プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤
【課題】安全性の高い天然物の中からプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を提供する。
【解決手段】本発明のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物及びトウニン抽出物からなる群より選択される１種又は２種以上の抽出物を含有させる。
【解決手段】本発明のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物及びトウニン抽出物からなる群より選択される１種又は２種以上の抽出物を含有させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors；ＮＭＦ）の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解されて産生される。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトでプロフィラグリンとして発現する。その後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、脱リン酸、加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
近年、このフィラグリンが、皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥等の条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが知られている（非特許文献２参照）。角質層におけるアミノ酸量が低下し、角質層の水分量が低下すると、角質層が硬くなってしまい、角質層に亀裂を生じさせ、皮膚の乾燥、荒れ、シワ等の原因となることが知られている。
【０００４】
したがって、表皮ケラチノサイトにおいて、プロフィラグリンの産生促進を通じて、フィラグリンの産生を促進し、それにより角質層内のアミノ酸量を増大させることで、角質層の水分環境を本質的に改善することができ、皮膚の乾燥、荒れ、シワ等を防止し得ると期待されている。
【０００５】
このようなプロフィラグリン産生促進作用及びフィラグリン産生促進作用を有するものとしては、例えば、カンゾウ抽出物（特許文献１参照）、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン（特許文献２参照）等が知られており、プロフィラグリン及びフィラグリン蛋白産生促進作用を有するものとしては、例えば、Citrus属に属する植物エキス又は酵母エキス（特許文献３参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３６３０５４号公報
【特許文献２】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献３】特開２００１−２６１５６８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「フレグランスジャーナル臨時増刊」，2000年，Vol.17，p.14-19
【非特許文献２】"Arch. Dermatol. Res."，1996年，Vol.288，p.442-446
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安全性の高い天然物の中からプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物及びトウニン抽出物からなる群より選択される１種又は２種以上の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有し、かつ安全性の高いプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物及びトウニン抽出物からなる群より選択される１種又は２種以上の抽出物を有効成分として含有するものである。
【００１２】
ここで、本実施形態において「抽出物」には、各天然物等を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１３】
本実施形態において使用する抽出原料は、ガイヨウ、クマザサ（学名：Sasa veitchii RERD.）、ローズマリー（学名：Rosmarinus officinalis L.）、レイシ（学名：Ganoderma lucidum（Fr．）Karst．）又はトウニンである。
【００１４】
ガイヨウ（生薬名）は、日本全土に分布しているキク科ヨモギ属に属する多年生草本であるヨモギ（学名：Artemisia priceps Pampanini）の葉部であり、これらの地域から容易に入手することができる。ガイヨウは、従来、婦人科領域の止血、流産防止、寒証の腹痛の予防等に使用されている。
【００１５】
クマザサ（Sasa veitchii RERD.）は、近畿地方、中国地方、九州地方等に自生しているイネ科ササ属に属する植物であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得る構成部位としては、例えば、葉部、茎部、又はこれらの混合物等が挙げられるが、好ましくは葉部である。
【００１６】
ローズマリー（Rosmarinus officinalis L.）は、ヨーロッパ、日本等に分布しているシソ科マンネンロウ属に属する常緑低木であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得る構成部位としては、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、種子部、花部等の地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは葉部である。
【００１７】
レイシ（Ganoderma lucidum（Fr．）Karst．）は、サルノコシカケ科（Polyporaceae）の担子菌類である。抽出原料として使用し得る構成部位は特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができ、特に子実体を用いることが好ましい。
【００１８】
トウニン（生薬名）は、中国や日本で古くから栽培されているバラ科サクラ属に属するモモ（学名：Prunus persica）の種子であり、これらの地域から容易に入手することができる。モモは、多くの品種が分化しており、花は観賞用として、果実は食用として利用されている。トウニンは、古くから民間薬として利用されており、浄血、鎮咳、消炎等の作用を有することが知られている。
【００１９】
ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物及びトウニン抽出物に含まれるプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有する物質の詳細は不明であるが、天然物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって、これらの天然物からプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有する抽出物を得ることができる。
【００２０】
例えば、上記抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、上記抽出原料の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００２１】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００２２】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２３】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２４】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合することが好ましい。
【００２５】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２６】
なお、上述のようにして得られた抽出液はそのままでもプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。
【００２７】
また、上記各抽出物は特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料等に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。
【００２８】
以上のようにして得られる上記各抽出物は、優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有しているため、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として用いることができる。
【００２９】
なお、本実施形態においては、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物のうちのいずれか一つを上記有効成分として用いてもよいし、これらを混合して上記有効成分として用いてもよい。ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物を混合して上記有効成分として用いる場合、その配合比は、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物が有するプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用の程度等により適宜調整すればよい。
【００３０】
本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物及びこれらの混合物のみからなるものでもよいし、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物及びこれらの混合物を製剤化したものでもよい。
【００３１】
本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、他の組成物（例えば、皮膚外用剤、美容用飲食品等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００３２】
本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を製剤化した場合、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物及びこれらの混合物の含有量は、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定することができる。
【００３３】
なお、本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、必要に応じて、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有する他の天然抽出物等を、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物及びこれらの混合物とともに配合して有効成分として用いることができる。
【００３４】
本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤の患者に対する投与方法としては、経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【００３５】
また、本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３６】
本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物が有するプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、表皮ケラチノサイトにおいて、フィラグリンの産生を促進し、これにより角質層内のアミノ酸量を増大させることで、角質層の水分環境を本質的に改善することができ、皮膚の乾燥、荒れ、シワ、老化症状等を予防・改善することができる。ただし、本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３７】
また、本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有するため、例えば、皮膚外用剤又は飲食品に配合するのに好適である。この場合に、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物及びこれらの混合物をそのまま配合してもよいし、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物及びこれらの混合物から製剤化したプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を配合してもよい。
【００３８】
ここで、皮膚外用剤としては、その区分に制限はなく、経皮的に使用される皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものであり、具体的には、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプー等が挙げられる。
【００３９】
飲食品としては、その区分に制限はなく、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。
【００４０】
また、本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有するので、プロフィラグリン又はフィラグリンの発現機構に関連する研究のための試薬としても好適に利用することができる。
【００４１】
なお、本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば，マウス，ラット，ハムスター，イヌ，ネコ，ウシ，ブタ，サル等）に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４２】
以下、試験例等を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の試験例等に何ら制限されるものではない。なお、下記試験例においては、被験試料として、表１に示す製品の凍結乾燥品（試料１〜５）を使用した。
【００４３】
【表１】
【００４４】
〔試験例１〕プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記各抽出物（試料１〜５）について、以下のようにしてプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００４５】
ヒト正常新生児表皮角化細胞（normal human epidermal keratinocyte，ＮＨＥＫ）をヒト正常新生児表皮角化細胞用培地（ＫＧＭ）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＫＧＭ培地で希釈した後、Φ３５ｍｍシャーレに２ｍＬずつ播種し（２×１０５ｃｅｌｌｓ／シャーレ）、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩（２４時間以上）培養した。
【００４６】
培養終了後、培地を除去し、被験試料（試料１〜５，試料濃度は下記表２を参照）を添加したＫＧＭ培地又は試料無添加のＫＧＭ培地を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で４８時間培養した後、以下の方法により総ＲＮＡを調製した。すなわち、細胞を１ｍＬのＲＮＡ抽出用試薬（インビトロジェン社製，ＴＲＩｚｏｌ）で溶解し、クロロホルムを２００μＬ添加し、常法にて撹拌処理を行った後、遠心機（エッペンドルフ社製，Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１５Ｒ）を用いた遠心処理（１２０００回転，４℃，１５分間）にて上層ＲＮＡ層を単離し、さらにイソプロパノールで濃縮を行った。濃縮沈殿させた総ＲＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現量を測定するための定量的ＲＴ−ＰＣＲ法の鋳型に使用する総ＲＮＡ標品とした。
【００４７】
得られた総ＲＮＡ標品５００ｎｇを鋳型として、ＰＣＲキット（タカラバイオ社製，ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ））を用いて、一本鎖ＤＮＡを合成した。得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲキット（タカラバイオ社製，ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ））と、プロフィラグリン遺伝子及び内部標準としてのＧＡＰＤＨ遺伝子のそれぞれに特異的なプライマーとを用い、ＰＣＲ装置（タカラバイオ社製，ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰ）によりＰＣＲ反応で増幅を行った。なお、プライマーとしては、プロフィラグリン遺伝子に対するセンスプライマー（配列番号１）及びアンチセンスプライマー（配列番号２）と、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するセンスプライマー（配列番号３）及びアンチセンスプライマー（配列番号４）を用いた。また、ＰＣＲ反応は、９５℃で３分間保温の後、９５℃で１分間、５９℃で１分間、７２℃で１分間の反応を３０サイクル繰り返し、サイクル終了後に７２℃で１０分間保温し、その後冷却する条件にて行った。
【００４８】
上記ＰＣＲ反応により得られた増幅産物１０μＬを１．５％アガロースゲルにて電気泳動した。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、これをトランスイルミネーター下でデジタルカメラ（コダック社製，ＤＣ１２０ ＺＯＯＭ Ｄｉｇｉｔａｌ ｃａｍｅｒａ）を用いて撮影後、画像解析ソフトウェア（コダック社製，１Ｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＥＤＡＳ２９０ Ｖｅｒｓｉｏｎ３．５）にてＲＴ−ＰＣＲ産物を定量的に測定した。反応液の内容は、試薬（タカラバイオ社製，ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ））添付資料に従った。結果は、「試料無添加」および「被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＲＴ−ＰＣＲ反応により増幅させたプロフィラグリンのバンド強度値をＧＡＰＤＨのバンド強度値で除して補正値を求め、さらに「試料無添加」の補正値を１００とした時の「被験試料添加」の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進率（％）を計算した。
プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「被験試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
表２に示すように、ガイヨウ抽出物（試料１）、クマザサ抽出物（試料２）、ローズマリー抽出物（試料３）、レイシ抽出物（試料４）、及びトウニン抽出物（試料５）は、いずれも優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、皮膚の乾燥、荒れ、シワ、老化症状の予防又は改善に大きく貢献できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors；ＮＭＦ）の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解されて産生される。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトでプロフィラグリンとして発現する。その後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、脱リン酸、加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
近年、このフィラグリンが、皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥等の条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが知られている（非特許文献２参照）。角質層におけるアミノ酸量が低下し、角質層の水分量が低下すると、角質層が硬くなってしまい、角質層に亀裂を生じさせ、皮膚の乾燥、荒れ、シワ等の原因となることが知られている。
【０００４】
したがって、表皮ケラチノサイトにおいて、プロフィラグリンの産生促進を通じて、フィラグリンの産生を促進し、それにより角質層内のアミノ酸量を増大させることで、角質層の水分環境を本質的に改善することができ、皮膚の乾燥、荒れ、シワ等を防止し得ると期待されている。
【０００５】
このようなプロフィラグリン産生促進作用及びフィラグリン産生促進作用を有するものとしては、例えば、カンゾウ抽出物（特許文献１参照）、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン（特許文献２参照）等が知られており、プロフィラグリン及びフィラグリン蛋白産生促進作用を有するものとしては、例えば、Citrus属に属する植物エキス又は酵母エキス（特許文献３参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３６３０５４号公報
【特許文献２】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献３】特開２００１−２６１５６８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「フレグランスジャーナル臨時増刊」，2000年，Vol.17，p.14-19
【非特許文献２】"Arch. Dermatol. Res."，1996年，Vol.288，p.442-446
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安全性の高い天然物の中からプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物及びトウニン抽出物からなる群より選択される１種又は２種以上の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有し、かつ安全性の高いプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物及びトウニン抽出物からなる群より選択される１種又は２種以上の抽出物を有効成分として含有するものである。
【００１２】
ここで、本実施形態において「抽出物」には、各天然物等を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１３】
本実施形態において使用する抽出原料は、ガイヨウ、クマザサ（学名：Sasa veitchii RERD.）、ローズマリー（学名：Rosmarinus officinalis L.）、レイシ（学名：Ganoderma lucidum（Fr．）Karst．）又はトウニンである。
【００１４】
ガイヨウ（生薬名）は、日本全土に分布しているキク科ヨモギ属に属する多年生草本であるヨモギ（学名：Artemisia priceps Pampanini）の葉部であり、これらの地域から容易に入手することができる。ガイヨウは、従来、婦人科領域の止血、流産防止、寒証の腹痛の予防等に使用されている。
【００１５】
クマザサ（Sasa veitchii RERD.）は、近畿地方、中国地方、九州地方等に自生しているイネ科ササ属に属する植物であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得る構成部位としては、例えば、葉部、茎部、又はこれらの混合物等が挙げられるが、好ましくは葉部である。
【００１６】
ローズマリー（Rosmarinus officinalis L.）は、ヨーロッパ、日本等に分布しているシソ科マンネンロウ属に属する常緑低木であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得る構成部位としては、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、種子部、花部等の地上部、根部又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは葉部である。
【００１７】
レイシ（Ganoderma lucidum（Fr．）Karst．）は、サルノコシカケ科（Polyporaceae）の担子菌類である。抽出原料として使用し得る構成部位は特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができ、特に子実体を用いることが好ましい。
【００１８】
トウニン（生薬名）は、中国や日本で古くから栽培されているバラ科サクラ属に属するモモ（学名：Prunus persica）の種子であり、これらの地域から容易に入手することができる。モモは、多くの品種が分化しており、花は観賞用として、果実は食用として利用されている。トウニンは、古くから民間薬として利用されており、浄血、鎮咳、消炎等の作用を有することが知られている。
【００１９】
ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物及びトウニン抽出物に含まれるプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有する物質の詳細は不明であるが、天然物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって、これらの天然物からプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有する抽出物を得ることができる。
【００２０】
例えば、上記抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、上記抽出原料の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００２１】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００２２】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２３】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２４】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合することが好ましい。
【００２５】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２６】
なお、上述のようにして得られた抽出液はそのままでもプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。
【００２７】
また、上記各抽出物は特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料等に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。
【００２８】
以上のようにして得られる上記各抽出物は、優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有しているため、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として用いることができる。
【００２９】
なお、本実施形態においては、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物のうちのいずれか一つを上記有効成分として用いてもよいし、これらを混合して上記有効成分として用いてもよい。ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物を混合して上記有効成分として用いる場合、その配合比は、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物が有するプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用の程度等により適宜調整すればよい。
【００３０】
本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物及びこれらの混合物のみからなるものでもよいし、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物及びこれらの混合物を製剤化したものでもよい。
【００３１】
本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、他の組成物（例えば、皮膚外用剤、美容用飲食品等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００３２】
本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を製剤化した場合、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物及びこれらの混合物の含有量は、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定することができる。
【００３３】
なお、本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、必要に応じて、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有する他の天然抽出物等を、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物及びこれらの混合物とともに配合して有効成分として用いることができる。
【００３４】
本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤の患者に対する投与方法としては、経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【００３５】
また、本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３６】
本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物が有するプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、表皮ケラチノサイトにおいて、フィラグリンの産生を促進し、これにより角質層内のアミノ酸量を増大させることで、角質層の水分環境を本質的に改善することができ、皮膚の乾燥、荒れ、シワ、老化症状等を予防・改善することができる。ただし、本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３７】
また、本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有するため、例えば、皮膚外用剤又は飲食品に配合するのに好適である。この場合に、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物及びこれらの混合物をそのまま配合してもよいし、ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物又はトウニン抽出物及びこれらの混合物から製剤化したプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤を配合してもよい。
【００３８】
ここで、皮膚外用剤としては、その区分に制限はなく、経皮的に使用される皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものであり、具体的には、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプー等が挙げられる。
【００３９】
飲食品としては、その区分に制限はなく、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。
【００４０】
また、本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有するので、プロフィラグリン又はフィラグリンの発現機構に関連する研究のための試薬としても好適に利用することができる。
【００４１】
なお、本実施形態のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば，マウス，ラット，ハムスター，イヌ，ネコ，ウシ，ブタ，サル等）に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４２】
以下、試験例等を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の試験例等に何ら制限されるものではない。なお、下記試験例においては、被験試料として、表１に示す製品の凍結乾燥品（試料１〜５）を使用した。
【００４３】
【表１】
【００４４】
〔試験例１〕プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記各抽出物（試料１〜５）について、以下のようにしてプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００４５】
ヒト正常新生児表皮角化細胞（normal human epidermal keratinocyte，ＮＨＥＫ）をヒト正常新生児表皮角化細胞用培地（ＫＧＭ）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＫＧＭ培地で希釈した後、Φ３５ｍｍシャーレに２ｍＬずつ播種し（２×１０５ｃｅｌｌｓ／シャーレ）、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩（２４時間以上）培養した。
【００４６】
培養終了後、培地を除去し、被験試料（試料１〜５，試料濃度は下記表２を参照）を添加したＫＧＭ培地又は試料無添加のＫＧＭ培地を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で４８時間培養した後、以下の方法により総ＲＮＡを調製した。すなわち、細胞を１ｍＬのＲＮＡ抽出用試薬（インビトロジェン社製，ＴＲＩｚｏｌ）で溶解し、クロロホルムを２００μＬ添加し、常法にて撹拌処理を行った後、遠心機（エッペンドルフ社製，Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１５Ｒ）を用いた遠心処理（１２０００回転，４℃，１５分間）にて上層ＲＮＡ層を単離し、さらにイソプロパノールで濃縮を行った。濃縮沈殿させた総ＲＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現量を測定するための定量的ＲＴ−ＰＣＲ法の鋳型に使用する総ＲＮＡ標品とした。
【００４７】
得られた総ＲＮＡ標品５００ｎｇを鋳型として、ＰＣＲキット（タカラバイオ社製，ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ））を用いて、一本鎖ＤＮＡを合成した。得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲキット（タカラバイオ社製，ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ））と、プロフィラグリン遺伝子及び内部標準としてのＧＡＰＤＨ遺伝子のそれぞれに特異的なプライマーとを用い、ＰＣＲ装置（タカラバイオ社製，ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰ）によりＰＣＲ反応で増幅を行った。なお、プライマーとしては、プロフィラグリン遺伝子に対するセンスプライマー（配列番号１）及びアンチセンスプライマー（配列番号２）と、ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するセンスプライマー（配列番号３）及びアンチセンスプライマー（配列番号４）を用いた。また、ＰＣＲ反応は、９５℃で３分間保温の後、９５℃で１分間、５９℃で１分間、７２℃で１分間の反応を３０サイクル繰り返し、サイクル終了後に７２℃で１０分間保温し、その後冷却する条件にて行った。
【００４８】
上記ＰＣＲ反応により得られた増幅産物１０μＬを１．５％アガロースゲルにて電気泳動した。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、これをトランスイルミネーター下でデジタルカメラ（コダック社製，ＤＣ１２０ ＺＯＯＭ Ｄｉｇｉｔａｌ ｃａｍｅｒａ）を用いて撮影後、画像解析ソフトウェア（コダック社製，１Ｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＥＤＡＳ２９０ Ｖｅｒｓｉｏｎ３．５）にてＲＴ−ＰＣＲ産物を定量的に測定した。反応液の内容は、試薬（タカラバイオ社製，ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ））添付資料に従った。結果は、「試料無添加」および「被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＲＴ−ＰＣＲ反応により増幅させたプロフィラグリンのバンド強度値をＧＡＰＤＨのバンド強度値で除して補正値を求め、さらに「試料無添加」の補正値を１００とした時の「被験試料添加」の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進率（％）を計算した。
プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「被験試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
表２に示すように、ガイヨウ抽出物（試料１）、クマザサ抽出物（試料２）、ローズマリー抽出物（試料３）、レイシ抽出物（試料４）、及びトウニン抽出物（試料５）は、いずれも優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤は、皮膚の乾燥、荒れ、シワ、老化症状の予防又は改善に大きく貢献できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物及びトウニン抽出物からなる群より選択される１種又は２種以上の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項１】
ガイヨウ抽出物、クマザサ抽出物、ローズマリー抽出物、レイシ抽出物及びトウニン抽出物からなる群より選択される１種又は２種以上の抽出物を有効成分として含有することを特徴とするプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤。
【公開番号】特開２０１２−２１９０４７（Ｐ２０１２−２１９０４７Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８４８５９（Ｐ２０１１−８４８５９）
【出願日】平成２３年４月６日（２０１１．４．６）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月６日（２０１１．４．６）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
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