉｒｏｎら、２００７年、Ｃｈｏｉら、２００６年）。ＡＤ患者の脳内でＰＫＣアイソザイムの分布が変化することは以前の知見により実証されている（Ｓｈｉｍｏｈａｍａら、１９９３年、Ｍａｓｌｉａｈら、１９９０年）。ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−γおよびＰＫＣ−βは、ＡＤ脳内でより低いことが判明した。Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａらの１９９６年の報告では、ＰＫＣ−δおよびＰＫＣ−ξレベルは変化しなかったにもかかわらず、ＡＤ脳内のＰＫＣ−εレベルは、サイトゾル部分と膜質部分の両方において減少したことが判明し、これは、Ｃａ２＋に依存しないＰＫＣアイソザイムの中で、ＰＫＣ−εの変化はＡＤ脳内において特異的事象であり、ＡＤ病態生理において重大な役割を有することを示唆した。ＡＰＰのα−セクレターゼ媒介性切断を活性化する主要な手段は、ＰＫＣアイソザイム−αおよび−εまたは間接的にＰＫＣ媒介性ＥＲＫ１／２またはこれら両方を介して成し遂げられた（Ａｌｋｏｎら、２００６年；Ｓｋｏｖｒｏｎｓｋｙら、２０００年；Ｄｉａｚ−Ｒｏｄｒｉｇｅｚら、２００２年；ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＣｏｂｂ、１９９７年）。散発性ＡＤに対する最も大きなリスクファクターは年齢であり、これは、脳内のＰＫＣアイソザイムの特異的分布、移動障害、およびＰＫＣアンカリングタンパク質ＲＡＣＫ１（活性化したプロテインキナーゼＣの受容体）レベルの減少を伴う（Ｂａｔｔａｎｉら、１９９７年）。
【００８５】
ＡＤに関連したＰＫＣ−εシグナル伝達欠損：アミロイド仮説によると、ＡＤは、β−およびγ−セクレターゼ経路により生成されたアミロイド斑を形成するＡβペプチドの凝集および蓄積により、引き起こされる。ヒト皮膚線維芽細胞を用いた研究は、ＡＤ患者と、年齢をマッチさせた対照との間でのＰＫＣアイソザイム機能の異常性を記録した（ＶａｎＨｕｙｎｈら、１９８９年、Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｕｇａｒａｙら、１９９３年、Ｇｏｖｏｎｉら、１９９３年、Ｆａｖｉｔら、１９９８年）。しかし、これまではＡＤ患者の末梢組織、例えば血液細胞または皮膚線維芽細胞などにおけるＰＫＣ−εレベルの低下を示す証拠が存在しなかった。より低くなったＰＫＣ−εの基本レベルがＡＤ特異性であるかどうかを調べるため、病理解剖で脳内にアミロイド斑および神経原線維変化が存在する、散発性と家族性ＡＤの両方の症例からＡＤ患者を選択し、また２つの異なるセットの非ＡＤ認知症対照、例えば：（ｉ）８つの遺伝性ハンチントン病（ＨＤ）患者の線維芽細胞：非ＡＤ特徴の強力な証拠を有し、遺伝子によりＨＤが識別されたものと、（ｉｉ）１つのパーキンソン病および１つの前頭側頭型認知症患者の線維芽細胞とを比較した。したがって、ＰＫＣ−ε欠損は、他の非ＡＤ認知症病態を伴わなかった。ＰＫＣ−εの基本レベルはまた、年齢と共に低下し得る。しかし、この研究は、１１のＡＣ（年齢をマッチさせた対照）が、有意により高いＰＫＣ−εレベルを有することを明らかに実証した。したがって、ＡＤ皮膚線維芽細胞においてより低くなったＰＫＣ−εの基本レベルは、アルツハイマー型の病態によるもので、加齢それ自体によるものではない。
【００８６】
ＡＤは、複数の病理学的欠損を含む疾患であり、ＰＫＣは、細胞生存、分化、および調節の主要な機構制御因子の１つである。ＰＫＣの中でも、ＰＫＣ−εは、シナプス形成を制御する。ＰＫＣ−εはまた、コレステロール除去の間の低密度受容体の転写を誘発すると報告され（Ｍｅｈｔａら、２００２年）、ＬＤＬ受容体はＡβの輸送および排除においてある役割を果たすと示唆された。他の研究において、ＰＫＣεアクチベーターは、ラットの空間迷路学習において、学習および記憶ならびに構造特異的なシナプス変化を強化することが示された（ＨｏｎｇｐａｉｓａｎおよびＡｌｋｏｎ、２００７年）。したがって、患者におけるＰＫＣ−ε総量の減少が、ＡＤにおける記憶損失を引き起こす可能性があった。さらに、ＰＫＣ−εのｍＲＮＡ転写レベルもまたＡＤ患者の試料においてより低かった。
【００８７】
ＡＤにおけるＰＫＣ−εの病態生理学的関連性：ＰＫＣ−αが、Ａβ治療により分解され（Ｆａｖｉｔら、１９９８年）、ホルボールエステル治療により、ＡβがＢ１０３細胞内のＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εの膜移動を変化させることがこれまでに示された（Ｌａｎｎｉら、２００４年）。ＰＫＣ−εの過剰発現は、遺伝子組み換えマウスにおいてＡβレベルを減少させたことも示された（Ｃｈｏｉら、２００６年；Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、２０１１年）。１００ｋＤａを超える分子量のＡβオリゴマーは、ラットの初代神経細胞に極めて有毒であることが判明した（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２００９年；Ｈｏｓｈｉら、２００３年）。これら合成オリゴマーに対する抗体は、ＡＤ患者の脳の未処置のアミロスフェロイドを認識し（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２００９年）、それ故これらオリゴマーは、疾患に対して病理学的に大きな意義がある。本発明者らは、これら極めて有毒なオリゴマー（＞１００ｋＤａ）は、ＡＣ線維芽細胞のＰＫＣ−εレベルに影響を及ぼし、これをＡＤ表現型に変えたことを実証した（図４Ｂ）。これらオリゴマーでＡＣ細胞を処理することで、ＰＫＣ−εの発現レベルを減少させたが、ＡＤ細胞には影響を及ぼさなかった。処理した細胞における正規化されたＰＫＣ−εのＡＣ−ＡＤ比は、約１であることが判明したが、未処理の細胞では１．４（図４Ｃ）であった。
【００８８】
ＡＤ病態において、より高いβ−，γ−セクレターゼ活性およびより低いα−セクレターゼ活性によるＡβの過剰生産は、ＰＫＣ−ε量を低下させる結果となり得るが、他方ではＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εは、α−セクレターゼ活性を増加させ、ならびにＰＫＣ−εは、Ａβ分解酵素の活性を増加させる。ＰＫＣ−εレベルは、ＡＣおよび非ＡＤ認知症と比較して、ＡＤ線維芽細胞において有意に低いことが判明しているので、したがって、ＰＫＣ−εシグナル伝達のＡＤ関連の機能不全および皮膚線維芽細胞におけるＰＫＣ−εの基本量の低下は、ＡＤに対するバイオマーカーとしての末梢性ＰＫＣ−ε、および治療的候補としてのＰＫＣ−εアクチベーターの可能性を支持している。異なる形態の有毒なＡβオリゴマーは、Ａβを分解するエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）の調整に関与している細胞中のＰＫＣ−εレベルに影響を及ぼす可能性がある。これらのタンパク質は、Ａβ排除において重要な役割を果たす。したがって、β−，γ−セクレターゼ活性の上昇によるＡβの異常な蓄積がＰＫＣ−εの低下を引き起こし、次いでこれがフィードバックループ（図５）に参加することで、さらなるＡβの高まりおよびシナプスの損失を引き起こすというのが当然の仮説である。
【００８９】
ＡＤ線維芽細胞および末梢バイオマーカーにおけるＰＫＣ−εの欠如：ＡＤの診断に対する判断基準は、神経病理パラメータの死後解剖分析であるが、様々な実験室は、末梢組織を使用して効果的な診断を発見しようとしており、この診断には、非侵襲性、容易に入手可能なこと、低コストおよび最も重要なことに疾患の早期検出などの利点がある。本明細書中に開示されている知見は、ＰＫＣシグナル伝達欠損は大部分のＡＤ要素より後で生じることを示している。高齢の動物において、ＰＫＣ機能は、脳内ＰＫＣアイソザイムの年齢特異的な分布、移動の減少およびＲＡＣＫ１タンパク質レベルの減少（Ｂａｔｔａｎｉら、１９９７年）と共に落ち、年齢は散発性ＡＤの症例において最も重要なリスクファクターである。ＰＫＣ−εの過剰発現は、ＡＤ遺伝子組み換えマウスのＡβレベルを減少させることが示されている（Ｃｈｏｉら、２００６年）。本発明者らは、驚くことに、ＰＫＣ−εがＡＤ患者の末梢細胞において欠如していることを示した。
【表１】
【００９０】
ＰＫＣイプシロンのアクチベーター
ＰＫＣεは、Ａβ産生を最も効果的に抑制するアイソザイムである。Ｒａｃｃｉら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００３年；８巻：２０９〜２１６頁；およびＺｈｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００１年；２８５巻：９９７〜１００６頁。したがって、アイソフォームに特異的なＰＫＣアクチベーターが有望な抗アルツハイマー薬物として極めて望ましい。特異的アクチベーターは、あまり特異性を示さないブリオスタチンなどの化合物が好ましい。なぜなら、ＰＫＣδまたはβの非特異的活性化は、望ましくない副作用を生じる可能性があるからである。
【００９１】
さらに、ＰＫＣεはまた、脳以外ではすべての正常な組織において極めて低レベルで発現する。Ｍｉｓｃｈａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３年；２６８巻：６０９０〜６０９６頁；Ｖａｎ Ｋｏｌｅｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００８年；１０４巻：１〜１３頁。シナプス前の神経線維での大量のＰＫＣεは、神経突起成長またはニューロトランスミッター放出における役割を示唆している。Ｓｈｉｒａｉら、ＦＥＢＳ Ｊ．２００８年；２７５巻：３９８８〜３９９４頁）。したがって、特異的ＰＫＣεアクチベーターの作用であれば、主として脳に限定され、望ましくない末梢性の副作用を生じる可能性は低い。
【００９２】
ＰＫＣアクチベーターとしてのＰＵＦＡ
一部のＰＵＦＡ、例えばアラキドン酸（図６を参照）などは、ＰＫＣの天然のアクチベーターとして長年の間知られてきた。ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）もまた、ＰＫＣの既知のアクチベーターであり、ＡＤに関係する、脳を詰まらせるプラークおよびもつれを伴うＡβおよびタウタンパク質の蓄積を遅延させることが最近示されている。Ｓａｈｌｉｎら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７年；２６巻（４）：８８２〜９頁。
【００９３】
Ｋａｎｎｏらは、８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）、すなわちｃｉｓ−二重結合の代わりにシクロプロパン環を有する、新たに合成されたリノール酸誘導体の、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性に対する作用を記載した。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００７年；４７巻：１１４６〜１１５６頁。ＤＣＰ−ＬＡは、ＰＫＣεを活性化し、作用強度は、他のＰＫＣアイソザイムの７倍を超えた。これは、ＤＣＰ−ＬＡがＰＫＣεに対して極めて特異的であることを示している。この化合物はまた、グルタミン酸作動性の末端または神経細胞でのシナプス前のアセチルコリン受容体の活性を強化することによって海馬のシナプス伝達を促進した。しかし、ＤＣＰ−ＬＡは、その最大の作用を生じるためには比較的高濃度を必要とする。
【００９４】
ＷＯ２００２／５０１１３で、Ｎｉｓｈｉｚａｋｉらは、シナプス伝達のＬＴＰ同様の増強のための、または認知強化薬物または認知症を治療するための薬物としての使用のための、シクロプロパン環を有するカルボン酸化合物およびこれらの対応する塩を開示している。これらの合成例は、エステルの調製を開示しているが、これらの実験結果は、遊離酸の使用を教示している。この理由は、脂肪酸出発物質のカルボン酸基が、Ｓｉｍｍｏｎｓ−Ｓｍｉｔｈ反応に使用されているジエチル亜鉛と反応するからである。メチルエステルは、保護基として作用し、加水分解によって切断されるか、または必要な場合にはとどまることが可能なこともある。
【００９５】
従来の技術の所見を有する仮出願は、前述の作用、ＰＫＣアイソフォームの非特異的活性化、または急速な代謝および未改質ＰＵＦＡの、脂肪組織および他の器官への隔離（ここで、これらはトリグリセリドおよびカイロミクロンへと取り込まれる）を達成するために高濃度で投与する必要性を含む。Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ．１９８８年；１１巻（４）：２５１〜６１頁。加えて未改質ＰＵＦＡを使用すれば、無数の有害な副作用を有することになる。例えば、アラキドン酸は、プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエンの生化学的前駆体であり、この前駆体は、強力な炎症促進作用を有する。病態が炎症を含む可能性のある場合には、これは、アルツハイマー病の治療に対して望ましくない。他の主要な脂肪酸もまた、一酸化窒素シグナル伝達の強化、抗炎症作用、およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの阻害（コレステロール生合成を妨げることになる）を含めた、多数の他の生物学的作用を有し得る。
【００９６】
ＡＤと脳卒中の両方を治療するための、限られた既存のオプションのため、神経保護を導き出すＰＫＣアイソフォームのみを選択的に活性化することができる新しい治療法が必要とされる。
【００９７】
ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡおよび疾患
増大する数の研究が、オメガ−３ＰＵＦＡは、他の気分障害疾患、例えば臨床的うつ病、双極性障害、人格障害、統合失調症、および注意欠陥障害などに対して有利となり得ることを示唆した。Ｒｏｓｓら、Ｌｉｐｉｄｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ．２００７年；１８巻；６：２１。オメガ−３脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸、およびオメガ−３とオメガ−６脂肪酸との健常なバランスを、うつ病の危険性が低くなることと結びつける多くの証拠が存在する。Ｌｏｇａｎら、Ｌｉｐｉｄｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ．２００４年；３巻：２５。オメガ−３脂肪酸のレベルは、ある程度まで低く、オメガ−６とオメガ−３脂肪酸との比は、うつ病で入院した患者の臨床研究で特に高かったことが判明した。最近の研究では、大うつ病性障害を有する患者の眼窩前頭皮質において、ドコサヘキサエン酸の選択的欠損が存在したことを実証された。ＭｃＮａｍａｒａら、Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００７年；６２巻（１）：１７〜２４頁。いくつかの研究はまた、双極性障害を有する対象が、より低いレベルのオメガ−３脂肪酸を有することを示した。いくつかの最近の研究において、オメガ−３脂肪酸は、双極性うつ病を有する成人と小児の両方において、うつ病に対してプラシーボより効果的であることを示した。ＯｓｈｅｒおよびＢｅｌｍａｋｅｒ、ＣＮＳ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｔｈｅｒ．２００９年；１５巻（２）：１２８〜３３頁；Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、Ａｒｃｈ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｎｕｒｓ．２００８年；２２巻（５）：３０５〜１１頁。
【００９８】
大規模な調査はまた、オメガ−３脂肪酸が炎症を減少させ、慢性疾患、例えば、心疾患、癌、炎症性腸疾患および関節リウマチなどを伴うリスクファクターを防止するのに役立つことを示している。Ｃａｌｄｅｒら、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ．２００９年；３５巻（３）：２６６〜７２頁；Ｐｓｏｔａら、Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００６年；９８巻（４Ａ）：３ｉ−１８ｉ頁；Ｗｅｎｄｅｌら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００９年；９巻（４）：４５７〜７０頁。
【００９９】
単不飽和脂肪酸はまた、障害に有利であることも示されている。２型糖尿病における医学的栄養療法のための低脂肪食の代替として、ＭＵＦＡ食への優れた科学的支持が存在する。Ｒｏｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２００３年；７８巻（３）：６１７Ｓ−６２５Ｓ頁。単不飽和脂肪酸を多く摂取する食事により、プラズマコレステロールとトリアシルグリセロール濃度の両方が低くなる。Ｋｒｉｓ−Ｅｔｈｅｒｔｏｎら、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．１９９９年１２月；７０巻（６）：１００９〜１５頁。
【０１００】
本発明は、二重結合のうちの１つ、一部、またはすべてがシクロプロパン基またはエポキサイド基で置きかえられている、ＰＵＦＡまたはＭＵＦＡのシクロプロパン化およびエポキシ化誘導体の使用を含む。末端官能基は、遊離カルボン酸、またはメチルエステル、エチルエステル、または脂肪族または芳香族アルコールを有するいくつかの他のアルキルエステルであってよい。このアルコールは、特にグリセロールおよびその誘導体もまた含む。脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、またはホスファチド酸の形態でグリセロールに結合しているのが最も頻繁に発見されているので、グリセロール誘導体は、生物学的に重要である。例えば、トリアシルグリセロールは、脂肪酸のカルボキシル基が、グリセロール中に発見される３個すべての炭素のヒドロキシルへエステル化している化合物であり、トリアシルグリセロールまたはトリグリセリドと呼ばれている。
【０１０１】
カルボン酸をエステル化する目的は、負電荷を排除することにより血液と脳のバリアを超えて輸送を促進することである。アルコール基の目的も、血液と脳のバリアを超えて輸送を促進することである。
【０１０２】
一実施形態において、本発明に使用される化合物の基礎を形成する脂肪酸は、以下の構造を有する多価不飽和脂肪酸である：
ＣＨ３（ＣＨ２）４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）ｘ（ＣＨ２）ｙＣＯＯＨ
式中、Ｘは、２〜６であり、Ｙは、２〜６であり、メチレンまたはポリメチレンで遮断されたポリエンを含む。例示的多価不飽和脂肪酸として、以下の構造を有するリノール酸、γ−リノール酸、アラキドン酸、およびアドレン酸が挙げられる：
リノール酸 ＣＨ３（ＣＨ２）４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）２ＣＨ２）６ＣＯＯＨ
γ−リノレン酸 ＣＨ３（ＣＨ２）４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）３（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ
アラキドン酸 ＣＨ３（ＣＨ２）４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）４（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ
アドレン酸 ＣＨ３（ＣＨ２）４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）４（ＣＨ２）４ＣＯＯＨ
これらは、オメガ−６ＰＵＦＡである。
【０１０３】
別の実施形態において、本発明に使用される化合物の基礎を形成する脂肪酸は、以下の構造を有する多価不飽和脂肪酸である：
ＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）ｘ（ＣＨ２）ｙＣＯＯＨ
式中、Ｘは、２〜６であり、Ｙは、２〜６であり、メチレンまたはポリメチレンで遮断されたポリエンを含む。例示的多価不飽和脂肪酸として、以下の構造を有するα−リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸が挙げられる：
α−リノレン酸 ＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）３（ＣＨ２）６ＣＯＯＨ
エイコサテトラエン酸 ＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）４（ＣＨ２）５ＣＯＯＨ
エイコサペンタエン酸 ＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）５（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ
ドコサヘキサエン酸 ＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）６（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ
これらは、オメガ−３ＰＵＦＡとして知られている。
【０１０４】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、ヒドロキシル基がアルコキシ基で置きかえられ、二重結合の少なくとも１つがシクロプロパン化されている、ｃｉｓ−ＰＵＦＡのエステルである。本実施形態に対する出発物質は、以下の構造を有する：
ＣＨ３（ＣＨ２）４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）ｘ（ＣＨ２）ｙＣＯＯＲまたはＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）ｘ（ＣＨ２）ｙＣＯＯＲ
式中、Ｒは、例えば、一価アルコールおよび多価アルコールなどのアルコール、例えば、これらだけには限らないがメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、グリセロール、マンニトール、およびソルビトールなどを含めたものからのアルキル基である。
【０１０５】
さらなる実施形態において、化合物は、少なくとも３つのシクロプロパン化二重結合を含有する。
【０１０６】
別の実施形態において、本発明に使用される化合物に対する基礎を形成する脂肪酸は、以下の構造を有する単不飽和脂肪酸である：
ＣＨ３（ＣＨ２）ｘＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｙＣＯＯＨ
式中、ＸおよびＹは、３〜１１の奇数である。
【０１０７】
本発明に使用される化合物の基礎となることができる例示的単不飽和脂肪酸として、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−単不飽和脂肪酸、例えば、オレイン酸、エライジン酸、トウハク酸、カプロレイン酸、ラウロレン酸、リンデル酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、およびペトロセリン酸などが挙げられる。
【０１０８】
本発明によるエステルとは、モノエステルまたはポリエステルを意味する。脂肪酸のエステルとして、メチル、プロピル、およびブチルエステル、およびより複雑なアルコール、例えば、プロピレングリコールなどから生成したエステルが挙げられる。非限定的実施形態において、Ｒ’は、直鎖または分枝であり、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、およびテトラデシルなどが挙げられる。エステルはまた、エステル結合で脂肪族アルコールと連結されている脂肪酸から形成されてもよい。
【０１０９】
エステルは、これだけに限らないが脂肪族アルコールエステルを含めたアルコールエステルであってよい。一実施形態において、アルコールエステルはグリセロールエステルである。脂肪酸のグリセロールエステルとして、グリセロール脂肪酸エステル、グリセロール酢酸脂肪酸エステル、グリセロール乳酸脂肪酸エステル、グリセロールクエン酸脂肪酸エステル、グリセロールコハク酸脂肪酸エステル、グリセロールジアセチル酒石酸脂肪酸エステル、グリセロール酢酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、およびポリグリセリン凝縮したリシノール酸エステルが挙げられる。
【０１１０】
別の特定の実施形態において、化合物は、二重結合のうちの少なくとも１つがシクロプロパン化されている、ｃｉｓ−ＰＵＦＡのアルコールである。さらなる実施形態において、化合物は、少なくとも３つのシクロプロパン化二重結合を含有するｃｉｓ−ＰＵＦＡのアルコールである。これらの化合物として、これらに限らないが、リノレイックアルコールジシクロプロパン（ＢＲ−１０５）、またはリノレニックアルコールトリシクロプロパン（ＢＲ−１０４）が挙げられる。本実施形態において、Ｒ’は、直鎖または分枝鎖のアルコールまたはフェノールのアルコールとなり得る。
【０１１１】
別の実施形態において、本発明の化合物、この化合物は、少なくとも１つの二重結合がエポキシル基で置きかえられている、ｃｉｓ−多価不飽和脂肪酸、またはその誘導体である。さらなる実施形態において、化合物は、少なくとも３つのエポキシ化二重結合を含有する。
【０１１２】
特定の実施形態では、化合物は、ｃｉｓ−ＰＵＦＡのエポキシ化エステルであり、これには、これだけに限らないが脂肪族アルコールエステルが含まれる。エステルは、シクロプロパン化ＰＵＦＡＳに対して上で記載されているものと同じエステルであってよい。さらなる実施形態において、アルコールは、脂肪族アルコールエステル、例えばグリセロールなどであってよい。
【０１１３】
別の特定の実施形態において、化合物は、エポキシ化ｃｉｓ−多価不飽和脂肪族アルコール、例えばリノレイックアルコールジシクロプロパンまたはリノレニックアルコールトリシクロプロパンなどである。アルコールは、シクロプロパン化ＰＵＦＡＳに対して上で記載されているものと同じであってよい。
【０１１４】
別の実施形態において、化合物として、ｃｉｓ−単不飽和脂肪酸（ｃｉｓ−モノエン酸）由来のシクロプロパン化またはエポキシ化した脂質、例えばオレイン酸、エライジン酸、エライジックアルコール、オレイルアルコール、および１−モノリノレイルｒａｃ−グリセロールなどが挙げられる。例示的化合物として、エライジックアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０６）、エライジン酸シクロプロパン（ＢＲ−１０７）、およびオレイルアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０８）が挙げられる。
【０１１５】
さらなる実施形態として、１以上のエポキサイド残基を含有する、ｃｉｓ−単不飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸、脂肪酸エステル、または脂肪酸アルコールの由来のシクロプロパン化脂質、例えば、ベルノリン酸メチルエステルシクロプロパン（例えば、ＢＲ−１０９）などが挙げられる。
【０１１６】
特定の実施形態において、本発明に使用される、シクロプロパン化した化合物の基礎を形成するＰＵＦＡとして、これらに限らないが、アラキドン酸（ＡＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が挙げられる。本発明の方法における使用のための例示的化合物として、ドコサヘキサエン酸メチルエステルヘキサシクロプロパン（ＢＲ−１１１）；エイコサペンタエン酸メチルエステルペンタシクロプロパン（ＢＲ−１１４）；およびアラキドン酸メチルエステルテトラシクロプロパン（ＢＲ−１１５）が挙げられる。
【０１１７】
さらなる特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有するドコサヘキサエン酸のシクロプロパン化ＰＵＦＡ誘導体である：
【化１】
【０１１８】
式中、ＲはＨまたはアルキル基である。特定の実施形態では、Ｒは、ＣＨ３（ＢＲ−１１１またはＤＨＡ−ＣＢ６メチルエステルまたはメチル−３−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）プロパノエートである。
【０１１９】
別の特定の実施形態において、ＰＵＦＡ誘導体は、以下の構造を有する：
【化２】
【０１２０】
この化合物は、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５またはメチル４−（２（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）ブタノエートメチルエステル）である。
【０１２１】
さらなる別の特定の実施形態において、ＰＵＦＡ誘導体は、以下の構造を有する：
【化３】
【０１２２】
この化合物は、ＢＲ−１１５（ＡＡ−ＣＰ４またはメチル４−（２−（（２−（（２−（（−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）ブタノエートメチルエステル）である。
【０１２３】
さらに別の特定の実施形態において、ＰＵＦＡ誘導体は、以下の構造を有する：
式中、Ｒは、Ｈまたはアルキルエステルである。特定の実施形態では、ＲはＣＨ３である。
【０１２４】
本発明における使用に対して想定された、天然にシクロプロパン化またはエポキシ化したＭＵＦＡＳまたはそのエステルもしくはアルコール誘導体として、マルベニン酸（ｍａｌｖｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ベルノリン酸、およびステルクリン酸が挙げられる。例示的化合物はベルノリン酸メチルエステル（ＢＲ−１１７）である。
【０１２５】
合成方法
脂肪酸、ならびにそのエステルおよびアルコールは、天然の供給源、例えば、魚油、アマニ油、ダイズ、アブラナ油、もしくは藻などからの精製により得るもしくは生成することができ、または微生物酵素の合成と化学合成の組合せを使用して合成することもできる。一例として、脂肪酸メチルエステルは、メタノールおよび同種のアルカリ触媒を使用して、精製油／食用タイプの油のトリグリセリドのエステル交換により生成することができる。
【０１２６】
炭化水素における二重結合のシクロプロパン化の方法は周知である。一例として、改質されたＳｉｍｍｏｎｓ−Ｓｍｉｔｈ反応は、二重結合をシクロプロパンへ変換するための標準的方法である。ＴａｎａｋａおよびＮｉｓｈｉｚａｋｉ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．２００３年；１３巻：１０３７〜１０４０頁；ＫａｗａｂａｔａおよびＮｉｓｈｉｍｕｒａ、Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．１９６７年；２４巻：５３〜５８頁；ならびにＤｅｎｍａｒｋおよびＥｄｗａｒｄｓ、Ｊ．ＯｒｇＣｈｅｍ．１９９１年；５６巻：６９７４頁。この反応において、金属カルベノイド、例えば、メチレンアイオダイドおよびジエチル亜鉛などでのアルケンの処理は、結果としてアルケンのシクロプロパン化を生じる。Ｉｔｏら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ．１９８８年；６巻：３２７頁も参照されたい。メチルエステルのシクロプロパン化もまた、触媒としての酢酸パラジウム（ＩＩ）の存在下、ジアゾメタンを使用して行われた。Ｇａｎｇａｄｈａｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’ Ｓｏｃｉｅｔｙ．１９８８年；６５巻（４）：６０１〜６０６頁。
【０１２７】
エポキシ化の方法もまた周知であり、有機溶媒中の脂肪酸ジオキシランの反応を通常含む。Ｓｏｎｎｅｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’ Ｓｏｃｉｅｔｙ．１９９５年；７２巻（２）１９９〜２０４頁。一例として、ＰＵＦＡ二重結合のエポキシ化は、エポキシ化薬剤としてジメチルジオキシラン（ＤＭＤ）を使用して達成することができる。Ｇｒａｂｏｖｓｋｉｙら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ．２００６年；８９巻（１０）：２２４３〜５３頁。
【０１２８】
治療方法
本発明は、本明細書中に開示されているＰＵＦＡ誘導体を使用した、病原性のＡβに伴う神経系疾患、例えばＡＤおよび脳卒中などの治療を想定している。本発明はまた、本明細書中に開示されているＰＵＦＡ誘導体を使用した、病原性のＡβに伴う神経系疾患の予防を想定している。任意の特定の機序に限定されることなく、ＰＫＣεの選択的活性化は、結果としてＴＡＣＥの活性化の増加を生じることができ、同時にＡβの産生を低下させる。しかし、これは主に非神経細胞、例えば線維芽細胞などに生じているようである。ＰＫＣεの活性化はまた、ＡＤにおける病原性タウタンパク質の過リン酸化を減少させることもできる。ＰＫＣεの活性化はまた、シナプス形成を誘発し、またはＡＤにおけるまたは脳卒中後のアポトーシスを防止することもできる。ＰＫＣεの活性化はまた、ＧＳΚ−３βの阻害を介して、Ａβ−媒介性神経毒性からラット神経細胞を保護することもできる。ＰＫＣεアクチベーターはまた、ＰＫＣα／εの下方制御に対するＡβの作用に反作用することもでき、これによって、Ａβ誘発性変化を逆行させるまたは防止することもできる。別の可能な作用機構は、Ａβ−分解酵素、例えばエンドセリン変換酵素などの活性化である。実施例で提示された実験結果は、これが作用機構となり得ることを示唆している。
【０１２９】
さらに別の機構は、ＰＫＣ−結合したＭ１およびＭ３ムスカリンの受容体の刺激によるものであってよく、これは、ＴＡＣＥにより、非アミロイド合成ＡＰＰプロセシングを増加させると報告されている。Ｒｏｓｓｎｅｒら、Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１９９８年；５６巻：５４１〜５６９頁。ムスカリン作用剤は、３ｘ遺伝子組み換えＡＤマウスを認知障害から救い、一部はＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７非アミロイド合成経路を活性化することによって、Ａβおよびタウ病態を減少させる。Ｃａｃｃａｍｏら、Ｎｅｕｒｏｎ．２００６年；４９巻：６７１〜６８２頁。ムスカリン受容体シグナル伝達は、ＰＫＣに密接に結ばれている。ムスカリン受容体ｍＲＮＡは、ＰＫＣにより調節され、Ｍ１ムスカリン受容体活性化により生じる神経細胞の分化は、ＰＫＣにより媒介される。Ｂａｒｎｅｓら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１９９７年；６０巻：１０１５〜１０２１頁；Ｖａｎｄｅｍａｒｋら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００９年；３２９巻（２）：５３２〜４２頁。
【０１３０】
本発明の方法による治療に対して想定される他の障害として、気分障害、例えばうつ病性障害および双極性障害、統合失調症、関節リウマチ、癌、循環器疾患、２型糖尿病、さらにこれらだけに限らないが、背景技術において言及されたものを含めて、ＰＵＦＡまたはＭＵＦＡが有利であることが示された任意の他の障害などが挙げられる。
【０１３１】
製剤および投与
ＰＵＦＡ誘導体は、これらが血液−脳バリアを通過することを可能にする任意の経路による投与に有用な用量単位で生産することができる。血漿のＰＵＦＡは、脳を通過することができることが実証されている。Ｒａｐｏｐｏｒｔら、Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．２００１年．４２巻：６７８〜６８５頁。例示的経路として、経口、非経口、経粘膜、鼻腔内、吸入、または経皮経路が挙げられる。非経口の経路として、静脈内、細動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、側脳室内、くも膜下腔内、および脳内の投与が挙げられる。
【０１３２】
本発明の化合物は、従来の方法により製剤化することができる。ＰＵＦＡ誘導体化合物は、標準的製剤で対象に提供することができ、任意の薬学的に許容される添加剤、例えば賦形剤、滑沢剤、希釈剤、着香剤、着色剤、緩衝剤および崩壊剤などを含むことができる。標準的製剤は、当技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０００年を参照されたい。
【０１３３】
一実施形態において、化合物は、固体の経口投与剤形で製剤化する。経口投与に対して、例えば、ＰＵＦＡに対して、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、アルファ化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはカルシウムリン酸水素）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などと共に従来の手段で調製した錠剤またはカプセル剤の形態を取ることができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によりコーティングすることもできる。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態を取ることができ、またはこれらは、使用前に水または他の適切なビヒクルと共に構成するための乾燥製品として提供することもできる。このような液体製剤は、薬学的に許容される添加剤、例えば懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体または水素化した食用の脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）などと共に従来の手段で調製することができる。製剤はまた、必要に応じて緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味料を含有することもできる。
【０１３４】
一例として、薬物Ｏｍａｃｏｒ（登録商標）は、オメガ−３ＰＵＦＡのエチルエステルの濃縮した組合せを含有する。各１ｇカプセル剤は、薬物ラベルによると、少なくとも９００ｍｇのオメガ−３脂肪酸のエチルエステル、主にＥＰＡ（４６５ｍｇ）およびＤＨＡ（３７５ｍｇ）を含有する。Ｏｍａｃｏｒ（登録商標）は、低カロリーの黄色の油を充填した１グラムの透明な軟ゼラチンカプセルとして、１日最高４回まで投与する。本発明のＰＵＦＡ化合物を投与するために同様の組成物を使用することができるが、ただし本発明はＰＵＦＡ誘導体のより低い投与量の使用を想定している。ＰＵＦＡの安定した蝋−エステルの製剤は、ｎ−３ＰＵＦＡおよび長鎖アルコール（１８〜２２個の炭素原子）を多く含む化学量論の量のエチルエステルのエステル交換による、ｎ−３ＰＵＦＡおよび長鎖アルコール（１８〜２２個の炭素原子）を多く含む化学量論の量のエチルエステルのエステル交換によるものが記載されている。Ｇｏｒｅｔｔａら、Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ−Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ ｕｎｄ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ．２００２年；３５巻（５）：４５８〜６５頁。
【０１３５】
別の実施形態において、ＰＵＦＡ化合物は、非経口投与用に製剤化される。化合物は、注射、例えば、大量瞬時投与または持続的な点滴などの非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤は、アンプルなどの単位剤形、または多数回容器などの形態で、保存剤を添加して提供することができる。組成物は、例えば、懸濁液、溶液、分散液、または油性または水性のビヒクル中のエマルジョンなどの形態を取ることができ、製剤化剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などを含有することもできる。
【０１３６】
特定の実施形態では、本発明のＰＵＦＡ誘導体は、疎水性の担体と共に投与される。疎水性の担体として、包接錯体、分散液（例えばミセル、マイクロエマルジョン、およびエマルジョン）、およびリポソームなどが挙げられる。例示的疎水性担体として、包接錯体、ミセルおよびリポソームなどがある。これらの製剤は、当技術分野で既知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ編集：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ ２００３年）。本発明のＰＵＦＡ誘導体は、例えば、担体の総質量の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０質量％を疎水性担体に取り込むことができる。加えて、他の化合物が、例えば製剤を安定化させるために、疎水性担体または溶液剤のいずれかの中に含まれていてもよい。
【０１３７】
前に記載した製剤に加えて、ＰＵＦＡ誘導体はまた、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型製剤は、埋め込み（例えば皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、化合物は、適切なポリマーまたは疎水性物質（例えば許容可能な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、または難溶性の誘導体、例えば、難溶性の塩などと共に製剤化することができる。
【０１３８】
別の実施形態において、ＰＵＦＡ誘導体は、小嚢、特にミセル、リポソームまたは米国特許出願第１１／６４８，８０８号、Ａｌｋｏｎらに記載されたような人工ＬＤＬ粒子で届けることができる。
【０１３９】
投与のための投与量は、１日当たり１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１ｇ、極めて好ましくは２５０ｍｇ〜５００ｍｇの化合物を届けるために適切に調製することができる。局所的投与または非経口製剤用に調製する場合、最終製剤の０．０１質量％〜６０質量％、好ましくは０．１質量％〜３０質量％、極めて好ましくは１質量％〜１０質量％を含有する処方で作ることができる。最適な１日の投与量は、当技術分野で知られている方法で判定することになるが、例えば患者の年齢および他の臨床的に関連する要因などの要因により影響を受けることになる。
【０１４０】
併用薬物療法
ＰＵＦＡ化合物は、ＡＤまたはＡβに関連する他の神経学的障害を有する患者を治療するために、障害を治療するために同様に使用される他の薬物と併用して使用することができる。ＡＤの治療に対して米国で認可された、例示的、非限定的な薬理作用のある物質として、コリンエステラーゼ阻害剤、例えばＡｒｉｃｅｐｔ（登録商標）（ドネペジル）、Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標）（リバスチグミン）、Ｒｅｍｉｎｙｌ（登録商標）（ガランタミン）など、およびＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、例えばＮａｍｅｎｄａ（登録商標）（メマンチン）などが挙げられる。他の有望な治療薬として、プロテアーゼ阻害剤（例えば、米国特許第５，８６３，９０２号；第５，８７２，１０１号を参照）；Ａβ産生阻害剤、例えば米国特許第７，０１１，９０１号；第６，４９５，５４０号；第６，６１０，７３４号；第６，６３２，８１２号；第６，７１３，４７６号；および第６，７３７，４２０号に記載のものなど；Ａβ凝集モジュレーター、第６，３０３，５６７号；第６，６８９，７５２号に記載のものなど；ならびにＢＡＣＥ阻害剤、例えば米国特許第第６，９８２，２６４号；第７，０３４，１８２号；第７，０３０，２３９号に開示ものなどが挙げられる。脳卒中の治療のために使用される例示的薬物として、アスピリン、抗血小板薬剤、例えば組織プラスミノゲンアクチベーターまたは他の抗凝血剤などが挙げられる。
【０１４１】
ある特定の実施形態において、本発明は、これだけに限らないがベンゾラクタム大環状ラクトンを含めた他のＰＫＣアクチベーターとの併用療法を想定している。ブリオスタチン１は、ＰＫＣをモジュレートし、結果として、非アミロイド形成経路への、ＴＡＣＥによるＡＰＰの切断を増加させることが示されている大環状ラクトンである。ブリオスタチンは、ウミウシの記憶保持の持続時間を、５００％を超えて増加させることができ、ラットの学習速度を劇的に増加させることができた。米国特許出願第１０／９１９，１１０号；Ｋｕｒｚｉｒｉａｎら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ．２００６年；２１０巻（３）：２０１〜１４頁；Ｓｕｎ ａｎｄ Ａｌｋｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２００５年；５１２巻（１）：４３〜５１頁を参照されたい。他の非限定的なＰＫＣアクチベーターは、審議中の米国特許出願番号第１２／０６８，７４２号、Ａｌｋｏｎらにおいて記載されている。
【０１４２】
例えば内因性のＴＡＣＥ阻害剤を阻害することによって、または内因性のＴＡＣＥアクチベーターを増加させることによって、ＴＡＣＥを間接的に増加させる薬物との併用。ＰＫＣを直接活性化する代替的手法は、内因性アクチベーター、ジアシルグリセロールのレベルを増加させることである。ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤、例えば６−（２−（４−［（４−フルオロフェニル）フェニルメチレン］−１−ピペリジニル）エチル）−７−メチル−５Ｈ−チアゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−５−オン（Ｒ５９０２２）および［３−［２−［４−（ビス−（４−フルオロフェニル）メチレン］ピペリジン−１−イル）エチル］−２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−４（１Ｈ）−キナゾリノン（Ｒ５９９４９）などは、内因性リガンドジアシルグリセロールのレベルを強化し、これによって、ＰＫＣの活性化が生じる。Ｍｅｉｎｈａｒｄｔら、（２００２年）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ １３巻：７２５頁。
【０１４３】
さらなる別の実施形態は、ＢＡＣＥ阻害剤との併用療法である。ＢＡＣＥ阻害剤は、既知であり、ＣｏＭｅｎｔｉｓ Ｉｎｃ．が所有するＣＴＳ−２１１６６が挙げられ、これはヒト治験において陽性結果を示した。他のＢＡＣＥ阻害剤は、公開された国際ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０１９０８０およびＢａｘｔｅｒら、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７年；５０巻（１８）：４２６１〜４２６４頁において記載されている。
【０１４４】
併用療法において使用される化合物は、相容性の場合、本発明のＰＵＦＡ化合物と同じ製剤で投与してもよいし、または別個の製剤として投与してもよい。
【０１４５】
治療の評価
本発明のＰＵＦＡ誘導体を用いた治療の評価は、疾患の症状または臨床代理マーカーにおける評価の改善により行うことができる。例えば、治療したＡＤ対象における記憶または認知スキルの改善は、病原性のＡβ蓄積が減少していることを示唆し得る。認知表現型の例として、これらに限らないが、健忘、失語症、失行症および認知不能症が挙げられる。精神医学的症状の例として、これらに限らないが、人格変化、うつ病、幻覚および妄想が挙げられる。１つの非限定的な例として、ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、第４版（ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎより出版）は、アルツハイマータイプの認知症に対する基準を含有する。
【０１４６】
ＡＤの表現型発現はまた、物理学的、例えばＡβプラークの直接的（撮像）または間接的（生化学的）検出などによるものであってよい。Ａβのインビボの撮像は、造影剤として放射性ヨウ化フラボン誘導体を使用し（Ｏｎｏら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００５年；４８巻（２３）：７２５３〜６０頁）、アミロイド結合染料、例えば、４０−残基放射性ヨウ化Ａペプチド（１２５Ｉ−ＰＵＴ−Ａ１−４０を生成）（血液−脳バリアを通過してＡβプラークと結合することが示された）に結合したプトレシンを用いて達成することができる。Ｗｅｎｇｅｎａｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０００年；１８巻（８）：８６８〜７２頁。Ａβの撮像はまた、スチルベン［１１Ｃ］ＳＢ−１３およびベンゾチアゾール［１１Ｃ］６−０Ｈ−ＢＴＡ−１（［１１Ｃ］ＰＩＢとしても知られている）を使用して示された。Ｖｅｒｈｏｅｆｆら、Ａｍ Ｊ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００４年；１２巻：５８４〜５９５頁。
【０１４７】
末梢血におけるＡβ（１−４０）の定量化は、高速液体クロマトグラフィーを、線形イオントラップでのタンデム質量分析と一緒に使用して実証された。Ｄｕら、Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｔｅｃｈ．２００５年；１６巻（４）：３５６〜６３頁。蛍光相関分光法による、アルツハイマー型患者の脳脊髄液中の単一Ａβタンパク質凝集体の検出もまた記載されている。Ｐｉｔｓｃｈｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９８年；４巻：８３２〜８３４頁。米国特許第５，５９３，８４６号は、可溶性Ａβを検出するための方法を記載している。抗体を使用した、終末糖化産物（ＲＡＧＥ）のためのＡβペプチドおよび受容体の間接的検出もまた記載されてきた。最後に、色素生産性基質を使用した、脳脊髄液中の増加したＢＡＣＥ−１活性の生化学的検出もまた、ＡＤの診断用または予後の指標として仮定されてきた。Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００６年；５２巻：１１６８〜１１７４頁。
【０１４８】
ＡＤを評価するための現在の手段として、初期の、進行性のおよび顕著なエピソード記憶喪失の臨床的コアの観察にＡＤに特徴的な１以上の異常なバイオマーカー（生物学的指標）を加えたものが挙げられるが、これにはＭＲＩで示されるような側頭葉萎縮の病理解剖（廃棄）；脳脊髄液中の異常なＡβタンパク質濃度；脳のＰＥＴスキャンにおけるグルコース代謝の減少を示す特定のパターン；および近親内での関連する遺伝子変異が含まれる。
【実施例】
【０１４９】
例１：患者集団および細胞培養
アルツハイマー病患者（ＡＤ）、非ＡＤ認知症（ハンチントン病、パーキンソン病および前頭側頭認知症）患者、および年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）症例のヒト皮膚線維芽細胞を、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）から入手した。線維芽細胞は、１０％ＦＢＳを補充した低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ中で維持し、培養して実験前に１００％コンフルエンスにした。異なる１０例のＡＤ患者（４つの家族性タイプおよび６つの散発性；これらの中で、１０例のうち９例は、病理解剖で確認した）、１１例のＡＣおよび８例のハンチントン病、１例のパーキンソン病および１例の前頭側頭型認知症が研究（表：１）に対して検討された。ＡＤ症例の平均年齢は６９．６±１３．０１（ＳＤ）才であり、ＡＣ症例の平均年齢は６３．３６４±７．６５（ＳＤ）才であり、非ＡＤ認知症症例の平均年齢は５６．４４±９．７（ＳＤ）才であった。
【０１５０】
タンパク質の単離：細胞を含有するフラスコを１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３×洗浄し、細胞スクレーパーを使用して細胞を収集した。収集した細胞を１．５ｍｌの微小遠心管に移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。得た細胞ペレットをホモジナイズ緩衝液中に懸濁させ（１０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ ＮａＦ）、３０秒の間超音波処理した。ホモジネートを、４℃でｌ０分間、１００００ｒｐｍで再び遠心し、上清を収集し、タンパク質評価のために新しいチューブに移した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキットを使用して全タンパク質濃度を測定した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）。
【０１５１】
免疫ブロット分析：タンパク質可溶化液（それぞれタンパク質２０μｇ）を２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液内で１０分間煮沸し、４〜２０％グラジエントＴＲＩＳ−グリシンゲルを使用して分離した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、この膜をＢＳＡで、室温で（ＲＴ）１５分間遮断し、１：２０００希釈の抗−ＰＫＣ−εウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ．；Ｃａｔ Ｎｏ：ｓｃ−２１４）、および１：５０００希釈の抗βチューブリン、クラスＩＩＩウサギモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ、Ｃａｔ Ｎｏ：０４−１０４９）と共に１時間ＲＴでインキュベートした。インキュベーション後、膜部分を標準的ウエスタンブロット洗浄緩衝液で３×洗浄し、さらにアルカリホスファターゼ結合した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）１：１００００希釈と共に４５分間インキュベートした。この膜部分を標準的なウエスタンブロット洗浄緩衝液で最後に３×洗浄し、１−ステップＮＢＴ−ＢＣＩＰ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して発色させた。シグナル強度の画像をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＲＴ−ＥＣＬ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で記録し、ＩＭＡＬソフトウエア（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ、ＷＶ）を使用して濃度定量化を実施した。ＰＫＣ−εに対してこのように定量化した強度を、各レーンについてβ−チューブリンに対して正規化した。
【０１５２】
免疫蛍光：線維芽細胞を、低密度で充填したスライド（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）内で培養した。免疫蛍光染色のため、細胞を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３×で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで４分間固定した。固定に続き、細胞を遮断し、１×ＰＢＳ中の５％血清および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で３０分間透過処理した。細胞を１×ＰＢＳで３×洗浄し、ウサギポリクローナルＰＫＣ−ε抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）と共に１時間、１：１００希釈でインキュベートした。インキュベーション後、１×ＰＢＳ中でスライドを３×洗浄し、ＦＩＴＣ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）と共に１時間、１：４００希釈でインキュベートした。細胞を洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２’−フェニルインドール、ジヒドロクロリド）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）でも着色した。最後に、スライドを洗浄し、グリセロールＰＢＳ封入液中に固定し、ＬＳＭ ７１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、ＤＡＰＩおよびＦＩＴＣに対してそれぞれ３５０ｎｍおよび４９０ｎｍ励起、ならびに４７０ｎｍおよび５２５ｎｍ発光で観察した。５つの個々の視野を６３×オイルレンズ拡大率で取り込み、各チャネルで平均蛍光強度（ＭＦＩ）を分析した。
【０１５３】
ＲＴ−ＰＣＲ：Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して、製造者のプロトコルに従い、ＲＮＡを約１×１０６細胞から単離した。簡単に説明すると、オリゴｄＴおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して、５０℃で１時間２μｇのＲＮＡを逆転写した。ＰＫＣ−εに対するプライマーを使用して（フォワードプライマー−ＡＧＣＣＴＣＧＴＴＣＡＣＧＧＴＴＣＴＡＴＧＣ、リバースプライマー−ＧＣＡＧＴＧＡＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡ）、およびβ−チューブリン（フォワードプライマー−ＴＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧ、リバースプライマーＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＧＧＣ）（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、２μｌのｃＤＮＡ生成物を増幅した。５５℃アニーリング温度での２５サイクルの増幅に続いて、Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）内でアンプリコンを分析した。Ｆｕｊｉ Ｉｍａｇｅゲルスキャナー（ＦＬＡ−９０００、Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）を使用してゲル画像を記録し、ＩＭＡＬソフトウエア（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ、ＷＶ）を使用して濃度定量化を実施した。３つの独立した実験について、ＰＫＣ−ε ＯＤ（光学密度）と、β−チューブリンＯＤとの正規化した比としてデータを表示した。
【０１５４】
可溶性のオリゴマーＡβの調製：Ｎｏｇｕｃｈｉら、（２００９年）により記載された方法に従いオリゴマーＡβを調製した。本方法で生成されたＡβは、極めて神経毒性のある、アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）と呼ばれる１０〜１５ｎｍの球状のＡβ集合体であると報告された。ＡＳＰＤの合成のため、Ａβ１−４２（Ａｎａｓｐｅｃ、ＵＳＡ）を１００μΜの濃度で、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルロ（ｈｅｘａｆｌｕｒｏ）−２−プロパノール中に、４℃で一晩、次いで３７℃で３時間溶解した。最後に、溶解したＡβを、アリコット（４０ｎｍｏｌ／チューブ）の中で凍結乾燥させた。凍結乾燥したＡβを、１μΜ濃度で、５０％ＰＢＳ中に溶解し、４℃で１４時間ゆっくりと回転させた。インキュベーションを流して、１００ｋＤａ分子量のカットオフフィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を使用して有毒なＡＳＰＤを精製した。１００ｋｄａを超える分子量の保持液を、線維芽細胞を処理するために使用した。
【０１５５】
オリゴマーＡβ１−４２での皮膚線維芽細胞の処理：ＡＤとＡＣ症例の両方の皮膚線維芽細胞を、１００％コンフルエンスまで７日間培養した。コンフルエント細胞は、これらが１００％コンフルエントになった後で、５００ｎＭ（最終濃度）のＡＳＰＤで、３７℃で２４時間処理した。インキュベーションに続いて、細胞を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３×洗浄し、以前に記載されたウエスタンブロット法用に処理した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＲＴ−ＥＣＬ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して、結果として得たＰＫＣ−εに対するバンド強度を定量化し、ＩＭＡＬソフトウエア（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ、ＷＶ）を使用して、濃度分析を実施した。
【０１５６】
例２：脂肪酸メチルエステルシクロプロパン化脂肪酸メチルエステルの合成。
【０１５７】
シクロプロパン化脂肪酸の合成。クロロヨードメタンおよびジエチル亜鉛を使用した、改変されたＳｉｍｍｏｎｓ−Ｓｍｉｔｈ反応を使用して、多価不飽和脂肪酸のメチルエステルをシクロプロパン化した（Ｔａｎａｋａら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．２００３年；１３巻：１０３７〜４０頁；Ｆｕｒｕｋａｗａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．１９６７年；５３〜５８頁；Ｄｅｎｍａｒｋら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１年；５６巻：６９７４〜８１頁）。すべての装置は、６０℃で１時間ベーキングし、乾燥窒素を用いた炎光を使用して乾燥させた。撹拌子および温度プローブを有する１００ｍｌの３口丸底フラスコを、氷−ドライアイスの混合物で取り囲み、２５ｍｌのジクロロメタン中の１．２５ｇ（４．２４ｍｍｏｌ）のリノール酸メチルエステルまたはドコサヘキサエン酸メチルエステルを充填し、Ｎ２でバブリングした。２４インチの長さの２０ゲージニードルを使用して、ジエチル亜鉛（５１ｍｌ、５４．９４ｍｍｏｌ）のヘキサン中１Ｍ溶液を嫌気的に添加し、溶液を−５℃に冷却した。絶え間なく撹拌しながら、ジヨードメタン（８．２ｍｌ、１０１．８８ｍｍｏｌ）またはクロロヨードメタン（ＣｌＣＨ２Ｉ）を毎秒一滴ずつ滴下添加した。必要に応じて添加速度を低下させることで、この反応混合物を２℃以下に維持した。この反応中にて反応混合物は濁り、不溶性の白色の亜鉛生成物を遊離した。フラスコを密閉し、この混合物を１時間反応させておき、次いで２時間に渡りゆっくりと室温に戻した。
【０１５８】
フード内での爆発性残渣の形成を防止するため、ジエチル亜鉛は蒸発させなかった。混合物を撹拌しながら、１００ｍｌの水の中へゆっくりと注ぎ入れ、あらゆる過剰なジエチル亜鉛を分解した。エタンが生成した。この混合物をガラス遠心管内で、５０００ｒｐｍで遠心させ、上部の水層を廃棄した。白色沈殿物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機相と合わせた。有機相を水で洗浄し、遠心した。ヘキサンプラス１％酢酸エチルを使用して、シリカゲルＧ ＴＬＣで生成物を分析し、ｎ−ヘキサン中の増加する濃度の１〜１０％酢酸エチルを使用して、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製し、窒素下で蒸発させると、無色の油としてメチルエステルが残った。
【０１５９】
Ｓｉｍｍｏｎｓ−Ｓｍｉｔｈ反応は、出発物質の立体配置を保存する。Ｆｕｒｕｋａｗａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．１９６７年；５３〜５８頁。ドコサヘキサエン酸メチルエステルを、９０〜９５％収率でＤＨＡ−ＣＰ６へと変換した。生成物は、無色の油であり、エタノール中での単一の吸収度は２０２ｎｍで最大であり、Ｉ２との反応はなかった。ＩＲスペクトルは、３０７０および１４５０ｃｍ−１でのシクロプロパン環の吸収を示した。同じ条件下で、エイコサペンタエン酸メチルエステルをＥＰＡ−ＣＰ５に変換し、アラキドン酸メチルエステルをＡＡ−ＣＰ４に変換した。リノール酸メチルエステルをＤＣＰ−ＬＡメチルエステルに変換したが、これは、既知の試料と等しかった。
【０１６０】
メチルエステルの加水分解。メチルエステル（０．１５ｇ）を１ｍｌの１Ｎ ＬｉＯＨおよび１ｍｌのジオキサン中に溶解した。ジオキサンおよびメタノールを、それが均一になるまで添加し、この溶液を６０°で一晩撹拌した。生成物をＣＨ２Ｃｌ２中に抽出し、遠心した。水層および白色の界面を水で再抽出し、白色層が形成されなくなるまで洗浄した。生成物をＮ２下で蒸発させ、シリカゲル上でのクロマトグラフィーで精製した。ｎ−ヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃの中で生成物である無色の油を溶出した。１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン中のＴＬＣおよびＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣで、２０５ｎｍでのＵＶ検出を使用して、その純度をチェックした。
【０１６１】
エポキサイド基は、従来の手段、例えば適切なアルケンをｍ−クロロ過安息香酸またはｔ−ブチルヒドロペルオキシドで酸化することによって、導入することができる。
【０１６２】
合成した他の化合物として、図１に表されているものが挙げられる（ＢＲ−１０１〜ＢＲ−１１８）。
【０１６３】
例２：ドコサヘキサエン酸を使用した精製したＰＫＣイプシロンの活性化
プロテインキナーゼＣアッセイ。組換えＰＫＣ（１ｎｇのアルファまたはイプシロンアイソフォーム）を、１０マイクロモルのヒストン、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２μｇ／μｌのホスファチジル−Ｌ−セリン、０．１８μｇ／μｌの１，２ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＡＧ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ ＥＧＴＡ、４％グリセロール、８μｇ／ｍｌのアプロチニン、８μｇ／ｍｌのロイペプチン、および２ｍＭ ベンズアミジンの存在下、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）と混合した。０．５マイクロＣｉ［γ３２Ｐ］ＡＴＰを添加した。このインキュベーション混合物を、総量１０マイクロリットルで、３７度で１５分間インキュベートした。１×２ｃｍのセルロースホスフェート紙片（Ｗｈａｔｍａｎ Ｐ８１）の上にこの反応混合物をスポットすることによって、この反応を中止し、即時に０．５％Ｈ３ＰＯ４中で２回、１時間に渡り洗浄した。このセルロースホスフェートの紙片をシンチレーションカウンターでカウントした。一部の実験では、ホスファチジルセリン、ジアシルグリセロール、および／またはカルシウムを取り除いた。
【０１６４】
ＤＨＡメチルエステルは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。ＰＫＣアイソザイムは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。精製されたＰＫＣεは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【０１６５】
結果
精製されたＰＫＣεを使用したＰＫＣ測定は、試験した最低の濃度（１０ｎＭ）において、化合物ＢＲ−１０１は、２．７５倍のＰＫＣεの活性化を生じたことを示した。ＰＫＣαは、影響を受けなかった（データは示されていない）。化合物ＢＲ−１０２はまた、活性化されていないＰＫＣεのおよそ１．７５倍までＰＫＣεの活性化を選択的に誘発した。低濃度でＰＫＣεを活性化するこれら化合物の有効性は、これらが優れた治療的候補となることを示唆している。
【０１６６】
例３：他のＰＫＣアクチベーターを使用した、精製されたまたは細胞のＰＫＣイプシロンの活性化
材料。培地はＫ−Ｄ Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得た。Ａβ１−４２はＡｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から購入した。多価不飽和脂肪酸メチルエステルはＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩから入手した。他の化学薬品はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。ＰＫＣアイソザイムは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手した。精製されたＰＫＣεはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【０１６７】
細胞培養。ラット海馬Ｈ１９−７／ＩＧＦ−ＩＲ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）をポリ−Ｌ−リジンコーティングしたプレートにプレーティングし、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で、３５℃で数日間培養し、およそ５０％カバー度が得られるまでこれを続けた。次いで細胞は、３９℃で、培地を、１０ｎｇ／ｍｌ塩基性の線維芽細胞成長因子を含有する５ｍｌのＮ２培地で置きかえることによって、神経細胞表現型へと分化するように誘導し、Ｔ−７５フラスコ内で、３７℃で培養した。ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロブラストーマ細胞（ＡＴＣＣ）は、４５％Ｆ１２Ｋ／４５％ＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で培養した。マウスＮ２Ａニューロブラストーマ細胞は、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中でグルタミンなしで培養した。１８日齢の胎仔のラット海馬の神経細胞。
【０１６８】
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの脳を、ポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でコーティングされた１２−または９６−ウェルプレート上で、０．５ｍＭグルタミンおよび２５μΜグルタメート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含有するＢ−２７ ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地内でプレーティングし、培地内で３日間グルタメートなしで培養した。５％ＣＯ２下、３７℃で維持したインキュベーター内で神経細胞を１４日間培養した。
【０１６９】
培養細胞に対するすべての実験は、他に述べられていない限り、３回重複して行った。すべてのデータ点は、平均値±ＳＥとして表示されている。ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）は、すべての実験においてその遊離酸で使用し、その一方で、ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５）、およびＢＲ−１１６（ＡＡ−ＣＰ４）は、これらのメチルエステルで使用した。
【０１７０】
プロテインキナーゼＣアッセイ。ラットの海馬細胞を培養し、０．２ｍｌの均質化緩衝液（２０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＦ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン、および０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）中ですくい取り、超音波処理により、Ｍａｒｓｏｎｉｘ マイクロ−プローブソニケーター（５秒、１０Ｗ）内でホモジナイズした。ＰＫＣを測定するため、１０μｌの細胞ホモジネートまたは精製されたＰＫＣアイソザイム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入）を、１０μΜヒストン、４．８９ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２μｇ／μｌのホスファチジル−Ｌ−セリン、０．１８μｇ／μｌの１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ ＥＧＴＡ、４％グリセロール、８μｇ／ｍｌのアプロチニン、８μｇ／ｍｌのロイペプチン、および２ｍＭベンズアミジンの存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。０．５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを添加し、前に記載した通り、ホスホセルロース上への吸着により３２Ｐ−ホスホタンパク質の形成を測定した。ＮｅｌｓｏｎおよびＡｌｋｏｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９５年；６５巻：２３５０〜５７頁。ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）および同様の化合物による活性化の測定のため、ジアシルグリセロールおよびホスファチジルセリンの非存在下、Ｋａｎｎｏらにより記載された通り、ＰＫＣ活性を測定し、添加したＥＧＴＡおよびＣａＣｌ２の非存在下、Ｋａｎｎｏら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２００６年；４７巻：１１４６〜５０頁で記載の通り、ＰＫＣδ、ε、η、およびμを測定した。高濃度のＣａ２＋は、ＰＫＣホスファチジルセリン結合部位と相互作用し、活性化を防止するので、低濃度のＣａ２＋を使用する。ブリオスタチン活性化の測定に対して、１，２−ジアシルグリセロールは、他に述べられていない限り、省略した。
【０１７１】
結果および考察
これらのＰＫＣアイソザイム特異性を判定するため、新しい化合物を精製されたＰＫＣと共に５分間プレインキュベートし、ＰＫＣ活性を放射分析により測定した。上の例２に対して示されているように、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）は、１０μΜでＰＫＣの効果的なアクチベーターであるが、他のＰＫＣアイソフォームに対する作用は比較的低かった（データは示されていない）。より高い濃度では、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）は、ＰＫＣδ（およそ１〜１００μΜ）を部分的に阻害し、ＰＫＣγ（５０〜１００μΜ）を活性化した（データは示されていない）。
【０１７２】
ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５）、およびＢＲ−１１５（ＡＡ−ＣＰ４）は、それぞれドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、およびアラキドン酸のシクロプロパン化誘導体であるが、精製されたＰＫＣεを同じ程度まで活性化した。ＰＫＣを活性化するために必要な濃度は、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）に対する濃度よりも約１００分の１低く、これはより高い親和性を示唆した。シクロプロパン化リノレニルおよびリノレイルアルコール（ＢＲ−１０４およびＢＲ−１０５）、エポキシステアリン酸（ＢＲ−１１６）、およびベルノリン酸メチルエステル（ＢＲ−１１７）は、ＰＫＣに対する作用がわずかにあるか、またはなかった。シクロプロパン化ベルノリン酸メチルエステル（ＢＲ−１０９）は、１μΜより上の濃度でＰＫＣεを阻害した。
【０１７３】
ジアシルグリセロール結合部位に結合したＰＫＣアクチベーターは、ブリオスタチン、グニジマクリン、およびホルボールエステルなどを含めて、ＰＫＣ活性の一時的な活性化を生じ、続いてより長い下方制御が生じた。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２００９年；３４巻：１３６〜４５頁。これを培養したラット海馬細胞において確認した。ブリオスタチンと共にラットＨ１９−７／ＩＧＦ−ＩＲ細胞（０．０４ｎＭおよび０．２ｎＭ）をインキュベートすることで、２倍の活性化を生じ、これが３０分間持続し、続いて２０％の下方制御があり、２４時間でベースラインに戻った（データは示されていない）。対照的に、ＤＣＰ−ＬＡに曝露されたＰＫＣは、少なくとも４時間の間高いままであった。この持続性の活性化は、初代神経細胞内でしか観察されなかった。
【０１７４】
ブリオスタチンは、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３−アセテート（ＰＭＡ）（ＥＣ５０＝１．３５ｎＭ対１０ｎＭ）よりもＰＫＣに対して高い親和性を有するにもかかわらず、ブリオスタチンは、ＰＫＣの下方制御においてＰＭＡより効果が極めて低かった。ＰＫＣ活性は、８時間でホルボールエステルにより強力に下方制御されているが、その一方で、ブリオスタチンで処理した細胞のＰＫＣは、ベースライン上またはその付近にある（データは示されていない）。この差は、ｄａ Ｃｒｕｚ ｅ Ｓｉｌｖａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００９年：１０８巻：３１９〜３０頁で報告された、ＰｄＢｕにより生じるＡβの増加を説明し得る。これらの研究者は、１μΜ ＰｄＢｕを培養されたＣＯＳ細胞に８時間適用し、Ａβの増加を観察した。この増加は、ホルボールエステルによるＰＫＣの下方制御に起因するものであったが、これらの結果と一致する。下方制御は、ＤＣＰ−ＬＡに対して、および関連化合物に対して測定することができなかった。
【０１７５】
例４：Ａβ産生および分解に対するＰＫＣアクチベーターの作用
細胞培養。例３に対して上で記載されているように細胞培養を実施した。
【０１７６】
Ａβの測定および細胞生存度アッセイ。Ａβ １−４２ヒト蛍光分析ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造者の指示書に従いＡβを測定した。Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダーで結果を測定した。製造者の指示書に従い、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅおよびＣｙＱｕａｎｔ ＮＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で測定を行った。
【０１７７】
結果および考察
Ａβ産生に対するＰＫＣε活性化の効果を測定するため、本発明者らは、多量のＡβを産生する、ヒトＡＰＰＳ ｗｅ／ＰＳＩＤを形質移入したマウスｎｅｕｒｏ２ａ（Ｎ２ａ）神経芽細胞腫細胞を使用した。Ｐｅｔａｎｃｅｓｋａら、ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９６年；７４巻：１８７８〜８４頁。様々な濃度のＰＫＣアクチベーター、ブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）との、これらの細胞の２４時間のインキュベーションは、細胞内と分泌されたＡβの両方のレベルを著しく減少させた。ジアシルグリセロール結合部位への結合によりＰＫＣを活性化するブリオスタチンを用いた場合、阻害は二相性であり、２０ｎＭ以上の濃度では正味の影響はない。これは、このクラスのＰＫＣアクチベーターが高濃度で使用された場合の、ＰＫＣを下方制御するその能力から説明することができる。対照的に、ＰＫＣのホスファチジルセリン部位に結合するＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）は、１０〜１００μΜまでの濃度で阻害を単調に増加させ、より高い濃度では下方制御の証拠がないことを示した。
【０１７８】
ＰＫＣアクチベーターにより引き起こされるＡβレベルの減少は、Ａβ合成の阻害またはＡβ分解の活性化が原因であったかどうか判定するため、本発明者らは、ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（０．０１〜１０μΜ）および低濃度（１００ｎＭ）の外因性の単量体Ａβ−４２を、培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に適用した。このＡβ濃度は低すぎて、測定可能な毒性または細胞死を生じない。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は微量のＡβしか産生しないので、この実験は、ＰＫＣアクチベーターのＡβ分解を強化する能力の効果的な試験であった。２４時間で、大部分のＡβが細胞により取り込まれ培地内のＡβ濃度は検出不能であった。０．０１〜１０μΜのＤＨＡ−ＣＰ６の細胞への添加は、Ａβの細胞レベルを４５〜６３％減少させたが、これは、ＰＫＣεアクチベーターが外因性のＡβの分解速度を増加させたことを示した。
【０１７９】
ＤＨＡ−ＣＰ６、ブリオスタチン、およびＤＣＰ−ＬＡは、アラマーブルーおよびＣｙＱｕａｎｔ染色で測定した場合、細胞生存または増殖に対して効果がなく、これは、Ａβ産生の減少が、細胞増殖または細胞生存の変化から生じなかったことを示している。
【０１８０】
例５：ＴＡＣＥ活性に対するＰＫＣアクチベーターの効果
ＴＡＣＥアッセイ。５μｌの細胞ホモジネート、３μｌの緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ７．４プラス２５ｍＭ ＮａＣｌプラス４％グリセロール）、および１μｌの１００μΜ ＴＡＣＥ基質ＩＶ（Ａβｚ−ＬＡＱＡＶＲＳＳＳＲ−ＤＰａ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を１．５ｍｌポリプロピレン遠心管内で、３７°で２０分間インキュベートすることによりＴＡＣＥを測定した（Ｊｉｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２年；３０２巻：２６９〜７５頁）。４℃まで冷却することにより、この反応を停止した。試料を１ｍｌに希釈し、Ｓｐｅｘ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ ２蛍光分光計内で蛍光を素早く測定した（ｅｘ＝３２０ｎｍ、ｅｍ＝４２０ｎｍ）。
【０１８１】
結果および考察
以前の研究者らは、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３−アセテートなどのＰＫＣアクチベーターは、ｓＡＰＰαの増加およびＡβの低下と相関するＴＡＣＥ活性において大きな増加を生じ、これはＡＰＰ基質の利用可能性に対してＴＡＣＥおよびＢＡＣＥ１が競合していることを示唆し、ＰＫＣアクチベーターは、この競合をＴＡＣＥ優位へとシフトさせることを報告した。Ｂｕｘｂａｕｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８年；２７３巻：２７７６５〜６７頁；Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６年：１０３巻：８２１５−２０頁。しかし、これら以前の研究の多くは、線維芽細胞および他の非神経細胞型において行われ、これら細胞は、ＰＫＣアクチベーターに対して神経細胞とは異なる反応をするようである。例えば、Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙらは、１０ｐＭ〜１００ｐＭブリオスタチンによるヒト線維芽細胞におけるＰＫＣの活性化が、α−セクレターゼ活性の初期速度をそれぞれ１６倍および１３２倍増加させたことを発見した（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６年）。しかし、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロブラストーマ細胞、Ｎ２ａマウス神経芽細胞腫細胞、およびラット海馬の初代神経細胞において、ＰＫＣアクチベーターであるブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）および／またはＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）は、ＴＡＣＥ活性においてわずかな増加しか起こさなかった。これは、ＰＫＣアクチベーターによる神経細胞のＡβレベルの減少が、ＴＡＣＥの活性化以外のいくつかの他の機構により引き起こされているに違いないことを示唆している。
【０１８２】
例６：エンドセリン変換酵素活性に対するＰＫＣアクチベーターの効果
ＥＣＥアッセイ。ＳＨ−Ｓ７５７ニューロブラストーマ細胞を、ブリオスタチン（０．２７ｎＭ）、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）（１μΜ）、およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（１μΜ）と共にインキュベートした。エンドセリン−変換酵素（ＥＣＥ）を、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＡｈｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００年；２８６巻：１１２〜１１８頁の方法を使用して蛍光分析により測定した。細胞ホモジネート試料（２０μｌ）を、５０ｍＭ ＭＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ６．０、０．０１％ Ｃ１２Ｅ１０（ポリオキシエチレン−１０−ラウリルエーテル）、および１５μΜ ＭｃａＢＫ２（７−メトキシクマリン−４−アセチル［Ａｌａ７−（２，４−ジニトロフェニル）Ｌｙｓ９］−ブラジキニントリフルオロアセテート塩）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）内でインキュベートした。３７℃で６０分後、トリフルオロ酢酸を０．５％まで添加することによって、この反応をクエンチした。試料を水で１．４ｍｌに希釈し、蛍光を、ｅｘ＝３３４ｎｍ、ｅｍ＝３９８ｎｍで測定した。
【０１８３】
結果および考察
Ａβは、インスリン分解酵素（インスリジン）、ネプリライシン、およびＥＣＥを含めたいくつかの酵素で、インビボで分解することができる。ＰＫＣεの過剰発現は、ＥＣＥを活性化することが報告されているので（Ｃｈｏｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６年；１０３巻：８２１５〜２０頁）、本発明者らは、ＥＣＥに対するＰＫＣアクチベーターの効果を試験した。ブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）、およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）はすべて、ＥＣＥ活性の持続的増加を生じた。ＥＣＥは、ジアシルグリセロール結合ＣＩドメインを有さないので、これは、ブリオスタチンによる活性化は、ＥＣＥの直接的活性化によるものではなく、ＰＫＣによる、ＥＣＥまたはいくつかのＥＣＥ活性化中間体のリン酸化から生じるものに違いないことを示唆している。この結果はまた、ＰＫＣアクチベーターによる間接的活性化ＥＣＥは、患者におけるＡβのレベルを減少させる有用な手段となり得ることを示唆している。
【０１８４】
ＰＫＣεを特異的に活性化する、本発明のＰＵＦＡ誘導体などの化合物の利点は、これらが、ホルボールエステルおよび同様の１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）類似体と比べてあまり下方制御を生じないことにある。ＤＡＧに基づくアクチベーターへのＰＫＣの二相性の反応とは、ＰＫＣアクチベーターは、ある時点においてＡβレベルを減少させ、別の時点ではこれらを増加させることを意味する。ｄａ Ｃｒｕｚ ｅ Ｓｉｌｖａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００９年；１０８巻：３１９〜３３０頁。意図するものと反する効果を回避するためには、慎重な投薬および患者のモニターが必要とされる。この新しいクラスのＰＫＣアクチベーターは、ＰＫＣを下方制御する能力に比較的劣るため、この問題は回避することができる。
【０１８５】
参考文献
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示全体が本明細書によって参照により本明細書中に組み込まれている、１０１０年２月２２日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／３０６，９２２号、および２０１０年７月８日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／３６２，５１２号、および２０１０年７月９日に出願された米国仮出願シリアル番号第６１／３６２，８９３号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、対照対象のＰＫＣイプシロンレベルと比較したヒト患者におけるＰＫＣイプシロンタンパク質レベルの比の変化を検出することにより、ヒト患者においてアルツハイマー病を診断する方法に関する。本明細書中に開示されているアルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーは、アルツハイマー病の診断およびアルツハイマー病を治療または予防するための化合物を同定するためのスクリーニング法に有用である。本発明はまた、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるための方法であって、１以上のヒト細胞を、無接触のヒト細胞と比較してＰＫＣイプシロンレベルを上げるために効果的な、ある量のＰＫＣアクチベーターと接触させるステップを含む方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
認知症の最も多くみられる形態であるアルツハイマー病（ＡＤ）は、近時記憶の喪失と共に始まり、脳における２つの主な病理学的特徴：細胞外アミロイド斑および細胞内の神経原線維変化を伴う。これらは通常、シナプシスの顕著な損失を伴う。アミロイド斑は、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼ経路によるアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の切断により生成されるＡβペプチドオリゴマーの凝集により形成され、αセクレターゼは、無毒性のシナプス形成性の可溶性ＡＰＰ−αを生成する。蓄積された監察結果により、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アイソザイム−αおよび−εは、直接的にＡＰＰのα−セクレターゼ媒介性切断を直接的に活性化し（Ｓｌａｃｋら、１９９３年；Ｋｉｎｏｕｃｈｉら、１９９５；Ｊｏｌｌｙ−ＴｏｒｎｅｔｔａおよびＷｏｌｆ、２０００年；Ｙｅｏｎら、２００１年、Ｌａｎｎｉら、２００４年）、および／または細胞外シグナル調節キナーゼのリン酸化を介して間接的に活性化する（ＥＲＫ１／２）（Ｄｅｖａｒｉら、２００６年、Ａｌｋｏｎら、２００７年）ことが示されている。ＰＫＣシグナル伝達経路は、ＡＤの神経変性病態生理における重要な事象、例えば、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）媒介性のＡβの分解などを調節していることも多くの観察結果により示されている（Ｎｅｌｓｏｎら、２００９年）。ＡＤ−遺伝子組み換えマウスにおけるＰＫＣ−εのインビボでの過剰発現は、アミロイド斑を減少させた（Ｃｈｏｉら、２００６年）。他の研究では、ＡＤに特異的な病理学的異常を、血液、皮膚線維芽細胞および眼組織を含めた脳以外の組織において発見することができるという証拠が提供された（Ｇｕｒｒｅｉｒｏら、２００７年、Ｒａｙら、２００７年）。ＡＤの皮膚線維芽細胞において、例えば、特定のＫ＋チャネル（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、１９９３年；１９９４年）、ＰＫＣアイソザイム（Ｇｏｖｏｎｉら、１９９３年、Ｆａｖｉｔら、１９９８年）、Ｃａ＋シグナル伝達（Ｉｔｏら、１９９４年）、ＭＡＰキナーゼＥｒｋｌ／２リン酸化（Ｚｈａｏら、２００２年；ＫｈａｎおよびＡｌｋｏｎ、２００６年）、およびＰＰ２Ａ（Ｚｈａｏら、２００３年）の欠陥が発見された。家族性ＡＤ患者に関して、皮膚線維芽細胞はＡβ分泌の強化を示したが（Ｃｉｔｒｏｎら、１９９４年；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、１９９４年）、その一方で、健常なヒト線維芽細胞では、特定のＫ＋チャネルのＡＤ特異的な減少が、Ａβ１−４０により誘発された（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、１９９３年；１９９４年）。最近、皮膚線維芽細胞における、病理解剖により確認された内部対照のリン酸化Ｅｒｋ１／２末梢バイオマーカーが、有望な感度および特異性を有することを示した（ＫｈａｎおよびＡｌｋｏｎ、２００６年；２０１０年）。さらなる他の研究は、ＡＤ患者の脳の特定領域におけるＰＫＣの欠損を示唆した（Ｍａｓｌｉａｈら、１９９１年）。最後に、ＰＫＣ−αおよび−εの薬理学的アクチベーターは、ＡＤのすべての病理学的および認知の異常特性から、２つの異なる系統のＡＤマウスを保護することができることも最近実証された（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、２０１１年）。これらの観察結果と一致して、ＰＫＣ−αおよび−εは、ＡＤ遺伝子組み換えマウスにおいて顕著に減少していることが判明し、ＰＫＣ−αおよび−εの薬理学的アクチベーターを用いた治療により正常レベルまで回復した（Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、２０１１年）。
【０００４】
総合的に、これらおよび他の以前の研究は、２つの重要な意味を有する：Ｉ．ＡＤは、症候の因果関係が脳機能に限られる全身の病態発現であり、ＩＩ．ＰＫＣアイソザイム、特に−αおよび−εは、シナプシスの損失、Ａβおよびアミロイド斑の生成、ならびに神経原線維変化におけるタウのＧＳＫ−３β媒介性過リン酸化を含むＡＤ病態の主要な側面の調節において重要な役割を果たしている。これらの理由から、本発明者らは、定常状態レベルで、ＡＤ、年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）およびＡＤ認知症でない（非ＡＤＤ）患者の皮膚線維芽細胞のＰＫＣ−εを分析した。この報告は、可溶性Ａβオリゴマーの適用により誘発されるＰＫＣ−εならびにこれらのレベルの変化が、末梢組織におけるＡＤのための診断の基礎を提供することができることを明らかにする。
【０００５】
アルツハイマー病を診断するため、およびアルツハイマー病の治療および予防に有用な化合物をスクリーニングするための、高度に感受性で高度に特異的な試験に対する必要性が存在する。本発明者らは、これまでに知られている診断用試験と比較して高度に感受性で高度に特異的なアルツハイマー病の診断に有用な、アルツハイマー病に特異的な独自の分子バイオマーカーを初めて同定した。したがって、本明細書中に開示されている独自のアルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーは、アルツハイマー病の検出および診断に対して高度な感受性および特異性を有する診断法の基礎となる。本発明の、アルツハイマー病に特異的な独自の分子バイオマーカーはまた、アルツハイマー病の治療および予防において治療薬として使用することができる化合物を同定するためのスクリーニング法において有用である。本発明者らはまた、ヒト患者においてＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるための方法を発見した。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＰＫＣイプシロンレベルが、年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）よりも、アルツハイマー病対象（ＡＤ）において低いという驚くべき所見に基づく。特定の実施形態において、本発明は、ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、ａ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、ｂ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを、対照対象のＰＫＣイプシロンレベルと比較するステップとを含み、前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルが前記対照対象のＰＫＣイプシロンレベルより低い場合、前記方法は、前記ヒト対象におけるアルツハイマー病を示す方法を対象とする。
【０００７】
診断方法の特定の実施形態において、前記ＰＫＣイプシロンレベルは、１以上の細胞において測定される。特定の実施形態において前記ＰＫＣイプシロンレベルは、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである。特定の実施形態において、ＰＫＣイプシロンレベルは、ＲＴ−ＰＣＲにより測定される。特定の実施形態において、対照対象は、アルツハイマー病を有さない。特定の実施形態において、本発明の診断方法は、インビトロで行われる。
【０００８】
本発明の特定の好ましい実施形態において、前記１以上の細胞は、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である。
【０００９】
特定の実施形態において、ＰＫＣイプシロンステップのレベルを測定または判定するステップは、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む。
【００１０】
特定の実施形態において、前記ヒト対象の前記ＰＫＣイプシロンレベルが前記対照対象のＰＫＣイプシロンレベル以上である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される。
【００１１】
特定の好ましい実施形態において、本発明は、ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、ａ）ヒト対象から１以上の細胞を得るステップと、ｂ）前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、ｃ）ステップ（ａ）の前記１以上の細胞を、ＰＫＣイプシロンアクチベーターである薬剤と接触させるステップと、ｄ）ステップ（ｃ）の前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを、ステップ（ｃ）における前記接触の後に判定するステップとを含み、ステップ（ｄ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルより大きい場合、アルツハイマー病が前記ヒト対象において示される方法を対象とする。
【００１２】
特定の実施形態において、ステップ（ｄ）で判定された前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベル以下である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される。
【００１３】
特定の実施形態において、本発明は、ヒト対象におけるアルツハイマー病の進行を判定またはモニターする方法であって、ａ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、ｂ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを、対照対象のＰＫＣイプシロンレベルと比較するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）における前記比較に基づいて、前記アルツハイマー病の進行を判定またはモニターするステップとを含む方法を対象とする。
【００１４】
特定の実施形態において、時間と共にアルツハイマー病が進行するにつれて、前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルは低下する。
【００１５】
特定の実施形態において、アルツハイマー病の進行が逆行するにつれて、ＰＫＣイプシロンレベルは前記ヒト対象において増加する。
【００１６】
特定の好ましい実施形態において、本発明は、細胞のＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるための方法であって、１以上のヒト細胞を、無接触のヒト細胞と比較して前記細胞のＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるために効果的なある量のＰＫＣアクチベーターと接触させるステップを含む方法を対象とする。
【００１７】
特定の実施形態において、前記ヒト細胞は、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である。特定の実施形態において前記ＰＫＣアクチベーターは大環状ラクトンである。特定の実施形態において、前記大環状ラクトンはブリオスタチンである。特定の実施形態において、前記ブリオスタチンはブリオスタチン１である。特定の実施形態において、前記ＰＫＣイプシロンレベルは、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明は、ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、ａ）ヒト対象から１以上の細胞を得るステップと、ｂ）前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、ｃ）ステップ（ａ）の前記１以上の細胞をＡβペプチドと接触させるステップと、ｄ）ステップ（ｃ）の前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを、ステップ（ｃ）における前記接触の後に判定するステップとを含み、ステップ（ｄ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルと有意に異ならない場合、アルツハイマー病が前記ヒト対象において示される方法を対象とする。
【００１９】
特定の実施形態において、ステップ（ｄ）で判定された前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベル未満である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明は、ＰＫＣイプシロンに特異的な１以上の抗体を含むキットを対象とする。特定の実施形態において前記キットは、ＰＫＣアクチベーターを含み得る。特定の実施形態において、前記キットは、ＰＫＣイプシロンアクチベーターを含み得る。特定の実施形態において、前記キットは、ＰＫＣイプシロンをコードしている遺伝子に特異的な１以上のオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明は、ＰＫＣイプシロンをコードしている遺伝子に特異的な１以上のオリゴヌクレオチドを含むキットを対象とする。特定の実施形態において、前記キットは、ＰＫＣアクチベーターを含み得る。特定の実施形態において、前記キットは、ＰＫＣイプシロンアクチベーターを含み得る。
【００２２】
特定の実施形態において、本発明は、アルツハイマー病の治療に有用な化合物を同定する方法であって、ａ）アルツハイマー病対象から１以上の細胞を得ることと、ｂ）前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定することと、ｃ）前記細胞を候補化合物と接触させることと、ｄ）前記接触させるステップ（ｃ）の後に前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定することとを含み、ステップ（ｄ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルより大きい場合、前記候補化合物がアルツハイマー病の治療に有用な化合物であると同定される方法を対象とする。
【００２３】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アイソザイム、特に−αおよび−εは、シナプシスの損失、Ａβおよびアミロイド斑の生成、ならびに神経原線維変化におけるタウのＧＳＫ−３β媒介性過リン酸化を含む、ＡＤ病態の主要な側面の調節において重大な役割を果たしている。ＡＤ特異的シグナル伝達の欠損の証拠が、例えば、血液、皮膚線維芽細胞、および眼組織などの末梢組織においてこれまで発見されている。ＡＤ皮膚線維芽細胞において、ＰＫＣ−εは、正確なＡＤバイオマーカーである。
【００２４】
特定の実施形態において、ＰＫＣ−εの基本タンパク質レベルは、ＡＤ患者、年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）の症例、および非ＡＤ認知症患者の培養した皮膚線維芽細胞において、ウエスタンブロット法、蛍光抗体法によって、および転写レベルでＲＴ−ＰＣＲによって測定することができる。１１名のＡＣ、および１０名のＡＤ対象が、病理解剖において脳内にアミロイド斑および神経原線維変化が存在する散発性と家族性の両方の症例から選択される（１０例のＡＤ症例のうち９例が病理解剖で確認された）。非ＡＤの特徴の遺伝学的徴候を有する８名の遺伝性ハンチントン病（ＨＤ）患者、１名のパーキンソン病患者、および１名の前頭側頭型認知症患者を含めることによって、ＰＫＣ−εの欠如は、ＡＤ病態のみによるものであることを確証する。
【００２５】
すべてのＡＤ線維芽細胞のＰＫＣ−εレベルは、ＡＣおよび非ＡＤ認知症の線維芽細胞よりも低いことが見出される。ＡＤ（０．５０１±０．０２１、Ａ．Ｕ．）における平均ＰＫＣ−εは、βチューブリンに対して正規化した場合、ウエスタンブロット法において、ＡＣ（０．８５７±０．０３６、Ａ．Ｕ．）よりも約４０％低く、非ＡＤ認知症（１．０４０±０．２８８、Ａ．Ｕ．）の症例よりも非常に低いことが見出される。同様の変化が、免疫蛍光分析後においても見出される。ＰＫＣ−εのｍＲＮＡレベル（ＡＣ：０．９０４±０．１０３、ＡＤ：０．５３０±０．０６１）もまた、ＡＤ患者のものより低くなっていることが見出される。オリゴマーＡβを皮膚線維芽細胞に適用後、ＰＫＣ−εレベルは、ＡＣの線維芽細胞では低下しているが、ＡＤ患者では低下しておらず、これは、ＰＫＣ−εに対する病態生理学的Ａβの作用を示している。
【００２６】
本発明者らは、ＰＫＣ−εレベルが、健常なＡＣおよび非ＡＤ認知症の症例と比較して、培養したＡＤの皮膚線維芽細胞で顕著に低くなっていることを発見している。ＰＫＣ−εは、診断用の抹消バイオマーカーであり、ＡＤのための治療標的である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂ：年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、および非ＡＤ認知症の培養されたヒト線維芽細胞におけるＰＫＣ−εの発現。値は、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭである。
【００２８】
図１Ａ：ＡＣ、ＡＤ、および非ＡＤ認知症線維芽細胞におけるＰＫＣ−εおよびβ−チューブリンの免疫反応性。それぞれ、ＡＣ１、ＡＣ２、およびＡＣ３（ＡＧ０７７１４、ＡＧ１１７３４およびＡＧ１２９２７）は年齢をマッチさせた対照の線維芽細胞であり、ＡＤｌ、ＡＤ２およびＡＤ３（ＡＧ０６８４４、ＡＧ０４１５９およびＡＧ０８２４５）はアルツハイマー病の線維芽細胞であり、ＨＤ１およびＨＤ２（ＧＭ０６２７４、ＧＭ０４１９８）はハンチントン病線維芽細胞である。
【００２９】
図１Ｂ：１１のＡＣ、１０のＡＤ、８のＨＤ、１つのパーキンソン病（ＰＤ）および１つの前頭側頭型認知症（ＦＴ）におけるＰＫＣ−εとβ−チューブリンとの、正規化した濃度比のグラフによる提示。ＡＣ細胞において、比は、０．７〜１．２（Ｙ軸）の間で変化し、非ＡＤ認知症において、この比は、０．７２〜１．３の間で変化した（２つの例外がＨＤ６およびＨＤ８）が、その一方で、ＡＤにおけるすべての細胞株の比は、０．６以下であった。パネルＢの挿入図：ＡＣ細胞の平均値は、０．８５７±０．０３６１（ＳＥＭ）であり、非ＡＤ認知症の平均値は、１．０４０±０．２８８であり、ＡＤ細胞の平均値は、０．５０１±０．０２１であった。ＰＫＣ−εは、ＡＤにおいて、ＡＣ（ｐ＜０．０００１）および非ＡＤ認知症（ｐ＝０．０３９４）と比較して有意に低かった。ＡＣ１１（０．６２１３±０．０４０）の平均値は、ＡＣの中で最低であった。しかし、すべてのＡＤ症例と比較した場合にもまた有意に異なっていた（Ｐ＝０．０１６２）。
【図２】図２Ａおよび２Ｂ：年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）線維芽細胞の培養されたヒト線維芽細胞におけるＰＫＣ−εの免疫蛍光検出。
【００３０】
図２Ａ：年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）、およびアルツハイマー病線維芽細胞（ＡＤ）の共焦点顕微鏡像。緑色のチャネル（ＦＩＴＣ）は、ＰＫＣ−εを表し、青色のチャネルは、（ＤＡＰＩ）核染色指標であり、第３のチャネルは、融合した画像を示す。緑色（ＰＫＣ−εに対する）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、５つのＡＣおよびＡＤ線維芽細胞のそれぞれの５つの異なる視野についてすべての細胞から測定する。値は平均値±ＳＥＭである。
【００３１】
図２Ｂ：５つのＡＣ症例（ＡＧ０７７１４、ＡＧ１１７３４、ＡＧ０５８４０、ＡＧ０６２４２およびＡＧ１２９２７）および５つのＡＤ症例（ＡＧ０６８４４、ＡＧ０４１５９、ＡＧ０６８４０、ＡＧ０５７７０およびＡＧ０８２４５）のＰＫＣ−εのＭＦＩ（平均値蛍光強度）のグラフによる提示。ＡＣ細胞において、ＭＦＩは１５〜２０Ａ．Ｕ．の間で変化したが（Ｙ軸）、その一方でＡＤにおいては、領域は、７〜１０の間である。ＡＣおよびＡＤにおけるＰＫＣ−εの平均強度は、それぞれ１８．０９２±２．０８７および９．１１０±１．４２０であった。
【図３】図３Ａおよび３Ｂ：ＰＫＣ−εのＲＴ−ＰＣＲ分析。
【００３２】
図３Ａ：ｍＲＮＡを３つのＡＣ、３つのＡＤおよび２つのＨＤの症例から単離した。ＰＫＣ−ε、およびβ−チューブリンのＲＴ−ＰＣＲアンプリコンを、Ｅ−Ｇｅｌで作動し、Ｆｕｊｉゲルスキャナーで撮像した。（ＡＣｌ、ＡＣ２およびＡＣ３：それぞれＡＧ１１３６３、ＡＧ０９９７７およびＡＧ１２９９８；ＡＤ１、ＡＤ２およびＡＤ３：それぞれＡＧ０６２６３、ＡＧ１０７８８およびＡＧ０８２５９；ＨＤ１およびＨＤ２：それぞれＧＭ０２１６５およびＧＭ０４２２６）。
【００３３】
図３Ｂ：（ａ）３つのＡＣ、３つのＡＤおよび２つのＨＤに対するβ−チューブリンに関するＰＫＣεの正規化数を表しているヒストグラム。値は、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。（ｂ）ＡＤ細胞の平均ＰＫＣ−εｍＲＮＡレベルは、ＡＣ細胞（ＡＣ：０．９０４±０．１０３、ＡＤ：０．５３０±０．０６１およびＨＤ：０．７０１±０．１４３）より有意に（ｐ＜０．００３３）低かった。
【図４】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ：可溶性Ａβオリゴマーは、アルツハイマーのＰＫＣ−ε表現型ヒト線維芽細胞を誘発する。
【００３４】
図４Ａ：Ａβ１−４２の、合成したＡβオリゴマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー、レーンｏＡβ：可溶性Ａβオリゴマー。
【００３５】
図４Ｂ：すべての年齢をマッチさせた対照の皮膚線維芽細胞（５つのＡＤおよび５つのＡＣ症例）において、可溶性Ａβオリゴマー（５００ｎＭ）での処理は、ＰＫＣ−εを低下させる。ＰＫＣ−εの正規化した濃度の平均値を５つの異なる細胞株（Ａβオリゴマーで処理した皮膚線維芽細胞および未処理の皮膚線維芽細胞）から算出した。いずれの場合も、ＡＣ値は、ＡＤ平均値を１つの値としてみなして算出した。ＡＣは、Ａβ治療後、ＰＫＣ−ε発現の有意な低下を示した（ｐ値は、それぞれＡＣ１、ＡＣ２、ＡＣ３、ＡＣ４およびＡＣ５に対して、０．００４４、０．００３５、０．０００５、０．０３３０および０．０２５３である）が、ＡＤ症例は、発現において低下を示さなかった。
【００３６】
図４Ｃ：Ａβオリゴマーでの処理は、ＡＣをＡＤ表現型に変えた。ＰＫＣ−εレベルは、Ａβオリゴマーで処理したＡＣおよびＡＤ細胞において有意な差を示さなかったが、未処理の細胞においてＡＤは、ＡＣと比較して発現が４０％減少したことを示した（Ｐ＝０．０２９２）。
【図５】ＰＫＣ−εとＡβとの相互作用、アルツハイマー病との関係。ＡＤ病態において、より高いβ−、γ−セクレターゼ活性によるＡβの過剰生産およびより低いα−セクレターゼ活性は、ＰＫＣ−εの量を低下させる。他方ではＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εは、α−セクレターゼ活性を増加させ、ＰＫＣ−εはまたＡβ分解酵素、特にＥＣＥ（エンドセリン変換酵素）の活性を増加させる。
【図６】本発明による使用に対して予期される分子の構造体（ＢＲ−１０１からＢＲ−１１８）。
【図７】アルツハイマー病の進行、または認知障害の重症度、または疾患持続時間の関数としての、時間の経過によるＰＫＣイプシロンレベルの減少の概略図。ＰＫＣイプシロンレベルは、活性レベル、例えばＲＴ−ＰＣＲにより測定される、１以上の細胞のタンパク質レベルまたは転写レベルであってよい。
【図８】ブリオスタチンは、Ｔｇ２５７６マウス（５×ＦＡＤ）における穿孔した線維中のＰＫＣεの損失を防止する。
【図９】ブリオスタチンを有するおよび有さない穿孔した線維中のＰＫＣε。
【発明の詳細な説明】
【００３７】
本明細書で使用する場合、「ＰＫＣイプシロンレベル」という用語は、これらに限らないが、以下のうちのいずれか１つ以上を含む：ＰＫＣイプシロンの酵素活性、ＰＫＣイプシロンタンパク質の量、またはＰＫＣイプシロンをコードしているＲＮＡの量。
【００３８】
「脂肪酸」は、およそ４〜３０個の炭素を含有する非分枝の脂肪族鎖を有するカルボン酸であり、最も長い鎖の脂肪酸は、１０〜２４個の炭素を含有する。脂肪酸は、飽和または不飽和であってよい。飽和脂肪酸は、鎖に沿っていかなる二重結合または他の官能基も含有しない。不飽和脂肪酸は、１以上のアルケニル官能基を含有する。すなわち、鎖に沿って二重結合を含有する。「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」という用語は、１より多くの二重結合を含有する脂肪酸を意味する。３種類のＰＵＦＡが存在する：オメガ−３ＰＵＦＡ、オメガ−６ＰＵＦＡ、およびオメガ−９ＰＵＦＡである。オメガ−３ＰＵＦＡにおいて、第１の二重結合は、鎖内の最後の炭素から３個離れた炭素に見出される（オメガ炭素）。オメガ−６ＰＵＦＡにおいて、第１の二重結合は、鎖から６個離れた炭素において見出され、オメガ−９ＰＵＦＡにおいて、第１の二重結合は、オメガ炭素から９個目の炭素である。
【００３９】
ＰＵＦＡはまた、「ポリエン脂肪酸」とも呼ばれる。本明細書で使用する場合、ＰＵＦＡという用語は、天然に生じた脂肪酸と合成脂肪酸との両方を含む。ＰＵＦＡの主要な供給源は、海産魚および脂肪種子作物由来の植物油であるが、商業的に開発された植物油において見出されるＰＵＦＡは、通常リノール酸およびリノレン酸に限られる（１８：３デルタ９，１２，１５）。
【００４０】
「ｃｉｓ−ＰＵＦＡ」は、隣接する炭素原子が、二重結合と同じ側にあるものである。
【００４１】
略語Ｘ：Ｙは、Ｘの炭素原子とＹの二重結合とを含有するアシル基を示す。例えば、リノール酸は、１８：２に短縮される。
【００４２】
「メチレン遮断されたポリエン」とは、単一のメチレン群により互いに分離している２つ以上のｃｉｓ二重結合を有するＰＵＦＡを指す。
【００４３】
「非メチレン遮断されたポリエン」または「ポリメチレン遮断された脂肪酸」とは、１つより多いメチレン基により分離された２つ以上のｃｉｓ二重結合を有するＰＵＦＡを指す。
【００４４】
「単不飽和脂肪酸」（ＭＵＦＡ）は、脂肪酸鎖内に単一の二重結合を有する脂肪酸であり、鎖内の残りのすべての炭素原子が一重結合されている。例示的ＭＵＦＡとして、オレイン酸、ミリストレイン酸およびパルミトレイン酸が挙げられる。
【００４５】
「ｃｉｓ単不飽和脂肪酸」とは、隣接する水素原子が、二重結合の同じ側にあることを意味する。
【００４６】
共役した脂肪酸、例えば、共役したリノール酸（９−シス、１１−ｔｒａｎｓ−オクタデカジエン酸）などは、隣接する炭素上の２つの二重結合である共役ジエンを有する。一部の証拠は、共役リノール酸は、抗腫瘍活性を有することを示唆している。
【００４７】
例示的ＰＵＦＡとして、リノレン酸（９，１２−オクタデカジエン酸）；γ−リノレン酸（ＧＬＡ；６，９，１２−オクタデカトリエン酸）；α−リノレン酸（９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）；アラキドン酸（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）；エイコサペンタン酸（ＥＰＡ；５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタン酸）；ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ；７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）；ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）；およびステアリドン酸（６，９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）が挙げられる。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「シクロプロパン」という用語は、環を形成するために互いに連結された３個の炭素原子からなり、各炭素原子が２個の水素原子を保持している、分子式Ｃ３Ｈ６を有するシクロアルカン分子を指す。
【００４９】
「エポキシド」とは、３個の環原子を有する環状鎖エーテルを指す。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「ＰＵＦＡ誘導体」とは、二重結合のうちの少なくとも１つが、シクロプロパン化またはエポキシ化している、ＰＵＦＡ、またはアルコールまたはそのエステルを指す。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「ＭＵＦＡ誘導体」とは、二重結合がシクロプロパン化またはエポキシ化している、ＭＵＦＡ、またはアルコールまたはそのエステルを指す。
【００５２】
ＰＫＣεの「選択的活性化」とは、本発明のＰＵＦＡ誘導体化合物が、いかなる他のＰＫＣアイソザイムよりも検出可能な程度までＰＫＣεを活性化することを意味する。具体的な実施形態において、ＰＵＦＡ誘導体は、例えば、本明細書中に記載されているＰＫＣ活性化アッセイを使用して測定した場合、他のＰＫＣアイソザイムよりも、ＰＫＣεを、少なくとも１倍、２倍または５倍活性化する。活性化の際に、プロテインキナーゼＣ酵素は、ＲＡＣＫタンパク質（活性化されるプロテインキナーゼＣタンパク質に対する膜結合受容体）により原形質膜へと移動する。一般的に、活性化の際に、プロテインキナーゼＣ酵素は、ＲＡＣＫタンパク質により原形質膜へと移動する。ＰＫＣ活性化の他の兆しとして、ホスファチジルイノシトール−トリスリン酸依存性キナーゼ（ＰＤＫｌ）による特定のＣ末端セリン／トレオニン残基でのリン酸化が挙げられ、ＰＫＣファミリーの各酵素においてよく保存された配列の少なくとも２つの追加のリン酸化および／または自己リン酸化が起こる。ＰＫＣの活性化は、ＳｕｎおよびＡｌｋｏｎ、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔｅｎｔｓ ＣＮＳ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００６年；１（２）：１４７〜５６頁において記載されている。
【００５３】
「神経変性」とは、神経細胞死を含めた、神経細胞の構造または機能の進行性の損失を指す。
【００５４】
本発明の目的のため、「神経系疾患」とは、ＡＰＰのβ−アミロイド形成過程を伴う任意の中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）疾患を指す。これは、これらだけには限らないが、神経細胞の損失、神経細胞の変性、神経細胞の脱髄、グリオーシス（すなわち、アストログリオーシス）、または異常なタンパク質または毒素（例えばＡβ）の神経細胞または神経細胞以外での蓄積を含めた、神経細胞またはグリア細胞の欠陥を結果として生じ得る。
【００５５】
１つの例示的神経系疾患はアルツハイマー病（ＡＤ）である。別の例示的神経系疾患は、脳アミロイド血管症とも呼ばれる、コンゴーレッド親和性血管障害（ＣＡＡ）である。
【００５６】
「アルツハイマー病」または「ＡＤ」という用語は、Ａβ堆積が中枢神経系の細胞内に最終的に蓄積することになるあらゆる状態を指す。１つの、非限定的実施形態では、Ａβ、特にＡβ１−４２ペプチドは、ＡＰＰのβ−アミロイド形成の代謝から形成される。ＡＤは、家族性の発現において遺伝性であるか、または散発性であることもある。本明細書中では、ＡＤには、表現型の発現に基づき、家族性、散発性、ならびにその中間およびサブグループが含まれる。
【００５７】
別の神経系疾患は、ダウン症候群（ＤＳ）である。ＤＳを有する対象は、ＡＤの特徴的病変である大脳アミロイド（Ａβ）プラークおよび神経原線維変化（ＮＦＴ）を常に発症する（３０代または４０代に）。最近の研究は、Ａβ４２は、ダウン症候群の脳内に堆積されたこのタンパク質の最も早期の形態であり、１２才の若い年齢の対象に見ることができ、可溶性Ａβは、Ａβプラークの形成よりもずっと前に、つまり妊娠第２１週には早くもＤＳ対象の脳内で検出することができることを示された。Ｇｙｕｒｅら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０００年；１２５巻：．４８９〜９２頁。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、哺乳動物を含む。
【００５９】
「薬学的に許容される」という句は、生理学的に許容され、対象に投与された場合に有害な反応物を通常産生しない分子的実体および組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、連邦または州政府の監督官庁により認可されている、または動物、より特定するとヒトにおける使用に対して米国薬局方または他の一般的に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。「薬学的に許容される担体」という用語は、有効成分と併用することができ、併用に続いて、これを使用して有効成分を対象に投与することができ、化合物が共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指し得る化学組成物を意味する。
【００６０】
「治療有効量」および「有効量」という用語は、測定可能な治療反応を生じることになる治療薬の量を指す。治療反応は、ユーザー（例えば、臨床医）が、療法に効果的な反応として認めたあらゆる反応であり、症状の改善および代理の臨床上のマーカーを含めたものであってよい。したがって、治療反応とは一般的に、疾患または状態、例えば、ＡＤの１以上の症状の回復または阻害である。測定可能な治療反応には、治療薬によって、症状または疾患が予防され、または発症が遅延され、またはさもなければ弱毒化するという所見も含まれる。
【００６１】
「およそ」および「約」という用語は、測定の性質または精密さを前提として、測定した量に対する許容可能な程度の誤差を一般的に意味するものとする。典型的な、例示的な程度の誤差は、所与の値または値の領域の２０パーセント（％）内、好ましくは１０％内、より好ましくは５％内である。あるいは、および特に生体系において、「およそ」および「約」という用語は、桁内であり、所与の値の好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書中に与えられている数値的な量はおおよそであり、別途述べられていない限り、明示により述べられていない場合、「およそ」または「約」という用語は、推測することができることを意味する。
【００６２】
ＰＫＣ−εレベルは、ＡＤ線維芽細胞においてより低い
この研究集団において、本発明者らは、ＰＫＣ−εが、散発性と家族性の両方の症例において機能不全であり、ＡＤ病理学的なシグナル伝達の特徴であることを試験するため、ＡＤの６つの散発性（後期発症型、家族歴なし）および４つの家族性の（早期発症型）症例を含めた。１０のＡＤ細胞株、１１の年齢ＡＣ細胞株および１０の非ＡＤ認知症線維芽細胞の免疫ブロット分析により、ＡＤ試料におけるＰＫＣ−εレベルは、ＡＣと比較して約４０％低いことが明らかになった（図１）。ＰＫＣ−εとβ−チューブリンとの平均の正規化比は、ＡＣ症例（ｎ＝１１）において０．８５７±０．０３６（ＳＥＭ）であり、非ＡＤ認知症（ｎ＝１０）において１．０４０±０．２８８であり、ＡＤ細胞（ｎ＝１０）において０．５０１±０．０２１であった。ＰＫＣ−εレベルは、ＡＣ症例と比較して、ＡＤ線維芽細胞（ｐ＜Ｏ．０００１）において有意に低かった。ＡＣの１１の症例（０．６２１３±０．０４０）に対する平均のＰＫＣ−ε基本レベルは、すべてのＡＣの中で最低であった（図１Ｂ）。しかし、ＡＣの１１のＰＫＣ−ε基本レベルはまた、すべてのＡＤ症例と別々に比較した場合、統計学的に有意であった（Ｐ＝０．０１６２）。
【００６３】
ウエスタンブロット法分析のデータは、ＡＣとＡＤ細胞との間での、ＦＩＴＣタグしたＰＫＣ−εの強度における明確な差を実証した着色した線維芽細胞の免疫蛍光分析により支持された（図２）。ＡＣおよびＡＤ細胞におけるＰＫＣ−εの平均強度は、それぞれ１８．０９２±２．０８７および９．１１０±１．４２０であった。転写レベルでの機能不全のＰＫＣ−εを試験するため、ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。３つのＡＤ、３つのＡＣおよび２つのＨＤ細胞株の平均ｍＲＮＡレベルを測定した（図３）。すべてのＰＫＣ−εのｍＲＮＡレベルを対応する細胞株のβ−チューブリンｍＲＮＡレベルで正規化した。ＡＤ細胞の平均の正規化ｍＲＮＡレベルは、ＡＣおよびＨＤ細胞より有意に低かった（ｐ＜０．００３）（ＡＣ：０．９０４±０．１０３、ＡＤ：０．５３０±０．０６１およびＨＤ：０．７０１±０．１４３）（図３）。
【００６４】
オリゴマーＡβを用いた皮膚線維芽細胞の処理
以前に記載した方法により合成したオリゴマーＡβは、１００ｋＤａを超えるサイズの分子量を有する高分子量オリゴマーを生産した（図４Ａ）。これらオリゴマーは、極めて有毒であり、ＡＤ脳内で発見されたものと類似であることが報告された（Ｎｏｕｇｕｃｈｉら、２００９年）。ＡＤの病態生理学的関連性を確証するため、外部からの毒素性オリゴマーＡβ１−４２を正常な線維芽細胞（ＡＣ）に添加し、ＰＫＣ−ε発現レベルに対する衝撃を基本的状態で評価した。オリゴマーＡβでの処理後、ＰＫＣ−εレベルは、ＡＣ症例において低下したことがわかったが、ＡＤ症例は統計的差を示さなかった。５つの異なるＡＣおよびＡＤ患者の３つの独立した実験の中間値の平均を、オリゴマーＡβ処理に続いて算出し、未治療の細胞と比較した。未治療のＡＣおよびＡＤ細胞は、これらの中で約４０％の差を示したが、治療したＡＣおよびＡＤ細胞は、ＰＫＣ−εの発現において差を実証しないか、またはＡＤ症例についてはＡβ治療後により高いこともあった。
【００６５】
本発明は、特定の態様において、試験および診断に対して特定された対象から採取したヒト細胞においてアルツハイマー病を診断する方法に関する。診断は、独自のアルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーの発見に基づく。特定の態様において、本発明は、アルツハイマー病の進行をモニターする方法およびアルツハイマー病を治療または予防するためのリード化合物の同定のためのスクリーニング法を対象とする。
【００６６】
生存しているヒトの脳内の神経細胞に直接アクセスすることは不可能なので、アルツハイマー病の初期診断は極度に困難である。本明細書中に開示されている、アルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーを測定することによって、本発明は、アルツハイマー病の初期診断のための高度な実用性、高度な特異性、および高度な選択性のある試験を提供する。さらに、本明細書中に記載されている、アルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーは、病気の進行を追跡するための、およびアルツハイマー病の治療および予防を標的とする創薬のために治療薬を特定するための基礎を提供する。
【００６７】
本発明者らは、アルツハイマー病の診断に対して高度に感受性で高度に特異的な診断用アッセイにおいて有用な末梢（非ＣＮＳ）組織を使用して、アルツハイマー病のための独自の分子バイオマーカーを発見した。本発明の大きな利点は、最小の侵襲性処置を使用して、すなわち脊椎穿刺を使用することなく、本明細書中に開示されているアッセイおよび方法で使用する組織を対象から得られることである。したがって、本発明の一態様は、アルツハイマー病の早期検出のためのアッセイまたは試験を対象とする。
【００６８】
一実施形態において本発明は、アルツハイマー病の治療または予防に有用な試験化合物（またはリード化合物）をスクリーニングするための方法であって、インビトロアッセイを含む方法を対象とする。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態では、プロテインキナーゼＣアクチベーターは、ブラジキニン、ブリオスタチン、ボンベシン、コレシストキニン、トロンビン、プロスタグランジンＦ２アルファおよびバソプレッシンからなる群から選択される。本発明さらなる実施形態において、細胞は末梢細胞である。本発明のまたさらなる実施形態において、末梢細胞は、皮膚細胞、皮膚線維芽細胞、血液細胞および口腔の粘膜細胞からなる群から選択される。本発明のまたさらなる実施形態において、細胞は、脳脊髄液から単離しない。本発明のまたさらなる実施形態において、細胞は、脳脊髄液を含まない。本発明のまたさらなる実施形態において、細胞は、脊椎穿刺または腰椎穿刺により取得しない。本発明のまたさらなる実施形態において、プロテインキナーゼＣアクチベーターを、血清を含む培地内の前記細胞と接触させる。本発明のまたさらなる実施形態において、プロテインキナーゼＣアクチベーターを、血清を含まない培地内の前記細胞と接触させる。本発明のまたさらなる実施形態において、ＰＫＣイプシロンタンパク質は、免疫アッセイによって検出される。本発明のまたさらなる実施形態において、免疫アッセイは、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫電気泳動アッセイ、ドットブロットアッセイ、またはスロットブロットアッセイである。本発明のまたさらなる実施形態において、測定は、タンパク質アレイ、ペプチドアレイ、またはタンパク質マイクロアレイを使用して行われる。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態において、ＰＫＣアクチベーターまたは医薬組成物は、以下からなる群から選択される以下の化合物のいずれかを含む：ＤＣＰ−ＬＡ；ＤＣＰＬＡメチルエステル、ＤＨＡ−ＣＰ６メチルエステル（ＢＲ−１１１）；ＥＰＡ−ＣＰ５メチルエステル（ＢＲ−１１４）；ＡＡ−ＣＰ４メチルエステル（ＢＲ−１１５）；ＤＨＡ−ＣＰ６；ＥＰＡ−ＣＰ５；ＡＡ−ＣＰ４；シクロプロパン化リノレニルアルコール（ＢＲ−１０４）；シクロプロパン化リノレイックアルコール（ＢＲ−１０５）；シクロプロパン化エライジックアルコール（ＢＲ−１０６）；シクロプロパン化エライジン酸（ＢＲ−１０７）；シクロプロパン化オレイルアルコール（ＢＲ−１０８）；シクロプロパン化ベルノール酸メチルエステル（ＢＲ−１０９）；シクロプロパン化リノレン酸（ＢＲ−１１８）；シクロプロパン化エライジン酸メチルエステル；シクロプロパン化ベルノール酸；シクロプロパン化リノレン酸メチルエステル；
８−（２（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）；
メチル３−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）プロパノエート
メチル３−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）プロパノエート（ＤＨＡ−ＣＰ６メチルエステル）
メチル４−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）−メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）ブタノエート
メチル４−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）−メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）ブタノエート（ＥＰＡ−ＣＰ５メチルエステル）
メチル４−（２−（（２−（（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）ブタノエート
メチル４−（２−（（２−（（２−（（２−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）ブタノエート（ＡＡ−ＣＰ４メチルエステル）
本発明の方法において、個体または患者から採取する細胞は、任意の生細胞であってよい。好ましくは、これらの細胞は皮膚線維芽細胞であるが、任意の他の末梢組織細胞（すなわち中枢神経系の外側）も、このような細胞が入手または処理するのにより便利である場合には、本発明の試験において使用することができる。他の適切な細胞として、これらに限らないが、血液細胞、例えば、赤血球およびリンパ球など、口腔粘膜細胞、神経細胞、例えば、嗅覚神経細胞など、脳脊髄液、尿および任意の他の末梢細胞の種類が挙げられる。加えて、比較目的のために使用される細胞は、必ずしも健常な提供者からものでなくてもよい。
【００７１】
細胞は、得たばかりの状態のものでも、または培養されたものであってよい（その全体が本明細書中に参照により組み込まれている米国特許第６，１０７，０５０号を参照）。具体的な実施形態では、パンチ皮膚生検を使用して、対象から皮膚線維芽細胞を得ることができる。これらの線維芽細胞は、本明細書中に記載されている技法を使用して直接分析するか、または細胞培養条件下に導入する。次いで、生成した培養線維芽細胞は、実施例および明細書全体を通して記載されているように分析する。分析に使用し得る他の種類の細胞、例えば口腔粘膜細胞、嗅覚細胞などの神経細胞、赤血球およびリンパ球などの血液細胞などを準備するための他のステップが必要となることもある。例えば、血液細胞は、末梢静脈から血液を取り出すことで容易に得ることができる。次いで細胞を、標準的な手順（例えばセルソータ、遠心分離などを使用）により分離し、後で分析することができる。
【００７２】
したがって、本発明は、特定の態様において、対象におけるアルツハイマー病の診断および治療のための方法に関する。本発明はまた、特定の実施形態において、アルツハイマー病の検出または診断に有用な試薬を含有するキットを対象とする。特定の態様において、本発明は、アルツハイマー病を治療するのに有用なリード化合物を同定するためのスクリーニングのための方法ならびにそれを必要とする対象においてアルツハイマー病を治療または予防するために、医薬製剤内においてこれらの化合物またはリード化合物の化学的誘導体を使用する方法を対象とする。
【００７３】
診断法、診断用キットおよび本発明の化合物を同定するためのスクリーニング法において使用することを特異的に想定したプロテインキナーゼＣアクチベーターとして、これらに限らないが、以下が挙げられる：ブラジキニン；ε−ΑΡΡモジュレーター；ブリオスタチン１；ブリオスタチン２；ＤＨＩ；１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール；ＦＴＴ；グニジマクリン、ステレラ・カマエヤスメ（Ｓｔｅｌｌｅｒａ ｃｈａｍａｅｊａｓｍｅ）Ｌ．；（−）−インドラクタムＶ；リポキシンＡ４；リングビアトキシンＡ、ミクロモノスポラ属；オレイン酸；ｌ−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール；４α−ホルボール；ホルボール−１２，１３−ジブチレート；ホルボール−１２，１３−ジデカノエート；４α−ホルボール−１２，１３−ジデカノエート；ホルボール−１２−ミリスチン酸−１３−アセテート；Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスホスフェート、ジパルミトイル−、ペンタアンモニウム塩；Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート、ジパルミトイル−、ペンタアンモニウム塩；Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスリン酸、ジパルミトイル−、ヘプタアンモニウム塩；１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロール；チメレアトキシン、チメレア・ヒルスタ（Ｔｈｙｍｅｌｅａ ｈｉｒｓｕｔａ）Ｌ．；インスリン、ホルボールエステル、リゾホスファチジルコリン、リポ多糖、アントラサイクリンダウノルビシンおよび硫酸バナジル。同様に含まれているのは、「ブリオログ」として知られている化合物である。ブリオログは、例えば、Ｗｅｎｄｅｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ ｌｅｔｔｅｒｓ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）２００５年５月１２日、７巻（１０）ｌ９９５〜８頁；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ ｌｅｔｔｅｒｓ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）２００５年３月１７日、７巻（６）１１７７〜８０頁；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）２００４年１２月１６日、４７巻（２６）６６３８〜４４頁に記載されている。プロテインキナーゼＣアクチベーターは、本明細書中に開示されている診断法、キットおよび化合物のスクリーニング法において、単独でまたは任意の他のプロテインキナーゼＣアクチベーターと併用して使用することができる。
【００７４】
ブラジキニンは、様々な炎症状態の過程で生成する強力な血管作用性ノナペプチドである。ブラジキニンは、特定の細胞膜ブラジキニン受容体（複数可）に結合し、これを活性化し、よって細胞内事象のカスケードを引き起こし、「マイトジェン活性化されたタンパク質キナーゼ」（ＭＡＰＫ）として知られているタンパク質のリン酸化を引き起こす。タンパク質のリン酸化、すなわちＳｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒ残基へのホスフェート基の付加は、タンパク質キナーゼとして総合的に知られた多数の酵素により媒介される。リン酸化は、通常タンパク質の機能を修正し、普通タンパク質を活性化する。ホメオスタシスは、リン酸化は一時的な処理であることを必要とし、これは基質を脱リン酸化するホスファターゼ酵素により逆転される。リン酸化または脱リン酸化において任意の逸脱があることで、生化学的経路および細胞機能が崩壊し得る。
【００７５】
タンパク質の検出のための本発明の免疫アッセイは、免疫蛍光アッセイ、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットまたはスロットブロットアッセイなどであってよい。（「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」（１９９１年）Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｐ．Ｐｒｉｃｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｎｅｏｍａｎ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。検出は、当業者に知られている比色分析法または放射能法または任意の他の従来の方法であってよい。ＥＬＩＳＡに関した当技術分野で知られている標準的な技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ、第２版、Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｂｉｇａｚｚｉ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９８０年およびＣａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｉｎｃ．、１９６４年、に記載されており、これら両方ともが本明細書に参照により組み込まれている。このようなアッセイは、当技術分野で記載されているような直接的、間接的、競合的、または非競合的免疫アッセイであってよい（「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」（１９９１年）Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｐ．Ｐｒｉｃｅ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｎｅｏｍａｎ編、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓ、ＮＹ、ＮＹ；Ｏｅｌｌｉｒｉｃｈ、Ｍ．、１９８４年；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：８９５〜９０４頁、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
【００７６】
これまでに述べたように、診断が行われている患者から採取した細胞は、任意の細胞であってよい。使用することができる細胞の例として、これらに限らないが、皮膚細胞、皮膚線維芽細胞、口腔粘膜細胞、血液細胞、例えば、赤血球、リンパ球およびリンパ芽細胞など、ならびに神経細胞およびＰＫＣイプシロンタンパク質を発現する任意の他の細胞が挙げられる。剖検試料および病態試料も使用することができる。脳組織または脳細胞を含めたこれらの細胞を含む組織もまた使用することができる。細胞は、得たばかりの状態のもの、培養されたものまたは凍結したものであってよい。細胞または組織から単離したタンパク質試料は、診断用アッセイまたは化合物をスクリーニングするための方法で即時に使用することができるか、または後で使用するため凍結することができる。好ましい実施形態において線維芽細胞が使用される。線維芽細胞は、パンチ皮膚生検により得ることができる。
【００７７】
タンパク質は、当業者に知られている従来の方法により細胞から単離することができる。好ましい方法において、患者から単離した細胞を洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でペレットにする。次いでペレットを５０ｎＭのＮａＦ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、５０μｇ／ｍｌのペプスタチン、１０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４を含む「均質化緩衝液」で洗浄し、遠心分離でペレットにする。上清を廃棄し、「均質化緩衝液」をペレットに添加し、続いてペレットを超音波処理する。このタンパク質抽出物は、得たばかりの状態で使用することもでき、または後で分析するために−８０℃で保存することもできる。
【００７８】
本発明の方法において、開示した免疫アッセイで使用される抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル起源であってよい。抗体を生成するために使用された、全部のＰＫＣイプシロンタンパク質またはその一部分は、天然のまたは組換え供給源からのもの、または化学合成で生成したものであってよい。天然のＥｒｋ１／２タンパク質は、従来の方法で生体試料から単離することができる。ＰＫＣイプシロンタンパク質を単離するために使用することができる生体試料の例として、これらに限らないが、皮膚細胞、例えば、線維芽細胞、線維芽細胞の細胞株、例えばアルツハイマー病線維芽細胞の細胞株および対照線維芽細胞の細胞株が挙げられ、これらは、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｍｄｅｎ、Ｎ．Ｊ．を介して市販されており、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｉｎｇ １９９１年の細胞株カタログ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９２／１９９３年、細胞株カタログ［（ＮＩＨ公開９２−２０１１（１９９２年）］に列挙されている。
【００７９】
本発明はまた、アルツハイマー病の治療または予防に有用な物質をスクリーニングし、同定する方法を対象とする。本実施形態によると、本明細書中に記載されているアルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーを逆行させるまたは向上させる（すなわち正常細胞において見出されるレベルに戻す）物質は、アルツハイマー病の治療または予防に対して潜在的に有用な物質として同定および選択される。
【００８０】
例として、治療物質を同定するためのスクリーニングの、１つのこのような方法は、アルツハイマー病の患者の試料細胞を、本明細書中に開示されているプロテインキナーゼＣアクチベーターのいずれかの存在下で、スクリーニングされている物質と接触させ、次いで本明細書中に開示されているアルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーのいずれかを測定するステップを含む。アルツハイマー病に特異的な分子バイオマーカーを逆行または向上させて、正常細胞に見出されるレベルに戻す（すなわち、アルツハイマー病を有さない対象から摂取した細胞）薬剤は、アルツハイマー病の治療または予防に対して潜在的に有用な物質として同定および選択される。
【００８１】
本発明はまた、アルツハイマー病の治療または予防に有用な組成物を対象とする。本明細書中に記載されているスクリーニング法を使用して同定された化合物は、それを必要とする対象への投与のための医薬組成物として製剤化することができる。
【００８２】
本発明の医薬組成物または本明細書中に開示されているスクリーニング法を使用して同定された化合物（またはリード化合物の化学的誘導体）は、経口、皮下、経皮、皮膚を通したまたは非経口（例えば、局所的、直腸または静脈内）投与のための、例えば、錠剤（糖コーティング錠および膜コーティング錠を含めて）、散剤、粒剤、カプセル剤（軟カプセル剤を含む）、液剤、注射剤、坐剤、持続放出薬剤などの医薬組成物を与えるための既知の方法により、例えば薬理学的に許容される担体と混和することにより安全に投与することができる。
【００８３】
本発明の医薬組成物内での使用のための薬理学的に許容される担体の例として、これらに限らないが、様々な従来からの有機または無機の担体が挙げられ、これには、固体製剤用の賦形剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤、ならびに液体製剤用の溶媒、可溶化剤、懸濁剤、等張剤、緩衝液、緩和剤などが含まれる。必要な場合、従来の添加剤、例えば、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸収剤、湿潤剤などを適切な量で適切に使用することができる。
【００８４】
ＰＫＣシグナル伝達欠損は、ＡＤの病態を引き起こす主要な要素の１つであることを増々多くの証拠が示唆している（Ａｌｋｏｎら、２００７年、Ｌｉｒｏｎら、２００７年、Ｃｈｏｉら、２００６年）。ＡＤ患者の脳内でＰＫＣアイソザイムの分布が変化することは以前の知見により実証されている（Ｓｈｉｍｏｈａｍａら、１９９３年、Ｍａｓｌｉａｈら、１９９０年）。ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−γおよびＰＫＣ−βは、ＡＤ脳内でより低いことが判明した。Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａらの１９９６年の報告では、ＰＫＣ−δおよびＰＫＣ−ξレベルは変化しなかったにもかかわらず、ＡＤ脳内のＰＫＣ−εレベルは、サイトゾル部分と膜質部分の両方において減少したことが判明し、これは、Ｃａ２＋に依存しないＰＫＣアイソザイムの中で、ＰＫＣ−εの変化はＡＤ脳内において特異的事象であり、ＡＤ病態生理において重大な役割を有することを示唆した。ＡＰＰのα−セクレターゼ媒介性切断を活性化する主要な手段は、ＰＫＣアイソザイム−αおよび−εまたは間接的にＰＫＣ媒介性ＥＲＫ１／２またはこれら両方を介して成し遂げられた（Ａｌｋｏｎら、２００６年；Ｓｋｏｖｒｏｎｓｋｙら、２０００年；Ｄｉａｚ−Ｒｏｄｒｉｇｅｚら、２００２年；ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＣｏｂｂ、１９９７年）。散発性ＡＤに対する最も大きなリスクファクターは年齢であり、これは、脳内のＰＫＣアイソザイムの特異的分布、移動障害、およびＰＫＣアンカリングタンパク質ＲＡＣＫ１（活性化したプロテインキナーゼＣの受容体）レベルの減少を伴う（Ｂａｔｔａｎｉら、１９９７年）。
【００８５】
ＡＤに関連したＰＫＣ−εシグナル伝達欠損：アミロイド仮説によると、ＡＤは、β−およびγ−セクレターゼ経路により生成されたアミロイド斑を形成するＡβペプチドの凝集および蓄積により、引き起こされる。ヒト皮膚線維芽細胞を用いた研究は、ＡＤ患者と、年齢をマッチさせた対照との間でのＰＫＣアイソザイム機能の異常性を記録した（ＶａｎＨｕｙｎｈら、１９８９年、Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｕｇａｒａｙら、１９９３年、Ｇｏｖｏｎｉら、１９９３年、Ｆａｖｉｔら、１９９８年）。しかし、これまではＡＤ患者の末梢組織、例えば血液細胞または皮膚線維芽細胞などにおけるＰＫＣ−εレベルの低下を示す証拠が存在しなかった。より低くなったＰＫＣ−εの基本レベルがＡＤ特異性であるかどうかを調べるため、病理解剖で脳内にアミロイド斑および神経原線維変化が存在する、散発性と家族性ＡＤの両方の症例からＡＤ患者を選択し、また２つの異なるセットの非ＡＤ認知症対照、例えば：（ｉ）８つの遺伝性ハンチントン病（ＨＤ）患者の線維芽細胞：非ＡＤ特徴の強力な証拠を有し、遺伝子によりＨＤが識別されたものと、（ｉｉ）１つのパーキンソン病および１つの前頭側頭型認知症患者の線維芽細胞とを比較した。したがって、ＰＫＣ−ε欠損は、他の非ＡＤ認知症病態を伴わなかった。ＰＫＣ−εの基本レベルはまた、年齢と共に低下し得る。しかし、この研究は、１１のＡＣ（年齢をマッチさせた対照）が、有意により高いＰＫＣ−εレベルを有することを明らかに実証した。したがって、ＡＤ皮膚線維芽細胞においてより低くなったＰＫＣ−εの基本レベルは、アルツハイマー型の病態によるもので、加齢それ自体によるものではない。
【００８６】
ＡＤは、複数の病理学的欠損を含む疾患であり、ＰＫＣは、細胞生存、分化、および調節の主要な機構制御因子の１つである。ＰＫＣの中でも、ＰＫＣ−εは、シナプス形成を制御する。ＰＫＣ−εはまた、コレステロール除去の間の低密度受容体の転写を誘発すると報告され（Ｍｅｈｔａら、２００２年）、ＬＤＬ受容体はＡβの輸送および排除においてある役割を果たすと示唆された。他の研究において、ＰＫＣεアクチベーターは、ラットの空間迷路学習において、学習および記憶ならびに構造特異的なシナプス変化を強化することが示された（ＨｏｎｇｐａｉｓａｎおよびＡｌｋｏｎ、２００７年）。したがって、患者におけるＰＫＣ−ε総量の減少が、ＡＤにおける記憶損失を引き起こす可能性があった。さらに、ＰＫＣ−εのｍＲＮＡ転写レベルもまたＡＤ患者の試料においてより低かった。
【００８７】
ＡＤにおけるＰＫＣ−εの病態生理学的関連性：ＰＫＣ−αが、Ａβ治療により分解され（Ｆａｖｉｔら、１９９８年）、ホルボールエステル治療により、ＡβがＢ１０３細胞内のＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εの膜移動を変化させることがこれまでに示された（Ｌａｎｎｉら、２００４年）。ＰＫＣ−εの過剰発現は、遺伝子組み換えマウスにおいてＡβレベルを減少させたことも示された（Ｃｈｏｉら、２００６年；Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎら、２０１１年）。１００ｋＤａを超える分子量のＡβオリゴマーは、ラットの初代神経細胞に極めて有毒であることが判明した（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２００９年；Ｈｏｓｈｉら、２００３年）。これら合成オリゴマーに対する抗体は、ＡＤ患者の脳の未処置のアミロスフェロイドを認識し（Ｎｏｇｕｃｈｉら、２００９年）、それ故これらオリゴマーは、疾患に対して病理学的に大きな意義がある。本発明者らは、これら極めて有毒なオリゴマー（＞１００ｋＤａ）は、ＡＣ線維芽細胞のＰＫＣ−εレベルに影響を及ぼし、これをＡＤ表現型に変えたことを実証した（図４Ｂ）。これらオリゴマーでＡＣ細胞を処理することで、ＰＫＣ−εの発現レベルを減少させたが、ＡＤ細胞には影響を及ぼさなかった。処理した細胞における正規化されたＰＫＣ−εのＡＣ−ＡＤ比は、約１であることが判明したが、未処理の細胞では１．４（図４Ｃ）であった。
【００８８】
ＡＤ病態において、より高いβ−，γ−セクレターゼ活性およびより低いα−セクレターゼ活性によるＡβの過剰生産は、ＰＫＣ−ε量を低下させる結果となり得るが、他方ではＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−εは、α−セクレターゼ活性を増加させ、ならびにＰＫＣ−εは、Ａβ分解酵素の活性を増加させる。ＰＫＣ−εレベルは、ＡＣおよび非ＡＤ認知症と比較して、ＡＤ線維芽細胞において有意に低いことが判明しているので、したがって、ＰＫＣ−εシグナル伝達のＡＤ関連の機能不全および皮膚線維芽細胞におけるＰＫＣ−εの基本量の低下は、ＡＤに対するバイオマーカーとしての末梢性ＰＫＣ−ε、および治療的候補としてのＰＫＣ−εアクチベーターの可能性を支持している。異なる形態の有毒なＡβオリゴマーは、Ａβを分解するエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）の調整に関与している細胞中のＰＫＣ−εレベルに影響を及ぼす可能性がある。これらのタンパク質は、Ａβ排除において重要な役割を果たす。したがって、β−，γ−セクレターゼ活性の上昇によるＡβの異常な蓄積がＰＫＣ−εの低下を引き起こし、次いでこれがフィードバックループ（図５）に参加することで、さらなるＡβの高まりおよびシナプスの損失を引き起こすというのが当然の仮説である。
【００８９】
ＡＤ線維芽細胞および末梢バイオマーカーにおけるＰＫＣ−εの欠如：ＡＤの診断に対する判断基準は、神経病理パラメータの死後解剖分析であるが、様々な実験室は、末梢組織を使用して効果的な診断を発見しようとしており、この診断には、非侵襲性、容易に入手可能なこと、低コストおよび最も重要なことに疾患の早期検出などの利点がある。本明細書中に開示されている知見は、ＰＫＣシグナル伝達欠損は大部分のＡＤ要素より後で生じることを示している。高齢の動物において、ＰＫＣ機能は、脳内ＰＫＣアイソザイムの年齢特異的な分布、移動の減少およびＲＡＣＫ１タンパク質レベルの減少（Ｂａｔｔａｎｉら、１９９７年）と共に落ち、年齢は散発性ＡＤの症例において最も重要なリスクファクターである。ＰＫＣ−εの過剰発現は、ＡＤ遺伝子組み換えマウスのＡβレベルを減少させることが示されている（Ｃｈｏｉら、２００６年）。本発明者らは、驚くことに、ＰＫＣ−εがＡＤ患者の末梢細胞において欠如していることを示した。
【表１】
【００９０】
ＰＫＣイプシロンのアクチベーター
ＰＫＣεは、Ａβ産生を最も効果的に抑制するアイソザイムである。Ｒａｃｃｉら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００３年；８巻：２０９〜２１６頁；およびＺｈｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００１年；２８５巻：９９７〜１００６頁。したがって、アイソフォームに特異的なＰＫＣアクチベーターが有望な抗アルツハイマー薬物として極めて望ましい。特異的アクチベーターは、あまり特異性を示さないブリオスタチンなどの化合物が好ましい。なぜなら、ＰＫＣδまたはβの非特異的活性化は、望ましくない副作用を生じる可能性があるからである。
【００９１】
さらに、ＰＫＣεはまた、脳以外ではすべての正常な組織において極めて低レベルで発現する。Ｍｉｓｃｈａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３年；２６８巻：６０９０〜６０９６頁；Ｖａｎ Ｋｏｌｅｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００８年；１０４巻：１〜１３頁。シナプス前の神経線維での大量のＰＫＣεは、神経突起成長またはニューロトランスミッター放出における役割を示唆している。Ｓｈｉｒａｉら、ＦＥＢＳ Ｊ．２００８年；２７５巻：３９８８〜３９９４頁）。したがって、特異的ＰＫＣεアクチベーターの作用であれば、主として脳に限定され、望ましくない末梢性の副作用を生じる可能性は低い。
【００９２】
ＰＫＣアクチベーターとしてのＰＵＦＡ
一部のＰＵＦＡ、例えばアラキドン酸（図６を参照）などは、ＰＫＣの天然のアクチベーターとして長年の間知られてきた。ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）もまた、ＰＫＣの既知のアクチベーターであり、ＡＤに関係する、脳を詰まらせるプラークおよびもつれを伴うＡβおよびタウタンパク質の蓄積を遅延させることが最近示されている。Ｓａｈｌｉｎら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７年；２６巻（４）：８８２〜９頁。
【００９３】
Ｋａｎｎｏらは、８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸（ＤＣＰ−ＬＡ）、すなわちｃｉｓ−二重結合の代わりにシクロプロパン環を有する、新たに合成されたリノール酸誘導体の、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性に対する作用を記載した。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００７年；４７巻：１１４６〜１１５６頁。ＤＣＰ−ＬＡは、ＰＫＣεを活性化し、作用強度は、他のＰＫＣアイソザイムの７倍を超えた。これは、ＤＣＰ−ＬＡがＰＫＣεに対して極めて特異的であることを示している。この化合物はまた、グルタミン酸作動性の末端または神経細胞でのシナプス前のアセチルコリン受容体の活性を強化することによって海馬のシナプス伝達を促進した。しかし、ＤＣＰ−ＬＡは、その最大の作用を生じるためには比較的高濃度を必要とする。
【００９４】
ＷＯ２００２／５０１１３で、Ｎｉｓｈｉｚａｋｉらは、シナプス伝達のＬＴＰ同様の増強のための、または認知強化薬物または認知症を治療するための薬物としての使用のための、シクロプロパン環を有するカルボン酸化合物およびこれらの対応する塩を開示している。これらの合成例は、エステルの調製を開示しているが、これらの実験結果は、遊離酸の使用を教示している。この理由は、脂肪酸出発物質のカルボン酸基が、Ｓｉｍｍｏｎｓ−Ｓｍｉｔｈ反応に使用されているジエチル亜鉛と反応するからである。メチルエステルは、保護基として作用し、加水分解によって切断されるか、または必要な場合にはとどまることが可能なこともある。
【００９５】
従来の技術の所見を有する仮出願は、前述の作用、ＰＫＣアイソフォームの非特異的活性化、または急速な代謝および未改質ＰＵＦＡの、脂肪組織および他の器官への隔離（ここで、これらはトリグリセリドおよびカイロミクロンへと取り込まれる）を達成するために高濃度で投与する必要性を含む。Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ．１９８８年；１１巻（４）：２５１〜６１頁。加えて未改質ＰＵＦＡを使用すれば、無数の有害な副作用を有することになる。例えば、アラキドン酸は、プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエンの生化学的前駆体であり、この前駆体は、強力な炎症促進作用を有する。病態が炎症を含む可能性のある場合には、これは、アルツハイマー病の治療に対して望ましくない。他の主要な脂肪酸もまた、一酸化窒素シグナル伝達の強化、抗炎症作用、およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの阻害（コレステロール生合成を妨げることになる）を含めた、多数の他の生物学的作用を有し得る。
【００９６】
ＡＤと脳卒中の両方を治療するための、限られた既存のオプションのため、神経保護を導き出すＰＫＣアイソフォームのみを選択的に活性化することができる新しい治療法が必要とされる。
【００９７】
ＰＵＦＡおよびＭＵＦＡおよび疾患
増大する数の研究が、オメガ−３ＰＵＦＡは、他の気分障害疾患、例えば臨床的うつ病、双極性障害、人格障害、統合失調症、および注意欠陥障害などに対して有利となり得ることを示唆した。Ｒｏｓｓら、Ｌｉｐｉｄｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ．２００７年；１８巻；６：２１。オメガ−３脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸、およびオメガ−３とオメガ−６脂肪酸との健常なバランスを、うつ病の危険性が低くなることと結びつける多くの証拠が存在する。Ｌｏｇａｎら、Ｌｉｐｉｄｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ．２００４年；３巻：２５。オメガ−３脂肪酸のレベルは、ある程度まで低く、オメガ−６とオメガ−３脂肪酸との比は、うつ病で入院した患者の臨床研究で特に高かったことが判明した。最近の研究では、大うつ病性障害を有する患者の眼窩前頭皮質において、ドコサヘキサエン酸の選択的欠損が存在したことを実証された。ＭｃＮａｍａｒａら、Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００７年；６２巻（１）：１７〜２４頁。いくつかの研究はまた、双極性障害を有する対象が、より低いレベルのオメガ−３脂肪酸を有することを示した。いくつかの最近の研究において、オメガ−３脂肪酸は、双極性うつ病を有する成人と小児の両方において、うつ病に対してプラシーボより効果的であることを示した。ＯｓｈｅｒおよびＢｅｌｍａｋｅｒ、ＣＮＳ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｔｈｅｒ．２００９年；１５巻（２）：１２８〜３３頁；Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、Ａｒｃｈ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｎｕｒｓ．２００８年；２２巻（５）：３０５〜１１頁。
【００９８】
大規模な調査はまた、オメガ−３脂肪酸が炎症を減少させ、慢性疾患、例えば、心疾患、癌、炎症性腸疾患および関節リウマチなどを伴うリスクファクターを防止するのに役立つことを示している。Ｃａｌｄｅｒら、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ．２００９年；３５巻（３）：２６６〜７２頁；Ｐｓｏｔａら、Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００６年；９８巻（４Ａ）：３ｉ−１８ｉ頁；Ｗｅｎｄｅｌら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００９年；９巻（４）：４５７〜７０頁。
【００９９】
単不飽和脂肪酸はまた、障害に有利であることも示されている。２型糖尿病における医学的栄養療法のための低脂肪食の代替として、ＭＵＦＡ食への優れた科学的支持が存在する。Ｒｏｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２００３年；７８巻（３）：６１７Ｓ−６２５Ｓ頁。単不飽和脂肪酸を多く摂取する食事により、プラズマコレステロールとトリアシルグリセロール濃度の両方が低くなる。Ｋｒｉｓ−Ｅｔｈｅｒｔｏｎら、Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．１９９９年１２月；７０巻（６）：１００９〜１５頁。
【０１００】
本発明は、二重結合のうちの１つ、一部、またはすべてがシクロプロパン基またはエポキサイド基で置きかえられている、ＰＵＦＡまたはＭＵＦＡのシクロプロパン化およびエポキシ化誘導体の使用を含む。末端官能基は、遊離カルボン酸、またはメチルエステル、エチルエステル、または脂肪族または芳香族アルコールを有するいくつかの他のアルキルエステルであってよい。このアルコールは、特にグリセロールおよびその誘導体もまた含む。脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、またはホスファチド酸の形態でグリセロールに結合しているのが最も頻繁に発見されているので、グリセロール誘導体は、生物学的に重要である。例えば、トリアシルグリセロールは、脂肪酸のカルボキシル基が、グリセロール中に発見される３個すべての炭素のヒドロキシルへエステル化している化合物であり、トリアシルグリセロールまたはトリグリセリドと呼ばれている。
【０１０１】
カルボン酸をエステル化する目的は、負電荷を排除することにより血液と脳のバリアを超えて輸送を促進することである。アルコール基の目的も、血液と脳のバリアを超えて輸送を促進することである。
【０１０２】
一実施形態において、本発明に使用される化合物の基礎を形成する脂肪酸は、以下の構造を有する多価不飽和脂肪酸である：
ＣＨ３（ＣＨ２）４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）ｘ（ＣＨ２）ｙＣＯＯＨ
式中、Ｘは、２〜６であり、Ｙは、２〜６であり、メチレンまたはポリメチレンで遮断されたポリエンを含む。例示的多価不飽和脂肪酸として、以下の構造を有するリノール酸、γ−リノール酸、アラキドン酸、およびアドレン酸が挙げられる：
リノール酸 ＣＨ３（ＣＨ２）４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）２ＣＨ２）６ＣＯＯＨ
γ−リノレン酸 ＣＨ３（ＣＨ２）４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）３（ＣＨ２）３ＣＯＯＨ
アラキドン酸 ＣＨ３（ＣＨ２）４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）４（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ
アドレン酸 ＣＨ３（ＣＨ２）４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）４（ＣＨ２）４ＣＯＯＨ
これらは、オメガ−６ＰＵＦＡである。
【０１０３】
別の実施形態において、本発明に使用される化合物の基礎を形成する脂肪酸は、以下の構造を有する多価不飽和脂肪酸である：
ＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）ｘ（ＣＨ２）ｙＣＯＯＨ
式中、Ｘは、２〜６であり、Ｙは、２〜６であり、メチレンまたはポリメチレンで遮断されたポリエンを含む。例示的多価不飽和脂肪酸として、以下の構造を有するα−リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸が挙げられる：
α−リノレン酸 ＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）３（ＣＨ２）６ＣＯＯＨ
エイコサテトラエン酸 ＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）４（ＣＨ２）５ＣＯＯＨ
エイコサペンタエン酸 ＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）５（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ
ドコサヘキサエン酸 ＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）６（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ
これらは、オメガ−３ＰＵＦＡとして知られている。
【０１０４】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、ヒドロキシル基がアルコキシ基で置きかえられ、二重結合の少なくとも１つがシクロプロパン化されている、ｃｉｓ−ＰＵＦＡのエステルである。本実施形態に対する出発物質は、以下の構造を有する：
ＣＨ３（ＣＨ２）４（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）ｘ（ＣＨ２）ｙＣＯＯＲまたはＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ＝ＣＨＣＨ２）ｘ（ＣＨ２）ｙＣＯＯＲ
式中、Ｒは、例えば、一価アルコールおよび多価アルコールなどのアルコール、例えば、これらだけには限らないがメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、グリセロール、マンニトール、およびソルビトールなどを含めたものからのアルキル基である。
【０１０５】
さらなる実施形態において、化合物は、少なくとも３つのシクロプロパン化二重結合を含有する。
【０１０６】
別の実施形態において、本発明に使用される化合物に対する基礎を形成する脂肪酸は、以下の構造を有する単不飽和脂肪酸である：
ＣＨ３（ＣＨ２）ｘＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｙＣＯＯＨ
式中、ＸおよびＹは、３〜１１の奇数である。
【０１０７】
本発明に使用される化合物の基礎となることができる例示的単不飽和脂肪酸として、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−単不飽和脂肪酸、例えば、オレイン酸、エライジン酸、トウハク酸、カプロレイン酸、ラウロレン酸、リンデル酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、およびペトロセリン酸などが挙げられる。
【０１０８】
本発明によるエステルとは、モノエステルまたはポリエステルを意味する。脂肪酸のエステルとして、メチル、プロピル、およびブチルエステル、およびより複雑なアルコール、例えば、プロピレングリコールなどから生成したエステルが挙げられる。非限定的実施形態において、Ｒ’は、直鎖または分枝であり、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、およびテトラデシルなどが挙げられる。エステルはまた、エステル結合で脂肪族アルコールと連結されている脂肪酸から形成されてもよい。
【０１０９】
エステルは、これだけに限らないが脂肪族アルコールエステルを含めたアルコールエステルであってよい。一実施形態において、アルコールエステルはグリセロールエステルである。脂肪酸のグリセロールエステルとして、グリセロール脂肪酸エステル、グリセロール酢酸脂肪酸エステル、グリセロール乳酸脂肪酸エステル、グリセロールクエン酸脂肪酸エステル、グリセロールコハク酸脂肪酸エステル、グリセロールジアセチル酒石酸脂肪酸エステル、グリセロール酢酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、およびポリグリセリン凝縮したリシノール酸エステルが挙げられる。
【０１１０】
別の特定の実施形態において、化合物は、二重結合のうちの少なくとも１つがシクロプロパン化されている、ｃｉｓ−ＰＵＦＡのアルコールである。さらなる実施形態において、化合物は、少なくとも３つのシクロプロパン化二重結合を含有するｃｉｓ−ＰＵＦＡのアルコールである。これらの化合物として、これらに限らないが、リノレイックアルコールジシクロプロパン（ＢＲ−１０５）、またはリノレニックアルコールトリシクロプロパン（ＢＲ−１０４）が挙げられる。本実施形態において、Ｒ’は、直鎖または分枝鎖のアルコールまたはフェノールのアルコールとなり得る。
【０１１１】
別の実施形態において、本発明の化合物、この化合物は、少なくとも１つの二重結合がエポキシル基で置きかえられている、ｃｉｓ−多価不飽和脂肪酸、またはその誘導体である。さらなる実施形態において、化合物は、少なくとも３つのエポキシ化二重結合を含有する。
【０１１２】
特定の実施形態では、化合物は、ｃｉｓ−ＰＵＦＡのエポキシ化エステルであり、これには、これだけに限らないが脂肪族アルコールエステルが含まれる。エステルは、シクロプロパン化ＰＵＦＡＳに対して上で記載されているものと同じエステルであってよい。さらなる実施形態において、アルコールは、脂肪族アルコールエステル、例えばグリセロールなどであってよい。
【０１１３】
別の特定の実施形態において、化合物は、エポキシ化ｃｉｓ−多価不飽和脂肪族アルコール、例えばリノレイックアルコールジシクロプロパンまたはリノレニックアルコールトリシクロプロパンなどである。アルコールは、シクロプロパン化ＰＵＦＡＳに対して上で記載されているものと同じであってよい。
【０１１４】
別の実施形態において、化合物として、ｃｉｓ−単不飽和脂肪酸（ｃｉｓ−モノエン酸）由来のシクロプロパン化またはエポキシ化した脂質、例えばオレイン酸、エライジン酸、エライジックアルコール、オレイルアルコール、および１−モノリノレイルｒａｃ−グリセロールなどが挙げられる。例示的化合物として、エライジックアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０６）、エライジン酸シクロプロパン（ＢＲ−１０７）、およびオレイルアルコールシクロプロパン（ＢＲ−１０８）が挙げられる。
【０１１５】
さらなる実施形態として、１以上のエポキサイド残基を含有する、ｃｉｓ−単不飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸、脂肪酸エステル、または脂肪酸アルコールの由来のシクロプロパン化脂質、例えば、ベルノリン酸メチルエステルシクロプロパン（例えば、ＢＲ−１０９）などが挙げられる。
【０１１６】
特定の実施形態において、本発明に使用される、シクロプロパン化した化合物の基礎を形成するＰＵＦＡとして、これらに限らないが、アラキドン酸（ＡＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が挙げられる。本発明の方法における使用のための例示的化合物として、ドコサヘキサエン酸メチルエステルヘキサシクロプロパン（ＢＲ−１１１）；エイコサペンタエン酸メチルエステルペンタシクロプロパン（ＢＲ−１１４）；およびアラキドン酸メチルエステルテトラシクロプロパン（ＢＲ−１１５）が挙げられる。
【０１１７】
さらなる特定の実施形態において、化合物は、以下の構造を有するドコサヘキサエン酸のシクロプロパン化ＰＵＦＡ誘導体である：
【化１】
【０１１８】
式中、ＲはＨまたはアルキル基である。特定の実施形態では、Ｒは、ＣＨ３（ＢＲ−１１１またはＤＨＡ−ＣＢ６メチルエステルまたはメチル−３−（２−（（２−（（２−（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）プロパノエートである。
【０１１９】
別の特定の実施形態において、ＰＵＦＡ誘導体は、以下の構造を有する：
【化２】
【０１２０】
この化合物は、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５またはメチル４−（２（（２−（（２−（（２−エチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）−シクロプロピル）ブタノエートメチルエステル）である。
【０１２１】
さらなる別の特定の実施形態において、ＰＵＦＡ誘導体は、以下の構造を有する：
【化３】
【０１２２】
この化合物は、ＢＲ−１１５（ＡＡ−ＣＰ４またはメチル４−（２−（（２−（（２−（（−ペンチルシクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）メチル）シクロプロピル）ブタノエートメチルエステル）である。
【０１２３】
さらに別の特定の実施形態において、ＰＵＦＡ誘導体は、以下の構造を有する：
式中、Ｒは、Ｈまたはアルキルエステルである。特定の実施形態では、ＲはＣＨ３である。
【０１２４】
本発明における使用に対して想定された、天然にシクロプロパン化またはエポキシ化したＭＵＦＡＳまたはそのエステルもしくはアルコール誘導体として、マルベニン酸（ｍａｌｖｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ベルノリン酸、およびステルクリン酸が挙げられる。例示的化合物はベルノリン酸メチルエステル（ＢＲ−１１７）である。
【０１２５】
合成方法
脂肪酸、ならびにそのエステルおよびアルコールは、天然の供給源、例えば、魚油、アマニ油、ダイズ、アブラナ油、もしくは藻などからの精製により得るもしくは生成することができ、または微生物酵素の合成と化学合成の組合せを使用して合成することもできる。一例として、脂肪酸メチルエステルは、メタノールおよび同種のアルカリ触媒を使用して、精製油／食用タイプの油のトリグリセリドのエステル交換により生成することができる。
【０１２６】
炭化水素における二重結合のシクロプロパン化の方法は周知である。一例として、改質されたＳｉｍｍｏｎｓ−Ｓｍｉｔｈ反応は、二重結合をシクロプロパンへ変換するための標準的方法である。ＴａｎａｋａおよびＮｉｓｈｉｚａｋｉ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．２００３年；１３巻：１０３７〜１０４０頁；ＫａｗａｂａｔａおよびＮｉｓｈｉｍｕｒａ、Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．１９６７年；２４巻：５３〜５８頁；ならびにＤｅｎｍａｒｋおよびＥｄｗａｒｄｓ、Ｊ．ＯｒｇＣｈｅｍ．１９９１年；５６巻：６９７４頁。この反応において、金属カルベノイド、例えば、メチレンアイオダイドおよびジエチル亜鉛などでのアルケンの処理は、結果としてアルケンのシクロプロパン化を生じる。Ｉｔｏら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ．１９８８年；６巻：３２７頁も参照されたい。メチルエステルのシクロプロパン化もまた、触媒としての酢酸パラジウム（ＩＩ）の存在下、ジアゾメタンを使用して行われた。Ｇａｎｇａｄｈａｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’ Ｓｏｃｉｅｔｙ．１９８８年；６５巻（４）：６０１〜６０６頁。
【０１２７】
エポキシ化の方法もまた周知であり、有機溶媒中の脂肪酸ジオキシランの反応を通常含む。Ｓｏｎｎｅｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’ Ｓｏｃｉｅｔｙ．１９９５年；７２巻（２）１９９〜２０４頁。一例として、ＰＵＦＡ二重結合のエポキシ化は、エポキシ化薬剤としてジメチルジオキシラン（ＤＭＤ）を使用して達成することができる。Ｇｒａｂｏｖｓｋｉｙら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ．２００６年；８９巻（１０）：２２４３〜５３頁。
【０１２８】
治療方法
本発明は、本明細書中に開示されているＰＵＦＡ誘導体を使用した、病原性のＡβに伴う神経系疾患、例えばＡＤおよび脳卒中などの治療を想定している。本発明はまた、本明細書中に開示されているＰＵＦＡ誘導体を使用した、病原性のＡβに伴う神経系疾患の予防を想定している。任意の特定の機序に限定されることなく、ＰＫＣεの選択的活性化は、結果としてＴＡＣＥの活性化の増加を生じることができ、同時にＡβの産生を低下させる。しかし、これは主に非神経細胞、例えば線維芽細胞などに生じているようである。ＰＫＣεの活性化はまた、ＡＤにおける病原性タウタンパク質の過リン酸化を減少させることもできる。ＰＫＣεの活性化はまた、シナプス形成を誘発し、またはＡＤにおけるまたは脳卒中後のアポトーシスを防止することもできる。ＰＫＣεの活性化はまた、ＧＳΚ−３βの阻害を介して、Ａβ−媒介性神経毒性からラット神経細胞を保護することもできる。ＰＫＣεアクチベーターはまた、ＰＫＣα／εの下方制御に対するＡβの作用に反作用することもでき、これによって、Ａβ誘発性変化を逆行させるまたは防止することもできる。別の可能な作用機構は、Ａβ−分解酵素、例えばエンドセリン変換酵素などの活性化である。実施例で提示された実験結果は、これが作用機構となり得ることを示唆している。
【０１２９】
さらに別の機構は、ＰＫＣ−結合したＭ１およびＭ３ムスカリンの受容体の刺激によるものであってよく、これは、ＴＡＣＥにより、非アミロイド合成ＡＰＰプロセシングを増加させると報告されている。Ｒｏｓｓｎｅｒら、Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１９９８年；５６巻：５４１〜５６９頁。ムスカリン作用剤は、３ｘ遺伝子組み換えＡＤマウスを認知障害から救い、一部はＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７非アミロイド合成経路を活性化することによって、Ａβおよびタウ病態を減少させる。Ｃａｃｃａｍｏら、Ｎｅｕｒｏｎ．２００６年；４９巻：６７１〜６８２頁。ムスカリン受容体シグナル伝達は、ＰＫＣに密接に結ばれている。ムスカリン受容体ｍＲＮＡは、ＰＫＣにより調節され、Ｍ１ムスカリン受容体活性化により生じる神経細胞の分化は、ＰＫＣにより媒介される。Ｂａｒｎｅｓら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１９９７年；６０巻：１０１５〜１０２１頁；Ｖａｎｄｅｍａｒｋら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００９年；３２９巻（２）：５３２〜４２頁。
【０１３０】
本発明の方法による治療に対して想定される他の障害として、気分障害、例えばうつ病性障害および双極性障害、統合失調症、関節リウマチ、癌、循環器疾患、２型糖尿病、さらにこれらだけに限らないが、背景技術において言及されたものを含めて、ＰＵＦＡまたはＭＵＦＡが有利であることが示された任意の他の障害などが挙げられる。
【０１３１】
製剤および投与
ＰＵＦＡ誘導体は、これらが血液−脳バリアを通過することを可能にする任意の経路による投与に有用な用量単位で生産することができる。血漿のＰＵＦＡは、脳を通過することができることが実証されている。Ｒａｐｏｐｏｒｔら、Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅｓ．２００１年．４２巻：６７８〜６８５頁。例示的経路として、経口、非経口、経粘膜、鼻腔内、吸入、または経皮経路が挙げられる。非経口の経路として、静脈内、細動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、側脳室内、くも膜下腔内、および脳内の投与が挙げられる。
【０１３２】
本発明の化合物は、従来の方法により製剤化することができる。ＰＵＦＡ誘導体化合物は、標準的製剤で対象に提供することができ、任意の薬学的に許容される添加剤、例えば賦形剤、滑沢剤、希釈剤、着香剤、着色剤、緩衝剤および崩壊剤などを含むことができる。標準的製剤は、当技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０００年を参照されたい。
【０１３３】
一実施形態において、化合物は、固体の経口投与剤形で製剤化する。経口投与に対して、例えば、ＰＵＦＡに対して、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、アルファ化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはカルシウムリン酸水素）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などと共に従来の手段で調製した錠剤またはカプセル剤の形態を取ることができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によりコーティングすることもできる。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態を取ることができ、またはこれらは、使用前に水または他の適切なビヒクルと共に構成するための乾燥製品として提供することもできる。このような液体製剤は、薬学的に許容される添加剤、例えば懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体または水素化した食用の脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）などと共に従来の手段で調製することができる。製剤はまた、必要に応じて緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味料を含有することもできる。
【０１３４】
一例として、薬物Ｏｍａｃｏｒ（登録商標）は、オメガ−３ＰＵＦＡのエチルエステルの濃縮した組合せを含有する。各１ｇカプセル剤は、薬物ラベルによると、少なくとも９００ｍｇのオメガ−３脂肪酸のエチルエステル、主にＥＰＡ（４６５ｍｇ）およびＤＨＡ（３７５ｍｇ）を含有する。Ｏｍａｃｏｒ（登録商標）は、低カロリーの黄色の油を充填した１グラムの透明な軟ゼラチンカプセルとして、１日最高４回まで投与する。本発明のＰＵＦＡ化合物を投与するために同様の組成物を使用することができるが、ただし本発明はＰＵＦＡ誘導体のより低い投与量の使用を想定している。ＰＵＦＡの安定した蝋−エステルの製剤は、ｎ−３ＰＵＦＡおよび長鎖アルコール（１８〜２２個の炭素原子）を多く含む化学量論の量のエチルエステルのエステル交換による、ｎ−３ＰＵＦＡおよび長鎖アルコール（１８〜２２個の炭素原子）を多く含む化学量論の量のエチルエステルのエステル交換によるものが記載されている。Ｇｏｒｅｔｔａら、Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ−Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ ｕｎｄ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ．２００２年；３５巻（５）：４５８〜６５頁。
【０１３５】
別の実施形態において、ＰＵＦＡ化合物は、非経口投与用に製剤化される。化合物は、注射、例えば、大量瞬時投与または持続的な点滴などの非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤は、アンプルなどの単位剤形、または多数回容器などの形態で、保存剤を添加して提供することができる。組成物は、例えば、懸濁液、溶液、分散液、または油性または水性のビヒクル中のエマルジョンなどの形態を取ることができ、製剤化剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などを含有することもできる。
【０１３６】
特定の実施形態では、本発明のＰＵＦＡ誘導体は、疎水性の担体と共に投与される。疎水性の担体として、包接錯体、分散液（例えばミセル、マイクロエマルジョン、およびエマルジョン）、およびリポソームなどが挙げられる。例示的疎水性担体として、包接錯体、ミセルおよびリポソームなどがある。これらの製剤は、当技術分野で既知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ編集：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ ２００３年）。本発明のＰＵＦＡ誘導体は、例えば、担体の総質量の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０質量％を疎水性担体に取り込むことができる。加えて、他の化合物が、例えば製剤を安定化させるために、疎水性担体または溶液剤のいずれかの中に含まれていてもよい。
【０１３７】
前に記載した製剤に加えて、ＰＵＦＡ誘導体はまた、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型製剤は、埋め込み（例えば皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、化合物は、適切なポリマーまたは疎水性物質（例えば許容可能な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、または難溶性の誘導体、例えば、難溶性の塩などと共に製剤化することができる。
【０１３８】
別の実施形態において、ＰＵＦＡ誘導体は、小嚢、特にミセル、リポソームまたは米国特許出願第１１／６４８，８０８号、Ａｌｋｏｎらに記載されたような人工ＬＤＬ粒子で届けることができる。
【０１３９】
投与のための投与量は、１日当たり１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１ｇ、極めて好ましくは２５０ｍｇ〜５００ｍｇの化合物を届けるために適切に調製することができる。局所的投与または非経口製剤用に調製する場合、最終製剤の０．０１質量％〜６０質量％、好ましくは０．１質量％〜３０質量％、極めて好ましくは１質量％〜１０質量％を含有する処方で作ることができる。最適な１日の投与量は、当技術分野で知られている方法で判定することになるが、例えば患者の年齢および他の臨床的に関連する要因などの要因により影響を受けることになる。
【０１４０】
併用薬物療法
ＰＵＦＡ化合物は、ＡＤまたはＡβに関連する他の神経学的障害を有する患者を治療するために、障害を治療するために同様に使用される他の薬物と併用して使用することができる。ＡＤの治療に対して米国で認可された、例示的、非限定的な薬理作用のある物質として、コリンエステラーゼ阻害剤、例えばＡｒｉｃｅｐｔ（登録商標）（ドネペジル）、Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標）（リバスチグミン）、Ｒｅｍｉｎｙｌ（登録商標）（ガランタミン）など、およびＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、例えばＮａｍｅｎｄａ（登録商標）（メマンチン）などが挙げられる。他の有望な治療薬として、プロテアーゼ阻害剤（例えば、米国特許第５，８６３，９０２号；第５，８７２，１０１号を参照）；Ａβ産生阻害剤、例えば米国特許第７，０１１，９０１号；第６，４９５，５４０号；第６，６１０，７３４号；第６，６３２，８１２号；第６，７１３，４７６号；および第６，７３７，４２０号に記載のものなど；Ａβ凝集モジュレーター、第６，３０３，５６７号；第６，６８９，７５２号に記載のものなど；ならびにＢＡＣＥ阻害剤、例えば米国特許第第６，９８２，２６４号；第７，０３４，１８２号；第７，０３０，２３９号に開示ものなどが挙げられる。脳卒中の治療のために使用される例示的薬物として、アスピリン、抗血小板薬剤、例えば組織プラスミノゲンアクチベーターまたは他の抗凝血剤などが挙げられる。
【０１４１】
ある特定の実施形態において、本発明は、これだけに限らないがベンゾラクタム大環状ラクトンを含めた他のＰＫＣアクチベーターとの併用療法を想定している。ブリオスタチン１は、ＰＫＣをモジュレートし、結果として、非アミロイド形成経路への、ＴＡＣＥによるＡＰＰの切断を増加させることが示されている大環状ラクトンである。ブリオスタチンは、ウミウシの記憶保持の持続時間を、５００％を超えて増加させることができ、ラットの学習速度を劇的に増加させることができた。米国特許出願第１０／９１９，１１０号；Ｋｕｒｚｉｒｉａｎら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ．２００６年；２１０巻（３）：２０１〜１４頁；Ｓｕｎ ａｎｄ Ａｌｋｏｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２００５年；５１２巻（１）：４３〜５１頁を参照されたい。他の非限定的なＰＫＣアクチベーターは、審議中の米国特許出願番号第１２／０６８，７４２号、Ａｌｋｏｎらにおいて記載されている。
【０１４２】
例えば内因性のＴＡＣＥ阻害剤を阻害することによって、または内因性のＴＡＣＥアクチベーターを増加させることによって、ＴＡＣＥを間接的に増加させる薬物との併用。ＰＫＣを直接活性化する代替的手法は、内因性アクチベーター、ジアシルグリセロールのレベルを増加させることである。ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤、例えば６−（２−（４−［（４−フルオロフェニル）フェニルメチレン］−１−ピペリジニル）エチル）−７−メチル−５Ｈ−チアゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−５−オン（Ｒ５９０２２）および［３−［２−［４−（ビス−（４−フルオロフェニル）メチレン］ピペリジン−１−イル）エチル］−２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−４（１Ｈ）−キナゾリノン（Ｒ５９９４９）などは、内因性リガンドジアシルグリセロールのレベルを強化し、これによって、ＰＫＣの活性化が生じる。Ｍｅｉｎｈａｒｄｔら、（２００２年）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ １３巻：７２５頁。
【０１４３】
さらなる別の実施形態は、ＢＡＣＥ阻害剤との併用療法である。ＢＡＣＥ阻害剤は、既知であり、ＣｏＭｅｎｔｉｓ Ｉｎｃ．が所有するＣＴＳ−２１１６６が挙げられ、これはヒト治験において陽性結果を示した。他のＢＡＣＥ阻害剤は、公開された国際ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０１９０８０およびＢａｘｔｅｒら、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００７年；５０巻（１８）：４２６１〜４２６４頁において記載されている。
【０１４４】
併用療法において使用される化合物は、相容性の場合、本発明のＰＵＦＡ化合物と同じ製剤で投与してもよいし、または別個の製剤として投与してもよい。
【０１４５】
治療の評価
本発明のＰＵＦＡ誘導体を用いた治療の評価は、疾患の症状または臨床代理マーカーにおける評価の改善により行うことができる。例えば、治療したＡＤ対象における記憶または認知スキルの改善は、病原性のＡβ蓄積が減少していることを示唆し得る。認知表現型の例として、これらに限らないが、健忘、失語症、失行症および認知不能症が挙げられる。精神医学的症状の例として、これらに限らないが、人格変化、うつ病、幻覚および妄想が挙げられる。１つの非限定的な例として、ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、第４版（ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎより出版）は、アルツハイマータイプの認知症に対する基準を含有する。
【０１４６】
ＡＤの表現型発現はまた、物理学的、例えばＡβプラークの直接的（撮像）または間接的（生化学的）検出などによるものであってよい。Ａβのインビボの撮像は、造影剤として放射性ヨウ化フラボン誘導体を使用し（Ｏｎｏら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００５年；４８巻（２３）：７２５３〜６０頁）、アミロイド結合染料、例えば、４０−残基放射性ヨウ化Ａペプチド（１２５Ｉ−ＰＵＴ−Ａ１−４０を生成）（血液−脳バリアを通過してＡβプラークと結合することが示された）に結合したプトレシンを用いて達成することができる。Ｗｅｎｇｅｎａｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０００年；１８巻（８）：８６８〜７２頁。Ａβの撮像はまた、スチルベン［１１Ｃ］ＳＢ−１３およびベンゾチアゾール［１１Ｃ］６−０Ｈ−ＢＴＡ−１（［１１Ｃ］ＰＩＢとしても知られている）を使用して示された。Ｖｅｒｈｏｅｆｆら、Ａｍ Ｊ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００４年；１２巻：５８４〜５９５頁。
【０１４７】
末梢血におけるＡβ（１−４０）の定量化は、高速液体クロマトグラフィーを、線形イオントラップでのタンデム質量分析と一緒に使用して実証された。Ｄｕら、Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｔｅｃｈ．２００５年；１６巻（４）：３５６〜６３頁。蛍光相関分光法による、アルツハイマー型患者の脳脊髄液中の単一Ａβタンパク質凝集体の検出もまた記載されている。Ｐｉｔｓｃｈｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９８年；４巻：８３２〜８３４頁。米国特許第５，５９３，８４６号は、可溶性Ａβを検出するための方法を記載している。抗体を使用した、終末糖化産物（ＲＡＧＥ）のためのＡβペプチドおよび受容体の間接的検出もまた記載されてきた。最後に、色素生産性基質を使用した、脳脊髄液中の増加したＢＡＣＥ−１活性の生化学的検出もまた、ＡＤの診断用または予後の指標として仮定されてきた。Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００６年；５２巻：１１６８〜１１７４頁。
【０１４８】
ＡＤを評価するための現在の手段として、初期の、進行性のおよび顕著なエピソード記憶喪失の臨床的コアの観察にＡＤに特徴的な１以上の異常なバイオマーカー（生物学的指標）を加えたものが挙げられるが、これにはＭＲＩで示されるような側頭葉萎縮の病理解剖（廃棄）；脳脊髄液中の異常なＡβタンパク質濃度；脳のＰＥＴスキャンにおけるグルコース代謝の減少を示す特定のパターン；および近親内での関連する遺伝子変異が含まれる。
【実施例】
【０１４９】
例１：患者集団および細胞培養
アルツハイマー病患者（ＡＤ）、非ＡＤ認知症（ハンチントン病、パーキンソン病および前頭側頭認知症）患者、および年齢をマッチさせた対照（ＡＣ）症例のヒト皮膚線維芽細胞を、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）から入手した。線維芽細胞は、１０％ＦＢＳを補充した低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ中で維持し、培養して実験前に１００％コンフルエンスにした。異なる１０例のＡＤ患者（４つの家族性タイプおよび６つの散発性；これらの中で、１０例のうち９例は、病理解剖で確認した）、１１例のＡＣおよび８例のハンチントン病、１例のパーキンソン病および１例の前頭側頭型認知症が研究（表：１）に対して検討された。ＡＤ症例の平均年齢は６９．６±１３．０１（ＳＤ）才であり、ＡＣ症例の平均年齢は６３．３６４±７．６５（ＳＤ）才であり、非ＡＤ認知症症例の平均年齢は５６．４４±９．７（ＳＤ）才であった。
【０１５０】
タンパク質の単離：細胞を含有するフラスコを１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３×洗浄し、細胞スクレーパーを使用して細胞を収集した。収集した細胞を１．５ｍｌの微小遠心管に移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。得た細胞ペレットをホモジナイズ緩衝液中に懸濁させ（１０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ ＮａＦ）、３０秒の間超音波処理した。ホモジネートを、４℃でｌ０分間、１００００ｒｐｍで再び遠心し、上清を収集し、タンパク質評価のために新しいチューブに移した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキットを使用して全タンパク質濃度を測定した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）。
【０１５１】
免疫ブロット分析：タンパク質可溶化液（それぞれタンパク質２０μｇ）を２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液内で１０分間煮沸し、４〜２０％グラジエントＴＲＩＳ−グリシンゲルを使用して分離した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、この膜をＢＳＡで、室温で（ＲＴ）１５分間遮断し、１：２０００希釈の抗−ＰＫＣ−εウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ．；Ｃａｔ Ｎｏ：ｓｃ−２１４）、および１：５０００希釈の抗βチューブリン、クラスＩＩＩウサギモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ、Ｃａｔ Ｎｏ：０４−１０４９）と共に１時間ＲＴでインキュベートした。インキュベーション後、膜部分を標準的ウエスタンブロット洗浄緩衝液で３×洗浄し、さらにアルカリホスファターゼ結合した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）１：１００００希釈と共に４５分間インキュベートした。この膜部分を標準的なウエスタンブロット洗浄緩衝液で最後に３×洗浄し、１−ステップＮＢＴ−ＢＣＩＰ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して発色させた。シグナル強度の画像をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＲＴ−ＥＣＬ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で記録し、ＩＭＡＬソフトウエア（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ、ＷＶ）を使用して濃度定量化を実施した。ＰＫＣ−εに対してこのように定量化した強度を、各レーンについてβ−チューブリンに対して正規化した。
【０１５２】
免疫蛍光：線維芽細胞を、低密度で充填したスライド（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）内で培養した。免疫蛍光染色のため、細胞を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３×で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで４分間固定した。固定に続き、細胞を遮断し、１×ＰＢＳ中の５％血清および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００で３０分間透過処理した。細胞を１×ＰＢＳで３×洗浄し、ウサギポリクローナルＰＫＣ−ε抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）と共に１時間、１：１００希釈でインキュベートした。インキュベーション後、１×ＰＢＳ中でスライドを３×洗浄し、ＦＩＴＣ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）と共に１時間、１：４００希釈でインキュベートした。細胞を洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２’−フェニルインドール、ジヒドロクロリド）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）でも着色した。最後に、スライドを洗浄し、グリセロールＰＢＳ封入液中に固定し、ＬＳＭ ７１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、ＤＡＰＩおよびＦＩＴＣに対してそれぞれ３５０ｎｍおよび４９０ｎｍ励起、ならびに４７０ｎｍおよび５２５ｎｍ発光で観察した。５つの個々の視野を６３×オイルレンズ拡大率で取り込み、各チャネルで平均蛍光強度（ＭＦＩ）を分析した。
【０１５３】
ＲＴ−ＰＣＲ：Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して、製造者のプロトコルに従い、ＲＮＡを約１×１０６細胞から単離した。簡単に説明すると、オリゴｄＴおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して、５０℃で１時間２μｇのＲＮＡを逆転写した。ＰＫＣ−εに対するプライマーを使用して（フォワードプライマー−ＡＧＣＣＴＣＧＴＴＣＡＣＧＧＴＴＣＴＡＴＧＣ、リバースプライマー−ＧＣＡＧＴＧＡＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡ）、およびβ−チューブリン（フォワードプライマー−ＴＴＧＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧ、リバースプライマーＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＧＧＣ）（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、２μｌのｃＤＮＡ生成物を増幅した。５５℃アニーリング温度での２５サイクルの増幅に続いて、Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）内でアンプリコンを分析した。Ｆｕｊｉ Ｉｍａｇｅゲルスキャナー（ＦＬＡ−９０００、Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）を使用してゲル画像を記録し、ＩＭＡＬソフトウエア（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ、ＷＶ）を使用して濃度定量化を実施した。３つの独立した実験について、ＰＫＣ−ε ＯＤ（光学密度）と、β−チューブリンＯＤとの正規化した比としてデータを表示した。
【０１５４】
可溶性のオリゴマーＡβの調製：Ｎｏｇｕｃｈｉら、（２００９年）により記載された方法に従いオリゴマーＡβを調製した。本方法で生成されたＡβは、極めて神経毒性のある、アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）と呼ばれる１０〜１５ｎｍの球状のＡβ集合体であると報告された。ＡＳＰＤの合成のため、Ａβ１−４２（Ａｎａｓｐｅｃ、ＵＳＡ）を１００μΜの濃度で、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルロ（ｈｅｘａｆｌｕｒｏ）−２−プロパノール中に、４℃で一晩、次いで３７℃で３時間溶解した。最後に、溶解したＡβを、アリコット（４０ｎｍｏｌ／チューブ）の中で凍結乾燥させた。凍結乾燥したＡβを、１μΜ濃度で、５０％ＰＢＳ中に溶解し、４℃で１４時間ゆっくりと回転させた。インキュベーションを流して、１００ｋＤａ分子量のカットオフフィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を使用して有毒なＡＳＰＤを精製した。１００ｋｄａを超える分子量の保持液を、線維芽細胞を処理するために使用した。
【０１５５】
オリゴマーＡβ１−４２での皮膚線維芽細胞の処理：ＡＤとＡＣ症例の両方の皮膚線維芽細胞を、１００％コンフルエンスまで７日間培養した。コンフルエント細胞は、これらが１００％コンフルエントになった後で、５００ｎＭ（最終濃度）のＡＳＰＤで、３７℃で２４時間処理した。インキュベーションに続いて、細胞を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３×洗浄し、以前に記載されたウエスタンブロット法用に処理した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＲＴ−ＥＣＬ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して、結果として得たＰＫＣ−εに対するバンド強度を定量化し、ＩＭＡＬソフトウエア（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｏｒｇａｎｔｏｗｎ、ＷＶ）を使用して、濃度分析を実施した。
【０１５６】
例２：脂肪酸メチルエステルシクロプロパン化脂肪酸メチルエステルの合成。
【０１５７】
シクロプロパン化脂肪酸の合成。クロロヨードメタンおよびジエチル亜鉛を使用した、改変されたＳｉｍｍｏｎｓ−Ｓｍｉｔｈ反応を使用して、多価不飽和脂肪酸のメチルエステルをシクロプロパン化した（Ｔａｎａｋａら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．２００３年；１３巻：１０３７〜４０頁；Ｆｕｒｕｋａｗａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．１９６７年；５３〜５８頁；Ｄｅｎｍａｒｋら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１年；５６巻：６９７４〜８１頁）。すべての装置は、６０℃で１時間ベーキングし、乾燥窒素を用いた炎光を使用して乾燥させた。撹拌子および温度プローブを有する１００ｍｌの３口丸底フラスコを、氷−ドライアイスの混合物で取り囲み、２５ｍｌのジクロロメタン中の１．２５ｇ（４．２４ｍｍｏｌ）のリノール酸メチルエステルまたはドコサヘキサエン酸メチルエステルを充填し、Ｎ２でバブリングした。２４インチの長さの２０ゲージニードルを使用して、ジエチル亜鉛（５１ｍｌ、５４．９４ｍｍｏｌ）のヘキサン中１Ｍ溶液を嫌気的に添加し、溶液を−５℃に冷却した。絶え間なく撹拌しながら、ジヨードメタン（８．２ｍｌ、１０１．８８ｍｍｏｌ）またはクロロヨードメタン（ＣｌＣＨ２Ｉ）を毎秒一滴ずつ滴下添加した。必要に応じて添加速度を低下させることで、この反応混合物を２℃以下に維持した。この反応中にて反応混合物は濁り、不溶性の白色の亜鉛生成物を遊離した。フラスコを密閉し、この混合物を１時間反応させておき、次いで２時間に渡りゆっくりと室温に戻した。
【０１５８】
フード内での爆発性残渣の形成を防止するため、ジエチル亜鉛は蒸発させなかった。混合物を撹拌しながら、１００ｍｌの水の中へゆっくりと注ぎ入れ、あらゆる過剰なジエチル亜鉛を分解した。エタンが生成した。この混合物をガラス遠心管内で、５０００ｒｐｍで遠心させ、上部の水層を廃棄した。白色沈殿物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機相と合わせた。有機相を水で洗浄し、遠心した。ヘキサンプラス１％酢酸エチルを使用して、シリカゲルＧ ＴＬＣで生成物を分析し、ｎ−ヘキサン中の増加する濃度の１〜１０％酢酸エチルを使用して、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製し、窒素下で蒸発させると、無色の油としてメチルエステルが残った。
【０１５９】
Ｓｉｍｍｏｎｓ−Ｓｍｉｔｈ反応は、出発物質の立体配置を保存する。Ｆｕｒｕｋａｗａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．１９６７年；５３〜５８頁。ドコサヘキサエン酸メチルエステルを、９０〜９５％収率でＤＨＡ−ＣＰ６へと変換した。生成物は、無色の油であり、エタノール中での単一の吸収度は２０２ｎｍで最大であり、Ｉ２との反応はなかった。ＩＲスペクトルは、３０７０および１４５０ｃｍ−１でのシクロプロパン環の吸収を示した。同じ条件下で、エイコサペンタエン酸メチルエステルをＥＰＡ−ＣＰ５に変換し、アラキドン酸メチルエステルをＡＡ−ＣＰ４に変換した。リノール酸メチルエステルをＤＣＰ−ＬＡメチルエステルに変換したが、これは、既知の試料と等しかった。
【０１６０】
メチルエステルの加水分解。メチルエステル（０．１５ｇ）を１ｍｌの１Ｎ ＬｉＯＨおよび１ｍｌのジオキサン中に溶解した。ジオキサンおよびメタノールを、それが均一になるまで添加し、この溶液を６０°で一晩撹拌した。生成物をＣＨ２Ｃｌ２中に抽出し、遠心した。水層および白色の界面を水で再抽出し、白色層が形成されなくなるまで洗浄した。生成物をＮ２下で蒸発させ、シリカゲル上でのクロマトグラフィーで精製した。ｎ−ヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃの中で生成物である無色の油を溶出した。１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン中のＴＬＣおよびＣ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣで、２０５ｎｍでのＵＶ検出を使用して、その純度をチェックした。
【０１６１】
エポキサイド基は、従来の手段、例えば適切なアルケンをｍ−クロロ過安息香酸またはｔ−ブチルヒドロペルオキシドで酸化することによって、導入することができる。
【０１６２】
合成した他の化合物として、図１に表されているものが挙げられる（ＢＲ−１０１〜ＢＲ−１１８）。
【０１６３】
例２：ドコサヘキサエン酸を使用した精製したＰＫＣイプシロンの活性化
プロテインキナーゼＣアッセイ。組換えＰＫＣ（１ｎｇのアルファまたはイプシロンアイソフォーム）を、１０マイクロモルのヒストン、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２μｇ／μｌのホスファチジル−Ｌ−セリン、０．１８μｇ／μｌの１，２ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＡＧ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ ＥＧＴＡ、４％グリセロール、８μｇ／ｍｌのアプロチニン、８μｇ／ｍｌのロイペプチン、および２ｍＭ ベンズアミジンの存在下、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）と混合した。０．５マイクロＣｉ［γ３２Ｐ］ＡＴＰを添加した。このインキュベーション混合物を、総量１０マイクロリットルで、３７度で１５分間インキュベートした。１×２ｃｍのセルロースホスフェート紙片（Ｗｈａｔｍａｎ Ｐ８１）の上にこの反応混合物をスポットすることによって、この反応を中止し、即時に０．５％Ｈ３ＰＯ４中で２回、１時間に渡り洗浄した。このセルロースホスフェートの紙片をシンチレーションカウンターでカウントした。一部の実験では、ホスファチジルセリン、ジアシルグリセロール、および／またはカルシウムを取り除いた。
【０１６４】
ＤＨＡメチルエステルは、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。ＰＫＣアイソザイムは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。精製されたＰＫＣεは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【０１６５】
結果
精製されたＰＫＣεを使用したＰＫＣ測定は、試験した最低の濃度（１０ｎＭ）において、化合物ＢＲ−１０１は、２．７５倍のＰＫＣεの活性化を生じたことを示した。ＰＫＣαは、影響を受けなかった（データは示されていない）。化合物ＢＲ−１０２はまた、活性化されていないＰＫＣεのおよそ１．７５倍までＰＫＣεの活性化を選択的に誘発した。低濃度でＰＫＣεを活性化するこれら化合物の有効性は、これらが優れた治療的候補となることを示唆している。
【０１６６】
例３：他のＰＫＣアクチベーターを使用した、精製されたまたは細胞のＰＫＣイプシロンの活性化
材料。培地はＫ−Ｄ Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得た。Ａβ１−４２はＡｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から購入した。多価不飽和脂肪酸メチルエステルはＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩから入手した。他の化学薬品はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。ＰＫＣアイソザイムは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手した。精製されたＰＫＣεはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【０１６７】
細胞培養。ラット海馬Ｈ１９−７／ＩＧＦ−ＩＲ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）をポリ−Ｌ−リジンコーティングしたプレートにプレーティングし、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で、３５℃で数日間培養し、およそ５０％カバー度が得られるまでこれを続けた。次いで細胞は、３９℃で、培地を、１０ｎｇ／ｍｌ塩基性の線維芽細胞成長因子を含有する５ｍｌのＮ２培地で置きかえることによって、神経細胞表現型へと分化するように誘導し、Ｔ−７５フラスコ内で、３７℃で培養した。ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロブラストーマ細胞（ＡＴＣＣ）は、４５％Ｆ１２Ｋ／４５％ＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で培養した。マウスＮ２Ａニューロブラストーマ細胞は、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中でグルタミンなしで培養した。１８日齢の胎仔のラット海馬の神経細胞。
【０１６８】
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの脳を、ポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でコーティングされた１２−または９６−ウェルプレート上で、０．５ｍＭグルタミンおよび２５μΜグルタメート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含有するＢ−２７ ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地内でプレーティングし、培地内で３日間グルタメートなしで培養した。５％ＣＯ２下、３７℃で維持したインキュベーター内で神経細胞を１４日間培養した。
【０１６９】
培養細胞に対するすべての実験は、他に述べられていない限り、３回重複して行った。すべてのデータ点は、平均値±ＳＥとして表示されている。ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）は、すべての実験においてその遊離酸で使用し、その一方で、ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５）、およびＢＲ−１１６（ＡＡ−ＣＰ４）は、これらのメチルエステルで使用した。
【０１７０】
プロテインキナーゼＣアッセイ。ラットの海馬細胞を培養し、０．２ｍｌの均質化緩衝液（２０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＦ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン、および０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）中ですくい取り、超音波処理により、Ｍａｒｓｏｎｉｘ マイクロ−プローブソニケーター（５秒、１０Ｗ）内でホモジナイズした。ＰＫＣを測定するため、１０μｌの細胞ホモジネートまたは精製されたＰＫＣアイソザイム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入）を、１０μΜヒストン、４．８９ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２μｇ／μｌのホスファチジル−Ｌ−セリン、０．１８μｇ／μｌの１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．８ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ ＥＧＴＡ、４％グリセロール、８μｇ／ｍｌのアプロチニン、８μｇ／ｍｌのロイペプチン、および２ｍＭベンズアミジンの存在下、３７℃で１５分間インキュベートした。０．５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを添加し、前に記載した通り、ホスホセルロース上への吸着により３２Ｐ−ホスホタンパク質の形成を測定した。ＮｅｌｓｏｎおよびＡｌｋｏｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９５年；６５巻：２３５０〜５７頁。ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）および同様の化合物による活性化の測定のため、ジアシルグリセロールおよびホスファチジルセリンの非存在下、Ｋａｎｎｏらにより記載された通り、ＰＫＣ活性を測定し、添加したＥＧＴＡおよびＣａＣｌ２の非存在下、Ｋａｎｎｏら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２００６年；４７巻：１１４６〜５０頁で記載の通り、ＰＫＣδ、ε、η、およびμを測定した。高濃度のＣａ２＋は、ＰＫＣホスファチジルセリン結合部位と相互作用し、活性化を防止するので、低濃度のＣａ２＋を使用する。ブリオスタチン活性化の測定に対して、１，２−ジアシルグリセロールは、他に述べられていない限り、省略した。
【０１７１】
結果および考察
これらのＰＫＣアイソザイム特異性を判定するため、新しい化合物を精製されたＰＫＣと共に５分間プレインキュベートし、ＰＫＣ活性を放射分析により測定した。上の例２に対して示されているように、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）は、１０μΜでＰＫＣの効果的なアクチベーターであるが、他のＰＫＣアイソフォームに対する作用は比較的低かった（データは示されていない）。より高い濃度では、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）は、ＰＫＣδ（およそ１〜１００μΜ）を部分的に阻害し、ＰＫＣγ（５０〜１００μΜ）を活性化した（データは示されていない）。
【０１７２】
ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）、ＢＲ−１１４（ＥＰＡ−ＣＰ５）、およびＢＲ−１１５（ＡＡ−ＣＰ４）は、それぞれドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、およびアラキドン酸のシクロプロパン化誘導体であるが、精製されたＰＫＣεを同じ程度まで活性化した。ＰＫＣを活性化するために必要な濃度は、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）に対する濃度よりも約１００分の１低く、これはより高い親和性を示唆した。シクロプロパン化リノレニルおよびリノレイルアルコール（ＢＲ−１０４およびＢＲ−１０５）、エポキシステアリン酸（ＢＲ−１１６）、およびベルノリン酸メチルエステル（ＢＲ−１１７）は、ＰＫＣに対する作用がわずかにあるか、またはなかった。シクロプロパン化ベルノリン酸メチルエステル（ＢＲ−１０９）は、１μΜより上の濃度でＰＫＣεを阻害した。
【０１７３】
ジアシルグリセロール結合部位に結合したＰＫＣアクチベーターは、ブリオスタチン、グニジマクリン、およびホルボールエステルなどを含めて、ＰＫＣ活性の一時的な活性化を生じ、続いてより長い下方制御が生じた。Ｎｅｌｓｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２００９年；３４巻：１３６〜４５頁。これを培養したラット海馬細胞において確認した。ブリオスタチンと共にラットＨ１９−７／ＩＧＦ−ＩＲ細胞（０．０４ｎＭおよび０．２ｎＭ）をインキュベートすることで、２倍の活性化を生じ、これが３０分間持続し、続いて２０％の下方制御があり、２４時間でベースラインに戻った（データは示されていない）。対照的に、ＤＣＰ−ＬＡに曝露されたＰＫＣは、少なくとも４時間の間高いままであった。この持続性の活性化は、初代神経細胞内でしか観察されなかった。
【０１７４】
ブリオスタチンは、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３−アセテート（ＰＭＡ）（ＥＣ５０＝１．３５ｎＭ対１０ｎＭ）よりもＰＫＣに対して高い親和性を有するにもかかわらず、ブリオスタチンは、ＰＫＣの下方制御においてＰＭＡより効果が極めて低かった。ＰＫＣ活性は、８時間でホルボールエステルにより強力に下方制御されているが、その一方で、ブリオスタチンで処理した細胞のＰＫＣは、ベースライン上またはその付近にある（データは示されていない）。この差は、ｄａ Ｃｒｕｚ ｅ Ｓｉｌｖａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００９年：１０８巻：３１９〜３０頁で報告された、ＰｄＢｕにより生じるＡβの増加を説明し得る。これらの研究者は、１μΜ ＰｄＢｕを培養されたＣＯＳ細胞に８時間適用し、Ａβの増加を観察した。この増加は、ホルボールエステルによるＰＫＣの下方制御に起因するものであったが、これらの結果と一致する。下方制御は、ＤＣＰ−ＬＡに対して、および関連化合物に対して測定することができなかった。
【０１７５】
例４：Ａβ産生および分解に対するＰＫＣアクチベーターの作用
細胞培養。例３に対して上で記載されているように細胞培養を実施した。
【０１７６】
Ａβの測定および細胞生存度アッセイ。Ａβ １−４２ヒト蛍光分析ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造者の指示書に従いＡβを測定した。Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴマイクロプレートリーダーで結果を測定した。製造者の指示書に従い、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅおよびＣｙＱｕａｎｔ ＮＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で測定を行った。
【０１７７】
結果および考察
Ａβ産生に対するＰＫＣε活性化の効果を測定するため、本発明者らは、多量のＡβを産生する、ヒトＡＰＰＳ ｗｅ／ＰＳＩＤを形質移入したマウスｎｅｕｒｏ２ａ（Ｎ２ａ）神経芽細胞腫細胞を使用した。Ｐｅｔａｎｃｅｓｋａら、ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９６年；７４巻：１８７８〜８４頁。様々な濃度のＰＫＣアクチベーター、ブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）との、これらの細胞の２４時間のインキュベーションは、細胞内と分泌されたＡβの両方のレベルを著しく減少させた。ジアシルグリセロール結合部位への結合によりＰＫＣを活性化するブリオスタチンを用いた場合、阻害は二相性であり、２０ｎＭ以上の濃度では正味の影響はない。これは、このクラスのＰＫＣアクチベーターが高濃度で使用された場合の、ＰＫＣを下方制御するその能力から説明することができる。対照的に、ＰＫＣのホスファチジルセリン部位に結合するＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）は、１０〜１００μΜまでの濃度で阻害を単調に増加させ、より高い濃度では下方制御の証拠がないことを示した。
【０１７８】
ＰＫＣアクチベーターにより引き起こされるＡβレベルの減少は、Ａβ合成の阻害またはＡβ分解の活性化が原因であったかどうか判定するため、本発明者らは、ＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（０．０１〜１０μΜ）および低濃度（１００ｎＭ）の外因性の単量体Ａβ−４２を、培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に適用した。このＡβ濃度は低すぎて、測定可能な毒性または細胞死を生じない。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は微量のＡβしか産生しないので、この実験は、ＰＫＣアクチベーターのＡβ分解を強化する能力の効果的な試験であった。２４時間で、大部分のＡβが細胞により取り込まれ培地内のＡβ濃度は検出不能であった。０．０１〜１０μΜのＤＨＡ−ＣＰ６の細胞への添加は、Ａβの細胞レベルを４５〜６３％減少させたが、これは、ＰＫＣεアクチベーターが外因性のＡβの分解速度を増加させたことを示した。
【０１７９】
ＤＨＡ−ＣＰ６、ブリオスタチン、およびＤＣＰ−ＬＡは、アラマーブルーおよびＣｙＱｕａｎｔ染色で測定した場合、細胞生存または増殖に対して効果がなく、これは、Ａβ産生の減少が、細胞増殖または細胞生存の変化から生じなかったことを示している。
【０１８０】
例５：ＴＡＣＥ活性に対するＰＫＣアクチベーターの効果
ＴＡＣＥアッセイ。５μｌの細胞ホモジネート、３μｌの緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ７．４プラス２５ｍＭ ＮａＣｌプラス４％グリセロール）、および１μｌの１００μΜ ＴＡＣＥ基質ＩＶ（Ａβｚ−ＬＡＱＡＶＲＳＳＳＲ−ＤＰａ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を１．５ｍｌポリプロピレン遠心管内で、３７°で２０分間インキュベートすることによりＴＡＣＥを測定した（Ｊｉｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２年；３０２巻：２６９〜７５頁）。４℃まで冷却することにより、この反応を停止した。試料を１ｍｌに希釈し、Ｓｐｅｘ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ ２蛍光分光計内で蛍光を素早く測定した（ｅｘ＝３２０ｎｍ、ｅｍ＝４２０ｎｍ）。
【０１８１】
結果および考察
以前の研究者らは、ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３−アセテートなどのＰＫＣアクチベーターは、ｓＡＰＰαの増加およびＡβの低下と相関するＴＡＣＥ活性において大きな増加を生じ、これはＡＰＰ基質の利用可能性に対してＴＡＣＥおよびＢＡＣＥ１が競合していることを示唆し、ＰＫＣアクチベーターは、この競合をＴＡＣＥ優位へとシフトさせることを報告した。Ｂｕｘｂａｕｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８年；２７３巻：２７７６５〜６７頁；Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６年：１０３巻：８２１５−２０頁。しかし、これら以前の研究の多くは、線維芽細胞および他の非神経細胞型において行われ、これら細胞は、ＰＫＣアクチベーターに対して神経細胞とは異なる反応をするようである。例えば、Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙらは、１０ｐＭ〜１００ｐＭブリオスタチンによるヒト線維芽細胞におけるＰＫＣの活性化が、α−セクレターゼ活性の初期速度をそれぞれ１６倍および１３２倍増加させたことを発見した（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６年）。しかし、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロブラストーマ細胞、Ｎ２ａマウス神経芽細胞腫細胞、およびラット海馬の初代神経細胞において、ＰＫＣアクチベーターであるブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）および／またはＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）は、ＴＡＣＥ活性においてわずかな増加しか起こさなかった。これは、ＰＫＣアクチベーターによる神経細胞のＡβレベルの減少が、ＴＡＣＥの活性化以外のいくつかの他の機構により引き起こされているに違いないことを示唆している。
【０１８２】
例６：エンドセリン変換酵素活性に対するＰＫＣアクチベーターの効果
ＥＣＥアッセイ。ＳＨ−Ｓ７５７ニューロブラストーマ細胞を、ブリオスタチン（０．２７ｎＭ）、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）（１μΜ）、およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）（１μΜ）と共にインキュベートした。エンドセリン−変換酵素（ＥＣＥ）を、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＡｈｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００年；２８６巻：１１２〜１１８頁の方法を使用して蛍光分析により測定した。細胞ホモジネート試料（２０μｌ）を、５０ｍＭ ＭＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ６．０、０．０１％ Ｃ１２Ｅ１０（ポリオキシエチレン−１０−ラウリルエーテル）、および１５μΜ ＭｃａＢＫ２（７−メトキシクマリン−４−アセチル［Ａｌａ７−（２，４−ジニトロフェニル）Ｌｙｓ９］−ブラジキニントリフルオロアセテート塩）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）内でインキュベートした。３７℃で６０分後、トリフルオロ酢酸を０．５％まで添加することによって、この反応をクエンチした。試料を水で１．４ｍｌに希釈し、蛍光を、ｅｘ＝３３４ｎｍ、ｅｍ＝３９８ｎｍで測定した。
【０１８３】
結果および考察
Ａβは、インスリン分解酵素（インスリジン）、ネプリライシン、およびＥＣＥを含めたいくつかの酵素で、インビボで分解することができる。ＰＫＣεの過剰発現は、ＥＣＥを活性化することが報告されているので（Ｃｈｏｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６年；１０３巻：８２１５〜２０頁）、本発明者らは、ＥＣＥに対するＰＫＣアクチベーターの効果を試験した。ブリオスタチン、ＢＲ−１０１（ＤＣＰ−ＬＡ）、およびＢＲ−１１１（ＤＨＡ−ＣＰ６）はすべて、ＥＣＥ活性の持続的増加を生じた。ＥＣＥは、ジアシルグリセロール結合ＣＩドメインを有さないので、これは、ブリオスタチンによる活性化は、ＥＣＥの直接的活性化によるものではなく、ＰＫＣによる、ＥＣＥまたはいくつかのＥＣＥ活性化中間体のリン酸化から生じるものに違いないことを示唆している。この結果はまた、ＰＫＣアクチベーターによる間接的活性化ＥＣＥは、患者におけるＡβのレベルを減少させる有用な手段となり得ることを示唆している。
【０１８４】
ＰＫＣεを特異的に活性化する、本発明のＰＵＦＡ誘導体などの化合物の利点は、これらが、ホルボールエステルおよび同様の１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）類似体と比べてあまり下方制御を生じないことにある。ＤＡＧに基づくアクチベーターへのＰＫＣの二相性の反応とは、ＰＫＣアクチベーターは、ある時点においてＡβレベルを減少させ、別の時点ではこれらを増加させることを意味する。ｄａ Ｃｒｕｚ ｅ Ｓｉｌｖａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００９年；１０８巻：３１９〜３３０頁。意図するものと反する効果を回避するためには、慎重な投薬および患者のモニターが必要とされる。この新しいクラスのＰＫＣアクチベーターは、ＰＫＣを下方制御する能力に比較的劣るため、この問題は回避することができる。
【０１８５】
参考文献
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
ａ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、
ｂ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを、対照対象のＰＫＣイプシロンレベルと比較するステップと
を含み、前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルが、前記対照対象のＰＫＣイプシロンレベルより低い場合、前記方法は、前記ヒト対象におけるアルツハイマー病を示す方法。
【請求項２】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、１以上の細胞において測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＲＴ−ＰＣＲにより測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対照対象が、アルツハイマー病を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記判定するステップ（ａ）が、インビトロで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記判定するステップ（ａ）が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト対象の前記ＰＫＣイプシロンレベルが、前記対照対象のＰＫＣイプシロンレベル以上である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
ａ）ヒト対象から１以上の細胞を得るステップと、
ｂ）前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、
ｃ）ステップ（ａ）の前記１以上の細胞を、ＰＫＣイプシロンアクチベーターである薬剤と接触させるステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）の前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを、ステップ（ｃ）における前記接触の後に判定するステップと
を含み、ステップ（ｄ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルより大きい場合、アルツハイマー病が前記ヒト対象において示される方法。
【請求項１１】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＫＣイプシロンレベルがＲＴ−ＰＣＲにより測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、１以上の細胞において測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップ（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）が、インビトロで行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記判定するステップ（ｂ）、（ｄ）、または（ｂ）および（ｄ）の両方が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｄ）で判定された前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベル以下である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト対象におけるアルツハイマー病の進行を判定またはモニターする方法であって、
ａ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、
ｂ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを、対照対象のＰＫＣイプシロンレベルと比較するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）における前記比較に基づいて、前記アルツハイマー病の進行を判定またはモニターするステップと
を含む方法。
【請求項１９】
アルツハイマー病が進行するにつれて、前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルが低下する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、１以上の細胞において測定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＲＴ−ＰＣＲにより測定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記対照対象が、アルツハイマー病を有さない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記判定するステップ（ａ）が、インビトロで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記判定するステップ（ａ）が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
アルツハイマー病の進行が逆行するにつれて、ＰＫＣイプシロンレベルが前記ヒト対象において増加する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
細胞のＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるための方法であって、１以上のヒト細胞を、無接触のヒト細胞と比較して前記細胞のＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるために効果的な、ある量のＰＫＣアクチベーターと接触させるステップを含む方法。
【請求項２９】
前記ヒト細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＫＣアクチベーターが大環状ラクトンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記大環状ラクトンがブリオスタチンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ブリオスタチンがブリオスタチン１である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
ａ）ヒト対象から１以上の細胞を得るステップと、
ｂ）前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、
ｃ）ステップ（ａ）の前記１以上の細胞をＡβペプチドと接触させるステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）の前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを、ステップ（ｃ）における前記接触の後に判定するステップと
を含み、ステップ（ｄ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルと有意に異ならない場合、アルツハイマー病が前記ヒト対象において示される方法。
【請求項３５】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＡβペプチドがＡβ１−４２である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＫＣイプシロンレベルがＲＴ−ＰＣＲにより測定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが１以上の細胞において測定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記ステップ（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）がインビトロで行われる、請求項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記判定するステップ（ｂ）、（ｄ）、または（ｂ）および（ｄ）の両方が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｄ）で判定された前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベル未満である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
ＰＫＣイプシロンに特異的な１以上の抗体を含むキット。
【請求項４４】
ＰＫＣアクチベーターをさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
ＰＫＣイプシロンアクチベーターをさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４６】
ＰＫＣイプシロンをコードしている遺伝子に特異的な１以上のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４７】
ＰＫＣイプシロンをコードしている遺伝子に特異的な１以上のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項４８】
ＰＫＣアクチベーターをさらに含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
ＰＫＣイプシロンアクチベーターをさらに含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
アルツハイマー病の治療に有用な化合物を同定する方法であって、
ａ）アルツハイマー病対象から１以上の細胞を得ることと、
ｂ）前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定することと、
ｃ）前記細胞を候補化合物と接触させることと、
ｄ）前記接触させるステップ（ｃ）の後に前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定することと
を含み、ステップ（ｄ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルより大きい場合、前記候補化合物がアルツハイマー病の治療に有用な化合物であると同定される方法。
【請求項５１】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＲＴ−ＰＣＲにより測定される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ステップがインビトロで行われる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記判定するステップ（ｂ）もしくは（ｄ）、または両方が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項１】
ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
ａ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、
ｂ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを、対照対象のＰＫＣイプシロンレベルと比較するステップと
を含み、前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルが、前記対照対象のＰＫＣイプシロンレベルより低い場合、前記方法は、前記ヒト対象におけるアルツハイマー病を示す方法。
【請求項２】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、１以上の細胞において測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＲＴ−ＰＣＲにより測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対照対象が、アルツハイマー病を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記判定するステップ（ａ）が、インビトロで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記判定するステップ（ａ）が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト対象の前記ＰＫＣイプシロンレベルが、前記対照対象のＰＫＣイプシロンレベル以上である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
ａ）ヒト対象から１以上の細胞を得るステップと、
ｂ）前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、
ｃ）ステップ（ａ）の前記１以上の細胞を、ＰＫＣイプシロンアクチベーターである薬剤と接触させるステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）の前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを、ステップ（ｃ）における前記接触の後に判定するステップと
を含み、ステップ（ｄ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルより大きい場合、アルツハイマー病が前記ヒト対象において示される方法。
【請求項１１】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＫＣイプシロンレベルがＲＴ−ＰＣＲにより測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、１以上の細胞において測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップ（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）が、インビトロで行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記判定するステップ（ｂ）、（ｄ）、または（ｂ）および（ｄ）の両方が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｄ）で判定された前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベル以下である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト対象におけるアルツハイマー病の進行を判定またはモニターする方法であって、
ａ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、
ｂ）前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルを、対照対象のＰＫＣイプシロンレベルと比較するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）における前記比較に基づいて、前記アルツハイマー病の進行を判定またはモニターするステップと
を含む方法。
【請求項１９】
アルツハイマー病が進行するにつれて、前記ヒト対象のＰＫＣイプシロンレベルが低下する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、１以上の細胞において測定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＲＴ−ＰＣＲにより測定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記対照対象が、アルツハイマー病を有さない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記判定するステップ（ａ）が、インビトロで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記判定するステップ（ａ）が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
アルツハイマー病の進行が逆行するにつれて、ＰＫＣイプシロンレベルが前記ヒト対象において増加する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
細胞のＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるための方法であって、１以上のヒト細胞を、無接触のヒト細胞と比較して前記細胞のＰＫＣイプシロンタンパク質レベルを上げるために効果的な、ある量のＰＫＣアクチベーターと接触させるステップを含む方法。
【請求項２９】
前記ヒト細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＫＣアクチベーターが大環状ラクトンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記大環状ラクトンがブリオスタチンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ブリオスタチンがブリオスタチン１である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
ヒト対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
ａ）ヒト対象から１以上の細胞を得るステップと、
ｂ）前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定するステップと、
ｃ）ステップ（ａ）の前記１以上の細胞をＡβペプチドと接触させるステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）の前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを、ステップ（ｃ）における前記接触の後に判定するステップと
を含み、ステップ（ｄ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルと有意に異ならない場合、アルツハイマー病が前記ヒト対象において示される方法。
【請求項３５】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＡβペプチドがＡβ１−４２である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＫＣイプシロンレベルがＲＴ−ＰＣＲにより測定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが１以上の細胞において測定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記ステップ（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）がインビトロで行われる、請求項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記判定するステップ（ｂ）、（ｄ）、または（ｂ）および（ｄ）の両方が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｄ）で判定された前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベル未満である場合、前記ヒト対象においてアルツハイマー病が存在しないことが示される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
ＰＫＣイプシロンに特異的な１以上の抗体を含むキット。
【請求項４４】
ＰＫＣアクチベーターをさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
ＰＫＣイプシロンアクチベーターをさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４６】
ＰＫＣイプシロンをコードしている遺伝子に特異的な１以上のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４７】
ＰＫＣイプシロンをコードしている遺伝子に特異的な１以上のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項４８】
ＰＫＣアクチベーターをさらに含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
ＰＫＣイプシロンアクチベーターをさらに含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
アルツハイマー病の治療に有用な化合物を同定する方法であって、
ａ）アルツハイマー病対象から１以上の細胞を得ることと、
ｂ）前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定することと、
ｃ）前記細胞を候補化合物と接触させることと、
ｄ）前記接触させるステップ（ｃ）の後に前記１以上の細胞のＰＫＣイプシロンレベルを判定することと
を含み、ステップ（ｄ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルが、ステップ（ｂ）で判定されたＰＫＣイプシロンレベルより大きい場合、前記候補化合物がアルツハイマー病の治療に有用な化合物であると同定される方法。
【請求項５１】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＰＫＣイプシロンタンパク質レベルまたはＰＫＣイプシロン活性レベルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＰＫＣイプシロンレベルが、ＲＴ−ＰＣＲにより測定される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ステップがインビトロで行われる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が、線維芽細胞、口腔粘膜細胞、神経細胞、または血液細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記判定するステップ（ｂ）もしくは（ｄ）、または両方が、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降法、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、ドットブロットアッセイおよびスロットブロットアッセイからなる群から選択される方法を含む、請求項５０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５２０６５２（Ｐ２０１３−５２０６５２Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５３９０７（Ｐ２０１２−５５３９０７）
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０００３１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０２９０７
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（５０３３１０２２４）ブランシェット・ロックフェラー・ニューロサイエンスィズ・インスティテュート (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０００３１５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０２９０７
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（５０３３１０２２４）ブランシェット・ロックフェラー・ニューロサイエンスィズ・インスティテュート (25)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]