ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌用の培養培地
本発明は、タンパク態窒素源が比動物起源のものであり、かつ、少なくとも１つの植物系ペプトンを含むこと、およびヘム源がプロトポルフィリンＩＸを含むことを特徴とするヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌用の培養培地に関する。この培地は、特に、ポリリボシル・リン酸（ＰＲＰ）の製造のため、およびヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌髄膜炎に対するワクチンの製造のために用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、タンパク態窒素源が少なくとも１つの植物系ペプトンを含んでおり、かつ、ヘム源がプロトポルフィリンＩＸからなっている、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）ｂ型菌用の培養培地である。本発明はまた、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌髄膜炎に対するワクチンの製造に用いるポリリボシル・リビトール・リン酸（ＰＲＰ）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
莢膜は、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌株の病原性の主要因子である。それは、リボシル・リビトール・リン酸の反復単位の連続からなる多糖である。ポリリボシル・リビトール・リン酸（ＰＲＰ）または莢膜多糖体ｂ型なる表現は、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌莢膜を示すために互換的に用いられる。
【０００３】
ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌集団は、しばしば、不均一であり；莢膜を持つ細菌と莢膜を持たない細菌とが共存する。莢膜を持たない細菌は、自然に生じる遺伝子変異の結果、それらの莢膜を発現する能力を喪失した。Hoisethら（非特許文献１）によると、莢膜発現の喪失は、細菌の各世代で０.１〜０.３％の頻度で生じる。遺伝子レベルでは、ｃａｐ遺伝子座がこれらの細菌の表面での莢膜の発現に関与していることを示している（非特許文献２）。莢膜を持つ細菌は、１８Ｋｂ遺伝子のコピーを少なくとも２つ持っているｃａｐ遺伝子座を有する。莢膜を持たない細菌は、もはや、１８Ｋｂ遺伝子またはこの遺伝子のコピーを１つだけでも持ってはいない。莢膜を持つ細菌を同定するために、通常、抗ＰＲＰ抗体の存在下での細菌のスライドガラス上での凝集試験が用いられるか、または、ｃａｐ遺伝子座を特徴付ける分子生物学技術が用いられる。
【０００４】
ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌感染を予防するために、ＰＲＰ由来のワクチン、またはキャリアタンパク質と共有結合したＰＲＰが用いられる。これらのワクチンを製造するためには、大量の培養培地中にて大量の細菌を製造することが必要であり、この培養培地からＰＲＰが抽出され、次いで、精製される。それにもかかわらず、莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザｂ型細菌が莢膜を持たない形態へ復帰する容易さは、ＰＲＰの製造の障害となり得る。
【０００５】
ＰＲＰの工業的製造に関しては、酵母エキス、グルコース、ヘミン、β−ＮＡＤおよび無機塩を添加したタンパク態窒素の主要供給源である動物ペプトンをベースとする培養培地が一般に使用される。例えば、特許文献１に記載されている生産培地が挙げられる。
【０００６】
ＢＳＥに関連するリスクのために、動物起源の製品、さらに詳しくはヒト起源またはウシ起源の製品の代わりにより良好な生物学的安全性を提供する生成物を用いることが求められている。
【０００７】
Cartyら（非特許文献３）は、ＰＲＰの生産に関して動物ペプトンの代わりにダイズペプトンを用いることができることを示している。この培地（ＭＰ培地）の１リットル当たりの組成は以下のとおりである：ダイズペプトン：１０ｇ；酵母イースト：１０ｍｌ；ＮａＣｌ：５ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4：２.５ｇ；Ｎａ2ＨＰＯ4：３.３ｇ；デキストロース：５ｇ；塩化ヘミン：１０ｍｇ；ＮＡＤ：１０ｍｇ。
【０００８】
Takagiら（非特許文献４）は、Ｃａｒｔｙ培地（ＭＰ培地）の組成を最適化することを求めた。彼らは、ヘミンおよびβ−ＮＡＤ濃度が増加した場合に培養培地中のＰＲＰ濃度が７０％増加して０.２５ｇ／ｌに達することができることを示した。したがって、ＰＲＰの生産を増加させるためには、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の増殖に必要なコファクター（ヘミンおよびβ−ＮＡＤ）濃度を増加させることが必要であると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４,４５９,２８６号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hoiseth et al. Infectious and Immunity (1985), 49: 389-395
【非特許文献２】Kroll, J. S., et al., J. Bacteriol. (1988) 170: 859-864
【非特許文献３】Carty et al. in Dev. Indust. Microbiol. 26: 763-767 (1985)
【非特許文献４】Takagi et al. J. Chem. Tech. and Biotech 81: 182-188 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、特に培養容量が大きい（１００リットル以上）場合に、最良の生物学的安全条件を適用しながら、ＰＲＰを製造する方法を改良することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明の主題は、タンパク態窒素源が非動物起源のものであり、少なくとも１つの植物系ペプトンを含むことを特徴とし、かつ、ヘム源がプロトポルフィリンＩＸからなることを特徴とする、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌用の新規培養培地である。このような培地は、ＰＲＰの工業的製造に特に適している。それは、動物起源のペプトンの代わりに植物系ペプトンを用いるので、大きな生物学的安全性をもたらす。工業的に利用可能な培養上清中のＰＲＰレベル（０.２ｇ／ｌ以上のレベル）を得るために必要なプロトポルフィリンＩＸはヘミンの１０分の１〜２０分の１であるので、生産コストの偶発性にも対応している。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、動物起源のペプトンの代わりにエンドウペプトンを用いた培養培地におけるＰＲＰ生産レベル（ｍｇ／ｌ）を、ヘミンの濃度（−◆−）または動物起源のプロトポルフィリンＩＸの濃度（−■−）もしくは合成起源のプロトポルフィリンＩＸの濃度（−（黒塗りの三角）−）（μｇ／ｌ）の関数として表す。
【図２】図２は、動物起源のペプトンの代わりにコムギペプトンを用いた培養培地におけるＰＲＰ生産レベル（ｍｇ／ｌ）を、ヘミンの濃度（−◆−）または動物起源のプロトポルフィリンＩＸの濃度（−■−）もしくは合成起源のプロトポルフィリンＩＸの濃度（−（黒塗りの三角）−）（μｇ／ｌ）の関数として表す。
【図３】図３は、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂの種々の細菌集団の電気泳動プロファイルを表す： バンドＭは、１８ｋｂおよび４５ｋｂの２つのバンドを有する不均一な貯蔵集団の電気泳動プロファイルを表し；バンドＦは、４５ｋｂの単一バンドを有する選択固体培地での選択後の娘集団（Ｆ）の電気泳動プロファイルを表し；バンドＢは、４５ｋｂの単一バンドを有する種々の白色細菌コロニー（Ｂ）のプロファイルを表し；バンドＧは、１８ｋｂの単一バンドを有する種々の灰色細菌コロニーの種々のプロファイルを表す。 バンドＭＷは分子量マーカー（ｋｂ）の位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
「ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂの培養のための培地」なる表現は、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂの増殖を促進する培地であって、
タンパク態窒素源、
ヘム源、
β−ＮＡＤ源、
炭水化物源
ビタミンおよび増殖因子の供給源、および
無機塩
を含む培地を意味すると解される。
【００１５】
「タンパク態窒素源」なる表現は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプトンおよび／またはタンパク質の量がこの組成物の乾燥重量の少なくとも５０％である調製物を意味すると解される。
【００１６】
「非動物起源のタンパク態窒素源」なる表現は、非動物起源のものであるタンパク態窒素源を意味すると解される。結果として、該調製物は、動物細胞、動物組織、または動物臓器もしくは動物体からは製造されない。それは、一般に、植物、藻類、細菌、酵母または真菌類から製造される。
【００１７】
本発明の培養培地は、第一に、液体培地を示すが、固体形態のものであってもよい。該固体形態は、液体培地に、通常１０〜３０ｇ／ｌの濃度範囲で使用される寒天のようなゲル化物質を添加することによって得られる。
【００１８】
本発明のヘム源は、式：
【化１】
［式中、Ｒは、Ｈまたは塩、好ましくは、アルカリ金属塩、特に、ナトリウム塩を表す］
で示されるプロトポルフィリンＩＸによって表される。
【００１９】
本発明の場合、プロトポルフィリンＩＸは、鉄と錯体形成していない。これまでＰＲＰの生産に推奨されていた培地は全て、ヘム源として、（ヘムに関する場合）鉄と錯体形成したプロトポルフィリンＩＸ、または（ヘミンに関する場合）ＦｅＣｌと錯体形成したプロトポルフィリンＩＸ、または稀であるが（ヘマチンに関する場合）ＦｅＯＨと錯体形成したプロトポルフィリンＩＸを含有していた。たとえヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ株がプロトポルフィリンＩＸを鉄と錯体形成した形態に変換するフェロケラターゼを有するとしても（Loeb et al., J. Bacteriology (1995), 177; 3613-3615）、工業的に利用可能な濃度でＰＲＰを製造するために、植物系ペプトンをベースとする培養培地中でヘム源として錯体形成していないプロトポルフィリンＩＸを使用することができることは示されていない。ＰＲＰの工業的生産を保証するためには培養上清中に少なくとも０.１〜０.２ｇ／ｌのＰＲＰが必要であると一般に考えられる。
【００２０】
驚くべきことに、ヘム源としてプロトポルフィリンＩＸを使用し、タンパク態窒素源として植物系ペプトンを使用することによって、必要なプロトポルフィリンＩＸ濃度が、ヘム源が鉄と錯体形成したプロトポルフィリンＩＸである場合に使用されるその濃度の１０分の１〜１００分の１となることが観察された。実施例１に示すように、ＰＲＰの最大生産（培養上清中の濃度は約０.４ｇ／ｌである）を得るためには１００〜２００μｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ濃度で十分であるが、等量のＰＲＰ生産を得るためには１０倍から２０倍のヘミン濃度が必要である。さらにまた、プロトポルフィリンＩＸの濃度が１０μｇ／ｌ程度の低さであっても、相当量のＰＲＰの生産が観察されたが、ヘミンの場合にはほんの僅かである。５０μｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸでは、ＰＲＰの生産は、１００μｇ／ｌ（既に工業的規模で使用することができる割合）に達するか、またはそれを超えるが、培養培地が同濃度のヘミンを含有する場合には約１０μｇ／ｌまたはそれ以下である（図１および２を参照）。
【００２１】
したがって、本発明の主題は、
プロトポルフィリンＩＸ濃度が少なくとも０.０１ｍｇ／ｌ、少なくとも０.０２ｍｇ／ｌ、少なくとも０.０３ｍｇ／ｌ、少なくとも０.０４ｍｇ／ｌ、または好ましくは、少なくとも０.０５ｍｇ／ｌである本発明の培養培地
である。
【００２２】
一般に、培養培地中のプロトポルフィリンＩＸ濃度は、０.１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌ、好ましくは、０.１ｍｇ／ｌ〜２ｍｇ／ｌである。これらの濃度範囲において、培養上清中でＰＲＰの最適な生産をもたらすための原料が最適に使用される。
【００２３】
本発明の主題に適しているプロトポルフィリンＩＸは、動物起源のものであってよく、動物（ウシ、ブタおよび同類のもの）の組織から製造され得る。これらの調製物の純度は、一般に、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、さらに好ましくは、少なくとも９５％（重量／重量）である。混入物は、残りの量のアミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を含有し得るが、存在していてもよい残りの量のアミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質は一般的に調製物の乾燥重量の５％未満、より一般的には１％未満であるので、該プロトポルフィリンＩＸ調製物は、本発明の目的のためのタンパク態窒素源であるとは考えられない。
【００２４】
好ましくは、より大きな生物学的安全性を確実にするために、動物起源の混入物を含まないプロトポルフィリンＩＸを使用する。このようなプロトポルフィリンＩＸを製造するために、２００７年３月３０日に出願された出願番号第０７／０２３３４号のフランス特許出願に記載されたスキーム２に記載されている工程を用いる製造方法を使用することができる。
【００２５】
別の好ましい実施態様では、本発明の培養培地は、動物起源の混入物を含まないプロトポルフィリンＩＸを含む。
【００２６】
本発明の主題によると、タンパク態窒素の主要供給源は、１つ以上の植物系ペプトンによって表される。それらは、一般に、加水分解物の形態のものである。それらは、タンパク質を最も多く含有する植物の部分から抽出されるタンパク質の酵素的または化学的処理によって得られる。好ましくは、遺伝子組換えされていない植物が用いられる。化学的ルートを用いる場合、方法の一つは、高温状態で加圧下にてタンパク質抽出物を塩酸で処理することである。次いで、該加水分解物を水酸化ナトリウムで中和し、次いで、固体副産物を除去する。酵素的ルートを用いる場合、古典的な方法の一つは、タンパク質抽出物をパパインで処理することである。
【００２７】
植物系ペプトンは、主に、アミノ酸とＭＷが１ＫＤ以下の小ペプチドとの混合物を含有する調製物である。ＭＷが１ＫＤを超えるペプチドは、一般に、該混合物の４０％未満である。必要な場合には、小さいサイズのペプチドを濃縮または選択するために、限外濾過した加水分解物を使用することもできる。１ＫＤ以下、または５００ダルトン以下または３５０ダルトン以下のＰＭを有する加水分解物フラクションを選択するために、限外濾過した加水分解物をさらにクロマトグラフィー処理することもできる。かくして、４０％を超えるペプチド、５０％を超えるペプチド、または６０％を超えるペプチドが１ＫＤ以下、または５００ダルトン以下または３５０ダルトン以下のＰＭを有する植物系ペプトン調製物が得られる。本発明の主題に適している植物系ペプトンは、特に、ジャガイモから得られるもの、例えば、Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅによって供給されるもの（ｐｌａｎｔ ｐｅｐｔｏｎｅ Ｅ１またはｐｌａｎｔ ｐｅｐｔｏｎｅ ＥＴ１）、ダイズから得られるもの、例えば、ＯｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅまたはＫｅｒｒｙによって供給されるもの、ワタから得られるもの（Ｑｕｅｓｔによって供給されるＨｙ ｃｏｔｔｏｎ）、コメから得られるもの（Ｋｅｒｒｙによって供給されるＨｙ ｒｉｃｅ）、Ｓｏｌａｂｉａによって供給されるソラマメから得られるもの、コムギから得られるもの、例えば、Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅによって供給されるもの（ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｏｎｅ Ｅ１）またはＫｅｒｒｙによって供給されるもの（ＨｙｐｅｐTM ４６０２、ＨｙｐｅｐTM ４６０１）、またはエンドウから得られるもの、特に、Ｋｅｒｒｙによって供給されるエンドウの酵素加水分解物（ＨＹ ｐｅａ ７４０４）もしくはＯｘｏｉｄによって供給されるエンドウの酵素加水分解物（ＶＧ １００）、または「Ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｐｅｐｔｏｎｅ」の名称の下に参照されるＯｘｏｉｄによって供給されるエンドウの酸加水分解物である。好ましくは、本発明の主題に適している植物系ペプトンは、コムギペプトンであり、より好ましくは、植物系ペプトンはエンドウペプトンである。
【００２８】
植物系ペプトンを使用するための濃度を定義するためには、ペプトンのタンパク態窒素含有率が考慮される。この含有率は、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法（Lynch JM et al., J AOAC Int. (1999) 82(6):1389-98）を使用して算出される。通常、本発明の主題による植物系ペプトンのタンパク態窒素含有率は、ペプトン１ｇ当たり８％〜１５％（重量／重量）である。この範囲では、本発明の培養培地中の植物系ペプトン濃度が０.０８〜２.２５ｇ／ｌの範囲、好ましくは０.４〜１.５ｇ／ｌの範囲のタンパク態窒素濃度に相当する場合に優れた結果が得られる。
【００２９】
したがって、本発明の主題は、総植物系ペプトン濃度が０.０８ｇ／ｌ〜２.２５ｇ／ｌの範囲のタンパク態窒素濃度と等価である培地である。
【００３０】
β−ＮＡＤ（因子Ｖまたはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとも称される）の供給源としてβ−ＮＡＤ自体の精製調製物またはニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、β−ニコチンアミドアデニンモノヌクレオチド（ＮＭＮ）もしくはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）から選択されるβ−ＮＡＤの誘導体を含有する精製調製物が使用される。調製物の純度は、一般に、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％である。本発明の場合、好ましくは、動物起源のタンパク質混入物を含まないβ−ＮＡＤ源が使用される。これらの精製調製物は、少なくとも１μＭの濃度で使用される。例えば、β−ＮＡＤは、培養培地１リットル当たり２〜５０ｍｇの範囲の濃度で使用される。
【００３１】
炭水化物源としては、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌によって代謝される糖、例えば、フルクトース、リボース、キシロース、フコース、グリセロール、または特に、グルコースを用いることができる。一般に、炭水化物源は非動物起源のものであり、培養培地中の炭水化物濃度は少なくとも１０ｍＭである。グルコースを使用する場合には、培養培地中のその濃度は、一般に２〜２０ｇ／ｌである。
【００３２】
本発明の培養培地はまた、ビタミンおよび増殖因子の供給源を含む。この目的を達成するために、サッカロミセス・エスピー（Saccharomyces sp）の培養物に由来するビール酵母の自己分解物の可溶性フラクションから得られる酵母エキスが使用される。多数のアミノ酸およびビタミン、例えば、ビタミンＢ５、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、ＰＰ、ＨおよびＢ１２、微量元素およびオリゴヌクレオチド誘導体がその組成物中に見られる。Ｑｕｅｓｔ、ＤｉｆｃｏまたはＳｏｌａｂｉａによって製造されている市販の自己分解酵母エキスが本発明の主題に適している。
【００３３】
本発明の培地中の酵母エキスの濃度は、通常、０.２ｇ／ｌ〜１５ｇ／ｌの濃度範囲内、好ましくは、０.２ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度範囲内、さらに有利には、０.２〜５ｇ／ｌの濃度範囲内である。酵母エキスの濃度が０.２〜５ｇ／ｌの範囲の濃度である場合に細菌によるＲＰＲ生産が良好であることが観察された。
【００３４】
酵母エキスはまた、非動物起源のさらなるタンパク態窒素源でもある。酵母エキス中のタンパク態窒素の含有率は、実際に、一般的に９〜１１％（重量／重量）である。培養の間の毒性廃棄物の蓄積の原因であり得る窒素性の異化亢進を回避するために、植物系ペプトンの濃度および酵母エキスの濃度は、一般に、培地中の総タンパク態窒素含有量が２.５ｇ／ｌを超えないように調節される。好ましくは、植物系ペプトンの濃度および酵母エキスの濃度は、本発明の培地中の総タンパク態窒素含有量が０.５〜２.５ｇ／ｌであるように調節される。
【００３５】
本発明の培養培地はまた、無機塩を含む。使用される無機塩は、一般に、塩溶液の形態であり、それらのうち少なくとも１つは、細菌接種前に、培地の初期ｐＨが６.５〜７.５、最も好ましくは、７〜７.５であるのに十分な緩衝力を発揮する。一般に、モル濃度が１０-2ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲内で変化する塩溶液の形態のＮａ+および／またはＫ+のような一価陽イオン、Ｃａ++および／またはＭｇ++のような二価陽イオン、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-および／またはＰＯ4---形態のリン酸陰イオン、ならびにＳＯ4--およびＣｌ-陰イオンの混合物が使用される。
【００３６】
前段に記載した成分に加えて、本発明の培養培地は、ＰＲＰの生産をネガティブに妨害しないことを条件に１つ以上の他の無機成分および／または有機成分をその組成に取り込むことができると明らかに解される。非常に好ましくは、非動物源由来の成分が導入される。かくして、本発明によると、該培地に、トリプトファンおよび／またはシスチンのような化学合成または微生物発酵によって製造されるアミノ酸、ＮＨ4+イオンをもたらす塩溶液の形態の無機窒素、および／または乳酸ナトリウムのような他の物質を加えることができる。これらの添加物は、一般に、低濃度で使用される。培養培地中のアミノ酸補充は、一般に、１ｍＭ以下の濃度である。同様に、アンモニウム塩および／または乳酸ナトリウムは、一般に、１０ｍＭ以下の濃度である。最後に、鉄は植物系ペプトンおよび酵母エキスの組成物中に既に十分な量で存在しているので鉄イオンの形態の鉄の供給によって本発明の培養培地に補充するのは必要ではないが、万一に備えて、細菌増殖の間に生じる可能性のある鉄不足を回避するために０.５〜１０ｍｇ／ｌの範囲であり得る濃度範囲で鉄塩の溶液を培養培地に加えることは可能である。
【００３７】
有利には、本発明の培養培地は、ヒト起源もしくはウシ起源のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはアミノ酸を含まないか、または、動物起源のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはアミノ酸を含まないか、または、より有利には、動物起源の混入物を含まない。
【００３８】
特定の実施態様によると、本発明の主題は、
０.１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
２〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
２〜２０ｇ／ｌのグルコース、
２〜５ｇ／ｌの酵母エキス、
０.４ｇ／ｌ〜１.５ｇ／ｌのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液の形態のＮａ+、ＮＨ4+、Ｃａ++、Ｍｇ++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-イオンを含む無機イオンのカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは、７.０〜７.５となる）
を含む培養培地である。
【００３９】
この培地組成物を使用することによって、液体媒体中での培養の間の莢膜を持たない復帰細菌の発生が予防される。実際に、この培地に、初めに莢膜を持つ細菌を１００％含有している集団（１８ｋｂ遺伝子のコピーを２つ持っているｃａｐ遺伝子座の細菌集団全体のゲノム）を接種することによって、４０細菌世代と等価な培養期間の後、莢膜を持つ細菌をなおも１００％含有している細菌集団が得られる。特に実施例３.２.２.１に記載されているものおよび実施例４で使用されているものを含むこの培地組成物は、莢膜を持つ細菌の集団に対して安定化の役割を果たすことによってＰＲＰ収率を向上することに貢献する（実施例４を参照）。
【００４０】
別の態様によると、本発明の主題は、ポリリボシル・リビトール・リン酸（ＰＲＰ）の製造方法であって、
（ｉ） 本発明の液体培養培地中にてヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂを培養し、
（ｉｉ） （ｉ）で得られた培養上清を回収し、そして、
（ｉｉｉ） 該培養上清からＰＲＰを抽出する
ことを含む方法である。
【００４１】
本発明の方法に従ってＰＲＰを製造するためには、工程（ｉ）において本発明の液体培地中にてヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂの一代以上の継代培養を行うことができる。該継代培養によって、バイオマスを増加させることができる。
【００４２】
これを行うには、凍結乾燥製品または凍結製品から得られる細菌を一般的に１リットル以下の培地に接種する。一夜培養した後、または、培地の光学密度が十分になった時に、この最初の培養物を２回目の培養培地に移す。この２回目の培養培地は、最初の培養培地と同一であるが、その容量は最大１０倍〜２０倍多くてもよい。細菌集団の急速な増殖を促進するために、この２回目の培地に接種する細菌の量を、６００ｎｍでの２回目の培養培地の初期光学密度（ＯＤ）が０.２〜０.４となるように調節する。この２回目の培養は、通常、発酵槽中で行われるが、他のタイプの容器（フラスコ、スピナー、および同類のもの）を使用することができる。培養が発酵槽中で行われる場合、通常、培養期間じゅう、３７℃±１℃の温度、持続撹拌、０.１バールの圧、３０％のｐＯ２、および毎分培地１容量につきガス０.２５容量の空気流速が使用される。この種の培養の他のパラメーターを選択することは当業者の能力の範囲内である。細菌の指数増殖期の終わりに、それを大容量の別の発酵槽に移して同じ手順などを使用してバイオマスをさらに増幅することができる。得られた培養容量は、最大１０００リットルであっても、またはそれ以上であってもよい。培養は、一般に、バッチ法によって行われる。他の培養方法、特に、流加培養法を採用することもできる。この場合、指数増殖期の間に培地に炭水化物栄養補助剤を添加して細胞増殖を延長することができ、指数増殖期の終わりに高い細菌密度を得ることができる。炭水化物の添加量は、添加時に培地中に存在する乳酸塩のレベルの関数として評価される。
【００４３】
最後の培養物の上清は、最終的には細菌の不活化後に回収される。該不活化は、最終濃度０.３５％〜０.３７％（ｖ／ｖ）のホルマリン溶液を用いて慣用的に行われる。該上清は、遠心分離工程によって細菌から慣用的に分離される。次いで、当業者に周知の慣用方法に従って、得られた上清に含まれるＰＲＰを抽出し、精製する。
【００４４】
別の実施態様によると、本発明の主題は、ＰＲＰの製造方法であって、
（ｉ） 固体培地上でヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂを培養し、
（ｉｉ） （ｉ）で得られた１つ以上のコロニーを本発明の液体培養培地に移して培養し、
（ｉｉｉ） （ｉｉ）で得られた培養上清を回収し、そして、
（ｉｖ） 該培養上清からＰＲＰを抽出する
ことを含む方法である。
【００４５】
本発明の方法で使用することができる固体培養培地は、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂの培養に適している。それは、また、
タンパク態窒素源、
ヘム源、
β−ＮＡＤ源、
炭水化物源、
ビタミンおよび増殖因子の供給源、
無機塩、ならびに
ゲル化物質、通常、１０〜３０ｇ／ｌの濃度の寒天
を含む。
【００４６】
ＰＲＰの工業的製造方法では、固体培地中での予備培養工程が慣用的に用いられる。通常、凍結乾燥製品または凍結製品から得られる細菌を再懸濁し、次いで、ウマの血液を加えたチャコールベース固体培地に接種する。１０％ＣＯ2下にて３７℃でインキュベーター中において１６〜２０時間培養した後、細菌コロニーを回収し、液体培地中にて増幅する。この方法は、タンパク態窒素源として動物起源のタンパク質を含有する固体培地を使用するという欠点を有する。したがって、本発明者らは、タンパク態窒素源が動物起源のタンパク質を含んでいない固体培地の組成を同定することを試みた。
【００４７】
まず始めに、本発明者らは、酵母エキスが同時にタンパク態窒素源、ビタミンおよび増殖因子の供給源、ならびにヘム、β−ＮＡＤ、炭水化物および上記のものと同じ特徴を有する無機塩の供給源としての役割を果たすことができる固体培地を使用することができることを示した。プロトポルフィリンＩＸの最小濃度０.０５ｍｇ／ｌ、β−ＮＡＤ源については０.１μＭ、そして、炭水化物源については０.１ｍＭが推奨されるが、培地中の酵母エキスの濃度は、０.２〜１.５ｇ／ｌのタンパク態窒素の含有量に対応する。得られたコロニーは、該コロニーのサイズに象徴される増殖が必ずしも最適であるとは限らなくても生存可能である。それらを本発明の液体培養培地に直接移すことができる。次いで、培養容量を増幅し、ＰＲＰを抽出および精製するために上記の手順を行う。
【００４８】
好ましくは、該固体培養培地は、タンパク態窒素源として、化学的または酵素的加水分解物の形態で使用される少なくとも１つの植物起源ペプトンを含む。特に、酵母エキス補助剤として、タンパク態窒素濃度の、コムギ、ワタ、コメ、ダイズ、ソラマメ、ジャガイモ、エンドウまたはこれらの混合物から得られる少なくとも１つの植物系ペプトンを使用することができ、該タンパク態窒素濃度は特に０.２ｇ／ｌ〜２ｇ／ｌの範囲であり得、固体培地中の総タンパク態窒素濃度は好ましくは２.５ｇ／ｌ以下である。使用することができる植物系ペプトンの混合物の例としては、ダイズ、ワタおよびコメのペプトンをベースとする混合物、またはエンドウ、ワタおよびコムギのペプトンをベースとする混合物、または、エンドウおよびジャガイモをベースとする混合物を挙げることができる。本発明者らは、実際、該培養培地がタンパク態窒素源として植物系ペプトンも含む場合、細菌増殖および細菌の生存性が、煮沸または脱線維素処理したウマの血液を加えたチャコールベース固体培地（チャコール寒天）で観察されたものよりも優れていることに注目していた。それらは、使用した植物系ペプトンがエンドウペプトンである場合に最大である。
【００４９】
したがって、本発明の主題は、固体培地のタンパク態窒素源が、動物起源のタンパク質を含んでおらず、少なくとも１つの植物系ペプトンを含んでいる、ＰＲＰの製造方法でもある。好ましくは、植物系ペプトンはエンドウペプトンである。
【００５０】
有利には、本発明の固体培養培地は、ヒト起源もしくはウシ起源のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはアミノ酸を含まないか、または、より有利には、動物起源の混入物を含まない。後者の場合、ヘム源は合成プロトポルフィリンＩＸからなり、β−ＮＡＤおよび炭水化物源もまた非動物起源のものであり、ビタミンおよび増殖因子の供給源は酵母エキスによってもたらされ、ゲル化物質は寒天（藻類由来の製品）である。
【００５１】
したがって、本発明の別の主題は、固体培養培地および液体培養培地が動物起源の混入物を含まない、ＰＲＰの製造方法である。
【００５２】
最大量のＰＲＰを製造する細菌コロニーを選択することができるように固体培地の組成を最適化することが求められている。このような培地の組成によって、
コロニーの優れた個別化；
コロニーの優れた生存性；
コロニーの形態を研究することができるようなコロニーの発生および十分なサイズ
を得ることができる。コロニー間で区別できるようにするためには、１６〜２４時間の培養の終わりに十分なサイズ（約３〜５ｍｍ）のヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌コロニーを得ることを可能にする培地を有することが必要である。
【００５３】
本発明のＰＲＰの製造方法の好ましい実施態様の１つでは、固体培地は、
少なくとも１ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
少なくとも０.５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
固体培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも０.２ｇ／ｌとなるのに十分な量の植物系ペプトンおよび酵母エキス（ここで、両者の割合は、培地中の植物系タンパク質の量と酵母エキスの量との比が、培地のタンパク態窒素の濃度が０.２ｇ／ｌ〜０.８ｇ／ｌである場合には０.１〜９となり、培地のタンパク態窒素の濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１〜９となる割合である）、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態のＮａ+、Ｋ+、Ｃａ++、Ｍｇ++、Ｆｅ+++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-イオンを含む無機イオンのカクテル（これにより、培養培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む。
【００５４】
使用する炭水化物は、好ましくは、細菌によって代謝される非動物起源の糖であり、例えば、フルクトース、リボース、キシロース、フコース、グリセロール、または、特に、グルコースである。少なくとも０.１ｇ／ｌの濃度のグルコースで優れた結果が得られた。通常、グルコースは、０.１ｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、好ましくは、０.１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度で使用される。
【００５５】
解毒剤は、Evans N. Mら（J. Med. Microbiol. Vol 7, pp 305-309, 1974）によって報告されているように、寒天調製物中に存在し得る阻害物質を中和することによって細菌の増殖を促進する。解毒剤としては、好ましくは、チャコール、デンプン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ポリビニルアルコール、オレイン酸ナトリウムまたは亜ジチオン酸ナトリウムが使用される。０.５〜１０ｍｇ／ｌの濃度で使用したＴｗｅｅｎ ８０（登録商標）（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）で優れた結果が観察されたが、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を含まない固体培地組成物は、形態学的観点から区別できない小さいサイズのコロニーを生産する。β−ＮＡＤ濃度が１ｍｇ／ｌ未満の場合、プロトポルフィリンＩＸ濃度が０.５ｍｇ／ｌ未満の場合、またはグルコース濃度が０.１ｍｇ／ｌ未満の場合にも形態学的観点から区別できない小さいサイズのコロニーが観察される。
【００５６】
コロニーの優れた増殖および優れた生存性を確実にするためには、酵母エキスの量および植物系ペプトンの量は、総タンパク態窒素の濃度が少なくとも０.２ｇ／ｌとなるような量である。培地中の植物系ペプトンの量と酵母エキスの量との比は、大きく変化することができ、該培養培地中のタンパク態窒素の濃度が０.８ｇ／ｌを超えない限りは０.１〜９の範囲である。他方、高い濃度では、この比が１未満である場合に固体培地上での細菌懸濁液の拡散が劣るためにコロニーの個別化が劣る。
【００５７】
この固体寒天ベース培地にヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ細菌の不均一集団（すなわち、莢膜を持つ細菌と莢膜を持たない細菌の両方を含有する集団）を接種することによって、１８〜２４時間の培養後に、白色コロニーおよび灰色コロニーが観察され、両者は白色光の光線を用いて透明度によって区別される。白色コロニーは、灰色コロニーよりも多くのＰＲＰを生産する。さらにまた、白色コロニーはまた、ウマの血液を添加したチャコール寒天ベース固体培地から得られたコロニーよりも多くのＰＲＰを生産する（実施例２を参照）。この培地組成物によって、最大量のＰＲＰを生産するコロニーを選別することができるので、この培地組成物は選択培地組成物であると考えられる。
【００５８】
本発明の方法のさらに好ましい実施態様によると、固体培地は、
５〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
０.５〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
１〜１０ｇ／ｌのグルコース、
１〜１０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ ８０、
３〜４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、
０.９〜３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、
０.５〜２ｇ／ｌのＫ2ＳＯ4、
２０〜５００ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ2、
２〜５０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１〜５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、
４〜８ｇ／ｌのＮａＣｌ、
４〜８ｇ／ｌの酵母エキス、および
４〜８ｇ／ｌのエンドウペプトン（ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１以上である）
を含む。
【００５９】
この培地組成物から得られる白色コロニーは、灰色コロニーと比べて最大４００倍のＰＲＰを生産する。制限酵素ＳｍａＩおよびＫｐｎＩを用いてゲノムＤＮＡを消化することによって、それらのｃａｐ遺伝子座を研究した。次いで、実施例３に記載した操作条件に従って、消化産物に対してパルスフィールド電気泳動を行い、次いで、特異的ＰｖｕＩＩプローブを用いて可視化した。驚くべきことに、白色コロニーからの電気泳動プロファイルは全て、４５ｋｂの電気泳動バンドを持っている。１８ｋｂの電気泳動バンドは観察されない。結果として、これらのコロニーのｃａｐ遺伝子座は１８ｋｂ遺伝子のコピーを少なくとも２つ持っており、このことは、白色コロニー由来の細菌集団が完全に莢膜を持つことを意味している。他方、灰色コロニーからの電気泳動プロファイルは、主に１８ｋｂの電気泳動バンドを持っている。この特に好ましい選択培地組成物によって、さらに、細菌集団が完全に莢膜を持っている白色コロニーを選択することができる。
【００６０】
実際、固体培地上での予備培養期を含むＰＲＰ製造方法における収率の向上のためのさらなる手段の１つは、選択固体培地組成物から得られた白色コロニーだけを液体培地に移すことである。好ましくは、本質的に莢膜を持つ細菌からなる白色コロニーを得ることを可能にする固体培地組成物が用いられる。
【００６１】
したがって、好ましい実施態様では、本発明の主題はまた、選択固体培地組成物上で得られた白色コロニーだけを液体培養培地に移すことを含む、ＰＲＰの製造方法である。
【００６２】
特に好ましい実施態様では、これらの白色コロニーは、莢膜を持つ細菌集団に対して安定化の役割を果たす液体培養培地に移される。培養工程が全て、タンパク態窒素源が非動物起源のものである培地または合成プロトポルフィリンＩＸを使用する場合に顕著である動物起源の混入物を含まない培地で行われるということに加えて、この方法によって、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ集団が不均一であって莢膜を持つ細菌と莢膜を持たない細菌の両方を含有する場合にＰＲＰの生産を最適化することもできる。固体培地上での培養の工程によって、完全に莢膜を持つ細菌の集団を含有する白色コロニーを選択することができる。液体培地中でバイオマスを増幅する工程は、上記のように、莢膜を持たない復帰変異体の発生を予防することによって莢膜を持つ細菌の集団を安定化する。そこで、最終的に得られる培養物１リットル当たりのＰＲＰの収量は最大となる（実施例４を参照）。
【００６３】
この方法はまた、完全に莢膜を持つ細菌の集団の生産に用いることができる。この集団のゲノムＤＮＡの電気泳動プロファイルが、ｃａｐ遺伝子座が１８ｋｂ遺伝子のコピーを少なくとも２つ持っていることを示す場合（実施例３のプロトコールを参照）および本発明の選択固体培地組成物へのこの集団のアリコートの接種によって９５％を超える白色コロニー、好ましくは少なくとも９８％の白色コロニーが生産される場合、得られる細菌集団は完全に莢膜を持つ。安定化液体培地（すなわち、莢膜を持たない復帰変異細菌の出現を予防する液体培地）中での細菌増幅の後、得られた細菌集団は、凍結乾燥または凍結によって保存される（この場合、グリセロールのような非動物起源の凍結剤が該培養培地に加えられる）。かくして、完全に莢膜を持つ細菌の均一集団を含有する接種バッチが調製される。このバッチは、動物起源の混入物を含まない培養培地を用いて得られるので生物学的安全性のさらなる保証を与える。これらの接種バッチは、今度は、ＰＲＰを生産することに役立つことができる。
【００６４】
したがって、本発明の主題は、以下のものである：
全ての工程が動物起源の混入物を含まない培地を用いて行われる、ＰＲＰの製造方法。
完全に莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ細菌の集団の製造方法であって、
（ｉ） ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂを、
５〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
０.５〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
１〜１０ｇ／ｌのグルコース、
１〜１０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ ８０、
３〜４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、
０.９〜３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、
０.５〜２ｇ／ｌのＫ2ＳＯ4、
２０〜５００ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ2、
２〜５０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１〜５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ3,・６Ｈ2Ｏ、
４〜８ｇ／ｌのＮａＣｌ、
４〜８ｇ／ｌの酵母エキス、および
４〜８ｇ／ｌのエンドウペプトン（ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１以上である）
を含む固体培地上で培養し；
（ｉｉ） （ｉ）で得られた１つ以上の白色コロニーを、
０.１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
２〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
２〜２０ｇ／ｌのグルコース、
２〜５ｇ／ｌの酵母エキス、
０.４ｇ／ｌ〜１.５ｇ／ｌのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液の形態の無機イオン：Ｎａ+、ＮＨ4+、Ｃａ++、Ｍｇ++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-のカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む液体培養培地に移して培養し、
（ｉｉｉ） （ｉｉ）で得られた細菌培養物を凍結または凍結乾燥させる、
製造方法。
全ての工程が動物起源の混入物を含まない培地によって行われる、完全に莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ細菌の集団の製造方法。
【００６５】
本発明の主題はまた、ＰＲＰの生産のための、この方法に従って得られる莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ細菌の均一集団の使用である。
【００６６】
本発明の主題は、本発明の方法の実施態様の１つから得られるＰＲＰを含む、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌髄膜炎に対するワクチンである。
【００６７】
また、本発明の主題は、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ用の固体培養培地であって、該固体培養培地のタンパク態窒素源が非動物起源のものであり、該固体培養培地が
少なくとも１ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
少なくとも０.５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも０.２ｇ／ｌのタンパク態窒素であるのに十分な量のペプトンおよび酵母エキス（ここで、両者の割合は、培地中の植物系ペプトンの量と酵母エキスの量との比が、培地のタンパク態窒素濃度が０.２ｇ／ｌ〜０.８ｇ／ｌである場合には０.１〜９となり、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１〜９となる割合である）、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態の無機イオン：Ｎａ+、Ｋ+、Ｃａ++、Ｍｇ++、Ｆｅ+++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-のカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む、固体培養培地である。
【００６８】
好ましくは、固体培養培地は、
５〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
０.５〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
１〜１０ｇ／ｌのグルコース、
１〜１０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ ８０、
３〜４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、
０.９〜３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、
０.５〜２ｇ／ｌのＫ2ＳＯ4、
２０〜５００ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ2、
２〜５０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１〜５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、
４〜８ｇ／ｌのＮａＣｌ、
４〜８ｇ／ｌの酵母エキス、および
４〜８ｇ／ｌのエンドウペプトン（ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１以上である）
を含む。
【００６９】
本発明は、結果的に本発明の内容を制限することなく本発明を例示する役割を果たす以下の実施例を考慮してさらに明瞭に理解されるであろう。
【実施例】
【００７０】
実施例１： 植物系ペプトンベース培養培地中におけるＰＲＰの生産に対するプロトポルフィリンＩＸの影響
１）方法
ヘム源がヘミンもしくは二ナトリウム塩形態の動物起源のプロトポルフィリンＩＸ（ブタプロトポルフィリン）であるか、または二ナトリウム塩形態の純粋な合成起源のプロトポルフィリンＩＸである液体植物系ペプトンベース培養培地中での１６時間の細菌培養の後に得られたＰＲＰの生産を比較した。培養培地中のヘミンおよびプロトポルフィリンＩＸ濃度範囲は、試験したヘム源の関数としておよび試験した植物系ペプトンの関数としてＰＲＰ滴定曲線を得ることができるように約０.０１０ｇ／ｌから約２ｇ／ｌまで変化する。Ｋｅｒｒｙによって供給されたエンドウペプトンの酵素的加水分解物（Ｈｙ ｐｅａ ７４０４）およびＯｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅによって供給されたコムギペプトン（１９５５９）を０.８７ｇ／ｌのタンパク態窒素と等価の培養培地中濃度で試験した。現行のＰＲＰ生産条件を参照して、漸増濃度のヘミンの存在下でＳｏｌａｂｉａによって供給されたカゼイン加水分解物（ＨＡＣ）のような動物起源のペプトンを０.８７ｇ／ｌのタンパク態窒素と等価の濃度で含有する培地中でのＰＲＰの生産を測定した（表３を参照）。
【００７１】
１.１）培地の調製
１.１.１. 限外濾過水中１ｇ／ｌのβ−ＮＡＤ（Ｆｌｕｋａ）の貯蔵溶液を、次いで、０.２２μｍで濾過滅菌した。
１.１.２. 溶解を補助するために２５％アンモニア水（Ｃｏｏｐｅｒ）５ｍｌを含む限外濾過水中０.２５／ｌのヘミン（Ｓｉｇｍａ）の貯蔵溶液。該貯蔵溶液を０.２２μｍで濾過滅菌する。
１.１.３. 溶解を促進するために２５％アンモニア水（Ｃｏｏｐｅｒ）５ｍｌを含む限外濾過水中０.２５ｇ／ｌのブタプロトポルフィリンＩＸ（Ｓｉｇｍａ）の貯蔵溶液。該貯蔵溶液を０.２２μｍで濾過滅菌する。
１.１.４. 溶解を促進するために２５％アンモニア水（Ｃｏｏｐｅｒ）５ｍｌを含む限外濾過水０.２５ｇ／ｌの合成プロトポルフィリンＩＸの貯蔵溶液。該貯蔵溶液を、０.２２μｍで濾過滅菌する前に完全に溶解するために撹拌しながら水浴中にて８０℃に加熱した。２００７年３月３０日に出願した出願番号第０７／０２３３４号のフランス特許出願に記載されたスキーム２に記載の工程を用いる方法に従ってプロトポルフィリンＩＸを二ナトリウム塩形態で合成した。
【００７２】
ヘミンの貯蔵溶液およびプロトポルフィリンＩＸの貯蔵溶液を、濾過滅菌後の各活性化合物の含有量についてチェックした。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってプロトポルフィリンＩＸ含有量およびヘミン含有量を決定した。クロマトグラフィーチェーンは、二成分勾配液の形成を可能にするツインヘッドポンプモジュール、プログラマブル自動注入装置、ダイオードアレイＵＶ検出器およびクロマトグラフィーカラム（タイプＳｙｎｅｒｇｉ ４μｍ、Ｐｏｌａｒ ＲＰ−８０Ａ（１５０×４.６）ｍｍ、ｒｅｆ ００Ｆ−４３３６−Ｅ０、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を含む。
【００７３】
濾過後にチェックされるべきヘミン（Ｓｉｇｍａ）の貯蔵溶液を蒸留水で３倍に希釈する。濾過後にチェックされるべきブタプロトポルフィリンＩＸ（Ｓｉｇｍａ）の貯蔵溶液および合成プロトポルフィリンＩＸの貯蔵溶液を蒸留水で４倍に希釈する。並行して、ＳｉｇｍａからのブタプロトポルフィリンＩＸ（ｒｅｆ： ２５８３８−５）でアンモニア水中プロトポルフィリンＩＸ０.０２５ｇ／ｌ〜０.１２５ｇ／ｌの範囲のキャリブレーションシリーズを調製し、Ｓｉｇｍａからのヘミン（ｒｅｆ： Ｈ５５３３−２５６）でヘミン０.０５０ｇ／ｌ〜０.１５０ｇ／ｌのキャリブレーションシリーズを調製する。チェックされるべき試料およびキャリブレーションシリーズの種々の溶液を２０μｌ（ヘミン溶液および試料について）および５μｌ（プロトポルフィリンＩＸ溶液および試料について）の容量で注入する。アセトニトリルおよび１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ｐＨ ２.５の混合物からなる初期移動相を流速１ｍｌ／分で設定する。次いで、波長４００ｎｍで検出される目的分子を分取するために、この移動相から不連続勾配液を調製する。キャリブレーションシリーズを確立した後、チェックされるべき試料についてのピークの表面積に基づいて、そこから種々の濾過貯蔵溶液中のヘミン濃度およびプロトポルフィリンＩＸ濃度を推定し、 それぞれ、ヘミン溶液については０.２９５ｇ／ｌであり、ブタプロトポルフィリンＩＸ溶液については０.１８７ｇ／ｌであり、合成プロトポルフィリンＩＸ溶液については０.２４９ｇ／ｌであった。これらの濃度は、その後、標的濃度０.２５０ｇ／ｌに調節されなかったが、ヘミンの貯蔵溶液およびプロトポルフィリンＩＸの貯蔵溶液中に実際に存在するこれらの濃度は結果の解析に使用した。
【００７４】
１.１.５. 限外濾過水中１２５μｇ／ｌの自己消化酵母エキス（Solabia）の貯蔵溶液を、次いで、０.２２μｍで滅菌した。
１.１.６. 限外濾過水中４６５.１２ｇ／ｌのグルコースの貯蔵溶液を、次いで、０.２２μｍで濾過滅菌した。
１.１.７. 濃縮溶液
それは、酵母エキスの貯蔵溶液４０ｍｌ、グルコースの貯蔵溶液４３ｍｌおよびβ−ＮＡＤの貯蔵溶液５ｍｌからなる。
１.１.８. 基本培地
基本培地１リットル当たりタンパク態窒素０.９５ｇ相当を提供するのに十分な量のコムギ植物系ペプトン（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ−Ｒｅｆ １９５５９）またはエンドウ植物系ペプトン（Ｋｅｒｒｙ−Ｒｅｆ Ｈｙｐｅａ ７４０４）（ここで、タンパク態窒素の量はｋｊｅｄｈａｌ法に従ってアッセイした）、
乳酸ナトリウムの５０％水溶液（ＶＷＲ）： １.８ｍｌ、
リン酸水素二ナトリウム・１２Ｈ2Ｏ（Ｂｕｄｅｎｈｅｉｍ）： ３１.１４ｇ、
リン酸二水素ナトリウム・２Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ）： ２.０３ｇ、
Ｌ−シスチン（Ｊｅｒａ Ｆｒａｎｃｅ）： ０.０７ｇ、
３７％ＨＣｌ（ＶＷＲ）： ０.０７ｍｌ、
Ｌ−トリプトファン（Ｊｅｒａ Ｆｒａｎｃｅ）： ０.０２ｇ、
硫酸アンモニウム： １ｇ、
硫酸マグネシウム・７Ｈ2Ｏ： ０.４ｇ、
塩化カルシウム・２Ｈ2Ｏ： ０.０２ｇ／ｌ、
限外濾過水： １リットルにするのに十分な量。
最後に、基本培地を、オートクレーブを使用して１２１℃で３０分間滅菌する。
【００７５】
１.２）操作プロトコール
５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で培養を行った。種々の培養培地中の試験したヘミン（またはプロトポルフィリンＩＸ）の理論濃度が１０μｇ／ｌ〜約２０００μｇ／ｌとなるように、各エルレンマイヤーフラスコ中にコムギペプトンまたはエンドウペプトンを含有する基本培地１００ｍｌ、濃縮培地８.８ｍｌ、および可変量のヘミン貯蔵溶液、ブタプロトポルフィリンＩＸ貯蔵溶液または合成プロトポルフィリンＩＸ貯蔵溶液を導入した（表１および２を参照）。各エルレンマイヤーフラスコに１０8〜１０10細菌／ｍｌを含有するヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂの凍結製品の内容物を０.２％（Ｖ／Ｖ）の接種率で接種する。インキュベーター中、３７℃にて１７５ｒｐｍで撹拌しながら１６時間インキュベートした後、少量の培養上清を回収することによって、各エルレンマイヤーフラスコ中にて得られた細菌懸濁液のＯＤおよびＰＲＰ濃度を測定する。
【００７６】
１.３) ＰＲＰのアッセイ
サンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイに基づいて二重に培養上清のＰＲＰ生産力を決定した。
ＥＬＩＳＡマイクロプレートを、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型細菌で過剰免疫したウサギから免疫血清の溶液（あらかじめ０.２Ｍ炭酸塩緩衝液ｐＨ９.６で希釈しておいた（希釈率：約１／２０００））１００μｌを各ウェルに導入して＋４℃で一夜感作する。ＥＬＩＳＡマイクロプレートをすすぎ、飽和した後、各マイクロプレート中にて、蒸留水中１ｍｇ／ｍｌのＰＲＰ精製溶液から、希釈緩衝液（ＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／１％ウシ血清アルブミン）による連続希釈液を生成することによってキャリブレーションシリーズを調製する。アッセイされるべき培養上清も希釈緩衝液による連続希釈を行って導入する。３７℃で約２時間、さらにインキュベートし、次いで、マイクロプレートをすすいだ後、破傷風タンパク質とコンジュゲートとしたヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌ワクチンを接種したウサギの血清をビオチン化剤で処理して得たビオチン化ウサギ抗体の溶液（あらかじめ希釈緩衝液で希釈しておいた（希釈率：約１／５００））１００μＬをマイクロウェルに導入する。３７℃で１時間インキュベートし、次いで、すすいだ後、各マイクロウェルに、ペルオキシダーゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｒｅｆ ７１００−０５）と結合したストレプトアビジンの溶液（あらかじめ希釈緩衝液で希釈しておいた（希釈率：約１／５０００））１００μｌを添加する。３７℃で１時間インキュベートし、すすいだ後、各マイクロウェルに可視化溶液（０.０３％の過酸化水素０.３μｌを加えた０.０５Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液（ｐＨ＝５）中０.４ｍｇ／ｍｌのオルト−フェニレンジアミンの溶液）１００μｌを添加する。光から保護した２０分間の可視化時間の後、２ＮのＨ2ＳＯ4 ５０μｌ／ウェルを添加することによって反応を遮断する。４９２および６２０ｎｍでマイクロプレートを測定する（プラスチックの吸光度を考慮するため）。キャリブレーションシリーズによる補間によって、試験した試料について得られた光学密度値から、種々の培養上清中のＰＲＰ含有量を決定する。
１.４) 結果
結果を表１および２ならびに図１および２に示す。
【００７７】
【表１】
【００７８】
【表２】
【００７９】
【表３】
【００８０】
図１は、表１の結果を示しており、エンドウペプトンを含有する培地において使用されたヘム源およびその濃度の関数として得られたＰＲＰ生産曲線を示す。ＰＲＰ生産曲線は、ヘム源として合成プロトポルフィリンＩＸを用いても動物起源のプロトポルフィリンＩＸを用いても同等である。他方、培地がヘミンを含有する場合のＰＲＰの生産は、プロトポルフィリンＩＸを含有する培地の場合に比べると実質的に低く、このことは、試験された濃度範囲全体で言える。最適なＰＲＰ生産（約４８０ｍｇ／ｍｌ）を得るために使用されるプロトポルフィリンＩＸは約２００μｇ／ｌにすぎないが、ＰＲＰの最大生産を得るために必要なヘミンは約２５００μｇ／ｌである。したがって、ＰＲＰの最大生産を得るためにエンドウペプトンをベースとする培養培地中に必要とされるプロトポルフィリンＩＸはヘミンの約１２.５分の１である。
【００８１】
図２は、表２の結果を示しており、コムギペプトンを含有する培地において使用されるヘム源およびその濃度の関数として得られたＰＲＰ生産曲線を示す。ＰＲＰ生産曲線は、ヘム源として合成プロトポルフィリンＩＸを用いても動物起源のプロトポルフィリンＩＸを用いても同等である。他方、培地がヘミンを含有する場合のＰＲＰの生産は、等しい濃度のプロトポルフィリンＩＸを含有する培地の場合に比べると低く、これは、ヘミン濃度が低いほどより明らかに現れる。最適なＰＲＰ生産（約４００ｍｇ／ｍｌ）を得るために使用されるプロトポルフィリンＩＸは約１００μｇ／ｌにすぎないが、ＰＲＰの等価な生産を得るために必要なヘミンは約１５００μｇ／ｌである。したがって、ＰＲＰの最大生産を得るためにコムギペプトンをベースとする培養培地中に必要とされるプロトポルフィリンＩＸはヘミンの約１５分の１である。
【００８２】
表１、２および３の結果はまた、培養上清中にて同濃度のＰＲＰを得るためには、現在推奨されているＰＲＰ生産用培地組成物である動物系ペプトンおよびヘミンをベースとする培地中のヘミン濃度が、コムギペプトンまたはエンドウペプトンのような植物系ペプトンをベースとする培地中に必要なプロトポルフィリンＩＸの濃度の２〜５倍必要であることを示している。例えば、カゼインの加水分解物およびヘミンをベースとする培地中にて約４００ｍｇ／ｌのＰＲＰ濃度を得るためには、ヘミン濃度は少なくとも５００μｇ／ｌでなければならないが、コムギペプトンまたはエンドウペプトンおよびプロトポルフィリンＩＸをベースとする培地中では約１００μｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ濃度で十分である。したがって、植物系ペプトンおよびプロトポルフィリンＩＸをベースとする培地は、動物ペプトンおよびヘミンを含有する培養培地よりも有利であり、ＰＲＰの生産に役立つと考えられる。
【００８３】
実施例２： コロニーによるＰＲＰの生産に対する固体培地の組成の影響
約１０8細菌を含有するヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ細菌の均一集団の凍結乾燥品をＤｕｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ ｒｅｆ １４０４０−０８３）１ｍｌに取り込む。この緩衝液で１０倍段階希釈を行う。希釈液（１０-5、１０-6および１０-7）各５０μｌを回収し、種々の本発明の選択固体培地組成物を入れたペトリ皿、または１０％（ｖ／ｖ）の脱線維素処理して沸騰処理したウマの血液（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｒｅｆ ５５８３２）を加えたチャコール寒天を含有する標準固体培地（Ｄｉｆｃｏ、Ｒｅｆ ２８９４１０）を入れたペトリ皿に接種する。
【００８４】
１０％ＣＯ2を入れたインキュベーター中にて３７℃で一夜インキュベートした後、７５Ｗランプ下で透明度によってコロニーを試験する。ペトリ皿は密閉されている。コロニーは、標準培地上では不透明であり、均一である。他方、選択培地上では白色コロニーおよび灰色コロニーが観察される。標準固体培地から４つのコロニーをランダムに回収し、１リットル当たりの組成が以下のとおりの２つの試験選択培地（ＡおよびＢ）から４つの灰色コロニーと４つの白色コロニーを回収した。
【００８５】
【表４】
【００８６】
回収した各コロニーのＰＲＰ含有量をパルスフィールドアンペロメトリック検出（ＨＰＡＥＣ／ＰＡＤ）クロマトグラフィーと結合した高速クロマトグラフィーによってアッセイする。
ＰＲＰの定量化は、多糖類の反復単位の成分の１つであり、酸加水分解後に定量的に遊離されるリビトールをアッセイすることによって行われる。
【００８７】
２.１） 試料の調製
各コロニーを限外濾過水５００μｌに取り込み、次いで、該懸濁液１００μｌを回収し、限外濾過水３００μｌで希釈する。
【００８８】
２.２） キャリブレーションシリーズの調製
限外濾過精製水中１ｍｇ／ｌのリビトール貯蔵溶液を用いて開始し、０〜２０μｇ／ｍｌの範囲のリビトールキャリブレーションシリーズを調製する。キャリブレーションシリーズの各試料の最終容量は４００μｌである。
【００８９】
２.３） 酸加水分解
各試料調製物またはキャリブレーションシリーズの各試料に１０Ｎのトリフルオロ酢酸溶液１００μｌを加える。１２０℃で２時間、加水分解を行う。次いで、全ての管を窒素流下で乾燥させ、分析時に各乾燥物を限外濾過精製水４００μｌ中に取り込む。
【００９０】
２.４） ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラフィーによる分析
あらかじめ４８０ｎＭ水酸化ナトリウム溶液で平衡化しておいた分析カラムＣＡＲＢＯＰＡＣ ＭＡ１（４×２５０ｍｍ）（ＤＩＯＮＥＸ ＃ ４４０６６）上に各加水分解物１００μｌを注入する。該カラムに１Ｍ水酸化ナトリウム４８％および限外濾過精製水溶液５２％を含有する溶液を流速０.４ｍｌ／分で４０分間流して、ＰＲＰの２つの構成単糖を溶離する。カラムの温度は、分析の期間全体で３０℃に維持される。単糖は、アンペロメトリーセルと結合したＥＤ４０マルチモード電気化学検出器（ＤＩＯＮＥＸ ＃４４０９４）を用いて検出される。
【００９１】
これらの条件下で、ＰＲＰの加水分解の間に遊離したリビトールに対応するクロマトグラフィーピークは１９±５％分で現れる。
キャリブレーションシリーズからキャリブレーション曲線（クロマトグラフィーピークの表面積の関数としてのリビトールの量）を確立し、次いで、各試料調製物中に含まれるリビトールの量を補間によって決定する。それから各試料に含まれるＰＲＰの量を推定し、次いで、各コロニー中のＰＲＰ濃度を推定して、リビトールがＰＲＰの重量の４１％であることが分かる。
【００９２】
２.５） コロニーのバイオマスの決定
ＭｉｃｒｏＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）に従って決定した各コロニーのタンパク質含有量は、各コロニーのバイオマスを反映する。そのために、コロニーを個々に回収し、次いで、滅菌限外濾過水２００μｌ中に取り込む。該混合物を３０秒間ボルテックス撹拌する。試料（１０μｌ〜４０μｌ）を回収し、製造者の推奨に従ってＭｉｃｒｏＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質アッセイを行う。１００μｇ／ｍｌのウシアルブミン血清からキャリブレーションシリーズを調製する。分光光度計にて５６２ｎｍで試料およびキャリブレーションシリーズを測定する。キャリブレーションシリーズを用いて、コロニー１つ当たりのμｇで表される試料のタンパク質濃度を算出する。
【００９３】
２.６） 結果
タンパク質マスの単位（μｇで表される）当たりのＰＲＰのμｇで表される結果を下記表に記載する。
【００９４】
【表５】
【００９５】
＊： タンパク質マス単位（μｇ）と比べて表されるコロニーによって生産されるＰＲＰの量（μｇ）を表す。
Ｎ.Ｄ.： アッセイしていない
【００９６】
コロニーによるＰＲＰの生産が高いほど、タンパク質マスの単位当たりのアッセイしたＰＲＰの量は高くなる。これらの結果は、白色コロニーによるＰＲＰの生産がチャコール寒天から回収されたコロニーの生産の３〜５倍であることを示している。他方、灰色コロニーが生産するＰＲＰの量は、一般的に、チャコール寒天から回収されたコロニーよりも低い。
【００９７】
実施例３： 液体培地中のＰＲＰの生産に対する選択固体培地上での培養工程の影響
２つのＰＲＰ生産方法を比較した。第一の方法では、貯蔵集団と称されるヘモフィルス・インフルエンザｂ型細菌の集団の凍結品の内容物（約１０8細菌／ｍｌ）を本発明の液体培養培地に直接接種する。あらかじめ貯蔵集団の特徴を分析しておいた（次の段を参照）。第２のプロトコールでは、莢膜を持つ細菌を１００％含有する白色コロニーから娘集団を選択することを可能にする本発明の選択固体培地を用いて貯蔵集団から娘集団を調製する。次いで、娘集団を貯蔵集団と同じ培養培地に接種する。次いで、貯蔵集団および娘集団によるＰＲＰの生産を測定し、第３工程で比較する。
【００９８】
３.１）貯蔵集団の特徴
３.１.１： ｃａｐ遺伝子座の分析
３.１.１.１： 試薬
細菌溶解緩衝液
Ｐｅｔｔ ＩＶ緩衝液： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４、１Ｍ ＮａＣｌ
１Ｘ溶解溶液： ６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７.４、１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５％Ｂｒｉｊ ５８、０.２％サルコシル、５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、１μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ
ＥＳＰ溶液： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼ
ＴＥ溶液： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ
酵素消化
ＳｍａＩ：（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ Ｒｅｆ： １５２２８−０１８）
１０Ｘ消化緩衝液４：（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、酵素を供給） − 使用時にヌクレアーゼを含まない滅菌精製水で１０倍希釈する
ＫｐｎＩ：（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｒｅｆ： １５５２３２−０３６）
１０Ｘ消化緩衝液４：（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｒｅｆ： １５５２３２−０３６） − 使用時にヌクレアーゼを含まない滅菌精製水で１０倍希釈する
パルスフィールド電気泳動緩衝液
１０Ｘ ＴＢＥ緩衝液： ８９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４、８９０ｍＭホウ酸、２５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０ − 使用時に限外濾過水で２０倍希釈する
ジゴキシゲニンで標識したＰｖｕＩＩプローブ：
プラスミドｐＢＲ３２２−ｐＵ０３８（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ − Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ − Ｊｏｈｎ Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から得たＤＮＡ調製物から特異的標識ＰｖｕＩＩプローブを得た。プラスミドＤＮＡ２０μｇを、あらかじめヌクレアーゼを含まない滅菌水で１０倍希釈した１０Ｘ緩衝液４（ＮＥＢＩＯＬＡＢＳ Ｒｅｆ． ＃Ｂ７００２−Ｓ）中、４０単位の酵素ｐｖｕＩＩ（ＮＥＢＩＯＬＡＢＳ Ｒｅｆ． ＃Ｒ０１５１−Ｓ）の存在下、３７℃で２時間消化した。次いで、消化生成物を１％重量／容量で、０.２５％容量／容量のブロモフェノールブルー、０.２５％容量／容量のキシレンシアノールＦＦ、および３０％容量／容量のグリセロールを加えた１Ｘ ＴＡＥ緩衝液の存在下でアガロースゲルにて電気泳動処理した。移動の終わりに、ＰｖｕＩＩ ＤＮＡフラグメントに対応する目的の２.１ｋｂバンドを回収する。次いで、「Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ」カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｌｇｅｌ Ｒｅｆ： ７４０５９０.２５０）に通すことによってアガロースゲルからＤＮＡを抽出し、次いで、２６０ｎｍで分光光度測定して、その完全性をチェックする。最後に、標識化キット「ＤＩＧ−Ｃｈｅｍ−Ｌｉｎｋ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｔ」（ＲＯＣＨＥ Ｒｅｆ： １８３６４６３）を用いて、ＰｖｕＩＩプローブをジゴキシゲニンで標識する。標識プローブを−２０℃で貯蔵する。
【００９９】
３.１.１.２： 操作プロトコール
貯蔵集団のアンプルを解凍し、１０％（ｖ／ｖ）脱線維素して沸騰したウマの血液（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ｒｅｆ ５５８３２）を加えたチャコール寒天（Ｄｉｆｃｏ、ｒｅｆ ２８９４１０）からなる標準固体培地を入れたペトリ皿に接種する。１０％ＣＯ2を入れたインキュベーター中にて３７℃で１８時間インキュベートした後、得られたコロニーを回収し、ＯＤ６８０ｎｍが約１.８となるようにＰｅｔｔ ＩＶ緩衝液に懸濁する。細菌懸濁液を２％（ｖ／ｖ）の低融点アガロース（Ｒｅｆ： ＢｉｏＲａｄ、ｒｅｆ １６２−０１３８）と混合し、５０℃でテンパリングし、次いで、この混合物を約８０μｌ／プラグの量でプラグモールド（ＢｉｏＲａｄ Ｒｅｆ： １７０−３７１３）中に分配する。かくして全細菌を含有するアガロースモールドが得られる。各プラグを１Ｘ溶解溶液１ｍｌ中に置く。３７℃で６時間インキュベートした後、この溶液をＥＳＰ溶液１ｍｌと取り換える。５０℃で一夜さらにインキュベートした後、各プラグをＴＥ溶液４ｍｌで３０分間、３回洗浄する。次いで、各プラグに含まれている溶解した細菌のゲノムＤＮＡを、酵素ＳｍａＩ（ＧＩＢＣＯ −ＢＲＬ Ｒｅｆ： １５２２８−０１８）２０単位を含有する１Ｘ消化緩衝液４（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）３００μｌを用いて２５℃で一夜消化し、次いで、ＴＥ溶液４ｍｌで洗浄する。酵素ＫｐｎＩ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ｒｅｆ： １５５２３２−０３６）２０単位を含有する１Ｘ緩衝液４（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｒｅｆ： １５５２３２−０３６）２００μｌを用いて、消化を３０℃で７時間続け、次いで、ＴＥ溶液で洗浄する。これら２つの制限酵素は、細菌ゲノムＤＮＡのｃａｐ遺伝子座を遊離する。消化したプラグを０.８％ｖ／ｖの認定アガロースゲル（ＢＩＯＲＡＤ ｒｅｆ： １６２−０１３８）中に挿入し、次いで、６ボルト／ｃｍ、角度１２０°、リニアプログレッション、初期スイッチ時０.９秒および最終スイッチ時１１.５４秒が適用されるような「Ｃｈｅｆ ｍａｐｐｅｒ」型（Ｂｉｏｒａｄ）セットの装置を用いて、０.５Ｘ ＴＢＥ緩衝液中にて１３時間パルスフィールド電気泳動処理する。製造者の推奨に従って装置「Ｖａｃｕｇｅｎｅ ＸＬ Ｖａｃｕｕｍ ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてセミドライトランスファーによってゲルを正帯電ナイロンフィルター（Ｒｏｃｈｅ Ｒｅｆ： １２０９２７２）に移す。ナイロンフィルター上に移したＤＮＡを３１２ｎｍのＵＶで３分間固化する。次いで、フィルターを「ＤＩＧ ｅａｓｙ ｈｙｂ」緩衝液（Ｒｏｃｈｅ ｒｅｆ： １５８５７３８）中にて４２℃で２時間プレハイブリダイズし、次いで、ジゴキシゲニンで標識した特異的ＰｖｕＩＩプローブを緩衝液１ｍｌ当たり２０〜５０ｎｇ含有する「ＤＩＧ ｅａｓｙ ｈｙｂ」緩衝液中にて４２℃で一夜ハイブリダイズする。このプローブは、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂのｃａｐ遺伝子座を特異的に認識する。次いで、フィルターを、６５℃で低ストリンジェンシー緩衝液を用いて２回洗浄し、次いで、高ストリンジェンシー緩衝液で洗浄する。次いで、キット「Ｄｉｇ−Ｃｈｅｍ−ｌｉｎｋ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｔ」（Ｒｏｃｈｅ）を用いてアルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体の溶液を添加した後、蛍光基質（ＣＤＰ −ｓｔａｒ： Ｒｏｃｈｅ Ｒｅｆ： ２０４１６７７）を用いてフィルターを可視化する。得られた電気泳動プロファイルを図３に示す。１８ｋｂおよび４５ｋｂの２つのバンドが観察され、これは、貯蔵集団のｃａｐ遺伝子座の構造が不均一であることを示している。集団の一部は、４５ｋｂの電気泳動バンドに対応する、１８ｋｂ遺伝子のコピーを２つ持っているｃａｐ遺伝子座を有しており、残りは、１８ｋｂの電気泳動バンドに対応する、非二重形態のｃａｐ遺伝子座を有している。結果的に、貯蔵集団は、莢膜をもつ細菌と莢膜を持たない細菌の混合物である。この不均一さは、さらにまた、選択固体培地上に貯蔵集団を接種した後に得られる白色コロニーのパーセンテージを測定するための試験を用いて確認される（実施例２を参照）。
【０１００】
３.２）選択固体培地上での貯蔵集団の培養： 選択固体培地上で白色コロニーを形成する細菌のパーセンテージの測定および本質的に莢膜を持つ細菌からなる娘集団の誘導
３.２.１）白色コロニーを形成する細菌のパーセンテージの測定
選択固体培地上で培養する工程および得られたコロニーの形態学的分析は、実施例２に記載した同操作条件に従って行われる。選択固体培地の組成は、実施例２の選択培地Ａのものに対応する。
可視化されたコロニー１００個当たりの白色コロニーの数を決定する。コロニーの６０％が白色コロニーの形態であり、これにより、最初の貯蔵溶液が不均一であり、かつ、莢膜をもつ細菌および莢膜を持たない細菌の混合物を含有することが実際に裏付けられる。
【０１０１】
３.２.２）娘集団の選択および特徴付け
３.２.２.１）娘集団の選択
選択固体培地Ａ上で１８〜２４時間培養した後に得られた白色コロニーをＢａｃｔｏ寒天を含まない選択固体培地と同一の液体培地の組成物２ｍｌが入っている管に接種する。振盪しながら３７℃で２０時間さらにインキュベートした後、管の内容物を、１リットル当たりの組成が以下のとおりの本発明の液体培地５０ｍｌが入っているエルレンマイヤーフラスコに移す：
β−ＮＡＤ： ５ｍｇ
プロトポルフィリンＩＸ： １ｍｇ
グルコース： ２０ｇ
酵母エキス： ５ｇ
エンドウペプトン（Ｈｙｐｅａ ７４０４（Ｑｕｅｓｔ））：７.４２ｇ
乳酸ナトリウムの６０％水溶液： １.４９ｍｌ
シスチン： ０.０７ｇ
トリプトファン： ０.０２ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ： ３１.１４ｇ
ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ： ２.０３ｇ
(ＮＨ4)2ＳＯ4： １ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ： ０.４ｇ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ： ０.０２ｇ
エルレンマイヤーフラスコを振盪しながら３７℃のインキュベーター中に置く。６００ｎｍのＯＤが２に近い場合には、細菌懸濁液中の最終濃度が２０％（ｖ／ｖ）となるような量のグリセロールを添加する。該細菌懸濁液１ｍｌをＮｕｎｃ管中に分配した後、−７０℃で冷凍する。かくして、選択固体培地の組成物上で得られた白色コロニーから生産されて貯蔵集団の細菌に由来する娘細菌集団が凍結品の形態で得られる。
【０１０２】
３.２.２.２）娘細菌集団の特徴付け
パラグラフ３.１.１.２に記載したプロトコールに従って娘集団のｃａｐ遺伝子座の分析を行った。電気泳動プロファイルは、４５ｋｂの単一バンドを示し、娘集団のｃａｐ遺伝子座が本質的に１８ｋｂ遺伝子の二重形態であることを示している（図３を参照）。結果的に、娘細菌集団は、本質的に莢膜を持つ細菌からなっている。選択固体培地に接種した場合に白色コロニーを１００％生産するということによって、この集団の均一性が確認される。
【０１０３】
３.３）貯蔵集団の細菌および娘集団の細菌によるＰＲＰの生産の比較
貯蔵集団または娘集団から得た約１０10細菌が入っているアンプルの内容物を、パラグラフ３.２.２.１で示した組成の液体培地２００ｍｌが入っているエルレンマイヤーフラスコに直接接種する。
振盪（１７５ｒｐｍ）しながら３７℃＋／−１℃で２４時間インキュベートした後、培養上清を回収し、次いで、実施例１に記載の方法に従ってＥＬＩＳＡによりＰＲＰ濃度を決定する。同試験を３回繰り返す。結果を下記表に示す。示された値は、３回の試験の平均値である。
【０１０４】
【表６】
＊： ｍｇ／ｌで表される結果。
【０１０５】
結論： 莢膜を持つ細菌の均一集団からなる娘集団によるＰＲＰの生産は約３倍増加する。結果的に、莢膜を持つ細菌を１００％含有する白色コロニーを選択することを可能にする選択固体培地上での培養工程を使用する方法によって、得られるＰＲＰ収量が増加する。この方法はまた、莢膜をもつ細菌および莢膜を持たない細菌の混合物を含有する初期集団から完全に莢膜を持つ細菌集団を構成するために用いることができる。
【０１０６】
実施例４： 細菌集団およびＰＲＰ生産に対する安定化培養培地の役割
出発細菌集団は、ｃａｐ遺伝子座が１８ｋｂ遺伝子のコピーを少なくとも２つ持っており、選択固体培地上で白色コロニーを１００％生産する、完全に莢膜を持つ細菌の集団からなる。
【０１０７】
４.１） 操作プロトコール
パラグラフ３.２.２.１の操作プロトコールに従って選択された娘集団から得られた細菌を１ｍｌ当たり１０8〜１０10個含有する凍結品の内容物を、パラグラフ３.２.２.１に示した組成の液体培地５００ｍｌが入っている１リットルの発酵槽に接種する。振盪しながら３７℃で１４時間インキュベートした後、第１の培養物を、初期ＯＤが０.３となるように同液体培地５００ｍｌが入っている第２の１リットルの発酵槽に移す。同条件下で約５時間さらにインキュベートした後（得られたＯＤ値は約４）、第２の培養物を、初期ＯＤが０.３となるように培地５００ｍｌが入っている第３の１リットルの発酵槽に移し、次いで、約３時間インキュベートした後（得られたＯＤ値は約４）、同液体培地５００ｍｌが入っている第４の１リットルの発酵槽中に注ぐ。この操作プロトコールは、通常ＰＲＰの工業的生産のために１３０００リットルの発酵槽中で行われる工程の研究室スケールへの適応である。
【０１０８】
各培養の終わりに、慣用的な式Ｎ＝Ｌｏｇ Ｘ／Ｘ０ ｘ １／Ｌｏｇ ２（式中、Ｘは培養の終わりのバイオマスを表し、Ｘ０は、培養開始時のバイオマスを表す）を用いて細菌世代数を算出する。１リットルの発酵槽中での第４の培養の終わりに得られた累積細菌世代数は、実際、１３０００リットルの発酵槽における培養の終わりに得られた細菌世代数に対応する。各培養の終わりに、実施例３に記載の方法に従って、ｃａｐ遺伝子座を特徴付け、選択固体培地上で白色コロニーを形成する細菌のパーセンテージを決定した。得られた結果を下記表にグループ分けする。
【０１０９】
【表７】
【０１１０】
第４の培養物の終わりの累積世代数は２４.０９世代である。
継代培養は細菌集団の特徴を変えず、細菌集団は継代培養の間じゅう完全に莢膜を持ったままである。ＰＲＰの生産もまた、非常に高いレベルで培養の間じゅう安定したままである。したがって、培養の間じゅう細菌集団の特徴は感知できるほど変化しないので、この培地の組成は莢膜を持つ細菌集団に対して安定化の役割を果たす。
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、タンパク態窒素源が少なくとも１つの植物系ペプトンを含んでおり、かつ、ヘム源がプロトポルフィリンＩＸからなっている、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）ｂ型菌用の培養培地である。本発明はまた、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌髄膜炎に対するワクチンの製造に用いるポリリボシル・リビトール・リン酸（ＰＲＰ）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
莢膜は、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌株の病原性の主要因子である。それは、リボシル・リビトール・リン酸の反復単位の連続からなる多糖である。ポリリボシル・リビトール・リン酸（ＰＲＰ）または莢膜多糖体ｂ型なる表現は、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌莢膜を示すために互換的に用いられる。
【０００３】
ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌集団は、しばしば、不均一であり；莢膜を持つ細菌と莢膜を持たない細菌とが共存する。莢膜を持たない細菌は、自然に生じる遺伝子変異の結果、それらの莢膜を発現する能力を喪失した。Hoisethら（非特許文献１）によると、莢膜発現の喪失は、細菌の各世代で０.１〜０.３％の頻度で生じる。遺伝子レベルでは、ｃａｐ遺伝子座がこれらの細菌の表面での莢膜の発現に関与していることを示している（非特許文献２）。莢膜を持つ細菌は、１８Ｋｂ遺伝子のコピーを少なくとも２つ持っているｃａｐ遺伝子座を有する。莢膜を持たない細菌は、もはや、１８Ｋｂ遺伝子またはこの遺伝子のコピーを１つだけでも持ってはいない。莢膜を持つ細菌を同定するために、通常、抗ＰＲＰ抗体の存在下での細菌のスライドガラス上での凝集試験が用いられるか、または、ｃａｐ遺伝子座を特徴付ける分子生物学技術が用いられる。
【０００４】
ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌感染を予防するために、ＰＲＰ由来のワクチン、またはキャリアタンパク質と共有結合したＰＲＰが用いられる。これらのワクチンを製造するためには、大量の培養培地中にて大量の細菌を製造することが必要であり、この培養培地からＰＲＰが抽出され、次いで、精製される。それにもかかわらず、莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザｂ型細菌が莢膜を持たない形態へ復帰する容易さは、ＰＲＰの製造の障害となり得る。
【０００５】
ＰＲＰの工業的製造に関しては、酵母エキス、グルコース、ヘミン、β−ＮＡＤおよび無機塩を添加したタンパク態窒素の主要供給源である動物ペプトンをベースとする培養培地が一般に使用される。例えば、特許文献１に記載されている生産培地が挙げられる。
【０００６】
ＢＳＥに関連するリスクのために、動物起源の製品、さらに詳しくはヒト起源またはウシ起源の製品の代わりにより良好な生物学的安全性を提供する生成物を用いることが求められている。
【０００７】
Cartyら（非特許文献３）は、ＰＲＰの生産に関して動物ペプトンの代わりにダイズペプトンを用いることができることを示している。この培地（ＭＰ培地）の１リットル当たりの組成は以下のとおりである：ダイズペプトン：１０ｇ；酵母イースト：１０ｍｌ；ＮａＣｌ：５ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4：２.５ｇ；Ｎａ2ＨＰＯ4：３.３ｇ；デキストロース：５ｇ；塩化ヘミン：１０ｍｇ；ＮＡＤ：１０ｍｇ。
【０００８】
Takagiら（非特許文献４）は、Ｃａｒｔｙ培地（ＭＰ培地）の組成を最適化することを求めた。彼らは、ヘミンおよびβ−ＮＡＤ濃度が増加した場合に培養培地中のＰＲＰ濃度が７０％増加して０.２５ｇ／ｌに達することができることを示した。したがって、ＰＲＰの生産を増加させるためには、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌の増殖に必要なコファクター（ヘミンおよびβ−ＮＡＤ）濃度を増加させることが必要であると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４,４５９,２８６号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hoiseth et al. Infectious and Immunity (1985), 49: 389-395
【非特許文献２】Kroll, J. S., et al., J. Bacteriol. (1988) 170: 859-864
【非特許文献３】Carty et al. in Dev. Indust. Microbiol. 26: 763-767 (1985)
【非特許文献４】Takagi et al. J. Chem. Tech. and Biotech 81: 182-188 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、特に培養容量が大きい（１００リットル以上）場合に、最良の生物学的安全条件を適用しながら、ＰＲＰを製造する方法を改良することが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明の主題は、タンパク態窒素源が非動物起源のものであり、少なくとも１つの植物系ペプトンを含むことを特徴とし、かつ、ヘム源がプロトポルフィリンＩＸからなることを特徴とする、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌用の新規培養培地である。このような培地は、ＰＲＰの工業的製造に特に適している。それは、動物起源のペプトンの代わりに植物系ペプトンを用いるので、大きな生物学的安全性をもたらす。工業的に利用可能な培養上清中のＰＲＰレベル（０.２ｇ／ｌ以上のレベル）を得るために必要なプロトポルフィリンＩＸはヘミンの１０分の１〜２０分の１であるので、生産コストの偶発性にも対応している。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、動物起源のペプトンの代わりにエンドウペプトンを用いた培養培地におけるＰＲＰ生産レベル（ｍｇ／ｌ）を、ヘミンの濃度（−◆−）または動物起源のプロトポルフィリンＩＸの濃度（−■−）もしくは合成起源のプロトポルフィリンＩＸの濃度（−（黒塗りの三角）−）（μｇ／ｌ）の関数として表す。
【図２】図２は、動物起源のペプトンの代わりにコムギペプトンを用いた培養培地におけるＰＲＰ生産レベル（ｍｇ／ｌ）を、ヘミンの濃度（−◆−）または動物起源のプロトポルフィリンＩＸの濃度（−■−）もしくは合成起源のプロトポルフィリンＩＸの濃度（−（黒塗りの三角）−）（μｇ／ｌ）の関数として表す。
【図３】図３は、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂの種々の細菌集団の電気泳動プロファイルを表す： バンドＭは、１８ｋｂおよび４５ｋｂの２つのバンドを有する不均一な貯蔵集団の電気泳動プロファイルを表し；バンドＦは、４５ｋｂの単一バンドを有する選択固体培地での選択後の娘集団（Ｆ）の電気泳動プロファイルを表し；バンドＢは、４５ｋｂの単一バンドを有する種々の白色細菌コロニー（Ｂ）のプロファイルを表し；バンドＧは、１８ｋｂの単一バンドを有する種々の灰色細菌コロニーの種々のプロファイルを表す。 バンドＭＷは分子量マーカー（ｋｂ）の位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
「ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂの培養のための培地」なる表現は、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂの増殖を促進する培地であって、
タンパク態窒素源、
ヘム源、
β−ＮＡＤ源、
炭水化物源
ビタミンおよび増殖因子の供給源、および
無機塩
を含む培地を意味すると解される。
【００１５】
「タンパク態窒素源」なる表現は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプトンおよび／またはタンパク質の量がこの組成物の乾燥重量の少なくとも５０％である調製物を意味すると解される。
【００１６】
「非動物起源のタンパク態窒素源」なる表現は、非動物起源のものであるタンパク態窒素源を意味すると解される。結果として、該調製物は、動物細胞、動物組織、または動物臓器もしくは動物体からは製造されない。それは、一般に、植物、藻類、細菌、酵母または真菌類から製造される。
【００１７】
本発明の培養培地は、第一に、液体培地を示すが、固体形態のものであってもよい。該固体形態は、液体培地に、通常１０〜３０ｇ／ｌの濃度範囲で使用される寒天のようなゲル化物質を添加することによって得られる。
【００１８】
本発明のヘム源は、式：
【化１】
［式中、Ｒは、Ｈまたは塩、好ましくは、アルカリ金属塩、特に、ナトリウム塩を表す］
で示されるプロトポルフィリンＩＸによって表される。
【００１９】
本発明の場合、プロトポルフィリンＩＸは、鉄と錯体形成していない。これまでＰＲＰの生産に推奨されていた培地は全て、ヘム源として、（ヘムに関する場合）鉄と錯体形成したプロトポルフィリンＩＸ、または（ヘミンに関する場合）ＦｅＣｌと錯体形成したプロトポルフィリンＩＸ、または稀であるが（ヘマチンに関する場合）ＦｅＯＨと錯体形成したプロトポルフィリンＩＸを含有していた。たとえヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ株がプロトポルフィリンＩＸを鉄と錯体形成した形態に変換するフェロケラターゼを有するとしても（Loeb et al., J. Bacteriology (1995), 177; 3613-3615）、工業的に利用可能な濃度でＰＲＰを製造するために、植物系ペプトンをベースとする培養培地中でヘム源として錯体形成していないプロトポルフィリンＩＸを使用することができることは示されていない。ＰＲＰの工業的生産を保証するためには培養上清中に少なくとも０.１〜０.２ｇ／ｌのＰＲＰが必要であると一般に考えられる。
【００２０】
驚くべきことに、ヘム源としてプロトポルフィリンＩＸを使用し、タンパク態窒素源として植物系ペプトンを使用することによって、必要なプロトポルフィリンＩＸ濃度が、ヘム源が鉄と錯体形成したプロトポルフィリンＩＸである場合に使用されるその濃度の１０分の１〜１００分の１となることが観察された。実施例１に示すように、ＰＲＰの最大生産（培養上清中の濃度は約０.４ｇ／ｌである）を得るためには１００〜２００μｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ濃度で十分であるが、等量のＰＲＰ生産を得るためには１０倍から２０倍のヘミン濃度が必要である。さらにまた、プロトポルフィリンＩＸの濃度が１０μｇ／ｌ程度の低さであっても、相当量のＰＲＰの生産が観察されたが、ヘミンの場合にはほんの僅かである。５０μｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸでは、ＰＲＰの生産は、１００μｇ／ｌ（既に工業的規模で使用することができる割合）に達するか、またはそれを超えるが、培養培地が同濃度のヘミンを含有する場合には約１０μｇ／ｌまたはそれ以下である（図１および２を参照）。
【００２１】
したがって、本発明の主題は、
プロトポルフィリンＩＸ濃度が少なくとも０.０１ｍｇ／ｌ、少なくとも０.０２ｍｇ／ｌ、少なくとも０.０３ｍｇ／ｌ、少なくとも０.０４ｍｇ／ｌ、または好ましくは、少なくとも０.０５ｍｇ／ｌである本発明の培養培地
である。
【００２２】
一般に、培養培地中のプロトポルフィリンＩＸ濃度は、０.１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌ、好ましくは、０.１ｍｇ／ｌ〜２ｍｇ／ｌである。これらの濃度範囲において、培養上清中でＰＲＰの最適な生産をもたらすための原料が最適に使用される。
【００２３】
本発明の主題に適しているプロトポルフィリンＩＸは、動物起源のものであってよく、動物（ウシ、ブタおよび同類のもの）の組織から製造され得る。これらの調製物の純度は、一般に、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、さらに好ましくは、少なくとも９５％（重量／重量）である。混入物は、残りの量のアミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質を含有し得るが、存在していてもよい残りの量のアミノ酸、ペプチドおよび／またはタンパク質は一般的に調製物の乾燥重量の５％未満、より一般的には１％未満であるので、該プロトポルフィリンＩＸ調製物は、本発明の目的のためのタンパク態窒素源であるとは考えられない。
【００２４】
好ましくは、より大きな生物学的安全性を確実にするために、動物起源の混入物を含まないプロトポルフィリンＩＸを使用する。このようなプロトポルフィリンＩＸを製造するために、２００７年３月３０日に出願された出願番号第０７／０２３３４号のフランス特許出願に記載されたスキーム２に記載されている工程を用いる製造方法を使用することができる。
【００２５】
別の好ましい実施態様では、本発明の培養培地は、動物起源の混入物を含まないプロトポルフィリンＩＸを含む。
【００２６】
本発明の主題によると、タンパク態窒素の主要供給源は、１つ以上の植物系ペプトンによって表される。それらは、一般に、加水分解物の形態のものである。それらは、タンパク質を最も多く含有する植物の部分から抽出されるタンパク質の酵素的または化学的処理によって得られる。好ましくは、遺伝子組換えされていない植物が用いられる。化学的ルートを用いる場合、方法の一つは、高温状態で加圧下にてタンパク質抽出物を塩酸で処理することである。次いで、該加水分解物を水酸化ナトリウムで中和し、次いで、固体副産物を除去する。酵素的ルートを用いる場合、古典的な方法の一つは、タンパク質抽出物をパパインで処理することである。
【００２７】
植物系ペプトンは、主に、アミノ酸とＭＷが１ＫＤ以下の小ペプチドとの混合物を含有する調製物である。ＭＷが１ＫＤを超えるペプチドは、一般に、該混合物の４０％未満である。必要な場合には、小さいサイズのペプチドを濃縮または選択するために、限外濾過した加水分解物を使用することもできる。１ＫＤ以下、または５００ダルトン以下または３５０ダルトン以下のＰＭを有する加水分解物フラクションを選択するために、限外濾過した加水分解物をさらにクロマトグラフィー処理することもできる。かくして、４０％を超えるペプチド、５０％を超えるペプチド、または６０％を超えるペプチドが１ＫＤ以下、または５００ダルトン以下または３５０ダルトン以下のＰＭを有する植物系ペプトン調製物が得られる。本発明の主題に適している植物系ペプトンは、特に、ジャガイモから得られるもの、例えば、Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅによって供給されるもの（ｐｌａｎｔ ｐｅｐｔｏｎｅ Ｅ１またはｐｌａｎｔ ｐｅｐｔｏｎｅ ＥＴ１）、ダイズから得られるもの、例えば、ＯｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅまたはＫｅｒｒｙによって供給されるもの、ワタから得られるもの（Ｑｕｅｓｔによって供給されるＨｙ ｃｏｔｔｏｎ）、コメから得られるもの（Ｋｅｒｒｙによって供給されるＨｙ ｒｉｃｅ）、Ｓｏｌａｂｉａによって供給されるソラマメから得られるもの、コムギから得られるもの、例えば、Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅによって供給されるもの（ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｏｎｅ Ｅ１）またはＫｅｒｒｙによって供給されるもの（ＨｙｐｅｐTM ４６０２、ＨｙｐｅｐTM ４６０１）、またはエンドウから得られるもの、特に、Ｋｅｒｒｙによって供給されるエンドウの酵素加水分解物（ＨＹ ｐｅａ ７４０４）もしくはＯｘｏｉｄによって供給されるエンドウの酵素加水分解物（ＶＧ １００）、または「Ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｐｅｐｔｏｎｅ」の名称の下に参照されるＯｘｏｉｄによって供給されるエンドウの酸加水分解物である。好ましくは、本発明の主題に適している植物系ペプトンは、コムギペプトンであり、より好ましくは、植物系ペプトンはエンドウペプトンである。
【００２８】
植物系ペプトンを使用するための濃度を定義するためには、ペプトンのタンパク態窒素含有率が考慮される。この含有率は、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法（Lynch JM et al., J AOAC Int. (1999) 82(6):1389-98）を使用して算出される。通常、本発明の主題による植物系ペプトンのタンパク態窒素含有率は、ペプトン１ｇ当たり８％〜１５％（重量／重量）である。この範囲では、本発明の培養培地中の植物系ペプトン濃度が０.０８〜２.２５ｇ／ｌの範囲、好ましくは０.４〜１.５ｇ／ｌの範囲のタンパク態窒素濃度に相当する場合に優れた結果が得られる。
【００２９】
したがって、本発明の主題は、総植物系ペプトン濃度が０.０８ｇ／ｌ〜２.２５ｇ／ｌの範囲のタンパク態窒素濃度と等価である培地である。
【００３０】
β−ＮＡＤ（因子Ｖまたはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとも称される）の供給源としてβ−ＮＡＤ自体の精製調製物またはニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、β−ニコチンアミドアデニンモノヌクレオチド（ＮＭＮ）もしくはβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）から選択されるβ−ＮＡＤの誘導体を含有する精製調製物が使用される。調製物の純度は、一般に、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％である。本発明の場合、好ましくは、動物起源のタンパク質混入物を含まないβ−ＮＡＤ源が使用される。これらの精製調製物は、少なくとも１μＭの濃度で使用される。例えば、β−ＮＡＤは、培養培地１リットル当たり２〜５０ｍｇの範囲の濃度で使用される。
【００３１】
炭水化物源としては、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌によって代謝される糖、例えば、フルクトース、リボース、キシロース、フコース、グリセロール、または特に、グルコースを用いることができる。一般に、炭水化物源は非動物起源のものであり、培養培地中の炭水化物濃度は少なくとも１０ｍＭである。グルコースを使用する場合には、培養培地中のその濃度は、一般に２〜２０ｇ／ｌである。
【００３２】
本発明の培養培地はまた、ビタミンおよび増殖因子の供給源を含む。この目的を達成するために、サッカロミセス・エスピー（Saccharomyces sp）の培養物に由来するビール酵母の自己分解物の可溶性フラクションから得られる酵母エキスが使用される。多数のアミノ酸およびビタミン、例えば、ビタミンＢ５、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、ＰＰ、ＨおよびＢ１２、微量元素およびオリゴヌクレオチド誘導体がその組成物中に見られる。Ｑｕｅｓｔ、ＤｉｆｃｏまたはＳｏｌａｂｉａによって製造されている市販の自己分解酵母エキスが本発明の主題に適している。
【００３３】
本発明の培地中の酵母エキスの濃度は、通常、０.２ｇ／ｌ〜１５ｇ／ｌの濃度範囲内、好ましくは、０.２ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度範囲内、さらに有利には、０.２〜５ｇ／ｌの濃度範囲内である。酵母エキスの濃度が０.２〜５ｇ／ｌの範囲の濃度である場合に細菌によるＲＰＲ生産が良好であることが観察された。
【００３４】
酵母エキスはまた、非動物起源のさらなるタンパク態窒素源でもある。酵母エキス中のタンパク態窒素の含有率は、実際に、一般的に９〜１１％（重量／重量）である。培養の間の毒性廃棄物の蓄積の原因であり得る窒素性の異化亢進を回避するために、植物系ペプトンの濃度および酵母エキスの濃度は、一般に、培地中の総タンパク態窒素含有量が２.５ｇ／ｌを超えないように調節される。好ましくは、植物系ペプトンの濃度および酵母エキスの濃度は、本発明の培地中の総タンパク態窒素含有量が０.５〜２.５ｇ／ｌであるように調節される。
【００３５】
本発明の培養培地はまた、無機塩を含む。使用される無機塩は、一般に、塩溶液の形態であり、それらのうち少なくとも１つは、細菌接種前に、培地の初期ｐＨが６.５〜７.５、最も好ましくは、７〜７.５であるのに十分な緩衝力を発揮する。一般に、モル濃度が１０-2ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲内で変化する塩溶液の形態のＮａ+および／またはＫ+のような一価陽イオン、Ｃａ++および／またはＭｇ++のような二価陽イオン、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-および／またはＰＯ4---形態のリン酸陰イオン、ならびにＳＯ4--およびＣｌ-陰イオンの混合物が使用される。
【００３６】
前段に記載した成分に加えて、本発明の培養培地は、ＰＲＰの生産をネガティブに妨害しないことを条件に１つ以上の他の無機成分および／または有機成分をその組成に取り込むことができると明らかに解される。非常に好ましくは、非動物源由来の成分が導入される。かくして、本発明によると、該培地に、トリプトファンおよび／またはシスチンのような化学合成または微生物発酵によって製造されるアミノ酸、ＮＨ4+イオンをもたらす塩溶液の形態の無機窒素、および／または乳酸ナトリウムのような他の物質を加えることができる。これらの添加物は、一般に、低濃度で使用される。培養培地中のアミノ酸補充は、一般に、１ｍＭ以下の濃度である。同様に、アンモニウム塩および／または乳酸ナトリウムは、一般に、１０ｍＭ以下の濃度である。最後に、鉄は植物系ペプトンおよび酵母エキスの組成物中に既に十分な量で存在しているので鉄イオンの形態の鉄の供給によって本発明の培養培地に補充するのは必要ではないが、万一に備えて、細菌増殖の間に生じる可能性のある鉄不足を回避するために０.５〜１０ｍｇ／ｌの範囲であり得る濃度範囲で鉄塩の溶液を培養培地に加えることは可能である。
【００３７】
有利には、本発明の培養培地は、ヒト起源もしくはウシ起源のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはアミノ酸を含まないか、または、動物起源のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはアミノ酸を含まないか、または、より有利には、動物起源の混入物を含まない。
【００３８】
特定の実施態様によると、本発明の主題は、
０.１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
２〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
２〜２０ｇ／ｌのグルコース、
２〜５ｇ／ｌの酵母エキス、
０.４ｇ／ｌ〜１.５ｇ／ｌのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液の形態のＮａ+、ＮＨ4+、Ｃａ++、Ｍｇ++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-イオンを含む無機イオンのカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは、７.０〜７.５となる）
を含む培養培地である。
【００３９】
この培地組成物を使用することによって、液体媒体中での培養の間の莢膜を持たない復帰細菌の発生が予防される。実際に、この培地に、初めに莢膜を持つ細菌を１００％含有している集団（１８ｋｂ遺伝子のコピーを２つ持っているｃａｐ遺伝子座の細菌集団全体のゲノム）を接種することによって、４０細菌世代と等価な培養期間の後、莢膜を持つ細菌をなおも１００％含有している細菌集団が得られる。特に実施例３.２.２.１に記載されているものおよび実施例４で使用されているものを含むこの培地組成物は、莢膜を持つ細菌の集団に対して安定化の役割を果たすことによってＰＲＰ収率を向上することに貢献する（実施例４を参照）。
【００４０】
別の態様によると、本発明の主題は、ポリリボシル・リビトール・リン酸（ＰＲＰ）の製造方法であって、
（ｉ） 本発明の液体培養培地中にてヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂを培養し、
（ｉｉ） （ｉ）で得られた培養上清を回収し、そして、
（ｉｉｉ） 該培養上清からＰＲＰを抽出する
ことを含む方法である。
【００４１】
本発明の方法に従ってＰＲＰを製造するためには、工程（ｉ）において本発明の液体培地中にてヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂの一代以上の継代培養を行うことができる。該継代培養によって、バイオマスを増加させることができる。
【００４２】
これを行うには、凍結乾燥製品または凍結製品から得られる細菌を一般的に１リットル以下の培地に接種する。一夜培養した後、または、培地の光学密度が十分になった時に、この最初の培養物を２回目の培養培地に移す。この２回目の培養培地は、最初の培養培地と同一であるが、その容量は最大１０倍〜２０倍多くてもよい。細菌集団の急速な増殖を促進するために、この２回目の培地に接種する細菌の量を、６００ｎｍでの２回目の培養培地の初期光学密度（ＯＤ）が０.２〜０.４となるように調節する。この２回目の培養は、通常、発酵槽中で行われるが、他のタイプの容器（フラスコ、スピナー、および同類のもの）を使用することができる。培養が発酵槽中で行われる場合、通常、培養期間じゅう、３７℃±１℃の温度、持続撹拌、０.１バールの圧、３０％のｐＯ２、および毎分培地１容量につきガス０.２５容量の空気流速が使用される。この種の培養の他のパラメーターを選択することは当業者の能力の範囲内である。細菌の指数増殖期の終わりに、それを大容量の別の発酵槽に移して同じ手順などを使用してバイオマスをさらに増幅することができる。得られた培養容量は、最大１０００リットルであっても、またはそれ以上であってもよい。培養は、一般に、バッチ法によって行われる。他の培養方法、特に、流加培養法を採用することもできる。この場合、指数増殖期の間に培地に炭水化物栄養補助剤を添加して細胞増殖を延長することができ、指数増殖期の終わりに高い細菌密度を得ることができる。炭水化物の添加量は、添加時に培地中に存在する乳酸塩のレベルの関数として評価される。
【００４３】
最後の培養物の上清は、最終的には細菌の不活化後に回収される。該不活化は、最終濃度０.３５％〜０.３７％（ｖ／ｖ）のホルマリン溶液を用いて慣用的に行われる。該上清は、遠心分離工程によって細菌から慣用的に分離される。次いで、当業者に周知の慣用方法に従って、得られた上清に含まれるＰＲＰを抽出し、精製する。
【００４４】
別の実施態様によると、本発明の主題は、ＰＲＰの製造方法であって、
（ｉ） 固体培地上でヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂを培養し、
（ｉｉ） （ｉ）で得られた１つ以上のコロニーを本発明の液体培養培地に移して培養し、
（ｉｉｉ） （ｉｉ）で得られた培養上清を回収し、そして、
（ｉｖ） 該培養上清からＰＲＰを抽出する
ことを含む方法である。
【００４５】
本発明の方法で使用することができる固体培養培地は、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂの培養に適している。それは、また、
タンパク態窒素源、
ヘム源、
β−ＮＡＤ源、
炭水化物源、
ビタミンおよび増殖因子の供給源、
無機塩、ならびに
ゲル化物質、通常、１０〜３０ｇ／ｌの濃度の寒天
を含む。
【００４６】
ＰＲＰの工業的製造方法では、固体培地中での予備培養工程が慣用的に用いられる。通常、凍結乾燥製品または凍結製品から得られる細菌を再懸濁し、次いで、ウマの血液を加えたチャコールベース固体培地に接種する。１０％ＣＯ2下にて３７℃でインキュベーター中において１６〜２０時間培養した後、細菌コロニーを回収し、液体培地中にて増幅する。この方法は、タンパク態窒素源として動物起源のタンパク質を含有する固体培地を使用するという欠点を有する。したがって、本発明者らは、タンパク態窒素源が動物起源のタンパク質を含んでいない固体培地の組成を同定することを試みた。
【００４７】
まず始めに、本発明者らは、酵母エキスが同時にタンパク態窒素源、ビタミンおよび増殖因子の供給源、ならびにヘム、β−ＮＡＤ、炭水化物および上記のものと同じ特徴を有する無機塩の供給源としての役割を果たすことができる固体培地を使用することができることを示した。プロトポルフィリンＩＸの最小濃度０.０５ｍｇ／ｌ、β−ＮＡＤ源については０.１μＭ、そして、炭水化物源については０.１ｍＭが推奨されるが、培地中の酵母エキスの濃度は、０.２〜１.５ｇ／ｌのタンパク態窒素の含有量に対応する。得られたコロニーは、該コロニーのサイズに象徴される増殖が必ずしも最適であるとは限らなくても生存可能である。それらを本発明の液体培養培地に直接移すことができる。次いで、培養容量を増幅し、ＰＲＰを抽出および精製するために上記の手順を行う。
【００４８】
好ましくは、該固体培養培地は、タンパク態窒素源として、化学的または酵素的加水分解物の形態で使用される少なくとも１つの植物起源ペプトンを含む。特に、酵母エキス補助剤として、タンパク態窒素濃度の、コムギ、ワタ、コメ、ダイズ、ソラマメ、ジャガイモ、エンドウまたはこれらの混合物から得られる少なくとも１つの植物系ペプトンを使用することができ、該タンパク態窒素濃度は特に０.２ｇ／ｌ〜２ｇ／ｌの範囲であり得、固体培地中の総タンパク態窒素濃度は好ましくは２.５ｇ／ｌ以下である。使用することができる植物系ペプトンの混合物の例としては、ダイズ、ワタおよびコメのペプトンをベースとする混合物、またはエンドウ、ワタおよびコムギのペプトンをベースとする混合物、または、エンドウおよびジャガイモをベースとする混合物を挙げることができる。本発明者らは、実際、該培養培地がタンパク態窒素源として植物系ペプトンも含む場合、細菌増殖および細菌の生存性が、煮沸または脱線維素処理したウマの血液を加えたチャコールベース固体培地（チャコール寒天）で観察されたものよりも優れていることに注目していた。それらは、使用した植物系ペプトンがエンドウペプトンである場合に最大である。
【００４９】
したがって、本発明の主題は、固体培地のタンパク態窒素源が、動物起源のタンパク質を含んでおらず、少なくとも１つの植物系ペプトンを含んでいる、ＰＲＰの製造方法でもある。好ましくは、植物系ペプトンはエンドウペプトンである。
【００５０】
有利には、本発明の固体培養培地は、ヒト起源もしくはウシ起源のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはアミノ酸を含まないか、または、より有利には、動物起源の混入物を含まない。後者の場合、ヘム源は合成プロトポルフィリンＩＸからなり、β−ＮＡＤおよび炭水化物源もまた非動物起源のものであり、ビタミンおよび増殖因子の供給源は酵母エキスによってもたらされ、ゲル化物質は寒天（藻類由来の製品）である。
【００５１】
したがって、本発明の別の主題は、固体培養培地および液体培養培地が動物起源の混入物を含まない、ＰＲＰの製造方法である。
【００５２】
最大量のＰＲＰを製造する細菌コロニーを選択することができるように固体培地の組成を最適化することが求められている。このような培地の組成によって、
コロニーの優れた個別化；
コロニーの優れた生存性；
コロニーの形態を研究することができるようなコロニーの発生および十分なサイズ
を得ることができる。コロニー間で区別できるようにするためには、１６〜２４時間の培養の終わりに十分なサイズ（約３〜５ｍｍ）のヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌コロニーを得ることを可能にする培地を有することが必要である。
【００５３】
本発明のＰＲＰの製造方法の好ましい実施態様の１つでは、固体培地は、
少なくとも１ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
少なくとも０.５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
固体培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも０.２ｇ／ｌとなるのに十分な量の植物系ペプトンおよび酵母エキス（ここで、両者の割合は、培地中の植物系タンパク質の量と酵母エキスの量との比が、培地のタンパク態窒素の濃度が０.２ｇ／ｌ〜０.８ｇ／ｌである場合には０.１〜９となり、培地のタンパク態窒素の濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１〜９となる割合である）、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態のＮａ+、Ｋ+、Ｃａ++、Ｍｇ++、Ｆｅ+++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-イオンを含む無機イオンのカクテル（これにより、培養培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む。
【００５４】
使用する炭水化物は、好ましくは、細菌によって代謝される非動物起源の糖であり、例えば、フルクトース、リボース、キシロース、フコース、グリセロール、または、特に、グルコースである。少なくとも０.１ｇ／ｌの濃度のグルコースで優れた結果が得られた。通常、グルコースは、０.１ｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、好ましくは、０.１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの濃度で使用される。
【００５５】
解毒剤は、Evans N. Mら（J. Med. Microbiol. Vol 7, pp 305-309, 1974）によって報告されているように、寒天調製物中に存在し得る阻害物質を中和することによって細菌の増殖を促進する。解毒剤としては、好ましくは、チャコール、デンプン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ポリビニルアルコール、オレイン酸ナトリウムまたは亜ジチオン酸ナトリウムが使用される。０.５〜１０ｍｇ／ｌの濃度で使用したＴｗｅｅｎ ８０（登録商標）（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）で優れた結果が観察されたが、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を含まない固体培地組成物は、形態学的観点から区別できない小さいサイズのコロニーを生産する。β−ＮＡＤ濃度が１ｍｇ／ｌ未満の場合、プロトポルフィリンＩＸ濃度が０.５ｍｇ／ｌ未満の場合、またはグルコース濃度が０.１ｍｇ／ｌ未満の場合にも形態学的観点から区別できない小さいサイズのコロニーが観察される。
【００５６】
コロニーの優れた増殖および優れた生存性を確実にするためには、酵母エキスの量および植物系ペプトンの量は、総タンパク態窒素の濃度が少なくとも０.２ｇ／ｌとなるような量である。培地中の植物系ペプトンの量と酵母エキスの量との比は、大きく変化することができ、該培養培地中のタンパク態窒素の濃度が０.８ｇ／ｌを超えない限りは０.１〜９の範囲である。他方、高い濃度では、この比が１未満である場合に固体培地上での細菌懸濁液の拡散が劣るためにコロニーの個別化が劣る。
【００５７】
この固体寒天ベース培地にヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ細菌の不均一集団（すなわち、莢膜を持つ細菌と莢膜を持たない細菌の両方を含有する集団）を接種することによって、１８〜２４時間の培養後に、白色コロニーおよび灰色コロニーが観察され、両者は白色光の光線を用いて透明度によって区別される。白色コロニーは、灰色コロニーよりも多くのＰＲＰを生産する。さらにまた、白色コロニーはまた、ウマの血液を添加したチャコール寒天ベース固体培地から得られたコロニーよりも多くのＰＲＰを生産する（実施例２を参照）。この培地組成物によって、最大量のＰＲＰを生産するコロニーを選別することができるので、この培地組成物は選択培地組成物であると考えられる。
【００５８】
本発明の方法のさらに好ましい実施態様によると、固体培地は、
５〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
０.５〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
１〜１０ｇ／ｌのグルコース、
１〜１０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ ８０、
３〜４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、
０.９〜３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、
０.５〜２ｇ／ｌのＫ2ＳＯ4、
２０〜５００ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ2、
２〜５０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１〜５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、
４〜８ｇ／ｌのＮａＣｌ、
４〜８ｇ／ｌの酵母エキス、および
４〜８ｇ／ｌのエンドウペプトン（ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１以上である）
を含む。
【００５９】
この培地組成物から得られる白色コロニーは、灰色コロニーと比べて最大４００倍のＰＲＰを生産する。制限酵素ＳｍａＩおよびＫｐｎＩを用いてゲノムＤＮＡを消化することによって、それらのｃａｐ遺伝子座を研究した。次いで、実施例３に記載した操作条件に従って、消化産物に対してパルスフィールド電気泳動を行い、次いで、特異的ＰｖｕＩＩプローブを用いて可視化した。驚くべきことに、白色コロニーからの電気泳動プロファイルは全て、４５ｋｂの電気泳動バンドを持っている。１８ｋｂの電気泳動バンドは観察されない。結果として、これらのコロニーのｃａｐ遺伝子座は１８ｋｂ遺伝子のコピーを少なくとも２つ持っており、このことは、白色コロニー由来の細菌集団が完全に莢膜を持つことを意味している。他方、灰色コロニーからの電気泳動プロファイルは、主に１８ｋｂの電気泳動バンドを持っている。この特に好ましい選択培地組成物によって、さらに、細菌集団が完全に莢膜を持っている白色コロニーを選択することができる。
【００６０】
実際、固体培地上での予備培養期を含むＰＲＰ製造方法における収率の向上のためのさらなる手段の１つは、選択固体培地組成物から得られた白色コロニーだけを液体培地に移すことである。好ましくは、本質的に莢膜を持つ細菌からなる白色コロニーを得ることを可能にする固体培地組成物が用いられる。
【００６１】
したがって、好ましい実施態様では、本発明の主題はまた、選択固体培地組成物上で得られた白色コロニーだけを液体培養培地に移すことを含む、ＰＲＰの製造方法である。
【００６２】
特に好ましい実施態様では、これらの白色コロニーは、莢膜を持つ細菌集団に対して安定化の役割を果たす液体培養培地に移される。培養工程が全て、タンパク態窒素源が非動物起源のものである培地または合成プロトポルフィリンＩＸを使用する場合に顕著である動物起源の混入物を含まない培地で行われるということに加えて、この方法によって、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ集団が不均一であって莢膜を持つ細菌と莢膜を持たない細菌の両方を含有する場合にＰＲＰの生産を最適化することもできる。固体培地上での培養の工程によって、完全に莢膜を持つ細菌の集団を含有する白色コロニーを選択することができる。液体培地中でバイオマスを増幅する工程は、上記のように、莢膜を持たない復帰変異体の発生を予防することによって莢膜を持つ細菌の集団を安定化する。そこで、最終的に得られる培養物１リットル当たりのＰＲＰの収量は最大となる（実施例４を参照）。
【００６３】
この方法はまた、完全に莢膜を持つ細菌の集団の生産に用いることができる。この集団のゲノムＤＮＡの電気泳動プロファイルが、ｃａｐ遺伝子座が１８ｋｂ遺伝子のコピーを少なくとも２つ持っていることを示す場合（実施例３のプロトコールを参照）および本発明の選択固体培地組成物へのこの集団のアリコートの接種によって９５％を超える白色コロニー、好ましくは少なくとも９８％の白色コロニーが生産される場合、得られる細菌集団は完全に莢膜を持つ。安定化液体培地（すなわち、莢膜を持たない復帰変異細菌の出現を予防する液体培地）中での細菌増幅の後、得られた細菌集団は、凍結乾燥または凍結によって保存される（この場合、グリセロールのような非動物起源の凍結剤が該培養培地に加えられる）。かくして、完全に莢膜を持つ細菌の均一集団を含有する接種バッチが調製される。このバッチは、動物起源の混入物を含まない培養培地を用いて得られるので生物学的安全性のさらなる保証を与える。これらの接種バッチは、今度は、ＰＲＰを生産することに役立つことができる。
【００６４】
したがって、本発明の主題は、以下のものである：
全ての工程が動物起源の混入物を含まない培地を用いて行われる、ＰＲＰの製造方法。
完全に莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ細菌の集団の製造方法であって、
（ｉ） ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂを、
５〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
０.５〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
１〜１０ｇ／ｌのグルコース、
１〜１０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ ８０、
３〜４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、
０.９〜３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、
０.５〜２ｇ／ｌのＫ2ＳＯ4、
２０〜５００ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ2、
２〜５０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１〜５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ3,・６Ｈ2Ｏ、
４〜８ｇ／ｌのＮａＣｌ、
４〜８ｇ／ｌの酵母エキス、および
４〜８ｇ／ｌのエンドウペプトン（ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１以上である）
を含む固体培地上で培養し；
（ｉｉ） （ｉ）で得られた１つ以上の白色コロニーを、
０.１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
２〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
２〜２０ｇ／ｌのグルコース、
２〜５ｇ／ｌの酵母エキス、
０.４ｇ／ｌ〜１.５ｇ／ｌのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液の形態の無機イオン：Ｎａ+、ＮＨ4+、Ｃａ++、Ｍｇ++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-のカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む液体培養培地に移して培養し、
（ｉｉｉ） （ｉｉ）で得られた細菌培養物を凍結または凍結乾燥させる、
製造方法。
全ての工程が動物起源の混入物を含まない培地によって行われる、完全に莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ細菌の集団の製造方法。
【００６５】
本発明の主題はまた、ＰＲＰの生産のための、この方法に従って得られる莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ細菌の均一集団の使用である。
【００６６】
本発明の主題は、本発明の方法の実施態様の１つから得られるＰＲＰを含む、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌髄膜炎に対するワクチンである。
【００６７】
また、本発明の主題は、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ用の固体培養培地であって、該固体培養培地のタンパク態窒素源が非動物起源のものであり、該固体培養培地が
少なくとも１ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
少なくとも０.５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも０.２ｇ／ｌのタンパク態窒素であるのに十分な量のペプトンおよび酵母エキス（ここで、両者の割合は、培地中の植物系ペプトンの量と酵母エキスの量との比が、培地のタンパク態窒素濃度が０.２ｇ／ｌ〜０.８ｇ／ｌである場合には０.１〜９となり、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１〜９となる割合である）、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態の無機イオン：Ｎａ+、Ｋ+、Ｃａ++、Ｍｇ++、Ｆｅ+++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-のカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む、固体培養培地である。
【００６８】
好ましくは、固体培養培地は、
５〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
０.５〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
１〜１０ｇ／ｌのグルコース、
１〜１０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ ８０、
３〜４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、
０.９〜３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、
０.５〜２ｇ／ｌのＫ2ＳＯ4、
２０〜５００ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ2、
２〜５０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１〜５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、
４〜８ｇ／ｌのＮａＣｌ、
４〜８ｇ／ｌの酵母エキス、および
４〜８ｇ／ｌのエンドウペプトン（ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１以上である）
を含む。
【００６９】
本発明は、結果的に本発明の内容を制限することなく本発明を例示する役割を果たす以下の実施例を考慮してさらに明瞭に理解されるであろう。
【実施例】
【００７０】
実施例１： 植物系ペプトンベース培養培地中におけるＰＲＰの生産に対するプロトポルフィリンＩＸの影響
１）方法
ヘム源がヘミンもしくは二ナトリウム塩形態の動物起源のプロトポルフィリンＩＸ（ブタプロトポルフィリン）であるか、または二ナトリウム塩形態の純粋な合成起源のプロトポルフィリンＩＸである液体植物系ペプトンベース培養培地中での１６時間の細菌培養の後に得られたＰＲＰの生産を比較した。培養培地中のヘミンおよびプロトポルフィリンＩＸ濃度範囲は、試験したヘム源の関数としておよび試験した植物系ペプトンの関数としてＰＲＰ滴定曲線を得ることができるように約０.０１０ｇ／ｌから約２ｇ／ｌまで変化する。Ｋｅｒｒｙによって供給されたエンドウペプトンの酵素的加水分解物（Ｈｙ ｐｅａ ７４０４）およびＯｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅによって供給されたコムギペプトン（１９５５９）を０.８７ｇ／ｌのタンパク態窒素と等価の培養培地中濃度で試験した。現行のＰＲＰ生産条件を参照して、漸増濃度のヘミンの存在下でＳｏｌａｂｉａによって供給されたカゼイン加水分解物（ＨＡＣ）のような動物起源のペプトンを０.８７ｇ／ｌのタンパク態窒素と等価の濃度で含有する培地中でのＰＲＰの生産を測定した（表３を参照）。
【００７１】
１.１）培地の調製
１.１.１. 限外濾過水中１ｇ／ｌのβ−ＮＡＤ（Ｆｌｕｋａ）の貯蔵溶液を、次いで、０.２２μｍで濾過滅菌した。
１.１.２. 溶解を補助するために２５％アンモニア水（Ｃｏｏｐｅｒ）５ｍｌを含む限外濾過水中０.２５／ｌのヘミン（Ｓｉｇｍａ）の貯蔵溶液。該貯蔵溶液を０.２２μｍで濾過滅菌する。
１.１.３. 溶解を促進するために２５％アンモニア水（Ｃｏｏｐｅｒ）５ｍｌを含む限外濾過水中０.２５ｇ／ｌのブタプロトポルフィリンＩＸ（Ｓｉｇｍａ）の貯蔵溶液。該貯蔵溶液を０.２２μｍで濾過滅菌する。
１.１.４. 溶解を促進するために２５％アンモニア水（Ｃｏｏｐｅｒ）５ｍｌを含む限外濾過水０.２５ｇ／ｌの合成プロトポルフィリンＩＸの貯蔵溶液。該貯蔵溶液を、０.２２μｍで濾過滅菌する前に完全に溶解するために撹拌しながら水浴中にて８０℃に加熱した。２００７年３月３０日に出願した出願番号第０７／０２３３４号のフランス特許出願に記載されたスキーム２に記載の工程を用いる方法に従ってプロトポルフィリンＩＸを二ナトリウム塩形態で合成した。
【００７２】
ヘミンの貯蔵溶液およびプロトポルフィリンＩＸの貯蔵溶液を、濾過滅菌後の各活性化合物の含有量についてチェックした。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってプロトポルフィリンＩＸ含有量およびヘミン含有量を決定した。クロマトグラフィーチェーンは、二成分勾配液の形成を可能にするツインヘッドポンプモジュール、プログラマブル自動注入装置、ダイオードアレイＵＶ検出器およびクロマトグラフィーカラム（タイプＳｙｎｅｒｇｉ ４μｍ、Ｐｏｌａｒ ＲＰ−８０Ａ（１５０×４.６）ｍｍ、ｒｅｆ ００Ｆ−４３３６−Ｅ０、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を含む。
【００７３】
濾過後にチェックされるべきヘミン（Ｓｉｇｍａ）の貯蔵溶液を蒸留水で３倍に希釈する。濾過後にチェックされるべきブタプロトポルフィリンＩＸ（Ｓｉｇｍａ）の貯蔵溶液および合成プロトポルフィリンＩＸの貯蔵溶液を蒸留水で４倍に希釈する。並行して、ＳｉｇｍａからのブタプロトポルフィリンＩＸ（ｒｅｆ： ２５８３８−５）でアンモニア水中プロトポルフィリンＩＸ０.０２５ｇ／ｌ〜０.１２５ｇ／ｌの範囲のキャリブレーションシリーズを調製し、Ｓｉｇｍａからのヘミン（ｒｅｆ： Ｈ５５３３−２５６）でヘミン０.０５０ｇ／ｌ〜０.１５０ｇ／ｌのキャリブレーションシリーズを調製する。チェックされるべき試料およびキャリブレーションシリーズの種々の溶液を２０μｌ（ヘミン溶液および試料について）および５μｌ（プロトポルフィリンＩＸ溶液および試料について）の容量で注入する。アセトニトリルおよび１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4 ｐＨ ２.５の混合物からなる初期移動相を流速１ｍｌ／分で設定する。次いで、波長４００ｎｍで検出される目的分子を分取するために、この移動相から不連続勾配液を調製する。キャリブレーションシリーズを確立した後、チェックされるべき試料についてのピークの表面積に基づいて、そこから種々の濾過貯蔵溶液中のヘミン濃度およびプロトポルフィリンＩＸ濃度を推定し、 それぞれ、ヘミン溶液については０.２９５ｇ／ｌであり、ブタプロトポルフィリンＩＸ溶液については０.１８７ｇ／ｌであり、合成プロトポルフィリンＩＸ溶液については０.２４９ｇ／ｌであった。これらの濃度は、その後、標的濃度０.２５０ｇ／ｌに調節されなかったが、ヘミンの貯蔵溶液およびプロトポルフィリンＩＸの貯蔵溶液中に実際に存在するこれらの濃度は結果の解析に使用した。
【００７４】
１.１.５. 限外濾過水中１２５μｇ／ｌの自己消化酵母エキス（Solabia）の貯蔵溶液を、次いで、０.２２μｍで滅菌した。
１.１.６. 限外濾過水中４６５.１２ｇ／ｌのグルコースの貯蔵溶液を、次いで、０.２２μｍで濾過滅菌した。
１.１.７. 濃縮溶液
それは、酵母エキスの貯蔵溶液４０ｍｌ、グルコースの貯蔵溶液４３ｍｌおよびβ−ＮＡＤの貯蔵溶液５ｍｌからなる。
１.１.８. 基本培地
基本培地１リットル当たりタンパク態窒素０.９５ｇ相当を提供するのに十分な量のコムギ植物系ペプトン（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ−Ｒｅｆ １９５５９）またはエンドウ植物系ペプトン（Ｋｅｒｒｙ−Ｒｅｆ Ｈｙｐｅａ ７４０４）（ここで、タンパク態窒素の量はｋｊｅｄｈａｌ法に従ってアッセイした）、
乳酸ナトリウムの５０％水溶液（ＶＷＲ）： １.８ｍｌ、
リン酸水素二ナトリウム・１２Ｈ2Ｏ（Ｂｕｄｅｎｈｅｉｍ）： ３１.１４ｇ、
リン酸二水素ナトリウム・２Ｈ2Ｏ（Ｍｅｒｃｋ）： ２.０３ｇ、
Ｌ−シスチン（Ｊｅｒａ Ｆｒａｎｃｅ）： ０.０７ｇ、
３７％ＨＣｌ（ＶＷＲ）： ０.０７ｍｌ、
Ｌ−トリプトファン（Ｊｅｒａ Ｆｒａｎｃｅ）： ０.０２ｇ、
硫酸アンモニウム： １ｇ、
硫酸マグネシウム・７Ｈ2Ｏ： ０.４ｇ、
塩化カルシウム・２Ｈ2Ｏ： ０.０２ｇ／ｌ、
限外濾過水： １リットルにするのに十分な量。
最後に、基本培地を、オートクレーブを使用して１２１℃で３０分間滅菌する。
【００７５】
１.２）操作プロトコール
５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で培養を行った。種々の培養培地中の試験したヘミン（またはプロトポルフィリンＩＸ）の理論濃度が１０μｇ／ｌ〜約２０００μｇ／ｌとなるように、各エルレンマイヤーフラスコ中にコムギペプトンまたはエンドウペプトンを含有する基本培地１００ｍｌ、濃縮培地８.８ｍｌ、および可変量のヘミン貯蔵溶液、ブタプロトポルフィリンＩＸ貯蔵溶液または合成プロトポルフィリンＩＸ貯蔵溶液を導入した（表１および２を参照）。各エルレンマイヤーフラスコに１０8〜１０10細菌／ｍｌを含有するヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂの凍結製品の内容物を０.２％（Ｖ／Ｖ）の接種率で接種する。インキュベーター中、３７℃にて１７５ｒｐｍで撹拌しながら１６時間インキュベートした後、少量の培養上清を回収することによって、各エルレンマイヤーフラスコ中にて得られた細菌懸濁液のＯＤおよびＰＲＰ濃度を測定する。
【００７６】
１.３) ＰＲＰのアッセイ
サンドイッチ型ＥＬＩＳＡアッセイに基づいて二重に培養上清のＰＲＰ生産力を決定した。
ＥＬＩＳＡマイクロプレートを、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型細菌で過剰免疫したウサギから免疫血清の溶液（あらかじめ０.２Ｍ炭酸塩緩衝液ｐＨ９.６で希釈しておいた（希釈率：約１／２０００））１００μｌを各ウェルに導入して＋４℃で一夜感作する。ＥＬＩＳＡマイクロプレートをすすぎ、飽和した後、各マイクロプレート中にて、蒸留水中１ｍｇ／ｍｌのＰＲＰ精製溶液から、希釈緩衝液（ＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０／１％ウシ血清アルブミン）による連続希釈液を生成することによってキャリブレーションシリーズを調製する。アッセイされるべき培養上清も希釈緩衝液による連続希釈を行って導入する。３７℃で約２時間、さらにインキュベートし、次いで、マイクロプレートをすすいだ後、破傷風タンパク質とコンジュゲートとしたヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌ワクチンを接種したウサギの血清をビオチン化剤で処理して得たビオチン化ウサギ抗体の溶液（あらかじめ希釈緩衝液で希釈しておいた（希釈率：約１／５００））１００μＬをマイクロウェルに導入する。３７℃で１時間インキュベートし、次いで、すすいだ後、各マイクロウェルに、ペルオキシダーゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｒｅｆ ７１００−０５）と結合したストレプトアビジンの溶液（あらかじめ希釈緩衝液で希釈しておいた（希釈率：約１／５０００））１００μｌを添加する。３７℃で１時間インキュベートし、すすいだ後、各マイクロウェルに可視化溶液（０.０３％の過酸化水素０.３μｌを加えた０.０５Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液（ｐＨ＝５）中０.４ｍｇ／ｍｌのオルト−フェニレンジアミンの溶液）１００μｌを添加する。光から保護した２０分間の可視化時間の後、２ＮのＨ2ＳＯ4 ５０μｌ／ウェルを添加することによって反応を遮断する。４９２および６２０ｎｍでマイクロプレートを測定する（プラスチックの吸光度を考慮するため）。キャリブレーションシリーズによる補間によって、試験した試料について得られた光学密度値から、種々の培養上清中のＰＲＰ含有量を決定する。
１.４) 結果
結果を表１および２ならびに図１および２に示す。
【００７７】
【表１】
【００７８】
【表２】
【００７９】
【表３】
【００８０】
図１は、表１の結果を示しており、エンドウペプトンを含有する培地において使用されたヘム源およびその濃度の関数として得られたＰＲＰ生産曲線を示す。ＰＲＰ生産曲線は、ヘム源として合成プロトポルフィリンＩＸを用いても動物起源のプロトポルフィリンＩＸを用いても同等である。他方、培地がヘミンを含有する場合のＰＲＰの生産は、プロトポルフィリンＩＸを含有する培地の場合に比べると実質的に低く、このことは、試験された濃度範囲全体で言える。最適なＰＲＰ生産（約４８０ｍｇ／ｍｌ）を得るために使用されるプロトポルフィリンＩＸは約２００μｇ／ｌにすぎないが、ＰＲＰの最大生産を得るために必要なヘミンは約２５００μｇ／ｌである。したがって、ＰＲＰの最大生産を得るためにエンドウペプトンをベースとする培養培地中に必要とされるプロトポルフィリンＩＸはヘミンの約１２.５分の１である。
【００８１】
図２は、表２の結果を示しており、コムギペプトンを含有する培地において使用されるヘム源およびその濃度の関数として得られたＰＲＰ生産曲線を示す。ＰＲＰ生産曲線は、ヘム源として合成プロトポルフィリンＩＸを用いても動物起源のプロトポルフィリンＩＸを用いても同等である。他方、培地がヘミンを含有する場合のＰＲＰの生産は、等しい濃度のプロトポルフィリンＩＸを含有する培地の場合に比べると低く、これは、ヘミン濃度が低いほどより明らかに現れる。最適なＰＲＰ生産（約４００ｍｇ／ｍｌ）を得るために使用されるプロトポルフィリンＩＸは約１００μｇ／ｌにすぎないが、ＰＲＰの等価な生産を得るために必要なヘミンは約１５００μｇ／ｌである。したがって、ＰＲＰの最大生産を得るためにコムギペプトンをベースとする培養培地中に必要とされるプロトポルフィリンＩＸはヘミンの約１５分の１である。
【００８２】
表１、２および３の結果はまた、培養上清中にて同濃度のＰＲＰを得るためには、現在推奨されているＰＲＰ生産用培地組成物である動物系ペプトンおよびヘミンをベースとする培地中のヘミン濃度が、コムギペプトンまたはエンドウペプトンのような植物系ペプトンをベースとする培地中に必要なプロトポルフィリンＩＸの濃度の２〜５倍必要であることを示している。例えば、カゼインの加水分解物およびヘミンをベースとする培地中にて約４００ｍｇ／ｌのＰＲＰ濃度を得るためには、ヘミン濃度は少なくとも５００μｇ／ｌでなければならないが、コムギペプトンまたはエンドウペプトンおよびプロトポルフィリンＩＸをベースとする培地中では約１００μｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ濃度で十分である。したがって、植物系ペプトンおよびプロトポルフィリンＩＸをベースとする培地は、動物ペプトンおよびヘミンを含有する培養培地よりも有利であり、ＰＲＰの生産に役立つと考えられる。
【００８３】
実施例２： コロニーによるＰＲＰの生産に対する固体培地の組成の影響
約１０8細菌を含有するヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ細菌の均一集団の凍結乾燥品をＤｕｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ ｒｅｆ １４０４０−０８３）１ｍｌに取り込む。この緩衝液で１０倍段階希釈を行う。希釈液（１０-5、１０-6および１０-7）各５０μｌを回収し、種々の本発明の選択固体培地組成物を入れたペトリ皿、または１０％（ｖ／ｖ）の脱線維素処理して沸騰処理したウマの血液（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｒｅｆ ５５８３２）を加えたチャコール寒天を含有する標準固体培地（Ｄｉｆｃｏ、Ｒｅｆ ２８９４１０）を入れたペトリ皿に接種する。
【００８４】
１０％ＣＯ2を入れたインキュベーター中にて３７℃で一夜インキュベートした後、７５Ｗランプ下で透明度によってコロニーを試験する。ペトリ皿は密閉されている。コロニーは、標準培地上では不透明であり、均一である。他方、選択培地上では白色コロニーおよび灰色コロニーが観察される。標準固体培地から４つのコロニーをランダムに回収し、１リットル当たりの組成が以下のとおりの２つの試験選択培地（ＡおよびＢ）から４つの灰色コロニーと４つの白色コロニーを回収した。
【００８５】
【表４】
【００８６】
回収した各コロニーのＰＲＰ含有量をパルスフィールドアンペロメトリック検出（ＨＰＡＥＣ／ＰＡＤ）クロマトグラフィーと結合した高速クロマトグラフィーによってアッセイする。
ＰＲＰの定量化は、多糖類の反復単位の成分の１つであり、酸加水分解後に定量的に遊離されるリビトールをアッセイすることによって行われる。
【００８７】
２.１） 試料の調製
各コロニーを限外濾過水５００μｌに取り込み、次いで、該懸濁液１００μｌを回収し、限外濾過水３００μｌで希釈する。
【００８８】
２.２） キャリブレーションシリーズの調製
限外濾過精製水中１ｍｇ／ｌのリビトール貯蔵溶液を用いて開始し、０〜２０μｇ／ｍｌの範囲のリビトールキャリブレーションシリーズを調製する。キャリブレーションシリーズの各試料の最終容量は４００μｌである。
【００８９】
２.３） 酸加水分解
各試料調製物またはキャリブレーションシリーズの各試料に１０Ｎのトリフルオロ酢酸溶液１００μｌを加える。１２０℃で２時間、加水分解を行う。次いで、全ての管を窒素流下で乾燥させ、分析時に各乾燥物を限外濾過精製水４００μｌ中に取り込む。
【００９０】
２.４） ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラフィーによる分析
あらかじめ４８０ｎＭ水酸化ナトリウム溶液で平衡化しておいた分析カラムＣＡＲＢＯＰＡＣ ＭＡ１（４×２５０ｍｍ）（ＤＩＯＮＥＸ ＃ ４４０６６）上に各加水分解物１００μｌを注入する。該カラムに１Ｍ水酸化ナトリウム４８％および限外濾過精製水溶液５２％を含有する溶液を流速０.４ｍｌ／分で４０分間流して、ＰＲＰの２つの構成単糖を溶離する。カラムの温度は、分析の期間全体で３０℃に維持される。単糖は、アンペロメトリーセルと結合したＥＤ４０マルチモード電気化学検出器（ＤＩＯＮＥＸ ＃４４０９４）を用いて検出される。
【００９１】
これらの条件下で、ＰＲＰの加水分解の間に遊離したリビトールに対応するクロマトグラフィーピークは１９±５％分で現れる。
キャリブレーションシリーズからキャリブレーション曲線（クロマトグラフィーピークの表面積の関数としてのリビトールの量）を確立し、次いで、各試料調製物中に含まれるリビトールの量を補間によって決定する。それから各試料に含まれるＰＲＰの量を推定し、次いで、各コロニー中のＰＲＰ濃度を推定して、リビトールがＰＲＰの重量の４１％であることが分かる。
【００９２】
２.５） コロニーのバイオマスの決定
ＭｉｃｒｏＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）に従って決定した各コロニーのタンパク質含有量は、各コロニーのバイオマスを反映する。そのために、コロニーを個々に回収し、次いで、滅菌限外濾過水２００μｌ中に取り込む。該混合物を３０秒間ボルテックス撹拌する。試料（１０μｌ〜４０μｌ）を回収し、製造者の推奨に従ってＭｉｃｒｏＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質アッセイを行う。１００μｇ／ｍｌのウシアルブミン血清からキャリブレーションシリーズを調製する。分光光度計にて５６２ｎｍで試料およびキャリブレーションシリーズを測定する。キャリブレーションシリーズを用いて、コロニー１つ当たりのμｇで表される試料のタンパク質濃度を算出する。
【００９３】
２.６） 結果
タンパク質マスの単位（μｇで表される）当たりのＰＲＰのμｇで表される結果を下記表に記載する。
【００９４】
【表５】
【００９５】
＊： タンパク質マス単位（μｇ）と比べて表されるコロニーによって生産されるＰＲＰの量（μｇ）を表す。
Ｎ.Ｄ.： アッセイしていない
【００９６】
コロニーによるＰＲＰの生産が高いほど、タンパク質マスの単位当たりのアッセイしたＰＲＰの量は高くなる。これらの結果は、白色コロニーによるＰＲＰの生産がチャコール寒天から回収されたコロニーの生産の３〜５倍であることを示している。他方、灰色コロニーが生産するＰＲＰの量は、一般的に、チャコール寒天から回収されたコロニーよりも低い。
【００９７】
実施例３： 液体培地中のＰＲＰの生産に対する選択固体培地上での培養工程の影響
２つのＰＲＰ生産方法を比較した。第一の方法では、貯蔵集団と称されるヘモフィルス・インフルエンザｂ型細菌の集団の凍結品の内容物（約１０8細菌／ｍｌ）を本発明の液体培養培地に直接接種する。あらかじめ貯蔵集団の特徴を分析しておいた（次の段を参照）。第２のプロトコールでは、莢膜を持つ細菌を１００％含有する白色コロニーから娘集団を選択することを可能にする本発明の選択固体培地を用いて貯蔵集団から娘集団を調製する。次いで、娘集団を貯蔵集団と同じ培養培地に接種する。次いで、貯蔵集団および娘集団によるＰＲＰの生産を測定し、第３工程で比較する。
【００９８】
３.１）貯蔵集団の特徴
３.１.１： ｃａｐ遺伝子座の分析
３.１.１.１： 試薬
細菌溶解緩衝液
Ｐｅｔｔ ＩＶ緩衝液： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４、１Ｍ ＮａＣｌ
１Ｘ溶解溶液： ６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７.４、１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５％Ｂｒｉｊ ５８、０.２％サルコシル、５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、１μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ
ＥＳＰ溶液： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼ
ＴＥ溶液： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ
酵素消化
ＳｍａＩ：（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ Ｒｅｆ： １５２２８−０１８）
１０Ｘ消化緩衝液４：（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、酵素を供給） − 使用時にヌクレアーゼを含まない滅菌精製水で１０倍希釈する
ＫｐｎＩ：（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｒｅｆ： １５５２３２−０３６）
１０Ｘ消化緩衝液４：（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｒｅｆ： １５５２３２−０３６） − 使用時にヌクレアーゼを含まない滅菌精製水で１０倍希釈する
パルスフィールド電気泳動緩衝液
１０Ｘ ＴＢＥ緩衝液： ８９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.４、８９０ｍＭホウ酸、２５０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８.０ − 使用時に限外濾過水で２０倍希釈する
ジゴキシゲニンで標識したＰｖｕＩＩプローブ：
プラスミドｐＢＲ３２２−ｐＵ０３８（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ − Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ − Ｊｏｈｎ Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から得たＤＮＡ調製物から特異的標識ＰｖｕＩＩプローブを得た。プラスミドＤＮＡ２０μｇを、あらかじめヌクレアーゼを含まない滅菌水で１０倍希釈した１０Ｘ緩衝液４（ＮＥＢＩＯＬＡＢＳ Ｒｅｆ． ＃Ｂ７００２−Ｓ）中、４０単位の酵素ｐｖｕＩＩ（ＮＥＢＩＯＬＡＢＳ Ｒｅｆ． ＃Ｒ０１５１−Ｓ）の存在下、３７℃で２時間消化した。次いで、消化生成物を１％重量／容量で、０.２５％容量／容量のブロモフェノールブルー、０.２５％容量／容量のキシレンシアノールＦＦ、および３０％容量／容量のグリセロールを加えた１Ｘ ＴＡＥ緩衝液の存在下でアガロースゲルにて電気泳動処理した。移動の終わりに、ＰｖｕＩＩ ＤＮＡフラグメントに対応する目的の２.１ｋｂバンドを回収する。次いで、「Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ」カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｌｇｅｌ Ｒｅｆ： ７４０５９０.２５０）に通すことによってアガロースゲルからＤＮＡを抽出し、次いで、２６０ｎｍで分光光度測定して、その完全性をチェックする。最後に、標識化キット「ＤＩＧ−Ｃｈｅｍ−Ｌｉｎｋ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｔ」（ＲＯＣＨＥ Ｒｅｆ： １８３６４６３）を用いて、ＰｖｕＩＩプローブをジゴキシゲニンで標識する。標識プローブを−２０℃で貯蔵する。
【００９９】
３.１.１.２： 操作プロトコール
貯蔵集団のアンプルを解凍し、１０％（ｖ／ｖ）脱線維素して沸騰したウマの血液（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、ｒｅｆ ５５８３２）を加えたチャコール寒天（Ｄｉｆｃｏ、ｒｅｆ ２８９４１０）からなる標準固体培地を入れたペトリ皿に接種する。１０％ＣＯ2を入れたインキュベーター中にて３７℃で１８時間インキュベートした後、得られたコロニーを回収し、ＯＤ６８０ｎｍが約１.８となるようにＰｅｔｔ ＩＶ緩衝液に懸濁する。細菌懸濁液を２％（ｖ／ｖ）の低融点アガロース（Ｒｅｆ： ＢｉｏＲａｄ、ｒｅｆ １６２−０１３８）と混合し、５０℃でテンパリングし、次いで、この混合物を約８０μｌ／プラグの量でプラグモールド（ＢｉｏＲａｄ Ｒｅｆ： １７０−３７１３）中に分配する。かくして全細菌を含有するアガロースモールドが得られる。各プラグを１Ｘ溶解溶液１ｍｌ中に置く。３７℃で６時間インキュベートした後、この溶液をＥＳＰ溶液１ｍｌと取り換える。５０℃で一夜さらにインキュベートした後、各プラグをＴＥ溶液４ｍｌで３０分間、３回洗浄する。次いで、各プラグに含まれている溶解した細菌のゲノムＤＮＡを、酵素ＳｍａＩ（ＧＩＢＣＯ −ＢＲＬ Ｒｅｆ： １５２２８−０１８）２０単位を含有する１Ｘ消化緩衝液４（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）３００μｌを用いて２５℃で一夜消化し、次いで、ＴＥ溶液４ｍｌで洗浄する。酵素ＫｐｎＩ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ｒｅｆ： １５５２３２−０３６）２０単位を含有する１Ｘ緩衝液４（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｒｅｆ： １５５２３２−０３６）２００μｌを用いて、消化を３０℃で７時間続け、次いで、ＴＥ溶液で洗浄する。これら２つの制限酵素は、細菌ゲノムＤＮＡのｃａｐ遺伝子座を遊離する。消化したプラグを０.８％ｖ／ｖの認定アガロースゲル（ＢＩＯＲＡＤ ｒｅｆ： １６２−０１３８）中に挿入し、次いで、６ボルト／ｃｍ、角度１２０°、リニアプログレッション、初期スイッチ時０.９秒および最終スイッチ時１１.５４秒が適用されるような「Ｃｈｅｆ ｍａｐｐｅｒ」型（Ｂｉｏｒａｄ）セットの装置を用いて、０.５Ｘ ＴＢＥ緩衝液中にて１３時間パルスフィールド電気泳動処理する。製造者の推奨に従って装置「Ｖａｃｕｇｅｎｅ ＸＬ Ｖａｃｕｕｍ ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてセミドライトランスファーによってゲルを正帯電ナイロンフィルター（Ｒｏｃｈｅ Ｒｅｆ： １２０９２７２）に移す。ナイロンフィルター上に移したＤＮＡを３１２ｎｍのＵＶで３分間固化する。次いで、フィルターを「ＤＩＧ ｅａｓｙ ｈｙｂ」緩衝液（Ｒｏｃｈｅ ｒｅｆ： １５８５７３８）中にて４２℃で２時間プレハイブリダイズし、次いで、ジゴキシゲニンで標識した特異的ＰｖｕＩＩプローブを緩衝液１ｍｌ当たり２０〜５０ｎｇ含有する「ＤＩＧ ｅａｓｙ ｈｙｂ」緩衝液中にて４２℃で一夜ハイブリダイズする。このプローブは、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂのｃａｐ遺伝子座を特異的に認識する。次いで、フィルターを、６５℃で低ストリンジェンシー緩衝液を用いて２回洗浄し、次いで、高ストリンジェンシー緩衝液で洗浄する。次いで、キット「Ｄｉｇ−Ｃｈｅｍ−ｌｉｎｋ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｔ」（Ｒｏｃｈｅ）を用いてアルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体の溶液を添加した後、蛍光基質（ＣＤＰ −ｓｔａｒ： Ｒｏｃｈｅ Ｒｅｆ： ２０４１６７７）を用いてフィルターを可視化する。得られた電気泳動プロファイルを図３に示す。１８ｋｂおよび４５ｋｂの２つのバンドが観察され、これは、貯蔵集団のｃａｐ遺伝子座の構造が不均一であることを示している。集団の一部は、４５ｋｂの電気泳動バンドに対応する、１８ｋｂ遺伝子のコピーを２つ持っているｃａｐ遺伝子座を有しており、残りは、１８ｋｂの電気泳動バンドに対応する、非二重形態のｃａｐ遺伝子座を有している。結果的に、貯蔵集団は、莢膜をもつ細菌と莢膜を持たない細菌の混合物である。この不均一さは、さらにまた、選択固体培地上に貯蔵集団を接種した後に得られる白色コロニーのパーセンテージを測定するための試験を用いて確認される（実施例２を参照）。
【０１００】
３.２）選択固体培地上での貯蔵集団の培養： 選択固体培地上で白色コロニーを形成する細菌のパーセンテージの測定および本質的に莢膜を持つ細菌からなる娘集団の誘導
３.２.１）白色コロニーを形成する細菌のパーセンテージの測定
選択固体培地上で培養する工程および得られたコロニーの形態学的分析は、実施例２に記載した同操作条件に従って行われる。選択固体培地の組成は、実施例２の選択培地Ａのものに対応する。
可視化されたコロニー１００個当たりの白色コロニーの数を決定する。コロニーの６０％が白色コロニーの形態であり、これにより、最初の貯蔵溶液が不均一であり、かつ、莢膜をもつ細菌および莢膜を持たない細菌の混合物を含有することが実際に裏付けられる。
【０１０１】
３.２.２）娘集団の選択および特徴付け
３.２.２.１）娘集団の選択
選択固体培地Ａ上で１８〜２４時間培養した後に得られた白色コロニーをＢａｃｔｏ寒天を含まない選択固体培地と同一の液体培地の組成物２ｍｌが入っている管に接種する。振盪しながら３７℃で２０時間さらにインキュベートした後、管の内容物を、１リットル当たりの組成が以下のとおりの本発明の液体培地５０ｍｌが入っているエルレンマイヤーフラスコに移す：
β−ＮＡＤ： ５ｍｇ
プロトポルフィリンＩＸ： １ｍｇ
グルコース： ２０ｇ
酵母エキス： ５ｇ
エンドウペプトン（Ｈｙｐｅａ ７４０４（Ｑｕｅｓｔ））：７.４２ｇ
乳酸ナトリウムの６０％水溶液： １.４９ｍｌ
シスチン： ０.０７ｇ
トリプトファン： ０.０２ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ： ３１.１４ｇ
ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ： ２.０３ｇ
(ＮＨ4)2ＳＯ4： １ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ： ０.４ｇ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ： ０.０２ｇ
エルレンマイヤーフラスコを振盪しながら３７℃のインキュベーター中に置く。６００ｎｍのＯＤが２に近い場合には、細菌懸濁液中の最終濃度が２０％（ｖ／ｖ）となるような量のグリセロールを添加する。該細菌懸濁液１ｍｌをＮｕｎｃ管中に分配した後、−７０℃で冷凍する。かくして、選択固体培地の組成物上で得られた白色コロニーから生産されて貯蔵集団の細菌に由来する娘細菌集団が凍結品の形態で得られる。
【０１０２】
３.２.２.２）娘細菌集団の特徴付け
パラグラフ３.１.１.２に記載したプロトコールに従って娘集団のｃａｐ遺伝子座の分析を行った。電気泳動プロファイルは、４５ｋｂの単一バンドを示し、娘集団のｃａｐ遺伝子座が本質的に１８ｋｂ遺伝子の二重形態であることを示している（図３を参照）。結果的に、娘細菌集団は、本質的に莢膜を持つ細菌からなっている。選択固体培地に接種した場合に白色コロニーを１００％生産するということによって、この集団の均一性が確認される。
【０１０３】
３.３）貯蔵集団の細菌および娘集団の細菌によるＰＲＰの生産の比較
貯蔵集団または娘集団から得た約１０10細菌が入っているアンプルの内容物を、パラグラフ３.２.２.１で示した組成の液体培地２００ｍｌが入っているエルレンマイヤーフラスコに直接接種する。
振盪（１７５ｒｐｍ）しながら３７℃＋／−１℃で２４時間インキュベートした後、培養上清を回収し、次いで、実施例１に記載の方法に従ってＥＬＩＳＡによりＰＲＰ濃度を決定する。同試験を３回繰り返す。結果を下記表に示す。示された値は、３回の試験の平均値である。
【０１０４】
【表６】
＊： ｍｇ／ｌで表される結果。
【０１０５】
結論： 莢膜を持つ細菌の均一集団からなる娘集団によるＰＲＰの生産は約３倍増加する。結果的に、莢膜を持つ細菌を１００％含有する白色コロニーを選択することを可能にする選択固体培地上での培養工程を使用する方法によって、得られるＰＲＰ収量が増加する。この方法はまた、莢膜をもつ細菌および莢膜を持たない細菌の混合物を含有する初期集団から完全に莢膜を持つ細菌集団を構成するために用いることができる。
【０１０６】
実施例４： 細菌集団およびＰＲＰ生産に対する安定化培養培地の役割
出発細菌集団は、ｃａｐ遺伝子座が１８ｋｂ遺伝子のコピーを少なくとも２つ持っており、選択固体培地上で白色コロニーを１００％生産する、完全に莢膜を持つ細菌の集団からなる。
【０１０７】
４.１） 操作プロトコール
パラグラフ３.２.２.１の操作プロトコールに従って選択された娘集団から得られた細菌を１ｍｌ当たり１０8〜１０10個含有する凍結品の内容物を、パラグラフ３.２.２.１に示した組成の液体培地５００ｍｌが入っている１リットルの発酵槽に接種する。振盪しながら３７℃で１４時間インキュベートした後、第１の培養物を、初期ＯＤが０.３となるように同液体培地５００ｍｌが入っている第２の１リットルの発酵槽に移す。同条件下で約５時間さらにインキュベートした後（得られたＯＤ値は約４）、第２の培養物を、初期ＯＤが０.３となるように培地５００ｍｌが入っている第３の１リットルの発酵槽に移し、次いで、約３時間インキュベートした後（得られたＯＤ値は約４）、同液体培地５００ｍｌが入っている第４の１リットルの発酵槽中に注ぐ。この操作プロトコールは、通常ＰＲＰの工業的生産のために１３０００リットルの発酵槽中で行われる工程の研究室スケールへの適応である。
【０１０８】
各培養の終わりに、慣用的な式Ｎ＝Ｌｏｇ Ｘ／Ｘ０ ｘ １／Ｌｏｇ ２（式中、Ｘは培養の終わりのバイオマスを表し、Ｘ０は、培養開始時のバイオマスを表す）を用いて細菌世代数を算出する。１リットルの発酵槽中での第４の培養の終わりに得られた累積細菌世代数は、実際、１３０００リットルの発酵槽における培養の終わりに得られた細菌世代数に対応する。各培養の終わりに、実施例３に記載の方法に従って、ｃａｐ遺伝子座を特徴付け、選択固体培地上で白色コロニーを形成する細菌のパーセンテージを決定した。得られた結果を下記表にグループ分けする。
【０１０９】
【表７】
【０１１０】
第４の培養物の終わりの累積世代数は２４.０９世代である。
継代培養は細菌集団の特徴を変えず、細菌集団は継代培養の間じゅう完全に莢膜を持ったままである。ＰＲＰの生産もまた、非常に高いレベルで培養の間じゅう安定したままである。したがって、培養の間じゅう細菌集団の特徴は感知できるほど変化しないので、この培地の組成は莢膜を持つ細菌集団に対して安定化の役割を果たす。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク態窒素源が非動物起源のものであり、かつ、少なくとも１つの植物系ペプトンを含んでおり、ヘム源がプロトポルフィリンＩＸからなることを特徴とする、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ培養用の培地。
【請求項２】
プロトポルフィリンＩＸ濃度が少なくとも０.０１ｍｇ／ｌである、請求項１記載の培地。
【請求項３】
プロトポルフィリンＩＸ濃度が０.１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌである、請求項２記載の培地。
【請求項４】
植物系ペプトンがコムギペプトンである、請求項１〜３いずれか１項記載の培地。
【請求項５】
植物系ペプトンがエンドウペプトンである、請求項１〜４いずれか１項記載の培地。
【請求項６】
培養培地中の総植物系ペプトン濃度が０.０８ｇ／ｌ〜２.２５ｇ／ｌのタンパク態窒素濃度と等価である、請求項１〜５いずれか１項記載の培地。
【請求項７】
動物起源の混入物を含まない、請求項１〜６いずれか１項記載の培地。
【請求項８】
０.１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
２〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
２〜２０ｇ／ｌのグルコース、
２〜５ｇ／ｌの酵母エキス、
０.４ｇ／ｌ〜１.５ｇ／ｌのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液の形態のＮａ+、ＮＨ4+、Ｃａ++、Ｍｇ++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-イオンを含む無機イオンのカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む、請求項５〜７いずれか１項記載の液体培養培地。
【請求項９】
ポリリボシル・リビトール・リン酸（ＰＲＰ）の製造方法であって、
（ｉ） 請求項１〜８いずれか１項記載の液体培養培地中にてヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂを培養し、
（ｉｉ） （ｉ）で得られた培養上清を回収し、そして、
（ｉｉｉ） 該培養上清からＰＲＰを抽出する
ことを含む方法。
【請求項１０】
ポリリボシル・リビトール・リン酸（ＰＲＰ）の製造方法であって
（ｉ） 固体培養培地上でヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂを培養し、
（ｉｉ） （ｉ）で得られた１つ以上のコロニーを、請求項１〜８いずれか１項記載の液体培養培地中に移して培養し、
（ｉｉｉ） （ｉｉ）で得られた培養上清を回収し、そして、
（ｉｖ） 該培養上清からＰＲＰを回収する
ことを含む方法。
【請求項１１】
固体培養培地のタンパク態窒素源が非動物起源のものであり、少なくとも１つの植物系ペプトンを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
植物系ペプトンがエンドウペプトンである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ヘム源がプロトポルフィリンＩＸからなる、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
固体培地が
少なくとも１ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
少なくとも０.５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
固体培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも０.２ｇ／ｌであるのに十分な量の少なくとも１つの植物系ペプトンおよび酵母エキス（ここで、両者の割合は、培地中の植物系タンパク質の量と酵母エキスの量の比が、培地のタンパク態窒素の濃度が０.２ｇ／ｌ〜０.８ｇ／ｌである場合には０.１〜９となり、培地のタンパク態窒素の濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１〜９となる割合である）、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態のＮａ+、Ｋ+、Ｃａ++、Ｍｇ++、Ｆｅ+++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-イオンを含む無機イオンのカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む、請求項１０〜１３いずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
固体培地が
５〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
０.５〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
１〜１０ｇ／ｌのグルコース、
１〜１０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ ８０、
３〜４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、
０.９〜３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、
０.５〜２ｇ／ｍｌのＫ2ＳＯ4、
２０〜５００ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ2、
２〜５０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１〜５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、
４〜８ｇ／ｌのＮａＣｌ、
４〜８ｇ／ｌの酵母エキス、および
４〜８ｇ／ｌのエンドウペプトン（ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量の比は、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１以上である）
を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
白色コロニーだけを液体培養培地中に移す、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
固体培養培地および液体培養培地が動物起源の混入物を含まない、請求項１０〜１６いずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
完全に莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ細菌の集団の製造方法であって、
（ｉ） ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂを、
５〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
０.５〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
１〜１０ｇ／ｌのグルコース、
１〜１０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ ８０、
３〜４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、
０.９〜３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、
０.５〜２ｇ／ｌのＫ2ＳＯ4、
２０〜５００ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ2、
２〜５０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１〜５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ3,・６Ｈ2Ｏ、
４〜８ｇ／ｌのＮａＣｌ、
４〜８ｇ／ｌの酵母エキス、および
４〜８ｇ／ｌのエンドウペプトン（ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１以上である）
を含む固体培地上で培養し；
（ｉｉ） （ｉ）で得られた１つ以上の白色コロニーを、
０.１〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
２〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
２〜２０ｇ／ｌのグルコース、
２〜５ｇ／ｌのa 酵母エキス、
０.４ｇ／ｌ〜１.５ｇ／ｌのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液形態のＮａ+、ＮＨ4+、Ｃａ++、Ｍｇ++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-イオンを含む無機イオンのカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む液体培養培地中に移して培養し；そして、
（ｉｉｉ） （ｉｉ）で得られた細菌集団を凍結または凍結乾燥させる
ことを含む方法。
【請求項１９】
全ての工程が動物起源の混入物を含まない培地を用いて行われる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＰＲＰの製造のための、請求項１８または１９記載の方法に従って得られる集団の使用。
【請求項２１】
請求項１０〜１９いずれか１項記載の方法に従って得られるＰＲＰを含む、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌髄膜炎に対するワクチン。
【請求項２２】
タンパク態窒素源が非動物起源を含まないヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ用固体培養培地であって、
少なくとも１ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
少なくとも０.５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも０.２ｇ／ｌのタンパク態窒素であるのに十分な量の植物系ペプトンおよび酵母エキス（ここで、両者の割合は、培地中における植物系ペプトンの量と酵母エキスの量との比が、培地のタンパク態窒素濃度が０.２ｇ／ｌ〜０.８ｇ／ｌである場合には０.１〜９となり、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１〜９となる割合である）、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態のＮａ+、Ｋ+、Ｃａ++、Ｍｇ++、Ｆｅ+++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-を含む無機イオンのカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む固体培養培地。
【請求項２３】
５〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
０.５〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
１〜１０ｇ／ｌのグルコース、
１〜１０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ ８０、
３〜４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、
０.９〜３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、
０.５〜２ｇ／ｌのＫ2ＳＯ4、
２０〜５００ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ2、
２〜５０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１〜５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、
４〜８ｇ／ｌのＮａＣｌ、
４〜８ｇ／ｌの酵母エキス、および
４〜８ｇ／ｌのエンドウペプトン（ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量の比は、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１以上である）
を含む、請求項２２記載の固体培地。
【請求項１】
タンパク態窒素源が非動物起源のものであり、かつ、少なくとも１つの植物系ペプトンを含んでおり、ヘム源がプロトポルフィリンＩＸからなることを特徴とする、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ培養用の培地。
【請求項２】
プロトポルフィリンＩＸ濃度が少なくとも０.０１ｍｇ／ｌである、請求項１記載の培地。
【請求項３】
プロトポルフィリンＩＸ濃度が０.１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌである、請求項２記載の培地。
【請求項４】
植物系ペプトンがコムギペプトンである、請求項１〜３いずれか１項記載の培地。
【請求項５】
植物系ペプトンがエンドウペプトンである、請求項１〜４いずれか１項記載の培地。
【請求項６】
培養培地中の総植物系ペプトン濃度が０.０８ｇ／ｌ〜２.２５ｇ／ｌのタンパク態窒素濃度と等価である、請求項１〜５いずれか１項記載の培地。
【請求項７】
動物起源の混入物を含まない、請求項１〜６いずれか１項記載の培地。
【請求項８】
０.１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
２〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
２〜２０ｇ／ｌのグルコース、
２〜５ｇ／ｌの酵母エキス、
０.４ｇ／ｌ〜１.５ｇ／ｌのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液の形態のＮａ+、ＮＨ4+、Ｃａ++、Ｍｇ++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-イオンを含む無機イオンのカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む、請求項５〜７いずれか１項記載の液体培養培地。
【請求項９】
ポリリボシル・リビトール・リン酸（ＰＲＰ）の製造方法であって、
（ｉ） 請求項１〜８いずれか１項記載の液体培養培地中にてヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂを培養し、
（ｉｉ） （ｉ）で得られた培養上清を回収し、そして、
（ｉｉｉ） 該培養上清からＰＲＰを抽出する
ことを含む方法。
【請求項１０】
ポリリボシル・リビトール・リン酸（ＰＲＰ）の製造方法であって
（ｉ） 固体培養培地上でヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂを培養し、
（ｉｉ） （ｉ）で得られた１つ以上のコロニーを、請求項１〜８いずれか１項記載の液体培養培地中に移して培養し、
（ｉｉｉ） （ｉｉ）で得られた培養上清を回収し、そして、
（ｉｖ） 該培養上清からＰＲＰを回収する
ことを含む方法。
【請求項１１】
固体培養培地のタンパク態窒素源が非動物起源のものであり、少なくとも１つの植物系ペプトンを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
植物系ペプトンがエンドウペプトンである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ヘム源がプロトポルフィリンＩＸからなる、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
固体培地が
少なくとも１ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
少なくとも０.５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
固体培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも０.２ｇ／ｌであるのに十分な量の少なくとも１つの植物系ペプトンおよび酵母エキス（ここで、両者の割合は、培地中の植物系タンパク質の量と酵母エキスの量の比が、培地のタンパク態窒素の濃度が０.２ｇ／ｌ〜０.８ｇ／ｌである場合には０.１〜９となり、培地のタンパク態窒素の濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１〜９となる割合である）、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態のＮａ+、Ｋ+、Ｃａ++、Ｍｇ++、Ｆｅ+++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-イオンを含む無機イオンのカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む、請求項１０〜１３いずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
固体培地が
５〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
０.５〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
１〜１０ｇ／ｌのグルコース、
１〜１０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ ８０、
３〜４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、
０.９〜３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、
０.５〜２ｇ／ｍｌのＫ2ＳＯ4、
２０〜５００ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ2、
２〜５０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１〜５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、
４〜８ｇ／ｌのＮａＣｌ、
４〜８ｇ／ｌの酵母エキス、および
４〜８ｇ／ｌのエンドウペプトン（ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量の比は、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１以上である）
を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
白色コロニーだけを液体培養培地中に移す、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
固体培養培地および液体培養培地が動物起源の混入物を含まない、請求項１０〜１６いずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
完全に莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ細菌の集団の製造方法であって、
（ｉ） ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂを、
５〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
０.５〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
１〜１０ｇ／ｌのグルコース、
１〜１０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ ８０、
３〜４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、
０.９〜３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、
０.５〜２ｇ／ｌのＫ2ＳＯ4、
２０〜５００ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ2、
２〜５０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１〜５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ3,・６Ｈ2Ｏ、
４〜８ｇ／ｌのＮａＣｌ、
４〜８ｇ／ｌの酵母エキス、および
４〜８ｇ／ｌのエンドウペプトン（ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１以上である）
を含む固体培地上で培養し；
（ｉｉ） （ｉ）で得られた１つ以上の白色コロニーを、
０.１〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
２〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
２〜２０ｇ／ｌのグルコース、
２〜５ｇ／ｌのa 酵母エキス、
０.４ｇ／ｌ〜１.５ｇ／ｌのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液形態のＮａ+、ＮＨ4+、Ｃａ++、Ｍｇ++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-イオンを含む無機イオンのカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む液体培養培地中に移して培養し；そして、
（ｉｉｉ） （ｉｉ）で得られた細菌集団を凍結または凍結乾燥させる
ことを含む方法。
【請求項１９】
全ての工程が動物起源の混入物を含まない培地を用いて行われる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＰＲＰの製造のための、請求項１８または１９記載の方法に従って得られる集団の使用。
【請求項２１】
請求項１０〜１９いずれか１項記載の方法に従って得られるＰＲＰを含む、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌髄膜炎に対するワクチン。
【請求項２２】
タンパク態窒素源が非動物起源を含まないヘモフィルス・インフルエンザ血清型ｂ用固体培養培地であって、
少なくとも１ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
少なくとも０.５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも０.２ｇ／ｌのタンパク態窒素であるのに十分な量の植物系ペプトンおよび酵母エキス（ここで、両者の割合は、培地中における植物系ペプトンの量と酵母エキスの量との比が、培地のタンパク態窒素濃度が０.２ｇ／ｌ〜０.８ｇ／ｌである場合には０.１〜９となり、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１〜９となる割合である）、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態のＮａ+、Ｋ+、Ｃａ++、Ｍｇ++、Ｆｅ+++、ＨＰＯ4--、Ｈ2ＰＯ4-、ＳＯ4--およびＣｌ-を含む無機イオンのカクテル（これにより、培地のｐＨが６.５〜７.５、好ましくは７.０〜７.５となる）
を含む固体培養培地。
【請求項２３】
５〜５０ｍｇ／ｌのβ−ＮＡＤ、
０.５〜５ｍｇ／ｌのプロトポルフィリンＩＸ、
１〜１０ｇ／ｌのグルコース、
１〜１０ｍｇ／ｌのＴｗｅｅｎ ８０、
３〜４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、
０.９〜３ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、
０.５〜２ｇ／ｌのＫ2ＳＯ4、
２０〜５００ｍｇ／ｌのＭｇＣｌ2、
２〜５０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１〜５ｍｇ／ｌのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、
４〜８ｇ／ｌのＮａＣｌ、
４〜８ｇ／ｌの酵母エキス、および
４〜８ｇ／ｌのエンドウペプトン（ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量の比は、培地のタンパク態窒素濃度が０.８ｇ／ｌを超える場合には１以上である）
を含む、請求項２２記載の固体培地。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５３２９８５（Ｐ２０１０−５３２９８５Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１５５６６（Ｐ２０１０−５１５５６６）
【出願日】平成２０年７月１日（２００８．７．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５１２２３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００７６４１
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（５９２０５５８２０）サノフィ・パスツール (20)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ ＰＡＳＴＥＵＲ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１日（２００８．７．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５１２２３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００７６４１
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（５９２０５５８２０）サノフィ・パスツール (20)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ ＰＡＳＴＥＵＲ
【Ｆターム（参考）】
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