ペルフルオル有機化合物の医用エマルジョン及びその製法
本発明は、薬剤、特に、血液損失、低酸素性及び虚血性状態を治療するための、血液酸素供給を改善するための及び分離された潅流臓器及び組織を保存するための薬物に関する。本発明の、ペルフルオル有機化合物の医用エマルジョンは、急速に排出可能なペルフルオル有機化合物、例えば、ペルフルオルデカリン、ペルフルオルアクチルブロミド、過弗素化三級アミンの混合物の形で表わされるペルフルオル有機添加剤及び水‐塩分散液の形での燐脂質を含む。前記のペルフルオルデカリン又はペルフルオルアクチルブロミドは、１０：１〜１：１０の範囲の比率で、急速に排出可能なペルフルオル有機化合物の組成物中に含有される。過弗素化三級アミンの混合物は、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：シス‐及びトランス‐異性体ペルフルオル‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフルオル‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンの混合物の形で表わされる。本発明のエマルジョンの製法は、燐脂質の水‐塩分散液を製造すること、その中のペルフルオル有機化合物を高圧で均一化すること及び最終エマルジョンの加熱殺菌にある。その非凍結状態で＋４℃の温度での本発明のエマルジョンの貯蔵寿命は、少なくとも６ヶ月間に等しく、その間は、前記のエマルジョンと生理学的媒体（血液、血漿又は血清）との生物適合性は保存される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物物理学及び医学の分野、特に、血液損失、低酸素症及び虚血状態の治療用及び同様に血液酸素輸送改善及び分離された潅流臓器及び組織の保存用の薬剤に関する。
【０００２】
略語、参照、単位及び用語の一覧
界面活性剤 界面‐活性物質
Ｐ‐２６８、Ｆ‐２６８ プロキサノール（Proxanol）２６８、プルロニック（Pluronic）２６８
ＰＦＤ ペルフルオロデカリン
ＰＦＭＨＰ ペルフルオロメチルシクロヘキシルピペリジン
ＰＦＯＢ ペルフルオロオクチルブロミド
Ｆ１ ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物、シス‐及びトランス‐異性体：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフルオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンの混合物を表わす有機性液体
ＰＦＣｓ 複数のフルオロカーボン、複数のフルオロカーボン化合物
ＰＦＴＢＡ ペルフルオロトリブチルアミン
ＰＦＴＰＡ（ＰＡＦ‐３） ペルフルオロトリプロピルアミン
大豆‐Ｐ 大豆燐脂質
卵‐Ｐ 卵脂質
ｎ 波長指数
Ｃｖ エマルジョン中のフルオロカーボンの容量的含量（ｍｌ／ｄｌ）
ａ 平均粒度
λ 波長
Ｉｐ リアクトゲニティ（reactogenity）指数
フルオロカーボン化合物のエマルジョンを含有する潅流媒体を開発することにおける成功は、選択されたＰＦＣｓ及びこれらのＰＦＣｓをベースとするエマルジョンの物理‐化学的特性及びその製法にも大きく依存する。
【０００３】
薬効目的のＰＦＣｓは、異なった系統のフルオロカーボン化合物を表わす。これらは、外観的には、水の約２倍重い極めて高密度を有する澄明な無色の無臭液体である。異常に強力なＣ‐Ｆ結合（４８５．６ＫＪ／モル）は、これらの化合物の分子間力が極めて弱いという事実に結び付く。弱い分子間力は、それらの異常に強力なガス溶解能力、その内でも血液ガス溶解能力において証明される。
【０００４】
ＰＦＣｓは、強力なＣ‐Ｆ結合の結果として、化学的不活性によって特徴付けられる。それらは水に難溶性であり、生体において代謝的基礎を形成しない。ＰＦＣｓの化学的不活性は、生物学的不活性とは同一視され得ない。ＰＦＣをベースとするエマルジョンの静脈内注射で、これらのエマルジョンは臓器及び組織中に保留され、その滞留時間は、ＰＦＣの性質及びエマルジョンの用量に依存する。
【０００５】
異なった系統の過弗素化化合物の生物学的特性についての調査により、排出速度は一連の関連した物理‐化学的パラメーター、つまり、構造及び分子量、沸騰温度、蒸気圧及びヘキサン中の臨界溶解温度（Ｔ臨界）に依存することが示された。Ｔ臨界は、試験されるべき化合物及びヘキサンの同一容量が混合する温度である。Ｔ臨界は、脂質中の相対的ＰＦＣ溶解性の値として考慮され、その値は膜への通過率を特徴付ける。Ｔ臨界が低くなればなるほど、化合物がより良好に脂質中に溶け、かつより急速にそれが生体から排出される。第1表に、薬効適用のためのＰＦＣｓの選択基準として用いられる物理‐化学的パラメーターを示す。
【０００６】
第１表
異なった化合物のヘキサン中の臨界溶解温度（Ｔ臨界）、蒸気圧（Ｐ）及び半‐分解時間（ｔ1/2）の値［１］。
【０００７】
【表１】
【０００８】
前記のデータから、Ｔ臨界及びｔ1/2の間の強力な相関を見ることができる。この相関は、蒸気圧については認められない。大部分は、Ｔ臨界及び分子量は相互に連結される。ＰＦＣｓの最適分子量は、４６０〜５２０の範囲である。全般的に、薬効的ＰＦＣｓについて示された全選択基準は相互に矛盾していないが、量的特徴を有する。最近は、ペルフルオロカーボンエマルジョンの開発及び試験に関係する研究者は、比較的限られた数の化合物にかれらの注意を向けている。第2表及び第3表に、最も広範囲のＰＦＣｓの構造式及び物理‐化学的主要特性を示す。
【０００９】
第２表
最も広範囲で有望なＰＦＶｓの構造式
【表２】
【００１０】
異なったＰＦＣｓの第一の生物学的特性を試験する場合には、重要な要求が公式化された：同一視不可能な混合物の不在。未知特性を有する混合物は、静脈内注射した際に、基本的物質の真の反応状況（臓器内の保留、毒性、生体の異なった系への影響）を歪曲し得る。
【００１１】
第３表
薬効的製剤のベースを形成するＰＦＣｓの物理‐化学的特性
【表３】
【００１２】
注意：ＰＦＤ／ＰＦＴＰＡは、製剤フルオソル（Fluosol）‐ＤＡのベースである；ＰＦＤ／ＰＦＭＨＰは、製剤ペルフトラン（Perftoran）について；ＰＦＯＢ／ＰＦＤＢは、製剤オキシゲント（Oxygent）について。
【００１３】
液体ＰＦＣｓは、種々の水溶性の、生物学的活性物質用の不十分な溶剤である。この理由のために、酸素輸送媒体として適用するためのＰＦＣｓは、微細に分配されたエマルジョンが得られるまで、乳化剤水溶液中で分散される。
【００１４】
ＰＦＣｓのガス交換能力は、エマルジョン中の全酸素含量に従って決定される。酸素濃度は、ヘンリーの（Henry's）法則に従い、酸素圧に正比例する。ＰＦＣｓ中のガスの物理的溶解性の原則は、ペルフルオロカーボンにも及ぶ。エマルジョン中に溶解した酸素量はフルオロカーボン相に依存し、粒度には依存しない、即ち、フルオロカーボンエマルジョン中に溶解した酸素量は、各相のガス量値の合計によって計算される数値に概算する（水相中の酸素量プラスＰＦＣｓ中の酸素量）。また、ＰＦＣ及び血漿の混合物中の不活性ガス含量は、各相のガス量の合計法則に従う。従って、エマルジョン中の各ガス含量は、画分ＰＦＣ／Ｈ2Ｏの部分的ガス圧及び容量比によるその溶解性の物理的法則に従って計算され得る。このことは、ペルフルオロカーボンエマルジョン中の酸素含量が高ければ高いほど、その部分圧又はその張力（ｐＯ2）及びフルオロカーボン相の比率が高くなる。
【００１５】
体に注射する際に、各製剤の特異的（機能的）作用は、ＬＤ50値によって及び、主に、リアクトゲニティとして現われる副作用の欠如によっても決定される製剤の適合性によって決定される。ＰＦＣエマルジョンのＬＤ50値の大きさは、粒度に極めて依存する。平均粒度は０．２μmを越えてはならない。大粒子（平均粒度０．４μm以上）の比率で３％〜１０％の増加は、２つの因子によって言及されるエマルジョンのＬＤ50値を減少させる。ペルフルオロカーボンエマルジョンの可能なリアクトゲニティの検知は、静脈内注射のためのペルフルオロカーボンエマルジョンをベースとする製薬学的形を開発する際に解決されるべきであった最も困難な問題の１つである。リアクトゲニティ製剤を使用する際に、アレルギー反応がヒトに出現することがあり、それは、皮膚の僅かな発赤から呼吸停止及び心拍動停止を伴うアナフィラキシー反応まで、それ自体異なった経緯で現われる。
【００１６】
殆どの研究者は、リアクトゲニティが、大抵は、エマルジョンのフルオロカーボンベースの分散のために使用されかつ粒子の周りに（表面的）吸収層を形成する乳化剤の性質に依存するという意見である。第一世代のエマルジョンのリアクトゲニティは、オキシエチレン及びポリオキシプロピレンの非イオン性ブロックポリマー、プルロニックＦ６８（Ｆ‐６８）によって引き起こされ、かつ天然燐脂質によるその交換は、リアクトゲニティ問題を完全に解決するということが断固として信じられている。この意見は、完全には正しくなく、それというのも、脂肪エマルジョンは、天然燐脂質による安定化にも拘らず、リアクトゲニティを有するからである。ペルフルオロカーボンエマルジョンのリアクトゲニティは、乳化剤及び安定剤としての燐脂質の使用によって簡単には排除され得ない。実際に、ＰＦＣエマルジョンのリアクトゲニティは、何よりも、乳化粒子の表面特性によって、即ち、粒子を安定させる乳化剤層の状態によって作用されることが明らかになった。しかし、化学的構造、界面活性剤分子の性質及び分散系の安定性及び可能な二次反応の２つを決定する重要なパラメーターに加えて、界面活性剤とエマルジョン粒子の油核との結合強度、表面上の分子位置、その充填密度、血流中に存在するタンパク質及び他の生物学的活性分子に関する吸収特性の優勢及び最後に、エマルジョン粒子の大きさが役割を果たす。最後のパラメーターが、特に挙げられるべきである。ブロックコポリマー、ポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレンによってのみ安定化された製剤、ペルフトラン及びＦ‐６８に最も近い原型であるプロキサノール中のエマルジョンの平均粒度における減少は、二次反応における急速な減少に結び付く。このことから、エマルジョンの開発、組成及び製法において、表面的現象（２つの不均一系、エマルジョン及び血液又は血漿の相互作用）は、静脈内注射されたエマルジョンの反応に決定的な役割を果たすことが明らかである。これによって、油核及びまた後者と共同する界面活性剤の組成は実験的に選択され、かつ使用される技術の支持性も試験されるべきである。
【００１７】
薬効目的のための本発明によるペルフルオロカーボンエマルジョン及びその製法を開発する場合に、各組成及び各技術的要素を、生物学的作用について、動物モデルによって試験した。ペルフルオロカーボンエマルジョンを注射した際に、ウサギのリアクトゲニティ反応は、末梢血液中の中性好性白血球における急速な減少によって表わされることが知られている。ペルフルオロカーボンエマルジョンの可能なリアクトゲニティを評価する場合には、リアクトゲニティ指数Ｉｐを試験中に使用し、この指数は、式： Ｉｐ＝Ｃｋ／Ｃｖ に従って計算され、式中のＣｋ及びＣｖは、対照群及び試験群での初期水準に相対する好中球（％）を示す。５及び２０分間後に、Ｉｐが３よりも少ない場合には、リアクトゲニティ確率は最小である［３］。
【００１８】
ペルフルオロカーボンエマルジョンを製造するための異なった方法が公知である。ペルフルオロカーボンエマルジョンを含み、その中のペルフルオロカーボンベースは油相である水中油エマルジョンは、エネルギーにおいて高コストで製造される。油相の微分散は超音波によって又は機械的に行なわれる。
【００１９】
超音波の作用下に、分散は、２つの理由を有する強力な局部圧変化の摩擦力によって行なわれる。第一に、局部圧縮及び膨張が波の通過と共に液体中で交互に生じる。第二に、空洞現象が起き、即ち、水中に溶けたガスで充填される空洞の形成及び崩壊が起きる。超‐微細エマルジョンを製造するために必要である超音波作用のエネルギー及び力は、分散に加えて、Ｃ‐Ｆ結合が破壊されるほど大きい。結果として、毒性濃度のＦ-イオン約３〜５ミリモルがエマルジョンの水相中に出現する。そのような高濃度のＦ-を有するエマルジョンは、血液置換のために又は潅流臓器を保存することに使用することはできない。過剰なＦ-イオンを、イオン交換樹脂の通過によって除去することが必要である。超音波によって分散されたエマルジョンの第二の不利な点は、著しく高い分散範囲にあり、それというのも、平均粒度０．１μｍで、大きい粒子比率は、０．４μｍ以上及び０．０１μｍ以下の大きさで見出されるからである。
【００２０】
振盪又は強力な攪拌による機械的分散によって、生物医学的適用には受け入れられない１ミリメートル以上の粒度を有する、粗大にしか分散されないエマルジョンが得られる。微細に分配されたエマルジョンを製造するために、高圧下に分散媒体中に微細孔を通じて分散相の物質の強力な通過（押出し）を使用し、その結果として、液体噴射が乱れて小滴が生じる。分散は、圧力勾配及び水圧摩擦力によって行なわれる。エマルジョンは、通例、高圧ホモジナイザー中で製造される。得られるエマルジョンの安定化は、界面活性物質又は乳化剤によって達成される。これらの物質の安定化作用は、２つの理由によって説明される：第一に、相の間の過剰な表面エネルギーでの減少によって又は表面張力の減少によって、第二に、粒子の安定性を保証しかつ粒子の接触又は付着又は凝集を予防する構造的、機械的バリヤー（吸収層）の形成によって。
【００２１】
多くの界面活性剤の中で、少数のみが、静脈内注射用の製剤の製造に適用するための要求を満たす（第４表）。
【００２２】
第４表
ペルフルオロカーボンエマルジョンの製造のための一般的界面活性物質
【表４】
【００２３】
ここで、主に２つの乳化剤、つまり、プロキサノール‐２６８（プルロニックＦ‐６８）及び天然燐脂質（卵及び大豆燐脂質等）を、ペルフルオロカーボンエマルジョンを製造するために使用する。
【００２４】
プロキサノール構造は、極性頭（親水性部分）及び非‐極性尾（疎水性部分）を有する水溶性界面活性剤の特異的な分子特性に相応しない。プロキサノールの場合には、親水性分子特性は、２つのポリオキシドエチレン鎖によって決定され、その水素結合はＨ2Ｏ分子で形成される。ポリプロピレンポリオキシドのメチル基は、その分子の脂肪親和性を必要条件とする。Ｆ‐６８及びｐ‐２６８についてのポリオキシドエチレン／ポリオキシドポリプロピレンの比率は、平均して同一であり、８０：２０である。これらの乳化剤の安定化作用は、主に、フルオロカーボン粒子の周りの界面‐活性剤分子によって形成される保護膜の立体効果によって作用される。それによって、界面活性剤分子の最大部分は、吸収層で結合される界面活性剤に加えて、水相中で種々のミセル構造を形成し、それらの中で、フルオロカーボン化合物を含有しないそれらも形成する。吸収層中及び水相のミセル中の界面活性剤分子間に動的平衡が存在し、これは、一方で、吸収層の安定化のために要求され、かつ他方で、長期間の貯蔵中で吸収層中の界面活性剤の分子充填密度を妨害する。
【００２５】
燐脂質は天然起源の化合物の混合物を表わし、その一般的構造を第４表に示す。燐脂質は水に不溶性であり、同時に、異なったフルオロカーボン化合物に関して脂肪親和性の乏しい物質であるが、それらはホスファチジルコリン粒子の二重層中でＰＦＤ及びＰＦＴＰＡによって部分的に溶解される。水相中での燐脂質及びフルオロカーボン化合物の共同作用は、二重特性を有する。燐脂質のラメラ構造中にフルオロカーボン化合物を含有すること及び（又は）粒子表面に不可逆的に結合される燐脂質の単層を形成することが可能である。不均一粒子は、フルオロカーボン化合物及び燐脂質を含むエマルジョン中で可能であり、即ち、その粒子は燐脂質を含む及び燐脂質を含まない保護層で被覆される。この不均一性は、特殊事情及び／又はフルオロカーボン相に比較して過剰な燐脂質を製造することに原因を帰すことができる。
【００２６】
微細に分配されたエマルジョンについて、微細性を減少させる（粒子粗大化）ために決定する機構は、分散媒体を通じるフルオロカーボン化合物の分子の拡散による、小粒子から大粒子の分散相の等温蒸留又は分子物質蒸留である。この方法は、エマルジョンの"オストワルド熟成（Ostwald ripening）"又は"再凝縮"と称する。この方法の推進力は、大粒子に比較して小粒子上への飽和蒸気圧を増大させることである。また、この場合には、重要なパラメーターは、水性媒体中のフルオロカーボン化合物の溶解性の水準である。再凝縮の防止は、ペルフルオロカーボンエマルジョンの抵抗性凝集状態を得るために、即ち、粒子の微細性及び単一性を得るために決定的に重要である。不安定化、つまり、分子拡散及び僅少な凝結及び凝集への主要な方法は、フルオロカーボン相が２０容量％以下である、相対的に薄いエマルジョン、及びフルオロカーボン相が５０容量％である、もっと高く濃縮されたエマルジョンの特徴的な２つである。
【００２７】
ペルフルオロカーボンエマルジョンの安定化方法は公知である。コロイド系の安定化の基本的原則は、それらの分解機構の防止を意味する。ＰＦＣ／燐脂質をベースとするエマルジョン中の糖及び陰電荷を有する助乳化剤（燐脂質の少数成分）の添加は、吸収層中での界面活性剤分子の立体的相互作用を変化させることによって、及び粒子間の静電気的析力を増加させることによっても粒子の凝結を防止する。
【００２８】
分子拡散によって引き起こされるペルフルオロカーボンエマルジョンの主要な分解過程を減少させることは、より高い沸騰温度を有し、この過程を遅延させるフルオロカーボンベースに、二番目に少ない水溶性の成分（付加的なフルオロカーボン化合物）の添加によって達成される。
【００２９】
この安定化の原則は、製剤フルオソル‐ＤＡ、ペルフトラン及びオキシゲントの開発で使用される。編集されたデータは、挙げられた製剤の組成及び物理‐化学特性に従って、次の表５に表わされる。
【００３０】
第５表
製剤フルオソル‐ＤＡ（日本）、ペルフトラン（ロシア）及びオキシゲント（ＵＳＡ）の組成に従って編集されたデータ／２／。
【００３１】
【表５】
【００３２】
最初の２つの製剤において、フルオロカーボン化合物ペルフルオロトリプロピルアミン及びペルフルオロメチルシクロヘキサンピペリジンを、より高い沸騰温度及びより少ない水溶性を有する補足剤として、油相の最大比率を有するペルフルオロデカリンに加える。燐脂質補足剤（フルオソル‐ＤＡ）を有する水溶性プルロニックＦ‐６８又はその原型プロキサノール‐２６８（ペルフトラン）を、乳化剤として使用する。それらは、それらの物理‐化学特性に従って、相互に少し異なっている。それらは第一世代の製剤に属し、その一般的な不利な点は、不十分な安定性の故に、それらを凍結貯蔵しなければならないという事実にある。より高い沸騰温度を有し、より少ない水溶性であるペルフルオロデシルブロミドを、オキシゲント（ペルフルオロオクチルブロミド）のフルオロカーボンベースに加える。第二世代に属するオキシゲントの利点は、非‐凍結状態での貯蔵によって決定される。更に、製剤のフルオロカーボンベースであるペルフルオロオクチルブロミドは、ペルフルオロデカリンと殆ど同じ速度で（ｔ1/2〜４及び７日間に相応する）、生体から急速に排出される。
【００３３】
オキシゲントは、組成に関してやや異なっている注入媒体の商標名である。
【００３４】
乳化剤は、微細性のために要求されるＨ2Ｏ／ＰＦＣ系で、表面の中間相張力を低下させることに寄与するだけではない。乳化剤特性における変化は、分子拡散速度に影響し得る。それらの分子中に、弗素化された、疎水性の非‐弗素化の親水性部分を有する弗素化界面活性剤は、今後は有望であると考慮される。フルオロカーボン化合物のための弗素化界面活性剤の合成での大きな成功は、最近、フランスの化学者によって達成された［４］。合成の弗素化界面活性剤の一般的構造は、過弗素化鎖及び極性頭の組み合わせを表わす。炭化水素鎖は、これらの要素の結合として使用される。極性頭は、天然物質又はそれらの誘導体から選択される。極性頭としてアルコール又は糖誘導体を含有する弗素化界面活性剤は、プルロニックＦ‐６８と相乗作用を有する。極性頭として、弗素化界面活性剤中での燐脂質、糖ホスフェート又はホスファチジルコリンの使用は、乳化剤として天然燐脂質を含有するフルオロカーボンエマルジョンの安定性を増加させる。新規の混合弗素化界面活性剤群は、安定化のために提案された［４］。この弗素化界面活性剤群の分子は、２種の直鎖成分、つまり、炭化水素成分及び過弗素化成分のブロックを表わす。これらの化合物の一般式は、次のようである：
CnF2n+1CmH2m+1 又は CnF2n+1CH=CHCmH2m+1
発明者は、これらの分子を"合せ釘（dowel）"と称し、これは文字通り、"ばね"又は"結合要素"を意味する。
【００３５】
この意見は、一般的な直鎖ＲＨ‐ＲＦ構造を有する弗素化界面活性剤の分子が、強化要素の役割を果たし、その炭化水素末端がペルフルオロカーボン粒子を被覆する脂質中に入り込み、かつその他方の弗素化末端が油相中に入り込むこと、即ち、ＲＨ‐ＲＦ分子が、界面活性剤表面層の接着特性を改善することを説いている。
【００３６】
最近は、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドが、それらが他のフルオロカーボン化合物に比較して生体からより急速に排出されるという理由で、生医学的エマルジョンを製造するための最も受け入れられた化合物である。
【００３７】
特許［５、６］が公知であり、この際、血液置換剤の組成物が記載されていて、そのフルオロカーボンベースは、２種（ペルフルオロデカリン／ペルフルオロメチルシクロヘキシルピペリジン又はペルフルオロデカリン／ペルフルオロトリブチルアミン又はペルフルオロオクチルブロミド／ペルフルオロメチルシクロヘキシルピペリジン）、又は３種（ペルフルオロオクチルブロミド／ペルフルオロデカリン／ペルフルオロメチルシクロヘキシルピペリジン又はペルフルオロオクチルブロミド／ペルフルオロデカリン／ペルフルオロトリブチルアミン）又は更に４種（ペルフルオロオクチルブロミド／ペルフルオロデカリン／ペルフルオロメチルシクロヘキシルピペリジン／ペルフルオロトリブチルアミン）のフルオロカーボン化合物の、異なった比率での混合物を表わす。これらの混合物は、水溶性乳化剤プロキサノールＰ‐２６８によって分散する。この乳化剤の使用は、前記の混合物をプラスの温度で貯蔵することを可能にさせない。更に、これらの乳化剤は、融解後に、＋４°での限定貯蔵期間（せいぜい、１ヶ月間）を有する。このことはそれらの主要な不利な点である。
【００３８】
弗素化界面活性剤を有するエマルジョンは、特許‐保護されている。現今では、弗素化界面活性剤を含有するミクロ‐エマルジョン［７］は、それらが生体内で十分には安定していないという理由で、もはや注入媒体として応用されない。混合弗素化界面活性剤により製造されるペルフルオロカーボンエマルジョンの他の組成物は公知であり、前記の界面活性剤は、分子中に弗素親和性部分及び脂肪親和性部分を含有する［８］。これらのエマルジョンは、実際に、平均粒度を、プラスの温度で、しかし、ほんの３ヶ月以内で維持する。
【００３９】
リポシン（liposyn）の１０％脂肪エマルジョンを、燐脂質給源として、エマルジョン製造に用いる特許［９］が公知である。フルオロカーボン化合物の３群は、フルオロカーボンベースとして特許‐保護されている。ペルフルオロシクロアルカン又はペルフルオロアルキルシクロアルカンは第一群に属する（それらの中で、特に、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロメチルデカリン、ペルフルオロペルヒドロフェナントレン）。第二群は、ペルフルオロアルキル‐飽和の複素環状化合物を包含する。第三群は、過弗素化の三級アミン及び実際には、特に、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロトリプロピルアミンを包含する。ペルフルオロオクチルブロミドも、適用可能なフルオロカーボン化合物に属する。しかし、１０％リポシンにより安定したペルフルオロデカリンエマルジョンを製造することは未だ不可能である。その最長貯蔵期間は２５日間である。
【００４０】
もう１つの特許［１０］では、卵燐脂質をエマルジョン製造に使用する。フルオロカーボン相の比率は、１０〜５０容量％の範囲内で変化し、燐脂質のそれは０．５〜７質量％で変化する。その特許では、油相として、広汎な群の化合物から、ＰＦＣｓの１種、つまり、１〜２４個の弗素原子を有するペルフルオロヒドロフェナントレン群、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロメチルアダマンタン及びペルフルオロペルヒドロフェナントレンだけが選択され、使用される。
【００４１】
前記の２つの特許における主要な焦点は、製造されたフルオロカーボンエマルジョンの使用によって、異なった臓器及び系を保存するための方法にある。生理学的試験の開始で、エマルジョンを、晶質溶液及び／又は膠質活性物質（アルブミン、ヒドロキシエチル澱粉）と混合させる。提案されたエマルジョンは、実際には、第二世代のエマルジョンに属するが、本質的な欠点を有する。２つの特許では、エマルジョン安定性について、即ち、粒度を長期貯蔵（１ヶ月以上）で維持することについての試験結果は示されない。ここに挙げた２つの特許［９、１０］は、この際、原型として見なされる。
【００４２】
本発明によるエマルジョンに最も近い原型は、［１１］で挙げられたエマルジョンである。原型として見なされるこのエマルジョンは、第二世代に属し、急速に排出される４０〜５０容量％の量のフルオロカーボン化合物及び５〜１０容量％の高沸騰化合物の過弗素化補足剤を含有する。急速に排出されるフルオロカーボン化合物として、ペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミド（主成分）が使用され、かつ補足剤として、ペルフルオロメチルシクロヘキシルピペリジンが使用される。乳化剤は卵又は大豆燐脂質である。
【００４３】
ペルフルオロシクロヘキシルピペリジンは、エマルジョンを安定化させ、主成分（ペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミド）の分子拡散（再凝縮）速度を減少させ、異なった組成のエマルジョン、つまり、ペルフトランを製造するために使用される。特許［１１］から公知のエマルジョンの主要な欠点は、０．２μｍ以上の比較的大きい平均粒度である。
【００４４】
この発明の目的は、エマルジョンの安定性を増加させること、及びエマルジョンの品質を改善すること、即ち、非‐凍結状態で少なくとも６〜１２ヶ月間の貯蔵で、生物学的媒体（血液、血漿又は血清）との生物適合性を得ることにある。
【００４５】
薬効目的のための本発明によるエマルジョンは、急速に排出されるペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミド及び過弗素化補足剤及び燐脂質も含有する。このエマルジョンは、混合されたペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミドの組成物が急速に排出される成分として使用されること、過弗素化補足剤が過弗素化三級アミンの混合物を表わすこと及び燐脂質が水‐塩媒体中の分散液として使用されることを特徴とする。
【００４６】
更に、このエマルジョンは、フルオロカーボン化合物の全濃度が、２〜４０容量％の範囲にあることを特徴とする。
【００４７】
更に、このエマルジョンは、その組成物が急速に排出されるペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミドを１０：１〜１：１０の比率で含有すること、過弗素化補足剤がフルオロカーボン化合物の全含量の１％〜５０％であり、かつペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフルオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体及び付加的なペルフルオロ‐Ｎ‐メチルシクロヘキシルピペリジン及びその副生成物も含有することを特徴とする。
【００４８】
更に、このエマルジョンは、水‐塩媒体中の卵及び大豆燐脂質又はこれらの脂質の混合物の分散液を０．２〜５質量％の濃度で含有することを特徴とする。
【００４９】
更に、このエマルジョンは、水‐塩媒体中の燐脂質分散液が、燐脂質全含量の１〜１５％のアジュバントを含有することを特徴とする。植物油がアジュバントとして使用され、実際には、大豆、ヒマワリ種子又はヒマシ油又はこれらの油の混合物が、有効比率で、２倍又は３倍の混合物として使用される。
【００５０】
更に、このエマルジョンは、水‐塩媒体が注射用水中の塩化‐及び燐酸‐ナトリウム及び‐カリウム及び単糖類マンニトールも含有し、水‐塩媒体中の成分濃度が、１００〜３５０モスモル（mosmol）／ｌの範囲の浸透圧を有することを特徴とする。
【００５１】
更に、このエマルジョンは、平均粒度が０．２μｍを越えず、０．０６〜０．２μｍの範囲にあることを特徴とする。
【００５２】
均一化による本発明によるエマルジョンの製法は、この方法が、水‐塩媒体中の燐脂質分散液、燐脂質分散液中の均一化、製造されたエマルジョンの加熱殺菌及びその後の、＋４℃の温度での非‐凍結状態での少なくとも６ヶ月間の貯蔵を含む多段階を包含することを特徴とする。
【００５３】
更に、本発明による製法は、水‐塩媒体中の燐脂質分散液が、少なくとも１００atmの高圧での均一化及びその後の殺菌によって製造されることを特徴とする。
【００５４】
更に、本発明による製法は、燐脂質分散液中のフルオロカーボン化合物が、３００〜６５０atmの圧力で均一化されることを特徴とする。
【００５５】
更に、本発明による製法は、燐脂質分散液及びエマルジョンが１００℃の温度で殺菌されることを特徴とする。
【００５６】
前記のように、本発明の目的は、エマルジョンの安定性を増加させ、エマルジョン品質を改善し、即ち、非‐凍結状態での６〜１２ヶ月間の貯蔵での生物学的媒体（血液、血漿又は血清）中での生物適合性を得ることにある。生物適合性という用語は、異なった変化を包含し、エマルジョンに関して明確にされるべきである。前記の特許［８〜１１］では、生物適合性によって、選択されたＰＦＣｓの比較的高い排出、エマルジョンが通過潅流される組織及び臓器を保護する能力及び動物に対する比較的低い毒性（貫流血液の少なくとも２容量）が理解される。これらの考えは、相互に排他的ではないが、第一段階、即ち、血流中の血漿及び血液との粒子の相互作用を反映しない。本発明では、生物適合性は、エマルジョンと生物学的媒体（血液、血漿又は血清）との相互作用（反応）の重大性の水準から始まる。この相互作用の結果は、生体内ばかりでなく、特に試験管内での試験で、貯蔵中の吸収層への障害及び血流中へのエマルジョンの浸透を模擬する一連の因子の影響でのエマルジョンの安定化水準によって評価され得る。
【００５７】
エマルジョンの品質及び安定性は、通例、粒度に基づいて特徴付けられ、実際には、平均粒度は０．２〜０．３μｍを越えるべきではない。そのような研究は、静脈内注射用の生物薬効的な分散化製剤には十分ではない。このことは、フルオロカーボン粒子が外来物質として、血漿中に見出されるタンパク質及び他の化合物分子と、及び血球とも血流中への浸透中に相互作用するという事実に基づいている。相互作用の一般的特徴は、粒子表面の特性に依存している。エマルジョンの機能的活性（ガス輸送機能）は、本質的には、乳化粒子の表面と血液及び血漿との適合性に依存し、それというのも、反応カスケードは、例えば、外来表面上の補体の系活性化中に開始され、前記の反応カスケードは、血管痙縮及び局部血流中の干渉によって引き起こされる。また、試験管内のエマルジョン安定性は、粒子の周りの界面活性剤の吸収層の特性（強度、表面の局在論等）によって大いに影響されることも注目されるべきである。ここで挙げた内容の意味において、エマルジョン安定性の問題は、構造的詳細を評価せずに、粒子試験の化学的コロイド常法によるだけで解明され得る。粒度及び粒子構造の全体についての情報を得ることができる簡単な方法及び研究のこの観点での開発は、極めて時事的である。従って、構造という用語それ自体は、エマルジョンに関して明確にされることが意図される。
【００５８】
試験管内及び生体内でのエマルジョン安定性の試験における経過は、構造という用語の拡大及び拡張及び構造の試験法の開発にも結び付けられる。製剤又は物質の安定性という用語は、多様な製剤又はこの物質の特性の安定性によって決定される。エマルジョンの特性を決定するパラメーターは、エマルジョンの安定性を十分には特徴付けない。この側での試験では、エマルジョンの構造の特殊性を考慮するエマルジョンの安定性についての考えが拡大された。
【００５９】
炭素エマルジョンの安定性は、通例、貯蔵中のエマルジョン粒度の変更後に評価される。この純粋に化学的なコロイド研究は、不十分である。製剤のベースを表わし、静脈内注射用の使用に意図されるエマルジョンについて、エマルジョン安定性に関する情報は、試験管内試験で極めて重要であるばかりでなく、血流中を通過する際のエマルジョン安定性を予想する可能性である。この情報は、エマルジョン構造についての考えが明確に決定され得る場合に得ることができる。エマルジョンの粒子は、２‐層球状物の形を有し、その中央にＰＦＣ（粒子核）があり、その表面上に乳化剤層（外殻）がある［１２］。乳化剤の外殻厚は薄く、粒径の５〜１０％である。しかし、血流中のエマルジョンの反応（血漿タンパク質及び血球との相互作用、排出速度等）及び長期間貯蔵中の安定性は、粒子の周りの界面‐活性物質の濃度及び状態に極めて依存する。この理由のために、それらの作用又は他の作用の場合で試験されるべき媒体中の粒度及び構造的変化についての情報を、同時に得ることが必要である。
【００６０】
注入媒体のベースとしてのエマルジョンにおける構造的変化の理論的説明及び分析について、次の考えが強調されるべきである［１３］：
１）エマルジョン及びそれらの変化の"全構造"は、平均粒度及び粒度による分配によって特徴付けられる。
【００６１】
２）"微細構造"は、外殻中の乳化剤状態及び乳化剤とＰＦＣｓとの相互作用、界面活性剤分子の相互位置、それらの配置、充填密度、酸化度及び構造分子の相状態の程度によって特徴付けられる。
【００６２】
今日まで、全研究者は、全体的に不十分である"一般構造"の分析に限定してきたが、それというのも、エマルジョン安定性、生物適合性及び特に、粒子表面特性及び粒子の吸収力が、微細構造によって決定されるからである。
【００６３】
本発明によるエマルジョンを原型と比較し、かつ特に、製造されたエマルジョンの異なった貯蔵時間での一般的構造における変化を特徴付けるパラメーターについて試験した。
【００６４】
第二に、エマルジョンへの破壊的因子の作用は、評価されるべきエマルジョンの微細構造状態を可能にする条件下に模擬された。つまり、水での希釈の形の"ストレス作用"が使用され、天然エマルジョンに比較したパラメーターにおける特異的変化が受け入れられた。エマルジョンの水希釈は、界面活性剤の吸収層（外殻）と分散媒体中の界面活性剤分子との間の所定の平衡を妨害する。この理由について、準安定系（フルオロカーボンエマルジョン）の安定性を維持すること又はその分解に関する特異的な予想的有意味を有するからである。
【００６５】
更に、微細構造における変化及び系モデルとしての血清との接触中のエマルジョンの適合性の変化を試験した（試験管内試験でのエマルジョンの生物適合性の試験）。２種の不均一分散系、血清及びフルオロカーボンエマルジョンの相互作用は、血流中への浸透中の表面粒子特性での変化及び貯蔵中のエマルジョンでの微細構造変化を特徴付ける。一般構造及び微細構造での変化を、１２ヶ月間中の同等の期間で試験した。
【００６６】
貯蔵中の前記の状態パラメーターでの変化を検知するために、測定中に試験されるべき系への付加的な妨害を導入されない方法及び研究が必要とされた。そうして、光学的試験法が選択され、試験されかつ現像された。
【００６７】
一般構造を評価するために、濁り法又は濁りスペクトル法［１４］が発明者によって選択された。この方法は、遠心分離及び分別後に試験されるべきエマルジョン中の粒度分布を評価するためにも使用された。フルオロカーボン化合物の周りの吸収層中の界面活性剤分子の相互関係での変化によって引き起こされた、エマルジョンの微細構造での及び粒子表面特性の変化を、生理学的食塩溶液に対して、試験されるべきエマルジョンと血清との相互作用指数（Ｋτ）を見出すために、間接法で評価した：相対的濁度Ｋτ＝τ1／τ2、τ1及びτ2は、混合物の成分の比率における相応する変化を伴う、血清／エマルジョン及び血清／生理学的食塩溶液の混合物の濁度を意味する［１５］。更に、計算及び実測‐τ値は、乳化粒子の自然の恒存性を確認するために比較された：τ計算＝ΣＮi□τi（ΣＮi＝１）、τi及びＮiは、排出画分の濁度又は比率を意味し、かつτ実験は、分別前の同じエマルジョン試料の濁度を意味する。
【００６８】
Ｉ．本発明によるエマルジョンの具体的組成物を次に示す。
【００６９】
組成物１
エマルジョンは、次の組成：注射用蒸留水中の塩化ナトリウム２ミリモル（１１５ｍｇ／ｌ）、１回‐置換の燐酸二水素カリウム２ミリモル（無水塩３１０ｍｇ／ｌ）、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム７．５ミリモル（無水塩４６０ｍｇ／ｌ）、マンニット３１８ミリモル（マンニトール５８ｇ／ｌ）の水‐塩媒体中の、卵燐脂質及びアジュバントとして、その濃度が卵燐脂質の全含量の１５％であるヒマシ油を含有する５％燐脂質分散液で、乳化状態で安定化させた、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを比率１：１で含有するフルオロカーボン相（Ｃｖ）４０容量％を、フルオロカーボン化合物全含量の５０％の量の、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフロオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体の混合物としての、過弗素化補足剤と共に含有する。浸透圧は３１０モスモル／ｌであった。エマルジョン粒子の平均直径は０．１９５μｍであった。
【００７０】
組成物２
組成物１によるエマルジョンは、次の組成：注射用蒸留水中の、１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム２ミリモル（無水塩２７６ｍｇ／ｌ）、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム７．５ミリモル（無水塩４６０ｍｇ／ｌ）、マンニット２７８ミリモル（マンニトール５０ｇ／ｌ）の水‐塩媒体中の、大豆燐脂質及びアジュバントとして、その濃度が卵燐脂質の全含量の１０％である大豆油を含有する２５％燐脂質分散液で、乳化状態で安定化された、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを比率１０：１で含有するフルオロカーボン相（Ｃv）２０容量％を、フルオロカーボン化合物全含量の２５％の量の、付加的なペルフルオロ‐Ｎ‐メチルシクロヘキシルピペリジンと共に、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフロオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体の混合物としての補足剤と共に含有したことを特徴とした。浸透圧は２７０モスモル／ｌであった。エマルジョン粒子の平均直径は０．１μｍであった。
【００７１】
組成物３
組成物１によるエマルジョンは、次の組成：注射用蒸留水中の、１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム１ミリモル（無水塩１３８ｍｇ／ｌ）、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム３．７ミリモル（無水塩２３０ｍｇ／ｌ）、マンニット１００ミリモル（マンニトール１８ｇ／ｌ）の水‐塩媒体中の、大豆及び卵燐脂質及びアジュバントとして、その濃度が燐脂質の全含量の５％であるヒマワリ種子油を含有する２％燐脂質分散液で、乳化状態で安定化された、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを比率１：１０で含有するフルオロカーボン相（Ｃv）１５容量％を、フルオロカーボン化合物の全含量の５％の量の、付加的なペルフルオロ‐Ｎ‐メチルシクロヘキシルピペリジンと共に、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフロオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体の混合物としての補足剤と共に含有したことを特徴とした。浸透圧は１０５モスモル／ｌであった。エマルジョン粒子の平均直径は、０．０８μｍであった。
【００７２】
組成物４
組成物１によるエマルジョンは、次の組成：注射用蒸留水中の、１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム１ミリモル（無水塩１３８ｍｇ／ｌ）、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム３．７ミリモル（無水塩２３０ｍｇ／ｌ）、マンニット９０ミリモル（マンニトール１３ｇ／ｌ）の水‐塩媒体中の、卵燐脂質及びアジュバントとして、その濃度が卵燐脂質の全含量の２％であるヒマワリ種子油及び大豆油を含有する２％燐脂質分散液で、乳化状態で安定化された、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを比率２：１で含有するフルオロカーボン相（Ｃv）１０容量％を、フルオロカーボン化合物の全含量の０．２％の量の、付加的なペルフルオロ‐Ｎ‐メチルシクロヘキシルピペリジンと共に、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフロオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体の混合物としての補足剤と共に含有したことを特徴とした。浸透圧は１００モスモル／ｌであった。エマルジョン粒子の平均直径は、０．０７μｍであった。
【００７３】
組成物５
組成物１によるエマルジョンは、次の組成：注射用蒸留水中の、塩化ナトリウム２ミリモル（無水塩１１５ｍｇ／ｌ）、１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム２ミリモル（無水塩２７６ｍｇ／ｌ）、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム７．５ミリモル（無水塩４６０ｍｇ／ｌ）、マンニット３１８ミリモル（マンニトール５８ｇ／ｌ）の水‐塩媒体中の、大豆燐脂質及びアジュバントとして、その濃度が大豆燐脂質の全含量の５％である大豆及びヒマシ油を含有する０．２％燐脂質分散液で、乳化状態で安定化された、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを比率１：２で含有するフルオロカーボン相（Ｃv）２容量％を、フルオロカーボン化合物の全含量の１０％の量の、付加的なペルフルオロ‐Ｎ‐メチルシクロヘキシルピペリジンと共に、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフロオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体の混合物としての補足剤と共に含有したことを特徴とした。浸透圧は３５０モスモル／ｌであった。エマルジョン粒子の平均直径は、０．０６μｍであった。
【００７４】
組成物６
組成物１によるエマルジョンは、次の組成：注射用蒸留水中の、１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム２ミリモル（無水塩２７６ｍｇ／ｌ）、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム７．５ミリモル（無水塩４６０ｍｇ／ｌ）、マンニット２００ミリモル（マンニトール３６ｇ／ｌ）の水‐塩媒体中の、その濃度が燐脂質の全含量の４％である、大豆燐脂質及びアジュバントとしてのヒマワリ種子、大豆及びヒマシ油を含有する２％燐脂質分散液で、乳化状態で安定化された、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを比率４：１で含有するフルオロカーボン相（Ｃv）１０容量％を、フルオロカーボン化合物の全含量の４％の量の、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフロオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体の混合物としての補足剤と共に含有したことを特徴とした。浸透圧は２２５モスモル／ｌであった。エマルジョン粒子の平均直径は、０．０９μｍであった。
【００７５】
次の第６表において、本発明によるエマルジョンの組成物を、組成物１〜６により表わす。
【００７６】
第６表
フルオロカーボンエマルジョンの組成物１〜６
【表６】
【００７７】
ＩＩ 本発明によるエマルジョンの組成物の製法の具体的態様及びエマルジョンの物理‐化学的パラメーターを次に示す。
【００７８】
例１ エマルジョンを無菌条件下に製造した。
１．１ 製造のために、エマルジョン１ｌを１％燐脂質分散液に対してＰＦＣ１０容量％で製造した。
１．２ 第一段階分散液製造：無菌の丸底フラスコに、卵脂質の１０％アルコール溶液１００ｍｌを充填した。アルコールを回転蒸発機で蒸留させた。ヒマシ油１ｇ（アジュバント濃度、卵脂質含量の１０％）及び塩水溶液９００ｍｌを加えた。
１．３ 無発熱原水を、塩水溶液を製造するために使用した。１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム及び結晶性マンニットを含有する粉末を、乾燥室中１１０℃で２時間乾燥させた。その後に、１回‐置換の無水燐酸二水素ナトリウム０．１３８ｇ、２回‐置換の無水燐酸二水素ナトリウム０．５２３ｇ及びマンニット５０．０ｇを、無菌条件下に、積層装置中で、無発熱原水１ｌ中に溶かした。得られた塩水溶液を、ミリポール社（Millipor Company）製の孔径０．４μｍの無菌フィルターを通して導入させた。
【００７９】
１．４ 植物油及び塩水溶液の混合物を、乳白黄色の均一懸濁液が得られるまで、機械的に攪拌した。得られた燐脂質懸濁液を高圧ホモジナイザーの無菌容器に加えた。
【００８０】
１．５ ホモジナイザーを、先に、過熱水蒸気及びアルコール５００ｍｌで殺菌し、無発熱原の熱水５００ｍｌで洗浄した。
【００８１】
１．６ 燐脂質懸濁液を、半透明の均一性液体が得られるまで、１００atmの圧力で４時間ホモジナイザーを通して導入させた。得られた分散液をガラス容器中にデカントした。ガラス容器を無菌の不活性ガス（窒素、アルゴン又は窒素と二酸化炭素の混合物）で２〜４分間処理した。
【００８２】
１．７ ガラス容器をゴム栓で塞ぎ、アルミニウムキャップで覆った。その後に、容器を１００℃で１時間加熱殺菌した。次の製造段階まで、容器を室温で貯蔵した。
【００８３】
１．８ ＰＦＣｓを次の段階で処理した。ＰＦＤ７２ｍｌをＰＦＯＢ８ｍｌと混合させた。ペルフルオロトリプロピルアミン２０ｍｌを、この組成物８０ｍｌ中に加えた。フルオロカーボンの補足剤と共に、ＰＦＤ及びＰＦＯＢを含む、取得した組成物を、薬用アルコール同容量と混合させた。ペルフルオロカーボン相を、分離ロートによって、より重いアルコールから分離させた。分離された混合物を、無発熱原水３倍容量と混合させ、振盪し、かつ分離ロート中で分離させた（フルオロカーボン比重は水比重を実際に２倍超過する）。
【００８４】
１．９ その後に、エマルジョンを製造した。燐脂質分散液９００ｍｌ及び処理したフルオロカーボン混合物１００ｍｌ（ＰＦＤ／ＰＦＯＢ＝９／１＋ＰＦＴＰＡ−２０％を含む組成物）をホモジナイザーに加えた。内容物を機械的に攪拌し、５００atmの圧力で分散させ、全容量を、乳白光色の次微エマルジョンの半透明で帯黄色の液体が得られるまで、小室に８回流通させた。エマルジョンを、ガラス容器中に各々１００ｍｌでデカントさせた。ガラス容器をゴム栓で塞ぎ、アルミニウムキャップで覆った。
【００８５】
１．１０ 容器中のエマルジョンを１００℃で１時間加熱殺菌し、その後に冷却し、４℃で１年間貯蔵した。
【００８６】
得られたエマルジョンは、次の組成を有した：フルオロカーボン相（Ｃv）１０容量％、ＰＦＤ対ＰＦＯＢの比率９／１、フルオロカーボン混合物中のＰＦＴＰＡの相対含量２０％、卵燐脂質の濃度１質量％、ヒマシ油濃度０．１％（アジュバントとして懸濁液中の相対的ヒマシ油含量、卵燐脂質の全含量の１０％）。ロット番号１。
【００８７】
ロットの粘度を、粘度計測器BΠЖ‐２型により測定し、０．９５３ｃＰ（センチポアズ）であった。フルオロカーボン相の同一含量を有するペルフトランに比較して、粘度は２．５ｃＰ（センチポアズ）であった。
【００８８】
例２
エマルジョンを、例１と同様の組成で製造した。大豆及びヒマシ油の１：１の比率の混合物をアジュバントとして選択した。エマルジョンは次の組成を有した：Ｃv１０容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ９：１、ＰＦＴＰＡの相対含量２０％、卵燐脂質濃度１質量％、相対的アジュバント含量（大豆／ヒマシ油１：１）１０％。ロット番号２。
【００８９】
例３
エマルジョンを、例１と同様の組成で、しかし、フルオロカーボン含量２０容量％を有する８００ｍｌの容量で製造した。大豆燐脂質の１０％アルコール溶液２００ｍｌを、丸底フラスコに加えた。アルコールを回転蒸発機中で蒸留させた。アジュバント（大豆及びヒマシ油１：２の比率で、アジュバント濃度は卵燐脂質の１５％）３ｇを加えた。塩水溶液は、無水の１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム０．２７６ｇ、無水の２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム１．０４６ｇ及びマンニット１０．０ｇを含有した。塩水溶液１ｌを、アジュバントと共にフラスコに加え、ホモジナイザー中で振盪して分散させ、ガラス容器中にデカントし、例１に置けるように殺菌した。フルオロカーボン相を製造した。ＰＦＯＢ４０ｍｌをＰＦＤ１６０ｍｌに加えた。この量から、組成物１６０ｍｌを取り、ＰＦＴＰＡ４０ｍｌと混合させた。清浄後に、得られたペルフルオロカーボン混合物を、大豆燐脂質の分散液８００ｍｌと共にホモジナイザーに滴加した。得られたエマルジョンをデカントし、殺菌した。
【００９０】
エマルジョンは、次の組成を有した：Ｃv＝２０容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率８：２、ＰＦＴＰＡの相対含量２０％、大豆燐脂質濃度２質量％、相対的アジュバント含量（大豆／ヒマシ油１：２）１５％。ロット番号３。
【００９１】
例４
エマルジョンを、例１におけるように、しかし、ＰＦＤ対ＰＦＯＢ比率８：２で製造した。ＰＦＭＨＰ３０ｍｌを組成物１７０ｍｌに加え、振盪によって混合させ、通常通りに清浄し、大豆燐脂質（例３におけるように得た）及び同じアジュバント：（大豆及びヒマシ油比率１：２で、大豆燐脂質含量の１５％の量で）を含む分散液８００ｍｌと共にホモジナイザー中に滴加した。エマルジョンを４００atmの圧力で分散させた。
【００９２】
エマルジョンは、次の組成を有した：Ｃｖ＝２０容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率８：２、ＰＦＭＰの相対含量１５％、大豆燐脂質濃度２質量％、相対的アジュバント含量（大豆／ヒマシ油１：２）１５％。ロット番号４。
【００９３】
例５
エマルジョンを、卵燐脂質の異なった量の添加を伴うだけで、例１におけるように製造した。卵燐脂質５０ｍｌを丸底フラスコに加えた。アルコールを回転蒸発機で蒸発させた。ヒマワリ種子油０．６ｇ及び食塩溶液０．５ｇを加え、振盪によって混合させ、１５０atmの圧力で均一化させた。ＰＦＤ／ＰＦＯＢの比率５：５での組成物を、ＰＦＤ２５ｍｌ及びＰＦＯＢ２５ｍｌの混合によって製造した。混合物４９．５ｍｌをＰＦＴＰＡ０．５ｍｌと混合させた。混合物５０ｍｌを、清浄後に、卵燐脂質の懸濁液０．９５ｌと共に、ホモジナイザーに加えた。予備懸濁液の均一化を３５０atmの圧力で行なった。微細分配エマルジョンのデカント及び殺菌は、規定の規則に従って行なわれた。
【００９４】
エマルジョンは、次の組成を有した：Ｃｖ＝５容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率５：５、ＰＦＴＰＡの相対含量１％、卵燐脂質濃度０．５質量％、相対的アジュバント含量ヒマワリ種子油１２％。ロット番号５。
【００９５】
例６
大豆燐脂質の１０％アルコール溶液５０ｍｌを、丸底フラスコに加えた。アルコールを前記の方法で蒸留させた。大豆油０．６ｇ及び塩溶液９５０ｍｌを加えた。混合後に、分散液をホモジナイザー中１８０atmの圧力で製造した。殺菌後に、分散液を、エマルジョンを製造するために使用した。ＰＦＤ及びＰＦＯＢ（比率５：５で）の組成物を、ＰＦＤ２５ｍｌ及びＰＦＯＢ２５ｍｌの混合によって製造した。この組成物４９．５ｍｌに、ＰＦＭＨＰ０．５ｍｌを加えた。アルコール５０ｍｌでの清浄後に、混合物を、大豆燐脂質分散液９５０ｍｌと共にホモジナイザー中で処理した。均一化を、前記のように２段階で、第一段階では、２００atmの圧力で、第二段階では、５００atmの圧力で行なった。
【００９６】
得られたエマルジョンは、次の組成を有した：Ｃｖ＝５容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率５：５、ＰＦＭＨＰの相対含量１％、大豆燐脂質濃度０．５質量％、相対的アジュバント含量（大豆油）１２％。ロット番号６。
【００９７】
例７
懸濁液を大豆燐脂質０．２質量％の濃度で製造した。更に、大豆燐脂質のアルコール溶液２０ｍｌを回転蒸発機に加えた。アルコールを蒸留させた。アジュバントとして、大豆及びヒマワリ種子油の比率１：１での混合物をそれに加えた。食塩溶液９８０ｍｌの添加と共に、分散及び殺菌を、例６におけるように行なった。
【００９８】
ＰＦＤ／ＰＦＯＢの組成物を、ＰＦＤ４ｍｌ及びＰＦＯＢ１６ｍｌの混合（比率２：８で）によって製造した。混合物１９ｍｌに、ＰＦＭＨＰ１ｍｌを際得た。得られた３成分の混合物２０ｍｌを、懸濁液９８０ｍｌと共に均一化させた。均一化は、前例におけるように行なわれた。殺菌及びデカントは、標準方法で行なわれた。
【００９９】
得られたエマルジョンは、次の組成を有した：Ｃv＝２０容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率２：８、ＰＦＭＨＰの相対含量５％、大豆燐脂質濃度０．２質量％、相対的アジュバント含量（大豆／ヒマワリ種子油１：１）１％。ロット番号７。
【０１００】
例８
エマルジョンを製造するために、卵燐脂質の４０質量％懸濁液を、５質量％の濃度で製造した。卵燐脂質のアルコール溶液５００ｍｌを、フラスコへの添加で加えた。アルコールを蒸留させた。アジュバントとしてのヒマシ油２．５ｇ及び食塩溶液６００ｍｌをそれに加えた。混合後に、帯黄‐白色の均一媒体が得られるまで、ホモジナイザー中２００atmの圧力で分散化を行なった。殺菌は前記のように行なわれた。
【０１０１】
組成物を、ＰＦＤ４ｍｌ及びＰＦＯＢ３６０ｍｌ（比率１：９で）との混合によって製造した。ＰＦＭＨＰ４０ｍｌを混合物３６０ｍｌに加えた。得られた３成分混合物４００ｍｌを、卵燐脂質懸濁液６００ｍｌと共に、２段階で、第一段階では、２５０atmで、第二段階では、６００atmの圧力で均一化させた。殺菌及びデカントは標準方法で行なわれた。
【０１０２】
エマルジョンは、次の組成を有した：Ｃｖ＝４０容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率１：９、ＰＦＭＨＰの相対含量１０％、卵燐脂質濃度５質量％、相対的アジュバント含量（ヒマシ油）５％。ロット番号８。
【０１０３】
例９
フルオロカーボン相を、ＰＦＤ４０ｍｌ及びＰＦＯＢ３６０ｍｌから混合させた。８０ｍｌ（実際に、ＰＦＭＨＰ４０ｍｌ及び有機液体４０ｍｌ）を混合物３２０ｍｌに加えた。乳化剤懸濁液は、卵燐脂質４．２質量％、大豆燐脂質４．２質量％及び、ヒマシ油及びヒマワリ種子油を比率９：１で含むアジュバント４．２ｇ、即ち、卵燐脂質の全含量の５％を含有した。
【０１０４】
エマルジョンを製造するために、懸濁液６００ｍｌを３成分の混合物４００ｍｌと共にホモジナイザーに加えた。均一化、デカント及び殺菌は、前例におけるように行なわれた。
【０１０５】
エマルジョンは、次の組成を有した：Ｃｖ＝４０容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率１：９、ＰＦＭＨＰ及び有機液体の相対含量２０％、燐脂質濃度（卵及び大豆燐脂質１：１）５質量％、相対的アジュバント含量（ヒマシ油及びヒマワリ種子油９：１）０．２５％。ロット番号９。
【０１０６】
第７表
ロット（例１〜９）による得られたエマルジョンの組成
【表７】
【０１０７】
全ロットの組成を表７に示す。
【０１０８】
第８表に、平均粒度の試験結果を、自然の（非希釈）及び水‐希釈のエマルジョンについて、異なった貯蔵時間で示す。
【０１０９】
第８表
例１、３、４、５、８及び９からの自然の及び水‐希釈のフルオロカーボンエマルジョンについての波長指数及び平均粒度
【表８】
【０１１０】
値ｎは、最小二乗法により計算された。ｎの決定における平均誤差二乗は、０．０１〜０．０３である。その結果、ｎの決定における誤差＝０．３〜１％である。パラメーターｎは、濁りスペクトル法の特性関数であり、少なくとも３〜５点により計算される。微細分配エマルジョンについて、ｎは、平均粒度ａと明白に関連される［１４］。
【０１１１】
得られた結果により、平均パラメーターｎ及びａは、実際に、１２ヶ月の貯蔵の場合には、変化しない。ストレス作用としての水希釈は粒度に殆ど影響しない。値ａにおける僅かな増加が、大豆燐脂質を有するエマルジョンについて、９〜１２ヵ月後に認められた。１年間までの貯蔵で、燐脂質分散液を有するフルオロカーボンエマルジョンの全ロットについての波長指数の変化範囲は、３．４〜２．７であった。これは、０．１１から０．１５〜０．１９５までの平均粒度における増加に相応する。
【０１１２】
粒度により粒子分配を試験するために、試験すべき媒体の分別を使用した。エマルジョンを緩和条件下に（１５００rpm）遠心分離させ、３画分に（正確に）分離した：上画分は試料容量の２０％、中画分は６０％及び低画分は２０％（図１）。図１から検知され得るように、原型として用いられる炭素エマルジョンは、粒度により異なる３画分とは別に、遊離燐脂質を含有する軽い画分を有し、その結果として、吸収層の油相に対する弱い結合及び吸収層で結合されない界面活性剤が確証される。各画分について、a及びｎの値が測定された。本発明による組成物の分別されたエマルジョンについて挙げられたパラメーターは、１〜１２ヶ月間の貯蔵と共に表９に示される。ｎ及びａは、上及び中画分についての貯蔵間に変化を示さないことが明らかである。低画分の場合には、ａは、貯蔵時間の増加と共に、粒度において僅かな増加が認められた。このことは、粒度の分配幅における拡張に繋がる。従って、最高分配幅は、０．０６〜０．１９μｍの範囲であった。
【０１１３】
得られた結果は、自然の及び水‐希釈のエマルジョン（ストレス作用）の平均粒度が、１２ヶ月間以内に僅かに増加し、０．２０μｍ以下の許容限界内で留まったことを確証した。
【０１１４】
第９表
１２ヶ月間の貯蔵での、例１，３、４、５、８及び９からのエマルジョンについての粒度の分配幅を特徴付けるパラメーターｎ及びａ（上、中、低＝遠心分離後の画分）
【表９】
【０１１５】
【表１０】
【０１１６】
粒度の分配幅における増加で確認された拡張は、比較的大きい粒子を有するエマルジョンで見出されることによって引き起こされた。１２ヶ月間の貯蔵後のエマルジョンの分別中に、低画分での粒度が０．１２から０．１９８μｍに増加した。全体で、結果は、オストワルド分解機構（又は分子蒸留）と一致する。そのような比較的大きい粒子の比率は低い（〜１０％）ので、このことは、平均粒度での増加を減損させなかった。均等の粒子沈降だけがエマルジョンの分別中に認められたことが強調されるべきであり、その結果として、遊離燐脂質の欠如が１年間の貯蔵後ですら確認される。従って、エマルジョン中の粒子分配は、単一様相で存続した。得られた結果は、１〜１２ヶ月間以内の貯蔵で、得られたエマルジョンの全体構造の維持を示す。
【０１１７】
粒子と血清との相互作用指数Ｋτは、次の第１０表に示され、前記の血清は比率１：１での５％アルブミン溶液の添加によって変性されていた。
【０１１８】
フルオロカーボンエマルジョンと血清との、エマルジョン微細構造を特徴付ける相互作用は、１２ヶ月間の貯蔵について、卵燐脂質を有するフルオロカーボンエマルジョンでの僅かな変化範囲を示した（血清‐エマルジョン比率１：０．０５及び１：０．１）。比率が１：０．１０に増加する場合には、Ｋτ及びＫτ／２の変化範囲も広くなった。大豆燐脂質を有するフルオロカーボンエマルジョンについては、Ｋτの小変化範囲が、６ヶ月間までの貯蔵でのみ存続した。前記のように、確認された変化は、多分、エマルジョンの異なった貯蔵時間での連続試験内で血清混合物を規格化することを極めて難しくさせるという事実に基づいている。同時に、特定のより狭い限度内での各ロットについてのエマルジョンと血清との相互作用の変化範囲の維持は、粒子表面特性が、長期間貯蔵（６〜９ヶ月間）で殆ど変化しないことを示す。エマルジョン中の遊離燐脂質の不在での貯蔵終了で、Ｋτの突然の変化は、粒子と血清の高分子との間の付加的な相互作用の発生によって引き起こされ得る。この仮想を調べるために、フルオロカーボンエマルジョンの構造的全体の評価のための付加的な独立したパラメーターである、濁り度τの実測値及び計算値を計算した（第１１表）［１３］。
【０１１９】
第１０表
温度＋４℃で異なった貯蔵時間のエマルジョンと血清との相互作用指数
【表１１】
【０１２０】
物理的観点から、τは、共同効果及び多重分散が無いならば、少しの粒子の場合において、分散系についての光線の損失の合計を意味する。非希釈及び水‐希釈エマルジョンに関するτの実測値及び計算値の一致は、粒子と血清の高分子との間の相互作用が＋４℃で９〜１２ヶ月間の貯蔵後ですら殆ど変化せずに存続することを証明する。従って、Ｋτの突然の変化は、多分、ペルフルオロカーボン／燐脂質の付加的な超分子構造が水性分散剤中に現われ、エマルジョン中と同じフルオロカーボン対燐脂質の比率が生じるという事実と連結している。
【０１２１】
第１１表
異なった貯蔵時間でのエマルジョンの濁り度の実測値及び計算値
【表１２】
【０１２２】
フルオロカーボンエマルジョンの本発明による組成物及び製法の利点について何事かを説明する前に、血流中を流れる際のエマルジョンのガス輸送機能を発揮するための主条件は、粒子の粒子特性の維持及びリアクトゲニティの無いことということを強調すべきである。コロイド化学及び生物理学の観点から、血流へのエマルジョンの通過は、分散剤特性における変化に繋がるべきストレス作用として考慮され得る。この作用は、次の確認、つまり、エマルジョンの希釈及び分散剤中の遊離乳化剤の濃度での減少に繋がり得る（高速相）。この過程の結果として、粒子表面への界面活性剤の分子結合の弱少化が作用される（低速相）。このフルオロカーボンへの界面活性剤の結合の弱少化は、粒子と血漿高分子との接触及び相互作用によって更になお損なわれ、その結果として、吸収層の組成又は粒子破壊が変化され得る。前記の連続法は、簡素化の典型である。
【０１２３】
この側の試験で、エマルジョンの水での希釈により、第一相、つまり、エマルジョンの希釈及び粒子の周りの遊離乳化剤濃度における減少が仮想される。得られるエマルジョンと血漿との相互作用の試験により、第二相、つまり、粒子表面の特性への血清高分子の接触作用が仮想される。１年間以内の貯蔵ですら、エマルジョン粒子はそれらの微細構造を維持し、水での希釈は粒度に影響せず、その結果として、粒子核、ペルフルオロカーボンへの界面活性剤の吸収層の強力な結合が確認されたことが明らかであった。また、エマルジョン粒子と血清との相互作用指数（測定誤差の限界内）が変化なく維持され、その結果として、粒子表面特性の維持が確立された。計算値τ（分別後）は、実測値（分別前）と一致し、その結果として、粒子特性（粒子構造）の維持及びエマルジョン中の遊離燐脂質の不在は、１年間の貯蔵後に確証された。
【０１２４】
使用される規律的研究は、血流を通過する際のエマルジョンの安定性に関する予想の正確性を著しく増加させる。同一組成の幾つかのロットからリアクトゲニティ指数（Ｉｐ）の安定性及び決定の平行試験の結果は、前記された内容の確認に用いられる。指数Ｉｐは、方法［３］により決定された。
【０１２５】
例１０
例２による組成物を有する同一エマルジョンの４ロットを製造した：フルオロカーボンベース９±１容量％、ＰＦＤ対ＰＦＯＢ比率９：１、有機液体の補足剤２０％、卵燐脂質１質量％、アジュバント（ヒマシ油及び大豆油１：１）卵燐脂質濃度の８％。
【０１２６】
次の第１２表に、これらのロットのｎ及びａの値を、異なった貯蔵時間で表わす。
【０１２７】
第１２表
異なった貯蔵時間での同一組成ＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／卵燐脂質のエマルジョンの波長指数ｎ及び平均粒度ａ
【表１３】
【０１２８】
第１３表
同一組成ＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／卵燐脂質を有するエマルジョンの遠心分離による分別中の、粒度による粒子の分配幅を特徴付ける波長指数ｎ及び平均粒度ａ
【表１４】
【０１２９】
得られるデータにより、自然の及び水‐希釈のエマルジョンの、全ての場合における平均粒度は、６ヶ月間の貯蔵時間で変化せずに維持され、０．０６〜０．１７μｍの範囲でであった。示された組成の自然の及び水‐希釈のエマルジョンの粒度の分配幅は、示された試験時間で、実際に少しも変化しなかった（第１３表）。相対的測定誤差（±１０％）に関して、得られたエマルジョンと変性化血清との相互作用指数Ｋτは、狭い限度内で変化した（次の第１４表参照）。
第１４表
同一組成ＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／卵燐脂質のエマルジョンとアルブミン（８０％）で変性された血清との相互作用指数Ｋτ
【表１５】
【０１３０】
第１５表
同一組成ＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／卵燐脂質（試験のために、卵燐脂質の分散液を使用した）のエマルジョンのリアクトゲニティ指数
【表１６】
【０１３１】
導かれた結果は、本発明によるエマルジョン及び製法が、非凍結状態での貯蔵中及び試験管内での連続ストレス作用（水‐希釈、アルブミンで富化された血清との相互作用）中に損なわれることなく、エマルジョン微細構造の高品質を可能にすることを確証する。全体的に同一エマルジョンパターンのリアクトゲニティ試験の結果は、仮想試験の結果を確証する。試験での時点ではなく、リアクトゲニティ指数は臨界値３を越えた（第１５表参照）。
【０１３２】
例１１
低フルオロカーボン含量５容量％を有するエマルジョンの構造の完全性及びリアクトゲニティの試験
エマルジョンは、次の組成を有した：ＰＦＤ／ＰＦＯＢ１：１、ＰＦＭＨＰ１％、大豆燐脂質０．５％、アジュバントとしての大豆油１２％、０．０３〜０．１２μｍの範囲の粒度の分配幅、初期リアクトゲニティ１．６１．６ヶ月間の貯蔵後の、４ロットの自然の及び水‐希釈の同一エマルジョンの平均粒度での変化（表１６参照）及びリアクトゲニティの変化（表１７参照）を試験した。示されたデータから検知可能であるように、本発明により使用される組成物中の粒度での増加及び製法は、低リアクトゲニティが得られることを保証する。
【０１３３】
第１６表
同一組成ＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／大豆燐脂質の自然の及び水‐希釈のエマルジョンの波長指数ｎ及び平均粒度ａ
【表１７】
【０１３４】
第１７表
非‐凍結状態での６ヶ月間の貯蔵後の低フルオロカーボン含量を有するエマルジョンのリアクトゲニティＩｐ
【表１８】
【０１３５】
例１２
フルオロカーボン１０容量％を含有する、１８ヶ月間以内のエマルジョンの長期間貯蔵は、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率８：２、有機液体２０％、卵燐脂質２％及びアジュバントとしてのヒマシ油１０％を有する。異なった貯蔵時間及び水希釈での平均粒度の試験結果は、表１８に示される。アルブミンで５０％まで富化された血清とのエマルジョンの相互作用の開発は、表１９に示される。
【０１３６】
第１８表
非‐凍結状態で異なった貯蔵時間での、自然の及び水‐希釈のエマルジョンＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／卵燐脂質の波長指数ｎ及び平均粒度ａ
【表１９】
【０１３７】
第１９表
異なった貯蔵時間でのアルブミン（５０％）で変性された血清とのエマルジョンＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／卵燐脂質の相互作用Ｋτ
【表２０】
【０１３８】
前記のデータから明らかなように、得られるエマルジョンは、測定可能な物理‐化学的特性を維持する。この事実の結果として、１８ヶ月間貯蔵後のエマルジョンのリアクトゲニティは１．５である。
【０１３９】
例１３
原型、オキシゲントＡＦ０１０４（製造社Alliance Therapeutic, USA）及び本発明による方法によって製造されたエマルジョンを、それらの品質に関して比較した。比較は、水希釈での波長指数及び平均粒度における変化の関数として行なわれた。
【０１４０】
異なった無水フルオロカーボン含量と比較されるべきエマルジョンにおいて、フルオロカーボン対燐脂質の同一比率が維持された。示されたエマルジョンは、製法によって異なる。結果として、エマルジョンＰＦＯＢ‐２（本発明による製法によって製造された）は、遠心分離後に、遊離燐脂質相を含有せず（図１６参照）、吸収層中のオキシゲント及び原型ＰＦＯ‐１は、遠心分離中に容易に浮かぶ非‐結合の遊離燐脂質を含んだ（図１Ａ参照）。この理由について、オキシゲントの平均粒度は、水でのエマルジョンの希釈中に０．３５〜０．１５に減少し、燐脂質凝集物及びエマルジョン粒子が分解するからである。
【０１４１】
原型エマルジョン（ＰＦＯＢ‐１）では、そのような粗凝集物は明らかに失われていた。しかし、それらの存在は、遠心分離結果とは別に、自然の及び希釈されたエマルジョンについて付加的な規則により決定される計算及び実測濁り度パラメーター間の大きな相違を示す。本発明による製法によるエマルジョンについて、実測及び計算濁り度値の実際に完全な一致が認められた（第２１表参照）。物理的観点から、決定されるべきパラメーターは、共同効果及び多重散布がない場合に、個々の粒子における光線力の損失の合計を表わす。オキシゲント及び原型についての実測及び計算濁り度値の不一致は、付加的規則の非‐達成、即ち、挙げられた分散系中で粒子と光線束との間で付加的な相互作用が起こることを確証する。この相互作用を、オキシゲント及び原型の水希釈中で明らかに検知することができ、その結果として、粒子型の均一化は達成されないが、フルオロカーボンエマルジョンの粒子に加えて燐脂質の異なったミセル構造は達成される。エマルジョンＰＦＯＢ‐２及びＰＦＤ／ＰＦＯＢ（ロット番号５‐０３）について、粒子と光源束との相互作用が、非‐凍結状態での１ヶ月間の貯蔵後ですら付加的規則を達成した。
【０１４２】
【０１４３】
図１：製法の機能としての画分中のフルオロカーボンエマルジョンの分離：Ａ原型による（エマルジョンは遊離燐脂質を含有する）、Ｂ本発明による方法による（エマルジョンは異なった大きさの粒子だけを含有する）。１、２、３は、上、中及び低画分を意味する。１ａは上画分中の遊離燐脂質を意味する。
【０１４４】
第２０表
非希釈及び水‐希釈（１：１）エマルジョンの異なったフルオロカーボンエマルジョンの組成、波長指数ｎ及び平均粒度ａ
【表２１】
【０１４５】
第２１表
付加的規則による実測及び計算濁り度値の一致
【表２２】
【０１４６】
従って、示された例は、原型及び本発明に最も近いエマルジョンと比較して、本発明によるエマルジョンの前記の組成及び前記の製法の完全な一連の利点を示す。このことは、その後の相乗効果なので可能である。
【０１４７】
１．ＰＦＤ及びＰＦＯＢは主成分として選択され、それというのも、これらのペルフルオロカーボンが、それらの生物学的及び物理‐化学的特性により生物学的に認容可能であることを証明し、かつフルオロカーボン粒子を蓄積する生体からの、即ち、網内系の細胞からの、立証された急速な排出を有するからである。
【０１４８】
２．有効比率でのＰＦＤ及びＰＦＯＢの一般使用は混合油相に通じ、その特性は、中枢から末梢へ漸次変化する。このことは、本質的に低い蒸気圧を有する成分中で、低脂肪親和性及び非親水性の三級アミンを使用し（第1表参照）、従って、水相中へのＰＦＤ及びＰＦＯＢの脂肪親和性分子の拡散を減少させることを可能にする。このことは、エマルジョン分解、オストワルド熟成の主機構の速度を遅くさせ、かつフルオロカーボンエマルジョンの選択された組成の安定性を増加させる。
【０１４９】
３．エマルジョンの組成へのＰＦＯＢの導入は、それらの酸素吸収力を、同一フルオロカーボン含量で拡大させ、付加的なｘ‐線コントラスト特性を与える。
【０１５０】
４．ＰＦＯＢ／ＰＦＤ及び三級アミンの混合物は、粒子の周りの界面活性剤の吸収層のより強力な結合の結果としての最終形態の低粘度に寄与し、その結果として、エマルジョンの水相中の燐脂質の遊離ミセル形態を除くことが可能になる。
【０１５１】
５．燐脂質に加えて、異なった物理‐化学的特性の油の使用は、少量の燐脂質を有する粒子の周りの稠密な膜様吸収層の形成を促進させ、かつフルオロカーボンを含まないミセル構造を予防する。
【０１５２】
６．使用される水‐塩媒体の特性は、粒子表面上での陰電荷を保証し、その結果として、貯蔵及び輸送中の粒子の融合を予防する。
【０１５３】
７．高度に検量されたエマルジョン（狭い粒子分布を有する）の製造を保証する技術的製法に加えて、前記の方法は、分子蒸留を弱め、エマルジョンの高い安定性を促進させる。
【０１５４】
８．粒子の凝集欠如及び燐脂質のミセル型は、吸収特性及び血流中の補体を活性化させるエマルジョンの特性を保証し、その結果として、低リアクトゲニティが作用され、本発明による組成のエマルジョンの増加された生物適合性が促進される。
【０１５５】
ＩＩＩ 本発明によるエマルジョンの生物薬効的使用のための試験を次に示す。
【０１５６】
試験１
大量血液置換用のエマルジョンの使用のために、例１（節ＩＩ）により製造されたフルオロカーボンエマルジョンでの容量置換を、ネムブタール（Nembutal）麻酔法で、体重２５０〜３００ｇの健康なウイスターラット（ｎ＝２０）で行なった。大量血液置換後の生存能力及び血液損失の同等化後に得られる肝臓ミトコンドリア収得（方法［１６］参照）を測定した。大量血液置換後の膠質浸透圧を保証するために、エマルジョンを、注入前に、ヒトアルブミン２０％と、アルブミン１部対エマルジョン６部の比率で混合させ、アルブミン最終濃度３．５％が達成された（エマルジョンはフルオロカーボンの１０容量％を有したという事実に対して）。血液置換中、ラットは、透明なプレクシガラスフード下に供給されたＦｉＯ２＝０．５までの酸素で富化された空気を吸入した。フードは、その後に固定された動物の頭部を覆った。血液３．５ｍｌを、静脈洞（右前庭の）から採取し、エマルジョン３．５ｍｌを静脈洞中に注入した。１０分間後に、血液３．５ｍｌを採取し、同量のエマルジョンを注入した。採取された量の血液が、平均して、動物の体重の少なくとも３．５％になるまで、この工程を繰り返す；例えば、採取された血液量及び注入されたエマルジョンが、体重２５０ｇについて、各々８．８ｍｌであった。血液置換前及びその後に、末梢血管中のヘモグロビン、酸素の部分圧及び動脈及び静脈血液中のｐＨ値を測定した。この連続試験において、血液置換後のヘモグロビン濃度は、平均１．９ほど下がった。対照群（ｎ＝２０）では、塩化ナトリウム０．１５モル及びアルブミン３．５％の溶液を、エマルジョンの代わりに注入した。核磁気共鳴分光計で、末梢血液中のフルオロカーボン含量を測定した。血液置換後に、動物を、ＦｉＯ２＝０．５まで酸素で富化された空気を供給した小室中に置いた。
【０１５７】
試験群（血液置換の）では、全動物は生存し、かつヘモグロビン、赤血球及び白血球値は、５日間以内に、標準値に戻された。対照群では、３頭の動物が死んだ。５日間後に、全動物をネムブタール麻酔下に殺し、ミトコンドリアを肝臓から分離した。肝臓ミトコンドリアの呼吸を、閉鎖された恒温操作小室中２７℃で偏光測定法で記録した。活性状態での呼吸率（ＡＴＰ合成で）及び３‐ヒドロオキシブチレートによるＮＡＤ‐依存性基質の酸化でのＡＴＰ合成率は、スクシネート酸化の２０％活性化で、平均して１．５ほど減少したことが確証された。これらのデータは、非常な虚血性障害を確証する。血液置換の５日間後に分離した肝臓ミトコンドリア中で、全呼吸率及びＡＴＰ合成の、平均して２５％の活性化が観察され、その結果として、既往症での重い低酸素症が示された。
【０１５８】
試験２
全処理を、前例におけるように、しかし、２０％フルオロカーボンエマルジョンを使用して行なった。ヘモグロビン含量は、初期値に比べて３倍減少され、平均して血液の６５〜７０容量％が置換された。採取された血液及び注入された血液置換剤の容量は、体重２５０ｇについて、各々１２．２５ｍｌであった。試験群では、全動物が生存し、対照群では５頭の動物が死んだ。
【０１５９】
試験３
全処理を例１におけるように行なった。しかし、各群の５頭の動物を、血液置換の６時間後、１日間後及び３日間後に殺した。肝臓ミトコンドリアを分離し、燐酸化呼吸を記録した。対照群において、呼吸率及びＮＡＤ‐依存性基質及びスクシネートの酸化での燐酸化の平均５０％以上の急速な抑制が確認され、それによって、ミトコンドリアへの重大な虚血性障害が特徴付けられる。試験群では、血液置換の６時間後に燐酸化呼吸の４０％活性化が確認され、それは１日間維持され、かつ血液置換の３日間後に多くとも２５％であった。そのような変化は、保存され、低酸素症に罹り、虚血には罹らなかった肝臓ミトコンドリアを特徴づける。
【０１６０】
試験４
この試験は、出血性ショック後のイヌにおける腎臓の保存に関係した。腎臓の保存は、２つの腎臓を取り出された動物への腎臓移植後の腎臓蘇生術によって（試験は、保健省（Health Ministry）の倫理委員会からの特別許可後に行なわれた）及び血液置換の１時間後に、腎臓中のアデニルヌクレオチドの、及びラクテート及びピルベート含量の評価によっても確認された。１０頭のイヌを各群において各々５頭のイヌで試験した。
【０１６１】
試験過程：体重２０ｋｇのイヌから、呼吸調整を伴った挿管法麻酔下に、腿動脈から噴出させて血液４００ｍｌを除去し、その結果として、急速な圧力低下（５０〜６０ｍｍＱＳまで）、二重心臓収縮及び血漿中の２０ミリモルまで増加したラクテート濃度が起きた。血液採取の１時間後に、その量が血液損失を１５容量％ほど超過する血液置換剤、つまり、試験群では、アルブミン補足剤３．５％までを有する例１による１０％炭素エマルジョン（例１４におけるように）及び対照群では、血漿増量剤ポリグルシンを動物に供給した。もう１時間後に、動物を殺し、腎臓を取り出した。１つを移植用に、他方を腎臓組織のエネルギー変化を試験するために使用した。
【０１６２】
対照群では、ＡＴＰ対ＡＤＰの比率が３倍減少し、エネルギー変化（［ＡＴＰ］＋１／２［ＡＤＰ］）／（［ＡＴＰ］＋［ＡＤＰ］＋［ＡＭＰ］）は０．４５に減少した。試験群では（フルオロカーボンエマルジョンによる血液置換）、ＡＴＰ対ＡＤＰの比率は多くて２倍減少し、エネルギー変化は０．６５〜０．７０に減少した。腎臓組織中のラクテート対ピルベートの比率は、対照群では２５〜３０に増加し、試験群では多くて６に増加した。
【０１６３】
全例において、血流中への移植組織の包含直後に、フルオロカーボンエマルジョンで処理されたイヌの移植腎臓を受けた動物で、放尿が認められた。対照群では、急速な組織浮腫及び完全な血流停止（ネフローゼ）を伴った再潅流（reperfusion）損害の展開が、５例の内２例で認められた。対照群の３例で、移植腎臓中の血流が回復した。放尿は数時間後にやっと認められた。
【０１６４】
これらのデータは、本発明によるフルオロカーボンエマルジョンの使用でのイヌにおける出血性ショックの治療が、虚血性及び連続する再潅流損害からの臓器のより良好な保護を保証することを証明する。
【０１６５】
試験５
この試験は、潅流されたウサギの心臓を保存するための、例２により製造されたフルオロカーボンエマルジョンの使用に関した。使用前に（１〜２時間）、フルオロカーボンエマルジョン４００ｍｌを、クレブス（Krebs）‐ヘンセライト（Henseleit）の等張溶液２００ｍｌと、比率２：１で混合させた。血清アルブミンの２０％溶液８０ｍｌを、混合物６００ｍｌに加えた。比較試験用の対照組成物は、マンニトール７．２ｇの補足剤を有する塩溶液６００ｍｌ及び２０％アルブミン溶液８０ｍｌを含んだ。これらの組成物は、ウサギの心臓を保存するための潅流媒体として使用された。ランゲンドルフ（Langendorff）潅流を３７℃で循環法により行なった。心臓収縮の拍動及び振幅が維持された時間を記録した。対照及び試験のために、８つの心臓を各々使用した。フルオロカーボンをベースとする潅流液の使用中、分離したウサギの心臓の収縮力は、少なくとも６〜８時間維持された。しかし、対照組成物での潅流中、心臓停止までの収縮の拍動及び振幅での著しい減少が認められた。
【０１６６】
最後に、本発明によるエマルジョンの利点は、原型及び本発明に最も近いエマルジョンに比較して、次のようであることが挙げられるべきである。
【０１６７】
フルオロカーボンエマルジョンの本発明による組成及び製法は、フルオロカーボン化合物２〜４０容量％を含有し、生理学的に認容可能な水‐塩溶液中の燐脂質分散液で安定化される、０．０６〜０．１９５μｍの範囲の規定された粒度を有する微細分配の検量されたエマルジョンを保証する。非‐凍結状態で１８ヶ月間の貯蔵を有するフルオロカーボンエマルジョンの高度の微細性及び微細構造の製造が示され、その結果として、低リアクトゲニティで示される高い生物適合性を得ることが可能である。開発されたエマルジョンは生物薬効目的に、つまり、多量の血液損失の代用に、出血性ショックを治療するために、虚血性再潅流損害を防止するために、移植組織のための臓器を治療するためにかつ分離した臓器の潅流保護のために適合可能である。開発されたエマルジョンは、極めて明白な酸素輸送及び流動学的特性を有し、これは、酸素‐依存性ミトコンドリア機能への虚血性損害の予防及び排除、及び血液置換中の組織での好気性エネルギー交換の支持及び出血性ショックの治療も保証する。
【０１６８】
参考文献
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物物理学及び医学の分野、特に、血液損失、低酸素症及び虚血状態の治療用及び同様に血液酸素輸送改善及び分離された潅流臓器及び組織の保存用の薬剤に関する。
【０００２】
略語、参照、単位及び用語の一覧
界面活性剤 界面‐活性物質
Ｐ‐２６８、Ｆ‐２６８ プロキサノール（Proxanol）２６８、プルロニック（Pluronic）２６８
ＰＦＤ ペルフルオロデカリン
ＰＦＭＨＰ ペルフルオロメチルシクロヘキシルピペリジン
ＰＦＯＢ ペルフルオロオクチルブロミド
Ｆ１ ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物、シス‐及びトランス‐異性体：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフルオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンの混合物を表わす有機性液体
ＰＦＣｓ 複数のフルオロカーボン、複数のフルオロカーボン化合物
ＰＦＴＢＡ ペルフルオロトリブチルアミン
ＰＦＴＰＡ（ＰＡＦ‐３） ペルフルオロトリプロピルアミン
大豆‐Ｐ 大豆燐脂質
卵‐Ｐ 卵脂質
ｎ 波長指数
Ｃｖ エマルジョン中のフルオロカーボンの容量的含量（ｍｌ／ｄｌ）
ａ 平均粒度
λ 波長
Ｉｐ リアクトゲニティ（reactogenity）指数
フルオロカーボン化合物のエマルジョンを含有する潅流媒体を開発することにおける成功は、選択されたＰＦＣｓ及びこれらのＰＦＣｓをベースとするエマルジョンの物理‐化学的特性及びその製法にも大きく依存する。
【０００３】
薬効目的のＰＦＣｓは、異なった系統のフルオロカーボン化合物を表わす。これらは、外観的には、水の約２倍重い極めて高密度を有する澄明な無色の無臭液体である。異常に強力なＣ‐Ｆ結合（４８５．６ＫＪ／モル）は、これらの化合物の分子間力が極めて弱いという事実に結び付く。弱い分子間力は、それらの異常に強力なガス溶解能力、その内でも血液ガス溶解能力において証明される。
【０００４】
ＰＦＣｓは、強力なＣ‐Ｆ結合の結果として、化学的不活性によって特徴付けられる。それらは水に難溶性であり、生体において代謝的基礎を形成しない。ＰＦＣｓの化学的不活性は、生物学的不活性とは同一視され得ない。ＰＦＣをベースとするエマルジョンの静脈内注射で、これらのエマルジョンは臓器及び組織中に保留され、その滞留時間は、ＰＦＣの性質及びエマルジョンの用量に依存する。
【０００５】
異なった系統の過弗素化化合物の生物学的特性についての調査により、排出速度は一連の関連した物理‐化学的パラメーター、つまり、構造及び分子量、沸騰温度、蒸気圧及びヘキサン中の臨界溶解温度（Ｔ臨界）に依存することが示された。Ｔ臨界は、試験されるべき化合物及びヘキサンの同一容量が混合する温度である。Ｔ臨界は、脂質中の相対的ＰＦＣ溶解性の値として考慮され、その値は膜への通過率を特徴付ける。Ｔ臨界が低くなればなるほど、化合物がより良好に脂質中に溶け、かつより急速にそれが生体から排出される。第1表に、薬効適用のためのＰＦＣｓの選択基準として用いられる物理‐化学的パラメーターを示す。
【０００６】
第１表
異なった化合物のヘキサン中の臨界溶解温度（Ｔ臨界）、蒸気圧（Ｐ）及び半‐分解時間（ｔ1/2）の値［１］。
【０００７】
【表１】
【０００８】
前記のデータから、Ｔ臨界及びｔ1/2の間の強力な相関を見ることができる。この相関は、蒸気圧については認められない。大部分は、Ｔ臨界及び分子量は相互に連結される。ＰＦＣｓの最適分子量は、４６０〜５２０の範囲である。全般的に、薬効的ＰＦＣｓについて示された全選択基準は相互に矛盾していないが、量的特徴を有する。最近は、ペルフルオロカーボンエマルジョンの開発及び試験に関係する研究者は、比較的限られた数の化合物にかれらの注意を向けている。第2表及び第3表に、最も広範囲のＰＦＣｓの構造式及び物理‐化学的主要特性を示す。
【０００９】
第２表
最も広範囲で有望なＰＦＶｓの構造式
【表２】
【００１０】
異なったＰＦＣｓの第一の生物学的特性を試験する場合には、重要な要求が公式化された：同一視不可能な混合物の不在。未知特性を有する混合物は、静脈内注射した際に、基本的物質の真の反応状況（臓器内の保留、毒性、生体の異なった系への影響）を歪曲し得る。
【００１１】
第３表
薬効的製剤のベースを形成するＰＦＣｓの物理‐化学的特性
【表３】
【００１２】
注意：ＰＦＤ／ＰＦＴＰＡは、製剤フルオソル（Fluosol）‐ＤＡのベースである；ＰＦＤ／ＰＦＭＨＰは、製剤ペルフトラン（Perftoran）について；ＰＦＯＢ／ＰＦＤＢは、製剤オキシゲント（Oxygent）について。
【００１３】
液体ＰＦＣｓは、種々の水溶性の、生物学的活性物質用の不十分な溶剤である。この理由のために、酸素輸送媒体として適用するためのＰＦＣｓは、微細に分配されたエマルジョンが得られるまで、乳化剤水溶液中で分散される。
【００１４】
ＰＦＣｓのガス交換能力は、エマルジョン中の全酸素含量に従って決定される。酸素濃度は、ヘンリーの（Henry's）法則に従い、酸素圧に正比例する。ＰＦＣｓ中のガスの物理的溶解性の原則は、ペルフルオロカーボンにも及ぶ。エマルジョン中に溶解した酸素量はフルオロカーボン相に依存し、粒度には依存しない、即ち、フルオロカーボンエマルジョン中に溶解した酸素量は、各相のガス量値の合計によって計算される数値に概算する（水相中の酸素量プラスＰＦＣｓ中の酸素量）。また、ＰＦＣ及び血漿の混合物中の不活性ガス含量は、各相のガス量の合計法則に従う。従って、エマルジョン中の各ガス含量は、画分ＰＦＣ／Ｈ2Ｏの部分的ガス圧及び容量比によるその溶解性の物理的法則に従って計算され得る。このことは、ペルフルオロカーボンエマルジョン中の酸素含量が高ければ高いほど、その部分圧又はその張力（ｐＯ2）及びフルオロカーボン相の比率が高くなる。
【００１５】
体に注射する際に、各製剤の特異的（機能的）作用は、ＬＤ50値によって及び、主に、リアクトゲニティとして現われる副作用の欠如によっても決定される製剤の適合性によって決定される。ＰＦＣエマルジョンのＬＤ50値の大きさは、粒度に極めて依存する。平均粒度は０．２μmを越えてはならない。大粒子（平均粒度０．４μm以上）の比率で３％〜１０％の増加は、２つの因子によって言及されるエマルジョンのＬＤ50値を減少させる。ペルフルオロカーボンエマルジョンの可能なリアクトゲニティの検知は、静脈内注射のためのペルフルオロカーボンエマルジョンをベースとする製薬学的形を開発する際に解決されるべきであった最も困難な問題の１つである。リアクトゲニティ製剤を使用する際に、アレルギー反応がヒトに出現することがあり、それは、皮膚の僅かな発赤から呼吸停止及び心拍動停止を伴うアナフィラキシー反応まで、それ自体異なった経緯で現われる。
【００１６】
殆どの研究者は、リアクトゲニティが、大抵は、エマルジョンのフルオロカーボンベースの分散のために使用されかつ粒子の周りに（表面的）吸収層を形成する乳化剤の性質に依存するという意見である。第一世代のエマルジョンのリアクトゲニティは、オキシエチレン及びポリオキシプロピレンの非イオン性ブロックポリマー、プルロニックＦ６８（Ｆ‐６８）によって引き起こされ、かつ天然燐脂質によるその交換は、リアクトゲニティ問題を完全に解決するということが断固として信じられている。この意見は、完全には正しくなく、それというのも、脂肪エマルジョンは、天然燐脂質による安定化にも拘らず、リアクトゲニティを有するからである。ペルフルオロカーボンエマルジョンのリアクトゲニティは、乳化剤及び安定剤としての燐脂質の使用によって簡単には排除され得ない。実際に、ＰＦＣエマルジョンのリアクトゲニティは、何よりも、乳化粒子の表面特性によって、即ち、粒子を安定させる乳化剤層の状態によって作用されることが明らかになった。しかし、化学的構造、界面活性剤分子の性質及び分散系の安定性及び可能な二次反応の２つを決定する重要なパラメーターに加えて、界面活性剤とエマルジョン粒子の油核との結合強度、表面上の分子位置、その充填密度、血流中に存在するタンパク質及び他の生物学的活性分子に関する吸収特性の優勢及び最後に、エマルジョン粒子の大きさが役割を果たす。最後のパラメーターが、特に挙げられるべきである。ブロックコポリマー、ポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレンによってのみ安定化された製剤、ペルフトラン及びＦ‐６８に最も近い原型であるプロキサノール中のエマルジョンの平均粒度における減少は、二次反応における急速な減少に結び付く。このことから、エマルジョンの開発、組成及び製法において、表面的現象（２つの不均一系、エマルジョン及び血液又は血漿の相互作用）は、静脈内注射されたエマルジョンの反応に決定的な役割を果たすことが明らかである。これによって、油核及びまた後者と共同する界面活性剤の組成は実験的に選択され、かつ使用される技術の支持性も試験されるべきである。
【００１７】
薬効目的のための本発明によるペルフルオロカーボンエマルジョン及びその製法を開発する場合に、各組成及び各技術的要素を、生物学的作用について、動物モデルによって試験した。ペルフルオロカーボンエマルジョンを注射した際に、ウサギのリアクトゲニティ反応は、末梢血液中の中性好性白血球における急速な減少によって表わされることが知られている。ペルフルオロカーボンエマルジョンの可能なリアクトゲニティを評価する場合には、リアクトゲニティ指数Ｉｐを試験中に使用し、この指数は、式： Ｉｐ＝Ｃｋ／Ｃｖ に従って計算され、式中のＣｋ及びＣｖは、対照群及び試験群での初期水準に相対する好中球（％）を示す。５及び２０分間後に、Ｉｐが３よりも少ない場合には、リアクトゲニティ確率は最小である［３］。
【００１８】
ペルフルオロカーボンエマルジョンを製造するための異なった方法が公知である。ペルフルオロカーボンエマルジョンを含み、その中のペルフルオロカーボンベースは油相である水中油エマルジョンは、エネルギーにおいて高コストで製造される。油相の微分散は超音波によって又は機械的に行なわれる。
【００１９】
超音波の作用下に、分散は、２つの理由を有する強力な局部圧変化の摩擦力によって行なわれる。第一に、局部圧縮及び膨張が波の通過と共に液体中で交互に生じる。第二に、空洞現象が起き、即ち、水中に溶けたガスで充填される空洞の形成及び崩壊が起きる。超‐微細エマルジョンを製造するために必要である超音波作用のエネルギー及び力は、分散に加えて、Ｃ‐Ｆ結合が破壊されるほど大きい。結果として、毒性濃度のＦ-イオン約３〜５ミリモルがエマルジョンの水相中に出現する。そのような高濃度のＦ-を有するエマルジョンは、血液置換のために又は潅流臓器を保存することに使用することはできない。過剰なＦ-イオンを、イオン交換樹脂の通過によって除去することが必要である。超音波によって分散されたエマルジョンの第二の不利な点は、著しく高い分散範囲にあり、それというのも、平均粒度０．１μｍで、大きい粒子比率は、０．４μｍ以上及び０．０１μｍ以下の大きさで見出されるからである。
【００２０】
振盪又は強力な攪拌による機械的分散によって、生物医学的適用には受け入れられない１ミリメートル以上の粒度を有する、粗大にしか分散されないエマルジョンが得られる。微細に分配されたエマルジョンを製造するために、高圧下に分散媒体中に微細孔を通じて分散相の物質の強力な通過（押出し）を使用し、その結果として、液体噴射が乱れて小滴が生じる。分散は、圧力勾配及び水圧摩擦力によって行なわれる。エマルジョンは、通例、高圧ホモジナイザー中で製造される。得られるエマルジョンの安定化は、界面活性物質又は乳化剤によって達成される。これらの物質の安定化作用は、２つの理由によって説明される：第一に、相の間の過剰な表面エネルギーでの減少によって又は表面張力の減少によって、第二に、粒子の安定性を保証しかつ粒子の接触又は付着又は凝集を予防する構造的、機械的バリヤー（吸収層）の形成によって。
【００２１】
多くの界面活性剤の中で、少数のみが、静脈内注射用の製剤の製造に適用するための要求を満たす（第４表）。
【００２２】
第４表
ペルフルオロカーボンエマルジョンの製造のための一般的界面活性物質
【表４】
【００２３】
ここで、主に２つの乳化剤、つまり、プロキサノール‐２６８（プルロニックＦ‐６８）及び天然燐脂質（卵及び大豆燐脂質等）を、ペルフルオロカーボンエマルジョンを製造するために使用する。
【００２４】
プロキサノール構造は、極性頭（親水性部分）及び非‐極性尾（疎水性部分）を有する水溶性界面活性剤の特異的な分子特性に相応しない。プロキサノールの場合には、親水性分子特性は、２つのポリオキシドエチレン鎖によって決定され、その水素結合はＨ2Ｏ分子で形成される。ポリプロピレンポリオキシドのメチル基は、その分子の脂肪親和性を必要条件とする。Ｆ‐６８及びｐ‐２６８についてのポリオキシドエチレン／ポリオキシドポリプロピレンの比率は、平均して同一であり、８０：２０である。これらの乳化剤の安定化作用は、主に、フルオロカーボン粒子の周りの界面‐活性剤分子によって形成される保護膜の立体効果によって作用される。それによって、界面活性剤分子の最大部分は、吸収層で結合される界面活性剤に加えて、水相中で種々のミセル構造を形成し、それらの中で、フルオロカーボン化合物を含有しないそれらも形成する。吸収層中及び水相のミセル中の界面活性剤分子間に動的平衡が存在し、これは、一方で、吸収層の安定化のために要求され、かつ他方で、長期間の貯蔵中で吸収層中の界面活性剤の分子充填密度を妨害する。
【００２５】
燐脂質は天然起源の化合物の混合物を表わし、その一般的構造を第４表に示す。燐脂質は水に不溶性であり、同時に、異なったフルオロカーボン化合物に関して脂肪親和性の乏しい物質であるが、それらはホスファチジルコリン粒子の二重層中でＰＦＤ及びＰＦＴＰＡによって部分的に溶解される。水相中での燐脂質及びフルオロカーボン化合物の共同作用は、二重特性を有する。燐脂質のラメラ構造中にフルオロカーボン化合物を含有すること及び（又は）粒子表面に不可逆的に結合される燐脂質の単層を形成することが可能である。不均一粒子は、フルオロカーボン化合物及び燐脂質を含むエマルジョン中で可能であり、即ち、その粒子は燐脂質を含む及び燐脂質を含まない保護層で被覆される。この不均一性は、特殊事情及び／又はフルオロカーボン相に比較して過剰な燐脂質を製造することに原因を帰すことができる。
【００２６】
微細に分配されたエマルジョンについて、微細性を減少させる（粒子粗大化）ために決定する機構は、分散媒体を通じるフルオロカーボン化合物の分子の拡散による、小粒子から大粒子の分散相の等温蒸留又は分子物質蒸留である。この方法は、エマルジョンの"オストワルド熟成（Ostwald ripening）"又は"再凝縮"と称する。この方法の推進力は、大粒子に比較して小粒子上への飽和蒸気圧を増大させることである。また、この場合には、重要なパラメーターは、水性媒体中のフルオロカーボン化合物の溶解性の水準である。再凝縮の防止は、ペルフルオロカーボンエマルジョンの抵抗性凝集状態を得るために、即ち、粒子の微細性及び単一性を得るために決定的に重要である。不安定化、つまり、分子拡散及び僅少な凝結及び凝集への主要な方法は、フルオロカーボン相が２０容量％以下である、相対的に薄いエマルジョン、及びフルオロカーボン相が５０容量％である、もっと高く濃縮されたエマルジョンの特徴的な２つである。
【００２７】
ペルフルオロカーボンエマルジョンの安定化方法は公知である。コロイド系の安定化の基本的原則は、それらの分解機構の防止を意味する。ＰＦＣ／燐脂質をベースとするエマルジョン中の糖及び陰電荷を有する助乳化剤（燐脂質の少数成分）の添加は、吸収層中での界面活性剤分子の立体的相互作用を変化させることによって、及び粒子間の静電気的析力を増加させることによっても粒子の凝結を防止する。
【００２８】
分子拡散によって引き起こされるペルフルオロカーボンエマルジョンの主要な分解過程を減少させることは、より高い沸騰温度を有し、この過程を遅延させるフルオロカーボンベースに、二番目に少ない水溶性の成分（付加的なフルオロカーボン化合物）の添加によって達成される。
【００２９】
この安定化の原則は、製剤フルオソル‐ＤＡ、ペルフトラン及びオキシゲントの開発で使用される。編集されたデータは、挙げられた製剤の組成及び物理‐化学特性に従って、次の表５に表わされる。
【００３０】
第５表
製剤フルオソル‐ＤＡ（日本）、ペルフトラン（ロシア）及びオキシゲント（ＵＳＡ）の組成に従って編集されたデータ／２／。
【００３１】
【表５】
【００３２】
最初の２つの製剤において、フルオロカーボン化合物ペルフルオロトリプロピルアミン及びペルフルオロメチルシクロヘキサンピペリジンを、より高い沸騰温度及びより少ない水溶性を有する補足剤として、油相の最大比率を有するペルフルオロデカリンに加える。燐脂質補足剤（フルオソル‐ＤＡ）を有する水溶性プルロニックＦ‐６８又はその原型プロキサノール‐２６８（ペルフトラン）を、乳化剤として使用する。それらは、それらの物理‐化学特性に従って、相互に少し異なっている。それらは第一世代の製剤に属し、その一般的な不利な点は、不十分な安定性の故に、それらを凍結貯蔵しなければならないという事実にある。より高い沸騰温度を有し、より少ない水溶性であるペルフルオロデシルブロミドを、オキシゲント（ペルフルオロオクチルブロミド）のフルオロカーボンベースに加える。第二世代に属するオキシゲントの利点は、非‐凍結状態での貯蔵によって決定される。更に、製剤のフルオロカーボンベースであるペルフルオロオクチルブロミドは、ペルフルオロデカリンと殆ど同じ速度で（ｔ1/2〜４及び７日間に相応する）、生体から急速に排出される。
【００３３】
オキシゲントは、組成に関してやや異なっている注入媒体の商標名である。
【００３４】
乳化剤は、微細性のために要求されるＨ2Ｏ／ＰＦＣ系で、表面の中間相張力を低下させることに寄与するだけではない。乳化剤特性における変化は、分子拡散速度に影響し得る。それらの分子中に、弗素化された、疎水性の非‐弗素化の親水性部分を有する弗素化界面活性剤は、今後は有望であると考慮される。フルオロカーボン化合物のための弗素化界面活性剤の合成での大きな成功は、最近、フランスの化学者によって達成された［４］。合成の弗素化界面活性剤の一般的構造は、過弗素化鎖及び極性頭の組み合わせを表わす。炭化水素鎖は、これらの要素の結合として使用される。極性頭は、天然物質又はそれらの誘導体から選択される。極性頭としてアルコール又は糖誘導体を含有する弗素化界面活性剤は、プルロニックＦ‐６８と相乗作用を有する。極性頭として、弗素化界面活性剤中での燐脂質、糖ホスフェート又はホスファチジルコリンの使用は、乳化剤として天然燐脂質を含有するフルオロカーボンエマルジョンの安定性を増加させる。新規の混合弗素化界面活性剤群は、安定化のために提案された［４］。この弗素化界面活性剤群の分子は、２種の直鎖成分、つまり、炭化水素成分及び過弗素化成分のブロックを表わす。これらの化合物の一般式は、次のようである：
CnF2n+1CmH2m+1 又は CnF2n+1CH=CHCmH2m+1
発明者は、これらの分子を"合せ釘（dowel）"と称し、これは文字通り、"ばね"又は"結合要素"を意味する。
【００３５】
この意見は、一般的な直鎖ＲＨ‐ＲＦ構造を有する弗素化界面活性剤の分子が、強化要素の役割を果たし、その炭化水素末端がペルフルオロカーボン粒子を被覆する脂質中に入り込み、かつその他方の弗素化末端が油相中に入り込むこと、即ち、ＲＨ‐ＲＦ分子が、界面活性剤表面層の接着特性を改善することを説いている。
【００３６】
最近は、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドが、それらが他のフルオロカーボン化合物に比較して生体からより急速に排出されるという理由で、生医学的エマルジョンを製造するための最も受け入れられた化合物である。
【００３７】
特許［５、６］が公知であり、この際、血液置換剤の組成物が記載されていて、そのフルオロカーボンベースは、２種（ペルフルオロデカリン／ペルフルオロメチルシクロヘキシルピペリジン又はペルフルオロデカリン／ペルフルオロトリブチルアミン又はペルフルオロオクチルブロミド／ペルフルオロメチルシクロヘキシルピペリジン）、又は３種（ペルフルオロオクチルブロミド／ペルフルオロデカリン／ペルフルオロメチルシクロヘキシルピペリジン又はペルフルオロオクチルブロミド／ペルフルオロデカリン／ペルフルオロトリブチルアミン）又は更に４種（ペルフルオロオクチルブロミド／ペルフルオロデカリン／ペルフルオロメチルシクロヘキシルピペリジン／ペルフルオロトリブチルアミン）のフルオロカーボン化合物の、異なった比率での混合物を表わす。これらの混合物は、水溶性乳化剤プロキサノールＰ‐２６８によって分散する。この乳化剤の使用は、前記の混合物をプラスの温度で貯蔵することを可能にさせない。更に、これらの乳化剤は、融解後に、＋４°での限定貯蔵期間（せいぜい、１ヶ月間）を有する。このことはそれらの主要な不利な点である。
【００３８】
弗素化界面活性剤を有するエマルジョンは、特許‐保護されている。現今では、弗素化界面活性剤を含有するミクロ‐エマルジョン［７］は、それらが生体内で十分には安定していないという理由で、もはや注入媒体として応用されない。混合弗素化界面活性剤により製造されるペルフルオロカーボンエマルジョンの他の組成物は公知であり、前記の界面活性剤は、分子中に弗素親和性部分及び脂肪親和性部分を含有する［８］。これらのエマルジョンは、実際に、平均粒度を、プラスの温度で、しかし、ほんの３ヶ月以内で維持する。
【００３９】
リポシン（liposyn）の１０％脂肪エマルジョンを、燐脂質給源として、エマルジョン製造に用いる特許［９］が公知である。フルオロカーボン化合物の３群は、フルオロカーボンベースとして特許‐保護されている。ペルフルオロシクロアルカン又はペルフルオロアルキルシクロアルカンは第一群に属する（それらの中で、特に、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロメチルデカリン、ペルフルオロペルヒドロフェナントレン）。第二群は、ペルフルオロアルキル‐飽和の複素環状化合物を包含する。第三群は、過弗素化の三級アミン及び実際には、特に、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロトリプロピルアミンを包含する。ペルフルオロオクチルブロミドも、適用可能なフルオロカーボン化合物に属する。しかし、１０％リポシンにより安定したペルフルオロデカリンエマルジョンを製造することは未だ不可能である。その最長貯蔵期間は２５日間である。
【００４０】
もう１つの特許［１０］では、卵燐脂質をエマルジョン製造に使用する。フルオロカーボン相の比率は、１０〜５０容量％の範囲内で変化し、燐脂質のそれは０．５〜７質量％で変化する。その特許では、油相として、広汎な群の化合物から、ＰＦＣｓの１種、つまり、１〜２４個の弗素原子を有するペルフルオロヒドロフェナントレン群、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロメチルアダマンタン及びペルフルオロペルヒドロフェナントレンだけが選択され、使用される。
【００４１】
前記の２つの特許における主要な焦点は、製造されたフルオロカーボンエマルジョンの使用によって、異なった臓器及び系を保存するための方法にある。生理学的試験の開始で、エマルジョンを、晶質溶液及び／又は膠質活性物質（アルブミン、ヒドロキシエチル澱粉）と混合させる。提案されたエマルジョンは、実際には、第二世代のエマルジョンに属するが、本質的な欠点を有する。２つの特許では、エマルジョン安定性について、即ち、粒度を長期貯蔵（１ヶ月以上）で維持することについての試験結果は示されない。ここに挙げた２つの特許［９、１０］は、この際、原型として見なされる。
【００４２】
本発明によるエマルジョンに最も近い原型は、［１１］で挙げられたエマルジョンである。原型として見なされるこのエマルジョンは、第二世代に属し、急速に排出される４０〜５０容量％の量のフルオロカーボン化合物及び５〜１０容量％の高沸騰化合物の過弗素化補足剤を含有する。急速に排出されるフルオロカーボン化合物として、ペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミド（主成分）が使用され、かつ補足剤として、ペルフルオロメチルシクロヘキシルピペリジンが使用される。乳化剤は卵又は大豆燐脂質である。
【００４３】
ペルフルオロシクロヘキシルピペリジンは、エマルジョンを安定化させ、主成分（ペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミド）の分子拡散（再凝縮）速度を減少させ、異なった組成のエマルジョン、つまり、ペルフトランを製造するために使用される。特許［１１］から公知のエマルジョンの主要な欠点は、０．２μｍ以上の比較的大きい平均粒度である。
【００４４】
この発明の目的は、エマルジョンの安定性を増加させること、及びエマルジョンの品質を改善すること、即ち、非‐凍結状態で少なくとも６〜１２ヶ月間の貯蔵で、生物学的媒体（血液、血漿又は血清）との生物適合性を得ることにある。
【００４５】
薬効目的のための本発明によるエマルジョンは、急速に排出されるペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミド及び過弗素化補足剤及び燐脂質も含有する。このエマルジョンは、混合されたペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミドの組成物が急速に排出される成分として使用されること、過弗素化補足剤が過弗素化三級アミンの混合物を表わすこと及び燐脂質が水‐塩媒体中の分散液として使用されることを特徴とする。
【００４６】
更に、このエマルジョンは、フルオロカーボン化合物の全濃度が、２〜４０容量％の範囲にあることを特徴とする。
【００４７】
更に、このエマルジョンは、その組成物が急速に排出されるペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミドを１０：１〜１：１０の比率で含有すること、過弗素化補足剤がフルオロカーボン化合物の全含量の１％〜５０％であり、かつペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフルオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体及び付加的なペルフルオロ‐Ｎ‐メチルシクロヘキシルピペリジン及びその副生成物も含有することを特徴とする。
【００４８】
更に、このエマルジョンは、水‐塩媒体中の卵及び大豆燐脂質又はこれらの脂質の混合物の分散液を０．２〜５質量％の濃度で含有することを特徴とする。
【００４９】
更に、このエマルジョンは、水‐塩媒体中の燐脂質分散液が、燐脂質全含量の１〜１５％のアジュバントを含有することを特徴とする。植物油がアジュバントとして使用され、実際には、大豆、ヒマワリ種子又はヒマシ油又はこれらの油の混合物が、有効比率で、２倍又は３倍の混合物として使用される。
【００５０】
更に、このエマルジョンは、水‐塩媒体が注射用水中の塩化‐及び燐酸‐ナトリウム及び‐カリウム及び単糖類マンニトールも含有し、水‐塩媒体中の成分濃度が、１００〜３５０モスモル（mosmol）／ｌの範囲の浸透圧を有することを特徴とする。
【００５１】
更に、このエマルジョンは、平均粒度が０．２μｍを越えず、０．０６〜０．２μｍの範囲にあることを特徴とする。
【００５２】
均一化による本発明によるエマルジョンの製法は、この方法が、水‐塩媒体中の燐脂質分散液、燐脂質分散液中の均一化、製造されたエマルジョンの加熱殺菌及びその後の、＋４℃の温度での非‐凍結状態での少なくとも６ヶ月間の貯蔵を含む多段階を包含することを特徴とする。
【００５３】
更に、本発明による製法は、水‐塩媒体中の燐脂質分散液が、少なくとも１００atmの高圧での均一化及びその後の殺菌によって製造されることを特徴とする。
【００５４】
更に、本発明による製法は、燐脂質分散液中のフルオロカーボン化合物が、３００〜６５０atmの圧力で均一化されることを特徴とする。
【００５５】
更に、本発明による製法は、燐脂質分散液及びエマルジョンが１００℃の温度で殺菌されることを特徴とする。
【００５６】
前記のように、本発明の目的は、エマルジョンの安定性を増加させ、エマルジョン品質を改善し、即ち、非‐凍結状態での６〜１２ヶ月間の貯蔵での生物学的媒体（血液、血漿又は血清）中での生物適合性を得ることにある。生物適合性という用語は、異なった変化を包含し、エマルジョンに関して明確にされるべきである。前記の特許［８〜１１］では、生物適合性によって、選択されたＰＦＣｓの比較的高い排出、エマルジョンが通過潅流される組織及び臓器を保護する能力及び動物に対する比較的低い毒性（貫流血液の少なくとも２容量）が理解される。これらの考えは、相互に排他的ではないが、第一段階、即ち、血流中の血漿及び血液との粒子の相互作用を反映しない。本発明では、生物適合性は、エマルジョンと生物学的媒体（血液、血漿又は血清）との相互作用（反応）の重大性の水準から始まる。この相互作用の結果は、生体内ばかりでなく、特に試験管内での試験で、貯蔵中の吸収層への障害及び血流中へのエマルジョンの浸透を模擬する一連の因子の影響でのエマルジョンの安定化水準によって評価され得る。
【００５７】
エマルジョンの品質及び安定性は、通例、粒度に基づいて特徴付けられ、実際には、平均粒度は０．２〜０．３μｍを越えるべきではない。そのような研究は、静脈内注射用の生物薬効的な分散化製剤には十分ではない。このことは、フルオロカーボン粒子が外来物質として、血漿中に見出されるタンパク質及び他の化合物分子と、及び血球とも血流中への浸透中に相互作用するという事実に基づいている。相互作用の一般的特徴は、粒子表面の特性に依存している。エマルジョンの機能的活性（ガス輸送機能）は、本質的には、乳化粒子の表面と血液及び血漿との適合性に依存し、それというのも、反応カスケードは、例えば、外来表面上の補体の系活性化中に開始され、前記の反応カスケードは、血管痙縮及び局部血流中の干渉によって引き起こされる。また、試験管内のエマルジョン安定性は、粒子の周りの界面活性剤の吸収層の特性（強度、表面の局在論等）によって大いに影響されることも注目されるべきである。ここで挙げた内容の意味において、エマルジョン安定性の問題は、構造的詳細を評価せずに、粒子試験の化学的コロイド常法によるだけで解明され得る。粒度及び粒子構造の全体についての情報を得ることができる簡単な方法及び研究のこの観点での開発は、極めて時事的である。従って、構造という用語それ自体は、エマルジョンに関して明確にされることが意図される。
【００５８】
試験管内及び生体内でのエマルジョン安定性の試験における経過は、構造という用語の拡大及び拡張及び構造の試験法の開発にも結び付けられる。製剤又は物質の安定性という用語は、多様な製剤又はこの物質の特性の安定性によって決定される。エマルジョンの特性を決定するパラメーターは、エマルジョンの安定性を十分には特徴付けない。この側での試験では、エマルジョンの構造の特殊性を考慮するエマルジョンの安定性についての考えが拡大された。
【００５９】
炭素エマルジョンの安定性は、通例、貯蔵中のエマルジョン粒度の変更後に評価される。この純粋に化学的なコロイド研究は、不十分である。製剤のベースを表わし、静脈内注射用の使用に意図されるエマルジョンについて、エマルジョン安定性に関する情報は、試験管内試験で極めて重要であるばかりでなく、血流中を通過する際のエマルジョン安定性を予想する可能性である。この情報は、エマルジョン構造についての考えが明確に決定され得る場合に得ることができる。エマルジョンの粒子は、２‐層球状物の形を有し、その中央にＰＦＣ（粒子核）があり、その表面上に乳化剤層（外殻）がある［１２］。乳化剤の外殻厚は薄く、粒径の５〜１０％である。しかし、血流中のエマルジョンの反応（血漿タンパク質及び血球との相互作用、排出速度等）及び長期間貯蔵中の安定性は、粒子の周りの界面‐活性物質の濃度及び状態に極めて依存する。この理由のために、それらの作用又は他の作用の場合で試験されるべき媒体中の粒度及び構造的変化についての情報を、同時に得ることが必要である。
【００６０】
注入媒体のベースとしてのエマルジョンにおける構造的変化の理論的説明及び分析について、次の考えが強調されるべきである［１３］：
１）エマルジョン及びそれらの変化の"全構造"は、平均粒度及び粒度による分配によって特徴付けられる。
【００６１】
２）"微細構造"は、外殻中の乳化剤状態及び乳化剤とＰＦＣｓとの相互作用、界面活性剤分子の相互位置、それらの配置、充填密度、酸化度及び構造分子の相状態の程度によって特徴付けられる。
【００６２】
今日まで、全研究者は、全体的に不十分である"一般構造"の分析に限定してきたが、それというのも、エマルジョン安定性、生物適合性及び特に、粒子表面特性及び粒子の吸収力が、微細構造によって決定されるからである。
【００６３】
本発明によるエマルジョンを原型と比較し、かつ特に、製造されたエマルジョンの異なった貯蔵時間での一般的構造における変化を特徴付けるパラメーターについて試験した。
【００６４】
第二に、エマルジョンへの破壊的因子の作用は、評価されるべきエマルジョンの微細構造状態を可能にする条件下に模擬された。つまり、水での希釈の形の"ストレス作用"が使用され、天然エマルジョンに比較したパラメーターにおける特異的変化が受け入れられた。エマルジョンの水希釈は、界面活性剤の吸収層（外殻）と分散媒体中の界面活性剤分子との間の所定の平衡を妨害する。この理由について、準安定系（フルオロカーボンエマルジョン）の安定性を維持すること又はその分解に関する特異的な予想的有意味を有するからである。
【００６５】
更に、微細構造における変化及び系モデルとしての血清との接触中のエマルジョンの適合性の変化を試験した（試験管内試験でのエマルジョンの生物適合性の試験）。２種の不均一分散系、血清及びフルオロカーボンエマルジョンの相互作用は、血流中への浸透中の表面粒子特性での変化及び貯蔵中のエマルジョンでの微細構造変化を特徴付ける。一般構造及び微細構造での変化を、１２ヶ月間中の同等の期間で試験した。
【００６６】
貯蔵中の前記の状態パラメーターでの変化を検知するために、測定中に試験されるべき系への付加的な妨害を導入されない方法及び研究が必要とされた。そうして、光学的試験法が選択され、試験されかつ現像された。
【００６７】
一般構造を評価するために、濁り法又は濁りスペクトル法［１４］が発明者によって選択された。この方法は、遠心分離及び分別後に試験されるべきエマルジョン中の粒度分布を評価するためにも使用された。フルオロカーボン化合物の周りの吸収層中の界面活性剤分子の相互関係での変化によって引き起こされた、エマルジョンの微細構造での及び粒子表面特性の変化を、生理学的食塩溶液に対して、試験されるべきエマルジョンと血清との相互作用指数（Ｋτ）を見出すために、間接法で評価した：相対的濁度Ｋτ＝τ1／τ2、τ1及びτ2は、混合物の成分の比率における相応する変化を伴う、血清／エマルジョン及び血清／生理学的食塩溶液の混合物の濁度を意味する［１５］。更に、計算及び実測‐τ値は、乳化粒子の自然の恒存性を確認するために比較された：τ計算＝ΣＮi□τi（ΣＮi＝１）、τi及びＮiは、排出画分の濁度又は比率を意味し、かつτ実験は、分別前の同じエマルジョン試料の濁度を意味する。
【００６８】
Ｉ．本発明によるエマルジョンの具体的組成物を次に示す。
【００６９】
組成物１
エマルジョンは、次の組成：注射用蒸留水中の塩化ナトリウム２ミリモル（１１５ｍｇ／ｌ）、１回‐置換の燐酸二水素カリウム２ミリモル（無水塩３１０ｍｇ／ｌ）、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム７．５ミリモル（無水塩４６０ｍｇ／ｌ）、マンニット３１８ミリモル（マンニトール５８ｇ／ｌ）の水‐塩媒体中の、卵燐脂質及びアジュバントとして、その濃度が卵燐脂質の全含量の１５％であるヒマシ油を含有する５％燐脂質分散液で、乳化状態で安定化させた、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを比率１：１で含有するフルオロカーボン相（Ｃｖ）４０容量％を、フルオロカーボン化合物全含量の５０％の量の、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフロオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体の混合物としての、過弗素化補足剤と共に含有する。浸透圧は３１０モスモル／ｌであった。エマルジョン粒子の平均直径は０．１９５μｍであった。
【００７０】
組成物２
組成物１によるエマルジョンは、次の組成：注射用蒸留水中の、１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム２ミリモル（無水塩２７６ｍｇ／ｌ）、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム７．５ミリモル（無水塩４６０ｍｇ／ｌ）、マンニット２７８ミリモル（マンニトール５０ｇ／ｌ）の水‐塩媒体中の、大豆燐脂質及びアジュバントとして、その濃度が卵燐脂質の全含量の１０％である大豆油を含有する２５％燐脂質分散液で、乳化状態で安定化された、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを比率１０：１で含有するフルオロカーボン相（Ｃv）２０容量％を、フルオロカーボン化合物全含量の２５％の量の、付加的なペルフルオロ‐Ｎ‐メチルシクロヘキシルピペリジンと共に、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフロオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体の混合物としての補足剤と共に含有したことを特徴とした。浸透圧は２７０モスモル／ｌであった。エマルジョン粒子の平均直径は０．１μｍであった。
【００７１】
組成物３
組成物１によるエマルジョンは、次の組成：注射用蒸留水中の、１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム１ミリモル（無水塩１３８ｍｇ／ｌ）、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム３．７ミリモル（無水塩２３０ｍｇ／ｌ）、マンニット１００ミリモル（マンニトール１８ｇ／ｌ）の水‐塩媒体中の、大豆及び卵燐脂質及びアジュバントとして、その濃度が燐脂質の全含量の５％であるヒマワリ種子油を含有する２％燐脂質分散液で、乳化状態で安定化された、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを比率１：１０で含有するフルオロカーボン相（Ｃv）１５容量％を、フルオロカーボン化合物の全含量の５％の量の、付加的なペルフルオロ‐Ｎ‐メチルシクロヘキシルピペリジンと共に、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフロオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体の混合物としての補足剤と共に含有したことを特徴とした。浸透圧は１０５モスモル／ｌであった。エマルジョン粒子の平均直径は、０．０８μｍであった。
【００７２】
組成物４
組成物１によるエマルジョンは、次の組成：注射用蒸留水中の、１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム１ミリモル（無水塩１３８ｍｇ／ｌ）、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム３．７ミリモル（無水塩２３０ｍｇ／ｌ）、マンニット９０ミリモル（マンニトール１３ｇ／ｌ）の水‐塩媒体中の、卵燐脂質及びアジュバントとして、その濃度が卵燐脂質の全含量の２％であるヒマワリ種子油及び大豆油を含有する２％燐脂質分散液で、乳化状態で安定化された、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを比率２：１で含有するフルオロカーボン相（Ｃv）１０容量％を、フルオロカーボン化合物の全含量の０．２％の量の、付加的なペルフルオロ‐Ｎ‐メチルシクロヘキシルピペリジンと共に、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフロオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体の混合物としての補足剤と共に含有したことを特徴とした。浸透圧は１００モスモル／ｌであった。エマルジョン粒子の平均直径は、０．０７μｍであった。
【００７３】
組成物５
組成物１によるエマルジョンは、次の組成：注射用蒸留水中の、塩化ナトリウム２ミリモル（無水塩１１５ｍｇ／ｌ）、１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム２ミリモル（無水塩２７６ｍｇ／ｌ）、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム７．５ミリモル（無水塩４６０ｍｇ／ｌ）、マンニット３１８ミリモル（マンニトール５８ｇ／ｌ）の水‐塩媒体中の、大豆燐脂質及びアジュバントとして、その濃度が大豆燐脂質の全含量の５％である大豆及びヒマシ油を含有する０．２％燐脂質分散液で、乳化状態で安定化された、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを比率１：２で含有するフルオロカーボン相（Ｃv）２容量％を、フルオロカーボン化合物の全含量の１０％の量の、付加的なペルフルオロ‐Ｎ‐メチルシクロヘキシルピペリジンと共に、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフロオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体の混合物としての補足剤と共に含有したことを特徴とした。浸透圧は３５０モスモル／ｌであった。エマルジョン粒子の平均直径は、０．０６μｍであった。
【００７４】
組成物６
組成物１によるエマルジョンは、次の組成：注射用蒸留水中の、１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム２ミリモル（無水塩２７６ｍｇ／ｌ）、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム７．５ミリモル（無水塩４６０ｍｇ／ｌ）、マンニット２００ミリモル（マンニトール３６ｇ／ｌ）の水‐塩媒体中の、その濃度が燐脂質の全含量の４％である、大豆燐脂質及びアジュバントとしてのヒマワリ種子、大豆及びヒマシ油を含有する２％燐脂質分散液で、乳化状態で安定化された、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを比率４：１で含有するフルオロカーボン相（Ｃv）１０容量％を、フルオロカーボン化合物の全含量の４％の量の、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物：ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフロオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体の混合物としての補足剤と共に含有したことを特徴とした。浸透圧は２２５モスモル／ｌであった。エマルジョン粒子の平均直径は、０．０９μｍであった。
【００７５】
次の第６表において、本発明によるエマルジョンの組成物を、組成物１〜６により表わす。
【００７６】
第６表
フルオロカーボンエマルジョンの組成物１〜６
【表６】
【００７７】
ＩＩ 本発明によるエマルジョンの組成物の製法の具体的態様及びエマルジョンの物理‐化学的パラメーターを次に示す。
【００７８】
例１ エマルジョンを無菌条件下に製造した。
１．１ 製造のために、エマルジョン１ｌを１％燐脂質分散液に対してＰＦＣ１０容量％で製造した。
１．２ 第一段階分散液製造：無菌の丸底フラスコに、卵脂質の１０％アルコール溶液１００ｍｌを充填した。アルコールを回転蒸発機で蒸留させた。ヒマシ油１ｇ（アジュバント濃度、卵脂質含量の１０％）及び塩水溶液９００ｍｌを加えた。
１．３ 無発熱原水を、塩水溶液を製造するために使用した。１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム、２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム及び結晶性マンニットを含有する粉末を、乾燥室中１１０℃で２時間乾燥させた。その後に、１回‐置換の無水燐酸二水素ナトリウム０．１３８ｇ、２回‐置換の無水燐酸二水素ナトリウム０．５２３ｇ及びマンニット５０．０ｇを、無菌条件下に、積層装置中で、無発熱原水１ｌ中に溶かした。得られた塩水溶液を、ミリポール社（Millipor Company）製の孔径０．４μｍの無菌フィルターを通して導入させた。
【００７９】
１．４ 植物油及び塩水溶液の混合物を、乳白黄色の均一懸濁液が得られるまで、機械的に攪拌した。得られた燐脂質懸濁液を高圧ホモジナイザーの無菌容器に加えた。
【００８０】
１．５ ホモジナイザーを、先に、過熱水蒸気及びアルコール５００ｍｌで殺菌し、無発熱原の熱水５００ｍｌで洗浄した。
【００８１】
１．６ 燐脂質懸濁液を、半透明の均一性液体が得られるまで、１００atmの圧力で４時間ホモジナイザーを通して導入させた。得られた分散液をガラス容器中にデカントした。ガラス容器を無菌の不活性ガス（窒素、アルゴン又は窒素と二酸化炭素の混合物）で２〜４分間処理した。
【００８２】
１．７ ガラス容器をゴム栓で塞ぎ、アルミニウムキャップで覆った。その後に、容器を１００℃で１時間加熱殺菌した。次の製造段階まで、容器を室温で貯蔵した。
【００８３】
１．８ ＰＦＣｓを次の段階で処理した。ＰＦＤ７２ｍｌをＰＦＯＢ８ｍｌと混合させた。ペルフルオロトリプロピルアミン２０ｍｌを、この組成物８０ｍｌ中に加えた。フルオロカーボンの補足剤と共に、ＰＦＤ及びＰＦＯＢを含む、取得した組成物を、薬用アルコール同容量と混合させた。ペルフルオロカーボン相を、分離ロートによって、より重いアルコールから分離させた。分離された混合物を、無発熱原水３倍容量と混合させ、振盪し、かつ分離ロート中で分離させた（フルオロカーボン比重は水比重を実際に２倍超過する）。
【００８４】
１．９ その後に、エマルジョンを製造した。燐脂質分散液９００ｍｌ及び処理したフルオロカーボン混合物１００ｍｌ（ＰＦＤ／ＰＦＯＢ＝９／１＋ＰＦＴＰＡ−２０％を含む組成物）をホモジナイザーに加えた。内容物を機械的に攪拌し、５００atmの圧力で分散させ、全容量を、乳白光色の次微エマルジョンの半透明で帯黄色の液体が得られるまで、小室に８回流通させた。エマルジョンを、ガラス容器中に各々１００ｍｌでデカントさせた。ガラス容器をゴム栓で塞ぎ、アルミニウムキャップで覆った。
【００８５】
１．１０ 容器中のエマルジョンを１００℃で１時間加熱殺菌し、その後に冷却し、４℃で１年間貯蔵した。
【００８６】
得られたエマルジョンは、次の組成を有した：フルオロカーボン相（Ｃv）１０容量％、ＰＦＤ対ＰＦＯＢの比率９／１、フルオロカーボン混合物中のＰＦＴＰＡの相対含量２０％、卵燐脂質の濃度１質量％、ヒマシ油濃度０．１％（アジュバントとして懸濁液中の相対的ヒマシ油含量、卵燐脂質の全含量の１０％）。ロット番号１。
【００８７】
ロットの粘度を、粘度計測器BΠЖ‐２型により測定し、０．９５３ｃＰ（センチポアズ）であった。フルオロカーボン相の同一含量を有するペルフトランに比較して、粘度は２．５ｃＰ（センチポアズ）であった。
【００８８】
例２
エマルジョンを、例１と同様の組成で製造した。大豆及びヒマシ油の１：１の比率の混合物をアジュバントとして選択した。エマルジョンは次の組成を有した：Ｃv１０容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ９：１、ＰＦＴＰＡの相対含量２０％、卵燐脂質濃度１質量％、相対的アジュバント含量（大豆／ヒマシ油１：１）１０％。ロット番号２。
【００８９】
例３
エマルジョンを、例１と同様の組成で、しかし、フルオロカーボン含量２０容量％を有する８００ｍｌの容量で製造した。大豆燐脂質の１０％アルコール溶液２００ｍｌを、丸底フラスコに加えた。アルコールを回転蒸発機中で蒸留させた。アジュバント（大豆及びヒマシ油１：２の比率で、アジュバント濃度は卵燐脂質の１５％）３ｇを加えた。塩水溶液は、無水の１回‐置換の燐酸二水素ナトリウム０．２７６ｇ、無水の２回‐置換の燐酸二水素ナトリウム１．０４６ｇ及びマンニット１０．０ｇを含有した。塩水溶液１ｌを、アジュバントと共にフラスコに加え、ホモジナイザー中で振盪して分散させ、ガラス容器中にデカントし、例１に置けるように殺菌した。フルオロカーボン相を製造した。ＰＦＯＢ４０ｍｌをＰＦＤ１６０ｍｌに加えた。この量から、組成物１６０ｍｌを取り、ＰＦＴＰＡ４０ｍｌと混合させた。清浄後に、得られたペルフルオロカーボン混合物を、大豆燐脂質の分散液８００ｍｌと共にホモジナイザーに滴加した。得られたエマルジョンをデカントし、殺菌した。
【００９０】
エマルジョンは、次の組成を有した：Ｃv＝２０容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率８：２、ＰＦＴＰＡの相対含量２０％、大豆燐脂質濃度２質量％、相対的アジュバント含量（大豆／ヒマシ油１：２）１５％。ロット番号３。
【００９１】
例４
エマルジョンを、例１におけるように、しかし、ＰＦＤ対ＰＦＯＢ比率８：２で製造した。ＰＦＭＨＰ３０ｍｌを組成物１７０ｍｌに加え、振盪によって混合させ、通常通りに清浄し、大豆燐脂質（例３におけるように得た）及び同じアジュバント：（大豆及びヒマシ油比率１：２で、大豆燐脂質含量の１５％の量で）を含む分散液８００ｍｌと共にホモジナイザー中に滴加した。エマルジョンを４００atmの圧力で分散させた。
【００９２】
エマルジョンは、次の組成を有した：Ｃｖ＝２０容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率８：２、ＰＦＭＰの相対含量１５％、大豆燐脂質濃度２質量％、相対的アジュバント含量（大豆／ヒマシ油１：２）１５％。ロット番号４。
【００９３】
例５
エマルジョンを、卵燐脂質の異なった量の添加を伴うだけで、例１におけるように製造した。卵燐脂質５０ｍｌを丸底フラスコに加えた。アルコールを回転蒸発機で蒸発させた。ヒマワリ種子油０．６ｇ及び食塩溶液０．５ｇを加え、振盪によって混合させ、１５０atmの圧力で均一化させた。ＰＦＤ／ＰＦＯＢの比率５：５での組成物を、ＰＦＤ２５ｍｌ及びＰＦＯＢ２５ｍｌの混合によって製造した。混合物４９．５ｍｌをＰＦＴＰＡ０．５ｍｌと混合させた。混合物５０ｍｌを、清浄後に、卵燐脂質の懸濁液０．９５ｌと共に、ホモジナイザーに加えた。予備懸濁液の均一化を３５０atmの圧力で行なった。微細分配エマルジョンのデカント及び殺菌は、規定の規則に従って行なわれた。
【００９４】
エマルジョンは、次の組成を有した：Ｃｖ＝５容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率５：５、ＰＦＴＰＡの相対含量１％、卵燐脂質濃度０．５質量％、相対的アジュバント含量ヒマワリ種子油１２％。ロット番号５。
【００９５】
例６
大豆燐脂質の１０％アルコール溶液５０ｍｌを、丸底フラスコに加えた。アルコールを前記の方法で蒸留させた。大豆油０．６ｇ及び塩溶液９５０ｍｌを加えた。混合後に、分散液をホモジナイザー中１８０atmの圧力で製造した。殺菌後に、分散液を、エマルジョンを製造するために使用した。ＰＦＤ及びＰＦＯＢ（比率５：５で）の組成物を、ＰＦＤ２５ｍｌ及びＰＦＯＢ２５ｍｌの混合によって製造した。この組成物４９．５ｍｌに、ＰＦＭＨＰ０．５ｍｌを加えた。アルコール５０ｍｌでの清浄後に、混合物を、大豆燐脂質分散液９５０ｍｌと共にホモジナイザー中で処理した。均一化を、前記のように２段階で、第一段階では、２００atmの圧力で、第二段階では、５００atmの圧力で行なった。
【００９６】
得られたエマルジョンは、次の組成を有した：Ｃｖ＝５容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率５：５、ＰＦＭＨＰの相対含量１％、大豆燐脂質濃度０．５質量％、相対的アジュバント含量（大豆油）１２％。ロット番号６。
【００９７】
例７
懸濁液を大豆燐脂質０．２質量％の濃度で製造した。更に、大豆燐脂質のアルコール溶液２０ｍｌを回転蒸発機に加えた。アルコールを蒸留させた。アジュバントとして、大豆及びヒマワリ種子油の比率１：１での混合物をそれに加えた。食塩溶液９８０ｍｌの添加と共に、分散及び殺菌を、例６におけるように行なった。
【００９８】
ＰＦＤ／ＰＦＯＢの組成物を、ＰＦＤ４ｍｌ及びＰＦＯＢ１６ｍｌの混合（比率２：８で）によって製造した。混合物１９ｍｌに、ＰＦＭＨＰ１ｍｌを際得た。得られた３成分の混合物２０ｍｌを、懸濁液９８０ｍｌと共に均一化させた。均一化は、前例におけるように行なわれた。殺菌及びデカントは、標準方法で行なわれた。
【００９９】
得られたエマルジョンは、次の組成を有した：Ｃv＝２０容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率２：８、ＰＦＭＨＰの相対含量５％、大豆燐脂質濃度０．２質量％、相対的アジュバント含量（大豆／ヒマワリ種子油１：１）１％。ロット番号７。
【０１００】
例８
エマルジョンを製造するために、卵燐脂質の４０質量％懸濁液を、５質量％の濃度で製造した。卵燐脂質のアルコール溶液５００ｍｌを、フラスコへの添加で加えた。アルコールを蒸留させた。アジュバントとしてのヒマシ油２．５ｇ及び食塩溶液６００ｍｌをそれに加えた。混合後に、帯黄‐白色の均一媒体が得られるまで、ホモジナイザー中２００atmの圧力で分散化を行なった。殺菌は前記のように行なわれた。
【０１０１】
組成物を、ＰＦＤ４ｍｌ及びＰＦＯＢ３６０ｍｌ（比率１：９で）との混合によって製造した。ＰＦＭＨＰ４０ｍｌを混合物３６０ｍｌに加えた。得られた３成分混合物４００ｍｌを、卵燐脂質懸濁液６００ｍｌと共に、２段階で、第一段階では、２５０atmで、第二段階では、６００atmの圧力で均一化させた。殺菌及びデカントは標準方法で行なわれた。
【０１０２】
エマルジョンは、次の組成を有した：Ｃｖ＝４０容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率１：９、ＰＦＭＨＰの相対含量１０％、卵燐脂質濃度５質量％、相対的アジュバント含量（ヒマシ油）５％。ロット番号８。
【０１０３】
例９
フルオロカーボン相を、ＰＦＤ４０ｍｌ及びＰＦＯＢ３６０ｍｌから混合させた。８０ｍｌ（実際に、ＰＦＭＨＰ４０ｍｌ及び有機液体４０ｍｌ）を混合物３２０ｍｌに加えた。乳化剤懸濁液は、卵燐脂質４．２質量％、大豆燐脂質４．２質量％及び、ヒマシ油及びヒマワリ種子油を比率９：１で含むアジュバント４．２ｇ、即ち、卵燐脂質の全含量の５％を含有した。
【０１０４】
エマルジョンを製造するために、懸濁液６００ｍｌを３成分の混合物４００ｍｌと共にホモジナイザーに加えた。均一化、デカント及び殺菌は、前例におけるように行なわれた。
【０１０５】
エマルジョンは、次の組成を有した：Ｃｖ＝４０容量％、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率１：９、ＰＦＭＨＰ及び有機液体の相対含量２０％、燐脂質濃度（卵及び大豆燐脂質１：１）５質量％、相対的アジュバント含量（ヒマシ油及びヒマワリ種子油９：１）０．２５％。ロット番号９。
【０１０６】
第７表
ロット（例１〜９）による得られたエマルジョンの組成
【表７】
【０１０７】
全ロットの組成を表７に示す。
【０１０８】
第８表に、平均粒度の試験結果を、自然の（非希釈）及び水‐希釈のエマルジョンについて、異なった貯蔵時間で示す。
【０１０９】
第８表
例１、３、４、５、８及び９からの自然の及び水‐希釈のフルオロカーボンエマルジョンについての波長指数及び平均粒度
【表８】
【０１１０】
値ｎは、最小二乗法により計算された。ｎの決定における平均誤差二乗は、０．０１〜０．０３である。その結果、ｎの決定における誤差＝０．３〜１％である。パラメーターｎは、濁りスペクトル法の特性関数であり、少なくとも３〜５点により計算される。微細分配エマルジョンについて、ｎは、平均粒度ａと明白に関連される［１４］。
【０１１１】
得られた結果により、平均パラメーターｎ及びａは、実際に、１２ヶ月の貯蔵の場合には、変化しない。ストレス作用としての水希釈は粒度に殆ど影響しない。値ａにおける僅かな増加が、大豆燐脂質を有するエマルジョンについて、９〜１２ヵ月後に認められた。１年間までの貯蔵で、燐脂質分散液を有するフルオロカーボンエマルジョンの全ロットについての波長指数の変化範囲は、３．４〜２．７であった。これは、０．１１から０．１５〜０．１９５までの平均粒度における増加に相応する。
【０１１２】
粒度により粒子分配を試験するために、試験すべき媒体の分別を使用した。エマルジョンを緩和条件下に（１５００rpm）遠心分離させ、３画分に（正確に）分離した：上画分は試料容量の２０％、中画分は６０％及び低画分は２０％（図１）。図１から検知され得るように、原型として用いられる炭素エマルジョンは、粒度により異なる３画分とは別に、遊離燐脂質を含有する軽い画分を有し、その結果として、吸収層の油相に対する弱い結合及び吸収層で結合されない界面活性剤が確証される。各画分について、a及びｎの値が測定された。本発明による組成物の分別されたエマルジョンについて挙げられたパラメーターは、１〜１２ヶ月間の貯蔵と共に表９に示される。ｎ及びａは、上及び中画分についての貯蔵間に変化を示さないことが明らかである。低画分の場合には、ａは、貯蔵時間の増加と共に、粒度において僅かな増加が認められた。このことは、粒度の分配幅における拡張に繋がる。従って、最高分配幅は、０．０６〜０．１９μｍの範囲であった。
【０１１３】
得られた結果は、自然の及び水‐希釈のエマルジョン（ストレス作用）の平均粒度が、１２ヶ月間以内に僅かに増加し、０．２０μｍ以下の許容限界内で留まったことを確証した。
【０１１４】
第９表
１２ヶ月間の貯蔵での、例１，３、４、５、８及び９からのエマルジョンについての粒度の分配幅を特徴付けるパラメーターｎ及びａ（上、中、低＝遠心分離後の画分）
【表９】
【０１１５】
【表１０】
【０１１６】
粒度の分配幅における増加で確認された拡張は、比較的大きい粒子を有するエマルジョンで見出されることによって引き起こされた。１２ヶ月間の貯蔵後のエマルジョンの分別中に、低画分での粒度が０．１２から０．１９８μｍに増加した。全体で、結果は、オストワルド分解機構（又は分子蒸留）と一致する。そのような比較的大きい粒子の比率は低い（〜１０％）ので、このことは、平均粒度での増加を減損させなかった。均等の粒子沈降だけがエマルジョンの分別中に認められたことが強調されるべきであり、その結果として、遊離燐脂質の欠如が１年間の貯蔵後ですら確認される。従って、エマルジョン中の粒子分配は、単一様相で存続した。得られた結果は、１〜１２ヶ月間以内の貯蔵で、得られたエマルジョンの全体構造の維持を示す。
【０１１７】
粒子と血清との相互作用指数Ｋτは、次の第１０表に示され、前記の血清は比率１：１での５％アルブミン溶液の添加によって変性されていた。
【０１１８】
フルオロカーボンエマルジョンと血清との、エマルジョン微細構造を特徴付ける相互作用は、１２ヶ月間の貯蔵について、卵燐脂質を有するフルオロカーボンエマルジョンでの僅かな変化範囲を示した（血清‐エマルジョン比率１：０．０５及び１：０．１）。比率が１：０．１０に増加する場合には、Ｋτ及びＫτ／２の変化範囲も広くなった。大豆燐脂質を有するフルオロカーボンエマルジョンについては、Ｋτの小変化範囲が、６ヶ月間までの貯蔵でのみ存続した。前記のように、確認された変化は、多分、エマルジョンの異なった貯蔵時間での連続試験内で血清混合物を規格化することを極めて難しくさせるという事実に基づいている。同時に、特定のより狭い限度内での各ロットについてのエマルジョンと血清との相互作用の変化範囲の維持は、粒子表面特性が、長期間貯蔵（６〜９ヶ月間）で殆ど変化しないことを示す。エマルジョン中の遊離燐脂質の不在での貯蔵終了で、Ｋτの突然の変化は、粒子と血清の高分子との間の付加的な相互作用の発生によって引き起こされ得る。この仮想を調べるために、フルオロカーボンエマルジョンの構造的全体の評価のための付加的な独立したパラメーターである、濁り度τの実測値及び計算値を計算した（第１１表）［１３］。
【０１１９】
第１０表
温度＋４℃で異なった貯蔵時間のエマルジョンと血清との相互作用指数
【表１１】
【０１２０】
物理的観点から、τは、共同効果及び多重分散が無いならば、少しの粒子の場合において、分散系についての光線の損失の合計を意味する。非希釈及び水‐希釈エマルジョンに関するτの実測値及び計算値の一致は、粒子と血清の高分子との間の相互作用が＋４℃で９〜１２ヶ月間の貯蔵後ですら殆ど変化せずに存続することを証明する。従って、Ｋτの突然の変化は、多分、ペルフルオロカーボン／燐脂質の付加的な超分子構造が水性分散剤中に現われ、エマルジョン中と同じフルオロカーボン対燐脂質の比率が生じるという事実と連結している。
【０１２１】
第１１表
異なった貯蔵時間でのエマルジョンの濁り度の実測値及び計算値
【表１２】
【０１２２】
フルオロカーボンエマルジョンの本発明による組成物及び製法の利点について何事かを説明する前に、血流中を流れる際のエマルジョンのガス輸送機能を発揮するための主条件は、粒子の粒子特性の維持及びリアクトゲニティの無いことということを強調すべきである。コロイド化学及び生物理学の観点から、血流へのエマルジョンの通過は、分散剤特性における変化に繋がるべきストレス作用として考慮され得る。この作用は、次の確認、つまり、エマルジョンの希釈及び分散剤中の遊離乳化剤の濃度での減少に繋がり得る（高速相）。この過程の結果として、粒子表面への界面活性剤の分子結合の弱少化が作用される（低速相）。このフルオロカーボンへの界面活性剤の結合の弱少化は、粒子と血漿高分子との接触及び相互作用によって更になお損なわれ、その結果として、吸収層の組成又は粒子破壊が変化され得る。前記の連続法は、簡素化の典型である。
【０１２３】
この側の試験で、エマルジョンの水での希釈により、第一相、つまり、エマルジョンの希釈及び粒子の周りの遊離乳化剤濃度における減少が仮想される。得られるエマルジョンと血漿との相互作用の試験により、第二相、つまり、粒子表面の特性への血清高分子の接触作用が仮想される。１年間以内の貯蔵ですら、エマルジョン粒子はそれらの微細構造を維持し、水での希釈は粒度に影響せず、その結果として、粒子核、ペルフルオロカーボンへの界面活性剤の吸収層の強力な結合が確認されたことが明らかであった。また、エマルジョン粒子と血清との相互作用指数（測定誤差の限界内）が変化なく維持され、その結果として、粒子表面特性の維持が確立された。計算値τ（分別後）は、実測値（分別前）と一致し、その結果として、粒子特性（粒子構造）の維持及びエマルジョン中の遊離燐脂質の不在は、１年間の貯蔵後に確証された。
【０１２４】
使用される規律的研究は、血流を通過する際のエマルジョンの安定性に関する予想の正確性を著しく増加させる。同一組成の幾つかのロットからリアクトゲニティ指数（Ｉｐ）の安定性及び決定の平行試験の結果は、前記された内容の確認に用いられる。指数Ｉｐは、方法［３］により決定された。
【０１２５】
例１０
例２による組成物を有する同一エマルジョンの４ロットを製造した：フルオロカーボンベース９±１容量％、ＰＦＤ対ＰＦＯＢ比率９：１、有機液体の補足剤２０％、卵燐脂質１質量％、アジュバント（ヒマシ油及び大豆油１：１）卵燐脂質濃度の８％。
【０１２６】
次の第１２表に、これらのロットのｎ及びａの値を、異なった貯蔵時間で表わす。
【０１２７】
第１２表
異なった貯蔵時間での同一組成ＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／卵燐脂質のエマルジョンの波長指数ｎ及び平均粒度ａ
【表１３】
【０１２８】
第１３表
同一組成ＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／卵燐脂質を有するエマルジョンの遠心分離による分別中の、粒度による粒子の分配幅を特徴付ける波長指数ｎ及び平均粒度ａ
【表１４】
【０１２９】
得られるデータにより、自然の及び水‐希釈のエマルジョンの、全ての場合における平均粒度は、６ヶ月間の貯蔵時間で変化せずに維持され、０．０６〜０．１７μｍの範囲でであった。示された組成の自然の及び水‐希釈のエマルジョンの粒度の分配幅は、示された試験時間で、実際に少しも変化しなかった（第１３表）。相対的測定誤差（±１０％）に関して、得られたエマルジョンと変性化血清との相互作用指数Ｋτは、狭い限度内で変化した（次の第１４表参照）。
第１４表
同一組成ＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／卵燐脂質のエマルジョンとアルブミン（８０％）で変性された血清との相互作用指数Ｋτ
【表１５】
【０１３０】
第１５表
同一組成ＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／卵燐脂質（試験のために、卵燐脂質の分散液を使用した）のエマルジョンのリアクトゲニティ指数
【表１６】
【０１３１】
導かれた結果は、本発明によるエマルジョン及び製法が、非凍結状態での貯蔵中及び試験管内での連続ストレス作用（水‐希釈、アルブミンで富化された血清との相互作用）中に損なわれることなく、エマルジョン微細構造の高品質を可能にすることを確証する。全体的に同一エマルジョンパターンのリアクトゲニティ試験の結果は、仮想試験の結果を確証する。試験での時点ではなく、リアクトゲニティ指数は臨界値３を越えた（第１５表参照）。
【０１３２】
例１１
低フルオロカーボン含量５容量％を有するエマルジョンの構造の完全性及びリアクトゲニティの試験
エマルジョンは、次の組成を有した：ＰＦＤ／ＰＦＯＢ１：１、ＰＦＭＨＰ１％、大豆燐脂質０．５％、アジュバントとしての大豆油１２％、０．０３〜０．１２μｍの範囲の粒度の分配幅、初期リアクトゲニティ１．６１．６ヶ月間の貯蔵後の、４ロットの自然の及び水‐希釈の同一エマルジョンの平均粒度での変化（表１６参照）及びリアクトゲニティの変化（表１７参照）を試験した。示されたデータから検知可能であるように、本発明により使用される組成物中の粒度での増加及び製法は、低リアクトゲニティが得られることを保証する。
【０１３３】
第１６表
同一組成ＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／大豆燐脂質の自然の及び水‐希釈のエマルジョンの波長指数ｎ及び平均粒度ａ
【表１７】
【０１３４】
第１７表
非‐凍結状態での６ヶ月間の貯蔵後の低フルオロカーボン含量を有するエマルジョンのリアクトゲニティＩｐ
【表１８】
【０１３５】
例１２
フルオロカーボン１０容量％を含有する、１８ヶ月間以内のエマルジョンの長期間貯蔵は、ＰＦＤ／ＰＦＯＢ比率８：２、有機液体２０％、卵燐脂質２％及びアジュバントとしてのヒマシ油１０％を有する。異なった貯蔵時間及び水希釈での平均粒度の試験結果は、表１８に示される。アルブミンで５０％まで富化された血清とのエマルジョンの相互作用の開発は、表１９に示される。
【０１３６】
第１８表
非‐凍結状態で異なった貯蔵時間での、自然の及び水‐希釈のエマルジョンＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／卵燐脂質の波長指数ｎ及び平均粒度ａ
【表１９】
【０１３７】
第１９表
異なった貯蔵時間でのアルブミン（５０％）で変性された血清とのエマルジョンＰＦＤ／ＰＦＯＢ／Ｆ１／卵燐脂質の相互作用Ｋτ
【表２０】
【０１３８】
前記のデータから明らかなように、得られるエマルジョンは、測定可能な物理‐化学的特性を維持する。この事実の結果として、１８ヶ月間貯蔵後のエマルジョンのリアクトゲニティは１．５である。
【０１３９】
例１３
原型、オキシゲントＡＦ０１０４（製造社Alliance Therapeutic, USA）及び本発明による方法によって製造されたエマルジョンを、それらの品質に関して比較した。比較は、水希釈での波長指数及び平均粒度における変化の関数として行なわれた。
【０１４０】
異なった無水フルオロカーボン含量と比較されるべきエマルジョンにおいて、フルオロカーボン対燐脂質の同一比率が維持された。示されたエマルジョンは、製法によって異なる。結果として、エマルジョンＰＦＯＢ‐２（本発明による製法によって製造された）は、遠心分離後に、遊離燐脂質相を含有せず（図１６参照）、吸収層中のオキシゲント及び原型ＰＦＯ‐１は、遠心分離中に容易に浮かぶ非‐結合の遊離燐脂質を含んだ（図１Ａ参照）。この理由について、オキシゲントの平均粒度は、水でのエマルジョンの希釈中に０．３５〜０．１５に減少し、燐脂質凝集物及びエマルジョン粒子が分解するからである。
【０１４１】
原型エマルジョン（ＰＦＯＢ‐１）では、そのような粗凝集物は明らかに失われていた。しかし、それらの存在は、遠心分離結果とは別に、自然の及び希釈されたエマルジョンについて付加的な規則により決定される計算及び実測濁り度パラメーター間の大きな相違を示す。本発明による製法によるエマルジョンについて、実測及び計算濁り度値の実際に完全な一致が認められた（第２１表参照）。物理的観点から、決定されるべきパラメーターは、共同効果及び多重散布がない場合に、個々の粒子における光線力の損失の合計を表わす。オキシゲント及び原型についての実測及び計算濁り度値の不一致は、付加的規則の非‐達成、即ち、挙げられた分散系中で粒子と光線束との間で付加的な相互作用が起こることを確証する。この相互作用を、オキシゲント及び原型の水希釈中で明らかに検知することができ、その結果として、粒子型の均一化は達成されないが、フルオロカーボンエマルジョンの粒子に加えて燐脂質の異なったミセル構造は達成される。エマルジョンＰＦＯＢ‐２及びＰＦＤ／ＰＦＯＢ（ロット番号５‐０３）について、粒子と光源束との相互作用が、非‐凍結状態での１ヶ月間の貯蔵後ですら付加的規則を達成した。
【０１４２】
【０１４３】
図１：製法の機能としての画分中のフルオロカーボンエマルジョンの分離：Ａ原型による（エマルジョンは遊離燐脂質を含有する）、Ｂ本発明による方法による（エマルジョンは異なった大きさの粒子だけを含有する）。１、２、３は、上、中及び低画分を意味する。１ａは上画分中の遊離燐脂質を意味する。
【０１４４】
第２０表
非希釈及び水‐希釈（１：１）エマルジョンの異なったフルオロカーボンエマルジョンの組成、波長指数ｎ及び平均粒度ａ
【表２１】
【０１４５】
第２１表
付加的規則による実測及び計算濁り度値の一致
【表２２】
【０１４６】
従って、示された例は、原型及び本発明に最も近いエマルジョンと比較して、本発明によるエマルジョンの前記の組成及び前記の製法の完全な一連の利点を示す。このことは、その後の相乗効果なので可能である。
【０１４７】
１．ＰＦＤ及びＰＦＯＢは主成分として選択され、それというのも、これらのペルフルオロカーボンが、それらの生物学的及び物理‐化学的特性により生物学的に認容可能であることを証明し、かつフルオロカーボン粒子を蓄積する生体からの、即ち、網内系の細胞からの、立証された急速な排出を有するからである。
【０１４８】
２．有効比率でのＰＦＤ及びＰＦＯＢの一般使用は混合油相に通じ、その特性は、中枢から末梢へ漸次変化する。このことは、本質的に低い蒸気圧を有する成分中で、低脂肪親和性及び非親水性の三級アミンを使用し（第1表参照）、従って、水相中へのＰＦＤ及びＰＦＯＢの脂肪親和性分子の拡散を減少させることを可能にする。このことは、エマルジョン分解、オストワルド熟成の主機構の速度を遅くさせ、かつフルオロカーボンエマルジョンの選択された組成の安定性を増加させる。
【０１４９】
３．エマルジョンの組成へのＰＦＯＢの導入は、それらの酸素吸収力を、同一フルオロカーボン含量で拡大させ、付加的なｘ‐線コントラスト特性を与える。
【０１５０】
４．ＰＦＯＢ／ＰＦＤ及び三級アミンの混合物は、粒子の周りの界面活性剤の吸収層のより強力な結合の結果としての最終形態の低粘度に寄与し、その結果として、エマルジョンの水相中の燐脂質の遊離ミセル形態を除くことが可能になる。
【０１５１】
５．燐脂質に加えて、異なった物理‐化学的特性の油の使用は、少量の燐脂質を有する粒子の周りの稠密な膜様吸収層の形成を促進させ、かつフルオロカーボンを含まないミセル構造を予防する。
【０１５２】
６．使用される水‐塩媒体の特性は、粒子表面上での陰電荷を保証し、その結果として、貯蔵及び輸送中の粒子の融合を予防する。
【０１５３】
７．高度に検量されたエマルジョン（狭い粒子分布を有する）の製造を保証する技術的製法に加えて、前記の方法は、分子蒸留を弱め、エマルジョンの高い安定性を促進させる。
【０１５４】
８．粒子の凝集欠如及び燐脂質のミセル型は、吸収特性及び血流中の補体を活性化させるエマルジョンの特性を保証し、その結果として、低リアクトゲニティが作用され、本発明による組成のエマルジョンの増加された生物適合性が促進される。
【０１５５】
ＩＩＩ 本発明によるエマルジョンの生物薬効的使用のための試験を次に示す。
【０１５６】
試験１
大量血液置換用のエマルジョンの使用のために、例１（節ＩＩ）により製造されたフルオロカーボンエマルジョンでの容量置換を、ネムブタール（Nembutal）麻酔法で、体重２５０〜３００ｇの健康なウイスターラット（ｎ＝２０）で行なった。大量血液置換後の生存能力及び血液損失の同等化後に得られる肝臓ミトコンドリア収得（方法［１６］参照）を測定した。大量血液置換後の膠質浸透圧を保証するために、エマルジョンを、注入前に、ヒトアルブミン２０％と、アルブミン１部対エマルジョン６部の比率で混合させ、アルブミン最終濃度３．５％が達成された（エマルジョンはフルオロカーボンの１０容量％を有したという事実に対して）。血液置換中、ラットは、透明なプレクシガラスフード下に供給されたＦｉＯ２＝０．５までの酸素で富化された空気を吸入した。フードは、その後に固定された動物の頭部を覆った。血液３．５ｍｌを、静脈洞（右前庭の）から採取し、エマルジョン３．５ｍｌを静脈洞中に注入した。１０分間後に、血液３．５ｍｌを採取し、同量のエマルジョンを注入した。採取された量の血液が、平均して、動物の体重の少なくとも３．５％になるまで、この工程を繰り返す；例えば、採取された血液量及び注入されたエマルジョンが、体重２５０ｇについて、各々８．８ｍｌであった。血液置換前及びその後に、末梢血管中のヘモグロビン、酸素の部分圧及び動脈及び静脈血液中のｐＨ値を測定した。この連続試験において、血液置換後のヘモグロビン濃度は、平均１．９ほど下がった。対照群（ｎ＝２０）では、塩化ナトリウム０．１５モル及びアルブミン３．５％の溶液を、エマルジョンの代わりに注入した。核磁気共鳴分光計で、末梢血液中のフルオロカーボン含量を測定した。血液置換後に、動物を、ＦｉＯ２＝０．５まで酸素で富化された空気を供給した小室中に置いた。
【０１５７】
試験群（血液置換の）では、全動物は生存し、かつヘモグロビン、赤血球及び白血球値は、５日間以内に、標準値に戻された。対照群では、３頭の動物が死んだ。５日間後に、全動物をネムブタール麻酔下に殺し、ミトコンドリアを肝臓から分離した。肝臓ミトコンドリアの呼吸を、閉鎖された恒温操作小室中２７℃で偏光測定法で記録した。活性状態での呼吸率（ＡＴＰ合成で）及び３‐ヒドロオキシブチレートによるＮＡＤ‐依存性基質の酸化でのＡＴＰ合成率は、スクシネート酸化の２０％活性化で、平均して１．５ほど減少したことが確証された。これらのデータは、非常な虚血性障害を確証する。血液置換の５日間後に分離した肝臓ミトコンドリア中で、全呼吸率及びＡＴＰ合成の、平均して２５％の活性化が観察され、その結果として、既往症での重い低酸素症が示された。
【０１５８】
試験２
全処理を、前例におけるように、しかし、２０％フルオロカーボンエマルジョンを使用して行なった。ヘモグロビン含量は、初期値に比べて３倍減少され、平均して血液の６５〜７０容量％が置換された。採取された血液及び注入された血液置換剤の容量は、体重２５０ｇについて、各々１２．２５ｍｌであった。試験群では、全動物が生存し、対照群では５頭の動物が死んだ。
【０１５９】
試験３
全処理を例１におけるように行なった。しかし、各群の５頭の動物を、血液置換の６時間後、１日間後及び３日間後に殺した。肝臓ミトコンドリアを分離し、燐酸化呼吸を記録した。対照群において、呼吸率及びＮＡＤ‐依存性基質及びスクシネートの酸化での燐酸化の平均５０％以上の急速な抑制が確認され、それによって、ミトコンドリアへの重大な虚血性障害が特徴付けられる。試験群では、血液置換の６時間後に燐酸化呼吸の４０％活性化が確認され、それは１日間維持され、かつ血液置換の３日間後に多くとも２５％であった。そのような変化は、保存され、低酸素症に罹り、虚血には罹らなかった肝臓ミトコンドリアを特徴づける。
【０１６０】
試験４
この試験は、出血性ショック後のイヌにおける腎臓の保存に関係した。腎臓の保存は、２つの腎臓を取り出された動物への腎臓移植後の腎臓蘇生術によって（試験は、保健省（Health Ministry）の倫理委員会からの特別許可後に行なわれた）及び血液置換の１時間後に、腎臓中のアデニルヌクレオチドの、及びラクテート及びピルベート含量の評価によっても確認された。１０頭のイヌを各群において各々５頭のイヌで試験した。
【０１６１】
試験過程：体重２０ｋｇのイヌから、呼吸調整を伴った挿管法麻酔下に、腿動脈から噴出させて血液４００ｍｌを除去し、その結果として、急速な圧力低下（５０〜６０ｍｍＱＳまで）、二重心臓収縮及び血漿中の２０ミリモルまで増加したラクテート濃度が起きた。血液採取の１時間後に、その量が血液損失を１５容量％ほど超過する血液置換剤、つまり、試験群では、アルブミン補足剤３．５％までを有する例１による１０％炭素エマルジョン（例１４におけるように）及び対照群では、血漿増量剤ポリグルシンを動物に供給した。もう１時間後に、動物を殺し、腎臓を取り出した。１つを移植用に、他方を腎臓組織のエネルギー変化を試験するために使用した。
【０１６２】
対照群では、ＡＴＰ対ＡＤＰの比率が３倍減少し、エネルギー変化（［ＡＴＰ］＋１／２［ＡＤＰ］）／（［ＡＴＰ］＋［ＡＤＰ］＋［ＡＭＰ］）は０．４５に減少した。試験群では（フルオロカーボンエマルジョンによる血液置換）、ＡＴＰ対ＡＤＰの比率は多くて２倍減少し、エネルギー変化は０．６５〜０．７０に減少した。腎臓組織中のラクテート対ピルベートの比率は、対照群では２５〜３０に増加し、試験群では多くて６に増加した。
【０１６３】
全例において、血流中への移植組織の包含直後に、フルオロカーボンエマルジョンで処理されたイヌの移植腎臓を受けた動物で、放尿が認められた。対照群では、急速な組織浮腫及び完全な血流停止（ネフローゼ）を伴った再潅流（reperfusion）損害の展開が、５例の内２例で認められた。対照群の３例で、移植腎臓中の血流が回復した。放尿は数時間後にやっと認められた。
【０１６４】
これらのデータは、本発明によるフルオロカーボンエマルジョンの使用でのイヌにおける出血性ショックの治療が、虚血性及び連続する再潅流損害からの臓器のより良好な保護を保証することを証明する。
【０１６５】
試験５
この試験は、潅流されたウサギの心臓を保存するための、例２により製造されたフルオロカーボンエマルジョンの使用に関した。使用前に（１〜２時間）、フルオロカーボンエマルジョン４００ｍｌを、クレブス（Krebs）‐ヘンセライト（Henseleit）の等張溶液２００ｍｌと、比率２：１で混合させた。血清アルブミンの２０％溶液８０ｍｌを、混合物６００ｍｌに加えた。比較試験用の対照組成物は、マンニトール７．２ｇの補足剤を有する塩溶液６００ｍｌ及び２０％アルブミン溶液８０ｍｌを含んだ。これらの組成物は、ウサギの心臓を保存するための潅流媒体として使用された。ランゲンドルフ（Langendorff）潅流を３７℃で循環法により行なった。心臓収縮の拍動及び振幅が維持された時間を記録した。対照及び試験のために、８つの心臓を各々使用した。フルオロカーボンをベースとする潅流液の使用中、分離したウサギの心臓の収縮力は、少なくとも６〜８時間維持された。しかし、対照組成物での潅流中、心臓停止までの収縮の拍動及び振幅での著しい減少が認められた。
【０１６６】
最後に、本発明によるエマルジョンの利点は、原型及び本発明に最も近いエマルジョンに比較して、次のようであることが挙げられるべきである。
【０１６７】
フルオロカーボンエマルジョンの本発明による組成及び製法は、フルオロカーボン化合物２〜４０容量％を含有し、生理学的に認容可能な水‐塩溶液中の燐脂質分散液で安定化される、０．０６〜０．１９５μｍの範囲の規定された粒度を有する微細分配の検量されたエマルジョンを保証する。非‐凍結状態で１８ヶ月間の貯蔵を有するフルオロカーボンエマルジョンの高度の微細性及び微細構造の製造が示され、その結果として、低リアクトゲニティで示される高い生物適合性を得ることが可能である。開発されたエマルジョンは生物薬効目的に、つまり、多量の血液損失の代用に、出血性ショックを治療するために、虚血性再潅流損害を防止するために、移植組織のための臓器を治療するためにかつ分離した臓器の潅流保護のために適合可能である。開発されたエマルジョンは、極めて明白な酸素輸送及び流動学的特性を有し、これは、酸素‐依存性ミトコンドリア機能への虚血性損害の予防及び排除、及び血液置換中の組織での好気性エネルギー交換の支持及び出血性ショックの治療も保証する。
【０１６８】
参考文献
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急速に排出されるフルオロカーボン化合物、例えば、ペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミド、フルオロカーボン補足剤及び燐脂質を含有する薬効目的用のフルオロカーボンエマルジョンにおいて、ペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミドの組成物は、急速に排出される成分として使用され、この際、フルオロカーボン補足剤は過弗素化三級アミンの混合物を表わし、かつ燐脂質は、水‐塩媒体中の分散液として使用されることを特徴とする、ペルフルオル有機化合物の医用エマルジョン。
【請求項２】
フルオロカーボン化合物２〜４０容量％を含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項３】
急速に排出されるフルオロカーボン化合物の組成物は、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを、１０：１〜１：１０の比率で含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項４】
フルオロカーボン補足剤は、急速に排出されるフルオロカーボン化合物の組成物の全含量の１〜５０％を含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項５】
過弗素化三級アミンの混合物は、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物、つまり、ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフルオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体を含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項６】
過弗素化三級アミンの混合物は、更に、ペルフルオロ‐Ｎ‐メチルシクロヘキシルピペリジン及びその副生成物を含有する、請求項１又は５に記載のエマルジョン。
【請求項７】
０．２〜５質量％の濃度で水‐塩媒体中の燐脂質分散液を含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項８】
水‐塩媒体中の燐脂質分散液は、卵又は大豆燐脂質又はそれらの脂質の混合物を含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項９】
水‐塩媒体中の燐脂質分散液は、アジュバントとして、植物油を、燐脂質の全含量の１〜１５％の量で含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項１０】
大豆油はアジュバントとして用いられる、請求項９に記載のエマルジョン。
【請求項１１】
ヒマワリ種子油はアジュバントとして用いられる、請求項９に記載のエマルジョン。
【請求項１２】
ヒマシ油はアジュバントとして用いられる、請求項９に記載のエマルジョン。
【請求項１３】
有効比率で挙げられた油の混合物は、２倍又は３倍の混合物の形で、アジュバントとして用いられる、請求項９に記載のエマルジョン。
【請求項１４】
水‐塩媒体の組成物は、塩化ナトリウム及び塩化カリウム及び燐酸ナトリウム及び燐酸カリウム及び単糖類マンニトールも注射用蒸留水中で含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項１５】
水‐塩媒体中の成分の濃度は、１００〜３５０モスモル／ｌの範囲の浸透圧を有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項１６】
平均粒度は０．２μｍを越えず、０．０６〜０．２μｍの範囲にある、請求項１から１５までのいずれか１項に記載のエマルジョン。
【請求項１７】
高圧下での均一化を包含するフルオロカーボンエマルジョンを製造する方法において、多数の段階、つまり、水‐塩媒体中で燐脂質分散液を製造する第一段階、燐脂質分散液中でのフルオロカーボン化合物の均一化の第二段階、製造されたエマルジョンの加熱殺菌の第三段階及び非‐凍結状態で＋４℃で少なくとも６ヶ月間の連続貯蔵の第四段階で行なわれることを特徴とする、フルオロカーボンエマルジョンの製法。
【請求項１８】
水‐塩媒体中の燐脂質分散液は、少なくとも１００atmの高圧での均一化に引き続き、加熱殺菌によって製造される、請求項１７に記載の製法。
【請求項１９】
燐脂質分散液中のフルオロカーボン化合物は、３００〜６５０atmの圧力で均一化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
燐脂質分散液は、１００℃で殺菌される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
フルオロカーボンエマルジョンは、１００℃で殺菌される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
急速に排出されるフルオロカーボン化合物、例えば、ペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミド、フルオロカーボン補足剤及び燐脂質を含有する薬効目的用のフルオロカーボンエマルジョンにおいて、ペルフルオロデカリン又はペルフルオロオクチルブロミドの組成物は、急速に排出される成分として使用され、この際、フルオロカーボン補足剤は過弗素化三級アミンの混合物を表わし、かつ燐脂質は、水‐塩媒体中の分散液として使用されることを特徴とする、ペルフルオル有機化合物の医用エマルジョン。
【請求項２】
フルオロカーボン化合物２〜４０容量％を含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項３】
急速に排出されるフルオロカーボン化合物の組成物は、ペルフルオロデカリン及びペルフルオロオクチルブロミドを、１０：１〜１：１０の比率で含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項４】
フルオロカーボン補足剤は、急速に排出されるフルオロカーボン化合物の組成物の全含量の１〜５０％を含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項５】
過弗素化三級アミンの混合物は、ペルフルオロトリプロピルアミン及びその副生成物、つまり、ペルフルオロ‐１‐プロピル‐３，４‐ジメチルピロリドン及びペルフルオロ‐１‐プロピル‐４‐メチルピペリジンのシス‐及びトランス‐異性体を含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項６】
過弗素化三級アミンの混合物は、更に、ペルフルオロ‐Ｎ‐メチルシクロヘキシルピペリジン及びその副生成物を含有する、請求項１又は５に記載のエマルジョン。
【請求項７】
０．２〜５質量％の濃度で水‐塩媒体中の燐脂質分散液を含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項８】
水‐塩媒体中の燐脂質分散液は、卵又は大豆燐脂質又はそれらの脂質の混合物を含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項９】
水‐塩媒体中の燐脂質分散液は、アジュバントとして、植物油を、燐脂質の全含量の１〜１５％の量で含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項１０】
大豆油はアジュバントとして用いられる、請求項９に記載のエマルジョン。
【請求項１１】
ヒマワリ種子油はアジュバントとして用いられる、請求項９に記載のエマルジョン。
【請求項１２】
ヒマシ油はアジュバントとして用いられる、請求項９に記載のエマルジョン。
【請求項１３】
有効比率で挙げられた油の混合物は、２倍又は３倍の混合物の形で、アジュバントとして用いられる、請求項９に記載のエマルジョン。
【請求項１４】
水‐塩媒体の組成物は、塩化ナトリウム及び塩化カリウム及び燐酸ナトリウム及び燐酸カリウム及び単糖類マンニトールも注射用蒸留水中で含有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項１５】
水‐塩媒体中の成分の濃度は、１００〜３５０モスモル／ｌの範囲の浸透圧を有する、請求項１に記載のエマルジョン。
【請求項１６】
平均粒度は０．２μｍを越えず、０．０６〜０．２μｍの範囲にある、請求項１から１５までのいずれか１項に記載のエマルジョン。
【請求項１７】
高圧下での均一化を包含するフルオロカーボンエマルジョンを製造する方法において、多数の段階、つまり、水‐塩媒体中で燐脂質分散液を製造する第一段階、燐脂質分散液中でのフルオロカーボン化合物の均一化の第二段階、製造されたエマルジョンの加熱殺菌の第三段階及び非‐凍結状態で＋４℃で少なくとも６ヶ月間の連続貯蔵の第四段階で行なわれることを特徴とする、フルオロカーボンエマルジョンの製法。
【請求項１８】
水‐塩媒体中の燐脂質分散液は、少なくとも１００atmの高圧での均一化に引き続き、加熱殺菌によって製造される、請求項１７に記載の製法。
【請求項１９】
燐脂質分散液中のフルオロカーボン化合物は、３００〜６５０atmの圧力で均一化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
燐脂質分散液は、１００℃で殺菌される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
フルオロカーボンエマルジョンは、１００℃で殺菌される、請求項１７に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５２５５３６（Ｐ２００７−５２５５３６Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０１７４３（Ｐ２００７−５０１７４３）
【出願日】平成１７年２月７日（２００５．２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＲＵ２００５／００００５８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９７３９
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５０６２９７１３１）
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｇｅｎｙ Ｐａｖｌｏｖｉｃｈ Ｇｅｒｍａｎｏｖ
【住所又は居所原語表記】ｕｌ． Ｇｏｄｏｖｉｋｏｖａ， ２−９６， Ｍｏｓｃｏｗ， １２９０８５， Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ
【出願人】（５０６２９７０７２）
【氏名又は名称原語表記】Ｉｒｉｎａ Ｎｉｋｏｌａｅｖｎａ Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ
【住所又は居所原語表記】ｐｅｒ． Ｕｌｙａｎａ Ｇｒｏｍｏｖａ， ８−６７， Ｓｔ． Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ， １９１０３６， Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ
【出願人】（５０６２９７１２０）
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｇｅｎｙ Ｉｌｉｃｈ Ｍａｉｅｖｓｋｙ
【住所又は居所原語表記】Ｍｉｃｒｏｒａｉｏｎ ＡＢ， １−１７， Ｐｕｓｃｈｉｎｏ， Ｍｏｓｋｏｖｓｋａｙａ ｏｂｌ．， １４２２９０， Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月７日（２００５．２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＲＵ２００５／００００５８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９７３９
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５０６２９７１３１）
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｇｅｎｙ Ｐａｖｌｏｖｉｃｈ Ｇｅｒｍａｎｏｖ
【住所又は居所原語表記】ｕｌ． Ｇｏｄｏｖｉｋｏｖａ， ２−９６， Ｍｏｓｃｏｗ， １２９０８５， Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ
【出願人】（５０６２９７０７２）
【氏名又は名称原語表記】Ｉｒｉｎａ Ｎｉｋｏｌａｅｖｎａ Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ
【住所又は居所原語表記】ｐｅｒ． Ｕｌｙａｎａ Ｇｒｏｍｏｖａ， ８−６７， Ｓｔ． Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ， １９１０３６， Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ
【出願人】（５０６２９７１２０）
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｇｅｎｙ Ｉｌｉｃｈ Ｍａｉｅｖｓｋｙ
【住所又は居所原語表記】Ｍｉｃｒｏｒａｉｏｎ ＡＢ， １−１７， Ｐｕｓｃｈｉｎｏ， Ｍｏｓｋｏｖｓｋａｙａ ｏｂｌ．， １４２２９０， Ｒｕｓｓｉａｎ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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