ベンゾジアゼピンブロモドメイン阻害剤
本発明は、式（Ｉ）のベンゾジアゼピン化合物
【化１】
その調製方法、そのような化合物を含んでなる医薬組成物およびその治療的使用に関する。
【化１】
その調製方法、そのような化合物を含んでなる医薬組成物およびその治療的使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベンゾジアゼピン化合物、その調製プロセス、そのような化合物を含んでなる医薬組成物、および治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のゲノムは細胞核内で高度に組織化されている。二本鎖ＤＮＡの長い鎖は、ヌクレオソームを形成するためにヒストンタンパク質（ほとんどはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の２つのコピーを含む）の八量体に巻きついている。次いでこの基本単位はさらに、ヌクレオソームの凝集およびフォールディングにより圧縮されて、非常に凝縮されたクロマチン構造を形成する。様々な異なる状態の凝縮が可能であり、この構造の緊密度は細胞周期の間、変化し、細胞分裂のプロセスの間、最もコンパクトになる。クロマチン構造は、遺伝子転写を調節する際に重要な役割を果たすが、非常に凝縮されたクロマチンからは効率的に起こり得ない。クロマチン構造は、ヒストンタンパク質、特にヒストンＨ３およびＨ４に対すて、通常、コアヌクレオソーム構造を超えて拡がるヒストンテール内での一連の翻訳後修飾によって制御される。これらの修飾には、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化およびＳＵＭＯ化が含まれる。これらの後成的マーカーは、ヒストンテール内の特異的残基上に標識を取り付ける、特異的酵素によって書き出され、消去され、それによって、後成的コードを形成し、次いでそれは、細胞に読み取られて、クロマチン構造の遺伝子特異的調節およびそれによる転写を可能にする。
【０００３】
その修飾によって、静電気が変化してＤＮＡとヒストン八量体との相互作用が緩まるため、ヒストンアセチル化は、通常、遺伝子転写の活性化と関連する。この物理的変化に加えて、特異的タンパク質はヒストン内でアセチル化リシン残基と結合して、後成的コードを読み取る。ブロモドメインは、ヒストンとの関連に限らないが、通常、アセチル化リシン残基と結合するタンパク質内の小さい（約１１０アミノ酸）特徴的なドメインである。ブロモドメインを含有することが知られている約５０タンパク質のファミリーが存在し、それらは細胞内で様々な機能を有する。
【０００４】
ブロモドメインを含有するタンパク質のさいてきなＢｅｔファミリーは、近接して２つのアセチル化リシン残基に結合できるタンデムブロモドメインを含有する４つのタンパク質（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４およびＢＲＤ−ｔ）を含み、相互作用の特異性を増加させる。ＢＲＤ２およびＢＲＤ３は、活性な転写遺伝子と共にヒストンと会合することが報告されており、転写伸長の促進にに関与するとされ（非特許文献１（Ｌｅｒｏｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００８ ３０（１）：５１−６０））、一方、ＢＲＤ４は、ｐＴＥＦ−Ｂ複合体が誘導的遺伝子にリクルートするのに関与し、それに伴いＲＮＡポリメラーゼのリン酸化が生じ、転写生産が増加するようである（非特許文献２（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら，Ｃｅｌｌ，２００９ １３８（１）：１２９−１４５））。また、ＢＲＤ４およびＢＲＤ３はＮＵＴ（睾丸中の核タンパク質）と融合して、上皮腫瘍の高度な悪性形態において、新規な融合癌遺伝子ＢＲＤ４−ＮＵＴを形成することが報告されている（非特許文献３（Ｆｒｅｎｃｈら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，６３，３０４−３０７）および非特許文献４（Ｆｒｅｎｃｈら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００４，２２（２０），４１３５−４１３９））。データでは、ＢＲＤ−ＮＵＴ融合タンパク質が発癌の原因であることが示唆されている（非特許文献５（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８，２７，２２３７−２２４２））。ＢＲＤ−ｔは睾丸および卵巣において一意的に発現される。全てのファミリーメンバーは、細胞周期の局面を制御または実行する機能の一部を有すると報告されており、細胞分裂の間、染色体との複合体に存在することが示されており、これらのことから、後成的メモリの維持における役割が示唆される。加えて、一部のウイルスは、ウイルス複製のプロセスの一部として、それらのタンパク質を使用して、それらのゲノムを宿主細胞クロマチンにつなぎ止める（非特許文献６（Ｙｏｕら，Ｃｅｌｌ，２００４ １１７（３）：３４９−６０））。
【０００５】
特許文献１（特開２００８−１５６３１１号公報）は、ウイルス感染／増殖に対して有用性を有するＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤と言われているベンズイミダゾール誘導体を開示している。
【０００６】
特許文献２（国際公開第２００９／０８４６９３Ａ１号パンフレット）は、アセチル化ヒストンと、抗癌剤として有用であると言われているブロモドメイン含有タンパク質との間の結合を阻害すると言われている一連のチエノトリアゾロジアゼピン誘導体を開示している。
【０００７】
ブロモドメインと、その同種アセチル化タンパク質との結合を阻害する化合物、より具体的には、アセチル化リシン残基に対する最適なファミリーのブロモドメインの結合を阻害する化合物が見出されている。このような化合物は、本明細書中で「ブロモドメイン阻害剤」と称される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１５６３１１号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／０８４６９３Ａ１号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌｅｒｏｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００８ ３０（１）：５１−６０
【非特許文献２】Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら，Ｃｅｌｌ，２００９ １３８（１）：１２９−１４５
【非特許文献３】Ｆｒｅｎｃｈら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，６３，３０４−３０７
【非特許文献４】Ｆｒｅｎｃｈら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００４，２２（２０），４１３５−４１３９
【非特許文献５】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８，２７，２２３７−２２４２
【非特許文献６】Ｙｏｕら，Ｃｅｌｌ，２００４ １１７（３）：３４９−６０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様において、式（Ｉ）の化合物またはその塩
【化１】
【００１１】
が提供される。
【００１２】
本発明の第２の態様において、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物が提供される。
【００１３】
本発明の第３の態様において、治療、特にブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容可能な塩が提供される。
【００１４】
本発明の第４の態様において、被験体においてブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態を治療する方法であって、治療的に有効な量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を、それを必要とする被験体投与することを含んでなる、前記方法が提供される。
【００１５】
本発明の第５の態様において、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態を治療するための薬剤の製造における式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容可能な塩の使用が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミドである式（Ｉ）の化合物
【化２】
【００１７】
またはその塩に関する。
【００１８】
本発明は、遊離塩基としておよびその塩として、例えばその医薬的に許容可能な塩として式（Ｉ）の化合物を含むことが理解されるだろう。
【００１９】
一実施形態において、２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミドである化合物が提供される。
【００２０】
薬剤におけるそれらの潜在的使用のために、式（Ｉ）の化合物の塩は望ましくは医薬的に許容可能である。別の実施形態において、２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミドである化合物またはその医薬的に許容可能な塩が提供される。
【００２１】
好適な医薬的に許容可能な塩としては酸または塩基付加塩が挙げられ得る。好適な塩に関する概説については、Ｂｅｒｇｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６：１−１９，（１９７７）を参照のこと。典型的に、医薬的に許容可能な塩は、必要に応じて所望の酸または塩基を用いることによって容易に調製できる。得られる塩は溶液から沈殿して、濾過により収集され得るか、または溶媒の蒸発により回収され得る。
【００２２】
医薬的に許容可能な塩基付加塩は、例えば結晶化および濾過によって通常単離される塩基付加塩を得るために、任意に好適な溶媒中で、式（Ｉ）の化合物と、好適な無機または有機塩基（例えばトリエチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、コリン、アルギニン、リシンまたはヒスチジン）とを反応させることによって形成できる。医薬的に許容可能な塩基塩としては、アンモニウム塩、ナトリウムおよびカリウムのものなどのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウムのものなどのアルカリ土類金属塩、ならびにイソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミンおよびＮ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンの塩を含む、有機塩基との塩が挙げられる。
【００２３】
医薬的に許容可能な酸付加塩は、例えば結晶化および濾過によって通常単離される塩を得るために、任意に有機溶媒などの好適な溶媒中で、式（Ｉ）の化合物と、好適な無機または有機酸（例えば臭化水素酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、コハク酸、マレイン酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸（例えば２−ナフタレンスルホン酸、またヘキサン酸））との反応によって形成できる。式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容可能な酸付加塩は、例えば、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩（例えば２−ナフタレンスルホン酸塩）またはヘキサン酸塩を含み得るか、またはそれらであり得る。
【００２４】
他の医薬的に許容可能でない塩、例えばギ酸塩、シュウ酸塩またはトリフルオロ酢酸塩が、例えば、式（Ｉ）の化合物の単離において使用されてもよく、本発明の範囲内に含まれる。
【００２５】
本発明は、その範囲内において、式（Ｉ）の化合物の塩の全ての可能な化学量論および非化学量論形態を含む。
【００２６】
多くの有機化合物は、溶媒中でそれらが反応するその溶媒と錯体を形成でき、またはそれらが溶媒から沈殿もしくは結晶化するその溶媒と錯体を形成できることが理解されるだろう。これらの錯体は「溶媒和物」として知られている。例えば、水との錯体は「水和物」として知られている。高い沸点を有するおよび／または水素結合を形成できる溶媒、例えば水、キシレン、Ｎ−メチルピロリジノン、メタノールおよびエタノールが溶媒和物を形成するために使用されてもよい。溶媒和物の同定方法には、限定されないが、ＮＭＲおよび微量分析が含まれる。式（Ｉ）の化合物の溶媒和物は本発明の範囲内である。
【００２７】
本発明は、その範囲内において、式（Ｉ）の化合物の溶媒和物の全ての可能な化学量論および非化学量論形態を含む。
【００２８】
本発明は、受容者への投与時に、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩、あるいはその活性代謝産物または活性残基を（直接または間接的に）与えることができる、式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩の全てのプロドラッグを包含する。そのような誘導体は、過度の実験を必要とせずに当業者に認識可能である。しかし、参照は、Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ １：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅの教示に対してなされる（その文献はこのような誘導体を教示する範囲で本明細書に参照として組み込まれる）。
【００２９】
式（Ｉ）の化合物は結晶形態または非結晶形態であってもよい。さらに、式（Ｉ）の化合物の結晶形態の一部は多型体として存在してもよく、本発明の範囲内に含まれる。式（Ｉ）の化合物の多型体形態は、限定されないが、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターン、赤外線（ＩＲ）スペクトル、ラマンスペクトル、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、熱重量分析（ＴＧＡ）および固体核磁気共鳴（ＳＳＮＭＲ）を含む、多くの従来の分析技術を用いて特徴付けられ、識別され得る。
【００３０】
式（Ｉ）の化合物は、実質的に他の異性体を含まない（すなわち鏡像異性的に純粋）ように単離された個々の異性体であるので、１０％未満、特に約１％未満、例えば約０．１％未満の他の鏡像異性体が存在する。
【００３１】
異性体の分離は、当業者に公知の従来の技術によって、例えば分別結晶、クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣによって達成され得る。
【００３２】
式（Ｉ）の化合物は数個の互変異性型のうちの１つで存在し得る。本発明は、個々の互変異性体としてまたはそれらの混合物として、いずれにせよ式（Ｉ）の化合物の全ての互変異性体を包含することは理解されるだろう。
【００３３】
式（Ｉ）の化合物またはその塩の溶媒和物、異性体および多型体は本発明の範囲内に含まれることは上述から理解されるだろう。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩は、標準的な化学を含む、種々の方法によって作製され得る。例示の一般的合成方法を以下に記載し、次いで式（Ｉ）の特定の化合物を、処理実施例において調製する。これらのプロセスは本発明のさらなる態様を形成する。
【００３５】
式（Ｉ）の化合物は、反応スキーム１に従って、室温にてＨＡＴＵまたはＨＢＴＵおよびＤＩＥＡの存在下で、式（ＩＩ）の化合物とＥｔＮＨ２との反応によって調製できる。代替として、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）の化合物と塩化オキサリルとを反応させ、続いてトリエチルアミンの存在下でＥｔＮＨ２を添加することによって調製できる。
【化３】
【００３６】
式（ＩＩ）の化合物は反応スキーム２に従って調製できる。適切な反応条件は、式（ＩＩＩ）の化合物と、アルカリ性水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウムまたは水酸化リチウムとを反応させることを含む。
【化４】
【００３７】
式中、ＲはメチルなどのＣ１−６アルキルを表す。
【００３８】
式（ＩＩＩ）の化合物は、反応スキーム３に従って、式（ＩＶ）の化合物とＡｃＯＨとを反応させることによって調製できる。
【化５】
【００３９】
式（ＩＶ）の化合物は、反応スキーム４に従って、１５℃以下で式（ＶＩ）の化合物とヒドラジンとを反応させ、続いて０℃にて得られたヒドラゾン（Ｖ）とＭｅＣＯＣｌとの反応によって調製できる。通常、ヒドラゾン（Ｖ）はさらに精製せずに使用され、例えば０℃にてＭｅＣＯＣｌと反応される。
【化６】
【００４０】
ＲがＣ１−６アルキル（例えばメチル）である式（ＶＩ）の化合物は、反応スキーム５に従って、ローソン試薬（Ｌａｗｅｓｓｏｎ‘ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）またはＰ４Ｓ１０での処理によって式（ＶＩＩ）の化合物から調製できる。好適な反応条件は、例えば７０℃にて１，２−ジクロロエタン中で式（ＶＩＩＩ）の化合物とＰ４Ｓ１０とを反応させることを含む。
【化７】
【００４１】
式（ＶＩＩ）の化合物は、反応スキーム６に従って、式（ＩＸ）の化合物とトリエチルアミンなどの有機塩基とを反応させ、続いて得られたアミン（ＶＩＩＩ）と酢酸との反応によって調製できる。通常、アミン（ＶＩＩＩ）はさらに精製せずに使用され、例えば６０℃にてＡｃＯＨと反応される。
【化８】
【００４２】
式（ＩＸ）の化合物は、反応スキーム７に従って、式（ＸＩ）の化合物と保護されたアスパラギン酸由来の塩化アシル（Ｘ）とを反応させることによって調製できる。
【化９】
【００４３】
式（ＸＩ）の化合物は、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９８０，６７７−６８８に記載される手順に従って調製できる。式（Ｘ）の塩化アシルは、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，５５，３０６８−３０７４およびＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，２００１，１６７３−１６９５に記載される手順に従って調製できる。
【００４４】
代替として、式（Ｉ）の化合物は反応スキーム８に従って調製できる。
【化１０】
【００４５】
式中、ＲはメチルなどのＣ１−４アルキルを表す。
【００４６】
式（ＩＩＩＡ）の化合物は、反応スキーム９に従って、例えば室温にてＨＡＴＵおよびＤＩＥＡの存在下で式（ＩＶＡ）の化合物とＥｔＮＨ２とを反応させることによって調製できる。
【化１１】
【００４７】
式（ＩＶＡ）の化合物は反応スキーム１０に従って調製できる。好適な反応条件は、式（ＶＩ）の化合物と、水酸化ナトリウムなどのアルカリ性水酸化物とを反応させることを含む。
【化１２】
【００４８】
上記プロセスに記載した化合物の１つ以上の官能基を保護することは有益であり得ることは当業者によって理解されるだろう。保護基およびそれらの除去手段の例は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ 「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（第４版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２００６）に見出され得る。好適なアミン保護基としては、アシル（例えばアセチル、カルバメート（例えば２’，２’，２’−トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブトキシカルボニル）およびアリールアルキル（例えばベンジル）が挙げられ、それらは、加水分解（例えばジオキサン中の塩酸またはジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸などの酸を用いること）によって除去され得るか、または必要に応じて還元的（例えばベンジルまたはベンジルオキシカルボニル基の水素化分解または酢酸中の亜鉛を用いる２’，２’，２’−トリクロロエトキシカルボニル基の還元的除去）によって除去され得る。他の好適なアミン保護基としては、塩基触媒加水分解により除去され得るトリフルオロアセチル（−ＣＯＣＦ３）が挙げられる。
【００４９】
上記の経路のいずれの場合も、種々の基および部分が分子内に導入される合成工程の正確な順序は変更されてもよいことが理解されるだろう。プロセスの一段階で導入される基または部分が、その後の変換および反応に影響を与えないことを保証し、それに応じて合成工程の順序を選択することは当業者の範囲内であろう。
【００５０】
上記の特定の中間体化合物は新規であり、従って本発明のさらなる態様を形成すると考えられる。
【００５１】
式（Ｉ）の化合物およびその塩はブロモドメイン阻害剤であるので、ブロモドメインが適応される疾患または病態の治療において潜在的有用性を有すると考えられる。
【００５２】
従って、本発明は、治療に使用するための式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。式（Ｉ）の化合物またはその医薬的塩は、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療に使用するためとなり得る。
【００５３】
一実施形態において、ブロモドメインが適応される疾患または病態の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩が提供される。別の実施形態において、慢性自己免疫病態および／または炎症病態の治療に使用するための化合物またはその医薬的に許容可能な塩が提供される。さらなる実施形態において、正中線癌（ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）などの癌の治療に使用するための化合物またはその医薬的に許容可能な塩が提供される。
【００５４】
一実施形態において、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態を治療するための薬剤の製造における式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用が提供される。別の実施形態において、慢性自己免疫病態および／または炎症病態を治療するための薬剤の製造における式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用が提供される。さらなる実施形態において、正中線癌などの癌を治療するための薬剤の製造における式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用が提供される。
【００５５】
一実施形態において、被験体においてブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態を治療する方法であって、治療的に有効量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、前記方法が提供される。別の実施形態において、被験体において慢性自己免疫病態および／または炎症病態を治療する方法であって、治療的に有効量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、方法が提供される。さらなる実施形態において、被験体において正中線癌などの癌を治療する方法であって、治療的に有効量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、方法が提供される。
【００５６】
一実施形態において、それを必要とする被験体は哺乳動物、特にヒトである。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、例えば研究者または臨床医によって求められる組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的反応を引き起こす薬物または薬剤の量を意味する。さらに、用語「治療的に有効量」は、そのような量を受容していない対応する被験体と比較して、疾患、症状、もしくは副作用の改善された治療、治癒、予防、または寛解を生じる量、または疾患もしくは障害の進行の速度を減少させる量を意味する。この用語はまた、その範囲内において、正常な生理学的機能を高めるのに有効な量を含む。
【００５８】
ブロモドメイン阻害剤は、全身または組織炎症、感染または低酸素に対する炎症反応、細胞活性化および増殖、脂質代謝、線維症に関連する種々の疾患または病態の治療、ならびにウイルス感染の予防および治療に有用であると考えられている。
【００５９】
ブロモドメイン阻害剤は、リウマチ性関節炎、骨関節炎、急性痛風、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、ぜんそく、慢性閉塞性気道疾患、肺炎、心筋炎、心膜炎、筋炎、湿疹、皮膚炎、脱毛症、白斑、水疱性皮膚疾患、腎炎、血管炎、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、鬱病、網膜炎、ブドウ膜炎、強膜炎、肝炎、膵炎、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、アジソン病、下垂体炎、甲状腺炎、Ｉ型糖尿病および移植器官の急性拒絶などの種々の慢性自己免疫病態および炎症病態の治療に有用であり得る。
【００６０】
ブロモドメイン阻害剤は、急性痛風、巨細胞性動脈炎、ループス腎炎を含む腎炎、糸球体腎炎などの臓器病変を伴う血管炎、巨細胞性動脈炎を含む血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、ベーチェット病、川崎病、高安動脈炎および移植器官の急性拒絶などの種々の急性炎症病態の治療に有用であり得る。
【００６１】
ブロモドメイン阻害剤は、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物またはそれらの毒素による感染に対する炎症反応を含む疾患または病態、例えば敗血症、敗血症症候群、敗血性ショック、内毒素血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群、毒素性ショック症候群、急性肺損傷、ＡＲＤＳ（成人呼吸窮迫症候群）、急性腎不全、劇症肝炎、熱傷、急性膵炎、手術後症候群、サルコイドーシス、ヘルクスハイマー反応、脳炎、脊髄炎、髄膜炎、マラリア、インフルエンザなどのウイルス感染に関連するＳＩＲＳ、帯状疱疹、単純ヘルペスおよびコロナウイルスの予防または治療に有用であり得る。
【００６２】
ブロモドメイン阻害剤は、心筋梗塞、脳血管虚血（脳卒中）、急性冠症候群、腎臓再灌流障害、臓器移植、冠動脈バイパス移植、心臓−肺バイパス処置などの虚血−再灌流障害に関連する病態および肺、腎臓、肝臓、胃腸または末梢四肢塞栓症の予防または治療に有用であり得る。
【００６３】
ブロモドメイン阻害剤は、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症およびアルツハイマー病などのＡＰＯ−Ａ１の調節による脂質代謝の障害の治療に有用であり得る。
【００６４】
ブロモドメイン阻害剤は、特発性肺線維症、腎線維症、術後狭窄、ケロイド形成、強皮症および心筋線維症などの線維性病態の治療に有用であり得る。
【００６５】
ブロモドメイン阻害剤は、ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルスおよび他のＤＮＡウイルスなどのウイルス感染の予防および治療に有用であり得る。
【００６６】
ブロモドメイン阻害剤は、血液癌（例えば白血病）、肺癌、乳癌、結腸癌を含む上皮癌、正中線癌、間葉癌、肝臓腫瘍、腎腫瘍および神経学的腫瘍を含む癌の治療に有用であり得る。
【００６７】
ブロモドメイン阻害剤は、ドライアイなどの眼科適応症の治療に有用であり得る。
【００６８】
一実施形態において、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態は、敗血症、熱傷、膵炎、大外傷、出血および虚血などの全身性炎症反応症候群に関連する疾患から選択される。この実施形態において、ブロモドメイン阻害剤は、ＳＩＲＳ、急性肺障害、ＡＲＤＳ、急性腎障害、肝障害、心外傷および胃腸障害の発症を含む、ショック状態、多臓器機能不全の発症の発生率および死亡率を減少させるために診断の時点で投与される。別の実施形態において、ブロモドメイン阻害剤は、高リスクの敗血症、出血、広範な組織損傷、ＳＩＲＳまたはＭＯＤＳに関連する外科手術または他の処置前に投与される。特定の実施形態において、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態は、敗血症、敗血症症候群、敗血性ショックおよび／または内毒素血症である。別の実施形態において、ブロモドメイン阻害剤は、急性または慢性膵炎の治療に適応される。別の実施形態において、ブロモドメインは熱傷の治療に適応される。
【００６９】
一実施形態において、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態は、単純ヘルペス感染および再活性化、ヘルペス、帯状疱疹感染および再活性化、水痘、帯状疱疹、ヒトパピローマウイルス、子宮頸部新生物、急性呼吸器疾患を含むアデノウイルス感染、ならびに牛痘および天然痘およびアフリカブタコレラウイルスなどのポックスウイルス感染から選択される。１つの特定の実施形態において、ブロモドメイン阻害剤は、皮膚または子宮頸部上皮のヒトパピローマウイルス感染の治療に適応される。
【００７０】
用語「ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態」は、上記の疾患状態のいずれかまたは全てを含むことを意図する。
【００７１】
治療に使用するために、式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩はそのままの化学物質として投与され得ることも可能であるが、医薬組成物として活性成分が提供されることが一般的である。
【００７２】
従って、本発明は、さらなる態様において、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物を提供する。
【００７３】
このように、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含んでなる、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態を治療するための医薬組成物が提供される。
【００７４】
このような医薬組成物に使用される担体、希釈剤または賦形剤は、組成物の他の成分と適合性があり、その受容者に有害ではないという意味で許容可能でなければならない。本発明の別の態様によれば、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容可能な塩と、１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを混合することを含んでなる、医薬組成物を調製するプロセスもまた提供される。医薬組成物は本明細書に記載される病態のいずれかを治療するのに使用され得る。
【００７５】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩は医薬組成物に使用することを意図されるので、それらは各々好ましくは実質的に純粋な形態、例えば少なくとも６０％の純度、より好適には少なくとも７５％の純度、好ましくは少なくとも８５％の純度、特に少なくとも９８％の純度（重量ベースでの重量％）で提供されることは容易に理解されるだろう。
【００７６】
医薬組成物は、単位投薬あたり所定量の活性成分を含有する単位投薬形態で提供され得る。好ましい単位投薬組成物は、活性成分の日用量またはサブ用量またはその適切な画分を含有するものである。従って、このような単位投薬は１日に１回より多く投与されてもよい。好ましい単位投薬組成物は、本明細書の上記に記載したように、（１日に１回より多く投与するための）活性成分の日用量またはサブ用量またはその適切な画分を含有するものである。
【００７７】
医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば経口（口腔または舌下を含む）、直腸、吸入、鼻腔内、局所（口腔、舌下または経皮を含む）、膣内または非経口（皮下、筋肉内、静脈内または皮内を含む）経路による投与に適合され得る。そのような組成物は、薬剤の分野において公知の任意の方法、例えば活性成分と担体または賦形剤とを混合することによって調製され得る。
【００７８】
一実施形態において、医薬組成物は経口投与に適合される。
【００７９】
一実施形態において、医薬組成物は非経口投与、特に静脈内投与に適合される。
【００８０】
非経口投与に適合される医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および組成物を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射液、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液を含む。組成物は、単位投薬または複数回投薬容器、例えば密閉アンプルおよびバイアルに提供されてもよく、使用の直前に、滅菌液担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。即座の注射溶液および懸濁剤が、滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製されてもよい。
【００８１】
経口投与に適合される医薬組成物は、カプセル剤または錠剤、粉末または顆粒、水性または非水性液体中の溶剤または懸濁剤、食用泡状物またはホイップ、あるいは水中油液体エマルションまたは油中水液体エマルションなどの別個の単位として調製されてもよい。
【００８２】
例えば、錠剤またはカプセル剤の形態の経口投与のために、活性薬物成分が、経口、非毒性の医薬的に許容可能な不活性担体、例えばエタノール、グリセロール、水などと混合されてもよい。錠剤またはカプセル剤に組み込むのに好適な粉末は、化合物を（例えば微粒子化により）好適な微細サイズに低減し、食用炭水化物（例えばデンプンまたはマンニトール）などの同様に調製した医薬担体と混合することによって調製され得る。矯味矯臭剤、防腐剤、分散剤および着色剤も存在してもよい。
【００８３】
カプセル剤は、上記のように粉末混合物を調製し、形成したゼラチンシースを充填することによって作製され得る。コロイド状シリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたは固体ポリエチレングリコールなどの流動促進剤および潤滑剤が、充填操作の前に粉末混合物に適合されてもよい。寒天、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤もまた、カプセルが摂取される場合の薬剤の利用可能性を改良するために添加されてもよい。
【００８４】
さらに、所望または必要な場合、好適な結合剤、流動促進剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、崩壊剤および着色剤もまた、混合物に組み込まれてもよい。好適な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、グルコースまたはβ−ラクトースなどの天然糖、コーンシロップ、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが挙げられる。これらの投薬形態に使用される潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが挙げられる。錠剤は、例えば、粉末混合物を調製すること、顆粒化または乾燥圧縮し（ｓｌｕｇｇｉｎｇ）、潤滑剤および崩壊剤を錠剤内に添加すること、および圧入することによって処方される。粉末混合物は、好適に粉末状にした化合物と、上記のような希釈剤または基剤、任意に、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、またはポリビニルピロリドンなどの結合剤、パラフィンなどの溶液遅延剤、第四級塩などの吸収促進剤、および／またはベントナイト、カオリンもしくはリン酸二カルシウムなどの吸収剤とを混合することによって調製される。粉末混合物は、シロップ剤、デンプン糊、アラビアゴム粘液（ａｃａｄｉａ ｍｕｃｉｌａｇｅ）またはセルロースもしくはポリマー材料の溶液などの結合剤で湿潤させて、それをふるいにかけて圧縮することによって顆粒化され得る。顆粒化の代わりとして、粉末混合物を打錠機に通し、不均一な形状の塊を与え、それを破砕して顆粒を形成することができる。錠剤成形型に粘着するのを防ぐために、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、または鉱油を添加することによって、顆粒を潤滑させることができる。次いで潤滑した混合物を圧縮して錠剤を与える。本発明の化合物を、易流動性の不活性の担体と組合わせ、次いで直接圧縮して、粒状化または乾燥圧縮ステップを行わずに錠剤を与えることもできる。セラックシーリング層、糖またはポリマー材料の層、およびワックスの光沢層からなる透明または不透明な保護層が存在してよい。異なる投薬単位を区別できるようにするために、これらのコーティングに色素を添加することができる。
【００８５】
例えば、溶剤、シロップ剤、およびエリキシル剤などの経口用液剤は、所与の量が、予め指定された量の化合物を含むように、投薬単位形態で調製することができる。シロップ剤は、化合物を適切な風味を有する水溶液中に溶解させることによって調製することができ、エリキシル剤は、非毒性のアルコールビヒクルを使用して調製される。懸濁液は、化合物を非毒性のビヒクル中に分散させることによって製剤化することができる。例えば、エトキシ化イソステアリルアルコールおよびポリオキシエチレンソルビトールエーテルなどの可溶化剤および乳剤、保存剤、例えばペパーミント油または天然甘味剤もしくはサッカリンなどの香味添加剤、あるいは他の人口甘味剤等も同様に添加することができる。
【００８６】
経口投与用の投薬単位組成物は、所望によりマイクロカプセル中に封入することができる。製剤は、例えばポリマー、ワックスなどで粒状材料をコーティングするまたは埋め込むことによって、放出を延長または遅延させるようにするやり方で調製することもできる。
【００８７】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩はまた、例えば、小型単層小胞、大型単層小胞、および多重膜小胞などのリポソーム送達系の形態で投与することもできる。リポソームは、例えば、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンなどの様々なリン脂質から形成することができる。
【００８８】
局所投与に適合する医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油として製剤化することができる。
【００８９】
目、または他の外組織、例えば口および皮膚などの治療では、組成物は好ましくは局所用軟膏またはクリームとして塗布される。軟膏を与える製剤の場合、活性成分はパラフィン系または水混和性クリームベースと共に使用することができる。あるいは、活性成分は、水中油クリームベースまたは油中水ベースのクリームと共に与えるように製剤化することもできる。
【００９０】
目の局所塗布に適合する医薬組成物には、活性成分が適切な担体、特に水性溶媒に溶解または懸濁した点眼剤が含まれる。
【００９１】
鼻腔または吸入投与のための投薬形態は簡便にはエアロゾル、溶液、懸濁剤、ゲルまたは乾燥粉末として製剤化され得る。
【００９２】
吸入投与に好適および／または適合する組成物に関して、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩は、例えば微粒子化によって得た、粒径が低減した形態で存在することが好ましい。サイズが低減した（例えば微粒子化した）化合物または塩の好ましい粒径は、（例えばレーザー回折を用いて測定した場合）約０．５〜約１０ミクロンのＤ５０値により規定される。
【００９３】
例えば吸入投与のためのエアロゾル製剤は、医薬的に許容可能な水性または非水性溶媒中に活性物質の溶液または微細懸濁液を含んでもよい。エアロゾル製剤は、カートリッジの形態をとり得るかまたは使用するために噴霧装置もしくは吸入器に充填される、密閉容器内の滅菌形態で単回または複数回用量で提供されてもよい。あるいは、密閉容器は、単回用量の、容器の内容物が使い尽くされると処分されることを意図する絞り弁が装着されている鼻吸入器またはエアロゾルディスペンサー（例えば計量式吸入器）などの単一の調剤装置であってもよい。
【００９４】
投薬形態がエアロゾルディスペンサーを含む場合、それは好ましくは、圧縮空気、二酸化炭素などの圧力下で好適な推進剤、またはヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）などの有機推進剤を含有する。好適なＨＦＣ推進剤としては、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンが挙げられる。エアロゾル投薬形態はまた、ポンプ噴霧器の形態をとってもよい。加圧エアロゾルは、活性化合物の溶液または懸濁液を含有してもよい。これは、追加の賦形剤、例えば懸濁化製剤の分散特性および均一性を改良するために共溶媒および／または界面活性剤の組み込みを必要としてもよい。溶液製剤はまた、エタノールなどの共溶媒の添加を必要としてもよい。
【００９５】
吸入投与に好適および／または適合する医薬組成物に関して、その医薬組成物は吸入可能な乾燥粉末組成物であってもよい。そのような組成物は、ラクトース、グルコース、トレハロース、マンニトールまたはデンプンなどの粉末基剤、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩（好ましくは粒径が低減した形態、例えば微粒子形態）と、任意にＬ−ロイシンもしくは別のアミノ酸および／またはステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムなどのステアリン酸の金属塩などの性能修飾剤を含んでもよい。好ましくは、吸入可能な乾燥粉末組成物は、ラクトース、例えばラクトース一水和物と、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩との乾燥粉末混合物を含む。そのような組成物は、例えば英国特許第２２４２１３４Ａ号明細書に記載されているＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって市販されているＤＩＳＫＵＳ（登録商標）装置などの適切な装置を用いて患者に投与されてもよい。
【００９６】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩は、流体ディスペンサー、例えば分配ノズルまたは分配オリフィスを有する流体ディスペンサーから送達するための流体製剤として製剤化され得、使用者が流体ディスペンサーのポンプ機構に付与した力の適用時に、その分配ノズルまたは分配オリフィスを通して定量の流体製剤が分配される。このような流体ディスペンサーには一般に定量される複数回用量の流体製剤のリザーバーが設けられ、順次ポンプが作動する時に、その用量が分配可能になる。分配ノズルまたはオリフィスは、流体製剤を鼻腔内に噴霧分配するために使用者の鼻孔に挿入するように構成され得る。上述の種類の流体ディスペンサーは国際公開第２００５／０４４３５４Ａ１号に記載され、例示されている。
【００９７】
治療有効量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩は、例えば、動物の年齢および体重、治療を必要とする正確な病態およびその重症度、製剤の性質、ならびに投与経路を含む、多くの要因に依存し、最終的に担当医または獣医の判断による。医薬組成物において、経口または非経口投与のための各投薬単位は、遊離塩基として算出して、好ましくは０．０１〜３０００ｍｇ、より好ましくは０．５〜１０００ｍｇの式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含む。鼻腔または吸入投与のための各投薬単位は、遊離塩基として算出して、好ましくは０．００１〜５０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜５ｍｇの式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含む。
【００９８】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩は、（成人患者について）例えば遊離塩基として算出して、０．０１ｍｇ〜３０００ｍｇ／日または０．５〜１０００ｍｇ／日の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の経口または非経口用量で、あるいは０．００１〜５０ｍｇ／日または０．０１〜５ｍｇ／日の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の鼻腔または吸入用量で１日に１回投与されてもよい。この量は、１日に１回与えられてもよく、またはより通常は、１日あたりサブ用量の回数（２回、３回、４回、５回または６回など）で与えられてもよく、それにより全日用量は同じとなる。有効量のその医薬的に許容可能な塩は、有効量の式（Ｉ）の化合物自体の割合として決定されてもよい。
【００９９】
このように、ａ）０．０１〜３０００ｍｇの式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩、および（ｂ）０．１〜２ｇの１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【０１００】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩は、単独で、または他の治療剤と組合わされて利用され得る。このように本発明による組合せ治療は、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の投与、および少なくとも１種の他の医薬的に活性な薬剤の使用を含む。好ましくは、本発明による組合せ治療は、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、少なくとも１種の他の医薬的に活性な薬剤との投与を含む。式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩と、他の医薬的に活性な薬剤は、単一の医薬組成物中で一緒に投与されてもよく、または別個に投与されてもよく、別個に投与される場合、これは同時または任意の順序で連続して行われてもよい。式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩と、他の医薬的に活性な薬剤の量、ならびに投与の相対的タイミングは所望の組合わせた治療効果を達成するために選択される。このように、さらなる態様において、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、少なくとも１種の他の医薬的に活性な薬剤とを含む組合せが提供される。一実施形態において、１種以上の他の治療活性剤と一緒に式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含む組合せ医薬品が提供される。
【０１０１】
このように、一態様において、本発明による式（Ｉ）の化合物および医薬組成物は、例えば、抗生物質、抗ウイルス、糖質コルチコステロイド、ムスカリン性アンタゴニストおよびβ−２アゴニストから選択される１種以上の他の治療剤と組み合わせて、またはそれらを含んで使用され得る。
【０１０２】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩が、通常、吸入、静脈内、経口または鼻腔内経路によって投与される他の治療剤と組合わされて投与される場合、得られる医薬組成物は同じ経路によって投与され得ることは理解されるだろう。代替として、組成物の個々の成分は異なる経路によって投与されてもよい。
【０１０３】
本発明の一実施形態は、１種または２種の他の治療剤を含む組合せを含む。
【０１０４】
必要に応じて、治療成分の活性および／または安定性および／または物理特性（例えば溶解度）を最適化するために、他の治療成分が、塩の形態で、例えばアルカリ金属もしくはアミン塩としてまたは酸付加塩として、またはプロドラッグ、またはエステル、例えば低級アルキルエステルとして、または溶媒和物、例えば水和物として使用されてもよいことは、当業者にとって自明であろう。また、必要に応じて、光学的に純粋な形態で治療成分が使用されてもよいことも自明であろう。
【０１０５】
上記に参照した組合せは、医薬組成物の形態で使用するために簡便に提供され得るので、医薬的に許容可能な希釈剤または担体と共に上記の組合せを含む医薬組成物は本発明のさらなる態様を表す。
【０１０６】
式（Ｉ）の化合物は以下に記載する方法または同様の方法によって調製され得る。従って、以下の中間体および実施例は式（Ｉ）の化合物の調製を例示するためのものであり、決して本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【実施例】
【０１０７】
全体的な実験の詳細
全ての温度は℃で表す。
【０１０８】
略語
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
ＡｃＯＨ 酢酸
ＡｃＣｌ 塩化アセチル
ＰＰＴＳ ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム
ＤＣＭ ジクロロメタン
１，２−ＤＣＥ １，２−ジクロロエタン
ＤＩＣ ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＥＡ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＡＰ ４−ジメチルアミノピリジン
Ｆｍｏｃ ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル
ＨＡＴＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｅｔ２Ｏ ジエチルエーテル
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ｉ−Ｐｒ２Ｏ ジ−イソプロピルエーテル
Ｃｏｎｆｉｇ． 絶対配置
ローソン試薬 ２，４−ビス（４−メトキシフェニル）−１，３−ジチア−２，４−ジホスフェタン−２，４−ジスルフィド
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＭｅＯＨ メタノール
Ｒｔ 保持時間
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＲＴ 室温
Ｐｄ／Ｃ パラジウム炭素
ＬＣ／ＭＳは、２種類の装置で実施した分析用ＨＰＬＣによる分析を指す：
ａ）Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣＡＢＺ＋ＰＬＵＳカラム（３μｍ、３．３ｃｍ×４．６ｍｍ ＩＤ）では、０．１％ＨＣＯ２Ｈおよび０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）、ならびに９５％アセトニトリルおよび０．０５％ＨＣＯ２Ｈ水溶液（溶媒Ｂ）で、３ｍＬ／分の流速で以下の溶出勾配０〜０．７分 ０％Ｂ、０．７〜４．２分 ０→１００％Ｂ、４．２〜５．３分 １００％Ｂ、５．３〜５．５分 １００→０％Ｂを用いて溶出する。質量スペクトル（ＭＳ）を、エレクトロスプレー陽イオン化［（［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋ＮＨ４］＋分子イオンを得るためにＥＳ＋ｖｅ］またはエレクトロスプレー陰イオン化［（［Ｍ−Ｈ］−分子イオンを得るためにＥＳ−ｖｅ］モードを用いてＦｉｓｏｎｓ ＶＧ Ｐｌａｔｆｏｒｍ質量分析計で記録した。この装置からの分析データを以下のフォーマット：［Ｍ＋Ｈ］＋または［Ｍ−Ｈ］−で与える。
【０１０９】
ｂ）Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＲＰ１８カラム（１００×４．６ｍｍ ｉｄ）では、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）および１００％アセトニトリル（溶媒Ｂ）で、５ｍＬ／分の流速で以下の溶出勾配０〜４分 ０→１００％Ｂ、４〜５分 １００％Ｂを用いて溶出する。質量スペクトル（ＭＳ）を、大気圧化学陽イオン化［ＭＨ＋分子イオンを得るためにＡＰ＋ｖｅ］または大気圧化学陰イオン化［（Ｍ−Ｈ）−分子イオンを得るためにＡＰ−ｖｅ］モードを用いてｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ−ＬＣ質量分析計で記録した。この装置からの分析データを、両方の質量分析源の間で特定するために先行してアクロニムＡＰＣＩを行い、以下のフォーマット：［Ｍ＋Ｈ］＋または［Ｍ−Ｈ］−で与える。
【０１１０】
ＬＣ／ＨＲＭＳ：分析用ＨＰＬＣを、Ｕｐｔｉｓｐｈｅｒｅ−ｈｓｃカラム（３μｍ ３３×３ｍｍ ｉｄ）で、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）および１００％アセトニトリル（溶媒Ｂ）を用いて１．３ｍＬ／分の流速で以下の溶出勾配０〜０．５分 ５％Ｂ、０．５〜３．７５分 ５→１００％Ｂ、３．７５〜４．５ １００％Ｂ、４．５〜５ １００→５％Ｂ、５〜５．５ ５％Ｂにて溶出して行った。質量スペクトル（ＭＳ）を、エレクトロスプレー陽イオン化［ＭＨ＋分子イオンを得るためにＥＳ＋ｖｅ］またはエレクトロスプレー陰イオン化［（Ｍ−Ｈ）−分子イオンを得るためにＥＳ−ｖｅ］モードを用いてｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＴ質量分析計で記録した。
【０１１１】
マスディレクテッドオートプレプ（ｍａｓｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｕｔｏ−ｐｒｅｐ）ＨＰＬＣは、物質が、８ｍＬ／分の流速で以下の勾配溶出条件：０〜１．０分 ５％Ｂ、１．０〜８．０分 ５→３０％Ｂ、８．０〜８．９分 ３０％Ｂ、８．９〜９．０分 ３０→９５％Ｂ、９．０〜９．９分 ９５％Ｂ、９．９〜１０分 ９５→０％Ｂを利用する、０．１％ＨＣＯ２Ｈ水溶液および９５％ＭｅＣＮ、５％水（０．５％ ＨＣＯ２Ｈ）を用いるＨＰＬＣＡＢＺ＋５μｍカラム（５ｃｍ×１０ｍｍ ｉ．ｄ．）上での高速液体クロマトグラフィーによって精製される方法を指す。Ｇｉｌｓｏｎ ２０２画分回収器を、対象の質量を検出する時にＶＧ Ｐｌａｔｆｏｒｍ質量分析計で起動した。
【０１１２】
プロトンＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルを、内部標準として溶媒を用いてＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ３００ ＤＰＸ分光計で周囲温度にて記録し、プロトン化学シフトを所定の溶媒においてｐｐｍで表す。以下の略語を複数のＮＭＲシグナル：ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｄｄ＝双二重項（ｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅｔ）、ｍ＝多重項で使用する。
【０１１３】
ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）は、シリカゲル６０ Ｆ２５４でコーティングしたＭｅｒｃｋにより販売されているＴＬＣプレートの使用を指す。
【０１１４】
実施例１：２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミド
【化１３】
【０１１５】
室温にて、ＴＨＦ中の［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］酢酸（調製については、中間体１を参照）（１６．０ｇ、４０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（１４ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）、その後、ＨＡＴＵ（３０．４ｇ、８０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、３時間、この温度にて攪拌し、エチルアミン（４０ｍＬ、ＴＨＦ中２Ｍ、８０ｍｍｏｌ）を加えた。減圧下で濃縮させる前に、混合物を４８時間、攪拌した。粗物質を、水中で懸濁し、ＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。粗固体を、ＳｉＯ２でのクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ９５／５）によって精製し、得られた固体をＭｅＣＮ中で再結晶化した。固体を次いでＤＣＭ中に溶解し、ｉ−Ｐｒ２Ｏで沈殿させ、標題化合物（８ｇ、４７％の収率）を白色の固体として得た。
【０１１６】
Ｒｆ＝０．４８（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９０／１０）。Ｍｐ＞１４０°Ｃ（粘着性となる）。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５３−７．４７（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３７−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２０（ｄｄ，Ｊ＝２．９ａｎｄ８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），６．４０（ｍ，１Ｈ），４．６２（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．５１（ｄｄ，Ｊ＝７．３および１４．１Ｈｚ，１Ｈ），３．４６−３．２１（ｍ，３Ｈ），２．６２（ｓ，３Ｈ），１．１９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ）．ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ４２４［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．３３ｍｉｎ。
【０１１７】
中間体１：［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］酢酸
【化１４】
【０１１８】
室温にて、ＴＨＦ（４５０ｍＬ）中のメチル［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセテート（調製については、中間体２を参照）（２８ｇ、６８ｍｍｏｌ）の溶液に、１ＮのＮａＯＨ（１３６ｍＬ、１３６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、冷却する前に、５時間、この温度で攪拌し、１ＮのＨＣｌ（１３６ｍＬ）でクエンチした。ＴＨＦを減圧下で取り除き、水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗固体を、ＣＨ３ＣＮ中で再結晶化し、標題化合物（２３．９ｇ、８９％の収率）を淡黄色の粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５５−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３８−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２２（ｄｄ，Ｊ＝２．９ａｎｄ８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．５９（ｄｄ，Ｊ＝６．９ａｎｄ６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｄｄ，Ｊ＝６．９ａｎｄ２５．７Ｈｚ，１Ｈ），３．６１（ｄｄ，Ｊ＝６．９ａｎｄ２５．７Ｈｚ，１Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ）．ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ３９７［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．１１ｍｉｎ。
【０１１９】
中間体２：メチル［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセテート
【化１５】
【０１２０】
クルードのメチル［（３Ｓ）−２−［（１Ｚ）−２−アセチルヒドラジノ］−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、中間体３を参照）（３４ｇ、７９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２００ｍＬ）中に懸濁し、ＡｃＯＨ（２００ｍＬ）を室温にて加えた。反応混合物を濃縮乾固する前に、この温度で一晩攪拌した。残渣を飽和ＮａＨＣＯ３中に懸濁し、ＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。粗固体をＳｉＯ２でのクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９０／１０）によって精製し、標題化合物（２８ｇ、８６％の収率）を黄色の粉末として得た。
【０１２１】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５４−７．４７（ｍ，２Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３７−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２２（ｄｄ，Ｊ＝２．８ａｎｄ８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６１（ｄｄ，Ｊ＝６．４ａｎｄ７．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），３．６６（ｄｄ，Ｊ＝７．８ａｎｄ１６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．６０（ｄｄ，Ｊ＝６．４ａｎｄ１６．９Ｈｚ，１Ｈ），２．６２（ｓ，３Ｈ）．ＬＣ／ＭＳｍ／ｚ４１１［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．８８ｍｉｎ。
【０１２２】
中間体３：メチル［（３Ｓ）−２−［２−アセチルヒドラジノ］−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化１６】
【０１２３】
０℃にてＴＨＦ（８００ｍＬ）中のメチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、中間体４を参照）（３０．２ｇ、７７．７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ヒドラジン一水和物（１１．３ｍＬ、２３３ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を、０℃に冷却する前に、４時間、０℃から１５℃の間で攪拌した。Ｅｔ３Ｎ（３２．４ｍＬ、２３０ｍｍｏｌ）を次いでゆっくりと加え、ＡｃＣｌ（１６．３ｍＬ、２３０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を室温まで加温し、１時間攪拌し、次いで、水でクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた水層を次いでＤＣＭで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮して、粗標題化合物（３４ｇ、１００％の収率）を得て、それをさらに精製せずに用いた。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ ４２９［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．８３ｍｉｎ。
【０１２４】
中間体４：メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化１７】
【０１２５】
室温にて、１，２−ＤＣＥ（１．５Ｌ）中のＰ４Ｓ１０（８５．８ｇ、１９０ｍｍｏｌ）およびＮａ２ＣＯ３（２０．５ｇ、１９０ｍｍｏｌ）の懸濁液を、メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、中間体５を参照）（４０ｇ、１０７ｍｍｏｌ）を加える前に、１時間、攪拌した。得られた混合物を、冷却し濾過する前に、４時間、６５℃で攪拌した。固体を、ＤＣＭで洗浄し、濾過物を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。標題化合物を、ＤＣＭ／ｉ−Ｐｒ２Ｏの混合物から沈殿させ、濾過した。濾過物を次いで、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９８／２）により精製し、別のバッチの生成物を得た。２つの画分を合わせて標題化合物（３０．２ｇ、７３％）を黄色の粉末として得た。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ ３８９［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ３．２９ｍｉｎ。
【０１２６】
中間体５：メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化１８】
【０１２７】
ＤＣＭ（５００ｍＬ）中のクルードのメチルＮ１−［２−［（４−クロロフェニル）カルボニル］−４−（メチルオキシ）フェニル］−Ｎ２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパラギネート（ａｓｐａｒａｇｉｎａｔｅ）（調製については、中間体６を参照）（推定０．２ｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（５００ｍＬ、３．６５ｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、濃縮する前に２４時間、還流した。得られたクルードのアミンを１，２−ＤＣＥ（１．５Ｌ）中に溶解し、ＡｃＯＨ（１０４ｍＬ、１．８ｍｏｌ）を注意して加えた。次いで反応混合物を、真空中で濃縮する前に、２時間、６０℃で攪拌し、ＤＣＭ中に溶解した。有機層を１ＮのＨＣｌで洗浄し、水層をＤＣＭ（×３）で抽出した。合わせた有機層を２度、水および食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗固体を、ＭｅＣＮ中で再結晶化し、標題化合物（５１ｇ）を淡黄色の固体として得た。濾過物を濃縮し、ＭｅＣＮ中で再結晶化し、別の１０ｇの中間体９を得た（全体：回収した中間体１２に基づき６１ｇ、６９％の収率）。Ｒｆ＝０．３４（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９５／５）。ＬＣ／ＭＳ ｍ／ｚ ３７３［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．７６ｍｉｎ。
【０１２８】
中間体６：メチルＮ１−［２−［（４−クロロフェニル）カルボニル］−４−（メチルオキシ）フェニル］−Ｎ２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパラギネート
【化１９】
【０１２９】
ＣＨＣｌ３（４１０ｍＬ）中のメチルＮ−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパルチルクロリド（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，３０６８−３０７４およびＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ ２００１，１６７３−１６９５から調製）（２２１ｇ、０．５７ｍｏｌ）および［２−アミノ−５−（メチルオキシ）フェニル］（４−クロロフェニル）メタノン（調製については、中間体７を参照）（１３３ｇ、０．５ｍｏｌ）の混合物を、冷却する前に、１．５時間、６０℃で攪拌し、減圧下で濃縮し、さらに精製せずに用いた。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ ６１３［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ＝３．８９ｍｉｎ。
【０１３０】
中間体７：［２−アミノ−５−（メチルオキシ）フェニル］（４−クロロフェニル）メタノン
【化２０】
【０１３１】
０℃にて、トルエン（５６０ｍＬ）／エーテル（２００ｍＬ）混合物中の２−メチル−６−（メチルオキシ）−４Ｈ−３，１−ベンゾオキサジノン−４−オン（調製については、中間体８を参照）（４０．０ｇ、０．２１ｍｏｌ）の溶液に、４−クロロフェニル臭化マグネシウム（１７０ｍＬ、Ｅｔ２Ｏ中１Ｍ、０．１７ｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を室温まで加温し、１ＮのＨＣｌでクエンチする前に、１時間、攪拌した。水層をＥｔＯＡｃ（３×）で抽出し、合わせた有機物を食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗化合物を次いで、ＥｔＯＨ（４００ｍＬ）に溶解し、６ＮのＨＣｌ（１６０ｍＬ）を加えた。反応混合物を、減圧下で濃縮する前に、２時間、還流した。得られた固体を濾過し、ＥｔＯＡｃに懸濁する前に、エーテルで２度、洗浄し、１ＮのＮａＯＨで中和した。水層を、ＥｔＯＡｃ（３×）で抽出し、合わせた有機物を、食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。標題化合物を、黄色の固体（３９ｇ、８８％の収率）として得て、さらに精製せずに用いた。
【０１３２】
中間体８：２−メチル−６−（メチルオキシ）−４Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−４−オン
【化２１】
【０１３３】
５−メトキシアントラニル酸（７．８ｇ、４６．５ｍｍｏｌ）の溶液を、冷却する前に、２時間１５分、無水酢酸（６０ｍＬ）中で還流し、減圧下で濃縮した。粗残渣を次いで、濾過する前に、トルエンの存在下で２度、濃縮し、エーテルで洗浄し、標題化合物（６．８ｇ、７７％の収率）をベージュ色の固体として得た；ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ １９２［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｒｔ１．６９ｍｉｎ。
【０１３４】
生物検定法において使用するための基準化合物の調製
本明細書において参照されるＬＣ−ＭＳ法ＡおよびＢの実験詳細は以下の通りである：
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）は、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣＡＢＺ＋ＰＬＵＳカラム（３μｍ、３．３ｃｍ×４．６ｍｍ ＩＤ）で、０．１％ ＨＣＯ２Ｈおよび０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）、ならびに９５％アセトニトリルおよび０．０５％ＨＣＯ２Ｈ水溶液（溶媒Ｂ）を用いて、３ｍＬ／分の流速で以下の溶出勾配０〜０．７分 ０％Ｂ、０．７〜４．２分 ０→１００％Ｂ、４．２〜５．３分 １００％Ｂ、５．３〜５．５分 １００→０％Ｂを用いて溶出する実施した。質量スペクトル（ＭＳ）を、エレクトロスプレー陽イオン化［（［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋ＮＨ４］＋分子イオンを得るためにＥＳ＋ｖｅ］またはエレクトロスプレー陰イオン化［（［Ｍ−Ｈ］−分子イオンを得るためにＥＳ−ｖｅ］モードを用いてＦｉｓｏｎｓ ＶＧ Ｐｌａｔｆｏｒｍ質量分析計で記録した。この装置からの分析データは以下のフォーマット：［Ｍ＋Ｈ］＋または［Ｍ−Ｈ］−で与える。
【０１３５】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）は、Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８カラム（３０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．３．５μｍパッキング直径）で、０．１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を用いて、３ｍｌ／分の流速で以下の溶出勾配０〜０．１分 ３％Ｂ、０．１〜４．２分 ３〜１００％Ｂ、４．２〜４．８分 １００％Ｂ、４．８〜４．９分 １００〜３％Ｂ、４．９〜５．０分 ３％Ｂを用いて３０℃で溶出を実施した。ＵＶ検出は２１０ｎｍ〜３５０ｎｍの波長から平均化したシグナルであり、質量スペクトルを、陽イオンエレクトロスプレーイオン化を用いて質量分析計で記録した。イオン化データは整数まで四捨五入した。
【０１３６】
ＬＣ／ＨＲＭＳ：分析用ＨＰＬＣを、Ｕｐｔｉｓｐｈｅｒｅ−ｈｓｃカラム（３μｍ ３３×３ｍｍ ｉｄ）で、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）および１００％アセトニトリル（溶媒Ｂ）を用いて、１．３ｍＬ／分の流速で以下の溶出勾配０〜０．５分 ５％Ｂ、０．５〜３．７５分 ５→１００％Ｂ、３．７５〜４．５ １００％Ｂ、４．５〜５ １００→５％ Ｂ、５〜５．５ ５％Ｂを用いて溶出を実施した。質量スペクトル（ＭＳ）を、エレクトロスプレー陽イオン化［ＭＨ＋分子イオンを得るためにＥＳ＋ｖｅ］またはエレクトロスプレー陰イオン化［（Ｍ−Ｈ）−分子イオンを得るためにＥＳ−ｖｅ］モードを用いて、ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＴ質量分析計で記録した。
【０１３７】
ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）は、シリカゲル６０Ｆ２５４でコーティングしたＭｅｒｃｋによって販売されているＴＬＣプレートの使用を指す。
【０１３８】
シリカクロマトグラフィー技術は、自動化（ＦｌａｓｈｍａｓｔｅｒまたはＢｉｏｔａｇｅ ＳＰ４）技術または予め充填したカートリッジ（ＳＰＥ）での手動クロマトグラフィーまたは手動で充填したフラッシュカラムのいずれかを含む。
【０１３９】
基準化合物Ａ：２−メチル−６−（メチルオキシ）−４Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−４−オン
【化２２】
【０１４０】
５−メトキシアントラニル酸（ランカスター（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ））（４１．８ｇ、０．２５ｍｏｌ）の溶液を、減圧下で濃縮する前に、３．５時間、無水酢酸（２３０ｍＬ）中で還流した。粗化合物を、次いで、濾過する前に、トルエンの存在下で２回濃縮し、エーテルで２度洗浄し、標題化合物（３３．７ｇ、７１％の収率）を茶色の固体として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ｍ／ｚ １９２［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｒｔ１．６９ｍｉｎ。
【０１４１】
基準化合物Ｂ：［２−アミノ−５−（メチルオキシ）フェニル］（４−クロロフェニル）メタノン
【化２３】
【０１４２】
０℃にて、トルエン／エーテル（２／１）混合物（７６０ｍＬ）中の２−メチル−６−（メチルオキシ）−４Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−４−オン（調製については、基準化合物Ａを参照）（４０．０ｇ、０．２１ｍｏｌ）の溶液に、４−クロロフェニル臭化マグネシウム（１７０ｍＬ、Ｅｔ２Ｏ中１Ｍ、０．１７ｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を、室温まで加温し、１ＮのＨＣｌ（２００ｍＬ）でクエンチする前に１時間、攪拌した。水層をＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物を食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。次いで粗化合物を、ＥｔＯＨ（４００ｍＬ）に溶解し、６ＮのＨＣｌ（１６０ｍＬ）を加えた。反応混合物を、１／３の体積に濃縮する前に、２時間、還流した。得られた固体を濾過し、ＥｔＯＡｃ中で懸濁する前に、エーテルで２度洗浄し、１ＮのＮａＯＨで中和した。水層を、ＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物を食塩水（１５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。標題化合物を黄色の固体（３９ｇ、８８％の収率）として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ｍ／ｚ ２６２［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．５７ｍｉｎ。
【０１４３】
基準化合物Ｃ：メチルＮ１−［２−［（４−クロロフェニル）カルボニル］−４−（メチルオキシ）フェニル］−Ｎ２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパラギネート
【化２４】
【０１４４】
メチルＮ−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパルチルクロリド（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１９９２，４０，１３−１８）（９３ｇ、０．２４ｍｏｌ）をＣＨＣｌ３（２７０ｍＬ）に溶解し、［２−アミノ−５−（メチルオキシ）フェニル］（４−クロロフェニル）メタノン（調製については、基準化合物Ｂを参照）（５３ｇ、０．２ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を、冷却する前に、１時間、６０℃で攪拌し、６０％の体積に濃縮した。エーテルを０℃で加え、得られた沈殿物を濾過し、取り除いた。濾過物を減圧下で濃縮し、さらに精製せずに用いた。
【０１４５】
基準化合物Ｄ：メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化２５】
【０１４６】
ＤＣＭ（５００ｍＬ）中のメチルＮ１−［２−［（４−クロロフェニル）カルボニル］−４−（メチルオキシ）フェニル］−Ｎ２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパラギネート（調製については、基準化合物Ｃを参照）（推定０．２ｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（５００ｍＬ、３．６５ｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、濃縮する前に２４時間、還流した。得られたクルードのアミンを、１，２−ＤＣＥ（１．５Ｌ）に溶解し、ＡｃＯＨ（１０４ｍＬ、１．８ｍｏｌ）を注意して加えた。反応混合物を、次いで、真空中で濃縮する前に、２時間、６０℃で攪拌し、ＤＣＭに溶解した。有機層を、１ＮのＨＣｌで洗浄し、水層をＤＣＭ（×３）で抽出した。合わせた有機層を水および食塩水で２度洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗固体を、ＭｅＣＮ中で再結晶化し、標題化合物（５１ｇ）を淡黄色の固体として得た。濾過物を濃縮し、ＭｅＣＮ中で再結晶化し、別の１０ｇの所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．３４（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９５／５）。
【０１４７】
ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ１９Ｈ１８３５ＣｌＮ２Ｏ４についての計算値３７３．０９５５；実測値３７３．０９５７。
【０１４８】
基準化合物Ｅ：メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化２６】
【０１４９】
室温にて、１，２−ＤＣＥ（７００ｍＬ）中のＰ４Ｓ１０（３６．１ｇ、８１．１ｍｍｏｌ）およびＮａ２ＣＯ３（８．６ｇ、８１．１ｍｍｏｌ）の懸濁液を、メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、基準化合物Ｄを参照）（１６．８ｇ、４５．１ｍｍｏｌ）を加える前に、２時間、攪拌した。得られた混合物を、冷却し、濾過する前に、２時間、７０℃で攪拌した。固体を、ＤＣＭで２度洗浄し、濾過物を、飽和ＮａＨＣＯ３および食塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９９／１）によって精製し、標題化合物（１７．２ｇ、９８％の収率）を、黄色がかった固体として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ｍ／ｚ ３８９［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．６４ｍｉｎ。
【０１５０】
ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ１９Ｈ１８３５ＣｌＮ２Ｏ３Ｓについての計算値３８９．０７２７；実測値３８９．０７１４。
【０１５１】
基準化合物Ｆ：メチル［（３Ｓ）−２−［２−アセチルヒドラジノ］−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化２７】
【０１５２】
０℃にて、ＴＨＦ（３００ｍＬ）中のメチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、基準化合物Ｅを参照）（９．０ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ヒドラジン一水和物（３．４ｍＬ、６９．６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を、０℃で冷却する前に、５℃から１５℃の間で５時間攪拌した。次いでＥｔ３Ｎ（９．７ｍ、６９．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、塩化アセチル（７．９５ｍＬ、６９．６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。次いで混合物を、減圧下で濃縮する前に、１６時間、室温まで加温した。粗生成物をＤＣＭに溶解し、水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮し、粗標題化合物（９．７ｇ、９８％の収率）を得て、それをさらに精製せずに用いた。Ｒｆ＝０．４９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９０／１０）。
【０１５３】
基準化合物Ｇ：メチル［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセテート
【化２８】
【０１５４】
クルードのメチル［（３Ｓ）−２−［（１Ｚ）−２−アセチルヒドラジノ］−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、基準化合物Ｆを参照）（推定９．７ｇ）を、ＴＨＦ（１００ｍｌ）に懸濁し、ＡｃＯＨ（６０ｍＬ）を室温で加えた。反応混合物を、減圧下で濃縮する前に、２日間、この温度にて攪拌した。粗固体を、ｉ−Ｐｒ２Ｏ中で粉砕し、濾過し、標題化合物（３工程に渡って８．７ｇ、９１％）をオフホワイト色の固体として得た。
【０１５５】
ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ２１Ｈ２０ＣｌＮ４Ｏ３についての計算値４１１．１２２９；実測値４１１．１２４５。
【０１５６】
基準化合物Ｈ：［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］酢酸
【化２９】
【０１５７】
室温にて、ＴＨＦ（１３０ｍＬ）中のメチル［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセテート（調製については、基準化合物Ｇを参照）（７．４ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）の溶液に、１ＮのＮａＯＨ（３６．２ｍＬ、３６．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、１ＮのＨＣｌ（３６．２ｍＬ）でクエンチする前に、５時間、この温度で攪拌し、真空中で濃縮した。次いで水を加え、水層をＤＣＭ（×３）で抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、標題化合物（７ｇ、９８％の収率）を淡黄色の固体として得た。
【０１５８】
基準化合物Ｉ：１，１−ジメチルエチル［５−（｛［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセチル｝アミノ）ペンチル］カルバメート
【化３０】
【０１５９】
［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］酢酸（調製については、基準化合物Ｈを参照）（１．０ｇ、２．５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．９ｇ、５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．８８ｍｌ、５ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で８０分間攪拌し、これに、１，１−ジメチルエチル（４−アミノブチル）カルバメート（１．０５ｍｌ、５．０ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）を加えた。反応混合物を、濃縮する前に、２時間、室温で攪拌した。残渣をジクロロメタン中に取り、１ＮのＨＣｌで洗浄した。水層をジクロロメタンで２度抽出した。有機層を、１Ｎの水酸化ナトリウムで洗浄し、その後、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（９５／５）を用いて、シリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、標題化合物を、黄色の固体（１．２ｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ｒｔ＝３．０４ｍｉｎ。
【０１６０】
基準化合物Ｊ：Ｎ−（５−アミノペンチル）−２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセトアミドトリフルオロアセテート
【化３１】
【０１６１】
ジクロロメタン（３ｍｌ）中の１，１−ジメチルエチル［５−（｛［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセチル｝アミノ）ペンチル］カルバメート（調製については、基準化合物Ｈを参照）（０．２ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．０５３ｍ、０．６８ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して加えた。反応混合物を、３時間、０℃から室温で攪拌した。反応混合物を濃縮乾固し、標題化合物を吸湿性の黄色の油（２００ｍｇ）として得た。
【０１６２】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ｒｔ＝２．３３ｍｉｎ。
【０１６３】
ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ２５Ｈ２９ＣｌＮ６Ｏ２についての計算値４８１．２１１９；実測値４８１．２１６２。
【０１６４】
基準化合物Ｋ：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−Ｎ−（５−アミノペンチル）−２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセトアミドの５−および６−異性体の混合物
【化３２】
【０１６５】
Ｎ−（５−アミノペンチル）−２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセトアミドトリフルオロアセテート（調製については、基準化合物Ｊを参照）（７．６５ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３００μｌ）に溶解し、エッペンドルフ遠心チューブ中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ カルボン酸スクシンイミジルエステル（５ｍｇ、７．７７μｍｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販の５および６の異性体の混合物、製造番号Ａ−２０１００）に加えた。ヒューニッヒ塩基（７．０μｌ、０．０４０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩、ボルテックスで混合した。１８時間後、反応混合物を蒸発乾固し、残渣をＤＭＳＯ／水（５０％、＜１ｍｌ合計）に再溶解し、分取Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８カラムに付与して、１０ｍｌ／分の流速で１５０分に渡って９５％Ａ：５％Ｂから１００％Ｂ（Ａ＝０．１％の水中のトリフルオロ酢酸、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／１０％水）の勾配で溶出した。同じ系を用いて、不純物画分を合わせて、再精製した。画分を合わせ、蒸発させ、標題生成物（２．８ｍｇ）を、示した２つの位置異性体の混合物として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：，ＭＨ＋＝９９９，ｒｔ＝１．８８ｍｉｎ。
【０１６６】
生物学的試験方法
蛍光異方性結合アッセイ
ブロモドメイン２、３および４に対する式（Ｉ）の化合物の結合を、蛍光異方性結合アッセイを用いて評価した。
【０１６７】
ブロモドメインタンパク質、蛍光リガンド（上記の基準化合物Ｋを参照）および種々の試験化合物を一緒にインキュベートして、試験化合物の非存在下で蛍光リガンドが有意に（＞５０％）結合し、十分な濃度の有効な阻害剤の存在下で結合していない蛍光リガンドの異方性が結合値と測定可能な程度に異なるような条件下で、熱力学的平衡に到達させる。
【０１６８】
全てのデータを、各プレートで１６個の高いコントロールウェルおよび１６個の低いコントロールウェルの平均に正規化した。次いで以下の式の４つのパラメータ曲線フィットを適用した：
ｙ＝ａ＋（（ｂ−ａ）／（１＋（１０∧×／１０∧ｃ）∧ｄ）
式中、「ａ」は最小値であり、「ｂ」はヒル勾配（Ｈｉｌｌ ｓｌｏｐｅ）であり、「ｃ」はｐＩＣ５０であり、「ｄ」は最大値である。
【０１６９】
組換えヒトブロモドメイン（ブロモドメイン２（１−４７３）、ブロモドメイン３（１−４３５）およびブロモドメイン４（１−４７７））を、Ｎ末端において６個のＨｉｓ標識を有する大腸菌細胞（ｐＥＴ１５ｂベクター内）で発現させた。Ｈｉｓ標識化ブロモドメインを、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび超音波処理を用いて大腸菌細胞から抽出した。次いでブロモドメインを、２０Ｃｖ以上で、線形１０〜５００ｍＭイミダゾール勾配で溶出する、ＨｉｓＴＲＡＰ ＨＰカラムでのアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。さらなる精製を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分取グレートサイズ排除カラムにより完了した。精製したタンパク質を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５および１００ｍＭ ＮａＣｌ中で−８０℃にて保存した。
【０１７０】
ブロモドメイン２についてのプロトコル：全ての成分を、ブロモドメイン２、７５ｎＭ、蛍光リガンド ５ｎＭの最終濃度で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍｍのＮａＣｌおよび０．５ｍＭのＣＨＡＰＳのバッファー組成に溶解した。１０μｌのこの反応混合物を、マイクロマルチドロップを用いて、Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルブラック低容量マイクロタイタープレート中で１００ｎｌの種々の濃度の試験化合物またはＤＭＳＯビヒクル（１％最終）を含有するウェルに加え、暗所で室温にて６０分平衡化した。蛍光異方性をＥｎｖｉｓｉｏｎ（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λＥＭ＝５３０ｎｍ；二色性−５０５ｎＭ）で読み取った。
【０１７１】
ブロモドメイン３についてのプロトコル：全ての成分を、ブロモドメイン３、７５ｎＭ、蛍光リガンド ５ｎＭの最終濃度で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍｍのＮａＣｌおよび０．５ｍＭのＣＨＡＰＳのバッファー組成に溶解した。１０μｌのこの反応混合物を、マイクロマルチドロップを用いて、Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルブラック低容量マイクロタイタープレート中で１００ｎｌの種々の濃度の試験化合物またはＤＭＳＯビヒクル（１％最終）を含有するウェルに加え、暗所で室温にて６０分平衡化した。蛍光異方性をＥｎｖｉｓｉｏｎ（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λＥＭ＝５３０ｎｍ；二色性−５０５ｎＭ）で読み取った。
【０１７２】
ブロモドメイン４についてのプロトコル：全ての成分を、ブロモドメイン４、７５ｎＭ、蛍光リガンド ５ｎＭの最終濃度で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍｍのＮａＣｌおよび０．５ｍＭのＣＨＡＰＳのバッファー組成に溶解した。１０μｌのこの反応混合物を、マイクロマルチドロップを用いて、Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルブラック低容量マイクロタイタープレート中で１００ｎｌの種々の濃度の試験化合物またはＤＭＳＯビヒクル（１％最終）を含有するウェルに加え、暗所で室温にて６０分平衡化した。蛍光異方性をＥｎｖｉｓｉｏｎ（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λＥＭ＝５３０ｎｍ；二色性−５０５ｎＭ）で読み取った。
【０１７３】
実施例１は、上記のＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４アッセイの各々においてｐＩＣ５０≧６．０を有した。
【０１７４】
ＬＰＳ刺激性全血を測定するＴＮＦαレベルアッセイ
細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）などのｔｏｌｌ様受容体のアゴニストによる単球細胞の活性化により、ＴＮＦαを含む重要な炎症性メディエータの生成が生じる。そのような経路は、様々な自己免疫および炎症性疾患の病態生理学に重要であると広く認められている。
【０１７５】
試験する化合物を希釈して、様々な適切な濃度を得て、１μｌの希釈ストックを９６プレートのウェルに加える。全血（１３０μｌ）の添加後、プレートを３７℃（５％ＣＯ２）にて３０分間インキュベートし、その後、１０μｌの２．８μｇ／ｍｌ ＬＰＳを添加し、完全ＲＰＭＩ１６４０（最終濃度＝２００ｎｇ／ｍｌ）に希釈し、ウェルあたり１４０μｌの全体積を得る。さらに３７℃にて２４時間のインキュベーション後、１４０μｌのＰＢＳを各ウェルに加える。プレートを密閉し、１０分間振盪し、次いで遠心分離（２５００ｒｐｍ×１０分）する。１００μｌの上清を除去し、ＴＮＦαレベルを、即座にまたは−２０℃での保存後のいずれかで免疫学的検定により（典型的にメソスケールディスカバリー（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）技術により）アッセイした。各化合物についての用量反応曲線をデータから生成し、ＩＣ５０値を算出した。
【０１７６】
実施例１は上記のアッセイにおいて、ｐＩＣ５０＞６．０を有することを見出した。
【０１７７】
これらのデータは、上記のアッセイにおいて試験した実施例１が重要な炎症性メディエータＴＮＦαの生成を阻害することを実証する。これは、このような化合物が、炎症性疾患において臨床的に有益になる可能性がある、強力な抗炎症性プロファイルを有することを示唆する。
【０１７８】
インビボでのマウス内毒素血モデル
動物に投与した高用量のエンドトキシン（細菌性リポ多糖）は、強力な炎症反応、心臓血管機能の異常調節、臓器不全および最終的に死亡を含む深刻なショック症候群を生じる。このパターンの反応は、ヒトの敗血症および敗血性ショックと非常に類似しており、顕著な細菌感染に対する身体の反応は同様に生命を脅かす危険性がある。
【０１７９】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩を試験するために、８匹のＢａｌｂ／ｃオスのマウスの群に、腹腔内注射により致死量の１５ｍｇ／ｋｇ ＬＰＳを与えた。９０分後、動物にビヒクル（非発熱性水中の２０％シクロデキストリン １％エタノール）または化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。動物の生存を４日にモニターした。
【０１８０】
４日に生存している動物の数（多重反復実験に渡って合計した）
ビヒクル ４／６６（６％）
実施例１ ２４／５６（５２％）
これらのデータは、上記のモデルにおいて試験した実施例１が、静脈内投与後に顕著な動物の生存効果を生じたことを実証している。これは、式（Ｉ）の化合物がヒトにおける炎症反応に対して十分な効果についての可能性を有することを示唆している。
【０１８１】
限定されないが、本明細書に記載した特許および特許出願を含む全ての文献は、各々の個々の文献が具体的かつ個々に完全に記載されているように本明細書に参照として組み込まれることを示すように、本明細書に参照として組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベンゾジアゼピン化合物、その調製プロセス、そのような化合物を含んでなる医薬組成物、および治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のゲノムは細胞核内で高度に組織化されている。二本鎖ＤＮＡの長い鎖は、ヌクレオソームを形成するためにヒストンタンパク質（ほとんどはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の２つのコピーを含む）の八量体に巻きついている。次いでこの基本単位はさらに、ヌクレオソームの凝集およびフォールディングにより圧縮されて、非常に凝縮されたクロマチン構造を形成する。様々な異なる状態の凝縮が可能であり、この構造の緊密度は細胞周期の間、変化し、細胞分裂のプロセスの間、最もコンパクトになる。クロマチン構造は、遺伝子転写を調節する際に重要な役割を果たすが、非常に凝縮されたクロマチンからは効率的に起こり得ない。クロマチン構造は、ヒストンタンパク質、特にヒストンＨ３およびＨ４に対すて、通常、コアヌクレオソーム構造を超えて拡がるヒストンテール内での一連の翻訳後修飾によって制御される。これらの修飾には、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化およびＳＵＭＯ化が含まれる。これらの後成的マーカーは、ヒストンテール内の特異的残基上に標識を取り付ける、特異的酵素によって書き出され、消去され、それによって、後成的コードを形成し、次いでそれは、細胞に読み取られて、クロマチン構造の遺伝子特異的調節およびそれによる転写を可能にする。
【０００３】
その修飾によって、静電気が変化してＤＮＡとヒストン八量体との相互作用が緩まるため、ヒストンアセチル化は、通常、遺伝子転写の活性化と関連する。この物理的変化に加えて、特異的タンパク質はヒストン内でアセチル化リシン残基と結合して、後成的コードを読み取る。ブロモドメインは、ヒストンとの関連に限らないが、通常、アセチル化リシン残基と結合するタンパク質内の小さい（約１１０アミノ酸）特徴的なドメインである。ブロモドメインを含有することが知られている約５０タンパク質のファミリーが存在し、それらは細胞内で様々な機能を有する。
【０００４】
ブロモドメインを含有するタンパク質のさいてきなＢｅｔファミリーは、近接して２つのアセチル化リシン残基に結合できるタンデムブロモドメインを含有する４つのタンパク質（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４およびＢＲＤ−ｔ）を含み、相互作用の特異性を増加させる。ＢＲＤ２およびＢＲＤ３は、活性な転写遺伝子と共にヒストンと会合することが報告されており、転写伸長の促進にに関与するとされ（非特許文献１（Ｌｅｒｏｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００８ ３０（１）：５１−６０））、一方、ＢＲＤ４は、ｐＴＥＦ−Ｂ複合体が誘導的遺伝子にリクルートするのに関与し、それに伴いＲＮＡポリメラーゼのリン酸化が生じ、転写生産が増加するようである（非特許文献２（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら，Ｃｅｌｌ，２００９ １３８（１）：１２９−１４５））。また、ＢＲＤ４およびＢＲＤ３はＮＵＴ（睾丸中の核タンパク質）と融合して、上皮腫瘍の高度な悪性形態において、新規な融合癌遺伝子ＢＲＤ４−ＮＵＴを形成することが報告されている（非特許文献３（Ｆｒｅｎｃｈら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，６３，３０４−３０７）および非特許文献４（Ｆｒｅｎｃｈら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００４，２２（２０），４１３５−４１３９））。データでは、ＢＲＤ−ＮＵＴ融合タンパク質が発癌の原因であることが示唆されている（非特許文献５（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８，２７，２２３７−２２４２））。ＢＲＤ−ｔは睾丸および卵巣において一意的に発現される。全てのファミリーメンバーは、細胞周期の局面を制御または実行する機能の一部を有すると報告されており、細胞分裂の間、染色体との複合体に存在することが示されており、これらのことから、後成的メモリの維持における役割が示唆される。加えて、一部のウイルスは、ウイルス複製のプロセスの一部として、それらのタンパク質を使用して、それらのゲノムを宿主細胞クロマチンにつなぎ止める（非特許文献６（Ｙｏｕら，Ｃｅｌｌ，２００４ １１７（３）：３４９−６０））。
【０００５】
特許文献１（特開２００８−１５６３１１号公報）は、ウイルス感染／増殖に対して有用性を有するＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤と言われているベンズイミダゾール誘導体を開示している。
【０００６】
特許文献２（国際公開第２００９／０８４６９３Ａ１号パンフレット）は、アセチル化ヒストンと、抗癌剤として有用であると言われているブロモドメイン含有タンパク質との間の結合を阻害すると言われている一連のチエノトリアゾロジアゼピン誘導体を開示している。
【０００７】
ブロモドメインと、その同種アセチル化タンパク質との結合を阻害する化合物、より具体的には、アセチル化リシン残基に対する最適なファミリーのブロモドメインの結合を阻害する化合物が見出されている。このような化合物は、本明細書中で「ブロモドメイン阻害剤」と称される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１５６３１１号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／０８４６９３Ａ１号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌｅｒｏｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００８ ３０（１）：５１−６０
【非特許文献２】Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら，Ｃｅｌｌ，２００９ １３８（１）：１２９−１４５
【非特許文献３】Ｆｒｅｎｃｈら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，６３，３０４−３０７
【非特許文献４】Ｆｒｅｎｃｈら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００４，２２（２０），４１３５−４１３９
【非特許文献５】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８，２７，２２３７−２２４２
【非特許文献６】Ｙｏｕら，Ｃｅｌｌ，２００４ １１７（３）：３４９−６０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の態様において、式（Ｉ）の化合物またはその塩
【化１】
【００１１】
が提供される。
【００１２】
本発明の第２の態様において、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物が提供される。
【００１３】
本発明の第３の態様において、治療、特にブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容可能な塩が提供される。
【００１４】
本発明の第４の態様において、被験体においてブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態を治療する方法であって、治療的に有効な量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を、それを必要とする被験体投与することを含んでなる、前記方法が提供される。
【００１５】
本発明の第５の態様において、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態を治療するための薬剤の製造における式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容可能な塩の使用が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミドである式（Ｉ）の化合物
【化２】
【００１７】
またはその塩に関する。
【００１８】
本発明は、遊離塩基としておよびその塩として、例えばその医薬的に許容可能な塩として式（Ｉ）の化合物を含むことが理解されるだろう。
【００１９】
一実施形態において、２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミドである化合物が提供される。
【００２０】
薬剤におけるそれらの潜在的使用のために、式（Ｉ）の化合物の塩は望ましくは医薬的に許容可能である。別の実施形態において、２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミドである化合物またはその医薬的に許容可能な塩が提供される。
【００２１】
好適な医薬的に許容可能な塩としては酸または塩基付加塩が挙げられ得る。好適な塩に関する概説については、Ｂｅｒｇｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６：１−１９，（１９７７）を参照のこと。典型的に、医薬的に許容可能な塩は、必要に応じて所望の酸または塩基を用いることによって容易に調製できる。得られる塩は溶液から沈殿して、濾過により収集され得るか、または溶媒の蒸発により回収され得る。
【００２２】
医薬的に許容可能な塩基付加塩は、例えば結晶化および濾過によって通常単離される塩基付加塩を得るために、任意に好適な溶媒中で、式（Ｉ）の化合物と、好適な無機または有機塩基（例えばトリエチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、コリン、アルギニン、リシンまたはヒスチジン）とを反応させることによって形成できる。医薬的に許容可能な塩基塩としては、アンモニウム塩、ナトリウムおよびカリウムのものなどのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウムのものなどのアルカリ土類金属塩、ならびにイソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミンおよびＮ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンの塩を含む、有機塩基との塩が挙げられる。
【００２３】
医薬的に許容可能な酸付加塩は、例えば結晶化および濾過によって通常単離される塩を得るために、任意に有機溶媒などの好適な溶媒中で、式（Ｉ）の化合物と、好適な無機または有機酸（例えば臭化水素酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、コハク酸、マレイン酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸（例えば２−ナフタレンスルホン酸、またヘキサン酸））との反応によって形成できる。式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容可能な酸付加塩は、例えば、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩（例えば２−ナフタレンスルホン酸塩）またはヘキサン酸塩を含み得るか、またはそれらであり得る。
【００２４】
他の医薬的に許容可能でない塩、例えばギ酸塩、シュウ酸塩またはトリフルオロ酢酸塩が、例えば、式（Ｉ）の化合物の単離において使用されてもよく、本発明の範囲内に含まれる。
【００２５】
本発明は、その範囲内において、式（Ｉ）の化合物の塩の全ての可能な化学量論および非化学量論形態を含む。
【００２６】
多くの有機化合物は、溶媒中でそれらが反応するその溶媒と錯体を形成でき、またはそれらが溶媒から沈殿もしくは結晶化するその溶媒と錯体を形成できることが理解されるだろう。これらの錯体は「溶媒和物」として知られている。例えば、水との錯体は「水和物」として知られている。高い沸点を有するおよび／または水素結合を形成できる溶媒、例えば水、キシレン、Ｎ−メチルピロリジノン、メタノールおよびエタノールが溶媒和物を形成するために使用されてもよい。溶媒和物の同定方法には、限定されないが、ＮＭＲおよび微量分析が含まれる。式（Ｉ）の化合物の溶媒和物は本発明の範囲内である。
【００２７】
本発明は、その範囲内において、式（Ｉ）の化合物の溶媒和物の全ての可能な化学量論および非化学量論形態を含む。
【００２８】
本発明は、受容者への投与時に、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩、あるいはその活性代謝産物または活性残基を（直接または間接的に）与えることができる、式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩の全てのプロドラッグを包含する。そのような誘導体は、過度の実験を必要とせずに当業者に認識可能である。しかし、参照は、Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ １：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅの教示に対してなされる（その文献はこのような誘導体を教示する範囲で本明細書に参照として組み込まれる）。
【００２９】
式（Ｉ）の化合物は結晶形態または非結晶形態であってもよい。さらに、式（Ｉ）の化合物の結晶形態の一部は多型体として存在してもよく、本発明の範囲内に含まれる。式（Ｉ）の化合物の多型体形態は、限定されないが、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターン、赤外線（ＩＲ）スペクトル、ラマンスペクトル、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、熱重量分析（ＴＧＡ）および固体核磁気共鳴（ＳＳＮＭＲ）を含む、多くの従来の分析技術を用いて特徴付けられ、識別され得る。
【００３０】
式（Ｉ）の化合物は、実質的に他の異性体を含まない（すなわち鏡像異性的に純粋）ように単離された個々の異性体であるので、１０％未満、特に約１％未満、例えば約０．１％未満の他の鏡像異性体が存在する。
【００３１】
異性体の分離は、当業者に公知の従来の技術によって、例えば分別結晶、クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣによって達成され得る。
【００３２】
式（Ｉ）の化合物は数個の互変異性型のうちの１つで存在し得る。本発明は、個々の互変異性体としてまたはそれらの混合物として、いずれにせよ式（Ｉ）の化合物の全ての互変異性体を包含することは理解されるだろう。
【００３３】
式（Ｉ）の化合物またはその塩の溶媒和物、異性体および多型体は本発明の範囲内に含まれることは上述から理解されるだろう。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩は、標準的な化学を含む、種々の方法によって作製され得る。例示の一般的合成方法を以下に記載し、次いで式（Ｉ）の特定の化合物を、処理実施例において調製する。これらのプロセスは本発明のさらなる態様を形成する。
【００３５】
式（Ｉ）の化合物は、反応スキーム１に従って、室温にてＨＡＴＵまたはＨＢＴＵおよびＤＩＥＡの存在下で、式（ＩＩ）の化合物とＥｔＮＨ２との反応によって調製できる。代替として、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）の化合物と塩化オキサリルとを反応させ、続いてトリエチルアミンの存在下でＥｔＮＨ２を添加することによって調製できる。
【化３】
【００３６】
式（ＩＩ）の化合物は反応スキーム２に従って調製できる。適切な反応条件は、式（ＩＩＩ）の化合物と、アルカリ性水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウムまたは水酸化リチウムとを反応させることを含む。
【化４】
【００３７】
式中、ＲはメチルなどのＣ１−６アルキルを表す。
【００３８】
式（ＩＩＩ）の化合物は、反応スキーム３に従って、式（ＩＶ）の化合物とＡｃＯＨとを反応させることによって調製できる。
【化５】
【００３９】
式（ＩＶ）の化合物は、反応スキーム４に従って、１５℃以下で式（ＶＩ）の化合物とヒドラジンとを反応させ、続いて０℃にて得られたヒドラゾン（Ｖ）とＭｅＣＯＣｌとの反応によって調製できる。通常、ヒドラゾン（Ｖ）はさらに精製せずに使用され、例えば０℃にてＭｅＣＯＣｌと反応される。
【化６】
【００４０】
ＲがＣ１−６アルキル（例えばメチル）である式（ＶＩ）の化合物は、反応スキーム５に従って、ローソン試薬（Ｌａｗｅｓｓｏｎ‘ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）またはＰ４Ｓ１０での処理によって式（ＶＩＩ）の化合物から調製できる。好適な反応条件は、例えば７０℃にて１，２−ジクロロエタン中で式（ＶＩＩＩ）の化合物とＰ４Ｓ１０とを反応させることを含む。
【化７】
【００４１】
式（ＶＩＩ）の化合物は、反応スキーム６に従って、式（ＩＸ）の化合物とトリエチルアミンなどの有機塩基とを反応させ、続いて得られたアミン（ＶＩＩＩ）と酢酸との反応によって調製できる。通常、アミン（ＶＩＩＩ）はさらに精製せずに使用され、例えば６０℃にてＡｃＯＨと反応される。
【化８】
【００４２】
式（ＩＸ）の化合物は、反応スキーム７に従って、式（ＸＩ）の化合物と保護されたアスパラギン酸由来の塩化アシル（Ｘ）とを反応させることによって調製できる。
【化９】
【００４３】
式（ＸＩ）の化合物は、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９８０，６７７−６８８に記載される手順に従って調製できる。式（Ｘ）の塩化アシルは、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，５５，３０６８−３０７４およびＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，２００１，１６７３−１６９５に記載される手順に従って調製できる。
【００４４】
代替として、式（Ｉ）の化合物は反応スキーム８に従って調製できる。
【化１０】
【００４５】
式中、ＲはメチルなどのＣ１−４アルキルを表す。
【００４６】
式（ＩＩＩＡ）の化合物は、反応スキーム９に従って、例えば室温にてＨＡＴＵおよびＤＩＥＡの存在下で式（ＩＶＡ）の化合物とＥｔＮＨ２とを反応させることによって調製できる。
【化１１】
【００４７】
式（ＩＶＡ）の化合物は反応スキーム１０に従って調製できる。好適な反応条件は、式（ＶＩ）の化合物と、水酸化ナトリウムなどのアルカリ性水酸化物とを反応させることを含む。
【化１２】
【００４８】
上記プロセスに記載した化合物の１つ以上の官能基を保護することは有益であり得ることは当業者によって理解されるだろう。保護基およびそれらの除去手段の例は、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ 「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（第４版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２００６）に見出され得る。好適なアミン保護基としては、アシル（例えばアセチル、カルバメート（例えば２’，２’，２’−トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブトキシカルボニル）およびアリールアルキル（例えばベンジル）が挙げられ、それらは、加水分解（例えばジオキサン中の塩酸またはジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸などの酸を用いること）によって除去され得るか、または必要に応じて還元的（例えばベンジルまたはベンジルオキシカルボニル基の水素化分解または酢酸中の亜鉛を用いる２’，２’，２’−トリクロロエトキシカルボニル基の還元的除去）によって除去され得る。他の好適なアミン保護基としては、塩基触媒加水分解により除去され得るトリフルオロアセチル（−ＣＯＣＦ３）が挙げられる。
【００４９】
上記の経路のいずれの場合も、種々の基および部分が分子内に導入される合成工程の正確な順序は変更されてもよいことが理解されるだろう。プロセスの一段階で導入される基または部分が、その後の変換および反応に影響を与えないことを保証し、それに応じて合成工程の順序を選択することは当業者の範囲内であろう。
【００５０】
上記の特定の中間体化合物は新規であり、従って本発明のさらなる態様を形成すると考えられる。
【００５１】
式（Ｉ）の化合物およびその塩はブロモドメイン阻害剤であるので、ブロモドメインが適応される疾患または病態の治療において潜在的有用性を有すると考えられる。
【００５２】
従って、本発明は、治療に使用するための式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。式（Ｉ）の化合物またはその医薬的塩は、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療に使用するためとなり得る。
【００５３】
一実施形態において、ブロモドメインが適応される疾患または病態の治療に使用するための式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩が提供される。別の実施形態において、慢性自己免疫病態および／または炎症病態の治療に使用するための化合物またはその医薬的に許容可能な塩が提供される。さらなる実施形態において、正中線癌（ｍｉｄｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）などの癌の治療に使用するための化合物またはその医薬的に許容可能な塩が提供される。
【００５４】
一実施形態において、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態を治療するための薬剤の製造における式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用が提供される。別の実施形態において、慢性自己免疫病態および／または炎症病態を治療するための薬剤の製造における式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用が提供される。さらなる実施形態において、正中線癌などの癌を治療するための薬剤の製造における式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用が提供される。
【００５５】
一実施形態において、被験体においてブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態を治療する方法であって、治療的に有効量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、前記方法が提供される。別の実施形態において、被験体において慢性自己免疫病態および／または炎症病態を治療する方法であって、治療的に有効量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、方法が提供される。さらなる実施形態において、被験体において正中線癌などの癌を治療する方法であって、治療的に有効量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、方法が提供される。
【００５６】
一実施形態において、それを必要とする被験体は哺乳動物、特にヒトである。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、例えば研究者または臨床医によって求められる組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的反応を引き起こす薬物または薬剤の量を意味する。さらに、用語「治療的に有効量」は、そのような量を受容していない対応する被験体と比較して、疾患、症状、もしくは副作用の改善された治療、治癒、予防、または寛解を生じる量、または疾患もしくは障害の進行の速度を減少させる量を意味する。この用語はまた、その範囲内において、正常な生理学的機能を高めるのに有効な量を含む。
【００５８】
ブロモドメイン阻害剤は、全身または組織炎症、感染または低酸素に対する炎症反応、細胞活性化および増殖、脂質代謝、線維症に関連する種々の疾患または病態の治療、ならびにウイルス感染の予防および治療に有用であると考えられている。
【００５９】
ブロモドメイン阻害剤は、リウマチ性関節炎、骨関節炎、急性痛風、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、ぜんそく、慢性閉塞性気道疾患、肺炎、心筋炎、心膜炎、筋炎、湿疹、皮膚炎、脱毛症、白斑、水疱性皮膚疾患、腎炎、血管炎、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、鬱病、網膜炎、ブドウ膜炎、強膜炎、肝炎、膵炎、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、アジソン病、下垂体炎、甲状腺炎、Ｉ型糖尿病および移植器官の急性拒絶などの種々の慢性自己免疫病態および炎症病態の治療に有用であり得る。
【００６０】
ブロモドメイン阻害剤は、急性痛風、巨細胞性動脈炎、ループス腎炎を含む腎炎、糸球体腎炎などの臓器病変を伴う血管炎、巨細胞性動脈炎を含む血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、ベーチェット病、川崎病、高安動脈炎および移植器官の急性拒絶などの種々の急性炎症病態の治療に有用であり得る。
【００６１】
ブロモドメイン阻害剤は、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物またはそれらの毒素による感染に対する炎症反応を含む疾患または病態、例えば敗血症、敗血症症候群、敗血性ショック、内毒素血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全症候群、毒素性ショック症候群、急性肺損傷、ＡＲＤＳ（成人呼吸窮迫症候群）、急性腎不全、劇症肝炎、熱傷、急性膵炎、手術後症候群、サルコイドーシス、ヘルクスハイマー反応、脳炎、脊髄炎、髄膜炎、マラリア、インフルエンザなどのウイルス感染に関連するＳＩＲＳ、帯状疱疹、単純ヘルペスおよびコロナウイルスの予防または治療に有用であり得る。
【００６２】
ブロモドメイン阻害剤は、心筋梗塞、脳血管虚血（脳卒中）、急性冠症候群、腎臓再灌流障害、臓器移植、冠動脈バイパス移植、心臓−肺バイパス処置などの虚血−再灌流障害に関連する病態および肺、腎臓、肝臓、胃腸または末梢四肢塞栓症の予防または治療に有用であり得る。
【００６３】
ブロモドメイン阻害剤は、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症およびアルツハイマー病などのＡＰＯ−Ａ１の調節による脂質代謝の障害の治療に有用であり得る。
【００６４】
ブロモドメイン阻害剤は、特発性肺線維症、腎線維症、術後狭窄、ケロイド形成、強皮症および心筋線維症などの線維性病態の治療に有用であり得る。
【００６５】
ブロモドメイン阻害剤は、ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルスおよび他のＤＮＡウイルスなどのウイルス感染の予防および治療に有用であり得る。
【００６６】
ブロモドメイン阻害剤は、血液癌（例えば白血病）、肺癌、乳癌、結腸癌を含む上皮癌、正中線癌、間葉癌、肝臓腫瘍、腎腫瘍および神経学的腫瘍を含む癌の治療に有用であり得る。
【００６７】
ブロモドメイン阻害剤は、ドライアイなどの眼科適応症の治療に有用であり得る。
【００６８】
一実施形態において、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態は、敗血症、熱傷、膵炎、大外傷、出血および虚血などの全身性炎症反応症候群に関連する疾患から選択される。この実施形態において、ブロモドメイン阻害剤は、ＳＩＲＳ、急性肺障害、ＡＲＤＳ、急性腎障害、肝障害、心外傷および胃腸障害の発症を含む、ショック状態、多臓器機能不全の発症の発生率および死亡率を減少させるために診断の時点で投与される。別の実施形態において、ブロモドメイン阻害剤は、高リスクの敗血症、出血、広範な組織損傷、ＳＩＲＳまたはＭＯＤＳに関連する外科手術または他の処置前に投与される。特定の実施形態において、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態は、敗血症、敗血症症候群、敗血性ショックおよび／または内毒素血症である。別の実施形態において、ブロモドメイン阻害剤は、急性または慢性膵炎の治療に適応される。別の実施形態において、ブロモドメインは熱傷の治療に適応される。
【００６９】
一実施形態において、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態は、単純ヘルペス感染および再活性化、ヘルペス、帯状疱疹感染および再活性化、水痘、帯状疱疹、ヒトパピローマウイルス、子宮頸部新生物、急性呼吸器疾患を含むアデノウイルス感染、ならびに牛痘および天然痘およびアフリカブタコレラウイルスなどのポックスウイルス感染から選択される。１つの特定の実施形態において、ブロモドメイン阻害剤は、皮膚または子宮頸部上皮のヒトパピローマウイルス感染の治療に適応される。
【００７０】
用語「ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態」は、上記の疾患状態のいずれかまたは全てを含むことを意図する。
【００７１】
治療に使用するために、式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩はそのままの化学物質として投与され得ることも可能であるが、医薬組成物として活性成分が提供されることが一般的である。
【００７２】
従って、本発明は、さらなる態様において、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物を提供する。
【００７３】
このように、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含んでなる、ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態を治療するための医薬組成物が提供される。
【００７４】
このような医薬組成物に使用される担体、希釈剤または賦形剤は、組成物の他の成分と適合性があり、その受容者に有害ではないという意味で許容可能でなければならない。本発明の別の態様によれば、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容可能な塩と、１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを混合することを含んでなる、医薬組成物を調製するプロセスもまた提供される。医薬組成物は本明細書に記載される病態のいずれかを治療するのに使用され得る。
【００７５】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩は医薬組成物に使用することを意図されるので、それらは各々好ましくは実質的に純粋な形態、例えば少なくとも６０％の純度、より好適には少なくとも７５％の純度、好ましくは少なくとも８５％の純度、特に少なくとも９８％の純度（重量ベースでの重量％）で提供されることは容易に理解されるだろう。
【００７６】
医薬組成物は、単位投薬あたり所定量の活性成分を含有する単位投薬形態で提供され得る。好ましい単位投薬組成物は、活性成分の日用量またはサブ用量またはその適切な画分を含有するものである。従って、このような単位投薬は１日に１回より多く投与されてもよい。好ましい単位投薬組成物は、本明細書の上記に記載したように、（１日に１回より多く投与するための）活性成分の日用量またはサブ用量またはその適切な画分を含有するものである。
【００７７】
医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば経口（口腔または舌下を含む）、直腸、吸入、鼻腔内、局所（口腔、舌下または経皮を含む）、膣内または非経口（皮下、筋肉内、静脈内または皮内を含む）経路による投与に適合され得る。そのような組成物は、薬剤の分野において公知の任意の方法、例えば活性成分と担体または賦形剤とを混合することによって調製され得る。
【００７８】
一実施形態において、医薬組成物は経口投与に適合される。
【００７９】
一実施形態において、医薬組成物は非経口投与、特に静脈内投与に適合される。
【００８０】
非経口投与に適合される医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および組成物を意図される受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射液、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液を含む。組成物は、単位投薬または複数回投薬容器、例えば密閉アンプルおよびバイアルに提供されてもよく、使用の直前に、滅菌液担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。即座の注射溶液および懸濁剤が、滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製されてもよい。
【００８１】
経口投与に適合される医薬組成物は、カプセル剤または錠剤、粉末または顆粒、水性または非水性液体中の溶剤または懸濁剤、食用泡状物またはホイップ、あるいは水中油液体エマルションまたは油中水液体エマルションなどの別個の単位として調製されてもよい。
【００８２】
例えば、錠剤またはカプセル剤の形態の経口投与のために、活性薬物成分が、経口、非毒性の医薬的に許容可能な不活性担体、例えばエタノール、グリセロール、水などと混合されてもよい。錠剤またはカプセル剤に組み込むのに好適な粉末は、化合物を（例えば微粒子化により）好適な微細サイズに低減し、食用炭水化物（例えばデンプンまたはマンニトール）などの同様に調製した医薬担体と混合することによって調製され得る。矯味矯臭剤、防腐剤、分散剤および着色剤も存在してもよい。
【００８３】
カプセル剤は、上記のように粉末混合物を調製し、形成したゼラチンシースを充填することによって作製され得る。コロイド状シリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたは固体ポリエチレングリコールなどの流動促進剤および潤滑剤が、充填操作の前に粉末混合物に適合されてもよい。寒天、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤もまた、カプセルが摂取される場合の薬剤の利用可能性を改良するために添加されてもよい。
【００８４】
さらに、所望または必要な場合、好適な結合剤、流動促進剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、崩壊剤および着色剤もまた、混合物に組み込まれてもよい。好適な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、グルコースまたはβ−ラクトースなどの天然糖、コーンシロップ、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが挙げられる。これらの投薬形態に使用される潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが挙げられる。錠剤は、例えば、粉末混合物を調製すること、顆粒化または乾燥圧縮し（ｓｌｕｇｇｉｎｇ）、潤滑剤および崩壊剤を錠剤内に添加すること、および圧入することによって処方される。粉末混合物は、好適に粉末状にした化合物と、上記のような希釈剤または基剤、任意に、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、またはポリビニルピロリドンなどの結合剤、パラフィンなどの溶液遅延剤、第四級塩などの吸収促進剤、および／またはベントナイト、カオリンもしくはリン酸二カルシウムなどの吸収剤とを混合することによって調製される。粉末混合物は、シロップ剤、デンプン糊、アラビアゴム粘液（ａｃａｄｉａ ｍｕｃｉｌａｇｅ）またはセルロースもしくはポリマー材料の溶液などの結合剤で湿潤させて、それをふるいにかけて圧縮することによって顆粒化され得る。顆粒化の代わりとして、粉末混合物を打錠機に通し、不均一な形状の塊を与え、それを破砕して顆粒を形成することができる。錠剤成形型に粘着するのを防ぐために、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、または鉱油を添加することによって、顆粒を潤滑させることができる。次いで潤滑した混合物を圧縮して錠剤を与える。本発明の化合物を、易流動性の不活性の担体と組合わせ、次いで直接圧縮して、粒状化または乾燥圧縮ステップを行わずに錠剤を与えることもできる。セラックシーリング層、糖またはポリマー材料の層、およびワックスの光沢層からなる透明または不透明な保護層が存在してよい。異なる投薬単位を区別できるようにするために、これらのコーティングに色素を添加することができる。
【００８５】
例えば、溶剤、シロップ剤、およびエリキシル剤などの経口用液剤は、所与の量が、予め指定された量の化合物を含むように、投薬単位形態で調製することができる。シロップ剤は、化合物を適切な風味を有する水溶液中に溶解させることによって調製することができ、エリキシル剤は、非毒性のアルコールビヒクルを使用して調製される。懸濁液は、化合物を非毒性のビヒクル中に分散させることによって製剤化することができる。例えば、エトキシ化イソステアリルアルコールおよびポリオキシエチレンソルビトールエーテルなどの可溶化剤および乳剤、保存剤、例えばペパーミント油または天然甘味剤もしくはサッカリンなどの香味添加剤、あるいは他の人口甘味剤等も同様に添加することができる。
【００８６】
経口投与用の投薬単位組成物は、所望によりマイクロカプセル中に封入することができる。製剤は、例えばポリマー、ワックスなどで粒状材料をコーティングするまたは埋め込むことによって、放出を延長または遅延させるようにするやり方で調製することもできる。
【００８７】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩はまた、例えば、小型単層小胞、大型単層小胞、および多重膜小胞などのリポソーム送達系の形態で投与することもできる。リポソームは、例えば、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンなどの様々なリン脂質から形成することができる。
【００８８】
局所投与に適合する医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油として製剤化することができる。
【００８９】
目、または他の外組織、例えば口および皮膚などの治療では、組成物は好ましくは局所用軟膏またはクリームとして塗布される。軟膏を与える製剤の場合、活性成分はパラフィン系または水混和性クリームベースと共に使用することができる。あるいは、活性成分は、水中油クリームベースまたは油中水ベースのクリームと共に与えるように製剤化することもできる。
【００９０】
目の局所塗布に適合する医薬組成物には、活性成分が適切な担体、特に水性溶媒に溶解または懸濁した点眼剤が含まれる。
【００９１】
鼻腔または吸入投与のための投薬形態は簡便にはエアロゾル、溶液、懸濁剤、ゲルまたは乾燥粉末として製剤化され得る。
【００９２】
吸入投与に好適および／または適合する組成物に関して、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩は、例えば微粒子化によって得た、粒径が低減した形態で存在することが好ましい。サイズが低減した（例えば微粒子化した）化合物または塩の好ましい粒径は、（例えばレーザー回折を用いて測定した場合）約０．５〜約１０ミクロンのＤ５０値により規定される。
【００９３】
例えば吸入投与のためのエアロゾル製剤は、医薬的に許容可能な水性または非水性溶媒中に活性物質の溶液または微細懸濁液を含んでもよい。エアロゾル製剤は、カートリッジの形態をとり得るかまたは使用するために噴霧装置もしくは吸入器に充填される、密閉容器内の滅菌形態で単回または複数回用量で提供されてもよい。あるいは、密閉容器は、単回用量の、容器の内容物が使い尽くされると処分されることを意図する絞り弁が装着されている鼻吸入器またはエアロゾルディスペンサー（例えば計量式吸入器）などの単一の調剤装置であってもよい。
【００９４】
投薬形態がエアロゾルディスペンサーを含む場合、それは好ましくは、圧縮空気、二酸化炭素などの圧力下で好適な推進剤、またはヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）などの有機推進剤を含有する。好適なＨＦＣ推進剤としては、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンが挙げられる。エアロゾル投薬形態はまた、ポンプ噴霧器の形態をとってもよい。加圧エアロゾルは、活性化合物の溶液または懸濁液を含有してもよい。これは、追加の賦形剤、例えば懸濁化製剤の分散特性および均一性を改良するために共溶媒および／または界面活性剤の組み込みを必要としてもよい。溶液製剤はまた、エタノールなどの共溶媒の添加を必要としてもよい。
【００９５】
吸入投与に好適および／または適合する医薬組成物に関して、その医薬組成物は吸入可能な乾燥粉末組成物であってもよい。そのような組成物は、ラクトース、グルコース、トレハロース、マンニトールまたはデンプンなどの粉末基剤、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩（好ましくは粒径が低減した形態、例えば微粒子形態）と、任意にＬ−ロイシンもしくは別のアミノ酸および／またはステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムなどのステアリン酸の金属塩などの性能修飾剤を含んでもよい。好ましくは、吸入可能な乾燥粉末組成物は、ラクトース、例えばラクトース一水和物と、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩との乾燥粉末混合物を含む。そのような組成物は、例えば英国特許第２２４２１３４Ａ号明細書に記載されているＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって市販されているＤＩＳＫＵＳ（登録商標）装置などの適切な装置を用いて患者に投与されてもよい。
【００９６】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩は、流体ディスペンサー、例えば分配ノズルまたは分配オリフィスを有する流体ディスペンサーから送達するための流体製剤として製剤化され得、使用者が流体ディスペンサーのポンプ機構に付与した力の適用時に、その分配ノズルまたは分配オリフィスを通して定量の流体製剤が分配される。このような流体ディスペンサーには一般に定量される複数回用量の流体製剤のリザーバーが設けられ、順次ポンプが作動する時に、その用量が分配可能になる。分配ノズルまたはオリフィスは、流体製剤を鼻腔内に噴霧分配するために使用者の鼻孔に挿入するように構成され得る。上述の種類の流体ディスペンサーは国際公開第２００５／０４４３５４Ａ１号に記載され、例示されている。
【００９７】
治療有効量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩は、例えば、動物の年齢および体重、治療を必要とする正確な病態およびその重症度、製剤の性質、ならびに投与経路を含む、多くの要因に依存し、最終的に担当医または獣医の判断による。医薬組成物において、経口または非経口投与のための各投薬単位は、遊離塩基として算出して、好ましくは０．０１〜３０００ｍｇ、より好ましくは０．５〜１０００ｍｇの式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含む。鼻腔または吸入投与のための各投薬単位は、遊離塩基として算出して、好ましくは０．００１〜５０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜５ｍｇの式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含む。
【００９８】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩は、（成人患者について）例えば遊離塩基として算出して、０．０１ｍｇ〜３０００ｍｇ／日または０．５〜１０００ｍｇ／日の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の経口または非経口用量で、あるいは０．００１〜５０ｍｇ／日または０．０１〜５ｍｇ／日の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の鼻腔または吸入用量で１日に１回投与されてもよい。この量は、１日に１回与えられてもよく、またはより通常は、１日あたりサブ用量の回数（２回、３回、４回、５回または６回など）で与えられてもよく、それにより全日用量は同じとなる。有効量のその医薬的に許容可能な塩は、有効量の式（Ｉ）の化合物自体の割合として決定されてもよい。
【００９９】
このように、ａ）０．０１〜３０００ｍｇの式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩、および（ｂ）０．１〜２ｇの１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【０１００】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩は、単独で、または他の治療剤と組合わされて利用され得る。このように本発明による組合せ治療は、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の投与、および少なくとも１種の他の医薬的に活性な薬剤の使用を含む。好ましくは、本発明による組合せ治療は、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、少なくとも１種の他の医薬的に活性な薬剤との投与を含む。式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩と、他の医薬的に活性な薬剤は、単一の医薬組成物中で一緒に投与されてもよく、または別個に投与されてもよく、別個に投与される場合、これは同時または任意の順序で連続して行われてもよい。式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩と、他の医薬的に活性な薬剤の量、ならびに投与の相対的タイミングは所望の組合わせた治療効果を達成するために選択される。このように、さらなる態様において、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、少なくとも１種の他の医薬的に活性な薬剤とを含む組合せが提供される。一実施形態において、１種以上の他の治療活性剤と一緒に式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含む組合せ医薬品が提供される。
【０１０１】
このように、一態様において、本発明による式（Ｉ）の化合物および医薬組成物は、例えば、抗生物質、抗ウイルス、糖質コルチコステロイド、ムスカリン性アンタゴニストおよびβ−２アゴニストから選択される１種以上の他の治療剤と組み合わせて、またはそれらを含んで使用され得る。
【０１０２】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩が、通常、吸入、静脈内、経口または鼻腔内経路によって投与される他の治療剤と組合わされて投与される場合、得られる医薬組成物は同じ経路によって投与され得ることは理解されるだろう。代替として、組成物の個々の成分は異なる経路によって投与されてもよい。
【０１０３】
本発明の一実施形態は、１種または２種の他の治療剤を含む組合せを含む。
【０１０４】
必要に応じて、治療成分の活性および／または安定性および／または物理特性（例えば溶解度）を最適化するために、他の治療成分が、塩の形態で、例えばアルカリ金属もしくはアミン塩としてまたは酸付加塩として、またはプロドラッグ、またはエステル、例えば低級アルキルエステルとして、または溶媒和物、例えば水和物として使用されてもよいことは、当業者にとって自明であろう。また、必要に応じて、光学的に純粋な形態で治療成分が使用されてもよいことも自明であろう。
【０１０５】
上記に参照した組合せは、医薬組成物の形態で使用するために簡便に提供され得るので、医薬的に許容可能な希釈剤または担体と共に上記の組合せを含む医薬組成物は本発明のさらなる態様を表す。
【０１０６】
式（Ｉ）の化合物は以下に記載する方法または同様の方法によって調製され得る。従って、以下の中間体および実施例は式（Ｉ）の化合物の調製を例示するためのものであり、決して本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【実施例】
【０１０７】
全体的な実験の詳細
全ての温度は℃で表す。
【０１０８】
略語
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
ＡｃＯＨ 酢酸
ＡｃＣｌ 塩化アセチル
ＰＰＴＳ ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム
ＤＣＭ ジクロロメタン
１，２−ＤＣＥ １，２−ジクロロエタン
ＤＩＣ ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＥＡ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＡＰ ４−ジメチルアミノピリジン
Ｆｍｏｃ ９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル
ＨＡＴＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｅｔ２Ｏ ジエチルエーテル
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ｉ−Ｐｒ２Ｏ ジ−イソプロピルエーテル
Ｃｏｎｆｉｇ． 絶対配置
ローソン試薬 ２，４−ビス（４−メトキシフェニル）−１，３−ジチア−２，４−ジホスフェタン−２，４−ジスルフィド
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＭｅＯＨ メタノール
Ｒｔ 保持時間
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＲＴ 室温
Ｐｄ／Ｃ パラジウム炭素
ＬＣ／ＭＳは、２種類の装置で実施した分析用ＨＰＬＣによる分析を指す：
ａ）Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣＡＢＺ＋ＰＬＵＳカラム（３μｍ、３．３ｃｍ×４．６ｍｍ ＩＤ）では、０．１％ＨＣＯ２Ｈおよび０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）、ならびに９５％アセトニトリルおよび０．０５％ＨＣＯ２Ｈ水溶液（溶媒Ｂ）で、３ｍＬ／分の流速で以下の溶出勾配０〜０．７分 ０％Ｂ、０．７〜４．２分 ０→１００％Ｂ、４．２〜５．３分 １００％Ｂ、５．３〜５．５分 １００→０％Ｂを用いて溶出する。質量スペクトル（ＭＳ）を、エレクトロスプレー陽イオン化［（［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋ＮＨ４］＋分子イオンを得るためにＥＳ＋ｖｅ］またはエレクトロスプレー陰イオン化［（［Ｍ−Ｈ］−分子イオンを得るためにＥＳ−ｖｅ］モードを用いてＦｉｓｏｎｓ ＶＧ Ｐｌａｔｆｏｒｍ質量分析計で記録した。この装置からの分析データを以下のフォーマット：［Ｍ＋Ｈ］＋または［Ｍ−Ｈ］−で与える。
【０１０９】
ｂ）Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＲＰ１８カラム（１００×４．６ｍｍ ｉｄ）では、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）および１００％アセトニトリル（溶媒Ｂ）で、５ｍＬ／分の流速で以下の溶出勾配０〜４分 ０→１００％Ｂ、４〜５分 １００％Ｂを用いて溶出する。質量スペクトル（ＭＳ）を、大気圧化学陽イオン化［ＭＨ＋分子イオンを得るためにＡＰ＋ｖｅ］または大気圧化学陰イオン化［（Ｍ−Ｈ）−分子イオンを得るためにＡＰ−ｖｅ］モードを用いてｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ−ＬＣ質量分析計で記録した。この装置からの分析データを、両方の質量分析源の間で特定するために先行してアクロニムＡＰＣＩを行い、以下のフォーマット：［Ｍ＋Ｈ］＋または［Ｍ−Ｈ］−で与える。
【０１１０】
ＬＣ／ＨＲＭＳ：分析用ＨＰＬＣを、Ｕｐｔｉｓｐｈｅｒｅ−ｈｓｃカラム（３μｍ ３３×３ｍｍ ｉｄ）で、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）および１００％アセトニトリル（溶媒Ｂ）を用いて１．３ｍＬ／分の流速で以下の溶出勾配０〜０．５分 ５％Ｂ、０．５〜３．７５分 ５→１００％Ｂ、３．７５〜４．５ １００％Ｂ、４．５〜５ １００→５％Ｂ、５〜５．５ ５％Ｂにて溶出して行った。質量スペクトル（ＭＳ）を、エレクトロスプレー陽イオン化［ＭＨ＋分子イオンを得るためにＥＳ＋ｖｅ］またはエレクトロスプレー陰イオン化［（Ｍ−Ｈ）−分子イオンを得るためにＥＳ−ｖｅ］モードを用いてｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＴ質量分析計で記録した。
【０１１１】
マスディレクテッドオートプレプ（ｍａｓｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｕｔｏ−ｐｒｅｐ）ＨＰＬＣは、物質が、８ｍＬ／分の流速で以下の勾配溶出条件：０〜１．０分 ５％Ｂ、１．０〜８．０分 ５→３０％Ｂ、８．０〜８．９分 ３０％Ｂ、８．９〜９．０分 ３０→９５％Ｂ、９．０〜９．９分 ９５％Ｂ、９．９〜１０分 ９５→０％Ｂを利用する、０．１％ＨＣＯ２Ｈ水溶液および９５％ＭｅＣＮ、５％水（０．５％ ＨＣＯ２Ｈ）を用いるＨＰＬＣＡＢＺ＋５μｍカラム（５ｃｍ×１０ｍｍ ｉ．ｄ．）上での高速液体クロマトグラフィーによって精製される方法を指す。Ｇｉｌｓｏｎ ２０２画分回収器を、対象の質量を検出する時にＶＧ Ｐｌａｔｆｏｒｍ質量分析計で起動した。
【０１１２】
プロトンＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルを、内部標準として溶媒を用いてＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ３００ ＤＰＸ分光計で周囲温度にて記録し、プロトン化学シフトを所定の溶媒においてｐｐｍで表す。以下の略語を複数のＮＭＲシグナル：ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｄｄ＝双二重項（ｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅｔ）、ｍ＝多重項で使用する。
【０１１３】
ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）は、シリカゲル６０ Ｆ２５４でコーティングしたＭｅｒｃｋにより販売されているＴＬＣプレートの使用を指す。
【０１１４】
実施例１：２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミド
【化１３】
【０１１５】
室温にて、ＴＨＦ中の［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］酢酸（調製については、中間体１を参照）（１６．０ｇ、４０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（１４ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）、その後、ＨＡＴＵ（３０．４ｇ、８０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、３時間、この温度にて攪拌し、エチルアミン（４０ｍＬ、ＴＨＦ中２Ｍ、８０ｍｍｏｌ）を加えた。減圧下で濃縮させる前に、混合物を４８時間、攪拌した。粗物質を、水中で懸濁し、ＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。粗固体を、ＳｉＯ２でのクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ９５／５）によって精製し、得られた固体をＭｅＣＮ中で再結晶化した。固体を次いでＤＣＭ中に溶解し、ｉ−Ｐｒ２Ｏで沈殿させ、標題化合物（８ｇ、４７％の収率）を白色の固体として得た。
【０１１６】
Ｒｆ＝０．４８（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９０／１０）。Ｍｐ＞１４０°Ｃ（粘着性となる）。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５３−７．４７（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３７−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２０（ｄｄ，Ｊ＝２．９ａｎｄ８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），６．４０（ｍ，１Ｈ），４．６２（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．５１（ｄｄ，Ｊ＝７．３および１４．１Ｈｚ，１Ｈ），３．４６−３．２１（ｍ，３Ｈ），２．６２（ｓ，３Ｈ），１．１９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ）．ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ４２４［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．３３ｍｉｎ。
【０１１７】
中間体１：［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］酢酸
【化１４】
【０１１８】
室温にて、ＴＨＦ（４５０ｍＬ）中のメチル［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセテート（調製については、中間体２を参照）（２８ｇ、６８ｍｍｏｌ）の溶液に、１ＮのＮａＯＨ（１３６ｍＬ、１３６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、冷却する前に、５時間、この温度で攪拌し、１ＮのＨＣｌ（１３６ｍＬ）でクエンチした。ＴＨＦを減圧下で取り除き、水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗固体を、ＣＨ３ＣＮ中で再結晶化し、標題化合物（２３．９ｇ、８９％の収率）を淡黄色の粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５５−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３８−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２２（ｄｄ，Ｊ＝２．９ａｎｄ８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．５９（ｄｄ，Ｊ＝６．９ａｎｄ６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｄｄ，Ｊ＝６．９ａｎｄ２５．７Ｈｚ，１Ｈ），３．６１（ｄｄ，Ｊ＝６．９ａｎｄ２５．７Ｈｚ，１Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ）．ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ３９７［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．１１ｍｉｎ。
【０１１９】
中間体２：メチル［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセテート
【化１５】
【０１２０】
クルードのメチル［（３Ｓ）−２−［（１Ｚ）−２−アセチルヒドラジノ］−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、中間体３を参照）（３４ｇ、７９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２００ｍＬ）中に懸濁し、ＡｃＯＨ（２００ｍＬ）を室温にて加えた。反応混合物を濃縮乾固する前に、この温度で一晩攪拌した。残渣を飽和ＮａＨＣＯ３中に懸濁し、ＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮した。粗固体をＳｉＯ２でのクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９０／１０）によって精製し、標題化合物（２８ｇ、８６％の収率）を黄色の粉末として得た。
【０１２１】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５４−７．４７（ｍ，２Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３７−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２２（ｄｄ，Ｊ＝２．８ａｎｄ８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６１（ｄｄ，Ｊ＝６．４ａｎｄ７．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），３．６６（ｄｄ，Ｊ＝７．８ａｎｄ１６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．６０（ｄｄ，Ｊ＝６．４ａｎｄ１６．９Ｈｚ，１Ｈ），２．６２（ｓ，３Ｈ）．ＬＣ／ＭＳｍ／ｚ４１１［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．８８ｍｉｎ。
【０１２２】
中間体３：メチル［（３Ｓ）−２−［２−アセチルヒドラジノ］−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化１６】
【０１２３】
０℃にてＴＨＦ（８００ｍＬ）中のメチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、中間体４を参照）（３０．２ｇ、７７．７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ヒドラジン一水和物（１１．３ｍＬ、２３３ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を、０℃に冷却する前に、４時間、０℃から１５℃の間で攪拌した。Ｅｔ３Ｎ（３２．４ｍＬ、２３０ｍｍｏｌ）を次いでゆっくりと加え、ＡｃＣｌ（１６．３ｍＬ、２３０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を室温まで加温し、１時間攪拌し、次いで、水でクエンチし、減圧下で濃縮した。得られた水層を次いでＤＣＭで抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮して、粗標題化合物（３４ｇ、１００％の収率）を得て、それをさらに精製せずに用いた。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ ４２９［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．８３ｍｉｎ。
【０１２４】
中間体４：メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化１７】
【０１２５】
室温にて、１，２−ＤＣＥ（１．５Ｌ）中のＰ４Ｓ１０（８５．８ｇ、１９０ｍｍｏｌ）およびＮａ２ＣＯ３（２０．５ｇ、１９０ｍｍｏｌ）の懸濁液を、メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、中間体５を参照）（４０ｇ、１０７ｍｍｏｌ）を加える前に、１時間、攪拌した。得られた混合物を、冷却し濾過する前に、４時間、６５℃で攪拌した。固体を、ＤＣＭで洗浄し、濾過物を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。標題化合物を、ＤＣＭ／ｉ−Ｐｒ２Ｏの混合物から沈殿させ、濾過した。濾過物を次いで、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９８／２）により精製し、別のバッチの生成物を得た。２つの画分を合わせて標題化合物（３０．２ｇ、７３％）を黄色の粉末として得た。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ ３８９［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ３．２９ｍｉｎ。
【０１２６】
中間体５：メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化１８】
【０１２７】
ＤＣＭ（５００ｍＬ）中のクルードのメチルＮ１−［２−［（４−クロロフェニル）カルボニル］−４−（メチルオキシ）フェニル］−Ｎ２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパラギネート（ａｓｐａｒａｇｉｎａｔｅ）（調製については、中間体６を参照）（推定０．２ｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（５００ｍＬ、３．６５ｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、濃縮する前に２４時間、還流した。得られたクルードのアミンを１，２−ＤＣＥ（１．５Ｌ）中に溶解し、ＡｃＯＨ（１０４ｍＬ、１．８ｍｏｌ）を注意して加えた。次いで反応混合物を、真空中で濃縮する前に、２時間、６０℃で攪拌し、ＤＣＭ中に溶解した。有機層を１ＮのＨＣｌで洗浄し、水層をＤＣＭ（×３）で抽出した。合わせた有機層を２度、水および食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗固体を、ＭｅＣＮ中で再結晶化し、標題化合物（５１ｇ）を淡黄色の固体として得た。濾過物を濃縮し、ＭｅＣＮ中で再結晶化し、別の１０ｇの中間体９を得た（全体：回収した中間体１２に基づき６１ｇ、６９％の収率）。Ｒｆ＝０．３４（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９５／５）。ＬＣ／ＭＳ ｍ／ｚ ３７３［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．７６ｍｉｎ。
【０１２８】
中間体６：メチルＮ１−［２−［（４−クロロフェニル）カルボニル］−４−（メチルオキシ）フェニル］−Ｎ２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパラギネート
【化１９】
【０１２９】
ＣＨＣｌ３（４１０ｍＬ）中のメチルＮ−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパルチルクロリド（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，３０６８−３０７４およびＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ ２００１，１６７３−１６９５から調製）（２２１ｇ、０．５７ｍｏｌ）および［２−アミノ−５−（メチルオキシ）フェニル］（４−クロロフェニル）メタノン（調製については、中間体７を参照）（１３３ｇ、０．５ｍｏｌ）の混合物を、冷却する前に、１．５時間、６０℃で攪拌し、減圧下で濃縮し、さらに精製せずに用いた。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ ６１３［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ＝３．８９ｍｉｎ。
【０１３０】
中間体７：［２−アミノ−５−（メチルオキシ）フェニル］（４−クロロフェニル）メタノン
【化２０】
【０１３１】
０℃にて、トルエン（５６０ｍＬ）／エーテル（２００ｍＬ）混合物中の２−メチル−６−（メチルオキシ）−４Ｈ−３，１−ベンゾオキサジノン−４−オン（調製については、中間体８を参照）（４０．０ｇ、０．２１ｍｏｌ）の溶液に、４−クロロフェニル臭化マグネシウム（１７０ｍＬ、Ｅｔ２Ｏ中１Ｍ、０．１７ｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を室温まで加温し、１ＮのＨＣｌでクエンチする前に、１時間、攪拌した。水層をＥｔＯＡｃ（３×）で抽出し、合わせた有機物を食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗化合物を次いで、ＥｔＯＨ（４００ｍＬ）に溶解し、６ＮのＨＣｌ（１６０ｍＬ）を加えた。反応混合物を、減圧下で濃縮する前に、２時間、還流した。得られた固体を濾過し、ＥｔＯＡｃに懸濁する前に、エーテルで２度、洗浄し、１ＮのＮａＯＨで中和した。水層を、ＥｔＯＡｃ（３×）で抽出し、合わせた有機物を、食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。標題化合物を、黄色の固体（３９ｇ、８８％の収率）として得て、さらに精製せずに用いた。
【０１３２】
中間体８：２−メチル−６−（メチルオキシ）−４Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−４−オン
【化２１】
【０１３３】
５−メトキシアントラニル酸（７．８ｇ、４６．５ｍｍｏｌ）の溶液を、冷却する前に、２時間１５分、無水酢酸（６０ｍＬ）中で還流し、減圧下で濃縮した。粗残渣を次いで、濾過する前に、トルエンの存在下で２度、濃縮し、エーテルで洗浄し、標題化合物（６．８ｇ、７７％の収率）をベージュ色の固体として得た；ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ １９２［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｒｔ１．６９ｍｉｎ。
【０１３４】
生物検定法において使用するための基準化合物の調製
本明細書において参照されるＬＣ−ＭＳ法ＡおよびＢの実験詳細は以下の通りである：
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）は、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣＡＢＺ＋ＰＬＵＳカラム（３μｍ、３．３ｃｍ×４．６ｍｍ ＩＤ）で、０．１％ ＨＣＯ２Ｈおよび０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）、ならびに９５％アセトニトリルおよび０．０５％ＨＣＯ２Ｈ水溶液（溶媒Ｂ）を用いて、３ｍＬ／分の流速で以下の溶出勾配０〜０．７分 ０％Ｂ、０．７〜４．２分 ０→１００％Ｂ、４．２〜５．３分 １００％Ｂ、５．３〜５．５分 １００→０％Ｂを用いて溶出する実施した。質量スペクトル（ＭＳ）を、エレクトロスプレー陽イオン化［（［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ＋ＮＨ４］＋分子イオンを得るためにＥＳ＋ｖｅ］またはエレクトロスプレー陰イオン化［（［Ｍ−Ｈ］−分子イオンを得るためにＥＳ−ｖｅ］モードを用いてＦｉｓｏｎｓ ＶＧ Ｐｌａｔｆｏｒｍ質量分析計で記録した。この装置からの分析データは以下のフォーマット：［Ｍ＋Ｈ］＋または［Ｍ−Ｈ］−で与える。
【０１３５】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）は、Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８カラム（３０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．３．５μｍパッキング直径）で、０．１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を用いて、３ｍｌ／分の流速で以下の溶出勾配０〜０．１分 ３％Ｂ、０．１〜４．２分 ３〜１００％Ｂ、４．２〜４．８分 １００％Ｂ、４．８〜４．９分 １００〜３％Ｂ、４．９〜５．０分 ３％Ｂを用いて３０℃で溶出を実施した。ＵＶ検出は２１０ｎｍ〜３５０ｎｍの波長から平均化したシグナルであり、質量スペクトルを、陽イオンエレクトロスプレーイオン化を用いて質量分析計で記録した。イオン化データは整数まで四捨五入した。
【０１３６】
ＬＣ／ＨＲＭＳ：分析用ＨＰＬＣを、Ｕｐｔｉｓｐｈｅｒｅ−ｈｓｃカラム（３μｍ ３３×３ｍｍ ｉｄ）で、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液（溶媒Ａ）および１００％アセトニトリル（溶媒Ｂ）を用いて、１．３ｍＬ／分の流速で以下の溶出勾配０〜０．５分 ５％Ｂ、０．５〜３．７５分 ５→１００％Ｂ、３．７５〜４．５ １００％Ｂ、４．５〜５ １００→５％ Ｂ、５〜５．５ ５％Ｂを用いて溶出を実施した。質量スペクトル（ＭＳ）を、エレクトロスプレー陽イオン化［ＭＨ＋分子イオンを得るためにＥＳ＋ｖｅ］またはエレクトロスプレー陰イオン化［（Ｍ−Ｈ）−分子イオンを得るためにＥＳ−ｖｅ］モードを用いて、ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＬＣＴ質量分析計で記録した。
【０１３７】
ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）は、シリカゲル６０Ｆ２５４でコーティングしたＭｅｒｃｋによって販売されているＴＬＣプレートの使用を指す。
【０１３８】
シリカクロマトグラフィー技術は、自動化（ＦｌａｓｈｍａｓｔｅｒまたはＢｉｏｔａｇｅ ＳＰ４）技術または予め充填したカートリッジ（ＳＰＥ）での手動クロマトグラフィーまたは手動で充填したフラッシュカラムのいずれかを含む。
【０１３９】
基準化合物Ａ：２−メチル−６−（メチルオキシ）−４Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−４−オン
【化２２】
【０１４０】
５−メトキシアントラニル酸（ランカスター（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ））（４１．８ｇ、０．２５ｍｏｌ）の溶液を、減圧下で濃縮する前に、３．５時間、無水酢酸（２３０ｍＬ）中で還流した。粗化合物を、次いで、濾過する前に、トルエンの存在下で２回濃縮し、エーテルで２度洗浄し、標題化合物（３３．７ｇ、７１％の収率）を茶色の固体として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ｍ／ｚ １９２［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｒｔ１．６９ｍｉｎ。
【０１４１】
基準化合物Ｂ：［２−アミノ−５−（メチルオキシ）フェニル］（４−クロロフェニル）メタノン
【化２３】
【０１４２】
０℃にて、トルエン／エーテル（２／１）混合物（７６０ｍＬ）中の２−メチル−６−（メチルオキシ）−４Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−４−オン（調製については、基準化合物Ａを参照）（４０．０ｇ、０．２１ｍｏｌ）の溶液に、４−クロロフェニル臭化マグネシウム（１７０ｍＬ、Ｅｔ２Ｏ中１Ｍ、０．１７ｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。反応混合物を、室温まで加温し、１ＮのＨＣｌ（２００ｍＬ）でクエンチする前に１時間、攪拌した。水層をＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物を食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。次いで粗化合物を、ＥｔＯＨ（４００ｍＬ）に溶解し、６ＮのＨＣｌ（１６０ｍＬ）を加えた。反応混合物を、１／３の体積に濃縮する前に、２時間、還流した。得られた固体を濾過し、ＥｔＯＡｃ中で懸濁する前に、エーテルで２度洗浄し、１ＮのＮａＯＨで中和した。水層を、ＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物を食塩水（１５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。標題化合物を黄色の固体（３９ｇ、８８％の収率）として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ｍ／ｚ ２６２［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．５７ｍｉｎ。
【０１４３】
基準化合物Ｃ：メチルＮ１−［２−［（４−クロロフェニル）カルボニル］−４−（メチルオキシ）フェニル］−Ｎ２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパラギネート
【化２４】
【０１４４】
メチルＮ−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパルチルクロリド（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１９９２，４０，１３−１８）（９３ｇ、０．２４ｍｏｌ）をＣＨＣｌ３（２７０ｍＬ）に溶解し、［２−アミノ−５−（メチルオキシ）フェニル］（４−クロロフェニル）メタノン（調製については、基準化合物Ｂを参照）（５３ｇ、０．２ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を、冷却する前に、１時間、６０℃で攪拌し、６０％の体積に濃縮した。エーテルを０℃で加え、得られた沈殿物を濾過し、取り除いた。濾過物を減圧下で濃縮し、さらに精製せずに用いた。
【０１４５】
基準化合物Ｄ：メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化２５】
【０１４６】
ＤＣＭ（５００ｍＬ）中のメチルＮ１−［２−［（４−クロロフェニル）カルボニル］−４−（メチルオキシ）フェニル］−Ｎ２−｛［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）オキシ］カルボニル｝−Ｌ−α−アスパラギネート（調製については、基準化合物Ｃを参照）（推定０．２ｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（５００ｍＬ、３．６５ｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、濃縮する前に２４時間、還流した。得られたクルードのアミンを、１，２−ＤＣＥ（１．５Ｌ）に溶解し、ＡｃＯＨ（１０４ｍＬ、１．８ｍｏｌ）を注意して加えた。反応混合物を、次いで、真空中で濃縮する前に、２時間、６０℃で攪拌し、ＤＣＭに溶解した。有機層を、１ＮのＨＣｌで洗浄し、水層をＤＣＭ（×３）で抽出した。合わせた有機層を水および食塩水で２度洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗固体を、ＭｅＣＮ中で再結晶化し、標題化合物（５１ｇ）を淡黄色の固体として得た。濾過物を濃縮し、ＭｅＣＮ中で再結晶化し、別の１０ｇの所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．３４（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９５／５）。
【０１４７】
ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ１９Ｈ１８３５ＣｌＮ２Ｏ４についての計算値３７３．０９５５；実測値３７３．０９５７。
【０１４８】
基準化合物Ｅ：メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化２６】
【０１４９】
室温にて、１，２−ＤＣＥ（７００ｍＬ）中のＰ４Ｓ１０（３６．１ｇ、８１．１ｍｍｏｌ）およびＮａ２ＣＯ３（８．６ｇ、８１．１ｍｍｏｌ）の懸濁液を、メチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、基準化合物Ｄを参照）（１６．８ｇ、４５．１ｍｍｏｌ）を加える前に、２時間、攪拌した。得られた混合物を、冷却し、濾過する前に、２時間、７０℃で攪拌した。固体を、ＤＣＭで２度洗浄し、濾過物を、飽和ＮａＨＣＯ３および食塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９９／１）によって精製し、標題化合物（１７．２ｇ、９８％の収率）を、黄色がかった固体として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ｍ／ｚ ３８９［Ｍ（３５Ｃｌ）＋Ｈ］＋，Ｒｔ２．６４ｍｉｎ。
【０１５０】
ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ１９Ｈ１８３５ＣｌＮ２Ｏ３Ｓについての計算値３８９．０７２７；実測値３８９．０７１４。
【０１５１】
基準化合物Ｆ：メチル［（３Ｓ）−２−［２−アセチルヒドラジノ］−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート
【化２７】
【０１５２】
０℃にて、ＴＨＦ（３００ｍＬ）中のメチル［（３Ｓ）−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−２−チオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、基準化合物Ｅを参照）（９．０ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ヒドラジン一水和物（３．４ｍＬ、６９．６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を、０℃で冷却する前に、５℃から１５℃の間で５時間攪拌した。次いでＥｔ３Ｎ（９．７ｍ、６９．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、塩化アセチル（７．９５ｍＬ、６９．６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。次いで混合物を、減圧下で濃縮する前に、１６時間、室温まで加温した。粗生成物をＤＣＭに溶解し、水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空中で濃縮し、粗標題化合物（９．７ｇ、９８％の収率）を得て、それをさらに精製せずに用いた。Ｒｆ＝０．４９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ：９０／１０）。
【０１５３】
基準化合物Ｇ：メチル［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセテート
【化２８】
【０１５４】
クルードのメチル［（３Ｓ）−２−［（１Ｚ）−２−アセチルヒドラジノ］−５−（４−クロロフェニル）−７−（メチルオキシ）−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−３−イル］アセテート（調製については、基準化合物Ｆを参照）（推定９．７ｇ）を、ＴＨＦ（１００ｍｌ）に懸濁し、ＡｃＯＨ（６０ｍＬ）を室温で加えた。反応混合物を、減圧下で濃縮する前に、２日間、この温度にて攪拌した。粗固体を、ｉ−Ｐｒ２Ｏ中で粉砕し、濾過し、標題化合物（３工程に渡って８．７ｇ、９１％）をオフホワイト色の固体として得た。
【０１５５】
ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ２１Ｈ２０ＣｌＮ４Ｏ３についての計算値４１１．１２２９；実測値４１１．１２４５。
【０１５６】
基準化合物Ｈ：［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］酢酸
【化２９】
【０１５７】
室温にて、ＴＨＦ（１３０ｍＬ）中のメチル［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセテート（調製については、基準化合物Ｇを参照）（７．４ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）の溶液に、１ＮのＮａＯＨ（３６．２ｍＬ、３６．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、１ＮのＨＣｌ（３６．２ｍＬ）でクエンチする前に、５時間、この温度で攪拌し、真空中で濃縮した。次いで水を加え、水層をＤＣＭ（×３）で抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、標題化合物（７ｇ、９８％の収率）を淡黄色の固体として得た。
【０１５８】
基準化合物Ｉ：１，１−ジメチルエチル［５−（｛［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセチル｝アミノ）ペンチル］カルバメート
【化３０】
【０１５９】
［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］酢酸（調製については、基準化合物Ｈを参照）（１．０ｇ、２．５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．９ｇ、５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．８８ｍｌ、５ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で８０分間攪拌し、これに、１，１−ジメチルエチル（４−アミノブチル）カルバメート（１．０５ｍｌ、５．０ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている）を加えた。反応混合物を、濃縮する前に、２時間、室温で攪拌した。残渣をジクロロメタン中に取り、１ＮのＨＣｌで洗浄した。水層をジクロロメタンで２度抽出した。有機層を、１Ｎの水酸化ナトリウムで洗浄し、その後、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（９５／５）を用いて、シリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、標題化合物を、黄色の固体（１．２ｇ）として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ｒｔ＝３．０４ｍｉｎ。
【０１６０】
基準化合物Ｊ：Ｎ−（５−アミノペンチル）−２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセトアミドトリフルオロアセテート
【化３１】
【０１６１】
ジクロロメタン（３ｍｌ）中の１，１−ジメチルエチル［５−（｛［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセチル｝アミノ）ペンチル］カルバメート（調製については、基準化合物Ｈを参照）（０．２ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．０５３ｍ、０．６８ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して加えた。反応混合物を、３時間、０℃から室温で攪拌した。反応混合物を濃縮乾固し、標題化合物を吸湿性の黄色の油（２００ｍｇ）として得た。
【０１６２】
ＬＣ／ＭＳ（方法Ａ）：ｒｔ＝２．３３ｍｉｎ。
【０１６３】
ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋Ｃ２５Ｈ２９ＣｌＮ６Ｏ２についての計算値４８１．２１１９；実測値４８１．２１６２。
【０１６４】
基準化合物Ｋ：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−Ｎ−（５−アミノペンチル）−２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセトアミドの５−および６−異性体の混合物
【化３２】
【０１６５】
Ｎ−（５−アミノペンチル）−２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］アセトアミドトリフルオロアセテート（調製については、基準化合物Ｊを参照）（７．６５ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３００μｌ）に溶解し、エッペンドルフ遠心チューブ中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ カルボン酸スクシンイミジルエステル（５ｍｇ、７．７７μｍｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販の５および６の異性体の混合物、製造番号Ａ−２０１００）に加えた。ヒューニッヒ塩基（７．０μｌ、０．０４０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩、ボルテックスで混合した。１８時間後、反応混合物を蒸発乾固し、残渣をＤＭＳＯ／水（５０％、＜１ｍｌ合計）に再溶解し、分取Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８カラムに付与して、１０ｍｌ／分の流速で１５０分に渡って９５％Ａ：５％Ｂから１００％Ｂ（Ａ＝０．１％の水中のトリフルオロ酢酸、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／１０％水）の勾配で溶出した。同じ系を用いて、不純物画分を合わせて、再精製した。画分を合わせ、蒸発させ、標題生成物（２．８ｍｇ）を、示した２つの位置異性体の混合物として得た。ＬＣ／ＭＳ（方法Ｂ）：，ＭＨ＋＝９９９，ｒｔ＝１．８８ｍｉｎ。
【０１６６】
生物学的試験方法
蛍光異方性結合アッセイ
ブロモドメイン２、３および４に対する式（Ｉ）の化合物の結合を、蛍光異方性結合アッセイを用いて評価した。
【０１６７】
ブロモドメインタンパク質、蛍光リガンド（上記の基準化合物Ｋを参照）および種々の試験化合物を一緒にインキュベートして、試験化合物の非存在下で蛍光リガンドが有意に（＞５０％）結合し、十分な濃度の有効な阻害剤の存在下で結合していない蛍光リガンドの異方性が結合値と測定可能な程度に異なるような条件下で、熱力学的平衡に到達させる。
【０１６８】
全てのデータを、各プレートで１６個の高いコントロールウェルおよび１６個の低いコントロールウェルの平均に正規化した。次いで以下の式の４つのパラメータ曲線フィットを適用した：
ｙ＝ａ＋（（ｂ−ａ）／（１＋（１０∧×／１０∧ｃ）∧ｄ）
式中、「ａ」は最小値であり、「ｂ」はヒル勾配（Ｈｉｌｌ ｓｌｏｐｅ）であり、「ｃ」はｐＩＣ５０であり、「ｄ」は最大値である。
【０１６９】
組換えヒトブロモドメイン（ブロモドメイン２（１−４７３）、ブロモドメイン３（１−４３５）およびブロモドメイン４（１−４７７））を、Ｎ末端において６個のＨｉｓ標識を有する大腸菌細胞（ｐＥＴ１５ｂベクター内）で発現させた。Ｈｉｓ標識化ブロモドメインを、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび超音波処理を用いて大腸菌細胞から抽出した。次いでブロモドメインを、２０Ｃｖ以上で、線形１０〜５００ｍＭイミダゾール勾配で溶出する、ＨｉｓＴＲＡＰ ＨＰカラムでのアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。さらなる精製を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分取グレートサイズ排除カラムにより完了した。精製したタンパク質を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５および１００ｍＭ ＮａＣｌ中で−８０℃にて保存した。
【０１７０】
ブロモドメイン２についてのプロトコル：全ての成分を、ブロモドメイン２、７５ｎＭ、蛍光リガンド ５ｎＭの最終濃度で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍｍのＮａＣｌおよび０．５ｍＭのＣＨＡＰＳのバッファー組成に溶解した。１０μｌのこの反応混合物を、マイクロマルチドロップを用いて、Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルブラック低容量マイクロタイタープレート中で１００ｎｌの種々の濃度の試験化合物またはＤＭＳＯビヒクル（１％最終）を含有するウェルに加え、暗所で室温にて６０分平衡化した。蛍光異方性をＥｎｖｉｓｉｏｎ（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λＥＭ＝５３０ｎｍ；二色性−５０５ｎＭ）で読み取った。
【０１７１】
ブロモドメイン３についてのプロトコル：全ての成分を、ブロモドメイン３、７５ｎＭ、蛍光リガンド ５ｎＭの最終濃度で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍｍのＮａＣｌおよび０．５ｍＭのＣＨＡＰＳのバッファー組成に溶解した。１０μｌのこの反応混合物を、マイクロマルチドロップを用いて、Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルブラック低容量マイクロタイタープレート中で１００ｎｌの種々の濃度の試験化合物またはＤＭＳＯビヒクル（１％最終）を含有するウェルに加え、暗所で室温にて６０分平衡化した。蛍光異方性をＥｎｖｉｓｉｏｎ（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λＥＭ＝５３０ｎｍ；二色性−５０５ｎＭ）で読み取った。
【０１７２】
ブロモドメイン４についてのプロトコル：全ての成分を、ブロモドメイン４、７５ｎＭ、蛍光リガンド ５ｎＭの最終濃度で５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍｍのＮａＣｌおよび０．５ｍＭのＣＨＡＰＳのバッファー組成に溶解した。１０μｌのこの反応混合物を、マイクロマルチドロップを用いて、Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルブラック低容量マイクロタイタープレート中で１００ｎｌの種々の濃度の試験化合物またはＤＭＳＯビヒクル（１％最終）を含有するウェルに加え、暗所で室温にて６０分平衡化した。蛍光異方性をＥｎｖｉｓｉｏｎ（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λＥＭ＝５３０ｎｍ；二色性−５０５ｎＭ）で読み取った。
【０１７３】
実施例１は、上記のＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４アッセイの各々においてｐＩＣ５０≧６．０を有した。
【０１７４】
ＬＰＳ刺激性全血を測定するＴＮＦαレベルアッセイ
細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）などのｔｏｌｌ様受容体のアゴニストによる単球細胞の活性化により、ＴＮＦαを含む重要な炎症性メディエータの生成が生じる。そのような経路は、様々な自己免疫および炎症性疾患の病態生理学に重要であると広く認められている。
【０１７５】
試験する化合物を希釈して、様々な適切な濃度を得て、１μｌの希釈ストックを９６プレートのウェルに加える。全血（１３０μｌ）の添加後、プレートを３７℃（５％ＣＯ２）にて３０分間インキュベートし、その後、１０μｌの２．８μｇ／ｍｌ ＬＰＳを添加し、完全ＲＰＭＩ１６４０（最終濃度＝２００ｎｇ／ｍｌ）に希釈し、ウェルあたり１４０μｌの全体積を得る。さらに３７℃にて２４時間のインキュベーション後、１４０μｌのＰＢＳを各ウェルに加える。プレートを密閉し、１０分間振盪し、次いで遠心分離（２５００ｒｐｍ×１０分）する。１００μｌの上清を除去し、ＴＮＦαレベルを、即座にまたは−２０℃での保存後のいずれかで免疫学的検定により（典型的にメソスケールディスカバリー（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）技術により）アッセイした。各化合物についての用量反応曲線をデータから生成し、ＩＣ５０値を算出した。
【０１７６】
実施例１は上記のアッセイにおいて、ｐＩＣ５０＞６．０を有することを見出した。
【０１７７】
これらのデータは、上記のアッセイにおいて試験した実施例１が重要な炎症性メディエータＴＮＦαの生成を阻害することを実証する。これは、このような化合物が、炎症性疾患において臨床的に有益になる可能性がある、強力な抗炎症性プロファイルを有することを示唆する。
【０１７８】
インビボでのマウス内毒素血モデル
動物に投与した高用量のエンドトキシン（細菌性リポ多糖）は、強力な炎症反応、心臓血管機能の異常調節、臓器不全および最終的に死亡を含む深刻なショック症候群を生じる。このパターンの反応は、ヒトの敗血症および敗血性ショックと非常に類似しており、顕著な細菌感染に対する身体の反応は同様に生命を脅かす危険性がある。
【０１７９】
式（Ｉ）の化合物およびその医薬的に許容可能な塩を試験するために、８匹のＢａｌｂ／ｃオスのマウスの群に、腹腔内注射により致死量の１５ｍｇ／ｋｇ ＬＰＳを与えた。９０分後、動物にビヒクル（非発熱性水中の２０％シクロデキストリン １％エタノール）または化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。動物の生存を４日にモニターした。
【０１８０】
４日に生存している動物の数（多重反復実験に渡って合計した）
ビヒクル ４／６６（６％）
実施例１ ２４／５６（５２％）
これらのデータは、上記のモデルにおいて試験した実施例１が、静脈内投与後に顕著な動物の生存効果を生じたことを実証している。これは、式（Ｉ）の化合物がヒトにおける炎症反応に対して十分な効果についての可能性を有することを示唆している。
【０１８１】
限定されないが、本明細書に記載した特許および特許出願を含む全ての文献は、各々の個々の文献が具体的かつ個々に完全に記載されているように本明細書に参照として組み込まれることを示すように、本明細書に参照として組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミドである式（Ｉ）の化合物
【化１】
またはその塩。
【請求項２】
２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミドである式（Ｉ）の化合物
【化２】
またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項３】
２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミドである式（Ｉ）の化合物
【化３】
【請求項４】
請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の式（Ｉ）の化合物と、１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項６】
１種以上の他の治療活性剤と共に請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含んでなる、組合せ医薬品。
【請求項７】
治療に使用するための請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項８】
治療に使用するための請求項３に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療における使用のための、請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項１０】
前記疾患または病態が、慢性自己免疫病態および／または炎症性病態である、請求項９に記載の使用のための、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項１１】
前記疾患または病態が癌である、請求項９に記載の使用のための、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項１２】
ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態を治療するための薬剤の製造における、請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用。
【請求項１３】
ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療方法であって、請求項２に記載の治療有効量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項１４】
前記疾患または病態が、慢性自己免疫病態および／または炎症性病態である、請求項１３に記載の治療方法。
【請求項１５】
前記疾患または病態が癌である、請求項１３に記載の治療方法。
【請求項１６】
前記被験体がヒトである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項１７】
ブロモドメインと、請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩とを接触させることを含んでなる、ブロモドメインを阻害する方法。
【請求項１】
２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミドである式（Ｉ）の化合物
【化１】
またはその塩。
【請求項２】
２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミドである式（Ｉ）の化合物
【化２】
またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項３】
２−［（４Ｓ）−６−（４−クロロフェニル）−１−メチル−８−（メチルオキシ）−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン−４−イル］−Ｎ−エチルアセトアミドである式（Ｉ）の化合物
【化３】
【請求項４】
請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩と、１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の式（Ｉ）の化合物と、１種以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項６】
１種以上の他の治療活性剤と共に請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含んでなる、組合せ医薬品。
【請求項７】
治療に使用するための請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項８】
治療に使用するための請求項３に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療における使用のための、請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項１０】
前記疾患または病態が、慢性自己免疫病態および／または炎症性病態である、請求項９に記載の使用のための、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項１１】
前記疾患または病態が癌である、請求項９に記載の使用のための、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
【請求項１２】
ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態を治療するための薬剤の製造における、請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用。
【請求項１３】
ブロモドメイン阻害剤が適応される疾患または病態の治療方法であって、請求項２に記載の治療有効量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項１４】
前記疾患または病態が、慢性自己免疫病態および／または炎症性病態である、請求項１３に記載の治療方法。
【請求項１５】
前記疾患または病態が癌である、請求項１３に記載の治療方法。
【請求項１６】
前記被験体がヒトである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項１７】
ブロモドメインと、請求項２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩とを接触させることを含んでなる、ブロモドメインを阻害する方法。
【公表番号】特表２０１３−５１０１０７（Ｐ２０１３−５１０１０７Ａ）
【公表日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３７３２９（Ｐ２０１２−５３７３２９）
【出願日】平成２２年８月６日（２０１０．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６１５１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５４５５３
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（５０９３２９５２３）グラクソスミスクライン エルエルシー (38)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月６日（２０１０．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６１５１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５４５５３
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（５０９３２９５２３）グラクソスミスクライン エルエルシー (38)
【Ｆターム（参考）】
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