ペプチドの定量方法
【課題】 簡便に、かつ効率的に複数種類のペプチドを定量する方法を提供する。
【解決手段】 検体に含まれる第１〜第ｎ（ｎは２以上の整数である。）のペプチドを定量する方法であって、（ａ）第１のペプチドの濃度を求める工程、（ｂ）検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出する工程、及び（ｃ）次式（１）：Ａ＝Ｂ／Ｃ×Ｄ（１）［式中、Ａは検体に含まれる第ｋ（ｋは２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度を表し、Ｂは検体に含まれる第ｋのペプチドのピーク面積を表し、Ｃは検体に含まれる第１のペプチドのピーク面積を表し、Ｄは検体に含まれる第１のペプチドの濃度を表す。］に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求める工程を含む方法である。
【解決手段】 検体に含まれる第１〜第ｎ（ｎは２以上の整数である。）のペプチドを定量する方法であって、（ａ）第１のペプチドの濃度を求める工程、（ｂ）検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出する工程、及び（ｃ）次式（１）：Ａ＝Ｂ／Ｃ×Ｄ（１）［式中、Ａは検体に含まれる第ｋ（ｋは２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度を表し、Ｂは検体に含まれる第ｋのペプチドのピーク面積を表し、Ｃは検体に含まれる第１のペプチドのピーク面積を表し、Ｄは検体に含まれる第１のペプチドの濃度を表す。］に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求める工程を含む方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体に含まれる複数種類のペプチドを定量する方法に関し、特に、複数種類のペプチドのうちの一種類のペプチドの濃度に基づいて、他の複数種類のペプチドの濃度を求めることができる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動植物等から得られるペプチドは、様々な生理活性を有することが知られている。例えば、ゴマ、かつお節、イワシ等から得られるペプチドは、アンジオテンシン変換酵素活性阻害作用を有することが知られており、小麦から得られるペプチドは、インスリン分泌促進作用を有することが知られている。これらの作用を有するペプチドは、医学的、生理学的に重要な役割を果たすため、ペプチドを定量する方法が重要視され、従来、様々なペプチドの定量方法が提案されている。
【０００３】
例えば、ペプチドは、従来、単離精製した単一成分、又は化学合成された単一成分を標準物質として高速液体クロマトグラフィー（特許文献１参照）や電気泳動（特許文献２参照）等により定量されている。
【０００４】
また、チオール基を有するペプチドを蛍光ラベル化して定量する方法（特許文献３参照）や酵素免疫検定法による神経ペプチドの定量方法（特許文献４参照）なども提案されている。
【特許文献１】特許第３３８８６０２号公報
【特許文献２】特開２００４−１８４０９２号公報
【特許文献３】特開２００３−５０２３６号公報
【特許文献４】特開２００３−１６１７３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、植物等の抽出物や動植物等の分解物等に含まれる複数種類のペプチドの中から特定の複数種類のペプチドを定量する場合、ペプチドが特有の発色団を有していないため、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動では分別検出をすることが困難であった。
【０００６】
また、特許文献３及び特許文献４に記載の定量方法は、特殊なペプチドを定量する方法であり、煩雑な前処理等を必要とするため、汎用性に乏しいという問題があった。
【０００７】
このような実状に鑑みて、本発明は、簡便に、かつ効率的に複数種類のペプチドを定量することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明は、検体に含まれる第１〜第ｎ（ｎは２以上の整数である。）のペプチドを定量する方法であって、（ａ）第１のペプチドの濃度を求める工程、（ｂ）検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出する工程、及び（ｃ）次式（１）：Ａ＝Ｂ／Ｃ×Ｄ［式中、Ａは検体に含まれる第ｋ（ｋは２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度を表し、Ｂは検体に含まれる第ｋのペプチドのピーク面積を表し、Ｃは検体に含まれる第１のペプチドのピーク面積を表し、Ｄは検体に含まれる第１のペプチドの濃度を表す。］に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求める工程を含む前記方法である（請求項１）。
【０００９】
上記発明（請求項１）によれば、検体に含まれる第１のペプチドの濃度に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求めることができるため、簡便に、かつ効率的に複数種類のペプチドを定量することができる。
【００１０】
上記発明（請求項１）においては、前記工程（ａ）において、内部標準物質を添加した検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比を算出し、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比と第１のペプチドの濃度との相関関係に基づいて、第１のペプチドの濃度を求めることが好ましい（請求項２）。
【００１１】
上記発明（請求項２）によれば、第１のペプチドの濃度の定量精度を向上させることができ、これにより、第２〜第ｎのペプチドの定量精度を向上させることができる。
【００１２】
上記発明（請求項２）においては、前記内部標準物質が、ペプチドであることが好ましい（請求項３）。
【００１３】
上記発明（請求項３）によれば、内部標準物質の化学的性質が、第１のペプチドの化学的性質と類似するため、第１のペプチドの定量精度をさらに向上させることができ、これにより、第２〜第ｎのペプチドの定量精度をさらに向上させることができる。
【００１４】
上記発明（請求項１〜３）においては、前記工程（ｂ）において、第１〜第ｎのペプチドの保持時間に基づいて、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルのピークと第１〜第ｎのペプチドとの対応関係を決定し、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出することが好ましい（請求項４）。
【００１５】
ペプチドの保持時間は、液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理したときに用いた液体クロマトグラフィー／質量分析法の条件（例えば、カラムに充填された固定相の種類、カラム温度、移動相の流速等）が同一であれば、ペプチドの種類に応じて異なる。したがって、上記発明（請求項４）によれば、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルの各ピークが、第１〜第ｎのペプチドのいずれのピークであるかを、第１〜第ｎのペプチドの保持時間に基づいて、正確に決定することができる。
【００１６】
上記発明（請求項１〜４）においては、前記第１〜第ｎのペプチドのアミノ酸残基数が、２〜５０個であることが好ましい（請求項５）。
【００１７】
アミノ酸残基数が２〜５０個のペプチドの場合、ペプチドの種類にかかわらず、ペプチドの濃度と当該ペプチドのピーク面積との比がほぼ一定になる。したがって、上記発明（請求項５）によれば、式（１）に基づいて、第２〜第ｎのペプチドを定量することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、検体に含まれる複数種類のペプチドのうちの一種類のペプチドの濃度に基づいて、他の複数種類のペプチドの濃度を求めることができ、簡便に、かつ効率的に複数種類のペプチドを定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、検体に含まれる第１〜第ｎ（ｎは２以上の整数である。）のペプチドを定量する方法である。
【００２０】
定量の対象となる第１〜第ｎのペプチド（「複数種類のペプチド」ということがある。）は、それぞれ種類が異なるペプチドである。第１〜第ｎのペプチドのアミノ酸残基数、アミノ酸配列等は特に限定されるものではない。第１〜第ｎのペプチドのアミノ酸残基数は、通常２〜５０個、好ましくは２〜２０個、さらに好ましくは２〜５個である。第１〜第ｎのペプチドのアミノ酸残基数が上記範囲であると、ペプチドの種類にかかわらず、液体クロマトグラフィー／質量分析法によって得られたマススペクトルのピーク面積とペプチドの濃度との比がほぼ一定になる。したがって、次式（１）：Ａ＝Ｂ／Ｃ×Ｄ［式中、Ａは検体に含まれる第ｋ（ｋは２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度を表し、Ｂは検体に含まれる第ｋのペプチドのピーク面積を表し、Ｃは検体に含まれる第１のペプチドのピーク面積を表し、Ｄは検体に含まれる第１のペプチドの濃度を表す。］に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求めることができる。
【００２１】
第１〜第ｎのペプチドは、天然物であってもよいし、合成物であってもよい。天然物としてのペプチドは、天然に存するペプチド又は天然に存するタンパク質の分解物として得ることができ、例えば、動植物等の抽出原料を抽出処理に供することによって得ることができる。また、合成物としてのペプチドは、公知の合成方法に従って得ることができる。
【００２２】
抽出原料である動植物等の種類としては、例えば、脱脂ゴマ、ゴマ、大豆、イワシ、牡蠣、蓄肉（牛肉，豚肉等）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
抽出処理は、特に限定されるものではなく、公知の方法により行うことができる。例えば、抽出原料をヘキサン等の非極性溶媒に供して脱脂等の前処理をし、抽出原料の５〜５０倍量の抽出溶媒（水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ溶媒等）に投入する。抽出溶媒による抽出処理後、抽出液を必要に応じて至適ｐＨ及び至適温度に調整し、タンパク質分解酵素等により酵素処理を行う。その後酵素を失活させ、濾過・濃縮・乾燥・粉末化することにより粉末状の複数種類のペプチドを得ることができる。
【００２４】
検体は、少なくとも第１〜第ｎのペプチドが含まれたものであれば特に限定されるものではなく、例えば、抽出原料を抽出処理することにより得られる抽出液；当該抽出液を希釈又は濃縮した希釈液又は濃縮液；当該抽出液、希釈液又は濃縮液を精製し乾燥することにより得られたペプチド固形物；当該ペプチド固形物を溶媒に溶解したペプチド溶液；合成により得られたペプチド固形物；当該ペプチド固形物を溶媒に溶解したペプチド溶液等が挙げられる。また、検体には第１〜第ｎのペプチド以外のペプチドが含まれていてもよい。
【００２５】
検体は、液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理する前に、必要に応じて前処理をしてもよい。検体は、複数種類のペプチド以外の不純物等を含んでいることもあり、前処理をして検体に含まれる不純物等を除去すると、ペプチドの定量精度を向上させることができる。なお、検体が不純物等を含まないものである場合は、当該前処理を省略してもよい。
【００２６】
検体の前処理は、検体に含まれる不純物等を除去することができれば特に限定されるものではなく、例えば、液体クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、透析、電気泳動等により行うことができる。ゲル浸透クロマトグラフィー又は透析により前処理を行えば、検体から不純物等を除去できるとともに、脱塩をすることもできるため好ましい。
【００２７】
「液体クロマトグラフィー／質量分析法」は、検体を液体クロマトグラフで処理した後、質量分析計で処理するすべての方法を含み、液体クロマトグラフ／質量分析計を用いた方法に限定されるものではない。また、「液体クロマトグラフィー／質量分析法」には、液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）分析法及び液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）分析法が含まれる。ＬＣ／ＭＳ分析法によれば、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）ピークを得ることができ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法によれば選択反応モニタリング（ＳＲＭ）ピークを得ることができる。本発明の方法における「液体クロマトグラフィー／質量分析法」は、ＬＣ／ＭＳ分析法であってもよいし、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法であってもよい。
【００２８】
本発明の方法は、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む。
（ａ）第１のペプチドの濃度を求める工程
（ｂ）検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出する工程
（ｃ）次式（１）：Ａ＝Ｂ／Ｃ×Ｄ［式中、Ａは検体に含まれる第ｋ（ｋは２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度を表し、Ｂは検体に含まれる第ｋのペプチドのピーク面積を表し、Ｃは検体に含まれる第１のペプチドのピーク面積を表し、Ｄは検体に含まれる第１のペプチドの濃度を表す。］に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求める工程
工程（ｃ）は、工程（ａ）及び工程（ｂ）の後に行う必要があるが、工程（ａ）又は工程（ｂ）を行う順序は特に限定されるものではない。
【００２９】
工程（ａ）
工程（ａ）は、第１のペプチドの濃度を定量する工程である。
第１のペプチドは、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求めるにあたって基準となるペプチドであるため、工程（ｃ）を行う段階では第１のペプチドの濃度が判明していることを要する。
【００３０】
第１のペプチドの濃度は、例えば、下記の方法により求めることができるが、この方法に限定されるものではない。
まず、内部標準物質を添加した検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比を算出する。次に、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比と第１のペプチドの濃度との相関関係に基づいて、第１のペプチドの濃度を求める。このように、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比と第１のペプチドの濃度との相関関係に基づいて第１のペプチドの濃度を求めると、第１のペプチドの濃度の定量精度を向上させることができる。
【００３１】
第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比を算出する際に用いる液体クロマトグラフィー／質量分析法は、ＬＣ／ＭＳ分析法であってもよいし、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法であってもよいが、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法を用いれば、ＳＲＭピーク面積を得ることができるため好ましい。ＳＲＭピーク面積に基づいて第１のペプチドの濃度を定量すると、定量精度を向上させることができる。
【００３２】
内部標準物質としては、定量対象である第１〜第ｎのペプチド以外のペプチドを用いるのが好ましい。第１のペプチドと化学的性質が類似する物質を内部標準物質として選択すると、第１のペプチドの定量精度を向上させることができ、これにより、第２〜第ｎのペプチドの定量精度を向上させることができる。
【００３３】
内部標準物質であるペプチドのアミノ酸配列は、特に限定されるものではないが、内部標準物質及び第１のペプチドは、共通するアミノ酸配列を有することが好ましい。アミノ酸配列はペプチドの化学的性質を決定する一因であると考えられるため、内部標準物質及び第１のペプチドが共通するアミノ酸配列を有すると、両者の化学的性質が類似する可能性が高く、第１のペプチドの定量精度を向上させることができる。
【００３４】
内部標準物質であるペプチドのアミノ酸残基数は、特に限定されるものではないが、通常２〜５０個、好ましくは２〜５個である。アミノ酸残基数が上記範囲内であると、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比の変化量と第１のペプチドの濃度の変化量との比はほぼ一定となるため、第１のペプチドの濃度の定量精度を向上させることができる。
【００３５】
検体に添加する内部標準物質の濃度は、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比と第１のペプチドの濃度との相関関係を求める際に用いた内部標準物質の濃度と同一の濃度であることを要する。
【００３６】
上記相関関係は、例えば、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積と第１のペプチドの濃度との関係を示す検量線を作成することにより求めることができる。
【００３７】
検量線は、下記の方法により作成することができる。
各種濃度に調整したそれぞれの第１のペプチド溶液と所定の濃度に調整した内部標準物質溶液とを等量ずつ混合して検量線用試料溶液を調製し、当該検量線用試料溶液を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られるマススペクトルに基づいて、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積を算出する。得られたピーク面積から、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比を算出する。得られたピーク面積比及び第１のペプチドの濃度から、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比と第１のペプチドの濃度との関係を示す検量線を作成する。
【００３８】
検量線作成時に用いる液体クロマトグラフィー／質量分析法は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法でもよいし、ＬＣ／ＭＳ分析法でもよい。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法を用いれば、ＳＲＭピーク面積を得ることができ、ＬＣ／ＭＳ分析法を用いれば、ＳＩＭピーク面積を得ることができるが、検量線作成時にはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法を用いて、ＳＲＭピーク面積を得ることが好ましい。ＳＲＭピーク面積に基づいて定量する方が、ＳＩＭピーク面積に基づいて定量するよりも、第１のペプチドの濃度の定量精度をさらに向上させることができる。
【００３９】
後述する実施例から明らかなように、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比の変化量と第１のペプチドの濃度の変化量との比はほぼ一定であり、所定の濃度範囲においては良好な直線性を示す。したがって、検体に含まれる第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比が判明すれば、検量線を用いて検体に含まれる第１のペプチドの濃度を求めることができる。
【００４０】
工程（ｂ）
工程（ｂ）は、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出する工程である。工程（ｂ）で用いられる液体クロマトグラフィー／質量分析法は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法でもよいし、ＬＣ／ＭＳ分析法でもよいが、ＬＣ／ＭＳ分析法を用いるのが好ましい。ＬＣ／ＭＳ分析法を用いる方が、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理するときの操作が簡便である。
【００４１】
工程（ｂ）において、第１〜第ｎのペプチドの保持時間に基づいて、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルのピークと第１〜第ｎのペプチドとの対応関係を決定し、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出することが好ましい。
「保持時間」は、液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理したときの保持時間を意味する。
【００４２】
ペプチドの保持時間は、液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理したときに用いた液体クロマトグラフィー／質量分析法の条件（例えば、カラムに充填された固定相の種類、カラム温度、移動相の流速等）が同一であれば、ペプチドの種類に応じて異なる。したがって、第１〜第ｎのペプチドの保持時間に基づいて、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルのピークと第１〜第ｎのペプチドとの対応関係を決定することができる。
【００４３】
第１〜第ｎのペプチドの保持時間は、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理したときに用いた液体クロマトグラフィー／質量分析法の条件と同一の条件の下、第１〜第ｎのペプチドを一種類ずつ液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって求めることを要する。
【００４４】
第１〜第ｎのペプチドの保持時間は、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルのピークと第１〜第ｎのペプチドとの対応関係を決定する際に判明していればよい。なお、第１〜第ｎのペプチドの保持時間が予め判明していれば、第１〜第ｎのペプチドの保持時間を測定しなくてもよい。
【００４５】
工程（ｃ）
工程（ｃ）は、次式（１）に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求める工程である。
Ａ＝Ｂ／Ｃ×Ｄ・・・（１）
ただし、式（１）中、Ａは検体に含まれる第ｋ（ｋは２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度を表し、Ｂは検体に含まれる第ｋのペプチドのピーク面積を表し、Ｃは検体に含まれる第１のペプチドのピーク面積を表し、Ｄは検体に含まれる第１のペプチドの濃度を表す。
第１〜第ｎのペプチド濃度の単位としては、例えば、ｎｇ／ｍＬ、μｇ／ｍＬ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
後述する実施例から明らかなように、ペプチドの種類にかかわらず、ペプチドのピーク面積と当該ペプチドの濃度との比は、ほぼ一定であると推測できる。したがって、検体に含まれる第１のペプチドの濃度を定量すれば、第１のペプチドのピーク面積と第２〜第ｎのペプチドのピーク面積との比及び第１のペプチドの濃度を用いて、式（１）に基づき、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求めることができるため、簡易に、かつ効率的に複数種類のペプチドを定量することができる。
【００４７】
本発明によれば、検体に含まれる複数種類のペプチドのうちの一種類のペプチド濃度に基づいて、他の複数種類のペプチドを定量することができるため、簡易に、かつ効率的に複数種類のペプチドを定量することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００４９】
〔実施例１〕ペプチドの抽出・精製
脱脂ゴマ１６０ｋｇに抽出溶媒として０．０５Ｎの水酸化ナトリウム３０００Ｌを加え、５５℃の温度条件下で４５分間攪拌してゴマタンパク質を溶解抽出した。得られた抽出液に２Ｎの塩酸を加え、抽出液のｐＨを４．５に調整し、等電点沈殿によりタンパク質を得た。得られたタンパク質を水１５００Ｌに懸濁させ、懸濁液に０．０５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加え、懸濁液のｐＨを７．０に調整した後、サモアーゼ（商品名，大和化成社製）３００ｇを添加し、６５℃の温度条件下で２時間反応させた。その後、酵素反応液に２Ｎの塩酸を加えて酵素反応液のｐＨを５．０に調整し、加熱により酵素を失活させ、濾過・濃縮・粉末化し、粉末状脱脂ゴマペプチド５０ｋｇを得た。
【００５０】
〔実施例２〕検量線の作成
（１）ＬＶＹ標準溶液の調製
脱脂ゴマに含まれていることが知られているトリペプチド（Leu-Val-Tyr(LVY)，ペプチド研究所社製）１０ｍｇを精密に量り取り、１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液を加え完全に溶解させ、１０ｍＬに定容した。この溶液を１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液にて段階的に希釈し、各種濃度（１５×１０３ｎｇ／ｍＬ，３．０×１０３ｎｇ／ｍＬ，０．６０×１０３ｎｇ／ｍＬ）のＬＶＹ標準溶液を調製した。
【００５１】
（２）内部標準溶液の調製
ジペプチド（Val-Tyr(VY)，シグマ−アルドリッチ社製）１０ｍｇを精密に量り取り、１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液を加え完全に溶解させ、１０ｍＬに定容し、内部標準溶液原液とした。この内部標準溶液原液１ｍＬに１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液を加えて１０ｍＬに定容し、内部標準溶液を調製した。
【００５２】
（３）検量線の作成
各種濃度のＬＶＹ標準溶液と内部標準溶液とを等量ずつ混合した検量線用溶液を調製し、下記の条件により、検量線用溶液をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法で処理し、ＶＹ及びＬＶＹのＳＲＭピーク面積を測定した。
【００５３】
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法の条件］
カラム：ODS-80Ts（内径；４．６ｍｍ，長さ；１００ｍｍ，東ソー社製）
カラム温度：３０℃
流速：４００μＬ／ｍｉｎ
検量線用溶液注入量：２０μＬ
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む
水／アセトニトリルのグラジエント（９０：１０→５５：４５）
UV検出波長：２１５ｎｍ
MS検出条件：エレクトロスプレーイオン(ESI)法
positive（測定範囲；m/z 150〜800）
MS/MS検出条件：（VY）ESI positive前駆イオンm/z 281，SRM m/z 182
（LVY）ESI positive前駆イオンm/z 394，SRM m/z 213
【００５４】
上記の測定結果に基づいて検量線を作成した。図１に、作成した検量線を示す。図１に示すように、作成した検量線は、ＬＶＹ濃度が１５×１０３ｎｇ／ｍＬ以下であれば、良好な直線性を示し、ＬＶＹ及びＶＹ（内部標準物質）のＳＲＭピーク面積比とＬＶＹ濃度とは、それぞれの変化量の比が一定であることが確認された。したがって、下記式（２）が成立し、ＬＶＹ及びＶＹのＳＲＭピーク面積比に基づいて、ＬＶＹの濃度を求めることができることが確認された。
ＬＶＹ濃度(ng/mL)＝(ＳＲＭピーク面積比−0.2003)/0.033・・・（２）
SRMピーク面積比(％)＝LVYのSRMピーク面積/VYのSRMピーク面積×100
【００５５】
〔実施例３〕各種ペプチドのＳＩＭピーク面積の測定，保持時間の測定
脱脂ゴマに含有される複数種類のペプチド（Leu-Val-Tyr(LVY)，Ile-Val-Tyr(IVY)，Val-Ile-Tyr(VIY)，Leu-Ser-Ala(LSA)，Leu-Gln-Pro(LQP)，Leu-Lys-Tyr(LKY)，Met-Leu-Pro-Ala-Tyr(MLPAY)）及び実施例２で用いた内部標準物質（Val-Tyr(VY)）を１ｍｇずつ精密に量り取り、１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液を加えて完全に溶解させ、それぞれ１０ｍＬに定容し各種ペプチド溶液を調製した。
【００５６】
上記各種ペプチド溶液を１００μＬずつ混合し、１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液を加え、各種ペプチド濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬになるように試料溶液を調製し、下記の条件により、試料溶液をＬＣ／ＭＳ分析法で処理し、各種ペプチドのＳＩＭピーク面積を測定した。
また、下記の条件により、上記各種ペプチド溶液を一種類ずつＬＣ／ＭＳ分析法で処理し、各種ペプチドの保持時間を測定した。
【００５７】
［ＬＣ／ＭＳ分析法の条件］
カラム：ODS-80Ts（内径；４．６ｍｍ，長さ；１００ｍｍ，東ソー社製）
カラム温度：３０℃
流速：４００μＬ／ｍｉｎ
試料溶液注入量：２０μＬ
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む
水／アセトニトリルのグラジエント（９０：１０→５５：４５）
UV検出波長：２１５ｎｍ
MS検出条件：エレクトロスプレーイオン化(ESI)法
positive（測定範囲 m/z 150〜800）
ESI positive SIM（VY） m/z 281
ESI positive SIM（LVY） m/z 394
ESI positive SIM（IVY） m/z 394
ESI positive SIM（VIY） m/z 394
ESI positive SIM（LSA） m/z 290
ESI positive SIM（LQP） m/z 357
ESI positive SIM（LKY） m/z 423
ESI positive SIM（MLPAY） m/z 594
【００５８】
図２に、上記測定により得られたマススペクトルのＳＩＭピークを示す。また、図２に示すＳＩＭピークから算出したＳＩＭピーク面積及び各種ペプチドの保持時間を表１に示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
図２及び表１に示すように、各種ペプチドのＳＩＭピーク面積はほぼ同一であることが確認された。このことから、ペプチドの種類にかかわらず、ペプチドのＳＩＭピーク面積とペプチド濃度との比がほぼ一定であることが推測できた。したがって、第１〜第ｎのペプチドが含まれている検体において、式（２）に基づいて定量した第１のペプチド（ＬＶＹ）の濃度、及び第１〜第ｎのペプチドのＳＩＭピーク面積を用いて、次式（３）に基づき、第２〜第ｎのペプチドの濃度を定量することができると考えられる。
Ａ’＝Ｂ’／Ｃ’×Ｄ’・・・（３）
ただし、式（３）中、Ａ’は検体に含まれる第ｋ’（ｋ’は２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表し、Ｂ’は検体に含まれる第ｋ’のペプチドのＳＩＭピーク面積を表し、Ｃ’は検体に含まれる第１のペプチドのＳＩＭピーク面積を表し、Ｄ’は検体に含まれる第１のペプチドの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００６１】
また、表１に示すように、ペプチドの種類に応じて液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理したときの保持時間が異なるため、液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルの各ＳＩＭピークが、各種ペプチドのいずれのＳＩＭピークであるかを、各種ペプチドの保持時間に基づいて決定できることが確認された。
【００６２】
〔実施例４〕脱脂ゴマペプチドの定量
実施例１で得られた粉末状脱脂ゴマペプチド５０ｍｇを精密に量り取り、１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液を加え、超音波処理等により可溶性のものを完全に溶解させ、１０ｍＬに定容したゴマペプチド溶液を得た。
【００６３】
上記ゴマペプチド溶液と実施例２で用いた内部標準溶液とを等量ずつ混合した試料溶液を調製し、下記の条件により、当該試料溶液をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法で処理し、得られたマススペクトルからＬＶＹ（第１のペプチド）及びＶＹ（内部標準物質）のＳＲＭピーク面積を算出した。また、下記の条件により、当該試料溶液をＬＣ／ＭＳ分析法で処理し、得られたマススペクトルの各ＳＩＭピークが、各種ペプチドのいずれのＳＩＭピークであるかを、実施例３で測定した各種ペプチドの保持時間に基づいて決定し、各種ペプチドのＳＩＭピーク面積を算出した。
【００６４】
［ＬＣ／ＭＳ（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）分析法の条件］
カラム：ODS-80Ts（径；４．６ｍｍ，長さ；１００ｍｍ，東ソー社製）
カラム温度：３０℃
流速：４００μＬ／ｍｉｎ
試料溶液注入量：２０μＬ
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む
水／アセトニトリルのグラジエント（９０：１０→５５：４５）
UV検出波長：２１５ｎｍ
MS検出条件：エレクトロスプレーイオン化(ESI)法
positive（測定範囲 m/z 150〜800）
ESI positive SIM（LVY） m/z 394
ESI positive SIM（IVY） m/z 281
ESI positive SIM（VIY） m/z 394
ESI positive SIM（LSA） m/z 394
ESI positive SIM（LQP） m/z 394
ESI positive SIM（LKY） m/z 394
ESI positive SIM（MLPAY） m/z 394
MS/MS検出条件：（VY）ESI positive 前駆イオン m/z 281，SRM m/z 182
（LVY）ESI positive 前駆イオン m/z 394，SRM m/z 213
【００６５】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法での処理により得られた測定結果を用いて、式（２）に基づき、試料溶液中のＬＶＹ濃度を算出した。また、ＬＣ／ＭＳ分析法での処理により得られたマススペクトルから算出した各種ペプチド及びＬＶＹのＳＩＭピーク面積を用いて、式（３）に基づき、試料溶液中の各種ペプチドの濃度を算出した。
上記試験結果について、表２に示す。
【００６６】
【表２】
【００６７】
上記試験の結果、脱脂ゴマに含まれる複数種類のペプチドのうち、ＬＳＡ，ＬＱＰ，ＬＫＹ，ＬＶＹ，ＭＬＰＡＹはペプチド濃度を算出することができ、検体に複数種類のペプチドが含まれている場合であっても、その複数種類のペプチドを液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られるＳＩＭピーク面積、及び複数種類のペプチドのうちの一種類のペプチドの濃度に基づいて、複数種類のペプチドをそれぞれ定量できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の方法は、植物からの抽出物、動植物等の分解物、食品、化粧品等に含有される活性ペプチド群の定量分析等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法で処理することによって得られたマススペクトルから作成した、ＬＶＹ及びＶＹのＳＲＭピーク面積比とＬＶＹ濃度との相関関係を示す検量線である。
【図２】脱脂ゴマに含有される複数種類のペプチドを、ＬＣ／ＭＳ分析法で処理することによって得られたマススペクトル（ＳＩＭピーク）である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体に含まれる複数種類のペプチドを定量する方法に関し、特に、複数種類のペプチドのうちの一種類のペプチドの濃度に基づいて、他の複数種類のペプチドの濃度を求めることができる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動植物等から得られるペプチドは、様々な生理活性を有することが知られている。例えば、ゴマ、かつお節、イワシ等から得られるペプチドは、アンジオテンシン変換酵素活性阻害作用を有することが知られており、小麦から得られるペプチドは、インスリン分泌促進作用を有することが知られている。これらの作用を有するペプチドは、医学的、生理学的に重要な役割を果たすため、ペプチドを定量する方法が重要視され、従来、様々なペプチドの定量方法が提案されている。
【０００３】
例えば、ペプチドは、従来、単離精製した単一成分、又は化学合成された単一成分を標準物質として高速液体クロマトグラフィー（特許文献１参照）や電気泳動（特許文献２参照）等により定量されている。
【０００４】
また、チオール基を有するペプチドを蛍光ラベル化して定量する方法（特許文献３参照）や酵素免疫検定法による神経ペプチドの定量方法（特許文献４参照）なども提案されている。
【特許文献１】特許第３３８８６０２号公報
【特許文献２】特開２００４−１８４０９２号公報
【特許文献３】特開２００３−５０２３６号公報
【特許文献４】特開２００３−１６１７３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、植物等の抽出物や動植物等の分解物等に含まれる複数種類のペプチドの中から特定の複数種類のペプチドを定量する場合、ペプチドが特有の発色団を有していないため、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動では分別検出をすることが困難であった。
【０００６】
また、特許文献３及び特許文献４に記載の定量方法は、特殊なペプチドを定量する方法であり、煩雑な前処理等を必要とするため、汎用性に乏しいという問題があった。
【０００７】
このような実状に鑑みて、本発明は、簡便に、かつ効率的に複数種類のペプチドを定量することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明は、検体に含まれる第１〜第ｎ（ｎは２以上の整数である。）のペプチドを定量する方法であって、（ａ）第１のペプチドの濃度を求める工程、（ｂ）検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出する工程、及び（ｃ）次式（１）：Ａ＝Ｂ／Ｃ×Ｄ［式中、Ａは検体に含まれる第ｋ（ｋは２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度を表し、Ｂは検体に含まれる第ｋのペプチドのピーク面積を表し、Ｃは検体に含まれる第１のペプチドのピーク面積を表し、Ｄは検体に含まれる第１のペプチドの濃度を表す。］に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求める工程を含む前記方法である（請求項１）。
【０００９】
上記発明（請求項１）によれば、検体に含まれる第１のペプチドの濃度に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求めることができるため、簡便に、かつ効率的に複数種類のペプチドを定量することができる。
【００１０】
上記発明（請求項１）においては、前記工程（ａ）において、内部標準物質を添加した検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比を算出し、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比と第１のペプチドの濃度との相関関係に基づいて、第１のペプチドの濃度を求めることが好ましい（請求項２）。
【００１１】
上記発明（請求項２）によれば、第１のペプチドの濃度の定量精度を向上させることができ、これにより、第２〜第ｎのペプチドの定量精度を向上させることができる。
【００１２】
上記発明（請求項２）においては、前記内部標準物質が、ペプチドであることが好ましい（請求項３）。
【００１３】
上記発明（請求項３）によれば、内部標準物質の化学的性質が、第１のペプチドの化学的性質と類似するため、第１のペプチドの定量精度をさらに向上させることができ、これにより、第２〜第ｎのペプチドの定量精度をさらに向上させることができる。
【００１４】
上記発明（請求項１〜３）においては、前記工程（ｂ）において、第１〜第ｎのペプチドの保持時間に基づいて、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルのピークと第１〜第ｎのペプチドとの対応関係を決定し、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出することが好ましい（請求項４）。
【００１５】
ペプチドの保持時間は、液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理したときに用いた液体クロマトグラフィー／質量分析法の条件（例えば、カラムに充填された固定相の種類、カラム温度、移動相の流速等）が同一であれば、ペプチドの種類に応じて異なる。したがって、上記発明（請求項４）によれば、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルの各ピークが、第１〜第ｎのペプチドのいずれのピークであるかを、第１〜第ｎのペプチドの保持時間に基づいて、正確に決定することができる。
【００１６】
上記発明（請求項１〜４）においては、前記第１〜第ｎのペプチドのアミノ酸残基数が、２〜５０個であることが好ましい（請求項５）。
【００１７】
アミノ酸残基数が２〜５０個のペプチドの場合、ペプチドの種類にかかわらず、ペプチドの濃度と当該ペプチドのピーク面積との比がほぼ一定になる。したがって、上記発明（請求項５）によれば、式（１）に基づいて、第２〜第ｎのペプチドを定量することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、検体に含まれる複数種類のペプチドのうちの一種類のペプチドの濃度に基づいて、他の複数種類のペプチドの濃度を求めることができ、簡便に、かつ効率的に複数種類のペプチドを定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、検体に含まれる第１〜第ｎ（ｎは２以上の整数である。）のペプチドを定量する方法である。
【００２０】
定量の対象となる第１〜第ｎのペプチド（「複数種類のペプチド」ということがある。）は、それぞれ種類が異なるペプチドである。第１〜第ｎのペプチドのアミノ酸残基数、アミノ酸配列等は特に限定されるものではない。第１〜第ｎのペプチドのアミノ酸残基数は、通常２〜５０個、好ましくは２〜２０個、さらに好ましくは２〜５個である。第１〜第ｎのペプチドのアミノ酸残基数が上記範囲であると、ペプチドの種類にかかわらず、液体クロマトグラフィー／質量分析法によって得られたマススペクトルのピーク面積とペプチドの濃度との比がほぼ一定になる。したがって、次式（１）：Ａ＝Ｂ／Ｃ×Ｄ［式中、Ａは検体に含まれる第ｋ（ｋは２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度を表し、Ｂは検体に含まれる第ｋのペプチドのピーク面積を表し、Ｃは検体に含まれる第１のペプチドのピーク面積を表し、Ｄは検体に含まれる第１のペプチドの濃度を表す。］に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求めることができる。
【００２１】
第１〜第ｎのペプチドは、天然物であってもよいし、合成物であってもよい。天然物としてのペプチドは、天然に存するペプチド又は天然に存するタンパク質の分解物として得ることができ、例えば、動植物等の抽出原料を抽出処理に供することによって得ることができる。また、合成物としてのペプチドは、公知の合成方法に従って得ることができる。
【００２２】
抽出原料である動植物等の種類としては、例えば、脱脂ゴマ、ゴマ、大豆、イワシ、牡蠣、蓄肉（牛肉，豚肉等）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
抽出処理は、特に限定されるものではなく、公知の方法により行うことができる。例えば、抽出原料をヘキサン等の非極性溶媒に供して脱脂等の前処理をし、抽出原料の５〜５０倍量の抽出溶媒（水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ溶媒等）に投入する。抽出溶媒による抽出処理後、抽出液を必要に応じて至適ｐＨ及び至適温度に調整し、タンパク質分解酵素等により酵素処理を行う。その後酵素を失活させ、濾過・濃縮・乾燥・粉末化することにより粉末状の複数種類のペプチドを得ることができる。
【００２４】
検体は、少なくとも第１〜第ｎのペプチドが含まれたものであれば特に限定されるものではなく、例えば、抽出原料を抽出処理することにより得られる抽出液；当該抽出液を希釈又は濃縮した希釈液又は濃縮液；当該抽出液、希釈液又は濃縮液を精製し乾燥することにより得られたペプチド固形物；当該ペプチド固形物を溶媒に溶解したペプチド溶液；合成により得られたペプチド固形物；当該ペプチド固形物を溶媒に溶解したペプチド溶液等が挙げられる。また、検体には第１〜第ｎのペプチド以外のペプチドが含まれていてもよい。
【００２５】
検体は、液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理する前に、必要に応じて前処理をしてもよい。検体は、複数種類のペプチド以外の不純物等を含んでいることもあり、前処理をして検体に含まれる不純物等を除去すると、ペプチドの定量精度を向上させることができる。なお、検体が不純物等を含まないものである場合は、当該前処理を省略してもよい。
【００２６】
検体の前処理は、検体に含まれる不純物等を除去することができれば特に限定されるものではなく、例えば、液体クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、透析、電気泳動等により行うことができる。ゲル浸透クロマトグラフィー又は透析により前処理を行えば、検体から不純物等を除去できるとともに、脱塩をすることもできるため好ましい。
【００２７】
「液体クロマトグラフィー／質量分析法」は、検体を液体クロマトグラフで処理した後、質量分析計で処理するすべての方法を含み、液体クロマトグラフ／質量分析計を用いた方法に限定されるものではない。また、「液体クロマトグラフィー／質量分析法」には、液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）分析法及び液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）分析法が含まれる。ＬＣ／ＭＳ分析法によれば、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）ピークを得ることができ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法によれば選択反応モニタリング（ＳＲＭ）ピークを得ることができる。本発明の方法における「液体クロマトグラフィー／質量分析法」は、ＬＣ／ＭＳ分析法であってもよいし、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法であってもよい。
【００２８】
本発明の方法は、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む。
（ａ）第１のペプチドの濃度を求める工程
（ｂ）検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出する工程
（ｃ）次式（１）：Ａ＝Ｂ／Ｃ×Ｄ［式中、Ａは検体に含まれる第ｋ（ｋは２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度を表し、Ｂは検体に含まれる第ｋのペプチドのピーク面積を表し、Ｃは検体に含まれる第１のペプチドのピーク面積を表し、Ｄは検体に含まれる第１のペプチドの濃度を表す。］に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求める工程
工程（ｃ）は、工程（ａ）及び工程（ｂ）の後に行う必要があるが、工程（ａ）又は工程（ｂ）を行う順序は特に限定されるものではない。
【００２９】
工程（ａ）
工程（ａ）は、第１のペプチドの濃度を定量する工程である。
第１のペプチドは、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求めるにあたって基準となるペプチドであるため、工程（ｃ）を行う段階では第１のペプチドの濃度が判明していることを要する。
【００３０】
第１のペプチドの濃度は、例えば、下記の方法により求めることができるが、この方法に限定されるものではない。
まず、内部標準物質を添加した検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比を算出する。次に、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比と第１のペプチドの濃度との相関関係に基づいて、第１のペプチドの濃度を求める。このように、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比と第１のペプチドの濃度との相関関係に基づいて第１のペプチドの濃度を求めると、第１のペプチドの濃度の定量精度を向上させることができる。
【００３１】
第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比を算出する際に用いる液体クロマトグラフィー／質量分析法は、ＬＣ／ＭＳ分析法であってもよいし、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法であってもよいが、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法を用いれば、ＳＲＭピーク面積を得ることができるため好ましい。ＳＲＭピーク面積に基づいて第１のペプチドの濃度を定量すると、定量精度を向上させることができる。
【００３２】
内部標準物質としては、定量対象である第１〜第ｎのペプチド以外のペプチドを用いるのが好ましい。第１のペプチドと化学的性質が類似する物質を内部標準物質として選択すると、第１のペプチドの定量精度を向上させることができ、これにより、第２〜第ｎのペプチドの定量精度を向上させることができる。
【００３３】
内部標準物質であるペプチドのアミノ酸配列は、特に限定されるものではないが、内部標準物質及び第１のペプチドは、共通するアミノ酸配列を有することが好ましい。アミノ酸配列はペプチドの化学的性質を決定する一因であると考えられるため、内部標準物質及び第１のペプチドが共通するアミノ酸配列を有すると、両者の化学的性質が類似する可能性が高く、第１のペプチドの定量精度を向上させることができる。
【００３４】
内部標準物質であるペプチドのアミノ酸残基数は、特に限定されるものではないが、通常２〜５０個、好ましくは２〜５個である。アミノ酸残基数が上記範囲内であると、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比の変化量と第１のペプチドの濃度の変化量との比はほぼ一定となるため、第１のペプチドの濃度の定量精度を向上させることができる。
【００３５】
検体に添加する内部標準物質の濃度は、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比と第１のペプチドの濃度との相関関係を求める際に用いた内部標準物質の濃度と同一の濃度であることを要する。
【００３６】
上記相関関係は、例えば、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積と第１のペプチドの濃度との関係を示す検量線を作成することにより求めることができる。
【００３７】
検量線は、下記の方法により作成することができる。
各種濃度に調整したそれぞれの第１のペプチド溶液と所定の濃度に調整した内部標準物質溶液とを等量ずつ混合して検量線用試料溶液を調製し、当該検量線用試料溶液を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られるマススペクトルに基づいて、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積を算出する。得られたピーク面積から、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比を算出する。得られたピーク面積比及び第１のペプチドの濃度から、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比と第１のペプチドの濃度との関係を示す検量線を作成する。
【００３８】
検量線作成時に用いる液体クロマトグラフィー／質量分析法は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法でもよいし、ＬＣ／ＭＳ分析法でもよい。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法を用いれば、ＳＲＭピーク面積を得ることができ、ＬＣ／ＭＳ分析法を用いれば、ＳＩＭピーク面積を得ることができるが、検量線作成時にはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法を用いて、ＳＲＭピーク面積を得ることが好ましい。ＳＲＭピーク面積に基づいて定量する方が、ＳＩＭピーク面積に基づいて定量するよりも、第１のペプチドの濃度の定量精度をさらに向上させることができる。
【００３９】
後述する実施例から明らかなように、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比の変化量と第１のペプチドの濃度の変化量との比はほぼ一定であり、所定の濃度範囲においては良好な直線性を示す。したがって、検体に含まれる第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比が判明すれば、検量線を用いて検体に含まれる第１のペプチドの濃度を求めることができる。
【００４０】
工程（ｂ）
工程（ｂ）は、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出する工程である。工程（ｂ）で用いられる液体クロマトグラフィー／質量分析法は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法でもよいし、ＬＣ／ＭＳ分析法でもよいが、ＬＣ／ＭＳ分析法を用いるのが好ましい。ＬＣ／ＭＳ分析法を用いる方が、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理するときの操作が簡便である。
【００４１】
工程（ｂ）において、第１〜第ｎのペプチドの保持時間に基づいて、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルのピークと第１〜第ｎのペプチドとの対応関係を決定し、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出することが好ましい。
「保持時間」は、液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理したときの保持時間を意味する。
【００４２】
ペプチドの保持時間は、液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理したときに用いた液体クロマトグラフィー／質量分析法の条件（例えば、カラムに充填された固定相の種類、カラム温度、移動相の流速等）が同一であれば、ペプチドの種類に応じて異なる。したがって、第１〜第ｎのペプチドの保持時間に基づいて、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルのピークと第１〜第ｎのペプチドとの対応関係を決定することができる。
【００４３】
第１〜第ｎのペプチドの保持時間は、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理したときに用いた液体クロマトグラフィー／質量分析法の条件と同一の条件の下、第１〜第ｎのペプチドを一種類ずつ液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって求めることを要する。
【００４４】
第１〜第ｎのペプチドの保持時間は、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルのピークと第１〜第ｎのペプチドとの対応関係を決定する際に判明していればよい。なお、第１〜第ｎのペプチドの保持時間が予め判明していれば、第１〜第ｎのペプチドの保持時間を測定しなくてもよい。
【００４５】
工程（ｃ）
工程（ｃ）は、次式（１）に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求める工程である。
Ａ＝Ｂ／Ｃ×Ｄ・・・（１）
ただし、式（１）中、Ａは検体に含まれる第ｋ（ｋは２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度を表し、Ｂは検体に含まれる第ｋのペプチドのピーク面積を表し、Ｃは検体に含まれる第１のペプチドのピーク面積を表し、Ｄは検体に含まれる第１のペプチドの濃度を表す。
第１〜第ｎのペプチド濃度の単位としては、例えば、ｎｇ／ｍＬ、μｇ／ｍＬ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
後述する実施例から明らかなように、ペプチドの種類にかかわらず、ペプチドのピーク面積と当該ペプチドの濃度との比は、ほぼ一定であると推測できる。したがって、検体に含まれる第１のペプチドの濃度を定量すれば、第１のペプチドのピーク面積と第２〜第ｎのペプチドのピーク面積との比及び第１のペプチドの濃度を用いて、式（１）に基づき、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求めることができるため、簡易に、かつ効率的に複数種類のペプチドを定量することができる。
【００４７】
本発明によれば、検体に含まれる複数種類のペプチドのうちの一種類のペプチド濃度に基づいて、他の複数種類のペプチドを定量することができるため、簡易に、かつ効率的に複数種類のペプチドを定量することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００４９】
〔実施例１〕ペプチドの抽出・精製
脱脂ゴマ１６０ｋｇに抽出溶媒として０．０５Ｎの水酸化ナトリウム３０００Ｌを加え、５５℃の温度条件下で４５分間攪拌してゴマタンパク質を溶解抽出した。得られた抽出液に２Ｎの塩酸を加え、抽出液のｐＨを４．５に調整し、等電点沈殿によりタンパク質を得た。得られたタンパク質を水１５００Ｌに懸濁させ、懸濁液に０．０５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を加え、懸濁液のｐＨを７．０に調整した後、サモアーゼ（商品名，大和化成社製）３００ｇを添加し、６５℃の温度条件下で２時間反応させた。その後、酵素反応液に２Ｎの塩酸を加えて酵素反応液のｐＨを５．０に調整し、加熱により酵素を失活させ、濾過・濃縮・粉末化し、粉末状脱脂ゴマペプチド５０ｋｇを得た。
【００５０】
〔実施例２〕検量線の作成
（１）ＬＶＹ標準溶液の調製
脱脂ゴマに含まれていることが知られているトリペプチド（Leu-Val-Tyr(LVY)，ペプチド研究所社製）１０ｍｇを精密に量り取り、１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液を加え完全に溶解させ、１０ｍＬに定容した。この溶液を１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液にて段階的に希釈し、各種濃度（１５×１０３ｎｇ／ｍＬ，３．０×１０３ｎｇ／ｍＬ，０．６０×１０３ｎｇ／ｍＬ）のＬＶＹ標準溶液を調製した。
【００５１】
（２）内部標準溶液の調製
ジペプチド（Val-Tyr(VY)，シグマ−アルドリッチ社製）１０ｍｇを精密に量り取り、１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液を加え完全に溶解させ、１０ｍＬに定容し、内部標準溶液原液とした。この内部標準溶液原液１ｍＬに１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液を加えて１０ｍＬに定容し、内部標準溶液を調製した。
【００５２】
（３）検量線の作成
各種濃度のＬＶＹ標準溶液と内部標準溶液とを等量ずつ混合した検量線用溶液を調製し、下記の条件により、検量線用溶液をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法で処理し、ＶＹ及びＬＶＹのＳＲＭピーク面積を測定した。
【００５３】
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法の条件］
カラム：ODS-80Ts（内径；４．６ｍｍ，長さ；１００ｍｍ，東ソー社製）
カラム温度：３０℃
流速：４００μＬ／ｍｉｎ
検量線用溶液注入量：２０μＬ
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む
水／アセトニトリルのグラジエント（９０：１０→５５：４５）
UV検出波長：２１５ｎｍ
MS検出条件：エレクトロスプレーイオン(ESI)法
positive（測定範囲；m/z 150〜800）
MS/MS検出条件：（VY）ESI positive前駆イオンm/z 281，SRM m/z 182
（LVY）ESI positive前駆イオンm/z 394，SRM m/z 213
【００５４】
上記の測定結果に基づいて検量線を作成した。図１に、作成した検量線を示す。図１に示すように、作成した検量線は、ＬＶＹ濃度が１５×１０３ｎｇ／ｍＬ以下であれば、良好な直線性を示し、ＬＶＹ及びＶＹ（内部標準物質）のＳＲＭピーク面積比とＬＶＹ濃度とは、それぞれの変化量の比が一定であることが確認された。したがって、下記式（２）が成立し、ＬＶＹ及びＶＹのＳＲＭピーク面積比に基づいて、ＬＶＹの濃度を求めることができることが確認された。
ＬＶＹ濃度(ng/mL)＝(ＳＲＭピーク面積比−0.2003)/0.033・・・（２）
SRMピーク面積比(％)＝LVYのSRMピーク面積/VYのSRMピーク面積×100
【００５５】
〔実施例３〕各種ペプチドのＳＩＭピーク面積の測定，保持時間の測定
脱脂ゴマに含有される複数種類のペプチド（Leu-Val-Tyr(LVY)，Ile-Val-Tyr(IVY)，Val-Ile-Tyr(VIY)，Leu-Ser-Ala(LSA)，Leu-Gln-Pro(LQP)，Leu-Lys-Tyr(LKY)，Met-Leu-Pro-Ala-Tyr(MLPAY)）及び実施例２で用いた内部標準物質（Val-Tyr(VY)）を１ｍｇずつ精密に量り取り、１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液を加えて完全に溶解させ、それぞれ１０ｍＬに定容し各種ペプチド溶液を調製した。
【００５６】
上記各種ペプチド溶液を１００μＬずつ混合し、１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液を加え、各種ペプチド濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬになるように試料溶液を調製し、下記の条件により、試料溶液をＬＣ／ＭＳ分析法で処理し、各種ペプチドのＳＩＭピーク面積を測定した。
また、下記の条件により、上記各種ペプチド溶液を一種類ずつＬＣ／ＭＳ分析法で処理し、各種ペプチドの保持時間を測定した。
【００５７】
［ＬＣ／ＭＳ分析法の条件］
カラム：ODS-80Ts（内径；４．６ｍｍ，長さ；１００ｍｍ，東ソー社製）
カラム温度：３０℃
流速：４００μＬ／ｍｉｎ
試料溶液注入量：２０μＬ
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む
水／アセトニトリルのグラジエント（９０：１０→５５：４５）
UV検出波長：２１５ｎｍ
MS検出条件：エレクトロスプレーイオン化(ESI)法
positive（測定範囲 m/z 150〜800）
ESI positive SIM（VY） m/z 281
ESI positive SIM（LVY） m/z 394
ESI positive SIM（IVY） m/z 394
ESI positive SIM（VIY） m/z 394
ESI positive SIM（LSA） m/z 290
ESI positive SIM（LQP） m/z 357
ESI positive SIM（LKY） m/z 423
ESI positive SIM（MLPAY） m/z 594
【００５８】
図２に、上記測定により得られたマススペクトルのＳＩＭピークを示す。また、図２に示すＳＩＭピークから算出したＳＩＭピーク面積及び各種ペプチドの保持時間を表１に示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
図２及び表１に示すように、各種ペプチドのＳＩＭピーク面積はほぼ同一であることが確認された。このことから、ペプチドの種類にかかわらず、ペプチドのＳＩＭピーク面積とペプチド濃度との比がほぼ一定であることが推測できた。したがって、第１〜第ｎのペプチドが含まれている検体において、式（２）に基づいて定量した第１のペプチド（ＬＶＹ）の濃度、及び第１〜第ｎのペプチドのＳＩＭピーク面積を用いて、次式（３）に基づき、第２〜第ｎのペプチドの濃度を定量することができると考えられる。
Ａ’＝Ｂ’／Ｃ’×Ｄ’・・・（３）
ただし、式（３）中、Ａ’は検体に含まれる第ｋ’（ｋ’は２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表し、Ｂ’は検体に含まれる第ｋ’のペプチドのＳＩＭピーク面積を表し、Ｃ’は検体に含まれる第１のペプチドのＳＩＭピーク面積を表し、Ｄ’は検体に含まれる第１のペプチドの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
【００６１】
また、表１に示すように、ペプチドの種類に応じて液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理したときの保持時間が異なるため、液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルの各ＳＩＭピークが、各種ペプチドのいずれのＳＩＭピークであるかを、各種ペプチドの保持時間に基づいて決定できることが確認された。
【００６２】
〔実施例４〕脱脂ゴマペプチドの定量
実施例１で得られた粉末状脱脂ゴマペプチド５０ｍｇを精密に量り取り、１０質量％トリフルオロ酢酸水溶液を加え、超音波処理等により可溶性のものを完全に溶解させ、１０ｍＬに定容したゴマペプチド溶液を得た。
【００６３】
上記ゴマペプチド溶液と実施例２で用いた内部標準溶液とを等量ずつ混合した試料溶液を調製し、下記の条件により、当該試料溶液をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法で処理し、得られたマススペクトルからＬＶＹ（第１のペプチド）及びＶＹ（内部標準物質）のＳＲＭピーク面積を算出した。また、下記の条件により、当該試料溶液をＬＣ／ＭＳ分析法で処理し、得られたマススペクトルの各ＳＩＭピークが、各種ペプチドのいずれのＳＩＭピークであるかを、実施例３で測定した各種ペプチドの保持時間に基づいて決定し、各種ペプチドのＳＩＭピーク面積を算出した。
【００６４】
［ＬＣ／ＭＳ（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）分析法の条件］
カラム：ODS-80Ts（径；４．６ｍｍ，長さ；１００ｍｍ，東ソー社製）
カラム温度：３０℃
流速：４００μＬ／ｍｉｎ
試料溶液注入量：２０μＬ
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸を含む
水／アセトニトリルのグラジエント（９０：１０→５５：４５）
UV検出波長：２１５ｎｍ
MS検出条件：エレクトロスプレーイオン化(ESI)法
positive（測定範囲 m/z 150〜800）
ESI positive SIM（LVY） m/z 394
ESI positive SIM（IVY） m/z 281
ESI positive SIM（VIY） m/z 394
ESI positive SIM（LSA） m/z 394
ESI positive SIM（LQP） m/z 394
ESI positive SIM（LKY） m/z 394
ESI positive SIM（MLPAY） m/z 394
MS/MS検出条件：（VY）ESI positive 前駆イオン m/z 281，SRM m/z 182
（LVY）ESI positive 前駆イオン m/z 394，SRM m/z 213
【００６５】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法での処理により得られた測定結果を用いて、式（２）に基づき、試料溶液中のＬＶＹ濃度を算出した。また、ＬＣ／ＭＳ分析法での処理により得られたマススペクトルから算出した各種ペプチド及びＬＶＹのＳＩＭピーク面積を用いて、式（３）に基づき、試料溶液中の各種ペプチドの濃度を算出した。
上記試験結果について、表２に示す。
【００６６】
【表２】
【００６７】
上記試験の結果、脱脂ゴマに含まれる複数種類のペプチドのうち、ＬＳＡ，ＬＱＰ，ＬＫＹ，ＬＶＹ，ＭＬＰＡＹはペプチド濃度を算出することができ、検体に複数種類のペプチドが含まれている場合であっても、その複数種類のペプチドを液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られるＳＩＭピーク面積、及び複数種類のペプチドのうちの一種類のペプチドの濃度に基づいて、複数種類のペプチドをそれぞれ定量できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の方法は、植物からの抽出物、動植物等の分解物、食品、化粧品等に含有される活性ペプチド群の定量分析等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法で処理することによって得られたマススペクトルから作成した、ＬＶＹ及びＶＹのＳＲＭピーク面積比とＬＶＹ濃度との相関関係を示す検量線である。
【図２】脱脂ゴマに含有される複数種類のペプチドを、ＬＣ／ＭＳ分析法で処理することによって得られたマススペクトル（ＳＩＭピーク）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に含まれる第１〜第ｎ（ｎは２以上の整数である。）のペプチドを定量する方法であって、
（ａ）第１のペプチドの濃度を求める工程、
（ｂ）検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出する工程、及び
（ｃ）次式（１）：Ａ＝Ｂ／Ｃ×Ｄ［式中、Ａは検体に含まれる第ｋ（ｋは２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度を表し、Ｂは検体に含まれる第ｋのペプチドのピーク面積を表し、Ｃは検体に含まれる第１のペプチドのピーク面積を表し、Ｄは検体に含まれる第１のペプチドの濃度を表す。］に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求める工程
を含む前記方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）において、内部標準物質を添加した検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比を算出し、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比と第１のペプチドの濃度との相関関係に基づいて、第１のペプチドの濃度を求める請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記内部標準物質が、ペプチドである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）において、第１〜第ｎのペプチドの保持時間に基づいて、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルのピークと第１〜第ｎのペプチドとの対応関係を決定し、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記第１〜第ｎのペプチドのアミノ酸残基数が、２〜５０個である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
検体に含まれる第１〜第ｎ（ｎは２以上の整数である。）のペプチドを定量する方法であって、
（ａ）第１のペプチドの濃度を求める工程、
（ｂ）検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出する工程、及び
（ｃ）次式（１）：Ａ＝Ｂ／Ｃ×Ｄ［式中、Ａは検体に含まれる第ｋ（ｋは２〜ｎの整数である。）のペプチドの濃度を表し、Ｂは検体に含まれる第ｋのペプチドのピーク面積を表し、Ｃは検体に含まれる第１のペプチドのピーク面積を表し、Ｄは検体に含まれる第１のペプチドの濃度を表す。］に基づいて、第２〜第ｎのペプチドの濃度を求める工程
を含む前記方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）において、内部標準物質を添加した検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルに基づいて、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比を算出し、第１のペプチド及び内部標準物質のピーク面積比と第１のペプチドの濃度との相関関係に基づいて、第１のペプチドの濃度を求める請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記内部標準物質が、ペプチドである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）において、第１〜第ｎのペプチドの保持時間に基づいて、検体を液体クロマトグラフィー／質量分析法で処理することによって得られたマススペクトルのピークと第１〜第ｎのペプチドとの対応関係を決定し、第１〜第ｎのペプチドのピーク面積を算出する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記第１〜第ｎのペプチドのアミノ酸残基数が、２〜５０個である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−１０５６９９（Ｐ２００６−１０５６９９Ａ）
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２９０７８１（Ｐ２００４−２９０７８１）
【出願日】平成１６年１０月１日（２００４．１０．１）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月１日（２００４．１０．１）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
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