ポリマーが結合したグリコシル化ニューブラスチン
【課題】ニューブラスチンの上記生物学的活性を示しつつ、向上した効力を示す分子を提供する。
【解決手段】以下の種類の分子が開示される：第一ニューブラスチンポリペプチドおよび第二ニューブラスチンポリペプチドを含む二量体であって、ここで；（ａ）少なくとも一つのポリペプチドがグリコシル化されており；（ｂ）少なくとも一つの上記ポリペプチドがそのＮ末端に、水溶性の合成ポリマーを結合しており；（ｃ）どちらの上記ペプチドも、Ｎ末端以外の位置に水溶性の合成ポリマーが結合していない、二量体。このような二量体は、野生型ニューブラスチンとしての生物学的活性を有する一方、血清半減期の向上および野生型ニューブラスチンに対する効力の向上の効果を示す。
【解決手段】以下の種類の分子が開示される：第一ニューブラスチンポリペプチドおよび第二ニューブラスチンポリペプチドを含む二量体であって、ここで；（ａ）少なくとも一つのポリペプチドがグリコシル化されており；（ｂ）少なくとも一つの上記ポリペプチドがそのＮ末端に、水溶性の合成ポリマーを結合しており；（ｃ）どちらの上記ペプチドも、Ｎ末端以外の位置に水溶性の合成ポリマーが結合していない、二量体。このような二量体は、野生型ニューブラスチンとしての生物学的活性を有する一方、血清半減期の向上および野生型ニューブラスチンに対する効力の向上の効果を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、タンパク質化学、分子生物学、神経生物学、神経学、および疼痛処理に関係する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
神経栄養因子は、発生の間における神経細胞の生存を調節し、およびこの成熟した神経系の可塑性および構造的統合性を調節する、天然に存在するタンパク質である。これらの神経栄養因子は、スーパーファミリー、ファミリー、サブファミリー、ならびにそれらの構造および機能に基づいた個別の種に分類され得る。
【０００３】
神経栄養因子スーパーファミリーとしては、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）スーパーファミリー、ニューロトロフィンスーパーファミリー、およびトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーが挙げられる。グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）関連リガンドは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー内のタンパク質ファミリーである。ＧＤＮＦ関連リガンドとしては、ＧＤＮＦ、パーセフィン（ＰＳＰ）、ニュールツリン（ＮＴＮ）およびニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）（ＮＢＮ；アルテミンまたはエノビン（ｅｎｏｖｉｎ）として公知である）が挙げられる。ＧＤＮＦ関連リガンドファミリーのメンバーは、特に、保存された７つのシステイン残基によって区別される。これらの残基は分子内および分子間のジスルフィド架橋を形成し、ならびに二量体化したポリペプチドリガンドの三次構造および四次構造を生じる。上記ファミリーのメンバーとしては、ＧＦＰαファミリーのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定化補助レセプター、ＧＤＮＦ関連リガンドサブファミリーのメンバー、およびＲＥＴチロシンキナーゼレセプターからなる多成分レセプター複合体によるシグナル伝達も誘導する。
【０００４】
活性化されたＲＥＴは、少なくとも部分的にＧＤＮＦ関連リガンドの下流の効果を担う、シグナル伝達カスケードを惹起する。
【０００５】
７つのシステインモチーフを含む他のＧＤＮＦリガンド（例えば、ＥＰ０２／０２６９１、ＰＣＴ公報ＵＳ０２／０２３１９およびＵＳ０２／０６３８８に記載されるようなもの）と相同性のある領域を共有し、ならびにＧＦＲα複合体の一部としてＲＥＴレセプターに結合し、そしてこのＲＥＴレセプターを活性化することから、ニューブラスチンは上記ＧＤＮＦファミリーに分類される。ニューブラスチンは、上記ＧＦＲα３−ＲＥＴレセプター複合体に対する結合において、高度に選択的である。その点において、ニューブラスチンはそのアミノ酸配列の中に、他の上記ＧＤＮＦ関連リガンドファミリーと比較して固有のサブ領域を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ニューブラスチンの投与は、神経の変性および神経の機能障害に関連した疾患の処置に有用である可能性がある。しかし、ニューブラスチンは身体によって速やかに除去され、このことが治療的な適用に必要なニューブラスチンの投薬パラダイムに影響を与え得る。ニューブラスチンの上記生物学的活性を示しつつ、向上した効力を示す分子に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
ニューブラスチンタンパク質（すなわち、二量体）が内部的にグリコシル化されており、およびアミノ末端に水溶性の合成ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が結合する場合、バイオアベイラビリティおよび血清半減期を顕著に向上させることが見い出されている。従って、インビボでの効果が低用量で達成される。
【０００８】
この発見に基づき、本発明は、第一ニューブラスチンポリペプチドおよび第二ニューブラスチンポリペプチドを含む二量体を特徴とし、ここで：（ａ）少なくとも一つの上記ポリペプチドがグリコシル化されており；（ｂ）少なくとも一つの上記ポリペプチドがそのＮ末端に、水溶性の合成ポリマーを結合しており；および、（ｃ）上記どちらのポリペプチドも、Ｎ末端以外の位置に水溶性の合成ポリマーが結合していない。
【０００９】
上記ニューブラスチンポリペプチドは、例えば、ＮＢＮ１１３（配列番号２）、ＮＢＮ１４０（配列番号６）、ＮＢＮ１１６（配列番号７）、ＮＢＮ１１２（配列番号８）、ＮＢＮ１１１（配列番号９）、ＮＢＮ１１０（配列番号１０）、ＮＢＮ１０９（配列番号１１）、ＮＢＮ１０８（配列番号１２）、ＮＢＮ１０７（配列番号１３）、ＮＢＮ１０６（配列番号１４）、ＮＢＮ１０５（配列番号１５）、ＮＢＮ１０４（配列番号１６）、ＮＢＮ１０３（配列番号１７）、ＮＢＮ１０２（配列番号１８）、ＮＢＮ１０１（配列番号１９）、ＮＢＮ１００（配列番号２０）およびＮＢＮ９９（配列番号２１）であり得る。上記二量体に組み込むのに好ましいポリペプチドは、ＮＢＮ１０４（配列番号１６）である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記第一ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列および上記第二ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は同一である。好ましくは、上記水溶性の合成ポリマーはポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））である。
【００１１】
好ましくは、上記二量体に結合した上記ポリアルキレングリコール部分の総分子量の平均が、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａであり；さらに好ましくは１５ｋＤａ〜４５ｋＤａであり；そして最も好ましくは２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。このポリアルキレングリコール部分は直鎖状または分枝状であり得る。
【００１２】
本発明は、請求項１に記載の二量体および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、哺乳動物（例えば、ヒトの患者）において、神経障害性疼痛を処置する方法を提供する。この方法は、上記哺乳動物に、治療的に有効な量の本発明の二量体を投与する工程を包含する。本発明は、哺乳動物において、触覚性異痛症を処置する方法を提供する。この方法は、上記哺乳動物に、治療的に有効な量の本発明の二量体を投与する工程を包含する。本発明は、哺乳動物において、温熱性痛覚過敏を処置する方法を提供する。この方法は、上記哺乳動物に、治療的に有効な量の本発明の二量体を投与する工程を包含する。本発明は、哺乳動物において、ＲＥＴレセプターを活性化する方法を提供する。この方法は、上記哺乳動物に、有効量の本発明の二量体を投与する工程を包含する。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態において、上記治療的に有効な量は、０．１μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、この治療的に有効な量は、１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、この治療的に有効な量は、１μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、この治療的に有効な量は、３μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇである。好ましくは、上記投与経路は筋肉内または皮下である。
【００１５】
他に定義される場合を除き、本明細書中で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明の属する分野の当業者が、通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似かまたは等価な方法および材料が、本発明の実施の実施において使用され得るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書中で言及した、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書に従う。
【００１６】
特別に定めた場合を除き、ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸残基番号についての参照は、配列番号１の番号に対応する。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「コンセンサスニューブラスチン」は、配列番号１の配列を意味する。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「ニューブラスチンポリペプチド」は、（１）ホモ二量体として二量体化したとき、少なくとも一つのニューブラスチンの生物学的活性を示し、かつ（２）配列番号２のアミノ酸８〜１１３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを意味する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「野生型ニューブラスチンポリペプチド」は、アミノ酸配列が、天然に存在するニューブラスチンポリペプチドの配列であるポリペプチドを意味する。野生型ニューブラスチンの例としては、ヒトニューブラスチン（配列番号２）、マウスニューブラスチン（配列番号３）、およびラットニューブラスチン（配列番号４）が挙げられる。
【００２０】
アミノ酸配列間の同一性のパーセントは、ＢＬＡＳＴ ２．０プログラム（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで入手可能）またはこれ以降のバージョンを使用して決定され得る。配列比較はギャップのないアラインメントおよび初期値のパラメータ（Ｂｌｏｓｓｌｍ ６２ マトリックス、１１のギャップ存在コスト、１の残基毎のギャップコスト、および０．８５のラムダ比である）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴプログラムに用いられる上記数学的アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３３８９−３４０２に記載される。
【００２１】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
第一ニューブラスチンポリペプチドおよび第二ニューブラスチンポリペプチドを含む二量体であって、ここで：（ａ）少なくとも一つの該ポリペプチドがグリコシル化されており；（ｂ）少なくとも一つの該ポリペプチドがそのＮ末端に、水溶性の合成ポリマーを結合しており；および、（ｃ）どちらの該ペプチドも、Ｎ末端以外の位置に水溶性の合成ポリマーが結合していない、二量体。
（項目２）
上記第一ニューブラスチンポリペプチドが、ＮＢＮ１１３（配列番号２）、ＮＢＮ１４０（配列番号６）、ＮＢＮ１１６（配列番号７）、ＮＢＮ１１２（配列番号８）、ＮＢＮ１１１（配列番号９）、ＮＢＮ１１０（配列番号１０）、ＮＢＮ１０９（配列番号１１）、ＮＢＮ１０８（配列番号１２）、ＮＢＮ１０７（配列番号１３）、ＮＢＮ１０６（配列番号１４）、ＮＢＮ１０５（配列番号１５）、ＮＢＮ１０４（配列番号１６）、ＮＢＮ１０３（配列番号１７）、ＮＢＮ１０２（配列番号１８）、ＮＢＮ１０１（配列番号１９）、ＮＢＮ１００（配列番号２０）およびＮＢＮ９９（配列番号２１）からなる群から選択される、項目１に記載の二量体。
（項目３）
上記第一ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列および上記第二ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列が同一である、項目１に記載の二量体。
（項目４）
上記水溶性の合成ポリマーがポリアルキレングリコールである、項目１に記載の二量体。
（項目５）
上記第一ニューブラスチンポリペプチドのＮ末端のアミノ酸および上記第二ニューブラスチンポリペプチドのＮ末端のアミノ酸が、それぞれ、ポリアルキレングリコールによって結合している、項目４に記載の二量体。
（項目６）
上記第一ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列がＮＢＮ１０４（配列番号１６）である、項目３に記載の二量体。
（項目７）
上記二量体に結合した上記ポリアルキレングリコール部分の総分子量の平均が、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａである、項目１に記載の二量体。
（項目８）
上記二量体に結合した上記ポリアルキレングリコール部分の総分子量の平均が、１５ｋＤａ〜４５ｋＤａである、項目７に記載の二量体。
（項目９）
上記二量体に結合した上記ポリアルキレングリコール部分の総分子量の平均が、２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである、項目８に記載の二量体。
（項目１０）
上記ポリアルキレングリコールが直鎖状である、項目１に記載の二量体。
（項目１１）
上記ポリアルキレングリコールが分枝状である、項目１に記載の二量体。
（項目１２）
上記ポリアルキレングリコール部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である、項目１に記載の二量体。
（項目１３）
項目１に記載の二量体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目１４）
哺乳動物において神経障害性疼痛を処置するための方法であって、該哺乳動物に、治療的に有効な量の項目１に記載の二量体を投与する工程を包含する、方法。
（項目１５）
哺乳動物において触覚性異痛症を処置するための方法であって、該哺乳動物に、治療的に有効な量の項目１に記載の二量体を投与する工程を包含する、方法。
（項目１６）
温熱性痛覚過敏を処置するための方法であって、上記哺乳動物に、治療的に有効な量の項目１に記載の二量体を投与する工程を包含する、方法。
（項目１７）
上記哺乳動物がヒトである、項目１４、項目１５または項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記治療的に有効な量が、０．１μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇである、項目１４、項目１５または項目１６に記載の方法。
（項目１９）
上記治療的に有効な量が、１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記治療的に有効な量が、１μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
上記治療的に有効な量が、３μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記投与経路が、静脈内、筋肉内または皮下である、項目１６、項目１７または項目１８に記載の方法。
（項目２３）
哺乳動物のＲＥＴレセプターを活性化するための方法であって、該哺乳動物に、有効な量の項目１に記載の二量体を投与する工程を包含する、方法。
（項目２４）
哺乳動物において神経障害性疼痛、触覚性異痛症、または温熱性痛覚過敏を処置する方法であって、該哺乳動物に、有効な量の項目１に記載の二量体、および鎮痛薬を、共に投与する工程を包含する、方法。
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および請求項から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、Ｌ５／Ｌ６脊髄神経結紮（ｓｐｉｎａｌ ｎｅｒｖｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ）（ＳＮＬ）を有するラットにおける、それぞれの単量体がそのアミノ末端にＰＥＧ部分を結合しており、かつ９５位がグリコシル化されているＮＢＮ１０４のホモ二量体（「２×２０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４」）の皮下投与による、完全に確立された触覚性異痛症の実質的な逆転を示すデータをまとめた折れ線プロットである。
【図２】図２は、Ｌ５／Ｌ６脊髄神経結紮を有するラットにおける、２×２０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４の皮下投与による、完全に確立された温熱性痛覚過敏の実質的な逆転を示すデータをまとめた折れ線プロットである。
【図３】図３は、ヒト、マウス、およびラット由来の成熟した野生型ニューブラスチン配列間のアライメントである。また、ヒト配列、マウス配列およびラット配列に基づいたコンセンサス配列も示される。
【図４】図４は、ヒトニューブラスチン配列、マウスニューブラスチン配列およびラットニューブラスチン配列に基づくコンセンサス配列であり、任意のアミノ酸置換が示される。
【図５】図５は、野生型ヒトニューブラスチンのプレプロ配列および、選択的な翻訳後プロセッシングにより天然に産生される３つの異なる成熟したヒトニューブラスチン配列のアライメントである。
【図６】図６は、本発明の二量体に組み込まれ得る野生型ヒトニューブラスチンの１１３アミノ酸形態の種々の短縮型のアミノ酸配列アライメントである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
（ポリマーが結合した、グリコシル化ニューブラスチン二量体）
本発明の二量体は、ニューブラスチンの生物学的活性についてのアッセイにおいて活性を示す。例えば、本発明の二量体は、ＲＥＴ活性化アッセイにおいて活性がある。本発明の二量体は、対応する二量体であってポリマーの結合とグリコシル化との組み合わせを伴わない二量体に対し、バイオアベイラビリティの向上および／または血清半減期の延長を示す。本発明の好ましい実施形態においては、上記ポリマーが結合し、グリコシル化された二量体は、上記対応するポリペプチドであってポリマーの結合およびグリコシル化を伴わないポリペプチドの効力に対し、インビボにおいて顕著に増強した効力を示す。
【００２４】
一般的に、本発明の二量体に組み込まれるポリペプチドは、以下に挙げる特徴の少なくとも一つを保持する：
（ｉ）配列番号１において残基１６、残基４３、残基４７、残基８０、残基８１、残基１０９、および残基１１１に対応する位置にある、保存された７つのシステイン残基；
（ｉｉ）以下のようなアミノ酸残基：
１６位にあるＣ、１８位にあるＬ、２５位にあるＶ、２８位にあるＬ、２９位にあるＧ、３０位にあるＬ、３１位にあるＧ、３６位にあるＥ、４０位にあるＦ、４１位にあるＲ、４２位にあるＦ、４３位にあるＣ、４５位にあるＧ、４７位にあるＣ、８０位にあるＣ、８１位にあるＣ、８２位にあるＲ、８３位にあるＰ、９１位にあるＦ、９３位にあるＤ、９５位にあるＮ、１０５位にあるＳ、１０６位にあるＡ、１０９位にあるＣおよび１１１位にあるＣ；
（ｉｉｉ）ＬＧＬＧリピート、ＦＲＦＣモチーフ、ＱＰＣＣＲＰモチーフ、およびＳＡＴＡＣＧＣモチーフ。
【００２５】
好ましくは、上記ポリペプチドは上記特徴の全てを保持する。
【００２６】
野生型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列の例は、図３に表される。野生型ニューブラスチンポリペプチドおよび配列に関しては、ＰＣＴ公報ＷＯ ００／０１８１５に記載される。ニューブラスチンコンセンサス配列（ヒト、マウスおよびラットに対して共通である）は図４に表される。
【００２７】
上記ヒトプレプロニューブラスチンの配列（配列番号５）は、図５に示される。異なった翻訳後プロセッシングから生じる、３つの成熟したヒトニューブラスチンの形態が同定された。この３つの形態は：
（ｉ）ＮＢＮ１４０と命名された１４０アミノ酸のポリペプチド（配列番号６）；
（ｉｉ）ＮＢＮ１１６と命名された１１６アミノ酸のポリペプチド（配列番号７）；および
（ｉｉｉ）ＮＢＮ１１３と命名された１１３アミノ酸のポリペプチド（配列番号２）
である。
【００２８】
図５は、上記ヒトプレプロニューブラスチンのアミノ酸配列および上記３つの成熟形態の配列のアライメント比較である。１行目は、配列番号５のポリペプチドを示し、２行目は、配列番号６のポリペプチドを示し、３行目は、配列番号７のポリペプチドを示し、そして４行目は配列番号２のポリペプチドを示す。７つの保存されたシステイン残基を、成熟した二量体化ニューブラスチンリガンドにおいて形成される分子内（＊と＊、＃と＃および＋と＋）ジスルフィド架橋ならびに分子間（「｜」）ジスルフィド架橋を示すための記号（「＊」、「＃」、「＋」および「｜」）で表す。
【００２９】
本発明の二量体におけるニューブラスチンポリペプチドは、プロテアーゼ開裂反応生成物または化学的開裂反応生成物であり得るか、あるいは組換えＤＮＡ構築物から直接的に発現され得る。あるいは、それらは市販の固相シンセサイザーを用いて化学的に合成され得る。
【００３０】
好ましいポリマーが結合したニューブラスチンポリペプチド二量体は、それぞれの単量体がそのアミノ末端にＰＥＧ部分を結合しており、そして９５位がグリコシル化されているＮＢＮ１０４のホモ二量体である（「２×２０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４」）。いくつかの実施形態において、上記二量体中のポリペプチドは本質的に、配列番号１のアミノ酸８〜１１３からなる。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態においては、上記二量体はＧＦＲα３に結合し、そしてＲＥＴポリペプチドのチロシンリン酸化を刺激する。いくつかの実施形態において、この二量体は感覚ニューロンの残存を向上させるか、あるいは感覚ニューロンの病理学的な変化を縮小または逆転する。いくつかの実施形態において、この二量体は自律神経またはドパミン作動性神経の残存を向上させる。
【００３２】
本発明は、ポリマーが結合したグリコシル化ニューブラスチンポリペプチド二量体を作製する方法を提供する。上記方法は、グリコシル化ニューブラスチン二量体を、例えば、真核細胞から提供する工程、および上記二量体中の少なくとも１つのポリペプチドが、水溶性の合成ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール部分）に結合させる工程を包含する。
【００３３】
（ニューブラスチンポリペプチド）
ニューブラスチンポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、ニューブラスチンポリペプチドをコードしている核酸配列は、ベクター（例えば、発現ベクター）に挿入され得、そして上記ベクターは適切な宿主細胞に導入され得る。適切な宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化する宿主細胞である。真核生物宿主細胞が好ましい。しかし、少なくとも一つの細菌（すなわち、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）は、細菌性宿主細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）に転移され得るＮ結合グリコシル化系を有する（Ｗａｃｋｅｒら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０−１７９３）。化学的修飾および／または細菌性グリコシル化の伸長は、当該分野で公知の方法および材料を使用して、インビトロで達成され得る。このように、グリコシル化コンピテント細菌系は必要に応じて、本発明により用いられるニューブラスチンポリペプチドを産生するために、使用され得る。
【００３４】
本発明における使用に適したニューブラスチンポリペプチドは、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞のようなヒト胚性腎臓（「ＨＥＫ」）細胞、ＢＨＫ２１細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞）で産生され得る。他の適切な哺乳動物細胞としては、ＰＣ１２細胞株、ＨｉＢ５細胞株、ＲＮ３３ｂ細胞株、ヒト神経前駆細胞、およびヒト細胞に由来する他の細胞であり、特に神経細胞、が挙げられる。本発明を実施する上で有用な不死化ヒト細胞株としては、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ９６０７）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２１３）、ＨｅＬａ細胞およびＨｅＬａ細胞の誘導体（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２、ＣＣＬ２．１、およびＣＣＬ２．２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２４０）、ＨＴ−１０８０細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ１２１）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＴＩＢ１５２）、ＫＢ癌細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ１７）、Ｋ−５６２白血病細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２４３）、ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＢＴＨ２２）、ＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ登録番号１５８２）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１４３２）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ８６）、ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ１５５）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１５９３）、ＷＩ−３８ＶＡ１３亜系統２Ｒ４細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＬＬ７５．１）、ならびに２７８０ＡＤ卵巣癌細胞（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｌｉｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：５９２７−５９３２，１９８８）が挙げられる。二次ヒト線維芽細胞株（例えば、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ７５）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ１７１））もまた、使用され得る。
【００３５】
適切な非哺乳動物宿主細胞としては、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母（「ＸＬＯ」）細胞、および酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）である。
【００３６】
上記宿主細胞の形質転換は、例えば、感染工程（ウイルスベクターを用いる）、トランスフェクション工程（プラスミドベクターを用いる）、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、およびリポフェクションの使用が挙げられる、適切な方法により得る。真核宿主細胞形質転換のための、方法および材料は当該分野で公知である。
【００３７】
形質転換された宿主細胞により生産されたニューブラスチンポリペプチドは、上記細胞または上記細胞培養培地から、標準的なタンパク質精製技術を使用して、単離され得る。再フォールディング工程は必要に応じて使用され得る。
【００３８】
ニューブラスチンポリペプチドは、標準的な、方法および材料を用いて修飾され得る。このような方法の１つは、部位特異的変異誘発であり、この方法において、１つまたはそれ以上のヌクレオチドは、ニューブラスチンポリペプチドの、予定した１つまたはそれ以上のアミノ酸を置換する目的で、変更される。適切な部位特異的変異誘発キットは市販されている（例えば、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．））。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態は、保存的アミノ酸置換を含むニューブラスチンポリペプチドを含む。保存的アミノ酸置換としては、以下のグループ内での挙げられる：バリン、アラニンおよびグリシン；ロイシン、バリンおよびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システインおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性の疎水性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００４０】
上記グリコシル化ニューブラスチンは、任意の生物活性形態で提供され得、その生物活性形態としては、プレプロタンパク質、プロタンパク質、成熟タンパク質、リン酸化タンパク質、非リン酸化タンパク質、短縮形態または他の任意の翻訳後修飾タンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号６として表される、１２２位にグリコシル化されたアスパラギン残基を保持するアミノ酸配列；あるいは配列番号１４として表される、９５位または例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータソフトウェアでアライメントした場合に、任意のニューブラスチンポリペプチドにおいて類似する位置にグリコシル化されたアスパラギン残基を有するアミノ酸配列を有する。
【００４１】
一般的に、哺乳動物細胞、またはタンパク質をグリコシル化可能な他のこのような細胞から単離された二量体は、９５位のアミノ酸がグリコシル化され得る。インビトロでタンパク質をグリコシル化する方法は当該分野において公知であり、そして所望される場合、ニューブラスチンポリペプチドまたはポリペプチド二量体をグリコシル化するために使用され得る。
【００４２】
本発明の実施は、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学、および免疫学の慣習的な技術の使用により実行され得る。このような技術は、一般的な参考文献に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ（Ｇｌｏｖｅｒ編），１９８５；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｇａｉｔ編），１９８４；米国特許第４，６８３，１９５（Ｍｕｌｌｉｓら）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｉｎｅｓら編），１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓら編），１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８４；Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．１５４および１５５（Ｗｕら編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒら編），１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｒｎｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒら編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７を参照のこと。
【００４３】
（ニューブラスチンポリペプチドのポリマー結合）
ニューブラスチンポリペプチドに結合体化するポリマーは水溶性である。好ましくは、上記ポリマーは薬学的組成物における使用に適したものである。適切な水溶性ポリマーの例としては、ＰＥＧ、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたは無作為的なコポリマーのどちらかである）、ならびにデキストランＰＥＧまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ＰＥＧ、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン酸化物／エチレン酸化物コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００４４】
１ポリマー鎖あたりの平均分子量は、二量体あたりに結合体化したポリマーの、望ましい総分子量の平均（例えば、二量体あたり１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、１５ｋＤａ〜４５ｋＤａ、または２０ｋＤａ〜４０ｋＤａ）に従って選択される。ＰＥＧ調製物において、いくつかの分子量は、定められた分子量より重いものといくぶん軽いものがある。従って、分子量は代表的に「平均分子量」として記載される。種々の結合体化方法は当該分野において公知である。例えば、ＥＰ ０ ４０１３８４（ＰＥＧとＧ−ＣＳＦとのカップリング）；Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５，１９９２（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化）を参照のこと。
【００４５】
ＰＥＧ化は任意の適切なＰＥＧ化により実施され得る。種々のＰＥＧ化化学反応は、当該分野において公知である。例えば、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，３（２）：４−１０，１９９２；ＥＰ ０ １５４ ３１６；ＥＰ ０ ４０１ ３８４；およびＰＥＧ化に関連する、本明細書中で引用されたその他の刊行物を参照のこと。上記ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または他の適切な反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。
【００４６】
アシル化によるＰＥＧ化は概して、ＰＥＧの活性エステル誘導体の反応工程を含む。公知の反応性ＰＥＧ分子またはその後見い出された反応性ＰＥＧ分子は、上記ＰＥＧ化を実施するために使用され得る。好ましい活性化ＰＥＧエステルはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とエステル化したＰＥＧである。本明細書中で使用される場合、「アシル化」とは以下の型の、上記治療的タンパク質と水溶性ポリマー（例えばＰＥＧ）との間の結合様式が挙げられるが、これらに限定されない：アミド、カルバメート、ウレタンなど。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照のこと。反応条件は、ＰＥＧ化の分野において公知の反応条件またはその後に開発された反応条件の任意のものから選択され得るが、修飾されるべきニューブラスチンタンパク質またはポリペプチドを不活性化する条件（例えば、温度、溶媒、およびｐＨ）は避けるべきである。
【００４７】
一般的に、アシル化によるＰＥＧ化は、結果としてポリＰＥＧ化ポリペプチドを生じる。しかしながら、ニューブラスチンの場合、しかしながら、リジン残基が存在しない。従って、アシル化によるＰＥＧ化は、排他的にアミノ末端がＰＥＧ化されたポリペプチドを得るために用いられ得る。ＰＥＧ化ポリペプチドは慣習的な技術（例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび電気泳動）により、反応混合物および未反応のポリペプチドから分離され得る。
【００４８】
アルキル化によるＰＥＧ化は、概して、還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体とニューブラスチンまたは二量体との反応工程を含む。一般的に、アルキル化によるＰＥＧ化は、結果としてポリＰＥＧ化ポリペプチドをもたらし得、そしてアミノ末端のＰＥＧ化を有利に行うために、反応条件が操作され得る。しかし、ニューブラスチンはリジン残基を含んでいないので、そのような操作を行う必要はない。上記ＰＥＧ基は、好ましくは、−ＣＨ２−ＮＨ−基を介して（すなわち、「アルキル」結合を介して）タンパク質と結合される。
【００４９】
上記アシル化アプローチおよび上記アルキル化アプローチの両方において使用される上記ポリマー分子は、上述したような水溶性ポリマーの中から選択され得る。上記選択されたポリマーは、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド、好ましくは本発明の方法において提供されるような重合度が制御できるような反応基）を有するように修飾されるべきである。模範的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水安定性のＰＥＧプロピオンアルデヒド、あるいはこれらのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシの誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）である。このポリマーは、分枝状または非分枝状であり得る。上記アシル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。本発明の還元的アルキル化のために、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。本発明の目的のために、ＰＥＧは、他のタンパク質の誘導体化の分野において公知であるＰＥＧの任意の形態（モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧおよびアリールオキシ−ＰＥＧを含む）であり得る。
【００５０】
（処方物）
本発明の二量体を含む組成物は、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。例えば、上記組成物は、賦形剤および／または助剤（これは二量体を、作用部位に送達するように設計された調製物にプロセシングすることを促進する）を含み得る。非経口的投与に適切な処方物としては、水溶性形態である活性化合物の水溶液（例えば、水溶性の塩）が挙げられる。さらに、適切な油性注射用懸濁液のような活性化合物の懸濁液が投与され得る。適切な親油性溶媒または親油性ビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射用懸濁液は、この懸濁液の粘度を増す物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストラン）を含み得る。必要に応じて、上記懸濁液はまた、安定剤も含み得る。リポソームはまた、本発明の分子を細胞または間隙に送達するために、カプセル化するのに使用され得る。例示的な薬学的に受容可能なキャリアは、生理学的に適合可能な溶媒、分散媒体、コーティング、抗生物質および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。いくつかの実施形態において、上記組成物は等張化剤（例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコールまたは塩化ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、上記組成物は薬学的に受容可能な物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存料あるいは緩衝剤）を含む。
【００５１】
本発明の組成物は、種々の形態であり得、その形態としては、例えば、液体（例えば、注射用溶液および注入用溶液）、分散物、懸濁物、半固形投与形態および固形投与形態が挙げられる。好ましい形態は、投与方法および治療的適用に依存する。
【００５２】
上記組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソーム、または高い薬物濃度に対して適切な他の規則的な構造として処方され得る。滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、必要量の上記活性成分を、以上に列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせとともに組み込むこと、必要な場合にはその後フィルター滅菌することにより、調製され得る。概して、分散物は、上記活性成分を、基本的な分散媒体、および以上に列挙した成分に由来する必要とされる他の成分を含む、滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製され得る。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、上記活性成分と、先にフィルター滅菌された溶液由来の望ましい任意のさらなる成分との粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。上記溶液の適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングにより、分散物の場合に必要とされる粒子径の維持により、および界面活性剤によって、維持され得る。注射用組成物の吸収長期は、吸収を遅らせる物質を組成物に含めることにより達成され得る。そのような物質の例は、モノステアリン酸塩およびゼラチンである。
【００５３】
上記活性成分は、徐放処方物または徐放デバイスとして処方され得る。そのような処方物およびデバイスの例としては、移植物、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。生分解性の、生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸）が、使用され得る。そのような処方物およびデバイスを調製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
【００５４】
注射用蓄積処方物は、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド）の中に、マイクロカプセル化した薬物のマトリックスを形成することにより、作製され得る。ポリマーに対する薬物の比、および使用されるポリマーの性質によって、薬物放出速度が制御され得る。その他の模範的な生分解性ポリマーは、ポリオルソエステルおよびポリ無水物である。蓄積注射用処方物はまた、上記薬物をリポソームまたはマイクロエマルジョンに包摂することによっても調製され得る。
【００５５】
補助活性化合物が、この処方物に組み込まれ得る。例えば、本発明に従う二量体は、鎮痛薬と共に同時投与され得る。
【００５６】
投薬レジメンは、最適な望ましい応答を提供するために調節され得る。例えば、１回のボーラスが投与されてもよく、数回に分割された投薬で長期に渡り投与されてもよく、またはこの投与量は、その治療状況の緊急性により示され、比例的に、減量または増量され得る。投与の容易さおよび投薬の均一性のための投薬単位形態において、非経口組成物を処方することは有利である。おおむね、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９８０）参照のこと。
【００５７】
本発明の二量体に加えて、液体投薬形態は、不活性な成分（例えば、水、エチルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル）を含み得る。
【００５８】
（処置方法）
本発明は、感覚ニューロン、網膜神経節細胞、脊髄神経節のニューロン、および以下に挙げる組織のニューロンの処置に有用である。：膝神経節、錐体神経節および下神経節；内耳脳神経の前庭聴覚複合体；三叉神経節の上下顎葉の腹外側極；および三叉神経中脳路核。
【００５９】
本発明の組成物および方法は、感覚ニューロン、自律ニューロンまたはその両方を処置するために使用され得る。侵害受容性ニューロンおよび機械受容性ニューロン（例えば、Ａ−δ線維ニューロン、Ｃ−線維ニューロンおよびＡ−β線維ニューロン）が処置され得る。さらに、自律ニューロン系の交感ニューロンおよび副交感ニューロンが処置され得る。
【００６０】
（神経障害性疼痛）
神経障害性疼痛の処置に用いた場合、本発明の二量体は、単独で、または鎮痛薬との組み合わせで、投与され得る。鎮痛薬の例としては、オピオイド、抗不整脈薬、局所鎮痛薬、局所麻酔薬、鎮痙薬、抗鬱薬、コルチコステロイドまたは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。好ましい鎮痛薬は、ガバペンチン（（１−アミノメチル）シクロヘキサン酢酸）；およびプレガバリン（Ｓ−（＋）−４−アミノ−３−（２−メチルプロピル）酪酸）である。
【００６１】
本発明の二量体は、末梢神経障害が関連した疼痛の処置に使用され得る。神経障害本発明により処置され得る末梢神経障害としては、外傷により誘導される神経障害、脳への身体的損傷、脊髄への身体的損傷、および脳卒中が挙げられる。
【００６２】
本発明はまた、化学療法誘導性神経障害の処置、その他の薬物誘導性神経障害の処置、病原体誘導性神経障害の処置、毒素誘導性神経障害の処置、ビタミン欠乏誘導性神経障害の処置；特発性神経障害の処置；および糖尿病性神経障害の処置も提供する。本発明はまた、単神経障害、単多発性神経炎、ならびに多発性神経障害（軸索神経障害および脱髄性神経障害を含む）を処置するためにも、使用され得る。
【００６３】
化学療法誘導性神経障害の例としては、化学療法剤(例えば、タキソール、タキソテレ（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、シスプラチン、ノコダゾール、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビンブラスチン）への曝露により引き起こされる神経障害が挙げられる。他の薬物誘導性神経障害の例としては、ｄｄＩ、ＤＤＣ、ｄ４Ｔ、ホスカネット、ダプソン、メトロニダゾールおよびイソニアジドにより引き起こされる、神経障害が挙げられる。毒素誘導性神経障害の例としては、アルコール症、ビタミンＢ６中毒、ヘキサカーボン（ｈｅｘａｃａｒｂｏｎ）中毒、アミオダロン、クロラムフェニコール、ジスルフィラム、イソニアジド、金、リチウム、メトロニダゾール、ミソニダゾール、およびニトロフラントインにより誘導される神経障害が挙げられる。ウイルス誘導性神経障害の例としては、（疱疹後神経痛に至り得る）帯状疱疹、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびパピローマウイルス（ＨＰＶ）により引き起こされる神経障害が挙げられる。ビタミン欠乏誘導性神経障害の例としては、ビタミンＢ１２不足、ビタミンＢ６不足、およびビタミンＥ不足により引き起こされる神経障害が挙げられる。本発明により処置され得るその他の型の神経障害としては、炎症誘導性神経損傷、神経変性、遺伝性神経障害（例えば、フリートライヒ運動失調、家族性アミロイド多発性神経障害、タンジアー病、ファブリー病）、代謝障害（例えば、腎不全および甲状腺機能低下症）、感染およびウィルス性神経障害（例えば、らい病、ライム病に関連する神経障害性疼痛）が挙げられる。自己免疫性神経障害としては、ギヤン−バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、重要性未定の単一クローン性高ガンマグロブリン血症および多発性神経障害、三叉神経痛およびエントラップメント症候群（例えば、手根管症候群）、ならびにその他の神経障害性疼痛症候群（外傷後神経痛、幻想肢痛、多発性硬化症性疼痛、複雑な局所性疼痛症候群（例えば、反射性交感神経性ジストロフィー、カウザルギー）、新形成関連疼痛、脈管炎／脈管障害性ニューロパシー、および坐骨神経痛を含む）が挙げられる。
【００６４】
（触覚性異痛症）
触覚性異痛症は、通常では無害の皮膚刺激（例えば、接触）によって疼痛が誘発される状態をいう。触覚性異痛症は、薬学的有効量の本発明における二量体を、被験体に投与することによって処置され得る。上記二量体は、単独または有効量の鎮痛薬との組み合わせで投与され得る。
【００６５】
本発明の二量体は、治療薬（例えば、抗癌剤または抗ウィルス剤）と共に同時投与され得る。抗癌剤の例としては、タキソール、タキソテレ、シスプラチン、ニコダゾール、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビンブラスチンが挙げられる。抗ウィルス剤の例としては、ｄｄＩ、ＤＤＣ、ｄ４Ｔ、ホスカネット、ダプソン、メトロニダゾールおよびイソニアジドが挙げられる。
【００６６】
（痛覚感受性損失の軽減）
本発明の組成物は、糖尿病性神経障害の患者における痛覚感受性損失（例えば、温熱性の痛覚感受性損失）の軽減に使用され得る。処置は、予防的または治療的であり得る。
【００６７】
予防的処置では、本発明の二量体は、痛覚感受性損失の発症の危険性がある患者（例えば、神経障害の初期段階である患者）に投与される。
【００６８】
治療的処置では、本発明の二量体は、神経障害の結果として痛覚感受性損失を経験した患者（例えば、神経障害後期）に投与される。
【００６９】
（ウィルス関連神経障害）
本発明の組成物および本発明の方法は、ウィルス感染または細菌感染が関連した神経障害の予防的処置に使用され得る。予防的処置は、ウィルス感染の確定後および神経障害性疼痛の発症前に示される。処置の間、本発明の二量体は、神経障害性疼痛（例えば、らい病、ライム病が関連する神経障害性疼痛、またはウィルスによって引き起こされる神経障害性疼痛）の出現を阻害するために投与される。神経障害性疼痛を引き起こし得るウィルスとしては、帯状疱疹ウィルス（疱疹後に神経痛を導き得る）；ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）；およびヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）が挙げられる。
【００７０】
ウィルス感染の急性症状としては、しばしば、発疹の出現が挙げられる。その他の症状としては、例えば、身体の罹患領域における持続的な疼痛が挙げられる。これは、帯状疱疹感染（帯状疱疹）の通常の合併症である。疱疹後神経痛は、一月以上にわたって持続し得、そして発疹様症状のいずれもが消失した数ヶ月後に現れ得る。
【００７１】
本発明はまた、ウィルス感染または細菌感染が関連した神経障害性疼痛の治療的処置も提供する。治療的処置において、本発明の二量体は感染が関連した神経障害性疼痛を経験している患者に投与される。
【００７２】
（有痛性の糖尿病性神経障害）
本発明の組成物および本発明の方法は、有痛性の糖尿病性神経障害の予防的処置に使用され得る。糖尿病性神経障害の予防的処置は、糖尿病または糖尿病関連症状の最初の診断後および神経障害性疼痛の発症前に開始する。有痛性の糖尿病性神経障害の予防的処置はまた、被験体が糖尿病または糖尿病関連症状の発症の危険性があることを決定する際に始まる。本発明の二量体は、神経障害性疼痛の出現を予防するためおよび／または既に現れている神経障害性疼痛の感受性を軽減するために投与される。
【００７３】
本発明はまた、糖尿病が関連した神経障害性疼痛の治療的処置も提供する。治療的処置では、本発明の二量体は、糖尿病が関連した神経障害性疼痛を経験している患者に投与される。
【００７４】
（投与量および投与経路）
好ましくは、本発明の二量体からなる処方物は、１用量当たり０．１μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇ被験体体重の投与量で投与される。好ましくは、この投与量が１用量当たり１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ被験体体重である。さらに好ましくは、この投与量が１用量当たり１μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ被験体体重（例えば、１用量当たり３μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇ被験体体重）である。本発明の上記処方物の治療的に有効な量は、過度な実験を伴わずに当業者が確認可能な投与計画により、その必要性がある、被験体に投与され得る。
【００７５】
本発明の二量体の投与は、全身的または局所的であり得る。本発明の二量体は任意の適切な送達系（例えば、静脈内送達、筋肉内送達、肺内送達、皮下送達、および腹腔内送達であり、最も好ましくは、筋肉内送達、静脈内送達、または皮下送達である）により投与され得る。上記二量体はまた、くも膜下腔内にも投与され得る。
【００７６】
本発明はさらに、以下の非限定的実施例においてさらに例示される。
【実施例】
【００７７】
（実施例１：哺乳動物細胞における発現）
成熟ヒトニューブラスチン（ｈＮＢＮ）は本来、プレプロタンパク質として発現する。このポリペプチドは、タンパク質を分泌経路に導くためのシグナルペプチド配列、成熟化の際に開裂および破棄されるプロドメイン、および成熟タンパク質を含む。この成熟１１３アミノ酸タンパク質は、１つのグリコシル化部位および７つのシステイン残基を含む。この７つのシステイン残基は、ジスルフィド架橋した、グリコシル化ホモ二量体を形成する、３つの分子内ジスルフィド結合と１つの分子間ジスルフィド結合に関与する。
【００７８】
（プラスミドｐＪＣ０７０．１４の構築）ヒトニューブラスチンｃＤＮＡをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させるために、ヒトニューブラスチンのプレプロ形態をコードするｃＤＮＡフラグメントを、哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＡＧ３４７に挿入して、プラスミドｐＪＣ０７０．１４を作製した。このプラスミドｐＥＡＧ３４７は、タンデムＳＶ４０初期プロモーターおよびアデノウイルス主要後期プロモーター（プラスミドｐＡＤ２β由来；Ｎｏｒｔｏｎら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２８１）、固有のＮｏｔ−Ｉクローニング部位、続くＳＶ４０後期転写終結およびポリＡシグナル（プラスミドｐＣＭＶβ由来；ＭａｃＧｒｅｇｏｒら，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：２３６５）を含む。さらに、ｐＥＡＧ３４７は、ｐＵＣ１９由来プラスミド骨格ならびにＭＴＸ選択およびトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における増幅のためのｐＳＶ２ｄｈｆｒ由来ｄｈｆｒを含む。
【００７９】
プラスミドｐＪＣ０７０．１４を、２工程で作製した。第一に、ヒトニューブラスチンのプレプロ形態をコードするフラグメントを、プラスミドｐＵｂｉｌＺ−ＮＢＮから、オリゴヌクレオチドＫＤ２−８２４ ５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡ ＴＧＧＡＡＣＴＴＧＧ ＡＣＴＴＧＧＡＧＧ３’（配列番号２２），ＫＤ２−８２５ ５’ＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴ ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴ ＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣ ＡＧＣＣＧＣＡＧＧ３’（配列番号２３）およびＰＦＵポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して単離した。プラスミドｐＪＣ０６９を作製するために、このフラグメントを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）のＳｒｆ−１部位にクローン化した。第二工程において、部分Ｎｏｔ−１消化をプラスミドｐＪＣ０６９において実行して、６８５ｂｐフラグメント（ニューブラスチン遺伝子を含む）を作製し、これを、プラスミドｐＥＡＧ３４７のＮｏｔ−１部位にクローン化して、プラスミドｐＪＣ０７０．１４を作製した。プラスミドｐＪＣ０７０．１４におけるニューブラスチン遺伝子の転写を、アデノウイルス主要後期プロモーターによって制御した。
【００８０】
（ヒトニューブラスチンを発現するＣＨＯ細胞株）最初に、２００μｇのｐＪＣ０７０．１４を、Ｍｌｕ−１を用いる消化によって直鎖化した。その後、２００μｇの超音波処理をしたサケ精子ＤＮＡを加えた。このＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、そしてエタノール沈殿した。上記直鎖化ＤＮＡを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０５）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース（ＨＥＢＳ）中に再懸濁し、そしてエレクトロポレーション（２８０Ｖおよび９６０μＦ）によって〜４Ｅ７ ＣＨＯ ｄｕｋｘ Ｂ１（ｄｈｆｒ−）細胞（ｐ２３）に導入した。エレクトロポレーションに続いて、細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補充されたα＋改変イーグル培地（ＭＥＭ）中の培養物に２日間、戻した。その後、細胞をトリプシン処理し、そして１０％透析ＦＢＳを補充した、α−ＭＥＭ（リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを欠く）中に１００ｍｍディッシュ中で、５日間、再プレートした（１００，０００細胞／プレート）。続いて、この細胞を、１００，０００細胞／１００ｍｍプレートの密度にて分け、そして２００ｎＭメトトレキサート中で選択した。耐性コロニーを選択し、そして６ウェルプレートまでスケールアップし；各クローン由来の馴化培地を、以下に記載されるニューブラスチンについての特異的アッセイを使用してスクリーニングした。
【００８１】
最も高いレベルのニューブラスチンを発現する１２個のクローンを、Ｔ１６２フラスコにスケールアップし、および続いて、再アッセイした。これらのＣＨＯ細胞株は、２５〜５０ｎｇ／ｍｌ／日の範囲でニューブラスチンを産生した。４個の最もよくニューブラスチンを発現する細胞株を１２００ｎＭメトトレキサート中で増幅し、そして攪拌フラスコ中での懸濁培養に供した。その結果得られたクローンは、高密度攪拌培養液中に約２μｇ／ｍＬを産生した。
【００８２】
（ニューブラスチンに対する三重複合体アッセイ）ニューブラスチンの存在を、ＣＨＯ細胞株の培地上清において、三重複合体アッセイの改変形態を用いて、評価した。上記アッセイは実質的にＳａｎｉｃｏｌａら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：６２３８に記載されたものと同様であった。
【００８３】
（ＣＨＯ細胞におけるＮＢＮ１０４の発現）成熟ｈＮＢＮ１０４アミノ酸形態は、以下の手順によりチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させた。合成ｈＮＢＮ遺伝子を、ＣＨＯ細胞において、タンパク質の翻訳に最も一般的に利用されるコドンを使用して作製した。固有の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入した。ラットアルブミン（ｒＡｌｂ）シグナルペプチドに対するコドン、すなわち、
【００８４】
【化１】
およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に対する配列、すなわち、
【００８５】
【化２】
を、ｈＮＢＮに独立して融合し、融合遺伝子（シグナルペプチドは普通の字体であり、そしてＮＢＮ配列はイタリック体であり；上記ｈＧＨシグナルペプチドはイントロンを含む）を作製した。それぞれの融合遺伝子を構成的なプロモーターの転写制御下に配置し、そしてＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。安定な形質転換体を単離した。
【００８６】
上記細胞株を、分泌されたｈＮＢＮの発現について分析した。還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット分析からのデータは、培地中に分泌されたｈＮＢＮに対応するタンパク質バンドの存在を実証した。馴化培地のさらなる分析は、直接（抗体に制御されたアッセイ）機能的アッセイおよび間接（細胞に基づいた）機能的アッセイの両方で、滴定可能な成分の存在を実証した。
【００８７】
この結論とは、機能的ｈＮＢＮが、ＣＨＯ細胞内で、プロドメインの非存在下で、および異種のシグナルペプチド配列と共に発現し得るということである。
【００８８】
（実施例２：ＣＨＯ細胞におけるラットニューブラスチンの発現）
（プラスミドｐＣＷＥＸ０１７．１の構築）ラットニューブラスチンに対する遺伝子を、共にラットニューブラスチンをコードする２つのフラグメント一緒に連結して作製した。ニューブラスチンのラットプレプロ形態の最初の１５６アミノ酸をコードするＤＮＡフラグメントからなるプラスミドｐＪＣ１０２を、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ ｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＴＯＰＯクローニング部位に挿入した。このフラグメントをＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｔ ラット肝臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、オリゴヌクレオチド ＡＰ２ ５’ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ３’（配列番号２６）およびＫＤ３−１７１ ５’ＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＴＡＴＣ３’（配列番号２７）を用いたポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。上記プレプロドメイン、およびニューブラスチンの成熟１１３アミノ酸形態の最初の２９アミノ酸を含むフラグメントを、最初に、プラスミドｐＪＣ１０２から、オリゴヌクレオチドＫＤ３−２１４ ５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＡ３’（配列番号２８）およびＫＤ３−２４７ ５’ＡＧＴＴＣＧＴＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＣＧ３’（配列番号２９）を用いたポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。ニューブラスチンの成熟１１３アミノ酸形態のアミノ酸３０〜１１３をコードする第２のフラグメントを、ｐＣＷＥＸ０１５から、オリゴヌクレオチドＫＤ３−２４６ ５’ＣＧＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＴＣＧＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＣＴＣＴＴＣＣＧＡＣＧＡＡＣＴ３’（配列番号３０）およびＫＤ３−２１９ ５’ＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＧ３’（配列番号３１）を用いて増幅した。上記プラスミドｐＣＷＥＸ０１５を、同系由来のＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１フラグメントを発現プラスミドｐＭＪＢ１３４の相補的部位に挿入して、作製した。この結果として生じるＤＮＡフラグメントを１：１の比率で混合し、オリゴヌクレオチドＫＤ３−２１４およびＫＤ３−２１９を用いた第二のポリメラーゼ連鎖反応に供し、ラットニューブラスチンの全長プレプロ形態を作製した。この結果として生じるＤＮＡフラグメントを、ｐＣＷＥＸ０１６を作成するために、プラスミドｐＣＲＩＩ 平滑部位のＴＯＰＯクローニング部位にクローニングした。全長プレプロニューブラチンを含むＮｏｔ−１フラグメントを単離し、そしてｐＥＡＧ３４７のＮｏｔ−１部位にクローニングして、ｐＣＷＥＸ０１７．１を作製した。
【００８９】
（ラットニューブラスチン合成遺伝子の配列）
【００９０】
【化３】
（ラットニューブラスチンを発現するＣＨＯ細胞株）２００μｇのプラスミドＣＷＥＸ０１７．１を、制限エンドヌクレアーゼＭｌｕ−１を用いる消化によって直鎖化した。消化後、２００μｇの超音波処理をしたサケ精子ＤＮＡを添加し、そしてこの混合物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、そしてエタノール沈殿した。上記直鎖化ＤＮＡを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０５）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース（ＨＥＢＳ）中に再懸濁させ、そしてエレクトロポレーション（２８０Ｖおよび９６０μＦ）によって〜４Ｅ７ ＣＨＯ ＤＧ４４ （ｄｈｆｒ−）細胞（ｐ８）に導入した。エレクトロポレーションに続いて、細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補充されたα＋改変イーグル培地（ＭＥＭ）中で２日間培養するために戻した。その後、細胞をトリプシン処理し、そして１０％透析ＦＢＳを補充した、α−ＭＥＭ（リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを欠く）中の１００ｍｍディッシュ中に再プレートした（１００，０００細胞／プレート）。６日間培養後、培地を取り替え、そしてこの細胞を２００ｎＭメトトレキサート中で選択した。耐性コロニーを選択し、そして６ウェルプレートまでスケールアップし；各クローン由来の馴化培地を、上に参照されるニューブラスチンに対する三重複合体アッセイを使用してスクリーニングした。最も高いレベルのニューブラスチンを発現する５個のクローンを、Ｔ１６２フラスコにスケールアップし、そして、その後、再アッセイした。これらのＣＨＯ細胞株は、５００ｎｇ／ｍｌ／日の範囲でニューブラスチンを産生した。この最も高く発現する株を、続いて懸濁培養に適合させ、そしてこの株は、高密度攪拌培養液中に約２μｇ／ｍｌでニューブラスチンを発現する。
【００９１】
（ＰＥＧ化されたＣＨＯ由来ラットニューブラスチン）
ラットＮＢＮ（クローン３３ｓ）を発現するＣＨＯ細胞１００リットルを、２００ｎＭメトトレキサートを含むＢＣＭ１６培地中で、３７℃にて１０日間、増殖させた。上記培養物をフィルター濾過し、そして１０倍に濃縮した。Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）を最終濃度１０ｍＭまで添加し、そして上記培地を１２０ｍＬ ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、４℃で終夜ロードした。このカラムを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄し、そして結合したタンパク質をカラムから、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中のＮａＣｌ勾配（０．１Ｍ〜１Ｍ）を用いて溶出した。試料を、吸光度を２８０ｎｍで、総タンパク質についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥで、そして機能性ＮＢＮについては、ＲｅｔＬ３三重複合体ＥＬＩＳＡを使用して分析した。ＮＢＮ活性は、このタンパク質ピークの立ち上がりに見られた。上記ＳＰカラムからのピークＮＢＮ含有画分をプールし、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（７．５）で５倍に希釈して、２２ｍＬ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードした。このカラムを１１０ｍＬの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭで洗浄し、そしてＮＢＮを１０ｍＭ Ｈｅｈｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。ＮＢＮ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定し、そしてプールした。このプールした画分を１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）で１５０ｍＭの最終塩濃度に希釈した。このタンパク質を２０ｍＬ ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードし、そしてＮａＣｌ勾配で、再び溶出した。ＮＢＮ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールし、フィルター濾過し、そして−７０℃で保存した。タンパク質の状態を、２８０ｎｍの吸光度で、１ｍｇ／ｍＬ溶液に対して０．５の吸光係数を使用して測定した。この精製したＣＨＯ ＮＢＮは、非還元状況下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、見かけ上の質量が３６ｋＤａの単一で広範なバンドとして移動し、そして還元状況下では、見かけ上の質量が１８ｋＤａのバンドとして移動した。Ｎ末端配列の分析は、生成物のＮ末端が、脱１−４付加物、脱１−７付加物および脱１−９付加物を産生する選択的部位における開裂により異なることを、明らかにした。
【００９２】
上記精製したＮＢＮにおいて、Ｎ末端の異種性を排除するため、このタンパク質を、ＮＢＮに対して１：１００（ｗ／ｗ）比のトリプシンを用いて、ｐＨ８．５にて、３７℃で２時間処理し、そして１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌでＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲル濾過カラムにて精製した。ピークＮＢＮ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プール（０．９ｍｇ／ｍＬ最終濃度）し、０．２μｍフィルターを通してフィルター濾過し、アリコートし、そして後の研究のために−７０℃で保存した。トリプシン処理後のＮＢＮのＮ末端配列決定は、このタンパク質がＡＴＤＡＲＧＣ配列で始まる脱１−９、１０４アミノ酸形態に変換されたことを明らかにした。還元され、そして脱グリコシル化された生成物の質量分析データは、１１１０４Ｄａの質量を示し、予想したＮＢＮの脱１−９形態の質量と厳密に一致した。
【００９３】
上記精製された脱１−９ＮＢＮを室温で解凍した。Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）を１Ｍストックから、５０ｍＭ加え、そして２０Ｋ ＮＨＳ−ＳＰＡ ＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｒｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．）を最終濃度８ｍｇＰＥＧ／ｍＬで加えた。反応物中の上記ＮＢＮの最終濃度は０．７ｍｇ／ｍＬであった。このサンプルを室温で３時間インキュベートし、そして５０容量の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌに対し、４℃で一晩透析した。このジＰＥＧ化形態を、他の反応生成物および遊離のＰＥＧから室温にて、樹脂の充填濃度が３ｍｇＮＢＮ／ｍＬでＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。このカラムを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌの４．５カラム体積分率で洗浄し、その後、上記ジＰＥＧ化生成物を１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌの４．５カラム体積分率で溶出した。その後、モノＰＥＧ化ＮＢＮを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、３５０ｍＭ ＮａＣｌの４．５カラム体積分率で、そして未反応のＮＢＮを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、８００ｍＭ ＮａＣｌの４．５カラム体積分率で溶出した。ＮＢＮを含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価し、そして９０％を超えるジＰＥＧ化生成物を含む画分をプールし、ＰＢＳに対して一晩透析し、そして０．２μｍフィルターによってフィルター濾過した。内毒素レベルを測定し、１ＥＵ／ｍｇ未満であると決定した。上記物質を、機能についてＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡおよび神経生存アッセイで試験し、そして十分な活性があると判定した。この最終物質をアリコートし、そして次の試験のために−７０℃で保存した。初期の研究において、上記モノＰＥＧ化生成物はまた、インビボ試験のために収集した。しかし、ジＰＥＧ化物質のより良い特性から、その後、全てにおいてジＰＥＧ化物質を選択した。ジＰＥＧ化物質の収量を増加するため、本発明者らは、さらに、モノＰＥＧ化ＮＢＮを新鮮なＰＥＧで処理し、そして再び、この反応混合物からジＰＥＧ化生成物を精製した。
【００９４】
（実施例３：ＰＥＧ化およびグリコシル化されたニューブラスチンの薬物動態）
ＰＥＧ化され、グリコシル化されたニューブラスチンの薬物動態特性を、ラットおよびマウスにおいて調べた。グリコシル化され、切断されたラットニューブラスチン（Ｎ末端９アミノ酸の切断；ＮＢＮ１０４）の、２つの２０，０００ＤａのＰＥＧ部分によるＮ末端のＰＥＧ化（２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４）は、ニューブラスチンの半減期およびバイオアベイラビリティの有意な改善を生じた。ＣＤマウスに対し、１．５ｍｇ／ｋｇ皮下投与した後では、２４時間で、ＰＥＧ化され、グリコシル化されたニューブラスチンに関して９７ｎｇ／ｍｌの血清レベルを検出した。対照的に、マウスに対し、２つの２００００ＤａのＰＥＧ（２×２０ＫＤａ ＰＥＧ）でＰＥＧ化された非グリコシル化ニューブラスチンの１．５ｍｇ／ｋｇ皮下投与後、ニューブラスチン血清レベルは２４時間で、３９ｎｇ／ｍｌであった。マウスに対する、非修飾グリコシル化ＮＢＮ１０４の１．５ｍｇ／ｋｇ皮下投与２４時間後では、ニューブラスチンは検出されず、これはニューブラスチンの血清レベルが５ｎｇ／ｍｌ未満であることを示している。意外なことに、ＰＥＧ化され、グリコシル化されたニューブラスチンを用いて達成された血清レベルは、ＰＥＧ化された非グリコシル化ニューブラスチンを用いて達成された血清レベルよりも約２．５倍大きかった。
【００９５】
Ｎ末端がＰＥＧ化されたグリコシル化ニューブラスチンの血清レベルの上昇がまた、ラット研究において観察された。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに対し、２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４の１ｍｇ／ｋｇ皮下投与後、５０ｎｇ／ｍｌのＰＥＧ化ニューブラスチンのピーク血清レベルを４８時間後に検出した。非ＰＥＥＧ化ニューブラスチンの１ｍｇ／ｋｇ皮下投与後、４８時間後での血清レベルは、２ｎｇ／ｍｌ未満であった。これらのデータはグリコシル化ニューブラスチンのＮ末端ＰＥＧ化（２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４）は、結果としてＰＥＧ化されていないグリコシル化ニューブラスチンの投与後に達したピーク血清レベルより、少なくとも１９倍高い、ニューブラスチンのピーク血清レベルを生じることを示した。これらのデータは、Ｎ末端でのＰＥＧ化およびアミノ酸９５でのグリコシル化の組み合わせが、ニューブラスチンの薬物動態特性およびバイオアベイラビリティの相当な向上を生じることを、実証した。
【００９６】
（実施例４：神経障害性疼痛の動物モデルにおける、ＰＥＧ化されたグリコシル化ニューブラスチン）
触覚性異痛症および温熱性痛覚過敏におけるＰＥＧ化されたグリコシル化ニューブラスチンの逆転効果を、Ｃｈｕｎｇ Ｌ５／Ｌ６脊髄神経結紮（「ＳＮＬ」）モデルにおいて研究した。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット（２００〜２５０ｇ）を３つの群に分けた。全てのラットが脊髄神経結紮を受けた。第一の群のラット（ｎ＝６）に皮下注射によりビヒクルを投与した。第二および第三の群のラット（群当たりｎ＝６）には３μｇ／ｋｇおよび３０μｇ／ｋｇのＰＥＧ化された、グリコシル化ニューブラスチン（２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４）を皮下注射により投与し、ここで上記タンパク質は、ＣＨＯ由来であり、切断され（Ｎ末端９アミノ酸の切断；ＮＢＮ１０４）、および２０，０００Ｄａ ＰＥＧでそれぞれのＮ末端がＰＥＧ化されていた。ニューブラスチンは二量体として存在するので、それぞれの二量体は、２つの２０，０００Ｄａ ＰＥＧを含む。上記ビヒクルは、５ｍＭリン酸塩および１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．５）からなる。皮下注射を施術後（ＳＮＬ後）３日目、５日目、７日目、１０日目、１２日目および１４日目に投与した。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ行動試験およびＨａｒｇｒｅａｖｅ行動試験（Ｃｈａｐｌａｎら，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．５３：５５−６３；Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら，１９８８，Ｐａｉｎ ３２：７７−８８）を用いて，触覚応答および温熱応答をそれぞれモニタリングした。これらの疼痛応答を、ベースライン応答を確立するために脊髄神経結紮の前にモニタリングして、そして、その後、ＳＮＬ後３日目の薬物投与前、ならびにＳＮＬ後５日目、７日目、１０日目、１２日目および１４日目での薬物投与後、約１時間でモニタリングした。ビヒクル処置に対する薬物処置の統計的有意性を評価するために、２元分散分析配置法（２−ｗａｙ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ（２−ｗａｙ ＲＭ ＡＮＯＶＡ））をｐｏｓｔ−ｈｏｃ Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｎｅｕｍａｎ Ｋｅｕｌｓ（ＳＮＫ）テストに従って実施した。
【００９７】
上記結果を、平均±平均の標準誤差として図１および図２に要約した。両方の型の神経障害性疼痛行動（触覚性異痛症を図１に、そして温熱性痛覚過敏を図２に示す）は、予測通り、３日までに十分に進行した。３μｇ／ｋｇまたは３０μｇ／ｋｇ ２×２０ＫＤａ
ＰＥＧ ＮＢＮ１０４の皮下投与(図１および図２において下向きの矢印によって示される）は、脊髄神経結紮を伴うラットにおいて、実質的かつ統計学的に有意な、両方の型の神経障害性疼痛の逆転を導いた。脊髄神経結紮を伴うラットにおいて、温熱性感受性および触覚性異痛症に対する２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４の効果は、ＰＥＧ化されたグリコシル化ニューブラスチンの投与開始後、それぞれ４日目および７日目で初めて統計学的に有意になった。温熱性感受性および触覚性異痛症に対する２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４の効果は、ＰＥＧ化されたグリコシル化ニューブラスチンの投与開始後約７日でプラトーに達した。２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４の効果は、投与の間の投与間隔２日〜３日間の間隔の間において減少しなかった。実際に、ＰＥＧ化されたグリコシル化ニューブラスチンの投与の間における疼痛作用の実質的な正常化が５日目、７日目および１０日目に存在した。
【００９８】
これらの結果は、２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４が、ＳＮＬモデルにおける触覚性異痛症の疼痛行動および温熱性痛覚過敏の疼痛行動に対する、ＰＥＧ化されておらず、グリコシル化されていないニューブラスチンの効力に対し、少なくとも３３３倍、効力が増加したことを実証した。
【００９９】
（その他の実施形態）
その他の実施形態は上記請求項に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、タンパク質化学、分子生物学、神経生物学、神経学、および疼痛処理に関係する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
神経栄養因子は、発生の間における神経細胞の生存を調節し、およびこの成熟した神経系の可塑性および構造的統合性を調節する、天然に存在するタンパク質である。これらの神経栄養因子は、スーパーファミリー、ファミリー、サブファミリー、ならびにそれらの構造および機能に基づいた個別の種に分類され得る。
【０００３】
神経栄養因子スーパーファミリーとしては、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）スーパーファミリー、ニューロトロフィンスーパーファミリー、およびトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーが挙げられる。グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）関連リガンドは、ＴＧＦ−βスーパーファミリー内のタンパク質ファミリーである。ＧＤＮＦ関連リガンドとしては、ＧＤＮＦ、パーセフィン（ＰＳＰ）、ニュールツリン（ＮＴＮ）およびニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）（ＮＢＮ；アルテミンまたはエノビン（ｅｎｏｖｉｎ）として公知である）が挙げられる。ＧＤＮＦ関連リガンドファミリーのメンバーは、特に、保存された７つのシステイン残基によって区別される。これらの残基は分子内および分子間のジスルフィド架橋を形成し、ならびに二量体化したポリペプチドリガンドの三次構造および四次構造を生じる。上記ファミリーのメンバーとしては、ＧＦＰαファミリーのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定化補助レセプター、ＧＤＮＦ関連リガンドサブファミリーのメンバー、およびＲＥＴチロシンキナーゼレセプターからなる多成分レセプター複合体によるシグナル伝達も誘導する。
【０００４】
活性化されたＲＥＴは、少なくとも部分的にＧＤＮＦ関連リガンドの下流の効果を担う、シグナル伝達カスケードを惹起する。
【０００５】
７つのシステインモチーフを含む他のＧＤＮＦリガンド（例えば、ＥＰ０２／０２６９１、ＰＣＴ公報ＵＳ０２／０２３１９およびＵＳ０２／０６３８８に記載されるようなもの）と相同性のある領域を共有し、ならびにＧＦＲα複合体の一部としてＲＥＴレセプターに結合し、そしてこのＲＥＴレセプターを活性化することから、ニューブラスチンは上記ＧＤＮＦファミリーに分類される。ニューブラスチンは、上記ＧＦＲα３−ＲＥＴレセプター複合体に対する結合において、高度に選択的である。その点において、ニューブラスチンはそのアミノ酸配列の中に、他の上記ＧＤＮＦ関連リガンドファミリーと比較して固有のサブ領域を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ニューブラスチンの投与は、神経の変性および神経の機能障害に関連した疾患の処置に有用である可能性がある。しかし、ニューブラスチンは身体によって速やかに除去され、このことが治療的な適用に必要なニューブラスチンの投薬パラダイムに影響を与え得る。ニューブラスチンの上記生物学的活性を示しつつ、向上した効力を示す分子に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
ニューブラスチンタンパク質（すなわち、二量体）が内部的にグリコシル化されており、およびアミノ末端に水溶性の合成ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が結合する場合、バイオアベイラビリティおよび血清半減期を顕著に向上させることが見い出されている。従って、インビボでの効果が低用量で達成される。
【０００８】
この発見に基づき、本発明は、第一ニューブラスチンポリペプチドおよび第二ニューブラスチンポリペプチドを含む二量体を特徴とし、ここで：（ａ）少なくとも一つの上記ポリペプチドがグリコシル化されており；（ｂ）少なくとも一つの上記ポリペプチドがそのＮ末端に、水溶性の合成ポリマーを結合しており；および、（ｃ）上記どちらのポリペプチドも、Ｎ末端以外の位置に水溶性の合成ポリマーが結合していない。
【０００９】
上記ニューブラスチンポリペプチドは、例えば、ＮＢＮ１１３（配列番号２）、ＮＢＮ１４０（配列番号６）、ＮＢＮ１１６（配列番号７）、ＮＢＮ１１２（配列番号８）、ＮＢＮ１１１（配列番号９）、ＮＢＮ１１０（配列番号１０）、ＮＢＮ１０９（配列番号１１）、ＮＢＮ１０８（配列番号１２）、ＮＢＮ１０７（配列番号１３）、ＮＢＮ１０６（配列番号１４）、ＮＢＮ１０５（配列番号１５）、ＮＢＮ１０４（配列番号１６）、ＮＢＮ１０３（配列番号１７）、ＮＢＮ１０２（配列番号１８）、ＮＢＮ１０１（配列番号１９）、ＮＢＮ１００（配列番号２０）およびＮＢＮ９９（配列番号２１）であり得る。上記二量体に組み込むのに好ましいポリペプチドは、ＮＢＮ１０４（配列番号１６）である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記第一ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列および上記第二ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は同一である。好ましくは、上記水溶性の合成ポリマーはポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））である。
【００１１】
好ましくは、上記二量体に結合した上記ポリアルキレングリコール部分の総分子量の平均が、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａであり；さらに好ましくは１５ｋＤａ〜４５ｋＤａであり；そして最も好ましくは２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。このポリアルキレングリコール部分は直鎖状または分枝状であり得る。
【００１２】
本発明は、請求項１に記載の二量体および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、哺乳動物（例えば、ヒトの患者）において、神経障害性疼痛を処置する方法を提供する。この方法は、上記哺乳動物に、治療的に有効な量の本発明の二量体を投与する工程を包含する。本発明は、哺乳動物において、触覚性異痛症を処置する方法を提供する。この方法は、上記哺乳動物に、治療的に有効な量の本発明の二量体を投与する工程を包含する。本発明は、哺乳動物において、温熱性痛覚過敏を処置する方法を提供する。この方法は、上記哺乳動物に、治療的に有効な量の本発明の二量体を投与する工程を包含する。本発明は、哺乳動物において、ＲＥＴレセプターを活性化する方法を提供する。この方法は、上記哺乳動物に、有効量の本発明の二量体を投与する工程を包含する。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態において、上記治療的に有効な量は、０．１μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、この治療的に有効な量は、１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、この治療的に有効な量は、１μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、この治療的に有効な量は、３μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇである。好ましくは、上記投与経路は筋肉内または皮下である。
【００１５】
他に定義される場合を除き、本明細書中で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明の属する分野の当業者が、通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似かまたは等価な方法および材料が、本発明の実施の実施において使用され得るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書中で言及した、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書に従う。
【００１６】
特別に定めた場合を除き、ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸残基番号についての参照は、配列番号１の番号に対応する。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「コンセンサスニューブラスチン」は、配列番号１の配列を意味する。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「ニューブラスチンポリペプチド」は、（１）ホモ二量体として二量体化したとき、少なくとも一つのニューブラスチンの生物学的活性を示し、かつ（２）配列番号２のアミノ酸８〜１１３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを意味する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「野生型ニューブラスチンポリペプチド」は、アミノ酸配列が、天然に存在するニューブラスチンポリペプチドの配列であるポリペプチドを意味する。野生型ニューブラスチンの例としては、ヒトニューブラスチン（配列番号２）、マウスニューブラスチン（配列番号３）、およびラットニューブラスチン（配列番号４）が挙げられる。
【００２０】
アミノ酸配列間の同一性のパーセントは、ＢＬＡＳＴ ２．０プログラム（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで入手可能）またはこれ以降のバージョンを使用して決定され得る。配列比較はギャップのないアラインメントおよび初期値のパラメータ（Ｂｌｏｓｓｌｍ ６２ マトリックス、１１のギャップ存在コスト、１の残基毎のギャップコスト、および０．８５のラムダ比である）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴプログラムに用いられる上記数学的アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３３８９−３４０２に記載される。
【００２１】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
第一ニューブラスチンポリペプチドおよび第二ニューブラスチンポリペプチドを含む二量体であって、ここで：（ａ）少なくとも一つの該ポリペプチドがグリコシル化されており；（ｂ）少なくとも一つの該ポリペプチドがそのＮ末端に、水溶性の合成ポリマーを結合しており；および、（ｃ）どちらの該ペプチドも、Ｎ末端以外の位置に水溶性の合成ポリマーが結合していない、二量体。
（項目２）
上記第一ニューブラスチンポリペプチドが、ＮＢＮ１１３（配列番号２）、ＮＢＮ１４０（配列番号６）、ＮＢＮ１１６（配列番号７）、ＮＢＮ１１２（配列番号８）、ＮＢＮ１１１（配列番号９）、ＮＢＮ１１０（配列番号１０）、ＮＢＮ１０９（配列番号１１）、ＮＢＮ１０８（配列番号１２）、ＮＢＮ１０７（配列番号１３）、ＮＢＮ１０６（配列番号１４）、ＮＢＮ１０５（配列番号１５）、ＮＢＮ１０４（配列番号１６）、ＮＢＮ１０３（配列番号１７）、ＮＢＮ１０２（配列番号１８）、ＮＢＮ１０１（配列番号１９）、ＮＢＮ１００（配列番号２０）およびＮＢＮ９９（配列番号２１）からなる群から選択される、項目１に記載の二量体。
（項目３）
上記第一ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列および上記第二ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列が同一である、項目１に記載の二量体。
（項目４）
上記水溶性の合成ポリマーがポリアルキレングリコールである、項目１に記載の二量体。
（項目５）
上記第一ニューブラスチンポリペプチドのＮ末端のアミノ酸および上記第二ニューブラスチンポリペプチドのＮ末端のアミノ酸が、それぞれ、ポリアルキレングリコールによって結合している、項目４に記載の二量体。
（項目６）
上記第一ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列がＮＢＮ１０４（配列番号１６）である、項目３に記載の二量体。
（項目７）
上記二量体に結合した上記ポリアルキレングリコール部分の総分子量の平均が、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａである、項目１に記載の二量体。
（項目８）
上記二量体に結合した上記ポリアルキレングリコール部分の総分子量の平均が、１５ｋＤａ〜４５ｋＤａである、項目７に記載の二量体。
（項目９）
上記二量体に結合した上記ポリアルキレングリコール部分の総分子量の平均が、２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである、項目８に記載の二量体。
（項目１０）
上記ポリアルキレングリコールが直鎖状である、項目１に記載の二量体。
（項目１１）
上記ポリアルキレングリコールが分枝状である、項目１に記載の二量体。
（項目１２）
上記ポリアルキレングリコール部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である、項目１に記載の二量体。
（項目１３）
項目１に記載の二量体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目１４）
哺乳動物において神経障害性疼痛を処置するための方法であって、該哺乳動物に、治療的に有効な量の項目１に記載の二量体を投与する工程を包含する、方法。
（項目１５）
哺乳動物において触覚性異痛症を処置するための方法であって、該哺乳動物に、治療的に有効な量の項目１に記載の二量体を投与する工程を包含する、方法。
（項目１６）
温熱性痛覚過敏を処置するための方法であって、上記哺乳動物に、治療的に有効な量の項目１に記載の二量体を投与する工程を包含する、方法。
（項目１７）
上記哺乳動物がヒトである、項目１４、項目１５または項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記治療的に有効な量が、０．１μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇである、項目１４、項目１５または項目１６に記載の方法。
（項目１９）
上記治療的に有効な量が、１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記治療的に有効な量が、１μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
上記治療的に有効な量が、３μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記投与経路が、静脈内、筋肉内または皮下である、項目１６、項目１７または項目１８に記載の方法。
（項目２３）
哺乳動物のＲＥＴレセプターを活性化するための方法であって、該哺乳動物に、有効な量の項目１に記載の二量体を投与する工程を包含する、方法。
（項目２４）
哺乳動物において神経障害性疼痛、触覚性異痛症、または温熱性痛覚過敏を処置する方法であって、該哺乳動物に、有効な量の項目１に記載の二量体、および鎮痛薬を、共に投与する工程を包含する、方法。
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および請求項から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、Ｌ５／Ｌ６脊髄神経結紮（ｓｐｉｎａｌ ｎｅｒｖｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ）（ＳＮＬ）を有するラットにおける、それぞれの単量体がそのアミノ末端にＰＥＧ部分を結合しており、かつ９５位がグリコシル化されているＮＢＮ１０４のホモ二量体（「２×２０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４」）の皮下投与による、完全に確立された触覚性異痛症の実質的な逆転を示すデータをまとめた折れ線プロットである。
【図２】図２は、Ｌ５／Ｌ６脊髄神経結紮を有するラットにおける、２×２０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４の皮下投与による、完全に確立された温熱性痛覚過敏の実質的な逆転を示すデータをまとめた折れ線プロットである。
【図３】図３は、ヒト、マウス、およびラット由来の成熟した野生型ニューブラスチン配列間のアライメントである。また、ヒト配列、マウス配列およびラット配列に基づいたコンセンサス配列も示される。
【図４】図４は、ヒトニューブラスチン配列、マウスニューブラスチン配列およびラットニューブラスチン配列に基づくコンセンサス配列であり、任意のアミノ酸置換が示される。
【図５】図５は、野生型ヒトニューブラスチンのプレプロ配列および、選択的な翻訳後プロセッシングにより天然に産生される３つの異なる成熟したヒトニューブラスチン配列のアライメントである。
【図６】図６は、本発明の二量体に組み込まれ得る野生型ヒトニューブラスチンの１１３アミノ酸形態の種々の短縮型のアミノ酸配列アライメントである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
（ポリマーが結合した、グリコシル化ニューブラスチン二量体）
本発明の二量体は、ニューブラスチンの生物学的活性についてのアッセイにおいて活性を示す。例えば、本発明の二量体は、ＲＥＴ活性化アッセイにおいて活性がある。本発明の二量体は、対応する二量体であってポリマーの結合とグリコシル化との組み合わせを伴わない二量体に対し、バイオアベイラビリティの向上および／または血清半減期の延長を示す。本発明の好ましい実施形態においては、上記ポリマーが結合し、グリコシル化された二量体は、上記対応するポリペプチドであってポリマーの結合およびグリコシル化を伴わないポリペプチドの効力に対し、インビボにおいて顕著に増強した効力を示す。
【００２４】
一般的に、本発明の二量体に組み込まれるポリペプチドは、以下に挙げる特徴の少なくとも一つを保持する：
（ｉ）配列番号１において残基１６、残基４３、残基４７、残基８０、残基８１、残基１０９、および残基１１１に対応する位置にある、保存された７つのシステイン残基；
（ｉｉ）以下のようなアミノ酸残基：
１６位にあるＣ、１８位にあるＬ、２５位にあるＶ、２８位にあるＬ、２９位にあるＧ、３０位にあるＬ、３１位にあるＧ、３６位にあるＥ、４０位にあるＦ、４１位にあるＲ、４２位にあるＦ、４３位にあるＣ、４５位にあるＧ、４７位にあるＣ、８０位にあるＣ、８１位にあるＣ、８２位にあるＲ、８３位にあるＰ、９１位にあるＦ、９３位にあるＤ、９５位にあるＮ、１０５位にあるＳ、１０６位にあるＡ、１０９位にあるＣおよび１１１位にあるＣ；
（ｉｉｉ）ＬＧＬＧリピート、ＦＲＦＣモチーフ、ＱＰＣＣＲＰモチーフ、およびＳＡＴＡＣＧＣモチーフ。
【００２５】
好ましくは、上記ポリペプチドは上記特徴の全てを保持する。
【００２６】
野生型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列の例は、図３に表される。野生型ニューブラスチンポリペプチドおよび配列に関しては、ＰＣＴ公報ＷＯ ００／０１８１５に記載される。ニューブラスチンコンセンサス配列（ヒト、マウスおよびラットに対して共通である）は図４に表される。
【００２７】
上記ヒトプレプロニューブラスチンの配列（配列番号５）は、図５に示される。異なった翻訳後プロセッシングから生じる、３つの成熟したヒトニューブラスチンの形態が同定された。この３つの形態は：
（ｉ）ＮＢＮ１４０と命名された１４０アミノ酸のポリペプチド（配列番号６）；
（ｉｉ）ＮＢＮ１１６と命名された１１６アミノ酸のポリペプチド（配列番号７）；および
（ｉｉｉ）ＮＢＮ１１３と命名された１１３アミノ酸のポリペプチド（配列番号２）
である。
【００２８】
図５は、上記ヒトプレプロニューブラスチンのアミノ酸配列および上記３つの成熟形態の配列のアライメント比較である。１行目は、配列番号５のポリペプチドを示し、２行目は、配列番号６のポリペプチドを示し、３行目は、配列番号７のポリペプチドを示し、そして４行目は配列番号２のポリペプチドを示す。７つの保存されたシステイン残基を、成熟した二量体化ニューブラスチンリガンドにおいて形成される分子内（＊と＊、＃と＃および＋と＋）ジスルフィド架橋ならびに分子間（「｜」）ジスルフィド架橋を示すための記号（「＊」、「＃」、「＋」および「｜」）で表す。
【００２９】
本発明の二量体におけるニューブラスチンポリペプチドは、プロテアーゼ開裂反応生成物または化学的開裂反応生成物であり得るか、あるいは組換えＤＮＡ構築物から直接的に発現され得る。あるいは、それらは市販の固相シンセサイザーを用いて化学的に合成され得る。
【００３０】
好ましいポリマーが結合したニューブラスチンポリペプチド二量体は、それぞれの単量体がそのアミノ末端にＰＥＧ部分を結合しており、そして９５位がグリコシル化されているＮＢＮ１０４のホモ二量体である（「２×２０ｋＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４」）。いくつかの実施形態において、上記二量体中のポリペプチドは本質的に、配列番号１のアミノ酸８〜１１３からなる。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態においては、上記二量体はＧＦＲα３に結合し、そしてＲＥＴポリペプチドのチロシンリン酸化を刺激する。いくつかの実施形態において、この二量体は感覚ニューロンの残存を向上させるか、あるいは感覚ニューロンの病理学的な変化を縮小または逆転する。いくつかの実施形態において、この二量体は自律神経またはドパミン作動性神経の残存を向上させる。
【００３２】
本発明は、ポリマーが結合したグリコシル化ニューブラスチンポリペプチド二量体を作製する方法を提供する。上記方法は、グリコシル化ニューブラスチン二量体を、例えば、真核細胞から提供する工程、および上記二量体中の少なくとも１つのポリペプチドが、水溶性の合成ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール部分）に結合させる工程を包含する。
【００３３】
（ニューブラスチンポリペプチド）
ニューブラスチンポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。例えば、ニューブラスチンポリペプチドをコードしている核酸配列は、ベクター（例えば、発現ベクター）に挿入され得、そして上記ベクターは適切な宿主細胞に導入され得る。適切な宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化する宿主細胞である。真核生物宿主細胞が好ましい。しかし、少なくとも一つの細菌（すなわち、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）は、細菌性宿主細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）に転移され得るＮ結合グリコシル化系を有する（Ｗａｃｋｅｒら、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：１７９０−１７９３）。化学的修飾および／または細菌性グリコシル化の伸長は、当該分野で公知の方法および材料を使用して、インビトロで達成され得る。このように、グリコシル化コンピテント細菌系は必要に応じて、本発明により用いられるニューブラスチンポリペプチドを産生するために、使用され得る。
【００３４】
本発明における使用に適したニューブラスチンポリペプチドは、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞のようなヒト胚性腎臓（「ＨＥＫ」）細胞、ＢＨＫ２１細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞）で産生され得る。他の適切な哺乳動物細胞としては、ＰＣ１２細胞株、ＨｉＢ５細胞株、ＲＮ３３ｂ細胞株、ヒト神経前駆細胞、およびヒト細胞に由来する他の細胞であり、特に神経細胞、が挙げられる。本発明を実施する上で有用な不死化ヒト細胞株としては、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ９６０７）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２１３）、ＨｅＬａ細胞およびＨｅＬａ細胞の誘導体（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２、ＣＣＬ２．１、およびＣＣＬ２．２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２４０）、ＨＴ−１０８０細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ１２１）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＴＩＢ１５２）、ＫＢ癌細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ１７）、Ｋ−５６２白血病細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２４３）、ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＢＴＨ２２）、ＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ登録番号１５８２）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１４３２）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ８６）、ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ１５５）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１５９３）、ＷＩ−３８ＶＡ１３亜系統２Ｒ４細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＬＬ７５．１）、ならびに２７８０ＡＤ卵巣癌細胞（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｌｉｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：５９２７−５９３２，１９８８）が挙げられる。二次ヒト線維芽細胞株（例えば、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ７５）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ１７１））もまた、使用され得る。
【００３５】
適切な非哺乳動物宿主細胞としては、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母（「ＸＬＯ」）細胞、および酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）である。
【００３６】
上記宿主細胞の形質転換は、例えば、感染工程（ウイルスベクターを用いる）、トランスフェクション工程（プラスミドベクターを用いる）、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、およびリポフェクションの使用が挙げられる、適切な方法により得る。真核宿主細胞形質転換のための、方法および材料は当該分野で公知である。
【００３７】
形質転換された宿主細胞により生産されたニューブラスチンポリペプチドは、上記細胞または上記細胞培養培地から、標準的なタンパク質精製技術を使用して、単離され得る。再フォールディング工程は必要に応じて使用され得る。
【００３８】
ニューブラスチンポリペプチドは、標準的な、方法および材料を用いて修飾され得る。このような方法の１つは、部位特異的変異誘発であり、この方法において、１つまたはそれ以上のヌクレオチドは、ニューブラスチンポリペプチドの、予定した１つまたはそれ以上のアミノ酸を置換する目的で、変更される。適切な部位特異的変異誘発キットは市販されている（例えば、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．））。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態は、保存的アミノ酸置換を含むニューブラスチンポリペプチドを含む。保存的アミノ酸置換としては、以下のグループ内での挙げられる：バリン、アラニンおよびグリシン；ロイシン、バリンおよびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システインおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性の疎水性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００４０】
上記グリコシル化ニューブラスチンは、任意の生物活性形態で提供され得、その生物活性形態としては、プレプロタンパク質、プロタンパク質、成熟タンパク質、リン酸化タンパク質、非リン酸化タンパク質、短縮形態または他の任意の翻訳後修飾タンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号６として表される、１２２位にグリコシル化されたアスパラギン残基を保持するアミノ酸配列；あるいは配列番号１４として表される、９５位または例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータソフトウェアでアライメントした場合に、任意のニューブラスチンポリペプチドにおいて類似する位置にグリコシル化されたアスパラギン残基を有するアミノ酸配列を有する。
【００４１】
一般的に、哺乳動物細胞、またはタンパク質をグリコシル化可能な他のこのような細胞から単離された二量体は、９５位のアミノ酸がグリコシル化され得る。インビトロでタンパク質をグリコシル化する方法は当該分野において公知であり、そして所望される場合、ニューブラスチンポリペプチドまたはポリペプチド二量体をグリコシル化するために使用され得る。
【００４２】
本発明の実施は、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学、および免疫学の慣習的な技術の使用により実行され得る。このような技術は、一般的な参考文献に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ（Ｇｌｏｖｅｒ編），１９８５；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｇａｉｔ編），１９８４；米国特許第４，６８３，１９５（Ｍｕｌｌｉｓら）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｉｎｅｓら編），１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓら編），１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８４；Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．１５４および１５５（Ｗｕら編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒら編），１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｒｎｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒら編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７を参照のこと。
【００４３】
（ニューブラスチンポリペプチドのポリマー結合）
ニューブラスチンポリペプチドに結合体化するポリマーは水溶性である。好ましくは、上記ポリマーは薬学的組成物における使用に適したものである。適切な水溶性ポリマーの例としては、ＰＥＧ、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたは無作為的なコポリマーのどちらかである）、ならびにデキストランＰＥＧまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ＰＥＧ、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン酸化物／エチレン酸化物コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００４４】
１ポリマー鎖あたりの平均分子量は、二量体あたりに結合体化したポリマーの、望ましい総分子量の平均（例えば、二量体あたり１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、１５ｋＤａ〜４５ｋＤａ、または２０ｋＤａ〜４０ｋＤａ）に従って選択される。ＰＥＧ調製物において、いくつかの分子量は、定められた分子量より重いものといくぶん軽いものがある。従って、分子量は代表的に「平均分子量」として記載される。種々の結合体化方法は当該分野において公知である。例えば、ＥＰ ０ ４０１３８４（ＰＥＧとＧ−ＣＳＦとのカップリング）；Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５，１９９２（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化）を参照のこと。
【００４５】
ＰＥＧ化は任意の適切なＰＥＧ化により実施され得る。種々のＰＥＧ化化学反応は、当該分野において公知である。例えば、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，３（２）：４−１０，１９９２；ＥＰ ０ １５４ ３１６；ＥＰ ０ ４０１ ３８４；およびＰＥＧ化に関連する、本明細書中で引用されたその他の刊行物を参照のこと。上記ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または他の適切な反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。
【００４６】
アシル化によるＰＥＧ化は概して、ＰＥＧの活性エステル誘導体の反応工程を含む。公知の反応性ＰＥＧ分子またはその後見い出された反応性ＰＥＧ分子は、上記ＰＥＧ化を実施するために使用され得る。好ましい活性化ＰＥＧエステルはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とエステル化したＰＥＧである。本明細書中で使用される場合、「アシル化」とは以下の型の、上記治療的タンパク質と水溶性ポリマー（例えばＰＥＧ）との間の結合様式が挙げられるが、これらに限定されない：アミド、カルバメート、ウレタンなど。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４を参照のこと。反応条件は、ＰＥＧ化の分野において公知の反応条件またはその後に開発された反応条件の任意のものから選択され得るが、修飾されるべきニューブラスチンタンパク質またはポリペプチドを不活性化する条件（例えば、温度、溶媒、およびｐＨ）は避けるべきである。
【００４７】
一般的に、アシル化によるＰＥＧ化は、結果としてポリＰＥＧ化ポリペプチドを生じる。しかしながら、ニューブラスチンの場合、しかしながら、リジン残基が存在しない。従って、アシル化によるＰＥＧ化は、排他的にアミノ末端がＰＥＧ化されたポリペプチドを得るために用いられ得る。ＰＥＧ化ポリペプチドは慣習的な技術（例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび電気泳動）により、反応混合物および未反応のポリペプチドから分離され得る。
【００４８】
アルキル化によるＰＥＧ化は、概して、還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体とニューブラスチンまたは二量体との反応工程を含む。一般的に、アルキル化によるＰＥＧ化は、結果としてポリＰＥＧ化ポリペプチドをもたらし得、そしてアミノ末端のＰＥＧ化を有利に行うために、反応条件が操作され得る。しかし、ニューブラスチンはリジン残基を含んでいないので、そのような操作を行う必要はない。上記ＰＥＧ基は、好ましくは、−ＣＨ２−ＮＨ−基を介して（すなわち、「アルキル」結合を介して）タンパク質と結合される。
【００４９】
上記アシル化アプローチおよび上記アルキル化アプローチの両方において使用される上記ポリマー分子は、上述したような水溶性ポリマーの中から選択され得る。上記選択されたポリマーは、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド、好ましくは本発明の方法において提供されるような重合度が制御できるような反応基）を有するように修飾されるべきである。模範的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水安定性のＰＥＧプロピオンアルデヒド、あるいはこれらのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシの誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）である。このポリマーは、分枝状または非分枝状であり得る。上記アシル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。本発明の還元的アルキル化のために、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。本発明の目的のために、ＰＥＧは、他のタンパク質の誘導体化の分野において公知であるＰＥＧの任意の形態（モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−ＰＥＧおよびアリールオキシ−ＰＥＧを含む）であり得る。
【００５０】
（処方物）
本発明の二量体を含む組成物は、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。例えば、上記組成物は、賦形剤および／または助剤（これは二量体を、作用部位に送達するように設計された調製物にプロセシングすることを促進する）を含み得る。非経口的投与に適切な処方物としては、水溶性形態である活性化合物の水溶液（例えば、水溶性の塩）が挙げられる。さらに、適切な油性注射用懸濁液のような活性化合物の懸濁液が投与され得る。適切な親油性溶媒または親油性ビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射用懸濁液は、この懸濁液の粘度を増す物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストラン）を含み得る。必要に応じて、上記懸濁液はまた、安定剤も含み得る。リポソームはまた、本発明の分子を細胞または間隙に送達するために、カプセル化するのに使用され得る。例示的な薬学的に受容可能なキャリアは、生理学的に適合可能な溶媒、分散媒体、コーティング、抗生物質および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。いくつかの実施形態において、上記組成物は等張化剤（例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコールまたは塩化ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態において、上記組成物は薬学的に受容可能な物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存料あるいは緩衝剤）を含む。
【００５１】
本発明の組成物は、種々の形態であり得、その形態としては、例えば、液体（例えば、注射用溶液および注入用溶液）、分散物、懸濁物、半固形投与形態および固形投与形態が挙げられる。好ましい形態は、投与方法および治療的適用に依存する。
【００５２】
上記組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソーム、または高い薬物濃度に対して適切な他の規則的な構造として処方され得る。滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、必要量の上記活性成分を、以上に列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせとともに組み込むこと、必要な場合にはその後フィルター滅菌することにより、調製され得る。概して、分散物は、上記活性成分を、基本的な分散媒体、および以上に列挙した成分に由来する必要とされる他の成分を含む、滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製され得る。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、上記活性成分と、先にフィルター滅菌された溶液由来の望ましい任意のさらなる成分との粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。上記溶液の適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングにより、分散物の場合に必要とされる粒子径の維持により、および界面活性剤によって、維持され得る。注射用組成物の吸収長期は、吸収を遅らせる物質を組成物に含めることにより達成され得る。そのような物質の例は、モノステアリン酸塩およびゼラチンである。
【００５３】
上記活性成分は、徐放処方物または徐放デバイスとして処方され得る。そのような処方物およびデバイスの例としては、移植物、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。生分解性の、生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸）が、使用され得る。そのような処方物およびデバイスを調製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
【００５４】
注射用蓄積処方物は、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド）の中に、マイクロカプセル化した薬物のマトリックスを形成することにより、作製され得る。ポリマーに対する薬物の比、および使用されるポリマーの性質によって、薬物放出速度が制御され得る。その他の模範的な生分解性ポリマーは、ポリオルソエステルおよびポリ無水物である。蓄積注射用処方物はまた、上記薬物をリポソームまたはマイクロエマルジョンに包摂することによっても調製され得る。
【００５５】
補助活性化合物が、この処方物に組み込まれ得る。例えば、本発明に従う二量体は、鎮痛薬と共に同時投与され得る。
【００５６】
投薬レジメンは、最適な望ましい応答を提供するために調節され得る。例えば、１回のボーラスが投与されてもよく、数回に分割された投薬で長期に渡り投与されてもよく、またはこの投与量は、その治療状況の緊急性により示され、比例的に、減量または増量され得る。投与の容易さおよび投薬の均一性のための投薬単位形態において、非経口組成物を処方することは有利である。おおむね、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９８０）参照のこと。
【００５７】
本発明の二量体に加えて、液体投薬形態は、不活性な成分（例えば、水、エチルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル）を含み得る。
【００５８】
（処置方法）
本発明は、感覚ニューロン、網膜神経節細胞、脊髄神経節のニューロン、および以下に挙げる組織のニューロンの処置に有用である。：膝神経節、錐体神経節および下神経節；内耳脳神経の前庭聴覚複合体；三叉神経節の上下顎葉の腹外側極；および三叉神経中脳路核。
【００５９】
本発明の組成物および方法は、感覚ニューロン、自律ニューロンまたはその両方を処置するために使用され得る。侵害受容性ニューロンおよび機械受容性ニューロン（例えば、Ａ−δ線維ニューロン、Ｃ−線維ニューロンおよびＡ−β線維ニューロン）が処置され得る。さらに、自律ニューロン系の交感ニューロンおよび副交感ニューロンが処置され得る。
【００６０】
（神経障害性疼痛）
神経障害性疼痛の処置に用いた場合、本発明の二量体は、単独で、または鎮痛薬との組み合わせで、投与され得る。鎮痛薬の例としては、オピオイド、抗不整脈薬、局所鎮痛薬、局所麻酔薬、鎮痙薬、抗鬱薬、コルチコステロイドまたは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。好ましい鎮痛薬は、ガバペンチン（（１−アミノメチル）シクロヘキサン酢酸）；およびプレガバリン（Ｓ−（＋）−４−アミノ−３−（２−メチルプロピル）酪酸）である。
【００６１】
本発明の二量体は、末梢神経障害が関連した疼痛の処置に使用され得る。神経障害本発明により処置され得る末梢神経障害としては、外傷により誘導される神経障害、脳への身体的損傷、脊髄への身体的損傷、および脳卒中が挙げられる。
【００６２】
本発明はまた、化学療法誘導性神経障害の処置、その他の薬物誘導性神経障害の処置、病原体誘導性神経障害の処置、毒素誘導性神経障害の処置、ビタミン欠乏誘導性神経障害の処置；特発性神経障害の処置；および糖尿病性神経障害の処置も提供する。本発明はまた、単神経障害、単多発性神経炎、ならびに多発性神経障害（軸索神経障害および脱髄性神経障害を含む）を処置するためにも、使用され得る。
【００６３】
化学療法誘導性神経障害の例としては、化学療法剤(例えば、タキソール、タキソテレ（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、シスプラチン、ノコダゾール、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビンブラスチン）への曝露により引き起こされる神経障害が挙げられる。他の薬物誘導性神経障害の例としては、ｄｄＩ、ＤＤＣ、ｄ４Ｔ、ホスカネット、ダプソン、メトロニダゾールおよびイソニアジドにより引き起こされる、神経障害が挙げられる。毒素誘導性神経障害の例としては、アルコール症、ビタミンＢ６中毒、ヘキサカーボン（ｈｅｘａｃａｒｂｏｎ）中毒、アミオダロン、クロラムフェニコール、ジスルフィラム、イソニアジド、金、リチウム、メトロニダゾール、ミソニダゾール、およびニトロフラントインにより誘導される神経障害が挙げられる。ウイルス誘導性神経障害の例としては、（疱疹後神経痛に至り得る）帯状疱疹、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびパピローマウイルス（ＨＰＶ）により引き起こされる神経障害が挙げられる。ビタミン欠乏誘導性神経障害の例としては、ビタミンＢ１２不足、ビタミンＢ６不足、およびビタミンＥ不足により引き起こされる神経障害が挙げられる。本発明により処置され得るその他の型の神経障害としては、炎症誘導性神経損傷、神経変性、遺伝性神経障害（例えば、フリートライヒ運動失調、家族性アミロイド多発性神経障害、タンジアー病、ファブリー病）、代謝障害（例えば、腎不全および甲状腺機能低下症）、感染およびウィルス性神経障害（例えば、らい病、ライム病に関連する神経障害性疼痛）が挙げられる。自己免疫性神経障害としては、ギヤン−バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、重要性未定の単一クローン性高ガンマグロブリン血症および多発性神経障害、三叉神経痛およびエントラップメント症候群（例えば、手根管症候群）、ならびにその他の神経障害性疼痛症候群（外傷後神経痛、幻想肢痛、多発性硬化症性疼痛、複雑な局所性疼痛症候群（例えば、反射性交感神経性ジストロフィー、カウザルギー）、新形成関連疼痛、脈管炎／脈管障害性ニューロパシー、および坐骨神経痛を含む）が挙げられる。
【００６４】
（触覚性異痛症）
触覚性異痛症は、通常では無害の皮膚刺激（例えば、接触）によって疼痛が誘発される状態をいう。触覚性異痛症は、薬学的有効量の本発明における二量体を、被験体に投与することによって処置され得る。上記二量体は、単独または有効量の鎮痛薬との組み合わせで投与され得る。
【００６５】
本発明の二量体は、治療薬（例えば、抗癌剤または抗ウィルス剤）と共に同時投与され得る。抗癌剤の例としては、タキソール、タキソテレ、シスプラチン、ニコダゾール、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビンブラスチンが挙げられる。抗ウィルス剤の例としては、ｄｄＩ、ＤＤＣ、ｄ４Ｔ、ホスカネット、ダプソン、メトロニダゾールおよびイソニアジドが挙げられる。
【００６６】
（痛覚感受性損失の軽減）
本発明の組成物は、糖尿病性神経障害の患者における痛覚感受性損失（例えば、温熱性の痛覚感受性損失）の軽減に使用され得る。処置は、予防的または治療的であり得る。
【００６７】
予防的処置では、本発明の二量体は、痛覚感受性損失の発症の危険性がある患者（例えば、神経障害の初期段階である患者）に投与される。
【００６８】
治療的処置では、本発明の二量体は、神経障害の結果として痛覚感受性損失を経験した患者（例えば、神経障害後期）に投与される。
【００６９】
（ウィルス関連神経障害）
本発明の組成物および本発明の方法は、ウィルス感染または細菌感染が関連した神経障害の予防的処置に使用され得る。予防的処置は、ウィルス感染の確定後および神経障害性疼痛の発症前に示される。処置の間、本発明の二量体は、神経障害性疼痛（例えば、らい病、ライム病が関連する神経障害性疼痛、またはウィルスによって引き起こされる神経障害性疼痛）の出現を阻害するために投与される。神経障害性疼痛を引き起こし得るウィルスとしては、帯状疱疹ウィルス（疱疹後に神経痛を導き得る）；ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）；およびヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）が挙げられる。
【００７０】
ウィルス感染の急性症状としては、しばしば、発疹の出現が挙げられる。その他の症状としては、例えば、身体の罹患領域における持続的な疼痛が挙げられる。これは、帯状疱疹感染（帯状疱疹）の通常の合併症である。疱疹後神経痛は、一月以上にわたって持続し得、そして発疹様症状のいずれもが消失した数ヶ月後に現れ得る。
【００７１】
本発明はまた、ウィルス感染または細菌感染が関連した神経障害性疼痛の治療的処置も提供する。治療的処置において、本発明の二量体は感染が関連した神経障害性疼痛を経験している患者に投与される。
【００７２】
（有痛性の糖尿病性神経障害）
本発明の組成物および本発明の方法は、有痛性の糖尿病性神経障害の予防的処置に使用され得る。糖尿病性神経障害の予防的処置は、糖尿病または糖尿病関連症状の最初の診断後および神経障害性疼痛の発症前に開始する。有痛性の糖尿病性神経障害の予防的処置はまた、被験体が糖尿病または糖尿病関連症状の発症の危険性があることを決定する際に始まる。本発明の二量体は、神経障害性疼痛の出現を予防するためおよび／または既に現れている神経障害性疼痛の感受性を軽減するために投与される。
【００７３】
本発明はまた、糖尿病が関連した神経障害性疼痛の治療的処置も提供する。治療的処置では、本発明の二量体は、糖尿病が関連した神経障害性疼痛を経験している患者に投与される。
【００７４】
（投与量および投与経路）
好ましくは、本発明の二量体からなる処方物は、１用量当たり０．１μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇ被験体体重の投与量で投与される。好ましくは、この投与量が１用量当たり１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ被験体体重である。さらに好ましくは、この投与量が１用量当たり１μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ被験体体重（例えば、１用量当たり３μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇ被験体体重）である。本発明の上記処方物の治療的に有効な量は、過度な実験を伴わずに当業者が確認可能な投与計画により、その必要性がある、被験体に投与され得る。
【００７５】
本発明の二量体の投与は、全身的または局所的であり得る。本発明の二量体は任意の適切な送達系（例えば、静脈内送達、筋肉内送達、肺内送達、皮下送達、および腹腔内送達であり、最も好ましくは、筋肉内送達、静脈内送達、または皮下送達である）により投与され得る。上記二量体はまた、くも膜下腔内にも投与され得る。
【００７６】
本発明はさらに、以下の非限定的実施例においてさらに例示される。
【実施例】
【００７７】
（実施例１：哺乳動物細胞における発現）
成熟ヒトニューブラスチン（ｈＮＢＮ）は本来、プレプロタンパク質として発現する。このポリペプチドは、タンパク質を分泌経路に導くためのシグナルペプチド配列、成熟化の際に開裂および破棄されるプロドメイン、および成熟タンパク質を含む。この成熟１１３アミノ酸タンパク質は、１つのグリコシル化部位および７つのシステイン残基を含む。この７つのシステイン残基は、ジスルフィド架橋した、グリコシル化ホモ二量体を形成する、３つの分子内ジスルフィド結合と１つの分子間ジスルフィド結合に関与する。
【００７８】
（プラスミドｐＪＣ０７０．１４の構築）ヒトニューブラスチンｃＤＮＡをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させるために、ヒトニューブラスチンのプレプロ形態をコードするｃＤＮＡフラグメントを、哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＡＧ３４７に挿入して、プラスミドｐＪＣ０７０．１４を作製した。このプラスミドｐＥＡＧ３４７は、タンデムＳＶ４０初期プロモーターおよびアデノウイルス主要後期プロモーター（プラスミドｐＡＤ２β由来；Ｎｏｒｔｏｎら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２８１）、固有のＮｏｔ−Ｉクローニング部位、続くＳＶ４０後期転写終結およびポリＡシグナル（プラスミドｐＣＭＶβ由来；ＭａｃＧｒｅｇｏｒら，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：２３６５）を含む。さらに、ｐＥＡＧ３４７は、ｐＵＣ１９由来プラスミド骨格ならびにＭＴＸ選択およびトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における増幅のためのｐＳＶ２ｄｈｆｒ由来ｄｈｆｒを含む。
【００７９】
プラスミドｐＪＣ０７０．１４を、２工程で作製した。第一に、ヒトニューブラスチンのプレプロ形態をコードするフラグメントを、プラスミドｐＵｂｉｌＺ−ＮＢＮから、オリゴヌクレオチドＫＤ２−８２４ ５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡ ＴＧＧＡＡＣＴＴＧＧ ＡＣＴＴＧＧＡＧＧ３’（配列番号２２），ＫＤ２−８２５ ５’ＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴ ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴ ＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣ ＡＧＣＣＧＣＡＧＧ３’（配列番号２３）およびＰＦＵポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して単離した。プラスミドｐＪＣ０６９を作製するために、このフラグメントを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）のＳｒｆ−１部位にクローン化した。第二工程において、部分Ｎｏｔ−１消化をプラスミドｐＪＣ０６９において実行して、６８５ｂｐフラグメント（ニューブラスチン遺伝子を含む）を作製し、これを、プラスミドｐＥＡＧ３４７のＮｏｔ−１部位にクローン化して、プラスミドｐＪＣ０７０．１４を作製した。プラスミドｐＪＣ０７０．１４におけるニューブラスチン遺伝子の転写を、アデノウイルス主要後期プロモーターによって制御した。
【００８０】
（ヒトニューブラスチンを発現するＣＨＯ細胞株）最初に、２００μｇのｐＪＣ０７０．１４を、Ｍｌｕ−１を用いる消化によって直鎖化した。その後、２００μｇの超音波処理をしたサケ精子ＤＮＡを加えた。このＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、そしてエタノール沈殿した。上記直鎖化ＤＮＡを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０５）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース（ＨＥＢＳ）中に再懸濁し、そしてエレクトロポレーション（２８０Ｖおよび９６０μＦ）によって〜４Ｅ７ ＣＨＯ ｄｕｋｘ Ｂ１（ｄｈｆｒ−）細胞（ｐ２３）に導入した。エレクトロポレーションに続いて、細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補充されたα＋改変イーグル培地（ＭＥＭ）中の培養物に２日間、戻した。その後、細胞をトリプシン処理し、そして１０％透析ＦＢＳを補充した、α−ＭＥＭ（リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを欠く）中に１００ｍｍディッシュ中で、５日間、再プレートした（１００，０００細胞／プレート）。続いて、この細胞を、１００，０００細胞／１００ｍｍプレートの密度にて分け、そして２００ｎＭメトトレキサート中で選択した。耐性コロニーを選択し、そして６ウェルプレートまでスケールアップし；各クローン由来の馴化培地を、以下に記載されるニューブラスチンについての特異的アッセイを使用してスクリーニングした。
【００８１】
最も高いレベルのニューブラスチンを発現する１２個のクローンを、Ｔ１６２フラスコにスケールアップし、および続いて、再アッセイした。これらのＣＨＯ細胞株は、２５〜５０ｎｇ／ｍｌ／日の範囲でニューブラスチンを産生した。４個の最もよくニューブラスチンを発現する細胞株を１２００ｎＭメトトレキサート中で増幅し、そして攪拌フラスコ中での懸濁培養に供した。その結果得られたクローンは、高密度攪拌培養液中に約２μｇ／ｍＬを産生した。
【００８２】
（ニューブラスチンに対する三重複合体アッセイ）ニューブラスチンの存在を、ＣＨＯ細胞株の培地上清において、三重複合体アッセイの改変形態を用いて、評価した。上記アッセイは実質的にＳａｎｉｃｏｌａら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：６２３８に記載されたものと同様であった。
【００８３】
（ＣＨＯ細胞におけるＮＢＮ１０４の発現）成熟ｈＮＢＮ１０４アミノ酸形態は、以下の手順によりチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させた。合成ｈＮＢＮ遺伝子を、ＣＨＯ細胞において、タンパク質の翻訳に最も一般的に利用されるコドンを使用して作製した。固有の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入した。ラットアルブミン（ｒＡｌｂ）シグナルペプチドに対するコドン、すなわち、
【００８４】
【化１】
およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に対する配列、すなわち、
【００８５】
【化２】
を、ｈＮＢＮに独立して融合し、融合遺伝子（シグナルペプチドは普通の字体であり、そしてＮＢＮ配列はイタリック体であり；上記ｈＧＨシグナルペプチドはイントロンを含む）を作製した。それぞれの融合遺伝子を構成的なプロモーターの転写制御下に配置し、そしてＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。安定な形質転換体を単離した。
【００８６】
上記細胞株を、分泌されたｈＮＢＮの発現について分析した。還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット分析からのデータは、培地中に分泌されたｈＮＢＮに対応するタンパク質バンドの存在を実証した。馴化培地のさらなる分析は、直接（抗体に制御されたアッセイ）機能的アッセイおよび間接（細胞に基づいた）機能的アッセイの両方で、滴定可能な成分の存在を実証した。
【００８７】
この結論とは、機能的ｈＮＢＮが、ＣＨＯ細胞内で、プロドメインの非存在下で、および異種のシグナルペプチド配列と共に発現し得るということである。
【００８８】
（実施例２：ＣＨＯ細胞におけるラットニューブラスチンの発現）
（プラスミドｐＣＷＥＸ０１７．１の構築）ラットニューブラスチンに対する遺伝子を、共にラットニューブラスチンをコードする２つのフラグメント一緒に連結して作製した。ニューブラスチンのラットプレプロ形態の最初の１５６アミノ酸をコードするＤＮＡフラグメントからなるプラスミドｐＪＣ１０２を、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ ｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＴＯＰＯクローニング部位に挿入した。このフラグメントをＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｔ ラット肝臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、オリゴヌクレオチド ＡＰ２ ５’ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ３’（配列番号２６）およびＫＤ３−１７１ ５’ＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＴＡＴＣ３’（配列番号２７）を用いたポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。上記プレプロドメイン、およびニューブラスチンの成熟１１３アミノ酸形態の最初の２９アミノ酸を含むフラグメントを、最初に、プラスミドｐＪＣ１０２から、オリゴヌクレオチドＫＤ３−２１４ ５’ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＴＴＧＧＡＧＡ３’（配列番号２８）およびＫＤ３−２４７ ５’ＡＧＴＴＣＧＴＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＣＧ３’（配列番号２９）を用いたポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。ニューブラスチンの成熟１１３アミノ酸形態のアミノ酸３０〜１１３をコードする第２のフラグメントを、ｐＣＷＥＸ０１５から、オリゴヌクレオチドＫＤ３−２４６ ５’ＣＧＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＴＣＧＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＣＴＣＴＴＣＣＧＡＣＧＡＡＣＴ３’（配列番号３０）およびＫＤ３−２１９ ５’ＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＧ３’（配列番号３１）を用いて増幅した。上記プラスミドｐＣＷＥＸ０１５を、同系由来のＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１フラグメントを発現プラスミドｐＭＪＢ１３４の相補的部位に挿入して、作製した。この結果として生じるＤＮＡフラグメントを１：１の比率で混合し、オリゴヌクレオチドＫＤ３−２１４およびＫＤ３−２１９を用いた第二のポリメラーゼ連鎖反応に供し、ラットニューブラスチンの全長プレプロ形態を作製した。この結果として生じるＤＮＡフラグメントを、ｐＣＷＥＸ０１６を作成するために、プラスミドｐＣＲＩＩ 平滑部位のＴＯＰＯクローニング部位にクローニングした。全長プレプロニューブラチンを含むＮｏｔ−１フラグメントを単離し、そしてｐＥＡＧ３４７のＮｏｔ−１部位にクローニングして、ｐＣＷＥＸ０１７．１を作製した。
【００８９】
（ラットニューブラスチン合成遺伝子の配列）
【００９０】
【化３】
（ラットニューブラスチンを発現するＣＨＯ細胞株）２００μｇのプラスミドＣＷＥＸ０１７．１を、制限エンドヌクレアーゼＭｌｕ−１を用いる消化によって直鎖化した。消化後、２００μｇの超音波処理をしたサケ精子ＤＮＡを添加し、そしてこの混合物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、そしてエタノール沈殿した。上記直鎖化ＤＮＡを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０５）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース（ＨＥＢＳ）中に再懸濁させ、そしてエレクトロポレーション（２８０Ｖおよび９６０μＦ）によって〜４Ｅ７ ＣＨＯ ＤＧ４４ （ｄｈｆｒ−）細胞（ｐ８）に導入した。エレクトロポレーションに続いて、細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補充されたα＋改変イーグル培地（ＭＥＭ）中で２日間培養するために戻した。その後、細胞をトリプシン処理し、そして１０％透析ＦＢＳを補充した、α−ＭＥＭ（リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを欠く）中の１００ｍｍディッシュ中に再プレートした（１００，０００細胞／プレート）。６日間培養後、培地を取り替え、そしてこの細胞を２００ｎＭメトトレキサート中で選択した。耐性コロニーを選択し、そして６ウェルプレートまでスケールアップし；各クローン由来の馴化培地を、上に参照されるニューブラスチンに対する三重複合体アッセイを使用してスクリーニングした。最も高いレベルのニューブラスチンを発現する５個のクローンを、Ｔ１６２フラスコにスケールアップし、そして、その後、再アッセイした。これらのＣＨＯ細胞株は、５００ｎｇ／ｍｌ／日の範囲でニューブラスチンを産生した。この最も高く発現する株を、続いて懸濁培養に適合させ、そしてこの株は、高密度攪拌培養液中に約２μｇ／ｍｌでニューブラスチンを発現する。
【００９１】
（ＰＥＧ化されたＣＨＯ由来ラットニューブラスチン）
ラットＮＢＮ（クローン３３ｓ）を発現するＣＨＯ細胞１００リットルを、２００ｎＭメトトレキサートを含むＢＣＭ１６培地中で、３７℃にて１０日間、増殖させた。上記培養物をフィルター濾過し、そして１０倍に濃縮した。Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）を最終濃度１０ｍＭまで添加し、そして上記培地を１２０ｍＬ ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、４℃で終夜ロードした。このカラムを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄し、そして結合したタンパク質をカラムから、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中のＮａＣｌ勾配（０．１Ｍ〜１Ｍ）を用いて溶出した。試料を、吸光度を２８０ｎｍで、総タンパク質についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥで、そして機能性ＮＢＮについては、ＲｅｔＬ３三重複合体ＥＬＩＳＡを使用して分析した。ＮＢＮ活性は、このタンパク質ピークの立ち上がりに見られた。上記ＳＰカラムからのピークＮＢＮ含有画分をプールし、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（７．５）で５倍に希釈して、２２ｍＬ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードした。このカラムを１１０ｍＬの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭで洗浄し、そしてＮＢＮを１０ｍＭ Ｈｅｈｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。ＮＢＮ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定し、そしてプールした。このプールした画分を１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）で１５０ｍＭの最終塩濃度に希釈した。このタンパク質を２０ｍＬ ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードし、そしてＮａＣｌ勾配で、再び溶出した。ＮＢＮ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールし、フィルター濾過し、そして−７０℃で保存した。タンパク質の状態を、２８０ｎｍの吸光度で、１ｍｇ／ｍＬ溶液に対して０．５の吸光係数を使用して測定した。この精製したＣＨＯ ＮＢＮは、非還元状況下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、見かけ上の質量が３６ｋＤａの単一で広範なバンドとして移動し、そして還元状況下では、見かけ上の質量が１８ｋＤａのバンドとして移動した。Ｎ末端配列の分析は、生成物のＮ末端が、脱１−４付加物、脱１−７付加物および脱１−９付加物を産生する選択的部位における開裂により異なることを、明らかにした。
【００９２】
上記精製したＮＢＮにおいて、Ｎ末端の異種性を排除するため、このタンパク質を、ＮＢＮに対して１：１００（ｗ／ｗ）比のトリプシンを用いて、ｐＨ８．５にて、３７℃で２時間処理し、そして１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌでＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲル濾過カラムにて精製した。ピークＮＢＮ含有画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プール（０．９ｍｇ／ｍＬ最終濃度）し、０．２μｍフィルターを通してフィルター濾過し、アリコートし、そして後の研究のために−７０℃で保存した。トリプシン処理後のＮＢＮのＮ末端配列決定は、このタンパク質がＡＴＤＡＲＧＣ配列で始まる脱１−９、１０４アミノ酸形態に変換されたことを明らかにした。還元され、そして脱グリコシル化された生成物の質量分析データは、１１１０４Ｄａの質量を示し、予想したＮＢＮの脱１−９形態の質量と厳密に一致した。
【００９３】
上記精製された脱１−９ＮＢＮを室温で解凍した。Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）を１Ｍストックから、５０ｍＭ加え、そして２０Ｋ ＮＨＳ−ＳＰＡ ＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｒｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．）を最終濃度８ｍｇＰＥＧ／ｍＬで加えた。反応物中の上記ＮＢＮの最終濃度は０．７ｍｇ／ｍＬであった。このサンプルを室温で３時間インキュベートし、そして５０容量の１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌに対し、４℃で一晩透析した。このジＰＥＧ化形態を、他の反応生成物および遊離のＰＥＧから室温にて、樹脂の充填濃度が３ｍｇＮＢＮ／ｍＬでＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。このカラムを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌの４．５カラム体積分率で洗浄し、その後、上記ジＰＥＧ化生成物を１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌの４．５カラム体積分率で溶出した。その後、モノＰＥＧ化ＮＢＮを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、３５０ｍＭ ＮａＣｌの４．５カラム体積分率で、そして未反応のＮＢＮを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、８００ｍＭ ＮａＣｌの４．５カラム体積分率で溶出した。ＮＢＮを含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価し、そして９０％を超えるジＰＥＧ化生成物を含む画分をプールし、ＰＢＳに対して一晩透析し、そして０．２μｍフィルターによってフィルター濾過した。内毒素レベルを測定し、１ＥＵ／ｍｇ未満であると決定した。上記物質を、機能についてＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡおよび神経生存アッセイで試験し、そして十分な活性があると判定した。この最終物質をアリコートし、そして次の試験のために−７０℃で保存した。初期の研究において、上記モノＰＥＧ化生成物はまた、インビボ試験のために収集した。しかし、ジＰＥＧ化物質のより良い特性から、その後、全てにおいてジＰＥＧ化物質を選択した。ジＰＥＧ化物質の収量を増加するため、本発明者らは、さらに、モノＰＥＧ化ＮＢＮを新鮮なＰＥＧで処理し、そして再び、この反応混合物からジＰＥＧ化生成物を精製した。
【００９４】
（実施例３：ＰＥＧ化およびグリコシル化されたニューブラスチンの薬物動態）
ＰＥＧ化され、グリコシル化されたニューブラスチンの薬物動態特性を、ラットおよびマウスにおいて調べた。グリコシル化され、切断されたラットニューブラスチン（Ｎ末端９アミノ酸の切断；ＮＢＮ１０４）の、２つの２０，０００ＤａのＰＥＧ部分によるＮ末端のＰＥＧ化（２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４）は、ニューブラスチンの半減期およびバイオアベイラビリティの有意な改善を生じた。ＣＤマウスに対し、１．５ｍｇ／ｋｇ皮下投与した後では、２４時間で、ＰＥＧ化され、グリコシル化されたニューブラスチンに関して９７ｎｇ／ｍｌの血清レベルを検出した。対照的に、マウスに対し、２つの２００００ＤａのＰＥＧ（２×２０ＫＤａ ＰＥＧ）でＰＥＧ化された非グリコシル化ニューブラスチンの１．５ｍｇ／ｋｇ皮下投与後、ニューブラスチン血清レベルは２４時間で、３９ｎｇ／ｍｌであった。マウスに対する、非修飾グリコシル化ＮＢＮ１０４の１．５ｍｇ／ｋｇ皮下投与２４時間後では、ニューブラスチンは検出されず、これはニューブラスチンの血清レベルが５ｎｇ／ｍｌ未満であることを示している。意外なことに、ＰＥＧ化され、グリコシル化されたニューブラスチンを用いて達成された血清レベルは、ＰＥＧ化された非グリコシル化ニューブラスチンを用いて達成された血清レベルよりも約２．５倍大きかった。
【００９５】
Ｎ末端がＰＥＧ化されたグリコシル化ニューブラスチンの血清レベルの上昇がまた、ラット研究において観察された。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに対し、２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４の１ｍｇ／ｋｇ皮下投与後、５０ｎｇ／ｍｌのＰＥＧ化ニューブラスチンのピーク血清レベルを４８時間後に検出した。非ＰＥＥＧ化ニューブラスチンの１ｍｇ／ｋｇ皮下投与後、４８時間後での血清レベルは、２ｎｇ／ｍｌ未満であった。これらのデータはグリコシル化ニューブラスチンのＮ末端ＰＥＧ化（２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４）は、結果としてＰＥＧ化されていないグリコシル化ニューブラスチンの投与後に達したピーク血清レベルより、少なくとも１９倍高い、ニューブラスチンのピーク血清レベルを生じることを示した。これらのデータは、Ｎ末端でのＰＥＧ化およびアミノ酸９５でのグリコシル化の組み合わせが、ニューブラスチンの薬物動態特性およびバイオアベイラビリティの相当な向上を生じることを、実証した。
【００９６】
（実施例４：神経障害性疼痛の動物モデルにおける、ＰＥＧ化されたグリコシル化ニューブラスチン）
触覚性異痛症および温熱性痛覚過敏におけるＰＥＧ化されたグリコシル化ニューブラスチンの逆転効果を、Ｃｈｕｎｇ Ｌ５／Ｌ６脊髄神経結紮（「ＳＮＬ」）モデルにおいて研究した。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット（２００〜２５０ｇ）を３つの群に分けた。全てのラットが脊髄神経結紮を受けた。第一の群のラット（ｎ＝６）に皮下注射によりビヒクルを投与した。第二および第三の群のラット（群当たりｎ＝６）には３μｇ／ｋｇおよび３０μｇ／ｋｇのＰＥＧ化された、グリコシル化ニューブラスチン（２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４）を皮下注射により投与し、ここで上記タンパク質は、ＣＨＯ由来であり、切断され（Ｎ末端９アミノ酸の切断；ＮＢＮ１０４）、および２０，０００Ｄａ ＰＥＧでそれぞれのＮ末端がＰＥＧ化されていた。ニューブラスチンは二量体として存在するので、それぞれの二量体は、２つの２０，０００Ｄａ ＰＥＧを含む。上記ビヒクルは、５ｍＭリン酸塩および１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．５）からなる。皮下注射を施術後（ＳＮＬ後）３日目、５日目、７日目、１０日目、１２日目および１４日目に投与した。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ行動試験およびＨａｒｇｒｅａｖｅ行動試験（Ｃｈａｐｌａｎら，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．５３：５５−６３；Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら，１９８８，Ｐａｉｎ ３２：７７−８８）を用いて，触覚応答および温熱応答をそれぞれモニタリングした。これらの疼痛応答を、ベースライン応答を確立するために脊髄神経結紮の前にモニタリングして、そして、その後、ＳＮＬ後３日目の薬物投与前、ならびにＳＮＬ後５日目、７日目、１０日目、１２日目および１４日目での薬物投与後、約１時間でモニタリングした。ビヒクル処置に対する薬物処置の統計的有意性を評価するために、２元分散分析配置法（２−ｗａｙ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ（２−ｗａｙ ＲＭ ＡＮＯＶＡ））をｐｏｓｔ−ｈｏｃ Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｎｅｕｍａｎ Ｋｅｕｌｓ（ＳＮＫ）テストに従って実施した。
【００９７】
上記結果を、平均±平均の標準誤差として図１および図２に要約した。両方の型の神経障害性疼痛行動（触覚性異痛症を図１に、そして温熱性痛覚過敏を図２に示す）は、予測通り、３日までに十分に進行した。３μｇ／ｋｇまたは３０μｇ／ｋｇ ２×２０ＫＤａ
ＰＥＧ ＮＢＮ１０４の皮下投与(図１および図２において下向きの矢印によって示される）は、脊髄神経結紮を伴うラットにおいて、実質的かつ統計学的に有意な、両方の型の神経障害性疼痛の逆転を導いた。脊髄神経結紮を伴うラットにおいて、温熱性感受性および触覚性異痛症に対する２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４の効果は、ＰＥＧ化されたグリコシル化ニューブラスチンの投与開始後、それぞれ４日目および７日目で初めて統計学的に有意になった。温熱性感受性および触覚性異痛症に対する２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４の効果は、ＰＥＧ化されたグリコシル化ニューブラスチンの投与開始後約７日でプラトーに達した。２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４の効果は、投与の間の投与間隔２日〜３日間の間隔の間において減少しなかった。実際に、ＰＥＧ化されたグリコシル化ニューブラスチンの投与の間における疼痛作用の実質的な正常化が５日目、７日目および１０日目に存在した。
【００９８】
これらの結果は、２×２０ＫＤａ ＰＥＧ ＮＢＮ１０４が、ＳＮＬモデルにおける触覚性異痛症の疼痛行動および温熱性痛覚過敏の疼痛行動に対する、ＰＥＧ化されておらず、グリコシル化されていないニューブラスチンの効力に対し、少なくとも３３３倍、効力が増加したことを実証した。
【００９９】
（その他の実施形態）
その他の実施形態は上記請求項に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−８４５６７（Ｐ２０１１−８４５６７Ａ）
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７１９９４（Ｐ２０１０−２７１９９４）
【出願日】平成２２年１２月６日（２０１０．１２．６）
【分割の表示】特願２００６−５１０１１２（Ｐ２００６−５１０１１２）の分割
【原出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月６日（２０１０．１２．６）
【分割の表示】特願２００６−５１０１１２（Ｐ２００６−５１０１１２）の分割
【原出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
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