マクロファージ転移阻害因子阻害剤を用いる、１型糖尿病処置
１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する方法が、提供される。本方法は、該哺乳類に、該哺乳類においてＭＩＦを阻害する物質を含む医薬組成物を投与することを含む。また、化合物が、１型糖尿病を予防するかもしくは処置するのに有用であるかどうか評価する方法が、提供される。本方法は、該化合物がマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を哺乳類において阻害するかどうか決定し、次いで、もし該化合物がＭＩＦを阻害すれば、該化合物が１型糖尿病の進展を阻害するかどうか決定することを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００４年３月２９日出願の米国仮出願第６０／５５７，１６９号の利益を請求する。
【０００２】
連邦基金研究開発に関する陳述
米国政府は、本発明において、支払い済みのライセンスを持ち、限られた環境において、本特許権者に、ＮＩＨによるＤＫ０６４２３３−０１により提供される合理的な項目に関して、他者にライセンスを与えるよう要求する権利を持つ。
【０００３】
（１）本発明分野
本発明は一般的に、糖尿病処置に関する。より具体的には、本発明は、マクロファージ転移阻害因子阻害剤の、１型糖尿病処置もしくは予防のための使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
（２）関連技術の記述
参照
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【０００５】
１型糖尿病（１型ＤＭ）は、多数の要因による症候であり、内因性インシュリンの欠乏により引き起こされ、自己反応性Ｔ細胞およびマクロファージにより媒介される、膵臓β細胞に対する免疫攻撃によるものと考えられる。この疾患は、およそ４，０００，０００人の北米の人々を患わせ、疫学データが、該疾患の発生率およびこれゆえ罹患率が、世界中で上昇していることで一致している（１）。更なる研究努力が大きく、疾患の病理の理解を拡大しており、幾つかの前炎症メディエーターに関する決定的な役割を解明してきている。しかしながら、有効な抗炎症治療薬は、１型ＤＭの臨床管理に関しては承認されていない。該疾患の幾つかの動物モデルが、糖尿病の病理に横たわる分子（レベルでの）現象の理解を促進してきた。罹患系統マウスに対する、多数回低用量ストレプトゾトシンが例えば、ヒト１型ＤＭの印の多くを有する糖尿病態を誘発させる。臨床および組織免疫学的な類似性は、膵島の、Ｔリンパ球およびマクロファージによる浸潤に関連した高血糖の進展も包含する（インシュリン炎、２、３）。原炎症サイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）−１β、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、およびＩＬ−１８を包含して、ストレプトゾトシン誘発糖尿病の進展において、重要な役割を演じる（４〜７）。しかしながら、組み換えＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、もしくはＴＮＦ−α、または、これらの活性の特異的阻害剤の投与が、疾患の進展および／または経過への複雑でしばしば矛盾する効果を持ち、これは使用される動物モデルおよび投与のタイミングに依っている（８〜１１）。
【０００６】
１型ＤＭの病因において免疫系により演じられる、鍵を握る病原的な役割が最近、多くの注意の焦点を、糖尿病前段階の個体において、もしくは、新たに診断された疾患を患っている患者において、β細胞崩壊を留めもしくは遅らせることを可能にするかも知れない免疫治療アプローチを同定することに当てている（１２）。マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）は、局所および全身での炎症における決定的なサイトカインであるが、糖尿病におけるその役割は、完全には探索されていない。ＭＩＦは多面的なサイトカインであり、免疫応答の間に、活性化Ｔ細胞、マクロファージ、および種々の非免疫細胞により産生される（１３、１４）。これは、宿主の防衛の決定的なメディエーターとして振る舞い、敗血症ショックならびに慢性炎症および自己免疫疾患における治療ターゲット（標的）として探索され続けている（１５〜１７）。上昇したＭＩＦ遺伝子発現が、自然に肥満しない糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおいて検出されているが、１型ＤＭの病因におけるその重要性は不明である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これゆえ、１型糖尿病における、サイトカイン、特にＭＩＦの精確な役割および相互作用へと分け入っていく更なる調査を求める必要性がある。
【０００８】
こうして、本発明者らは、マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）阻害剤が、１型糖尿病を軽減させることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これゆえ、ある幾つかの実施形態において、本発明は、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する方法に関する。本方法は、該哺乳類に、該哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含んでいる医薬組成物を投与することを含む。これらの実施形態において、該物質は、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである。
【００１０】
本発明は、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する他の方法にも関する。これらの方法も、該哺乳類に、該哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含んでいる医薬組成物を投与することを含む。これらの実施形態において、該物質は、以降の構造ＩもしくはＩＩを含んでいる有機分子である。
【００１１】
【化１】
【００１２】
本発明は加えて、化合物が、１型糖尿病を予防するかもしくは処置するのに有用であるかどうか評価する方法に関する。本方法は、（ａ）該化合物がマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を哺乳類において阻害するかどうか決定し、次いで、もし該化合物がＭＩＦを阻害すれば、（ｂ）該化合物が１型糖尿病の進展を阻害するかどうか決定することを含む。
【００１３】
更なる実施形態において、本発明は、（ａ）マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を該哺乳類において阻害する、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである物質を含んでいる医薬組成物、ならびに、（ｂ）該組成物を、該哺乳類に投与するための説明書を含んでいるキットに関する。これらの実施形態において、該哺乳類が１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている。
【００１４】
更なる実施形態において、本発明は、（ａ）マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を該哺乳類において阻害する、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである物質を含んでいる医薬組成物、ならびに、（ｂ）該組成物を、該哺乳類に投与するための説明書を含んでいる他のキットに関する。これらの実施形態において、該哺乳類が１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている。これらの実施形態の医薬組成物は、以降の構造ＩもしくはＩＩを含んでいる有機分子である。
【００１５】
【化２】
【００１６】
本発明は、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類の処置用医薬品の製造のための、マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を該哺乳類において阻害する物質の使用にも関し、ここで該物質が、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである。
【００１７】
加えて、本発明は、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類の処置用医薬品の製造のための、マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を該哺乳類において阻害する物質の使用に関する。これらの実施形態において、該物質は、以降の構造ＩもしくはＩＩを含んでいる有機分子である。
【００１８】
【化３】
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
略号
ＭＩＦ：マクロファージ転移阻害因子
ＩＳＯ−１：（Ｓ，Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソキサゾール酢酸メチルエステル
ｉＮＯＳ：誘発型酸化窒素（ＮＯ）合成酵素
ＳＴＺ：ストレプトゾトシン
ＭＬＤ−ＳＴＺ：多数回低用量ストレプトゾトシン
ＳＭＮＣ：脾臓単核細胞
ＰＣ：腹腔細胞
ＩＦＮ−γ：γ−インターフェロン
ＴＮＦ−α：腫瘍壊死因子−α
ＩＬ−１β：インターロイキン１β
【００２０】
本発明は、ＭＩＦが、１型糖尿病の病因における決定的な因子であるとの発見に基づいている。これゆえ、ＭＩＦ阻害は、１型糖尿病の進展を防ぐかもしくは軽減させる。実施例参照。
【００２１】
これゆえ、ある幾つかの実施形態において、本発明は、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する方法に関する。本方法は、該哺乳類に、該哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含んでいる医薬組成物を投与することを含む。これらの実施形態において、該物質は、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである。
【００２２】
これらの方法のうちのある幾つかにおいて、該物質は、ＭＩＦ活性を阻害する。このような物質の１タイプは、特異的にＭＩＦに結合する抗体結合部位、例えば、抗体、抗体のＦａｂ断片、もしくは抗体のＦ（ａｂ）２断片を含む。このような物質は、よく知られた方法により、産生され得る。限定しない方法は：
動物の、ＭＩＦでの免疫。次いで、抗ＭＩＦ抗体の、血清からの単離、もしくは、抗ＭＩＦモノクローナル抗体の、脾臓細胞のミエローマ細胞との融合により調製されたハイブリドーマからの産生。
ファージディスプレー
他の組み換え方法
を包含する。好ましくは、該モノクローナル抗体は、処置されるべき（動物）種に適合するよう選ばれ、もしくは、適応される。ヒトの処置に関しては、例えば、抗ＭＩＦ抗体（もしくはこれの抗原結合断片）は、ヒトの抗体もしくはヒト化された抗体とされる。このような抗原特異的なヒトのモノクローナル抗体もしくはヒト化されたモノクローナル抗体が、当業界においてよく知られた種々の方法により得られることがある。
【００２３】
これらの方法に有用なもう１つ別の、ＭＩＦ活性を阻害する物質は、特異的にＭＩＦに結合するアプタマーである。アプタマーは、１本鎖オリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド類似体であり、ＭＩＦのような特定の標的分子に結合する。これゆえ、アプタマーは、抗体に対するオリゴヌクレオチドとしての類似性を有する。しかしながら、アプタマーは、抗体よりも小さく、一般的に、５０〜１００ｎｔの範囲中にある。それらの結合は高度に、当該アプタマーオリゴヌクレオチドにより形成される２次構造に依存している。ＲＮＡおよび１本鎖ＤＮＡ（もしくは類似体）両方のアプタマーが、知られている。例えば、（米国特許第）５，７７３，５９８、５，４９６，９３８、５，５８０，７３７、５，６５４，１５１、５，７２６，０１７、５，７８６，４６２、５，５０３，９７８、６，０２８，１８６、６，１１０，９００、６，１２４，４４９、６，１２７，１１９、６，１４０，４９０、６，１４７，２０４、６，１６８，７７８、および６，１７１，７９５（号明細書）参照。アプタマーは、トランスフェクションされたベクターからも、発現され得る（Ｊｏｓｈｉら、２００２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６、６５４５）。
【００２４】
如何なる視覚的に特定の標的に結合するアプタマーも、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを表すＳＥＬＥＸと呼ばれる反復プロセスを使用しながら、選択され得る（Ｂｕｒｋｅら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４、６５０；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４６、８１８；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４、９５９９；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６９８８；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：５０５）。ＳＥＬＥＸの幾つかの変法が開発されており、該プロセスを向上させ、特定環境下でのそれの使用を可能にする。例えば、（米国特許第）５，４７２，８４１、５，５０３，９７８、５，５６７，５８８、５，５８２，９８１、５，６３７，４５９、５，６８３，８６７、５，７０５，３３７、５，７１２，３７５、および６，０８３，６９６（号明細書）参照。これゆえ、アプタマーの、如何なる特定のペプチドに対する産生も、ＭＩＦも包含して、過度な実験を必要としない。
【００２５】
これらの方法の他の実施形態において、該物質は、ＭＩＦ発現を阻害する。好ましい例は、該哺乳類において、ＭＩＦｍＲＮＡ特異的な、アンチセンス核酸、リボザイム、および小阻害的核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）の形の阻害的オリゴヌクレオチドを包含する。これらの阻害的オリゴヌクレオチドの各々は、ＭＩＦｍＲＮＡ配列の知識を必要とする。ＭＩＦｍＲＮＡ配列は、多くの哺乳類種に関して、知られている。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ（配列番号）：１〜３参照、但し、ＭＩＦｃＤＮＡ配列はそれぞれ、ヒト、マウス、およびラットに関する。ＭＩＦｃＤＮＡ配列は、如何なる哺乳類に関しても、過度な実験なく求められ得、例えば、当該哺乳類のｃＤＮＡ調製品からの配列を増幅させること、既知の哺乳類ＭＩＦｃＤＮＡ配列からデザイン（設計）されたプライマーを使用することによる。
【００２６】
これらの実施形態のうちのある幾つかの態様において、本発明の阻害的オリゴヌクレオチドは、アンチセンス核酸もしくは模倣体である。アンチセンス核酸分子は、ｍＲＮＡの翻訳を、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションして蛋白への翻訳を防ぐことにより、直接ブロックするよう作用する。アンチセンスによるアプローチは、ＭＩＦｍＲＮＡ蛋白に相補的であるオリゴヌクレオチドのデザインを含んでいる。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、この相補的な保護的配列のｍＲＮＡの転写（産）物に結合して、翻訳を防ぐことになる。絶対的な（完全な）相補性が好ましいが、（必ずしも）必要とされない。
【００２７】
ＭＩＦｍＲＮＡ転写（産）物を触媒的に開裂させるようデザインされたリボザイム分子も、ＭＩＦｍＲＮＡの翻訳、これゆえ、ＭＩＦ蛋白の発現を防ぐのに使用され得る。例えば、ＰＣＴ（国際）公開（ＷＯ）９０／１１３６４、Ｓａｒｖｅｒら、１９９０参照。
【００２８】
リボザイムは酵素ＲＮＡ分子であり、ＲＮＡの特異的開裂を触媒できる。総説に関して、Ｒｏｓｓｉ、１９９４参照。リボザイムの作用メカニズム（機序）は、当該リボザイム分子の、相補的標的ＲＮＡに対する配列特異的ハイブリダイゼーションを含んでおり、核酸内部の分解開裂現象を伴う。リボザイム分子の組成物は、１種以上の、ＭＩＦｍＲＮＡに相補的な配列を包含しなくてはならず、ｍＲＮＡ開裂に応答性の、よく知られた触媒配列を包含しなければならない。この配列に関して、例えば、米国特許第５，０９３，２４６号明細書参照。
【００２９】
本発明に好ましいタイプのリボザイムは、ハンマーヘッドリボザイムである。これらの実施形態において、ハンマーヘッドリボザイムは、ＭＩＦｍＲＮＡを、当該ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域により書き取られる位置において開裂させる。ハンマーヘッドリボザイムの唯一の要件は、ｍＲＮＡが、２つの塩基配列５’−ＵＧ−３’を持つことであり、これは、ＭＩＦ遺伝子中に何回もある（配列番号：１〜３参照）。ハンマーヘッドリボザイムの構築および産生は、当業界においてよく知られ、より充分に、Ｍｙｅｒｓ、１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（特に、図４、８３３ページ参照）、ならびに、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、１９８８に記載される。
【００３０】
本発明のリボザイムは、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａに天然にあり（ＩＶＳもしくはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られる）、Ｔｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈおよび共同実験者らにより更に記載されているもの（ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ、１９８６；Ｚａｕｇら、１９８４；ＺａｕｇおよびＣｅｃｈ、１９８６；Ｚａｕｇら、１９８６；ＷＯ８８／０４３００、Ｃｅｌｌ、４７：２０７〜２１６）のようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以降、＜＜Ｃｅｃｈタイプリボザイム＞＞）も包含する。Ｃｅｃｈタイプリボザイムは、８塩基対の活性部位を持ち、ＭＩＦのＲＮＡの開環が望まれる場合であれば、ＭＩＦｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする。本発明は、ＭＩＦｍＲＮＡ中に存在している８塩基対の配列を標的とするＣｅｃｈタイプリボザイムを含んでいる。
【００３１】
アンチセンスを用いたアプローチを用いた場合のように、これらリボザイムは修飾（例えば、安定性向上、標的化等）オリゴヌクレオチドから構成され得、ＭＩＦをＩｉｎ ｖｉｖｏにおいて作る細胞、好ましくは活性化Ｔ細胞および／またはマクロファージに与えられるべきである。好ましい投与方法は、リボザイムを＜＜コード化している＞＞ＤＮＡ構築物を、強い構成ｐｏｌＩＩＩもしくはｐｏｌＩＩプロモーター制御下に使用することを含んでおり、トランスフェクションされた細胞は、充分量の該リボザイムを産生するようになり、内因性ＭＩＦ遺伝子のメッセージを破壊し、翻訳を阻害する。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり、触媒であるので、より低い細胞内濃度が、効率のためには必要とされる。
【００３２】
あるいは、内因性標的遺伝子発現は、ＭＩＦ遺伝子制御領域（つまり、ＭＩＦ遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に対して相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化して、抑えられ得、３重螺旋構造を形成し、体内標的細胞におけるＭＩＦ遺伝子の転写を防ぐ。一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ、１９９１；Ｈｅｌｅｎｅら、１９９２；Ｍａｈｅｒ、１９９２参照。
【００３３】
３重螺旋形成において、転写阻害に使用される核酸分子は一本鎖であり、デオキシヌクレオチドから構成されるべきである。これらオリゴヌクレオチドの基礎的な組成は、３重螺旋形成をＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対則を介して促進させるようデザインされなければならず、一般的には、２重螺旋の一本鎖上に存在すべきプリンもしくはピリミジンのかなりの引き延ばしを必要とする。核酸は、ピリミジン主体でもよく、結果的に得られてくる３重螺旋の関連した３本鎖を横断するＴＡＴおよびＣＧＣ＋コドン（＝トリプレット）を与えることになる。このピリミジンの豊富な分子は、この鎖に対して平行な向きの２重螺旋の１本鎖のプリンの豊富な領域に対する塩基の相補性を与える。加えて、プリンが豊富、例えば、連なったＧ残基を含有する核酸分子が、選ばれてもよい。これらの分子は、ＧＣ対の豊富なＤＮＡ２重螺旋と共に、３重螺旋を形成することになり、そのプリン残基の殆どが、この標的の２重螺旋の１本鎖上に位置され、結果的に、該３重螺旋中の３本鎖を横断するＣＧＣトリプレットを与える。幾つかのこのようなＧＣ豊富な領域が、ＭＩＦ遺伝子における標的化に使える（配列番号：１〜３）。
【００３４】
あるいは、３重螺旋形成目指して標的化され得る潜在的な配列は、いわゆる＜＜スイッチバック＞＞核酸分子を作り出して、増やされることがある。スイッチバック分子は、交互に５’−３’、３’−５’としていく様式で合成され、２重螺旋の第１の１本鎖次いでもう一方と塩基対となり、連なり得るプリンもしくはピリミジンが、２重螺旋の１本鎖上に存在している必要性を取り除いてくれる。
【００３５】
他の実施形態においては、該オリゴヌクレオチドが小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得、当業界において、２本鎖ＲＮＡとして知られ、その標的ｍＲＮＡ（ここでは、ＭＩＦ）に相補的であり、細胞性因子と相互作用して該標的配列に結合し、次いで分解される。ｓｉＲＮＡ配列は、如何なる領域のＭＩＦｍＲＮＡにも相補的であり得る。ｓｉＲＮＡは好ましくは２１〜２３ｎｔ長であるが、より長い配列は、その長さ（２１〜２３ｎｔ）に加工（プロセシング）されることになる。文献は、Ｃａｐｌｅｎら、２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１；ＪａｒｖｉｓおよびＦｏｒｄ、２００２；ならびにＳｕｓｓｍａｎおよびＰｅｉｒｃｅ、２００２も包含する。
【００３６】
本発明の、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、３重螺旋、ならびにｓｉＲＮＡ分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成に関して当業界において知られる如何なる方法によっても調製されてよく、上記のとおりである。これらは例えば、固相ホスホラミデート化学合成のような、当業界においてよく知られる、オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的合成する手法も包含する。あるいは、ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでの、そのアンチセンスＲＮＡ分子をコード化しているＤＮＡ配列の転写により産生されてもよい。このようなＤＮＡ配列は、広く種々のベクター中に取り込まれてもよく、これらは、Ｔ７もしくはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取り込む。もう１つ別の代わりの場合、アンチセンスｃＤＮＡ構築物が、アンチセンスＲＮＡを、使用されるプロモーターに拠り構造的もしくは誘発的に合成し、細胞株中に、もしくは、哺乳類の標的細胞中に、既知の遺伝子療法により安定に導入され得る。
【００３７】
本明細書において使用される場合、用語＜＜オリゴヌクレオチド＞＞とは、オリゴマーもしくはポリマーのリボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはこれらの模倣体を言う。この用語は、天然起源の核酸塩基、糖、および、ヌクレオシド間共有結合（骨格）から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに、同様に機能する非天然起源の部分を持っているオリゴヌクレオチドも包含する。このようなオリゴヌクレオチド模倣体はしばしば、元の形を凌駕して好ましく、例えば、増強された細胞への取り込み、核酸標的への増強された親和性、および、ヌクレアーゼ存在下での増加した安定性のような望ましい特性のためである。
【００３８】
本発明において有用な好ましい模倣体の特定例は、修飾骨格もしくは非天然ヌクレオシド間結合を含有しているオリゴヌクレオチドも包含する。本明細書において定義されるとおり、修飾骨格を持っているオリゴヌクレオチドは、燐原子をその骨格中に保持するもの、および、燐原子をその骨格中に持たないものも包含する。
【００３９】
好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は例えば、ホスホロチオエート、不斉ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、および不斉ホスホネートを包含して、メチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを包含して、ホスホロアミデート、チオホスホロアミデート、チオアルキルホスホネート、チオアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を持っているセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、ならびに、１つ以上のヌクレオチド間結合が３’から３’へ、５’から５’へ、もしくは２’から２’結合へと逆転した極性を持っているものも包含する。逆転した極性を持っている好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド間結合において、単一の３’から３’への結合を含み、つまり、非塩基性であることがある単一逆転ヌクレオシド残基である（この核酸塩基は失われているか、もしくは、その代わりに水酸基を持つ）。種々の塩、混合塩、および遊離酸の形も、包含される。
【００４０】
上の燐含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書、米国特許第４，４６９，８６３号明細書、米国特許第４，４７６，３０１号明細書、米国特許第５，０２３，２４３号明細書、米国特許第５，１７７，１９６号明細書、米国特許第５，１８８，８９７号明細書、米国特許第５，２６４，４２３号明細書、米国特許第５，２７６，０１９号明細書、米国特許第５，２７８，３０２号明細書、米国特許第５，２８６，７１７号明細書、米国特許第５，３２１，１３１号明細書、米国特許第５，３９９，６７６号明細書、米国特許第５，４０５，９３９号明細書、米国特許第５，４５３，４９６号明細書、米国特許第５，４５５，２３３号明細書、米国特許第５，４６６，６７７号明細書、米国特許第５，４７６，９２５号明細書、米国特許第５，５１９，１２６号明細書、米国特許第５，５３６，８２１号明細書、米国特許第５，５４１，３０６号明細書、米国特許第５，５５０，１１１号明細書、米国特許第５，５６３，２５３号明細書、米国特許第５，５７１，７９９号明細書、米国特許第５，５８７，３６１号明細書、米国特許第５，１９４，５９９号明細書、米国特許第５，５６５，５５５号明細書、米国特許第５，５２７，８９９号明細書、米国特許第５，７２１，２１８号明細書、米国特許第５，６７２，６９７号明細書、および米国特許第５，６２５，０５０号明細書も包含するが、これらに限られず、これらのうちの特定のものが、本願と共通の著者であり、その各々が、本明細書において援用される。
【００４１】
燐原子をその中に包含しない好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子混合のアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または、１種以上のヘテロ原子短鎖もしくはヘテロ環状ヌクレオシド間結合により形成される骨格を持つ。これらは、モルホリノ結合（一部、ヌクレオシドの糖部分から形成）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格を持っているもの、ならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の混合した構成部分を持っている他のものも包含する。
【００４２】
上のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，０３４，５０６号明細書、米国特許第５，１６６，３１５号明細書、米国特許第５，１８５，４４４号明細書、米国特許第５，２１４，１３４号明細書、米国特許第５，２１６，１４１号明細書、米国特許第５，２３５，０３３号明細書、米国特許第５，２６４，５６２号明細書、米国特許第５，２６４，５６４号明細書、米国特許第５，４０５，９３８号明細書、米国特許第５，４３４，２５７号明細書、米国特許第５，４６６，６７７号明細書、米国特許第５，４７０，９６７号明細書、米国特許第５，４８９，６７７号明細書、米国特許第５，５４１，３０７号明細書、米国特許第５，５６１，２２５号明細書、米国特許第５，５９６，０８６号明細書、米国特許第５，６０２，２４０号明細書、米国特許第５，６１０，２８９号明細書、米国特許第５，６０２，２４０号明細書、米国特許第５，６０８，０４６号明細書、米国特許第５，６１０，２８９号明細書、米国特許第５，６１８，７０４号明細書、米国特許第５，６２３，０７０号明細書、米国特許第５，６６３，３１２号明細書、米国特許第５，６３３，３６０号明細書、米国特許第５，６７７，４３７号明細書、米国特許第５，７９２，６０８号明細書、米国特許第５，６４６，２６９号明細書、および米国特許第５，６７７，４３９号明細書も包含するが、これらに限られず、これらのうちの特定のものが、本願と共通の著者であり、その各々が、本明細書において援用される。
【００４３】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体においては、その糖およびそのヌクレオシド間結合両方、つまり、当該ヌクレオチド単位の骨格が、新規な基で置き換えられる。その塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために、維持される。１種のこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を持つと示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と言われる。ＰＮＡ化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖骨格が、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。その核酸塩基は維持され、直接もしくは間接に、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書、米国特許第５，７１４，３３１号明細書、および米国特許第５，７１９，２６２号明細書も包含するが、これらに限られない。ＰＮＡ化合物の更なる教示が、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７〜１５００に見出され得る。
【００４４】
修飾オリゴヌクレオチドは、１種以上の置換糖部分も含有してよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、その２’位において、以降のうちの１種を含む。
ＯＨ；Ｆ；Ｏ−，Ｓ−，もしくはＮ−アルキル；Ｏ−，Ｓ−，もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−，Ｓ−，もしくはＮ−アルキニル；または、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル
式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは無置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、あるいは、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、式中、ｎおよびｍが、１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、その２’位において、以降のうちの１種を含む。
Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、アリールアルキル、Ｏ−アルキルアリール、Ｏ−アリールアルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物速度論特性を向上させるための基、または、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させるための基、ならびに、同様な特性を持っている他の置換基
好ましい修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）もしくは２’−ＭＯＥとしても知られる、Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６〜５０４）を包含し、つまり、アルコキシアルコキシ基である。更に好ましい修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、つまりＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基であり、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られ、本明細書における以下の実施例に記載されるようであり、ならびに、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当業界において、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルもしくは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、つまり２’−ＯＣＨ２ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ２）２基であり、本明細書における以下の実施例にも記載されるものも包含する。
【００４５】
更に好ましい修飾は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）も包含し、ここではその２’−水酸基が、その糖の環の３’および４’炭素原子に結合され、これにより、２環性の糖部分を形成している。該結合は好ましくはメチレン（ＣＨ２）ｎ基であり、その２’酸素原子とその３’もしくは４’炭素原子とを架橋しており、式中、ｎは１もしくは２である。ＬＮＡおよびこの調製物が、ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６において記載される。
【００４６】
他の好ましい修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を包含する。この２’−における修飾は、アラビノ位（上向き）もしくはリボ位（下向き）でもよい。好ましい２’−アラビノ位での修飾は、２’−Ｆである。同様な修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特にその３’末ヌクレオチドもしくは２’−５’結合オリゴヌクレオチド上の糖の３’位、および、５’末ヌクレオチドの５’位においてなされてもよい。オリゴヌクレオチドは、シクロブチル部分のような糖模倣体を、そのフラノース５炭糖の代わりに持ってもよい。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第４，９８１，９５７号明細書、米国特許第５，１１８，８００号明細書、米国特許第５，３１９，０８０号明細書、米国特許第５，３５９，０４４号明細書、米国特許第５，３９３，８７８号明細書、米国特許第５，４４６，１３７号明細書、米国特許第５，４６６，７８６号明細書、米国特許第５，５１４，７８５号明細書、米国特許第５，５１９，１３４号明細書、米国特許第５，５６７，８１１号明細書、米国特許第５，５７６，４２７号明細書、米国特許第５，５９１，７２２号明細書、米国特許第５，５９７，９０９号明細書、米国特許第５，６１０，３００号明細書、米国特許第５，６２７，０５３号明細書、米国特許第５，６３９，８７３号明細書、米国特許第５，６４６，２６５号明細書、米国特許第５，６５８，８７３号明細書、米国特許第５，６７０，６３３号明細書、米国特許第５，７９２，７４７号明細書、および米国特許第５，７００，９２０号明細書も包含するが、これらに限られず、これらのうちの特定のものが、本願と共通の著者であり、その各々が、本明細書において、その全体を援用される。
【００４７】
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（しばしば当業界において、単に＜＜塩基＞＞と言われる）の修飾もしくは置換も包含してよい。本明細書において使用される場合、＜＜無修飾＞＞もしくは＜＜天然＞＞核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびに、ピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）も包含する。修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘発体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘発体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘発体、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（擬ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのような他の合成および天然核酸塩基も包含する。更なる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジンのような３環性ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン、カルバゾールシチジン、およびピリドインドールシチジンのようなＧ−クランプも包含する。修飾核酸塩基は、プリンもしくはピリミジン塩基が、他のヘテロ環、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンで置き換えられているものも包含してよい。更なる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書において開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０版において開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３により開示されるもの、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ版、１９９３により開示されるものも包含する。これらの核酸塩基のうちの特定のものが特に、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を上昇させるのに有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを包含して、Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンを包含する。５−メチルシトシンの置換が、核酸２重螺旋の安定性を０．６〜１．２℃上昇させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．、およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．著、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３、ｐｐ．２７６〜２７８）、本願において好ましい塩基置換であり、尚より具体的には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合である。
【００４８】
上記のうちの特定の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許は、上記米国特許第３，６８７，８０８号明細書、ならびに、米国特許第４，８４５，２０５号明細書、米国特許第５，１３０，３０２号明細書、米国特許第５，１３４，０６６号明細書、米国特許第５，１７５，２７３号明細書、米国特許第５，３６７，０６６号明細書、米国特許第５，４３２，２７２号明細書、米国特許第５，４５７，１８７号明細書、米国特許第５，４５９，２５５号明細書、米国特許第５，４８４，９０８号明細書、米国特許第５，５０２，１７７号明細書、米国特許第５，５２５，７１１号明細書、米国特許第５，５５２，５４０号明細書、米国特許第５，５８７，４６９号明細書、米国特許第５，５９４，１２１号明細書、米国特許第５，５９６，０９１号明細書、米国特許第５，６１４，６１７号明細書、米国特許第５，６４５，９８５号明細書、米国特許第５，８３０，６５３号明細書、米国特許第５，７６３，５８８号明細書、米国特許第６，００５，０９６号明細書、米国特許第５，６８１，９４１号明細書、および米国特許第５，７５０，６９２号明細書も包含するが、これらに限られず、本願と共通の著者であり、やはり本明細書において援用される。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドのもう１つ別の修飾は、該オリゴヌクレオチドに化学的に、該オリゴヌクレオチド活性、細胞での分布、もしくは細胞への取り込みを促進させる１つ以上の部分もしくは共役部分を結合させることを含んでいる。本発明の化合物は、１級もしくは２級水酸基のような官能基に共有結合した共役基も包含し得る。本発明の共役基は、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物動態特性を促進させる基、ならびに、オリゴマーの薬物速度論特性を促進させる基も包含する。典型的な共役基は、コレステロール、脂質、燐脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料を包含する。薬物動態特性を促進させる基は、本発明の文脈においては、オリゴマーの取り込みを向上させ、分解に対するオリゴマーの耐性を促進させ、および／または、ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強める基を包含する。薬物速度論特性を促進させる基は、本発明の文脈においては、オリゴマーの取り込み、分布、代謝、もしくは排泄を向上させる基を包含する。代表的な共役基が、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６において開示される。共役部分は、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３〜６５５６）、胆汁酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９４、４、１０５３〜１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０、３０６〜３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９３、３、２７６５〜２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２、２０、５３３〜５３８）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９１、１０、１１１１〜１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９、３２７〜３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３、７５、４９〜５４）、燐脂質、例えば、ジヘキサデシルラセミ体グリセロールもしくは１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシルラセミ体グリセロ−３Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１〜３６５４；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０、１８、３７７７〜３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４、９６９〜９７３）、アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１〜３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４、２２９〜２３７）、または、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７、９２３〜９３７）のような脂質部分も包含するが、これらに限られない。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性な薬剤物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルザルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナミン酸、葉酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツール酸（バルビツレート）、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、もしくは抗生物質にも、共役されてよい。
【００５０】
このような共役オリゴヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第４，８２８，９７９号明細書、米国特許第４，９４８，８８２号明細書、米国特許第５，２１８，１０５号明細書、米国特許第５，５２５，４６５号明細書、米国特許第５，５４１，３１３号明細書、米国特許第５，５４５，７３０号明細書、米国特許第５，５５２，５３８号明細書、米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書、米国特許第５，５９１，５８４号明細書、米国特許第５，１０９，１２４号明細書、米国特許第５，１１８，８０２号明細書、米国特許第５，１３８，０４５号明細書、米国特許第５，４１４，０７７号明細書、米国特許第５，４８６，６０３号明細書、米国特許第５，５１２，４３９号明細書、米国特許第５，５７８，７１８号明細書、米国特許第５，６０８，０４６号明細書、米国特許第４，５８７，０４４号明細書、米国特許第４，６０５，７３５号明細書、米国特許第４，６６７，０２５号明細書、米国特許第４，７６２，７７９号明細書、米国特許第４，７８９，７３７号明細書、米国特許第４，８２４，９４１号明細書、米国特許第４，８３５，２６３号明細書、米国特許第４，８７６，３３５号明細書、米国特許第４，９０４，５８２号明細書、米国特許第４，９５８，０１３号明細書、米国特許第５，０８２，８３０号明細書、米国特許第５，１１２，９６３号明細書、米国特許第５，２１４，１３６号明細書、米国特許第５，０８２，８３０号明細書、米国特許第５，１１２，９６３号明細書、米国特許第５，２１４，１３６号明細書、米国特許第５，２４５，０２２号明細書、米国特許第５，２５４，４６９号明細書、米国特許第５，２５８，５０６号明細書、米国特許第５，２６２，５３６号明細書、米国特許第５，２７２，２５０号明細書、米国特許第５，２９２，８７３号明細書、米国特許第５，３１７，０９８号明細書、米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書、米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書、米国特許第５，５１０，４７５号明細書、米国特許第５，５１２，６６７号明細書、米国特許第５，５１４，７８５号明細書、米国特許第５，５６５，５５２号明細書、米国特許第５，５６７，８１０号明細書、米国特許第５，５７４，１４２号明細書、米国特許第５，５８５，４８１号明細書、米国特許第５，５８７，３７１号明細書、米国特許第５，５９５，７２６号明細書、米国特許第５，５９７，６９６号明細書、米国特許第５，５９９，９２３号明細書、米国特許第５，５９９，９２８号明細書、および米国特許第５，６８８，９４１号明細書も包含するが、これらに限られない。
【００５１】
与えられる化合物における全ての位置が一様に修飾される必要はなく、実際、前述した修飾の１種より多くが、単一化合物において、もしくは、オリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドにおいてさえ、取り込まれてよい。本発明は、キメラ化合物である阻害的オリゴヌクレオチド化合物をも包含する。＜＜キメラ＞＞阻害的オリゴヌクレオチド化合物もしくは＜＜キメラ＞＞は、本発明の文脈においては、２カ所以上の化学的に区別できる領域を含有する阻害的オリゴヌクレオチドであり、各々が少なくとも１つのモノマー単位からできあがっており、つまり、オリゴヌクレオチド化合物の場合におけるヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも１領域を含有し、ここでは該オリゴヌクレオチドが修飾され、該オリゴヌクレオチドに関して、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性を増加、細胞への取り込みを増加、および／または、その標的核酸に関する結合親和性を増加させる。該オリゴヌクレオチドの追加領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡもしくはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂できる酵素の基質として働いてもよい。例として、ＲＮａｓｅＨは細胞性エンドヌクレアーゼであり、ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ鎖を開裂させる。ＲＮａｓｅＨの活性化はこれゆえ結果的に、その標的ＲＮＡの開裂に至り、これにより大きく、遺伝子発現のオリゴヌクレオチドによる阻害効率を上昇させる。引き続き、同一標的領域にハイブリダイゼーションしているホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドに比肩される結果がしばしば、より短いオリゴヌクレオチドを用いて得られ、これはキメラオリゴヌクレオチドが使用される場合である。ＲＮＡ標的の開裂は通常どおり、ゲル電気泳動、もし必要ならば、当業界において知られる関連した核酸ハイブリダイゼーション手法により検出され得る。
【００５２】
本発明のキメラ阻害的オリゴヌクレオチド化合物は、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／または、上記のようなオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成されればよい。このような化合物は、当業界において、ハイブリッドもしくはギャップマーとも言われてきた。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，０１３，８３０号明細書、米国特許第５，１４９，７９７号明細書、米国特許第５，２２０，００７号明細書、米国特許第５，２５６，７７５号明細書、米国特許第５，３６６，８７８号明細書、米国特許第５，４０３，７１１号明細書、米国特許第５，４９１，１３３号明細書、米国特許第５，５６５，３５０号明細書、米国特許第５，６２３，０６５号明細書、米国特許第５，６５２，３５５号明細書、米国特許第５，６５２，３５６号明細書、および米国特許第５，７００，９２２号明細書も包含するが、これらに限られない。
【００５３】
本発明の方法に有用な阻害オリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて合成されてもよい。本発明の阻害オリゴヌクレオチドは、取り込み、分布、および／または吸収を支援するために、他の分子、分子構造、もしくは化合物、例えば、リポゾーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所、もしくは他の製剤と追加混合され、カプセル化され、共役され、もしくは、他の様式で関連付けられてもよい。このような取り込み、分布、および／または吸収支援製剤の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，１０８，９２１号明細書、米国特許第５，３５４，８４４号明細書、米国特許第５，４１６，０１６号明細書、米国特許第５，４５９，１２７号明細書、米国特許第５，５２１，２９１号明細書、米国特許第５，５４３，１５８号明細書、米国特許第５，５４７，９３２号明細書、米国特許第５，５８３，０２０号明細書、米国特許第５，５９１，７２１号明細書、米国特許第４，４２６，３３０号明細書、米国特許第４，５３４，８９９号明細書、米国特許第５，０１３，５５６号明細書、米国特許第５，１０８，９２１号明細書、米国特許第５，２１３，８０４号明細書、米国特許第５，２２７，１７０号明細書、米国特許第５，２６４，２２１号明細書、米国特許第５，３５６，６３３号明細書、米国特許第５，３９５，６１９号明細書、米国特許第５，４１６，０１６号明細書、米国特許第５，４１７，９７８号明細書、米国特許第５，４６２，８５４号明細書、米国特許第５，４６９，８５４号明細書、米国特許第５，５１２，２９５号明細書、米国特許第５，５２７，５２８号明細書、米国特許第５，５３４，２５９号明細書、米国特許第５，５４３，１５２号明細書、米国特許第５，５５６，９４８号明細書、米国特許第５，５８０，５７５号明細書、および米国特許第５，５９５，７５６号明細書も包含するが、これらに限られず、これらの各々が、本明細書において援用される。
【００５４】
用語＜＜プロドラッグ＞＞は、非活性な形で調製される治療薬を指し示し、体内もしくはその細胞内で活性な形（つまり薬剤）に、内因性酵素もしくは他の化学物質および／または条件の作用により変換される。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ版は、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）燐酸］誘発体（ホスフェート）として調製され、１９９３年１２月９日公開されたＧｏｓｓｅｌｉｎらに対するＷＯ９３／２４５１０において、あるいは、Ｉｍｂａｃｈらに対するＷＯ９４／２６７６４および米国特許第５，７７０，７１３号明細書において開示されている方法による。
【００５５】
本オリゴヌクレオチドは、ハプテン、蛍光分子、もしくは放射性部分のような、非ヌクレオチド部分をも含み得、例えば、細胞に入ってしまったオリゴヌクレオチド量を検出もしくは定量するのに有用である。
【００５６】
好ましい実施形態においては、前記哺乳類が、糖尿病、障害性グルコース不寛容、ストレス性高血糖、代謝症候群（メタボリック・シンドローム）、および／またはインシュリン耐性を患っているかもしくは患うリスクに晒されている。
【００５７】
これらの方法は、如何なる哺乳類を用いても使用され得る。好ましくは、該哺乳類は齧歯類（例えば、ストレプトゾトシン注射マウス。認められている１型糖尿病動物モデル）。他の好ましい実施形態においては、該哺乳類はヒトである。
【００５８】
本発明は、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する方法にも関する。これらの方法は、該哺乳類に、該哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含んでいる医薬組成物を投与することを含む。これらの実施形態においては、該物質が、以降の構造ＩもしくはＩＩを含んでいる有機分子である。
【００５９】
【化４】
【００６０】
好ましくは、該有機分子が構造ＩＩを含み、式中：
【００６１】
【化５】
である。
【００６２】
上記組成物のいずれもが、過度な実験なく、ヒトを包含して哺乳類に対する投与のために、その特定の適用にふさわしいように製剤され得る。加えて、該組成物の適切な用量が、過度な実験なく、標準用量応答プロトコールを使用して求められ得る。
【００６３】
従って、経口、舌、舌下、口腔、および口腔内投与用にデザインされた該組成物は、過度な実験なく、当業界においてよく知られた手段により、例えば不活性稀釈剤を用いてもしくは食用担体を用いて調製され得る。該組成物は、ゼラチンカプセル中に閉じ込められるかもしくはタブレット（錠剤）中に圧縮されてもよい。経口治療投与目的では、本発明の医薬組成物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁、シロップ、ウェハウス、チューイングガム、および同様なものの形で使用されてもよい。
【００６４】
錠剤、ピル、カプセル、トローチ、および同様なものは、バインダー、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、および香料をも含有してよい。バインダーのある幾つかの例は、微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンも包含する。賦形剤の例は、スターチ（澱粉）もしくはラクトースも包含する。崩壊剤のある幾つかの例は、アルギン酸、コーンスターチ、および同様なものも包含する。潤滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カリウムも包含する。潤滑剤のある１例は、コロイド状二酸化硅素である。甘味料のある幾つかの例は、スクロース、サッカリン、および同様なものも包含する。香料の例は、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、および同様なものも包含する。これらの種々の組成物を調製していくに当たって使用される材料は、医薬的に純粋であり、使用量では無毒であるべきである。
【００６５】
本発明に有用な組成物は容易に、例えば、静脈内、筋内、蜘蛛膜内、もしくは皮下注射によるように、非経口投与され得る。非経口投与は、本発明の組成物を、溶液もしくは懸濁中に取り込んでいくことにより、達成され得る。このような溶液もしくは懸濁は、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒のような無菌稀釈剤をも包含してよい。非経口製剤は例えば、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、例えば、アスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、ならびに、ＥＤＴＡのようなキレート剤をも包含してよい。酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、もしくは燐酸緩衝剤のような緩衝剤、ならびに、塩化ナトリウムもしくはデキストロースのような浸透圧調整剤も、加えられてよい。本非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチックでできたアンプル、使い捨てシリンジ、もしくは多数回用量のバイアル中に閉じ込められ得る。直腸投与は、本医薬組成物を、直腸もしくは大腸中に投与していくことを包含する。これは、坐薬もしくは浣腸を使用して達成され得る。坐薬製剤は容易に、当業界において知られている方法により、調製され得る。例えば、坐薬製剤は、グリセリンを約１２０℃まで熱していき、該グリセリンに本組成物を溶解させていき、ここで、精製水が加えられてもよく、その後、熱せられた該グリセリンを混合し、そして、この熱い混合物を坐薬の型中に注いでいくことにより、調製され得る。
【００６６】
経皮投与は、皮膚を通した本組成物の経皮吸収を包含する。経皮製剤は、パッチ（例のよく知られたニコチンパッチのような）、外用薬、クリーム、ゲル、軟膏、および同様なものを包含する。
【００６７】
本発明は、前記哺乳類に、治療有効量の本組成物を鼻から投与していくことも包含する。本明細書において使用される場合、鼻から投与もしくは経鼻投与は、本組成物を、患者の鼻道もしくは鼻腔の粘膜に投与していくことも包含する。本明細書において使用される場合、組成物の鼻からの投与用医薬組成物は、治療有効量の本組成物も包含し、例えば、鼻用スプレー、鼻用ドロップ、懸濁、ゲル、外用薬、クリーム、もしくは粉末として投与されるべく、よく知られている方法により調製される。本組成物の投与は、鼻栓もしくは鼻用スポンジを使用しても行われてよい。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態では、該哺乳類が、糖尿病、あるいは、糖尿病もしくは糖尿病リスクと関連した病状、例えば、グルコース不寛容障害、ストレス高血糖、メタボリック・シンドローム、および／またはインシュリン耐性を患っているかもしくは患うリスクに晒されている。
【００６９】
本発明は、如何なる哺乳類、例えば、糖尿病実験モデルとして一般的に使用される齧歯類（実施例参照）、もしくは、ヒトに関しても、利用され得る。
【００７０】
ＭＩＦ活性もしくは発現を阻害する化合物が、１型糖尿病処置に有用であるとの発見は、ＭＩＦ阻害活性を目指す化合物スクリーニングが、１型糖尿病を予防するかもしくは処置する能力を求めて化合物を同定するのに使用され得ることを指し示す。これゆえ、ある幾つかの実施形態では、本発明は、化合物が１型糖尿病を予防するかもしくは処置するのに有用であるかどうか評価していく方法に関する。本方法は、以降の２ステップ：
（ａ）化合物が、マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を、哺乳類において阻害するかどうか決定していき、次いでもし該化合物がＭＩＦを阻害すれば
（ｂ）該化合物が、１型糖尿病の進展を阻害するかどうか決定していくステップ
を含む。
【００７１】
これらの方法では、試験化合物のＭＩＦ活性を阻害する能力が、如何なる既知の手順によってでも求められ得る。非限定例は、米国特許出願公開２００３／０００８９０８および２００３／０１９５１９４において記載される方法も包含する。同様に、如何なる既知の手順も、１型糖尿病への化合物の効果を評価するために、利用され得る。好ましい実施形態では、１型糖尿病への化合物の効果は、多数回低用量ストレプトゾトシン投与を利用しての動物モデルにおける、もしくは、ＮＯＤマウスのような１型糖尿病の進展に遺伝子的に感受性の動物モデルにおける糖尿病の進展への該化合物の効果を評価して、求められる。このようなモデルにおける糖尿病の進展への試験化合物もしくは製剤の効果は、種々の便利な方法により、例えば、該哺乳類における循環グルコースもしくは脾臓リンパ球増殖をモニターしていくことにより、査定されることがある（実施例も参照）。
【００７２】
これらの方法は、如何なる特定タイプの化合物の評価にも限られない。これらの方法により評価され得る化合物の例は、酵素、もしくは、抗体結合部位を含む蛋白のような、オリゴペプチドもしくは蛋白；アンチセンス化合物、リボザイム、アプタマー、ｓｉＲＮＡのような干渉ＲＮＡのような核酸もしくは模倣体も包含する。好ましい実施形態では、該化合物が、１０００ダルトン未満の有機分子であり、構造Ｉもしくは構造ＩＩを持っており、前に定義されたとおりである。
【００７３】
更なる実施形態では、本発明はキットに関し、（ａ）前記哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含んでいる医薬組成物、ならびに、（ｂ）該組成物を該哺乳類に投与するための説明書を含んでおり、ここで該物質が、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである。これらの実施形態では、該哺乳類が、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている。
【００７４】
更なる実施形態では、本発明は他のキットに関し、（ａ）前記哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含んでいる医薬組成物、ならびに、（ｂ）該組成物を該哺乳類に投与するための説明書を含んでいる。これらの実施形態では、該哺乳類が、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている。これらの実施形態の本医薬組成物は、以降の構造ＩもしくはＩＩを含んでいる有機分子である。
【００７５】
【化６】
【００７６】
本発明は、前記哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質の、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類の処置用の医薬品の製造のための使用にも関し、ここで該物質が、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである。
【００７７】
加えて、本発明は、前記哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質の、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類の処置用の医薬品の製造のための使用に関する。これらの実施形態では、該物質が、以降の構造ＩもしくはＩＩを含んでいる有機分子である。
【００７８】
【化７】
【実施例】
【００７９】
以下の実施例が提示され、更に本発明の組成物および方法を例示するが、本発明を限定しているとして解釈されるべきでなく、添付の請求項において描写される。反対に指し示されなければ、本実施例における全ての部および％は重量基準であり、全ての測定値は約２３℃において得られた。
【００８０】
実施例１．マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）活性の中和が、実験自己免疫糖尿病を減弱させる
実施例の要約
原炎症サイトカイン、マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）は、軸となる役割を、幾つかの炎症および自己免疫疾患において演じる。ＭＩＦｍＲＮＡ発現は、非肥満糖尿病マウスにおいてアップレギュレーションされるが、尚僅かしか、１型糖尿病レギュレーターとしての潜在的なポテンシャルについて知られていない。ここで、我々は、ＭＩＦ蛋白が、多数回低用量ストレプトゾトシンによりマウスにおいて誘発された実験糖尿病の進展の間に、膵島細胞において顕著に上昇されることを示す。ＭＩＦに対する中和抗体、もしくは、薬理的ＭＩＦ阻害剤（Ｓ，Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソキサゾール酢酸メチルエステル（ＩＳＯ−１）のような例示的なＭＩＦ阻害剤を用いたＭＩＦ活性の減衰は顕著に、膵島における組織病理学的変化（病変）を抑え、高血糖の進展を抑え、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する本方法の一般的な有用性を示している。観察された有益な効果は、自己反応性リンパ球の増殖および接着の抑制、ｉＮＯＳ発現のダウンレギュレーション、ならびに、膵島および腹腔マクロファージによるＮＯおよびＴＮＦ−αの分泌に帰属され得るが、これらの機序の繋がりの知識は、本発明の教示には必須ではない。本研究は、１型糖尿病の病理におけるＭＩＦに関する決定的な役割を定義し、新たな治療戦略を同定し、自己免疫プロセスを多段階において減衰させる。
【００８１】
はじめに
ＭＩＦが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、および酸化窒素（ＮＯ）（１９）のような、１型糖尿病（ＤＭ）の病理に含まれている他の原炎症サイトカインおよび可溶性メディエーターの合成をも刺激するとの観察は、ＭＩＦ活性の阻害が、疾患の進展を調節するかも知れないとの可能性を喚起した。
【００８２】
はじめに
マクロファージおよびＴ細胞両方により仲介される免疫応答におけるＭＩＦの中心的な制御の役割が与えられれば、我々は、多数回低用量ストレプトゾトシン（ＭＬＤ−ＳＴＺ）処置されたマウスにおける糖尿病の進行の間のＭＩＦ発現、ならびに、ＭＩＦ活性の中和のこの疾患の進展への影響を研究してきた。これらは、ヒトでのよく認められた１型糖尿病モデルである。この目的では、抗ＭＩＦポリクローナル抗体が、（Ｓ，Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソキサゾール酢酸メチルエステル（ＩＳＯ−１）、ＭＩＦの薬理的阻害剤（２０）同様、ＳＴＺを用いた挑戦前に、予防処置としてマウスに与えられた。ＤＭの病理に関する種々の免疫学的パラメーターが求められ、自己反応性細胞増殖および接着ならびに原炎症メディエーター産生も包含していた。我々の知る限り、これが最初の試みであり、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＩＦの中和により、自己免疫糖尿病において干渉させる。
【００８３】
材料および方法
マウス
ＩｎｂｒｅｄＣＢＡ／Ｈマウスが、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｌｇｒａｄｅにある我々自体の飼育コロニーから得られた。ＩｎｂｒｅｄＣ５７Ｂ１／６マウスは元来、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｃａｌｃｏ、Ｉｔａｌｙ）から購入され、次いで、４世代までの間、兄弟姉妹間交配により飼育された。マウスは、標準的な実験室条件下におかれ、食物および水に自由にアクセスできた。該マウスの取り扱いおよび研究のプロトコールは、Ｌｏｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより（動物愛護の点から良いものと）認められた。
【００８４】
試薬
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Ｓ−０１３０）、スルファニラミド、ナフチレンジアミン二塩酸、および非罹患性ウサギＩｇＧが、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入された。抗マウスＭＩＦＩｇＧが、マウスＭＩＦに対して惹起されたウサギ血清から調製され、蛋白Ａ親和性クロマトグラフィーにより、製造元（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の説明書に従って精製された。（Ｓ，Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソキサゾール酢酸メチルエステル（ＩＳＯ−１）が、前に記載されたように（２０）合成された。
【００８５】
糖尿病の誘発およびｉｎ ｖｉｖｏでの処置
糖尿病が、成雄マウスにおいて誘発され、多数回の毒性を下回る用量のストレプトゾトシン（ＭＬＤ−ＳＴＺ、４０ｍｇ／体重ｋｇ／日、ｉ．ｐ．投与、５日間連続）を、記載のとおり（２１）投与された。抗ＭＩＦポリクローナル抗体のインパクト（効果）が、マウス（５〜１０匹／処置群）の、５ｍｇ／ｋｇの抗マウスＭＩＦウサギＩｇＧ抗体での、３、１、２、および５日の日のｉ．ｐ．投与により、最初のＳＴＺ用量に関して研究された。ＩＳＯ−１の効果は、当該薬剤のｉ．ｐ．投与により、用量１ｍｇ／マウス／日において、１４日間連続研究され、ＳＴＺの最初の注射３日前に開始された。コントロールの動物は、非免疫ＩｇＧもしくは稀釈ＩＳＯ−１（ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ）を与えられた。マウスは、グルコース測定器（Ｓｅｎｓｉｍａｃ、登録商標、Ｉｍａｃｏ、Ｌｕｄｅｒｓｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、血中グルコースレベルの週毎の測定により、糖尿病に関してモニターされた。臨床的な糖尿病は、非肥満の動物における高血糖（血中グルコース１１．８ｍモル／Ｌ）により定義された。
【００８６】
細胞のインキュベートおよび原炎症メディエーターの決定
定住個体の腹腔細胞（ＰＣ）、脾臓単球細胞（ＳＭＮＣ）、および膵島が、個々の、抗ＭＩＦＩｇＧ処置、ＩＳＯ−１処置、もしくはコントロールマウスから、ＳＴＺの最初の注射後１５日に、同様に、正常非処置動物から単離された。ＳＭＮＣ（５×１０６／ウェル）はＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により調製され、定住個体のＰＣ（２．５×１０６／ウェル）は冷ＰＢＳでの腹腔洗浄により収集され、もしくは、膵島（１５０〜２００膵島／ウェル）は記載されるとおり（２２）コラゲナーゼによる消化および密度勾配精製により調製され、２４ウェルＬｉｍｂｒｏ培養プレート中においてインキュベートされ、１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培養培地中においてであり、５％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を含有しており、細胞の上清が、４８時間後に収集された。培養上清における生物活性なＴＮＦ−αの濃度が求められ（以前に記載されたとおり、２２）、アクチノマイシンＤ処理フィブロサルコーマ細胞株Ｌ９２９を用いた細胞溶解バイオアッセイを使用した。ＮＯ産生の指標たる亜硝酸（塩）の蓄積が、細胞培養上清中において、Ｇｒｉｅｓｓ反応を使用して求められた。細胞内ＭＩＦ、ＩＦＮ−γ、ＭＨＣ（クラス）ＩＩ、もしくはｉＮＯＳの発現が、細胞主体の僅かに修飾されたＥＬＩＳＡプロトコール（２３）により求められた。脾臓ＭＮＣ（５×１０５／ウェル）もしくはＰＣ（２．５×１０５／ウェル）が、ポリ−Ｌ−リジンにより予備コーティングされた９６ウェルマイクロプレートに接着するようにされた。４％パラホルムアルデヒドでの固定化およびＰＢＳ中０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｔ／ＰＢＳ）での洗浄後、内因性過酸化酵素が、Ｔ／ＰＢＳ中１％Ｈ２Ｏ２を用いてクウェンチされ、反応が１時間、３７℃において、Ｔ／ＰＢＳ中１０％ＦＢＳを用いてブロックされた。引き続き、細胞が１時間、３７℃において、ウサギ抗マウスＭＩＦＩｇＧ、ラット抗マウスＩＦＮ−γ（Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）、マウス抗マウス／ラットＭＨＣ（クラス）ＩＩ（ＭＣＡ４６Ｒ、Ｓｅｒｏｔｅｃ）、もしくは、ウサギ抗マウスｉＮＯＳ（シグマ）を用いて、１％ＢＳＡ含有Ｔ／ＰＢＳ中においてインキュベートされた。洗浄後、これら細胞が１時間、対応している２次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ、ヤギ抗ラットＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ、もしくはヤギ抗マウスＩｇ（Ｆ（ａｂ’）２−特異的）−ＨＲＰ）と共にインキュベートされ、再び洗浄され、１５分間暗所室温において、０．４ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ（シグマ）、１１．８ｍｇ／ｍＬのＮａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、７．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸、および０．０１５％Ｈ２Ｏ２含有溶液５０μＬと共にインキュベートされた。該反応は、３ＮのＨＣｌを用いて停止され、その吸光度が、Ｔｉｔｅｒｔｅｋマイクロプレート読み取り機（Ｆｌｏｗ）において、４９２ｎｍにおいて測定された。
【００８７】
Ｅｘ ｖｉｖｏでのリンパ増殖応答および接着アッセイ
ＳＭＮＣの自然な増殖が、１μＣｉの３Ｈ−チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ、ＩＣＮ）を有する９６ウェルマイクロプレート中の、各動物個体からの細胞（５×１０５／ウェル）のインキュベートにより求められた。取り込まれた放射能が、２４時間後、Ｂｅｃｋｍａｎ液体シンチレーションカウンター中において測定された。ＳＭＮＣ（２．５×１０５／ウェル）の、単層Ｌ９２９線維芽細胞もしくはプラスチックへの自然接着の分析が、クリスタルバイオレットアッセイを前に記載されたように（２１）使用して実施された。接着細胞数に対応している吸光度が、５７０ｎｍにおいて測定された。
【００８８】
抗体およびフローサイトメトリー
脾臓ＭＮＣ（１×１０６）が、ラット抗マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、抗ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ−１）フィコエリトリン（ＰＥ）、もしくは抗ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体α鎖、ｐ５５）−ビオチン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、次いでストレプタビジン−ＰＥ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と共にインキュベートされた。ＳＭＮＣの各細胞の懸濁は、同一実験群から糖尿病誘発１５日後に得られた３〜５匹の動物ならびに正常な非処理マウスからプールしたものであった。細胞表面マーカー発現が、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＷｉｎ ＭＤＩ ２．８ソフトウェア（Ｊｏｓｅｐｈ Ｔｒｏｔｔｅｒ）を用いて分析された。
【００８９】
膵臓の組織学的および免疫組織学的検査
膵臓が、中性に緩衝化されたホルマリン中において固定され、次いで、パラフィン中に埋められた。この固定された塊が切開され（７μｍ厚）、ヘマトキシリンおよびエオシン染色が実施され、炎症変化の発症および程度を査定した。インシュリン炎のスコア化が実施され（以前に記載されたとおり、１０、１１）、マウスにつき少なくとも１５の膵島を検査していき、盲検的に、以降のように格付けされた。
０ 浸潤なし
１ 腺管周囲の浸潤
２ 膵島周囲の浸潤
３ 膵島内への浸潤
４ β細胞の破壊を伴う膵島内への浸潤
少なくとも１５の膵島が、各マウスにつき数えられた。各膵臓に関する平均スコアが、その合計スコアを検査膵島数で割って算出された。インシュリン炎スコア（ＩＳ）は、平均値±ＳＤとして表現される。免疫組織学が、パラフィンに埋められたホルマリン固定組織の切片において実施され、以前に記載されたマイクロ波主体の方法（２４）を使用した。ＭＩＦの免疫染色に関しては、ポリクローナルウサギ抗ＭＩＦＩｇＧおよびコントロールウサギＩｇＧが使用された。膵島の検査面積が概算され、ＭＩＦ＋膵島細胞の％が、定量的画像分析システム（Ｏｐｔｉｍａ６．５、Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎａｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＭＤ）を使用して測定された。
【００９０】
統計解析
血中グルコース値が、平均値±ＳＥとして示される。統計解析が、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ較正およびＦｉｓｈｅｒ精密度検定を有するＡＮＯＶＡにより実施された。他の値は、平均±ＳＤとして表現され、データ群が、Ｓｔｕｄｅｎｔ組み合わせｔ検定を使用して比較された。同様な結果の少なくとも３回の別々の実験の代表例の結果が、表示される。統計的な有意差は、Ｐ＜０．０５に設定された。
【００９１】
結果
ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発糖尿病マウスにおけるＭＩＦ発現の増加
最近の研究が、ＭＩＦｍＲＮＡ発現が、自然発症糖尿病ＮＯＤマウスにおいてアップレギュレーションされることを明らかにしているが、糖尿病の進行におけるその役割は、知られていない。ＭＩＦ蛋白発現レベルが、免疫炎症糖尿病の間に代えられるかどうかを決定するために、ＭＬＤ−ＳＴＺが、糖尿病感受性ＣＢＡ／Ｈマウスに投与された。免疫組織化学が、この疾患の経過の間に、これらのマウスからの膵臓切片における膵島細胞によるＭＩＦ蛋白発現の実質的な誘発、ならびに、単核細胞の浸潤を明らかにした（図１Ｂ〜Ｄ）。同様に、非糖尿病コントロールマウスに比べてより高濃度のＭＩＦが、糖尿病マウスの腹腔細胞（ＰＣ）において検出された（図１Ｅ）。疾患誘発の間の、抗ＭＩＦ免疫中和グロブリンでのｉｎ ｖｉｖｏでのマウスの処置が顕著に、ＰＣでのＭＩＦ発現を抑えた（図１Ｅ）。これゆえ、ＤＭ誘発の結果として、ＭＩＦ蛋白含量の増加が、末梢レベルおよび標的組織レベル両方において観察され、ＭＩＦ蛋白レベルが、抗ＭＩＦ抗体投与により減弱され得る。
【００９２】
抗ＭＩＦ予防薬は、ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発糖尿病の、臨床的および組織学的パラメーターを抑える
ＭＩＦ活性阻害が、ＭＬＤ−ＳＴＺに晒されたマウスにおける糖尿病を調節するかどうか決定するために、我々は第１に、ＭＩＦに対する中和ポリクローナル抗体の効果を、２つのＤＭ感受性同系交配系統マウスにおいて研究した。Ｃ５７Ｂ１／６およびＣＢＡ／Ｈコントロールマウス両方が、ＰＢＳもしくは非免疫ＩｇＧを用いて処置され、ＭＬＤ−ＳＴＺ注射後の２週間に亘り、持続した高血糖を進展させた。ＭＬＤ−ＳＴＺは、異なる程度の高血糖を、２系統のマウスにおいて誘発させたが、−３〜＋５日の抗ＭＩＦＡｂでのＣ５７Ｂ１／６マウス（図２Ａ）もしくはＣＢＡ／Ｈマウス（図２Ｂ）の処置は顕著に、ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発高血糖を阻害した。加えて、膵臓の見本の組織学的検査が、この疾患の１５日後に実施され、膵島の浸潤の程度が顕著に、非罹患性ＩｇＧを用いて処置された糖尿病コントロールマウスと比べて、抗ＭＩＦ抗体を用いて処置されたマウスにおけるよりも低かったことを指し示した（図２ＣおよびＤ）。我々は、ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発ＤＭにおけるＭＩＦアンタゴニストＩＳＯ−１（２０）の薬理効果も検査した。従って、我々は、マウスを予防的に１４日の期間に亘り、ＩＳＯ−１を用いて処置し、５回のＳＴＺ注射のうちの最初の３日前に開始した。これらのマウスは、８週の実験期間を通して、正常血糖のままであった（図２Ｂ）。ＭＩＦの免疫的もしくは薬理的中和の抗糖尿病原性効果は長く継続し、５８日のフォローアップ期間全体を通して、変動は限られていた（図２ＡおよびＢ）。ＩＳＯ−１によるＭＩＦのブロックが、膵島の炎症を減弱させた（図２Ｄ）。これらのデータは、免疫炎症ＤＭの誘発および進行におけるＭＩＦの決定的な役割、ならびに、リスク集団における１型糖尿病の進展をそらすＭＩＦ阻害剤での処置の有用性に関する証拠を与える。
【００９３】
抗ＭＩＦ処置は、脾臓細胞増殖および接着特性を抑える
抗ＭＩＦ処置の細胞への効果を理解するために、ＣＢＡ／Ｈマウスからの脾臓単核細胞（ＳＭＮＣ）の機能の特徴のｅｘ ｖｉｖｏでの分析が、高血糖１５日後の初期高血糖の進行の間に、実施された。糖尿病マウスから単離された自己反応性リンパ球が、健康な動物から単離された細胞に比べて顕著に、ｅｘ ｖｉｖｏでの自然増殖の増加を呈することを、以前の研究が示しており、このタイプの細胞が、疾患の進行に寄与するかも知れないことを示唆している（２１、２２）。ＭＩＦ阻害剤が、脾臓細胞増殖応答を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて調節するかどうか決定するために、糖尿病ＣＢＡ／Ｈマウスが、抗ＭＩＦ抗体もしくはＩＳＯ−１で処置され、ＭＬＤ−ＳＴＺに晒した１５日後に安楽死させられ、脾臓細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏでの分析用に採取された。ＭＬＤ−ＳＴＺに晒したマウスの抗ＭＩＦ抗体での処置は顕著に、糖尿病関連ＳＭＮＣ増殖を阻害した（３Ｈ−チミジン取り込みが、糖尿病のコントロールの細胞の６３６５１±１０１５７ｃｐｍに対し、２９７８２±３６９４ｃｐｍであった。図３Ａ）。同様に、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩＳＯ−１でのＭＩＦ活性阻害は、脾臓細胞増殖を、コントロールレベル近くにまで逆行させた（非処置のコントロールの細胞の２１１５０±１２７２３ｃｐｍに比べ、２５６３７±２０１８ｃｐｍ。図３Ａ）。細胞増殖に加え、細胞−細胞接着が、ＣＤ１１ｂとＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）との間の相互作用により仲介されるのであるが、１型ＤＭの免疫プロセスに参画する（２１、２５）。糖尿病プロセスに参画している細胞間の相互作用への抗ＭＩＦ処置の可能な結果を決定するために、我々は、ＳＭＮＣの接着特性を主張し、プラスチックへの細胞の自然接着が、線維芽細胞への接着同様顕著に、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＭＩＦＩｇＧもしくはＩＳＯ−１での処置により阻害されたことを見出した（図３Ｂ）。接着性のダウンレギュレーションが、ＣＤ１１ｂ発現の変化と関連しており、フローサイトメトリー分析により明らかにされたとおりであり、ＣＤ１１ｂに対して向けられた抗体を使用し、これは、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）への細胞接着を仲介する分子である。これゆえ、コントロールの糖尿病マウス由来のＳＭＮＣに比べて、抗ＭＩＦＩｇＧ処置およびＩＳＯ−１処置両方が（表１）、ＣＤ１１ｂ＋ＳＭＮＣ頻度および平均抗原密度（平均蛍光強度、ＭＦＩ）を、非処置正常マウスレベルまで抑え、ＭＩＦ阻害剤での処置の抗糖尿病原性に対する有益性を指し示していた。
【００９４】
【表１】
【００９５】
ＩＬ−２は、如何なる免疫応答開始においても、中心的に含まれているので、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ、ＣＤ２５）系との相互作用をブロックすることによりその作用をなくしていくことが、齧歯類およびヒトの疾患両方における免疫介入のための可能な治療標的として、多くの注意を得ている（２６）。抗ＣＤ２５も、マウスにおける低用量ストレプトゾトシン誘発糖尿病を減弱させると示されている（１２、２６）。ＩＬ−２Ｒ＋細胞集団への、ＭＩＦアンタゴニストを用いたｉｎ ｖｉｖｏでの処置の効果を求めるために、リンパ球が、コントロール、もしくは、ＭＬＤ−ＳＴＺに晒されて１５日後の抗ＭＩＦ処置マウスの膵臓から単離され、ＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）に対して向けられた蛍光タグを付けられた抗体で標識された。これらの細胞をＩＬ−２Ｒ発現に関して染色すると（表１）、正常な非処置動物に比べた場合、コントロールの糖尿病マウスにおけるＩＬ−２Ｒ＋リンパ球の％および抗原密度両方において、顕著な増加が明らかにされ、一方、抗ＭＩＦＩｇＧもしくはＩＳＯ−１でのｉｎ ｖｉｖｏでの処置が、これらのパラメーターを抑えた。
【００９６】
原炎症メディエーター産生
原炎症メディエーターは、齧歯類における１型ＤＭにおいて、重大な役割を演じるので（４〜７、２１、２２）、我々は、局所および末梢免疫細胞両方からのＳＴＺ関連サイトカイン放出へのＭＩＦ阻害効果を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて求めた。抗ＭＩＦＩｇＧでの内因性ＭＩＦ蛋白の免疫的中和（図４Ａ）もしくはＩＳＯ−１でのＭＩＦの薬理的阻害（図４Ｂ）が、脾臓ＭＮＣ、腹腔マクロファージ、および膵島細胞によるＴＮＦ−α産生をダウンレギュレーションし、これを、健康な非処置マウスレベルまで低下させた。我々は、細胞内でのｉＮＯＳの発現が顕著に、抗ＭＩＦもしくはＩＳＯ−１で処置された動物から単離されたマクロファージにおいて、相対的に高発現のｉＮＯＳの糖尿病の動物に比べて抑えられたことをも見出した（図５Ａ）。従って、ＭＩＦのブロックが、マクロファージならびに膵島における引き続いてのＮＯ産生を廃止させた（図５Ｂ）。ＭＩＦ阻害剤の効果が、ＴＮＦ−α、ｉＮＯＳ、およびＮＯに特異的であったが、これは、脾臓細胞における細胞内ＩＦＮ−γ発現が、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現同様、コントロールの糖尿病マウスに比べて変わらないままであったからである（図６ＡおよびＢ）。
【００９７】
議論
ＭＩＦは顕著に、過剰炎症および自己免疫と関連した免疫病理に寄与し、内因性ＭＩＦを、中和抗ＭＩＦ抗体、もしくは、ＭＩＦ遺伝子の標的とされた破壊で中和しており、数種類の炎症疾患の齧歯類モデルの進展を阻害し、免疫誘発腎疾患（２７）、リーシュマニア（２８）、グラム陰性およびグラム陽性敗血症（１５、２９、３０）、抗原誘発関節炎（３１）、結腸炎（１６）、ならびに実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ、１７）も包含している。最近、自己免疫の仲介によるＤＭの進展および病理におけるＭＩＦに関する潜在的な役割が、元より糖尿病のＮＯＤマウスにおいて示唆されてきており、これは、ＭＩＦｍＲＮＡ発現が顕著に、疾患の進展の間に増加されるからであり、外因性ＭＩＦ投与が、これらの動物における疾患の発症を増加させる（１８）。ＭＩＦは構造的に発現され、膵臓β細胞から、インシュリンと一緒に分泌され、オートクリンの因子として振る舞い、インシュリン放出を刺激する（３２）。インシュリン分泌の誘発が、β細胞上での発現および免疫細胞に対する抗原提示をしやすくすることにより、機能活性が増強される場合アップレギュレーションされる免疫炎症糖尿病原性経路に寄与すると考えられるので（１２）、この＜＜ホルモン＞＞特性が、内因性ＭＩＦを、β細胞不全および破壊初期の現象に巻き込んでいく更なる重要な因子を代表し得ると考えられる。内因性ＭＩＦを標的とするとこれゆえ、１型糖尿病の病理におけるこのサイトカインの役割を解明するのに、ならびに、この病状の治療および／または予防処置に、適切なアプローチであるかも知れない。
【００９８】
本研究において、我々は初めて、内因性ＭＩＦが、マウス自己免疫糖尿病の進展において鍵となる役割を演じることを示す。ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発糖尿病の進行が、アップレギュレーションされたＭＩＦ蛋白発現を、膵島および末梢細胞両方において伴った。抗ＭＩＦＩｇＧによるＭＩＦの免疫の中和化、または、ＭＩＦ活性のＩＳＯ−１による薬理的阻害は顕著に、この疾患の臨床的および組織学的発症を減弱させた。炎症応答ならびに脾臓細胞増殖および接着を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて阻害した。両薬剤の抗糖尿病原性効果は長く継続し、これはマウスが、８週のフォローアップ期間、正常血糖のままであったからである。自己反応性Ｔ細胞増殖、白血球接着、および、標的組織中への転移の阻害、ならびに、これら抗ＭＩＦ戦略によるマクロファージの活性化は、ＭＩＦ活性の免疫的もしくは薬理的中和が、病原性自己免疫応答を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて減弱させることがあることを示唆する。
【００９９】
Ｔ細胞の活性化および転移におけるＭＩＦの役割と一致して（３０、３３）、我々は、ＭＩＦのブロックが有意に、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて測定されたＩＬ−２Ｒ発現および脾臓リンパ球の自然増殖を減少させることを見出し、これは最も恐らく、ＳＴＺによるβ細胞の破壊の際に放出された骨髄膵臓抗原に対する自己反応性Ｔ細胞応答を反映した（２１、２２）。これらの結果はこれゆえ、ＭＩＦが、自己反応性Ｔ細胞クローンのサイズに寄与すること、ならびに、糖尿病原性Ｔクローンの拡大をブロックすると一部、これら抗ＭＩＦ戦略の保護的効果に応答性かも知れないことを指し示す。
【０１００】
自己反応性細胞のクローンの拡大に加えて、該疾患の進展は、自己免疫応答の誘発および遠心相両方における接着受容体およびリガンドにより仲介される細胞−細胞相互作用により決定される。この文脈においては、我々は、ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発糖尿病マウスからの単核細胞が高度に、培養血管内皮細胞（２１）もしくは線維芽細胞（図３Ｂ）に、疾患活動ピーク時において接着性であることを示している。これらの接着特性は、標的組織の炎症浸潤に重要なメカニズムかも知れない（２１）。幾つかの系列の証拠が、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）への細胞接着を仲介する（３４）ＣＤ１１ｂのアップレギュレーションが、１型ＤＭの免疫学的進展に参画している細胞間の相互作用に、機能的な結果を持つかも知れないことを実証する（２１、２５）。ＭＩＦのブロックが顕著に、糖尿病マウスの単核細胞上でのＣＤ１１ｂ発現を阻害し、顕著に白血球の接着特性をダウンレギュレーションしたが、このことは、抗ＭＩＦ戦略が、これらの細胞の膵島への帰還を妨げるかも知れず、これゆえ、ＭＩＦのブロックの治療の有益性に寄与していることを示唆している。この仮定を裏付けるように、組織学的分析が、抗ＭＩＦマウスにおけるインシュリン炎の抑制を示した。ＭＩＦ活性阻害も、ＥＡＥにおける接着分子依存性の標的組織の病理をダウンレギュレーションすると示されている（１７）。
【０１０１】
この研究のもう１つ別の重要な知見は、抗ＭＩＦ処置が、原炎症性および細胞毒性メディエーターの産生に影響を及ぼすことである。ＴＮＦ−αおよびＮＯのより低い局所的な産生が結果的に、膵臓中への炎症細胞流入の抑制から得られることがある。我々のｅｘ ｖｉｖｏでの知見に基づけば、しかしながら、腹腔および／または脾臓細胞による、ＴＮＦ−α、ｉＮＯＳ、およびＮＯのダウンレギュレーションにより示唆されるように、ＭＩＦのブロックも直接、マクロファージおよびＴ細胞のエフェクターとしての機能に影響するかも知れないように思われる。このことは、これらのメディエーター産生に干渉するｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗ＭＩＦ抗体の能力（２８）と一致している。ＭＩＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＮＦ−αならびに反応性酸素種および窒素代謝物の産生をアップレギュレーションする（３５）。これゆえ、ＭＩＦの仲介によるｉＮＯＳ発現およびＴＮＦ−α合成の直接のブロックが、組織損傷原炎症メディエーターの１型ＤＭにおけるダウンレギュレーションに寄与するかも知れないことに思い至る。これゆえ、我々は、ＭＬＤ−ＳＴＺによるＤＭ処置におけるＭＩＦのブロック効率が、Ｔ細胞およびマクロファージならびに膵島細胞の自己免疫および／または炎症応答への阻害効果によるものと仮定する。
【０１０２】
興味深いことに、ＭＩＦの全身でのブロック効果は特に、ＴＮＦ−αおよびｉＮＯＳ仲介ＮＯ産生を、局所および末梢の両方の細胞において阻害したが、これは、これらの治療アプローチが、象徴的なＴｈ１サイトカインたるＩＦＮ−γの末梢での産生を消去しなかったからである。ＭＨＣクラスＩＩの制御におけるＩＦＮ−γに関する役割と一致して、腹腔および脾臓の細胞による抗原の発現は、抗ＭＩＦ処置後に障害されなかった。これらの観察は、糖尿病の病理におけるＩＦＮ−γに関する中心的な役割を実証している以前の知見（３６）に反するように見えるが、末梢でのサイトカイン産生が、器官特異的自己免疫疾患の進展におけるサイトカインの役割を鏡に映す（反映する）のではないのかも知れないことが、特記されなくてはならない。例えば、我々は以前に、ＤＰ−ＢＢラットモデルにおいて、明らかに矛盾して、抗ＩＦＮ−γ抗体および外から投与されたＩＦＮ−γ両方が、自己免疫疾患の進展を予防したことを示している（１０、３７）。ＥＡＥに関して最近報じられたように、抗ＭＩＦ抗体処置は、ＩＦＮ−γの、抗原特異的脾臓細胞産生に影響を及ぼさなかったが、標的組織における抗原反応性Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γ放出を抑えた（１７）。これゆえ、我々のモデルにおける抗ＭＩＦ処置が、膵臓のミクロな環境内でのサイトカイン産生を抑えたが、この効果が、我々のｅｘ ｖｉｖｏの分析において反映されなかったかも知れないことがあり得る。この裏付けにおいて、我々は以前に、ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発１型糖尿病における、全身に適用される異なる薬剤によるＩＦＮ−γ発現およびＭＨＣクラスＩＩ＋細胞の分布の、同様な調節パターンを示している（２１、２２）。ＩＦＮ−γが、炎症への効果を保有するかも知れず、免疫応答により標的とされる器官レベルにおいて（例えば、膵島のミクロな環境）産生される場合、原炎症効果を発揮している一方、コルチコステロイド依存性および非依存性抗炎症経路を、全身レベルにおいて活性化していることが知られている（８）。グルココルチコイドの免疫抑制効果に反作用するＭＩＦの深遠な能力を心に留めておくと（３８）、ＩＦＮ−γの循環濃度の維持を伴うＭＩＦ活性の中和は、処置動物において、全身の抗炎症効果を潜在化し得ると思われる。
【０１０３】
ＭＩＦは、炎症および自己免疫疾患の決定的なメディエーターであるが、これは、内因性ＭＩＦ活性を抗ＭＩＦ抗体を用いて中和させることが、敗血症ショック、結腸炎、脳脊髄炎、およびリーシュマニア感染（１５〜１７、２８）の動物モデルにおいて効果的であり、ヒトの種々の疾患の治療に向けての確約されているアプローチであるかも知れないからである。しかしながら、ヒト化抗体も包含して外から投与される蛋白に頼る処置アプローチは、潜在的な免疫原性も包含して幾つかの挑戦に面することがあり、このことは、より好ましい実施形態が望まれることを示唆する。抗サイトカイン抗体は、サイトカイント小さな炎症性複合体、これにより、再燃し得る炎症応答（３９）を形成し得る。これらの理由により、抗ＭＩＦＩｇ調製物の治療での使用に代わるものも、医薬の発展のためと考えられるべきである。これゆえ、ＭＩＦ互変異化酵素および生物活性を阻害する薬剤のような小分子として（２０）、ＩＳＯ−１による薬理的介入が、ＭＩＦ関連疾患処置に向けてのより好ましいアプローチであることがある。更なる研究が、ＭＩＦ阻害剤の、糖尿病の病理および発症の制御用の予防薬というよりもむしろ、治療薬としての潜在的な使用に向けられることとなろう。
【０１０４】
実施例２．糖尿病誘発後の遅れたＭＩＦ阻害
実施例１において記載された方法を使用して、糖尿病が、成雄マウスにおいて誘発され、多数回の毒性を下回る用量のストレプトゾトシン（ＭＬＤ−ＳＴＺ、４０ｍｇ／体重ｋｇ／日、ｉ．ｐ．投与、５日間連続）を、記載のとおり（２１）投与された。糖尿病誘発後のＭＩＦ阻害効果が、ＭＩＦの薬理的阻害剤（２０）たる（Ｓ，Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソキサゾール酢酸メチルエステル（ＩＳＯ−１）の、用量１ｍｇ／マウス／日における１４日間連続のｉ．ｐ．注射により研究され、ストレプトゾトシンの最初の投与７日後に開始された。腹腔血中グルコースが、これらのマウスにおいて、および、ＩＳＯ−１処理が稀釈ＩＳＯ−１により置き換えられた場合を除き、同一に処置されたコントロールマウスにおいて、週毎にモニターされた。
【０１０５】
図７および８において示されるように、糖尿病誘発後のＭＩＦ阻害は、有意な有益性をストレプトゾトシン処置マウスに、糖尿病の進展を阻害することにより与えた。
【０１０６】
実施例３．無ＭＩＦマウスは、ストレプトゾトシンによる１型糖尿病誘発に対して耐性である
更に１型糖尿病におけるＭＩＦの重要性を樹立させるために、ＭＩＦ−／−Ｃ５７Ｂ１／６マウス（４０）がストレプトゾトシン処理され、糖尿病の進展中のＭＩＦ＋／＋マウスと比較された。ストレプトゾトシン処理された場合、ＭＩＦ−／−マウスは糖尿病を進展させず、一方、ＭＩＦ＋／＋マウスは糖尿病を進展させた（図９）。これは更に、例えば、リボザイム、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ等を用いてＭＩＦ発現を阻害することに関する方法が、１型糖尿病処置に有用であると期待されることをも、樹立させる。
【０１０７】
上に鑑みて、本発明の幾つかの利点が達成され、他の利点が獲得されることが判る。
【０１０８】
種々の変更が、本発明範囲を逸脱せず、上の方法および組成物においてなされ得るので、上の記載に含有され、添付の図面に示される全事項が例示的に解釈され、限定的な意味で解釈されないことが、意図される。
【０１０９】
本明細書において引用された全文献が、ここに援用される。本明細書におけるこれら文献に関する議論は単に、著者らによる主張を要約するよう意図され、如何なる文献も先行技術を構成するとは認められない。出願人は、これら引用文献の精確さおよび適切さに挑戦する権利を保つ。
【０１１０】
配列番号
配列番号：１−ヒトＭＩＦｃＤＮＡ−GenBank寄託番号NM002415
１ accacagtgg tgtccgagaa gtcaggcacg tagctcagcg gcggccgcgg cgcgtgcgtc
61 tgtgcctctgcgcgggtctc ctggtccttc tgccatcatg ccgatgttca tcgtaaacac
121 caacgtgccc cgcgcctccg tgccggacgg gttcctctcc gagctcaccc agcagctggc
181 gcaggccacc ggcaagcccc cccagtacat cgcggtgcac gtggtcccgg accagctcat
241 ggccttcggcggctccagcgagccgtgcgc gctctgcagc ctgcacagca tcggcaagat
301 cggcggcgcg cagaaccgct cctacagcaa gctgctgtgc ggcctgctgg ccgagcgcct
361 gcgcatcagcccggacaggg tctacatcaactattacgacatgaacgcggccaatgtggg
421 ctggaacaac tccaccttcg cctaagagcc gcagggaccc acgctgtctg cgctggctcc
481 acccgggaac ccgccgcacg ctgtgttcta ggcccgccca ccccaacctt ctggtgggga
541 gaaataaacg gtttagagac t
配列番号；２−マウスＭＩＦｃＤＮＡ−GenBank寄託番号BC024895
１ ggcttgggtcacaccgcgct ttgtaccgtc ctccggtcca cgctcgcagt ctctccgcca
61 ccatgcctatgttcatcgtgaacaccaatgttccccgcgcctccgtgcca gaggggtttc
121 tgtcggagctcacccagcagctggcgcaggccaccggcaa gcccgcacag tacatcgcag
181 tgcacgtggtcccggaccagctcatgactt ttagcggcacgaacgatccctgcgccctct
241 gcagcctgca cagcatcggc aagatcggtg gtgcccagaa ccgcaactac agtaagctgc
301 tgtgtggcctgctgtccgatcgcctgcaca tcagcccggaccgggtctac atcaactatt
361 acgacatgaa cgctgccaac gtgggctgga acggttccac cttcgcttga gtcctggccc
421 cacttacctg caccgctgtt ctttgagcct cgctccacgt agtgttctgt gtttatccac
481 cggtagcgat gcccaccttc cagccgggag aaataaatgg tttataagag aaaaaaaaaa
541 aaaaaaa
配列番号：３−ラットＭＩＦｃＤＮＡ−GenBank寄託番号NM031051
１ gggtcacgta gtcaggtccc agacttgggt cacaccgcac ttaacaccgt cctccggccg
61 tcgttcgcagtctctccgcc accatgcctatgttcatcgt gaacaccaat gttccccgcg
121 cctccgtgccagaggggtttctctccgagctcacccagca gctggcgcaggccaccggca
181 agccggcacagtacatcgca gtgcacgtgg tcccggaccagctcatgacttttagtggca
241 cgagcgacccctgcgccctctgcagcctgcacagcatcggcaagatcggtggcgcccaga
301 accgcaacta cagcaagctgctgtgcggcctgctgtccga tcgcctgcac atcagcccgg
361 accgggtcta catcaactattacgacatgaacgcagccaacgtgggctggaacggttcca
421 ccttcgcttgagcccgggcc tcacttacctgcaccgctgttcttcgagtc ttgctgcacg
481 ccccgttctgtgtttatcca cccgtaatgatggccaccttccggtcgggagaaataaatg
541 gtttgagacc a
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、糖尿病マウスの膵臓および腹腔細胞における上昇したＭＩＦ蛋白発現を実証しているマイクログラフおよびグラフである。パネルＡ〜Ｃは、膵臓の光免疫マイクログラフである。ＭＩＦは弱く、非糖尿病コントロールマウスの膵島により発現され（パネルＡ）、１０日後の糖尿病マウスの膵島においては、多量の単核細胞（ＭＮＣ）の浸潤があり、ＭＩＦ発現が顕著にアップレギュレーションされ（パネルＢ）、糖尿病マウス膵島の一連の切片におけるネガ染色である（パネルＣ）。パネルＤは、定量的画像分析のグラフを示し、糖尿病対非糖尿病コントロールからの膵島細胞による異なる段階のＭＩＦ発現を示している。膵島につきＭＩＦ＋細胞の％の平均±ＳＤが示される（マウスは１群につきｎ＝３）。パネルＥは、非糖尿病マウス（コントロール）、ＭＬＤ−ＳＴＺ糖尿病マウス（ＳＴＺ）、および、抗ＭＩＦ抗体（ＳＴＺ−αＭＩＦ）で処置されたＭＬＤ−ＳＴＺ糖尿病マウスの腹腔細胞における細胞内でのＭＩＦ蛋白発現の定量分析のグラフであり、細胞主体のＥＬＩＳＡにより測定され、ＭＩＦ特異的抗体を用いて、本実施例の「材料および方法」記載のように実施された。この結果が、コントロールの吸光度値（ＯＤ４９２ｎｍ、０．６８７±０．０１３）の何倍増加したかで表される。＊ｐ＜０．０５は、さもなくば無処置のＭＬＤ−ＳＴＺ糖尿病動物対照である。
【図２】図２は、抗ＭＩＦ抗体およびＩＳＯ−１でのＭＩＦのブロックが、高血糖およびインシュリン炎の進展を抑えることを実証している実験結果のグラフである。血中グルコースレベルが、Ｃ５７Ｂ１／６マウス（パネルＡ）およびＣＢＡ／Ｈマウス（パネルＢ）において求められ、ＳＴＺ処置開始時に開始し、週毎の測定を通して継続された。動物は、ＭＬＤ−ＳＴＺ注射を受けさせられ、ビヒクル（ＳＴＺ）、非免疫ウサギＩｇＧ（ＳＴＺ−ＩｇＧ）、抗ＭＩＦＩｇＧ（ＳＴＺ−αＭＩＦ）、もしくはＩＳＯ−１（ＳＴＺ−ＩＳＯ）を用いて処置された。Ｃ５７Ｂ１／６マウス（パネルＣ）およびＣＢＡ／Ｈマウス（パネルＤ）からの膵臓の組織病理学的分析が、インシュリン炎スコアとして表され、本実施例の「材料および方法」記載のとおりである。＊ｐ＜０．０５は、対応しているＳＴＺもしくはＳＴＺ−ＩｇＧ動物対照である。
【図３】図３は、ＭＩＦ活性の中和が、脾臓細胞増殖および接着を抑えることを実証している実験結果のグラフである。パネルＡが、３Ｈ−チミジン取り込みを、細胞増殖測定値として示し、ＳＴＺ（コントロール）では無処置、ＳＴＺおよびビヒクル（ＳＴＺ）、ＳＴＺおよび非免疫ウサギＩｇＧ（ＳＴＺ−ＩｇＧ）、ＳＴＺおよび抗ＭＩＦＩｇＧ（ＳＴＺ−αＭＩＦ）、あるいは、ＳＴＺおよびＩＳＯ−１（ＳＴＺ−ＩＳＯ）で処置されたマウスから単離されたＳＭＮＣにおいて求められたとおりである。パネルＢは、プラスチック表面もしくはＬ９２９線維芽細胞への接着を示し、同一群のマウスから単離されたＳＭＮＣにいて求められたとおりである。この結果が、プラスチック表面もしくはＬ９２９線維芽細胞へのコントロールの接着（Ｏ．Ｄ．５７０ｎｍ、それぞれ、０．３１６±０．０１８および０．９０５±０．０７７）の何倍増加したかで表される。＊ｐ＜０．０５は、対応しているＳＴＺもしくはＳＴＺ−ＩｇＧ動物対照である。
【図４】図４は、ＭＩＦ活性の中和が、ＴＮＦ−α産生を抑えることを実証している実験結果のグラフである。脾臓ＭＮＣ（ＳＭＮＣ）、腹腔細胞（ＰＣ）、および膵島が、コントロールの無処置マウス（コントロール）、ＳＴＺおよび非免疫ウサギＩｇＧ（ＳＴＺ−ＩｇＧ）、ＳＴＺおよび抗ＭＩＦＩｇＧ（ＳＴＺ−αＭＩＦ）、ＳＴＺおよびビヒクル（ＳＴＺ）、ならびに、ＳＴＺおよびＩＳＯ−１（ＳＴＺ−ＩＳＯ）で処置されたマウスから単離された。ＴＮＦ産生が、細胞培養上清中において測定され、本実施例の「材料および方法」記載のとおりであった。結果は、同様な結果の３回の独立した実験の代表である。＊ｐ＜０．０５は、対応しているＳＴＺ−ＩｇＧ（パネルＡ）もしくはＳＴＺ（パネルＢ）動物対照である。
【図５】図５は、ＭＩＦ活性の中和が、ｉＮＯＳ発現およびＮＯ産生をダウンレギュレーションすることを実証している実験結果のグラフである。腹腔細胞（ＰＣ）および膵島は、図３に記載されたように処置されたマウスから単離された。パネルＡにおいて、ｉＮＯＳ発現が、細胞主体のＥＬＩＳＡにより求められ、コントロール値（Ｏ．Ｄ．４９２ｎｍ、０．４４５±０．０２７）に比べて何倍増加したかで表される。パネルＢにおいて、マウスから単離後、ＰＣが培地中４８時間、膵島が２５０Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γ＋ＩＬ−１β存在下に７２時間、培養された。引き続き、該細胞培養上清中における亜硝酸（塩）の蓄積が、求められた。結果は、同様な結果の３回の独立した実験の代表である。＊ｐ＜０．０５は、対応しているＳＴＺもしくはＳＴＺ−ＩｇＧ動物対照である。
【図６】図６は、ＭＩＦ活性の中和が、ＩＦＮ−γおよびＭＨＣクラスＩＩの発現に影響を及ぼさないことを実証している実験結果のグラフである。脾臓ＭＮＣ（ＳＭＮＣ）および腹腔細胞（ＰＣ）が、図３に記載されたように処置されたマウスから単離された。パネルＡにおいて、ＳＭＮＣにおけるＩＦＮ−γ発現が、細胞主体のＥＬＩＳＡにより求められ、コントロール値（Ｏ．Ｄ．４９２ｎｍ、０．０７０±０．０１４）に比べて何倍増加したかで表される。パネルＢにおいて、ＰＣおよびＳＭＮＣにおけるＭＨＣ（クラス）ＩＩ分子発現が、細胞主体のＥＬＩＳＡにより求められ、コントロール値（Ｏ．Ｄ．４９２ｎｍ、それぞれ、１．６７８±０．１５１および１．２０４±０．１２４）に比べて何倍増加したかで表される。結果は、同様な結果の３回の独立した実験の代表である。＊ｐ＜０．０５は、対応しているＳＴＺもしくはＳＴＺ−ＩｇＧ動物対照である。
【図７】図７は、ＭＩＦ阻害剤で処置されたストレプトゾトシン処置マウスにおける糖尿病阻害を示している実験結果のグラフである。
【図８】図８は、ストレプトゾトシン処置マウスにおける糖尿病コントロールへの、ＭＩＦ阻害剤ＩＳＯ−１および抗ＭＩＦ抗体のタイミングの効果を示している実験結果のグラフである。無処置ＣＢＡ／Ｈマウス（コントロール、ｎ＝８）、あるいは、ＳＴＺ単独（ＳＴＺ、ｎ＝８）、ＳＴＺおよびＩＳＯ−１（ＳＴＺ−ＩＳＯ初期、ｎ＝８）、後期（ＳＴＺ−ＩＳＯ−１後期、ｎ＝８）、もしくは後期抗ＭＩＦＡｂ（ＳＴＺ−ＭＩＦ、ｎ＝８）で処置されたＭＬＤ−ＳＴＺ２１日後の糖尿病マウスの、血中グルコースレベル。 初期注射：ＩＳＯ−１がｉ．ｐ．注射により、４０ｍｇ／Ｋｇ／日で１４日間投与され、ＳＴＺの第１回の注射３日前に開始した。 後期注射：ＩＳＯ−１もしくは抗ＭＩＦＡｂが、ＳＴＺの最後の注射６日後に投与された。 ＊ｐ＜０．０５は、対応しているＳＴＺ動物対照である。
【図９】図９は、ＭＩＦなしのマウスが、ストレプトゾトシンでの処置後に、糖尿病を獲得しないことを示している実験結果のグラフである。血中グルコースレベルが、野生型およびＭＩＦ−／−Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて求められた。動物は、ＭＬＤ−ＳＴＺ注射（５×４０ｍｇ／ｋｇ／日）を受けさせられた。血中グルコースレベルが求められ、ＳＴＺ処置開始時に開始し、週毎の測定を通して継続された。＊ｐ＜０．００５は、対応しているＳＴＺ動物対照である。血中グルコースレベルが求められた。 （ａ）ＳＴＺ処置開始時に開始し、週毎の測定を通して継続された。ＭＬＤ−ＳＴＺ注射を受けさせられた代表的な２群に使用された記号は、Ｃ５７Ｂ１／６マウス（●；ｎ＝１１）およびＭＩＦ−／−Ｃ５７Ｂ１／６（○；ｎ＝１１）。 ２回の独立した実験の代表からの結果が、±ＳＤとして表される。＊ｐ＜０．００５は、対応しているＳＴＺ動物対照である。統計分析が、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ較正を用いたＡＮＯＶＡにより実施された。
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００４年３月２９日出願の米国仮出願第６０／５５７，１６９号の利益を請求する。
【０００２】
連邦基金研究開発に関する陳述
米国政府は、本発明において、支払い済みのライセンスを持ち、限られた環境において、本特許権者に、ＮＩＨによるＤＫ０６４２３３−０１により提供される合理的な項目に関して、他者にライセンスを与えるよう要求する権利を持つ。
【０００３】
（１）本発明分野
本発明は一般的に、糖尿病処置に関する。より具体的には、本発明は、マクロファージ転移阻害因子阻害剤の、１型糖尿病処置もしくは予防のための使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
（２）関連技術の記述
参照
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40．Bozza M, et al: Targeted disruption of migration inhibitory factor gene reveals its critical role in sepsis. J. Exp. Med. 189: 341-346, 1999
【０００５】
１型糖尿病（１型ＤＭ）は、多数の要因による症候であり、内因性インシュリンの欠乏により引き起こされ、自己反応性Ｔ細胞およびマクロファージにより媒介される、膵臓β細胞に対する免疫攻撃によるものと考えられる。この疾患は、およそ４，０００，０００人の北米の人々を患わせ、疫学データが、該疾患の発生率およびこれゆえ罹患率が、世界中で上昇していることで一致している（１）。更なる研究努力が大きく、疾患の病理の理解を拡大しており、幾つかの前炎症メディエーターに関する決定的な役割を解明してきている。しかしながら、有効な抗炎症治療薬は、１型ＤＭの臨床管理に関しては承認されていない。該疾患の幾つかの動物モデルが、糖尿病の病理に横たわる分子（レベルでの）現象の理解を促進してきた。罹患系統マウスに対する、多数回低用量ストレプトゾトシンが例えば、ヒト１型ＤＭの印の多くを有する糖尿病態を誘発させる。臨床および組織免疫学的な類似性は、膵島の、Ｔリンパ球およびマクロファージによる浸潤に関連した高血糖の進展も包含する（インシュリン炎、２、３）。原炎症サイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）−１β、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、およびＩＬ−１８を包含して、ストレプトゾトシン誘発糖尿病の進展において、重要な役割を演じる（４〜７）。しかしながら、組み換えＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、もしくはＴＮＦ−α、または、これらの活性の特異的阻害剤の投与が、疾患の進展および／または経過への複雑でしばしば矛盾する効果を持ち、これは使用される動物モデルおよび投与のタイミングに依っている（８〜１１）。
【０００６】
１型ＤＭの病因において免疫系により演じられる、鍵を握る病原的な役割が最近、多くの注意の焦点を、糖尿病前段階の個体において、もしくは、新たに診断された疾患を患っている患者において、β細胞崩壊を留めもしくは遅らせることを可能にするかも知れない免疫治療アプローチを同定することに当てている（１２）。マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）は、局所および全身での炎症における決定的なサイトカインであるが、糖尿病におけるその役割は、完全には探索されていない。ＭＩＦは多面的なサイトカインであり、免疫応答の間に、活性化Ｔ細胞、マクロファージ、および種々の非免疫細胞により産生される（１３、１４）。これは、宿主の防衛の決定的なメディエーターとして振る舞い、敗血症ショックならびに慢性炎症および自己免疫疾患における治療ターゲット（標的）として探索され続けている（１５〜１７）。上昇したＭＩＦ遺伝子発現が、自然に肥満しない糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおいて検出されているが、１型ＤＭの病因におけるその重要性は不明である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これゆえ、１型糖尿病における、サイトカイン、特にＭＩＦの精確な役割および相互作用へと分け入っていく更なる調査を求める必要性がある。
【０００８】
こうして、本発明者らは、マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）阻害剤が、１型糖尿病を軽減させることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これゆえ、ある幾つかの実施形態において、本発明は、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する方法に関する。本方法は、該哺乳類に、該哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含んでいる医薬組成物を投与することを含む。これらの実施形態において、該物質は、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである。
【００１０】
本発明は、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する他の方法にも関する。これらの方法も、該哺乳類に、該哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含んでいる医薬組成物を投与することを含む。これらの実施形態において、該物質は、以降の構造ＩもしくはＩＩを含んでいる有機分子である。
【００１１】
【化１】
【００１２】
本発明は加えて、化合物が、１型糖尿病を予防するかもしくは処置するのに有用であるかどうか評価する方法に関する。本方法は、（ａ）該化合物がマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を哺乳類において阻害するかどうか決定し、次いで、もし該化合物がＭＩＦを阻害すれば、（ｂ）該化合物が１型糖尿病の進展を阻害するかどうか決定することを含む。
【００１３】
更なる実施形態において、本発明は、（ａ）マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を該哺乳類において阻害する、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである物質を含んでいる医薬組成物、ならびに、（ｂ）該組成物を、該哺乳類に投与するための説明書を含んでいるキットに関する。これらの実施形態において、該哺乳類が１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている。
【００１４】
更なる実施形態において、本発明は、（ａ）マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を該哺乳類において阻害する、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである物質を含んでいる医薬組成物、ならびに、（ｂ）該組成物を、該哺乳類に投与するための説明書を含んでいる他のキットに関する。これらの実施形態において、該哺乳類が１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている。これらの実施形態の医薬組成物は、以降の構造ＩもしくはＩＩを含んでいる有機分子である。
【００１５】
【化２】
【００１６】
本発明は、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類の処置用医薬品の製造のための、マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を該哺乳類において阻害する物質の使用にも関し、ここで該物質が、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである。
【００１７】
加えて、本発明は、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類の処置用医薬品の製造のための、マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を該哺乳類において阻害する物質の使用に関する。これらの実施形態において、該物質は、以降の構造ＩもしくはＩＩを含んでいる有機分子である。
【００１８】
【化３】
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
略号
ＭＩＦ：マクロファージ転移阻害因子
ＩＳＯ−１：（Ｓ，Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソキサゾール酢酸メチルエステル
ｉＮＯＳ：誘発型酸化窒素（ＮＯ）合成酵素
ＳＴＺ：ストレプトゾトシン
ＭＬＤ−ＳＴＺ：多数回低用量ストレプトゾトシン
ＳＭＮＣ：脾臓単核細胞
ＰＣ：腹腔細胞
ＩＦＮ−γ：γ−インターフェロン
ＴＮＦ−α：腫瘍壊死因子−α
ＩＬ−１β：インターロイキン１β
【００２０】
本発明は、ＭＩＦが、１型糖尿病の病因における決定的な因子であるとの発見に基づいている。これゆえ、ＭＩＦ阻害は、１型糖尿病の進展を防ぐかもしくは軽減させる。実施例参照。
【００２１】
これゆえ、ある幾つかの実施形態において、本発明は、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する方法に関する。本方法は、該哺乳類に、該哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含んでいる医薬組成物を投与することを含む。これらの実施形態において、該物質は、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである。
【００２２】
これらの方法のうちのある幾つかにおいて、該物質は、ＭＩＦ活性を阻害する。このような物質の１タイプは、特異的にＭＩＦに結合する抗体結合部位、例えば、抗体、抗体のＦａｂ断片、もしくは抗体のＦ（ａｂ）２断片を含む。このような物質は、よく知られた方法により、産生され得る。限定しない方法は：
動物の、ＭＩＦでの免疫。次いで、抗ＭＩＦ抗体の、血清からの単離、もしくは、抗ＭＩＦモノクローナル抗体の、脾臓細胞のミエローマ細胞との融合により調製されたハイブリドーマからの産生。
ファージディスプレー
他の組み換え方法
を包含する。好ましくは、該モノクローナル抗体は、処置されるべき（動物）種に適合するよう選ばれ、もしくは、適応される。ヒトの処置に関しては、例えば、抗ＭＩＦ抗体（もしくはこれの抗原結合断片）は、ヒトの抗体もしくはヒト化された抗体とされる。このような抗原特異的なヒトのモノクローナル抗体もしくはヒト化されたモノクローナル抗体が、当業界においてよく知られた種々の方法により得られることがある。
【００２３】
これらの方法に有用なもう１つ別の、ＭＩＦ活性を阻害する物質は、特異的にＭＩＦに結合するアプタマーである。アプタマーは、１本鎖オリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド類似体であり、ＭＩＦのような特定の標的分子に結合する。これゆえ、アプタマーは、抗体に対するオリゴヌクレオチドとしての類似性を有する。しかしながら、アプタマーは、抗体よりも小さく、一般的に、５０〜１００ｎｔの範囲中にある。それらの結合は高度に、当該アプタマーオリゴヌクレオチドにより形成される２次構造に依存している。ＲＮＡおよび１本鎖ＤＮＡ（もしくは類似体）両方のアプタマーが、知られている。例えば、（米国特許第）５，７７３，５９８、５，４９６，９３８、５，５８０，７３７、５，６５４，１５１、５，７２６，０１７、５，７８６，４６２、５，５０３，９７８、６，０２８，１８６、６，１１０，９００、６，１２４，４４９、６，１２７，１１９、６，１４０，４９０、６，１４７，２０４、６，１６８，７７８、および６，１７１，７９５（号明細書）参照。アプタマーは、トランスフェクションされたベクターからも、発現され得る（Ｊｏｓｈｉら、２００２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６、６５４５）。
【００２４】
如何なる視覚的に特定の標的に結合するアプタマーも、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを表すＳＥＬＥＸと呼ばれる反復プロセスを使用しながら、選択され得る（Ｂｕｒｋｅら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４、６５０；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４６、８１８；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４、９５９９；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６９８８；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：５０５）。ＳＥＬＥＸの幾つかの変法が開発されており、該プロセスを向上させ、特定環境下でのそれの使用を可能にする。例えば、（米国特許第）５，４７２，８４１、５，５０３，９７８、５，５６７，５８８、５，５８２，９８１、５，６３７，４５９、５，６８３，８６７、５，７０５，３３７、５，７１２，３７５、および６，０８３，６９６（号明細書）参照。これゆえ、アプタマーの、如何なる特定のペプチドに対する産生も、ＭＩＦも包含して、過度な実験を必要としない。
【００２５】
これらの方法の他の実施形態において、該物質は、ＭＩＦ発現を阻害する。好ましい例は、該哺乳類において、ＭＩＦｍＲＮＡ特異的な、アンチセンス核酸、リボザイム、および小阻害的核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）の形の阻害的オリゴヌクレオチドを包含する。これらの阻害的オリゴヌクレオチドの各々は、ＭＩＦｍＲＮＡ配列の知識を必要とする。ＭＩＦｍＲＮＡ配列は、多くの哺乳類種に関して、知られている。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ（配列番号）：１〜３参照、但し、ＭＩＦｃＤＮＡ配列はそれぞれ、ヒト、マウス、およびラットに関する。ＭＩＦｃＤＮＡ配列は、如何なる哺乳類に関しても、過度な実験なく求められ得、例えば、当該哺乳類のｃＤＮＡ調製品からの配列を増幅させること、既知の哺乳類ＭＩＦｃＤＮＡ配列からデザイン（設計）されたプライマーを使用することによる。
【００２６】
これらの実施形態のうちのある幾つかの態様において、本発明の阻害的オリゴヌクレオチドは、アンチセンス核酸もしくは模倣体である。アンチセンス核酸分子は、ｍＲＮＡの翻訳を、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションして蛋白への翻訳を防ぐことにより、直接ブロックするよう作用する。アンチセンスによるアプローチは、ＭＩＦｍＲＮＡ蛋白に相補的であるオリゴヌクレオチドのデザインを含んでいる。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、この相補的な保護的配列のｍＲＮＡの転写（産）物に結合して、翻訳を防ぐことになる。絶対的な（完全な）相補性が好ましいが、（必ずしも）必要とされない。
【００２７】
ＭＩＦｍＲＮＡ転写（産）物を触媒的に開裂させるようデザインされたリボザイム分子も、ＭＩＦｍＲＮＡの翻訳、これゆえ、ＭＩＦ蛋白の発現を防ぐのに使用され得る。例えば、ＰＣＴ（国際）公開（ＷＯ）９０／１１３６４、Ｓａｒｖｅｒら、１９９０参照。
【００２８】
リボザイムは酵素ＲＮＡ分子であり、ＲＮＡの特異的開裂を触媒できる。総説に関して、Ｒｏｓｓｉ、１９９４参照。リボザイムの作用メカニズム（機序）は、当該リボザイム分子の、相補的標的ＲＮＡに対する配列特異的ハイブリダイゼーションを含んでおり、核酸内部の分解開裂現象を伴う。リボザイム分子の組成物は、１種以上の、ＭＩＦｍＲＮＡに相補的な配列を包含しなくてはならず、ｍＲＮＡ開裂に応答性の、よく知られた触媒配列を包含しなければならない。この配列に関して、例えば、米国特許第５，０９３，２４６号明細書参照。
【００２９】
本発明に好ましいタイプのリボザイムは、ハンマーヘッドリボザイムである。これらの実施形態において、ハンマーヘッドリボザイムは、ＭＩＦｍＲＮＡを、当該ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域により書き取られる位置において開裂させる。ハンマーヘッドリボザイムの唯一の要件は、ｍＲＮＡが、２つの塩基配列５’−ＵＧ−３’を持つことであり、これは、ＭＩＦ遺伝子中に何回もある（配列番号：１〜３参照）。ハンマーヘッドリボザイムの構築および産生は、当業界においてよく知られ、より充分に、Ｍｙｅｒｓ、１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（特に、図４、８３３ページ参照）、ならびに、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、１９８８に記載される。
【００３０】
本発明のリボザイムは、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａに天然にあり（ＩＶＳもしくはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られる）、Ｔｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈおよび共同実験者らにより更に記載されているもの（ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ、１９８６；Ｚａｕｇら、１９８４；ＺａｕｇおよびＣｅｃｈ、１９８６；Ｚａｕｇら、１９８６；ＷＯ８８／０４３００、Ｃｅｌｌ、４７：２０７〜２１６）のようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以降、＜＜Ｃｅｃｈタイプリボザイム＞＞）も包含する。Ｃｅｃｈタイプリボザイムは、８塩基対の活性部位を持ち、ＭＩＦのＲＮＡの開環が望まれる場合であれば、ＭＩＦｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする。本発明は、ＭＩＦｍＲＮＡ中に存在している８塩基対の配列を標的とするＣｅｃｈタイプリボザイムを含んでいる。
【００３１】
アンチセンスを用いたアプローチを用いた場合のように、これらリボザイムは修飾（例えば、安定性向上、標的化等）オリゴヌクレオチドから構成され得、ＭＩＦをＩｉｎ ｖｉｖｏにおいて作る細胞、好ましくは活性化Ｔ細胞および／またはマクロファージに与えられるべきである。好ましい投与方法は、リボザイムを＜＜コード化している＞＞ＤＮＡ構築物を、強い構成ｐｏｌＩＩＩもしくはｐｏｌＩＩプロモーター制御下に使用することを含んでおり、トランスフェクションされた細胞は、充分量の該リボザイムを産生するようになり、内因性ＭＩＦ遺伝子のメッセージを破壊し、翻訳を阻害する。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり、触媒であるので、より低い細胞内濃度が、効率のためには必要とされる。
【００３２】
あるいは、内因性標的遺伝子発現は、ＭＩＦ遺伝子制御領域（つまり、ＭＩＦ遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に対して相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化して、抑えられ得、３重螺旋構造を形成し、体内標的細胞におけるＭＩＦ遺伝子の転写を防ぐ。一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ、１９９１；Ｈｅｌｅｎｅら、１９９２；Ｍａｈｅｒ、１９９２参照。
【００３３】
３重螺旋形成において、転写阻害に使用される核酸分子は一本鎖であり、デオキシヌクレオチドから構成されるべきである。これらオリゴヌクレオチドの基礎的な組成は、３重螺旋形成をＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対則を介して促進させるようデザインされなければならず、一般的には、２重螺旋の一本鎖上に存在すべきプリンもしくはピリミジンのかなりの引き延ばしを必要とする。核酸は、ピリミジン主体でもよく、結果的に得られてくる３重螺旋の関連した３本鎖を横断するＴＡＴおよびＣＧＣ＋コドン（＝トリプレット）を与えることになる。このピリミジンの豊富な分子は、この鎖に対して平行な向きの２重螺旋の１本鎖のプリンの豊富な領域に対する塩基の相補性を与える。加えて、プリンが豊富、例えば、連なったＧ残基を含有する核酸分子が、選ばれてもよい。これらの分子は、ＧＣ対の豊富なＤＮＡ２重螺旋と共に、３重螺旋を形成することになり、そのプリン残基の殆どが、この標的の２重螺旋の１本鎖上に位置され、結果的に、該３重螺旋中の３本鎖を横断するＣＧＣトリプレットを与える。幾つかのこのようなＧＣ豊富な領域が、ＭＩＦ遺伝子における標的化に使える（配列番号：１〜３）。
【００３４】
あるいは、３重螺旋形成目指して標的化され得る潜在的な配列は、いわゆる＜＜スイッチバック＞＞核酸分子を作り出して、増やされることがある。スイッチバック分子は、交互に５’−３’、３’−５’としていく様式で合成され、２重螺旋の第１の１本鎖次いでもう一方と塩基対となり、連なり得るプリンもしくはピリミジンが、２重螺旋の１本鎖上に存在している必要性を取り除いてくれる。
【００３５】
他の実施形態においては、該オリゴヌクレオチドが小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得、当業界において、２本鎖ＲＮＡとして知られ、その標的ｍＲＮＡ（ここでは、ＭＩＦ）に相補的であり、細胞性因子と相互作用して該標的配列に結合し、次いで分解される。ｓｉＲＮＡ配列は、如何なる領域のＭＩＦｍＲＮＡにも相補的であり得る。ｓｉＲＮＡは好ましくは２１〜２３ｎｔ長であるが、より長い配列は、その長さ（２１〜２３ｎｔ）に加工（プロセシング）されることになる。文献は、Ｃａｐｌｅｎら、２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１；ＪａｒｖｉｓおよびＦｏｒｄ、２００２；ならびにＳｕｓｓｍａｎおよびＰｅｉｒｃｅ、２００２も包含する。
【００３６】
本発明の、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、３重螺旋、ならびにｓｉＲＮＡ分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成に関して当業界において知られる如何なる方法によっても調製されてよく、上記のとおりである。これらは例えば、固相ホスホラミデート化学合成のような、当業界においてよく知られる、オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的合成する手法も包含する。あるいは、ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでの、そのアンチセンスＲＮＡ分子をコード化しているＤＮＡ配列の転写により産生されてもよい。このようなＤＮＡ配列は、広く種々のベクター中に取り込まれてもよく、これらは、Ｔ７もしくはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取り込む。もう１つ別の代わりの場合、アンチセンスｃＤＮＡ構築物が、アンチセンスＲＮＡを、使用されるプロモーターに拠り構造的もしくは誘発的に合成し、細胞株中に、もしくは、哺乳類の標的細胞中に、既知の遺伝子療法により安定に導入され得る。
【００３７】
本明細書において使用される場合、用語＜＜オリゴヌクレオチド＞＞とは、オリゴマーもしくはポリマーのリボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはこれらの模倣体を言う。この用語は、天然起源の核酸塩基、糖、および、ヌクレオシド間共有結合（骨格）から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに、同様に機能する非天然起源の部分を持っているオリゴヌクレオチドも包含する。このようなオリゴヌクレオチド模倣体はしばしば、元の形を凌駕して好ましく、例えば、増強された細胞への取り込み、核酸標的への増強された親和性、および、ヌクレアーゼ存在下での増加した安定性のような望ましい特性のためである。
【００３８】
本発明において有用な好ましい模倣体の特定例は、修飾骨格もしくは非天然ヌクレオシド間結合を含有しているオリゴヌクレオチドも包含する。本明細書において定義されるとおり、修飾骨格を持っているオリゴヌクレオチドは、燐原子をその骨格中に保持するもの、および、燐原子をその骨格中に持たないものも包含する。
【００３９】
好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は例えば、ホスホロチオエート、不斉ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、および不斉ホスホネートを包含して、メチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを包含して、ホスホロアミデート、チオホスホロアミデート、チオアルキルホスホネート、チオアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を持っているセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、ならびに、１つ以上のヌクレオチド間結合が３’から３’へ、５’から５’へ、もしくは２’から２’結合へと逆転した極性を持っているものも包含する。逆転した極性を持っている好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド間結合において、単一の３’から３’への結合を含み、つまり、非塩基性であることがある単一逆転ヌクレオシド残基である（この核酸塩基は失われているか、もしくは、その代わりに水酸基を持つ）。種々の塩、混合塩、および遊離酸の形も、包含される。
【００４０】
上の燐含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書、米国特許第４，４６９，８６３号明細書、米国特許第４，４７６，３０１号明細書、米国特許第５，０２３，２４３号明細書、米国特許第５，１７７，１９６号明細書、米国特許第５，１８８，８９７号明細書、米国特許第５，２６４，４２３号明細書、米国特許第５，２７６，０１９号明細書、米国特許第５，２７８，３０２号明細書、米国特許第５，２８６，７１７号明細書、米国特許第５，３２１，１３１号明細書、米国特許第５，３９９，６７６号明細書、米国特許第５，４０５，９３９号明細書、米国特許第５，４５３，４９６号明細書、米国特許第５，４５５，２３３号明細書、米国特許第５，４６６，６７７号明細書、米国特許第５，４７６，９２５号明細書、米国特許第５，５１９，１２６号明細書、米国特許第５，５３６，８２１号明細書、米国特許第５，５４１，３０６号明細書、米国特許第５，５５０，１１１号明細書、米国特許第５，５６３，２５３号明細書、米国特許第５，５７１，７９９号明細書、米国特許第５，５８７，３６１号明細書、米国特許第５，１９４，５９９号明細書、米国特許第５，５６５，５５５号明細書、米国特許第５，５２７，８９９号明細書、米国特許第５，７２１，２１８号明細書、米国特許第５，６７２，６９７号明細書、および米国特許第５，６２５，０５０号明細書も包含するが、これらに限られず、これらのうちの特定のものが、本願と共通の著者であり、その各々が、本明細書において援用される。
【００４１】
燐原子をその中に包含しない好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子混合のアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または、１種以上のヘテロ原子短鎖もしくはヘテロ環状ヌクレオシド間結合により形成される骨格を持つ。これらは、モルホリノ結合（一部、ヌクレオシドの糖部分から形成）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格を持っているもの、ならびに、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の混合した構成部分を持っている他のものも包含する。
【００４２】
上のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，０３４，５０６号明細書、米国特許第５，１６６，３１５号明細書、米国特許第５，１８５，４４４号明細書、米国特許第５，２１４，１３４号明細書、米国特許第５，２１６，１４１号明細書、米国特許第５，２３５，０３３号明細書、米国特許第５，２６４，５６２号明細書、米国特許第５，２６４，５６４号明細書、米国特許第５，４０５，９３８号明細書、米国特許第５，４３４，２５７号明細書、米国特許第５，４６６，６７７号明細書、米国特許第５，４７０，９６７号明細書、米国特許第５，４８９，６７７号明細書、米国特許第５，５４１，３０７号明細書、米国特許第５，５６１，２２５号明細書、米国特許第５，５９６，０８６号明細書、米国特許第５，６０２，２４０号明細書、米国特許第５，６１０，２８９号明細書、米国特許第５，６０２，２４０号明細書、米国特許第５，６０８，０４６号明細書、米国特許第５，６１０，２８９号明細書、米国特許第５，６１８，７０４号明細書、米国特許第５，６２３，０７０号明細書、米国特許第５，６６３，３１２号明細書、米国特許第５，６３３，３６０号明細書、米国特許第５，６７７，４３７号明細書、米国特許第５，７９２，６０８号明細書、米国特許第５，６４６，２６９号明細書、および米国特許第５，６７７，４３９号明細書も包含するが、これらに限られず、これらのうちの特定のものが、本願と共通の著者であり、その各々が、本明細書において援用される。
【００４３】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体においては、その糖およびそのヌクレオシド間結合両方、つまり、当該ヌクレオチド単位の骨格が、新規な基で置き換えられる。その塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために、維持される。１種のこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を持つと示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と言われる。ＰＮＡ化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖骨格が、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。その核酸塩基は維持され、直接もしくは間接に、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書、米国特許第５，７１４，３３１号明細書、および米国特許第５，７１９，２６２号明細書も包含するが、これらに限られない。ＰＮＡ化合物の更なる教示が、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７〜１５００に見出され得る。
【００４４】
修飾オリゴヌクレオチドは、１種以上の置換糖部分も含有してよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、その２’位において、以降のうちの１種を含む。
ＯＨ；Ｆ；Ｏ−，Ｓ−，もしくはＮ−アルキル；Ｏ−，Ｓ−，もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−，Ｓ−，もしくはＮ−アルキニル；または、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル
式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは無置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、あるいは、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、式中、ｎおよびｍが、１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、その２’位において、以降のうちの１種を含む。
Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、アリールアルキル、Ｏ−アルキルアリール、Ｏ−アリールアルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物速度論特性を向上させるための基、または、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させるための基、ならびに、同様な特性を持っている他の置換基
好ましい修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）もしくは２’−ＭＯＥとしても知られる、Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６〜５０４）を包含し、つまり、アルコキシアルコキシ基である。更に好ましい修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、つまりＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基であり、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られ、本明細書における以下の実施例に記載されるようであり、ならびに、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当業界において、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルもしくは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、つまり２’−ＯＣＨ２ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ２）２基であり、本明細書における以下の実施例にも記載されるものも包含する。
【００４５】
更に好ましい修飾は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）も包含し、ここではその２’−水酸基が、その糖の環の３’および４’炭素原子に結合され、これにより、２環性の糖部分を形成している。該結合は好ましくはメチレン（ＣＨ２）ｎ基であり、その２’酸素原子とその３’もしくは４’炭素原子とを架橋しており、式中、ｎは１もしくは２である。ＬＮＡおよびこの調製物が、ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６において記載される。
【００４６】
他の好ましい修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を包含する。この２’−における修飾は、アラビノ位（上向き）もしくはリボ位（下向き）でもよい。好ましい２’−アラビノ位での修飾は、２’−Ｆである。同様な修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特にその３’末ヌクレオチドもしくは２’−５’結合オリゴヌクレオチド上の糖の３’位、および、５’末ヌクレオチドの５’位においてなされてもよい。オリゴヌクレオチドは、シクロブチル部分のような糖模倣体を、そのフラノース５炭糖の代わりに持ってもよい。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第４，９８１，９５７号明細書、米国特許第５，１１８，８００号明細書、米国特許第５，３１９，０８０号明細書、米国特許第５，３５９，０４４号明細書、米国特許第５，３９３，８７８号明細書、米国特許第５，４４６，１３７号明細書、米国特許第５，４６６，７８６号明細書、米国特許第５，５１４，７８５号明細書、米国特許第５，５１９，１３４号明細書、米国特許第５，５６７，８１１号明細書、米国特許第５，５７６，４２７号明細書、米国特許第５，５９１，７２２号明細書、米国特許第５，５９７，９０９号明細書、米国特許第５，６１０，３００号明細書、米国特許第５，６２７，０５３号明細書、米国特許第５，６３９，８７３号明細書、米国特許第５，６４６，２６５号明細書、米国特許第５，６５８，８７３号明細書、米国特許第５，６７０，６３３号明細書、米国特許第５，７９２，７４７号明細書、および米国特許第５，７００，９２０号明細書も包含するが、これらに限られず、これらのうちの特定のものが、本願と共通の著者であり、その各々が、本明細書において、その全体を援用される。
【００４７】
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（しばしば当業界において、単に＜＜塩基＞＞と言われる）の修飾もしくは置換も包含してよい。本明細書において使用される場合、＜＜無修飾＞＞もしくは＜＜天然＞＞核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびに、ピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）も包含する。修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘発体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘発体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘発体、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（擬ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのような他の合成および天然核酸塩基も包含する。更なる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジンのような３環性ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン、カルバゾールシチジン、およびピリドインドールシチジンのようなＧ−クランプも包含する。修飾核酸塩基は、プリンもしくはピリミジン塩基が、他のヘテロ環、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンで置き換えられているものも包含してよい。更なる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書において開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０版において開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３により開示されるもの、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ版、１９９３により開示されるものも包含する。これらの核酸塩基のうちの特定のものが特に、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を上昇させるのに有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを包含して、Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンを包含する。５−メチルシトシンの置換が、核酸２重螺旋の安定性を０．６〜１．２℃上昇させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．、およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．著、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３、ｐｐ．２７６〜２７８）、本願において好ましい塩基置換であり、尚より具体的には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合である。
【００４８】
上記のうちの特定の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許は、上記米国特許第３，６８７，８０８号明細書、ならびに、米国特許第４，８４５，２０５号明細書、米国特許第５，１３０，３０２号明細書、米国特許第５，１３４，０６６号明細書、米国特許第５，１７５，２７３号明細書、米国特許第５，３６７，０６６号明細書、米国特許第５，４３２，２７２号明細書、米国特許第５，４５７，１８７号明細書、米国特許第５，４５９，２５５号明細書、米国特許第５，４８４，９０８号明細書、米国特許第５，５０２，１７７号明細書、米国特許第５，５２５，７１１号明細書、米国特許第５，５５２，５４０号明細書、米国特許第５，５８７，４６９号明細書、米国特許第５，５９４，１２１号明細書、米国特許第５，５９６，０９１号明細書、米国特許第５，６１４，６１７号明細書、米国特許第５，６４５，９８５号明細書、米国特許第５，８３０，６５３号明細書、米国特許第５，７６３，５８８号明細書、米国特許第６，００５，０９６号明細書、米国特許第５，６８１，９４１号明細書、および米国特許第５，７５０，６９２号明細書も包含するが、これらに限られず、本願と共通の著者であり、やはり本明細書において援用される。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドのもう１つ別の修飾は、該オリゴヌクレオチドに化学的に、該オリゴヌクレオチド活性、細胞での分布、もしくは細胞への取り込みを促進させる１つ以上の部分もしくは共役部分を結合させることを含んでいる。本発明の化合物は、１級もしくは２級水酸基のような官能基に共有結合した共役基も包含し得る。本発明の共役基は、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物動態特性を促進させる基、ならびに、オリゴマーの薬物速度論特性を促進させる基も包含する。典型的な共役基は、コレステロール、脂質、燐脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料を包含する。薬物動態特性を促進させる基は、本発明の文脈においては、オリゴマーの取り込みを向上させ、分解に対するオリゴマーの耐性を促進させ、および／または、ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強める基を包含する。薬物速度論特性を促進させる基は、本発明の文脈においては、オリゴマーの取り込み、分布、代謝、もしくは排泄を向上させる基を包含する。代表的な共役基が、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６において開示される。共役部分は、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３〜６５５６）、胆汁酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９４、４、１０５３〜１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０、３０６〜３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９３、３、２７６５〜２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２、２０、５３３〜５３８）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９１、１０、１１１１〜１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９、３２７〜３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３、７５、４９〜５４）、燐脂質、例えば、ジヘキサデシルラセミ体グリセロールもしくは１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシルラセミ体グリセロ−３Ｈ−ホスホン酸トリエチルアンモニウム（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１〜３６５４；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０、１８、３７７７〜３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４、９６９〜９７３）、アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１〜３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４、２２９〜２３７）、または、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７、９２３〜９３７）のような脂質部分も包含するが、これらに限られない。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性な薬剤物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルザルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナミン酸、葉酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツール酸（バルビツレート）、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、もしくは抗生物質にも、共役されてよい。
【００５０】
このような共役オリゴヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第４，８２８，９７９号明細書、米国特許第４，９４８，８８２号明細書、米国特許第５，２１８，１０５号明細書、米国特許第５，５２５，４６５号明細書、米国特許第５，５４１，３１３号明細書、米国特許第５，５４５，７３０号明細書、米国特許第５，５５２，５３８号明細書、米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書、米国特許第５，５９１，５８４号明細書、米国特許第５，１０９，１２４号明細書、米国特許第５，１１８，８０２号明細書、米国特許第５，１３８，０４５号明細書、米国特許第５，４１４，０７７号明細書、米国特許第５，４８６，６０３号明細書、米国特許第５，５１２，４３９号明細書、米国特許第５，５７８，７１８号明細書、米国特許第５，６０８，０４６号明細書、米国特許第４，５８７，０４４号明細書、米国特許第４，６０５，７３５号明細書、米国特許第４，６６７，０２５号明細書、米国特許第４，７６２，７７９号明細書、米国特許第４，７８９，７３７号明細書、米国特許第４，８２４，９４１号明細書、米国特許第４，８３５，２６３号明細書、米国特許第４，８７６，３３５号明細書、米国特許第４，９０４，５８２号明細書、米国特許第４，９５８，０１３号明細書、米国特許第５，０８２，８３０号明細書、米国特許第５，１１２，９６３号明細書、米国特許第５，２１４，１３６号明細書、米国特許第５，０８２，８３０号明細書、米国特許第５，１１２，９６３号明細書、米国特許第５，２１４，１３６号明細書、米国特許第５，２４５，０２２号明細書、米国特許第５，２５４，４６９号明細書、米国特許第５，２５８，５０６号明細書、米国特許第５，２６２，５３６号明細書、米国特許第５，２７２，２５０号明細書、米国特許第５，２９２，８７３号明細書、米国特許第５，３１７，０９８号明細書、米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書、米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書、米国特許第５，５１０，４７５号明細書、米国特許第５，５１２，６６７号明細書、米国特許第５，５１４，７８５号明細書、米国特許第５，５６５，５５２号明細書、米国特許第５，５６７，８１０号明細書、米国特許第５，５７４，１４２号明細書、米国特許第５，５８５，４８１号明細書、米国特許第５，５８７，３７１号明細書、米国特許第５，５９５，７２６号明細書、米国特許第５，５９７，６９６号明細書、米国特許第５，５９９，９２３号明細書、米国特許第５，５９９，９２８号明細書、および米国特許第５，６８８，９４１号明細書も包含するが、これらに限られない。
【００５１】
与えられる化合物における全ての位置が一様に修飾される必要はなく、実際、前述した修飾の１種より多くが、単一化合物において、もしくは、オリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドにおいてさえ、取り込まれてよい。本発明は、キメラ化合物である阻害的オリゴヌクレオチド化合物をも包含する。＜＜キメラ＞＞阻害的オリゴヌクレオチド化合物もしくは＜＜キメラ＞＞は、本発明の文脈においては、２カ所以上の化学的に区別できる領域を含有する阻害的オリゴヌクレオチドであり、各々が少なくとも１つのモノマー単位からできあがっており、つまり、オリゴヌクレオチド化合物の場合におけるヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも１領域を含有し、ここでは該オリゴヌクレオチドが修飾され、該オリゴヌクレオチドに関して、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性を増加、細胞への取り込みを増加、および／または、その標的核酸に関する結合親和性を増加させる。該オリゴヌクレオチドの追加領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡもしくはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂できる酵素の基質として働いてもよい。例として、ＲＮａｓｅＨは細胞性エンドヌクレアーゼであり、ＲＮＡ：ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ鎖を開裂させる。ＲＮａｓｅＨの活性化はこれゆえ結果的に、その標的ＲＮＡの開裂に至り、これにより大きく、遺伝子発現のオリゴヌクレオチドによる阻害効率を上昇させる。引き続き、同一標的領域にハイブリダイゼーションしているホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドに比肩される結果がしばしば、より短いオリゴヌクレオチドを用いて得られ、これはキメラオリゴヌクレオチドが使用される場合である。ＲＮＡ標的の開裂は通常どおり、ゲル電気泳動、もし必要ならば、当業界において知られる関連した核酸ハイブリダイゼーション手法により検出され得る。
【００５２】
本発明のキメラ阻害的オリゴヌクレオチド化合物は、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／または、上記のようなオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造として形成されればよい。このような化合物は、当業界において、ハイブリッドもしくはギャップマーとも言われてきた。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，０１３，８３０号明細書、米国特許第５，１４９，７９７号明細書、米国特許第５，２２０，００７号明細書、米国特許第５，２５６，７７５号明細書、米国特許第５，３６６，８７８号明細書、米国特許第５，４０３，７１１号明細書、米国特許第５，４９１，１３３号明細書、米国特許第５，５６５，３５０号明細書、米国特許第５，６２３，０６５号明細書、米国特許第５，６５２，３５５号明細書、米国特許第５，６５２，３５６号明細書、および米国特許第５，７００，９２２号明細書も包含するが、これらに限られない。
【００５３】
本発明の方法に有用な阻害オリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて合成されてもよい。本発明の阻害オリゴヌクレオチドは、取り込み、分布、および／または吸収を支援するために、他の分子、分子構造、もしくは化合物、例えば、リポゾーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所、もしくは他の製剤と追加混合され、カプセル化され、共役され、もしくは、他の様式で関連付けられてもよい。このような取り込み、分布、および／または吸収支援製剤の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，１０８，９２１号明細書、米国特許第５，３５４，８４４号明細書、米国特許第５，４１６，０１６号明細書、米国特許第５，４５９，１２７号明細書、米国特許第５，５２１，２９１号明細書、米国特許第５，５４３，１５８号明細書、米国特許第５，５４７，９３２号明細書、米国特許第５，５８３，０２０号明細書、米国特許第５，５９１，７２１号明細書、米国特許第４，４２６，３３０号明細書、米国特許第４，５３４，８９９号明細書、米国特許第５，０１３，５５６号明細書、米国特許第５，１０８，９２１号明細書、米国特許第５，２１３，８０４号明細書、米国特許第５，２２７，１７０号明細書、米国特許第５，２６４，２２１号明細書、米国特許第５，３５６，６３３号明細書、米国特許第５，３９５，６１９号明細書、米国特許第５，４１６，０１６号明細書、米国特許第５，４１７，９７８号明細書、米国特許第５，４６２，８５４号明細書、米国特許第５，４６９，８５４号明細書、米国特許第５，５１２，２９５号明細書、米国特許第５，５２７，５２８号明細書、米国特許第５，５３４，２５９号明細書、米国特許第５，５４３，１５２号明細書、米国特許第５，５５６，９４８号明細書、米国特許第５，５８０，５７５号明細書、および米国特許第５，５９５，７５６号明細書も包含するが、これらに限られず、これらの各々が、本明細書において援用される。
【００５４】
用語＜＜プロドラッグ＞＞は、非活性な形で調製される治療薬を指し示し、体内もしくはその細胞内で活性な形（つまり薬剤）に、内因性酵素もしくは他の化学物質および／または条件の作用により変換される。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ版は、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）燐酸］誘発体（ホスフェート）として調製され、１９９３年１２月９日公開されたＧｏｓｓｅｌｉｎらに対するＷＯ９３／２４５１０において、あるいは、Ｉｍｂａｃｈらに対するＷＯ９４／２６７６４および米国特許第５，７７０，７１３号明細書において開示されている方法による。
【００５５】
本オリゴヌクレオチドは、ハプテン、蛍光分子、もしくは放射性部分のような、非ヌクレオチド部分をも含み得、例えば、細胞に入ってしまったオリゴヌクレオチド量を検出もしくは定量するのに有用である。
【００５６】
好ましい実施形態においては、前記哺乳類が、糖尿病、障害性グルコース不寛容、ストレス性高血糖、代謝症候群（メタボリック・シンドローム）、および／またはインシュリン耐性を患っているかもしくは患うリスクに晒されている。
【００５７】
これらの方法は、如何なる哺乳類を用いても使用され得る。好ましくは、該哺乳類は齧歯類（例えば、ストレプトゾトシン注射マウス。認められている１型糖尿病動物モデル）。他の好ましい実施形態においては、該哺乳類はヒトである。
【００５８】
本発明は、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する方法にも関する。これらの方法は、該哺乳類に、該哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含んでいる医薬組成物を投与することを含む。これらの実施形態においては、該物質が、以降の構造ＩもしくはＩＩを含んでいる有機分子である。
【００５９】
【化４】
【００６０】
好ましくは、該有機分子が構造ＩＩを含み、式中：
【００６１】
【化５】
である。
【００６２】
上記組成物のいずれもが、過度な実験なく、ヒトを包含して哺乳類に対する投与のために、その特定の適用にふさわしいように製剤され得る。加えて、該組成物の適切な用量が、過度な実験なく、標準用量応答プロトコールを使用して求められ得る。
【００６３】
従って、経口、舌、舌下、口腔、および口腔内投与用にデザインされた該組成物は、過度な実験なく、当業界においてよく知られた手段により、例えば不活性稀釈剤を用いてもしくは食用担体を用いて調製され得る。該組成物は、ゼラチンカプセル中に閉じ込められるかもしくはタブレット（錠剤）中に圧縮されてもよい。経口治療投与目的では、本発明の医薬組成物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁、シロップ、ウェハウス、チューイングガム、および同様なものの形で使用されてもよい。
【００６４】
錠剤、ピル、カプセル、トローチ、および同様なものは、バインダー、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、および香料をも含有してよい。バインダーのある幾つかの例は、微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンも包含する。賦形剤の例は、スターチ（澱粉）もしくはラクトースも包含する。崩壊剤のある幾つかの例は、アルギン酸、コーンスターチ、および同様なものも包含する。潤滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カリウムも包含する。潤滑剤のある１例は、コロイド状二酸化硅素である。甘味料のある幾つかの例は、スクロース、サッカリン、および同様なものも包含する。香料の例は、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、および同様なものも包含する。これらの種々の組成物を調製していくに当たって使用される材料は、医薬的に純粋であり、使用量では無毒であるべきである。
【００６５】
本発明に有用な組成物は容易に、例えば、静脈内、筋内、蜘蛛膜内、もしくは皮下注射によるように、非経口投与され得る。非経口投与は、本発明の組成物を、溶液もしくは懸濁中に取り込んでいくことにより、達成され得る。このような溶液もしくは懸濁は、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒のような無菌稀釈剤をも包含してよい。非経口製剤は例えば、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、例えば、アスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、ならびに、ＥＤＴＡのようなキレート剤をも包含してよい。酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、もしくは燐酸緩衝剤のような緩衝剤、ならびに、塩化ナトリウムもしくはデキストロースのような浸透圧調整剤も、加えられてよい。本非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチックでできたアンプル、使い捨てシリンジ、もしくは多数回用量のバイアル中に閉じ込められ得る。直腸投与は、本医薬組成物を、直腸もしくは大腸中に投与していくことを包含する。これは、坐薬もしくは浣腸を使用して達成され得る。坐薬製剤は容易に、当業界において知られている方法により、調製され得る。例えば、坐薬製剤は、グリセリンを約１２０℃まで熱していき、該グリセリンに本組成物を溶解させていき、ここで、精製水が加えられてもよく、その後、熱せられた該グリセリンを混合し、そして、この熱い混合物を坐薬の型中に注いでいくことにより、調製され得る。
【００６６】
経皮投与は、皮膚を通した本組成物の経皮吸収を包含する。経皮製剤は、パッチ（例のよく知られたニコチンパッチのような）、外用薬、クリーム、ゲル、軟膏、および同様なものを包含する。
【００６７】
本発明は、前記哺乳類に、治療有効量の本組成物を鼻から投与していくことも包含する。本明細書において使用される場合、鼻から投与もしくは経鼻投与は、本組成物を、患者の鼻道もしくは鼻腔の粘膜に投与していくことも包含する。本明細書において使用される場合、組成物の鼻からの投与用医薬組成物は、治療有効量の本組成物も包含し、例えば、鼻用スプレー、鼻用ドロップ、懸濁、ゲル、外用薬、クリーム、もしくは粉末として投与されるべく、よく知られている方法により調製される。本組成物の投与は、鼻栓もしくは鼻用スポンジを使用しても行われてよい。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態では、該哺乳類が、糖尿病、あるいは、糖尿病もしくは糖尿病リスクと関連した病状、例えば、グルコース不寛容障害、ストレス高血糖、メタボリック・シンドローム、および／またはインシュリン耐性を患っているかもしくは患うリスクに晒されている。
【００６９】
本発明は、如何なる哺乳類、例えば、糖尿病実験モデルとして一般的に使用される齧歯類（実施例参照）、もしくは、ヒトに関しても、利用され得る。
【００７０】
ＭＩＦ活性もしくは発現を阻害する化合物が、１型糖尿病処置に有用であるとの発見は、ＭＩＦ阻害活性を目指す化合物スクリーニングが、１型糖尿病を予防するかもしくは処置する能力を求めて化合物を同定するのに使用され得ることを指し示す。これゆえ、ある幾つかの実施形態では、本発明は、化合物が１型糖尿病を予防するかもしくは処置するのに有用であるかどうか評価していく方法に関する。本方法は、以降の２ステップ：
（ａ）化合物が、マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を、哺乳類において阻害するかどうか決定していき、次いでもし該化合物がＭＩＦを阻害すれば
（ｂ）該化合物が、１型糖尿病の進展を阻害するかどうか決定していくステップ
を含む。
【００７１】
これらの方法では、試験化合物のＭＩＦ活性を阻害する能力が、如何なる既知の手順によってでも求められ得る。非限定例は、米国特許出願公開２００３／０００８９０８および２００３／０１９５１９４において記載される方法も包含する。同様に、如何なる既知の手順も、１型糖尿病への化合物の効果を評価するために、利用され得る。好ましい実施形態では、１型糖尿病への化合物の効果は、多数回低用量ストレプトゾトシン投与を利用しての動物モデルにおける、もしくは、ＮＯＤマウスのような１型糖尿病の進展に遺伝子的に感受性の動物モデルにおける糖尿病の進展への該化合物の効果を評価して、求められる。このようなモデルにおける糖尿病の進展への試験化合物もしくは製剤の効果は、種々の便利な方法により、例えば、該哺乳類における循環グルコースもしくは脾臓リンパ球増殖をモニターしていくことにより、査定されることがある（実施例も参照）。
【００７２】
これらの方法は、如何なる特定タイプの化合物の評価にも限られない。これらの方法により評価され得る化合物の例は、酵素、もしくは、抗体結合部位を含む蛋白のような、オリゴペプチドもしくは蛋白；アンチセンス化合物、リボザイム、アプタマー、ｓｉＲＮＡのような干渉ＲＮＡのような核酸もしくは模倣体も包含する。好ましい実施形態では、該化合物が、１０００ダルトン未満の有機分子であり、構造Ｉもしくは構造ＩＩを持っており、前に定義されたとおりである。
【００７３】
更なる実施形態では、本発明はキットに関し、（ａ）前記哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含んでいる医薬組成物、ならびに、（ｂ）該組成物を該哺乳類に投与するための説明書を含んでおり、ここで該物質が、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである。これらの実施形態では、該哺乳類が、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている。
【００７４】
更なる実施形態では、本発明は他のキットに関し、（ａ）前記哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含んでいる医薬組成物、ならびに、（ｂ）該組成物を該哺乳類に投与するための説明書を含んでいる。これらの実施形態では、該哺乳類が、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている。これらの実施形態の本医薬組成物は、以降の構造ＩもしくはＩＩを含んでいる有機分子である。
【００７５】
【化６】
【００７６】
本発明は、前記哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質の、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類の処置用の医薬品の製造のための使用にも関し、ここで該物質が、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである。
【００７７】
加えて、本発明は、前記哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質の、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類の処置用の医薬品の製造のための使用に関する。これらの実施形態では、該物質が、以降の構造ＩもしくはＩＩを含んでいる有機分子である。
【００７８】
【化７】
【実施例】
【００７９】
以下の実施例が提示され、更に本発明の組成物および方法を例示するが、本発明を限定しているとして解釈されるべきでなく、添付の請求項において描写される。反対に指し示されなければ、本実施例における全ての部および％は重量基準であり、全ての測定値は約２３℃において得られた。
【００８０】
実施例１．マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）活性の中和が、実験自己免疫糖尿病を減弱させる
実施例の要約
原炎症サイトカイン、マクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）は、軸となる役割を、幾つかの炎症および自己免疫疾患において演じる。ＭＩＦｍＲＮＡ発現は、非肥満糖尿病マウスにおいてアップレギュレーションされるが、尚僅かしか、１型糖尿病レギュレーターとしての潜在的なポテンシャルについて知られていない。ここで、我々は、ＭＩＦ蛋白が、多数回低用量ストレプトゾトシンによりマウスにおいて誘発された実験糖尿病の進展の間に、膵島細胞において顕著に上昇されることを示す。ＭＩＦに対する中和抗体、もしくは、薬理的ＭＩＦ阻害剤（Ｓ，Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソキサゾール酢酸メチルエステル（ＩＳＯ−１）のような例示的なＭＩＦ阻害剤を用いたＭＩＦ活性の減衰は顕著に、膵島における組織病理学的変化（病変）を抑え、高血糖の進展を抑え、１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する本方法の一般的な有用性を示している。観察された有益な効果は、自己反応性リンパ球の増殖および接着の抑制、ｉＮＯＳ発現のダウンレギュレーション、ならびに、膵島および腹腔マクロファージによるＮＯおよびＴＮＦ−αの分泌に帰属され得るが、これらの機序の繋がりの知識は、本発明の教示には必須ではない。本研究は、１型糖尿病の病理におけるＭＩＦに関する決定的な役割を定義し、新たな治療戦略を同定し、自己免疫プロセスを多段階において減衰させる。
【００８１】
はじめに
ＭＩＦが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、および酸化窒素（ＮＯ）（１９）のような、１型糖尿病（ＤＭ）の病理に含まれている他の原炎症サイトカインおよび可溶性メディエーターの合成をも刺激するとの観察は、ＭＩＦ活性の阻害が、疾患の進展を調節するかも知れないとの可能性を喚起した。
【００８２】
はじめに
マクロファージおよびＴ細胞両方により仲介される免疫応答におけるＭＩＦの中心的な制御の役割が与えられれば、我々は、多数回低用量ストレプトゾトシン（ＭＬＤ−ＳＴＺ）処置されたマウスにおける糖尿病の進行の間のＭＩＦ発現、ならびに、ＭＩＦ活性の中和のこの疾患の進展への影響を研究してきた。これらは、ヒトでのよく認められた１型糖尿病モデルである。この目的では、抗ＭＩＦポリクローナル抗体が、（Ｓ，Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソキサゾール酢酸メチルエステル（ＩＳＯ−１）、ＭＩＦの薬理的阻害剤（２０）同様、ＳＴＺを用いた挑戦前に、予防処置としてマウスに与えられた。ＤＭの病理に関する種々の免疫学的パラメーターが求められ、自己反応性細胞増殖および接着ならびに原炎症メディエーター産生も包含していた。我々の知る限り、これが最初の試みであり、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＩＦの中和により、自己免疫糖尿病において干渉させる。
【００８３】
材料および方法
マウス
ＩｎｂｒｅｄＣＢＡ／Ｈマウスが、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｌｇｒａｄｅにある我々自体の飼育コロニーから得られた。ＩｎｂｒｅｄＣ５７Ｂ１／６マウスは元来、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｃａｌｃｏ、Ｉｔａｌｙ）から購入され、次いで、４世代までの間、兄弟姉妹間交配により飼育された。マウスは、標準的な実験室条件下におかれ、食物および水に自由にアクセスできた。該マウスの取り扱いおよび研究のプロトコールは、Ｌｏｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより（動物愛護の点から良いものと）認められた。
【００８４】
試薬
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Ｓ−０１３０）、スルファニラミド、ナフチレンジアミン二塩酸、および非罹患性ウサギＩｇＧが、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入された。抗マウスＭＩＦＩｇＧが、マウスＭＩＦに対して惹起されたウサギ血清から調製され、蛋白Ａ親和性クロマトグラフィーにより、製造元（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の説明書に従って精製された。（Ｓ，Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソキサゾール酢酸メチルエステル（ＩＳＯ−１）が、前に記載されたように（２０）合成された。
【００８５】
糖尿病の誘発およびｉｎ ｖｉｖｏでの処置
糖尿病が、成雄マウスにおいて誘発され、多数回の毒性を下回る用量のストレプトゾトシン（ＭＬＤ−ＳＴＺ、４０ｍｇ／体重ｋｇ／日、ｉ．ｐ．投与、５日間連続）を、記載のとおり（２１）投与された。抗ＭＩＦポリクローナル抗体のインパクト（効果）が、マウス（５〜１０匹／処置群）の、５ｍｇ／ｋｇの抗マウスＭＩＦウサギＩｇＧ抗体での、３、１、２、および５日の日のｉ．ｐ．投与により、最初のＳＴＺ用量に関して研究された。ＩＳＯ−１の効果は、当該薬剤のｉ．ｐ．投与により、用量１ｍｇ／マウス／日において、１４日間連続研究され、ＳＴＺの最初の注射３日前に開始された。コントロールの動物は、非免疫ＩｇＧもしくは稀釈ＩＳＯ−１（ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ）を与えられた。マウスは、グルコース測定器（Ｓｅｎｓｉｍａｃ、登録商標、Ｉｍａｃｏ、Ｌｕｄｅｒｓｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、血中グルコースレベルの週毎の測定により、糖尿病に関してモニターされた。臨床的な糖尿病は、非肥満の動物における高血糖（血中グルコース１１．８ｍモル／Ｌ）により定義された。
【００８６】
細胞のインキュベートおよび原炎症メディエーターの決定
定住個体の腹腔細胞（ＰＣ）、脾臓単球細胞（ＳＭＮＣ）、および膵島が、個々の、抗ＭＩＦＩｇＧ処置、ＩＳＯ−１処置、もしくはコントロールマウスから、ＳＴＺの最初の注射後１５日に、同様に、正常非処置動物から単離された。ＳＭＮＣ（５×１０６／ウェル）はＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により調製され、定住個体のＰＣ（２．５×１０６／ウェル）は冷ＰＢＳでの腹腔洗浄により収集され、もしくは、膵島（１５０〜２００膵島／ウェル）は記載されるとおり（２２）コラゲナーゼによる消化および密度勾配精製により調製され、２４ウェルＬｉｍｂｒｏ培養プレート中においてインキュベートされ、１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培養培地中においてであり、５％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を含有しており、細胞の上清が、４８時間後に収集された。培養上清における生物活性なＴＮＦ−αの濃度が求められ（以前に記載されたとおり、２２）、アクチノマイシンＤ処理フィブロサルコーマ細胞株Ｌ９２９を用いた細胞溶解バイオアッセイを使用した。ＮＯ産生の指標たる亜硝酸（塩）の蓄積が、細胞培養上清中において、Ｇｒｉｅｓｓ反応を使用して求められた。細胞内ＭＩＦ、ＩＦＮ−γ、ＭＨＣ（クラス）ＩＩ、もしくはｉＮＯＳの発現が、細胞主体の僅かに修飾されたＥＬＩＳＡプロトコール（２３）により求められた。脾臓ＭＮＣ（５×１０５／ウェル）もしくはＰＣ（２．５×１０５／ウェル）が、ポリ−Ｌ−リジンにより予備コーティングされた９６ウェルマイクロプレートに接着するようにされた。４％パラホルムアルデヒドでの固定化およびＰＢＳ中０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｔ／ＰＢＳ）での洗浄後、内因性過酸化酵素が、Ｔ／ＰＢＳ中１％Ｈ２Ｏ２を用いてクウェンチされ、反応が１時間、３７℃において、Ｔ／ＰＢＳ中１０％ＦＢＳを用いてブロックされた。引き続き、細胞が１時間、３７℃において、ウサギ抗マウスＭＩＦＩｇＧ、ラット抗マウスＩＦＮ−γ（Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）、マウス抗マウス／ラットＭＨＣ（クラス）ＩＩ（ＭＣＡ４６Ｒ、Ｓｅｒｏｔｅｃ）、もしくは、ウサギ抗マウスｉＮＯＳ（シグマ）を用いて、１％ＢＳＡ含有Ｔ／ＰＢＳ中においてインキュベートされた。洗浄後、これら細胞が１時間、対応している２次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ、ヤギ抗ラットＩｇ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ、もしくはヤギ抗マウスＩｇ（Ｆ（ａｂ’）２−特異的）−ＨＲＰ）と共にインキュベートされ、再び洗浄され、１５分間暗所室温において、０．４ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ（シグマ）、１１．８ｍｇ／ｍＬのＮａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ、７．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸、および０．０１５％Ｈ２Ｏ２含有溶液５０μＬと共にインキュベートされた。該反応は、３ＮのＨＣｌを用いて停止され、その吸光度が、Ｔｉｔｅｒｔｅｋマイクロプレート読み取り機（Ｆｌｏｗ）において、４９２ｎｍにおいて測定された。
【００８７】
Ｅｘ ｖｉｖｏでのリンパ増殖応答および接着アッセイ
ＳＭＮＣの自然な増殖が、１μＣｉの３Ｈ−チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ、ＩＣＮ）を有する９６ウェルマイクロプレート中の、各動物個体からの細胞（５×１０５／ウェル）のインキュベートにより求められた。取り込まれた放射能が、２４時間後、Ｂｅｃｋｍａｎ液体シンチレーションカウンター中において測定された。ＳＭＮＣ（２．５×１０５／ウェル）の、単層Ｌ９２９線維芽細胞もしくはプラスチックへの自然接着の分析が、クリスタルバイオレットアッセイを前に記載されたように（２１）使用して実施された。接着細胞数に対応している吸光度が、５７０ｎｍにおいて測定された。
【００８８】
抗体およびフローサイトメトリー
脾臓ＭＮＣ（１×１０６）が、ラット抗マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、抗ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ−１）フィコエリトリン（ＰＥ）、もしくは抗ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体α鎖、ｐ５５）−ビオチン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、次いでストレプタビジン−ＰＥ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と共にインキュベートされた。ＳＭＮＣの各細胞の懸濁は、同一実験群から糖尿病誘発１５日後に得られた３〜５匹の動物ならびに正常な非処理マウスからプールしたものであった。細胞表面マーカー発現が、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＷｉｎ ＭＤＩ ２．８ソフトウェア（Ｊｏｓｅｐｈ Ｔｒｏｔｔｅｒ）を用いて分析された。
【００８９】
膵臓の組織学的および免疫組織学的検査
膵臓が、中性に緩衝化されたホルマリン中において固定され、次いで、パラフィン中に埋められた。この固定された塊が切開され（７μｍ厚）、ヘマトキシリンおよびエオシン染色が実施され、炎症変化の発症および程度を査定した。インシュリン炎のスコア化が実施され（以前に記載されたとおり、１０、１１）、マウスにつき少なくとも１５の膵島を検査していき、盲検的に、以降のように格付けされた。
０ 浸潤なし
１ 腺管周囲の浸潤
２ 膵島周囲の浸潤
３ 膵島内への浸潤
４ β細胞の破壊を伴う膵島内への浸潤
少なくとも１５の膵島が、各マウスにつき数えられた。各膵臓に関する平均スコアが、その合計スコアを検査膵島数で割って算出された。インシュリン炎スコア（ＩＳ）は、平均値±ＳＤとして表現される。免疫組織学が、パラフィンに埋められたホルマリン固定組織の切片において実施され、以前に記載されたマイクロ波主体の方法（２４）を使用した。ＭＩＦの免疫染色に関しては、ポリクローナルウサギ抗ＭＩＦＩｇＧおよびコントロールウサギＩｇＧが使用された。膵島の検査面積が概算され、ＭＩＦ＋膵島細胞の％が、定量的画像分析システム（Ｏｐｔｉｍａ６．５、Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎａｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＭＤ）を使用して測定された。
【００９０】
統計解析
血中グルコース値が、平均値±ＳＥとして示される。統計解析が、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ較正およびＦｉｓｈｅｒ精密度検定を有するＡＮＯＶＡにより実施された。他の値は、平均±ＳＤとして表現され、データ群が、Ｓｔｕｄｅｎｔ組み合わせｔ検定を使用して比較された。同様な結果の少なくとも３回の別々の実験の代表例の結果が、表示される。統計的な有意差は、Ｐ＜０．０５に設定された。
【００９１】
結果
ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発糖尿病マウスにおけるＭＩＦ発現の増加
最近の研究が、ＭＩＦｍＲＮＡ発現が、自然発症糖尿病ＮＯＤマウスにおいてアップレギュレーションされることを明らかにしているが、糖尿病の進行におけるその役割は、知られていない。ＭＩＦ蛋白発現レベルが、免疫炎症糖尿病の間に代えられるかどうかを決定するために、ＭＬＤ−ＳＴＺが、糖尿病感受性ＣＢＡ／Ｈマウスに投与された。免疫組織化学が、この疾患の経過の間に、これらのマウスからの膵臓切片における膵島細胞によるＭＩＦ蛋白発現の実質的な誘発、ならびに、単核細胞の浸潤を明らかにした（図１Ｂ〜Ｄ）。同様に、非糖尿病コントロールマウスに比べてより高濃度のＭＩＦが、糖尿病マウスの腹腔細胞（ＰＣ）において検出された（図１Ｅ）。疾患誘発の間の、抗ＭＩＦ免疫中和グロブリンでのｉｎ ｖｉｖｏでのマウスの処置が顕著に、ＰＣでのＭＩＦ発現を抑えた（図１Ｅ）。これゆえ、ＤＭ誘発の結果として、ＭＩＦ蛋白含量の増加が、末梢レベルおよび標的組織レベル両方において観察され、ＭＩＦ蛋白レベルが、抗ＭＩＦ抗体投与により減弱され得る。
【００９２】
抗ＭＩＦ予防薬は、ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発糖尿病の、臨床的および組織学的パラメーターを抑える
ＭＩＦ活性阻害が、ＭＬＤ−ＳＴＺに晒されたマウスにおける糖尿病を調節するかどうか決定するために、我々は第１に、ＭＩＦに対する中和ポリクローナル抗体の効果を、２つのＤＭ感受性同系交配系統マウスにおいて研究した。Ｃ５７Ｂ１／６およびＣＢＡ／Ｈコントロールマウス両方が、ＰＢＳもしくは非免疫ＩｇＧを用いて処置され、ＭＬＤ−ＳＴＺ注射後の２週間に亘り、持続した高血糖を進展させた。ＭＬＤ−ＳＴＺは、異なる程度の高血糖を、２系統のマウスにおいて誘発させたが、−３〜＋５日の抗ＭＩＦＡｂでのＣ５７Ｂ１／６マウス（図２Ａ）もしくはＣＢＡ／Ｈマウス（図２Ｂ）の処置は顕著に、ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発高血糖を阻害した。加えて、膵臓の見本の組織学的検査が、この疾患の１５日後に実施され、膵島の浸潤の程度が顕著に、非罹患性ＩｇＧを用いて処置された糖尿病コントロールマウスと比べて、抗ＭＩＦ抗体を用いて処置されたマウスにおけるよりも低かったことを指し示した（図２ＣおよびＤ）。我々は、ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発ＤＭにおけるＭＩＦアンタゴニストＩＳＯ−１（２０）の薬理効果も検査した。従って、我々は、マウスを予防的に１４日の期間に亘り、ＩＳＯ−１を用いて処置し、５回のＳＴＺ注射のうちの最初の３日前に開始した。これらのマウスは、８週の実験期間を通して、正常血糖のままであった（図２Ｂ）。ＭＩＦの免疫的もしくは薬理的中和の抗糖尿病原性効果は長く継続し、５８日のフォローアップ期間全体を通して、変動は限られていた（図２ＡおよびＢ）。ＩＳＯ−１によるＭＩＦのブロックが、膵島の炎症を減弱させた（図２Ｄ）。これらのデータは、免疫炎症ＤＭの誘発および進行におけるＭＩＦの決定的な役割、ならびに、リスク集団における１型糖尿病の進展をそらすＭＩＦ阻害剤での処置の有用性に関する証拠を与える。
【００９３】
抗ＭＩＦ処置は、脾臓細胞増殖および接着特性を抑える
抗ＭＩＦ処置の細胞への効果を理解するために、ＣＢＡ／Ｈマウスからの脾臓単核細胞（ＳＭＮＣ）の機能の特徴のｅｘ ｖｉｖｏでの分析が、高血糖１５日後の初期高血糖の進行の間に、実施された。糖尿病マウスから単離された自己反応性リンパ球が、健康な動物から単離された細胞に比べて顕著に、ｅｘ ｖｉｖｏでの自然増殖の増加を呈することを、以前の研究が示しており、このタイプの細胞が、疾患の進行に寄与するかも知れないことを示唆している（２１、２２）。ＭＩＦ阻害剤が、脾臓細胞増殖応答を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて調節するかどうか決定するために、糖尿病ＣＢＡ／Ｈマウスが、抗ＭＩＦ抗体もしくはＩＳＯ−１で処置され、ＭＬＤ−ＳＴＺに晒した１５日後に安楽死させられ、脾臓細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏでの分析用に採取された。ＭＬＤ−ＳＴＺに晒したマウスの抗ＭＩＦ抗体での処置は顕著に、糖尿病関連ＳＭＮＣ増殖を阻害した（３Ｈ−チミジン取り込みが、糖尿病のコントロールの細胞の６３６５１±１０１５７ｃｐｍに対し、２９７８２±３６９４ｃｐｍであった。図３Ａ）。同様に、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩＳＯ−１でのＭＩＦ活性阻害は、脾臓細胞増殖を、コントロールレベル近くにまで逆行させた（非処置のコントロールの細胞の２１１５０±１２７２３ｃｐｍに比べ、２５６３７±２０１８ｃｐｍ。図３Ａ）。細胞増殖に加え、細胞−細胞接着が、ＣＤ１１ｂとＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）との間の相互作用により仲介されるのであるが、１型ＤＭの免疫プロセスに参画する（２１、２５）。糖尿病プロセスに参画している細胞間の相互作用への抗ＭＩＦ処置の可能な結果を決定するために、我々は、ＳＭＮＣの接着特性を主張し、プラスチックへの細胞の自然接着が、線維芽細胞への接着同様顕著に、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＭＩＦＩｇＧもしくはＩＳＯ−１での処置により阻害されたことを見出した（図３Ｂ）。接着性のダウンレギュレーションが、ＣＤ１１ｂ発現の変化と関連しており、フローサイトメトリー分析により明らかにされたとおりであり、ＣＤ１１ｂに対して向けられた抗体を使用し、これは、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）への細胞接着を仲介する分子である。これゆえ、コントロールの糖尿病マウス由来のＳＭＮＣに比べて、抗ＭＩＦＩｇＧ処置およびＩＳＯ−１処置両方が（表１）、ＣＤ１１ｂ＋ＳＭＮＣ頻度および平均抗原密度（平均蛍光強度、ＭＦＩ）を、非処置正常マウスレベルまで抑え、ＭＩＦ阻害剤での処置の抗糖尿病原性に対する有益性を指し示していた。
【００９４】
【表１】
【００９５】
ＩＬ−２は、如何なる免疫応答開始においても、中心的に含まれているので、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ、ＣＤ２５）系との相互作用をブロックすることによりその作用をなくしていくことが、齧歯類およびヒトの疾患両方における免疫介入のための可能な治療標的として、多くの注意を得ている（２６）。抗ＣＤ２５も、マウスにおける低用量ストレプトゾトシン誘発糖尿病を減弱させると示されている（１２、２６）。ＩＬ−２Ｒ＋細胞集団への、ＭＩＦアンタゴニストを用いたｉｎ ｖｉｖｏでの処置の効果を求めるために、リンパ球が、コントロール、もしくは、ＭＬＤ−ＳＴＺに晒されて１５日後の抗ＭＩＦ処置マウスの膵臓から単離され、ＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）に対して向けられた蛍光タグを付けられた抗体で標識された。これらの細胞をＩＬ−２Ｒ発現に関して染色すると（表１）、正常な非処置動物に比べた場合、コントロールの糖尿病マウスにおけるＩＬ−２Ｒ＋リンパ球の％および抗原密度両方において、顕著な増加が明らかにされ、一方、抗ＭＩＦＩｇＧもしくはＩＳＯ−１でのｉｎ ｖｉｖｏでの処置が、これらのパラメーターを抑えた。
【００９６】
原炎症メディエーター産生
原炎症メディエーターは、齧歯類における１型ＤＭにおいて、重大な役割を演じるので（４〜７、２１、２２）、我々は、局所および末梢免疫細胞両方からのＳＴＺ関連サイトカイン放出へのＭＩＦ阻害効果を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて求めた。抗ＭＩＦＩｇＧでの内因性ＭＩＦ蛋白の免疫的中和（図４Ａ）もしくはＩＳＯ−１でのＭＩＦの薬理的阻害（図４Ｂ）が、脾臓ＭＮＣ、腹腔マクロファージ、および膵島細胞によるＴＮＦ−α産生をダウンレギュレーションし、これを、健康な非処置マウスレベルまで低下させた。我々は、細胞内でのｉＮＯＳの発現が顕著に、抗ＭＩＦもしくはＩＳＯ−１で処置された動物から単離されたマクロファージにおいて、相対的に高発現のｉＮＯＳの糖尿病の動物に比べて抑えられたことをも見出した（図５Ａ）。従って、ＭＩＦのブロックが、マクロファージならびに膵島における引き続いてのＮＯ産生を廃止させた（図５Ｂ）。ＭＩＦ阻害剤の効果が、ＴＮＦ−α、ｉＮＯＳ、およびＮＯに特異的であったが、これは、脾臓細胞における細胞内ＩＦＮ−γ発現が、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現同様、コントロールの糖尿病マウスに比べて変わらないままであったからである（図６ＡおよびＢ）。
【００９７】
議論
ＭＩＦは顕著に、過剰炎症および自己免疫と関連した免疫病理に寄与し、内因性ＭＩＦを、中和抗ＭＩＦ抗体、もしくは、ＭＩＦ遺伝子の標的とされた破壊で中和しており、数種類の炎症疾患の齧歯類モデルの進展を阻害し、免疫誘発腎疾患（２７）、リーシュマニア（２８）、グラム陰性およびグラム陽性敗血症（１５、２９、３０）、抗原誘発関節炎（３１）、結腸炎（１６）、ならびに実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ、１７）も包含している。最近、自己免疫の仲介によるＤＭの進展および病理におけるＭＩＦに関する潜在的な役割が、元より糖尿病のＮＯＤマウスにおいて示唆されてきており、これは、ＭＩＦｍＲＮＡ発現が顕著に、疾患の進展の間に増加されるからであり、外因性ＭＩＦ投与が、これらの動物における疾患の発症を増加させる（１８）。ＭＩＦは構造的に発現され、膵臓β細胞から、インシュリンと一緒に分泌され、オートクリンの因子として振る舞い、インシュリン放出を刺激する（３２）。インシュリン分泌の誘発が、β細胞上での発現および免疫細胞に対する抗原提示をしやすくすることにより、機能活性が増強される場合アップレギュレーションされる免疫炎症糖尿病原性経路に寄与すると考えられるので（１２）、この＜＜ホルモン＞＞特性が、内因性ＭＩＦを、β細胞不全および破壊初期の現象に巻き込んでいく更なる重要な因子を代表し得ると考えられる。内因性ＭＩＦを標的とするとこれゆえ、１型糖尿病の病理におけるこのサイトカインの役割を解明するのに、ならびに、この病状の治療および／または予防処置に、適切なアプローチであるかも知れない。
【００９８】
本研究において、我々は初めて、内因性ＭＩＦが、マウス自己免疫糖尿病の進展において鍵となる役割を演じることを示す。ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発糖尿病の進行が、アップレギュレーションされたＭＩＦ蛋白発現を、膵島および末梢細胞両方において伴った。抗ＭＩＦＩｇＧによるＭＩＦの免疫の中和化、または、ＭＩＦ活性のＩＳＯ−１による薬理的阻害は顕著に、この疾患の臨床的および組織学的発症を減弱させた。炎症応答ならびに脾臓細胞増殖および接着を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて阻害した。両薬剤の抗糖尿病原性効果は長く継続し、これはマウスが、８週のフォローアップ期間、正常血糖のままであったからである。自己反応性Ｔ細胞増殖、白血球接着、および、標的組織中への転移の阻害、ならびに、これら抗ＭＩＦ戦略によるマクロファージの活性化は、ＭＩＦ活性の免疫的もしくは薬理的中和が、病原性自己免疫応答を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて減弱させることがあることを示唆する。
【００９９】
Ｔ細胞の活性化および転移におけるＭＩＦの役割と一致して（３０、３３）、我々は、ＭＩＦのブロックが有意に、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて測定されたＩＬ−２Ｒ発現および脾臓リンパ球の自然増殖を減少させることを見出し、これは最も恐らく、ＳＴＺによるβ細胞の破壊の際に放出された骨髄膵臓抗原に対する自己反応性Ｔ細胞応答を反映した（２１、２２）。これらの結果はこれゆえ、ＭＩＦが、自己反応性Ｔ細胞クローンのサイズに寄与すること、ならびに、糖尿病原性Ｔクローンの拡大をブロックすると一部、これら抗ＭＩＦ戦略の保護的効果に応答性かも知れないことを指し示す。
【０１００】
自己反応性細胞のクローンの拡大に加えて、該疾患の進展は、自己免疫応答の誘発および遠心相両方における接着受容体およびリガンドにより仲介される細胞−細胞相互作用により決定される。この文脈においては、我々は、ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発糖尿病マウスからの単核細胞が高度に、培養血管内皮細胞（２１）もしくは線維芽細胞（図３Ｂ）に、疾患活動ピーク時において接着性であることを示している。これらの接着特性は、標的組織の炎症浸潤に重要なメカニズムかも知れない（２１）。幾つかの系列の証拠が、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）への細胞接着を仲介する（３４）ＣＤ１１ｂのアップレギュレーションが、１型ＤＭの免疫学的進展に参画している細胞間の相互作用に、機能的な結果を持つかも知れないことを実証する（２１、２５）。ＭＩＦのブロックが顕著に、糖尿病マウスの単核細胞上でのＣＤ１１ｂ発現を阻害し、顕著に白血球の接着特性をダウンレギュレーションしたが、このことは、抗ＭＩＦ戦略が、これらの細胞の膵島への帰還を妨げるかも知れず、これゆえ、ＭＩＦのブロックの治療の有益性に寄与していることを示唆している。この仮定を裏付けるように、組織学的分析が、抗ＭＩＦマウスにおけるインシュリン炎の抑制を示した。ＭＩＦ活性阻害も、ＥＡＥにおける接着分子依存性の標的組織の病理をダウンレギュレーションすると示されている（１７）。
【０１０１】
この研究のもう１つ別の重要な知見は、抗ＭＩＦ処置が、原炎症性および細胞毒性メディエーターの産生に影響を及ぼすことである。ＴＮＦ−αおよびＮＯのより低い局所的な産生が結果的に、膵臓中への炎症細胞流入の抑制から得られることがある。我々のｅｘ ｖｉｖｏでの知見に基づけば、しかしながら、腹腔および／または脾臓細胞による、ＴＮＦ−α、ｉＮＯＳ、およびＮＯのダウンレギュレーションにより示唆されるように、ＭＩＦのブロックも直接、マクロファージおよびＴ細胞のエフェクターとしての機能に影響するかも知れないように思われる。このことは、これらのメディエーター産生に干渉するｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗ＭＩＦ抗体の能力（２８）と一致している。ＭＩＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＮＦ−αならびに反応性酸素種および窒素代謝物の産生をアップレギュレーションする（３５）。これゆえ、ＭＩＦの仲介によるｉＮＯＳ発現およびＴＮＦ−α合成の直接のブロックが、組織損傷原炎症メディエーターの１型ＤＭにおけるダウンレギュレーションに寄与するかも知れないことに思い至る。これゆえ、我々は、ＭＬＤ−ＳＴＺによるＤＭ処置におけるＭＩＦのブロック効率が、Ｔ細胞およびマクロファージならびに膵島細胞の自己免疫および／または炎症応答への阻害効果によるものと仮定する。
【０１０２】
興味深いことに、ＭＩＦの全身でのブロック効果は特に、ＴＮＦ−αおよびｉＮＯＳ仲介ＮＯ産生を、局所および末梢の両方の細胞において阻害したが、これは、これらの治療アプローチが、象徴的なＴｈ１サイトカインたるＩＦＮ−γの末梢での産生を消去しなかったからである。ＭＨＣクラスＩＩの制御におけるＩＦＮ−γに関する役割と一致して、腹腔および脾臓の細胞による抗原の発現は、抗ＭＩＦ処置後に障害されなかった。これらの観察は、糖尿病の病理におけるＩＦＮ−γに関する中心的な役割を実証している以前の知見（３６）に反するように見えるが、末梢でのサイトカイン産生が、器官特異的自己免疫疾患の進展におけるサイトカインの役割を鏡に映す（反映する）のではないのかも知れないことが、特記されなくてはならない。例えば、我々は以前に、ＤＰ−ＢＢラットモデルにおいて、明らかに矛盾して、抗ＩＦＮ−γ抗体および外から投与されたＩＦＮ−γ両方が、自己免疫疾患の進展を予防したことを示している（１０、３７）。ＥＡＥに関して最近報じられたように、抗ＭＩＦ抗体処置は、ＩＦＮ−γの、抗原特異的脾臓細胞産生に影響を及ぼさなかったが、標的組織における抗原反応性Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γ放出を抑えた（１７）。これゆえ、我々のモデルにおける抗ＭＩＦ処置が、膵臓のミクロな環境内でのサイトカイン産生を抑えたが、この効果が、我々のｅｘ ｖｉｖｏの分析において反映されなかったかも知れないことがあり得る。この裏付けにおいて、我々は以前に、ＭＬＤ−ＳＴＺ誘発１型糖尿病における、全身に適用される異なる薬剤によるＩＦＮ−γ発現およびＭＨＣクラスＩＩ＋細胞の分布の、同様な調節パターンを示している（２１、２２）。ＩＦＮ−γが、炎症への効果を保有するかも知れず、免疫応答により標的とされる器官レベルにおいて（例えば、膵島のミクロな環境）産生される場合、原炎症効果を発揮している一方、コルチコステロイド依存性および非依存性抗炎症経路を、全身レベルにおいて活性化していることが知られている（８）。グルココルチコイドの免疫抑制効果に反作用するＭＩＦの深遠な能力を心に留めておくと（３８）、ＩＦＮ−γの循環濃度の維持を伴うＭＩＦ活性の中和は、処置動物において、全身の抗炎症効果を潜在化し得ると思われる。
【０１０３】
ＭＩＦは、炎症および自己免疫疾患の決定的なメディエーターであるが、これは、内因性ＭＩＦ活性を抗ＭＩＦ抗体を用いて中和させることが、敗血症ショック、結腸炎、脳脊髄炎、およびリーシュマニア感染（１５〜１７、２８）の動物モデルにおいて効果的であり、ヒトの種々の疾患の治療に向けての確約されているアプローチであるかも知れないからである。しかしながら、ヒト化抗体も包含して外から投与される蛋白に頼る処置アプローチは、潜在的な免疫原性も包含して幾つかの挑戦に面することがあり、このことは、より好ましい実施形態が望まれることを示唆する。抗サイトカイン抗体は、サイトカイント小さな炎症性複合体、これにより、再燃し得る炎症応答（３９）を形成し得る。これらの理由により、抗ＭＩＦＩｇ調製物の治療での使用に代わるものも、医薬の発展のためと考えられるべきである。これゆえ、ＭＩＦ互変異化酵素および生物活性を阻害する薬剤のような小分子として（２０）、ＩＳＯ−１による薬理的介入が、ＭＩＦ関連疾患処置に向けてのより好ましいアプローチであることがある。更なる研究が、ＭＩＦ阻害剤の、糖尿病の病理および発症の制御用の予防薬というよりもむしろ、治療薬としての潜在的な使用に向けられることとなろう。
【０１０４】
実施例２．糖尿病誘発後の遅れたＭＩＦ阻害
実施例１において記載された方法を使用して、糖尿病が、成雄マウスにおいて誘発され、多数回の毒性を下回る用量のストレプトゾトシン（ＭＬＤ−ＳＴＺ、４０ｍｇ／体重ｋｇ／日、ｉ．ｐ．投与、５日間連続）を、記載のとおり（２１）投与された。糖尿病誘発後のＭＩＦ阻害効果が、ＭＩＦの薬理的阻害剤（２０）たる（Ｓ，Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソキサゾール酢酸メチルエステル（ＩＳＯ−１）の、用量１ｍｇ／マウス／日における１４日間連続のｉ．ｐ．注射により研究され、ストレプトゾトシンの最初の投与７日後に開始された。腹腔血中グルコースが、これらのマウスにおいて、および、ＩＳＯ−１処理が稀釈ＩＳＯ−１により置き換えられた場合を除き、同一に処置されたコントロールマウスにおいて、週毎にモニターされた。
【０１０５】
図７および８において示されるように、糖尿病誘発後のＭＩＦ阻害は、有意な有益性をストレプトゾトシン処置マウスに、糖尿病の進展を阻害することにより与えた。
【０１０６】
実施例３．無ＭＩＦマウスは、ストレプトゾトシンによる１型糖尿病誘発に対して耐性である
更に１型糖尿病におけるＭＩＦの重要性を樹立させるために、ＭＩＦ−／−Ｃ５７Ｂ１／６マウス（４０）がストレプトゾトシン処理され、糖尿病の進展中のＭＩＦ＋／＋マウスと比較された。ストレプトゾトシン処理された場合、ＭＩＦ−／−マウスは糖尿病を進展させず、一方、ＭＩＦ＋／＋マウスは糖尿病を進展させた（図９）。これは更に、例えば、リボザイム、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ等を用いてＭＩＦ発現を阻害することに関する方法が、１型糖尿病処置に有用であると期待されることをも、樹立させる。
【０１０７】
上に鑑みて、本発明の幾つかの利点が達成され、他の利点が獲得されることが判る。
【０１０８】
種々の変更が、本発明範囲を逸脱せず、上の方法および組成物においてなされ得るので、上の記載に含有され、添付の図面に示される全事項が例示的に解釈され、限定的な意味で解釈されないことが、意図される。
【０１０９】
本明細書において引用された全文献が、ここに援用される。本明細書におけるこれら文献に関する議論は単に、著者らによる主張を要約するよう意図され、如何なる文献も先行技術を構成するとは認められない。出願人は、これら引用文献の精確さおよび適切さに挑戦する権利を保つ。
【０１１０】
配列番号
配列番号：１−ヒトＭＩＦｃＤＮＡ−GenBank寄託番号NM002415
１ accacagtgg tgtccgagaa gtcaggcacg tagctcagcg gcggccgcgg cgcgtgcgtc
61 tgtgcctctgcgcgggtctc ctggtccttc tgccatcatg ccgatgttca tcgtaaacac
121 caacgtgccc cgcgcctccg tgccggacgg gttcctctcc gagctcaccc agcagctggc
181 gcaggccacc ggcaagcccc cccagtacat cgcggtgcac gtggtcccgg accagctcat
241 ggccttcggcggctccagcgagccgtgcgc gctctgcagc ctgcacagca tcggcaagat
301 cggcggcgcg cagaaccgct cctacagcaa gctgctgtgc ggcctgctgg ccgagcgcct
361 gcgcatcagcccggacaggg tctacatcaactattacgacatgaacgcggccaatgtggg
421 ctggaacaac tccaccttcg cctaagagcc gcagggaccc acgctgtctg cgctggctcc
481 acccgggaac ccgccgcacg ctgtgttcta ggcccgccca ccccaacctt ctggtgggga
541 gaaataaacg gtttagagac t
配列番号；２−マウスＭＩＦｃＤＮＡ−GenBank寄託番号BC024895
１ ggcttgggtcacaccgcgct ttgtaccgtc ctccggtcca cgctcgcagt ctctccgcca
61 ccatgcctatgttcatcgtgaacaccaatgttccccgcgcctccgtgcca gaggggtttc
121 tgtcggagctcacccagcagctggcgcaggccaccggcaa gcccgcacag tacatcgcag
181 tgcacgtggtcccggaccagctcatgactt ttagcggcacgaacgatccctgcgccctct
241 gcagcctgca cagcatcggc aagatcggtg gtgcccagaa ccgcaactac agtaagctgc
301 tgtgtggcctgctgtccgatcgcctgcaca tcagcccggaccgggtctac atcaactatt
361 acgacatgaa cgctgccaac gtgggctgga acggttccac cttcgcttga gtcctggccc
421 cacttacctg caccgctgtt ctttgagcct cgctccacgt agtgttctgt gtttatccac
481 cggtagcgat gcccaccttc cagccgggag aaataaatgg tttataagag aaaaaaaaaa
541 aaaaaaa
配列番号：３−ラットＭＩＦｃＤＮＡ−GenBank寄託番号NM031051
１ gggtcacgta gtcaggtccc agacttgggt cacaccgcac ttaacaccgt cctccggccg
61 tcgttcgcagtctctccgcc accatgcctatgttcatcgt gaacaccaat gttccccgcg
121 cctccgtgccagaggggtttctctccgagctcacccagca gctggcgcaggccaccggca
181 agccggcacagtacatcgca gtgcacgtgg tcccggaccagctcatgacttttagtggca
241 cgagcgacccctgcgccctctgcagcctgcacagcatcggcaagatcggtggcgcccaga
301 accgcaacta cagcaagctgctgtgcggcctgctgtccga tcgcctgcac atcagcccgg
361 accgggtcta catcaactattacgacatgaacgcagccaacgtgggctggaacggttcca
421 ccttcgcttgagcccgggcc tcacttacctgcaccgctgttcttcgagtc ttgctgcacg
481 ccccgttctgtgtttatcca cccgtaatgatggccaccttccggtcgggagaaataaatg
541 gtttgagacc a
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、糖尿病マウスの膵臓および腹腔細胞における上昇したＭＩＦ蛋白発現を実証しているマイクログラフおよびグラフである。パネルＡ〜Ｃは、膵臓の光免疫マイクログラフである。ＭＩＦは弱く、非糖尿病コントロールマウスの膵島により発現され（パネルＡ）、１０日後の糖尿病マウスの膵島においては、多量の単核細胞（ＭＮＣ）の浸潤があり、ＭＩＦ発現が顕著にアップレギュレーションされ（パネルＢ）、糖尿病マウス膵島の一連の切片におけるネガ染色である（パネルＣ）。パネルＤは、定量的画像分析のグラフを示し、糖尿病対非糖尿病コントロールからの膵島細胞による異なる段階のＭＩＦ発現を示している。膵島につきＭＩＦ＋細胞の％の平均±ＳＤが示される（マウスは１群につきｎ＝３）。パネルＥは、非糖尿病マウス（コントロール）、ＭＬＤ−ＳＴＺ糖尿病マウス（ＳＴＺ）、および、抗ＭＩＦ抗体（ＳＴＺ−αＭＩＦ）で処置されたＭＬＤ−ＳＴＺ糖尿病マウスの腹腔細胞における細胞内でのＭＩＦ蛋白発現の定量分析のグラフであり、細胞主体のＥＬＩＳＡにより測定され、ＭＩＦ特異的抗体を用いて、本実施例の「材料および方法」記載のように実施された。この結果が、コントロールの吸光度値（ＯＤ４９２ｎｍ、０．６８７±０．０１３）の何倍増加したかで表される。＊ｐ＜０．０５は、さもなくば無処置のＭＬＤ−ＳＴＺ糖尿病動物対照である。
【図２】図２は、抗ＭＩＦ抗体およびＩＳＯ−１でのＭＩＦのブロックが、高血糖およびインシュリン炎の進展を抑えることを実証している実験結果のグラフである。血中グルコースレベルが、Ｃ５７Ｂ１／６マウス（パネルＡ）およびＣＢＡ／Ｈマウス（パネルＢ）において求められ、ＳＴＺ処置開始時に開始し、週毎の測定を通して継続された。動物は、ＭＬＤ−ＳＴＺ注射を受けさせられ、ビヒクル（ＳＴＺ）、非免疫ウサギＩｇＧ（ＳＴＺ−ＩｇＧ）、抗ＭＩＦＩｇＧ（ＳＴＺ−αＭＩＦ）、もしくはＩＳＯ−１（ＳＴＺ−ＩＳＯ）を用いて処置された。Ｃ５７Ｂ１／６マウス（パネルＣ）およびＣＢＡ／Ｈマウス（パネルＤ）からの膵臓の組織病理学的分析が、インシュリン炎スコアとして表され、本実施例の「材料および方法」記載のとおりである。＊ｐ＜０．０５は、対応しているＳＴＺもしくはＳＴＺ−ＩｇＧ動物対照である。
【図３】図３は、ＭＩＦ活性の中和が、脾臓細胞増殖および接着を抑えることを実証している実験結果のグラフである。パネルＡが、３Ｈ−チミジン取り込みを、細胞増殖測定値として示し、ＳＴＺ（コントロール）では無処置、ＳＴＺおよびビヒクル（ＳＴＺ）、ＳＴＺおよび非免疫ウサギＩｇＧ（ＳＴＺ−ＩｇＧ）、ＳＴＺおよび抗ＭＩＦＩｇＧ（ＳＴＺ−αＭＩＦ）、あるいは、ＳＴＺおよびＩＳＯ−１（ＳＴＺ−ＩＳＯ）で処置されたマウスから単離されたＳＭＮＣにおいて求められたとおりである。パネルＢは、プラスチック表面もしくはＬ９２９線維芽細胞への接着を示し、同一群のマウスから単離されたＳＭＮＣにいて求められたとおりである。この結果が、プラスチック表面もしくはＬ９２９線維芽細胞へのコントロールの接着（Ｏ．Ｄ．５７０ｎｍ、それぞれ、０．３１６±０．０１８および０．９０５±０．０７７）の何倍増加したかで表される。＊ｐ＜０．０５は、対応しているＳＴＺもしくはＳＴＺ−ＩｇＧ動物対照である。
【図４】図４は、ＭＩＦ活性の中和が、ＴＮＦ−α産生を抑えることを実証している実験結果のグラフである。脾臓ＭＮＣ（ＳＭＮＣ）、腹腔細胞（ＰＣ）、および膵島が、コントロールの無処置マウス（コントロール）、ＳＴＺおよび非免疫ウサギＩｇＧ（ＳＴＺ−ＩｇＧ）、ＳＴＺおよび抗ＭＩＦＩｇＧ（ＳＴＺ−αＭＩＦ）、ＳＴＺおよびビヒクル（ＳＴＺ）、ならびに、ＳＴＺおよびＩＳＯ−１（ＳＴＺ−ＩＳＯ）で処置されたマウスから単離された。ＴＮＦ産生が、細胞培養上清中において測定され、本実施例の「材料および方法」記載のとおりであった。結果は、同様な結果の３回の独立した実験の代表である。＊ｐ＜０．０５は、対応しているＳＴＺ−ＩｇＧ（パネルＡ）もしくはＳＴＺ（パネルＢ）動物対照である。
【図５】図５は、ＭＩＦ活性の中和が、ｉＮＯＳ発現およびＮＯ産生をダウンレギュレーションすることを実証している実験結果のグラフである。腹腔細胞（ＰＣ）および膵島は、図３に記載されたように処置されたマウスから単離された。パネルＡにおいて、ｉＮＯＳ発現が、細胞主体のＥＬＩＳＡにより求められ、コントロール値（Ｏ．Ｄ．４９２ｎｍ、０．４４５±０．０２７）に比べて何倍増加したかで表される。パネルＢにおいて、マウスから単離後、ＰＣが培地中４８時間、膵島が２５０Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γ＋ＩＬ−１β存在下に７２時間、培養された。引き続き、該細胞培養上清中における亜硝酸（塩）の蓄積が、求められた。結果は、同様な結果の３回の独立した実験の代表である。＊ｐ＜０．０５は、対応しているＳＴＺもしくはＳＴＺ−ＩｇＧ動物対照である。
【図６】図６は、ＭＩＦ活性の中和が、ＩＦＮ−γおよびＭＨＣクラスＩＩの発現に影響を及ぼさないことを実証している実験結果のグラフである。脾臓ＭＮＣ（ＳＭＮＣ）および腹腔細胞（ＰＣ）が、図３に記載されたように処置されたマウスから単離された。パネルＡにおいて、ＳＭＮＣにおけるＩＦＮ−γ発現が、細胞主体のＥＬＩＳＡにより求められ、コントロール値（Ｏ．Ｄ．４９２ｎｍ、０．０７０±０．０１４）に比べて何倍増加したかで表される。パネルＢにおいて、ＰＣおよびＳＭＮＣにおけるＭＨＣ（クラス）ＩＩ分子発現が、細胞主体のＥＬＩＳＡにより求められ、コントロール値（Ｏ．Ｄ．４９２ｎｍ、それぞれ、１．６７８±０．１５１および１．２０４±０．１２４）に比べて何倍増加したかで表される。結果は、同様な結果の３回の独立した実験の代表である。＊ｐ＜０．０５は、対応しているＳＴＺもしくはＳＴＺ−ＩｇＧ動物対照である。
【図７】図７は、ＭＩＦ阻害剤で処置されたストレプトゾトシン処置マウスにおける糖尿病阻害を示している実験結果のグラフである。
【図８】図８は、ストレプトゾトシン処置マウスにおける糖尿病コントロールへの、ＭＩＦ阻害剤ＩＳＯ−１および抗ＭＩＦ抗体のタイミングの効果を示している実験結果のグラフである。無処置ＣＢＡ／Ｈマウス（コントロール、ｎ＝８）、あるいは、ＳＴＺ単独（ＳＴＺ、ｎ＝８）、ＳＴＺおよびＩＳＯ−１（ＳＴＺ−ＩＳＯ初期、ｎ＝８）、後期（ＳＴＺ−ＩＳＯ−１後期、ｎ＝８）、もしくは後期抗ＭＩＦＡｂ（ＳＴＺ−ＭＩＦ、ｎ＝８）で処置されたＭＬＤ−ＳＴＺ２１日後の糖尿病マウスの、血中グルコースレベル。 初期注射：ＩＳＯ−１がｉ．ｐ．注射により、４０ｍｇ／Ｋｇ／日で１４日間投与され、ＳＴＺの第１回の注射３日前に開始した。 後期注射：ＩＳＯ−１もしくは抗ＭＩＦＡｂが、ＳＴＺの最後の注射６日後に投与された。 ＊ｐ＜０．０５は、対応しているＳＴＺ動物対照である。
【図９】図９は、ＭＩＦなしのマウスが、ストレプトゾトシンでの処置後に、糖尿病を獲得しないことを示している実験結果のグラフである。血中グルコースレベルが、野生型およびＭＩＦ−／−Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて求められた。動物は、ＭＬＤ−ＳＴＺ注射（５×４０ｍｇ／ｋｇ／日）を受けさせられた。血中グルコースレベルが求められ、ＳＴＺ処置開始時に開始し、週毎の測定を通して継続された。＊ｐ＜０．００５は、対応しているＳＴＺ動物対照である。血中グルコースレベルが求められた。 （ａ）ＳＴＺ処置開始時に開始し、週毎の測定を通して継続された。ＭＬＤ−ＳＴＺ注射を受けさせられた代表的な２群に使用された記号は、Ｃ５７Ｂ１／６マウス（●；ｎ＝１１）およびＭＩＦ−／−Ｃ５７Ｂ１／６（○；ｎ＝１１）。 ２回の独立した実験の代表からの結果が、±ＳＤとして表される。＊ｐ＜０．００５は、対応しているＳＴＺ動物対照である。統計分析が、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ較正を用いたＡＮＯＶＡにより実施された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する方法であって、該哺乳類に、該哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含む医薬組成物を投与することを含み、該物質がポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである、方法。
【請求項２】
前記物質が、ＭＩＦに特異的に結合する抗体の結合部位を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記物質が抗体である、請求項２の方法。
【請求項４】
前記物質が、ＭＩＦに特異的に結合するアプタマーである、請求項１の方法。
【請求項５】
前記物質が、ＭＩＦ発現を阻害する、請求項１の方法。
【請求項６】
前記物質が、前記哺乳類におけるＭＩＦｍＲＮＡに特異的なアンチセンス核酸もしくは模倣体である、請求項５の方法。
【請求項７】
前記物質が、前記哺乳類におけるＭＩＦｍＲＮＡに特異的なリボザイム核酸もしくは模倣体である、請求項５の方法。
【請求項８】
前記物質が、前記哺乳類におけるＭＩＦｍＲＮＡに特異的な阻害ＲＮＡもしくは模倣体である、請求項５の方法。
【請求項９】
前記哺乳類が、糖尿病、グルコース不寛容障害、ストレス高血糖、メタボリック・シンドローム、および／またはインシュリン耐性を患っているかもしくは患うリスクに晒されている、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類が齧歯類である、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記哺乳類がヒトである、請求項１の方法。
【請求項１２】
１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する方法であって、該哺乳類に、該哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含む医薬組成物を投与することを含み、該物質が以降の構造ＩもしくはＩＩ：
【化１】
を含む有機分子である、方法。
【請求項１３】
前記有機分子が構造ＩＩを含み、式中：
【化２】
である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
化合物が、１型糖尿病を予防するかもしくは処置するのに有用であるかどうか評価する方法であって：
（ａ）該化合物がマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を哺乳類において阻害するかどうか決定し、次いで、もし該化合物がＭＩＦを阻害すれば
（ｂ）該化合物が１型糖尿病の進展を阻害するかどうか決定すること
を含む、方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）が、前記哺乳類における脾臓リンパ球の増殖への前記化合物の効果を評価することにより実施される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記化合物が蛋白である、請求項１４の方法。
【請求項１７】
前記蛋白が抗体結合部位を含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記化合物が核酸もしくは模倣体である、請求項１４の方法。
【請求項１９】
前記核酸もしくは模倣体が、アンチセンス、リボザイム、アプタマー、もしくは干渉ＲＮＡである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記化合物が１０００ダルトン未満の有機分子である、請求項１４の方法。
【請求項２１】
前記化合物が以降の構造ＩもしくはＩＩ：
【化３】
を含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
（ａ）請求項１においてＭＩＦを阻害するのに使用された物質を含む医薬組成物；ならびに
（ｂ）該組成物を、前記哺乳類に投与するための説明書
を含み、ここで、該哺乳類が１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている、キット。
【請求項２３】
（ａ）請求項１２においてＭＩＦを阻害するのに使用された物質を含む医薬組成物；ならびに
（ｂ）該組成物を、前記哺乳類に投与するための説明書
を含み、ここで、該哺乳類が１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている、キット。
【請求項２４】
１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類の処置用医薬品の製造のための、請求項１においてＭＩＦを阻害するのに使用された物質の使用。
【請求項２５】
１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類の処置用医薬品の製造のための、請求項１２においてＭＩＦを阻害するのに使用された物質の使用。
【請求項１】
１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する方法であって、該哺乳類に、該哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含む医薬組成物を投与することを含み、該物質がポリペプチドもしくはポリヌクレオチドである、方法。
【請求項２】
前記物質が、ＭＩＦに特異的に結合する抗体の結合部位を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記物質が抗体である、請求項２の方法。
【請求項４】
前記物質が、ＭＩＦに特異的に結合するアプタマーである、請求項１の方法。
【請求項５】
前記物質が、ＭＩＦ発現を阻害する、請求項１の方法。
【請求項６】
前記物質が、前記哺乳類におけるＭＩＦｍＲＮＡに特異的なアンチセンス核酸もしくは模倣体である、請求項５の方法。
【請求項７】
前記物質が、前記哺乳類におけるＭＩＦｍＲＮＡに特異的なリボザイム核酸もしくは模倣体である、請求項５の方法。
【請求項８】
前記物質が、前記哺乳類におけるＭＩＦｍＲＮＡに特異的な阻害ＲＮＡもしくは模倣体である、請求項５の方法。
【請求項９】
前記哺乳類が、糖尿病、グルコース不寛容障害、ストレス高血糖、メタボリック・シンドローム、および／またはインシュリン耐性を患っているかもしくは患うリスクに晒されている、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類が齧歯類である、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記哺乳類がヒトである、請求項１の方法。
【請求項１２】
１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処置する方法であって、該哺乳類に、該哺乳類においてマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を阻害する物質を含む医薬組成物を投与することを含み、該物質が以降の構造ＩもしくはＩＩ：
【化１】
を含む有機分子である、方法。
【請求項１３】
前記有機分子が構造ＩＩを含み、式中：
【化２】
である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
化合物が、１型糖尿病を予防するかもしくは処置するのに有用であるかどうか評価する方法であって：
（ａ）該化合物がマクロファージ転移阻害因子（ＭＩＦ）を哺乳類において阻害するかどうか決定し、次いで、もし該化合物がＭＩＦを阻害すれば
（ｂ）該化合物が１型糖尿病の進展を阻害するかどうか決定すること
を含む、方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）が、前記哺乳類における脾臓リンパ球の増殖への前記化合物の効果を評価することにより実施される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記化合物が蛋白である、請求項１４の方法。
【請求項１７】
前記蛋白が抗体結合部位を含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記化合物が核酸もしくは模倣体である、請求項１４の方法。
【請求項１９】
前記核酸もしくは模倣体が、アンチセンス、リボザイム、アプタマー、もしくは干渉ＲＮＡである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記化合物が１０００ダルトン未満の有機分子である、請求項１４の方法。
【請求項２１】
前記化合物が以降の構造ＩもしくはＩＩ：
【化３】
を含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
（ａ）請求項１においてＭＩＦを阻害するのに使用された物質を含む医薬組成物；ならびに
（ｂ）該組成物を、前記哺乳類に投与するための説明書
を含み、ここで、該哺乳類が１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている、キット。
【請求項２３】
（ａ）請求項１２においてＭＩＦを阻害するのに使用された物質を含む医薬組成物；ならびに
（ｂ）該組成物を、前記哺乳類に投与するための説明書
を含み、ここで、該哺乳類が１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている、キット。
【請求項２４】
１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類の処置用医薬品の製造のための、請求項１においてＭＩＦを阻害するのに使用された物質の使用。
【請求項２５】
１型糖尿病を患っているかもしくは１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類の処置用医薬品の製造のための、請求項１２においてＭＩＦを阻害するのに使用された物質の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５３４６７２（Ｐ２００７−５３４６７２Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０６４７３（Ｐ２００７−５０６４７３）
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１０５２１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９４３３８
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０１３２４８３４）ザ・フェインスタイン・インスティチュート・フォー・メディカル・リサーチ (14)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
【住所又は居所原語表記】３５０ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｎｈａｓｓｅｔ， ＮＹ １１０３０， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１０５２１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９４３３８
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０１３２４８３４）ザ・フェインスタイン・インスティチュート・フォー・メディカル・リサーチ (14)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
【住所又は居所原語表記】３５０ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｎｈａｓｓｅｔ， ＮＹ １１０３０， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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