ヘパリン結合活性を有する新規な抗微生物ペプチド
本発明は、ヘパリン結合活性を有し、ラミニンアイソフォーム、補体因子Ｃ３、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、及びキニノーゲンから成る群から選択される、実質的に抗微生物活性を含まない内在性哺乳類タンパク質に由来し、そして１０〜３６のアミノ酸残基を有する抗微生物ペプチドであって、ここで当該抗微生物ペプチドが、Ｋ、Ｒ、及びＨから成る群から選択される少なくとも４つのアミノ酸残基から成る抗微生物ペプチドに関する。また、本発明は、上記抗微生物ペプチドを含んで成る医薬組成物、並びに当該抗微生物ペプチド及び／又は抗微生物／医薬組成物の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパリン結合活性を有し、ラミニンアイソフォーム、補体因子Ｃ３、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、及びキニノーゲンから成る群から選択される実質的に抗微生物活性を含まない内在性哺乳類タンパク質に由来し、そして１０〜３６のアミノ酸残基を有する抗微生物ペプチドであって、ここで当該抗微生物ペプチドが、Ｋ、Ｒ、及びＨから成る群から選択される少なくとも４つのアミノ酸残基から成る抗微生物ペプチドに関する。また、本発明は、上記抗微生物ペプチドを含んで成る医薬組成物、並びに当該抗微生物ペプチド及び／又は抗微生物／医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの感染は、哺乳類、例えば、ヒトの免疫系によりうまく駆除されている。しかしながら、いくらかの感染においては、細菌、真菌、又はウイルスが必ずしも駆除されるわけでははく、それは局在化又は一般化した急性の感染の原因となりうる。これは、出生時、火傷、又は集中治療室、及び免疫無防備状態の個体において深刻な問題である。他のケースにおいて、上皮表面における連続的な細菌残留は、慢性的疾患の原因又は悪化となり得る。ヒトにおいて、これは、慢性皮膚潰瘍、アトピー性皮膚炎、及び他の種類の湿疹、アクネ、又は尿生殖器感染といった例が挙げられる。
【０００３】
症候性感染は多様な医薬により治療することができる。また、いくつかの疾患は、例えば、ワクチンにより駆除することができる。しかしながら、ワクチンは常に最良の治療選択ではなく、そして、一定の微生物に対しては利用できるワクチンが存在しない。しばしば当該治療は、抗生物質の使用により行われ、これは当該微生物を殺す。しかしながら、近年、いくらかの微生物が抗生物質に対して抵抗性となってきている。おそらく抵抗性の問題は近い将来増加するであろう。更に、いくつかの個体は、抗生物質に対してアレルギーを発生し、このため一定の抗生物質を有効的に使用する可能性が減少している。
【０００４】
多様な生物の上皮表面は、連続的に細菌に暴露されている。近年、抗細菌ペプチドに基づく自然免疫系が、感染に対して感受性の高い生物学的境界において細菌の初期クリアランスに重要な役割を果たしてきている(Lehrer, R. I. , and Ganz, T. (1999) Curr Opin Immunol 11 : 23-27, Boman, H. G. (2000) Immunol. Rev. 173, 5-16)。抗微生物ペプチドは、細菌の膜に浸透することにより細菌を殺し、従って特異的な分子の標的微生物の欠如は抵抗性の発生を最小化する。
【０００５】
本明細書に記載されているものとは無関係のいくつかの抗微生物ペプチド及びタンパク質は、当業界において既知である。
【０００６】
米国出願第6,503, 881号は、抗微生物ペプチドとして使用されるインドリシジン類事態である陽イオン性ペプチドを開示する。当該陽イオン性ペプチドは、動物及び植物を含む異なる種に由来する。
【０００７】
米国出願第5,912, 230号は、抗真菌及び抗細菌ヒスタチン型ペプチドを開示する。当該ペプチドは、天然のヒトヒスタチンのアミノ酸配列の限定部分、及び真菌及び細菌感染の治療方法に基づく。
【０００８】
米国出願第5,717, 064号は、メチル化リジン−リッチ溶解性ペプチドを開示する。当該溶解性ペプチドは、トリプシン分解抵抗性、且つ非天然である。当該溶解性ペプチドは生体内投与に適当である。
【０００９】
米国出願第5,646, 014号は、抗微生物ペプチドを開示する。当該ペプチドはカイコ血リンパ由来の抗微生物フラクションから単離された。当該ペプチドは、いくつかの細菌種、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）及びセレウス菌（Bacillus cereus）に対して優れた抗微生物活性を示す。
【００１０】
McCabe et al., J. Biol. Chem. Vol 277: 27477-27488, 2002 は、ヘパリン結合コンセンサスモチーフである、ＸＢＢＸＢＸ、及びＸＢＢＢＸＸＢＸを含む、３７ｋＤａの抗微生物且つ走化性タンパク質であるアズロシジンを開示する。
【００１１】
WO 2004016653 は、２０〜４４のアズロシジンの配列に基づくペプチドを開示する。当該ペプチドは、ジスルフィド架橋により連結されるループ構造を含む。
【００１２】
米国出願第6495516号及び関連特許文献は、抗細菌／透過性増大タンパク質（ＢＰＩ)である、抗細菌性の５５ＫＤａのタンパク質に基づくペプチドを開示する。当該ペプチドは、抗微生物効果を発揮し、そしてヘパリン及びＬＰＳ中和能力を有する。
【００１３】
WO 01/81578 は、Ｇ−カップリングタンパク質レセプター関連ポリペプチドであって、多数の疾患に使用することができるポリペプチドをコードする多数の配列を開示する。
【００１４】
WO 00/27415 は、血管形成の阻害に適当なペプチドを開示する。当該ペプチドは高分子量のキニノーゲン５の類似体である。ＢＬＡＳＴｐサーチは、異なる種、例えば、このような保存領域の機能、又はこれらが小ペプチドとしていずれの機能も全く有さないキニノーゲン中に類似性を保存し又は有する配列を示す。
【００１５】
現在、セクロピン、デフェンシン、マガイニン、及びカテリシジン（cathelicidins）を含む、７００以上の異なる抗微生物ペプチド配列が知られている(www. bbcm. univ. trieste. it/〜tossi/search. htm)。
【００１６】
今日入手可能な大量の抗微生物ペプチドが存在するが、新たに改善した抗微生物ペプチドの必要性がいまだ増加している。抗微生物ペプチドは、抗生物質及び／又は他の抗微生物剤に対して抵抗性又は耐性がある微生物を駆除するために使用することができる。更に、哺乳類、例えば、ヒトに導入した場合に非アレルギー性である、新規な抗微生物ペプチドが必要である。細菌は、有意な抵抗性の誘導を伴わない進化の間に、内在的に産出された抗微生物ペプチドに遭遇してきた。
【発明の開示】
【００１７】
第一の観点に従い、本発明は、ヘパリン結合活性を有し、ラミニンアイソフォーム、補体因子Ｃ３、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、及びキニノーゲンから成る群から選択される実質的に抗微生物活性を含まない内在性哺乳類ペプチドに由来し、そして１０〜３６のアミノ酸残基を有する抗微生物ペプチドであって、ここで当該抗微生物ペプチドが、Ｋ、Ｒ、及びＨから成る群から選択される少なくとも４つのアミノ酸残基から成る抗微生物ペプチドに関する。
【００１８】
このような抗微生物ペプチドを供することにより、当該ペプチドが内在性タンパク質及び／又はペプチドに由来するという事実により、抗微生物ペプチドに対するアレルギー反応のリスクを低下することができる。より短いペプチドを使用することにより、長いペプチドと比較して当該ペプチドの安定性を向上させることがき、そして製造コストを減少することができ、従って本発明は経済的に有利となりうる。本発明は、本出願の優先日後に公表されたAndersson et al., Eur JBiochem, 2004,271 : 1219-1226により説明されるように、非抗微生物の内在性タンパク質由来のヘパリン結合モチーフを有するペプチドが抗微生物活性を示すことの発見から生じる。多様なタンパク質中のヘパリン結合に必須の構造及びヘパリン結合モチーフの存在は、一般的によく説明されている。当該分子群は、多様なラミニンアイソフォーム、フィブロネクチン、凝固因子、成長因子、ケモカイン、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、キニノーゲン、及び多くの他のものを含む（Andersson et al. , (2004) Eur JBio- chem 271; 271: 1219-26 及びこの関連物を参照のこと）。これらは本質的に抗微生物性ではない。
【００１９】
本発明に従う抗微生物ペプチド及び対応する抗微生物／医薬組成物は、微生物の有効な予防、減少又は除去を促進するペプチドを供する。これにより、抗生物質に対して抵抗性又は耐性である微生物を駆除する能力を向上することができる。更に、商業的に入手可能な抗微生物剤に対してアレルギー性である哺乳類を治療することができる。内在性タンパク質由来の抗微生物／医薬組成物を供することにより、哺乳類がこれらの特異的なペプチドに対してアレルギーを生じる可能性を減少させることができ、又は除去することができる。これは、抗微生物／医薬組成物が哺乳類と接触するいくつかの投与に有用な抗微生物／医薬組成物を、感染を防止するための医薬又は添加剤とする。
【００２０】
更に、短いペプチドの使用は、生物学的利用能を向上させる。更に、グラム陰性及びグラム陽性菌、又は真菌において特異的又は好ましい作用を有する構造的に異なるヘパリン結合抗微生物ペプチドの使用は、多様な微生物の特異的なターゲッティングを可能にし、従って、抵抗性の発生及び生態学的問題を最小化する。すでに哺乳類中に存在するペプチドを補うことにより、新規な抗生物質による追加的な生態学的圧力のリスクは更に減少される。最後に、これらの製剤はまた、内在性抗微生物ペプチドの効果を増強することができる。
【００２１】
二番目の観点に従い、本発明は、上述のような１又は複数の抗微生物ペプチド、及び医薬的に受容可能なバッファー、希釈剤、担体、アジュバント、又は賦形剤を含んで成る抗微生物／医薬組成物に関する。
【００２２】
三番目の観点に従い、本発明は、以下に示すように、抗微生物ペプチド及び／又は抗微生物／医薬組成物の使用に関する。
【００２３】
本発明の抗微生物ペプチドは、制限することなく哺乳類、例えば、ヒトに侵入又は感染するものを含む全ての種類の適用における微生物の予防、減少、又は除去のための選択を助ける、抗微生物剤のリストを増加させる。
【００２４】
発明の詳細な説明
定義
本出願及び発明の文脈において、以下の定義を適用する：
【００２５】
「ヌクレオチド配列」の語は、２又は複数のヌクレオチドの配列を意味することを意図する。当該ヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成若しくは合成起源又はこれらの混合物であってよい。当該語は、ＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖又は二本鎖形態を含む。
【００２６】
「抗微生物ペプチド」の語は、約１０〜約３６のアミノ酸残基を含んで成り、抗微生物及びヘパリン結合活性を有し、そして本質的に抗微生物効果を有さない内在性哺乳類由来であるペプチドを意味することを意図する。「抗微生物ペプチド」は、微生物を予防し、抑制し、減少し、又は駆除する。当該抗微生物活性は、例えば、実施例２、４、又は５における方法により測定することができる。
【００２７】
「ヘパリン結合アフィニティー」の語は、ヘパリンに直接的に又は間接的に結合するペプチドを意味することを意図する。当該ヘパリン結合活性は、例えば、実施例７における方法により測定することができる。ヘパリンに親和性を示す本発明の抗微生物ペプチドはまた、内在性グリコサミノグリカンであるデルマタンの表面と相互作用する。
【００２８】
「両親媒性」の語は、分子のある面が主に帯電し、そして他の面が主に親水性である、α−ヘリックス構造、β−ストランド、直線、円形、又は他の二次構造の面に対する親水性及び疎水性アミノ酸残基の分布を意味することを意図する。ペプチドの両親媒性の程度は、多様なウェブ型アルゴリズムによるアミノ酸残基の配列、例えば、http://us. expasy. org/cgi-bin/protscale. pl.において見つかるものをプロッティングすることによりアッセイすることができる。疎水性残基の分布は、らせん状ホイールダイアグラムにより視覚化することができる。二次構造予測アルゴリズム、例えば、ＧＯＲＩＶは、www. expasy. com.において見つけることができる。
【００２９】
「陽イオン性」の語は、約４〜約１２のｐＨ範囲中で、正味正の帯電を有する分子を意味することを意図する。
【００３０】
「微生物」の語は、いずれかの生きている微生物を意味することを意図する。微生物の例は、細菌、真菌、ウイルス、寄生虫、及び酵母である。
【００３１】
「抗微生物剤」の語は、微生物を予防、抑制、又は駆除するいずれかの薬剤を意味することを意図する。抗微生物剤の例は、The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy (32nd edition, Antimicrobial Therapy, Inc, US)において見つけることができる。
【００３２】
本文脈において、アミノ酸名及び原子名は、ＩＵＰＡＣ命名法（アミノ酸及びペプチドのためのＩＵＰＡＣ命名法）及びシンボル(残基名、原子名等), Eur J Biochem. , 138,9-37 (1984) together with their corrections in Eur J Biochem., 152,1 (1985)に基づき、プロテインデータバンク (PNB) (www. pdb. ors）により定義されるとおり使用される。「アミノ酸」の語はアラニン（Ａｌａ又はＡ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、及びチロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、又はこれらの誘導体から成る群由来のアミノ酸を示すことを意図する。
【００３３】
説明
抗微生物ペプチド
本発明は、ヘパリン結合活性を有し、実質的に抗微生物活性を含まない内在性哺乳類タンパク質に由来し、そして１０〜３６のアミノ酸残基を有する抗微生物ペプチドであって、ここで当該抗微生物ペプチドがＫ、Ｒ、及びＨから成る群から選択される少なくとも４つのアミノ酸残基から成る抗微生物ペプチドに関する。当該２つのアミノ酸残基は隣接していてもよい。
Margalit et al., 1993 JBiol Chem 268, 19228-31により報告されているように、Ｂアミノ酸残基間の〜２０オングストロングの距離は、ペプチドの高次構造に無関係なヘパリン結合の必要条件を構成する。短いペプチドの使用は、長いペプチド又はタンパク質と比較して、例えば、向上した皮膚浸透能を介してより短いペプチドの生物利用能を向上させ、並びに当該製造及び精製コストを減少する。当該抗微生物ペプチドは、今日商業的に入手可能であり、入手可能な抗微生物剤に対して耐性及び／又は抵抗性である微生物を駆除する能力を向上させるこれらの抗微生物ペプチドの補体である。新規な抗微生物ペプチドが内在性の非抗微生物タンパク質に由来することにより、当該ペプチドが基づく哺乳類に対して非アレルギー性の新規なペプチドを同定することが可能である。
【００３４】
更に、ペプチド作用の増加した知見、及び多様な塩及びイオン性環境の依存性は、ペプチドの効果を増強及び制御する特異的な組成物のデザインを可能にする。真菌における作用に切り取られたペプチドは、特異的な疾患、例えば、粘膜における酵母感染のターゲッティングにおいて、これらの部位における細菌生態学に有意に影響することなく、有利となるであろう。抗微生物ペプチドが細菌膜において作用するという事実は、これらが抗生物質と相乗的に作用できることを示唆する。このため、抗生物質とペプチドの組み合わせは治療的な有利性を有することができる。最後にまた、低コストで、かつ微生物の成長を防ぐために必要な異なる種の生成物の使用に非アレルギー性である抗微生物剤の必要性が存在する。
【００３５】
更に、グラム陰性菌及びグラム陽性菌、又は真菌において特異的又は好ましくは作用を有する構造的に異なるヘパリン結合性の短い抗微生物ペプチドの使用は、多様な微生物の特異的なターゲッティングを可能し、従って抵抗性及び生態学的問題を最小化する。生物にすでに生じているペプチドを補うことにより、新規な抗生物質による追加的な生体学的圧力のリスクが更に減少される。ペプチドの効果を増強する特異的な製剤の導入は、更にペプチドの副作用のリスク、例えば、処置部外への抵抗性の導入を最小化する外来性ペプチドを局在化及び増強する。最後に、また、これらの製剤は、内在性抗微生物ペプチドの効果も増強することができる。抗微生物ペプチドがヒト中の微生物を駆除するために使用されるように開発される場合、当該内在性抗微生物ペプチドはヒト内在性タンパク質に由来する。同じものは他の動物、例えば、ウマ、乳牛、ブタ、又は家禽に適用される。抗微生物ペプチドは血漿、血液、結合組織、及び構成細胞に存在するペプチド及び／又は
タンパク質の構造に基づいてよく、そしてヘパリン結合タンパク質；ラミニンアイソフォーム、フォンウィルブランド因子、ビトロネクチン、プロテインＣ阻害因子、フィブロネクチン、凝固因子、成長因子、ケモカイン、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、キニノーゲン、又は補体因子Ｃ３から成る群から選択することができる。
【００３６】
本発明の抗微生物ペプチドは、約１０ｎＭ〜約２０μＭのヘパリンに対する結合アフィニティー（Ｋｄ）を有する。
【００３７】
上記ペプチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６のアミの酸残基のサイズを有する。当該ペプチドの長さ及び配列は、抗微生物ペプチドの起源、及びどのような微生物を駆除するか、ペプチドが微生物を防止、抑制、減少又は駆除するために使用される場合、微生物がどのような環境に存在するか、及び抗微生物ペプチドを投与後に、どのような環境において遭遇するかに基づく。
【００３８】
第一の態様に従い、本発明は、キニノーゲンタンパク質又はヒスチジンリッチ糖タンパク質に基づき、少なくとも２０％のアミン酸残基がＨである抗微生物ペプチドに関する。当該抗微生物ペプチドは３０、４０、又は５０％以上のＨ、Ｒ及び／又はＫアミノ酸残基を含んで成る。具体的な実施例１、２、３、４、５、又は６において、アミノ酸残基はＨである。例えば、当該抗微生物ペプチドは、配列番号１、２、３、及び４から成る群から選択することができる。これらのペプチドは、それぞれ非抗微生物タンパク質であるキニノーゲン及びヒスチジンリッチ糖タンパク質のヘパリン結合ドメインに由来し、Ｈ残基においてリッチである。
【００３９】
他の態様に従い、本発明は、補体因子タンパク質に基づく抗微生物ペプチドに関する。例えば、当該抗微生物ペプチドは、配列番号５、６、及び７から成る群から選択することができる。配列番号５、６、及び７のペプチドは補体因子Ｃ３分子の明確に定義されたらせん状セグメントに由来する。Hugliら(Chazin et al. , (1988) Biochemistry 27,9139-48, Hugli, Current topics in Microbi- ology and Immunology, 1989,153, 181-208) により示されるように、Ｃ３由来のＣ３ａ分子のらせん領域は、セグメント１９〜２８（配列番号５により示される）、及び４７〜７０（配列番号６及び７により示される）により定義される。ホロタンパク質Ｃ３は、抗微生物効果を発揮しない。Ｃ３由来のペプチドセグメントのヘパリン結合及び抗微生物能は、最近開示された(Andersson et al., Eur J Biochem, 2004,271 ; 271: 1219-1226)。
【００４０】
第三の態様に従い、本発明は、ラミニンタンパク質群に由来する抗微生物ペプチドに関する。例えば、当該抗微生物ペプチドは、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６から成る群から選択することができる。ラミニンα−チェーンＬＧ−ドメインは、ヘパリン及び他の細胞表面レセプターの結合部位として同定された(Timpl. , et al., Matrix Biol, 2000,19, 309-317)、５つの（１〜５）ＬＧ−モジュールから構成される。これらのモジュラータンパク質は、開発プロセス、例えば、創傷治癒の間に合成され、ＬＧ−モジュールのタンパク質分解性のプロセッシングがこれらの現象間に発生することが説明されている。先に開示されていないＬＧ−モジュールのヘパリン結合エピトープの抗微生物機能は、最近説明された(Andersson et al., Eur JBiochem, 2004, 271 ; 271: 1219-1226)。
【００４１】
当該ペプチドが内在性タンパク質に由来しても、これらは半合成又は合成ペプチドとして、並びに微生物中で産出することができる。
【００４２】
抗微生物ペプチドは、１又は複数のアミノ酸残基、例えば、１〜１００のアミノ酸残基、５〜５０のアミノ酸残基、又は６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０のアミノ酸残基により伸長することができる。このような追加的アミノ酸は、非抗微生物タンパク質由来の抗微生物ペプチドの配列に近接する配列を複製することができる。追加すべき数は、当該ペプチドの安定性、毒性、治療すべき哺乳類を含む、いずれの微生物が駆除されるか、またはいずれの生成物に当該ペプチドが存在すべきか、そして抗微生物ペプチドが基づくものはいずれのペプチド構造であるかに依存する。当該ペプチドに付加するアミノ酸残基の数はまた、生成物の選択、例えば、発現ベクター及び発現宿主、及び抗微生物／医薬組成物の製造の選択に依存する。当該伸長は、当該ペプチドの抗微生物効果を破壊しない限り、Ｎ−又はＣ−末端部、又は抗微生物ペプチドの両方の部分におけるものでよい。また、当該抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドが他のペプチドと融合される、融合タンパク質でもよい。
【００４３】
更に、上記抗微生物ペプチドは、他の既知の抗微生物ペプチド又は他の物質、例えば、他のペプチド、タンパク質、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、他の有機化合物、又は無機物質と連結することができる。例えば、抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドが微生物を抑制、予防、又は駆除する前に、哺乳類中で分解する抗微生物ペプチドを保護する物質とカップリングしてもよい。
【００４４】
従って、上記抗微生物ペプチドは、アミド化又はエステル化によりＣ−末端部において、及びアシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、アルキル化等によりＮ−末端部において修飾されてもよい。
【００４５】
あるいは、非抗微生物性ホロタンパク質の機能的抗微生物セグメントに由来するペプチドは、１〜６のアミノ酸の置換により修飾することができる。
【００４６】
抗微生物ペプチドにより抑制、予防、又は駆除される微生物の例は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方の細菌、例えば、腸球菌（Enterococcus faecalis）、大腸菌（Eschericia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ミラビリス変形菌（Proteus mirabilis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、ウイルス、寄生虫、真菌、並びに酵母、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）である。
【００４７】
上記抗微生物ペプチドは、天然源、例えば、ヒト細胞、ｃＤＮＡ、ゲノムクローンから得ることがき、化学合成、又は細胞源由来の発現生成物として組換えＤＮＡ技術により得ることができる。
【００４８】
上記抗微生物ペプチドは、自動化方法による合成を含む、標準的な化学法により合成することができる。一般的に、類似体は、カップリング剤として、ＨＡＴＵ（Ｎ−［ジメチルアミノ−１Ｈ−１．２．３．−トリアゾロ［４，５−Ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファテン−オキシド）、又は他のカップリング剤、例えば、ＨＯＡｔ−１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールを伴う標準的な固相Ｆｍｏｃ保護法に基づき合成される。当該ペプチドは、適当なスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸で固相樹脂から切断される、また、それは側鎖官能基を脱保護する。更に、粗ペプチドは調製用逆相クロマトグラフィーを使用して精製される。他の精製方法、例えば、分配クロマトグラフィー、ゲルろ過、ゲル電気泳動、又はイオン交換クロマトグラフィーも使用できる。当業界において既知な他の合成技術、例えば、ｔＢｏｃ保護法、又は異なるカップリング試薬等の使用が相当するペプチドを産出するために利用することができる。
【００４９】
あるいは、ペプチドは組換え生成により合成することができる（例えば、米国特許第5,593, 866号を参照のこと）。宿主系の変種は、ペプチド類似体の産出に適当であり、細菌、例えば、大腸菌（E.coli)、酵母、例えば、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）又はピチア（pichia）、昆虫、例えば、Ｓｆ９、及び哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ又はＣＯＳ−７を含む。各宿主に使用することができる多くの発現ベクターが存在し、当該ベクター及び宿主が、抗微生物ペプチドを産出することができる限り、本発明はこれらのいずれかに制限されない。大腸菌（E.coli)におけるクローニング及び発現ベクターのためのベクター及び方法は、例えば、Sambrookら(Molecu- lar Cloning.: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1987) 及びAusubelら(Current Protocols in Molecular Bi- ology, Greene Publishing Co. , 1995)において見つけることができる。
【００５０】
最後に、上記ペプチドは、血漿、血液、多様な組織等から精製することができる。当該ペプチドは内在性であってよく、又は精製タンパク質の酵素的若しくは化学的分解後に産出することができる。例えば、ヘパリン結合タンパク質は、トリプシンにより消化することができ、そして大規模において更に単離された抗微生物ペプチドを生じる。
【００５１】
抗微生物ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、宿主に適した適当な発現ベクターに導入される。好ましい態様において、当該遺伝子は、融合タンパク質を作製するためにクローン化される。当該ペプチド配列の単離を促進するために、化学的切断（例えば、ＣＮＢｒ）、又は酵素的切断（例えば、Ｖ８プロテアーゼ、トリプシン）に感受性のアミノ酸が、当該ペプチドと融合パートナーを架橋するように使用される。大腸菌（E.coli)中での発現のために、融合パートナーは、好ましくは、発現を身体形成に誘導する細胞内タンパク質に中で正常である。かかる場合、最終生成物を放出するための後の切断において、当該タンパク質の再生の必要性はない。本発明において、融合パートナー及びペプチド遺伝子を含んで成るＤＮＡカセットは、発現ベクター中に挿入することができる。好ましくは、当該発現ベクターは、宿主に挿入されたＤＮＡ配列の有効な転写を促進するための誘導又は構成プロモーターを含むプラスミドである。
【００５２】
上記発現ベクターは、慣習的な形質転換技術、例えば、カルシウム媒介技術、電気穿孔法、又は当業者に周知な他の方法により、宿主に導入することができる。抗微生物ペプチドをコードする配列は、天然源、例えば、哺乳類細胞、現存ｃＤＮＡ、又はゲノムクローンに由来することができ、あるいは合成することができる。使用することができる１つの方法は、抗微生物ＤＮＡ鋳型の５’及び３’末端に由来する増幅プライマーを使用するＰＣＲの助けによる抗微生物ペプチドの増幅であり、そして典型的にはベクターのクローニング部位に関して選択された制限部位に組み込みこむ。必要ならば、転写開始及び終止コドンをプライマー配列中に設計することができる。当該抗微生物ペプチドをコードする配列は、コドンの選択が、治療すべき最終的な哺乳類に関して作製される限り、特異的な宿主中での発現を促進するために最適化されたコドンであってよい。従って、例えば、抗微生物ペプチドが細菌中で発現される場合、当該コドンは細菌に最適化される。
【００５３】
上記発現ベクターは、導入された抗微生物ペプチドの発現を促進するためのプロモーター配列を含むべきである。必要であれば、制御配列も含むことができる。例えば、１又は複数のエンハンサー、リボソーム結合部位、転写終了シグナル配列、分泌シグナル配列、複製の開始点、選択マーカー等である。当該制御配列は、転写、及び続く翻訳を許容するように互いに接合することができる。抗微生物ペプチドが細菌中で発現される場合、当該制御配列は、細菌中で使用するために設計され、且つ当業者に周知なものである。適当なプロモーター、例えば、構成及び誘導プロモーターは広く利用することができ、そしてＴ５、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６ファージ由来のプロモーター、及びｔｒｐ、ｌｐｐ、及びｌａｃオペロンを含む。
【００５４】
抗微生物ペプチドを含むベクターが細菌中で発現される場合、開始点の例は、高コピー数を生じるもの、又は低コピーを生じるもの、例えば、ｆｌ−複製起点、及びｃｏｌ Ｅｌ複製起点のいずれかである。
【００５５】
好ましくは、プラスミドは、形質転換細胞を同定、及び／又は選択的に成長させることを許容する、宿主中で機能的な少なくとも１つの選択マーカーを含む。細菌宿主に適当な選択マーカー遺伝子は、アンピリシン耐性遺伝子、クロロアンフェニコール耐性遺伝子、テトラシクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、及び当業界において既知な他のものを含む。
【００５６】
細菌中での発現のためのプラスミドの例は、ｐＥＴ発現ベクターである、ｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ１１ａ、ｐＥＴ１２ａ−ｃ、及びｐＥＴ１５ｂを含む(Novagen, Madi- son, Wis. から入手可能)。低コピー数のベクター（例えば、ｐＰＤ１００）は、大腸菌（E.coli)宿主に有害なペプチドの有用な過剰産出のために使用することができる(Dersch et al. , FEMS Micro- biol. Lett. 123: 19,1994）。
【００５７】
適当な宿主の例は、細菌、酵母、昆虫、哺乳類細胞である。しかしながら、多くの場合いずれかの細菌、例えば、大腸菌（E.coli)が使用される。
【００５８】
発現された抗微生物ペプチドは、慣習的な単離技術、例えば、アフィニティー、サイズ除外、又はイオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣにより単離される。異なる精製技術は、A Biologist's Guide to Principles and Techniques of Practical Biochemistry (eds. Wilson and Golding, Edward Arnold, London, 又はCurrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc)において見つけることができる。
【００５９】
抗微生物／医薬組成物
更に、本発明は、前述の抗微生物ペプチド及び医薬的に受容可能なバッファー、希釈剤、担体、アジュバント、又は賦形剤を含んで成る抗微生物／医薬組成物に関する。追加的な化合物を当該組成物中に含んでもよい。これらは、例えば、キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ又はグルタチオンを含む。当該抗微生物／医薬組成物は、十分に保存安定性で、且つヒト及び動物に対する投与に適当である、当業界に既知の方法において調製することができる。当該医薬組成物は、例えば、フリーズドライング、スプレードライイング、又はスプレークーリングを介して凍結乾燥されていてもよい。
【００６０】
「医薬的に受容可能」は、活性成分、すなわち抗微生物ペプチドの生物活性の有効性を干渉しない無毒性物質を意味する。このような医薬的に受容可能なバッファー、担体、又は賦形剤は、当業界において既知である（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R Gennaro, Ed. , Mack Publishing Company (1990) 及びPharmaceutical Excipientsのハンドブック, 3rd edition, A. Kibbe, Ed. , Pharmaceutical Press (2000)を参照のこと）。
【００６１】
「バッファー」の語は、ｐＨを安定させる目的を有する酸−塩基混合物を含有する水溶液を意味することを意図する。バッファーの例は、トリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス（Ｔｒｉｓ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、トリシンである。
【００６２】
「希釈剤」の語は、医薬調製物においてペプチドを希釈する目的を有する水性又は非水性溶液を意味することを意図する。当該希釈剤は１又は複数の生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、又は油（例えば、ベニバナ油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、又はゴマ油）であってよい。
【００６３】
『アジュバント」の語は、上記ペプチドの生物学的効果を向上させるために当該製剤に添加されるいずれかの化合物を意味することを意図する。当該アジュバントは、１又は複数の異なるアニオンを伴う亜鉛、銅、又は銀塩、例えば、制限することなく異なるアシル組成物のフッ化物、塩素化物、臭化物、ヨウ素化物、チオシアネート、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、及び酢酸塩であってよい。
【００６４】
上記賦形剤は、１又は複数の炭水化物、ポリマー、脂質、及びミネラルであってよい。炭水化物の例は、例えば、凍結乾燥を促進するために組成物に添加されるラクトース、スクロース、マンニトール、及びシクロデキストリンを含む。ポリマーの例は、例えば、粘度調製のため、生物接着を達成するため、又は化学的及びタンパク質分解性の分解由来の脂質を保護するために組成物に添加される、全ての異なる分子量のスターチ、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、カラゲナン、ヒアルロン酸、ポリアクリル酸、ポリスルホネート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、異なる加水分解度のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、及びポリビニルピロリドンである。脂質の例は、ポリマーに似た理由により組成物に添加される、全ての異なるアシル鎖の長さ及び飽和度の脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−、及びトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質、及び糖脂質、卵レシチン、大豆レシチン、水素化卵及び大豆レシチンである。ミネラルの例は、利点、例えば、液体の蓄積の減少、又は有利な色素特性を得るために組成物に添加されるタルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、及び酸化チタンである。
【００６５】
担体の特徴は、投与経路に依存する。１つの投与経路は、局所的投与である。例えば、局所的投与のために好ましい担体は、活性ペプチドを含んで成る乳化クリームであるが、他の一般的な担体、例えば、一定のワセリン／ミネラル型及び植物型軟膏剤、並びに、ポリマーゲル、液晶フェーズ及び微小乳剤もまた使用することができる。
【００６６】
抗微生物／医薬組成物は、抗微生物／医薬組成物中に１又は複数の、例えば、１、２、３、又は４の異なるペプチドを含んで成ってよい。異なるペプチドの組み合わせを使用することにより、抗微生物効果を向上させ、並びに駆除すべき微生物が抗微生物剤に対して抵抗性及び／又は耐性であるという能力を低下させることができる。
【００６７】
特に短いペプチドとして、ヒスチジンリッチ及び／又はキニノーゲン型ペプチドは制限された抗微生物活性を有する。しかしながら、これらのペプチドが塩及び／又は約５．０〜７．０のｐＨを含んで成る組成物中に存在する場合、当該ペプチドは活性である。すなわち塩の添加及び／又は特定のｐＨ範囲の選択により増強された効果が得られる。
【００６８】
塩としてのペプチドは、無機酸、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、リン酸、過塩素酸、チオシアン酸、ホウ酸等、又は有機酸、例えば、ギ酸、酒石酸、コハク酸、グルコンさん、乳酸、マロン酸、フマル酸、アントラニル酸、安息香酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸等を伴う酸付加物であってよい。無機塩は、例えば、全て対応するアニオンを伴う一価のナトリウム、カリウム、又は二価の亜鉛、マグネシウム、銅、カルシウムは、抗微生物組成物の生物活性を改善するために加えることができる。キニノーゲン基づく抗微生物的なＨ−リッチペプチド、及びヒスチジン−リッチ糖タンパク質は、加えた抗微生物ペプチドの効果を増強するために、制限された溶液、例えば、ｐＨが規定され及び調整された（例えば、ｐＨ５．５〜６．０）ゲルにおいて使用することができる。例えば、約５．０〜約７．０、例えば、イオン性の環境を伴う又は伴わない約５．５〜６．０に規定されたｐＨを伴うゲル、軟膏、又は絆創膏は、抗微生物ペプチドの機能を増強し、制御し、そして局在化するであろう。
【００６９】
本発明の抗微生物／医薬組成物はまた、ミセル、不溶性単層、及び液晶として凝集形態において存在する上記ペプチド、更に他の医薬的に受容可能な担体と両親媒性薬剤、例えば、脂質と組み合わされたリポソームの形態であってよい。リポソーム製剤のために安定な脂質は、制限することなく、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等を含む。このようなリポソーム製剤の調製は、例えば、米国出願第4, 235, 871号において見つけることができる。
【００７０】
また、本発明の抗微生物／医薬組成物は、生分解性微粒子形態であってよい。脂肪性ポリエステル、例えば、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡのコポリマー（ＰＬＧＡ）、又はポリ（カルプロラクトン）（ＰＣＬ）、及びポリ無水物は、微粒子の生成物における生分解性ポリマーとして広く使用されてきた。このような微粒子の調製物は、米国出願第5,851, 451号 及びEP 0213303 において見つけることができる。
【００７１】
あるいは、上記抗微生物ペプチドは、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、又は油（例えば、ベニバナ油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、又はゴマ油）、トラガカントゴム、及び／又は多様なバッファー中に溶かしてもよい。また、上記医薬組成物は、抗微生物ペプチドの作用の増強のために、イオン及び規定されたｐＨを含んでもよい。
【００７２】
抗微生物／医薬組成物は、慣習的な医薬的操作、例えば、無菌化に供することができ、及び／又は慣習的なアジュバント、例えば、本明細書のいずれかに記載の防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、バッファー、賦形剤等を含んでよい。
【００７３】
本発明に従う抗微生物／医薬組成物は、局所的に又は全身的に投与することができる。投与経路は、局所、眼球、経鼻、肺、頬側、非経口（静脈内、皮下、及び筋肉内）、経口、非経口、膣、及び直腸を含む。またインプラントからの投与も可能である。適当な抗微生物調製形態は、例えば、顆粒、粉末、タブレット、コーティングタブレット、（微小）カプセル、座薬、シロップ、乳化剤、微小乳化剤、水、油、及び界面活性剤、長い範囲のオーダーであるが短い範囲のディスオーダーにより特徴づけられる任意的な等方性の熱力学的に安定な系として定義される液晶相（例は、水−又は油持続性である層状、六方形及び立方相を含む）、又は分散対応物、ゲル、軟膏、懸濁液、クリーム、エアロゾル、液滴、又はアンプル形態における注射用溶液、及び活性化合物の徐放を伴う調製物であり、これらの調製賦形剤、希釈剤、アジュバント、又は担体は一般的に上述のとおり使用される。
【００７４】
上記医薬組成物は、医薬的に有効な用量において投与されるであろう。「医薬的に有効な容量」は、投与される状態に関する所望される効果を生じるのに十分な用量を意味する。正確な用量は、化合物の活性、投与方法、疾患の性質及び重篤度、患者の年齢及び体重に依存し、異なる用量が必要とされる。当該用量の投与は、個々の用量単位の形態、又はいくつかのより少量単位において単回投与により、及び一定の間隔で細分した用量の複数回投与により行うことができる。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、単独で、又は他の治療剤、例えば、抗生物質又は消毒薬、例えば、抗細菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、及び抗寄生虫剤との組み合わせにおいて投与することができる。例は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、糖ペプチド、キノロン、テトラシクリン、マクロライド、及びフルオロキノロンである。消毒薬は、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド、及び他のビグアナイド、キトサン、酢酸、大過酸化水素である。これらの薬剤は、同医薬組成物の一部として組み込むことができ、又は別々に投与することもできる。
【００７６】
本発明は、ヒト及び他の動物、例えば、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ラクダ等に関する。従って、当該方法は、ヒトの治療及び獣医学的適用の両方に適用することができる。このような治療に適当な対象は、明確な感染の証拠、例えば、熱、脈動、生物の培養等により確認することができる。抗微生物ペプチドで治療できる感染は、微生物により、又は微生物が原因で生じるものを含む。微生物の例は、細菌（例えば、グラム陽性、グラム陰性）、真菌（例えば、酵母及びカビ）、寄生虫（例えば、原虫、線虫、条虫、及び吸虫）、ウイルス、及びプリオンを含む。これらの種類の具体的な生物は周知である（例えば、Davis et al., Microbiology, 3. sup. rd edition, Harper & Row, 1980を参照のこと)。感染は、制限することなく、慢性皮膚潰瘍、感染型急性創傷、及び火傷、感染型湿疹、膿痂疹、アトピー性皮膚炎、アクネ、外耳炎、膣感染、脂漏性皮膚炎、経口感染、及び歯周炎、カンジダ間擦疹、結膜炎及び他の眼球感染、及び肺炎を含む。
【００７７】
従って、上記抗微生物／医薬組成物は、火傷、手術後及び皮膚外傷後の予防的な治療のために使用することができる。当該医薬組成物はまた、人体と接触する外部物質、例えば、コンタクトレンズ、整形インプラント、及びカテーテルの保存及び処置を意図する溶液中に含まれてよい。
【００７８】
更に、抗微生物／医薬組成物は、アトピー性皮膚炎、膿痂疹、慢性皮膚潰瘍、感染型急性創傷、及び火傷、アクネ、外耳炎、真菌感染、肺炎、脂漏性皮膚炎、カンジダ間擦疹、口咽頭カンジダ症、眼球感染（細菌性結膜炎）、及び経鼻感染（ＭＲＳＡ輸送を含む）のために使用できる。
【００７９】
抗微生物／医薬組成物はまた、洗浄溶液、例えば、レンズ消毒液、及び保存溶液として使用することができ、又は泌尿器カテーテルの使用若しくは中心静脈カテーテルの使用に関して細菌感染を防ぐために使用することができる。
【００８０】
更に、抗微生物組成物は、プラスター、接着剤、縫合における手術後の感染を防止するために使用することができ、あるいは包帯剤に組み入れることができる。
【００８１】
また、抗微生物ペプチドは、抗微生物表面を作るためにポリマー、織物等において使用することができ、又は化粧品及びパーソナルケア用品（石鹸、シャンプー、歯磨き粉、抗にきび薬、日焼けクリーム、タンポン、オムツ等）は、抗微生物／医薬組成物で補足することができる。
【００８２】
抗微生物性ヒトペプチド及び／又はタンパク質を同定するための方法
また、本発明は、哺乳類、例えば、ヒトに低アレルギー性を有し、且つ哺乳類に侵入する微生物に対して有効な抗微生物ペプチドの新規なセットを供することを可能にする、１又は複数の新規な抗微生物ペプチドを同定するための方法に関する。このような方法により、市場において入手可能な抗微生物剤に対して今日一般的な抵抗性及び／又は耐性の問題を低下、又は除去する抗微生物剤の大きな収集を供する新規な改良された抗微生物ペプチドが利用できるであろう。
【００８３】
内在性ペプチド及び／又はタンパク質を供する工程、ヘパリンを供する工程、ペプチド及び／又はタンパク質ヘパリン複合体を作製する内在性ペプチド及び／又はタンパク質とヘパリンを混合する工程、当該ペプチド及び／又はタンパク質ヘパリン複合体を検出する工程、及び抗微生物性ヒト内在性ペプチド及び／又はタンパク質を同定する工程を含んで成る方法。更に、ニッケル、例えば、ニッケルセファロースをヘパリンの代わりに使用することもできる。ヘパリンは溶液中に存在することができ、又はマトリックスと結合することができる。後者の場合、これは、分離目的（ｈ．ｐ．ｌ．ｃ又はｆ．ｐ．ｌ．ｃ）又はバイオコア分析に適当である。ヘパリン−セファロース、又は類似した媒体を使用することもできる。また、抗微生物ペプチドは、他のグリコサミノグリカンとも相互作用するため、新規な抗微生物ペプチドの精製のためにこれらの分子、例えば、デルマタン、又はヘパランスルフェートを使用することが可能である。ヘパリン、ヘパランスルフェート、及びデルマタンスルフェートは、分散型で、空間的に限定されたスルホ−又はカルボキシル基を含む。原則として、これらのグリコサミノグリカンのような類似した相互作用能のいずれかの他の重合体化合物は、抗微生物ペプチドの特異的な結合のために使用することができる。更に、Ｈ−リッチペプチドは、ニッケル−セファロース、又は類似した媒体において、単独又はヘパリン−クロマトグラフィーと組み合わせて精製することができる。
【００８４】
以下の実施例は、明示的に又は暗黙的に、制限することなくいずれかの方法、形状、又は形態本発明を説明することを意図する。
【実施例】
【００８５】
微生物
慢性静脈潰瘍から最初に得られた腸球菌（Enterococcus faecalis）２３７４、大腸菌（Escherichia coli）３７．４、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）２７．４、及びアトピー性皮膚炎を有する患者から得られた真菌類であるカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）ＢＭ４４３５を、実験に使用した。
【００８６】
実施例１
抗微生物ペプチド
配列表及び以下の表１に示された抗微生物ペプチドは、Innovagen AB, Ideon, SE-22370, Lund, Swedenにより合成された。これらのペプチドの純度及び分子量は、マススペクトル分析(MALDI. TOF Voyager)により確認した。
【００８７】
【表１】
【００８８】
【表２】
【００８９】
実施例２
アルギニン及びリジンリッチペプチドの抗微生物効果
図１は、腸球菌（Enterococcus faecalis）におけるアルギニン及びリジン−リッチペプチド（配列表）の抗細菌効果を示す。細菌はトッド−ヒューイット（ＴＨ）培地において、中対数期（mid-logarithmic phase）まで成長させた。細菌を洗浄し、そして５ｍＭのグルコースを含む１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４で洗浄した。細菌（５０μｌ；２×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）を、０．０３〜６０μＭの上昇濃度の合成ペプチドとともに３７℃で２時間インキュベートした。殺菌活性を定量するために、インキュベート混合物の連続希釈を、ＴＨ寒天に置き、続いて３７℃で一昼夜インキュベートし、そしてコロニー形成ユニットの数を測定した。２×１０6のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）×ｍｌ-1の腸球菌（E. faecalis)（単離２３７４）を、約０．０３〜６０μＭの範囲の濃度におけるペプチドとともに５０μｌでインキュベートした。（Ａ）ラミニン由来の合成ペプチド。α５鎖（ＰＰＰ２５：配列番号：１３，ＬＧＴ２５：配列番号：１２，ＲＬＲ２２：配列番号：１４，ＰＧＲ１１：配列番号：１５）、及びα１鎖（ＳＲＮ１６：配列番号：８，ＳＲＮ２９：配列番号：９，ＫＤＦ１５：配列番号：１０，ＳＡＶ１５：配列番号：１１）のＬＧ−ドメイン由来のペプチドの効果を示す。１つのペプチド（ＲＩＱ１８：配列番号：１６）はβ１鎖に由来している。（Ｂ）３つのペプチドは補体因子Ｃ３（ＬＲＫ２６：配列番号：５，ＬＧＥ２７：配列番号：６、及びＣＮＹ２１：配列番号：７）に由来し、ＡＫＫ１５はビトロネクチン、ＳＥＫ２０：配列番号：１９はプロテインＣ阻害因子、ＱＰＰ１８：配列番号：１７はフィブロネクチン、及びＹＩＧ２３：配列番号：１８はウィルブランド因子に由来する。（Ｃ）ヘパリン結合コンセンサス配列（ＡＫＫＡＲＡ）n（ｎ＝１〜４）、及び（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）n（ｎ＝１〜３）の抗微生物効果。ｎ＝１のペプチドは抗微生物効果を発揮しなかった。ヘパリンと相互作用しないペプチド；ＧＨＲＰＬＤＫＫＲＥＥＡＰＳＬＲＰＡ、ＬＶＴＳＫＧＤＫＥＬＲＴＧＫＥＫＶＴＳ、及びＫＮＮＱＫＳＥＰＬＩＧＲＫＫＴ(Andersson et al. , Eur J Biochem, 2004,271 ; 271: 1219-1226)は、抗微生物性ではなかった。
【００９０】
実施例３
抗微生物ペプチドの放射拡散アッセイ分析（表２）
放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）は、先に説明されるとおり(Andersson et al., Eur JBiochem, 2004,271 : 1219-1226)、基本的に行った。端的には、細菌（大腸菌（E.coli)）又は真菌（カンジダ・アルビカンス（C. albicans）を、１０ｍｌの全強（３％ｗ／ｖ）のトリプチケース・ソイ・ブロス（ＴＳＢ）(Becton-Dickinson, Cockeysville, MD)中で中対数期（mid-logarithmic phase）まで成長させた。当該微生物を１０ｍｌのトリス、ｐＨ７．４で１回洗浄した。４×１０6ｃｆｕの細菌、又は１×１０５ｃｆｕの真菌を、０．０３％（ｗ／ｖ）ＴＢＳ、１％（ｗ／ｖ）低−電気浸透型（Ｌｏｗ−ＥＥＯ）アガロース(Sigma, St Louise MO)、及び最終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）トゥイーン２０(Sigma）を含む５ｍｌの下層アガロースゲルに添加した。当該下層は、Φ８５ｍｍのペトリ皿に流した。アガロースを凝固させた後、４ｍｍの直径のウェルをあけ、そして６μｌの試験試料を各ウェルに添加した。当該プレートは３７℃で３時間インキュベートし、ペプチドを拡散させた。それから下層ゲルを５ｍｌの溶融オーバレイ（ｄＨ2Ｏ中の６％ＴＳＢ、及び１％Ｌｏｗ−ＥＥＯアガロース）で覆った。ペプチドの抗微生物活性を、１８〜２４時間の３７℃でのインキュベート後に、各ウェルの周りのクリアーゾーンにより視覚化した。既知のペプチドＬＬ−３７と比較した抗微生物効果を測定するために、１００μＭの濃度において合成ペプチドを試験した。実験間の変動を最小とするために、ＬＬ−３７スタンダード（１００μＭ）を各プレートに入れた。当該ペプチドの活性は、放射拡散単位において示された（ミリメーターにおけるクリアーゾーンの直径−ウェルの直径）×１０）。当該結果は以下の表２に示す。
【００９１】
【表３】
【００９２】
実施例４
大腸菌（E.coli)及びカンジダ・アルビカンス（C. albicans）に対するペプチドの放射拡散アッセイ（図２）
図２は、抗微生物ペプチドのセットを使用する放射拡散アッセイを示す。当該アッセイは上述のように行った。ペプチドの抗微生物効果は、腸球菌（E. faecalis）は３７℃で、及びカンジダ・アルビカンス（C. albicans）は２５℃で１８〜２４時間のインキュベート後に、各ウェルの周りのクリアーゾーンとして視覚化した（パネルＢ）。
【００９３】
実施例５
ヒスチジン−リッチペプチドの抗微生物効果
図３は、ヒスチジン−リッチペプチドの抗微生物ペプチドの抗微生物効果を示す。腸球菌（E. faecalis）細菌を、トッド−ヒューイット（ＴＨ）培地において、中対数期（mid-logarithmic phase）まで成長させた。細菌を洗浄し、そして５０μＭのＺｎＣｌを伴う又は伴わない５ｍＭのグルコースを含む１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、又は１０ｍＭのＭＥＳ−バッファー、５ｍＭのグルコース、ｐＨ５．５で希釈した。細菌（５０μｌ；２×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）を、０．０３〜６０μＭ（亜鉛を伴う又は伴わないトリスバッファー）、又は３０及び６０μＭ（トリス及びＭＥＳバッファー）の範囲の合成ペプチドとともに３７℃で２時間インキュベートした。殺菌活性を定量するために、インキュベート混合物の連続希釈を、ＴＨ寒天に置き、続いて３７℃で一昼夜インキュベートし、そしてコロニー形成ユニットの数を測定した。（Ａ）：５０μＭのＺｎＣｌの存在、又は不存在中におけるヒスチジン−リッチ糖タンパク質（ＧＨＨ２０：配列番号４）及びキニノーゲン（ＫＨＮ２０：配列番号３，ＧＧＨ２０：配列番号２、及びＨＫＨ２０：配列番号１）のヘパリン結合ドメイン由来のペプチドの効果を示す。（Ｂ）：５ｍＭのグルコースを含む１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、又は１０ｍＭのＭＥＳ−バッファー、５ｍＭのグルコース、ｐＨ５．５中のペプチド（３０及び６０μＭ）の効果。数字は１００％をコントロール（ペプチド無し）とした場合の％生存率を示す。（Ｃ）：固定ペプチド／亜鉛モル比（１：１００）の存在下における腸球菌（E. faecalis）におけるペプチド、ＡＨＨ２４：１、及びＡＨＨ２４：２の効果。亜鉛を伴わないペプチドは抗微生物効果を発揮しなかった。
【００９４】
実施例６
ペプチド効果の電子顕微鏡観察による分析
図４は、抗微生物ペプチドに供した緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）細菌の電子顕微鏡観察分析を示す。（Ａ）コントロール。（Ｂ〜Ｈ）〜５０％の所望された抗微生物濃度におけるペプチドで処理した細菌の分析。また、ＮＫＨ２０は２００％において分析した。（Ｂ）ＬＬ−３７、（Ｃ）ＡＲＫ２４、（Ｄ）ＳＥＫ２０、（Ｅ）ＡＫＫ２４、（Ｆ）ＬＧＴ２５（Ｇ）ＨＫＨ２０、（Ｈ）２００％の抗微生物濃度におけるＨＫＨ２０。バーはＧ及びＨ（０．５μｍ）を除き１μｍを示す。ペプチドで処理した細菌の電子顕微鏡観察分析は、コントロールで処置された細菌の形態と比較して顕著な相違を示した。カテリシジンＬＬ−３７は局所的な摂動を生じさせ、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の細胞膜を破壊し、しばしば細胞内物質が細胞外で発見され、そして明細書に開示した内在性抗微生物ペプチドで類似した発見が得られた。
【００９５】
実施例７
内在性抗微生物ペプチドのヘパリン結合（図５）
ペプチドはヘパリン結合活性のために試験された。ペプチドは、ニトロセルロース膜(Hybond, Amersham Biosciences)に適用された。膜は１時間ブロックされ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．２５％トゥイーン２０、３％ウシ血清アルブミン）、放射標識されたヘパリンとともに同じバッファー中で１時間インキュベートした。ヒスチジン−リッチペプチドは、５０μＭのＺｎＣｌの存在下又は不存在下におけるヘパリン結合のために試験した。ヘパリンの放射ヨウ素標識は、先に説明されたように行った(Anders- son et al., Eur JBioche7n, 2004, 271 ; 271: 1219-1226)。標識していないポリサッカライド（２ｍｇ／ｍｌ）を結合の比較のために添加した。当該膜を洗浄した（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．２５％トゥイーン２０中で３×１０分）。バス２００ラジオイメージングシステム(Fuji)を放射活性の視覚化のために使用した。標識されていないヘパリン（６ｍｇ／ｍｌ）は125Ｉ−ヘパリンのＣ３由来ペプチドＬＲＫ２６及びＬＧＥ２７及びＬＬ−３７（上部）に対する結合を阻害した。
【００９６】
実施例８
ニッケル−セファロースにおけるヒスチジン含有抗微生物フラグメントの精製（図６）
ペプチドエピトープであるＫＨＮ２０、ＧＧＨ２０、及びＨＩＬＥ２０を含むヒトキニノーゲンのドメインＤ５は、大腸菌（Escherichia coli）株中で発現された。タンパク質生成物は、１ｍＭのイソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドを指数関数的に増殖している細菌に添加することにより誘導された。３時間のインキュベート後、当該細菌を遠心分離により回収した。当該ペレットを、５０ｍＭのリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０（バッファーＡ）に再懸濁し、そして細菌を冷凍−解凍の反復サイクルにより溶解した。それから当該溶菌液を２９０００ｇで３０分間遠心分離した。当該懸濁液を、ニッケルを充填した２ｍｌのＮｉＮＴＡ−セファロースと混合し、そしてバッファーＡで平衡化した。当該セファロースをカラムに充填し、そして０．１％トリトンＸ−１００を伴う１０ｍｌのバッファーＡ、１０ｍｌのバッファーＡ、１ＭのＮａＣｌを伴う５ｍｌのバッファー、５ｍｌのバッファーＡ、１０ｍｌの２０％エタノール、５ｍＭのイミダゾールを伴う１０ｍｌのバッファーＡ、及び３０ｍＭのイミダゾールを伴うバッファーＡで洗浄した。タンパク質（矢印）は５００ｍＭのイミダゾール中に溶出した。当該ドメインは、放射拡散アッセイにおいて大腸菌（Escherichia coli）に対する抗微生物効果を発揮した。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】Ａ〜Ｃは、腸球菌（Enterococcus faecalis）におけるペプチドの抗微生物効果を示すダイアグラムである。
【図２】Ａ〜Ｂは、高活性ペプチドのセットを使用する放射拡散アッセイを示すペトリ皿である。
【図３】Ａ〜Ｃは、ヒスチジン−リッチペプチドの抗微生物効果を示すダイアグラム及び表である。
【図４】Ａ〜Ｈは、抗微生物ペプチドに供した緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の分析を示す、電子顕微鏡写真である。
【図５】Ａ〜Ｃは、補体Ｃ３、ヒスチジン−リッチ糖タンパク質、及びキニノーゲンに由来するペプチドのヘパリン結合活性を示す写真である。
【図６】図６は、ニッケル−セファロースにおけるヒスチジン含有抗微生物フラグメントの精製を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパリン結合活性を有し、ラミニンアイソフォーム、補体因子Ｃ３、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、及びキニノーゲンから成る群から選択される実質的に抗微生物活性を含まない内在性哺乳類タンパク質に由来し、そして１０〜３６のアミノ酸残基を有する抗微生物ペプチドであって、ここで当該抗微生物ペプチドが、Ｋ、Ｒ、及びＨから成る群から選択される少なくとも４つのアミノ酸残基から成る抗微生物ペプチドに関する。また、本発明は、上記抗微生物ペプチドを含んで成る医薬組成物、並びに当該抗微生物ペプチド及び／又は抗微生物／医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの感染は、哺乳類、例えば、ヒトの免疫系によりうまく駆除されている。しかしながら、いくらかの感染においては、細菌、真菌、又はウイルスが必ずしも駆除されるわけでははく、それは局在化又は一般化した急性の感染の原因となりうる。これは、出生時、火傷、又は集中治療室、及び免疫無防備状態の個体において深刻な問題である。他のケースにおいて、上皮表面における連続的な細菌残留は、慢性的疾患の原因又は悪化となり得る。ヒトにおいて、これは、慢性皮膚潰瘍、アトピー性皮膚炎、及び他の種類の湿疹、アクネ、又は尿生殖器感染といった例が挙げられる。
【０００３】
症候性感染は多様な医薬により治療することができる。また、いくつかの疾患は、例えば、ワクチンにより駆除することができる。しかしながら、ワクチンは常に最良の治療選択ではなく、そして、一定の微生物に対しては利用できるワクチンが存在しない。しばしば当該治療は、抗生物質の使用により行われ、これは当該微生物を殺す。しかしながら、近年、いくらかの微生物が抗生物質に対して抵抗性となってきている。おそらく抵抗性の問題は近い将来増加するであろう。更に、いくつかの個体は、抗生物質に対してアレルギーを発生し、このため一定の抗生物質を有効的に使用する可能性が減少している。
【０００４】
多様な生物の上皮表面は、連続的に細菌に暴露されている。近年、抗細菌ペプチドに基づく自然免疫系が、感染に対して感受性の高い生物学的境界において細菌の初期クリアランスに重要な役割を果たしてきている(Lehrer, R. I. , and Ganz, T. (1999) Curr Opin Immunol 11 : 23-27, Boman, H. G. (2000) Immunol. Rev. 173, 5-16)。抗微生物ペプチドは、細菌の膜に浸透することにより細菌を殺し、従って特異的な分子の標的微生物の欠如は抵抗性の発生を最小化する。
【０００５】
本明細書に記載されているものとは無関係のいくつかの抗微生物ペプチド及びタンパク質は、当業界において既知である。
【０００６】
米国出願第6,503, 881号は、抗微生物ペプチドとして使用されるインドリシジン類事態である陽イオン性ペプチドを開示する。当該陽イオン性ペプチドは、動物及び植物を含む異なる種に由来する。
【０００７】
米国出願第5,912, 230号は、抗真菌及び抗細菌ヒスタチン型ペプチドを開示する。当該ペプチドは、天然のヒトヒスタチンのアミノ酸配列の限定部分、及び真菌及び細菌感染の治療方法に基づく。
【０００８】
米国出願第5,717, 064号は、メチル化リジン−リッチ溶解性ペプチドを開示する。当該溶解性ペプチドは、トリプシン分解抵抗性、且つ非天然である。当該溶解性ペプチドは生体内投与に適当である。
【０００９】
米国出願第5,646, 014号は、抗微生物ペプチドを開示する。当該ペプチドはカイコ血リンパ由来の抗微生物フラクションから単離された。当該ペプチドは、いくつかの細菌種、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）及びセレウス菌（Bacillus cereus）に対して優れた抗微生物活性を示す。
【００１０】
McCabe et al., J. Biol. Chem. Vol 277: 27477-27488, 2002 は、ヘパリン結合コンセンサスモチーフである、ＸＢＢＸＢＸ、及びＸＢＢＢＸＸＢＸを含む、３７ｋＤａの抗微生物且つ走化性タンパク質であるアズロシジンを開示する。
【００１１】
WO 2004016653 は、２０〜４４のアズロシジンの配列に基づくペプチドを開示する。当該ペプチドは、ジスルフィド架橋により連結されるループ構造を含む。
【００１２】
米国出願第6495516号及び関連特許文献は、抗細菌／透過性増大タンパク質（ＢＰＩ)である、抗細菌性の５５ＫＤａのタンパク質に基づくペプチドを開示する。当該ペプチドは、抗微生物効果を発揮し、そしてヘパリン及びＬＰＳ中和能力を有する。
【００１３】
WO 01/81578 は、Ｇ−カップリングタンパク質レセプター関連ポリペプチドであって、多数の疾患に使用することができるポリペプチドをコードする多数の配列を開示する。
【００１４】
WO 00/27415 は、血管形成の阻害に適当なペプチドを開示する。当該ペプチドは高分子量のキニノーゲン５の類似体である。ＢＬＡＳＴｐサーチは、異なる種、例えば、このような保存領域の機能、又はこれらが小ペプチドとしていずれの機能も全く有さないキニノーゲン中に類似性を保存し又は有する配列を示す。
【００１５】
現在、セクロピン、デフェンシン、マガイニン、及びカテリシジン（cathelicidins）を含む、７００以上の異なる抗微生物ペプチド配列が知られている(www. bbcm. univ. trieste. it/〜tossi/search. htm)。
【００１６】
今日入手可能な大量の抗微生物ペプチドが存在するが、新たに改善した抗微生物ペプチドの必要性がいまだ増加している。抗微生物ペプチドは、抗生物質及び／又は他の抗微生物剤に対して抵抗性又は耐性がある微生物を駆除するために使用することができる。更に、哺乳類、例えば、ヒトに導入した場合に非アレルギー性である、新規な抗微生物ペプチドが必要である。細菌は、有意な抵抗性の誘導を伴わない進化の間に、内在的に産出された抗微生物ペプチドに遭遇してきた。
【発明の開示】
【００１７】
第一の観点に従い、本発明は、ヘパリン結合活性を有し、ラミニンアイソフォーム、補体因子Ｃ３、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、及びキニノーゲンから成る群から選択される実質的に抗微生物活性を含まない内在性哺乳類ペプチドに由来し、そして１０〜３６のアミノ酸残基を有する抗微生物ペプチドであって、ここで当該抗微生物ペプチドが、Ｋ、Ｒ、及びＨから成る群から選択される少なくとも４つのアミノ酸残基から成る抗微生物ペプチドに関する。
【００１８】
このような抗微生物ペプチドを供することにより、当該ペプチドが内在性タンパク質及び／又はペプチドに由来するという事実により、抗微生物ペプチドに対するアレルギー反応のリスクを低下することができる。より短いペプチドを使用することにより、長いペプチドと比較して当該ペプチドの安定性を向上させることがき、そして製造コストを減少することができ、従って本発明は経済的に有利となりうる。本発明は、本出願の優先日後に公表されたAndersson et al., Eur JBiochem, 2004,271 : 1219-1226により説明されるように、非抗微生物の内在性タンパク質由来のヘパリン結合モチーフを有するペプチドが抗微生物活性を示すことの発見から生じる。多様なタンパク質中のヘパリン結合に必須の構造及びヘパリン結合モチーフの存在は、一般的によく説明されている。当該分子群は、多様なラミニンアイソフォーム、フィブロネクチン、凝固因子、成長因子、ケモカイン、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、キニノーゲン、及び多くの他のものを含む（Andersson et al. , (2004) Eur JBio- chem 271; 271: 1219-26 及びこの関連物を参照のこと）。これらは本質的に抗微生物性ではない。
【００１９】
本発明に従う抗微生物ペプチド及び対応する抗微生物／医薬組成物は、微生物の有効な予防、減少又は除去を促進するペプチドを供する。これにより、抗生物質に対して抵抗性又は耐性である微生物を駆除する能力を向上することができる。更に、商業的に入手可能な抗微生物剤に対してアレルギー性である哺乳類を治療することができる。内在性タンパク質由来の抗微生物／医薬組成物を供することにより、哺乳類がこれらの特異的なペプチドに対してアレルギーを生じる可能性を減少させることができ、又は除去することができる。これは、抗微生物／医薬組成物が哺乳類と接触するいくつかの投与に有用な抗微生物／医薬組成物を、感染を防止するための医薬又は添加剤とする。
【００２０】
更に、短いペプチドの使用は、生物学的利用能を向上させる。更に、グラム陰性及びグラム陽性菌、又は真菌において特異的又は好ましい作用を有する構造的に異なるヘパリン結合抗微生物ペプチドの使用は、多様な微生物の特異的なターゲッティングを可能にし、従って、抵抗性の発生及び生態学的問題を最小化する。すでに哺乳類中に存在するペプチドを補うことにより、新規な抗生物質による追加的な生態学的圧力のリスクは更に減少される。最後に、これらの製剤はまた、内在性抗微生物ペプチドの効果を増強することができる。
【００２１】
二番目の観点に従い、本発明は、上述のような１又は複数の抗微生物ペプチド、及び医薬的に受容可能なバッファー、希釈剤、担体、アジュバント、又は賦形剤を含んで成る抗微生物／医薬組成物に関する。
【００２２】
三番目の観点に従い、本発明は、以下に示すように、抗微生物ペプチド及び／又は抗微生物／医薬組成物の使用に関する。
【００２３】
本発明の抗微生物ペプチドは、制限することなく哺乳類、例えば、ヒトに侵入又は感染するものを含む全ての種類の適用における微生物の予防、減少、又は除去のための選択を助ける、抗微生物剤のリストを増加させる。
【００２４】
発明の詳細な説明
定義
本出願及び発明の文脈において、以下の定義を適用する：
【００２５】
「ヌクレオチド配列」の語は、２又は複数のヌクレオチドの配列を意味することを意図する。当該ヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成若しくは合成起源又はこれらの混合物であってよい。当該語は、ＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖又は二本鎖形態を含む。
【００２６】
「抗微生物ペプチド」の語は、約１０〜約３６のアミノ酸残基を含んで成り、抗微生物及びヘパリン結合活性を有し、そして本質的に抗微生物効果を有さない内在性哺乳類由来であるペプチドを意味することを意図する。「抗微生物ペプチド」は、微生物を予防し、抑制し、減少し、又は駆除する。当該抗微生物活性は、例えば、実施例２、４、又は５における方法により測定することができる。
【００２７】
「ヘパリン結合アフィニティー」の語は、ヘパリンに直接的に又は間接的に結合するペプチドを意味することを意図する。当該ヘパリン結合活性は、例えば、実施例７における方法により測定することができる。ヘパリンに親和性を示す本発明の抗微生物ペプチドはまた、内在性グリコサミノグリカンであるデルマタンの表面と相互作用する。
【００２８】
「両親媒性」の語は、分子のある面が主に帯電し、そして他の面が主に親水性である、α−ヘリックス構造、β−ストランド、直線、円形、又は他の二次構造の面に対する親水性及び疎水性アミノ酸残基の分布を意味することを意図する。ペプチドの両親媒性の程度は、多様なウェブ型アルゴリズムによるアミノ酸残基の配列、例えば、http://us. expasy. org/cgi-bin/protscale. pl.において見つかるものをプロッティングすることによりアッセイすることができる。疎水性残基の分布は、らせん状ホイールダイアグラムにより視覚化することができる。二次構造予測アルゴリズム、例えば、ＧＯＲＩＶは、www. expasy. com.において見つけることができる。
【００２９】
「陽イオン性」の語は、約４〜約１２のｐＨ範囲中で、正味正の帯電を有する分子を意味することを意図する。
【００３０】
「微生物」の語は、いずれかの生きている微生物を意味することを意図する。微生物の例は、細菌、真菌、ウイルス、寄生虫、及び酵母である。
【００３１】
「抗微生物剤」の語は、微生物を予防、抑制、又は駆除するいずれかの薬剤を意味することを意図する。抗微生物剤の例は、The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy (32nd edition, Antimicrobial Therapy, Inc, US)において見つけることができる。
【００３２】
本文脈において、アミノ酸名及び原子名は、ＩＵＰＡＣ命名法（アミノ酸及びペプチドのためのＩＵＰＡＣ命名法）及びシンボル(残基名、原子名等), Eur J Biochem. , 138,9-37 (1984) together with their corrections in Eur J Biochem., 152,1 (1985)に基づき、プロテインデータバンク (PNB) (www. pdb. ors）により定義されるとおり使用される。「アミノ酸」の語はアラニン（Ａｌａ又はＡ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、及びチロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、又はこれらの誘導体から成る群由来のアミノ酸を示すことを意図する。
【００３３】
説明
抗微生物ペプチド
本発明は、ヘパリン結合活性を有し、実質的に抗微生物活性を含まない内在性哺乳類タンパク質に由来し、そして１０〜３６のアミノ酸残基を有する抗微生物ペプチドであって、ここで当該抗微生物ペプチドがＫ、Ｒ、及びＨから成る群から選択される少なくとも４つのアミノ酸残基から成る抗微生物ペプチドに関する。当該２つのアミノ酸残基は隣接していてもよい。
Margalit et al., 1993 JBiol Chem 268, 19228-31により報告されているように、Ｂアミノ酸残基間の〜２０オングストロングの距離は、ペプチドの高次構造に無関係なヘパリン結合の必要条件を構成する。短いペプチドの使用は、長いペプチド又はタンパク質と比較して、例えば、向上した皮膚浸透能を介してより短いペプチドの生物利用能を向上させ、並びに当該製造及び精製コストを減少する。当該抗微生物ペプチドは、今日商業的に入手可能であり、入手可能な抗微生物剤に対して耐性及び／又は抵抗性である微生物を駆除する能力を向上させるこれらの抗微生物ペプチドの補体である。新規な抗微生物ペプチドが内在性の非抗微生物タンパク質に由来することにより、当該ペプチドが基づく哺乳類に対して非アレルギー性の新規なペプチドを同定することが可能である。
【００３４】
更に、ペプチド作用の増加した知見、及び多様な塩及びイオン性環境の依存性は、ペプチドの効果を増強及び制御する特異的な組成物のデザインを可能にする。真菌における作用に切り取られたペプチドは、特異的な疾患、例えば、粘膜における酵母感染のターゲッティングにおいて、これらの部位における細菌生態学に有意に影響することなく、有利となるであろう。抗微生物ペプチドが細菌膜において作用するという事実は、これらが抗生物質と相乗的に作用できることを示唆する。このため、抗生物質とペプチドの組み合わせは治療的な有利性を有することができる。最後にまた、低コストで、かつ微生物の成長を防ぐために必要な異なる種の生成物の使用に非アレルギー性である抗微生物剤の必要性が存在する。
【００３５】
更に、グラム陰性菌及びグラム陽性菌、又は真菌において特異的又は好ましくは作用を有する構造的に異なるヘパリン結合性の短い抗微生物ペプチドの使用は、多様な微生物の特異的なターゲッティングを可能し、従って抵抗性及び生態学的問題を最小化する。生物にすでに生じているペプチドを補うことにより、新規な抗生物質による追加的な生体学的圧力のリスクが更に減少される。ペプチドの効果を増強する特異的な製剤の導入は、更にペプチドの副作用のリスク、例えば、処置部外への抵抗性の導入を最小化する外来性ペプチドを局在化及び増強する。最後に、また、これらの製剤は、内在性抗微生物ペプチドの効果も増強することができる。抗微生物ペプチドがヒト中の微生物を駆除するために使用されるように開発される場合、当該内在性抗微生物ペプチドはヒト内在性タンパク質に由来する。同じものは他の動物、例えば、ウマ、乳牛、ブタ、又は家禽に適用される。抗微生物ペプチドは血漿、血液、結合組織、及び構成細胞に存在するペプチド及び／又は
タンパク質の構造に基づいてよく、そしてヘパリン結合タンパク質；ラミニンアイソフォーム、フォンウィルブランド因子、ビトロネクチン、プロテインＣ阻害因子、フィブロネクチン、凝固因子、成長因子、ケモカイン、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、キニノーゲン、又は補体因子Ｃ３から成る群から選択することができる。
【００３６】
本発明の抗微生物ペプチドは、約１０ｎＭ〜約２０μＭのヘパリンに対する結合アフィニティー（Ｋｄ）を有する。
【００３７】
上記ペプチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６のアミの酸残基のサイズを有する。当該ペプチドの長さ及び配列は、抗微生物ペプチドの起源、及びどのような微生物を駆除するか、ペプチドが微生物を防止、抑制、減少又は駆除するために使用される場合、微生物がどのような環境に存在するか、及び抗微生物ペプチドを投与後に、どのような環境において遭遇するかに基づく。
【００３８】
第一の態様に従い、本発明は、キニノーゲンタンパク質又はヒスチジンリッチ糖タンパク質に基づき、少なくとも２０％のアミン酸残基がＨである抗微生物ペプチドに関する。当該抗微生物ペプチドは３０、４０、又は５０％以上のＨ、Ｒ及び／又はＫアミノ酸残基を含んで成る。具体的な実施例１、２、３、４、５、又は６において、アミノ酸残基はＨである。例えば、当該抗微生物ペプチドは、配列番号１、２、３、及び４から成る群から選択することができる。これらのペプチドは、それぞれ非抗微生物タンパク質であるキニノーゲン及びヒスチジンリッチ糖タンパク質のヘパリン結合ドメインに由来し、Ｈ残基においてリッチである。
【００３９】
他の態様に従い、本発明は、補体因子タンパク質に基づく抗微生物ペプチドに関する。例えば、当該抗微生物ペプチドは、配列番号５、６、及び７から成る群から選択することができる。配列番号５、６、及び７のペプチドは補体因子Ｃ３分子の明確に定義されたらせん状セグメントに由来する。Hugliら(Chazin et al. , (1988) Biochemistry 27,9139-48, Hugli, Current topics in Microbi- ology and Immunology, 1989,153, 181-208) により示されるように、Ｃ３由来のＣ３ａ分子のらせん領域は、セグメント１９〜２８（配列番号５により示される）、及び４７〜７０（配列番号６及び７により示される）により定義される。ホロタンパク質Ｃ３は、抗微生物効果を発揮しない。Ｃ３由来のペプチドセグメントのヘパリン結合及び抗微生物能は、最近開示された(Andersson et al., Eur J Biochem, 2004,271 ; 271: 1219-1226)。
【００４０】
第三の態様に従い、本発明は、ラミニンタンパク質群に由来する抗微生物ペプチドに関する。例えば、当該抗微生物ペプチドは、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６から成る群から選択することができる。ラミニンα−チェーンＬＧ−ドメインは、ヘパリン及び他の細胞表面レセプターの結合部位として同定された(Timpl. , et al., Matrix Biol, 2000,19, 309-317)、５つの（１〜５）ＬＧ−モジュールから構成される。これらのモジュラータンパク質は、開発プロセス、例えば、創傷治癒の間に合成され、ＬＧ−モジュールのタンパク質分解性のプロセッシングがこれらの現象間に発生することが説明されている。先に開示されていないＬＧ−モジュールのヘパリン結合エピトープの抗微生物機能は、最近説明された(Andersson et al., Eur JBiochem, 2004, 271 ; 271: 1219-1226)。
【００４１】
当該ペプチドが内在性タンパク質に由来しても、これらは半合成又は合成ペプチドとして、並びに微生物中で産出することができる。
【００４２】
抗微生物ペプチドは、１又は複数のアミノ酸残基、例えば、１〜１００のアミノ酸残基、５〜５０のアミノ酸残基、又は６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０のアミノ酸残基により伸長することができる。このような追加的アミノ酸は、非抗微生物タンパク質由来の抗微生物ペプチドの配列に近接する配列を複製することができる。追加すべき数は、当該ペプチドの安定性、毒性、治療すべき哺乳類を含む、いずれの微生物が駆除されるか、またはいずれの生成物に当該ペプチドが存在すべきか、そして抗微生物ペプチドが基づくものはいずれのペプチド構造であるかに依存する。当該ペプチドに付加するアミノ酸残基の数はまた、生成物の選択、例えば、発現ベクター及び発現宿主、及び抗微生物／医薬組成物の製造の選択に依存する。当該伸長は、当該ペプチドの抗微生物効果を破壊しない限り、Ｎ−又はＣ−末端部、又は抗微生物ペプチドの両方の部分におけるものでよい。また、当該抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドが他のペプチドと融合される、融合タンパク質でもよい。
【００４３】
更に、上記抗微生物ペプチドは、他の既知の抗微生物ペプチド又は他の物質、例えば、他のペプチド、タンパク質、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、他の有機化合物、又は無機物質と連結することができる。例えば、抗微生物ペプチドは、抗微生物ペプチドが微生物を抑制、予防、又は駆除する前に、哺乳類中で分解する抗微生物ペプチドを保護する物質とカップリングしてもよい。
【００４４】
従って、上記抗微生物ペプチドは、アミド化又はエステル化によりＣ−末端部において、及びアシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、アルキル化等によりＮ−末端部において修飾されてもよい。
【００４５】
あるいは、非抗微生物性ホロタンパク質の機能的抗微生物セグメントに由来するペプチドは、１〜６のアミノ酸の置換により修飾することができる。
【００４６】
抗微生物ペプチドにより抑制、予防、又は駆除される微生物の例は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方の細菌、例えば、腸球菌（Enterococcus faecalis）、大腸菌（Eschericia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ミラビリス変形菌（Proteus mirabilis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、ウイルス、寄生虫、真菌、並びに酵母、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）である。
【００４７】
上記抗微生物ペプチドは、天然源、例えば、ヒト細胞、ｃＤＮＡ、ゲノムクローンから得ることがき、化学合成、又は細胞源由来の発現生成物として組換えＤＮＡ技術により得ることができる。
【００４８】
上記抗微生物ペプチドは、自動化方法による合成を含む、標準的な化学法により合成することができる。一般的に、類似体は、カップリング剤として、ＨＡＴＵ（Ｎ−［ジメチルアミノ−１Ｈ−１．２．３．−トリアゾロ［４，５−Ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファテン−オキシド）、又は他のカップリング剤、例えば、ＨＯＡｔ−１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールを伴う標準的な固相Ｆｍｏｃ保護法に基づき合成される。当該ペプチドは、適当なスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸で固相樹脂から切断される、また、それは側鎖官能基を脱保護する。更に、粗ペプチドは調製用逆相クロマトグラフィーを使用して精製される。他の精製方法、例えば、分配クロマトグラフィー、ゲルろ過、ゲル電気泳動、又はイオン交換クロマトグラフィーも使用できる。当業界において既知な他の合成技術、例えば、ｔＢｏｃ保護法、又は異なるカップリング試薬等の使用が相当するペプチドを産出するために利用することができる。
【００４９】
あるいは、ペプチドは組換え生成により合成することができる（例えば、米国特許第5,593, 866号を参照のこと）。宿主系の変種は、ペプチド類似体の産出に適当であり、細菌、例えば、大腸菌（E.coli)、酵母、例えば、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）又はピチア（pichia）、昆虫、例えば、Ｓｆ９、及び哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ又はＣＯＳ−７を含む。各宿主に使用することができる多くの発現ベクターが存在し、当該ベクター及び宿主が、抗微生物ペプチドを産出することができる限り、本発明はこれらのいずれかに制限されない。大腸菌（E.coli)におけるクローニング及び発現ベクターのためのベクター及び方法は、例えば、Sambrookら(Molecu- lar Cloning.: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1987) 及びAusubelら(Current Protocols in Molecular Bi- ology, Greene Publishing Co. , 1995)において見つけることができる。
【００５０】
最後に、上記ペプチドは、血漿、血液、多様な組織等から精製することができる。当該ペプチドは内在性であってよく、又は精製タンパク質の酵素的若しくは化学的分解後に産出することができる。例えば、ヘパリン結合タンパク質は、トリプシンにより消化することができ、そして大規模において更に単離された抗微生物ペプチドを生じる。
【００５１】
抗微生物ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、宿主に適した適当な発現ベクターに導入される。好ましい態様において、当該遺伝子は、融合タンパク質を作製するためにクローン化される。当該ペプチド配列の単離を促進するために、化学的切断（例えば、ＣＮＢｒ）、又は酵素的切断（例えば、Ｖ８プロテアーゼ、トリプシン）に感受性のアミノ酸が、当該ペプチドと融合パートナーを架橋するように使用される。大腸菌（E.coli)中での発現のために、融合パートナーは、好ましくは、発現を身体形成に誘導する細胞内タンパク質に中で正常である。かかる場合、最終生成物を放出するための後の切断において、当該タンパク質の再生の必要性はない。本発明において、融合パートナー及びペプチド遺伝子を含んで成るＤＮＡカセットは、発現ベクター中に挿入することができる。好ましくは、当該発現ベクターは、宿主に挿入されたＤＮＡ配列の有効な転写を促進するための誘導又は構成プロモーターを含むプラスミドである。
【００５２】
上記発現ベクターは、慣習的な形質転換技術、例えば、カルシウム媒介技術、電気穿孔法、又は当業者に周知な他の方法により、宿主に導入することができる。抗微生物ペプチドをコードする配列は、天然源、例えば、哺乳類細胞、現存ｃＤＮＡ、又はゲノムクローンに由来することができ、あるいは合成することができる。使用することができる１つの方法は、抗微生物ＤＮＡ鋳型の５’及び３’末端に由来する増幅プライマーを使用するＰＣＲの助けによる抗微生物ペプチドの増幅であり、そして典型的にはベクターのクローニング部位に関して選択された制限部位に組み込みこむ。必要ならば、転写開始及び終止コドンをプライマー配列中に設計することができる。当該抗微生物ペプチドをコードする配列は、コドンの選択が、治療すべき最終的な哺乳類に関して作製される限り、特異的な宿主中での発現を促進するために最適化されたコドンであってよい。従って、例えば、抗微生物ペプチドが細菌中で発現される場合、当該コドンは細菌に最適化される。
【００５３】
上記発現ベクターは、導入された抗微生物ペプチドの発現を促進するためのプロモーター配列を含むべきである。必要であれば、制御配列も含むことができる。例えば、１又は複数のエンハンサー、リボソーム結合部位、転写終了シグナル配列、分泌シグナル配列、複製の開始点、選択マーカー等である。当該制御配列は、転写、及び続く翻訳を許容するように互いに接合することができる。抗微生物ペプチドが細菌中で発現される場合、当該制御配列は、細菌中で使用するために設計され、且つ当業者に周知なものである。適当なプロモーター、例えば、構成及び誘導プロモーターは広く利用することができ、そしてＴ５、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６ファージ由来のプロモーター、及びｔｒｐ、ｌｐｐ、及びｌａｃオペロンを含む。
【００５４】
抗微生物ペプチドを含むベクターが細菌中で発現される場合、開始点の例は、高コピー数を生じるもの、又は低コピーを生じるもの、例えば、ｆｌ−複製起点、及びｃｏｌ Ｅｌ複製起点のいずれかである。
【００５５】
好ましくは、プラスミドは、形質転換細胞を同定、及び／又は選択的に成長させることを許容する、宿主中で機能的な少なくとも１つの選択マーカーを含む。細菌宿主に適当な選択マーカー遺伝子は、アンピリシン耐性遺伝子、クロロアンフェニコール耐性遺伝子、テトラシクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、及び当業界において既知な他のものを含む。
【００５６】
細菌中での発現のためのプラスミドの例は、ｐＥＴ発現ベクターである、ｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ１１ａ、ｐＥＴ１２ａ−ｃ、及びｐＥＴ１５ｂを含む(Novagen, Madi- son, Wis. から入手可能)。低コピー数のベクター（例えば、ｐＰＤ１００）は、大腸菌（E.coli)宿主に有害なペプチドの有用な過剰産出のために使用することができる(Dersch et al. , FEMS Micro- biol. Lett. 123: 19,1994）。
【００５７】
適当な宿主の例は、細菌、酵母、昆虫、哺乳類細胞である。しかしながら、多くの場合いずれかの細菌、例えば、大腸菌（E.coli)が使用される。
【００５８】
発現された抗微生物ペプチドは、慣習的な単離技術、例えば、アフィニティー、サイズ除外、又はイオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣにより単離される。異なる精製技術は、A Biologist's Guide to Principles and Techniques of Practical Biochemistry (eds. Wilson and Golding, Edward Arnold, London, 又はCurrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc)において見つけることができる。
【００５９】
抗微生物／医薬組成物
更に、本発明は、前述の抗微生物ペプチド及び医薬的に受容可能なバッファー、希釈剤、担体、アジュバント、又は賦形剤を含んで成る抗微生物／医薬組成物に関する。追加的な化合物を当該組成物中に含んでもよい。これらは、例えば、キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ又はグルタチオンを含む。当該抗微生物／医薬組成物は、十分に保存安定性で、且つヒト及び動物に対する投与に適当である、当業界に既知の方法において調製することができる。当該医薬組成物は、例えば、フリーズドライング、スプレードライイング、又はスプレークーリングを介して凍結乾燥されていてもよい。
【００６０】
「医薬的に受容可能」は、活性成分、すなわち抗微生物ペプチドの生物活性の有効性を干渉しない無毒性物質を意味する。このような医薬的に受容可能なバッファー、担体、又は賦形剤は、当業界において既知である（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R Gennaro, Ed. , Mack Publishing Company (1990) 及びPharmaceutical Excipientsのハンドブック, 3rd edition, A. Kibbe, Ed. , Pharmaceutical Press (2000)を参照のこと）。
【００６１】
「バッファー」の語は、ｐＨを安定させる目的を有する酸−塩基混合物を含有する水溶液を意味することを意図する。バッファーの例は、トリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス（Ｔｒｉｓ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、トリシンである。
【００６２】
「希釈剤」の語は、医薬調製物においてペプチドを希釈する目的を有する水性又は非水性溶液を意味することを意図する。当該希釈剤は１又は複数の生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、又は油（例えば、ベニバナ油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、又はゴマ油）であってよい。
【００６３】
『アジュバント」の語は、上記ペプチドの生物学的効果を向上させるために当該製剤に添加されるいずれかの化合物を意味することを意図する。当該アジュバントは、１又は複数の異なるアニオンを伴う亜鉛、銅、又は銀塩、例えば、制限することなく異なるアシル組成物のフッ化物、塩素化物、臭化物、ヨウ素化物、チオシアネート、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、及び酢酸塩であってよい。
【００６４】
上記賦形剤は、１又は複数の炭水化物、ポリマー、脂質、及びミネラルであってよい。炭水化物の例は、例えば、凍結乾燥を促進するために組成物に添加されるラクトース、スクロース、マンニトール、及びシクロデキストリンを含む。ポリマーの例は、例えば、粘度調製のため、生物接着を達成するため、又は化学的及びタンパク質分解性の分解由来の脂質を保護するために組成物に添加される、全ての異なる分子量のスターチ、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、カラゲナン、ヒアルロン酸、ポリアクリル酸、ポリスルホネート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、異なる加水分解度のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、及びポリビニルピロリドンである。脂質の例は、ポリマーに似た理由により組成物に添加される、全ての異なるアシル鎖の長さ及び飽和度の脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−、及びトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質、及び糖脂質、卵レシチン、大豆レシチン、水素化卵及び大豆レシチンである。ミネラルの例は、利点、例えば、液体の蓄積の減少、又は有利な色素特性を得るために組成物に添加されるタルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、及び酸化チタンである。
【００６５】
担体の特徴は、投与経路に依存する。１つの投与経路は、局所的投与である。例えば、局所的投与のために好ましい担体は、活性ペプチドを含んで成る乳化クリームであるが、他の一般的な担体、例えば、一定のワセリン／ミネラル型及び植物型軟膏剤、並びに、ポリマーゲル、液晶フェーズ及び微小乳剤もまた使用することができる。
【００６６】
抗微生物／医薬組成物は、抗微生物／医薬組成物中に１又は複数の、例えば、１、２、３、又は４の異なるペプチドを含んで成ってよい。異なるペプチドの組み合わせを使用することにより、抗微生物効果を向上させ、並びに駆除すべき微生物が抗微生物剤に対して抵抗性及び／又は耐性であるという能力を低下させることができる。
【００６７】
特に短いペプチドとして、ヒスチジンリッチ及び／又はキニノーゲン型ペプチドは制限された抗微生物活性を有する。しかしながら、これらのペプチドが塩及び／又は約５．０〜７．０のｐＨを含んで成る組成物中に存在する場合、当該ペプチドは活性である。すなわち塩の添加及び／又は特定のｐＨ範囲の選択により増強された効果が得られる。
【００６８】
塩としてのペプチドは、無機酸、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、リン酸、過塩素酸、チオシアン酸、ホウ酸等、又は有機酸、例えば、ギ酸、酒石酸、コハク酸、グルコンさん、乳酸、マロン酸、フマル酸、アントラニル酸、安息香酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸等を伴う酸付加物であってよい。無機塩は、例えば、全て対応するアニオンを伴う一価のナトリウム、カリウム、又は二価の亜鉛、マグネシウム、銅、カルシウムは、抗微生物組成物の生物活性を改善するために加えることができる。キニノーゲン基づく抗微生物的なＨ−リッチペプチド、及びヒスチジン−リッチ糖タンパク質は、加えた抗微生物ペプチドの効果を増強するために、制限された溶液、例えば、ｐＨが規定され及び調整された（例えば、ｐＨ５．５〜６．０）ゲルにおいて使用することができる。例えば、約５．０〜約７．０、例えば、イオン性の環境を伴う又は伴わない約５．５〜６．０に規定されたｐＨを伴うゲル、軟膏、又は絆創膏は、抗微生物ペプチドの機能を増強し、制御し、そして局在化するであろう。
【００６９】
本発明の抗微生物／医薬組成物はまた、ミセル、不溶性単層、及び液晶として凝集形態において存在する上記ペプチド、更に他の医薬的に受容可能な担体と両親媒性薬剤、例えば、脂質と組み合わされたリポソームの形態であってよい。リポソーム製剤のために安定な脂質は、制限することなく、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等を含む。このようなリポソーム製剤の調製は、例えば、米国出願第4, 235, 871号において見つけることができる。
【００７０】
また、本発明の抗微生物／医薬組成物は、生分解性微粒子形態であってよい。脂肪性ポリエステル、例えば、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡのコポリマー（ＰＬＧＡ）、又はポリ（カルプロラクトン）（ＰＣＬ）、及びポリ無水物は、微粒子の生成物における生分解性ポリマーとして広く使用されてきた。このような微粒子の調製物は、米国出願第5,851, 451号 及びEP 0213303 において見つけることができる。
【００７１】
あるいは、上記抗微生物ペプチドは、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、又は油（例えば、ベニバナ油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、又はゴマ油）、トラガカントゴム、及び／又は多様なバッファー中に溶かしてもよい。また、上記医薬組成物は、抗微生物ペプチドの作用の増強のために、イオン及び規定されたｐＨを含んでもよい。
【００７２】
抗微生物／医薬組成物は、慣習的な医薬的操作、例えば、無菌化に供することができ、及び／又は慣習的なアジュバント、例えば、本明細書のいずれかに記載の防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、バッファー、賦形剤等を含んでよい。
【００７３】
本発明に従う抗微生物／医薬組成物は、局所的に又は全身的に投与することができる。投与経路は、局所、眼球、経鼻、肺、頬側、非経口（静脈内、皮下、及び筋肉内）、経口、非経口、膣、及び直腸を含む。またインプラントからの投与も可能である。適当な抗微生物調製形態は、例えば、顆粒、粉末、タブレット、コーティングタブレット、（微小）カプセル、座薬、シロップ、乳化剤、微小乳化剤、水、油、及び界面活性剤、長い範囲のオーダーであるが短い範囲のディスオーダーにより特徴づけられる任意的な等方性の熱力学的に安定な系として定義される液晶相（例は、水−又は油持続性である層状、六方形及び立方相を含む）、又は分散対応物、ゲル、軟膏、懸濁液、クリーム、エアロゾル、液滴、又はアンプル形態における注射用溶液、及び活性化合物の徐放を伴う調製物であり、これらの調製賦形剤、希釈剤、アジュバント、又は担体は一般的に上述のとおり使用される。
【００７４】
上記医薬組成物は、医薬的に有効な用量において投与されるであろう。「医薬的に有効な容量」は、投与される状態に関する所望される効果を生じるのに十分な用量を意味する。正確な用量は、化合物の活性、投与方法、疾患の性質及び重篤度、患者の年齢及び体重に依存し、異なる用量が必要とされる。当該用量の投与は、個々の用量単位の形態、又はいくつかのより少量単位において単回投与により、及び一定の間隔で細分した用量の複数回投与により行うことができる。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、単独で、又は他の治療剤、例えば、抗生物質又は消毒薬、例えば、抗細菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、及び抗寄生虫剤との組み合わせにおいて投与することができる。例は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、糖ペプチド、キノロン、テトラシクリン、マクロライド、及びフルオロキノロンである。消毒薬は、ヨウ素、銀、銅、クロルヘキシジン、ポリヘキサニド、及び他のビグアナイド、キトサン、酢酸、大過酸化水素である。これらの薬剤は、同医薬組成物の一部として組み込むことができ、又は別々に投与することもできる。
【００７６】
本発明は、ヒト及び他の動物、例えば、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ラクダ等に関する。従って、当該方法は、ヒトの治療及び獣医学的適用の両方に適用することができる。このような治療に適当な対象は、明確な感染の証拠、例えば、熱、脈動、生物の培養等により確認することができる。抗微生物ペプチドで治療できる感染は、微生物により、又は微生物が原因で生じるものを含む。微生物の例は、細菌（例えば、グラム陽性、グラム陰性）、真菌（例えば、酵母及びカビ）、寄生虫（例えば、原虫、線虫、条虫、及び吸虫）、ウイルス、及びプリオンを含む。これらの種類の具体的な生物は周知である（例えば、Davis et al., Microbiology, 3. sup. rd edition, Harper & Row, 1980を参照のこと)。感染は、制限することなく、慢性皮膚潰瘍、感染型急性創傷、及び火傷、感染型湿疹、膿痂疹、アトピー性皮膚炎、アクネ、外耳炎、膣感染、脂漏性皮膚炎、経口感染、及び歯周炎、カンジダ間擦疹、結膜炎及び他の眼球感染、及び肺炎を含む。
【００７７】
従って、上記抗微生物／医薬組成物は、火傷、手術後及び皮膚外傷後の予防的な治療のために使用することができる。当該医薬組成物はまた、人体と接触する外部物質、例えば、コンタクトレンズ、整形インプラント、及びカテーテルの保存及び処置を意図する溶液中に含まれてよい。
【００７８】
更に、抗微生物／医薬組成物は、アトピー性皮膚炎、膿痂疹、慢性皮膚潰瘍、感染型急性創傷、及び火傷、アクネ、外耳炎、真菌感染、肺炎、脂漏性皮膚炎、カンジダ間擦疹、口咽頭カンジダ症、眼球感染（細菌性結膜炎）、及び経鼻感染（ＭＲＳＡ輸送を含む）のために使用できる。
【００７９】
抗微生物／医薬組成物はまた、洗浄溶液、例えば、レンズ消毒液、及び保存溶液として使用することができ、又は泌尿器カテーテルの使用若しくは中心静脈カテーテルの使用に関して細菌感染を防ぐために使用することができる。
【００８０】
更に、抗微生物組成物は、プラスター、接着剤、縫合における手術後の感染を防止するために使用することができ、あるいは包帯剤に組み入れることができる。
【００８１】
また、抗微生物ペプチドは、抗微生物表面を作るためにポリマー、織物等において使用することができ、又は化粧品及びパーソナルケア用品（石鹸、シャンプー、歯磨き粉、抗にきび薬、日焼けクリーム、タンポン、オムツ等）は、抗微生物／医薬組成物で補足することができる。
【００８２】
抗微生物性ヒトペプチド及び／又はタンパク質を同定するための方法
また、本発明は、哺乳類、例えば、ヒトに低アレルギー性を有し、且つ哺乳類に侵入する微生物に対して有効な抗微生物ペプチドの新規なセットを供することを可能にする、１又は複数の新規な抗微生物ペプチドを同定するための方法に関する。このような方法により、市場において入手可能な抗微生物剤に対して今日一般的な抵抗性及び／又は耐性の問題を低下、又は除去する抗微生物剤の大きな収集を供する新規な改良された抗微生物ペプチドが利用できるであろう。
【００８３】
内在性ペプチド及び／又はタンパク質を供する工程、ヘパリンを供する工程、ペプチド及び／又はタンパク質ヘパリン複合体を作製する内在性ペプチド及び／又はタンパク質とヘパリンを混合する工程、当該ペプチド及び／又はタンパク質ヘパリン複合体を検出する工程、及び抗微生物性ヒト内在性ペプチド及び／又はタンパク質を同定する工程を含んで成る方法。更に、ニッケル、例えば、ニッケルセファロースをヘパリンの代わりに使用することもできる。ヘパリンは溶液中に存在することができ、又はマトリックスと結合することができる。後者の場合、これは、分離目的（ｈ．ｐ．ｌ．ｃ又はｆ．ｐ．ｌ．ｃ）又はバイオコア分析に適当である。ヘパリン−セファロース、又は類似した媒体を使用することもできる。また、抗微生物ペプチドは、他のグリコサミノグリカンとも相互作用するため、新規な抗微生物ペプチドの精製のためにこれらの分子、例えば、デルマタン、又はヘパランスルフェートを使用することが可能である。ヘパリン、ヘパランスルフェート、及びデルマタンスルフェートは、分散型で、空間的に限定されたスルホ−又はカルボキシル基を含む。原則として、これらのグリコサミノグリカンのような類似した相互作用能のいずれかの他の重合体化合物は、抗微生物ペプチドの特異的な結合のために使用することができる。更に、Ｈ−リッチペプチドは、ニッケル−セファロース、又は類似した媒体において、単独又はヘパリン−クロマトグラフィーと組み合わせて精製することができる。
【００８４】
以下の実施例は、明示的に又は暗黙的に、制限することなくいずれかの方法、形状、又は形態本発明を説明することを意図する。
【実施例】
【００８５】
微生物
慢性静脈潰瘍から最初に得られた腸球菌（Enterococcus faecalis）２３７４、大腸菌（Escherichia coli）３７．４、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）２７．４、及びアトピー性皮膚炎を有する患者から得られた真菌類であるカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）ＢＭ４４３５を、実験に使用した。
【００８６】
実施例１
抗微生物ペプチド
配列表及び以下の表１に示された抗微生物ペプチドは、Innovagen AB, Ideon, SE-22370, Lund, Swedenにより合成された。これらのペプチドの純度及び分子量は、マススペクトル分析(MALDI. TOF Voyager)により確認した。
【００８７】
【表１】
【００８８】
【表２】
【００８９】
実施例２
アルギニン及びリジンリッチペプチドの抗微生物効果
図１は、腸球菌（Enterococcus faecalis）におけるアルギニン及びリジン−リッチペプチド（配列表）の抗細菌効果を示す。細菌はトッド−ヒューイット（ＴＨ）培地において、中対数期（mid-logarithmic phase）まで成長させた。細菌を洗浄し、そして５ｍＭのグルコースを含む１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４で洗浄した。細菌（５０μｌ；２×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）を、０．０３〜６０μＭの上昇濃度の合成ペプチドとともに３７℃で２時間インキュベートした。殺菌活性を定量するために、インキュベート混合物の連続希釈を、ＴＨ寒天に置き、続いて３７℃で一昼夜インキュベートし、そしてコロニー形成ユニットの数を測定した。２×１０6のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）×ｍｌ-1の腸球菌（E. faecalis)（単離２３７４）を、約０．０３〜６０μＭの範囲の濃度におけるペプチドとともに５０μｌでインキュベートした。（Ａ）ラミニン由来の合成ペプチド。α５鎖（ＰＰＰ２５：配列番号：１３，ＬＧＴ２５：配列番号：１２，ＲＬＲ２２：配列番号：１４，ＰＧＲ１１：配列番号：１５）、及びα１鎖（ＳＲＮ１６：配列番号：８，ＳＲＮ２９：配列番号：９，ＫＤＦ１５：配列番号：１０，ＳＡＶ１５：配列番号：１１）のＬＧ−ドメイン由来のペプチドの効果を示す。１つのペプチド（ＲＩＱ１８：配列番号：１６）はβ１鎖に由来している。（Ｂ）３つのペプチドは補体因子Ｃ３（ＬＲＫ２６：配列番号：５，ＬＧＥ２７：配列番号：６、及びＣＮＹ２１：配列番号：７）に由来し、ＡＫＫ１５はビトロネクチン、ＳＥＫ２０：配列番号：１９はプロテインＣ阻害因子、ＱＰＰ１８：配列番号：１７はフィブロネクチン、及びＹＩＧ２３：配列番号：１８はウィルブランド因子に由来する。（Ｃ）ヘパリン結合コンセンサス配列（ＡＫＫＡＲＡ）n（ｎ＝１〜４）、及び（ＡＲＫＫＡＡＫＡ）n（ｎ＝１〜３）の抗微生物効果。ｎ＝１のペプチドは抗微生物効果を発揮しなかった。ヘパリンと相互作用しないペプチド；ＧＨＲＰＬＤＫＫＲＥＥＡＰＳＬＲＰＡ、ＬＶＴＳＫＧＤＫＥＬＲＴＧＫＥＫＶＴＳ、及びＫＮＮＱＫＳＥＰＬＩＧＲＫＫＴ(Andersson et al. , Eur J Biochem, 2004,271 ; 271: 1219-1226)は、抗微生物性ではなかった。
【００９０】
実施例３
抗微生物ペプチドの放射拡散アッセイ分析（表２）
放射拡散アッセイ（ＲＤＡ）は、先に説明されるとおり(Andersson et al., Eur JBiochem, 2004,271 : 1219-1226)、基本的に行った。端的には、細菌（大腸菌（E.coli)）又は真菌（カンジダ・アルビカンス（C. albicans）を、１０ｍｌの全強（３％ｗ／ｖ）のトリプチケース・ソイ・ブロス（ＴＳＢ）(Becton-Dickinson, Cockeysville, MD)中で中対数期（mid-logarithmic phase）まで成長させた。当該微生物を１０ｍｌのトリス、ｐＨ７．４で１回洗浄した。４×１０6ｃｆｕの細菌、又は１×１０５ｃｆｕの真菌を、０．０３％（ｗ／ｖ）ＴＢＳ、１％（ｗ／ｖ）低−電気浸透型（Ｌｏｗ−ＥＥＯ）アガロース(Sigma, St Louise MO)、及び最終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）トゥイーン２０(Sigma）を含む５ｍｌの下層アガロースゲルに添加した。当該下層は、Φ８５ｍｍのペトリ皿に流した。アガロースを凝固させた後、４ｍｍの直径のウェルをあけ、そして６μｌの試験試料を各ウェルに添加した。当該プレートは３７℃で３時間インキュベートし、ペプチドを拡散させた。それから下層ゲルを５ｍｌの溶融オーバレイ（ｄＨ2Ｏ中の６％ＴＳＢ、及び１％Ｌｏｗ−ＥＥＯアガロース）で覆った。ペプチドの抗微生物活性を、１８〜２４時間の３７℃でのインキュベート後に、各ウェルの周りのクリアーゾーンにより視覚化した。既知のペプチドＬＬ−３７と比較した抗微生物効果を測定するために、１００μＭの濃度において合成ペプチドを試験した。実験間の変動を最小とするために、ＬＬ−３７スタンダード（１００μＭ）を各プレートに入れた。当該ペプチドの活性は、放射拡散単位において示された（ミリメーターにおけるクリアーゾーンの直径−ウェルの直径）×１０）。当該結果は以下の表２に示す。
【００９１】
【表３】
【００９２】
実施例４
大腸菌（E.coli)及びカンジダ・アルビカンス（C. albicans）に対するペプチドの放射拡散アッセイ（図２）
図２は、抗微生物ペプチドのセットを使用する放射拡散アッセイを示す。当該アッセイは上述のように行った。ペプチドの抗微生物効果は、腸球菌（E. faecalis）は３７℃で、及びカンジダ・アルビカンス（C. albicans）は２５℃で１８〜２４時間のインキュベート後に、各ウェルの周りのクリアーゾーンとして視覚化した（パネルＢ）。
【００９３】
実施例５
ヒスチジン−リッチペプチドの抗微生物効果
図３は、ヒスチジン−リッチペプチドの抗微生物ペプチドの抗微生物効果を示す。腸球菌（E. faecalis）細菌を、トッド−ヒューイット（ＴＨ）培地において、中対数期（mid-logarithmic phase）まで成長させた。細菌を洗浄し、そして５０μＭのＺｎＣｌを伴う又は伴わない５ｍＭのグルコースを含む１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、又は１０ｍＭのＭＥＳ−バッファー、５ｍＭのグルコース、ｐＨ５．５で希釈した。細菌（５０μｌ；２×１０6ｃｆｕ／ｍｌ）を、０．０３〜６０μＭ（亜鉛を伴う又は伴わないトリスバッファー）、又は３０及び６０μＭ（トリス及びＭＥＳバッファー）の範囲の合成ペプチドとともに３７℃で２時間インキュベートした。殺菌活性を定量するために、インキュベート混合物の連続希釈を、ＴＨ寒天に置き、続いて３７℃で一昼夜インキュベートし、そしてコロニー形成ユニットの数を測定した。（Ａ）：５０μＭのＺｎＣｌの存在、又は不存在中におけるヒスチジン−リッチ糖タンパク質（ＧＨＨ２０：配列番号４）及びキニノーゲン（ＫＨＮ２０：配列番号３，ＧＧＨ２０：配列番号２、及びＨＫＨ２０：配列番号１）のヘパリン結合ドメイン由来のペプチドの効果を示す。（Ｂ）：５ｍＭのグルコースを含む１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、又は１０ｍＭのＭＥＳ−バッファー、５ｍＭのグルコース、ｐＨ５．５中のペプチド（３０及び６０μＭ）の効果。数字は１００％をコントロール（ペプチド無し）とした場合の％生存率を示す。（Ｃ）：固定ペプチド／亜鉛モル比（１：１００）の存在下における腸球菌（E. faecalis）におけるペプチド、ＡＨＨ２４：１、及びＡＨＨ２４：２の効果。亜鉛を伴わないペプチドは抗微生物効果を発揮しなかった。
【００９４】
実施例６
ペプチド効果の電子顕微鏡観察による分析
図４は、抗微生物ペプチドに供した緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）細菌の電子顕微鏡観察分析を示す。（Ａ）コントロール。（Ｂ〜Ｈ）〜５０％の所望された抗微生物濃度におけるペプチドで処理した細菌の分析。また、ＮＫＨ２０は２００％において分析した。（Ｂ）ＬＬ−３７、（Ｃ）ＡＲＫ２４、（Ｄ）ＳＥＫ２０、（Ｅ）ＡＫＫ２４、（Ｆ）ＬＧＴ２５（Ｇ）ＨＫＨ２０、（Ｈ）２００％の抗微生物濃度におけるＨＫＨ２０。バーはＧ及びＨ（０．５μｍ）を除き１μｍを示す。ペプチドで処理した細菌の電子顕微鏡観察分析は、コントロールで処置された細菌の形態と比較して顕著な相違を示した。カテリシジンＬＬ−３７は局所的な摂動を生じさせ、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の細胞膜を破壊し、しばしば細胞内物質が細胞外で発見され、そして明細書に開示した内在性抗微生物ペプチドで類似した発見が得られた。
【００９５】
実施例７
内在性抗微生物ペプチドのヘパリン結合（図５）
ペプチドはヘパリン結合活性のために試験された。ペプチドは、ニトロセルロース膜(Hybond, Amersham Biosciences)に適用された。膜は１時間ブロックされ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．２５％トゥイーン２０、３％ウシ血清アルブミン）、放射標識されたヘパリンとともに同じバッファー中で１時間インキュベートした。ヒスチジン−リッチペプチドは、５０μＭのＺｎＣｌの存在下又は不存在下におけるヘパリン結合のために試験した。ヘパリンの放射ヨウ素標識は、先に説明されたように行った(Anders- son et al., Eur JBioche7n, 2004, 271 ; 271: 1219-1226)。標識していないポリサッカライド（２ｍｇ／ｍｌ）を結合の比較のために添加した。当該膜を洗浄した（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．２５％トゥイーン２０中で３×１０分）。バス２００ラジオイメージングシステム(Fuji)を放射活性の視覚化のために使用した。標識されていないヘパリン（６ｍｇ／ｍｌ）は125Ｉ−ヘパリンのＣ３由来ペプチドＬＲＫ２６及びＬＧＥ２７及びＬＬ−３７（上部）に対する結合を阻害した。
【００９６】
実施例８
ニッケル−セファロースにおけるヒスチジン含有抗微生物フラグメントの精製（図６）
ペプチドエピトープであるＫＨＮ２０、ＧＧＨ２０、及びＨＩＬＥ２０を含むヒトキニノーゲンのドメインＤ５は、大腸菌（Escherichia coli）株中で発現された。タンパク質生成物は、１ｍＭのイソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドを指数関数的に増殖している細菌に添加することにより誘導された。３時間のインキュベート後、当該細菌を遠心分離により回収した。当該ペレットを、５０ｍＭのリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０（バッファーＡ）に再懸濁し、そして細菌を冷凍−解凍の反復サイクルにより溶解した。それから当該溶菌液を２９０００ｇで３０分間遠心分離した。当該懸濁液を、ニッケルを充填した２ｍｌのＮｉＮＴＡ−セファロースと混合し、そしてバッファーＡで平衡化した。当該セファロースをカラムに充填し、そして０．１％トリトンＸ−１００を伴う１０ｍｌのバッファーＡ、１０ｍｌのバッファーＡ、１ＭのＮａＣｌを伴う５ｍｌのバッファー、５ｍｌのバッファーＡ、１０ｍｌの２０％エタノール、５ｍＭのイミダゾールを伴う１０ｍｌのバッファーＡ、及び３０ｍＭのイミダゾールを伴うバッファーＡで洗浄した。タンパク質（矢印）は５００ｍＭのイミダゾール中に溶出した。当該ドメインは、放射拡散アッセイにおいて大腸菌（Escherichia coli）に対する抗微生物効果を発揮した。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】Ａ〜Ｃは、腸球菌（Enterococcus faecalis）におけるペプチドの抗微生物効果を示すダイアグラムである。
【図２】Ａ〜Ｂは、高活性ペプチドのセットを使用する放射拡散アッセイを示すペトリ皿である。
【図３】Ａ〜Ｃは、ヒスチジン−リッチペプチドの抗微生物効果を示すダイアグラム及び表である。
【図４】Ａ〜Ｈは、抗微生物ペプチドに供した緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の分析を示す、電子顕微鏡写真である。
【図５】Ａ〜Ｃは、補体Ｃ３、ヒスチジン−リッチ糖タンパク質、及びキニノーゲンに由来するペプチドのヘパリン結合活性を示す写真である。
【図６】図６は、ニッケル−セファロースにおけるヒスチジン含有抗微生物フラグメントの精製を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリン結合活性を有し、ラミニンアイソフォーム、補体因子Ｃ３、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、及びキニノーゲンから成る群から選択される実質的に抗微生物活性を含まない内在性哺乳類タンパク質に由来し、そして１０〜３６のアミノ酸残基を有する、抗微生物ペプチドであって、ここで当該抗微生物ペプチドが、Ｋ、Ｒ、及びＨから成る群から選択される少なくとも４つのアミノ酸残基から成る抗微生物ペプチド。
【請求項２】
上記抗微生物ペプチドが、キニノーゲンタンパク質、又はヒスチジンリッチ糖タンパク質に基づき、且つ少なくとも３０％のアミノ酸残基がＨである、請求項１に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項３】
少なくとも５０％の抗微生物ペプチドが、Ｈ、Ｋ、及び／又はＲのアミノ酸残基を含んで成る、請求項２に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項４】
上記抗微生物ペプチドが、配列番号１、２、３、及び４から成る群から選択される、請求項２〜３のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項５】
上記抗微生物ペプチドが、補体因子タンパク質に基づく、請求項１に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項６】
上記抗微生物ペプチドが、配列番号５、６、及び７から成る群から選択される、請求項５に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項７】
上記抗微生物ペプチドが、ラミニンタンパク質に基づく、請求項１に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項８】
上記抗微生物ペプチドが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６から成る群から選択される、請求項７に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項９】
上記ペプチドが、内在的、合成的、又は半合成的である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１０】
上記ペプチドが、１又は複数の抗微生物ペプチド、又は他の物質に結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１１】
上記ペプチドが、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、又はアルキル化により修飾される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１２】
ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド、及び、
ｂ）医薬的に受容可能なバッファー、希釈剤、担体、アジュバント、又は賦形剤、
を含んで成る、抗微生物／医薬組成物。
【請求項１３】
塩を含んで成る、請求項１２に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項１４】
上記塩が、一価のナトリウム、カリウム、又は二価の亜鉛、マグネシウム、銅、カルシウムから成る群から選択することができる、請求項１３に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項１５】
上記塩が、二価の亜鉛である、請求項１４に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項１６】
上記組成物が、約５．０〜約７．０のｐＨを有する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項１７】
上記組成物が、１、２、３、又は４つの異なるポリペプチドの混合物を含んで成る、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項１８】
上記抗微生物／医薬組成物が、１又は複数の抗生物質、及び／又は消毒薬を含んで成る、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項１９】
上記抗微生物／医薬組成物が、顆粒、粉末、タブレット、コーティング化タブレット、カプセル、座薬、シロップ、乳濁液、ゲル、軟膏、懸濁液、クリーム、エアロゾル、液滴、又は注射用形態の形態における、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項２０】
細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、及び酵母から成る群から選択される微生物を、予防、抑制、減少、又は駆除するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド、又は請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の抗微生物／医薬組成物の使用。
【請求項２１】
治療又は診断における、請求項２０に記載の抗微生物ペプチド又は抗微生物／医薬組成物の使用。
【請求項２２】
細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、及び酵母から成る群から選択される微生物により引き起こされる疾患の抗微生物的治療のための医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド、又は請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の抗微生物／医薬組成物の使用。
【請求項２３】
腸球菌（Enterococcus faecalis）、大腸菌（Eschericia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ミラビリス変形菌（Proteus mirabilis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から成る群から選択される微生物により引き起こされる疾患の治療のための、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド、又は抗微生物／医薬組成物の使用。
【請求項２４】
カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、及びカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）から成る群から選択される微生物により引き起こされる疾患の治療のための、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド、又は抗微生物／医薬組成物の使用。
【請求項２５】
患者に対して治療的有効量の請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含んで成る、微生物感染を有する哺乳類の治療方法。
【請求項１】
ヘパリン結合活性を有し、ラミニンアイソフォーム、補体因子Ｃ３、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、及びキニノーゲンから成る群から選択される実質的に抗微生物活性を含まない内在性哺乳類タンパク質に由来し、そして１０〜３６のアミノ酸残基を有する、抗微生物ペプチドであって、ここで当該抗微生物ペプチドが、Ｋ、Ｒ、及びＨから成る群から選択される少なくとも４つのアミノ酸残基から成る抗微生物ペプチド。
【請求項２】
上記抗微生物ペプチドが、キニノーゲンタンパク質、又はヒスチジンリッチ糖タンパク質に基づき、且つ少なくとも３０％のアミノ酸残基がＨである、請求項１に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項３】
少なくとも５０％の抗微生物ペプチドが、Ｈ、Ｋ、及び／又はＲのアミノ酸残基を含んで成る、請求項２に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項４】
上記抗微生物ペプチドが、配列番号１、２、３、及び４から成る群から選択される、請求項２〜３のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項５】
上記抗微生物ペプチドが、補体因子タンパク質に基づく、請求項１に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項６】
上記抗微生物ペプチドが、配列番号５、６、及び７から成る群から選択される、請求項５に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項７】
上記抗微生物ペプチドが、ラミニンタンパク質に基づく、請求項１に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項８】
上記抗微生物ペプチドが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６から成る群から選択される、請求項７に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項９】
上記ペプチドが、内在的、合成的、又は半合成的である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１０】
上記ペプチドが、１又は複数の抗微生物ペプチド、又は他の物質に結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１１】
上記ペプチドが、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、又はアルキル化により修飾される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド。
【請求項１２】
ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド、及び、
ｂ）医薬的に受容可能なバッファー、希釈剤、担体、アジュバント、又は賦形剤、
を含んで成る、抗微生物／医薬組成物。
【請求項１３】
塩を含んで成る、請求項１２に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項１４】
上記塩が、一価のナトリウム、カリウム、又は二価の亜鉛、マグネシウム、銅、カルシウムから成る群から選択することができる、請求項１３に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項１５】
上記塩が、二価の亜鉛である、請求項１４に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項１６】
上記組成物が、約５．０〜約７．０のｐＨを有する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項１７】
上記組成物が、１、２、３、又は４つの異なるポリペプチドの混合物を含んで成る、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項１８】
上記抗微生物／医薬組成物が、１又は複数の抗生物質、及び／又は消毒薬を含んで成る、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項１９】
上記抗微生物／医薬組成物が、顆粒、粉末、タブレット、コーティング化タブレット、カプセル、座薬、シロップ、乳濁液、ゲル、軟膏、懸濁液、クリーム、エアロゾル、液滴、又は注射用形態の形態における、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の抗微生物／医薬組成物。
【請求項２０】
細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、及び酵母から成る群から選択される微生物を、予防、抑制、減少、又は駆除するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド、又は請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の抗微生物／医薬組成物の使用。
【請求項２１】
治療又は診断における、請求項２０に記載の抗微生物ペプチド又は抗微生物／医薬組成物の使用。
【請求項２２】
細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、及び酵母から成る群から選択される微生物により引き起こされる疾患の抗微生物的治療のための医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド、又は請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の抗微生物／医薬組成物の使用。
【請求項２３】
腸球菌（Enterococcus faecalis）、大腸菌（Eschericia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ミラビリス変形菌（Proteus mirabilis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から成る群から選択される微生物により引き起こされる疾患の治療のための、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド、又は抗微生物／医薬組成物の使用。
【請求項２４】
カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、及びカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）から成る群から選択される微生物により引き起こされる疾患の治療のための、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の抗微生物ペプチド、又は抗微生物／医薬組成物の使用。
【請求項２５】
患者に対して治療的有効量の請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含んで成る、微生物感染を有する哺乳類の治療方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５３１６９１（Ｐ２００７−５３１６９１Ａ）
【公表日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７０１６（Ｐ２００６−５１７０１６）
【出願日】平成１６年５月１９日（２００４．５．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／０００７９７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６１５３５
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５０５４２９００５）デルマゲン アクティエボラーグ (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月１９日（２００４．５．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／０００７９７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６１５３５
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５０５４２９００５）デルマゲン アクティエボラーグ (5)
【Ｆターム（参考）】
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