ポリペプチドと五糖の複合物
本発明は、ポリペプチドが少なくとも１個のオリゴ糖−スペーサー残基と複合化され、該オリゴ糖が４−１８単糖単位を含む合成硫酸化オリゴ糖であり、該オリゴ糖自体がアンチトロンビンＩＩＩに親和性を有し、該スペーサーが結合であり、又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である、ポリペプチドとオリゴ糖の複合物又は薬剤として許容されるその塩に関する。本発明の複合物は、元のポリペプチド（すなわち、対応する非複合ポリペプチド自体）よりも、薬物動態特性が改善されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドとオリゴ糖の新しい複合物、その調製方法、該化合物を活性成分として含む薬剤組成物並びに医薬品の製造への前記化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術の最近の進歩及び先進のペプチド合成方法によって、医学的に有用な量の治療用ポリペプチドを商業生産することが可能になった。しかし、多数の治療用ポリペプチドの半減期が短いことが、これらの化合物の投与にこれまで難題を提起してきた。半減期を延長することによって有利となる、現行の重要なポリペプチド系薬物が幾つかある。例は、（著しく）数時間未満の半減期を有する、エリスロポイエチン、インスリン、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ、顆粒球コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リラキシン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲンアクチベーター、カルシトニン、インターロイキン−２及び腫よう壊死因子である。例えば、インスリンは、ヒトにおける半減期がわずか１２分程度である。治療薬候補として開発されたが、半減期が短いポリペプチドの他の例は、アドレノメデュリン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）及びキスペプチン（メタスチン）である。治療用ポリペプチドの半減期が延長されると、投薬量及び投薬頻度を削減することによって、現行の治療を改善することができる（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． Ｄｅｖ． ２００５， ８， ５９０−６００）。
【０００３】
例えばＰＥＧ化（すなわち、約１−３０ｋＤａのポリエチレングリコール部分との結合；Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２００５， １０， １４５１−１４５８）による改良によって、インビボでの半減期を延長する目的で多数のタンパク質がすでに研究されている。例えば、半減期の延長されたインスリンのＰＥＧ化類似体が現在入手可能である。このインスリン誘導体の重要な側面は、クリアランス速度の低下に加えて、免疫原性が低下し（例えば、米国特許第４，１７９，３３７号）、溶解性が増大することである。また、インスリンのＰＥＧ化の進歩によって、未変性インスリンよりも物理的にもタンパク質分解性的にも安定な複合物も得られる（例えば、国際公開第２００４／０９１４９４号、同２００２／０９８２３２号、米国特許出願公開第２００５／０１５２８４８号参照。）。
【０００４】
より長い血清半減期を有するＰＥＧ化エリスロポイエチンは、例えば、国際公開第２００４／０２２５７７号に記載されている。さらに、エリスロポイエチンの改変グリコシル化によって、半減期が延長されることも見出された。また、エリスロポイエチンのハイパーグリコシル化類似体がより高いインビボ活性を有することが報告された（国際公開第２０００／２４８９３号）。作用期間の長いＰＥＧ化（ポリ）ペプチドの他の例は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（国際公開第２００５／０５８９５４号、同２００４／０９３８２３号；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００５， １６， ３７７−３８２；Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２００５， ２６， ３５９７−３６０６）、ブドウ糖依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）（Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ， ２００５， １５， ４１１４−４１１７）、カルシトニン（Ｐｈａｒｍ． Ｄｅｖ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １９９９， ４， ２６９−２７５）及びオクトレオチド（Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２００５， ２２， ７４３−７４９）である。
【０００５】
それでも、ＰＥＧの使用には制約がある。ＰＥＧは化学合成によって得られ、全ての合成高分子同様、多分散である。これは、１つのバッチのＰＥＧが、分子量の正規分布を生じる異なるモノマー数の分子からなることを意味する。ポリペプチドをＰＥＧ化すると、異なる生物学的諸性質、特に半減期及び免疫原性を有し得る複合物の集合になる。したがって、ＰＥＧ化ポリペプチドの薬理活性の再現性は、この技術の重大な欠点になり得る。また、タンパク質のＰＥＧ化は、生物活性の損失を伴うことが多い。また、ＰＥＧの使用は、体内からの排出に関する問題を生じ得る。高分子量のＰＥＧは、肝臓に蓄積し、巨大分子症候群（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を起こす恐れがある。したがって、薬物のＰＥＧ化は、細心の注意を払って実施すべきである。多糖、特にポリシアル酸鎖によるポリペプチドの誘導体化によってＰＥＧ化と類似の結果が得られた（例えば、国際公開第９２／２２３３１号及び同２００１／８７９２２号）。
【０００６】
日本特許出願公開第０２／２３１０７７号では、ヘパリン−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）複合物が記載されている。好ましくは、幾つかのヘパリン分子がＳＯＤと結合して、酵素活性の約９０％を保持しつつ、未変性ＳＯＤよりも長い半減期を有する複合物を生成する。
【０００７】
半減期の長い他のポリペプチド複合物としては、循環血清アルブミンに結合した、インスリン（国際公開第２００３／０１３５７３号、同０５／０１２３４６号）又はＧＬＰ−１（Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２００４， １４， ４３９５−４３９８）の複合誘導体が例示される。これらの化合物における血清アルブミンとの結合は、特に、複合物内の結合部分とヒト血清アルブミンの疎水的相互作用に基づく。結合部分の疎水性が高いほど、ヒト血清アルブミンとの結合親和性は強くなる。多様な結合部分が適切であるが、かかる複合物の欠点は、複合物とヒト血清アルブミンの相互作用の親和性及び選択性が低いことであり、その結果、薬力学的挙動を予測することが困難である。或いは、ヒトインスリンの遺伝子をヒト血清アルブミンの遺伝子と直接融合させると、皮下投与後長期間にわたって血糖値を低下させるのに有効な長時間作用型インスリンが得られる（Ｄｕｔｔａｒｏｙ ｅｔ ａｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００５， ５４， ２５１−２５８）。しかし、この場合、融合ポリペプチドの生物学的利用能及び標的受容体に対する結合親和性が低下する。
【０００８】
また、国際公開第２０００／４０２５３号は、例えば、ペプチドと、特にグリコサミノグリカン鎖との複合物を開示しており、これは、合成プロテオグリカンと考えられる。この複合物では、複合グリコサミノグリカンの薬理活性は、その治療活性にかなり影響を及ぼす。
【０００９】
また、薬剤的に活性な化合物の溶解性を増大させるために、オリゴ糖が該化合物に結合された（国際公開第２００４／０３９７１号）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ポリペプチドとオリゴ糖の複合物である、半減期の長い新しいポリペプチド複合物又は薬剤として許容されるその塩に関する。ここで、ポリペプチドは、少なくとも１個の合成硫酸化オリゴ糖−スペーサー残基と複合化されている。オリゴ糖は、４−１８単糖単位を含み、それ自体がアンチトロンビンＩＩＩに親和性を有する。スペーサーは結合であり、又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である。好ましいオリゴ糖は４−６単糖単位からなり、特に好ましいのは五糖である。本発明の複合物は、元のポリペプチド（すなわち、対応する非複合ポリペプチド自体）よりも、薬物動態特性が改善され、したがって薬理学的特性が改善されている。
【００１１】
本発明は、さらに、治療に有効な、抗血栓活性の無視し得る、ポリペプチドを含む複合物の調製方法に基づく新規技術にも関する。この調製方法は、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対する親和性をそれ自体が有する合成硫酸化オリゴ糖、特に五糖が、結合又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基を介して、ポリペプチドに共有結合する段階を含む。
【００１２】
ＡＴＩＩＩはセリンプロテアーゼ阻害剤であり、血しょう中に存在し、凝固カスケードを分断してフィードバックループを与える。硫酸化五糖の半減期は、本質的にＡＴＩＩＩとの親和性に基づく（例えば、Ｆ． Ｐａｏｌｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ２００２；４１ Ｓｕｐｐｌ． ２：１１−１８参照）。本発明の複合物においては、血清半減期は、複合物の半減期を主として占める五糖の半減期の結果として、元のポリペプチドの半減期よりも長い。また、本発明の複合物は、半減期が長いだけでなく、複合物の五糖部分とＡＴＩＩＩの特異的相互作用に基づいて、薬物動態特性を調整することもできる（この相互作用は、例えば、Ｗｅｓｔｅｒｄｕｉｎ ｅｔ． ａｌ． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９４， １２６７−１２８０； ｖａｎ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ． １９９５；１５：４９５−５０３に記載されている。）。本発明の一実施形態においては、オリゴ糖−ポリペプチド複合物（オリゴ糖は、特に４−６単糖単位からなり、とりわけ五糖である。）は、５０ｎＭ以下の循環血しょう中濃度を有する。この濃度まで、ＡＴＩＩＩによって媒介されるオリゴ糖（特に五糖）の抗凝血活性は、特に出血のリスクに関して重要でない（例えば、（１）Ｆ． Ｄｏｎａｔ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ２００２；４１ Ｓｕｐｐｌ． ２：１−９；（２）Ｓ．Ｊ． Ｋｅａｍ ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇｓ ２００２；６２（１１）：１６７３−１６８５及び（３）Ｔｈｅ Ｒｅｍｂｒａｎｄｔ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０００；１０２：２７２６−２７３１参照）。本発明の実施形態によれば、複合物に使用するオリゴ糖（特に４−６単糖単位からなり、とりわけ五糖である。）は、ポリペプチド自体の薬理活性と比較したときに、治療量以下のレベルである抗凝血活性をそれ自体が有する。この点で、治療量以下とは、治療効果未満であり、出血リスクなどの副作用がないことを意味する。例えば、１型糖尿病患者は、本複合物に使用する五糖の治療量以下の範囲に十分ある（基本の）治療血しょう中濃度約［０．１−１．０］ｎＭを補足する（長い半減期の）インスリン注射を必要とする。当業者は、ポリペプチドと五糖それぞれの治療レベル間の適切なバランスで複合物を選択する方法を理解されたい。
【００１３】
本発明の複合物中のポリペプチドはその生物活性を保持している。また、本発明の複合物中のＡＴＩＩＩと結合した五糖が線形の薬物動態学的挙動を示すことは、複合ポリペプチドの極めて予測可能な治療効果を説明するものである。というのは、複合物は、ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．投与後は主として血管内の区画に残存するからである。
【００１４】
本発明の複合物中のオリゴ糖残基は、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対する親和性をそれ自体が有する合成硫酸化オリゴ糖に由来する残基である。硫酸化オリゴ糖、特に五糖は、一般に、ＡＴＩＩＩに対して親和性を有するが、当業者はＡＴＩＩＩに対するオリゴ糖の親和性を容易に調べ（ｖａｎ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ． １９９５；１５：４９５−５０３）、所望の親和性レベルを選択することができる。適切な合成オリゴ糖残基、特に五糖残基は、ＥＰ ０，４５４，２２０、ＥＰ ０，５２９，７１５、国際公開第９８／０３５５４号、同９９／３６４２８号、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００５；４８， ３４９−３５２， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９４， ３２， １６７１−１６９０などに開示されているオリゴ糖及び五糖から誘導し得る。
【００１５】
オリゴ糖及び五糖の残基は、直接的に、又は五糖残基内の任意の化学的に適切な位置に結合した連結残基を介して、ポリペプチドと複合化し得る。したがって、本発明の一実施形態においては、複合物は、オリゴ糖−スペーサー残基が構造（Ｉ）を有する複合物である。
【００１６】
【化１１】
式中、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な１個の連結残基が存在し、Ｒは独立にＯＳＯ３−、（１−８Ｃ）アルコキシ又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、
Ｒａは独立にＯＳＯ３−であり、（１−８Ｃ）アルコキシであり、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、又は１−１３単糖単位を含むオリゴ糖残基であり、
Ｒｂは独立に（１−８Ｃ）アルコキシであり、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、又は１−１３単糖単位を含むオリゴ糖残基であり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。
【００１７】
より好ましいのは、オリゴ糖−スペーサー残基が、構造（ＩＩ）を有する五糖−スペーサー残基である複合物である。
【００１８】
【化１２】
式中、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な１個の連結残基が存在し、Ｒは独立にＯＳＯ３−、（１−８Ｃ）アルコキシ又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。
【００１９】
さらに好ましいのは、五糖残基が構造（ＩＩＩ）を有する複合物である。
【００２０】
【化１３】
式中、Ｒは独立にＯＳＯ３−又は（１−８Ｃ）アルコキシであり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。
【００２１】
本発明による極めて好ましい化合物は、五糖残基が構造（ＩＶ）を有する化合物である。
【００２２】
【化１４】
式中、Ｒは独立にＯＣＨ３又はＯＳＯ３−であり、特に（ＩＩ）中の両方のＲ基はＯＳＯ３−である。
【００２３】
本発明によれば、ＡＴＩＩＩに対して親和性を有する合成硫酸化オリゴ糖残基、特に五糖残基は、任意のポリペプチドと複合化し得る。例えば、ポリペプチドは、生理活性ペプチド（例えば、３から５０アミノ酸長）とすることができ、又は触媒活性を有しても、有さなくてもよいより長いポリペプチドとすることができる。生理活性ペプチドの非限定的例としては、コナントキンＧ、ダイノルフィン、エンドルフィン、エンケファリン、ニューロテンシンなどの神経伝達物質；ボンベシン、モチリン、ガストリンなどの胃の活性化因子（ｇａｓｔｒｉｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）；カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）などのカルシウム調節因子；オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）などの骨吸収調節因子；アドレノメデュリン又はＡＤＭ（２７−５２）などのその切断型誘導体などの骨芽細胞活性の刺激因子；血管作動性腸管ポリペプチド、コルチコトロピン、セクレチンなどのホルモン；ソマトスタチンなどのホルモン阻害剤；メラニン細胞刺激ホルモン、黄体化ホルモン放出因子、セルモレリンなどのホルモン刺激因子；グルカゴン、アミリン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）又はＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−２、ブドウ糖依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）、インスリン（「Ｈｕｍｕｌｉｎ」、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）などのその切断型誘導体などの抗糖尿病薬；リソスタフィンなどの抗感染薬；オベスタチンなどの食欲抑制ホルモン；アンジオテンシンＩＩなどの血管収縮剤；ブラジキニン、サブスタンスＰ、カリジンなどの血管拡張薬；心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（ＡＮＰ）などのナトリウム排泄増加薬；バソプレッシン、デスモプレッシンなどの抗利尿ホルモン及びオキシトシンなどの分娩促進薬が挙げられる。使用することができるポリペプチドの追加の例としては、ヒト成長ホルモン（「Ｈｕｍａｎｔｒｏｐｅ」、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ｒＬＨ；ｒＧ−ＣＦＳ（「Ｎｅｕｐｏｇｅｎ」、Ａｍｇｅｎ）；エリスロポイエチン（「Ｅｐｏｇｅｎ」、Ａｍｇｅｎ）；インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ又はインターフェロンγ；第ＶＩＩＩ因子又はプロテインＣ、第ＶＩＩａ因子などの他の血液凝固因子；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２又は−１８）などのサイトカイン；ヘモグロビン；スーパーオキシドジスムターゼ；可溶性ＣＤ４又はＣＤ４受容体；血小板ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ類似体及びその受容体（「ＲｅｏＰｒｏ」、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）；グルコセレブロシダーゼ（「Ｃｅｒｅｄａｓｅ」又は「Ｃｅｒｅｚｙｍｅ」、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；ＡＣＴＨ；ソマトトロピン；副甲状腺ホルモン、抗利尿ホルモン；プロラクチン；ペグビソマント（「Ｓｏｍａｖｅｒｔ」、Ｐｆｉｚｅｒ）などのｒＨＧＨ；ロイプロリド（「Ｌｕｐｒｏｎ」、「Ｌｅｐｒｏｒｅｌｉｎ」、Ｔａｋｅｄａ）、ナファレリン（「Ｓｙｎａｒｅｌ」、Ｒｏｃｈｅ）などのＧｎＲＨ作動物質及びガニレリクス（「Ａｎｔａｇｏｎ」、Ｏｒｇａｎｏｎ）などのＧｎＲＨ拮抗物質；セルモレリン（「Ｇｅｒｅｆ」、Ｓｅｒｏｎｏ）などのＧＨＲＨ作動物質；オクトレオチド（「Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ」、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子（「Ａｃｔｉｖａｓｅ」、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの血栓溶解剤；メタスチン（ＫＩＳＳ１又はキスペプチン−５４）、キスペプチン−１０などのその切断型誘導体が挙げられる。
【００２４】
好ましいポリペプチドは、分子量が約０．３−５０ｋＤａである。他の好ましいポリペプチドは、分子量が約０．３−２０ｋＤａである。分子量約０．３−７．５ｋＤａのポリペプチドも好ましい。
【００２５】
さらに好ましいポリペプチドは、インスリン（ｔ１／２＝１２ｍｉｎ；Ｍｗ＝５．８ｋＤａ）、カルシトニン（ｔ１／２＝２０ｍｉｎ；Ｍｗ＝３．４ｋＤａ）、ＧＬＰ−１（７−３６）（ｔ１／２＝６ｍｉｎ；Ｍｗ＝３．４ｋＤａ）、アドレノメデュリン（ｔ１／２＝２０ｍｉｎ；Ｍｗ＝６．０ｋＤａ）、ＡＤＭ（２７−５２）（Ｍｗ ３．０ｋＤａ）、オクトレオチド（ｔ１／２＝１．７ｈ、Ｍｗ＝１．０ｋＤａ）、インターロイキン−２（ｔ１／２＝２０ｍｉｎ；Ｍｗ＝１５ｋＤａ）及びガニレリクス（ｔ１／２＝１２ｈ；Ｍｗ＝１．６ｋＤａ）である。インスリン及び［Ｄ−Ａｌａ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）が特に好ましい。本発明のさらなる実施形態は、五糖−スペーサー残基で一置換されたポリペプチド複合物である。
【００２６】
スペーサーは、結合であり、又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である。好ましくは、スペーサーは、スペーサー「骨格」に沿ってオリゴ糖残基の酸素を含めずに数えて特に１０−５０原子の本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である。本明細書では「本質的に薬理学的に不活性」という用語は、本発明の化合物が治療上有効である用量においてそれ自体が薬理学的に活性である原子又は基をスペーサーが含まないことを意味する。したがって、本発明の化合物を治療薬として使用する用量において、スペーサーの性質は、実証し得る薬理学的副作用をもたらさない。スペーサーは、環構造、不飽和結合などの（いくらか）剛直な要素を含み得る。本発明の化合物のスペーサーは、好ましくは柔軟である。適切なスペーサーは、当業者が容易に設計することができる。合成上の理由で、スペーサーが長いほど不適切であると考えられるが、長いスペーサーでも、本発明の化合物に首尾よく適用し得る。好ましいスペーサーは、少なくとも１個の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−基を含む。
【００２７】
本発明の複合物の代表例は、以下の構造の複合物又は他のその塩、スペーサーが異なる、若しくは五糖の別の位置に結合している複合物である。
【００２８】
【化１５】
式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝
【００２９】
【化１６】
又はＲ１＝Ｒ３＝Ｈ、Ｒ２＝
【００３０】
【化１７】
であり、Ｙは構造Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから選択される。
【００３１】
【化１８】
ナトリウム塩が好ましい。好ましくは、Ｙは構造Ａ及びＢから選択される。
【００３２】
本開示において明示的に定義していない、一般に用いられる化学略語は、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｔｙｌｅ Ｇｕｉｄｅ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ（１９９７）， ”２００１ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ａｕｔｈｏｒｓ” Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６６（１）， ２４Ａ（２００１）， ”Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ” Ｊ． Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ． Ｓｃｉ． ５， ４６５−４７１（１９９９）に記載されている。
【００３３】
ポリペプチドという用語は、翻訳後修飾にかかわらず、少なくとも３個のアミノ酸からなる鎖を指す。ポリペプチドは、天然の、化学合成された、又は組換え産生されたアミノ酸ポリマーでもよい。３から５０個のアミノ酸を含むポリペプチドは、典型的には、ペプチドとして分類される。
【００３４】
「触媒活性を有するポリペプチド」という句は酵素を意味する。本明細書ではインスリンという用語は、ヒト、ラット、モルモット及びウサギを含めた哺乳動物中に存在する天然の血糖降下ポリペプチド、組換えインスリン並びに米国特許第４，６５２，５２５号、同４，４３１，７４０号、同５，２６８，４５３号、同５，５０６，２０２号、同５，５１４，６４６号及び同５，７００，６６２号に開示されている類似の血糖降下ポリペプチドを指す。
【００３５】
本発明の複合物の記載においては、さらに以下の定義を使用する。（１−４Ｃ）アルキル及び（１−８Ｃ）アルキルという用語は、それぞれ１−４個及び１−８個の炭素原子を有する分枝又は非分枝アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシル及びオクチルを意味する。メチル及びエチルが好ましいアルキル基である。
【００３６】
（１−８Ｃ）アルコキシという用語は、１−８個の炭素原子を有するアルコキシ基を意味する。アルキル部分は、上で定義した意味を有する。メトキシが好ましいアルコキシ基である。
【００３７】
スペーサーの長さは、スペーサーと結合したオリゴ糖残基の酸素原子を数えずに、オリゴ糖残基とポリペプチドの間の最短の鎖に沿って数えたスペーサーの原子数である。
【００３８】
本発明の実施形態は、さらに、アンチトロンビンＩＩＩに対する親和性をそれ自体が有する合成硫酸化オリゴ糖（特に、オリゴ糖は４−６単糖単位からなり、とりわけ硫酸化五糖である。）が、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基を場合によっては介して、ポリペプチドに結合する段階を含み、該ポリペプチドを含む複合物が、生物活性を本質的に保持しつつ、元のポリペプチドよりも長い血しょう中半減期を有し、無視し得る抗血栓活性を有する、治療に有効な該複合物の調製方法である。
【００３９】
合成及び分析の一般的態様
五糖の合成
本発明の化合物の、ＡＴＩＩＩ結合性のオリゴ糖、特に五糖は、例えば、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９４， ３２， １６７１−１６９０に記載のように調製することができる。ＡＴＩＩＩに対して異なる親和性を有する異なるオリゴ糖及び五糖は、中間体の単糖、二糖又は四糖構成要素を変えることによって、例えば、（永続的な）アルキル基を導入することによって、又は異なる硫酸化オリゴ糖及び五糖を制御された様式で利用する異なる（一時的な）保護基を適用することによって、得ることができる（例えば、Ｗｅｓｔｅｒｄｕ ｉｎ ｅｔ． ａｌ． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９４， １２６７）。スペーサーは、例えば、国際公開第２００１／４２２６２号に記載のように導入することができる。オリゴ糖−及び五糖−スペーサー分子は、ガンマ−マレイミドブチリル（ＧＭＢ）基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基、保護されていてもよいチオール基などの連結残基を用いてさらに誘導体化して（例えばＡｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９６， ３５， ３３１−３３３）、修飾されていてもよいポリペプチドと直接カップリングすることができる。
【００４０】
複合化
一般に、本発明の複合物は、（ａ）ポリペプチドが複合化用に改変される、必須でない段階と、（ｂ）改変されていてもよいポリペプチドがオリゴ糖−又は五糖−スペーサー分子と反応する、カップリング段階とを含む方法によって製造される。
【００４１】
バイオコンジュゲートを生成する一般的合成方法は、Ｇｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” １９９６， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されている。また、複合化としては、（Ｋ．Ｌ． Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ２００２；９９：１９−２４に記載のものなどの）Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション又は五糖誘導体とアルキン若しくはアジド官能基で独立に修飾されたポリペプチドとを用いたＨｕｉｓｇｅｎの１，３−双極子環付加を考えることができる。或いは、（Ｍ． Ｌｅｗｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００４， １５， ２３１−２３４に記載のものなどの）位置選択的ＩｇＡプロテアーゼによって媒介されるポリペプチドのＮ末端伸長、（Ｍ． Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００４， １２６， １４０１３−１４０２２に記載のものなどの）トランスグルタミナーゼによって触媒されるアミノスペーサー含有オリゴ糖の導入などの酵素反応を用いて、修飾されていてもよいポリペプチドに五糖−スペーサー残基を複合化することができる。
【００４２】
また、例えばインスリン、ＧＬＰ−１及びオクトレオチドのＰＥＧ化は、詳細に記録されている。これらのタンパク質においては、約５−３０ｋＤａのＰＥＧ部分を、その生物活性を失わずに導入することができる。かかる戦略に従って、五糖（スペーサー）部分を（部位特異的に）導入することができる。また、五糖複合物とＡＴＩＩＩ（約５０ｋＤａ）の結合は、ポリペプチドの生物活性に実質的な有害作用を及ぼさないことが必要条件である。
【００４３】
インスリン：Ｎ末端Ｂ−１及びＣ末端近傍Ｂ−２９のリジンアミノ官能基は、インスリンの生理活性には必須ではない。Ｂ１−ＰＥＧ化インスリンが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化ＰＥＧ誘導体とジＮ−Ｂｏｃによって保護されたインスリンとの反応によって全収率２０％で調製された（Ｓ．Ｗ． Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ． ２００２， ５４， ５０５−５３０）。Ｎ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）などの二官能カップリング試薬の類似の反応によって、Ｂ１修飾インスリン五糖複合物が得られる。或いは、非保護Ｚｎ２＋−インスリンのＢ２９ Ｌｙｓ残基を、過剰のＮＨＳエステルを用いてｐＨ約１０−１１で収率約６０％で選択的に修飾することができる。インスリンとの位置選択的な複合化のための他の確立された方法は、国際公開第９８／０２４６０号、同２００４／０９１４９４号、同２００５／０１２３４６号、米国特許出願公開第２００５／０１５２８４８号、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｓｃｉ． ２００５， １１， ３３９−３４６， Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． ２００５， １６， ６１５−６２０， Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔ． ２００３， １６２２， ４２−４９， Ｔｅｓｓｍａｒ ｅｔ ａｌ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎ． ２００４， １０， ３， ４４１−４５３から改良して作成することができる）。
【００４４】
ガニレリクス：五糖のＮＨＳエステル誘導体は、ｄｅ−Ｎ−Ａｃガニレリクスの遊離Ｎ末端アミノ基と複合化することができる。又は、五糖誘導体を含むアミノスペーサーは、場合によっては追加のスペーサーを介して、デスアミドガニレリクスの遊離末端カルボン酸基と複合化することができる。デスアミドガニレリクスは、例えばＪ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９２， ３５， ３９４２−３９４８に記載された、先進の（固相）ペプチド合成によって得ることができる。
【００４５】
オクトレオチド：市販ペプチドであるオクトレオチドのＮ末端Ｄ−Ｐｈｅアミノ酸残基は、最高５ｋＤａのＰＥＧを用いて、生理活性を失わずに修飾することができる（Ｄ． Ｈｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２００５， ２２， ７４３−７４９）。Ｎ末端アミノ基の位置特異的官能基化は、過剰の二官能ＮＨＳエステル連結試薬を用いてｐＨ約６で実施することができる。その後、上述のバイオコンジュゲートを生成する一般的合成方法に従って（例えば、チオール基を含む五糖−スペーサー残基をオクトレオチドのマレイミド誘導体と複合化することによって）、担体の五糖とさらに複合化することができる。
【００４６】
ＡＤＭ（２７−５２）：完全長アドレノメデュリン（ＡＤＭ）のＮ末端は、骨形成活性及び血管石灰化に対する抑制作用に必須ではない。五糖−スペーサー残基とＡＤＭ（２７−５２）のＮ末端Ａｌａ残基との位置特異的複合化は、固相ペプチド合成を利用する確立された方法及び上述のバイオコンジュゲートを生成する一般的合成方法を用いて、Ｎ末端修飾されていてもよいＡＤＭ（２７−５２）を合成することによって実施することができる。
【００４７】
［Ｄ−Ａｌａ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）：ＧＬＰ−１（７−３６）及びエキセンディン−４（１−３９）などのその誘導体のＣ末端部分は、受容体の結合に重要であるアミノ酸残基が露出したαヘリックス構造を形成する。Ｎε位がマレイミド官能基で修飾された追加のリジン残基を用いて、例えば国際公開第２００５／０５８９５４号に記載された、改良された固相ペプチド合成によって、このアミノ酸配列を伸長すると、ヒト血清アルブミンのＣｙｓ３４アミノ酸と共有結合した後でも、受容体と結合し、インビボでの官能基活性を示す。一方、タンパク質分解の安定性は、２位にＤ−Ａｌａ残基を組み込むことによって（さらに）改善することができる（Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２００４， １４， ４３９５−４３９８）。同様に、ＧＬＰ−１（７−３６）又はその類似体を、適切に官能基化された（例えばチオール基を含む）五糖−スペーサー部分と複合化することができる。或いは、Ｃｙｓアミノ酸は、ペプチド配列、好ましくは１１、１２、１６、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３４、３５若しくは３６位に組み込むことができ、又は３７位に付加することができ、また、適切に官能基化された（例えばマレイミド基を含む）五糖−スペーサー部分に、ＧＬＰ−１誘導体のＰＥＧ化（国際公開第２００４／０９３８２３号）の場合と類似した方法によってカップリングすることができる。また、ＧＬＰ−１の複合物は、ＧＬＰ−１に対する二官能ＮＨＳエステル連結試薬との直接カップリングと、それに続く（例えば、ＧＬＰ−１の直接ＰＥＧ化についてＬｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００５， １６， ３７７−３８２に記載されたように）位置異性体の分離及び適切に官能基化された五糖−スペーサー部分とのカップリングによって得ることができる。
【００４８】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）：市販の未変性ｒｅｃＨ−ＩＬ２の遊離Ｃｙｓ１２５アミノ酸又は依然として生物活性である、ＩＬ２変異タンパク質の遊離の（追加の）Ｃｙｓアミノ酸を、ＰＥＧ−マレイミドによるＩＬ２のＰＥＧ化（米国特許第５，２０６，３４４号）の場合と類似したプロトコルに従って、マレイミド基を含む五糖−スペーサー部分と反応させることができる。
【００４９】
本発明の化合物を調製する上記方法において考えられる手順段階であるペプチドカップリングは、アジド法、混合酸無水物法、活性化エステル法、カルボジイミド法などペプチド断片のカップリング若しくは縮合に対して当分野で周知の方法によって、又は、好ましくは、ＴＢＴＵのようなアンモニウム／ウロニウム塩の影響下で、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び７−アザ−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールのような触媒作用的なラセミ化抑制化合物を添加して、実施することができる。概要は、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３， Ｅ． Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ． Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， ｅｄｓ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８１）及びＰｅｐｔｉｄｅｓ： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｎ． Ｓｅｗａｌｄ ａｎｄ Ｈ．−Ｄ． Ｊａｋｕｂｋｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， ２００２）に記載されている。
【００５０】
化合物中のアミン官能基は、合成手順中にＮ保護基（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基又はフタロイル（Ｐｈｔｈ）基のような、ペプチド化学反応においてα−アミノ基の保護のために一般に使用される基を意味する。）によって保護することができ、又はアジド部分のデマスキングによって導入することができる。アミノ保護基及びその除去方法の概要は、上記Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３及びＰｅｐｔｉｄｅｓ： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されている。
【００５１】
遊離塩基の形で存在し得る本発明の化合物は、薬剤として許容される塩の形で反応混合物から単離することができる。薬剤として許容される塩は、式（Ｉ）の遊離塩基を塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、アスコルビン酸などの有機又は無機酸で処理することによって得ることもできる。
【００５２】
本発明の化合物又はその中間体は、不斉炭素原子を有し得る。したがって、本発明の化合物又はその中間体は、純粋な鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、又はジアステレオマーを含む混合物として得られる場合がある。純粋な鏡像異性体を得る方法は、当分野で周知であり、例えば光学活性な酸から得られる塩及びラセミ混合物の結晶化、又はキラルカラムを用いたクロマトグラフィーである。ジアステレオマーの場合には、順相（ｓｔｒａｉｇｈｔ ｐｈａｓｅ）又は逆相カラムを使用することができる。
【００５３】
物理化学分析及び生化学分析
タンパク質の生理活性に対する、二官能リンカー及び／又は反応性五糖部分を用いた反応の効果をモニターする幾つかの技術が利用可能である。この点で、可溶な受容体分子を相補的結合剤（インスリン）として用いた生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）及び酵素活性の測定は貴重なツールである。五糖複合物とＡＴＩＩＩの結合試験も、これらのアッセイに含まれ得る。イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィー及びＡＴＩＩＩアフィニティークロマトグラフィーは、五糖複合物の亜分画に利用可能な方法である。一方、電気泳動技術は、直交、定性及び定量キャラクタリゼーション（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＺＥ）に適切である。複合化部位は、複合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析及びＮ末端配列決定によって同定することができる。
【００５４】
薬物動態（ＰＫ）試験
非修飾ポリペプチド及び対応する五糖複合物のインビボでの半減期を求めるＰＫ試験をラットで実施することができる。幾つかの選択肢、例えば血しょう試料におけるＩｏｄｏｇｅｎ、求電子置換を起こすラクトペルオキシダーゼイオン化、又は標識部分としてのボルトンハンター試薬を用いた１２５Ｉによる放射性標識とガンマ線放射の測定が利用可能である。当分野で公知の他の方法は、非標識複合物の注入と、それに続くＥＬＩＳＡ又はＬｕｍｉｎｅｘ法による免疫化学的分析に基づく。
【００５５】
薬理学的評価
本発明のポリペプチドとＡＴＩＩＩ結合性五糖の複合化の薬理効果は、以下に示すように、インビトロでのアッセイ及びインビボでの動物モデルにおいて試験することができる。インスリンは、２個のジスルフィド架橋によって結合した２個のペプチド鎖からなる５．８ｋＤａのタンパク質である。Ｌｙｓ ε−アミノ基又はＮ末端α−アミノ基の１つにおける部位特異的化学修飾は詳細に記録されている。五糖とインスリンの複合化の効果は、血清試料のグルコース、インスリン及びＣ−ペプチド含有量（内因性インスリン分泌を補正するための生物マーカー）を分析することによって試験することができる。血糖計、ヒトインスリン及びＣ−ペプチド放射性免疫測定法が商用的に利用可能である。血糖値に対するインスリンのインビボでの効果は、ラット又はビーグルで測定することができる。
【００５６】
デカペプチド模倣ＧｎＲＨ拮抗物質ガニレリクスの五糖複合化のインビトロ及びインビボでの薬理学的効果は、確立されたアッセイ及び動物モデルにおいて試験することができる。先進のポリペプチド合成によって、マウス及びラットにおいて卵成熟及び排卵を阻止するガニレリクスとその効果を比較することができる明確に定義された分子が生成される。ガニレリクスとその五糖複合物の相手の生物学的半減期の比較は、例えば、投与後に成熟及び排卵の天然プロセスが回復する時間を求めることによって試験することができる。
【００５７】
ＧＬＰ−１（７−３６）は、インスリン分泌の刺激、グルカゴン分泌、胃又は腸運動の阻害、グルコース利用の促進、体重減少の誘導などの多数の生物学的効果をもたらす、十分研究された周知のインスリン分泌性内分泌ホルモンである。ＧＬＰ−１（７−３６）は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）によって迅速に分解される。この早すぎる分解は、例えば、８位のアミノ酸残基を（例えばＤ−アラニンで）置換することによって回避し得る。大きい脂肪酸鎖又はＰＥＧによる修飾などの他の手法によって、生物活性ＧＬＰ−１又は（例えば、国際公開第２００４／０９３８２３号に定義される）その類似体が生成される。修飾されていてもよいＧＬＰ−１（７−３６）誘導体を担体の五糖と複合化する（付加的な）安定化効果は、ＤＰＰＩＶの存在下でインビトロで複合物の安定性を測定することによって、また、血しょう中半減期を免疫化学的分析を用いて測定することによってインビボで、試験することができる。ＧＬＰ−１五糖複合物の官能基の活性は、ＧＬＰ−１受容体に結合し、それを活性化する能力を測定することによってインビトロで求めることができる。インビボでの薬力学的効果は、血清試料のグルコース及びインスリンを分析することによって試験することができる。
【００５８】
アドレノメデュリンは、血管拡張、気管支拡張、神経伝達、成長調節、骨形成調節などの多数の生物学的機能を有する５２アミノ酸ポリペプチドである。切断断片のＡＤＭ（２７−５２）は、血管拡張剤活性の構造上の要件を欠くが、培養したラット骨芽細胞の成長を依然として用量依存的に刺激することができる（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００３， １１２， ７９−８６）。また、ＡＤＭ（２７−５２）は、ラットにおける血管石灰化を阻害し（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００５， １２９， １２５−１３２）、したがって動脈石灰化の予防に応用し得ることが最近確認された。ＡＤＭ（２７−５２）を担体の五糖と複合化する効果は、ラット胎児の活発に成長する骨芽細胞の培養におけるインビトロでの骨形成活性又は骨形成の指標のインビボでの増加を（骨吸収に影響を及ぼさずに）測定する確立されたアッセイによって評価することができる。
【００５９】
オクトレオチドは、ソマトスタチンの合成オクタペプチド類似体であり、末端肥大症及びある種の内分泌腫ようの治療に臨床的に使用される。長時間作用性デポー製剤（例えば、Ｓａｎｏｓｔａｔｉｎ ＬＡＲデポー、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、毎日３回の皮下注射と比較して、血しょう成長ホルモン及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）レベルの低下に少なくとも有効であることが判明した。薬物動態特性及び薬理学的特性に対するオクトレオチドと五糖の複合化の効果は、オスのラットにおいて、確立された放射性免疫測定法を用いて複合オクトレオチドのレベル及びＩＧＦ−Ｉの変化レベルを測定することによって試験することができる。
【００６０】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、白血球（Ｔリンパ球）によって体内で自然に産生されるタンパク質であり、免疫系の重要なタンパク質である。ＩＬ−２は、薬物として市販されており（アルデスロイキン、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、Ｃｈｉｒｏｎ、Ｕ．Ｓ．）、一部のタイプの癌（有毛細胞白血病）の治療に使用され、ＣＤ４細胞数を増加させるために抗ＨＩＶ治療と併用される。五糖−ＩＬ−２複合物の特異的生理活性は、Ｇｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９７８， １２０， ２０２７−２０３２）によって記述されたＩＬ−２細胞増殖バイオアッセイによってインビトロで求めることができる。
【００６１】
薬剤
本発明の複合物は、経腸又は非経口投与することができる。これらの化合物及びその組成物の正確な用量及び投薬計画は、ポリペプチド自体の生物活性、医薬品を投与する個々の対象の要求、苦痛の程度又は開業医の要求及び判断に応じて必然的に決まる。一般に、非経口投与は、吸収により大きく依存する他の投与方法よりも少ない投与量を必要とする。しかし、ヒトに対する１日用量は、好ましくは０．０００１−１ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．００１−０．１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００６２】
本発明の化合物を用いて製造された医薬品は、治療におけるアジュバントとしても使用することができる。かかる場合には、医薬品は、かかる病態の治療に有用である他の化合物と一緒に投与される。
【００６３】
本化合物は、例えば標準の参考文献、Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１８ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０、特にＰａｒｔ ８： Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅを参照されたい。）に記載された、薬剤的に適切な助剤と混合して、丸剤、錠剤などの固体投与単位に圧縮することができ、又はカプセル剤若しくは坐剤に加工することができる。本化合物は、薬剤的に適切な液体を用いて、例えば注射剤又は噴霧剤用の溶液、懸濁液、乳濁液の形で適用することもできる。
【００６４】
投与単位、例えば錠剤を製造する場合、充填剤、着色剤、重合体結合剤などの従来の添加剤の使用が企図される。一般に、活性化合物の機能を妨げない、薬剤として許容される任意の添加剤を使用することができる。組成物を一緒に投与することができる適切な担体としては、適切な量で使用される、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体など又はその混合物が挙げられる。静脈内投与するときには、薬剤組成物を、ボーラスとして、時間の異なる２回以上の回数で、又は一定流量若しくは非線形流量の注入として、投与することができる。したがって、本発明の組成物は、任意の投与経路用に処方することができる。
【００６５】
典型的には、静脈内投与用組成物は、無菌等張性緩衝水溶液である。必要に応じて、本組成物は、可溶化剤、安定剤及び注射部位におけるとう痛を軽減するリドカインなどの局所麻酔薬を含むこともできる。一般に、これらの成分は、別個に、例えばキットで、又は単位剤形として一緒に混合して、例えば、凍結乾燥粉末、又は水を含まない濃縮物として、供給される。本組成物は、活性薬剤量を活性単位で示した、アンプル、小袋などの機密密封容器に保存することができる。本組成物を注入投与する場合には、医薬品等級の無菌「注射用水」、食塩水又は他の適切な静脈内輸液を含む注入ボトルを用いて投与することができる。本組成物を注射投与する場合には、無菌注射用水又は食塩水のアンプルを、投与前に各成分を混合することができるように用意することができる。本発明の薬剤組成物は、本発明の化合物及び薬剤として許容されるその塩と、薬剤として許容される任意の成分、賦形剤、担体、アジュバント又はビヒクルを含む。
【００６６】
特に断らない限り、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は等価である方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を本明細書に記載する。本明細書で言及する全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献を参照によりその全体を援用する。矛盾が生じた場合には、定義を含めて本明細書が基準になる。また、材料、方法及び実施例は、説明のためにのみあり、限定的なものではない。
【００６７】
本発明を、これらだけに限定されないが、以下の実施例によってさらに詳細に説明する。異なる五糖、スペーサー及びポリペプチドを用いて、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変を成し得ることを理解されたい。
実施例
使用略語：
ＡＣＮ アセトニトリル
ＡｃＯＨ 酢酸
ＡＤＭ アドレノメデュリン
（ｈ）ＡＴＩＩＩ （ヒト）抗トロンビンＩＩＩ
ＡＵＣ 曲線下面積
ＢＩＡ 生体分子間相互作用解析
Ｂｏｃ２Ｏ ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート
Ｃｌ クリアランス
ＤＣＣＩ Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着検定法
Ｅｑｕｉｖ． 当量
ＥＳＩ エレクトロンスプレーイオン化
ＧＬＰ−１ グルカゴン様ペプチド１
ＧＭＢ ガンマ−マレイミドブチリル
ＧＭＢＳ ガンマ−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｃ）エステル
ＨＢＳ−ＥＰ ＥＤＴＡとポリエチレングリコールを含むｈｅｐｅｓ緩衝食塩水
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＰ−ＳＥＣ 高速サイズ排除クロマトグラフィー
ＨＲＰ 西洋わさびペルオキシダーゼ
ｉ．ｖ． 静脈内
ＩＬ−２ インターロイキン−２
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型
ＭｏＡｂ モノクローナル抗体
ＭＲＴ 平均滞留時間
ＭＳ 質量分析法
ＮＭＭ Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＰＡＧＥ ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ＰＳ 五糖
Ｑ−ＴＯＦ 四重極飛行時間型
ｒｅｃＨ 組換えヒト
ＲＴ 室温
Ｒｔ 保持時間
ＳＤＳ ドデシル（ｄｏｃｅｃｙｌ）硫酸ナトリウム
ＴＢＴＵ ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
ＴＣＡ トリクロロ酢酸
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
Ｖｓｓ 定常状態での分布容積
材料及び方法
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＤＲＸ−４００（ｕｌｔｒａ ｓｈｉｅｌｄ）によって４００ＭＨｚで記録した。有機溶媒中の化学シフトをテトラメチルシランに対するｐｐｍ（δ）で報告する。
【００６８】
ＤＭＦ、１，４−ジオキサン、ＮＭＭ、酢酸アンモニウム、Ｂｏｃ２Ｏ、ＴＦＡ、ＤＭＳＯ、ＤＣＣＩ（Ａｃｒｏｓ）、ヒドロキシルアミン（５０ｗｔ％水溶液）、無水ヨード酢酸、ＧＭＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｒｅｃＨインスリン（Ｄｉｏｓｙｎｔｈ）、ＴＥＡ、６−アミノカプロン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＴＨＦ（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ）、２−メルカプト−［Ｓ−アセチル］酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１３）、ＴＢＴＵ（Ｆｌｕｋａ）、ＡＣＮ（Ｍｅｒｃｋ）、ＡｃＯＨ及びＮａ２ＨＰＯ４（Ｊ．Ｔ． Ｂａｋｅｒ）を各供給業者から入手してそのまま使用した。
【００６９】
カラムクロマトグラフィーを、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｇｅｒｍａｎｙ ＧｍｂＨ ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（ＭＰ ｓｉｌｉｃａ ３２−６３、６０Å）及びＭｅｒｃｋ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−１８（４０−６３μｍ）を用いて実施した。ＴＬＣ分析を、Ｍｅｒｃｋ ＴＬＣ ｐｌａｔｅｓ ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４を用いて実施した。化合物をＵＶ吸収（２５４ｎｍ）によって、及び／又はＵＳＵＩ試薬（リンモリブデン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｍｏｌｙｂｄｅｎｉｃ ａｃｉｄ）／ＡｃＯＨ／Ｈ２ＳＯ４のＥｔＯＨ溶液）と一緒に炭化することによって、可視化した。
【００７０】
ＭＡＬＤＩスペクトルをＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて正及び負イオンモードの線形、遅延引き出しモードで得た。再結晶化アルファ−シアノヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ、５００ｍＬ／Ｌ ＡＣＮ／１ｍＬ／Ｌ ＴＦＡ中３ｇ／Ｌ）をマトリックスとして使用した。分子量を二点較正によって（例えば、ｒｅｃＨインスリン及びその断片鎖の１つ又はミオグロビンをｍ／ｚ１６９５３及びｍ／ｚ８４７７に割り当てることによって）測定した。
【００７１】
Ｑ−ＴＯＦスペクトルを、ＥＳＩ源を備えたＰＥ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ Ｑ−ｓｔａｒ Ｐｕｌｓａｒを用いて正イオンモードで得た。試料をＨ２Ｏに溶解させ、逆相Ｚｉｐ Ｔｉｐ（登録商標）を用いて脱塩した。初期設定の分析ＨＰＬＣを、３台のＧｉｌｓｏｎポンプ（３０５）の勾配システムを備えたＧｉｌｓｏｎ ２３４自動試料採取装置とＬｕｎａ（商標）Ｃ１８（２）カラム（逆相、１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を用いて実施した。Ｇｉｌｓｏｎ ＵＶ検出器（１１８）を２１０ｎｍにおける検出に使用した。勾配溶出をカラム温度４０℃及び流量１ｍＬ／ｍｉｎで実施した。溶離剤Ａ（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ、９：１中の０．１％ＴＦＡ溶液）９５％と溶離剤Ｂ（０．１％ＴＦＡのＡＣＮ溶液）５％で５分間開始し、次いで１５から５０％ＡＣＮの線形勾配を２５分間適用した。
【００７２】
化合物４の分析的な（ＨＰＬＣ）分析を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ−１０Ａ ｖｐ（システム制御装置）二方向ポンプ勾配システムとＬｕｎａ（商標）Ｃ１８（２）カラム（逆相、１５０×２．０ｍｍ、５μｍ）を用いて実施した。ＳｈｉｍａｄｚｕダイオードアレイＵＶ検出器（ＳＰＤ−Ｍ１０Ａ ｖｐ）を２１４ｎｍにおける検出に使用した。勾配溶出をカラム温度４０℃及び流量０．４ｍＬ／ｍｉｎで実施した。
【００７３】
分取ＨＰＬＣを、単一のポンプ（Ｗａｔｅｒｓ ６００）勾配システムを備えたＷａｔｅｒｓ ２７６９ ｓａｍｐｌｅ ｍａｎａｇｅｒとＬｕｎａ（商標）Ｃ１８（２）カラム（逆相、２５０×５０ｍｍ、１０μｍ）を用いて実施した。Ｇｉｌｓｏｎ ＵＶ検出器（２９９６、フォトダイオードアレイ）を２１０ｎｍにおける検出に使用した。勾配溶出を流量５０ｍＬ／ｍｉｎで実施した。溶離剤Ａ（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ、９：１中の０．１％ＴＦＡ溶液）９０％と溶離剤Ｂ（０．１％ＴＦＡのＡＣＮ溶液）１０％で１０分間開始し、次いで１５から５０％の溶離剤Ｂの線形勾配を５０分間適用した。
【００７４】
分析陰イオン交換クロマトグラフィーを、Ｐｈａｒｍａｃｉａポンプ（Ｐ−９００）勾配システムを備えたＰｈａｒｍａｃｉａ Ａｋｔａ ＥｘｐｌｏｒｅｒとＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５カラムを用いて実施した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＵＶ検出器（ＵＶ ９００）を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｐＨ及び電気伝導度検出器（ｐＨ／Ｃ ９００）と組み合わせて、２１０ｎｍにおける検出に使用した。ＡＤ検出器（ＡＤ９００）をＣｈｉｒａｌｙｓｅｒ（ＩＢＺ）と併用した。また、Ｐｈａｒｍａｃｉａフラクションコレクター（Ｆｒａｃ ９５０）及びＰｈａｒｍａｃｉａ自動試料採取装置（Ａ ９００）を使用した。初期設定の溶出を流量１ｍＬ／ｍｉｎで実施した。溶離剤Ａ（ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ２：８）７４％と溶離剤Ｂ（ＡＣＮ／２Ｍ ＮａＣｌ ２：８）２６％で５分間開始し、次いで溶離剤Ａ ２０％と溶離剤Ｂ ８０％までの勾配を１５分間適用した。
【００７５】
分取陰イオン交換クロマトグラフィーを、Ｐｈａｒｍａｃｉａポンプ（Ｐ−５０）とＰｈａｒｍａｃｉａ勾配ミキサー（ＬＫＢ ＧＰ−１０）勾配システムを備えたＰｈａｒｍａｃｉａシステム及びＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＸＫ１６ Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗカラムを用いて実施した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＵＶ検出器（ＬＫＢ−ＵＶ−ＭＩＩ）を、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ電気伝導度検出器と組み合わせて、２１４ｎｍにおける検出に使用した。初期設定の勾配溶出を流量４．６ｍＬ／ｍｉｎで実施した。溶離剤Ａ（Ｈ２Ｏ）８０％と溶離剤Ｂ（２Ｍ ＮａＣｌ水溶液）２０％で２０分間開始し、次いで溶離剤Ａ ２０％と溶離剤Ｂ ８０％までの勾配を２１０分間適用した。
【００７６】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を用いた分取ゲルろ過（脱塩）を、Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗポンプ（１０１Ｖ）を備えたＰｈａｒｍａｃｉａシステムとＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＸＫ２６ Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５ファインカラムとを用いて実施した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＵＶ検出器（ＬＫＢ−ＵＶ−ＭＩＩ）を、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ電気伝導度検出器と組み合わせて、２１４ｎｍにおける検出に使用した。均一濃度溶離をＨ２Ｏを用いて流量１ｍＬ／ｍｉｎ Ｈ２Ｏで１０時間実施した。
【００７７】
化合物６を用いた分析ＨＰ−ＳＥＣを、ＨＰ１１００クロマトグラフィーシステムに搭載したＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）３０ ＨＲ １０／３０カラムを用いて実施した。０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７．０を用いて流量０．４ｍＬ／Ｌで溶出させた。
【００７８】
他の複合物を用いた分析ＨＰ−ＳＥＣを、分析Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ クロマトグラフィーの場合と同様に、Ａｋｔａ ＥｘｐｌｏｒｅｒシステムとＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５ ＨＲ １０／３０カラムを用いて実施した。均一濃度溶離を５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて流量１ｍＬ／ｍｉｎで実施した。
【００７９】
分取ＨＰＳＥＣを、分析Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ クロマトグラフィーの場合と同じＡｋｔａ ＥｘｐｌｏｒｅｒシステムとＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）ＸＫ２６ Ｈｉｌｏａｄ ２６／６０ ｐｒｅｐ−ｇｒａｄｅカラムを用いて実施した。均一濃度溶離を５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて流量１．３２ｍＬ／ｍｉｎで実施した。
【００８０】
五糖複合物とＡＴＩＩＩ、抗インスリン抗体及びインスリン受容体との結合試験をＢＩＡ法によって実施した。センサーグラム及び記録点を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．２によってブランク（ｂｌａｎｃ）のフローセルを減算して分析した。ＩＣ５０値をｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０によって計算した。
【００８１】
Ａ２８０測定をＮａｎｏ Ｄｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００ ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を用いて実施した。
【００８２】
スキーム１． 化合物４の合成
【００８３】
【化１９】
【００８４】
（実施例１）
６−（２−ヨード−アセチルアミノ）−ヘキサン酸（２）
６−アミノ−ヘキサン酸（１）（０．３７ｇ、２．８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（６０ｍＬ）懸濁液に無水ヨード酢酸（０．５０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５０℃で３時間及び周囲温度で１６時間撹拌した。その後、ＴＬＣ分析（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、９８／１０／１、ｖ／ｖ／ｖ）によって、化合物１が親油性（ｌｙｐｏｐｈｉｌｉｃ）のより低い生成物に完全に転化したことを確認した。ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を添加し、反応混合物を０．１０Ｍ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。次いで、有機層を塩水（５０ｍＬ）で２回洗浄し、混合水層をＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）で２回抽出した。混合有機層を脱水（ＭｇＳＯ４）し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、９８／１０／１、ｖ／ｖ／ｖ）にかけて、６−（２−ヨード−アセチルアミノ）−ヘキサン酸（２）（０．４５ｇ、＞１００％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：δ ３．６７（ｓ、２Ｈ）、３．１７（ｔ、２Ｈ）、２．２９（ｔ、２Ｈ）、１．６６−１．３３（ｍ、６Ｈ）。
【００８５】
（実施例２）
６−（２−ヨード−アセチルアミノ）−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（３）
６−（２−ヨード−アセチルアミノ）−ヘキサン酸（２）（０．２０ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（８５ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２１ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を暗所で１６時間撹拌した。ＴＬＣ分析（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ／ＡｃＯＨ、８０／２０／１、ｖ／ｖ／ｖ）によって活性化エステル３への完全な転化を確認した後、酢酸７滴を添加した。次いで、混合物を冷凍庫に終夜保存した（−２０℃）。粗製混合物をろ過し、ろ液を濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ／ＡｃＯＨ、４０／６０／５→２０／８０／５、ｖ／ｖ／ｖ）によって精製し、適切な画分を濃縮して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体３（０．１８ｇ、６７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：δ ３．６７（ｓ、２Ｈ）、３．１８（ｔ、２Ｈ）、２．８２（ｓ、４Ｈ）、２．６３（ｔ、２Ｈ）、２．０−１．０（ｍ、６Ｈ）。
【００８６】
（実施例３）
化合物４
ｒｅｃＨインスリン（５０ｍｇ、８．６μｍｏｌ）のＤＭＦ（１５ｍＬ）懸濁液に溶液が透明になるまでＨ２Ｏ（９．０ｍＬ）を添加した。溶液を１５分間撹拌して、室温に調節した。０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を滴下して、溶液のｐＨを１０に調節した。その後、反応フラスコをスズ箔で包んだ。３（５．０ｍｇ、８．６μｍｏｌ）のＤＭＦ（１．０ｍＬ）溶液を反応混合物に１分間滴下した。反応混合物を磁気撹拌子で撹拌し、ｐＨを１０に維持した。３０分後、過剰の０．１％ＴＦＡ水溶液（５．０ｍＬ）を添加して、反応をクエンチした。Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）を添加し、反応混合物を凍結乾燥して、４（６０ｍｇ、＞１００％、最高８．６μｍｏｌ）を得た。溶離剤Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）８０％と溶離剤Ｂ（ＡＣＮ）２０％で５分間開始し、次いで溶離剤Ａ ２０％と溶離剤Ｂ ８０％までの勾配を３０分間適用したＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、逆相）分析によって、４５％の一置換生成物の存在が明らかになった（ｒｅｃＨインスリン Ｒｔ：１２．８４ｍｉｎ；化合物４ Ｒｔ：１３．５４ｍｉｎ；Ｂ２９／Ａ１二置換生成物：Ｒｔ １４．１６ｍｉｎ）。粗製生成物を精製せずに次の反応に使用した。
【００８７】
（実施例４）
化合物６
粗製化合物４（６０ｍｇ）を、（Ｎ２を通して）脱気した０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝剤（２５ｍＬ、ｐＨ７．０）中の０．０５Ｍ ＮＨ２ＯＨ溶液に溶解させた。反応混合物を磁気撹拌子で撹拌し、（Ｎ２を通して）３０分間脱気した。次いで、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ．（１９９６）， ３５， ３３１−３３３に記載のように調製した五糖−スペーサー化合物５（９５ｍｇ、４３μｍｏｌ）を固体として添加し、反応混合物を窒素雰囲気下で１６時間撹拌した。
【００８８】
スキーム２． 化合物６の合成
【００８９】
【化２０】
【００９０】
五糖−インスリン複合物６の精製。
【００９１】
前段落の反応混合物から、一置換五糖−インスリン複合物６を、陰イオン交換クロマトグラフィー（捕捉段階）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ポリッシング段階）によって精製してほぼ均一にした。
【００９２】
複合物含有溶液を、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝剤ＰＨ８．０で平衡にしたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムにかけた。保持されないタンパク質画分がカラムを通過した後、Ａ２８０がベースラインレベルに戻るまで平衡緩衝剤で徹底して洗浄した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０を用いた分析ＨＰ−ＳＥＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで測定して、結合した未反応のインスリンは約０．４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌで溶出し、一置換五糖−インスリン複合物は０．７ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌで溶出した。複合物画分を、限外ろ過又は２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌバンプ（ｂｕｍｐ）を溶出段階として用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって濃縮し、リン酸緩衝食塩水で平衡にした分取Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０カラムにかけた。ＨＰ−ＳＥＣ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳで測定して、純粋なモノ複合物（ｍｏｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含む画分をプールした。最終生成物をエタノール／ドライアイス混合物中で瞬間凍結（ｓｎａｐｆｒｅｅｚｉｎｇ）後、−７０℃で保存した。複合物濃度を、１ｍｇ／ｍＬに対する吸光度係数０．８を用いたＡ２８０測定によって推定した。
【００９３】
化合物６のキャラクタリゼーション
精製五糖−インスリン複合物６の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をインスリンのＥＬＩＳＡによって、また、ヒトインスリン受容体とヒトＡＴＩＩＩを分析物として用いた生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）によって求めた。純度及び単量体性（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃｉｔｙ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０を用いたＨＰ−ＳＥＣ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳによって評価した。
【００９４】
図１に示すように、２バッチの五糖−インスリン複合物６がインスリン特異的ＥＬＩＳＡによって識別される。これは、免疫反応性インスリン部分が存在することを示している。ＢｉａｃｏｒｅにおけるＢＩＡ実験から、五糖と複合化したインスリンは、依然としてヒトインスリン受容体に結合することができると結論することができる（図２Ａ）。これらの実験においては、ヒトインスリンに対するＭｏＡｂ（クローンＭ３２２２２１３、１０−１３０、バッチ２２３、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＭｏＡｂ １３と命名）を、標準アミノカップリングによってＣＭ５センサーチップ上に固定した。ＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号２２−０５１２−４４）を泳動緩衝剤として流量５μＬ／ｍｉｎで用いた。インスリン複合物を注射すると、複合物と固定化抗体が結合した。免疫結合したインスリン複合物は、ヒトインスリン受容体及びＡＴＩＩＩと反応することができた。後者は、共有結合した五糖を表す（図２Ｂ）。
【００９５】
五糖−インスリン複合物６のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを、材料及び方法の項に記載したように得た。分析前に、試料を脱塩し、μＣ１８−ＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ、ＵＳＡ）で濃縮した。溶出は、５００ｍＬ／Ｌ ＡＣＮ／１ｍＬ／Ｌ ＴＦＡ中の１０ｇ／Ｌアルファ−シアノを含有する溶液１μＬを用いて、ステンレススチールＭＡＬＤＩ標的に対して直接的であった。図３は、ｍ／ｚ６７００及び７４００の周囲のピークを含む、一置換五糖−インスリン複合物の典型的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳプロファイルである。見掛け上の不均一性は、８０Ｄａの段階的損失をもたらす、レーザーにより誘導された五糖部分の脱硫酸化（ｄｅｓｕｌｆａｔａｔｉｏｎ）によって生じる。二置換インスリンに特徴的なｍ／ｚ９４００の範囲にピークが存在せず、二置換五糖−インスリン複合物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析では見出されなかった。未反応インスリンのピークも存在しないことに注意すべきである（ｍ／ｚ５８０８）。
【００９６】
ＨＰ−ＳＥＣ分析（図４）は、保持時間２２分の主ピークを示している。純度は９７％と推定された。（未反応インスリン及び二置換複合物は存在しないと考えられる。）。
【００９７】
（実施例５）
化合物１１
五糖７（４６ｍｇ）［五糖７は、国際公開第２００１／４２２６２号に記載の誘導体化された単糖５と、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９９４）， ２， １２６７−１２８０に記載の四糖３０を生成する合成経路を実施することによって得られる四糖とのカップリングによって得ることができる。ここで、還元性末端の単糖構成要素１２は、脱保護及び硫酸化を含めて、これらの刊行物に記載の方法と類似の方法によって、メチル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコースで置換される。］及びグリコール誘導体１０（１８ｍｇ、１．６当量）をＤＭＦ（５ｍＬ）に窒素雰囲気下で溶解させた。ＮＭＭ（６１μＬ、５当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を分取陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。適切な画分を混合し、分取Ｇ２５カラムで脱塩した。混合画分を凍結乾燥させて、１１（２９ｍｇ、５７％）を白色粉末として得た。純度＞９８％（分析陰イオン交換、ＵＶ２１０ｎｍ）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ５．３１（ｄ、１Ｈ）、５．２３（ｍ、１Ｈ）、４．９１（ｍ、１Ｈ）、４．４５−４．３５（ｍ、１Ｈ）、４．４８−３．９３（ｍ、１１Ｈ）、３．８７−３．６２（ｍ、９Ｈ）、３．６０−３．４５（ｍ、３９Ｈ）、３．４１−３．３４（ｍ、１５Ｈ）、３．３３−３．２３（ｍ、７Ｈ）、３．１８−３．０８（ｍ、２Ｈ）、２．９７（ｔ、２Ｈ）、２．２３（ｓ、３Ｈ）。
【００９８】
（実施例６）
化合物１２
国際公開第２００１／４２２６２号に記載のように調製した五糖８（０．２ｇ）及びＡｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ．（１９９６）， ３５， ３３１−３３３に記載のように調製したグリコール誘導体１０（５３ｍｇ、１．３当量）をＤＭＦ（５．０ｍＬ）に溶解させた。ＮＭＭ（６１μＬ、５当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を分取陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。適切な画分を混合し、分取Ｇ２５カラムで脱塩した。混合画分を凍結乾燥させて、１２（０．１３ｇ、５５％）を白色粉末として得た。純度＞９５％（分析陰イオン交換、ＵＶ２１０ｎｍ）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ５．１２（ｄ、１Ｈ）、５．０３（ｄ、１Ｈ）、４．７０（ｄ、１Ｈ）、４．３４−４．１８（ｍ、２Ｈ）、４．０９−４．０３（ｍ、１Ｈ）、３．９８−３．９０（ｍ、５Ｈ）、３．８５−３．７４（ｍ、６Ｈ）、３．６６−３．４８（ｍ、７Ｈ）、３．４３−３．２４（ｍ、４１Ｈ）、３．２３−３．１５（ｍ、１３Ｈ）、３．１２（ｍ、２Ｈ）、３．１０−３．０１（ｍ、７Ｈ）、２．９９−２．８８（ｍ、３Ｈ）、２．７８（ｔ、２Ｈ）、２．０４（ｓ、３Ｈ）。
【００９９】
（実施例７）
化合物１４
五糖９（１００ｍｇ）［五糖９は、国際公開第０１／４２２６２号に記載の誘導体化された単糖５と、米国特許出願公開第２００４／００２４１９７号に記載の四糖４８との、脱保護及び硫酸化を含めて、これらの特許出願に記載の方法と類似の方法を用いたカップリングによって得ることができる。］及び化合物１３（１８ｍｇ、１．５当量）をＤＭＦに溶解させた。ＮＭＭ（１５μＬ、２．５当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を分取Ｇ２５カラムによって精製した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、１４（８４ｍｇ、７９％）を白色粉末として得た。純度＞９５％（分析陰イオン交換、ＵＶ２１０ｎｍ）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ５．１２（ｄ、１Ｈ）、５．０９（ｄ、１Ｈ）、４．８２（ｄ、１Ｈ）、４．４０−４．２６（ｍ、１Ｈ）、４．１０−３．８７（ｍ、８Ｈ）、３．８２−３．７３（ｍ、４Ｈ）、３．６７−３．４３（ｍ、１１Ｈ）、３．４１−３．３５（ｍ、１４Ｈ）、３．３１−３．２６（ｍ、１３Ｈ）、３．２４−３．１５（ｍ、８Ｈ）、３．１４−３．０２（ｍ、５Ｈ）、３．０１−２．８７（ｍ、３Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ）。
【０１００】
スキーム３． 五糖スペーサー誘導体１１、１２及び１４の合成。
【０１０１】
【化２１】
【０１０２】
（実施例８）
化合物１５
ＲｅｃＨインスリン（７７９ｍｇ）を無水ＤＭＳＯ（２５ｍＬ）及びＡｃＯＨ（４６５μＬ）に溶解させた。Ｂｏｃ２Ｏ（７３ｍｇ、２．５当量）を溶液に添加し、生成した混合物を周囲温度で５時間撹拌した。０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／１、ｖ／ｖ、１５０ｍＬ）溶液を添加して反応をクエンチし、溶液を４回凍結乾燥させた。残渣を０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／ｌ）／ＡＣＮ（３：１）溶液に溶解させ、主生成物を分取ＨＰＬＣによって単離した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、Ａ１，Ｂ１−ジＢｏｃインスリン１５（２００ｍｇ、２６％）を白色粉末として得た。純度：９８％（分析ＨＰＬＣ）。Ｃ２６７Ｈ３９９Ｎ６５Ｏ８１Ｓ６のＭＳ計算値＝６００８、（ｒｅｃＨインスリンを内部比較基準として用いた）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実測値６００８。
【０１０３】
（実施例９）
化合物１６
ＲｅｃＨインスリン（７５２ｍｇ）を無水ＤＭＳＯ（２０ｍＬ）及びＴＥＡ（０．７５ｍＬ）に溶解させた。Ｂｏｃ２Ｏ（６６ｍｇ、２．５当量）のＤＭＳＯ（５ｍＬ）溶液を溶液に添加し、反応物を周囲温度で１．５時間撹拌した。０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／１、ｖ／ｖ、１５０ｍＬ）溶液を添加して反応をクエンチし、混合物を３回凍結乾燥させた。生成した残渣を０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／１）に溶解させ、分取ＨＰＬＣに供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、Ａ１，Ｂ２９−ジＢｏｃインスリン１６を白色粉末として得た（３３２ｍｇ、４３％）。純度：＞９８％（分析ＨＰＬＣ）。Ｃ２６７Ｈ３９９Ｎ６５Ｏ８１Ｓ６のＭＳ計算値＝６００８、（ｒｅｃＨインスリンを内部比較基準として用いた）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実測値６００８。
【０１０４】
（実施例１０）
化合物１７
Ａ１，Ｂ１−ジＢｏｃインスリン１５（２００ｍｇ）を無水ジメチルスルホキシド（５ｍＬ）及びトリエチルアミン（１４５μＬ）に溶解させた。ＧＭＢＳ（４５ｍｇ、５当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で３０分間撹拌した。０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／１、ｖ／ｖ、１５０ｍＬ）を添加して反応混合物をクエンチし、生成した混合物を凍結乾燥させて、Ａ１，Ｂ１−ジＢｏｃ−Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１７（０．５ｇ、粗製）を得た。これをさらに精製せずに次の段階に使用した。
【０１０５】
（実施例１１）
化合物１８
Ａ１，Ｂ２９−ジＢｏｃインスリン１６（３３０ｍｇ）を無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）及びＴＥＡ（３３２μＬ）に溶解させた。ＧＭＢＳ（２３０ｍｇ、１５当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で３０分間撹拌した。０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／１、ｖ／ｖ、１５０ｍＬ）溶液を添加して反応混合物をクエンチし、生成した溶液を凍結乾燥させて、Ａ１，Ｂ２９−ジＢｏｃ−Ｂ１−ＧＭＢインスリン１８（０．６ｇ、粗製）を得た。これをさらに精製せずに次の段階に使用した。
【０１０６】
（実施例１２）
化合物１９
Ａ１，Ｂ１−ジＢｏｃ−Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１７（０．５ｇ、粗製）をＴＦＡ（５ｍＬ）に溶解させ、周囲温度で１０分間撹拌した。ＴＦＡを減圧除去し、残渣を０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（２／１、ｖ／ｖ）溶液に溶解させ、溶液をすぐに分取ＨＰＬＣに供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１９を白色粉末として得た（９３ｍｇ、４７％）。純度 ＞９９％（分析ＨＰＬＣ）。
【０１０７】
（実施例１３）
化合物２０
Ａ１，Ｂ２９−ジＢｏｃ−Ｂ１−ＧＭＢインスリン１８（０．６ｇ、粗製）をＴＦＡ（５ｍＬ）に溶解させ、混合物を周囲温度で１０分間撹拌した。ＴＦＡを減圧蒸発させ、粗生成物を０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／２、ｖ／ｖ）溶液に溶解させ、生成溶液をすぐに分取ＨＰＬＣに供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、Ｂ１−ＧＭＢインスリン２０を白色粉末として得た（１２７ｍｇ、４０％）。純度 ＞９９％ 分析ＨＰＬＣ）。Ｃ２６７Ｈ３９９Ｎ６５Ｏ８１Ｓ６のＭＳ計算値＝５９７３、（ｒｅｃＨインスリンを内部比較基準として用いた）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実測値５９７３。
【０１０８】
（実施例１４−１９）
ＧＭＢ−インスリンと五糖の複合化の一般的手順
ＧＭＢ−インスリン１９又は２０（２５ｍｇ）を０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝剤（１２ｍＬ、ｐＨ７．０、Ｎ２を溶液に通して脱気）に溶解させた。溶液を磁気撹拌子で撹拌し、さらに３０分間脱気した。次いで、五糖５、１１、１２又は１４（２３ｍｇ、２．５当量）を固体として添加し、続いてＮＨ２ＯＨ（５０μＬ、０．０５Ｍ）を添加した。反応混合物を窒素雰囲気下で周囲温度で撹拌した。１６時間後、反応混合物を分取ＨＰＳＥＣ（Ｓ７５）に供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、インスリン−ペンタ複合物２４、２５、２６、２７、２８、２９を白色粉末として、３０％−５０％の典型的な収率で得た。収率は、Ａ２８０測定によってｒｅｃＨインスリンの場合と同じモル吸光係数を用いて求めた。
【０１０９】
（実施例１４）
化合物２４
Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１９（２５ｍｇ）を五糖５（２３ｍｇ）と一般的手順に従って複合化して、Ｂ２９−五糖インスリン誘導体２４（１５ｍｇ、４５％）を得た。Ｃ３２０Ｈ４８７Ｎ６７Ｏ１３７Ｓ１４のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝７９１３、Ｑ−ＴＯＦによる実測値２６３８．７ Ｍ３＋；１９７９．２ Ｍ４＋；１５８３．６ Ｍ５＋、１３１９．８ Ｍ６＋。純度：＞９８％（分析ＨＰＳＥＣ、分析陰イオン交換）。
【０１１０】
（実施例１５）
化合物２５
Ｂ１−ＧＭＢインスリン２０（２５ｍｇ）を五糖５（２３ｍｇ）と一般的手順に従って複合化して、Ｂ１−五糖インスリン誘導体２５（１６ｍｇ、４７％）を得た。Ｃ３２０Ｈ４８７Ｎ６７Ｏ１３７Ｓ１４のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝７９１３、Ｑ−ＴＯＦによる実測値２６３７ Ｍ３＋；１９７８ Ｍ４＋；１５８３ Ｍ５＋。純度：＞９５％（分析ＨＰＳＥＣ）、＞９８％（分析陰イオン交換）。
【０１１１】
（実施例１６）
化合物２６
Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１９（１３ｍｇ）を五糖１４（１２ｍｇ）と一般的手順に従って複合化して、Ｂ２９−五糖インスリン誘導体２６（５ｍｇ、３１％）を得た。Ｃ３１２Ｈ４７１Ｎ６７Ｏ１３３Ｓ１４のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝７７３７、Ｑ−ＴＯＦによる実測値２５７８ Ｍ３＋；１９３４ Ｍ４＋。純度：＞９８％（分析ＨＰＳＥＣ）。
【０１１２】
（実施例１７）
化合物２７
Ｂ１−ＧＭＢインスリン２０（１５ｍｇ）を五糖１４（１３ｍｇ）と一般的手順に従って複合化して、Ｂ１−五糖インスリン誘導体２７（８ｍｇ、４０％）を得た。Ｃ３１２Ｈ４７１Ｎ６７Ｏ１３３Ｓ１４のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝７７３７、Ｑ−ＴＯＦによる実測値２５７８ Ｍ３＋；１９３４ Ｍ４＋。純度：＞９８％（分析ＨＰＳＥＣ）。
【０１１３】
（実施例１８）
化合物２８
Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１９（１５ｍｇ）を五糖１２（１３ｍｇ）と一般的手順に従って複合化して、Ｂ２９−五糖インスリン誘導体２８（６ｍｇ、３０％）を得た。Ｃ３２１Ｈ４８９Ｎ６７Ｏ１３４Ｓ１３のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝７８４７、Ｑ−ＴＯＦによる実測値１９６２ Ｍ４＋；１５７０ Ｍ５＋；１３０８ Ｍ６＋。ＨＰＳＥＣ純度：＞９８％。
【０１１４】
（実施例１９）
化合物２９
Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１９（１５ｍｇ）を五糖１１（１３ｍｇ）と一般的手順に従って複合化して、Ｂ２９−五糖インスリン誘導体２９（７ｍｇ、３３％）を得た。Ｃ３２２Ｈ４９１Ｎ６７Ｏ１３１Ｓ１２のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝７７８２、Ｑ−ＴＯＦによる実測値２５９３ Ｍ３＋；１９４５ Ｍ４＋；１５５６ Ｍ５＋。純度：＞９８％（分析ＨＰＳＥＣ）。
【０１１５】
スキーム４． インスリン−五糖複合物２４−２９の合成
【０１１６】
【化２２】
【０１１７】
キャラクタリゼーション
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
化合物２４−２９をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ２６／１０カラムを用いた分析的なＨＰ−ＳＥＣ分析に供した。５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて流量１．０ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。
【０１１８】
表１． インスリン複合物２４−２９のＨＰＳＥＣ分析
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
全ての複合物が単一ピーク（少なくとも＞９５％純度）として観測され、インスリン−五糖の凝集体が存在しないことを示している。
【０１２１】
Ｎ末端配列解析
インスリン−五糖複合物２４−２９並びに対応する前駆体１５、１６、１９及び２０をＮ末端配列解析（エドマン分解）に供した。実施したサイクルの各々において、Ｂ２９が置換されたインスリン誘導体１５、１９、２４、２６、２８及び２９は、複合物の初期量のレベルに匹敵するレベルでＡ鎖アミノ酸とＢ鎖アミノ酸の等モル量を生成した。これは、両方のＮ末端の利用性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）が十分であることを示し、したがってＢ２９位に限定される複合部分が存在しないことを示している。これに対し、Ｂ１が置換されたインスリン誘導体１６、２０、２５及び２７のＮ末端配列決定中にはＡ鎖アミノ酸しか見出されなかった。これは、Ｂ鎖のＮ末端におけるエドマン分解が結果として阻害されたＢ１位における複合化を示している。
【０１２２】
生体分子間相互作用解析を用いた競合的ｈＡＴＩＩＩ結合アッセイ
試験の原理及び目的：生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）は、相互作用物の一方をセンサーチップ表面に共有結合によって固定し、もう一方の相互作用物をこの表面を連続して流れる緩衝剤に注入することによって、（生体）分子間の相互作用を試験する。結合は、この表面での屈折率の変化として記録され、相互作用物の分子量（Ｍｗ）に比例する。
【０１２３】
ｈＡＴＩＩＩと五糖複合物の相互作用を試験するために、化合物９をセンサーチップ表面に共有結合させる。ｈＡＴＩＩＩと五糖が結合することによって、結合した（小さい）五糖リガンドと（大きい）ｈＡＴＩＩＩ分析物とのＭｗの差の結果として、強い信号が発生する。一定濃度のｈＡＴＩＩＩと可変濃度の遊離五糖又は複合物とを含む、プレインキュベートした試料を表面全体に注入する。プレインキュベーション中に五糖又は複合物とＡＴＩＩＩが結合すると、固定化五糖に結合するＡＴＩＩＩが減少する。この競合結合アッセイによって、各五糖複合物のＩＣ５０値を求めることができる。
【０１２４】
実験手順：化合物９をアミンカップリングによってｐＨ８．５でＣＭ５センサーチップに共有結合させる。センサーチップをＥＤＣ／ＮＨＳによって１５分間活性化させ、続いて化合物９を濃度１００μｇ／ｍＬで注入する。未反応ヒドロキシスクシンイミド基をエタノールアミンと７分間反応させる。５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ ５μＬを流量２５μＬ／ｍｉｎで３回短時間注入して表面を再生させる。五糖の固定化を検出することはできないが、上記のように処理した表面とｈＡＴＩＩＩの結合は特異的であることが判明した。これは、表面に五糖が存在することを示している。一連の濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓ）のｈＡＴＩＩＩを試験して、（最大結合量の８０％において）阻害に敏感な濃度を推定した。ブランク（ｂｌａｎｃ）及び固定化表面に流量２０μＬ／ｍｉｎで２５℃で順次３分間注入した。記録点を１７０秒にする。５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを１２秒間注入して表面を再生する。
【０１２５】
試料を、一定濃度のｈＡＴＩＩＩ（すなわち１５ｎｍｏｌ／Ｌ）と０．７８−１００ｎＭの濃度の五糖複合物に対して試験する。五糖複合物のないｈＡＴＩＩＩ注入又は記録点を１００％結合とする。最大結合量に対する五糖と複合物の相対結合％を用い、Ｌｏｇ［濃度］と結合％をプロットすることによって（可変勾配を有する）Ｓ字曲線を作成した。このＳ字曲線からＩＣ５０値を得た。
表２． 競合結合アッセイ（ＢＩＡ試験）における潜在的ＡＴＩＩＩ結合能力を表すＩＣ５０値
【０１２６】
【表２】
【０１２７】
結論 − 基準担体五糖７−９（図５、表２）間のＩＣ５０の差から、ＡＴＩＩＩに対する結合親和性の尺度である、ＡＴＩＩＩに対する潜在的競合結合能力を、これらの分子中の硫酸基数を変えることによって調整できることが確認される。ｈＡＴＩＩＩに対する全ての対応するインスリン−五糖複合物（２４−２９）の潜在的（競合）結合能力（ＩＣ５０）は、親の基準五糖７−９と比較して同じ範囲にある（図６、表２）。これらのデータによれば、複合物の薬物動態特性は、ＡＴＩＩＩに対して異なる結合親和性を有する代替の担体五糖を用いることによって調整することができる。
【０１２８】
質量分析法
五糖複合物の質量分析法による典型的な分析結果を図７に示す。例えば、総計の式（ｂｒｕｔｏ ｆｏｒｍｕｌａ）Ｃ３２０Ｈ４８７Ｎ６７Ｏ１３７Ｓ１４及びモノアイソトピック質量計算値７９１３を有する化合物２４をＥＳＩ−ＱＴＯＦシステムで分析した。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルでは、ｒｅｃＨインスリンの電荷分布と一致するｍ／ｚ比１３１９．８（６＋）、１５８３．６（５＋）、１９７９．２（４＋）、２６３８．７（３＋）の複数の荷電イオンが出現した。また、Ｃ３２０Ｈ４８７Ｎ６７Ｏ１３７Ｓ１４（化合物２４）に対して無作為に選択した２価以上の荷電ピーク（例えば５＋）の同位体分布は、Ｉｓｏｐｒｏプログラムを用いて理論計算した同位体分布（図７Ａの点線を参照）と一致する。
【０１２９】
ＧｎＲＨ拮抗デカペプチドと五糖の一般的複合化手順（実施例２０、２１、２４、２５）
ガニレリクス誘導体（ｄｅｒｖａｔｉｖｅ）３０又は３５（７０ｍｇ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に窒素雰囲気下で溶解させた。ＴＢＴＵ（１４ｍｇ、１．０５当量）及びＮＭＭ（２５μＬ、５当量）を添加し、混合物を周囲温度で１時間撹拌した。五糖８又は９（８８ｍｇ、１．１当量）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解させて、懸濁液を得た。この懸濁液を反応混合物に添加し、残りの混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。反応混合物を水（２００ｍＬ）で希釈し、凍結乾燥させた。生成した残渣を、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７）を用いた逆相シリカ（Ｃ１８）にかけ、１０から５０％ＡＣＮの勾配でブロック溶出（ｂｌｏｃｋ−ｅｌｕｔｉｏｎ）させて精製した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、ガニレリクス五糖複合物３１、３２、３６又は３７を白色粉末として得た。勾配溶出による分析ＨＰＬＣを、溶離剤Ａ（０．０１Ｍ酢酸アンモニウム）９０％と溶離剤Ｂ（ＡＣＮ）１０％で５分間開始し、次いで溶離剤Ｂ １００％までの勾配を３０分間適用して実施した。
【０１３０】
（実施例２０）
化合物３１
Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９２， ３５， ３９４２−３９４８に記載の固相ペプチド合成によって調製したガニレリクス誘導体３０（７０ｍｇ）を、一般的手順に従って五糖８（８８ｍｇ）と複合化して、３１（１６ｍｇ、４０％）を得た。純度９６％（分析ＨＰＬＣ）、９７％（分析陰イオン交換）。Ｃ１２６Ｈ１９１ＣｌＮ１８Ｏ６２Ｓ６のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝３１７５．０３５９、実測値７９２．７３９０［Ｍ−４Ｈ］４−、１０５７．３２５８［Ｍ−３Ｈ］３−、１０６２．９８８３［Ｍ＋ＮＨ３−３Ｈ］３−。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ８．５６（ｍ、１Ｈ）、８．５３（ｍ、１Ｈ）、８．１０（ｍ、１Ｈ）、７．７６（ｍ、２Ｈ）、７．６８（ｍ、２Ｈ）、７．４７（ｍ、１Ｈ）、７．３９（ｍ、２Ｈ）、７．１６（ｍ、３Ｈ）、７．０４（ｍ、２Ｈ）、６．９５（ｍ、２Ｈ）、６．６３（ｍ、２Ｈ）、５．３５−５．２５（ｍ、２Ｈ）、４．９５（ｍ、１Ｈ）、４．６８−４．６１（ｍ、１Ｈ）、４．６１−４．５１（ｍ、２Ｈ）、４．５０−４．３８（ｍ、２Ｈ）、４．３８−４．２５（ｍ、３Ｈ）、４．２４−３．９６（ｍ、１５Ｈ）、３．９０−３．８４（ｍ、１Ｈ）、３．８４−３．６７（ｍ、８Ｈ）、３．６７−３．２０（ｍ、５３Ｈ）、３．１９−３．０９（ｍ、４Ｈ）、３．０９−２．９８（ｍ、１２Ｈ）、２．９８−２．８４（ｍ、８Ｈ）、２．７７（ｍ、２Ｈ）、２．１３（ｍ、１Ｈ）、１．９６−１．７２（ｍ、５Ｈ）、１．６８−１．４２（ｍ、５Ｈ）、１．４２−１．２０（ｍ、７Ｈ）、１．１８−０．８９（ｍ、１３Ｈ）、０．８５−０．７１（ｍ、５Ｈ）。
【０１３１】
（実施例２１）
化合物３２
ガニレリクス誘導体３０（７０ｍｇ）を一般的手順に従って五糖９（８８ｍｇ）と複合化して３２（５２ｍｇ、３５％）を得た。Ｃ１２５Ｈ１８９ＣｌＮ１８Ｏ６５Ｓ７の質量計算値＝３２４０．９７７０；ＥＳＩ−ＱＴＯＦによる実測値８０９．２２１９［Ｍ−４Ｈ］４−、１０７９．２９９４［Ｍ−３Ｈ］３−、１０８４．９７３９［Ｍ＋ＮＨ３］３−、１０９０．６３４０、［Ｍ＋２ＮＨ３−３Ｈ］３−。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ８．４５（ｍ、１Ｈ）、８．３８（ｍ、１Ｈ）、７．９０（ｍ、１Ｈ）、７．７８（ｄ、１Ｈ）、７．７３（ｍ、２Ｈ）、７．５９（ｍ、１Ｈ）、７．５０（ｍ、１Ｈ）、７．４３（ｍ、２Ｈ）、７．２０（ｍ、３Ｈ）、７．０５（ｄ、２Ｈ）、６．９７（ｍ、２Ｈ）、６．６６（ｍ、２Ｈ）、５．４０−５．３０（ｍ、２Ｈ）、５．０９（ｄ、１Ｈ）、４．６７−４．４８（ｍ、２Ｈ）、４．４０−３．９２（ｍ、１８Ｈ）、３．９２−３．７５（ｍ、７Ｈ）、３．７７−３．１７（ｍ、５６Ｈ）、３．１２−３．０２（ｍ、１１Ｈ）、３．０２−２．９８（ｍ、８Ｈ）、２．９７−２．８３（ｍ、４Ｈ）、２．８１−２．７５（ｍ、２Ｈ）、２．１４（ｍ、１Ｈ）、１．９９−１．８６（ｍ、５Ｈ）、１．８２−１．２３（ｍ、１２Ｈ）、１．２２−０．９０（ｍ、１３Ｈ）、０．８７−０．７２（ｍ、５Ｈ）。純度：９５％（分析ＨＰＬＣ）、９７％（分析陰イオン交換純度）。
【０１３２】
（実施例２２）
化合物３４
化合物３０（１００ｍｇ）をＤＭＦに溶解させた。ＴＢＴＵ（３６ｍｇ、２当量）及びＮＭＭ（６０μＬ、１０当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で１時間撹拌した。次いで、国際公開第２００５０９０３８２号に記載のように調製した化合物３３（３４ｍｇ、２当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を水／ＣＡＮに溶解させ、生成した溶液を分取ＨＰＬＣ（勾配：溶離剤Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）８０％と溶離剤Ｂ（ＡＣＮ）２０％から溶離剤Ａ ２０％と溶離剤Ｂ ８０％まで４５分間）に供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、化合物３４（６０ｍｇ、６０％）を白色粉末として得た。分析ＨＰＬＣを、溶離剤Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）７５％と溶離剤Ｂ（ＣＨ３ＣＮ）２５％から溶離剤Ａ ２０％と溶離剤Ｂ ８０％までの勾配を１５分間適用して実施した。Ｃ９４Ｈ１３９ＣｌＮ１８Ｏ１９の質量計算値＝１８５９、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実測値１８６０［Ｍ＋Ｈ］＋及び１８８２［Ｍ＋Ｎａ］＋。純度：＞９０％（分析ＨＰＬＣ）。
【０１３３】
（実施例２３）
化合物３５
化合物３４（６０ｍｇ）をＨ２Ｏ／ＴＦＡ／ＡＣＮ（７ｍＬ、５：１：１）に溶解させ、周囲温度で２時間撹拌した。過剰量のＴＦＡ（２．５ｍＬ）を添加し、反応混合物をさらに２２時間撹拌した。ＴＦＡを減圧蒸発させ、残りの溶液を凍結乾燥させて、３５（４５ｍｇ、７７％）を白色粉末として得た。Ｃ９０Ｈ１３１ＣｌＮ１８Ｏ１９の質量計算値＝１８０３、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実測値１８０４［Ｍ＋Ｈ］＋及び１８２６［Ｍ＋Ｎａ］＋。純度：＞９５％（分析ＨＰＬＣ）。
【０１３４】
（実施例２４）
化合物３６
ガニレリクス誘導体３５（１７ｍｇ）を五糖８（１９ｍｇ）と一般的手順に従って複合化した。さらなる精製を分取ＨＰＬＣ（勾配：溶離剤Ａ（０．０１Ｍ酢酸アンモニウム）９０％と溶離剤Ｂ（ＣＨ３ＣＮ）１０％を５分間、次いでＢ １００％まで５０分間）によって実施した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、３６（２ｍｇ、６％）を得た。純度：９４％（分析ＨＰＬＣ）、＞９８％（分析陰イオン交換）。
【０１３５】
（実施例２５）
化合物３７
ガニレリクス誘導体３５（１７ｍｇ）を五糖９（１９ｍｇ）と一般的手順に従って複合化した。さらなる精製を、化合物３６の場合と同様に、分取ＨＰＬＣによって実施した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、３７（１．１６ｍｇ、３％）を得た。純度：８８％（分析ＨＰＬＣ）。分析陰イオン交換純度：＞９５％。
【０１３６】
スキーム５． 化合物３１、３２、３６及び３７の合成。
【０１３７】
【化２３】
【０１３８】
結論：（図８に示す）複合物３１及び３２と複合物３６及び３７とのＡＴＩＩＩに対する潜在的競合結合能力の差は、連結残基の長さに無関係に、ＡＴＩＩＩに対する親和性を、これらの分子に含まれる硫酸基数を変えることによって調整できることを示している。さらに、これらのデータによれば、これらの複合物のインビボでの薬物動態特性が五糖を選択することによって調整することができる（下記の薬物動態試験参照）。また、複合化されていない親ペプチドガニレリクスがＡＴＩＩＩと競合結合を示さないことから、複合物とＡＴＩＩＩの結合は特異的である。
【０１３９】
（実施例２４）
化合物３９
ＮｅｏＭＰＳ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）によって供給される化合物３８（２６．５ｍｇ、８．４μｍｏｌ）を、脱気した０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝剤（１６ｍＬ、ｐＨ７．０）に溶解させた。五糖５（４５．５ｍｇ、２１μｍｏｌ、２．５当量）を窒素雰囲気下で添加し、生成した混合物を約１０分間撹拌した。次いで、ＮＨ２ＯＨ水溶液（５０ｗｔ％、６９μＬ）を添加し、反応混合物を１６時間撹拌した。生成物をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２Ｍ ＮａＣｌ（ａｑ）／Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ、１０／４０／１→４０／１０／１、ｖ／ｖ／ｖ）によって精製した。適切な画分を、上述したようにＧ２５ ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーによって脱塩して、化合物３９（１５．７ｍｇ、３５％）を得た。収率は、１ｍｇ／ｍＬ溶液に対する理論吸光度０．４８を用いてＡ２８０測定によって求めた。Ｃ１９６Ｈ３０９Ｎ４１Ｏ１０１Ｓ８の質量計算値＝５１０８．８；ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦによる実測値＝１７４０．６［Ｍ＋５Ｎａ］３＋、１３１１．２［Ｍ−１Ｈ＋６Ｎａ］４＋、１０５３．５［Ｍ−２Ｈ＋７Ｎａ］５＋
スキーム６． 化合物３９の合成
【０１４０】
【化２４】
【０１４１】
結論：図９に示すように、ＡＴＩＩＩに対する複合物３９の潜在的競合結合能力は、親の五糖−スペーサー残基（図５、化合物９参照）と比較して、一定である。これらのデータは、ペプチドのインビボでの半減期が、ＡＴＩＩＩ結合性担体の五糖との複合化によって、かなり延長され得ることを示唆している（下記の薬物動態試験参照）。また、複合化されていない親ペプチドＡＤＭ（２７−５２）がＡＴＩＩＩと競合結合を示さないことから、複合物とＡＴＩＩＩの結合は特異的である。
【０１４２】
（実施例２５）
化合物４１
ＮｅｏＭＰＳ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）によって調製された化合物４０（１５ｍｇ、４．２μｍｏｌ）を、脱気した０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝剤（８ｍＬ、ｐＨ７．０）に溶解させた。五糖５（２２．７ｍｇ、１０．４μｍｏｌ、２．５当量）を窒素雰囲気下で添加し、混合物を約１０分間撹拌した。次いで、ＮＨ２ＯＨ水溶液（５０ｗｔ％、０．１４ｍＬ）を添加し、反応混合物を１６時間撹拌した。生成物を、化合物３９の場合と同様に精製して、化合物４１（１．３８ｍｇ、６％）を得た。収率は、１ｍｇ／ｍＬ溶液に対する理論吸光度１．２２を用いてＡ２８０測定によって求めた。Ｃ２１８Ｈ３４２Ｎ４４Ｏ１０６Ｓ８の質量計算値＝５５２８；ＥＳＩ Ｑ−ＴＯＦの実測値＝１８４３．７［Ｍ＋３Ｈ］３＋、１３８３．０［Ｍ＋４Ｈ］４＋、１１０７ Ｍ＋５Ｈ］５＋。
【０１４３】
結論：ＡＴＩＩＩに対する複合物４１の潜在的競合結合能力は、親の五糖−スペーサー残基化合物９と比較して、一定である（図１０参照）。これらのデータは、ペプチドのインビボでの半減期が、ＡＴＩＩＩ結合性担体の五糖との複合化によって、かなり延長され得ることを示唆している（下記の薬物動態試験参照）。
【０１４４】
スキーム７． 化合物４１の合成
【０１４５】
【化２５】
【０１４６】
（実施例２６）
化合物４４
Ｂａｃｈｅｍ（Ｗｅｉｌ ａｍ Ｒｈｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などの供給業者から入手することができるオクトレオチド（化合物４２、５０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解させた。ＡｃＯＨ（７μＬ）を添加して、微酸性溶液を作製した。続いて、ＧＭＢＳ（１１．２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、生成溶液を窒素下で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析によれば、ＧＭＢ部分がＮ末端Ｐｈｅ残基に極めて位置選択的に導入されたＧＭＢオクトレオチド４３にほぼ完全に転化された。反応物を約５℃に冷却し、ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４（２０ｍＬ、ｐＨ７．０）溶液を添加した。１０分後、混合物を室温にし、Ｎ２を１０分間通した。次いで、五糖５（２１．８ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、０．２５当量）を窒素雰囲気下で固体として添加し、続いてＮＨ２ＯＨ水溶液（０．１１ｍＬ、５０ｗｔ％）を添加し、反応混合物を１６時間撹拌した。生成物を、上述したようにイオン交換クロマトグラフィーによって精製して、化合物４４（６．３ｍｇ、１９％）を得た。Ｃ１１２Ｈ１７０Ｎ１２Ｏ７０Ｓ１０の質量計算値＝３１２２．７；ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦによる実測値＝１５６２．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋、１０４１．９［Ｍ＋３Ｈ］３＋。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ７．５２−７．２９（ｍ、１０Ｈ）、７．２６−７．１４（ｍ、４Ｈ）、７．０３（ｓ、１Ｈ）、５．４４（ｍ、１Ｈ）、５．３７（ｍ、１Ｈ）、５．１４（ｍ、１Ｈ）、５．１２−４．８９（ｍ、２Ｈ）、４．７７−４．６０（ｍ、３Ｈ）、４．４５−３．９７（ｍ、１８Ｈ）、３．９５−３．７６（ｍ、１３Ｈ）３．７５−３．３５（ｍ、５７Ｈ）、３．３３−２．５９（ｍ、１８Ｈ）、２．２２−１．１６（ｍ、２Ｈ）、１．８５−１．７６（ｍ、３Ｈ）、１．７１−１．３８（ｍ、３Ｈ）、１．３２−１．１５（ｍ、７Ｈ）、０．８１−０．６１（Ｍ、２Ｈ）。
【０１４７】
スキーム８． 化合物４４の合成
【０１４８】
【化２６】
【０１４９】
結論：ＡＴＩＩＩに対する複合物４４の潜在的競合結合能力は、親の五糖−スペーサー残基化合物９と比較して、一定である（図１１参照）。これらのデータは、ＡＴＩＩＩ結合性担体の五糖との複合化によって、ペプチドのインビボでの半減期がかなり延長されることを示している。
【０１５０】
（実施例２７）
化合物４６
五糖９（１００ｍｇ）及びＧＭＢＳ（２２ｍｇ、１．５当量）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解させた。ＤｉＰＥＡ（１８μＬ、２当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を分取Ｇ２５カラムによって精製した。混合画分を凍結乾燥させて、４６（５０ｍｇ、４６％）を白色粉末として得た。Ｃ５３Ｈ７７Ｎ２Ｏ５５Ｓ７Ｎａ９のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝２０５２；ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦによる実測値＝１０２７Ｍ２＋。
【０１５１】
（実施例２８）
化合物４７
五糖マレイミド誘導体４６を未変性ｒｅｃＨ−ＩＬ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、２０２−ＩＬ／ＣＦ）の遊離Ｃｙｓ１２５と複合化した。複合化前に、ｒｅｃＨ−ＩＬ−２をＨＰＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した。それによれば、ｒｅｃＨ−ＩＬ−２は、圧倒的に単一な組成であった。ｒｅｃＨ−ＩＬ２（１ｍｇ、８００μＬ、１．２６ｍｇ／ｍＬ ０．５％ＳＤＳ含有ＰＢＳ溶液）をロールバンク上で過剰の化合物４６（１０ｍｇ／ｍＬ水溶液５９μＬ、５当量）で終夜室温で処理して、出発材料を完全に転化させた。次に、未反応マレイミド４６を５倍モル過剰のシステアミン（１６μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）で３時間ブロックした。反応混合物を、０．５％ＳＤＳのＰＢＳ溶液で透析して（カットオフ６−８ｋＤａ）、過剰のシステアミン及び４６を除去した。生成物の最終量はＡ２８０で求めて０．６９ｍｇであった。
【０１５２】
最終複合物４７をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１２％）及びウエスタンブロットによって分析した（図１２参照）。レーン３及び４から、化合物４７は、（五糖部分の存在に対応して）ｒｅｃＨ−ＩＬ２よりも高いＭｗを有すると結論される。ａ）１０μｇ／ｍＬ ｈＡＴＩＩＩ（ＨＡＴ ９５０Ａ２Ｌ−Ｋｏｒｄｉａ）；ｂ）ａ−ｈＡＴＩＩＩ（ＭｏＡｂ ＨＡＴＩＩＩ ２００−Ｋｏｒｄｉａ）；ｃ）ＧＡＭ−ＨＲＰ（Ｗ４０２Ｂ ２０３７３２０１−Ｐｒｏｍｅｇａ）のウエスタンブロット分析とそれに続くインキュベーション及びＤＡＢ試薬による最終の検出によって、五糖含有ＩＬ２との特異的ＡＴＩＩＩ結合（レーン７対８）が明らかになった。
【０１５３】
スキーム９． 複合物４７の合成
【０１５４】
【化２７】
【０１５５】
薬理学
複合（ポリ）ペプチドの薬物動態の測定
本発明の化合物の代表例の薬物動態特性を以下のパラグラフに記載のように求めた。
【０１５６】
ラット血しょう中のインスリンを測定するためのヒトインスリンＥＬＩＳＡ
ヒト及びラットの血しょう又は緩衝系中のヒトインスリンを測定するために、ヒト酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を開発した。このようにして、ＥＬＩＳＡを使用して、薬物動態学的実験由来の血しょう試料中のインスリン濃度を求めることができる。
【０１５７】
アッセイは、２種類のモノクローナル抗体、すなわち固相に結合した捕捉抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された検出抗体とを用いた免疫化学的「サンドイッチ」原理に基づく。
【０１５８】
五糖−インスリン複合物６及び組換えヒトインスリン（ｒｅｃＨインスリン、バッチＳＩＨＲ０１７、Ｄｉｏｓｙｎｔｈ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）の薬物動態特性を求めるために、ラット血しょう試料を１０Ｈｚで振とうしながら室温で１時間インキュベートした。このインキュベーション中に、五糖−インスリン複合物６又はｒｅｃＨインスリンは、固定化抗インスリン抗体と結合する。第２の洗浄手順後、ＨＲＰと複合化された検出抗体抗インスリンを添加して、固定化インスリン複合体に結合させた。プレートを洗浄して、結合していない酵素標識抗体を除去し、続いて３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン／Ｈ２Ｏ２基質溶液を添加した。反応を０．５Ｍ硫酸によって停止させ、マイクロタイタープレートを分光測定によって４５０ｎｍで読み取った。色の強度は、インスリン濃度に正比例する。次いで、各血しょう試料について、インスリンの平均濃度（ｍｏｌ／Ｌ）を求めた。
【０１５９】
化合物６の薬物動態特性の測定
インスリン複合物６及びｒｅｃＨインスリンの薬物動態学的挙動を３００−４００ｇのオスのウィスターラットで試験した。ラットをＯ２／Ｎ２Ｏ／イソフルラン混合物の吸入によって麻酔し、その後、右の頚静脈をカニューレ処置した。翌日、ラットに化合物６又はｒｅｃＨインスリン３．５ｎｍｏｌ／ｋｇをｉ．ｖ．投与し、その後、血液を幾つかの時間間隔で採取した。血液を遠心分離し、その後、血しょうを吸い上げ、使用するまで−２０℃で保存した。血しょう試料中の試験化合物の濃度を、ヒトＥＬＩＳＡによって、試験化合物自体の原液でできた検量線に対して求めた。試料中の濃度をｎｍｏｌ／Ｌで表した。動力学的パラメータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎのノンコンパートメントモデルを用いて計算した。
【０１６０】
結論：図１３及び表３に示すように、五糖−インスリン複合物６の薬物動態特性は、親のｒｅｃＨインスリンの薬物動態特性よりも大きく改善された。
【０１６１】
表３． ラットにおける化合物６又はｒｅｃＨインスリン（３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ）のｉ．ｖ．投与後の薬物動態パラメータ。実験をｎ＝３／処理で実施した。
【０１６２】
【表３】
【０１６３】
１２５Ｉ標識後の薬物動態の測定
五糖複合物２４、２８、２９、３１、３２、３９及び４１を、Ｍａｃｈａｌｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． １９６９， １１３：２９９−３０５）に従って、ラクトペルオキシダーゼ法によって１２５Ｉで標識した。標識後、複合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を用いたゲルろ過及び陰イオン交換体ＨｉＴｒａｐ Ｑ１０によって精製した。動力学的実験を化合物６の場合と同様に、但し１２５Ｉ標識複合物を代わりに用いて繰り返した。甲状腺に１２５Ｉ−が蓄積するのを防止するために、化合物の投与前にラットを１０ｍｇ／ｋｇヨウ化カリウムで経口的に処理した。
【０１６４】
１２５Ｉ標識複合物の結末（ｆａｔｅ）を正確に求めることは、循環する遊離１２５Ｉ−を生成する代謝的な細胞内の内因性脱ハロゲン化によって悪影響を受ける恐れがある。遊離１２５Ｉ−自体はラットにおける消失半減期が３．２時間であるので（対照。データ示さず。）、比較的短い半減期を有する１２５Ｉ標識化合物の実測全半減期は延長され、比較的長い半減期を有する化合物の実験的に求めた半減期は短くなり得る。実際、複合物３１、３２及び３９の観測された排出半減期は、ペプチドと担体五糖の複合化によって滞留時間が延長されることを定性的に示している。
【０１６５】
４０倍の体積のＴＣＡで沈殿させた（最終濃度１０％）後のペレット（０．１ｍＬ）中の放射能を測定することによって上記方法を改良すると、競合する内因性１２５Ｉ脱ハロゲン化に対して補正された、化合物２４、２８、２９及び４１の薬物動態パラメータが得られた。
【０１６６】
ｒｅｃＨインスリンと比較したインスリン−五糖複合物２４、２８及び２９の薬物動態
表４． インスリン複合物２４、２８及び２９のｉ．ｖ．投与後の薬物動態パラメータ。実験をｎ＝３／処理で実施した。比較のために、ｒｅｃＨインスリンをｎ＝１で試験した（ｃｐｍ単位の用量を正規化した。）。
【０１６７】
【表４】
【０１６８】
結論：１２５Ｉ標識法によって求めたインスリン−五糖複合物２４の薬物動態特性（図１４、表４）は、ＥＬＩＳＡ法によって求めた類似のインスリン−五糖複合物（化合物６）の薬物動態特性（図１３、表３）と一致した。２つの分析方法によって求めたｒｅｃＨインスリンの動力学的パラメータの差は、最初の１５分間に循環から標識が急速に消失するために、（Ｖｓｓ及びＣｌを計算する）曲線外挿の差によって説明することができる。
【０１６９】
また、インスリン五糖複合物２４、２８、２９のＡＵＣ、Ｃｌ及びＶｓｓの観測された差（図１４、表４）は、ＡＴＩＩＩに対して異なる結合親和性を有する代替の担体五糖を用いることによって複合物の薬物動態特性を調整できることを明確に示している（これは、ＢＩＡ試験の知見と一致する。図６及び表２を参照されたい。）。
【０１７０】
五糖複合物３１及び３２の薬物動態
表５． ２種類の複合物３１及び３２のｉ．ｖ．投与後の薬物動態パラメータ実験をｎ＝３／処理で実施した。（脱ハロゲン化に対する補正をしていないデータ）。
【０１７１】
【表５】
【０１７２】
結論：遊離ガニレリクスの半減期（ラットにおけるＴ１／２ １．４時間、ｉ．ｖ．、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇ． Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ １９９１， １９， ８５８）は、担体五糖との複合化によってかなり延長される（図１５、表５）。化合物３１と３２の薬物動態学の比較によれば、Ｖｓｓ、Ｃｌ及びＴ１／２排出は、ＡＴＩＩＩに対する親和性が高い五糖を使用することによって改善される。これらのデータは、ＢＩＡ試験（図８参照）の知見と合わせて、ＡＴＩＩＩに対して異なる結合親和性を有する代替の担体五糖を用いることによって複合物の薬物動態特性を調整できることを示している。
【０１７３】
五糖複合物３９及びＡＤＭ（２７−５２）の薬物動態
表６． ＡＤＭ（２７−５２）及び化合物３９のｉ．ｖ．投与後の薬物動態パラメータ。実験をｎ＝３／処理で実施した。（脱ハロゲン化に対する補正をしていないデータ）。
【０１７４】
【表６】
【０１７５】
結論：ＡＤＭ（２７−５２）の薬物動態特性は、ＡＴＩＩＩ結合性担体の五糖との複合化によって改善された（化合物３９、図１６、表６）。データを脱ハロゲン化に対して補正していないので、ＡＤＭ（２７−５２）のＴ１／２自体は、過大評価されている可能性がある。さらに、遊離アドレノメデュリンの半減期は、ヒトにおいて僅か２２分に過ぎない（Ｍｅｅｒａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． Ｍｅｔ． １９９７， ８２， ９５−１００）。これらの観測結果及びＢＩＡ試験における観測結果（図９）は、（ポリ）ペプチドの薬物動態特性が、循環ＡＴＩＩＩに対して特異的結合親和性を有する（担体）複合物への転化によって改善され得るという結論を支持する。
【０１７６】
［Ｄ−Ａｌａ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）と比較した五糖複合物４１の薬物動態
表７． ＧＬＰ−１及び化合物４１のｉ．ｖ．投与後の薬物動態パラメータ。実験をｎ＝３／処理で実施した（ｃｐｍ単位のデータを正規化した。）。
【０１７７】
【表７】
【０１７８】
結論：［Ｄ−Ａｌａ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）の薬物動態特性は、ＡＴＩＩＩ結合性担体の五糖との複合化によって改善された（化合物４１、図１７、表７）。化合物４１のＣｌは非複合ペプチドの約１／１００に減少し、Ｖｓｓは１／１３に減少し、その結果、ＡＵＣ（暴露）は約１００倍になった。ＢＩＡデータ（図１０）と合わせて、これらの観測結果は、（ポリ）ペプチドの薬物動態特性が、ＡＴＩＩＩ結合性複合物への転化によって改善され得るという結論を支持する。
【０１７９】
ラット血しょう中の（ポリ）ペプチド−五糖−ＡＴＩＩＩ複合体の測定
（ポリ）ペプチド五糖複合物がアンチトロンビンＩＩＩにインビボで確実に結合するように、捕捉抗体として抗インスリンＭａｂと検出抗体としてＨＲＰ複合抗ＡＴＩＩＩ抗体とを使用するサンドイッチ型ＥＬＩＳＡを、化合物６の薬物動態学的実験から得られた血しょう試料に対して実施した。完全な五糖−インスリン−ＡＴＩＩＩ複合体のみが、ｒｅｃＨインスリンを負の対照として使用したこのアッセイタイプにおいて検出できることは明らかである）。
【０１８０】
ラットにおいて化合物６又はｒｅｃＨインスリン３．５ｎｍｏｌ／ｋｇのｉ．ｖ．投与の１分後に得られる血しょう試料から、五糖−インスリン複合物６及びｒｅｃＨインスリンとラットＡＴＩＩＩの結合性を判定した。結果を図１８に示す。
【０１８１】
結論：五糖−インスリン複合物６はＡＴＩＩＩと結合するが、ｒｅｃＨ−インスリンはＡＴＩＩＩと複合体を形成することができない。抗ウサギＡＴＩＩＩ抗体は感応性が低いが、両方のＡＴＩＩＩ抗体は、五糖−インスリン複合物６−ＡＴＩＩＩ複合体を検出することができた。これらの結果によれば、化合物６は循環中のＡＴＩＩＩと結合し、ＡＴＩＩＩ結合性五糖の半減期の延長はこの複合体形成の結果である。したがって、元の非複合（ポリ）ペプチドよりも（化合物６などの）（ポリ）ペプチド−五糖複合物の薬物動態特性が改善されることは、複合物とＡＴＩＩＩの特異的結合によるものであると結論することができる。
【０１８２】
ラットにおけるインビボでのグルコース抑制試験
インスリン及びインスリン複合物の生物活性を、ラットモデルにおいてグルコース抑制レベルを測定することによって試験した。ラットを実験前に終夜（１６時間）絶食させた。朝、尾部を少し切って、全ラットから採血した。その後、血液を試験片に滴下し、ＡＣＣＵ−Ｃｈｅｃｋ Ｓｅｎｓｏｒ血糖モニター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてグルコースレベルを測定した。ラットを加熱箱中で３９℃で１０分間予熱後、五糖−インスリン複合物６及びインスリンを尾静脈にｉ．ｖ．投与した。投与量は、五糖−インスリン複合物６ ７ｎｍｏｌ／ｋｇ及びｒｅｃＨ−インスリン３．５ｎｍｏｌ／ｋｇであった。種々の時間間隔で、凝固した血液を除去して血液試料を採取し、その後、グルコース含量を上記のようにすぐに測定した。
【０１８３】
五糖インスリン複合物６の薬力学
ｒｅｃＨ−インスリンよりも五糖−インスリン複合物６の薬物動態特性が改善されたことは、ｉ．ｖ．投与後のグルコース抑制レベルが延長したことによって確認される（図１９参照）。
【０１８４】
化合物２４、２５、２６、２７及びインスリンデテミル（対照）を用いて実施した実験においては、（対照群における一貫したグルコースレベルを確実にするために）化合物の投与直前にラットを飢餓状態にした。
【０１８５】
Ｂ２９−インスリン複合物２４とＢ２９−インスリン複合物２６（図２０）及びＢ１−インスリン複合物２５とＢ１−インスリン複合物２７（図２１）を比較すると、グルコース抑制活性がスペーサーの長さにかかわらず同様に延長されたことがわかる。
【０１８６】
驚くべきことに、試験した全インスリン複合物の作用開始は、ｒｅｃＨインスリン又はインスリンデテミル（ｉ．ｖ．投与）の作用開始よりも遅く、暴露は、より長い作用期間によって増強されたことが判明した。
【０１８７】
２４ｎｍｏｌ／ｋｇの用量における１回の実験内のＢ２９−インスリン複合物２４、２８及び２９の直接比較によって、これらの血糖降下活性の作用期間の違いが実証される（図２２参照）。すなわち、化合物２４によるグルコースレベルの抑制は７時間以上持続したのに対して、複合物２８及び２９はｉ．ｖ．投与後５．５時間を過ぎるともはや活性ではなかった。薬力学的差は、それぞれ化合物２８及び２９と比較した、化合物２４の分布容積及びクリアランスの上記薬物動態学的差と一致する。最後に、インスリンデテミルを比較例として試験した。インスリンデテミルは、用量２４及び４８ｎｍｏｌ／ｋｇにおいて、より不明瞭でより短い活性を示した（図２１、２２）。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】インスリン特異的ＥＬＩＳＡによる五糖−インスリン複合物６（インスリン−ペンタ）の識別。
【図２Ａ】五糖（ＰＳ）−インスリン複合物６の生体分子間相互作用解析。固定化抗インスリン抗体とインスリン複合物の反応と、それに続くヒトインスリン受容体への結合。
【図２Ｂ】五糖（ＰＳ）−インスリン複合物６のＢｉａｃｏｒｅ解析。固定化抗インスリン抗体とインスリン複合物の反応と、それに続くヒトＡＴＩＩＩへの結合。
【図３】一置換五糖−インスリン複合物６のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。
【図４】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０を用いた一置換五糖−インスリン複合物６のＨＰ−ＳＥＣ分析。
【図５】基準五糖−スペーサー残基７、８及び９のｈＡＴＩＩＩ結合（ＢＩＡ試験）。
【図６】インスリン−五糖複合物２４、２８及び２９のｈＡＴＩＩＩ結合（ＢＩＡ試験）。
【図７】インスリン−五糖複合物２４の質量分析（ＥＳＩ−ＱＴＯＦ）。
【図７Ａ】インスリン−五糖複合物の実測及び計算による典型的な同位体分布の比較（ＥＳＩ−ＱＴＯＦ、Ｍ５＋、化合物２４）。
【図８】化合物３１、３２、３６、３７のｈＡＴＩＩＩ結合（Ｂｉａｃｏｒｅ試験）。
【図９】（ＢＩＡによって測定した）化合物３９のｈＡＴＩＩＩ結合。
【図１０】（ＢＩＡによって測定した）化合物４１のｈＡＴＩＩＩ結合プロファイル。
【図１１】（ＢＩＡによって測定した）化合物４４のｈＡＴＩＩＩ結合プロファイル。
【図１２】化合物４７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析。
【図１３】３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｒｅｃＨインスリン（白丸）又は五糖−インスリン複合物６（三角形）のｉ．ｖ．投与後のインスリン濃度を測定して求めた平均血しょう中濃度（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図１４】１２５Ｉ標識複合物２９（白四角形）、２４（白丸）及び２８（白三角形）並びにｒｅｃＨインスリン自体（黒丸）のｉ．ｖ．投与後Ｔ＝１分の測定濃度に対する％で表した平均血しょう中濃度（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図１５】１２５Ｉ標識複合物３１（白四角形）及び３２（黒三角形）のｉ．ｖ．投与後Ｔ＝１分の測定濃度に対する％で表した平均血しょう中濃度（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。（脱ハロゲン化に対する補正をしていないデータ）。
【図１６】１２５Ｉ標識複合物３９（白四角形）及び１２５Ｉ標識ＡＤＭ（２７−５２）（黒三角形）のｉ．ｖ．投与後Ｔ＝１分の測定濃度に対する％で表した平均血しょう中濃度（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。（脱ハロゲン化に対する補正をしていないデータ）。
【図１７】１２５Ｉ標識複合物４１（黒三角形）及び１２５Ｉ標識ＧＬＰ−１（白四角形）のｉ．ｖ．投与後Ｔ＝１分の測定濃度に対する％で表した平均血しょう中濃度（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図１８】抗ヒト及び抗ウサギＡＴＩＩＩ抗体を用いた五糖−インスリン複合物６−ＡＴＩＩＩ複合体の検出。
【図１９】７ｎｍｏｌ／ｋｇ五糖−インスリン複合物６（白三角形）又は３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｒｅｃＨ−インスリン（白丸）のｉ．ｖ．投与後の平均グルコースレベル（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図２０】９ｎｍｏｌ／ｋｇ ｒｅｃＨ−インスリン（白丸）で処理後のグルコースレベルと比較した、１２ｎｍｏｌ／ｋｇ五糖−インスリン複合物２６（黒三角形）又は２４（黒丸）のｉ．ｖ．投与後の平均グルコースレベル（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図２１】９ｎｍｏｌ／ｋｇ ｒｅｃＨ−インスリン（白丸）又は４８ｎｍｏｌ／ｋｇインスリンデテミル（白三角形）で処理後のグルコースレベルと比較した、２４ｎｍｏｌ／ｋｇ五糖−インスリン複合物２７（黒四角形）又は２５（黒菱形）のｉ．ｖ．投与後の平均グルコースレベル（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図２２】９ｎｍｏｌ／ｋｇ ｒｅｃＨ−インスリン（白丸）又は２４ｎｍｏｌ／ｋｇインスリンデテミル（白菱形）で処理後のグルコースレベルと比較した、２４ｎｍｏｌ／ｋｇ五糖−インスリン複合物２４（黒三角形）、２８（黒丸）又は２９（黒四角形）のｉ．ｖ．投与後の平均グルコースレベル（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドとオリゴ糖の新しい複合物、その調製方法、該化合物を活性成分として含む薬剤組成物並びに医薬品の製造への前記化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術の最近の進歩及び先進のペプチド合成方法によって、医学的に有用な量の治療用ポリペプチドを商業生産することが可能になった。しかし、多数の治療用ポリペプチドの半減期が短いことが、これらの化合物の投与にこれまで難題を提起してきた。半減期を延長することによって有利となる、現行の重要なポリペプチド系薬物が幾つかある。例は、（著しく）数時間未満の半減期を有する、エリスロポイエチン、インスリン、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ、顆粒球コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リラキシン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノゲンアクチベーター、カルシトニン、インターロイキン−２及び腫よう壊死因子である。例えば、インスリンは、ヒトにおける半減期がわずか１２分程度である。治療薬候補として開発されたが、半減期が短いポリペプチドの他の例は、アドレノメデュリン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）及びキスペプチン（メタスチン）である。治療用ポリペプチドの半減期が延長されると、投薬量及び投薬頻度を削減することによって、現行の治療を改善することができる（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． Ｄｅｖ． ２００５， ８， ５９０−６００）。
【０００３】
例えばＰＥＧ化（すなわち、約１−３０ｋＤａのポリエチレングリコール部分との結合；Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２００５， １０， １４５１−１４５８）による改良によって、インビボでの半減期を延長する目的で多数のタンパク質がすでに研究されている。例えば、半減期の延長されたインスリンのＰＥＧ化類似体が現在入手可能である。このインスリン誘導体の重要な側面は、クリアランス速度の低下に加えて、免疫原性が低下し（例えば、米国特許第４，１７９，３３７号）、溶解性が増大することである。また、インスリンのＰＥＧ化の進歩によって、未変性インスリンよりも物理的にもタンパク質分解性的にも安定な複合物も得られる（例えば、国際公開第２００４／０９１４９４号、同２００２／０９８２３２号、米国特許出願公開第２００５／０１５２８４８号参照。）。
【０００４】
より長い血清半減期を有するＰＥＧ化エリスロポイエチンは、例えば、国際公開第２００４／０２２５７７号に記載されている。さらに、エリスロポイエチンの改変グリコシル化によって、半減期が延長されることも見出された。また、エリスロポイエチンのハイパーグリコシル化類似体がより高いインビボ活性を有することが報告された（国際公開第２０００／２４８９３号）。作用期間の長いＰＥＧ化（ポリ）ペプチドの他の例は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（国際公開第２００５／０５８９５４号、同２００４／０９３８２３号；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００５， １６， ３７７−３８２；Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２００５， ２６， ３５９７−３６０６）、ブドウ糖依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）（Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ， ２００５， １５， ４１１４−４１１７）、カルシトニン（Ｐｈａｒｍ． Ｄｅｖ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １９９９， ４， ２６９−２７５）及びオクトレオチド（Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２００５， ２２， ７４３−７４９）である。
【０００５】
それでも、ＰＥＧの使用には制約がある。ＰＥＧは化学合成によって得られ、全ての合成高分子同様、多分散である。これは、１つのバッチのＰＥＧが、分子量の正規分布を生じる異なるモノマー数の分子からなることを意味する。ポリペプチドをＰＥＧ化すると、異なる生物学的諸性質、特に半減期及び免疫原性を有し得る複合物の集合になる。したがって、ＰＥＧ化ポリペプチドの薬理活性の再現性は、この技術の重大な欠点になり得る。また、タンパク質のＰＥＧ化は、生物活性の損失を伴うことが多い。また、ＰＥＧの使用は、体内からの排出に関する問題を生じ得る。高分子量のＰＥＧは、肝臓に蓄積し、巨大分子症候群（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を起こす恐れがある。したがって、薬物のＰＥＧ化は、細心の注意を払って実施すべきである。多糖、特にポリシアル酸鎖によるポリペプチドの誘導体化によってＰＥＧ化と類似の結果が得られた（例えば、国際公開第９２／２２３３１号及び同２００１／８７９２２号）。
【０００６】
日本特許出願公開第０２／２３１０７７号では、ヘパリン−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）複合物が記載されている。好ましくは、幾つかのヘパリン分子がＳＯＤと結合して、酵素活性の約９０％を保持しつつ、未変性ＳＯＤよりも長い半減期を有する複合物を生成する。
【０００７】
半減期の長い他のポリペプチド複合物としては、循環血清アルブミンに結合した、インスリン（国際公開第２００３／０１３５７３号、同０５／０１２３４６号）又はＧＬＰ−１（Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２００４， １４， ４３９５−４３９８）の複合誘導体が例示される。これらの化合物における血清アルブミンとの結合は、特に、複合物内の結合部分とヒト血清アルブミンの疎水的相互作用に基づく。結合部分の疎水性が高いほど、ヒト血清アルブミンとの結合親和性は強くなる。多様な結合部分が適切であるが、かかる複合物の欠点は、複合物とヒト血清アルブミンの相互作用の親和性及び選択性が低いことであり、その結果、薬力学的挙動を予測することが困難である。或いは、ヒトインスリンの遺伝子をヒト血清アルブミンの遺伝子と直接融合させると、皮下投与後長期間にわたって血糖値を低下させるのに有効な長時間作用型インスリンが得られる（Ｄｕｔｔａｒｏｙ ｅｔ ａｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００５， ５４， ２５１−２５８）。しかし、この場合、融合ポリペプチドの生物学的利用能及び標的受容体に対する結合親和性が低下する。
【０００８】
また、国際公開第２０００／４０２５３号は、例えば、ペプチドと、特にグリコサミノグリカン鎖との複合物を開示しており、これは、合成プロテオグリカンと考えられる。この複合物では、複合グリコサミノグリカンの薬理活性は、その治療活性にかなり影響を及ぼす。
【０００９】
また、薬剤的に活性な化合物の溶解性を増大させるために、オリゴ糖が該化合物に結合された（国際公開第２００４／０３９７１号）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ポリペプチドとオリゴ糖の複合物である、半減期の長い新しいポリペプチド複合物又は薬剤として許容されるその塩に関する。ここで、ポリペプチドは、少なくとも１個の合成硫酸化オリゴ糖−スペーサー残基と複合化されている。オリゴ糖は、４−１８単糖単位を含み、それ自体がアンチトロンビンＩＩＩに親和性を有する。スペーサーは結合であり、又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である。好ましいオリゴ糖は４−６単糖単位からなり、特に好ましいのは五糖である。本発明の複合物は、元のポリペプチド（すなわち、対応する非複合ポリペプチド自体）よりも、薬物動態特性が改善され、したがって薬理学的特性が改善されている。
【００１１】
本発明は、さらに、治療に有効な、抗血栓活性の無視し得る、ポリペプチドを含む複合物の調製方法に基づく新規技術にも関する。この調製方法は、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対する親和性をそれ自体が有する合成硫酸化オリゴ糖、特に五糖が、結合又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基を介して、ポリペプチドに共有結合する段階を含む。
【００１２】
ＡＴＩＩＩはセリンプロテアーゼ阻害剤であり、血しょう中に存在し、凝固カスケードを分断してフィードバックループを与える。硫酸化五糖の半減期は、本質的にＡＴＩＩＩとの親和性に基づく（例えば、Ｆ． Ｐａｏｌｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ２００２；４１ Ｓｕｐｐｌ． ２：１１−１８参照）。本発明の複合物においては、血清半減期は、複合物の半減期を主として占める五糖の半減期の結果として、元のポリペプチドの半減期よりも長い。また、本発明の複合物は、半減期が長いだけでなく、複合物の五糖部分とＡＴＩＩＩの特異的相互作用に基づいて、薬物動態特性を調整することもできる（この相互作用は、例えば、Ｗｅｓｔｅｒｄｕｉｎ ｅｔ． ａｌ． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９４， １２６７−１２８０； ｖａｎ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ． １９９５；１５：４９５−５０３に記載されている。）。本発明の一実施形態においては、オリゴ糖−ポリペプチド複合物（オリゴ糖は、特に４−６単糖単位からなり、とりわけ五糖である。）は、５０ｎＭ以下の循環血しょう中濃度を有する。この濃度まで、ＡＴＩＩＩによって媒介されるオリゴ糖（特に五糖）の抗凝血活性は、特に出血のリスクに関して重要でない（例えば、（１）Ｆ． Ｄｏｎａｔ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ２００２；４１ Ｓｕｐｐｌ． ２：１−９；（２）Ｓ．Ｊ． Ｋｅａｍ ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇｓ ２００２；６２（１１）：１６７３−１６８５及び（３）Ｔｈｅ Ｒｅｍｂｒａｎｄｔ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０００；１０２：２７２６−２７３１参照）。本発明の実施形態によれば、複合物に使用するオリゴ糖（特に４−６単糖単位からなり、とりわけ五糖である。）は、ポリペプチド自体の薬理活性と比較したときに、治療量以下のレベルである抗凝血活性をそれ自体が有する。この点で、治療量以下とは、治療効果未満であり、出血リスクなどの副作用がないことを意味する。例えば、１型糖尿病患者は、本複合物に使用する五糖の治療量以下の範囲に十分ある（基本の）治療血しょう中濃度約［０．１−１．０］ｎＭを補足する（長い半減期の）インスリン注射を必要とする。当業者は、ポリペプチドと五糖それぞれの治療レベル間の適切なバランスで複合物を選択する方法を理解されたい。
【００１３】
本発明の複合物中のポリペプチドはその生物活性を保持している。また、本発明の複合物中のＡＴＩＩＩと結合した五糖が線形の薬物動態学的挙動を示すことは、複合ポリペプチドの極めて予測可能な治療効果を説明するものである。というのは、複合物は、ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．投与後は主として血管内の区画に残存するからである。
【００１４】
本発明の複合物中のオリゴ糖残基は、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対する親和性をそれ自体が有する合成硫酸化オリゴ糖に由来する残基である。硫酸化オリゴ糖、特に五糖は、一般に、ＡＴＩＩＩに対して親和性を有するが、当業者はＡＴＩＩＩに対するオリゴ糖の親和性を容易に調べ（ｖａｎ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ． １９９５；１５：４９５−５０３）、所望の親和性レベルを選択することができる。適切な合成オリゴ糖残基、特に五糖残基は、ＥＰ ０，４５４，２２０、ＥＰ ０，５２９，７１５、国際公開第９８／０３５５４号、同９９／３６４２８号、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００５；４８， ３４９−３５２， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９４， ３２， １６７１−１６９０などに開示されているオリゴ糖及び五糖から誘導し得る。
【００１５】
オリゴ糖及び五糖の残基は、直接的に、又は五糖残基内の任意の化学的に適切な位置に結合した連結残基を介して、ポリペプチドと複合化し得る。したがって、本発明の一実施形態においては、複合物は、オリゴ糖−スペーサー残基が構造（Ｉ）を有する複合物である。
【００１６】
【化１１】
式中、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な１個の連結残基が存在し、Ｒは独立にＯＳＯ３−、（１−８Ｃ）アルコキシ又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、
Ｒａは独立にＯＳＯ３−であり、（１−８Ｃ）アルコキシであり、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、又は１−１３単糖単位を含むオリゴ糖残基であり、
Ｒｂは独立に（１−８Ｃ）アルコキシであり、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、又は１−１３単糖単位を含むオリゴ糖残基であり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。
【００１７】
より好ましいのは、オリゴ糖−スペーサー残基が、構造（ＩＩ）を有する五糖−スペーサー残基である複合物である。
【００１８】
【化１２】
式中、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な１個の連結残基が存在し、Ｒは独立にＯＳＯ３−、（１−８Ｃ）アルコキシ又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。
【００１９】
さらに好ましいのは、五糖残基が構造（ＩＩＩ）を有する複合物である。
【００２０】
【化１３】
式中、Ｒは独立にＯＳＯ３−又は（１−８Ｃ）アルコキシであり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。
【００２１】
本発明による極めて好ましい化合物は、五糖残基が構造（ＩＶ）を有する化合物である。
【００２２】
【化１４】
式中、Ｒは独立にＯＣＨ３又はＯＳＯ３−であり、特に（ＩＩ）中の両方のＲ基はＯＳＯ３−である。
【００２３】
本発明によれば、ＡＴＩＩＩに対して親和性を有する合成硫酸化オリゴ糖残基、特に五糖残基は、任意のポリペプチドと複合化し得る。例えば、ポリペプチドは、生理活性ペプチド（例えば、３から５０アミノ酸長）とすることができ、又は触媒活性を有しても、有さなくてもよいより長いポリペプチドとすることができる。生理活性ペプチドの非限定的例としては、コナントキンＧ、ダイノルフィン、エンドルフィン、エンケファリン、ニューロテンシンなどの神経伝達物質；ボンベシン、モチリン、ガストリンなどの胃の活性化因子（ｇａｓｔｒｉｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）；カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）などのカルシウム調節因子；オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）などの骨吸収調節因子；アドレノメデュリン又はＡＤＭ（２７−５２）などのその切断型誘導体などの骨芽細胞活性の刺激因子；血管作動性腸管ポリペプチド、コルチコトロピン、セクレチンなどのホルモン；ソマトスタチンなどのホルモン阻害剤；メラニン細胞刺激ホルモン、黄体化ホルモン放出因子、セルモレリンなどのホルモン刺激因子；グルカゴン、アミリン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）又はＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−２、ブドウ糖依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）、インスリン（「Ｈｕｍｕｌｉｎ」、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）などのその切断型誘導体などの抗糖尿病薬；リソスタフィンなどの抗感染薬；オベスタチンなどの食欲抑制ホルモン；アンジオテンシンＩＩなどの血管収縮剤；ブラジキニン、サブスタンスＰ、カリジンなどの血管拡張薬；心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（ＡＮＰ）などのナトリウム排泄増加薬；バソプレッシン、デスモプレッシンなどの抗利尿ホルモン及びオキシトシンなどの分娩促進薬が挙げられる。使用することができるポリペプチドの追加の例としては、ヒト成長ホルモン（「Ｈｕｍａｎｔｒｏｐｅ」、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ｒＬＨ；ｒＧ−ＣＦＳ（「Ｎｅｕｐｏｇｅｎ」、Ａｍｇｅｎ）；エリスロポイエチン（「Ｅｐｏｇｅｎ」、Ａｍｇｅｎ）；インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ又はインターフェロンγ；第ＶＩＩＩ因子又はプロテインＣ、第ＶＩＩａ因子などの他の血液凝固因子；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２又は−１８）などのサイトカイン；ヘモグロビン；スーパーオキシドジスムターゼ；可溶性ＣＤ４又はＣＤ４受容体；血小板ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ類似体及びその受容体（「ＲｅｏＰｒｏ」、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）；グルコセレブロシダーゼ（「Ｃｅｒｅｄａｓｅ」又は「Ｃｅｒｅｚｙｍｅ」、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；ＡＣＴＨ；ソマトトロピン；副甲状腺ホルモン、抗利尿ホルモン；プロラクチン；ペグビソマント（「Ｓｏｍａｖｅｒｔ」、Ｐｆｉｚｅｒ）などのｒＨＧＨ；ロイプロリド（「Ｌｕｐｒｏｎ」、「Ｌｅｐｒｏｒｅｌｉｎ」、Ｔａｋｅｄａ）、ナファレリン（「Ｓｙｎａｒｅｌ」、Ｒｏｃｈｅ）などのＧｎＲＨ作動物質及びガニレリクス（「Ａｎｔａｇｏｎ」、Ｏｒｇａｎｏｎ）などのＧｎＲＨ拮抗物質；セルモレリン（「Ｇｅｒｅｆ」、Ｓｅｒｏｎｏ）などのＧＨＲＨ作動物質；オクトレオチド（「Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ」、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子（「Ａｃｔｉｖａｓｅ」、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの血栓溶解剤；メタスチン（ＫＩＳＳ１又はキスペプチン−５４）、キスペプチン−１０などのその切断型誘導体が挙げられる。
【００２４】
好ましいポリペプチドは、分子量が約０．３−５０ｋＤａである。他の好ましいポリペプチドは、分子量が約０．３−２０ｋＤａである。分子量約０．３−７．５ｋＤａのポリペプチドも好ましい。
【００２５】
さらに好ましいポリペプチドは、インスリン（ｔ１／２＝１２ｍｉｎ；Ｍｗ＝５．８ｋＤａ）、カルシトニン（ｔ１／２＝２０ｍｉｎ；Ｍｗ＝３．４ｋＤａ）、ＧＬＰ−１（７−３６）（ｔ１／２＝６ｍｉｎ；Ｍｗ＝３．４ｋＤａ）、アドレノメデュリン（ｔ１／２＝２０ｍｉｎ；Ｍｗ＝６．０ｋＤａ）、ＡＤＭ（２７−５２）（Ｍｗ ３．０ｋＤａ）、オクトレオチド（ｔ１／２＝１．７ｈ、Ｍｗ＝１．０ｋＤａ）、インターロイキン−２（ｔ１／２＝２０ｍｉｎ；Ｍｗ＝１５ｋＤａ）及びガニレリクス（ｔ１／２＝１２ｈ；Ｍｗ＝１．６ｋＤａ）である。インスリン及び［Ｄ−Ａｌａ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）が特に好ましい。本発明のさらなる実施形態は、五糖−スペーサー残基で一置換されたポリペプチド複合物である。
【００２６】
スペーサーは、結合であり、又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である。好ましくは、スペーサーは、スペーサー「骨格」に沿ってオリゴ糖残基の酸素を含めずに数えて特に１０−５０原子の本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である。本明細書では「本質的に薬理学的に不活性」という用語は、本発明の化合物が治療上有効である用量においてそれ自体が薬理学的に活性である原子又は基をスペーサーが含まないことを意味する。したがって、本発明の化合物を治療薬として使用する用量において、スペーサーの性質は、実証し得る薬理学的副作用をもたらさない。スペーサーは、環構造、不飽和結合などの（いくらか）剛直な要素を含み得る。本発明の化合物のスペーサーは、好ましくは柔軟である。適切なスペーサーは、当業者が容易に設計することができる。合成上の理由で、スペーサーが長いほど不適切であると考えられるが、長いスペーサーでも、本発明の化合物に首尾よく適用し得る。好ましいスペーサーは、少なくとも１個の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−基を含む。
【００２７】
本発明の複合物の代表例は、以下の構造の複合物又は他のその塩、スペーサーが異なる、若しくは五糖の別の位置に結合している複合物である。
【００２８】
【化１５】
式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝
【００２９】
【化１６】
又はＲ１＝Ｒ３＝Ｈ、Ｒ２＝
【００３０】
【化１７】
であり、Ｙは構造Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから選択される。
【００３１】
【化１８】
ナトリウム塩が好ましい。好ましくは、Ｙは構造Ａ及びＢから選択される。
【００３２】
本開示において明示的に定義していない、一般に用いられる化学略語は、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｔｙｌｅ Ｇｕｉｄｅ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ（１９９７）， ”２００１ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ａｕｔｈｏｒｓ” Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６６（１）， ２４Ａ（２００１）， ”Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ” Ｊ． Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ． Ｓｃｉ． ５， ４６５−４７１（１９９９）に記載されている。
【００３３】
ポリペプチドという用語は、翻訳後修飾にかかわらず、少なくとも３個のアミノ酸からなる鎖を指す。ポリペプチドは、天然の、化学合成された、又は組換え産生されたアミノ酸ポリマーでもよい。３から５０個のアミノ酸を含むポリペプチドは、典型的には、ペプチドとして分類される。
【００３４】
「触媒活性を有するポリペプチド」という句は酵素を意味する。本明細書ではインスリンという用語は、ヒト、ラット、モルモット及びウサギを含めた哺乳動物中に存在する天然の血糖降下ポリペプチド、組換えインスリン並びに米国特許第４，６５２，５２５号、同４，４３１，７４０号、同５，２６８，４５３号、同５，５０６，２０２号、同５，５１４，６４６号及び同５，７００，６６２号に開示されている類似の血糖降下ポリペプチドを指す。
【００３５】
本発明の複合物の記載においては、さらに以下の定義を使用する。（１−４Ｃ）アルキル及び（１−８Ｃ）アルキルという用語は、それぞれ１−４個及び１−８個の炭素原子を有する分枝又は非分枝アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシル及びオクチルを意味する。メチル及びエチルが好ましいアルキル基である。
【００３６】
（１−８Ｃ）アルコキシという用語は、１−８個の炭素原子を有するアルコキシ基を意味する。アルキル部分は、上で定義した意味を有する。メトキシが好ましいアルコキシ基である。
【００３７】
スペーサーの長さは、スペーサーと結合したオリゴ糖残基の酸素原子を数えずに、オリゴ糖残基とポリペプチドの間の最短の鎖に沿って数えたスペーサーの原子数である。
【００３８】
本発明の実施形態は、さらに、アンチトロンビンＩＩＩに対する親和性をそれ自体が有する合成硫酸化オリゴ糖（特に、オリゴ糖は４−６単糖単位からなり、とりわけ硫酸化五糖である。）が、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基を場合によっては介して、ポリペプチドに結合する段階を含み、該ポリペプチドを含む複合物が、生物活性を本質的に保持しつつ、元のポリペプチドよりも長い血しょう中半減期を有し、無視し得る抗血栓活性を有する、治療に有効な該複合物の調製方法である。
【００３９】
合成及び分析の一般的態様
五糖の合成
本発明の化合物の、ＡＴＩＩＩ結合性のオリゴ糖、特に五糖は、例えば、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９４， ３２， １６７１−１６９０に記載のように調製することができる。ＡＴＩＩＩに対して異なる親和性を有する異なるオリゴ糖及び五糖は、中間体の単糖、二糖又は四糖構成要素を変えることによって、例えば、（永続的な）アルキル基を導入することによって、又は異なる硫酸化オリゴ糖及び五糖を制御された様式で利用する異なる（一時的な）保護基を適用することによって、得ることができる（例えば、Ｗｅｓｔｅｒｄｕ ｉｎ ｅｔ． ａｌ． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９４， １２６７）。スペーサーは、例えば、国際公開第２００１／４２２６２号に記載のように導入することができる。オリゴ糖−及び五糖−スペーサー分子は、ガンマ−マレイミドブチリル（ＧＭＢ）基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基、保護されていてもよいチオール基などの連結残基を用いてさらに誘導体化して（例えばＡｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． １９９６， ３５， ３３１−３３３）、修飾されていてもよいポリペプチドと直接カップリングすることができる。
【００４０】
複合化
一般に、本発明の複合物は、（ａ）ポリペプチドが複合化用に改変される、必須でない段階と、（ｂ）改変されていてもよいポリペプチドがオリゴ糖−又は五糖−スペーサー分子と反応する、カップリング段階とを含む方法によって製造される。
【００４１】
バイオコンジュゲートを生成する一般的合成方法は、Ｇｒｅｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” １９９６， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されている。また、複合化としては、（Ｋ．Ｌ． Ｋｉｉｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ２００２；９９：１９−２４に記載のものなどの）Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション又は五糖誘導体とアルキン若しくはアジド官能基で独立に修飾されたポリペプチドとを用いたＨｕｉｓｇｅｎの１，３−双極子環付加を考えることができる。或いは、（Ｍ． Ｌｅｗｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００４， １５， ２３１−２３４に記載のものなどの）位置選択的ＩｇＡプロテアーゼによって媒介されるポリペプチドのＮ末端伸長、（Ｍ． Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００４， １２６， １４０１３−１４０２２に記載のものなどの）トランスグルタミナーゼによって触媒されるアミノスペーサー含有オリゴ糖の導入などの酵素反応を用いて、修飾されていてもよいポリペプチドに五糖−スペーサー残基を複合化することができる。
【００４２】
また、例えばインスリン、ＧＬＰ−１及びオクトレオチドのＰＥＧ化は、詳細に記録されている。これらのタンパク質においては、約５−３０ｋＤａのＰＥＧ部分を、その生物活性を失わずに導入することができる。かかる戦略に従って、五糖（スペーサー）部分を（部位特異的に）導入することができる。また、五糖複合物とＡＴＩＩＩ（約５０ｋＤａ）の結合は、ポリペプチドの生物活性に実質的な有害作用を及ぼさないことが必要条件である。
【００４３】
インスリン：Ｎ末端Ｂ−１及びＣ末端近傍Ｂ−２９のリジンアミノ官能基は、インスリンの生理活性には必須ではない。Ｂ１−ＰＥＧ化インスリンが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化ＰＥＧ誘導体とジＮ−Ｂｏｃによって保護されたインスリンとの反応によって全収率２０％で調製された（Ｓ．Ｗ． Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ． ２００２， ５４， ５０５−５３０）。Ｎ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）などの二官能カップリング試薬の類似の反応によって、Ｂ１修飾インスリン五糖複合物が得られる。或いは、非保護Ｚｎ２＋−インスリンのＢ２９ Ｌｙｓ残基を、過剰のＮＨＳエステルを用いてｐＨ約１０−１１で収率約６０％で選択的に修飾することができる。インスリンとの位置選択的な複合化のための他の確立された方法は、国際公開第９８／０２４６０号、同２００４／０９１４９４号、同２００５／０１２３４６号、米国特許出願公開第２００５／０１５２８４８号、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｓｃｉ． ２００５， １１， ３３９−３４６， Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． ２００５， １６， ６１５−６２０， Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔ． ２００３， １６２２， ４２−４９， Ｔｅｓｓｍａｒ ｅｔ ａｌ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎ． ２００４， １０， ３， ４４１−４５３から改良して作成することができる）。
【００４４】
ガニレリクス：五糖のＮＨＳエステル誘導体は、ｄｅ−Ｎ−Ａｃガニレリクスの遊離Ｎ末端アミノ基と複合化することができる。又は、五糖誘導体を含むアミノスペーサーは、場合によっては追加のスペーサーを介して、デスアミドガニレリクスの遊離末端カルボン酸基と複合化することができる。デスアミドガニレリクスは、例えばＪ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９２， ３５， ３９４２−３９４８に記載された、先進の（固相）ペプチド合成によって得ることができる。
【００４５】
オクトレオチド：市販ペプチドであるオクトレオチドのＮ末端Ｄ−Ｐｈｅアミノ酸残基は、最高５ｋＤａのＰＥＧを用いて、生理活性を失わずに修飾することができる（Ｄ． Ｈｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２００５， ２２， ７４３−７４９）。Ｎ末端アミノ基の位置特異的官能基化は、過剰の二官能ＮＨＳエステル連結試薬を用いてｐＨ約６で実施することができる。その後、上述のバイオコンジュゲートを生成する一般的合成方法に従って（例えば、チオール基を含む五糖−スペーサー残基をオクトレオチドのマレイミド誘導体と複合化することによって）、担体の五糖とさらに複合化することができる。
【００４６】
ＡＤＭ（２７−５２）：完全長アドレノメデュリン（ＡＤＭ）のＮ末端は、骨形成活性及び血管石灰化に対する抑制作用に必須ではない。五糖−スペーサー残基とＡＤＭ（２７−５２）のＮ末端Ａｌａ残基との位置特異的複合化は、固相ペプチド合成を利用する確立された方法及び上述のバイオコンジュゲートを生成する一般的合成方法を用いて、Ｎ末端修飾されていてもよいＡＤＭ（２７−５２）を合成することによって実施することができる。
【００４７】
［Ｄ−Ａｌａ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）：ＧＬＰ−１（７−３６）及びエキセンディン−４（１−３９）などのその誘導体のＣ末端部分は、受容体の結合に重要であるアミノ酸残基が露出したαヘリックス構造を形成する。Ｎε位がマレイミド官能基で修飾された追加のリジン残基を用いて、例えば国際公開第２００５／０５８９５４号に記載された、改良された固相ペプチド合成によって、このアミノ酸配列を伸長すると、ヒト血清アルブミンのＣｙｓ３４アミノ酸と共有結合した後でも、受容体と結合し、インビボでの官能基活性を示す。一方、タンパク質分解の安定性は、２位にＤ−Ａｌａ残基を組み込むことによって（さらに）改善することができる（Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２００４， １４， ４３９５−４３９８）。同様に、ＧＬＰ−１（７−３６）又はその類似体を、適切に官能基化された（例えばチオール基を含む）五糖−スペーサー部分と複合化することができる。或いは、Ｃｙｓアミノ酸は、ペプチド配列、好ましくは１１、１２、１６、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３４、３５若しくは３６位に組み込むことができ、又は３７位に付加することができ、また、適切に官能基化された（例えばマレイミド基を含む）五糖−スペーサー部分に、ＧＬＰ−１誘導体のＰＥＧ化（国際公開第２００４／０９３８２３号）の場合と類似した方法によってカップリングすることができる。また、ＧＬＰ−１の複合物は、ＧＬＰ−１に対する二官能ＮＨＳエステル連結試薬との直接カップリングと、それに続く（例えば、ＧＬＰ−１の直接ＰＥＧ化についてＬｅｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００５， １６， ３７７−３８２に記載されたように）位置異性体の分離及び適切に官能基化された五糖−スペーサー部分とのカップリングによって得ることができる。
【００４８】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）：市販の未変性ｒｅｃＨ−ＩＬ２の遊離Ｃｙｓ１２５アミノ酸又は依然として生物活性である、ＩＬ２変異タンパク質の遊離の（追加の）Ｃｙｓアミノ酸を、ＰＥＧ−マレイミドによるＩＬ２のＰＥＧ化（米国特許第５，２０６，３４４号）の場合と類似したプロトコルに従って、マレイミド基を含む五糖−スペーサー部分と反応させることができる。
【００４９】
本発明の化合物を調製する上記方法において考えられる手順段階であるペプチドカップリングは、アジド法、混合酸無水物法、活性化エステル法、カルボジイミド法などペプチド断片のカップリング若しくは縮合に対して当分野で周知の方法によって、又は、好ましくは、ＴＢＴＵのようなアンモニウム／ウロニウム塩の影響下で、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び７−アザ−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールのような触媒作用的なラセミ化抑制化合物を添加して、実施することができる。概要は、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３， Ｅ． Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ． Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， ｅｄｓ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８１）及びＰｅｐｔｉｄｅｓ： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｎ． Ｓｅｗａｌｄ ａｎｄ Ｈ．−Ｄ． Ｊａｋｕｂｋｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， ２００２）に記載されている。
【００５０】
化合物中のアミン官能基は、合成手順中にＮ保護基（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基又はフタロイル（Ｐｈｔｈ）基のような、ペプチド化学反応においてα−アミノ基の保護のために一般に使用される基を意味する。）によって保護することができ、又はアジド部分のデマスキングによって導入することができる。アミノ保護基及びその除去方法の概要は、上記Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３及びＰｅｐｔｉｄｅｓ： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されている。
【００５１】
遊離塩基の形で存在し得る本発明の化合物は、薬剤として許容される塩の形で反応混合物から単離することができる。薬剤として許容される塩は、式（Ｉ）の遊離塩基を塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、アスコルビン酸などの有機又は無機酸で処理することによって得ることもできる。
【００５２】
本発明の化合物又はその中間体は、不斉炭素原子を有し得る。したがって、本発明の化合物又はその中間体は、純粋な鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、又はジアステレオマーを含む混合物として得られる場合がある。純粋な鏡像異性体を得る方法は、当分野で周知であり、例えば光学活性な酸から得られる塩及びラセミ混合物の結晶化、又はキラルカラムを用いたクロマトグラフィーである。ジアステレオマーの場合には、順相（ｓｔｒａｉｇｈｔ ｐｈａｓｅ）又は逆相カラムを使用することができる。
【００５３】
物理化学分析及び生化学分析
タンパク質の生理活性に対する、二官能リンカー及び／又は反応性五糖部分を用いた反応の効果をモニターする幾つかの技術が利用可能である。この点で、可溶な受容体分子を相補的結合剤（インスリン）として用いた生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）及び酵素活性の測定は貴重なツールである。五糖複合物とＡＴＩＩＩの結合試験も、これらのアッセイに含まれ得る。イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィー及びＡＴＩＩＩアフィニティークロマトグラフィーは、五糖複合物の亜分画に利用可能な方法である。一方、電気泳動技術は、直交、定性及び定量キャラクタリゼーション（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＺＥ）に適切である。複合化部位は、複合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析及びＮ末端配列決定によって同定することができる。
【００５４】
薬物動態（ＰＫ）試験
非修飾ポリペプチド及び対応する五糖複合物のインビボでの半減期を求めるＰＫ試験をラットで実施することができる。幾つかの選択肢、例えば血しょう試料におけるＩｏｄｏｇｅｎ、求電子置換を起こすラクトペルオキシダーゼイオン化、又は標識部分としてのボルトンハンター試薬を用いた１２５Ｉによる放射性標識とガンマ線放射の測定が利用可能である。当分野で公知の他の方法は、非標識複合物の注入と、それに続くＥＬＩＳＡ又はＬｕｍｉｎｅｘ法による免疫化学的分析に基づく。
【００５５】
薬理学的評価
本発明のポリペプチドとＡＴＩＩＩ結合性五糖の複合化の薬理効果は、以下に示すように、インビトロでのアッセイ及びインビボでの動物モデルにおいて試験することができる。インスリンは、２個のジスルフィド架橋によって結合した２個のペプチド鎖からなる５．８ｋＤａのタンパク質である。Ｌｙｓ ε−アミノ基又はＮ末端α−アミノ基の１つにおける部位特異的化学修飾は詳細に記録されている。五糖とインスリンの複合化の効果は、血清試料のグルコース、インスリン及びＣ−ペプチド含有量（内因性インスリン分泌を補正するための生物マーカー）を分析することによって試験することができる。血糖計、ヒトインスリン及びＣ−ペプチド放射性免疫測定法が商用的に利用可能である。血糖値に対するインスリンのインビボでの効果は、ラット又はビーグルで測定することができる。
【００５６】
デカペプチド模倣ＧｎＲＨ拮抗物質ガニレリクスの五糖複合化のインビトロ及びインビボでの薬理学的効果は、確立されたアッセイ及び動物モデルにおいて試験することができる。先進のポリペプチド合成によって、マウス及びラットにおいて卵成熟及び排卵を阻止するガニレリクスとその効果を比較することができる明確に定義された分子が生成される。ガニレリクスとその五糖複合物の相手の生物学的半減期の比較は、例えば、投与後に成熟及び排卵の天然プロセスが回復する時間を求めることによって試験することができる。
【００５７】
ＧＬＰ−１（７−３６）は、インスリン分泌の刺激、グルカゴン分泌、胃又は腸運動の阻害、グルコース利用の促進、体重減少の誘導などの多数の生物学的効果をもたらす、十分研究された周知のインスリン分泌性内分泌ホルモンである。ＧＬＰ−１（７−３６）は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）によって迅速に分解される。この早すぎる分解は、例えば、８位のアミノ酸残基を（例えばＤ−アラニンで）置換することによって回避し得る。大きい脂肪酸鎖又はＰＥＧによる修飾などの他の手法によって、生物活性ＧＬＰ−１又は（例えば、国際公開第２００４／０９３８２３号に定義される）その類似体が生成される。修飾されていてもよいＧＬＰ−１（７−３６）誘導体を担体の五糖と複合化する（付加的な）安定化効果は、ＤＰＰＩＶの存在下でインビトロで複合物の安定性を測定することによって、また、血しょう中半減期を免疫化学的分析を用いて測定することによってインビボで、試験することができる。ＧＬＰ−１五糖複合物の官能基の活性は、ＧＬＰ−１受容体に結合し、それを活性化する能力を測定することによってインビトロで求めることができる。インビボでの薬力学的効果は、血清試料のグルコース及びインスリンを分析することによって試験することができる。
【００５８】
アドレノメデュリンは、血管拡張、気管支拡張、神経伝達、成長調節、骨形成調節などの多数の生物学的機能を有する５２アミノ酸ポリペプチドである。切断断片のＡＤＭ（２７−５２）は、血管拡張剤活性の構造上の要件を欠くが、培養したラット骨芽細胞の成長を依然として用量依存的に刺激することができる（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００３， １１２， ７９−８６）。また、ＡＤＭ（２７−５２）は、ラットにおける血管石灰化を阻害し（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００５， １２９， １２５−１３２）、したがって動脈石灰化の予防に応用し得ることが最近確認された。ＡＤＭ（２７−５２）を担体の五糖と複合化する効果は、ラット胎児の活発に成長する骨芽細胞の培養におけるインビトロでの骨形成活性又は骨形成の指標のインビボでの増加を（骨吸収に影響を及ぼさずに）測定する確立されたアッセイによって評価することができる。
【００５９】
オクトレオチドは、ソマトスタチンの合成オクタペプチド類似体であり、末端肥大症及びある種の内分泌腫ようの治療に臨床的に使用される。長時間作用性デポー製剤（例えば、Ｓａｎｏｓｔａｔｉｎ ＬＡＲデポー、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、毎日３回の皮下注射と比較して、血しょう成長ホルモン及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）レベルの低下に少なくとも有効であることが判明した。薬物動態特性及び薬理学的特性に対するオクトレオチドと五糖の複合化の効果は、オスのラットにおいて、確立された放射性免疫測定法を用いて複合オクトレオチドのレベル及びＩＧＦ−Ｉの変化レベルを測定することによって試験することができる。
【００６０】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、白血球（Ｔリンパ球）によって体内で自然に産生されるタンパク質であり、免疫系の重要なタンパク質である。ＩＬ−２は、薬物として市販されており（アルデスロイキン、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、Ｃｈｉｒｏｎ、Ｕ．Ｓ．）、一部のタイプの癌（有毛細胞白血病）の治療に使用され、ＣＤ４細胞数を増加させるために抗ＨＩＶ治療と併用される。五糖−ＩＬ−２複合物の特異的生理活性は、Ｇｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９７８， １２０， ２０２７−２０３２）によって記述されたＩＬ−２細胞増殖バイオアッセイによってインビトロで求めることができる。
【００６１】
薬剤
本発明の複合物は、経腸又は非経口投与することができる。これらの化合物及びその組成物の正確な用量及び投薬計画は、ポリペプチド自体の生物活性、医薬品を投与する個々の対象の要求、苦痛の程度又は開業医の要求及び判断に応じて必然的に決まる。一般に、非経口投与は、吸収により大きく依存する他の投与方法よりも少ない投与量を必要とする。しかし、ヒトに対する１日用量は、好ましくは０．０００１−１ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．００１−０．１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００６２】
本発明の化合物を用いて製造された医薬品は、治療におけるアジュバントとしても使用することができる。かかる場合には、医薬品は、かかる病態の治療に有用である他の化合物と一緒に投与される。
【００６３】
本化合物は、例えば標準の参考文献、Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１８ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０、特にＰａｒｔ ８： Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅを参照されたい。）に記載された、薬剤的に適切な助剤と混合して、丸剤、錠剤などの固体投与単位に圧縮することができ、又はカプセル剤若しくは坐剤に加工することができる。本化合物は、薬剤的に適切な液体を用いて、例えば注射剤又は噴霧剤用の溶液、懸濁液、乳濁液の形で適用することもできる。
【００６４】
投与単位、例えば錠剤を製造する場合、充填剤、着色剤、重合体結合剤などの従来の添加剤の使用が企図される。一般に、活性化合物の機能を妨げない、薬剤として許容される任意の添加剤を使用することができる。組成物を一緒に投与することができる適切な担体としては、適切な量で使用される、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体など又はその混合物が挙げられる。静脈内投与するときには、薬剤組成物を、ボーラスとして、時間の異なる２回以上の回数で、又は一定流量若しくは非線形流量の注入として、投与することができる。したがって、本発明の組成物は、任意の投与経路用に処方することができる。
【００６５】
典型的には、静脈内投与用組成物は、無菌等張性緩衝水溶液である。必要に応じて、本組成物は、可溶化剤、安定剤及び注射部位におけるとう痛を軽減するリドカインなどの局所麻酔薬を含むこともできる。一般に、これらの成分は、別個に、例えばキットで、又は単位剤形として一緒に混合して、例えば、凍結乾燥粉末、又は水を含まない濃縮物として、供給される。本組成物は、活性薬剤量を活性単位で示した、アンプル、小袋などの機密密封容器に保存することができる。本組成物を注入投与する場合には、医薬品等級の無菌「注射用水」、食塩水又は他の適切な静脈内輸液を含む注入ボトルを用いて投与することができる。本組成物を注射投与する場合には、無菌注射用水又は食塩水のアンプルを、投与前に各成分を混合することができるように用意することができる。本発明の薬剤組成物は、本発明の化合物及び薬剤として許容されるその塩と、薬剤として許容される任意の成分、賦形剤、担体、アジュバント又はビヒクルを含む。
【００６６】
特に断らない限り、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は等価である方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を本明細書に記載する。本明細書で言及する全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献を参照によりその全体を援用する。矛盾が生じた場合には、定義を含めて本明細書が基準になる。また、材料、方法及び実施例は、説明のためにのみあり、限定的なものではない。
【００６７】
本発明を、これらだけに限定されないが、以下の実施例によってさらに詳細に説明する。異なる五糖、スペーサー及びポリペプチドを用いて、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変を成し得ることを理解されたい。
実施例
使用略語：
ＡＣＮ アセトニトリル
ＡｃＯＨ 酢酸
ＡＤＭ アドレノメデュリン
（ｈ）ＡＴＩＩＩ （ヒト）抗トロンビンＩＩＩ
ＡＵＣ 曲線下面積
ＢＩＡ 生体分子間相互作用解析
Ｂｏｃ２Ｏ ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボナート
Ｃｌ クリアランス
ＤＣＣＩ Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着検定法
Ｅｑｕｉｖ． 当量
ＥＳＩ エレクトロンスプレーイオン化
ＧＬＰ−１ グルカゴン様ペプチド１
ＧＭＢ ガンマ−マレイミドブチリル
ＧＭＢＳ ガンマ−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｃ）エステル
ＨＢＳ−ＥＰ ＥＤＴＡとポリエチレングリコールを含むｈｅｐｅｓ緩衝食塩水
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＰ−ＳＥＣ 高速サイズ排除クロマトグラフィー
ＨＲＰ 西洋わさびペルオキシダーゼ
ｉ．ｖ． 静脈内
ＩＬ−２ インターロイキン−２
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型
ＭｏＡｂ モノクローナル抗体
ＭＲＴ 平均滞留時間
ＭＳ 質量分析法
ＮＭＭ Ｎ−メチルモルホリン
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＰＡＧＥ ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ＰＳ 五糖
Ｑ−ＴＯＦ 四重極飛行時間型
ｒｅｃＨ 組換えヒト
ＲＴ 室温
Ｒｔ 保持時間
ＳＤＳ ドデシル（ｄｏｃｅｃｙｌ）硫酸ナトリウム
ＴＢＴＵ ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
ＴＣＡ トリクロロ酢酸
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
Ｖｓｓ 定常状態での分布容積
材料及び方法
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ ＤＲＸ−４００（ｕｌｔｒａ ｓｈｉｅｌｄ）によって４００ＭＨｚで記録した。有機溶媒中の化学シフトをテトラメチルシランに対するｐｐｍ（δ）で報告する。
【００６８】
ＤＭＦ、１，４−ジオキサン、ＮＭＭ、酢酸アンモニウム、Ｂｏｃ２Ｏ、ＴＦＡ、ＤＭＳＯ、ＤＣＣＩ（Ａｃｒｏｓ）、ヒドロキシルアミン（５０ｗｔ％水溶液）、無水ヨード酢酸、ＧＭＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｒｅｃＨインスリン（Ｄｉｏｓｙｎｔｈ）、ＴＥＡ、６−アミノカプロン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＴＨＦ（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ）、２−メルカプト−［Ｓ−アセチル］酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１３）、ＴＢＴＵ（Ｆｌｕｋａ）、ＡＣＮ（Ｍｅｒｃｋ）、ＡｃＯＨ及びＮａ２ＨＰＯ４（Ｊ．Ｔ． Ｂａｋｅｒ）を各供給業者から入手してそのまま使用した。
【００６９】
カラムクロマトグラフィーを、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｇｅｒｍａｎｙ ＧｍｂＨ ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（ＭＰ ｓｉｌｉｃａ ３２−６３、６０Å）及びＭｅｒｃｋ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−１８（４０−６３μｍ）を用いて実施した。ＴＬＣ分析を、Ｍｅｒｃｋ ＴＬＣ ｐｌａｔｅｓ ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４を用いて実施した。化合物をＵＶ吸収（２５４ｎｍ）によって、及び／又はＵＳＵＩ試薬（リンモリブデン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｍｏｌｙｂｄｅｎｉｃ ａｃｉｄ）／ＡｃＯＨ／Ｈ２ＳＯ４のＥｔＯＨ溶液）と一緒に炭化することによって、可視化した。
【００７０】
ＭＡＬＤＩスペクトルをＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて正及び負イオンモードの線形、遅延引き出しモードで得た。再結晶化アルファ−シアノヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ、５００ｍＬ／Ｌ ＡＣＮ／１ｍＬ／Ｌ ＴＦＡ中３ｇ／Ｌ）をマトリックスとして使用した。分子量を二点較正によって（例えば、ｒｅｃＨインスリン及びその断片鎖の１つ又はミオグロビンをｍ／ｚ１６９５３及びｍ／ｚ８４７７に割り当てることによって）測定した。
【００７１】
Ｑ−ＴＯＦスペクトルを、ＥＳＩ源を備えたＰＥ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ Ｑ−ｓｔａｒ Ｐｕｌｓａｒを用いて正イオンモードで得た。試料をＨ２Ｏに溶解させ、逆相Ｚｉｐ Ｔｉｐ（登録商標）を用いて脱塩した。初期設定の分析ＨＰＬＣを、３台のＧｉｌｓｏｎポンプ（３０５）の勾配システムを備えたＧｉｌｓｏｎ ２３４自動試料採取装置とＬｕｎａ（商標）Ｃ１８（２）カラム（逆相、１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を用いて実施した。Ｇｉｌｓｏｎ ＵＶ検出器（１１８）を２１０ｎｍにおける検出に使用した。勾配溶出をカラム温度４０℃及び流量１ｍＬ／ｍｉｎで実施した。溶離剤Ａ（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ、９：１中の０．１％ＴＦＡ溶液）９５％と溶離剤Ｂ（０．１％ＴＦＡのＡＣＮ溶液）５％で５分間開始し、次いで１５から５０％ＡＣＮの線形勾配を２５分間適用した。
【００７２】
化合物４の分析的な（ＨＰＬＣ）分析を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ−１０Ａ ｖｐ（システム制御装置）二方向ポンプ勾配システムとＬｕｎａ（商標）Ｃ１８（２）カラム（逆相、１５０×２．０ｍｍ、５μｍ）を用いて実施した。ＳｈｉｍａｄｚｕダイオードアレイＵＶ検出器（ＳＰＤ−Ｍ１０Ａ ｖｐ）を２１４ｎｍにおける検出に使用した。勾配溶出をカラム温度４０℃及び流量０．４ｍＬ／ｍｉｎで実施した。
【００７３】
分取ＨＰＬＣを、単一のポンプ（Ｗａｔｅｒｓ ６００）勾配システムを備えたＷａｔｅｒｓ ２７６９ ｓａｍｐｌｅ ｍａｎａｇｅｒとＬｕｎａ（商標）Ｃ１８（２）カラム（逆相、２５０×５０ｍｍ、１０μｍ）を用いて実施した。Ｇｉｌｓｏｎ ＵＶ検出器（２９９６、フォトダイオードアレイ）を２１０ｎｍにおける検出に使用した。勾配溶出を流量５０ｍＬ／ｍｉｎで実施した。溶離剤Ａ（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ、９：１中の０．１％ＴＦＡ溶液）９０％と溶離剤Ｂ（０．１％ＴＦＡのＡＣＮ溶液）１０％で１０分間開始し、次いで１５から５０％の溶離剤Ｂの線形勾配を５０分間適用した。
【００７４】
分析陰イオン交換クロマトグラフィーを、Ｐｈａｒｍａｃｉａポンプ（Ｐ−９００）勾配システムを備えたＰｈａｒｍａｃｉａ Ａｋｔａ ＥｘｐｌｏｒｅｒとＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５カラムを用いて実施した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＵＶ検出器（ＵＶ ９００）を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｐＨ及び電気伝導度検出器（ｐＨ／Ｃ ９００）と組み合わせて、２１０ｎｍにおける検出に使用した。ＡＤ検出器（ＡＤ９００）をＣｈｉｒａｌｙｓｅｒ（ＩＢＺ）と併用した。また、Ｐｈａｒｍａｃｉａフラクションコレクター（Ｆｒａｃ ９５０）及びＰｈａｒｍａｃｉａ自動試料採取装置（Ａ ９００）を使用した。初期設定の溶出を流量１ｍＬ／ｍｉｎで実施した。溶離剤Ａ（ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ２：８）７４％と溶離剤Ｂ（ＡＣＮ／２Ｍ ＮａＣｌ ２：８）２６％で５分間開始し、次いで溶離剤Ａ ２０％と溶離剤Ｂ ８０％までの勾配を１５分間適用した。
【００７５】
分取陰イオン交換クロマトグラフィーを、Ｐｈａｒｍａｃｉａポンプ（Ｐ−５０）とＰｈａｒｍａｃｉａ勾配ミキサー（ＬＫＢ ＧＰ−１０）勾配システムを備えたＰｈａｒｍａｃｉａシステム及びＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＸＫ１６ Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗカラムを用いて実施した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＵＶ検出器（ＬＫＢ−ＵＶ−ＭＩＩ）を、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ電気伝導度検出器と組み合わせて、２１４ｎｍにおける検出に使用した。初期設定の勾配溶出を流量４．６ｍＬ／ｍｉｎで実施した。溶離剤Ａ（Ｈ２Ｏ）８０％と溶離剤Ｂ（２Ｍ ＮａＣｌ水溶液）２０％で２０分間開始し、次いで溶離剤Ａ ２０％と溶離剤Ｂ ８０％までの勾配を２１０分間適用した。
【００７６】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を用いた分取ゲルろ過（脱塩）を、Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗポンプ（１０１Ｖ）を備えたＰｈａｒｍａｃｉａシステムとＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＸＫ２６ Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５ファインカラムとを用いて実施した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＵＶ検出器（ＬＫＢ−ＵＶ−ＭＩＩ）を、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ電気伝導度検出器と組み合わせて、２１４ｎｍにおける検出に使用した。均一濃度溶離をＨ２Ｏを用いて流量１ｍＬ／ｍｉｎ Ｈ２Ｏで１０時間実施した。
【００７７】
化合物６を用いた分析ＨＰ−ＳＥＣを、ＨＰ１１００クロマトグラフィーシステムに搭載したＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）３０ ＨＲ １０／３０カラムを用いて実施した。０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ７．０を用いて流量０．４ｍＬ／Ｌで溶出させた。
【００７８】
他の複合物を用いた分析ＨＰ−ＳＥＣを、分析Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ クロマトグラフィーの場合と同様に、Ａｋｔａ ＥｘｐｌｏｒｅｒシステムとＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５ ＨＲ １０／３０カラムを用いて実施した。均一濃度溶離を５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて流量１ｍＬ／ｍｉｎで実施した。
【００７９】
分取ＨＰＳＥＣを、分析Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ クロマトグラフィーの場合と同じＡｋｔａ ＥｘｐｌｏｒｅｒシステムとＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）ＸＫ２６ Ｈｉｌｏａｄ ２６／６０ ｐｒｅｐ−ｇｒａｄｅカラムを用いて実施した。均一濃度溶離を５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて流量１．３２ｍＬ／ｍｉｎで実施した。
【００８０】
五糖複合物とＡＴＩＩＩ、抗インスリン抗体及びインスリン受容体との結合試験をＢＩＡ法によって実施した。センサーグラム及び記録点を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．２によってブランク（ｂｌａｎｃ）のフローセルを減算して分析した。ＩＣ５０値をｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ３．０によって計算した。
【００８１】
Ａ２８０測定をＮａｎｏ Ｄｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００ ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を用いて実施した。
【００８２】
スキーム１． 化合物４の合成
【００８３】
【化１９】
【００８４】
（実施例１）
６−（２−ヨード−アセチルアミノ）−ヘキサン酸（２）
６−アミノ−ヘキサン酸（１）（０．３７ｇ、２．８ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（６０ｍＬ）懸濁液に無水ヨード酢酸（０．５０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５０℃で３時間及び周囲温度で１６時間撹拌した。その後、ＴＬＣ分析（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、９８／１０／１、ｖ／ｖ／ｖ）によって、化合物１が親油性（ｌｙｐｏｐｈｉｌｉｃ）のより低い生成物に完全に転化したことを確認した。ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を添加し、反応混合物を０．１０Ｍ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。次いで、有機層を塩水（５０ｍＬ）で２回洗浄し、混合水層をＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）で２回抽出した。混合有機層を脱水（ＭｇＳＯ４）し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、９８／１０／１、ｖ／ｖ／ｖ）にかけて、６−（２−ヨード−アセチルアミノ）−ヘキサン酸（２）（０．４５ｇ、＞１００％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：δ ３．６７（ｓ、２Ｈ）、３．１７（ｔ、２Ｈ）、２．２９（ｔ、２Ｈ）、１．６６−１．３３（ｍ、６Ｈ）。
【００８５】
（実施例２）
６−（２−ヨード−アセチルアミノ）−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（３）
６−（２−ヨード−アセチルアミノ）−ヘキサン酸（２）（０．２０ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（８５ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２１ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を暗所で１６時間撹拌した。ＴＬＣ分析（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ／ＡｃＯＨ、８０／２０／１、ｖ／ｖ／ｖ）によって活性化エステル３への完全な転化を確認した後、酢酸７滴を添加した。次いで、混合物を冷凍庫に終夜保存した（−２０℃）。粗製混合物をろ過し、ろ液を濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｐ／ＡｃＯＨ、４０／６０／５→２０／８０／５、ｖ／ｖ／ｖ）によって精製し、適切な画分を濃縮して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体３（０．１８ｇ、６７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：δ ３．６７（ｓ、２Ｈ）、３．１８（ｔ、２Ｈ）、２．８２（ｓ、４Ｈ）、２．６３（ｔ、２Ｈ）、２．０−１．０（ｍ、６Ｈ）。
【００８６】
（実施例３）
化合物４
ｒｅｃＨインスリン（５０ｍｇ、８．６μｍｏｌ）のＤＭＦ（１５ｍＬ）懸濁液に溶液が透明になるまでＨ２Ｏ（９．０ｍＬ）を添加した。溶液を１５分間撹拌して、室温に調節した。０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を滴下して、溶液のｐＨを１０に調節した。その後、反応フラスコをスズ箔で包んだ。３（５．０ｍｇ、８．６μｍｏｌ）のＤＭＦ（１．０ｍＬ）溶液を反応混合物に１分間滴下した。反応混合物を磁気撹拌子で撹拌し、ｐＨを１０に維持した。３０分後、過剰の０．１％ＴＦＡ水溶液（５．０ｍＬ）を添加して、反応をクエンチした。Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）を添加し、反応混合物を凍結乾燥して、４（６０ｍｇ、＞１００％、最高８．６μｍｏｌ）を得た。溶離剤Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）８０％と溶離剤Ｂ（ＡＣＮ）２０％で５分間開始し、次いで溶離剤Ａ ２０％と溶離剤Ｂ ８０％までの勾配を３０分間適用したＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、逆相）分析によって、４５％の一置換生成物の存在が明らかになった（ｒｅｃＨインスリン Ｒｔ：１２．８４ｍｉｎ；化合物４ Ｒｔ：１３．５４ｍｉｎ；Ｂ２９／Ａ１二置換生成物：Ｒｔ １４．１６ｍｉｎ）。粗製生成物を精製せずに次の反応に使用した。
【００８７】
（実施例４）
化合物６
粗製化合物４（６０ｍｇ）を、（Ｎ２を通して）脱気した０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝剤（２５ｍＬ、ｐＨ７．０）中の０．０５Ｍ ＮＨ２ＯＨ溶液に溶解させた。反応混合物を磁気撹拌子で撹拌し、（Ｎ２を通して）３０分間脱気した。次いで、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ．（１９９６）， ３５， ３３１−３３３に記載のように調製した五糖−スペーサー化合物５（９５ｍｇ、４３μｍｏｌ）を固体として添加し、反応混合物を窒素雰囲気下で１６時間撹拌した。
【００８８】
スキーム２． 化合物６の合成
【００８９】
【化２０】
【００９０】
五糖−インスリン複合物６の精製。
【００９１】
前段落の反応混合物から、一置換五糖−インスリン複合物６を、陰イオン交換クロマトグラフィー（捕捉段階）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ポリッシング段階）によって精製してほぼ均一にした。
【００９２】
複合物含有溶液を、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝剤ＰＨ８．０で平衡にしたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムにかけた。保持されないタンパク質画分がカラムを通過した後、Ａ２８０がベースラインレベルに戻るまで平衡緩衝剤で徹底して洗浄した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０を用いた分析ＨＰ−ＳＥＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで測定して、結合した未反応のインスリンは約０．４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌで溶出し、一置換五糖−インスリン複合物は０．７ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌで溶出した。複合物画分を、限外ろ過又は２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌバンプ（ｂｕｍｐ）を溶出段階として用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって濃縮し、リン酸緩衝食塩水で平衡にした分取Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０カラムにかけた。ＨＰ−ＳＥＣ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳで測定して、純粋なモノ複合物（ｍｏｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含む画分をプールした。最終生成物をエタノール／ドライアイス混合物中で瞬間凍結（ｓｎａｐｆｒｅｅｚｉｎｇ）後、−７０℃で保存した。複合物濃度を、１ｍｇ／ｍＬに対する吸光度係数０．８を用いたＡ２８０測定によって推定した。
【００９３】
化合物６のキャラクタリゼーション
精製五糖−インスリン複合物６の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をインスリンのＥＬＩＳＡによって、また、ヒトインスリン受容体とヒトＡＴＩＩＩを分析物として用いた生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）によって求めた。純度及び単量体性（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃｉｔｙ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０を用いたＨＰ−ＳＥＣ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳによって評価した。
【００９４】
図１に示すように、２バッチの五糖−インスリン複合物６がインスリン特異的ＥＬＩＳＡによって識別される。これは、免疫反応性インスリン部分が存在することを示している。ＢｉａｃｏｒｅにおけるＢＩＡ実験から、五糖と複合化したインスリンは、依然としてヒトインスリン受容体に結合することができると結論することができる（図２Ａ）。これらの実験においては、ヒトインスリンに対するＭｏＡｂ（クローンＭ３２２２２１３、１０−１３０、バッチ２２３、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＭｏＡｂ １３と命名）を、標準アミノカップリングによってＣＭ５センサーチップ上に固定した。ＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ、カタログ番号２２−０５１２−４４）を泳動緩衝剤として流量５μＬ／ｍｉｎで用いた。インスリン複合物を注射すると、複合物と固定化抗体が結合した。免疫結合したインスリン複合物は、ヒトインスリン受容体及びＡＴＩＩＩと反応することができた。後者は、共有結合した五糖を表す（図２Ｂ）。
【００９５】
五糖−インスリン複合物６のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを、材料及び方法の項に記載したように得た。分析前に、試料を脱塩し、μＣ１８−ＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ、ＵＳＡ）で濃縮した。溶出は、５００ｍＬ／Ｌ ＡＣＮ／１ｍＬ／Ｌ ＴＦＡ中の１０ｇ／Ｌアルファ−シアノを含有する溶液１μＬを用いて、ステンレススチールＭＡＬＤＩ標的に対して直接的であった。図３は、ｍ／ｚ６７００及び７４００の周囲のピークを含む、一置換五糖−インスリン複合物の典型的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳプロファイルである。見掛け上の不均一性は、８０Ｄａの段階的損失をもたらす、レーザーにより誘導された五糖部分の脱硫酸化（ｄｅｓｕｌｆａｔａｔｉｏｎ）によって生じる。二置換インスリンに特徴的なｍ／ｚ９４００の範囲にピークが存在せず、二置換五糖−インスリン複合物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析では見出されなかった。未反応インスリンのピークも存在しないことに注意すべきである（ｍ／ｚ５８０８）。
【００９６】
ＨＰ−ＳＥＣ分析（図４）は、保持時間２２分の主ピークを示している。純度は９７％と推定された。（未反応インスリン及び二置換複合物は存在しないと考えられる。）。
【００９７】
（実施例５）
化合物１１
五糖７（４６ｍｇ）［五糖７は、国際公開第２００１／４２２６２号に記載の誘導体化された単糖５と、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９９４）， ２， １２６７−１２８０に記載の四糖３０を生成する合成経路を実施することによって得られる四糖とのカップリングによって得ることができる。ここで、還元性末端の単糖構成要素１２は、脱保護及び硫酸化を含めて、これらの刊行物に記載の方法と類似の方法によって、メチル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−６−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコースで置換される。］及びグリコール誘導体１０（１８ｍｇ、１．６当量）をＤＭＦ（５ｍＬ）に窒素雰囲気下で溶解させた。ＮＭＭ（６１μＬ、５当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を分取陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。適切な画分を混合し、分取Ｇ２５カラムで脱塩した。混合画分を凍結乾燥させて、１１（２９ｍｇ、５７％）を白色粉末として得た。純度＞９８％（分析陰イオン交換、ＵＶ２１０ｎｍ）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ５．３１（ｄ、１Ｈ）、５．２３（ｍ、１Ｈ）、４．９１（ｍ、１Ｈ）、４．４５−４．３５（ｍ、１Ｈ）、４．４８−３．９３（ｍ、１１Ｈ）、３．８７−３．６２（ｍ、９Ｈ）、３．６０−３．４５（ｍ、３９Ｈ）、３．４１−３．３４（ｍ、１５Ｈ）、３．３３−３．２３（ｍ、７Ｈ）、３．１８−３．０８（ｍ、２Ｈ）、２．９７（ｔ、２Ｈ）、２．２３（ｓ、３Ｈ）。
【００９８】
（実施例６）
化合物１２
国際公開第２００１／４２２６２号に記載のように調製した五糖８（０．２ｇ）及びＡｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ．（１９９６）， ３５， ３３１−３３３に記載のように調製したグリコール誘導体１０（５３ｍｇ、１．３当量）をＤＭＦ（５．０ｍＬ）に溶解させた。ＮＭＭ（６１μＬ、５当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を分取陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。適切な画分を混合し、分取Ｇ２５カラムで脱塩した。混合画分を凍結乾燥させて、１２（０．１３ｇ、５５％）を白色粉末として得た。純度＞９５％（分析陰イオン交換、ＵＶ２１０ｎｍ）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ５．１２（ｄ、１Ｈ）、５．０３（ｄ、１Ｈ）、４．７０（ｄ、１Ｈ）、４．３４−４．１８（ｍ、２Ｈ）、４．０９−４．０３（ｍ、１Ｈ）、３．９８−３．９０（ｍ、５Ｈ）、３．８５−３．７４（ｍ、６Ｈ）、３．６６−３．４８（ｍ、７Ｈ）、３．４３−３．２４（ｍ、４１Ｈ）、３．２３−３．１５（ｍ、１３Ｈ）、３．１２（ｍ、２Ｈ）、３．１０−３．０１（ｍ、７Ｈ）、２．９９−２．８８（ｍ、３Ｈ）、２．７８（ｔ、２Ｈ）、２．０４（ｓ、３Ｈ）。
【００９９】
（実施例７）
化合物１４
五糖９（１００ｍｇ）［五糖９は、国際公開第０１／４２２６２号に記載の誘導体化された単糖５と、米国特許出願公開第２００４／００２４１９７号に記載の四糖４８との、脱保護及び硫酸化を含めて、これらの特許出願に記載の方法と類似の方法を用いたカップリングによって得ることができる。］及び化合物１３（１８ｍｇ、１．５当量）をＤＭＦに溶解させた。ＮＭＭ（１５μＬ、２．５当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を分取Ｇ２５カラムによって精製した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、１４（８４ｍｇ、７９％）を白色粉末として得た。純度＞９５％（分析陰イオン交換、ＵＶ２１０ｎｍ）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ５．１２（ｄ、１Ｈ）、５．０９（ｄ、１Ｈ）、４．８２（ｄ、１Ｈ）、４．４０−４．２６（ｍ、１Ｈ）、４．１０−３．８７（ｍ、８Ｈ）、３．８２−３．７３（ｍ、４Ｈ）、３．６７−３．４３（ｍ、１１Ｈ）、３．４１−３．３５（ｍ、１４Ｈ）、３．３１−３．２６（ｍ、１３Ｈ）、３．２４−３．１５（ｍ、８Ｈ）、３．１４−３．０２（ｍ、５Ｈ）、３．０１−２．８７（ｍ、３Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ）。
【０１００】
スキーム３． 五糖スペーサー誘導体１１、１２及び１４の合成。
【０１０１】
【化２１】
【０１０２】
（実施例８）
化合物１５
ＲｅｃＨインスリン（７７９ｍｇ）を無水ＤＭＳＯ（２５ｍＬ）及びＡｃＯＨ（４６５μＬ）に溶解させた。Ｂｏｃ２Ｏ（７３ｍｇ、２．５当量）を溶液に添加し、生成した混合物を周囲温度で５時間撹拌した。０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／１、ｖ／ｖ、１５０ｍＬ）溶液を添加して反応をクエンチし、溶液を４回凍結乾燥させた。残渣を０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／ｌ）／ＡＣＮ（３：１）溶液に溶解させ、主生成物を分取ＨＰＬＣによって単離した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、Ａ１，Ｂ１−ジＢｏｃインスリン１５（２００ｍｇ、２６％）を白色粉末として得た。純度：９８％（分析ＨＰＬＣ）。Ｃ２６７Ｈ３９９Ｎ６５Ｏ８１Ｓ６のＭＳ計算値＝６００８、（ｒｅｃＨインスリンを内部比較基準として用いた）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実測値６００８。
【０１０３】
（実施例９）
化合物１６
ＲｅｃＨインスリン（７５２ｍｇ）を無水ＤＭＳＯ（２０ｍＬ）及びＴＥＡ（０．７５ｍＬ）に溶解させた。Ｂｏｃ２Ｏ（６６ｍｇ、２．５当量）のＤＭＳＯ（５ｍＬ）溶液を溶液に添加し、反応物を周囲温度で１．５時間撹拌した。０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／１、ｖ／ｖ、１５０ｍＬ）溶液を添加して反応をクエンチし、混合物を３回凍結乾燥させた。生成した残渣を０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／１）に溶解させ、分取ＨＰＬＣに供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、Ａ１，Ｂ２９−ジＢｏｃインスリン１６を白色粉末として得た（３３２ｍｇ、４３％）。純度：＞９８％（分析ＨＰＬＣ）。Ｃ２６７Ｈ３９９Ｎ６５Ｏ８１Ｓ６のＭＳ計算値＝６００８、（ｒｅｃＨインスリンを内部比較基準として用いた）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実測値６００８。
【０１０４】
（実施例１０）
化合物１７
Ａ１，Ｂ１−ジＢｏｃインスリン１５（２００ｍｇ）を無水ジメチルスルホキシド（５ｍＬ）及びトリエチルアミン（１４５μＬ）に溶解させた。ＧＭＢＳ（４５ｍｇ、５当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で３０分間撹拌した。０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／１、ｖ／ｖ、１５０ｍＬ）を添加して反応混合物をクエンチし、生成した混合物を凍結乾燥させて、Ａ１，Ｂ１−ジＢｏｃ−Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１７（０．５ｇ、粗製）を得た。これをさらに精製せずに次の段階に使用した。
【０１０５】
（実施例１１）
化合物１８
Ａ１，Ｂ２９−ジＢｏｃインスリン１６（３３０ｍｇ）を無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）及びＴＥＡ（３３２μＬ）に溶解させた。ＧＭＢＳ（２３０ｍｇ、１５当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で３０分間撹拌した。０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／１、ｖ／ｖ、１５０ｍＬ）溶液を添加して反応混合物をクエンチし、生成した溶液を凍結乾燥させて、Ａ１，Ｂ２９−ジＢｏｃ−Ｂ１−ＧＭＢインスリン１８（０．６ｇ、粗製）を得た。これをさらに精製せずに次の段階に使用した。
【０１０６】
（実施例１２）
化合物１９
Ａ１，Ｂ１−ジＢｏｃ−Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１７（０．５ｇ、粗製）をＴＦＡ（５ｍＬ）に溶解させ、周囲温度で１０分間撹拌した。ＴＦＡを減圧除去し、残渣を０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（２／１、ｖ／ｖ）溶液に溶解させ、溶液をすぐに分取ＨＰＬＣに供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１９を白色粉末として得た（９３ｍｇ、４７％）。純度 ＞９９％（分析ＨＰＬＣ）。
【０１０７】
（実施例１３）
化合物２０
Ａ１，Ｂ２９−ジＢｏｃ−Ｂ１−ＧＭＢインスリン１８（０．６ｇ、粗製）をＴＦＡ（５ｍＬ）に溶解させ、混合物を周囲温度で１０分間撹拌した。ＴＦＡを減圧蒸発させ、粗生成物を０．１％ＴＦＡのＨ２Ｏ／ＡＣＮ（９／２、ｖ／ｖ）溶液に溶解させ、生成溶液をすぐに分取ＨＰＬＣに供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、Ｂ１−ＧＭＢインスリン２０を白色粉末として得た（１２７ｍｇ、４０％）。純度 ＞９９％ 分析ＨＰＬＣ）。Ｃ２６７Ｈ３９９Ｎ６５Ｏ８１Ｓ６のＭＳ計算値＝５９７３、（ｒｅｃＨインスリンを内部比較基準として用いた）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実測値５９７３。
【０１０８】
（実施例１４−１９）
ＧＭＢ−インスリンと五糖の複合化の一般的手順
ＧＭＢ−インスリン１９又は２０（２５ｍｇ）を０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝剤（１２ｍＬ、ｐＨ７．０、Ｎ２を溶液に通して脱気）に溶解させた。溶液を磁気撹拌子で撹拌し、さらに３０分間脱気した。次いで、五糖５、１１、１２又は１４（２３ｍｇ、２．５当量）を固体として添加し、続いてＮＨ２ＯＨ（５０μＬ、０．０５Ｍ）を添加した。反応混合物を窒素雰囲気下で周囲温度で撹拌した。１６時間後、反応混合物を分取ＨＰＳＥＣ（Ｓ７５）に供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、インスリン−ペンタ複合物２４、２５、２６、２７、２８、２９を白色粉末として、３０％−５０％の典型的な収率で得た。収率は、Ａ２８０測定によってｒｅｃＨインスリンの場合と同じモル吸光係数を用いて求めた。
【０１０９】
（実施例１４）
化合物２４
Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１９（２５ｍｇ）を五糖５（２３ｍｇ）と一般的手順に従って複合化して、Ｂ２９−五糖インスリン誘導体２４（１５ｍｇ、４５％）を得た。Ｃ３２０Ｈ４８７Ｎ６７Ｏ１３７Ｓ１４のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝７９１３、Ｑ−ＴＯＦによる実測値２６３８．７ Ｍ３＋；１９７９．２ Ｍ４＋；１５８３．６ Ｍ５＋、１３１９．８ Ｍ６＋。純度：＞９８％（分析ＨＰＳＥＣ、分析陰イオン交換）。
【０１１０】
（実施例１５）
化合物２５
Ｂ１−ＧＭＢインスリン２０（２５ｍｇ）を五糖５（２３ｍｇ）と一般的手順に従って複合化して、Ｂ１−五糖インスリン誘導体２５（１６ｍｇ、４７％）を得た。Ｃ３２０Ｈ４８７Ｎ６７Ｏ１３７Ｓ１４のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝７９１３、Ｑ−ＴＯＦによる実測値２６３７ Ｍ３＋；１９７８ Ｍ４＋；１５８３ Ｍ５＋。純度：＞９５％（分析ＨＰＳＥＣ）、＞９８％（分析陰イオン交換）。
【０１１１】
（実施例１６）
化合物２６
Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１９（１３ｍｇ）を五糖１４（１２ｍｇ）と一般的手順に従って複合化して、Ｂ２９−五糖インスリン誘導体２６（５ｍｇ、３１％）を得た。Ｃ３１２Ｈ４７１Ｎ６７Ｏ１３３Ｓ１４のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝７７３７、Ｑ−ＴＯＦによる実測値２５７８ Ｍ３＋；１９３４ Ｍ４＋。純度：＞９８％（分析ＨＰＳＥＣ）。
【０１１２】
（実施例１７）
化合物２７
Ｂ１−ＧＭＢインスリン２０（１５ｍｇ）を五糖１４（１３ｍｇ）と一般的手順に従って複合化して、Ｂ１−五糖インスリン誘導体２７（８ｍｇ、４０％）を得た。Ｃ３１２Ｈ４７１Ｎ６７Ｏ１３３Ｓ１４のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝７７３７、Ｑ−ＴＯＦによる実測値２５７８ Ｍ３＋；１９３４ Ｍ４＋。純度：＞９８％（分析ＨＰＳＥＣ）。
【０１１３】
（実施例１８）
化合物２８
Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１９（１５ｍｇ）を五糖１２（１３ｍｇ）と一般的手順に従って複合化して、Ｂ２９−五糖インスリン誘導体２８（６ｍｇ、３０％）を得た。Ｃ３２１Ｈ４８９Ｎ６７Ｏ１３４Ｓ１３のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝７８４７、Ｑ−ＴＯＦによる実測値１９６２ Ｍ４＋；１５７０ Ｍ５＋；１３０８ Ｍ６＋。ＨＰＳＥＣ純度：＞９８％。
【０１１４】
（実施例１９）
化合物２９
Ｂ２９−ＧＭＢインスリン１９（１５ｍｇ）を五糖１１（１３ｍｇ）と一般的手順に従って複合化して、Ｂ２９−五糖インスリン誘導体２９（７ｍｇ、３３％）を得た。Ｃ３２２Ｈ４９１Ｎ６７Ｏ１３１Ｓ１２のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝７７８２、Ｑ−ＴＯＦによる実測値２５９３ Ｍ３＋；１９４５ Ｍ４＋；１５５６ Ｍ５＋。純度：＞９８％（分析ＨＰＳＥＣ）。
【０１１５】
スキーム４． インスリン−五糖複合物２４−２９の合成
【０１１６】
【化２２】
【０１１７】
キャラクタリゼーション
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
化合物２４−２９をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ２６／１０カラムを用いた分析的なＨＰ−ＳＥＣ分析に供した。５０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて流量１．０ｍＬ／ｍｉｎで溶出させた。
【０１１８】
表１． インスリン複合物２４−２９のＨＰＳＥＣ分析
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
全ての複合物が単一ピーク（少なくとも＞９５％純度）として観測され、インスリン−五糖の凝集体が存在しないことを示している。
【０１２１】
Ｎ末端配列解析
インスリン−五糖複合物２４−２９並びに対応する前駆体１５、１６、１９及び２０をＮ末端配列解析（エドマン分解）に供した。実施したサイクルの各々において、Ｂ２９が置換されたインスリン誘導体１５、１９、２４、２６、２８及び２９は、複合物の初期量のレベルに匹敵するレベルでＡ鎖アミノ酸とＢ鎖アミノ酸の等モル量を生成した。これは、両方のＮ末端の利用性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）が十分であることを示し、したがってＢ２９位に限定される複合部分が存在しないことを示している。これに対し、Ｂ１が置換されたインスリン誘導体１６、２０、２５及び２７のＮ末端配列決定中にはＡ鎖アミノ酸しか見出されなかった。これは、Ｂ鎖のＮ末端におけるエドマン分解が結果として阻害されたＢ１位における複合化を示している。
【０１２２】
生体分子間相互作用解析を用いた競合的ｈＡＴＩＩＩ結合アッセイ
試験の原理及び目的：生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）は、相互作用物の一方をセンサーチップ表面に共有結合によって固定し、もう一方の相互作用物をこの表面を連続して流れる緩衝剤に注入することによって、（生体）分子間の相互作用を試験する。結合は、この表面での屈折率の変化として記録され、相互作用物の分子量（Ｍｗ）に比例する。
【０１２３】
ｈＡＴＩＩＩと五糖複合物の相互作用を試験するために、化合物９をセンサーチップ表面に共有結合させる。ｈＡＴＩＩＩと五糖が結合することによって、結合した（小さい）五糖リガンドと（大きい）ｈＡＴＩＩＩ分析物とのＭｗの差の結果として、強い信号が発生する。一定濃度のｈＡＴＩＩＩと可変濃度の遊離五糖又は複合物とを含む、プレインキュベートした試料を表面全体に注入する。プレインキュベーション中に五糖又は複合物とＡＴＩＩＩが結合すると、固定化五糖に結合するＡＴＩＩＩが減少する。この競合結合アッセイによって、各五糖複合物のＩＣ５０値を求めることができる。
【０１２４】
実験手順：化合物９をアミンカップリングによってｐＨ８．５でＣＭ５センサーチップに共有結合させる。センサーチップをＥＤＣ／ＮＨＳによって１５分間活性化させ、続いて化合物９を濃度１００μｇ／ｍＬで注入する。未反応ヒドロキシスクシンイミド基をエタノールアミンと７分間反応させる。５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ ５μＬを流量２５μＬ／ｍｉｎで３回短時間注入して表面を再生させる。五糖の固定化を検出することはできないが、上記のように処理した表面とｈＡＴＩＩＩの結合は特異的であることが判明した。これは、表面に五糖が存在することを示している。一連の濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓ）のｈＡＴＩＩＩを試験して、（最大結合量の８０％において）阻害に敏感な濃度を推定した。ブランク（ｂｌａｎｃ）及び固定化表面に流量２０μＬ／ｍｉｎで２５℃で順次３分間注入した。記録点を１７０秒にする。５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを１２秒間注入して表面を再生する。
【０１２５】
試料を、一定濃度のｈＡＴＩＩＩ（すなわち１５ｎｍｏｌ／Ｌ）と０．７８−１００ｎＭの濃度の五糖複合物に対して試験する。五糖複合物のないｈＡＴＩＩＩ注入又は記録点を１００％結合とする。最大結合量に対する五糖と複合物の相対結合％を用い、Ｌｏｇ［濃度］と結合％をプロットすることによって（可変勾配を有する）Ｓ字曲線を作成した。このＳ字曲線からＩＣ５０値を得た。
表２． 競合結合アッセイ（ＢＩＡ試験）における潜在的ＡＴＩＩＩ結合能力を表すＩＣ５０値
【０１２６】
【表２】
【０１２７】
結論 − 基準担体五糖７−９（図５、表２）間のＩＣ５０の差から、ＡＴＩＩＩに対する結合親和性の尺度である、ＡＴＩＩＩに対する潜在的競合結合能力を、これらの分子中の硫酸基数を変えることによって調整できることが確認される。ｈＡＴＩＩＩに対する全ての対応するインスリン−五糖複合物（２４−２９）の潜在的（競合）結合能力（ＩＣ５０）は、親の基準五糖７−９と比較して同じ範囲にある（図６、表２）。これらのデータによれば、複合物の薬物動態特性は、ＡＴＩＩＩに対して異なる結合親和性を有する代替の担体五糖を用いることによって調整することができる。
【０１２８】
質量分析法
五糖複合物の質量分析法による典型的な分析結果を図７に示す。例えば、総計の式（ｂｒｕｔｏ ｆｏｒｍｕｌａ）Ｃ３２０Ｈ４８７Ｎ６７Ｏ１３７Ｓ１４及びモノアイソトピック質量計算値７９１３を有する化合物２４をＥＳＩ−ＱＴＯＦシステムで分析した。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルでは、ｒｅｃＨインスリンの電荷分布と一致するｍ／ｚ比１３１９．８（６＋）、１５８３．６（５＋）、１９７９．２（４＋）、２６３８．７（３＋）の複数の荷電イオンが出現した。また、Ｃ３２０Ｈ４８７Ｎ６７Ｏ１３７Ｓ１４（化合物２４）に対して無作為に選択した２価以上の荷電ピーク（例えば５＋）の同位体分布は、Ｉｓｏｐｒｏプログラムを用いて理論計算した同位体分布（図７Ａの点線を参照）と一致する。
【０１２９】
ＧｎＲＨ拮抗デカペプチドと五糖の一般的複合化手順（実施例２０、２１、２４、２５）
ガニレリクス誘導体（ｄｅｒｖａｔｉｖｅ）３０又は３５（７０ｍｇ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に窒素雰囲気下で溶解させた。ＴＢＴＵ（１４ｍｇ、１．０５当量）及びＮＭＭ（２５μＬ、５当量）を添加し、混合物を周囲温度で１時間撹拌した。五糖８又は９（８８ｍｇ、１．１当量）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解させて、懸濁液を得た。この懸濁液を反応混合物に添加し、残りの混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。反応混合物を水（２００ｍＬ）で希釈し、凍結乾燥させた。生成した残渣を、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７）を用いた逆相シリカ（Ｃ１８）にかけ、１０から５０％ＡＣＮの勾配でブロック溶出（ｂｌｏｃｋ−ｅｌｕｔｉｏｎ）させて精製した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、ガニレリクス五糖複合物３１、３２、３６又は３７を白色粉末として得た。勾配溶出による分析ＨＰＬＣを、溶離剤Ａ（０．０１Ｍ酢酸アンモニウム）９０％と溶離剤Ｂ（ＡＣＮ）１０％で５分間開始し、次いで溶離剤Ｂ １００％までの勾配を３０分間適用して実施した。
【０１３０】
（実施例２０）
化合物３１
Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９２， ３５， ３９４２−３９４８に記載の固相ペプチド合成によって調製したガニレリクス誘導体３０（７０ｍｇ）を、一般的手順に従って五糖８（８８ｍｇ）と複合化して、３１（１６ｍｇ、４０％）を得た。純度９６％（分析ＨＰＬＣ）、９７％（分析陰イオン交換）。Ｃ１２６Ｈ１９１ＣｌＮ１８Ｏ６２Ｓ６のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝３１７５．０３５９、実測値７９２．７３９０［Ｍ−４Ｈ］４−、１０５７．３２５８［Ｍ−３Ｈ］３−、１０６２．９８８３［Ｍ＋ＮＨ３−３Ｈ］３−。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ８．５６（ｍ、１Ｈ）、８．５３（ｍ、１Ｈ）、８．１０（ｍ、１Ｈ）、７．７６（ｍ、２Ｈ）、７．６８（ｍ、２Ｈ）、７．４７（ｍ、１Ｈ）、７．３９（ｍ、２Ｈ）、７．１６（ｍ、３Ｈ）、７．０４（ｍ、２Ｈ）、６．９５（ｍ、２Ｈ）、６．６３（ｍ、２Ｈ）、５．３５−５．２５（ｍ、２Ｈ）、４．９５（ｍ、１Ｈ）、４．６８−４．６１（ｍ、１Ｈ）、４．６１−４．５１（ｍ、２Ｈ）、４．５０−４．３８（ｍ、２Ｈ）、４．３８−４．２５（ｍ、３Ｈ）、４．２４−３．９６（ｍ、１５Ｈ）、３．９０−３．８４（ｍ、１Ｈ）、３．８４−３．６７（ｍ、８Ｈ）、３．６７−３．２０（ｍ、５３Ｈ）、３．１９−３．０９（ｍ、４Ｈ）、３．０９−２．９８（ｍ、１２Ｈ）、２．９８−２．８４（ｍ、８Ｈ）、２．７７（ｍ、２Ｈ）、２．１３（ｍ、１Ｈ）、１．９６−１．７２（ｍ、５Ｈ）、１．６８−１．４２（ｍ、５Ｈ）、１．４２−１．２０（ｍ、７Ｈ）、１．１８−０．８９（ｍ、１３Ｈ）、０．８５−０．７１（ｍ、５Ｈ）。
【０１３１】
（実施例２１）
化合物３２
ガニレリクス誘導体３０（７０ｍｇ）を一般的手順に従って五糖９（８８ｍｇ）と複合化して３２（５２ｍｇ、３５％）を得た。Ｃ１２５Ｈ１８９ＣｌＮ１８Ｏ６５Ｓ７の質量計算値＝３２４０．９７７０；ＥＳＩ−ＱＴＯＦによる実測値８０９．２２１９［Ｍ−４Ｈ］４−、１０７９．２９９４［Ｍ−３Ｈ］３−、１０８４．９７３９［Ｍ＋ＮＨ３］３−、１０９０．６３４０、［Ｍ＋２ＮＨ３−３Ｈ］３−。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ８．４５（ｍ、１Ｈ）、８．３８（ｍ、１Ｈ）、７．９０（ｍ、１Ｈ）、７．７８（ｄ、１Ｈ）、７．７３（ｍ、２Ｈ）、７．５９（ｍ、１Ｈ）、７．５０（ｍ、１Ｈ）、７．４３（ｍ、２Ｈ）、７．２０（ｍ、３Ｈ）、７．０５（ｄ、２Ｈ）、６．９７（ｍ、２Ｈ）、６．６６（ｍ、２Ｈ）、５．４０−５．３０（ｍ、２Ｈ）、５．０９（ｄ、１Ｈ）、４．６７−４．４８（ｍ、２Ｈ）、４．４０−３．９２（ｍ、１８Ｈ）、３．９２−３．７５（ｍ、７Ｈ）、３．７７−３．１７（ｍ、５６Ｈ）、３．１２−３．０２（ｍ、１１Ｈ）、３．０２−２．９８（ｍ、８Ｈ）、２．９７−２．８３（ｍ、４Ｈ）、２．８１−２．７５（ｍ、２Ｈ）、２．１４（ｍ、１Ｈ）、１．９９−１．８６（ｍ、５Ｈ）、１．８２−１．２３（ｍ、１２Ｈ）、１．２２−０．９０（ｍ、１３Ｈ）、０．８７−０．７２（ｍ、５Ｈ）。純度：９５％（分析ＨＰＬＣ）、９７％（分析陰イオン交換純度）。
【０１３２】
（実施例２２）
化合物３４
化合物３０（１００ｍｇ）をＤＭＦに溶解させた。ＴＢＴＵ（３６ｍｇ、２当量）及びＮＭＭ（６０μＬ、１０当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で１時間撹拌した。次いで、国際公開第２００５０９０３８２号に記載のように調製した化合物３３（３４ｍｇ、２当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を水／ＣＡＮに溶解させ、生成した溶液を分取ＨＰＬＣ（勾配：溶離剤Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）８０％と溶離剤Ｂ（ＡＣＮ）２０％から溶離剤Ａ ２０％と溶離剤Ｂ ８０％まで４５分間）に供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、化合物３４（６０ｍｇ、６０％）を白色粉末として得た。分析ＨＰＬＣを、溶離剤Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）７５％と溶離剤Ｂ（ＣＨ３ＣＮ）２５％から溶離剤Ａ ２０％と溶離剤Ｂ ８０％までの勾配を１５分間適用して実施した。Ｃ９４Ｈ１３９ＣｌＮ１８Ｏ１９の質量計算値＝１８５９、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実測値１８６０［Ｍ＋Ｈ］＋及び１８８２［Ｍ＋Ｎａ］＋。純度：＞９０％（分析ＨＰＬＣ）。
【０１３３】
（実施例２３）
化合物３５
化合物３４（６０ｍｇ）をＨ２Ｏ／ＴＦＡ／ＡＣＮ（７ｍＬ、５：１：１）に溶解させ、周囲温度で２時間撹拌した。過剰量のＴＦＡ（２．５ｍＬ）を添加し、反応混合物をさらに２２時間撹拌した。ＴＦＡを減圧蒸発させ、残りの溶液を凍結乾燥させて、３５（４５ｍｇ、７７％）を白色粉末として得た。Ｃ９０Ｈ１３１ＣｌＮ１８Ｏ１９の質量計算値＝１８０３、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの実測値１８０４［Ｍ＋Ｈ］＋及び１８２６［Ｍ＋Ｎａ］＋。純度：＞９５％（分析ＨＰＬＣ）。
【０１３４】
（実施例２４）
化合物３６
ガニレリクス誘導体３５（１７ｍｇ）を五糖８（１９ｍｇ）と一般的手順に従って複合化した。さらなる精製を分取ＨＰＬＣ（勾配：溶離剤Ａ（０．０１Ｍ酢酸アンモニウム）９０％と溶離剤Ｂ（ＣＨ３ＣＮ）１０％を５分間、次いでＢ １００％まで５０分間）によって実施した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、３６（２ｍｇ、６％）を得た。純度：９４％（分析ＨＰＬＣ）、＞９８％（分析陰イオン交換）。
【０１３５】
（実施例２５）
化合物３７
ガニレリクス誘導体３５（１７ｍｇ）を五糖９（１９ｍｇ）と一般的手順に従って複合化した。さらなる精製を、化合物３６の場合と同様に、分取ＨＰＬＣによって実施した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、３７（１．１６ｍｇ、３％）を得た。純度：８８％（分析ＨＰＬＣ）。分析陰イオン交換純度：＞９５％。
【０１３６】
スキーム５． 化合物３１、３２、３６及び３７の合成。
【０１３７】
【化２３】
【０１３８】
結論：（図８に示す）複合物３１及び３２と複合物３６及び３７とのＡＴＩＩＩに対する潜在的競合結合能力の差は、連結残基の長さに無関係に、ＡＴＩＩＩに対する親和性を、これらの分子に含まれる硫酸基数を変えることによって調整できることを示している。さらに、これらのデータによれば、これらの複合物のインビボでの薬物動態特性が五糖を選択することによって調整することができる（下記の薬物動態試験参照）。また、複合化されていない親ペプチドガニレリクスがＡＴＩＩＩと競合結合を示さないことから、複合物とＡＴＩＩＩの結合は特異的である。
【０１３９】
（実施例２４）
化合物３９
ＮｅｏＭＰＳ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）によって供給される化合物３８（２６．５ｍｇ、８．４μｍｏｌ）を、脱気した０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝剤（１６ｍＬ、ｐＨ７．０）に溶解させた。五糖５（４５．５ｍｇ、２１μｍｏｌ、２．５当量）を窒素雰囲気下で添加し、生成した混合物を約１０分間撹拌した。次いで、ＮＨ２ＯＨ水溶液（５０ｗｔ％、６９μＬ）を添加し、反応混合物を１６時間撹拌した。生成物をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２Ｍ ＮａＣｌ（ａｑ）／Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ、１０／４０／１→４０／１０／１、ｖ／ｖ／ｖ）によって精製した。適切な画分を、上述したようにＧ２５ ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーによって脱塩して、化合物３９（１５．７ｍｇ、３５％）を得た。収率は、１ｍｇ／ｍＬ溶液に対する理論吸光度０．４８を用いてＡ２８０測定によって求めた。Ｃ１９６Ｈ３０９Ｎ４１Ｏ１０１Ｓ８の質量計算値＝５１０８．８；ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦによる実測値＝１７４０．６［Ｍ＋５Ｎａ］３＋、１３１１．２［Ｍ−１Ｈ＋６Ｎａ］４＋、１０５３．５［Ｍ−２Ｈ＋７Ｎａ］５＋
スキーム６． 化合物３９の合成
【０１４０】
【化２４】
【０１４１】
結論：図９に示すように、ＡＴＩＩＩに対する複合物３９の潜在的競合結合能力は、親の五糖−スペーサー残基（図５、化合物９参照）と比較して、一定である。これらのデータは、ペプチドのインビボでの半減期が、ＡＴＩＩＩ結合性担体の五糖との複合化によって、かなり延長され得ることを示唆している（下記の薬物動態試験参照）。また、複合化されていない親ペプチドＡＤＭ（２７−５２）がＡＴＩＩＩと競合結合を示さないことから、複合物とＡＴＩＩＩの結合は特異的である。
【０１４２】
（実施例２５）
化合物４１
ＮｅｏＭＰＳ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）によって調製された化合物４０（１５ｍｇ、４．２μｍｏｌ）を、脱気した０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝剤（８ｍＬ、ｐＨ７．０）に溶解させた。五糖５（２２．７ｍｇ、１０．４μｍｏｌ、２．５当量）を窒素雰囲気下で添加し、混合物を約１０分間撹拌した。次いで、ＮＨ２ＯＨ水溶液（５０ｗｔ％、０．１４ｍＬ）を添加し、反応混合物を１６時間撹拌した。生成物を、化合物３９の場合と同様に精製して、化合物４１（１．３８ｍｇ、６％）を得た。収率は、１ｍｇ／ｍＬ溶液に対する理論吸光度１．２２を用いてＡ２８０測定によって求めた。Ｃ２１８Ｈ３４２Ｎ４４Ｏ１０６Ｓ８の質量計算値＝５５２８；ＥＳＩ Ｑ−ＴＯＦの実測値＝１８４３．７［Ｍ＋３Ｈ］３＋、１３８３．０［Ｍ＋４Ｈ］４＋、１１０７ Ｍ＋５Ｈ］５＋。
【０１４３】
結論：ＡＴＩＩＩに対する複合物４１の潜在的競合結合能力は、親の五糖−スペーサー残基化合物９と比較して、一定である（図１０参照）。これらのデータは、ペプチドのインビボでの半減期が、ＡＴＩＩＩ結合性担体の五糖との複合化によって、かなり延長され得ることを示唆している（下記の薬物動態試験参照）。
【０１４４】
スキーム７． 化合物４１の合成
【０１４５】
【化２５】
【０１４６】
（実施例２６）
化合物４４
Ｂａｃｈｅｍ（Ｗｅｉｌ ａｍ Ｒｈｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などの供給業者から入手することができるオクトレオチド（化合物４２、５０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解させた。ＡｃＯＨ（７μＬ）を添加して、微酸性溶液を作製した。続いて、ＧＭＢＳ（１１．２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、生成溶液を窒素下で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析によれば、ＧＭＢ部分がＮ末端Ｐｈｅ残基に極めて位置選択的に導入されたＧＭＢオクトレオチド４３にほぼ完全に転化された。反応物を約５℃に冷却し、ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４（２０ｍＬ、ｐＨ７．０）溶液を添加した。１０分後、混合物を室温にし、Ｎ２を１０分間通した。次いで、五糖５（２１．８ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、０．２５当量）を窒素雰囲気下で固体として添加し、続いてＮＨ２ＯＨ水溶液（０．１１ｍＬ、５０ｗｔ％）を添加し、反応混合物を１６時間撹拌した。生成物を、上述したようにイオン交換クロマトグラフィーによって精製して、化合物４４（６．３ｍｇ、１９％）を得た。Ｃ１１２Ｈ１７０Ｎ１２Ｏ７０Ｓ１０の質量計算値＝３１２２．７；ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦによる実測値＝１５６２．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋、１０４１．９［Ｍ＋３Ｈ］３＋。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ７．５２−７．２９（ｍ、１０Ｈ）、７．２６−７．１４（ｍ、４Ｈ）、７．０３（ｓ、１Ｈ）、５．４４（ｍ、１Ｈ）、５．３７（ｍ、１Ｈ）、５．１４（ｍ、１Ｈ）、５．１２−４．８９（ｍ、２Ｈ）、４．７７−４．６０（ｍ、３Ｈ）、４．４５−３．９７（ｍ、１８Ｈ）、３．９５−３．７６（ｍ、１３Ｈ）３．７５−３．３５（ｍ、５７Ｈ）、３．３３−２．５９（ｍ、１８Ｈ）、２．２２−１．１６（ｍ、２Ｈ）、１．８５−１．７６（ｍ、３Ｈ）、１．７１−１．３８（ｍ、３Ｈ）、１．３２−１．１５（ｍ、７Ｈ）、０．８１−０．６１（Ｍ、２Ｈ）。
【０１４７】
スキーム８． 化合物４４の合成
【０１４８】
【化２６】
【０１４９】
結論：ＡＴＩＩＩに対する複合物４４の潜在的競合結合能力は、親の五糖−スペーサー残基化合物９と比較して、一定である（図１１参照）。これらのデータは、ＡＴＩＩＩ結合性担体の五糖との複合化によって、ペプチドのインビボでの半減期がかなり延長されることを示している。
【０１５０】
（実施例２７）
化合物４６
五糖９（１００ｍｇ）及びＧＭＢＳ（２２ｍｇ、１．５当量）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解させた。ＤｉＰＥＡ（１８μＬ、２当量）を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を分取Ｇ２５カラムによって精製した。混合画分を凍結乾燥させて、４６（５０ｍｇ、４６％）を白色粉末として得た。Ｃ５３Ｈ７７Ｎ２Ｏ５５Ｓ７Ｎａ９のＥＳＩ−ＭＳ計算値＝２０５２；ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦによる実測値＝１０２７Ｍ２＋。
【０１５１】
（実施例２８）
化合物４７
五糖マレイミド誘導体４６を未変性ｒｅｃＨ−ＩＬ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、２０２−ＩＬ／ＣＦ）の遊離Ｃｙｓ１２５と複合化した。複合化前に、ｒｅｃＨ−ＩＬ−２をＨＰＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した。それによれば、ｒｅｃＨ−ＩＬ−２は、圧倒的に単一な組成であった。ｒｅｃＨ−ＩＬ２（１ｍｇ、８００μＬ、１．２６ｍｇ／ｍＬ ０．５％ＳＤＳ含有ＰＢＳ溶液）をロールバンク上で過剰の化合物４６（１０ｍｇ／ｍＬ水溶液５９μＬ、５当量）で終夜室温で処理して、出発材料を完全に転化させた。次に、未反応マレイミド４６を５倍モル過剰のシステアミン（１６μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）で３時間ブロックした。反応混合物を、０．５％ＳＤＳのＰＢＳ溶液で透析して（カットオフ６−８ｋＤａ）、過剰のシステアミン及び４６を除去した。生成物の最終量はＡ２８０で求めて０．６９ｍｇであった。
【０１５２】
最終複合物４７をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１２％）及びウエスタンブロットによって分析した（図１２参照）。レーン３及び４から、化合物４７は、（五糖部分の存在に対応して）ｒｅｃＨ−ＩＬ２よりも高いＭｗを有すると結論される。ａ）１０μｇ／ｍＬ ｈＡＴＩＩＩ（ＨＡＴ ９５０Ａ２Ｌ−Ｋｏｒｄｉａ）；ｂ）ａ−ｈＡＴＩＩＩ（ＭｏＡｂ ＨＡＴＩＩＩ ２００−Ｋｏｒｄｉａ）；ｃ）ＧＡＭ−ＨＲＰ（Ｗ４０２Ｂ ２０３７３２０１−Ｐｒｏｍｅｇａ）のウエスタンブロット分析とそれに続くインキュベーション及びＤＡＢ試薬による最終の検出によって、五糖含有ＩＬ２との特異的ＡＴＩＩＩ結合（レーン７対８）が明らかになった。
【０１５３】
スキーム９． 複合物４７の合成
【０１５４】
【化２７】
【０１５５】
薬理学
複合（ポリ）ペプチドの薬物動態の測定
本発明の化合物の代表例の薬物動態特性を以下のパラグラフに記載のように求めた。
【０１５６】
ラット血しょう中のインスリンを測定するためのヒトインスリンＥＬＩＳＡ
ヒト及びラットの血しょう又は緩衝系中のヒトインスリンを測定するために、ヒト酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を開発した。このようにして、ＥＬＩＳＡを使用して、薬物動態学的実験由来の血しょう試料中のインスリン濃度を求めることができる。
【０１５７】
アッセイは、２種類のモノクローナル抗体、すなわち固相に結合した捕捉抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された検出抗体とを用いた免疫化学的「サンドイッチ」原理に基づく。
【０１５８】
五糖−インスリン複合物６及び組換えヒトインスリン（ｒｅｃＨインスリン、バッチＳＩＨＲ０１７、Ｄｉｏｓｙｎｔｈ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）の薬物動態特性を求めるために、ラット血しょう試料を１０Ｈｚで振とうしながら室温で１時間インキュベートした。このインキュベーション中に、五糖−インスリン複合物６又はｒｅｃＨインスリンは、固定化抗インスリン抗体と結合する。第２の洗浄手順後、ＨＲＰと複合化された検出抗体抗インスリンを添加して、固定化インスリン複合体に結合させた。プレートを洗浄して、結合していない酵素標識抗体を除去し、続いて３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン／Ｈ２Ｏ２基質溶液を添加した。反応を０．５Ｍ硫酸によって停止させ、マイクロタイタープレートを分光測定によって４５０ｎｍで読み取った。色の強度は、インスリン濃度に正比例する。次いで、各血しょう試料について、インスリンの平均濃度（ｍｏｌ／Ｌ）を求めた。
【０１５９】
化合物６の薬物動態特性の測定
インスリン複合物６及びｒｅｃＨインスリンの薬物動態学的挙動を３００−４００ｇのオスのウィスターラットで試験した。ラットをＯ２／Ｎ２Ｏ／イソフルラン混合物の吸入によって麻酔し、その後、右の頚静脈をカニューレ処置した。翌日、ラットに化合物６又はｒｅｃＨインスリン３．５ｎｍｏｌ／ｋｇをｉ．ｖ．投与し、その後、血液を幾つかの時間間隔で採取した。血液を遠心分離し、その後、血しょうを吸い上げ、使用するまで−２０℃で保存した。血しょう試料中の試験化合物の濃度を、ヒトＥＬＩＳＡによって、試験化合物自体の原液でできた検量線に対して求めた。試料中の濃度をｎｍｏｌ／Ｌで表した。動力学的パラメータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎのノンコンパートメントモデルを用いて計算した。
【０１６０】
結論：図１３及び表３に示すように、五糖−インスリン複合物６の薬物動態特性は、親のｒｅｃＨインスリンの薬物動態特性よりも大きく改善された。
【０１６１】
表３． ラットにおける化合物６又はｒｅｃＨインスリン（３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ）のｉ．ｖ．投与後の薬物動態パラメータ。実験をｎ＝３／処理で実施した。
【０１６２】
【表３】
【０１６３】
１２５Ｉ標識後の薬物動態の測定
五糖複合物２４、２８、２９、３１、３２、３９及び４１を、Ｍａｃｈａｌｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． １９６９， １１３：２９９−３０５）に従って、ラクトペルオキシダーゼ法によって１２５Ｉで標識した。標識後、複合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を用いたゲルろ過及び陰イオン交換体ＨｉＴｒａｐ Ｑ１０によって精製した。動力学的実験を化合物６の場合と同様に、但し１２５Ｉ標識複合物を代わりに用いて繰り返した。甲状腺に１２５Ｉ−が蓄積するのを防止するために、化合物の投与前にラットを１０ｍｇ／ｋｇヨウ化カリウムで経口的に処理した。
【０１６４】
１２５Ｉ標識複合物の結末（ｆａｔｅ）を正確に求めることは、循環する遊離１２５Ｉ−を生成する代謝的な細胞内の内因性脱ハロゲン化によって悪影響を受ける恐れがある。遊離１２５Ｉ−自体はラットにおける消失半減期が３．２時間であるので（対照。データ示さず。）、比較的短い半減期を有する１２５Ｉ標識化合物の実測全半減期は延長され、比較的長い半減期を有する化合物の実験的に求めた半減期は短くなり得る。実際、複合物３１、３２及び３９の観測された排出半減期は、ペプチドと担体五糖の複合化によって滞留時間が延長されることを定性的に示している。
【０１６５】
４０倍の体積のＴＣＡで沈殿させた（最終濃度１０％）後のペレット（０．１ｍＬ）中の放射能を測定することによって上記方法を改良すると、競合する内因性１２５Ｉ脱ハロゲン化に対して補正された、化合物２４、２８、２９及び４１の薬物動態パラメータが得られた。
【０１６６】
ｒｅｃＨインスリンと比較したインスリン−五糖複合物２４、２８及び２９の薬物動態
表４． インスリン複合物２４、２８及び２９のｉ．ｖ．投与後の薬物動態パラメータ。実験をｎ＝３／処理で実施した。比較のために、ｒｅｃＨインスリンをｎ＝１で試験した（ｃｐｍ単位の用量を正規化した。）。
【０１６７】
【表４】
【０１６８】
結論：１２５Ｉ標識法によって求めたインスリン−五糖複合物２４の薬物動態特性（図１４、表４）は、ＥＬＩＳＡ法によって求めた類似のインスリン−五糖複合物（化合物６）の薬物動態特性（図１３、表３）と一致した。２つの分析方法によって求めたｒｅｃＨインスリンの動力学的パラメータの差は、最初の１５分間に循環から標識が急速に消失するために、（Ｖｓｓ及びＣｌを計算する）曲線外挿の差によって説明することができる。
【０１６９】
また、インスリン五糖複合物２４、２８、２９のＡＵＣ、Ｃｌ及びＶｓｓの観測された差（図１４、表４）は、ＡＴＩＩＩに対して異なる結合親和性を有する代替の担体五糖を用いることによって複合物の薬物動態特性を調整できることを明確に示している（これは、ＢＩＡ試験の知見と一致する。図６及び表２を参照されたい。）。
【０１７０】
五糖複合物３１及び３２の薬物動態
表５． ２種類の複合物３１及び３２のｉ．ｖ．投与後の薬物動態パラメータ実験をｎ＝３／処理で実施した。（脱ハロゲン化に対する補正をしていないデータ）。
【０１７１】
【表５】
【０１７２】
結論：遊離ガニレリクスの半減期（ラットにおけるＴ１／２ １．４時間、ｉ．ｖ．、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇ． Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ １９９１， １９， ８５８）は、担体五糖との複合化によってかなり延長される（図１５、表５）。化合物３１と３２の薬物動態学の比較によれば、Ｖｓｓ、Ｃｌ及びＴ１／２排出は、ＡＴＩＩＩに対する親和性が高い五糖を使用することによって改善される。これらのデータは、ＢＩＡ試験（図８参照）の知見と合わせて、ＡＴＩＩＩに対して異なる結合親和性を有する代替の担体五糖を用いることによって複合物の薬物動態特性を調整できることを示している。
【０１７３】
五糖複合物３９及びＡＤＭ（２７−５２）の薬物動態
表６． ＡＤＭ（２７−５２）及び化合物３９のｉ．ｖ．投与後の薬物動態パラメータ。実験をｎ＝３／処理で実施した。（脱ハロゲン化に対する補正をしていないデータ）。
【０１７４】
【表６】
【０１７５】
結論：ＡＤＭ（２７−５２）の薬物動態特性は、ＡＴＩＩＩ結合性担体の五糖との複合化によって改善された（化合物３９、図１６、表６）。データを脱ハロゲン化に対して補正していないので、ＡＤＭ（２７−５２）のＴ１／２自体は、過大評価されている可能性がある。さらに、遊離アドレノメデュリンの半減期は、ヒトにおいて僅か２２分に過ぎない（Ｍｅｅｒａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． Ｍｅｔ． １９９７， ８２， ９５−１００）。これらの観測結果及びＢＩＡ試験における観測結果（図９）は、（ポリ）ペプチドの薬物動態特性が、循環ＡＴＩＩＩに対して特異的結合親和性を有する（担体）複合物への転化によって改善され得るという結論を支持する。
【０１７６】
［Ｄ−Ａｌａ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）と比較した五糖複合物４１の薬物動態
表７． ＧＬＰ−１及び化合物４１のｉ．ｖ．投与後の薬物動態パラメータ。実験をｎ＝３／処理で実施した（ｃｐｍ単位のデータを正規化した。）。
【０１７７】
【表７】
【０１７８】
結論：［Ｄ−Ａｌａ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）の薬物動態特性は、ＡＴＩＩＩ結合性担体の五糖との複合化によって改善された（化合物４１、図１７、表７）。化合物４１のＣｌは非複合ペプチドの約１／１００に減少し、Ｖｓｓは１／１３に減少し、その結果、ＡＵＣ（暴露）は約１００倍になった。ＢＩＡデータ（図１０）と合わせて、これらの観測結果は、（ポリ）ペプチドの薬物動態特性が、ＡＴＩＩＩ結合性複合物への転化によって改善され得るという結論を支持する。
【０１７９】
ラット血しょう中の（ポリ）ペプチド−五糖−ＡＴＩＩＩ複合体の測定
（ポリ）ペプチド五糖複合物がアンチトロンビンＩＩＩにインビボで確実に結合するように、捕捉抗体として抗インスリンＭａｂと検出抗体としてＨＲＰ複合抗ＡＴＩＩＩ抗体とを使用するサンドイッチ型ＥＬＩＳＡを、化合物６の薬物動態学的実験から得られた血しょう試料に対して実施した。完全な五糖−インスリン−ＡＴＩＩＩ複合体のみが、ｒｅｃＨインスリンを負の対照として使用したこのアッセイタイプにおいて検出できることは明らかである）。
【０１８０】
ラットにおいて化合物６又はｒｅｃＨインスリン３．５ｎｍｏｌ／ｋｇのｉ．ｖ．投与の１分後に得られる血しょう試料から、五糖−インスリン複合物６及びｒｅｃＨインスリンとラットＡＴＩＩＩの結合性を判定した。結果を図１８に示す。
【０１８１】
結論：五糖−インスリン複合物６はＡＴＩＩＩと結合するが、ｒｅｃＨ−インスリンはＡＴＩＩＩと複合体を形成することができない。抗ウサギＡＴＩＩＩ抗体は感応性が低いが、両方のＡＴＩＩＩ抗体は、五糖−インスリン複合物６−ＡＴＩＩＩ複合体を検出することができた。これらの結果によれば、化合物６は循環中のＡＴＩＩＩと結合し、ＡＴＩＩＩ結合性五糖の半減期の延長はこの複合体形成の結果である。したがって、元の非複合（ポリ）ペプチドよりも（化合物６などの）（ポリ）ペプチド−五糖複合物の薬物動態特性が改善されることは、複合物とＡＴＩＩＩの特異的結合によるものであると結論することができる。
【０１８２】
ラットにおけるインビボでのグルコース抑制試験
インスリン及びインスリン複合物の生物活性を、ラットモデルにおいてグルコース抑制レベルを測定することによって試験した。ラットを実験前に終夜（１６時間）絶食させた。朝、尾部を少し切って、全ラットから採血した。その後、血液を試験片に滴下し、ＡＣＣＵ−Ｃｈｅｃｋ Ｓｅｎｓｏｒ血糖モニター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてグルコースレベルを測定した。ラットを加熱箱中で３９℃で１０分間予熱後、五糖−インスリン複合物６及びインスリンを尾静脈にｉ．ｖ．投与した。投与量は、五糖−インスリン複合物６ ７ｎｍｏｌ／ｋｇ及びｒｅｃＨ−インスリン３．５ｎｍｏｌ／ｋｇであった。種々の時間間隔で、凝固した血液を除去して血液試料を採取し、その後、グルコース含量を上記のようにすぐに測定した。
【０１８３】
五糖インスリン複合物６の薬力学
ｒｅｃＨ−インスリンよりも五糖−インスリン複合物６の薬物動態特性が改善されたことは、ｉ．ｖ．投与後のグルコース抑制レベルが延長したことによって確認される（図１９参照）。
【０１８４】
化合物２４、２５、２６、２７及びインスリンデテミル（対照）を用いて実施した実験においては、（対照群における一貫したグルコースレベルを確実にするために）化合物の投与直前にラットを飢餓状態にした。
【０１８５】
Ｂ２９−インスリン複合物２４とＢ２９−インスリン複合物２６（図２０）及びＢ１−インスリン複合物２５とＢ１−インスリン複合物２７（図２１）を比較すると、グルコース抑制活性がスペーサーの長さにかかわらず同様に延長されたことがわかる。
【０１８６】
驚くべきことに、試験した全インスリン複合物の作用開始は、ｒｅｃＨインスリン又はインスリンデテミル（ｉ．ｖ．投与）の作用開始よりも遅く、暴露は、より長い作用期間によって増強されたことが判明した。
【０１８７】
２４ｎｍｏｌ／ｋｇの用量における１回の実験内のＢ２９−インスリン複合物２４、２８及び２９の直接比較によって、これらの血糖降下活性の作用期間の違いが実証される（図２２参照）。すなわち、化合物２４によるグルコースレベルの抑制は７時間以上持続したのに対して、複合物２８及び２９はｉ．ｖ．投与後５．５時間を過ぎるともはや活性ではなかった。薬力学的差は、それぞれ化合物２８及び２９と比較した、化合物２４の分布容積及びクリアランスの上記薬物動態学的差と一致する。最後に、インスリンデテミルを比較例として試験した。インスリンデテミルは、用量２４及び４８ｎｍｏｌ／ｋｇにおいて、より不明瞭でより短い活性を示した（図２１、２２）。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】インスリン特異的ＥＬＩＳＡによる五糖−インスリン複合物６（インスリン−ペンタ）の識別。
【図２Ａ】五糖（ＰＳ）−インスリン複合物６の生体分子間相互作用解析。固定化抗インスリン抗体とインスリン複合物の反応と、それに続くヒトインスリン受容体への結合。
【図２Ｂ】五糖（ＰＳ）−インスリン複合物６のＢｉａｃｏｒｅ解析。固定化抗インスリン抗体とインスリン複合物の反応と、それに続くヒトＡＴＩＩＩへの結合。
【図３】一置換五糖−インスリン複合物６のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。
【図４】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０を用いた一置換五糖−インスリン複合物６のＨＰ−ＳＥＣ分析。
【図５】基準五糖−スペーサー残基７、８及び９のｈＡＴＩＩＩ結合（ＢＩＡ試験）。
【図６】インスリン−五糖複合物２４、２８及び２９のｈＡＴＩＩＩ結合（ＢＩＡ試験）。
【図７】インスリン−五糖複合物２４の質量分析（ＥＳＩ−ＱＴＯＦ）。
【図７Ａ】インスリン−五糖複合物の実測及び計算による典型的な同位体分布の比較（ＥＳＩ−ＱＴＯＦ、Ｍ５＋、化合物２４）。
【図８】化合物３１、３２、３６、３７のｈＡＴＩＩＩ結合（Ｂｉａｃｏｒｅ試験）。
【図９】（ＢＩＡによって測定した）化合物３９のｈＡＴＩＩＩ結合。
【図１０】（ＢＩＡによって測定した）化合物４１のｈＡＴＩＩＩ結合プロファイル。
【図１１】（ＢＩＡによって測定した）化合物４４のｈＡＴＩＩＩ結合プロファイル。
【図１２】化合物４７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析。
【図１３】３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｒｅｃＨインスリン（白丸）又は五糖−インスリン複合物６（三角形）のｉ．ｖ．投与後のインスリン濃度を測定して求めた平均血しょう中濃度（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図１４】１２５Ｉ標識複合物２９（白四角形）、２４（白丸）及び２８（白三角形）並びにｒｅｃＨインスリン自体（黒丸）のｉ．ｖ．投与後Ｔ＝１分の測定濃度に対する％で表した平均血しょう中濃度（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図１５】１２５Ｉ標識複合物３１（白四角形）及び３２（黒三角形）のｉ．ｖ．投与後Ｔ＝１分の測定濃度に対する％で表した平均血しょう中濃度（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。（脱ハロゲン化に対する補正をしていないデータ）。
【図１６】１２５Ｉ標識複合物３９（白四角形）及び１２５Ｉ標識ＡＤＭ（２７−５２）（黒三角形）のｉ．ｖ．投与後Ｔ＝１分の測定濃度に対する％で表した平均血しょう中濃度（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。（脱ハロゲン化に対する補正をしていないデータ）。
【図１７】１２５Ｉ標識複合物４１（黒三角形）及び１２５Ｉ標識ＧＬＰ−１（白四角形）のｉ．ｖ．投与後Ｔ＝１分の測定濃度に対する％で表した平均血しょう中濃度（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図１８】抗ヒト及び抗ウサギＡＴＩＩＩ抗体を用いた五糖−インスリン複合物６−ＡＴＩＩＩ複合体の検出。
【図１９】７ｎｍｏｌ／ｋｇ五糖−インスリン複合物６（白三角形）又は３．５ｎｍｏｌ／ｋｇ ｒｅｃＨ−インスリン（白丸）のｉ．ｖ．投与後の平均グルコースレベル（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図２０】９ｎｍｏｌ／ｋｇ ｒｅｃＨ−インスリン（白丸）で処理後のグルコースレベルと比較した、１２ｎｍｏｌ／ｋｇ五糖−インスリン複合物２６（黒三角形）又は２４（黒丸）のｉ．ｖ．投与後の平均グルコースレベル（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図２１】９ｎｍｏｌ／ｋｇ ｒｅｃＨ−インスリン（白丸）又は４８ｎｍｏｌ／ｋｇインスリンデテミル（白三角形）で処理後のグルコースレベルと比較した、２４ｎｍｏｌ／ｋｇ五糖−インスリン複合物２７（黒四角形）又は２５（黒菱形）のｉ．ｖ．投与後の平均グルコースレベル（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【図２２】９ｎｍｏｌ／ｋｇ ｒｅｃＨ−インスリン（白丸）又は２４ｎｍｏｌ／ｋｇインスリンデテミル（白菱形）で処理後のグルコースレベルと比較した、２４ｎｍｏｌ／ｋｇ五糖−インスリン複合物２４（黒三角形）、２８（黒丸）又は２９（黒四角形）のｉ．ｖ．投与後の平均グルコースレベル（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドが少なくとも１個のオリゴ糖−スペーサー残基と複合化され、該オリゴ糖が４−１８単糖単位を含む合成硫酸化オリゴ糖であり、該オリゴ糖自体がアンチトロンビンＩＩＩに親和性を有し、該スペーサーが結合であり、又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である、ポリペプチドとオリゴ糖の複合物又は薬剤として許容されるその塩。
【請求項２】
オリゴ糖が４−６単糖単位からなる、請求項１に記載の複合物。
【請求項３】
オリゴ糖が五糖である、請求項１又は２に記載の複合物。
【請求項４】
５０ｎＭ以下の循環血しょう中濃度を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項５】
オリゴ糖自体が、ポリペプチド自体の薬理活性と比較したときに、治療レベル以下である抗凝血活性を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項６】
オリゴ糖−スペーサー残基が構造（Ｉ）を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の複合物。
【化１】
（式中、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な１個の連結残基が存在し、Ｒは独立にＯＳＯ３−、（１−８Ｃ）アルコキシ又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、
Ｒａは独立にＯＳＯ３−であり、（１−８Ｃ）アルコキシであり、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、又は１−１３単糖単位を含むオリゴ糖残基であり、
Ｒｂは独立に（１−８Ｃ）アルコキシであり、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、又は１−１３単糖単位を含むオリゴ糖残基であり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。）
【請求項７】
オリゴ糖−スペーサー残基が、構造（ＩＩ）を有する五糖−スペーサー残基である、請求項１から６のいずれか一項に記載の複合物。
【化２】
（式中、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な１個の連結残基が存在し、Ｒは独立にＯＳＯ３−、（１−８Ｃ）アルコキシ又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。）
【請求項８】
五糖残基が構造（ＩＩＩ）を有する、請求項７に記載の複合物。
【化３】
（式中、Ｒは独立にＯＳＯ３−又は（１−８Ｃ）アルコキシであり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。）
【請求項９】
五糖残基が構造（ＩＶ）を有する、請求項８に記載の複合物。
【化４】
（式中、Ｒは独立にＯＣＨ３又はＯＳＯ３−である。）
【請求項１０】
（ＩＶ）中の両方のＲ基がＯＳＯ３−である、請求項９に記載の複合物。
【請求項１１】
ポリペプチドが分子量約０．３−５０ｋＤａである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項１２】
ポリペプチドが分子量約０．３−２０ｋＤａである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項１３】
ポリペプチドが分子量約０．３−７．５ｋＤａである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項１４】
ポリペプチドが、インスリン、カルシトニン、ガニレリクス、ＧＬＰ−１、［Ｄ−Ａｌａ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）、アドレノメデュリン、ＡＤＭ（２７−５２）、キスペプチン−１０、オクトレオチド又はインターロイキン−２から選択される、請求項１１に記載の複合物。
【請求項１５】
ポリペプチドが、インスリン、ＡＤＭ（２７−５２）及び［Ｄ−Ａｌａ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）から選択される、請求項１４に記載の複合物。
【請求項１６】
ポリペプチドが五糖−スペーサー残基で一置換されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項１７】
スペーサーが、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項１８】
スペーサーが１０−５０原子の長さを有する、請求項１７に記載の複合物。
【請求項１９】
スペーサーが少なくとも１個の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む、請求項１７又は１８に記載の複合物。
【請求項２０】
以下の構造から選択される、請求項１に記載の複合物。
【化５】
（式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝
【化６】
又はＲ１＝Ｒ３＝Ｈ、Ｒ２＝
【化７】
であり、Ｙは構造Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから選択される。）
【化８】
【請求項２１】
Ｙが構造Ａ及びＢから選択される、請求項２０に記載の複合物。
【請求項２２】
以下の構造を有する、請求項１に記載の複合物。
【化９】
【請求項２３】
以下の構造を有する、請求項１に記載の複合物。
【化１０】
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の複合物と薬剤的に適切な助剤とを含む、薬剤組成物。
【請求項２５】
治療用の、請求項１から２３のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項２６】
医薬品が、ある種の治療用ポリペプチドよりも改善された薬物動態特性を有する請求項１から２３のいずれか一項に記載の複合物を含む、該ポリペプチドによる治療を必要とする患者を治療するための該医薬品の製造に対する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の複合物の使用。
【請求項２７】
（ａ）ポリペプチドが複合化用に改変される、必須でない段階と、（ｂ）改変されていてもよいポリペプチドがオリゴ糖−スペーサー分子と反応する、カップリング段階とを含み、
ポリペプチドが少なくとも１個のオリゴ糖−スペーサー残基と複合化され、該オリゴ糖が４−１８単糖単位を含む合成硫酸化オリゴ糖であり、該オリゴ糖自体がアンチトロンビンＩＩＩに親和性を有し、該スペーサーが結合であり、又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である、ポリペプチドとオリゴ糖の複合物又は薬剤として許容されるその塩の調製方法。
【請求項２８】
オリゴ糖が４−６単糖単位からなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
オリゴ糖が五糖である、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
４−１８単糖単位を含む合成硫酸化オリゴ糖であって、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対する親和性をそれ自体が有するオリゴ糖が、結合又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基によって、ポリペプチドに共有結合する段階を含み、該ポリペプチドを含む複合物が、生物活性を本質的に保持しつつ、元のポリペプチドよりも長い血しょう中半減期を有し、無視し得る抗凝血活性を有する、治療に有効な該複合物の調製方法。
【請求項３１】
オリゴ糖が４−６単糖単位からなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
オリゴ糖が五糖である、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項１】
ポリペプチドが少なくとも１個のオリゴ糖−スペーサー残基と複合化され、該オリゴ糖が４−１８単糖単位を含む合成硫酸化オリゴ糖であり、該オリゴ糖自体がアンチトロンビンＩＩＩに親和性を有し、該スペーサーが結合であり、又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である、ポリペプチドとオリゴ糖の複合物又は薬剤として許容されるその塩。
【請求項２】
オリゴ糖が４−６単糖単位からなる、請求項１に記載の複合物。
【請求項３】
オリゴ糖が五糖である、請求項１又は２に記載の複合物。
【請求項４】
５０ｎＭ以下の循環血しょう中濃度を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項５】
オリゴ糖自体が、ポリペプチド自体の薬理活性と比較したときに、治療レベル以下である抗凝血活性を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項６】
オリゴ糖−スペーサー残基が構造（Ｉ）を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の複合物。
【化１】
（式中、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な１個の連結残基が存在し、Ｒは独立にＯＳＯ３−、（１−８Ｃ）アルコキシ又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、
Ｒａは独立にＯＳＯ３−であり、（１−８Ｃ）アルコキシであり、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、又は１−１３単糖単位を含むオリゴ糖残基であり、
Ｒｂは独立に（１−８Ｃ）アルコキシであり、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、又は１−１３単糖単位を含むオリゴ糖残基であり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。）
【請求項７】
オリゴ糖−スペーサー残基が、構造（ＩＩ）を有する五糖−スペーサー残基である、請求項１から６のいずれか一項に記載の複合物。
【化２】
（式中、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な１個の連結残基が存在し、Ｒは独立にＯＳＯ３−、（１−８Ｃ）アルコキシ又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。）
【請求項８】
五糖残基が構造（ＩＩＩ）を有する、請求項７に記載の複合物。
【化３】
（式中、Ｒは独立にＯＳＯ３−又は（１−８Ｃ）アルコキシであり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。）
【請求項９】
五糖残基が構造（ＩＶ）を有する、請求項８に記載の複合物。
【化４】
（式中、Ｒは独立にＯＣＨ３又はＯＳＯ３−である。）
【請求項１０】
（ＩＶ）中の両方のＲ基がＯＳＯ３−である、請求項９に記載の複合物。
【請求項１１】
ポリペプチドが分子量約０．３−５０ｋＤａである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項１２】
ポリペプチドが分子量約０．３−２０ｋＤａである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項１３】
ポリペプチドが分子量約０．３−７．５ｋＤａである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項１４】
ポリペプチドが、インスリン、カルシトニン、ガニレリクス、ＧＬＰ−１、［Ｄ−Ａｌａ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）、アドレノメデュリン、ＡＤＭ（２７−５２）、キスペプチン−１０、オクトレオチド又はインターロイキン−２から選択される、請求項１１に記載の複合物。
【請求項１５】
ポリペプチドが、インスリン、ＡＤＭ（２７−５２）及び［Ｄ−Ａｌａ８］−ＧＬＰ−１（７−３６）から選択される、請求項１４に記載の複合物。
【請求項１６】
ポリペプチドが五糖−スペーサー残基で一置換されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項１７】
スペーサーが、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項１８】
スペーサーが１０−５０原子の長さを有する、請求項１７に記載の複合物。
【請求項１９】
スペーサーが少なくとも１個の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む、請求項１７又は１８に記載の複合物。
【請求項２０】
以下の構造から選択される、請求項１に記載の複合物。
【化５】
（式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝
【化６】
又はＲ１＝Ｒ３＝Ｈ、Ｒ２＝
【化７】
であり、Ｙは構造Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから選択される。）
【化８】
【請求項２１】
Ｙが構造Ａ及びＢから選択される、請求項２０に記載の複合物。
【請求項２２】
以下の構造を有する、請求項１に記載の複合物。
【化９】
【請求項２３】
以下の構造を有する、請求項１に記載の複合物。
【化１０】
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の複合物と薬剤的に適切な助剤とを含む、薬剤組成物。
【請求項２５】
治療用の、請求項１から２３のいずれか一項に記載の複合物。
【請求項２６】
医薬品が、ある種の治療用ポリペプチドよりも改善された薬物動態特性を有する請求項１から２３のいずれか一項に記載の複合物を含む、該ポリペプチドによる治療を必要とする患者を治療するための該医薬品の製造に対する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の複合物の使用。
【請求項２７】
（ａ）ポリペプチドが複合化用に改変される、必須でない段階と、（ｂ）改変されていてもよいポリペプチドがオリゴ糖−スペーサー分子と反応する、カップリング段階とを含み、
ポリペプチドが少なくとも１個のオリゴ糖−スペーサー残基と複合化され、該オリゴ糖が４−１８単糖単位を含む合成硫酸化オリゴ糖であり、該オリゴ糖自体がアンチトロンビンＩＩＩに親和性を有し、該スペーサーが結合であり、又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である、ポリペプチドとオリゴ糖の複合物又は薬剤として許容されるその塩の調製方法。
【請求項２８】
オリゴ糖が４−６単糖単位からなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
オリゴ糖が五糖である、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
４−１８単糖単位を含む合成硫酸化オリゴ糖であって、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対する親和性をそれ自体が有するオリゴ糖が、結合又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基によって、ポリペプチドに共有結合する段階を含み、該ポリペプチドを含む複合物が、生物活性を本質的に保持しつつ、元のポリペプチドよりも長い血しょう中半減期を有し、無視し得る抗凝血活性を有する、治療に有効な該複合物の調製方法。
【請求項３１】
オリゴ糖が４−６単糖単位からなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
オリゴ糖が五糖である、請求項３０又は３１に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図７Ａ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図７Ａ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２００８−５３８２００（Ｐ２００８−５３８２００Ａ）
【公表日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５２６５８（Ｐ２００７−５５２６５８）
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０５０５５１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８２１８４
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（３９８０５７２８２）ナームローゼ・フエンノートチヤツプ・オルガノン (93)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０５０５５１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８２１８４
【国際公開日】平成１８年８月１０日（２００６．８．１０）
【出願人】（３９８０５７２８２）ナームローゼ・フエンノートチヤツプ・オルガノン (93)
【Ｆターム（参考）】
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