ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質のｍＲＮＡの測定方法、そのためのプローブ及びキット
【課題】 ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを分別して定量する新しい測定技術及びそのためのプライマー対及びプローブを提供する。
【解決手段】 ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定に用いられるプローブであって、遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；前記プローブ、及び遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対の組合せから選ばれる、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定キット；並びに前記測定キットを用いる、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定方法である。
【解決手段】 ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定に用いられるプローブであって、遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；前記プローブ、及び遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対の組合せから選ばれる、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定キット；並びに前記測定キットを用いる、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定方法及びそのためのプローブ及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
新薬を開発する上で、ラットを用いた試験は一般的に行なわれている。
【０００３】
例えば、糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連した疾病に対する新薬を開発する上で、該新薬を投与した際のラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質の働き（発現量の増減）を把握することは重要である。何故なら、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質の変動が判らないと、該新薬の効力や副作用の増減或いは併用薬剤や他の摂取物との関連で起こる新薬の効力や副作用の起こる機構が予測できず、該新薬の効果や安全性を確認することができないからである。
【０００４】
そこで、上記新薬開発等の分野においては、かかるラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡに関する情報、特にこれら各ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを区別して測定できる測定技術の開発が、要望されている。かかる技術が開発できれば、例えば、新薬の効果や特殊病態時における影響の機構解明が容易にでき、該新薬の作用に関する有用な情報を得ることができ、かくして新薬の効能を確保することができる。
【０００５】
他方、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR）、コンペティティブＲＴ−ＰＣＲ等が微量のｍＲＮＡの検出、定量に威力を発揮している。
【０００６】
近年、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量検出法が確立された（Taq Man PCR (Genome Res., 6(10), 986 (1996)), ABI PRISMTMSequence Detection System (Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標識プローブ（TaqMan probe）を用いて核酸を測定する方法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター色素及び３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状態で、通常のＰＣＲ反応を行なわせると、伸長反応の進行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５′−３′エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲＥＴ（Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、かくして、該蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出できるのである。この方法によれば、ＰＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パターンを解析する等の複雑な工程が不要となり、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利点がある。先に上記ＰＣＲによるリアルタイム検出法に着目し、これをヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の検出に利用することが提案されている（特許文献１）。
【０００７】
本発明者らは、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出法に着目し、これが、ラットにおける各種の蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出に利用できれば、同じ装置を用いて同時に同一のＰＣＲ条件で上記各ｍＲＮＡを区別して測定、検出できるとの着想から、鋭意研究を重ねた。
【０００８】
しかしながら、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡは、それぞれのｍＲＮＡの配列は知られているものの、これらをターゲット遺伝子として、同一ＰＣＲ条件で充分に増幅し得、更に、該ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズし得る各プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検索自体困難であると考えられた。また、かかるプライマー対に挟まれた特定領域に、同一ＰＣＲ条件下にこれらのプライマーよりも早くハイブリダイズし得、しかもラットにおける特異的なプローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。特に、ヌクレオチド配列が既知の２つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔｍ）の計算によりある程度推定することはできるものの、この推定によって選択したプライマーとプローブとの組合せが、必ずしもＤＮＡ測定において好結果をもたらすわけではないことが知られていることより、現在知られているラットにおける各種の蛋白質をコードするｍＲＮＡについて、これらを同時に区別して測定可能な、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による多大な実験等が必要となると予想された。
【特許文献１】特開２００２−８５０６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡのＰＣＲによる測定法、特にリアルタイム検出法の確立と、そのためのプローブ及びプライマー対を提供することにある。
【００１０】
本発明者らは、上記目的よりラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡについて、更に、多大な実験、研究を繰返し行った結果、５２種類の各ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡに対する目的のプライマー対及びプローブの組合せを提供することに成功し、ここに下記要旨の本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(52)の各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれることを特徴とするプローブ；特にリポーター色素とクエンチャー色素とが結合している前記プローブ；塩基配列の長さが２０〜４５である前記プローブ；配列番号１〜配列番号５２に示される配列のいずれかを含む前記プローブ；並びに配列番号１〜配列番号５２に示される配列のいずれかである前記プローブが提供される。
(1)CYP2C23遺伝子の890-915の領域
(2)CYP7A1遺伝子の1009-1034の領域
(3)CYPOR遺伝子の918-950の領域
(4)STAT1遺伝子の1372-1398の領域
(5)STAT3遺伝子の1688-1718の領域
(6)STAT5a遺伝子の2238-2268の領域
(7)STAT5b遺伝子の2253-2278の領域
(8)PPARdelta遺伝子の957-980の領域
(9)PPARgamma遺伝子の1142-1163の領域
(10)Ahr遺伝子の993-1016の領域
(11)Arnt遺伝子の1304-1334の領域
(12)Arnt2遺伝子の1629-1656の領域
(13)Hnf4a遺伝子の229-258の領域
(14)Grp58遺伝子の488-520の領域
(15)Fdps遺伝子の76-104の領域
(16)Srebf1遺伝子の1571-1598の領域
(17)SREBP-2遺伝子の329-357の領域
(18)Sqle遺伝子の231-256の領域
(19)Pafah1b2遺伝子の395-425の領域
(20)Pafah1b3遺伝子の105-135の領域
(21)Pdgfrb遺伝子の2508-2536の領域
(22)Igf1r遺伝子の3576-3600の領域
(23)Staap遺伝子の463-488の領域
(24)Plau遺伝子の418-445の領域
(25)Plat遺伝子の353-380の領域
(26)TGFbeta1遺伝子の345-372の領域
(27)Fasn遺伝子の943-968の領域
(28)Scd1遺伝子の397-426の領域
(29)Acly遺伝子の493-520の領域
(30)Thrsp遺伝子の43-68の領域
(31)Irs1遺伝子の496-529の領域
(32)Irs2遺伝子の405-439の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AF050159での位置、開始コドンからの位置は未確認）
(33)Irs3遺伝子の292-319の領域
(34)Hsd11b1遺伝子の703-726の領域
(35)Apoe遺伝子の187-216の領域
(36)Hfe1遺伝子の740-770の領域
(37)transferrin遺伝子の1522-1553の領域
(38)GPT遺伝子の931-958の領域
(39)GOT1遺伝子の698-730の領域
(40)GOT2遺伝子の1033-1056の領域
(41)Cbl-b遺伝子の196-228の領域
(42)Fbxo32遺伝子の841-865の領域
(43)Ubb遺伝子の152-179の領域
(44)Eif4ebp1遺伝子の161-186の領域
(45)Igfbp1遺伝子の528-555の領域
(46)Siah1a遺伝子の252-275の領域
(47)MuRF1遺伝子の646-676の領域
(48)Fads1遺伝子の1038-1061の領域
(49)Fads2遺伝子の420-443の領域
(50)Acox1遺伝子の64-91の領域
(51)Acox2遺伝子の1869-1895の領域
(52)PKLR遺伝子の619-646の領域
【００１２】
また、本発明によれば、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードする遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対およびプローブのセットの少なくとも１つを含むラットにおける各種の蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出および定量キットであって、上記両プライマー対およびプローブが下記(1)〜(52)に示される遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであるキットが提供される。
(1)プライマー対；CYP2C23遺伝子の868-888領域及び977-958領域、プローブ；890-915領域
(2)プライマー対；CYP7A1遺伝子の981-1001領域及び1082-1063領域、プローブ；1009-1034領域
(3)プライマー対；CYPOR遺伝子の890-908領域及び983-963領域、プローブ；918-950領域
(4)プライマー対；STAT1遺伝子の1351-1371領域及び1419-1400領域、プローブ；1372-1398領域
(5)プライマー対；STAT3遺伝子の1652-1670領域及び1746-1726領域、プローブ；1688-1718領域
(6)プライマー対；STAT5a遺伝子の2201-2221領域及び2300-2280領域、プローブ；2238-2268領域
(7)プライマー対；STAT5b遺伝子の2221-2242領域及び2307-2292領域、プローブ；2253-2278領域
(8)プライマー対；PPARdelta遺伝子の935-955領域及び1002-983領域、プローブ；957-980領域
(9)プライマー対；PPARgamma遺伝子の1120-1140領域及び1196-1175領域、プローブ；1142-1163領域
(10)プライマー対；Ahr遺伝子の962-980領域及び1059-1040領域、プローブ；993-1016領域
(11)プライマー対；Arnt遺伝子の1282-1302領域及び1393-1375領域、プローブ；1304-1334領域
(12)プライマー対；Arnt2遺伝子の1603-1623領域及び1682-1662領域、プローブ；1629-1656領域
(13)プライマー対；Hnf4a遺伝子の206-224領域及び293-273領域、プローブ；229-258領域
(14)プライマー対；Grp58遺伝子の467-485領域及び563-543領域、プローブ；488-520領域
(15)プライマー対；Fdps遺伝子の53-73領域及び146-126領域、プローブ；76-104領域
(16)プライマー対；Srebf1遺伝子の1546-1569領域及び1662-1643領域、プローブ；1571-1598領域
(17)プライマー対；SREBP-2遺伝子の303-323領域及び394-374領域、プローブ；329-357領域
(18)プライマー対；Sqle遺伝子の209-229領域及び282-259領域、プローブ；231-256領域
(19)プライマー対；Pafah1b2遺伝子の373-393領域及び447-427領域、プローブ；395-425領域
(20)プライマー対；Pafah1b3遺伝子の83-102領域及び161-141領域、プローブ；105-135領域
(21)プライマー対；Pdgfrb遺伝子の2482-2502領域及び2563-2544領域、プローブ；2508-2536領域
(22)プライマー対；Igf1r遺伝子の3556-3574領域及び3673-3653領域、プローブ；3576-3600領域
(23)プライマー対；Staap遺伝子の442-461領域及び511-492領域、プローブ；463-488領域
(24)プライマー対；Plau遺伝子の397-416領域及び470-450領域、プローブ；418-445領域
(25)プライマー対；Plat遺伝子の332-351領域及び429-411領域、プローブ；353-380領域
(26)プライマー対；TGFbeta1遺伝子の320-338領域及び424-404領域、プローブ；345-372領域
(27)プライマー対；Fasn遺伝子の911-931領域及び993-974領域、プローブ；943-968領域
(28)プライマー対；Scd1遺伝子の367-387領域及び462-444領域、プローブ；397-426領域
(29)プライマー対；Acly遺伝子の469-489領域及び569-549領域、プローブ；493-520領域
(30)プライマー対；Thrsp遺伝子の22-40領域及び97-77領域、プローブ；43-68領域
(31)プライマー対；Irs1遺伝子の467-487領域及び559-541領域、プローブ；496-529領域
(32)プライマー対；Irs2遺伝子の376-395領域及び461-441領域、プローブ；405-439の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AF050159での位置、開始コドンからの位置は未確認）
(33)プライマー対；Irs3遺伝子の262-280領域及び378-358領域、プローブ；292-319領域
(34)プライマー対；Hsd11b1遺伝子の682-701領域及び746-728領域、プローブ；703-726領域
(35)プライマー対；Apoe遺伝子の159-179領域及び247-222領域、プローブ；187-216領域
(36)プライマー対；Hfe1遺伝子の716-736領域及び805-785領域、プローブ；740-770領域
(37)プライマー対；transferrin遺伝子の1500-1520領域及び1575-1556領域、プローブ；1522-1553領域
(38)プライマー対；GPT遺伝子の910-929領域及び992-972領域、プローブ；931-958領域
(39)プライマー対；GOT1遺伝子の673-693領域及び752-732領域、プローブ；698-730領域
(40)プライマー対；GOT2遺伝子の1010-1028領域及び1158-1138領域、プローブ；1033-1056領域
(41)プライマー対；Cbl-b遺伝子の173-192領域及び259-240領域、プローブ；196-228領域
(42)プライマー対；Fbxo32遺伝子の818-837領域及び901-882領域、プローブ；841-865領域
(43)プライマー対；Ubb遺伝子の114-134領域及び207-187領域、プローブ；152-179領域
(44)プライマー対；Eif4ebp1遺伝子の137-157領域及び231-212領域、プローブ；161-186領域
(45)プライマー対；Igfbp1遺伝子の500-520領域及び583-563領域、プローブ；528-555領域
(46)プライマー対；Siah1a遺伝子の226-246x領域及び297-277領域、プローブ；252-275領域
(47)プライマー対；MuRF1遺伝子の626-644領域及び727-707領域、プローブ；646-676領域
(48)プライマー対；Fads1遺伝子の1013-1031領域及び1107-1088領域、プローブ；1038-1061領域
(49)プライマー対；Fads2遺伝子の398-418領域及び471-453領域、プローブ；420-443領域
(50)プライマー対；Acox1遺伝子の41-60領域及び112-94領域、プローブ；64-91領域
(51)プライマー対；Acox2遺伝子の1849-1867領域及び1926-1907領域、プローブ；1869-1895領域
(52)プライマー対；PKLR遺伝子の589-609領域及び668-648領域、プローブ；619-646領域
【００１３】
上記キットにおけるプローブは、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものであることが好ましい。
上記キットを構成するプライマー対とプローブとの組合せ（セット）の好ましいものとしては、下記(1)〜(52)から選ばれる各配列番号で示される配列を含むもの、より好ましくは各配列番号で示される配列を有するものを挙げることができる。
(1)プライマー対；配列番号５３及び５４、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号５５及び５６、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号５７及び５８、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号５９及び６０、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号６１及び６２、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号６３及び６４、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号６５及び６６、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号６７及び６８、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号６９及び７０、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号７１及び７２、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号７３及び７４、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号７５及び７６、プローブ；配列番号１２
(13)プライマー対；配列番号７７及び７８、プローブ；配列番号１３
(14)プライマー対；配列番号７９及び８０、プローブ；配列番号１４
(15)プライマー対；配列番号８１及び８２、プローブ；配列番号１５
(16)プライマー対；配列番号８３及び８４、プローブ；配列番号１６
(17)プライマー対；配列番号８５及び８６、プローブ；配列番号１７
(18)プライマー対；配列番号８７及び８８、プローブ；配列番号１８
(19)プライマー対；配列番号８９及び９０、プローブ；配列番号１９
(20)プライマー対；配列番号９１及び９２、プローブ；配列番号２０
(21)プライマー対；配列番号９３及び９４、プローブ；配列番号２１
(22)プライマー対；配列番号９５及び９６、プローブ；配列番号２２
(23)プライマー対；配列番号９７及び９８、プローブ；配列番号２３
(24)プライマー対；配列番号９９及び１００、プローブ；配列番号２４
(25)プライマー対；配列番号１０１及び１０２、プローブ；配列番号２５
(26)プライマー対；配列番号１０３及び１０４、プローブ；配列番号２６
(27)プライマー対；配列番号１０５及び１０６、プローブ；配列番号２７
(28)プライマー対；配列番号１０７及び１０８、プローブ；配列番号２８
(29)プライマー対；配列番号１０９及び１１０、プローブ；配列番号２９
(30)プライマー対；配列番号１１１及び１１２、プローブ；配列番号３０
(31)プライマー対；配列番号１１３及び１１４、プローブ；配列番号３１
(32)プライマー対；配列番号１１５及び１１６、プローブ；配列番号３２
(33)プライマー対；配列番号１１７及び１１８、プローブ；配列番号３３
(34)プライマー対；配列番号１１９及び１２０、プローブ；配列番号３４
(35)プライマー対；配列番号１２１及び１２２、プローブ；配列番号３５
(36)プライマー対；配列番号１２３及び１２４、プローブ；配列番号３６
(37)プライマー対；配列番号１２５及び１２６、プローブ；配列番号３７
(38)プライマー対；配列番号１２７及び１２８、プローブ；配列番号３８
(39)プライマー対；配列番号１２９及び１３０、プローブ；配列番号３９
(40)プライマー対；配列番号１３１及び１３２、プローブ；配列番号４０
(41)プライマー対；配列番号１３３及び１３４、プローブ；配列番号４１
(42)プライマー対；配列番号１３５及び１３６、プローブ；配列番号４２
(43)プライマー対；配列番号１３７及び１３８、プローブ；配列番号４３
(44)プライマー対；配列番号１３９及び１４０、プローブ；配列番号４４
(45)プライマー対；配列番号１４１及び１４２、プローブ；配列番号４５
(46)プライマー対；配列番号１４３及び１４４、プローブ；配列番号４６
(47)プライマー対；配列番号１４５及び１４６、プローブ；配列番号４７
(48)プライマー対；配列番号１４７及び１４８、プローブ；配列番号４８
(49)プライマー対；配列番号１４９及び１５０、プローブ；配列番号４９
(50)プライマー対；配列番号１５１及び１５２、プローブ；配列番号５０
(51)プライマー対；配列番号１５３及び１５４、プローブ；配列番号５１
(52)プライマー対；配列番号１５５及び１５６、プローブ；配列番号５２
【００１４】
また、上記各セットはそれぞれ以下のラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定用であることが好ましい。
(1)のセット；CYP2C23測定用
(2)のセット；CYP7A1測定用
(3)のセット；CYPOR測定用
(4)のセット；STAT1測定用
(5)のセット；STAT3測定用
(6)のセット；STAT5a測定用
(7)のセット；STAT5bｖ
(8)のセット；PPARdelta測定用
(9)のセット；PPARgamma測定用
(10)のセット；Ahr測定用
(11)のセット；Arnt測定用
(12)のセット；Arnt2測定用
(13)のセット；Hnf4a測定用
(14)のセット；Grp58測定用
(15)のセット；Fdps測定用
(16)のセット；Srebf1測定用
(17)のセット；SREBP-2測定用
(18)のセット；Sqle測定用
(19)のセット；Pafah1b2測定用
(20)のセット；Pafah1b3測定用
(21)のセット；Pdgfrb測定用
(22)のセット；Igf1r測定用
(23)のセット；Staap測定用
(24)のセット；Plau測定用
(25)のセット；Plat測定用
(26)のセット；TGFbeta1測定用
(27)のセット；Fasn測定用
(28)のセット；Scd1測定用
(29)のセット；Acly測定用
(30)のセット；Thrsp測定用
(31)のセット；Irs1測定用
(32)のセット；Irs2測定用
(33)のセット；Irs3測定用
(34)のセット；Hsd11b1測定用
(35)のセット；Apoe測定用
(36)のセット；Hfe1測定用
(37)のセット；transferrin測定用
(38)のセット；GPT測定用
(39)のセット；GOT1測定用
(40)のセット；GOT2測定用
(41)のセット；Cbl-b測定用
(42)のセット；Fbxo32測定用
(43)のセット；Ubb測定用
(44)のセット；Eif4ebp1測定用
(45)のセット；Igfbp1測定用
(46)のセット；Siah1a測定用
(47)のセット；MuRF1測定用
(48)のセット；Fads1測定用
(49)のセット；Fads2測定用
(50)のセット；Acox1測定用
(51)のセット；Acox2測定用
(52)のセット；PKLR測定用
さらに、本発明によれば、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む検体について、上記いずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ）を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定することを特徴とするラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定方法、特に上記加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無により測定される前記測定方法が提供される。
【００１５】
より詳しくは、フォーワードプライマー及びリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを用いて、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードする遺伝子を測定するリアルタイム検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、同一ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードする各種ｍＲＮＡを定量することができる。このようなラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡのリアルタイム検出方法の確立は、臨床分野において非常に有益である。
【００１７】
また、上記方法によれば、ラットより手術で摘出した組織やバイオプシーにより摘出した組織中に発現するラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを見るにあたり、迅速に且つ多種の試料を処理でき、また、僅かな組織片から抽出した全ＲＮＡで検出可能である、という効果も得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明におけるプローブ及びプライマー対について詳述する。本発明における各プローブ及びプライマーは、上述した通り、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードする遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。
【００１９】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、後述するＰＣＲ（又はＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００２０】
本発明におけるプローブ及びプライマーに共通する要件としては、増幅生成物が５０〜４００塩基対の長さであること、プライマーとプローブができる限り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）及びＣ（シトシン）の割合が好ましくは５０％前後であること、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないこと、を挙げることができる。加えて、本発明におけるプローブにみられる要件としては、Ｔｍ値が７０℃前後であることを挙げることができ、本発明におけるプライマーにみられる要件としてはＴｍ値が６０℃前後であることを挙げることができる。
【００２１】
それぞれのｍＲＮＡ配列は公知であり、それぞれジーンバンク（BenBank）に以下の登録番号で登録されている。
(1)CYP2C23遺伝子；NM_031839
(2)CYP7A1遺伝子；NM_012942
(3)CYPOR遺伝子；NM_031576
(4)STAT1遺伝子；NM_032612
(5)STAT3遺伝子；NM_012747
(6)STAT5a遺伝子；NM_017064
(7)STAT5b遺伝子；NM_022380
(8)PPARdelta遺伝子；NM_013141
(9)PPARgamma遺伝子；NM_013124
(10)Ahr遺伝子；NM_013149
(11)Arnt遺伝子；NM_012780
(12)Arnt2遺伝子；NM_012781
(13)Hnf4a遺伝子；NM_022180
(14)Grp58遺伝子；NM_017319
(15)Fdps遺伝子；NM_031840
(16)Srebf1遺伝子；XM_213329
(17)SREBP-2遺伝子；XM_216989
(18)Sqle遺伝子；NM_017136
(19)Pafah1b2遺伝子；NM_022387
(20)Pafah1b3遺伝子；NM_053654
(21)Pdgfrb遺伝子；NM_031525, AF359356
(22)Igf1r遺伝子；NM_052807
(23)Staap遺伝子；NM_130744
(24)Plau遺伝子；NM_013085
(25)Plat遺伝子；NM_013151
(26)TGFbeta1遺伝子；NM_021578
(27)Fasn遺伝子；NM_017332
(28)Scd1遺伝子；NM_139192
(29)Acly遺伝子；NM_016987
(30)Thrsp遺伝子；NM_012703
(31)Irs1遺伝子；NM_012969
(32)Irs2遺伝子；AF050159
(33)Irs3遺伝子；NM_032074
(34)Hsd11b1遺伝子；NM_017080
(35)Apoe遺伝子；NM_138828
(36)Hfe1遺伝子；NM_053301
(37)transferrin遺伝子；NM_017055
(38)GPT遺伝子；NM_031039
(39)GOT1遺伝子；NM_012571
(40)GOT2遺伝子；NM_013177
(41)Cbl-b遺伝子；NM_133601
(42)Fbxo32遺伝子；NM_133521
(43)Ubb遺伝子；NM_138895
(44)Eif4ebp1遺伝子；NM_053857
(45)Igfbp1遺伝子；NM_013144
(46)Siah1a遺伝子；NM_080905
(47)MuRF1遺伝子；NM_080903
(48)Fads1遺伝子；NM_053445
(49)Fads2遺伝子；NM_031344
(50)Acox1遺伝子；NM_017340
(51)Acox2遺伝子；NM_145770
(52)PKLR遺伝子；NM_012624
【００２２】
本明細書において、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの特定領域の表示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の開始コドンからの配列に従うものである。
【００２３】
これら各プライマー及びプローブ用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、１５個以上、好ましくは１５〜５０個、より好ましくは２０〜４５個の範囲にあるのがよい。これらプライマー及びプローブのヌクレオチド数が上記範囲よりも多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆に、少なすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する傾向がある。
【００２４】
プライマー及びプローブの特定のヌクレオチド配列の好ましい具体的配列例は、前述したとおり、各分子種に応じて、それぞれ、配列番号１〜５２（プローブの場合）並びに配列番号５３〜１５６（プライマーの場合）に示されるとおりである。
【００２５】
なお、例えば２０ヌクレオチドからなるプライマー又はプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッチが存在してもハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマーとして又は検出用プローブとして機能し得ることが知られている。従って、本発明におけるプライマー及びプローブもまた、上記の特定のヌクレオチド配列を有するものに限定されず、その配列をその一部として含むものや、その配列中の例えば２個以下のヌクレオチドに置換、欠失及び／又は付加による修飾がなされた配列等をも包含することができる。
【００２６】
上述した本発明におけるプローブ及びプライマーとしての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機（例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社製））等を用いて容易に合成することができ、さらに必要に応じて、得られたオリゴヌクレオチドを市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。
【００２７】
本発明のリアルタイム検出用のプローブは、その一端、例えば５′−末端にレポーター色素を結合しており、そして他端、例えば３′−末端にクエンチャー色素を結合していることが好ましい。レポーター色素としては、例えば励起光の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャー色素としては、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合、該レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有する物質が挙げられる。このようなレポーター色素の例としては、例えば、６−カルボキシ−フルオレッセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）等が挙げられる。クエンチャー色素の例としては、例えば、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。
【００２８】
本発明におけるプローブは、前記特定配列のプローブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素及びクエンチャー色素を結合させることにより調製できる。例えば、プローブの５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形で結合させることができる。また、プローブの３′側には、下記に示す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を結合させ得る。
【００２９】
【化１】
【００３０】
以下、本発明におけるプライマー対及びプローブを利用したＰＣＲによるリアルタイム検出法について詳述する。
【００３１】
本発明にかかる測定方法は、前述した本発明におけるプライマー対及びプローブを利用することを必須として、他は公知のＰＣＲ法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Genome Res., 6(10), 986 (1996)参照）等、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PCR, ABI PRISM TM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June (1996)参照）に従い実施することができる。
【００３２】
これらの方法は、特に、本発明が対象とするラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの発現量の測定方法として、ｍＲＮＡを測定する場合に有用である。この場合、例えば、特定のラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを発現している生体組織を採取し、常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次にそれに対して相補性のｃＤＮＡを常法に従って合成した後、本発明におけるプライマー対とプローブとを用いて、ＰＣＲを行えばよい。また、常法に従って全ＲＮＡを抽出後、本発明におけるプライマーとプローブとを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲを行なうこともできる。
【００３３】
ＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲ反応は、基本的には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件も、公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に制限されるものではない。具体的には、後述する実施例に示す条件を好ましく採用できる。
【００３４】
検出も、基本的には常法に従い、例えば、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射される蛍光をＣＣＤカメラを用いて検出することにより行なうことができる。
【００３５】
以上のようにして、本発明にかかる測定方法によって、所期の各ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを容易且つ迅速に、しかも各ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡ毎に測定、検出することができる。
【００３６】
本発明のキットは、上記本発明におけるプライマー対及びプローブを含んでなる。本発明のキットは、さらに、対照として使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定するためのプライマー対及びプローブを含んでいてもよい。
【００３７】
本発明のキットによれば、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡをそのラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡ毎に測定、検出でき、ひいては、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの定量を迅速に、精度よく行なうことができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明をさらに詳しく説明するため、実施例を挙げる。
【００３９】
（実施例）
ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡについて以下の試験を行い、リアルタイム検出方法による検量線を作成した。
本試験で採用したリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲ法は、９６ウエルを用いて、最大９６の異なった反応を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できるものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反応とを行なうことができるものであり、さらに、３８４ウエルでの測定も可能なものである。
【００４０】
本定量の原理は、隣接した２種類の蛍光色素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用したものである。すなわち、ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端に結合させたプローブ（TaqMan probe）が、ＰＣＲで増幅した特定のラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡ種由来のｃＤＮＡにハイブリダイゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反応が始まると、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが有する５’−３’エンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブが加水分解される。それにより、リポーター色素が脱離し、クエンチャー色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによって抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加する。この蛍光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に比例するため、これをＰＣＲ反応毎に測定することによって、所望の定量が可能となる。
【００４１】
本試験では、プローブの５’末端側にはリポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にはクエンチャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。これら各色素の結合及びこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献（Genome Res., 6(10), 986 (1996)）記載の方法に従って行なった。
【００４２】
また、各プライマー及びプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザー（ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（ＡＢＩ社製））を利用して、基質（ｄＮＴＰ）及び規定の試薬を用いて合成した。
【００４３】
検体ＲＮＡとしては、ラットの肝臓プールあるいは心臓プールより精製された全ＲＮＡを用いた。なお、これらの全ＲＮＡは、ラットの肝臓プールあるいは心臓プールよりMini kit（「Rneasy（登録商標）」QIAGEN社製）を用いて調製した。
【００４４】
ラットの肝臓プールあるいは心臓プールより精製された全ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈して２０μｇ／ｍＬとし、検量線作成用とした。以後は、５０μｇ／ｍＬのイーストｔＲＮＡ（「Yeast tRNA」GIBCO社製）を用いて、５倍公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。
【００４５】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、３００ｎＭフォーワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、及び２００ｎＭ TaqManプローブを含むTaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems)を用いて、２０μＬ／チューブの系で、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）にて行なった。
【００４６】
温度等の測定条件は、４８℃で３０分間保温した後、９５℃で１０分間保温し、その後、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を１サイクルとして該サイクルを５０回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
【００４７】
下記表１および表２に示す各ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡに対して各配列番号に示される配列のプライマー対及びプローブを用いて上記試験を行った。結果（検量線）を表３および表４に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表４】
【００５２】
上記表３および表４より、６００００ｐｇ全ＲＮＡ／２０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を作成したところ、定量下限は０．７６８ｐｇ全ＲＮＡ／２０μＬ反応液量から２４００ｐｇ全ＲＮＡ／２０μＬ反応液量であり、検量線の相関係数（ｒ）は全てにおいて０．９９以上であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定方法及びそのためのプローブ及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
新薬を開発する上で、ラットを用いた試験は一般的に行なわれている。
【０００３】
例えば、糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連した疾病に対する新薬を開発する上で、該新薬を投与した際のラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質の働き（発現量の増減）を把握することは重要である。何故なら、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質の変動が判らないと、該新薬の効力や副作用の増減或いは併用薬剤や他の摂取物との関連で起こる新薬の効力や副作用の起こる機構が予測できず、該新薬の効果や安全性を確認することができないからである。
【０００４】
そこで、上記新薬開発等の分野においては、かかるラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡに関する情報、特にこれら各ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを区別して測定できる測定技術の開発が、要望されている。かかる技術が開発できれば、例えば、新薬の効果や特殊病態時における影響の機構解明が容易にでき、該新薬の作用に関する有用な情報を得ることができ、かくして新薬の効能を確保することができる。
【０００５】
他方、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription-PCR）、コンペティティブＲＴ−ＰＣＲ等が微量のｍＲＮＡの検出、定量に威力を発揮している。
【０００６】
近年、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量検出法が確立された（Taq Man PCR (Genome Res., 6(10), 986 (1996)), ABI PRISMTMSequence Detection System (Applied Biosystems社)）。これは、特定の蛍光標識プローブ（TaqMan probe）を用いて核酸を測定する方法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター色素及び３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状態で、通常のＰＣＲ反応を行なわせると、伸長反応の進行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５′−３′エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲＥＴ（Fluoresence Resonance Energy Transfer, 両蛍光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、かくして、該蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出できるのである。この方法によれば、ＰＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パターンを解析する等の複雑な工程が不要となり、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利点がある。先に上記ＰＣＲによるリアルタイム検出法に着目し、これをヒトにおけるグルクロン酸抱合に関与する酵素の検出に利用することが提案されている（特許文献１）。
【０００７】
本発明者らは、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出法に着目し、これが、ラットにおける各種の蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出に利用できれば、同じ装置を用いて同時に同一のＰＣＲ条件で上記各ｍＲＮＡを区別して測定、検出できるとの着想から、鋭意研究を重ねた。
【０００８】
しかしながら、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡは、それぞれのｍＲＮＡの配列は知られているものの、これらをターゲット遺伝子として、同一ＰＣＲ条件で充分に増幅し得、更に、該ターゲット遺伝子の特定位置にハイブリダイズし得る各プライマー対としてのオリゴヌクレオチドの検索自体困難であると考えられた。また、かかるプライマー対に挟まれた特定領域に、同一ＰＣＲ条件下にこれらのプライマーよりも早くハイブリダイズし得、しかもラットにおける特異的なプローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。特に、ヌクレオチド配列が既知の２つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔｍ）の計算によりある程度推定することはできるものの、この推定によって選択したプライマーとプローブとの組合せが、必ずしもＤＮＡ測定において好結果をもたらすわけではないことが知られていることより、現在知られているラットにおける各種の蛋白質をコードするｍＲＮＡについて、これらを同時に区別して測定可能な、上記ＰＣＲによるリアルタイム検出用の各プライマー対とプローブとの組合せの選択には、熟練者の試行錯誤による多大な実験等が必要となると予想された。
【特許文献１】特開２００２−８５０６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡのＰＣＲによる測定法、特にリアルタイム検出法の確立と、そのためのプローブ及びプライマー対を提供することにある。
【００１０】
本発明者らは、上記目的よりラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡについて、更に、多大な実験、研究を繰返し行った結果、５２種類の各ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡに対する目的のプライマー対及びプローブの組合せを提供することに成功し、ここに下記要旨の本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(52)の各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれることを特徴とするプローブ；特にリポーター色素とクエンチャー色素とが結合している前記プローブ；塩基配列の長さが２０〜４５である前記プローブ；配列番号１〜配列番号５２に示される配列のいずれかを含む前記プローブ；並びに配列番号１〜配列番号５２に示される配列のいずれかである前記プローブが提供される。
(1)CYP2C23遺伝子の890-915の領域
(2)CYP7A1遺伝子の1009-1034の領域
(3)CYPOR遺伝子の918-950の領域
(4)STAT1遺伝子の1372-1398の領域
(5)STAT3遺伝子の1688-1718の領域
(6)STAT5a遺伝子の2238-2268の領域
(7)STAT5b遺伝子の2253-2278の領域
(8)PPARdelta遺伝子の957-980の領域
(9)PPARgamma遺伝子の1142-1163の領域
(10)Ahr遺伝子の993-1016の領域
(11)Arnt遺伝子の1304-1334の領域
(12)Arnt2遺伝子の1629-1656の領域
(13)Hnf4a遺伝子の229-258の領域
(14)Grp58遺伝子の488-520の領域
(15)Fdps遺伝子の76-104の領域
(16)Srebf1遺伝子の1571-1598の領域
(17)SREBP-2遺伝子の329-357の領域
(18)Sqle遺伝子の231-256の領域
(19)Pafah1b2遺伝子の395-425の領域
(20)Pafah1b3遺伝子の105-135の領域
(21)Pdgfrb遺伝子の2508-2536の領域
(22)Igf1r遺伝子の3576-3600の領域
(23)Staap遺伝子の463-488の領域
(24)Plau遺伝子の418-445の領域
(25)Plat遺伝子の353-380の領域
(26)TGFbeta1遺伝子の345-372の領域
(27)Fasn遺伝子の943-968の領域
(28)Scd1遺伝子の397-426の領域
(29)Acly遺伝子の493-520の領域
(30)Thrsp遺伝子の43-68の領域
(31)Irs1遺伝子の496-529の領域
(32)Irs2遺伝子の405-439の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AF050159での位置、開始コドンからの位置は未確認）
(33)Irs3遺伝子の292-319の領域
(34)Hsd11b1遺伝子の703-726の領域
(35)Apoe遺伝子の187-216の領域
(36)Hfe1遺伝子の740-770の領域
(37)transferrin遺伝子の1522-1553の領域
(38)GPT遺伝子の931-958の領域
(39)GOT1遺伝子の698-730の領域
(40)GOT2遺伝子の1033-1056の領域
(41)Cbl-b遺伝子の196-228の領域
(42)Fbxo32遺伝子の841-865の領域
(43)Ubb遺伝子の152-179の領域
(44)Eif4ebp1遺伝子の161-186の領域
(45)Igfbp1遺伝子の528-555の領域
(46)Siah1a遺伝子の252-275の領域
(47)MuRF1遺伝子の646-676の領域
(48)Fads1遺伝子の1038-1061の領域
(49)Fads2遺伝子の420-443の領域
(50)Acox1遺伝子の64-91の領域
(51)Acox2遺伝子の1869-1895の領域
(52)PKLR遺伝子の619-646の領域
【００１２】
また、本発明によれば、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードする遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対およびプローブのセットの少なくとも１つを含むラットにおける各種の蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出および定量キットであって、上記両プライマー対およびプローブが下記(1)〜(52)に示される遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであるキットが提供される。
(1)プライマー対；CYP2C23遺伝子の868-888領域及び977-958領域、プローブ；890-915領域
(2)プライマー対；CYP7A1遺伝子の981-1001領域及び1082-1063領域、プローブ；1009-1034領域
(3)プライマー対；CYPOR遺伝子の890-908領域及び983-963領域、プローブ；918-950領域
(4)プライマー対；STAT1遺伝子の1351-1371領域及び1419-1400領域、プローブ；1372-1398領域
(5)プライマー対；STAT3遺伝子の1652-1670領域及び1746-1726領域、プローブ；1688-1718領域
(6)プライマー対；STAT5a遺伝子の2201-2221領域及び2300-2280領域、プローブ；2238-2268領域
(7)プライマー対；STAT5b遺伝子の2221-2242領域及び2307-2292領域、プローブ；2253-2278領域
(8)プライマー対；PPARdelta遺伝子の935-955領域及び1002-983領域、プローブ；957-980領域
(9)プライマー対；PPARgamma遺伝子の1120-1140領域及び1196-1175領域、プローブ；1142-1163領域
(10)プライマー対；Ahr遺伝子の962-980領域及び1059-1040領域、プローブ；993-1016領域
(11)プライマー対；Arnt遺伝子の1282-1302領域及び1393-1375領域、プローブ；1304-1334領域
(12)プライマー対；Arnt2遺伝子の1603-1623領域及び1682-1662領域、プローブ；1629-1656領域
(13)プライマー対；Hnf4a遺伝子の206-224領域及び293-273領域、プローブ；229-258領域
(14)プライマー対；Grp58遺伝子の467-485領域及び563-543領域、プローブ；488-520領域
(15)プライマー対；Fdps遺伝子の53-73領域及び146-126領域、プローブ；76-104領域
(16)プライマー対；Srebf1遺伝子の1546-1569領域及び1662-1643領域、プローブ；1571-1598領域
(17)プライマー対；SREBP-2遺伝子の303-323領域及び394-374領域、プローブ；329-357領域
(18)プライマー対；Sqle遺伝子の209-229領域及び282-259領域、プローブ；231-256領域
(19)プライマー対；Pafah1b2遺伝子の373-393領域及び447-427領域、プローブ；395-425領域
(20)プライマー対；Pafah1b3遺伝子の83-102領域及び161-141領域、プローブ；105-135領域
(21)プライマー対；Pdgfrb遺伝子の2482-2502領域及び2563-2544領域、プローブ；2508-2536領域
(22)プライマー対；Igf1r遺伝子の3556-3574領域及び3673-3653領域、プローブ；3576-3600領域
(23)プライマー対；Staap遺伝子の442-461領域及び511-492領域、プローブ；463-488領域
(24)プライマー対；Plau遺伝子の397-416領域及び470-450領域、プローブ；418-445領域
(25)プライマー対；Plat遺伝子の332-351領域及び429-411領域、プローブ；353-380領域
(26)プライマー対；TGFbeta1遺伝子の320-338領域及び424-404領域、プローブ；345-372領域
(27)プライマー対；Fasn遺伝子の911-931領域及び993-974領域、プローブ；943-968領域
(28)プライマー対；Scd1遺伝子の367-387領域及び462-444領域、プローブ；397-426領域
(29)プライマー対；Acly遺伝子の469-489領域及び569-549領域、プローブ；493-520領域
(30)プライマー対；Thrsp遺伝子の22-40領域及び97-77領域、プローブ；43-68領域
(31)プライマー対；Irs1遺伝子の467-487領域及び559-541領域、プローブ；496-529領域
(32)プライマー対；Irs2遺伝子の376-395領域及び461-441領域、プローブ；405-439の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AF050159での位置、開始コドンからの位置は未確認）
(33)プライマー対；Irs3遺伝子の262-280領域及び378-358領域、プローブ；292-319領域
(34)プライマー対；Hsd11b1遺伝子の682-701領域及び746-728領域、プローブ；703-726領域
(35)プライマー対；Apoe遺伝子の159-179領域及び247-222領域、プローブ；187-216領域
(36)プライマー対；Hfe1遺伝子の716-736領域及び805-785領域、プローブ；740-770領域
(37)プライマー対；transferrin遺伝子の1500-1520領域及び1575-1556領域、プローブ；1522-1553領域
(38)プライマー対；GPT遺伝子の910-929領域及び992-972領域、プローブ；931-958領域
(39)プライマー対；GOT1遺伝子の673-693領域及び752-732領域、プローブ；698-730領域
(40)プライマー対；GOT2遺伝子の1010-1028領域及び1158-1138領域、プローブ；1033-1056領域
(41)プライマー対；Cbl-b遺伝子の173-192領域及び259-240領域、プローブ；196-228領域
(42)プライマー対；Fbxo32遺伝子の818-837領域及び901-882領域、プローブ；841-865領域
(43)プライマー対；Ubb遺伝子の114-134領域及び207-187領域、プローブ；152-179領域
(44)プライマー対；Eif4ebp1遺伝子の137-157領域及び231-212領域、プローブ；161-186領域
(45)プライマー対；Igfbp1遺伝子の500-520領域及び583-563領域、プローブ；528-555領域
(46)プライマー対；Siah1a遺伝子の226-246x領域及び297-277領域、プローブ；252-275領域
(47)プライマー対；MuRF1遺伝子の626-644領域及び727-707領域、プローブ；646-676領域
(48)プライマー対；Fads1遺伝子の1013-1031領域及び1107-1088領域、プローブ；1038-1061領域
(49)プライマー対；Fads2遺伝子の398-418領域及び471-453領域、プローブ；420-443領域
(50)プライマー対；Acox1遺伝子の41-60領域及び112-94領域、プローブ；64-91領域
(51)プライマー対；Acox2遺伝子の1849-1867領域及び1926-1907領域、プローブ；1869-1895領域
(52)プライマー対；PKLR遺伝子の589-609領域及び668-648領域、プローブ；619-646領域
【００１３】
上記キットにおけるプローブは、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものであることが好ましい。
上記キットを構成するプライマー対とプローブとの組合せ（セット）の好ましいものとしては、下記(1)〜(52)から選ばれる各配列番号で示される配列を含むもの、より好ましくは各配列番号で示される配列を有するものを挙げることができる。
(1)プライマー対；配列番号５３及び５４、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号５５及び５６、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号５７及び５８、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号５９及び６０、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号６１及び６２、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号６３及び６４、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号６５及び６６、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号６７及び６８、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号６９及び７０、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号７１及び７２、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号７３及び７４、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号７５及び７６、プローブ；配列番号１２
(13)プライマー対；配列番号７７及び７８、プローブ；配列番号１３
(14)プライマー対；配列番号７９及び８０、プローブ；配列番号１４
(15)プライマー対；配列番号８１及び８２、プローブ；配列番号１５
(16)プライマー対；配列番号８３及び８４、プローブ；配列番号１６
(17)プライマー対；配列番号８５及び８６、プローブ；配列番号１７
(18)プライマー対；配列番号８７及び８８、プローブ；配列番号１８
(19)プライマー対；配列番号８９及び９０、プローブ；配列番号１９
(20)プライマー対；配列番号９１及び９２、プローブ；配列番号２０
(21)プライマー対；配列番号９３及び９４、プローブ；配列番号２１
(22)プライマー対；配列番号９５及び９６、プローブ；配列番号２２
(23)プライマー対；配列番号９７及び９８、プローブ；配列番号２３
(24)プライマー対；配列番号９９及び１００、プローブ；配列番号２４
(25)プライマー対；配列番号１０１及び１０２、プローブ；配列番号２５
(26)プライマー対；配列番号１０３及び１０４、プローブ；配列番号２６
(27)プライマー対；配列番号１０５及び１０６、プローブ；配列番号２７
(28)プライマー対；配列番号１０７及び１０８、プローブ；配列番号２８
(29)プライマー対；配列番号１０９及び１１０、プローブ；配列番号２９
(30)プライマー対；配列番号１１１及び１１２、プローブ；配列番号３０
(31)プライマー対；配列番号１１３及び１１４、プローブ；配列番号３１
(32)プライマー対；配列番号１１５及び１１６、プローブ；配列番号３２
(33)プライマー対；配列番号１１７及び１１８、プローブ；配列番号３３
(34)プライマー対；配列番号１１９及び１２０、プローブ；配列番号３４
(35)プライマー対；配列番号１２１及び１２２、プローブ；配列番号３５
(36)プライマー対；配列番号１２３及び１２４、プローブ；配列番号３６
(37)プライマー対；配列番号１２５及び１２６、プローブ；配列番号３７
(38)プライマー対；配列番号１２７及び１２８、プローブ；配列番号３８
(39)プライマー対；配列番号１２９及び１３０、プローブ；配列番号３９
(40)プライマー対；配列番号１３１及び１３２、プローブ；配列番号４０
(41)プライマー対；配列番号１３３及び１３４、プローブ；配列番号４１
(42)プライマー対；配列番号１３５及び１３６、プローブ；配列番号４２
(43)プライマー対；配列番号１３７及び１３８、プローブ；配列番号４３
(44)プライマー対；配列番号１３９及び１４０、プローブ；配列番号４４
(45)プライマー対；配列番号１４１及び１４２、プローブ；配列番号４５
(46)プライマー対；配列番号１４３及び１４４、プローブ；配列番号４６
(47)プライマー対；配列番号１４５及び１４６、プローブ；配列番号４７
(48)プライマー対；配列番号１４７及び１４８、プローブ；配列番号４８
(49)プライマー対；配列番号１４９及び１５０、プローブ；配列番号４９
(50)プライマー対；配列番号１５１及び１５２、プローブ；配列番号５０
(51)プライマー対；配列番号１５３及び１５４、プローブ；配列番号５１
(52)プライマー対；配列番号１５５及び１５６、プローブ；配列番号５２
【００１４】
また、上記各セットはそれぞれ以下のラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定用であることが好ましい。
(1)のセット；CYP2C23測定用
(2)のセット；CYP7A1測定用
(3)のセット；CYPOR測定用
(4)のセット；STAT1測定用
(5)のセット；STAT3測定用
(6)のセット；STAT5a測定用
(7)のセット；STAT5bｖ
(8)のセット；PPARdelta測定用
(9)のセット；PPARgamma測定用
(10)のセット；Ahr測定用
(11)のセット；Arnt測定用
(12)のセット；Arnt2測定用
(13)のセット；Hnf4a測定用
(14)のセット；Grp58測定用
(15)のセット；Fdps測定用
(16)のセット；Srebf1測定用
(17)のセット；SREBP-2測定用
(18)のセット；Sqle測定用
(19)のセット；Pafah1b2測定用
(20)のセット；Pafah1b3測定用
(21)のセット；Pdgfrb測定用
(22)のセット；Igf1r測定用
(23)のセット；Staap測定用
(24)のセット；Plau測定用
(25)のセット；Plat測定用
(26)のセット；TGFbeta1測定用
(27)のセット；Fasn測定用
(28)のセット；Scd1測定用
(29)のセット；Acly測定用
(30)のセット；Thrsp測定用
(31)のセット；Irs1測定用
(32)のセット；Irs2測定用
(33)のセット；Irs3測定用
(34)のセット；Hsd11b1測定用
(35)のセット；Apoe測定用
(36)のセット；Hfe1測定用
(37)のセット；transferrin測定用
(38)のセット；GPT測定用
(39)のセット；GOT1測定用
(40)のセット；GOT2測定用
(41)のセット；Cbl-b測定用
(42)のセット；Fbxo32測定用
(43)のセット；Ubb測定用
(44)のセット；Eif4ebp1測定用
(45)のセット；Igfbp1測定用
(46)のセット；Siah1a測定用
(47)のセット；MuRF1測定用
(48)のセット；Fads1測定用
(49)のセット；Fads2測定用
(50)のセット；Acox1測定用
(51)のセット；Acox2測定用
(52)のセット；PKLR測定用
さらに、本発明によれば、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む検体について、上記いずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ）を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定することを特徴とするラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定方法、特に上記加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無により測定される前記測定方法が提供される。
【００１５】
より詳しくは、フォーワードプライマー及びリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを用いて、５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードする遺伝子を測定するリアルタイム検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、同一ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードする各種ｍＲＮＡを定量することができる。このようなラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡのリアルタイム検出方法の確立は、臨床分野において非常に有益である。
【００１７】
また、上記方法によれば、ラットより手術で摘出した組織やバイオプシーにより摘出した組織中に発現するラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを見るにあたり、迅速に且つ多種の試料を処理でき、また、僅かな組織片から抽出した全ＲＮＡで検出可能である、という効果も得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明におけるプローブ及びプライマー対について詳述する。本発明における各プローブ及びプライマーは、上述した通り、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードする遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。
【００１９】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、後述するＰＣＲ（又はＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００２０】
本発明におけるプローブ及びプライマーに共通する要件としては、増幅生成物が５０〜４００塩基対の長さであること、プライマーとプローブができる限り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）及びＣ（シトシン）の割合が好ましくは５０％前後であること、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないこと、を挙げることができる。加えて、本発明におけるプローブにみられる要件としては、Ｔｍ値が７０℃前後であることを挙げることができ、本発明におけるプライマーにみられる要件としてはＴｍ値が６０℃前後であることを挙げることができる。
【００２１】
それぞれのｍＲＮＡ配列は公知であり、それぞれジーンバンク（BenBank）に以下の登録番号で登録されている。
(1)CYP2C23遺伝子；NM_031839
(2)CYP7A1遺伝子；NM_012942
(3)CYPOR遺伝子；NM_031576
(4)STAT1遺伝子；NM_032612
(5)STAT3遺伝子；NM_012747
(6)STAT5a遺伝子；NM_017064
(7)STAT5b遺伝子；NM_022380
(8)PPARdelta遺伝子；NM_013141
(9)PPARgamma遺伝子；NM_013124
(10)Ahr遺伝子；NM_013149
(11)Arnt遺伝子；NM_012780
(12)Arnt2遺伝子；NM_012781
(13)Hnf4a遺伝子；NM_022180
(14)Grp58遺伝子；NM_017319
(15)Fdps遺伝子；NM_031840
(16)Srebf1遺伝子；XM_213329
(17)SREBP-2遺伝子；XM_216989
(18)Sqle遺伝子；NM_017136
(19)Pafah1b2遺伝子；NM_022387
(20)Pafah1b3遺伝子；NM_053654
(21)Pdgfrb遺伝子；NM_031525, AF359356
(22)Igf1r遺伝子；NM_052807
(23)Staap遺伝子；NM_130744
(24)Plau遺伝子；NM_013085
(25)Plat遺伝子；NM_013151
(26)TGFbeta1遺伝子；NM_021578
(27)Fasn遺伝子；NM_017332
(28)Scd1遺伝子；NM_139192
(29)Acly遺伝子；NM_016987
(30)Thrsp遺伝子；NM_012703
(31)Irs1遺伝子；NM_012969
(32)Irs2遺伝子；AF050159
(33)Irs3遺伝子；NM_032074
(34)Hsd11b1遺伝子；NM_017080
(35)Apoe遺伝子；NM_138828
(36)Hfe1遺伝子；NM_053301
(37)transferrin遺伝子；NM_017055
(38)GPT遺伝子；NM_031039
(39)GOT1遺伝子；NM_012571
(40)GOT2遺伝子；NM_013177
(41)Cbl-b遺伝子；NM_133601
(42)Fbxo32遺伝子；NM_133521
(43)Ubb遺伝子；NM_138895
(44)Eif4ebp1遺伝子；NM_053857
(45)Igfbp1遺伝子；NM_013144
(46)Siah1a遺伝子；NM_080905
(47)MuRF1遺伝子；NM_080903
(48)Fads1遺伝子；NM_053445
(49)Fads2遺伝子；NM_031344
(50)Acox1遺伝子；NM_017340
(51)Acox2遺伝子；NM_145770
(52)PKLR遺伝子；NM_012624
【００２２】
本明細書において、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの特定領域の表示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の開始コドンからの配列に従うものである。
【００２３】
これら各プライマー及びプローブ用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、１５個以上、好ましくは１５〜５０個、より好ましくは２０〜４５個の範囲にあるのがよい。これらプライマー及びプローブのヌクレオチド数が上記範囲よりも多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆に、少なすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する傾向がある。
【００２４】
プライマー及びプローブの特定のヌクレオチド配列の好ましい具体的配列例は、前述したとおり、各分子種に応じて、それぞれ、配列番号１〜５２（プローブの場合）並びに配列番号５３〜１５６（プライマーの場合）に示されるとおりである。
【００２５】
なお、例えば２０ヌクレオチドからなるプライマー又はプローブは、鋳型鎖との間に少数のミスマッチが存在してもハイブリダイズし、ＰＣＲのプライマーとして又は検出用プローブとして機能し得ることが知られている。従って、本発明におけるプライマー及びプローブもまた、上記の特定のヌクレオチド配列を有するものに限定されず、その配列をその一部として含むものや、その配列中の例えば２個以下のヌクレオチドに置換、欠失及び／又は付加による修飾がなされた配列等をも包含することができる。
【００２６】
上述した本発明におけるプローブ及びプライマーとしての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機（例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社製））等を用いて容易に合成することができ、さらに必要に応じて、得られたオリゴヌクレオチドを市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。
【００２７】
本発明のリアルタイム検出用のプローブは、その一端、例えば５′−末端にレポーター色素を結合しており、そして他端、例えば３′−末端にクエンチャー色素を結合していることが好ましい。レポーター色素としては、例えば励起光の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャー色素としては、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合、該レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有する物質が挙げられる。このようなレポーター色素の例としては、例えば、６−カルボキシ−フルオレッセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）等が挙げられる。クエンチャー色素の例としては、例えば、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。
【００２８】
本発明におけるプローブは、前記特定配列のプローブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素及びクエンチャー色素を結合させることにより調製できる。例えば、プローブの５′側は、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形で結合させることができる。また、プローブの３′側には、下記に示す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を結合させ得る。
【００２９】
【化１】
【００３０】
以下、本発明におけるプライマー対及びプローブを利用したＰＣＲによるリアルタイム検出法について詳述する。
【００３１】
本発明にかかる測定方法は、前述した本発明におけるプライマー対及びプローブを利用することを必須として、他は公知のＰＣＲ法（例えば、Science, 230, 1350 (1985)参照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Genome Res., 6(10), 986 (1996)参照）等、特にリアルタイム検出法（例えばTaqMan PCR, ABI PRISM TM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June (1996)参照）に従い実施することができる。
【００３２】
これらの方法は、特に、本発明が対象とするラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの発現量の測定方法として、ｍＲＮＡを測定する場合に有用である。この場合、例えば、特定のラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを発現している生体組織を採取し、常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次にそれに対して相補性のｃＤＮＡを常法に従って合成した後、本発明におけるプライマー対とプローブとを用いて、ＰＣＲを行えばよい。また、常法に従って全ＲＮＡを抽出後、本発明におけるプライマーとプローブとを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲを行なうこともできる。
【００３３】
ＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲ反応は、基本的には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件も、公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に制限されるものではない。具体的には、後述する実施例に示す条件を好ましく採用できる。
【００３４】
検出も、基本的には常法に従い、例えば、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射される蛍光をＣＣＤカメラを用いて検出することにより行なうことができる。
【００３５】
以上のようにして、本発明にかかる測定方法によって、所期の各ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを容易且つ迅速に、しかも各ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡ毎に測定、検出することができる。
【００３６】
本発明のキットは、上記本発明におけるプライマー対及びプローブを含んでなる。本発明のキットは、さらに、対照として使用することのできる既知の核酸や、該核酸を測定するためのプライマー対及びプローブを含んでいてもよい。
【００３７】
本発明のキットによれば、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡをそのラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡ毎に測定、検出でき、ひいては、ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの定量を迅速に、精度よく行なうことができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明をさらに詳しく説明するため、実施例を挙げる。
【００３９】
（実施例）
ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡについて以下の試験を行い、リアルタイム検出方法による検量線を作成した。
本試験で採用したリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲ法は、９６ウエルを用いて、最大９６の異なった反応を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できるものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反応とを行なうことができるものであり、さらに、３８４ウエルでの測定も可能なものである。
【００４０】
本定量の原理は、隣接した２種類の蛍光色素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用したものである。すなわち、ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端に結合させたプローブ（TaqMan probe）が、ＰＣＲで増幅した特定のラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡ種由来のｃＤＮＡにハイブリダイゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反応が始まると、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが有する５’−３’エンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブが加水分解される。それにより、リポーター色素が脱離し、クエンチャー色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによって抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加する。この蛍光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に比例するため、これをＰＣＲ反応毎に測定することによって、所望の定量が可能となる。
【００４１】
本試験では、プローブの５’末端側にはリポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にはクエンチャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。これら各色素の結合及びこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献（Genome Res., 6(10), 986 (1996)）記載の方法に従って行なった。
【００４２】
また、各プライマー及びプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザー（ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（ＡＢＩ社製））を利用して、基質（ｄＮＴＰ）及び規定の試薬を用いて合成した。
【００４３】
検体ＲＮＡとしては、ラットの肝臓プールあるいは心臓プールより精製された全ＲＮＡを用いた。なお、これらの全ＲＮＡは、ラットの肝臓プールあるいは心臓プールよりMini kit（「Rneasy（登録商標）」QIAGEN社製）を用いて調製した。
【００４４】
ラットの肝臓プールあるいは心臓プールより精製された全ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈して２０μｇ／ｍＬとし、検量線作成用とした。以後は、５０μｇ／ｍＬのイーストｔＲＮＡ（「Yeast tRNA」GIBCO社製）を用いて、５倍公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。
【００４５】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、３００ｎＭフォーワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、及び２００ｎＭ TaqManプローブを含むTaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems)を用いて、２０μＬ／チューブの系で、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）にて行なった。
【００４６】
温度等の測定条件は、４８℃で３０分間保温した後、９５℃で１０分間保温し、その後、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を１サイクルとして該サイクルを５０回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
【００４７】
下記表１および表２に示す各ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡに対して各配列番号に示される配列のプライマー対及びプローブを用いて上記試験を行った。結果（検量線）を表３および表４に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表４】
【００５２】
上記表３および表４より、６００００ｐｇ全ＲＮＡ／２０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を作成したところ、定量下限は０．７６８ｐｇ全ＲＮＡ／２０μＬ反応液量から２４００ｐｇ全ＲＮＡ／２０μＬ反応液量であり、検量線の相関係数（ｒ）は全てにおいて０．９９以上であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(52)の各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれることを特徴とするプローブ。
(1)CYP2C23遺伝子の890-915の領域
(2)CYP7A1遺伝子の1009-1034の領域
(3)CYPOR遺伝子の918-950の領域
(4)STAT1遺伝子の1372-1398の領域
(5)STAT3遺伝子の1688-1718の領域
(6)STAT5a遺伝子の2238-2268の領域
(7)STAT5b遺伝子の2253-2278の領域
(8)PPARdelta遺伝子の957-980の領域
(9)PPARgamma遺伝子の1142-1163の領域
(10)Ahr遺伝子の993-1016の領域
(11)Arnt遺伝子の1304-1334の領域
(12)Arnt2遺伝子の1629-1656の領域
(13)Hnf4a遺伝子の229-258の領域
(14)Grp58遺伝子の488-520の領域
(15)Fdps遺伝子の76-104の領域
(16)Srebf1遺伝子の1571-1598の領域
(17)SREBP-2遺伝子の329-357の領域
(18)Sqle遺伝子の231-256の領域
(19)Pafah1b2遺伝子の395-425の領域
(20)Pafah1b3遺伝子の105-135の領域
(21)Pdgfrb遺伝子の2508-2536の領域
(22)Igf1r遺伝子の3576-3600の領域
(23)Staap遺伝子の463-488の領域
(24)Plau遺伝子の418-445の領域
(25)Plat遺伝子の353-380の領域
(26)TGFbeta1遺伝子の345-372の領域
(27)Fasn遺伝子の943-968の領域
(28)Scd1遺伝子の397-426の領域
(29)Acly遺伝子の493-520の領域
(30)Thrsp遺伝子の43-68の領域
(31)Irs1遺伝子の496-529の領域
(32)Irs2遺伝子の405-439の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AF050159での位置、開始コドンからの位置は未確認）
(33)Irs3遺伝子の292-319の領域
(34)Hsd11b1遺伝子の703-726の領域
(35)Apoe遺伝子の187-216の領域
(36)Hfe1遺伝子の740-770の領域
(37)transferrin遺伝子の1522-1553の領域
(38)GPT遺伝子の931-958の領域
(39)GOT1遺伝子の698-730の領域
(40)GOT2遺伝子の1033-1056の領域
(41)Cbl-b遺伝子の196-228の領域
(42)Fbxo32遺伝子の841-865の領域
(43)Ubb遺伝子の152-179の領域
(44)Eif4ebp1遺伝子の161-186の領域
(45)Igfbp1遺伝子の528-555の領域
(46)Siah1a遺伝子の252-275の領域
(47)MuRF1遺伝子の646-676の領域
(48)Fads1遺伝子の1038-1061の領域
(49)Fads2遺伝子の420-443の領域
(50)Acox1遺伝子の64-91の領域
(51)Acox2遺伝子の1869-1895の領域
(52)PKLR遺伝子の619-646の領域
【請求項２】
リポーター色素とクエンチャー色素とが結合している請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
塩基配列の長さが２０〜４５である請求項１または２に記載のプローブ。
【請求項４】
配列番号１〜配列番号５２に示される配列のいずれかを含むものである請求項１〜３のいずれかに記載のプローブ。
【請求項５】
配列番号１〜配列番号５２に示される配列のいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載のプローブ。
【請求項６】
ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードする遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対およびプローブのセットの少なくとも１つを含むラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出および定量キットであって、上記両プライマー対およびプローブが下記(1)〜(52)に示される遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであることを特徴とするキット。
(1)プライマー対；CYP2C23遺伝子の868-888領域及び977-958領域、プローブ；890-915領域
(2)プライマー対；CYP7A1遺伝子の981-1001領域及び1082-1063領域、プローブ；1009-1034領域
(3)プライマー対；CYPOR遺伝子の890-908領域及び983-963領域、プローブ；918-950領域
(4)プライマー対；STAT1遺伝子の1351-1371領域及び1419-1400領域、プローブ；1372-1398領域
(5)プライマー対；STAT3遺伝子の1652-1670領域及び1746-1726領域、プローブ；1688-1718領域
(6)プライマー対；STAT5a遺伝子の2201-2221領域及び2300-2280領域、プローブ；2238-2268領域
(7)プライマー対；STAT5b遺伝子の2221-2242領域及び2307-2292領域、プローブ；2253-2278領域
(8)プライマー対；PPARdelta遺伝子の935-955領域及び1002-983領域、プローブ；957-980領域
(9)プライマー対；PPARgamma遺伝子の1120-1140領域及び1196-1175領域、プローブ；1142-1163領域
(10)プライマー対；Ahr遺伝子の962-980領域及び1059-1040領域、プローブ；993-1016領域
(11)プライマー対；Arnt遺伝子の1282-1302領域及び1393-1375領域、プローブ；1304-1334領域
(12)プライマー対；Arnt2遺伝子の1603-1623領域及び1682-1662領域、プローブ；1629-1656領域
(13)プライマー対；Hnf4a遺伝子の206-224領域及び293-273領域、プローブ；229-258領域
(14)プライマー対；Grp58遺伝子の467-485領域及び563-543領域、プローブ；488-520領域
(15)プライマー対；Fdps遺伝子の53-73領域及び146-126領域、プローブ；76-104領域
(16)プライマー対；Srebf1遺伝子の1546-1569領域及び1662-1643領域、プローブ；1571-1598領域
(17)プライマー対；SREBP-2遺伝子の303-323領域及び394-374領域、プローブ；329-357領域
(18)プライマー対；Sqle遺伝子の209-229領域及び282-259領域、プローブ；231-256領域
(19)プライマー対；Pafah1b2遺伝子の373-393領域及び447-427領域、プローブ；395-425領域
(20)プライマー対；Pafah1b3遺伝子の83-102領域及び161-141領域、プローブ；105-135領域
(21)プライマー対；Pdgfrb遺伝子の2482-2502領域及び2563-2544領域、プローブ；2508-2536領域
(22)プライマー対；Igf1r遺伝子の3556-3574領域及び3673-3653領域、プローブ；3576-3600領域
(23)プライマー対；Staap遺伝子の442-461領域及び511-492領域、プローブ；463-488領域
(24)プライマー対；Plau遺伝子の397-416領域及び470-450領域、プローブ；418-445領域
(25)プライマー対；Plat遺伝子の332-351領域及び429-411領域、プローブ；353-380領域
(26)プライマー対；TGFbeta1遺伝子の320-338領域及び424-404領域、プローブ；345-372領域
(27)プライマー対；Fasn遺伝子の911-931領域及び993-974領域、プローブ；943-968領域
(28)プライマー対；Scd1遺伝子の367-387領域及び462-444領域、プローブ；397-426領域
(29)プライマー対；Acly遺伝子の469-489領域及び569-549領域、プローブ；493-520領域
(30)プライマー対；Thrsp遺伝子の22-40領域及び97-77領域、プローブ；43-68領域
(31)プライマー対；Irs1遺伝子の467-487領域及び559-541領域、プローブ；496-529領域
(32)プライマー対；Irs2遺伝子の376-395領域及び461-441領域、プローブ；405-439の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AF050159での位置、開始コドンからの位置は未確認）
(33)プライマー対；Irs3遺伝子の262-280領域及び378-358領域、プローブ；292-319領域
(34)プライマー対；Hsd11b1遺伝子の682-701領域及び746-728領域、プローブ；703-726領域
(35)プライマー対；Apoe遺伝子の159-179領域及び247-222領域、プローブ；187-216領域
(36)プライマー対；Hfe1遺伝子の716-736領域及び805-785領域、プローブ；740-770領域
(37)プライマー対；transferrin遺伝子の1500-1520領域及び1575-1556領域、プローブ；1522-1553領域
(38)プライマー対；GPT遺伝子の910-929領域及び992-972領域、プローブ；931-958領域
(39)プライマー対；GOT1遺伝子の673-693領域及び752-732領域、プローブ；698-730領域
(40)プライマー対；GOT2遺伝子の1010-1028領域及び1158-1138領域、プローブ；1033-1056領域
(41)プライマー対；Cbl-b遺伝子の173-192領域及び259-240領域、プローブ；196-228領域
(42)プライマー対；Fbxo32遺伝子の818-837領域及び901-882領域、プローブ；841-865領域
(43)プライマー対；Ubb遺伝子の114-134領域及び207-187領域、プローブ；152-179領域
(44)プライマー対；Eif4ebp1遺伝子の137-157領域及び231-212領域、プローブ；161-186領域
(45)プライマー対；Igfbp1遺伝子の500-520領域及び583-563領域、プローブ；528-555領域
(46)プライマー対；Siah1a遺伝子の226-246x領域及び297-277領域、プローブ；252-275領域
(47)プライマー対；MuRF1遺伝子の626-644領域及び727-707領域、プローブ；646-676領域
(48)プライマー対；Fads1遺伝子の1013-1031領域及び1107-1088領域、プローブ；1038-1061領域
(49)プライマー対；Fads2遺伝子の398-418領域及び471-453領域、プローブ；420-443領域
(50)プライマー対；Acox1遺伝子の41-60領域及び112-94領域、プローブ；64-91領域
(51)プライマー対；Acox2遺伝子の1849-1867領域及び1926-1907領域、プローブ；1869-1895領域
(52)プライマー対；PKLR遺伝子の589-609領域及び668-648領域、プローブ；619-646領域
【請求項７】
プローブが、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである請求項６に記載のキット。
【請求項８】
下記(1)〜(52)に示されるセットの、各配列番号で示される配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とプローブとの組合せから選ばれる、請求項６または７に記載のキット。
(1)プライマー対；配列番号５３及び５４、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号５５及び５６、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号５７及び５８、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号５９及び６０、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号６１及び６２、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号６３及び６４、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号６５及び６６、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号６７及び６８、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号６９及び７０、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号７１及び７２、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号７３及び７４、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号７５及び７６、プローブ；配列番号１２
(13)プライマー対；配列番号７７及び７８、プローブ；配列番号１３
(14)プライマー対；配列番号７９及び８０、プローブ；配列番号１４
(15)プライマー対；配列番号８１及び８２、プローブ；配列番号１５
(16)プライマー対；配列番号８３及び８４、プローブ；配列番号１６
(17)プライマー対；配列番号８５及び８６、プローブ；配列番号１７
(18)プライマー対；配列番号８７及び８８、プローブ；配列番号１８
(19)プライマー対；配列番号８９及び９０、プローブ；配列番号１９
(20)プライマー対；配列番号９１及び９２、プローブ；配列番号２０
(21)プライマー対；配列番号９３及び９４、プローブ；配列番号２１
(22)プライマー対；配列番号９５及び９６、プローブ；配列番号２２
(23)プライマー対；配列番号９７及び９８、プローブ；配列番号２３
(24)プライマー対；配列番号９９及び１００、プローブ；配列番号２４
(25)プライマー対；配列番号１０１及び１０２、プローブ；配列番号２５
(26)プライマー対；配列番号１０３及び１０４、プローブ；配列番号２６
(27)プライマー対；配列番号１０５及び１０６、プローブ；配列番号２７
(28)プライマー対；配列番号１０７及び１０８、プローブ；配列番号２８
(29)プライマー対；配列番号１０９及び１１０、プローブ；配列番号２９
(30)プライマー対；配列番号１１１及び１１２、プローブ；配列番号３０
(31)プライマー対；配列番号１１３及び１１４、プローブ；配列番号３１
(32)プライマー対；配列番号１１５及び１１６、プローブ；配列番号３２
(33)プライマー対；配列番号１１７及び１１８、プローブ；配列番号３３
(34)プライマー対；配列番号１１９及び１２０、プローブ；配列番号３４
(35)プライマー対；配列番号１２１及び１２２、プローブ；配列番号３５
(36)プライマー対；配列番号１２３及び１２４、プローブ；配列番号３６
(37)プライマー対；配列番号１２５及び１２６、プローブ；配列番号３７
(38)プライマー対；配列番号１２７及び１２８、プローブ；配列番号３８
(39)プライマー対；配列番号１２９及び１３０、プローブ；配列番号３９
(40)プライマー対；配列番号１３１及び１３２、プローブ；配列番号４０
(41)プライマー対；配列番号１３３及び１３４、プローブ；配列番号４１
(42)プライマー対；配列番号１３５及び１３６、プローブ；配列番号４２
(43)プライマー対；配列番号１３７及び１３８、プローブ；配列番号４３
(44)プライマー対；配列番号１３９及び１４０、プローブ；配列番号４４
(45)プライマー対；配列番号１４１及び１４２、プローブ；配列番号４５
(46)プライマー対；配列番号１４３及び１４４、プローブ；配列番号４６
(47)プライマー対；配列番号１４５及び１４６、プローブ；配列番号４７
(48)プライマー対；配列番号１４７及び１４８、プローブ；配列番号４８
(49)プライマー対；配列番号１４９及び１５０、プローブ；配列番号４９
(50)プライマー対；配列番号１５１及び１５２、プローブ；配列番号５０
(51)プライマー対；配列番号１５３及び１５４、プローブ；配列番号５１
(52)プライマー対；配列番号１５５及び１５６、プローブ；配列番号５２
【請求項９】
請求項８に記載のキットであって、(1)のセットがCYP2C23の測定用で、(2)のセットがCYP7A1の測定用で、(3)のセットがCYPORの測定用で、(4)のセットがSTAT1の測定用で、(5)のセットがSTAT3の測定用で、(6)のセットがSTAT5aの測定用で、(7)のセットがSTAT5bの測定用で、(8)のセットがPPARdeltaの測定用で、(9)のセットがPPARgammaの測定用で、(10)のセットがAhrの測定用で、(11)のセットがArntの測定用で、(12)のセットがArnt2の測定用で、(13)のセットがHnf4aの測定用で、(14)のセットがGrp58の測定用で、(15)のセットがFdpsの測定用で、 (16)のセットがSrebf1の測定用で、(17)のセットがSREBP-2の測定用で、(18)のセットがSqleの測定用で、(19)のセットがPafah1b2の測定用で、(20)のセットがPafah1b3の測定用で、 (21)のセットがPdgfrbの測定用で、(22)のセットがIgf1rの測定用で、(23)のセットがStaapの測定用で、(24)のセットがPlauの測定用で、(25)のセットがPlatの測定用で、(26)のセットがTGFbeta1の測定用で、(27)のセットがFasnの測定用で、(28)のセットがScd1の測定用で、(29)のセットがAclyの測定用で、(30)のセットがThrspの測定用で、(31)のセットがIrs1の測定用で、(32)のセットがIrs2の測定用で、(33)のセットがIrs3の測定用で、(34)のセットがHsd11b1の測定用で、(35)のセットがApoeの測定用で、(36)のセットがHfe1の測定用で、(37)のセットがtransferrinの測定用で、(38)のセットがGPTの測定用で、(39)のセットがGOT1の測定用で、(40)のセットがGOT2の測定用で、(41)のセットがCbl-bの測定用で、(42)のセットがFbxo32の測定用で、(43)のセットがUbbの測定用で、(44)のセットがEif4ebp1の測定用で、(45)のセットがIgfbp1の測定用で、(46)のセットがSiah1aの測定用で、(47)のセットがMuRF1の測定用で、(48)のセットがFads1の測定用で、(49)のセットがFads2の測定用で、(50)のセットがAcox1の測定用で、(51)のセットがAcox2の測定用で、(52)のセットがPKLRの測定用であるキット。
【請求項１０】
請求項８に記載の(1)〜(52)に示されるセットの、各配列番号で示される配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とプローブとの組合せから選ばれる、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む検体について、請求項６〜１０のいずれかに記載のキットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ）を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定することを特徴とするラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定方法。
【請求項１２】
加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無により測定される請求項１１に記載の測定方法。
【請求項１】
ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定に用いられるプローブであって、下記(1)〜(52)の各領域のそれぞれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選ばれることを特徴とするプローブ。
(1)CYP2C23遺伝子の890-915の領域
(2)CYP7A1遺伝子の1009-1034の領域
(3)CYPOR遺伝子の918-950の領域
(4)STAT1遺伝子の1372-1398の領域
(5)STAT3遺伝子の1688-1718の領域
(6)STAT5a遺伝子の2238-2268の領域
(7)STAT5b遺伝子の2253-2278の領域
(8)PPARdelta遺伝子の957-980の領域
(9)PPARgamma遺伝子の1142-1163の領域
(10)Ahr遺伝子の993-1016の領域
(11)Arnt遺伝子の1304-1334の領域
(12)Arnt2遺伝子の1629-1656の領域
(13)Hnf4a遺伝子の229-258の領域
(14)Grp58遺伝子の488-520の領域
(15)Fdps遺伝子の76-104の領域
(16)Srebf1遺伝子の1571-1598の領域
(17)SREBP-2遺伝子の329-357の領域
(18)Sqle遺伝子の231-256の領域
(19)Pafah1b2遺伝子の395-425の領域
(20)Pafah1b3遺伝子の105-135の領域
(21)Pdgfrb遺伝子の2508-2536の領域
(22)Igf1r遺伝子の3576-3600の領域
(23)Staap遺伝子の463-488の領域
(24)Plau遺伝子の418-445の領域
(25)Plat遺伝子の353-380の領域
(26)TGFbeta1遺伝子の345-372の領域
(27)Fasn遺伝子の943-968の領域
(28)Scd1遺伝子の397-426の領域
(29)Acly遺伝子の493-520の領域
(30)Thrsp遺伝子の43-68の領域
(31)Irs1遺伝子の496-529の領域
(32)Irs2遺伝子の405-439の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AF050159での位置、開始コドンからの位置は未確認）
(33)Irs3遺伝子の292-319の領域
(34)Hsd11b1遺伝子の703-726の領域
(35)Apoe遺伝子の187-216の領域
(36)Hfe1遺伝子の740-770の領域
(37)transferrin遺伝子の1522-1553の領域
(38)GPT遺伝子の931-958の領域
(39)GOT1遺伝子の698-730の領域
(40)GOT2遺伝子の1033-1056の領域
(41)Cbl-b遺伝子の196-228の領域
(42)Fbxo32遺伝子の841-865の領域
(43)Ubb遺伝子の152-179の領域
(44)Eif4ebp1遺伝子の161-186の領域
(45)Igfbp1遺伝子の528-555の領域
(46)Siah1a遺伝子の252-275の領域
(47)MuRF1遺伝子の646-676の領域
(48)Fads1遺伝子の1038-1061の領域
(49)Fads2遺伝子の420-443の領域
(50)Acox1遺伝子の64-91の領域
(51)Acox2遺伝子の1869-1895の領域
(52)PKLR遺伝子の619-646の領域
【請求項２】
リポーター色素とクエンチャー色素とが結合している請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
塩基配列の長さが２０〜４５である請求項１または２に記載のプローブ。
【請求項４】
配列番号１〜配列番号５２に示される配列のいずれかを含むものである請求項１〜３のいずれかに記載のプローブ。
【請求項５】
配列番号１〜配列番号５２に示される配列のいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載のプローブ。
【請求項６】
ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードする遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対およびプローブのセットの少なくとも１つを含むラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの検出および定量キットであって、上記両プライマー対およびプローブが下記(1)〜(52)に示される遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであることを特徴とするキット。
(1)プライマー対；CYP2C23遺伝子の868-888領域及び977-958領域、プローブ；890-915領域
(2)プライマー対；CYP7A1遺伝子の981-1001領域及び1082-1063領域、プローブ；1009-1034領域
(3)プライマー対；CYPOR遺伝子の890-908領域及び983-963領域、プローブ；918-950領域
(4)プライマー対；STAT1遺伝子の1351-1371領域及び1419-1400領域、プローブ；1372-1398領域
(5)プライマー対；STAT3遺伝子の1652-1670領域及び1746-1726領域、プローブ；1688-1718領域
(6)プライマー対；STAT5a遺伝子の2201-2221領域及び2300-2280領域、プローブ；2238-2268領域
(7)プライマー対；STAT5b遺伝子の2221-2242領域及び2307-2292領域、プローブ；2253-2278領域
(8)プライマー対；PPARdelta遺伝子の935-955領域及び1002-983領域、プローブ；957-980領域
(9)プライマー対；PPARgamma遺伝子の1120-1140領域及び1196-1175領域、プローブ；1142-1163領域
(10)プライマー対；Ahr遺伝子の962-980領域及び1059-1040領域、プローブ；993-1016領域
(11)プライマー対；Arnt遺伝子の1282-1302領域及び1393-1375領域、プローブ；1304-1334領域
(12)プライマー対；Arnt2遺伝子の1603-1623領域及び1682-1662領域、プローブ；1629-1656領域
(13)プライマー対；Hnf4a遺伝子の206-224領域及び293-273領域、プローブ；229-258領域
(14)プライマー対；Grp58遺伝子の467-485領域及び563-543領域、プローブ；488-520領域
(15)プライマー対；Fdps遺伝子の53-73領域及び146-126領域、プローブ；76-104領域
(16)プライマー対；Srebf1遺伝子の1546-1569領域及び1662-1643領域、プローブ；1571-1598領域
(17)プライマー対；SREBP-2遺伝子の303-323領域及び394-374領域、プローブ；329-357領域
(18)プライマー対；Sqle遺伝子の209-229領域及び282-259領域、プローブ；231-256領域
(19)プライマー対；Pafah1b2遺伝子の373-393領域及び447-427領域、プローブ；395-425領域
(20)プライマー対；Pafah1b3遺伝子の83-102領域及び161-141領域、プローブ；105-135領域
(21)プライマー対；Pdgfrb遺伝子の2482-2502領域及び2563-2544領域、プローブ；2508-2536領域
(22)プライマー対；Igf1r遺伝子の3556-3574領域及び3673-3653領域、プローブ；3576-3600領域
(23)プライマー対；Staap遺伝子の442-461領域及び511-492領域、プローブ；463-488領域
(24)プライマー対；Plau遺伝子の397-416領域及び470-450領域、プローブ；418-445領域
(25)プライマー対；Plat遺伝子の332-351領域及び429-411領域、プローブ；353-380領域
(26)プライマー対；TGFbeta1遺伝子の320-338領域及び424-404領域、プローブ；345-372領域
(27)プライマー対；Fasn遺伝子の911-931領域及び993-974領域、プローブ；943-968領域
(28)プライマー対；Scd1遺伝子の367-387領域及び462-444領域、プローブ；397-426領域
(29)プライマー対；Acly遺伝子の469-489領域及び569-549領域、プローブ；493-520領域
(30)プライマー対；Thrsp遺伝子の22-40領域及び97-77領域、プローブ；43-68領域
(31)プライマー対；Irs1遺伝子の467-487領域及び559-541領域、プローブ；496-529領域
(32)プライマー対；Irs2遺伝子の376-395領域及び461-441領域、プローブ；405-439の領域（ジーンバンク(GenBank)の登録番号AF050159での位置、開始コドンからの位置は未確認）
(33)プライマー対；Irs3遺伝子の262-280領域及び378-358領域、プローブ；292-319領域
(34)プライマー対；Hsd11b1遺伝子の682-701領域及び746-728領域、プローブ；703-726領域
(35)プライマー対；Apoe遺伝子の159-179領域及び247-222領域、プローブ；187-216領域
(36)プライマー対；Hfe1遺伝子の716-736領域及び805-785領域、プローブ；740-770領域
(37)プライマー対；transferrin遺伝子の1500-1520領域及び1575-1556領域、プローブ；1522-1553領域
(38)プライマー対；GPT遺伝子の910-929領域及び992-972領域、プローブ；931-958領域
(39)プライマー対；GOT1遺伝子の673-693領域及び752-732領域、プローブ；698-730領域
(40)プライマー対；GOT2遺伝子の1010-1028領域及び1158-1138領域、プローブ；1033-1056領域
(41)プライマー対；Cbl-b遺伝子の173-192領域及び259-240領域、プローブ；196-228領域
(42)プライマー対；Fbxo32遺伝子の818-837領域及び901-882領域、プローブ；841-865領域
(43)プライマー対；Ubb遺伝子の114-134領域及び207-187領域、プローブ；152-179領域
(44)プライマー対；Eif4ebp1遺伝子の137-157領域及び231-212領域、プローブ；161-186領域
(45)プライマー対；Igfbp1遺伝子の500-520領域及び583-563領域、プローブ；528-555領域
(46)プライマー対；Siah1a遺伝子の226-246x領域及び297-277領域、プローブ；252-275領域
(47)プライマー対；MuRF1遺伝子の626-644領域及び727-707領域、プローブ；646-676領域
(48)プライマー対；Fads1遺伝子の1013-1031領域及び1107-1088領域、プローブ；1038-1061領域
(49)プライマー対；Fads2遺伝子の398-418領域及び471-453領域、プローブ；420-443領域
(50)プライマー対；Acox1遺伝子の41-60領域及び112-94領域、プローブ；64-91領域
(51)プライマー対；Acox2遺伝子の1849-1867領域及び1926-1907領域、プローブ；1869-1895領域
(52)プライマー対；PKLR遺伝子の589-609領域及び668-648領域、プローブ；619-646領域
【請求項７】
プローブが、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである請求項６に記載のキット。
【請求項８】
下記(1)〜(52)に示されるセットの、各配列番号で示される配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とプローブとの組合せから選ばれる、請求項６または７に記載のキット。
(1)プライマー対；配列番号５３及び５４、プローブ；配列番号１
(2)プライマー対；配列番号５５及び５６、プローブ；配列番号２
(3)プライマー対；配列番号５７及び５８、プローブ；配列番号３
(4)プライマー対；配列番号５９及び６０、プローブ；配列番号４
(5)プライマー対；配列番号６１及び６２、プローブ；配列番号５
(6)プライマー対；配列番号６３及び６４、プローブ；配列番号６
(7)プライマー対；配列番号６５及び６６、プローブ；配列番号７
(8)プライマー対；配列番号６７及び６８、プローブ；配列番号８
(9)プライマー対；配列番号６９及び７０、プローブ；配列番号９
(10)プライマー対；配列番号７１及び７２、プローブ；配列番号１０
(11)プライマー対；配列番号７３及び７４、プローブ；配列番号１１
(12)プライマー対；配列番号７５及び７６、プローブ；配列番号１２
(13)プライマー対；配列番号７７及び７８、プローブ；配列番号１３
(14)プライマー対；配列番号７９及び８０、プローブ；配列番号１４
(15)プライマー対；配列番号８１及び８２、プローブ；配列番号１５
(16)プライマー対；配列番号８３及び８４、プローブ；配列番号１６
(17)プライマー対；配列番号８５及び８６、プローブ；配列番号１７
(18)プライマー対；配列番号８７及び８８、プローブ；配列番号１８
(19)プライマー対；配列番号８９及び９０、プローブ；配列番号１９
(20)プライマー対；配列番号９１及び９２、プローブ；配列番号２０
(21)プライマー対；配列番号９３及び９４、プローブ；配列番号２１
(22)プライマー対；配列番号９５及び９６、プローブ；配列番号２２
(23)プライマー対；配列番号９７及び９８、プローブ；配列番号２３
(24)プライマー対；配列番号９９及び１００、プローブ；配列番号２４
(25)プライマー対；配列番号１０１及び１０２、プローブ；配列番号２５
(26)プライマー対；配列番号１０３及び１０４、プローブ；配列番号２６
(27)プライマー対；配列番号１０５及び１０６、プローブ；配列番号２７
(28)プライマー対；配列番号１０７及び１０８、プローブ；配列番号２８
(29)プライマー対；配列番号１０９及び１１０、プローブ；配列番号２９
(30)プライマー対；配列番号１１１及び１１２、プローブ；配列番号３０
(31)プライマー対；配列番号１１３及び１１４、プローブ；配列番号３１
(32)プライマー対；配列番号１１５及び１１６、プローブ；配列番号３２
(33)プライマー対；配列番号１１７及び１１８、プローブ；配列番号３３
(34)プライマー対；配列番号１１９及び１２０、プローブ；配列番号３４
(35)プライマー対；配列番号１２１及び１２２、プローブ；配列番号３５
(36)プライマー対；配列番号１２３及び１２４、プローブ；配列番号３６
(37)プライマー対；配列番号１２５及び１２６、プローブ；配列番号３７
(38)プライマー対；配列番号１２７及び１２８、プローブ；配列番号３８
(39)プライマー対；配列番号１２９及び１３０、プローブ；配列番号３９
(40)プライマー対；配列番号１３１及び１３２、プローブ；配列番号４０
(41)プライマー対；配列番号１３３及び１３４、プローブ；配列番号４１
(42)プライマー対；配列番号１３５及び１３６、プローブ；配列番号４２
(43)プライマー対；配列番号１３７及び１３８、プローブ；配列番号４３
(44)プライマー対；配列番号１３９及び１４０、プローブ；配列番号４４
(45)プライマー対；配列番号１４１及び１４２、プローブ；配列番号４５
(46)プライマー対；配列番号１４３及び１４４、プローブ；配列番号４６
(47)プライマー対；配列番号１４５及び１４６、プローブ；配列番号４７
(48)プライマー対；配列番号１４７及び１４８、プローブ；配列番号４８
(49)プライマー対；配列番号１４９及び１５０、プローブ；配列番号４９
(50)プライマー対；配列番号１５１及び１５２、プローブ；配列番号５０
(51)プライマー対；配列番号１５３及び１５４、プローブ；配列番号５１
(52)プライマー対；配列番号１５５及び１５６、プローブ；配列番号５２
【請求項９】
請求項８に記載のキットであって、(1)のセットがCYP2C23の測定用で、(2)のセットがCYP7A1の測定用で、(3)のセットがCYPORの測定用で、(4)のセットがSTAT1の測定用で、(5)のセットがSTAT3の測定用で、(6)のセットがSTAT5aの測定用で、(7)のセットがSTAT5bの測定用で、(8)のセットがPPARdeltaの測定用で、(9)のセットがPPARgammaの測定用で、(10)のセットがAhrの測定用で、(11)のセットがArntの測定用で、(12)のセットがArnt2の測定用で、(13)のセットがHnf4aの測定用で、(14)のセットがGrp58の測定用で、(15)のセットがFdpsの測定用で、 (16)のセットがSrebf1の測定用で、(17)のセットがSREBP-2の測定用で、(18)のセットがSqleの測定用で、(19)のセットがPafah1b2の測定用で、(20)のセットがPafah1b3の測定用で、 (21)のセットがPdgfrbの測定用で、(22)のセットがIgf1rの測定用で、(23)のセットがStaapの測定用で、(24)のセットがPlauの測定用で、(25)のセットがPlatの測定用で、(26)のセットがTGFbeta1の測定用で、(27)のセットがFasnの測定用で、(28)のセットがScd1の測定用で、(29)のセットがAclyの測定用で、(30)のセットがThrspの測定用で、(31)のセットがIrs1の測定用で、(32)のセットがIrs2の測定用で、(33)のセットがIrs3の測定用で、(34)のセットがHsd11b1の測定用で、(35)のセットがApoeの測定用で、(36)のセットがHfe1の測定用で、(37)のセットがtransferrinの測定用で、(38)のセットがGPTの測定用で、(39)のセットがGOT1の測定用で、(40)のセットがGOT2の測定用で、(41)のセットがCbl-bの測定用で、(42)のセットがFbxo32の測定用で、(43)のセットがUbbの測定用で、(44)のセットがEif4ebp1の測定用で、(45)のセットがIgfbp1の測定用で、(46)のセットがSiah1aの測定用で、(47)のセットがMuRF1の測定用で、(48)のセットがFads1の測定用で、(49)のセットがFads2の測定用で、(50)のセットがAcox1の測定用で、(51)のセットがAcox2の測定用で、(52)のセットがPKLRの測定用であるキット。
【請求項１０】
請求項８に記載の(1)〜(52)に示されるセットの、各配列番号で示される配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とプローブとの組合せから選ばれる、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
ラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む検体について、請求項６〜１０のいずれかに記載のキットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ）を行い、用いたプローブの加水分解の有無を測定することを特徴とするラットにおける糖、脂肪、蛋白質の代謝に関連する蛋白質をコードするｍＲＮＡの測定方法。
【請求項１２】
加水分解の有無が、励起光照射による蛍光の発色の有無により測定される請求項１１に記載の測定方法。
【公開番号】特開２００８−２１２０３２（Ｐ２００８−２１２０３２Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２０５３（Ｐ２００７−５２０５３）
【出願日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【出願人】（０００１４９４３５）株式会社大塚製薬工場 (154)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【出願人】（０００１４９４３５）株式会社大塚製薬工場 (154)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]