リンパ球枯渇剤をＣＴＬおよびサイトカインと組合せる癌処置
細胞療法を化学療法と組合せる癌処置において、自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞を患者から得、選択されたペプチド抗原を負荷した異種抗原提示細胞とそれらを接触させることによりｅｘ ｖｉｖｏで活性化して、それにより抗原特異的活性化細胞傷害性Ｔリンパ球を生成する。こうした活性化ＣＴＬを、クラドリビン若しくはデニロイキンジフチトクスのような非骨髄破壊的しかしリンパ球を枯渇する剤、ならびにインターロイキン−２およびインターフェロン−α−２ｂ刺激性サイトカインを含んでなるリンパ球枯渇およびＣＴＬ維持レジメンとともに患者に投与する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への交差引用
本出願は、２００６年３月１日出願の米国仮出願第６０／７７８，５１６号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、活性化細胞傷害性リンパ球、ＩＬ−２およびＩＦＮ−α−２ｂのようなサイトカイン、ならびにリンパ球枯渇剤（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）としてのクラドリビン若しくはデニロイキンジフチトクスの投与を伴う、患者における癌の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の正しい認識を容易にするため、本節は、発明者に独特でありうる観察結果、結論および観点を包含する本発明の開発に至る歴史的および技術的背景を論考しうる。従って、本明細書の背景の声明は、従来技術の内容に関する承認として解釈されるべきでない。
【０００４】
多数の治療が、多様な癌を処置するため開発された。これらの努力の多くは化学療法レジメンに集中してきた。転移性黒色腫の処置として設計された１種の特定の併用化学療法レジメンで、３５〜５０％の奏功率が「ダートマスレジメン」（ＤＴＩＣ、シスプラチン、ＢＣＮＵおよびタモキシフェンの組合せ）で報告されたが、しかし生存期間は６ないし１０か月のままであった。高寛解率は、積極的高用量強度化学療法（非特許文献１）、および自己骨髄移植での造血過多についてもまた報告されている。にもかかわらず、生存期間の中央値は短かった（およそ４か月（非特許文献２））。
【０００５】
数年の桁での生存の有意の改善が、ある種の免疫療法を受けている黒色腫患者の小さい比率で示されている。これは、癌ワクチンでの能動的特異的免疫療法、ならびに、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）のような免疫系の非特異的ブースターの使用を包含する（非特許文献３〜５）。
【０００６】
黒色腫におけるＴ細胞に定義される腫瘍抗原の同定は、抗原特異的細胞性免疫応答を増強することを試みることにより癌細胞を標的とする臨床試験に至った。このアプローチは、強力なＴ細胞応答をｉｎ ｖｉｖｏで誘導するための試みにおいて、免疫原性の情況で抗原が送達される多数のワクチン接種戦略で遂行された。数種の臨床応答が該ワクチン試験で観察されたとは言え、誘導されるＴ細胞応答の大きさは一般に低いか若しくは検出不可能であり、そして臨床応答と乏しく相関した。黒色腫患者の癌抗原での免疫化は循環ＣＴＬ前駆体の数を増大させうるが；しかしながらそれは臨床での腫瘍退縮と相関せず、ｉｎ ｖｉｖｏでの機能若しくは活性化の欠陥を示唆している。
【０００７】
マウス腫瘍モデルでの研究は、１種若しくはそれ以上の腫瘍抗原に特異的なＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化を必要とする養子免疫療法が、最小限の毒性を伴い有効でありうることを示した。ヒト腫瘍の処置にこの戦略を応用することにおける一障害は、腫瘍細胞をＣＴＬ媒介性破壊に対し感受性にする免疫原性抗原の同定であった。黒色腫患者からの腫瘍反応性Ｔ細胞の単離は、ＣＴＬが向けられる腫瘍抗原（エピトープ）のいくつかの同定に至った。これらはチロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００およびＭＡＧＥを包含する。これらのうち、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１は黒色腫でほぼ普遍的に発現されており、そして従って養子免疫療法の所望の標的選択を表す（非特許文献６〜１３）。
【０００８】
養子Ｔ細胞療法は、癌患者においてｉｎ ｖｉｖｏで免疫寛容誘発機構が活性である宿主環境からのＴ細胞の取り出しを必要とし、そして、この患者集団で示される無効な応答に寄与する。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は抗原特異的ＣＴＬを生成するためにｅｘ ｖｉｖｏで刺激しうる（例えば特許文献１を参照されたい）。早期の養子免疫療法のアプローチは、多様な癌の処置として活性化リンパ球を使用した（非特許文献１４）。当初、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、および後にｅｘ ｖｉｖｏでＩＬ−２で活性化した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が使用されたが、しかし有効性の実証はあいまいであった。これらの早期の対照臨床試験は、黒色腫患者へのＩＬ−２の直接投与を上回るｅｘ ｖｉｖｏ活性化細胞の使用の利点を示すことに失敗した。Ｙｅｅら（フレッド・ハッチンソン癌研究センター）（非特許文献１５）およびＤｕｄｌｅｙら（ＮＣＩ）（非特許文献１６）によるより最近の研究は、ある種の養子Ｔ細胞の治療的アプローチに対する潜在性を示した。これらの研究は、ＭＡＲＴ−１若しくはｇｐ１００に特異的なＴ細胞クローンおよび低用量ＩＬ−２、または同種支持細胞とともにｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＴＩＬおよび高用量ＩＬ−２のいずれかの使用を必要とした。これらの研究は養子免疫療法が癌の処置として期待できることを確認したとは言え、その完全な開発は、治療的抗原特異的ＣＤ８＋ ＣＴＬ数の再現可能なｅｘ ｖｉｖｏ生成方法の欠如により妨げられていた（非特許文献１７）。
【０００９】
Ｃｙｔｏｔｏｌｙｔｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ細胞はウイルス感染に対する主防御線である。ＣＤ８＋リンパ球はウイルスに感染している宿主細胞を特異的に認識かつ溶解する。ＣＴＬの細胞傷害活性を利用することが望ましいとみられるとは言え、ＣＴＬを特異的に活性化するために利用可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏ手順はほとんどなかった。重要な黒色腫関連抗原の同定、およびＣＴＬの特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化方法が、転移性黒色腫の養子免疫療法の効率的評価を見込む（非特許文献１５〜１８）。
【００１０】
天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば樹状細胞、マクロファージ、自己腫瘍細胞）をｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤ８＋活性化に使用することが可能である一方、天然のＡＰＣのＭＨＣクラスＩ分子は多くの他のペプチドエピトープを含有し、従って腫瘍関連ペプチドエピトープの最小限の提示を可能にするため、活性化の有効性は低い。これらの提示されるペプチドの大部分は正常の無害な内因性タンパク質を表す。この問題へのより直接的アプローチは、疾患と闘うことに関連するエピトープ（この特定の場合には黒色腫関連抗原）に対し特異的にＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化することであるとみられる。
【００１１】
最近、人工的ＡＰＣが、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を発現するキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）胚細胞株を利用して開発された（非特許文献１８、非特許文献１９）。特許文献１および特許文献２もまた参照されたい。昆虫ショウジョウバエは進歩した免疫系を欠くため、ヒトクラスＩ分子へのペプチドエピトープの負荷に関与するＴＡＰ−１，２ペプチドトランスポーターが存在しない。結果として、トランスフェクトされたクラスＩ分子はショウジョウバエ細胞表面上に空の容器として出現する。これらのトランスフェクトしたショウジョウバエ細胞を、特定のクラスＩ分子（すなわち腫瘍抗原Ｔ細胞ペプチドエピトープ）に結合する外因性合成ペプチドとインキュベートすることにより、利用可能なクラスＩ分子の全部がＭＨＣ拘束性の特異的ペプチドエピトープ（１種若しくは複数）で占有されうる。これらのショウジョウバエＡＰＣ上の単一若しくは複数のエピトープを提示するクラスＩ分子の高密度発現ならびに重要な共刺激分子Ｂ７−１（ＣＤ８０）、ＣＤ７０、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の添加は、抗原性ペプチドに特異的である強力な自己細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成を可能にしうる（非特許文献２０）。
【特許文献１】米国特許第６，２２５，０４２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３５５，４７９号明細書
【非特許文献１】Ｈｒｙｎｉｕｋ Ｗ、Ｂｕｓｈ Ｈ．Ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｄｏｓｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｉｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ４：１１６２−１１７０、１９８６
【非特許文献２】Ｈｅｒｚｉｇ，ＲＨ．Ｄｏｓｅ−ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ．Ｏ．Ａｒｍｉｔａｇｅ、Ｋ．Ｈ．Ａｎｔｍａｎ（編）、Ｈｉｇｈ−Ｄｏｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｎｓ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；ボルティモア：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ中ｐｐ７５０−７５４、１９９２
【非特許文献３】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＭＳ、Ｈａｒｅｌ Ｗ、Ｋａｎ−Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｊら Ａｃｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｗｉｔｈ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ：ｒａｔｉｏｎａｌｅ，ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ．Ｊ．−Ｃ．Ｂｙｓｔｒｙｎ、Ｓ．ＦｅｒｒｏｎｅとＰ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ（編）、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ Ｖａｃｃｉｎｅｓ；Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．中ｐｐ１５３−１６６、１９９３
【非特許文献４】Ｑｕａｎ ＷＤＹ Ｊｒ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＭＳ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃ．Ｍ．Ｈａｓｋｅｌｌ編 Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；フィラデルフィア：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ中ｐｐ５７−６９、１９９５
【非特許文献５】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＭＳ、Ｊａｋｏｗａｔｚ Ｊ、Ｈａｒｅｌ Ｗら Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｆａ ２ｂ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｃｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １２：４０２−４１１、１９９４
【非特許文献６】Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ、Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ Ｃ、Ｃｈｏｍｅｚ Ｐら Ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ａ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６４３−１６４７、１９９１
【非特許文献７】Ｇａｕｇｌｅｒ Ｂ、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｙｎｄｅ Ｂ、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐら Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ＭＡＧＥ−３ ｃｏｄｅｓ ｆｏｒ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｏｎ ａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７９：９２１−９３０、１９９４
【非特許文献８】Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ、Ｅｌｉｙａｈｕ Ｓ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ Ｋら Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＭＡＲＴ−１ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ ＨＬＡ−Ａ２−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８０：３４７−３５２、１９９４
【非特許文献９】Ｂｒｉｃｈａｒｄ Ｖ、Ｖａｎ Ｐｅｌ Ａ、Ｗｏｌｆｅｌ Ｔら Ｔｈｅ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｅｓ ｆｏｒ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ＨＬＡ−Ａ２ ｍｅｌａｎｏｍａｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７８：４８９−４９５、１９９３
【非特許文献１０】Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＦ、ｅｌ−Ｇａｍｉｌ Ｍ、Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ、Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｅ、Ｙａｎｎｅｌｌｉ ＪＲ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｂｙ ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４：３１２４−３１２６、１９９４
【非特許文献１１】Ｂａｋｋｅｒ ＡＢ、Ｓｃｈｒｅｕｒｓ ＭＷ、ｄｅ Ｂｏｅｒ ＡＪら Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ１００ ｉｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｍｅｌａｎｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７９：１００５−１００９、１９９４
【非特許文献１２】Ｗｏｌｆｅｌ Ｔ、Ｖａｎ Ｐｅｌ Ａ、Ｂｒｉｃｈａｒｄ Ｖら Ｔｗｏ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｎｏｎａｐｅｐｔｉｄｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｏｎ ＨＬＡ−Ａ２ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｎｏｌ ２４：７５９−７６４、１９９４
【非特許文献１３】Ｖｉｓｓｅｒｅｎ ＭＪＷ、Ｖａｎ Ｅｌｓａｓ Ａ、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｔ ＥＩＨら ＣＴＬ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ ｃａｎ ｂｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｄｏｎｏｒ ｂｌｏｏｄ ｔｏ ｌｙｓｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５４：３９９１−３９９８、１９９５
【非特許文献１４】Ｒｕｂｉｎ ＪＴ、Ｌｏｔｚｅ ＭＴ．Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｍ．Ｓ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ（編）、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｉｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ；ニューヨーク：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ中ｐｐ３７９−４１０、１９９３
【非特許文献１５】Ｙｅｅ，Ｃ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＪＡ、Ｂｙｒｄ，Ｄら Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．ＰＮＡＳ ９９：１６１６８−１６１７３、２００２
【非特許文献１６】Ｄｕｄｌｅｙ ＭＥ、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，ＪＲ、Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＦら Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｃｌｏｎａｌ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：８５０−８５４、２００２
【非特許文献１７】Ｏｅｌｋｅ Ｍ、Ｍａｕｓ ＭＶ、Ｄｉｄｉａｎｏ，Ｄら Ｅｘ ｖｉｖｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＨＬＡ−Ｉｇ−ｃｏａｔｅｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ９：６１９−６２４、２００３
【非特許文献１８】Ｌｅｔｕｒｃｑ ＤＬ、Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＭ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＭＲ、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＰＡとＭｏｒｉａｒｔｙ ＡＭ．Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ：Ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ １７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ；Ａｂｓｔｒａｃｔ＃４０、２００２
【非特許文献１９】Ｊａｃｋｓｏｎ ＭＲ、Ｓｏｎｇ ＥＳ、Ｙａｎｇ Ｙら Ｅｍｐｔｙ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍｅｒｓ ｏｆ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８９：１２１１７−１２１２１、１９９２
【非特許文献２０】Ｃａｉ Ｚ、Ｂｒｕｎｍａｒｋ Ａ、Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ ＡＴら Ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｎａiｖｅ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １６５：２４９−２６５、１９９８
【発明の開示】
【００１２】
［発明の要約］
本発明の多様な全般的局面および好ましい態様は、本明細に付随される請求の範囲（本明細書に引用することにより組み込まれる）に反映されている。本発明の多様な局面の他の好ましい態様、特徴および利点は、図面とともに解釈される下の詳細な記述から明らかとなるであろう。
【００１３】
［発明の詳細な記述］
本発明の多様な局面を、特定のかつ好ましい態様の詳細な記述により下に具体的に説明する。簡潔さのため、本明細書で引用される全部の特許および他の刊行物の開示は引用することにより組み込まれる。別の方法で本明細書で定義されるか若しくは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される全部の技術的および科学的用語は、当該技術分野で一般に使用されると同一の意味を有する。
【００１４】
「包含すること」、「含んでなること」および「含有すること」という用語は、本明細書で、それらの公然の制限しない意味で使用する。
【００１５】
サイトカイン、ならびにクラドリビンおよびＤＡＢ−ＩＬ２から選択される最低１種のリンパ球枯渇剤とともに選択されたペプチドを負荷したｘＡＰＣを接触させることにより活性化したＣＴＬを投与することを含んでなる本発明の治療レジメンは、こうした処置の必要な被験体で癌を処置するのに使用しうる。好ましくは、癌は、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫、甲状腺癌、子宮癌、腎癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、肝癌、膵癌、前立腺癌、結腸癌、皮膚癌、胃癌および子宮頚癌から選択される。
【００１６】
従って、好ましい一態様において、本発明は、ナイーブなＣＤ８＋ Ｔ細胞を被験体から得ること；選択されたペプチド抗原を負荷した異種抗原提示細胞（ｘＡＰＣ）と該ナイーブなＣＤ８＋ Ｔ細胞を接触させて、それにより該選択されたペプチド抗原を発現する細胞を標的とする活性化ＣＴＬを生成すること；該活性化ＣＴＬを該被験体に戻し投与すること；クラドリビンおよびＤＡＢ−ＩＬ２から選択される最低１種のリンパ球枯渇剤を投与すること；ならびにＣＴＬ持続性を遂げる最低２種のサイトカインを投与することを含んでなる、転移性黒色腫を処置若しくは寛解させるための養子ＣＴＬ治療レジメンを提供する。該養子ＣＴＬ治療レジメンは、好ましくは、本発明により活性化されかつ被験体に投与される場合に癌関連抗原エピトープを有する腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏ破壊が可能である、ｅｘ ｖｉｖｏで活性化されている自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞を使用する。
【００１７】
本情況での「被験体」という用語は、癌の処置を必要とする哺乳動物患者を指す。例えば、被験体は、進行悪性転移性黒色腫のような黒色腫と診断されたヒト、例えば、ＨＬＡ−Ａ２陽性でありかつステージＩＩＩ／ＩＶの切除不能疾患を有すると診断された患者でありうる。
【００１８】
ＣＴＬ剤はｘＡＰＣから製造する。使用に適する例示的異種抗原提示細胞（ｘＡＰＣ）は、以下の成分、すなわち、外因性ＭＨＣ Ｉ分子；ナイーブなＴ細胞の活性化で補助するための１種若しくはそれ以上の外因性補助分子；ならびにそれらの表面に該外因性分子を発現することが可能な宿主細胞を包含しうる。好ましくは、外因性分子は、宿主細胞に導入された異種核酸によりコードされる。ｘＡＰＣは、好ましくは、該ｘＡＰＣのＴ細胞活性化能力を増強する外因性補助刺激物質および接着分子もまた発現する。好ましくは、宿主細胞は昆虫細胞、より好ましくはＳｃｈｎｅｉｄｅｒ ２（Ｓ２）細胞のようなショウジョウバエ細胞である。例示的ｘＡＰＣおよびそれらの製造方法は、例えば米国特許第６，２２５，０４２号および同第６，３５５，４７９号明細書に記述されている。
【００１９】
ｘＡＰＣは、当該技術分野で既知若しくは利用可能な多様な方法によりペプチド抗原を負荷しうる。空のＭＨＣクラスＩ分子に結合することが可能であるペプチドを選択する。選択されるペプチドは、好ましくは、養子ＣＴＬ療法で使用されるＴ細胞の標的としてはたらくことができる、細胞の表面上で発現されるタンパク質由来の抗原性若しくは免疫原性アミノ酸配列を含んでなるエピトープに対応する。選択されたペプチドを空のＭＨＣクラスＩ分子に負荷するために、こうした空のＭＨＣクラスＩ分子に結合する１種若しくはそれ以上の抗原性若しくは免疫原性ペプチド種を、結合が起こるのに適する条件下でｘＡＰＣと接触させうる。
【００２０】
１種若しくはそれ以上の抗原性若しくは免疫原性ペプチド種を選択しうる。１種以上の種を選択する場合、それらを同時に若しくは個別の場合にｘＡＰＣと接触させて、該ｘＡＰＣ上で産生される多抗原性若しくは多免疫原性ＭＨＣ−ペプチド複合体をもたらしうる。
【００２１】
空のＭＨＣ分子への選択されたペプチドの負荷は、好ましくは、生物学的結合条件に近似した条件（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで近似させうる）下で起こる。ペプチドの選択において、当業者は、熱力学、静電、エネルギーおよびエントロピーの考慮のような１種若しくはそれ以上の因子、ならびにＭＨＣ分子への有効な結合に必要とされる、選択されたペプチド内の特定のアミノ酸を考慮しうる。
【００２２】
好ましいペプチドは、例えば、チロシナーゼタンパク質、ｇｐ１００タンパク質およびＭＡＲＴ−１タンパク質から選択されるアミノ酸配列に対応するペプチドを包含する。他の好ましいペプチドは、ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号１）、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号２）、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号３）、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号４）、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（配列番号５）およびＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号６）を包含する。選択されうる付加的な例示的ペプチドは、例えば、以下のアミノ酸配列（各ペプチドが由来するタンパク質をカッコ内で示す）、すなわちＳＩＬＳＬＫＥＡＳＴ（Ｃ−レクチン；配列番号１）、ＫＭＡＳＲＳＭＲＬ（Ｃ−レクチン；配列番号２）、ＡＬＡＬＡＡＬＬＶＶ（Ｐｅｃ ６０；配列番号３）、ＡＬＬＶＶＤＲＥＶ（Ｐｅｃ６０；配列番号４）、ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（チロシナーゼ；配列番号５）、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（チロシナーゼ；配列番号６）、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（ｇｐ１００；配列番号７）、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（ｇｐ１００；配列番号８）、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＭＡＲＴ−１；配列番号９）、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＭＡＲＴ−１；配列番号１０）、ＣＬＴＳＴＶＱＬＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１１）、ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１２）、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１３）、ＩＩＳＡＶＶＧＩＬ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１４）、ＰＬＴＳＩＩＳＡＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１５）、ＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１６）、ＶＬＶＫＳＰＮＨＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１７）、ＥＬＶＳＥＦＳＲＭ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１８）、ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ（ＣＥＡ；配列番号１９）、ＧＰＬＴＰＬＰＶ（ＡＥＳ；配列番号２０）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（ＮＹ−ＥＳＯ−１；配列番号２１）、ＫＡＬＦＡＧＰＰＶ（ＣＡ−１２５；配列番号２２）、ＹＬＥＴＦＲＥＱＶ（ＣＡ−１２５；配列番号２３）、ＧＬＱＳＰＫＳＰＬ（ＣＡ−１２５；配列番号２４）、ＶＬＬＫＬＲＲＰＶ（ＣＡ−１２５；配列番号２５）、ＥＬＹＩＰＳＶＤＬ（ＣＡ−１２５；配列番号２６）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（ＮＹ−ＥＳＯ−１；配列番号２７）、ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（テロメラーゼ；配列番号２８）、ＳＴＡＰＰＶＨＮＶ（ＭＵＣ−１；配列番号２９）、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（ＭＡＧＥ−３；配列番号３０）、ＦＭＷＧＮＬＴＬＡ（ＣＡ−１２５；配列番号３１）、ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（テロメラーゼ；配列番号３２）、ＨＬＳＴＡＦＡＲＶ（Ｇ２５０；配列番号３３）、ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ（ＮＹ−ＥＳＯ−１；配列番号３４）、ＥＬＷＴＨＳＹＫＶ（ＦＢＰ；配列番号３５）、ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ（ＭＡＧＥ−３；配列番号３６）、ＹＩＦＡＴＣＬＧＬ（ＭＡＧＥ−３；配列番号３７）、ＨＬＹＩＦＡＴＣＬ（ＭＡＧＥ−３；配列番号３８）、ＭＬＭＡＱＥＡＬＡＦＬ（ＣＡＭＥＬ；配列番号３９）、ＳＴＬＥＫＩＮＫＴ（ＳＳＸ−４；配列番号４０）、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（ＳＳＸ−２；配列番号４１）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（ＮＹ−ＥＳＯ−１；配列番号４２）、ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（スルビビン；配列番号４３）、ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（スルビビン；配列番号４４）、ＳＬＬＥＫＲＥＫＴ（ＳＰ１７；配列番号４５）、ＴＬＧＥＤＤＰＷＬ（ＳＡＲＴ−１；配列番号４６）、ＫＬＧＬＫＰＬＥＶ（ＳＡＲＴ−１；配列番号４７）、ＹＬＷＴＳＡＫＮＴ（ＳＣＰ−１；配列番号４８）、ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ（ＭＵＣ−１；配列番号４９）、ＧＭＧＳＥＥＬＲＬ（ＬＩＶＩＮ；配列番号５０）、ＳＬＧＳＰＶＬＧＬ（ＬＩＶＩＮ；配列番号５１）、ＹＬＦＦＹＲＫＳＶ（ｈＴＲＴ；配列番号５２）、ＣＱＱＥＥＴＦＬＬ（ＣＡ−１２５；配列番号５３）、ＴＬＡＫＦＳＰＹＬ（ＰＲＡＭＥ；配列番号５４）、ＮＬＴＨＶＬＹＰＶ（ＰＲＡＭＥ；配列番号５５）、ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（スルビビン；配列番号５６）、ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（ＰＲＡＭＥ；配列番号５７）、ＦＬＤＱＲＶＦＦＶ（ｇｐ１００；配列番号５８）、ＦＬＤＱＲＶＦＶＶ（ｇｐ１００；配列番号５９）、ＦＬＤＱＶＡＦＶＶ（ｇｐ１００；配列番号６０）、ＧＬＤＲＥＱＬＹＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号６１）、ＶＭＱＨＬＬＳＰＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号６２）、ＱＱＴＨＧＩＴＲＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号６３）、ＬＱＰＬＳＧＰＧＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号６４）、ＴＬＤＲＤＳＬＹＶ（ＭＵＣ−１６；配列番号６５）、ＱＬＹＬＥＬＳＱＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号６６）、ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（ＭＡＧＥ−１；配列番号６７）、ＫＶＡＤＬＶＧＦＬ（ＭＡＧＥ−１；配列番号６８）およびＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号７０）を包含する。
【００２３】
選択されたペプチドは、当該技術分野の多様な手段および方法を介して細胞に提示しうる。選択されたペプチドは、ペプチドの細胞内プールにそれらを進入させる様式で提示しうる。例えばペプチドは浸透圧負荷を介して提示しうる。好ましくはペプチドはｘＡＰＣ系培地に添加する。ペプチドは、例えば酵素分解のような細胞過程を介して後に分解される無傷のポリペプチド若しくはタンパク質の形態で培地に添加しうる。あるいは、無傷のポリペプチド若しくはタンパク質は、ｘＡＰＣ系培地への添加前に化学的消化（例えば臭化シアン）若しくはプロテアーゼ（例えばトリプシンおよびキモトリプシン）のようないくつかの他の手段を介して分解されうる。あるいは、タンパク質若しくはポリペプチド配列全体を適切なベクターにクローン化しかつ原核生物細胞に挿入することができ、それにより、細胞はかなりの量の抗原性ポリペプチドを生成し、それらをその後収集、精製かつペプチドに消化し、該ペプチドをその後ｘＡＰＣ系培地に添加する。
【００２４】
十分な量の各選択されたペプチドを、クラスＩ ＭＨＣ分子を結合させかつその後ヒトクラスＩ ＭＨＣ発現細胞の表面上で高密度のペプチドを提示させるために細胞培養物に添加しうる。
【００２５】
ｘＡＰＣは、非異種すなわち内因性抗原提示細胞のＡＰＣ機能に比較して高められたＡＰＣ機能についてアッセイしうる。高められたＡＰＣ機能は、例えば、ＣＤ６９細胞表面発現、分化の程度、細胞傷害性死滅能力の程度、特異的細胞溶解の程度およびサイトカイン産生の程度のようなＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の指標である１種若しくはそれ以上の細胞表面タンパク質発現の程度のようなＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の多様なパラメータのいずれかを測定することにより、測定しうる。
【００２６】
タンパク質およびペプチドの精製は、免疫親和性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、タンパク質沈殿、緩衝液交換、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーのような当該技術分野で既知である多様な技術により達成しうる。抗原刺激したＣＴＬはペプチド−ＭＨＣ ｐＭＨＣ四量体染色により検出若しくは単離することができ、検出されるＣＴＬは、ｘＡＰＣにより提示される選択されたペプチドに特異的である。
【００２７】
末梢血白血球（ＰＢＬ）を被験体から得、そして好ましくは実質的に精製する。ＰＢＬの精製方法は、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を使用する方法が本目的上利用しうるを包含する。精製したＰＢＬをその後、適切な抗原性ペプチドと前インキュベートしたｘＡＰＣ細胞と混合する。好ましくは、ＰＢＬは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＤｙｎａｂｅａｄ系（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような当該技術分野にある磁性ビーズ精製系により精製する。ＰＢＬは、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）に基づく方法、若しくは他の適切な細胞分取装置および方法論を用いるような細胞分取手順を介してもまた精製しうる。多様な細胞特異的タンパク質のマーカーとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用することによるこうした細胞分取法若しくは赤血球の分取。
【００２８】
ナイーブなＴ細胞を適切なｘＡＰＣとともに培養物中でインキュベートし、そして、活性化かつＣＤ８＋細胞の集団についてさらに濃縮するのに十分な時間、選択されたペプチドを負荷する。例えば、米国特許第４，６９０，９１５号明細書は、リンパ球除去（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）を介する多数のリンパ球を得る方法を記述する。好ましくは、ＣＤ８＋細胞は抗原特異的様式で活性化する。抗原提示細胞に対する休止期すなわち前駆体ＣＤ８＋（エフェクター）細胞の比は個体間で変動することがあり、かつ、培養条件に対する個々のリンパ球のなじみ易さならびに癌の性質および重症度のような変数にさらに依存しうる。好ましくは、しかしながら、リンパ球：抗原提示細胞（例えばショウジョウバエ細胞）比は、好ましくは約３０：１ないし３００：１の範囲にある。例えば、一態様において、３×１０７ヒトＰＢＬおよび１×１０６生存ショウジョウバエ細胞を混合し、かつ、２０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地中で維持する。
【００２９】
エフェクター／抗原提示培養物は、活性化かつ治療上使用可能若しくは有効な数のＣＤ８＋細胞の集団について濃縮するのに必要であるくらい長い時間維持しうる。１ないし１０日培養後、例えば５日培養後に一般に観察される最大の特異的ＣＤ８＋活性化レベルで、好ましい時間は約３から７日までである。本発明の一態様において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化が細胞株のトランスフェクション後短期間内に検出されうる。一態様において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化することが可能なトランスフェクト細胞株での一過性発現が、トランスフェクション４８時間以内に検出可能である。従って、ヒトクラスＩ ＭＨＣ分子を発現する形質転換細胞の安定な若しくは一過性いずれの培養物も、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化において有効である。
【００３０】
活性化細胞傷害性Ｔリンパ球は、当該技術分野で既知若しくは利用可能な適する方法を使用して、ｘＡＰＣ（例えばショウジョウバエ細胞）から効果的に分離しうる。例えば、人工的ＡＰＣ、人工的ＡＰＣに負荷したペプチド、若しくはＣＴＬに特異的なモノクローナル抗体（またはそれらのセグメント）を、それらの適切な相補リガンドを結合するのに利用しうる。抗体標識した細胞を、その後、例えば免疫沈降およびイムノアッセイ法のような当該技術分野の多様な方法のいずれかにより、刺激体（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）−エフェクター細胞混合状態から抽出しうる。あるいは、分離段階を完全に省略することができ、そして不活性化ｘＡＰＣを活性化ＣＴＬとともに培養物中に残してもよい。
【００３１】
治療上有効な細胞傷害性量の活性化ＣＴＬは、記述されたｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの使用に適するように、例えば、これらのＣＴＬ細胞の究極の標的である細胞の量および型を鑑みて選択しうる。該量は患者の状態を鑑みてもまた選択することができ、そして実務者による全部の適切な因子の考慮を介して決定しうる。好ましくは、マウスで使用される約５×１０６〜５×１０７細胞に比較して、約１×１０６ないし約１×１０１２、より好ましくは約１×１０８ないし約１×１０１１、およびなおより好ましくは約１×１０９ないし約１×１０１０の活性化ＣＤ８＋細胞を、成体ヒトに利用する。
【００３２】
好ましくは、ＣＴＬである活性化ＣＤ８＋細胞は、処置されている個体へのＣＴＬ細胞の投与前に、ｘＡＰＣ培養物から上述されたとおり収集する。該細胞培養物系は好ましくは腫瘍原性でない。従って、ショウジョウバエ細胞および活性化ＣＤ８＋細胞の完全な分離が達成されない場合、少数のショウジョウバエ細胞の投与に伴う固有の危険は存在しないはずである。
【００３３】
ナイーブなＣＤ４＋ Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の双方は、好ましくは、ｘＡＰＣ培養物とのインキュベーション前に被験体から抽出しうる。被験体は、白血球を収集するために、多様な既知の若しくは利用可能な血液細胞分離処置（例えば白血球除去）のいずれかを受けることができる。
【００３４】
ナイーブなＴ細胞は、ナイーブなＴ細胞の特異的活性化方法を妨害、減弱、若しくはいずれかの方法で制限しうる他の処置若しくは治療、および本明細書に提供されるところの用途の開始前に、被験体から収集しうる。例えば、新形成若しくは腫瘍を伴う個体の処置において、ナイーブなＴ細胞のサンプルを化学療法若しくは放射線治療の開始前に得かつ培養物中で保つことができる。ペプチド負荷したｘＡＰＣでナイーブなＴ細胞を活性化した後、ナイーブなＴ細胞を増殖かつ活性化することができ、そして活性化ＣＴＬを該被験体に戻し導入しうる。あるいは、ナイーブなＴ細胞を活性化することができ、そして該活性化ＣＴＬを、化学療法若しくは照射のような他の任意の形態の処置の前、後若しくはそれらとともに、該ナイーブなＴ細胞を得た被験体に戻し導入しうる。
【００３５】
活性化ＣＴＬは被験体への送達および注入のための適切なベヒクルにもまた懸濁しうる。細胞成分の再導入技術は当該技術分野で既知であり、そして米国特許第４，８４４，８９３号および同第４，６９０，９１５号明細書に例示されるもののような手順を包含する。例えば、静脈内注入を介する活性化ＣＴＬ細胞の投与を使用しうる。複数の注入が必要とされることがあり、そしてこれらの注入は数週若しくはそれ以上の期間にわたり発生しうる。
【００３６】
本発明の処置レジメンにおいて、ＣＴＬ持続性を達成しかつそれにより被験体に投与されるＣＴＬの半減期、活性、効力および／若しくは選択性の特性を高めるためにサイトカインもまた投与される。こうした持続性は、ＣＴＬに対する直接的影響、若しくはＣＴＬの標的細胞上での抗原発現の上方制御を必要とする間接的影響から生じうる。好ましいサイトカインはＩＦＮ−α−２ｂおよびＩＬ−２である。
【００３７】
クラドリビン（２−ＣｄＡ、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（Ｒ））および／若しくはＤＡＢ ＩＬ−２（ＯＮＴＡＫ（Ｒ））リンパ球枯渇剤もまた発明の処置レジメンで投与される。これらの剤は非骨髄破壊的であり、そしてＣＴＬ療法を受領する被験体で一過性の免疫抑制を導き出す。
【００３８】
ＣＴＬ、サイトカインおよびリンパ球枯渇剤のそれぞれの投与のタイミングおよび持続期間は、慣例の実験、および下の実施例を包含する本明細書の手引きに基づき当業者により選択しうる。
【００３９】
本発明の多様な局面および特徴を具体的に説明するため、以下の実施例を提供する。
【実施例】
【００４０】
ＣＴＬのｅｘ ｖｉｖｏ調製
異種ＡＰＣ（ｘＡＰＣ）株は、公表された手順（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｍｏｒｐｈ．２７：３５３−３６５、１９７２）に従って、数百個の２０ないし２４時間齢のＯｒｅｇｏｎ−Ｒ（野生型）キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（Ｏｒｅｇｏｎ−Ｒ）胚（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９６３）から１９６９年に樹立されたＳｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２細胞（Ｓ２細胞）から生成する。Ｓ２細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている（ＣＲＬ１０９７４）。ｘＡＰＣが由来する細胞株を派生させるのに使用したＳ２細胞の元の供給物はこの供給源から得る。ｘＡＰＣを生成させるため、Ｓ２細胞をプラスミドベクターｐＲＭＨａ−３由来のベクターでトランスフェクトする（例えば米国特許第６，２２５，０４２号明細書を参照されたい）。クローンＡと呼称される１種のｘＡＰＣ株を、ＨＡＬ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１をコードするベクターでトランスフェクトする。クローンＢと呼称される第二のｘＡＰＣ株は、ＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３をコードするベクターでトランスフェクトする。クローンＣと呼称される第三のｘＡＰＣ細胞株は、ＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＣＤ７０をコードするベクターでトランスフェクトする。従って、クローンＡはＨＬＡ−Ａ２、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１を発現し、クローンＢはＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３を発現し、そしてクローンＣはＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＣＤ７０．Ｂ７．２およびＬＦＡ−３を発現する。
【００４１】
クローンＡおよびクローンＢ系統細胞の独立した連続培養物は、１０％ウシ胎児血清および５００μｇ／ｍｌジェネチシン（Ｇ４１８）を補充したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地中で維持し、そして、細胞密度をおよそ１×１０６細胞／ｍＬに調節するための各分割の間に新鮮培地を添加して週２回分割する。誘導のおよそ１日前（第−２ないし−４日；第０日を外因性分子の発現について細胞を試験しかつペプチドを負荷する日と定義する）に、３個のＴ７５フラスコに、１．５×１０７細胞／フラスコに同等なストック培養物中で維持した細胞懸濁液の容量を接種する。Ｇ４１８を含まない完全ショウジョウバエＳＦＭ培地を添加して容量を１５ｍｌ／フラスコまでもたらす。フラスコをその後およそ２７℃のチャンバー中でインキュベートする。およそ第−１ないし−３日に、細胞をその後、１．０ｍＭの最終濃度までの硫酸銅（ＣｕＳＯ４）の添加（ＣｕＳＯ４の２００ｍＭストックの２００倍希釈；１５ｍｌの細胞懸濁液を含有する各Ｔ７５フラスコにつき７５μｌのＣｕＳＯ４）により誘導し、そして２７℃のチャンバーに戻す。誘導時間はおよそ２４ないし７２時間持続する。
【００４２】
第０日に、誘導した細胞培養物を含有するフラスコを汚染の証拠について視覚的におよび顕微鏡で確認する。汚染されていないフラスコを合わせ、そして生存細胞を計数する。およそ６×１０６細胞の合わせた細胞培養物のサンプルを、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析を使用するフローサイトメトリーにより評価して、外因性分子の発現のレベルを測定する。細胞培養物（およそ１×１０７細胞／ｍＬ）をその後、ペプチド負荷前に試験して、外因性ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１（クローンＡ細胞について）若しくはＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３（クローンＢ細胞について）の発現を確認する。外因性分子の発現が一旦確認されれば、各細胞培養物を２個の滅菌５０ｍｌコニカルチューブに分割することにより各培養物を洗浄する。各チューブをその後ＨＹＱ ＳＦＸ昆虫培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で満たし、そして１，７００ｒｐｍ（６００×ｇ）でおよそ７分間遠心分離して細胞をペレットにする。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを含有するチューブを再度１，７００ｒｐｍ（６００×ｇ）でおよそ１分間遠心分離する。上清を先細ピペットで除去する。各分割細胞培養物からのペレットをその後再度合わせ、そして８ｍＬのＳＦＸ昆虫培地におよそ１×１０７細胞／ｍＬの細胞密度まで再懸濁する。およそ４０μＬの１．０ｍｇ／ｍＬのβ２ミクログロブリンストック溶液、および各ペプチドについて１．６７ｍｇ／ｍＬのストックペプチドコンボ溶液の５０倍希釈２４μＬを、各再懸濁培養物に添加する。従って、各細胞培養懸濁液は、およそ５μｇ／ｍＬの最終濃度のβ２ミクログロブリン、およびペプチドあたりおよそ０．１μｇ／ｍＬの最終濃度のｘＡＰＣに負荷されるべき各選択されたペプチドを含有する。細胞培養物を、β２ミクログロブリンおよびペプチドを含有する懸濁液中で、室温で３０分ごとに回転しながら最低４時間かつ８時間を超えずインキュベートする。ペプチドインキュベーション期間の後に、各細胞培養物のおよそ１ｍＬのアリコートを８本のポリプロピレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ ２００６）に個別に分配する。いかなる残余の細胞培養懸濁液も廃棄する。
【００４３】
抗ＣＤ８抗体での陽性選択により白血球除去サンプルから単離したＣＤ８＋細胞を、ヒトクラスＩならびに共刺激／接着分子ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１、ＣＤ７０、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１を発現するショウジョウバエ細胞により提示されるヒト黒色腫関連ペプチド（チロシナーゼ−６８９３６９−３７７、チロシナーゼ−７９２３６９−３７７、ＭＡＲＴ−１−８１９２７−３５、ｇｐ１００−８１７２０９−２１７、ｇｐ１００−８１８２８０−２８８およびｇｐ１００−８５３１５４−１６２）に対し刺激する。ＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下に自己単球（記述されるエピトープでパルスした）で２回再刺激する。エフェクター細胞の数をその後、γ線照射自己支持細胞およびＩＬ−２の存在下での抗ＣＤ３モノクローナル抗体での非特異的刺激により増大させる。細胞傷害性Ｔリンパ球活性を、ペプチド負荷したＴ２細胞および一団の黒色腫細胞に対し測定する一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激したＣＤ８＋ Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーにより評価する。
材料。
【００４４】
【表１】
【００４５】
試薬
ｒｈＩＬ−７。組換えヒトインターロイキン−７（ＩＬ−７）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生されかつ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して供給元（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）により精製されるリンホカインであるがしかし抗体でない。粉末として受領したＩＬ−７は、１％ヒト血清アルブミンを含有する無菌ＤＰＢＳで希釈する。バルク溶液をその後、０．２μｍフィルターを通して濾過し、滅菌バイアルに分注し（３０，０００Ｕ／ｍＬ、１０００×濃度）、そして使用前に−８０℃で保存する。
【００４６】
ｒｈＩＬ−２。組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）は組換えＤＮＡ技術により製造しかつＣｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより供給される（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｒ））。粉末として受領したＩＬ−２をＩＬ−２希釈剤（５０ｍＭ酢酸中０．５％ヒト血清アルブミン）で希釈し、０．２μｍフィルターを通して濾過し、滅菌バイアルに分注し（２０，０００Ｕ／ｍＬ、１０００×濃度）かつその後使用前に−８０℃で保存する。
【００４７】
チロシナーゼペプチドＹＭＮＧＴＭＳＱＶ。ヒトチロシナーゼのアミノ酸３６９−３７７に対応するチロシナーゼペプチド（ｔｙｒ ３６９−３７７）はＧＬＰ準拠の標準を使用し製造かつ精製する（Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。製造元（Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から受領したところのペプチド粉末を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のストックペプチド溶液を達成するようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。このストックペプチド溶液を、等部分で他のペプチドストック溶液（また１０ｍｇ／ｍｌの濃度の）と混合して、ｘＡＰＣの負荷における使用のための複合ペプチド溶液を生成する。該複合ペプチド溶液を、クラス１０，０００クリーンルーム中でクラスＩＩバイオセーフティーキャビネット中無菌条件下で滅菌バイアルに分注する。
【００４８】
チロシナーゼペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶ。上述されたｔｙｒ ３６９−３７７ペプチドの３位にアスパラギン残基の代わりにアスパラギン酸残基を含有する該ペプチドの脱アミド化形態は、ＧＬＰ準拠の標準を使用し製造かつ精製する（Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。この脱アミド化形態はｔｙｒ ３６９−３７７ｄと呼ばれる。製造元から受領したペプチド粉末を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のストックペプチド溶液を達成するようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。
【００４９】
ｇｐ１００ペプチドＩＴＤＱＶＰＦＳＶ。ヒトｇｐ−１００のアミノ酸２０９−２１７に対応するｇｐ１００ペプチド（ｇｐ１００２０９−２１７）は、ＧＬＰ準拠の標準を使用し製造かつ精製する（Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。該ペプチド粉末を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のストックペプチド溶液を達成するようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。
【００５０】
ｇｐ１００ペプチドＫＴＷＧＱＹＷＱＶ。ヒトｇｐ１００のアミノ酸１５４−１６２に対応するｇｐ１００ペプチド（ｇｐ１００１５４−１６２）は、ＧＬＰ準拠の標準を使用し製造かつ精製する。Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから受領したところのペプチド粉末を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のストックペプチド溶液を達成するようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。
【００５１】
ｇｐ１００ペプチドＹＬＥＰＧＶＴＡ。ヒトｇｐ１００のアミノ酸２８０−２８８に対応するｇｐ１００ペプチド（ｇｐ１００２８０−２８８）は、ＧＬＰ準拠の標準を使用してＳｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造かつ精製する。該ペプチド粉末を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のストックペプチド溶液を達成するようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。
【００５２】
ＭＡＲＴ−１ペプチドＡＡＧＩＧＩＬＴＶ。ヒトＭＡＲＴ−１のアミノ酸２７−３５に対応するＭＡＲＴ−１ペプチド（ＭＡＲＴ−１２７−３５）は、ＧＬＰ準拠を使用して製造かつ精製する（Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。該ペプチド粉末は、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のストックペプチド溶液を達成するようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。
【００５３】
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（Ｒ）Ｍ−４５０。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（Ｒ）Ｍ−４５０（ＳＡＭ）ＩｇＧは、一次マウスＩｇＧを結合するポリクローナルヒツジ抗マウスＩｇＧで被覆した無菌常磁性ビーズである。Ｂａｘｔｅｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．から入手可能なＤＹＮＡＢＥＡＤＳは、Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ磁性細胞選別器を使用するＴ細胞単離での使用前に４℃で保存する。
【００５４】
ヒト血清アルブミン。米国薬局方２５％ＨＳＡ（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；各ロットの血漿供給源はＨＩＶ−１ ＨＩＶ−２、ＨＣＶおよびＨＢＶについて陰性であることを試験した）は、以下のＴ細胞調製および活性化段階の段階、すなわちＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ８− Ｔ細胞の精製；接着細胞のペプチド負荷；ならびに活性化Ｔ細胞の最終処方の間の緩衝タンパク質の供給源としての使用前にＲＴで保存する。
【００５５】
抗ＣＤ８抗体。抗ＣＤ８モノクローナル抗体（３７Ｂ１Ａ）は、Ｔ細胞のＣＤ８抗原に向けられたマウスモノクローナル抗体であり、Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ磁性細胞選別器装置でＣＤ８＋ Ｔ細胞を選択するのに使用する。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の単離若しくは活性化過程での使用のため、濃縮溶液を無菌ＤＰＢＳで希釈する。該バルク溶液を０．２μｍフィルターを通して濾過し、そしてその後、クラス１０，０００クリーンルーム中でクラスＩＩバイオセーフティーキャビネット中無菌条件下で単回使用バイアルに分注する。アリコート（１０．０ｍｇ／ｍＬ）は使用前に−８０℃で保存する。
【００５６】
ＣＤ８ α鎖ペプチド−ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ。ＣＤ８ α Ｌ鎖ペプチド（ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ）はＧＬＰ準拠の標準のもとで精製かつ製造する。ＣＤ８ α鎖ペプチドは、ＣＤ８（３７Ｂ１Ａ）抗体およびＩｓｏｌｅｘ ３００ｉ磁性細胞選別器を使用して捕捉されるＣＤ８＋ Ｔ細胞を遊離させるためＣＤ８＋ Ｔ細胞単離過程で使用する。ペプチドの各ロットは、製薬学的等級標準に合致するようにＳｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造し、そしてペプチドの配列、純度、分子量および外観について試験する。粉末として受領したＣＤ８ α鎖ペプチドは、１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液を創製するようにさらに処理する。このストック溶液をＤＰＢＳで希釈し、０．２μｍフィルターを通して濾過し、滅菌バイアルに分注し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。ペプチド試薬のバイアル分注は、クラス１０，０００クリーンルーム中でクラスＩＩバイオセーフティーキャビネット中無菌条件下で実施する。
【００５７】
ヒトβ２Ｍミクログロブリン。組換えＤＮＡ技術により製造したヒトβ−２ミクログロブリン（β２Ｍ）の濃縮物を、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度を達成するように無菌ＤＰＢＳで希釈する。該バルク溶液をその後０．２μｍフィルターを通して濾過し、滅菌バイアルに分注し、そして、ｘＡＰＣの製造およびペプチド負荷ならびに接着細胞のペプチド負荷の間の使用前に−８０℃で保存する。
【００５８】
クエン酸ナトリウム溶液。米国薬局方の無菌の非発熱性抗凝固剤、クエン酸ナトリウム溶液（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ）は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ８− Ｔ細胞の選択のためにＩｓｏｌｅｘ ３００ｉ磁性細胞選別器を運転するための緩衝剤添加物としての使用前に室温（ＲＴ）で保存する。
【００５９】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ培地。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒショウジョウバエ培地は、ショウジョウバエ細胞を培養するのに使用する培地である。培地の各ロットは、オスモル濃度、ｐＨ、無菌性、およびショウジョウバエ細胞の増殖を持続する能力について、供給元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により試験する。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒショウジョウバエ培地（１×濃度）は使用前に２℃ないし６℃で保存する。
【００６０】
ウシ胎児血清。宿主細胞若しくはｘＡＰＣ細胞の増殖のためのタンパク質供給源として使用するウシ胎児血清（ＦＢＳ）は−８０℃で保存する。Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能なＦＢＳは、米国起源の動物からのウシ胎児血液から加工されている。血液が由来する母動物は、感染性および接触伝染性疾患ならびに有害な寄生虫がない。
【００６１】
ＨＹＱ ＳＦＸ昆虫培地。ＨｙｃｌｏｎｅのＳＦＸ昆虫培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、ｘＡＰＣのペプチド負荷の間に使用する無血清培地（１×濃度）であり、そして使用前に２℃ないし６℃で保存する。この培地はウシ起源の生成物を含有しない。
【００６２】
硫酸銅。硫酸銅（ＩＩ）五水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ヒトＨＬＡ、共刺激および接着分子を発現させるための改変宿主細胞の誘導に使用する。ストック溶液は、２００ｍＭの濃度を達成するようにエンドトキシンを含まない滅菌水に結晶ＣｕＳＯ４を溶解すること、およびクラスＩＩバイオセーフティーキャビネット中で０．２μｍフィルターを通して滅菌容器に該溶液を無菌的に濾過することにより、処方する。
【００６３】
ＲＰＭＩ。血清および抗生物質を含まないＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ若しくはＧｉｂｃｏから入手可能）（１×濃度）はＴ細胞を増殖させるのに使用する。ＲＰＭＩ培地は使用前に２ないし６℃で保存する。
【００６４】
ダルベッコリン酸緩衝生理的食塩水（ＤＰＢＳ）。無菌の非発熱性ダルベッコリン酸緩衝生理的食塩水（ＤＰＢＳ）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ若しくはＧｉｂｃｏから入手可能、１×濃度）は使用前にＲＴで保存する。ＤＰＢＳは以下の処置、すなわち、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ８− Ｔ細胞の選択の間にＩｓｏｌｅｘ ３００ｉ磁性細胞選別器装置を運転すること；再刺激段階の間に非接着細胞を洗浄すること、および非特異的増殖の間に未結合のＯＫＴ３モノクローナル抗体を洗浄すること；ならびにヒトβ２ミクログロブリン、ＩＬ−７、ＣＤ８ペプチドおよびＯＫＴ３を希釈することに使用する。
【００６５】
Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地（Ｌ−グルタミンを含まない；１×濃度）は、Ｔ細胞活性化過程のペプチド負荷の間の使用前に２℃ないし６℃で保存する。
【００６６】
ＯＫＴ（Ｒ）３抗体。臨床使用に承認された無菌溶液としてアンプル中で供給される、Ｔ細胞のＣＤ３抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ（Ｒ）３（１．０ｍｇ／ｍＬ）（Ｏｒｔｈｏから入手可能）は、無菌条件下で単回使用バイアルに分注し、そしてＴ細胞の活性化での使用前に−８０℃で凍結保存する。
【００６７】
ジェネチシン（Ｇ４１８）。ジェネチシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、異種核酸によりコードされる外因性分子の発現を維持するためにショウジョウバエ細胞の培養物中で使用する選択的抗生物質である。ジェネチシンは無菌ストック溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）として供給され、そして使用前に２ないし６℃で保存する。
【００６８】
塩化カルシウム。塩化カルシウム水和物は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の単離若しくは活性化過程で使用される自己血清を生成するためリンパ球除去生成物から得られる自己血漿の凝固のため使用する。塩化カルシウム水和物は結晶性粉末として受領し、ストック溶液（１Ｍ）に調合し、そして使用前に２℃ないし６℃で保存する。該ストック溶液は、エンドトキシンを含まない滅菌水に塩化カルシウムを溶解すること、およびクラスＩＩバイオセーフティーキャビネット中で０．２μｍフィルターを通して滅菌容器に無菌的に濾過することにより、処方する。
【００６９】
酢酸。ＩＬ−２のストック溶液の調製に使用する酢酸（１７．４Ｍ）はＳｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得、そして使用前にＲＴで保存する。
【００７０】
ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（Ｒ）Ｐｌｕｓ。Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ細胞選別器装置を用いるＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ８− Ｔ細胞の単離後に、非ＣＤ８＋画分からの単核細胞を、死細胞、好中球および赤血球を除去するのに使用するＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手可能ないかなる動物成分も含まないＦｉｃｏｌｌ勾配試薬、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（Ｒ）Ｐｌｕｓ（１×濃度）を使用して、さらに分画する。該試薬は使用前にＲＴで保存する。
【００７１】
ＰＥＮＴＡＳＰＡＮ（Ｒ）。ＰＥＮＴＡＳＰＡＮ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ）は、臨床使用のための０．９％塩化ナトリウム中１０％ペンタスターチ（ｐｅｎｔａｓｔａｒｃｈ）の無菌溶液であり（ＮＤＣ ０２６４−１９７２−１０）、そして使用前にＲＴで保存する。それは単離したＣＤ８− Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の低温保存における低温保存剤として使用する（１×濃度）。
【００７２】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）。ＤＭＳＯは、単離したＣＤ８− Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の低温保存における低温保存剤として使用する。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なＤＭＳＯ溶液（１×濃度）は使用前にＲＴで保存する。
【００７３】
Ｌ−グルタミン。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な２００ｍＭ（１００×濃度）Ｌ−グルタミン（米国薬局方）は、ＲＰＭＩ培地補充物質として使用し、そして使用前に−８０℃で保存する。
【００７４】
ＭＥＭピルビン酸ナトリウム溶液。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＭＥＭピルビン酸ナトリウム溶液（１００ｍＭ、１００×濃度）はＲＰＭＩ培地を補充するために使用し、そして使用前に２ないし６℃で保存する。
【００７５】
非必須アミノ酸。ＲＰＭＩ培地を補充するために使用する、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの非必須アミノ酸（１０ｍＭ；１００×濃度）は、使用前に２ないし６℃で保存する。
【００７６】
ＨＥＰＥＳ溶液。ＲＰＭＩ培地を補充するために使用する１Ｍ（２００×濃度）ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、使用前に２℃ないし６℃で保存する。
【００７７】
Ｘ−ｖｉｖｏ １０細胞培地。ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒにより供給されるＸ−ｖｉｖｏ １０細胞培地は、使用前に２℃ないし６℃で保存する。血清、フェノールレッドおよび抗生物質を含まないこの培地（１×濃度）は、ペプチド負荷したｘＡＰＣへの曝露により活性化されるＴ細胞の非特異的増殖期の間に使用する。
【００７８】
塩化ナトリウム注射剤。Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な米国薬局方０．９％塩化ナトリウム溶液は、Ｔ細胞の収集の間の細胞洗浄処置に使用する。無菌、非発熱性かつ動物成分を含まない該溶液は使用前にＲＴで保存する。
【００７９】
デキストロース＋塩化ナトリウム溶液。米国薬局方の５％デキストロースおよび０．９％塩化ナトリウムの注入可能な溶液（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、動物成分を含まない無菌の非発熱性溶液として得られる。活性化Ｔ細胞の保存緩衝液として使用する該溶液は、使用前にＲＴで保存する。
【００８０】
乳糖リンゲル液。注射用水中の塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよび乳酸ナトリウムの無菌の低エンドトキシン溶液（動物成分を含まない）である米国薬局方０．９％乳酸リンゲル液（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、Ｔ細胞の収集および懸濁における使用前にＲＴで保存する。
【００８１】
蒸留水。メンブレン濾過およびエンドトキシンスクリーニングにより得られる細胞培養等級蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、硫酸銅、塩化カルシウムおよびインターロイキン−２（ＩＬ−２）のストック溶液の調製のための溶媒として使用し、そして使用前にＲＴで保存する。
【００８２】
他の材料。
リンパ球除去生成物は、黒色腫と診断されたヒト被験体から収集し、そして、自己の患者特異的細胞生成物の生成のための使用前にＲＴで保存する。
【００８３】
自己ヒト血清は単離したＴ細胞の培養のためのタンパク質供給源として使用する。自己ヒト血漿は、フィブリン凝固を達成するために塩化カルシウムを添加すること、およびその後液体血清層を収集することにより、リンパ球除去生成物から調製する。収集した液体血清層は、短期保存のために４℃、および長期保存のために−８０℃で保存する。
【００８４】
連続的ショウジョウバエｘＡＰＣ培養物を創製するためのシードストックとして使用する異種ショウジョウバエクローンＢ由来のショウジョウバエｘＡＰＣ株は、下述されるとおり得る。
【００８５】
手順。
ヒトＣＤ８＋細胞の単離。
ＣＤ８＋細胞は、抗ＣＤ８モノクローナル抗体（抗体１）での陽性選択、次いで磁性ビーズ（ＳＡＭビーズ）上に被覆したヒツジ抗マウスＩｇＧ（抗体２）を使用するＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ（Ｄｙｎａｌ）単離手順により、Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ装置（Ｂａｘｔｅｒ）を使用して、白血球除去サンプルから単離する。抗ヒトＣＤ８マウスモノクローナル抗体を、１％ＨＳＡ（Ｂａｘｔｅｒ−Ｈｙｌａｎｄ）および０．２％クエン酸ナトリウムを補充したダルベッコＰＢＳに再懸濁した洗浄した細胞に添加する。Ｄｙｎａｌの磁性ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）を、ＰＢＭＣの数に依存して１：１ないし１：２のビーズ対細胞比で添加する。単離したＣＤ８＋細胞を磁性分離により除去する。残存する非ＣＤ８画分を収集し、そして再刺激および非特異的増殖段階の間での将来の使用のため低温保存する。ＣＤ８細胞−抗体１−抗体２−ビーズ複合体の解離を、それに対し抗体１を生成させたペプチド、ＣＤ８ペプチド５９−７０（ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ）の存在下３７℃で４５分間のインキュベーションにより達成する。遊離されたビーズを磁性で除去し、そしてＣＤ８＋細胞を計数しかつて純度を評価するためフローサイトメトリーにより分析する。ＣＤ８＋細胞の回収は典型的に８０％以上である。初期細胞洗浄段階の時点で自己血漿を収集することにより熱不活性化血清を調製する。ＣａＣｌ２を使用してフィブリンを凝固させかつフィブリン塊を除去する。血清を熱不活性化し、濾過し、分注しかつ−８０℃で凍結する。非ＣＤ８＋細胞を陽性選択手順から保持し、そしてＦｉｃｏｌｌ勾配を使用して精製する。これらの細胞をＤＭＳＯ、Ｐｅｎｔａｓｐａｎおよび熱不活性化自己血清中で低温保存しかつ液体窒素（ＬＮ２）中で保存する。これらの細胞を再刺激の時点で接着細胞の供給源として使用し、そして抗原提示細胞としての使用前にペプチドでパルスする。
【００８６】
精製ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化
一次刺激。トランスフェクトしたショウジョウバエＳ２細胞を、１０％ウシ胎児血清および硫酸銅を補充したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地中（１０６細胞／ｍＬ）２７℃で２４ないし７２時間インキュベートする。Ｓ２細胞（クローン１１２０−３−９）を収集し、洗浄し、そしてヒトｇｐ１００１５４−１６２、ｇｐ１００２０９−２１７、ｇｐ１００２８０−２８８、ＭＡＲＴ−１２７−３５、チロシナーゼ−Ｎ３６９−３７７およびチロシナーゼ−Ｄ３６９−３７７ペプチドのそれぞれ０．１μｇ／ｍＬ、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製したヒトβ２ミクログロブリン組換えタンパク質５μｇ／ｍＬを含有するＨＹＱ ＳＦＸ昆虫培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に再懸濁する。室温（２３〜２５℃）で４時間のインキュベーション後に、５〜１０％自己血清を補充したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、Ｓ２細胞をＣＤ８＋細胞と１：１０（ショウジョウバエ細胞：Ｔ細胞）の比で混合する。細胞混合物を３７℃でインキュベートし、その時間の間にショウジョウバエ細胞が死滅する（４８時間までに）。第４日に、黒色腫特異的ＣＴＬ集団を選択的に増殖させるためＩＬ−２（２０Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍＬ）を添加する。
【００８７】
再刺激。リンパ球除去の時点で得かつ将来の使用のため凍結した自己ＣＤ８枯渇ＰＢＭＣを融解し、洗浄し、そして１０％自己血清、５μｇ／ｍＬ組換えヒトβ２ミクログロブリン、ならびに５μｇ／ｍＬのｇｐ１００１５４−１６２、ｇｐ１００２０９−２１７、ｇｐ１００２８０−２８８、ＭＡＲＴ−１２７−３５、チロシナーゼ−Ｎ３６９−３７７およびチロシナーゼ−Ｄ３６９−３７７ペプチドを含有するＲＰＭＩ培地に１０７細胞／ｍＬで再懸濁する。γ線照射（５，０００ｒａｄ）後に、再刺激に使用したフラスコ中で細胞を３７℃で２時間インキュベートする。ダルベッコＰＢＳで洗浄することにより非接着細胞を除去する。接着性単球にペプチドエピトープを負荷し、そして１％ＨＳＡ中５μｇ／ｍＬヒトβ２ミクログロブリンおよび５μｇ／ｍＬの各ペプチドを含有するＬｅｉｂｏｖｉｔｚ培地中で９０分間インキュベートする。上清を除去し、そして、ショウジョウバエ活性化ＣＤ８＋細胞懸濁液（１０％自己血清を含むＲＰＭＩ培地中２．５×１０６細胞／ｍＬ）を１接着性単球に対し約１０のＣＤ８＋細胞の比で添加する。３７℃で３ないし４日培養後に、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍＬ）を、黒色腫特異的ＣＴＬ集団を選択的に増殖させるために培地交換を用いて添加する。
【００８８】
非特異的増殖。２回の再刺激を受けたＣＤ８＋エフェクター細胞を、ＯＫＴ３抗体で刺激した後に支持細胞（照射した自己のＣＤ８＋で選択していない細胞）と一緒に細胞培養袋中で増殖させる。凍結した、ＣＤ８＋で選択していない細胞を融解し、洗浄し、そしてその後γ線照射する（３，５００ｒａｄ）。４：１（支持：エフェクター）の比を、ＯＫＴ３抗体で被覆したＴ−２２５フラスコに入れる。ＯＫＴ３刺激は、２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を補充した１０％自己血清を含有する完全ＲＰＭＩ培地中で実施する。２日後に、刺激したＴ細胞を新鮮培地（Ｘ−ｖｉｖｏ １０培地）で希釈し、そして増殖のため細胞培養袋に移す。新鮮培地およびＩＬ−２をおよそ２ないし３日ごとに補充して、迅速に増殖するＴ細胞を養う。
【００８９】
ＣＴＬの調製および放出
細胞の収集および最終生成物の処方。最終細胞生成物の収集は、培地を除去しかつ細胞を濃縮するための遠心分離により実施する。遠心分離後、１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する生理的食塩水で細胞を洗浄し、７０μｍフィルターを通して濾過し、そしてその後注入媒体で希釈する。注入のための細胞生成物は、３００ｍＬの米国薬局方乳糖リンゲル液（７６％ ｖ／ｖ）、０．９％塩化ナトリウム中５％デキストロース（４％ ｖ／ｖ）および２５％ＨＳＡ（２０％ ｖ／ｖ）中に自己ＣＴＬを含有する。最終生成物細胞を、温度データ自記計測器を伴う冷却断熱輸送容器中の１０００ｍＬ輸送袋に包装する。
【００９０】
生成物試験。ＣＴＬ生成物の放出前に実施する試験を下に列挙する。個々のペプチドに向けられた比活性は、刺激に使用した各個別のペプチドを負荷したクロム標識Ｔ２細胞に対するエフェクター細胞の細胞傷害活性を測定することにより評価する。細胞傷害活性は、正常線維芽細胞（Ｍａｌｍｅ ３）、若しくはチロシナーゼ、ｇｐ １００およびＭＡＲＴ−１について陰性の黒色腫細胞株（０１−ＫＮ）を対照として使用して、クロム標識黒色腫標的（Ｍａｌｍｅ ３Ｍ、Ｍ１４）に対してもまた測定する。
【００９１】
表現型：細胞収集物の一部分を使用して、発送前にＣＤ８生成物の表現型を試験する。最終生成物の規格はＣＤ３、ＣＤ８およびＴＣＲ発現である。記憶、活性化などと一致するマーカーの付加的な表現型評価を測定かつ記録する。
【００９２】
同一性：サンプルのＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＣおよびＨＬＡ−ＤＲ状態を、初期の白血球除去の受領の時点で調製したＰＢＭＣサンプル、および収集した細胞生成物から採取した、培養の終了時に収集したＣＤ８＋ Ｔ細胞から単離したＤＮＡ調製物の分析により決定する。ＤＮＡサンプルのＰＣＲ分析は、Ｇｅｎｏｖｉｓｉｏｎにより提供されるＨＬＡ特異的プライマーオリゴを用いて実施する。最終生成物の規格は第０日サンプルとの同一性である。
【００９３】
細胞数：注入のための所望の細胞用量は１０１０ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。最終生成物の注入限界は１０１０細胞である。生成される細胞の総数は患者依存性である。細胞用量は、該細胞を同一のｅｘ ｖｉｖｏプロトコルで生成した以前の試験で平均９×１０９であった。最終細胞計数は生存細胞の数を決定することにより行う。
【００９４】
生存率：最終細胞用量の生存率は＞７０％である。生存細胞の数は、トリパンブルー色素を排除する細胞を顕微鏡で計数することにより確立する。
【００９５】
マイコプラスマ試験：マイコプラスマについての細胞の試験は、細胞を患者に投与して陰性のマイコプラスマ検出を確認する前に実施する。ＥＬＩＳＡアッセイもまた包含するＲｏｃｈｅのＰＣＲキットを使用する。加えて、Ｔ細胞培養物のサンプルを、２８日培養手順を満たすために最初のサイトカイン供給時（第６日）に収集しかつＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅに送る。培養の結果はＴ細胞注入後に受領する。
【００９６】
エンドトキシン試験：最終細胞生成物のエンドトキシン試験は、カブトガニ変形細胞ライセート（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）アッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、メリーランド州ウォーカーズビル）を使用して実施する。エンドトキシン濃度限界は患者に注入される１ｋｇあたり５ＥＵを超えない。最終細胞生成物の規格は＜１ＥＵ／ｍＬである。
【００９７】
工程内生成物無菌試験：無菌性の工程内試験はＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ装置を使用して実施する。サンプルを培地交換の時間に採取する。最終用量からのサンプルもまたＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ装置により試験し、そして最終生成物の規格は増殖の非存在である。
【００９８】
ショウジョウバエＤＮＡおよび昆虫ウイルスＲＮＡ検出：ＤＮＡを最終ＣＤ８＋ Ｔ細胞生成物から単離し、そして、組換えショウジョウバエＡＰＣを調製するのに使用した昆虫ベクターに特異的なプライマーを使用するショウジョウバエＤＮＡ ＰＣＲアッセイの鋳型として使用する。このサンプルを、陰性対照として作用するナイーブなＣＤ８＋サンプルと比較し、また、ショウジョウバエ細胞ＤＮＡを陽性対照として使用する。全ＲＮＡもまた同一のＣＤ８＋ Ｔ細胞サンプルから単離し、そして、３種の異なる既知の昆虫ウイルスＲＮＡウイルスのｃＤＮＡ１μｇあたり２０コピーを検出し得る定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施する。双方のアッセイについての生成物の規格は、昆虫ゲノムおよびウイルス核酸の陰性検出である。
【００９９】
溶解活性：溶解活性は、抗ペプチド活性を測定するためにペプチドを負荷したＴ２細胞標的、ならびに、黒色腫特異的死滅を評価するために樹立若しくは自己黒色腫細胞ＨＬＡ−Ａ２標的ならびにドナーをマッチさせた腫瘍および非腫瘍株（Ｍａｌｍｅ ３およびＭａｌｍｅ ３Ｍ）の双方でのクロム放出アッセイにより、最終的なＣＤ８＋ Ｔ細胞について評価する。生成物の規格は標的細胞の特異的死滅である。
【０１００】
また、モニターすることを容易にするため、上述された放出試験に加えて以下の試験もまた実施しうる。
【０１０１】
四量体染色：ナイーブな白血球除去由来サンプルのＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＣＴＬをｅｘ ｖｉｖｏで生成するのに使用したペプチドエピトープに対する特異性をもつＴ細胞を数え上げるように設計した四量体分子を用いて、抗原特異的Ｔ細胞の存在について評価する。これは、処置後の抗原特異的Ｔ細胞のモニタリングを可能にする。
【０１０２】
末梢血サンプル中の黒色腫腫瘍細胞：感受性の定量的リアルタイムＰＣＲアッセイは、薬物処置前、間および後の患者血液サンプル中の循環黒色腫細胞のモニタリングを見込む。全部のステージＩＩＩ／ＩＶ黒色腫患者が循環腫瘍細胞を示すわけではない一方、これらの細胞の検出を、治療に対する応答の代理マーカーとして使用し得る。
【０１０３】
上述されたとおり調製したＣＴＬ生成物は、以下の実施例で記述される好ましい態様により具体的に説明されるところの本発明の併用療法処置レジメンで使用しうる。
２−ＣｄＡ若しくはＤＡＢ ＩＬ−２の投与を伴うおよび伴わない、黒色腫関連ペプチド（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼ）を負荷したショウジョウバエ細胞でｅｘ ｖｉｖｏで刺激した自己ＣＤ８＋リンパ球ならびにＩＦＮα−２ｂおよびＩＬ−２を使用する転移性黒色腫を伴う患者の処置。
【０１０４】
これらの実施例は、クラドリビンおよびＤＡＢ ＩＬ２から選択される１種のリンパ球枯渇剤、ならびにサイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−α−２ｂと組合せの黒色腫関連抗原由来のペプチドエピトープに特異的である自己細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の投与を含んでなる処置、ならびに対照処置を具体的に説明する。ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼ由来の抗原性ペプチドを負荷したショウジョウバエｘＡＰＣを接触させることによりＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼを発現する黒色腫細胞をそれらが特異的に標的とするような、活性化した自己ＣＴＬを含んでなる細胞治療剤を、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼを発現する黒色腫細胞の患者の免疫ターゲッティングを高めかつ維持するよう設計する。免疫調節物質ＩＦＮ−α−２ｂおよびＩＬ−２の添加はＣＴＬの応答を増強するために包含する。非骨髄破壊的しかしリンパ球を枯渇させる調製的レジメン（クラドリビン）若しくは特異的Ｔ細胞サブセット枯渇デニロイキンジフリトクス（ＤＡＢ ＩＬ−２）を、ＣＴＬの生着を高めるため、ＣＴＬ注入前に投与する。該処置は、黒色腫特異的ＣＴＬの持続により腫瘍退縮および臨床的有益性を生じさせるように設計されている。
【０１０５】
より具体的には、ＨＬＡ−Ａ２陽性である進行悪性黒色腫を伴う臨床患者に、クラドリビン（０．１２ｍｇ／ｋｇ／日×５日）若しくはＤＡＢ ＩＬ−２（１８μｇ／ｋｇの単回注入）いずれかよりなる非骨髄破壊的しかしリンパ球を枯渇させる調製的レジメンを投与する。加えて、インターフェロン−α−２ｂ（ＩＦＮ−α−２ｂ；１０ＭＩＵ／ｍ２）の付随するレジメンを、ＣＴＬ注入前に皮下注入により連続５日間連日投与する。その後、患者は、ＣＴＬ表現型を表示するｅｘ ｖｉｖｏで生成したショウジョウバエｘＡＰＣで刺激した自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞の単回投与を受領する。細胞注入に直ちに２８日間の低用量（例えば３ＭＩＵ）ＩＬ−２の皮下連日投与、次いで腫瘍評価が続く。低用量（例えば３ＭＩＵ）ＩＬ−２の皮下連日投与を、疾患進行の証拠を伴わない患者で継続する。
【０１０６】
ＣＴＬは、精製したナイーブなＣＤ８＋ Ｔ細胞をヒトＭＨＣクラスＩ拘束の情況で６種の異なる黒色腫関連Ｔ細胞ペプチドエピトープを提示するショウジョウバエｘＡＰＣで刺激して、培養およそ３４日後にＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼに対する複数の特異性を表すＣＴＬをもたらす方法により、生成する。
【０１０７】
患者を試験に適格にするためのスクリーニングで血液を収集し、また、調製的白血球除去手順が第０日若しくは第１日に起こる。患者は、細胞治療剤を製造するために必要とされる十分な白血球を得るために、標準的な、血液容量の２．０〜３．０倍の白血球除去を受ける。示される時点で、分析のための末梢血液細胞を得るため付加的な白血球除去処置（最初のＣＤ８サンプルを得るのに使用した量の１／３の以下）を実施する。これらのサンプルを使用して、抗原特異的Ｔ細胞および可能な循環黒色腫腫瘍細胞の存在をモニターする。血漿および血液細胞は、処置前および後サンプルの保管に対する異種移植要件に合致するようにもまた収集する。白血球除去生成物は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する施設に輸送し、刺激し、そしておよそ３４日間培養する。
【０１０８】
測定可能病変の評価はＣＴＬ注入後４および８週双方に実施する。該試験の一目的は、Ｔ細胞注入前のかつ確立された免疫増強サイトカインレジメンとともにの完全な非骨髄破壊的なリンパ球を枯渇する（クラドリビン）若しくは選択的Ｔ細胞サブセット枯渇（ＤＡＢ ＩＬ−２）の投与が、付随する客観的腫瘍退縮を伴う抗原特異的Ｔ細胞持続をもたらすことができるかどうかを決定することである。
【０１０９】
細胞傷害性リンパ球の調製
抗ＣＤ８抗体での陽性選択により白血球除去サンプルから単離したＣＤ８＋細胞を、ヒトクラスＩおよび共刺激分子（ＨＬＡ−Ａ２．１、β２ミクログロブリン、Ｂ７．１、ＣＤ７０、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３）を発現するショウジョウバエｘＡＰＣにより提示されるヒト黒色腫関連抗原ペプチド（チロシナーゼ３６９−３７７（ｎａｔｉｖｅ）、チロシナーゼ３６９−３７７（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄ３７１）、ＭＡＲＴ−１２７−３５、ｇｐ１００１５４−１６３、ｇｐ１００２０９−２１７およびｇｐ１００２８０−２８８）で刺激する。これら同一ＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下で、２回の自己のペプチドパルスした単核細胞により再刺激する。抗ＣＤ３ ｍＡｂ（ＯＫＴ３）を用いる非特異的増殖段階もまた細胞の総数を増大させる（すなわち一般に第二の再刺激段階の終了時に得られるものの２５倍以上）ために包含する。細胞傷害性Ｔ細胞活性をペプチド負荷したＴ２細胞および一団のＡ２＋黒色腫細胞に対し測定する一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激したＣＤ８＋ Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーにより評価する。加えて、抗原特異的刺激およびペプチド特異的四量体分析に応答してのインターフェロン−γ産生は、生成されるＣＴＬのそれぞれエフェクター機能および特異性を確認する。
【０１１０】
黒色腫癌患者から単離したナイーブなＣＤ８＋ Ｔ細胞から生成したＣＴＬの効力
末梢血サンプルから単離した抗原特異的ＣＴＬが、ＴＣＲが向けられる特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する低から高までのアビディティーの範囲にわたる細胞の不均一集団の一部であることが、黒色腫患者で示されている。しかしながら、これらのＣＴＬの大多数は低アビディティーのものであり、そして高アビディティーをもつＣＴＬのみが有意の腫瘍細胞溶解を示す２１。加えて、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が黒色腫を伴う患者の腫瘍塊から単離された。高用量ＩＬ−２の存在下でのこれらのＴＩＬのｅｘ ｖｉｖｏ増殖は黒色腫患者における客観的応答をもたらしたが；しかしながら、これらの応答は、短期間、かつ、いかなる完全奏功も生成することに失敗したＴＩＬから発する高度に反応性のクローン化Ｔ細胞のものであった１６。
【０１１１】
対照的に、ショウジョウバエｘＡＰＣを用いてｅｘ ｖｉｖｏで生成したＣＴＬは、ペプチド特異的溶解（例えば図１を参照されたい）および強い黒色腫腫瘍細胞死滅が可能な強力な高アビディティーの抗原特異的Ｔ細胞である。腫瘍細胞に対する強い細胞溶解活性をもつＣＴＬの再現可能な生成は数種の寄与因子に帰されると考えられる。第一に、ペプチド特異的抗ＣＤ８モノクローナル抗体でのＣＤ８＋精製はＣＤ８の高密度を伴う細胞について選択した一方、特異的ペプチドの存在下での抗体放出はＴ細胞の非特異的刺激を回避した。第二に、高度に精製したＣＤ８＋ Ｔ細胞（表Ｉ）を、高密度の抗原提示が強力な一次Ｔ細胞免疫応答をもたらすＭＨＣ分子の情況で、特異的Ｔ細胞エピトープを提示するｘＡＰＣで刺激する。ＡＰＣ上の複数の共刺激分子の包含はＴ細胞刺激を最適化する。第三に、再刺激段階は、一次刺激で使用される同一の黒色腫関連Ｔ細胞エピトープを負荷された自己の単核細胞を取り込み、そして増殖するＴ細胞に増強を提供する。最後に、ＯＫＴ３、自己支持細胞および低用量ＩＬ−２を用いる単一の非特異的増殖段階は、Ｔ細胞の総数を約２５倍増大させる一方で、第二の再刺激段階の終了時に記録される抗原特異的Ｔ細胞の同一比率を維持する。
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
このｅｘ ｖｉｖｏ ｘＡＰＣ ＣＤ８＋ Ｔ細胞刺激プロトコルは、ペプチド特異的四量体分子、特異的抗原刺激に応答してのインターフェロン−γ放出および特異的腫瘍溶解での列挙により評価されるとおり、強力な腫瘍細胞溶解、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する高アビディティー、および抗原特異性をもたらした。
【０１１４】
以前の研究からの悪性転移性黒色腫におけるＣＴＬ治療の評価
ステージＩＩＩ若しくはステージＩＶ黒色腫を伴う合計５５例の被験体を伴った２件のフェーズＩ試験および１件のフェーズＩＩ試験が実施された。試験１、「ショウジョウバエ抗原提示細胞、インターロイキン−２、インターロイキン−７、その後接着性単球およびチロシナーゼペプチドとともにｅｘ ｖｉｖｏで連続培養した自己細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）」は、１０例のステージＩＶ黒色腫患者でのオープンラベル試験であった。臨床エンドポイントは、１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化後の再注入した自己ＣＴＬの安全性および忍容性；２）制限希釈分析による全身循環中の注入されたＣＴＬのキネティクスの測定；３）放射シンチグラフィーによる１１１インジウム標識ＣＴＬの全身配置；４）免疫組織化学分析による生検小結節の細胞組成（ＣＴＬ、ＴＨ、ＮＫ、Ｂ細胞）ならびに５）測定可能病変の退縮および２か月にわたる応答持続期間であった２２。
【０１１５】
試験２、「進行黒色腫の処置のためのショウジョウバエ細胞で刺激した自己ＣＤ８＋リンパ球の注入を伴う皮下インターフェロン−αのパイロット試験」において、合計１５例のステージＩＩＩ／ＩＶ黒色腫患者に、ＩＦＮα−２ｂでのバックグラウンド維持療法上で自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞を注入した。ＣＴＬ療法を、１）再注入したＣＴＬの安全性および耐性（ｔｏｌｅｒａｔｉｏｎ）をモニターすること；２）生検小結節の細胞組成；３）
測定可能病変の退縮、ならびに４）３か月にわたる応答持続期間により評価した。経過観察評価（最初の注入後４週）で安定な疾患を有したか若しくは臨床応答を示した被験体に第２サイクルの処置を提供した。１５例の被験体のうち８例が第２サイクルのＣＴＬ療法を受け、４例の被験体が第３のサイクルに進入し、そして１例の被験体は４サイクルのＴ細胞療法で処置した２３。
【０１１６】
試験３、「進行黒色腫の処置のためのショウジョウバエ細胞で刺激した自己ＣＤ８リンパ球の注入を伴う若しくは伴わない皮下インターフェロン−α−２ｂ（ＩＦＮ）およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）の無作為化フェーズＩＩ試験」において、合計３０例のステージＩＩＩ／ＩＶ黒色腫患者を、サイトカイン単独（ＩＦＮαおよびＩＬ−２）若しくはサイトカインおよびＴ細胞で処置した。それは、患者がサイトカインのみアーム（アームＡ）若しくはサイトカインおよびＴ細胞アーム（アームＢ）に進入した無作為化試験であった。アームＡに進入しかつそこで進行した患者に、サイトカインおよびＴ細胞アーム（アームＣ）にクロスオーバーする機会を提供した。本試験の一次エンドポイントは、２群（アームＡ対アームＢ）間の疾患の無増悪期間（ＴＴＰ）を比較することであった。統計学的有意性は、アームＡに進入する患者に対するアームＢに進入する者のＴＴＰで達せられた（図１１）。アームＡからアームＣにクロスオーバーした患者で、ＴＴＰの統計学的有意性はＴ細胞を受領する患者でもまた検出された。用量および処方されたスケジュールでのＩＦＮαおよびＩＬ−２の安全性および耐性もまたモニターした２４。
【０１１７】
インターフェロン−α−２ｂ（ＩＦＮ−α−２ｂ）の使用の理論的根拠
インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）は、多様な悪性病変において広範な免疫調節および抗増殖効果を有する。ＩＦＮ−αの１作用機序は黒色腫細胞上での腫瘍抗原発現の上方制御であると考えられている。それは腫瘍の表面上の免疫学的に重要な分子の発現を高める能力を有する。これらは、ＭＨＣ抗原、アクセサリー分子、ならびに腫瘍関連抗原を包含する２５−２７。これらの免疫調節効果は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を認識かつ攻撃する抗体およびリンパ球双方を包含する免疫系の活性を改善しうる。能動的特異的免疫療法は播種性黒色腫の処置において有意の臨床応答を示した。上で論考された免疫機能研究の結果は、黒色腫ワクチン処置が抗黒色腫ＣＴＬの頻度を増大させることを示した。免疫療法のこれら２種の様式が相乗的に作用しうると考えられる。５日クールのＩＦＮ−α（１０ＭＵ／ｍ２；皮下で）が試験２に包含され、また、組織のＩＨＣ染色の結果は、該タイミングおよび用量が、指定される時間枠で単一患者から得た連続生検サンプル中のクラスＩおよび黒色腫関連抗原双方の発現を上方制御するのに十分であったことを示した。臨床試験での同一の５日クールを試験３で包含した。
【０１１８】
インターロイキン−２の使用の理論的根拠
ヒト組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）は、組換えＤＮＡ技術により製造されるリンホカインであり、多様な生物学的活性を表すことが示されている。ＩＬ−２は、標的細胞の表面上の特定の受容体への結合後に免疫系を刺激しかつその生物学的効果を発揮する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、それはＴ細胞増殖およびリンパ球の細胞傷害性を高め、リンホカイン活性化およびナチュラル双方のキラー細胞のキラー活性を誘導し、そしてインターフェロン−γ産生を誘導することが示されている。２８３例の患者への高用量ＩＬ−２の投与は、９例の完全奏功を伴う７％の寛解率を生じ、そして該患者は９から９１か月以上まで無病のままであった２８。高用量ＩＬ−２は低用量連続注入より有効であるようであったとは言え、高用量のＩＬ−２はまたより毒性でもある。最も一般的な副作用は流感様症状であった。最も重篤な副作用は、低血圧、毛細管漏出症候群および低下された臓器灌流であった。養子移入した自己Ｔ細胞のレベルを高めかつ維持するために、低用量ＩＬ−２（３ＭＩＵ／日で×２８日）の皮下投与を試験３の一部で使用した。それは、抗原特異的Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで維持するための試みにおいてリンパ球有糸分裂誘発、リンパ球細胞傷害性およびインターフェロン−γ産生を高めるため、短い１クールのＩＦＮ−αの後およびＣＴＬ注入直後に追加した。
【０１１９】
非骨髄破壊的免疫抑制性化学療法レジメン後のリンパ球の養子移入
マウスの研究は、Ｔ細胞の投与前の化学療法での免疫抑制の誘導が、リンパ球の養子移入が最大の腫瘍退縮を媒介することを可能にするために不可欠であったことを示した２９，３０。これらの研究に基づき、非骨髄破壊的化学療法レジメンの適用後のリンパ球の養子移入を用いて患者を処置するための臨床プロトコルを開始した１６，３１。非骨髄破壊的調製的レジメンを使用して、同種骨髄移植片を受領する患者を処置し、そして、これらのレジメンは、養子移入したＴリンパ球の効果を高めうる一過性免疫抑制を誘導するのに理想的に適するようである。ＨＬＡを一致させた同種移植片を受領する腎細胞癌患者で元は使用されたシクロホスファミドおよびフルダラビンのレジメン３２が、転移性黒色腫患者で最近使用されている１６，３１。Ｔ細胞の養子移入前のリンパ球枯渇レジメンの組み込みの理論的根拠は、制御性細胞をおそらく破壊する、恒常性Ｔ細胞制御を破壊する（「空間を作成する」）、若しくは移入されたＴ細胞の生着を潜在的に高め得る他の正常の免疫寛容誘発機構を廃止することであった。処置関連の死亡は観察されず、そして従って、抗腫瘍リンパ球および高用量ＩＬ−２と組合せの非骨髄破壊的化学療法は安全であるはずである。非骨髄破壊はフルダラビン（２５ｍｇ／ｍ２）およびシクロホスファミド（６０ｍｇ／ｋｇ）で誘導され、そしてリンパ球注入および高用量ＩＬ−２（７２０，０００ＩＵ／ｋｇ）が続いた。
【０１２０】
化学療法剤シクロホスファミドおよびフルダラビンの投与は、完全には骨髄破壊的でない一方で、骨髄抑制的であることが示され、好中球、リンパ球、血小板および赤血球に影響を及ぼす。化学療法の開始後第１０日に最下点まで下落した好中球レベルは６／ｍｍ３で記録され、そしてフィルグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ）の支持で第１４日に５００／ｍｍ３より上に回復した。リンパ球レベルは６／ｍｍ３の最下点を有し、そして同一期間に２００／ｍｍ３より上に回復した。患者は通常、化学療法の開始２〜３週後に５００／ｍｍ３より上の好中球数および２０，０００／ｍｍ３より上の血小板数を表した。骨髄機能を救出するための幹細胞注入を必要とした患者はなく、そして従って処置全体は安全であるようであった。しかしながら、ＣＤ４数は持続して低いままであり（およそ第２００日の平均ＣＤ４数は４６／ｍｍ３と３２０／ｍｍ３の間の範囲を伴い１５６／ｍｍ３であった）、これはフルダラビンで誘導される免疫抑制の既知の副作用である。日和見感染の発症が起こり（すなわち一過性帯状疱疹の突然の発生）、それは処置の終了後に解消した。
【０１２１】
フルダラビンに類似のプリンアナログ、クラドリビン（２−ＣｄＡ、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（Ｒ））は、ヘアリーセル白血病の処置での使用に承認され、そして自己反応性Ｔリンパ球を減少させる試みにおいて多発性硬化症（ＭＳ）患者でもまた評価された。ＭＳ患者で、Ｔ細胞サブセットの特異的減少が、クラドリビンの異なる用量と相関した３３−３５。それは、長期間持続するリンパ球減少を誘発する一方で、他のリンパ球溶解薬に関して非常に好都合な毒性プロファイルを有する。リンパ球レベルは、４か月クールの間投与される場合、クラドリビンの最初の注入直後に低下し、５か月で最下点に達し、そして６か月までに回復することを開始する３３，３４。リンパ球減少は全患者で観察され、また、感染性合併症は重大な問題でなかった。該薬物は、局所刺激を引き起こすことなくかつＩＶ経路に完全に同等のようである薬物動態および治療結果を伴い、便宜的皮下経路により与えうる。
【０１２２】
ワクチンの状況で制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を免疫抑制性と同定するヒトでの最近の研究は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＧＩＴＲと一緒にＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ｈｉ表現型を表すＴｒｅｇサブセットの枯渇後に、高められた抗腫瘍免疫応答を示した３８。このＴ細胞サブセットは、デニロイキンジフチチクス（ＤＡＢ３８９ＩＬ−２、ＯＮＴＡＫ（Ｒ））の単回投与後に選択的に枯渇され得る（およそ３週）。単回投与４日後に、Ｔｒｅｇ細胞の３７〜７７％枯渇が８例の腎細胞癌患者で示された。Ｔ細胞枯渇後、ＲＮＡ−ＤＣワクチンを投与し、そして、ワクチン抗原に対する免疫応答の１０倍増強が、ワクチン単独に対しＤＡＢ ＩＬ−２およびワクチン双方を受領する患者で示された。従って、抗原特異的ＣＴＬの養子移入前６日の同一用量（１８μｇ／ｋｇ）が、本発明のレジメンでの使用のための好ましい用量である。
【０１２３】
患者選択
試験の被験体は、ＨＬＡ−Ａ２陽性である、転移性黒色腫と診断されたヒト患者である。モノクローナル抗体（ＢＢ７．２）をＦＡＣＳ分析によりＰＢＭＣサンプルを分析するのに使用し、そして、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１サブタイプを決定するためのＯｌｅｒｕｐ ＳＳＰＴＭ ＰＣＲ試験（ＧｅｎｏＶｉｓｉｏｎ）を使用してさらなる分析を実施する。
【０１２４】
処置スキーム
図２は下により詳細に記述される処置レジメンを描く。患者を各コホートに１０例を含み被験体の３コホートに分割する。リンパ球枯渇レジメンの対照、コホートＡレジメンではＣＴＬおよびサイトカインを投与する。本発明の好ましい一態様であるコホートＢレジメンでは、患者はクラドリビン（第０〜４日）およびＣＴＬ（第３６日）およびサイトカインを受領する。本発明の別の好ましい態様であるコホートＢレジメンでは、患者はＤＡＢ ＩＬ−２（第３０日）およびＣＴＬ（第３６日）およびサイトカインを受領する。実験レジメンを下により詳細に記述する。
【０１２５】
黒色腫関連抗原に特異的なＣＴＬ
悪性黒色腫の細胞傷害性Ｔリンパ球療法は、黒色腫関連抗原エピトープを有する黒色腫細胞を破壊するのに自己のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を利用する。ＣＴＬは臨床の場で生成した白血球除去サンプルから調製し、そして、ＧＭＰガイドラインのもとでＣＴＬを生成する施設に輸送し、そして注入のため戻す。
【０１２６】
第０日に、転移性黒色腫を伴う患者が白血球除去を受ける（患者の体重および状態に依存しておよそ１０〜１５リットルの運転）。得られた細胞を、ＧＭＰ製造施設での処理のため室温で翌日配達で発送する。適切な時点で白血球除去を実施して分析のための末梢血リンパ球を得る。これらのサンプルを使用して、抗原特異的Ｔ細胞の存在および循環黒色腫腫瘍細胞の存在をモニターする。モニタリング白血球除去処置は、臨床の場でおよそ５リットルの末梢血（若しくは、その後の注入のためのＣＤ８細胞を得るため初回白血球除去で収集した容量の１／３）を処理し、そしてＧＭＰ製造施設に発送する。ＰＣＲアッセイを使用して、治療後の循環黒色腫細胞のレベルの低下を測定する。循環黒色腫細胞の検出は、感受性の定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにより測定し得る３９−４１。抗原特異的Ｔ細胞の存在を、ペプチド特異的／ＨＬＡ−Ａ２四量体を用いて評価する。
【０１２７】
注入のための最終ＣＴＬ調製物は、７６％（ｖ／ｖ）乳糖リンゲル液、４％（ｖ／ｖ）Ｄ５ＮＳおよび２０％（ｖ／ｖ）の２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に含有される３００ｍＬ中に１×１０１０自己ＣＴＬを含有する。ＣＴＬ生成物を氷上で保持した注入に適する滅菌袋中で調製し、そして調製４２時間以内に３０分にわたり注入する。
【０１２８】
注入前に、ＣＴＬを溶解活性（ペプチド負荷した標的細胞および黒色腫腫瘍細胞双方の溶解）、生存率、ならびにＦＡＣＳ分析による純度についてモニターする。ショウジョウバエ細胞ＤＮＡおよび昆虫ウイルスＲＮＡ双方の非存在を、感受性の定量的リアルタイムＰＣＲアッセイで確認する。無菌性は、ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ（Ｒ）分析、マイコプラスマ試験およびグラム染色分析により決定する。
【０１２９】
患者は、ＣＴＬが向けられている抗原をｉｎ ｖｉｖｏで発現する細胞を標的とすることが可能な細胞傷害性Ｔリンパ球になるようにｅｘ ｖｉｖｏで刺激かつ増殖したおよそ１０１０自己Ｔ細胞のＣＴＬ注入を受領する。細胞はＩＦＮ−α処置後の終了後に注入し、そしてＩＬ−２レジメンの開始にすぐ先行する。
【０１３０】
サイトカイン
インターロイキン−２（ＩＬ−２）はＣｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州エメリービル）から得る。それはおよそ０．１７ｍｇの第一および０．８９ｍｇの第二リン酸ナトリウムで７．５（範囲７．２ないし７．８）のｐＨに緩衝した、５０ｍｇマンニトールおよび０．１８ｍｇドデシル硫酸ナトリウムを含む無菌の白色ないし灰白色凍結乾燥ケーキとして２２百万ＩＵ（約１．３ｍｇ）のＩＬ−２を含有する単回使用バイアルとして供給される。該粉末を１．２ｍＬの米国薬局方注射用滅菌水で再構成し、そして生じる濃度は１８百万ＩＵ／ｍｌすなわち１．１ｍｇ／ｍＬである。無傷のバイアルは冷蔵庫（２°〜８℃）中で保存しかつ光から保護する。再構成したＩＬ−２を、２．４ｍＬのＤ５％水でさらに希釈する。該最終濃度（６ＭＵ／ｍＬ）は、プラスチック製シリンジに一旦吸い込まれれば、２〜８℃で冷蔵保存される場合に再構成後１４日間十分である。ＩＬ−２の最終希釈を、ＣＴＬ注入直後に開始しかつ疾患の進行まで毎日、３百万単位（３ＭＩＵ）の用量で皮下に外来で自己投与する。
【０１３１】
ＩＮＴＲＯＮ−Ａ（Ｒ）はＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州ケニルワース）から得る。このＩＦＮ−α−２ｂ製品は、凍結乾燥粉末若しくは注入のための溶液いずれかとして滅菌５ｍｌバイアル中で供給される。１バイアルはおよそ３×１０６Ｕ若しくは１８×１０６ＵのＩＦＮを含有する。凍結乾燥粉末は、静菌剤が包含されていないため、好ましくは使用直前に再構成し；未使用の凍結乾燥粉末は冷蔵庫若しくは冷凍庫（−４℃ないし−２０℃）で保存する。該剤が注入可能な溶液として供給される場合はそれを冷蔵庫に保存する（２°〜８℃すなわち３６°〜４６°Ｆ）。ＩＦＮ−□の最終希釈を、皮下注入として第３１〜３５日に１０ＭＵ／ｍ２で外来で自己投与する。
【０１３２】
ＤＡＢ３８９ＩＬ−２
ＤＡＢ３８９ＩＬ−２（デニロイキンジフチトクス、ＯＮＴＡＫ（Ｒ））は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現される、ジフテリア毒素フラグメントＡおよびＢのアミノ酸配列、次いでインターロイキン２の配列から構成される、組換えＤＮＡ由来の細胞傷害性タンパク質である。それは標的を定められた薬物であり、それらの表面上にＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ）を発現する細胞に結合する。それは悪性若しくは正常の制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の表面上の高アフィニティーＩＬ−２受容体と相互作用して細胞内タンパク質合成を阻害し、迅速に細胞死に至る。ＤＡＢ３８９ＩＬ−２は、静脈内（ＩＶ）投与に意図している無菌の凍結溶液として単回使用バイアル中で供給される。ＯＮＴＡＫの各２ｍＬバイアルは、米国薬局方注射用水中クエン酸（２０ｎＭ）、ＥＤＴＡ（０．０５ｍＭ）およびポリソルベート２０（＜１％）の無菌溶液中に３００ｍｃｇの組換えＤＡＢ−ＩＬ２を含有する。該溶液は６．９〜７．２のｐＨを有する。無傷のバイアルは凍結すなわち−１０℃で保存するがしかし再凍結しない。該物質は、冷蔵庫中で２４時間を超えない間若しくは室温（２５℃すなわち７７°Ｆ）で１〜２時間融解することにより用量を調製する前に室温にもたらし、そしてＮＳで≧１５ｍｃｇ／ｍＬの濃度に希釈する。ＤＡＢ３８９ＩＬ−２は静脈内注入、好ましくは最低１５分にわたる注入により投与する。コホートＣに割り当てられた患者は第３０日（ＩＦＮ−□の開始１日前かつＣＴＬの注入６日前である）にＤＡＢ ＩＬ−２の単回皮下注入を受領する。該用量は１８μｇ／ｋｇである。
【０１３３】
クラドリビン
Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（Ｒ）（２−クロロ−２’デオキシ−□−Ｄ−アデノシン）は合成抗腫瘍剤である。それはアデノシンデアミナーゼの作用に抵抗性のプリンヌクレオシドアナログであり、優先的なリンパ球傷害性をもたらす。デオキシヌクレオチダーゼに対するデオキシシチジンキナーゼの高い比を伴う細胞（例えばリンパ球および単球）で、クラドリビンは活性の三リン酸デオキシヌクレオチド２−ＣｄＡＴＰにリン酸化され、蓄積して細胞代謝の破壊、ＤＮＡ損傷およびその後の細胞死を引き起こす。該薬物はクラドリビン１０ｍｇ（１ｍｇ／ｍＬ）を含有する単回使用バイアル中で供給される、澄明無色の無菌の保存剤を含まない等張溶液である。クラドリビンの各ｍＬは、１ｍｇの有効成分、および不活性成分として９ｍｇ（０．１５ｍＥｑ）の塩化ナトリウムを含有する。該溶液は５．５ないし８．０のｐＨ範囲を有する。リン酸および／若しくは第二リン酸ナトリウムを添加して６．３±０．３にｐＨを調節してもよい。無傷のバイアルは冷蔵保存（２〜８℃）する。コホートＢのクラドリビンの用量は合計５日間０．１２ｍｇ／ｋｇ／日であり、最大３．０ｃｃを単一部位に投与する３〜４部位に細分する。総クラドリビン用量は０．６ｍｇ／ｋｇである。（この同一スケジュール（連続５日）および０．１４ｍｇ／ｋｇ／日の用量（総用量＝０．７ｍｇ／ｋｇ）で皮下投与されるクラドリビンは、ヘアリーセル白血病患者で安全であることが報告された３７。加えて、６０例の患者にこのスケジュールおよび用量で投与したクラドリビンは、単一サイクル後に臨床上同一の骨髄抑制を伴いおよそ７０％のリンパ球枯渇を生じた。標準化における変化の結果として、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎは、実験室で合成したクラドリビンストックと比較して、以前の臨床研究で報告されたより１２％より高いことが見出された。０．１ｍｇ／ｋｇであると報告された用量は現在、実際にわずか０．０８７ｍｇ／ｋｇであったことが推定されている３３。２〜３部位に細分したＬｅｕｓｔａｔｉｎ（Ｒ）製剤での皮下投与の安全性に関して、再発−寛解型多発性硬化症患者での研究は、２．１ｍｇ／ｋｇの総累積用量に月１回６か月間０．０７ｍｇ／ｋｇ／日×５日を使用した３６。合計２７例の患者を処置薬物アームに無作為化した。感染症は、２例のクラドリビン処置患者およびプラセボを受領する１例の患者で発生した軽度の部分的帯状疱疹のエピソードに制限された。重大な血小板減少症、貧血顆粒球減少症若しくは全身骨髄抑制の個別症例は存在しなかった。）
【０１３４】
任意の支持療法
患者は処置の間およびその後、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−２毒性を排除するため、以下、すなわちアセトアミノフェン（６５０ｍｇ ＰＯ 必要に応じ４時間ごと）、ジフェンヒドラミン（５０ｍｇ ＩＭ若しくはＰＯ 必要に応じ４時間ごと）、インドメタシン（２５ｍｇ ＰＯ １日３回若しくは７５ｍｇ徐放１日１回）、プロクロルペラジン（１０ｍｇ ＩＶ若しくはＰＯ 必要に応じ４時間ごと、吐き気）、Ｚａｎｔａｃ（Ｒ）（１５０ｍｇ １日２回、胃炎）のいずれかを受領しうる。とりわけ処方されない他の抗炎症剤および制吐剤を上の支持薬物のいずれの代わりに用いてもよい。
【０１３５】
本発明は具体的に説明する実施例および好ましい態様に関して上に詳述されたとは言え、当業者は、本発明の範囲が前述の記述により定義されず、しかし、特許法の原理のもとで適正に解釈されるとおり付随する請求の範囲により定義されることを理解するであろう。
【０１３６】
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３６． Ｒｏｍｉｎｅ，ＪＳ，Ｓｉｐｅ，ＪＣ，Ｋｏｚｉｏｌ，ＪＡ ｅｔ ａｌ．Ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｒｅａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ａｓｓｏｃ Ａｍｅｒ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １１１：３５−４４，１９９９．
３７． ｖｏｎ Ｒｏｈｒ，Ａ，Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｓ−ＦＨ，Ｔｉｃｈｅｌｌｉ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈａｉｒｙ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｗｉｔｈ ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ（２−ｃｈｌｏｒｏｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）ｂｙ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｂｏｌｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：ａ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １３：１６４１−１６４９，２００２．
３８． Ｖｉｅｗ，Ｊ，Ｓｕ，Ｚ，ａｎｄ Ｄａｎｎｕｌｌ，Ｊ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ＡＳＣＯ Ａｂｓｔ ２５０６，２００４．
３９． Ｋｅｉｌｈｏｌｚ，Ｕ．，Ｇｏｌｄｉｎ−Ｌａｎｇ，Ｐ，Ｂｅｃｈｒａｋｉｓ，ＮＥ ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｏｃｕｌａｒ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０：１６０５−１６１２，２００４．
４０． Ｈｏｏｎ，ＤＳＢ，Ｂｏｓｔｉｃｋ，Ｐ，Ｋｕｏ，Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｓ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：２２５３−２２５７，２０００．
４１． Ｇｏｙｄｏｓ，ＪＳ ａｎｄ Ｒｅｉｎｔｇｅｎ，ＤＳ．Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｕｓｅｆｕｌ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｃｕｌｔ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｉｎ：Ｂ．Ｊ．Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ（ｅｄ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ ６１：Ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．３０１−３２０．
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】ペプチド負荷した標的細胞に向けられた、ｅｘ ｖｉｖｏで生成したＣＴＬの細胞溶解活性を具体的に説明する。黒色腫患者から単離したＣＤ８＋ Ｔ細胞を、５種の異なる黒色腫関連ペプチドエピトープを負荷したショウジョウバエＡＰＣでｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した。活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、黒色腫特異的ＣＴＬを選択的に増殖させるため、ＩＬ−２およびＩＬ−７を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。活性は、各ペプチドを個別に負荷した５１Ｃｒ標識Ｔ２標的細胞の特異的溶解として評価した（ＨＬＡ−Ａ２対照ペプチドを負荷したＴ２細胞に対するＴｙｒ−１６８９、Ｔｙｒ−２７９２、ｇｐ１００−１８１７、ｇｐ１００−２８５３若しくはＭＡＲＴ−１８１９）。
【図２】対照レジメンと一緒の本発明の処置レジメンの２種の好ましい態様の図解を提供する。
【技術分野】
【０００１】
関連出願への交差引用
本出願は、２００６年３月１日出願の米国仮出願第６０／７７８，５１６号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、活性化細胞傷害性リンパ球、ＩＬ−２およびＩＦＮ−α−２ｂのようなサイトカイン、ならびにリンパ球枯渇剤（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）としてのクラドリビン若しくはデニロイキンジフチトクスの投与を伴う、患者における癌の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の正しい認識を容易にするため、本節は、発明者に独特でありうる観察結果、結論および観点を包含する本発明の開発に至る歴史的および技術的背景を論考しうる。従って、本明細書の背景の声明は、従来技術の内容に関する承認として解釈されるべきでない。
【０００４】
多数の治療が、多様な癌を処置するため開発された。これらの努力の多くは化学療法レジメンに集中してきた。転移性黒色腫の処置として設計された１種の特定の併用化学療法レジメンで、３５〜５０％の奏功率が「ダートマスレジメン」（ＤＴＩＣ、シスプラチン、ＢＣＮＵおよびタモキシフェンの組合せ）で報告されたが、しかし生存期間は６ないし１０か月のままであった。高寛解率は、積極的高用量強度化学療法（非特許文献１）、および自己骨髄移植での造血過多についてもまた報告されている。にもかかわらず、生存期間の中央値は短かった（およそ４か月（非特許文献２））。
【０００５】
数年の桁での生存の有意の改善が、ある種の免疫療法を受けている黒色腫患者の小さい比率で示されている。これは、癌ワクチンでの能動的特異的免疫療法、ならびに、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）のような免疫系の非特異的ブースターの使用を包含する（非特許文献３〜５）。
【０００６】
黒色腫におけるＴ細胞に定義される腫瘍抗原の同定は、抗原特異的細胞性免疫応答を増強することを試みることにより癌細胞を標的とする臨床試験に至った。このアプローチは、強力なＴ細胞応答をｉｎ ｖｉｖｏで誘導するための試みにおいて、免疫原性の情況で抗原が送達される多数のワクチン接種戦略で遂行された。数種の臨床応答が該ワクチン試験で観察されたとは言え、誘導されるＴ細胞応答の大きさは一般に低いか若しくは検出不可能であり、そして臨床応答と乏しく相関した。黒色腫患者の癌抗原での免疫化は循環ＣＴＬ前駆体の数を増大させうるが；しかしながらそれは臨床での腫瘍退縮と相関せず、ｉｎ ｖｉｖｏでの機能若しくは活性化の欠陥を示唆している。
【０００７】
マウス腫瘍モデルでの研究は、１種若しくはそれ以上の腫瘍抗原に特異的なＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化を必要とする養子免疫療法が、最小限の毒性を伴い有効でありうることを示した。ヒト腫瘍の処置にこの戦略を応用することにおける一障害は、腫瘍細胞をＣＴＬ媒介性破壊に対し感受性にする免疫原性抗原の同定であった。黒色腫患者からの腫瘍反応性Ｔ細胞の単離は、ＣＴＬが向けられる腫瘍抗原（エピトープ）のいくつかの同定に至った。これらはチロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００およびＭＡＧＥを包含する。これらのうち、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１は黒色腫でほぼ普遍的に発現されており、そして従って養子免疫療法の所望の標的選択を表す（非特許文献６〜１３）。
【０００８】
養子Ｔ細胞療法は、癌患者においてｉｎ ｖｉｖｏで免疫寛容誘発機構が活性である宿主環境からのＴ細胞の取り出しを必要とし、そして、この患者集団で示される無効な応答に寄与する。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は抗原特異的ＣＴＬを生成するためにｅｘ ｖｉｖｏで刺激しうる（例えば特許文献１を参照されたい）。早期の養子免疫療法のアプローチは、多様な癌の処置として活性化リンパ球を使用した（非特許文献１４）。当初、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、および後にｅｘ ｖｉｖｏでＩＬ−２で活性化した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が使用されたが、しかし有効性の実証はあいまいであった。これらの早期の対照臨床試験は、黒色腫患者へのＩＬ−２の直接投与を上回るｅｘ ｖｉｖｏ活性化細胞の使用の利点を示すことに失敗した。Ｙｅｅら（フレッド・ハッチンソン癌研究センター）（非特許文献１５）およびＤｕｄｌｅｙら（ＮＣＩ）（非特許文献１６）によるより最近の研究は、ある種の養子Ｔ細胞の治療的アプローチに対する潜在性を示した。これらの研究は、ＭＡＲＴ−１若しくはｇｐ１００に特異的なＴ細胞クローンおよび低用量ＩＬ−２、または同種支持細胞とともにｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＴＩＬおよび高用量ＩＬ−２のいずれかの使用を必要とした。これらの研究は養子免疫療法が癌の処置として期待できることを確認したとは言え、その完全な開発は、治療的抗原特異的ＣＤ８＋ ＣＴＬ数の再現可能なｅｘ ｖｉｖｏ生成方法の欠如により妨げられていた（非特許文献１７）。
【０００９】
Ｃｙｔｏｔｏｌｙｔｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ細胞はウイルス感染に対する主防御線である。ＣＤ８＋リンパ球はウイルスに感染している宿主細胞を特異的に認識かつ溶解する。ＣＴＬの細胞傷害活性を利用することが望ましいとみられるとは言え、ＣＴＬを特異的に活性化するために利用可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏ手順はほとんどなかった。重要な黒色腫関連抗原の同定、およびＣＴＬの特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化方法が、転移性黒色腫の養子免疫療法の効率的評価を見込む（非特許文献１５〜１８）。
【００１０】
天然に存在する抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば樹状細胞、マクロファージ、自己腫瘍細胞）をｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＤ８＋活性化に使用することが可能である一方、天然のＡＰＣのＭＨＣクラスＩ分子は多くの他のペプチドエピトープを含有し、従って腫瘍関連ペプチドエピトープの最小限の提示を可能にするため、活性化の有効性は低い。これらの提示されるペプチドの大部分は正常の無害な内因性タンパク質を表す。この問題へのより直接的アプローチは、疾患と闘うことに関連するエピトープ（この特定の場合には黒色腫関連抗原）に対し特異的にＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化することであるとみられる。
【００１１】
最近、人工的ＡＰＣが、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を発現するキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）胚細胞株を利用して開発された（非特許文献１８、非特許文献１９）。特許文献１および特許文献２もまた参照されたい。昆虫ショウジョウバエは進歩した免疫系を欠くため、ヒトクラスＩ分子へのペプチドエピトープの負荷に関与するＴＡＰ−１，２ペプチドトランスポーターが存在しない。結果として、トランスフェクトされたクラスＩ分子はショウジョウバエ細胞表面上に空の容器として出現する。これらのトランスフェクトしたショウジョウバエ細胞を、特定のクラスＩ分子（すなわち腫瘍抗原Ｔ細胞ペプチドエピトープ）に結合する外因性合成ペプチドとインキュベートすることにより、利用可能なクラスＩ分子の全部がＭＨＣ拘束性の特異的ペプチドエピトープ（１種若しくは複数）で占有されうる。これらのショウジョウバエＡＰＣ上の単一若しくは複数のエピトープを提示するクラスＩ分子の高密度発現ならびに重要な共刺激分子Ｂ７−１（ＣＤ８０）、ＣＤ７０、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の添加は、抗原性ペプチドに特異的である強力な自己細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成を可能にしうる（非特許文献２０）。
【特許文献１】米国特許第６，２２５，０４２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３５５，４７９号明細書
【非特許文献１】Ｈｒｙｎｉｕｋ Ｗ、Ｂｕｓｈ Ｈ．Ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｄｏｓｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｉｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ４：１１６２−１１７０、１９８６
【非特許文献２】Ｈｅｒｚｉｇ，ＲＨ．Ｄｏｓｅ−ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ．Ｏ．Ａｒｍｉｔａｇｅ、Ｋ．Ｈ．Ａｎｔｍａｎ（編）、Ｈｉｇｈ−Ｄｏｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｎｓ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；ボルティモア：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ中ｐｐ７５０−７５４、１９９２
【非特許文献３】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＭＳ、Ｈａｒｅｌ Ｗ、Ｋａｎ−Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｊら Ａｃｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｗｉｔｈ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ：ｒａｔｉｏｎａｌｅ，ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ．Ｊ．−Ｃ．Ｂｙｓｔｒｙｎ、Ｓ．ＦｅｒｒｏｎｅとＰ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ（編）、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ Ｖａｃｃｉｎｅｓ；Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．中ｐｐ１５３−１６６、１９９３
【非特許文献４】Ｑｕａｎ ＷＤＹ Ｊｒ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＭＳ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃ．Ｍ．Ｈａｓｋｅｌｌ編 Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；フィラデルフィア：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ中ｐｐ５７−６９、１９９５
【非特許文献５】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＭＳ、Ｊａｋｏｗａｔｚ Ｊ、Ｈａｒｅｌ Ｗら Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｆａ ２ｂ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｃｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １２：４０２−４１１、１９９４
【非特許文献６】Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ、Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ Ｃ、Ｃｈｏｍｅｚ Ｐら Ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ａ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６４３−１６４７、１９９１
【非特許文献７】Ｇａｕｇｌｅｒ Ｂ、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｙｎｄｅ Ｂ、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ Ｐら Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ＭＡＧＥ−３ ｃｏｄｅｓ ｆｏｒ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｏｎ ａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７９：９２１−９３０、１９９４
【非特許文献８】Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ、Ｅｌｉｙａｈｕ Ｓ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ Ｋら Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＭＡＲＴ−１ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ ＨＬＡ−Ａ２−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８０：３４７−３５２、１９９４
【非特許文献９】Ｂｒｉｃｈａｒｄ Ｖ、Ｖａｎ Ｐｅｌ Ａ、Ｗｏｌｆｅｌ Ｔら Ｔｈｅ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｅｓ ｆｏｒ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ＨＬＡ−Ａ２ ｍｅｌａｎｏｍａｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７８：４８９−４９５、１９９３
【非特許文献１０】Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＦ、ｅｌ−Ｇａｍｉｌ Ｍ、Ｋａｗａｋａｍｉ Ｙ、Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｅ、Ｙａｎｎｅｌｌｉ ＪＲ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｂｙ ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４：３１２４−３１２６、１９９４
【非特許文献１１】Ｂａｋｋｅｒ ＡＢ、Ｓｃｈｒｅｕｒｓ ＭＷ、ｄｅ Ｂｏｅｒ ＡＪら Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ１００ ｉｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｍｅｌａｎｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７９：１００５−１００９、１９９４
【非特許文献１２】Ｗｏｌｆｅｌ Ｔ、Ｖａｎ Ｐｅｌ Ａ、Ｂｒｉｃｈａｒｄ Ｖら Ｔｗｏ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｎｏｎａｐｅｐｔｉｄｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｏｎ ＨＬＡ−Ａ２ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｎｏｌ ２４：７５９−７６４、１９９４
【非特許文献１３】Ｖｉｓｓｅｒｅｎ ＭＪＷ、Ｖａｎ Ｅｌｓａｓ Ａ、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｏｒｔ ＥＩＨら ＣＴＬ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ ｃａｎ ｂｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｄｏｎｏｒ ｂｌｏｏｄ ｔｏ ｌｙｓｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５４：３９９１−３９９８、１９９５
【非特許文献１４】Ｒｕｂｉｎ ＪＴ、Ｌｏｔｚｅ ＭＴ．Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｍ．Ｓ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ（編）、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｉｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ；ニューヨーク：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ中ｐｐ３７９−４１０、１９９３
【非特許文献１５】Ｙｅｅ，Ｃ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＪＡ、Ｂｙｒｄ，Ｄら Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．ＰＮＡＳ ９９：１６１６８−１６１７３、２００２
【非特許文献１６】Ｄｕｄｌｅｙ ＭＥ、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，ＪＲ、Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＦら Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｃｌｏｎａｌ ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：８５０−８５４、２００２
【非特許文献１７】Ｏｅｌｋｅ Ｍ、Ｍａｕｓ ＭＶ、Ｄｉｄｉａｎｏ，Ｄら Ｅｘ ｖｉｖｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＨＬＡ−Ｉｇ−ｃｏａｔｅｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ９：６１９−６２４、２００３
【非特許文献１８】Ｌｅｔｕｒｃｑ ＤＬ、Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＭ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＭＲ、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＰＡとＭｏｒｉａｒｔｙ ＡＭ．Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ：Ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ １７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ；Ａｂｓｔｒａｃｔ＃４０、２００２
【非特許文献１９】Ｊａｃｋｓｏｎ ＭＲ、Ｓｏｎｇ ＥＳ、Ｙａｎｇ Ｙら Ｅｍｐｔｙ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍｅｒｓ ｏｆ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８９：１２１１７−１２１２１、１９９２
【非特許文献２０】Ｃａｉ Ｚ、Ｂｒｕｎｍａｒｋ Ａ、Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ ＡＴら Ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｎａiｖｅ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １６５：２４９−２６５、１９９８
【発明の開示】
【００１２】
［発明の要約］
本発明の多様な全般的局面および好ましい態様は、本明細に付随される請求の範囲（本明細書に引用することにより組み込まれる）に反映されている。本発明の多様な局面の他の好ましい態様、特徴および利点は、図面とともに解釈される下の詳細な記述から明らかとなるであろう。
【００１３】
［発明の詳細な記述］
本発明の多様な局面を、特定のかつ好ましい態様の詳細な記述により下に具体的に説明する。簡潔さのため、本明細書で引用される全部の特許および他の刊行物の開示は引用することにより組み込まれる。別の方法で本明細書で定義されるか若しくは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される全部の技術的および科学的用語は、当該技術分野で一般に使用されると同一の意味を有する。
【００１４】
「包含すること」、「含んでなること」および「含有すること」という用語は、本明細書で、それらの公然の制限しない意味で使用する。
【００１５】
サイトカイン、ならびにクラドリビンおよびＤＡＢ−ＩＬ２から選択される最低１種のリンパ球枯渇剤とともに選択されたペプチドを負荷したｘＡＰＣを接触させることにより活性化したＣＴＬを投与することを含んでなる本発明の治療レジメンは、こうした処置の必要な被験体で癌を処置するのに使用しうる。好ましくは、癌は、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫、甲状腺癌、子宮癌、腎癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、肝癌、膵癌、前立腺癌、結腸癌、皮膚癌、胃癌および子宮頚癌から選択される。
【００１６】
従って、好ましい一態様において、本発明は、ナイーブなＣＤ８＋ Ｔ細胞を被験体から得ること；選択されたペプチド抗原を負荷した異種抗原提示細胞（ｘＡＰＣ）と該ナイーブなＣＤ８＋ Ｔ細胞を接触させて、それにより該選択されたペプチド抗原を発現する細胞を標的とする活性化ＣＴＬを生成すること；該活性化ＣＴＬを該被験体に戻し投与すること；クラドリビンおよびＤＡＢ−ＩＬ２から選択される最低１種のリンパ球枯渇剤を投与すること；ならびにＣＴＬ持続性を遂げる最低２種のサイトカインを投与することを含んでなる、転移性黒色腫を処置若しくは寛解させるための養子ＣＴＬ治療レジメンを提供する。該養子ＣＴＬ治療レジメンは、好ましくは、本発明により活性化されかつ被験体に投与される場合に癌関連抗原エピトープを有する腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏ破壊が可能である、ｅｘ ｖｉｖｏで活性化されている自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞を使用する。
【００１７】
本情況での「被験体」という用語は、癌の処置を必要とする哺乳動物患者を指す。例えば、被験体は、進行悪性転移性黒色腫のような黒色腫と診断されたヒト、例えば、ＨＬＡ−Ａ２陽性でありかつステージＩＩＩ／ＩＶの切除不能疾患を有すると診断された患者でありうる。
【００１８】
ＣＴＬ剤はｘＡＰＣから製造する。使用に適する例示的異種抗原提示細胞（ｘＡＰＣ）は、以下の成分、すなわち、外因性ＭＨＣ Ｉ分子；ナイーブなＴ細胞の活性化で補助するための１種若しくはそれ以上の外因性補助分子；ならびにそれらの表面に該外因性分子を発現することが可能な宿主細胞を包含しうる。好ましくは、外因性分子は、宿主細胞に導入された異種核酸によりコードされる。ｘＡＰＣは、好ましくは、該ｘＡＰＣのＴ細胞活性化能力を増強する外因性補助刺激物質および接着分子もまた発現する。好ましくは、宿主細胞は昆虫細胞、より好ましくはＳｃｈｎｅｉｄｅｒ ２（Ｓ２）細胞のようなショウジョウバエ細胞である。例示的ｘＡＰＣおよびそれらの製造方法は、例えば米国特許第６，２２５，０４２号および同第６，３５５，４７９号明細書に記述されている。
【００１９】
ｘＡＰＣは、当該技術分野で既知若しくは利用可能な多様な方法によりペプチド抗原を負荷しうる。空のＭＨＣクラスＩ分子に結合することが可能であるペプチドを選択する。選択されるペプチドは、好ましくは、養子ＣＴＬ療法で使用されるＴ細胞の標的としてはたらくことができる、細胞の表面上で発現されるタンパク質由来の抗原性若しくは免疫原性アミノ酸配列を含んでなるエピトープに対応する。選択されたペプチドを空のＭＨＣクラスＩ分子に負荷するために、こうした空のＭＨＣクラスＩ分子に結合する１種若しくはそれ以上の抗原性若しくは免疫原性ペプチド種を、結合が起こるのに適する条件下でｘＡＰＣと接触させうる。
【００２０】
１種若しくはそれ以上の抗原性若しくは免疫原性ペプチド種を選択しうる。１種以上の種を選択する場合、それらを同時に若しくは個別の場合にｘＡＰＣと接触させて、該ｘＡＰＣ上で産生される多抗原性若しくは多免疫原性ＭＨＣ−ペプチド複合体をもたらしうる。
【００２１】
空のＭＨＣ分子への選択されたペプチドの負荷は、好ましくは、生物学的結合条件に近似した条件（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで近似させうる）下で起こる。ペプチドの選択において、当業者は、熱力学、静電、エネルギーおよびエントロピーの考慮のような１種若しくはそれ以上の因子、ならびにＭＨＣ分子への有効な結合に必要とされる、選択されたペプチド内の特定のアミノ酸を考慮しうる。
【００２２】
好ましいペプチドは、例えば、チロシナーゼタンパク質、ｇｐ１００タンパク質およびＭＡＲＴ−１タンパク質から選択されるアミノ酸配列に対応するペプチドを包含する。他の好ましいペプチドは、ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号１）、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号２）、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号３）、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号４）、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（配列番号５）およびＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号６）を包含する。選択されうる付加的な例示的ペプチドは、例えば、以下のアミノ酸配列（各ペプチドが由来するタンパク質をカッコ内で示す）、すなわちＳＩＬＳＬＫＥＡＳＴ（Ｃ−レクチン；配列番号１）、ＫＭＡＳＲＳＭＲＬ（Ｃ−レクチン；配列番号２）、ＡＬＡＬＡＡＬＬＶＶ（Ｐｅｃ ６０；配列番号３）、ＡＬＬＶＶＤＲＥＶ（Ｐｅｃ６０；配列番号４）、ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（チロシナーゼ；配列番号５）、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（チロシナーゼ；配列番号６）、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（ｇｐ１００；配列番号７）、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（ｇｐ１００；配列番号８）、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＭＡＲＴ−１；配列番号９）、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（ＭＡＲＴ−１；配列番号１０）、ＣＬＴＳＴＶＱＬＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１１）、ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１２）、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１３）、ＩＩＳＡＶＶＧＩＬ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１４）、ＰＬＴＳＩＩＳＡＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１５）、ＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１６）、ＶＬＶＫＳＰＮＨＶ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１７）、ＥＬＶＳＥＦＳＲＭ（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；配列番号１８）、ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ（ＣＥＡ；配列番号１９）、ＧＰＬＴＰＬＰＶ（ＡＥＳ；配列番号２０）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（ＮＹ−ＥＳＯ−１；配列番号２１）、ＫＡＬＦＡＧＰＰＶ（ＣＡ−１２５；配列番号２２）、ＹＬＥＴＦＲＥＱＶ（ＣＡ−１２５；配列番号２３）、ＧＬＱＳＰＫＳＰＬ（ＣＡ−１２５；配列番号２４）、ＶＬＬＫＬＲＲＰＶ（ＣＡ−１２５；配列番号２５）、ＥＬＹＩＰＳＶＤＬ（ＣＡ−１２５；配列番号２６）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（ＮＹ−ＥＳＯ−１；配列番号２７）、ＩＬＡＫＦＬＨＷＬ（テロメラーゼ；配列番号２８）、ＳＴＡＰＰＶＨＮＶ（ＭＵＣ−１；配列番号２９）、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（ＭＡＧＥ−３；配列番号３０）、ＦＭＷＧＮＬＴＬＡ（ＣＡ−１２５；配列番号３１）、ＲＬＶＤＤＦＬＬＶ（テロメラーゼ；配列番号３２）、ＨＬＳＴＡＦＡＲＶ（Ｇ２５０；配列番号３３）、ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ（ＮＹ−ＥＳＯ−１；配列番号３４）、ＥＬＷＴＨＳＹＫＶ（ＦＢＰ；配列番号３５）、ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ（ＭＡＧＥ−３；配列番号３６）、ＹＩＦＡＴＣＬＧＬ（ＭＡＧＥ−３；配列番号３７）、ＨＬＹＩＦＡＴＣＬ（ＭＡＧＥ−３；配列番号３８）、ＭＬＭＡＱＥＡＬＡＦＬ（ＣＡＭＥＬ；配列番号３９）、ＳＴＬＥＫＩＮＫＴ（ＳＳＸ−４；配列番号４０）、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（ＳＳＸ−２；配列番号４１）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（ＮＹ−ＥＳＯ−１；配列番号４２）、ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（スルビビン；配列番号４３）、ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（スルビビン；配列番号４４）、ＳＬＬＥＫＲＥＫＴ（ＳＰ１７；配列番号４５）、ＴＬＧＥＤＤＰＷＬ（ＳＡＲＴ−１；配列番号４６）、ＫＬＧＬＫＰＬＥＶ（ＳＡＲＴ−１；配列番号４７）、ＹＬＷＴＳＡＫＮＴ（ＳＣＰ−１；配列番号４８）、ＳＴＡＰＰＡＨＧＶ（ＭＵＣ−１；配列番号４９）、ＧＭＧＳＥＥＬＲＬ（ＬＩＶＩＮ；配列番号５０）、ＳＬＧＳＰＶＬＧＬ（ＬＩＶＩＮ；配列番号５１）、ＹＬＦＦＹＲＫＳＶ（ｈＴＲＴ；配列番号５２）、ＣＱＱＥＥＴＦＬＬ（ＣＡ−１２５；配列番号５３）、ＴＬＡＫＦＳＰＹＬ（ＰＲＡＭＥ；配列番号５４）、ＮＬＴＨＶＬＹＰＶ（ＰＲＡＭＥ；配列番号５５）、ＳＴＦＫＮＷＰＦＬ（スルビビン；配列番号５６）、ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（ＰＲＡＭＥ；配列番号５７）、ＦＬＤＱＲＶＦＦＶ（ｇｐ１００；配列番号５８）、ＦＬＤＱＲＶＦＶＶ（ｇｐ１００；配列番号５９）、ＦＬＤＱＶＡＦＶＶ（ｇｐ１００；配列番号６０）、ＧＬＤＲＥＱＬＹＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号６１）、ＶＭＱＨＬＬＳＰＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号６２）、ＱＱＴＨＧＩＴＲＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号６３）、ＬＱＰＬＳＧＰＧＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号６４）、ＴＬＤＲＤＳＬＹＶ（ＭＵＣ−１６；配列番号６５）、ＱＬＹＬＥＬＳＱＬ（ＭＵＣ−１６；配列番号６６）、ＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（ＭＡＧＥ−１；配列番号６７）、ＫＶＡＤＬＶＧＦＬ（ＭＡＧＥ−１；配列番号６８）およびＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号７０）を包含する。
【００２３】
選択されたペプチドは、当該技術分野の多様な手段および方法を介して細胞に提示しうる。選択されたペプチドは、ペプチドの細胞内プールにそれらを進入させる様式で提示しうる。例えばペプチドは浸透圧負荷を介して提示しうる。好ましくはペプチドはｘＡＰＣ系培地に添加する。ペプチドは、例えば酵素分解のような細胞過程を介して後に分解される無傷のポリペプチド若しくはタンパク質の形態で培地に添加しうる。あるいは、無傷のポリペプチド若しくはタンパク質は、ｘＡＰＣ系培地への添加前に化学的消化（例えば臭化シアン）若しくはプロテアーゼ（例えばトリプシンおよびキモトリプシン）のようないくつかの他の手段を介して分解されうる。あるいは、タンパク質若しくはポリペプチド配列全体を適切なベクターにクローン化しかつ原核生物細胞に挿入することができ、それにより、細胞はかなりの量の抗原性ポリペプチドを生成し、それらをその後収集、精製かつペプチドに消化し、該ペプチドをその後ｘＡＰＣ系培地に添加する。
【００２４】
十分な量の各選択されたペプチドを、クラスＩ ＭＨＣ分子を結合させかつその後ヒトクラスＩ ＭＨＣ発現細胞の表面上で高密度のペプチドを提示させるために細胞培養物に添加しうる。
【００２５】
ｘＡＰＣは、非異種すなわち内因性抗原提示細胞のＡＰＣ機能に比較して高められたＡＰＣ機能についてアッセイしうる。高められたＡＰＣ機能は、例えば、ＣＤ６９細胞表面発現、分化の程度、細胞傷害性死滅能力の程度、特異的細胞溶解の程度およびサイトカイン産生の程度のようなＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の指標である１種若しくはそれ以上の細胞表面タンパク質発現の程度のようなＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化の多様なパラメータのいずれかを測定することにより、測定しうる。
【００２６】
タンパク質およびペプチドの精製は、免疫親和性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、タンパク質沈殿、緩衝液交換、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーのような当該技術分野で既知である多様な技術により達成しうる。抗原刺激したＣＴＬはペプチド−ＭＨＣ ｐＭＨＣ四量体染色により検出若しくは単離することができ、検出されるＣＴＬは、ｘＡＰＣにより提示される選択されたペプチドに特異的である。
【００２７】
末梢血白血球（ＰＢＬ）を被験体から得、そして好ましくは実質的に精製する。ＰＢＬの精製方法は、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を使用する方法が本目的上利用しうるを包含する。精製したＰＢＬをその後、適切な抗原性ペプチドと前インキュベートしたｘＡＰＣ細胞と混合する。好ましくは、ＰＢＬは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＤｙｎａｂｅａｄ系（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような当該技術分野にある磁性ビーズ精製系により精製する。ＰＢＬは、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）に基づく方法、若しくは他の適切な細胞分取装置および方法論を用いるような細胞分取手順を介してもまた精製しうる。多様な細胞特異的タンパク質のマーカーとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用することによるこうした細胞分取法若しくは赤血球の分取。
【００２８】
ナイーブなＴ細胞を適切なｘＡＰＣとともに培養物中でインキュベートし、そして、活性化かつＣＤ８＋細胞の集団についてさらに濃縮するのに十分な時間、選択されたペプチドを負荷する。例えば、米国特許第４，６９０，９１５号明細書は、リンパ球除去（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）を介する多数のリンパ球を得る方法を記述する。好ましくは、ＣＤ８＋細胞は抗原特異的様式で活性化する。抗原提示細胞に対する休止期すなわち前駆体ＣＤ８＋（エフェクター）細胞の比は個体間で変動することがあり、かつ、培養条件に対する個々のリンパ球のなじみ易さならびに癌の性質および重症度のような変数にさらに依存しうる。好ましくは、しかしながら、リンパ球：抗原提示細胞（例えばショウジョウバエ細胞）比は、好ましくは約３０：１ないし３００：１の範囲にある。例えば、一態様において、３×１０７ヒトＰＢＬおよび１×１０６生存ショウジョウバエ細胞を混合し、かつ、２０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地中で維持する。
【００２９】
エフェクター／抗原提示培養物は、活性化かつ治療上使用可能若しくは有効な数のＣＤ８＋細胞の集団について濃縮するのに必要であるくらい長い時間維持しうる。１ないし１０日培養後、例えば５日培養後に一般に観察される最大の特異的ＣＤ８＋活性化レベルで、好ましい時間は約３から７日までである。本発明の一態様において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化が細胞株のトランスフェクション後短期間内に検出されうる。一態様において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化することが可能なトランスフェクト細胞株での一過性発現が、トランスフェクション４８時間以内に検出可能である。従って、ヒトクラスＩ ＭＨＣ分子を発現する形質転換細胞の安定な若しくは一過性いずれの培養物も、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化において有効である。
【００３０】
活性化細胞傷害性Ｔリンパ球は、当該技術分野で既知若しくは利用可能な適する方法を使用して、ｘＡＰＣ（例えばショウジョウバエ細胞）から効果的に分離しうる。例えば、人工的ＡＰＣ、人工的ＡＰＣに負荷したペプチド、若しくはＣＴＬに特異的なモノクローナル抗体（またはそれらのセグメント）を、それらの適切な相補リガンドを結合するのに利用しうる。抗体標識した細胞を、その後、例えば免疫沈降およびイムノアッセイ法のような当該技術分野の多様な方法のいずれかにより、刺激体（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）−エフェクター細胞混合状態から抽出しうる。あるいは、分離段階を完全に省略することができ、そして不活性化ｘＡＰＣを活性化ＣＴＬとともに培養物中に残してもよい。
【００３１】
治療上有効な細胞傷害性量の活性化ＣＴＬは、記述されたｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの使用に適するように、例えば、これらのＣＴＬ細胞の究極の標的である細胞の量および型を鑑みて選択しうる。該量は患者の状態を鑑みてもまた選択することができ、そして実務者による全部の適切な因子の考慮を介して決定しうる。好ましくは、マウスで使用される約５×１０６〜５×１０７細胞に比較して、約１×１０６ないし約１×１０１２、より好ましくは約１×１０８ないし約１×１０１１、およびなおより好ましくは約１×１０９ないし約１×１０１０の活性化ＣＤ８＋細胞を、成体ヒトに利用する。
【００３２】
好ましくは、ＣＴＬである活性化ＣＤ８＋細胞は、処置されている個体へのＣＴＬ細胞の投与前に、ｘＡＰＣ培養物から上述されたとおり収集する。該細胞培養物系は好ましくは腫瘍原性でない。従って、ショウジョウバエ細胞および活性化ＣＤ８＋細胞の完全な分離が達成されない場合、少数のショウジョウバエ細胞の投与に伴う固有の危険は存在しないはずである。
【００３３】
ナイーブなＣＤ４＋ Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋ Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の双方は、好ましくは、ｘＡＰＣ培養物とのインキュベーション前に被験体から抽出しうる。被験体は、白血球を収集するために、多様な既知の若しくは利用可能な血液細胞分離処置（例えば白血球除去）のいずれかを受けることができる。
【００３４】
ナイーブなＴ細胞は、ナイーブなＴ細胞の特異的活性化方法を妨害、減弱、若しくはいずれかの方法で制限しうる他の処置若しくは治療、および本明細書に提供されるところの用途の開始前に、被験体から収集しうる。例えば、新形成若しくは腫瘍を伴う個体の処置において、ナイーブなＴ細胞のサンプルを化学療法若しくは放射線治療の開始前に得かつ培養物中で保つことができる。ペプチド負荷したｘＡＰＣでナイーブなＴ細胞を活性化した後、ナイーブなＴ細胞を増殖かつ活性化することができ、そして活性化ＣＴＬを該被験体に戻し導入しうる。あるいは、ナイーブなＴ細胞を活性化することができ、そして該活性化ＣＴＬを、化学療法若しくは照射のような他の任意の形態の処置の前、後若しくはそれらとともに、該ナイーブなＴ細胞を得た被験体に戻し導入しうる。
【００３５】
活性化ＣＴＬは被験体への送達および注入のための適切なベヒクルにもまた懸濁しうる。細胞成分の再導入技術は当該技術分野で既知であり、そして米国特許第４，８４４，８９３号および同第４，６９０，９１５号明細書に例示されるもののような手順を包含する。例えば、静脈内注入を介する活性化ＣＴＬ細胞の投与を使用しうる。複数の注入が必要とされることがあり、そしてこれらの注入は数週若しくはそれ以上の期間にわたり発生しうる。
【００３６】
本発明の処置レジメンにおいて、ＣＴＬ持続性を達成しかつそれにより被験体に投与されるＣＴＬの半減期、活性、効力および／若しくは選択性の特性を高めるためにサイトカインもまた投与される。こうした持続性は、ＣＴＬに対する直接的影響、若しくはＣＴＬの標的細胞上での抗原発現の上方制御を必要とする間接的影響から生じうる。好ましいサイトカインはＩＦＮ−α−２ｂおよびＩＬ−２である。
【００３７】
クラドリビン（２−ＣｄＡ、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（Ｒ））および／若しくはＤＡＢ ＩＬ−２（ＯＮＴＡＫ（Ｒ））リンパ球枯渇剤もまた発明の処置レジメンで投与される。これらの剤は非骨髄破壊的であり、そしてＣＴＬ療法を受領する被験体で一過性の免疫抑制を導き出す。
【００３８】
ＣＴＬ、サイトカインおよびリンパ球枯渇剤のそれぞれの投与のタイミングおよび持続期間は、慣例の実験、および下の実施例を包含する本明細書の手引きに基づき当業者により選択しうる。
【００３９】
本発明の多様な局面および特徴を具体的に説明するため、以下の実施例を提供する。
【実施例】
【００４０】
ＣＴＬのｅｘ ｖｉｖｏ調製
異種ＡＰＣ（ｘＡＰＣ）株は、公表された手順（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｍｏｒｐｈ．２７：３５３−３６５、１９７２）に従って、数百個の２０ないし２４時間齢のＯｒｅｇｏｎ−Ｒ（野生型）キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（Ｏｒｅｇｏｎ−Ｒ）胚（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９６３）から１９６９年に樹立されたＳｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２細胞（Ｓ２細胞）から生成する。Ｓ２細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている（ＣＲＬ１０９７４）。ｘＡＰＣが由来する細胞株を派生させるのに使用したＳ２細胞の元の供給物はこの供給源から得る。ｘＡＰＣを生成させるため、Ｓ２細胞をプラスミドベクターｐＲＭＨａ−３由来のベクターでトランスフェクトする（例えば米国特許第６，２２５，０４２号明細書を参照されたい）。クローンＡと呼称される１種のｘＡＰＣ株を、ＨＡＬ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１をコードするベクターでトランスフェクトする。クローンＢと呼称される第二のｘＡＰＣ株は、ＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３をコードするベクターでトランスフェクトする。クローンＣと呼称される第三のｘＡＰＣ細胞株は、ＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＣＤ７０をコードするベクターでトランスフェクトする。従って、クローンＡはＨＬＡ−Ａ２、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１を発現し、クローンＢはＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３を発現し、そしてクローンＣはＨＬＡ−Ａ２．１クラスＩ、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびＣＤ７０．Ｂ７．２およびＬＦＡ−３を発現する。
【００４１】
クローンＡおよびクローンＢ系統細胞の独立した連続培養物は、１０％ウシ胎児血清および５００μｇ／ｍｌジェネチシン（Ｇ４１８）を補充したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地中で維持し、そして、細胞密度をおよそ１×１０６細胞／ｍＬに調節するための各分割の間に新鮮培地を添加して週２回分割する。誘導のおよそ１日前（第−２ないし−４日；第０日を外因性分子の発現について細胞を試験しかつペプチドを負荷する日と定義する）に、３個のＴ７５フラスコに、１．５×１０７細胞／フラスコに同等なストック培養物中で維持した細胞懸濁液の容量を接種する。Ｇ４１８を含まない完全ショウジョウバエＳＦＭ培地を添加して容量を１５ｍｌ／フラスコまでもたらす。フラスコをその後およそ２７℃のチャンバー中でインキュベートする。およそ第−１ないし−３日に、細胞をその後、１．０ｍＭの最終濃度までの硫酸銅（ＣｕＳＯ４）の添加（ＣｕＳＯ４の２００ｍＭストックの２００倍希釈；１５ｍｌの細胞懸濁液を含有する各Ｔ７５フラスコにつき７５μｌのＣｕＳＯ４）により誘導し、そして２７℃のチャンバーに戻す。誘導時間はおよそ２４ないし７２時間持続する。
【００４２】
第０日に、誘導した細胞培養物を含有するフラスコを汚染の証拠について視覚的におよび顕微鏡で確認する。汚染されていないフラスコを合わせ、そして生存細胞を計数する。およそ６×１０６細胞の合わせた細胞培養物のサンプルを、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析を使用するフローサイトメトリーにより評価して、外因性分子の発現のレベルを測定する。細胞培養物（およそ１×１０７細胞／ｍＬ）をその後、ペプチド負荷前に試験して、外因性ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１（クローンＡ細胞について）若しくはＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３（クローンＢ細胞について）の発現を確認する。外因性分子の発現が一旦確認されれば、各細胞培養物を２個の滅菌５０ｍｌコニカルチューブに分割することにより各培養物を洗浄する。各チューブをその後ＨＹＱ ＳＦＸ昆虫培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で満たし、そして１，７００ｒｐｍ（６００×ｇ）でおよそ７分間遠心分離して細胞をペレットにする。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを含有するチューブを再度１，７００ｒｐｍ（６００×ｇ）でおよそ１分間遠心分離する。上清を先細ピペットで除去する。各分割細胞培養物からのペレットをその後再度合わせ、そして８ｍＬのＳＦＸ昆虫培地におよそ１×１０７細胞／ｍＬの細胞密度まで再懸濁する。およそ４０μＬの１．０ｍｇ／ｍＬのβ２ミクログロブリンストック溶液、および各ペプチドについて１．６７ｍｇ／ｍＬのストックペプチドコンボ溶液の５０倍希釈２４μＬを、各再懸濁培養物に添加する。従って、各細胞培養懸濁液は、およそ５μｇ／ｍＬの最終濃度のβ２ミクログロブリン、およびペプチドあたりおよそ０．１μｇ／ｍＬの最終濃度のｘＡＰＣに負荷されるべき各選択されたペプチドを含有する。細胞培養物を、β２ミクログロブリンおよびペプチドを含有する懸濁液中で、室温で３０分ごとに回転しながら最低４時間かつ８時間を超えずインキュベートする。ペプチドインキュベーション期間の後に、各細胞培養物のおよそ１ｍＬのアリコートを８本のポリプロピレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ ２００６）に個別に分配する。いかなる残余の細胞培養懸濁液も廃棄する。
【００４３】
抗ＣＤ８抗体での陽性選択により白血球除去サンプルから単離したＣＤ８＋細胞を、ヒトクラスＩならびに共刺激／接着分子ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１、ＣＤ７０、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１を発現するショウジョウバエ細胞により提示されるヒト黒色腫関連ペプチド（チロシナーゼ−６８９３６９−３７７、チロシナーゼ−７９２３６９−３７７、ＭＡＲＴ−１−８１９２７−３５、ｇｐ１００−８１７２０９−２１７、ｇｐ１００−８１８２８０−２８８およびｇｐ１００−８５３１５４−１６２）に対し刺激する。ＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下に自己単球（記述されるエピトープでパルスした）で２回再刺激する。エフェクター細胞の数をその後、γ線照射自己支持細胞およびＩＬ−２の存在下での抗ＣＤ３モノクローナル抗体での非特異的刺激により増大させる。細胞傷害性Ｔリンパ球活性を、ペプチド負荷したＴ２細胞および一団の黒色腫細胞に対し測定する一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激したＣＤ８＋ Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーにより評価する。
材料。
【００４４】
【表１】
【００４５】
試薬
ｒｈＩＬ−７。組換えヒトインターロイキン−７（ＩＬ−７）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生されかつ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して供給元（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）により精製されるリンホカインであるがしかし抗体でない。粉末として受領したＩＬ−７は、１％ヒト血清アルブミンを含有する無菌ＤＰＢＳで希釈する。バルク溶液をその後、０．２μｍフィルターを通して濾過し、滅菌バイアルに分注し（３０，０００Ｕ／ｍＬ、１０００×濃度）、そして使用前に−８０℃で保存する。
【００４６】
ｒｈＩＬ−２。組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）は組換えＤＮＡ技術により製造しかつＣｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより供給される（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｒ））。粉末として受領したＩＬ−２をＩＬ−２希釈剤（５０ｍＭ酢酸中０．５％ヒト血清アルブミン）で希釈し、０．２μｍフィルターを通して濾過し、滅菌バイアルに分注し（２０，０００Ｕ／ｍＬ、１０００×濃度）かつその後使用前に−８０℃で保存する。
【００４７】
チロシナーゼペプチドＹＭＮＧＴＭＳＱＶ。ヒトチロシナーゼのアミノ酸３６９−３７７に対応するチロシナーゼペプチド（ｔｙｒ ３６９−３７７）はＧＬＰ準拠の標準を使用し製造かつ精製する（Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。製造元（Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から受領したところのペプチド粉末を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のストックペプチド溶液を達成するようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。このストックペプチド溶液を、等部分で他のペプチドストック溶液（また１０ｍｇ／ｍｌの濃度の）と混合して、ｘＡＰＣの負荷における使用のための複合ペプチド溶液を生成する。該複合ペプチド溶液を、クラス１０，０００クリーンルーム中でクラスＩＩバイオセーフティーキャビネット中無菌条件下で滅菌バイアルに分注する。
【００４８】
チロシナーゼペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶ。上述されたｔｙｒ ３６９−３７７ペプチドの３位にアスパラギン残基の代わりにアスパラギン酸残基を含有する該ペプチドの脱アミド化形態は、ＧＬＰ準拠の標準を使用し製造かつ精製する（Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。この脱アミド化形態はｔｙｒ ３６９−３７７ｄと呼ばれる。製造元から受領したペプチド粉末を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のストックペプチド溶液を達成するようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。
【００４９】
ｇｐ１００ペプチドＩＴＤＱＶＰＦＳＶ。ヒトｇｐ−１００のアミノ酸２０９−２１７に対応するｇｐ１００ペプチド（ｇｐ１００２０９−２１７）は、ＧＬＰ準拠の標準を使用し製造かつ精製する（Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。該ペプチド粉末を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のストックペプチド溶液を達成するようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。
【００５０】
ｇｐ１００ペプチドＫＴＷＧＱＹＷＱＶ。ヒトｇｐ１００のアミノ酸１５４−１６２に対応するｇｐ１００ペプチド（ｇｐ１００１５４−１６２）は、ＧＬＰ準拠の標準を使用し製造かつ精製する。Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから受領したところのペプチド粉末を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のストックペプチド溶液を達成するようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。
【００５１】
ｇｐ１００ペプチドＹＬＥＰＧＶＴＡ。ヒトｇｐ１００のアミノ酸２８０−２８８に対応するｇｐ１００ペプチド（ｇｐ１００２８０−２８８）は、ＧＬＰ準拠の標準を使用してＳｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造かつ精製する。該ペプチド粉末を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のストックペプチド溶液を達成するようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。
【００５２】
ＭＡＲＴ−１ペプチドＡＡＧＩＧＩＬＴＶ。ヒトＭＡＲＴ−１のアミノ酸２７−３５に対応するＭＡＲＴ−１ペプチド（ＭＡＲＴ−１２７−３５）は、ＧＬＰ準拠を使用して製造かつ精製する（Ｓｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。該ペプチド粉末は、１０ｍｇ／ｍＬの濃度のストックペプチド溶液を達成するようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。
【００５３】
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（Ｒ）Ｍ−４５０。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（Ｒ）Ｍ−４５０（ＳＡＭ）ＩｇＧは、一次マウスＩｇＧを結合するポリクローナルヒツジ抗マウスＩｇＧで被覆した無菌常磁性ビーズである。Ｂａｘｔｅｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．から入手可能なＤＹＮＡＢＥＡＤＳは、Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ磁性細胞選別器を使用するＴ細胞単離での使用前に４℃で保存する。
【００５４】
ヒト血清アルブミン。米国薬局方２５％ＨＳＡ（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；各ロットの血漿供給源はＨＩＶ−１ ＨＩＶ−２、ＨＣＶおよびＨＢＶについて陰性であることを試験した）は、以下のＴ細胞調製および活性化段階の段階、すなわちＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ８− Ｔ細胞の精製；接着細胞のペプチド負荷；ならびに活性化Ｔ細胞の最終処方の間の緩衝タンパク質の供給源としての使用前にＲＴで保存する。
【００５５】
抗ＣＤ８抗体。抗ＣＤ８モノクローナル抗体（３７Ｂ１Ａ）は、Ｔ細胞のＣＤ８抗原に向けられたマウスモノクローナル抗体であり、Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ磁性細胞選別器装置でＣＤ８＋ Ｔ細胞を選択するのに使用する。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の単離若しくは活性化過程での使用のため、濃縮溶液を無菌ＤＰＢＳで希釈する。該バルク溶液を０．２μｍフィルターを通して濾過し、そしてその後、クラス１０，０００クリーンルーム中でクラスＩＩバイオセーフティーキャビネット中無菌条件下で単回使用バイアルに分注する。アリコート（１０．０ｍｇ／ｍＬ）は使用前に−８０℃で保存する。
【００５６】
ＣＤ８ α鎖ペプチド−ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ。ＣＤ８ α Ｌ鎖ペプチド（ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ）はＧＬＰ準拠の標準のもとで精製かつ製造する。ＣＤ８ α鎖ペプチドは、ＣＤ８（３７Ｂ１Ａ）抗体およびＩｓｏｌｅｘ ３００ｉ磁性細胞選別器を使用して捕捉されるＣＤ８＋ Ｔ細胞を遊離させるためＣＤ８＋ Ｔ細胞単離過程で使用する。ペプチドの各ロットは、製薬学的等級標準に合致するようにＳｙｎｐｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造し、そしてペプチドの配列、純度、分子量および外観について試験する。粉末として受領したＣＤ８ α鎖ペプチドは、１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液を創製するようにさらに処理する。このストック溶液をＤＰＢＳで希釈し、０．２μｍフィルターを通して濾過し、滅菌バイアルに分注し、そして使用前に−７２℃ないし−８８℃で保存する。ペプチド試薬のバイアル分注は、クラス１０，０００クリーンルーム中でクラスＩＩバイオセーフティーキャビネット中無菌条件下で実施する。
【００５７】
ヒトβ２Ｍミクログロブリン。組換えＤＮＡ技術により製造したヒトβ−２ミクログロブリン（β２Ｍ）の濃縮物を、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度を達成するように無菌ＤＰＢＳで希釈する。該バルク溶液をその後０．２μｍフィルターを通して濾過し、滅菌バイアルに分注し、そして、ｘＡＰＣの製造およびペプチド負荷ならびに接着細胞のペプチド負荷の間の使用前に−８０℃で保存する。
【００５８】
クエン酸ナトリウム溶液。米国薬局方の無菌の非発熱性抗凝固剤、クエン酸ナトリウム溶液（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ）は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ８− Ｔ細胞の選択のためにＩｓｏｌｅｘ ３００ｉ磁性細胞選別器を運転するための緩衝剤添加物としての使用前に室温（ＲＴ）で保存する。
【００５９】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ培地。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒショウジョウバエ培地は、ショウジョウバエ細胞を培養するのに使用する培地である。培地の各ロットは、オスモル濃度、ｐＨ、無菌性、およびショウジョウバエ細胞の増殖を持続する能力について、供給元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により試験する。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒショウジョウバエ培地（１×濃度）は使用前に２℃ないし６℃で保存する。
【００６０】
ウシ胎児血清。宿主細胞若しくはｘＡＰＣ細胞の増殖のためのタンパク質供給源として使用するウシ胎児血清（ＦＢＳ）は−８０℃で保存する。Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能なＦＢＳは、米国起源の動物からのウシ胎児血液から加工されている。血液が由来する母動物は、感染性および接触伝染性疾患ならびに有害な寄生虫がない。
【００６１】
ＨＹＱ ＳＦＸ昆虫培地。ＨｙｃｌｏｎｅのＳＦＸ昆虫培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、ｘＡＰＣのペプチド負荷の間に使用する無血清培地（１×濃度）であり、そして使用前に２℃ないし６℃で保存する。この培地はウシ起源の生成物を含有しない。
【００６２】
硫酸銅。硫酸銅（ＩＩ）五水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ヒトＨＬＡ、共刺激および接着分子を発現させるための改変宿主細胞の誘導に使用する。ストック溶液は、２００ｍＭの濃度を達成するようにエンドトキシンを含まない滅菌水に結晶ＣｕＳＯ４を溶解すること、およびクラスＩＩバイオセーフティーキャビネット中で０．２μｍフィルターを通して滅菌容器に該溶液を無菌的に濾過することにより、処方する。
【００６３】
ＲＰＭＩ。血清および抗生物質を含まないＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ若しくはＧｉｂｃｏから入手可能）（１×濃度）はＴ細胞を増殖させるのに使用する。ＲＰＭＩ培地は使用前に２ないし６℃で保存する。
【００６４】
ダルベッコリン酸緩衝生理的食塩水（ＤＰＢＳ）。無菌の非発熱性ダルベッコリン酸緩衝生理的食塩水（ＤＰＢＳ）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ若しくはＧｉｂｃｏから入手可能、１×濃度）は使用前にＲＴで保存する。ＤＰＢＳは以下の処置、すなわち、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ８− Ｔ細胞の選択の間にＩｓｏｌｅｘ ３００ｉ磁性細胞選別器装置を運転すること；再刺激段階の間に非接着細胞を洗浄すること、および非特異的増殖の間に未結合のＯＫＴ３モノクローナル抗体を洗浄すること；ならびにヒトβ２ミクログロブリン、ＩＬ−７、ＣＤ８ペプチドおよびＯＫＴ３を希釈することに使用する。
【００６５】
Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地（Ｌ−グルタミンを含まない；１×濃度）は、Ｔ細胞活性化過程のペプチド負荷の間の使用前に２℃ないし６℃で保存する。
【００６６】
ＯＫＴ（Ｒ）３抗体。臨床使用に承認された無菌溶液としてアンプル中で供給される、Ｔ細胞のＣＤ３抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ（Ｒ）３（１．０ｍｇ／ｍＬ）（Ｏｒｔｈｏから入手可能）は、無菌条件下で単回使用バイアルに分注し、そしてＴ細胞の活性化での使用前に−８０℃で凍結保存する。
【００６７】
ジェネチシン（Ｇ４１８）。ジェネチシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、異種核酸によりコードされる外因性分子の発現を維持するためにショウジョウバエ細胞の培養物中で使用する選択的抗生物質である。ジェネチシンは無菌ストック溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）として供給され、そして使用前に２ないし６℃で保存する。
【００６８】
塩化カルシウム。塩化カルシウム水和物は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の単離若しくは活性化過程で使用される自己血清を生成するためリンパ球除去生成物から得られる自己血漿の凝固のため使用する。塩化カルシウム水和物は結晶性粉末として受領し、ストック溶液（１Ｍ）に調合し、そして使用前に２℃ないし６℃で保存する。該ストック溶液は、エンドトキシンを含まない滅菌水に塩化カルシウムを溶解すること、およびクラスＩＩバイオセーフティーキャビネット中で０．２μｍフィルターを通して滅菌容器に無菌的に濾過することにより、処方する。
【００６９】
酢酸。ＩＬ−２のストック溶液の調製に使用する酢酸（１７．４Ｍ）はＳｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得、そして使用前にＲＴで保存する。
【００７０】
ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（Ｒ）Ｐｌｕｓ。Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ細胞選別器装置を用いるＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ８− Ｔ細胞の単離後に、非ＣＤ８＋画分からの単核細胞を、死細胞、好中球および赤血球を除去するのに使用するＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手可能ないかなる動物成分も含まないＦｉｃｏｌｌ勾配試薬、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（Ｒ）Ｐｌｕｓ（１×濃度）を使用して、さらに分画する。該試薬は使用前にＲＴで保存する。
【００７１】
ＰＥＮＴＡＳＰＡＮ（Ｒ）。ＰＥＮＴＡＳＰＡＮ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ）は、臨床使用のための０．９％塩化ナトリウム中１０％ペンタスターチ（ｐｅｎｔａｓｔａｒｃｈ）の無菌溶液であり（ＮＤＣ ０２６４−１９７２−１０）、そして使用前にＲＴで保存する。それは単離したＣＤ８− Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の低温保存における低温保存剤として使用する（１×濃度）。
【００７２】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）。ＤＭＳＯは、単離したＣＤ８− Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の低温保存における低温保存剤として使用する。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なＤＭＳＯ溶液（１×濃度）は使用前にＲＴで保存する。
【００７３】
Ｌ−グルタミン。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な２００ｍＭ（１００×濃度）Ｌ−グルタミン（米国薬局方）は、ＲＰＭＩ培地補充物質として使用し、そして使用前に−８０℃で保存する。
【００７４】
ＭＥＭピルビン酸ナトリウム溶液。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＭＥＭピルビン酸ナトリウム溶液（１００ｍＭ、１００×濃度）はＲＰＭＩ培地を補充するために使用し、そして使用前に２ないし６℃で保存する。
【００７５】
非必須アミノ酸。ＲＰＭＩ培地を補充するために使用する、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの非必須アミノ酸（１０ｍＭ；１００×濃度）は、使用前に２ないし６℃で保存する。
【００７６】
ＨＥＰＥＳ溶液。ＲＰＭＩ培地を補充するために使用する１Ｍ（２００×濃度）ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、使用前に２℃ないし６℃で保存する。
【００７７】
Ｘ−ｖｉｖｏ １０細胞培地。ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒにより供給されるＸ−ｖｉｖｏ １０細胞培地は、使用前に２℃ないし６℃で保存する。血清、フェノールレッドおよび抗生物質を含まないこの培地（１×濃度）は、ペプチド負荷したｘＡＰＣへの曝露により活性化されるＴ細胞の非特異的増殖期の間に使用する。
【００７８】
塩化ナトリウム注射剤。Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な米国薬局方０．９％塩化ナトリウム溶液は、Ｔ細胞の収集の間の細胞洗浄処置に使用する。無菌、非発熱性かつ動物成分を含まない該溶液は使用前にＲＴで保存する。
【００７９】
デキストロース＋塩化ナトリウム溶液。米国薬局方の５％デキストロースおよび０．９％塩化ナトリウムの注入可能な溶液（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、動物成分を含まない無菌の非発熱性溶液として得られる。活性化Ｔ細胞の保存緩衝液として使用する該溶液は、使用前にＲＴで保存する。
【００８０】
乳糖リンゲル液。注射用水中の塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよび乳酸ナトリウムの無菌の低エンドトキシン溶液（動物成分を含まない）である米国薬局方０．９％乳酸リンゲル液（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、Ｔ細胞の収集および懸濁における使用前にＲＴで保存する。
【００８１】
蒸留水。メンブレン濾過およびエンドトキシンスクリーニングにより得られる細胞培養等級蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、硫酸銅、塩化カルシウムおよびインターロイキン−２（ＩＬ−２）のストック溶液の調製のための溶媒として使用し、そして使用前にＲＴで保存する。
【００８２】
他の材料。
リンパ球除去生成物は、黒色腫と診断されたヒト被験体から収集し、そして、自己の患者特異的細胞生成物の生成のための使用前にＲＴで保存する。
【００８３】
自己ヒト血清は単離したＴ細胞の培養のためのタンパク質供給源として使用する。自己ヒト血漿は、フィブリン凝固を達成するために塩化カルシウムを添加すること、およびその後液体血清層を収集することにより、リンパ球除去生成物から調製する。収集した液体血清層は、短期保存のために４℃、および長期保存のために−８０℃で保存する。
【００８４】
連続的ショウジョウバエｘＡＰＣ培養物を創製するためのシードストックとして使用する異種ショウジョウバエクローンＢ由来のショウジョウバエｘＡＰＣ株は、下述されるとおり得る。
【００８５】
手順。
ヒトＣＤ８＋細胞の単離。
ＣＤ８＋細胞は、抗ＣＤ８モノクローナル抗体（抗体１）での陽性選択、次いで磁性ビーズ（ＳＡＭビーズ）上に被覆したヒツジ抗マウスＩｇＧ（抗体２）を使用するＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ（Ｄｙｎａｌ）単離手順により、Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ装置（Ｂａｘｔｅｒ）を使用して、白血球除去サンプルから単離する。抗ヒトＣＤ８マウスモノクローナル抗体を、１％ＨＳＡ（Ｂａｘｔｅｒ−Ｈｙｌａｎｄ）および０．２％クエン酸ナトリウムを補充したダルベッコＰＢＳに再懸濁した洗浄した細胞に添加する。Ｄｙｎａｌの磁性ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）を、ＰＢＭＣの数に依存して１：１ないし１：２のビーズ対細胞比で添加する。単離したＣＤ８＋細胞を磁性分離により除去する。残存する非ＣＤ８画分を収集し、そして再刺激および非特異的増殖段階の間での将来の使用のため低温保存する。ＣＤ８細胞−抗体１−抗体２−ビーズ複合体の解離を、それに対し抗体１を生成させたペプチド、ＣＤ８ペプチド５９−７０（ＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧ）の存在下３７℃で４５分間のインキュベーションにより達成する。遊離されたビーズを磁性で除去し、そしてＣＤ８＋細胞を計数しかつて純度を評価するためフローサイトメトリーにより分析する。ＣＤ８＋細胞の回収は典型的に８０％以上である。初期細胞洗浄段階の時点で自己血漿を収集することにより熱不活性化血清を調製する。ＣａＣｌ２を使用してフィブリンを凝固させかつフィブリン塊を除去する。血清を熱不活性化し、濾過し、分注しかつ−８０℃で凍結する。非ＣＤ８＋細胞を陽性選択手順から保持し、そしてＦｉｃｏｌｌ勾配を使用して精製する。これらの細胞をＤＭＳＯ、Ｐｅｎｔａｓｐａｎおよび熱不活性化自己血清中で低温保存しかつ液体窒素（ＬＮ２）中で保存する。これらの細胞を再刺激の時点で接着細胞の供給源として使用し、そして抗原提示細胞としての使用前にペプチドでパルスする。
【００８６】
精製ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化
一次刺激。トランスフェクトしたショウジョウバエＳ２細胞を、１０％ウシ胎児血清および硫酸銅を補充したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地中（１０６細胞／ｍＬ）２７℃で２４ないし７２時間インキュベートする。Ｓ２細胞（クローン１１２０−３−９）を収集し、洗浄し、そしてヒトｇｐ１００１５４−１６２、ｇｐ１００２０９−２１７、ｇｐ１００２８０−２８８、ＭＡＲＴ−１２７−３５、チロシナーゼ−Ｎ３６９−３７７およびチロシナーゼ−Ｄ３６９−３７７ペプチドのそれぞれ０．１μｇ／ｍＬ、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製したヒトβ２ミクログロブリン組換えタンパク質５μｇ／ｍＬを含有するＨＹＱ ＳＦＸ昆虫培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に再懸濁する。室温（２３〜２５℃）で４時間のインキュベーション後に、５〜１０％自己血清を補充したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、Ｓ２細胞をＣＤ８＋細胞と１：１０（ショウジョウバエ細胞：Ｔ細胞）の比で混合する。細胞混合物を３７℃でインキュベートし、その時間の間にショウジョウバエ細胞が死滅する（４８時間までに）。第４日に、黒色腫特異的ＣＴＬ集団を選択的に増殖させるためＩＬ−２（２０Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍＬ）を添加する。
【００８７】
再刺激。リンパ球除去の時点で得かつ将来の使用のため凍結した自己ＣＤ８枯渇ＰＢＭＣを融解し、洗浄し、そして１０％自己血清、５μｇ／ｍＬ組換えヒトβ２ミクログロブリン、ならびに５μｇ／ｍＬのｇｐ１００１５４−１６２、ｇｐ１００２０９−２１７、ｇｐ１００２８０−２８８、ＭＡＲＴ−１２７−３５、チロシナーゼ−Ｎ３６９−３７７およびチロシナーゼ−Ｄ３６９−３７７ペプチドを含有するＲＰＭＩ培地に１０７細胞／ｍＬで再懸濁する。γ線照射（５，０００ｒａｄ）後に、再刺激に使用したフラスコ中で細胞を３７℃で２時間インキュベートする。ダルベッコＰＢＳで洗浄することにより非接着細胞を除去する。接着性単球にペプチドエピトープを負荷し、そして１％ＨＳＡ中５μｇ／ｍＬヒトβ２ミクログロブリンおよび５μｇ／ｍＬの各ペプチドを含有するＬｅｉｂｏｖｉｔｚ培地中で９０分間インキュベートする。上清を除去し、そして、ショウジョウバエ活性化ＣＤ８＋細胞懸濁液（１０％自己血清を含むＲＰＭＩ培地中２．５×１０６細胞／ｍＬ）を１接着性単球に対し約１０のＣＤ８＋細胞の比で添加する。３７℃で３ないし４日培養後に、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−７（３０Ｕ／ｍＬ）を、黒色腫特異的ＣＴＬ集団を選択的に増殖させるために培地交換を用いて添加する。
【００８８】
非特異的増殖。２回の再刺激を受けたＣＤ８＋エフェクター細胞を、ＯＫＴ３抗体で刺激した後に支持細胞（照射した自己のＣＤ８＋で選択していない細胞）と一緒に細胞培養袋中で増殖させる。凍結した、ＣＤ８＋で選択していない細胞を融解し、洗浄し、そしてその後γ線照射する（３，５００ｒａｄ）。４：１（支持：エフェクター）の比を、ＯＫＴ３抗体で被覆したＴ−２２５フラスコに入れる。ＯＫＴ３刺激は、２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を補充した１０％自己血清を含有する完全ＲＰＭＩ培地中で実施する。２日後に、刺激したＴ細胞を新鮮培地（Ｘ−ｖｉｖｏ １０培地）で希釈し、そして増殖のため細胞培養袋に移す。新鮮培地およびＩＬ−２をおよそ２ないし３日ごとに補充して、迅速に増殖するＴ細胞を養う。
【００８９】
ＣＴＬの調製および放出
細胞の収集および最終生成物の処方。最終細胞生成物の収集は、培地を除去しかつ細胞を濃縮するための遠心分離により実施する。遠心分離後、１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する生理的食塩水で細胞を洗浄し、７０μｍフィルターを通して濾過し、そしてその後注入媒体で希釈する。注入のための細胞生成物は、３００ｍＬの米国薬局方乳糖リンゲル液（７６％ ｖ／ｖ）、０．９％塩化ナトリウム中５％デキストロース（４％ ｖ／ｖ）および２５％ＨＳＡ（２０％ ｖ／ｖ）中に自己ＣＴＬを含有する。最終生成物細胞を、温度データ自記計測器を伴う冷却断熱輸送容器中の１０００ｍＬ輸送袋に包装する。
【００９０】
生成物試験。ＣＴＬ生成物の放出前に実施する試験を下に列挙する。個々のペプチドに向けられた比活性は、刺激に使用した各個別のペプチドを負荷したクロム標識Ｔ２細胞に対するエフェクター細胞の細胞傷害活性を測定することにより評価する。細胞傷害活性は、正常線維芽細胞（Ｍａｌｍｅ ３）、若しくはチロシナーゼ、ｇｐ １００およびＭＡＲＴ−１について陰性の黒色腫細胞株（０１−ＫＮ）を対照として使用して、クロム標識黒色腫標的（Ｍａｌｍｅ ３Ｍ、Ｍ１４）に対してもまた測定する。
【００９１】
表現型：細胞収集物の一部分を使用して、発送前にＣＤ８生成物の表現型を試験する。最終生成物の規格はＣＤ３、ＣＤ８およびＴＣＲ発現である。記憶、活性化などと一致するマーカーの付加的な表現型評価を測定かつ記録する。
【００９２】
同一性：サンプルのＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＣおよびＨＬＡ−ＤＲ状態を、初期の白血球除去の受領の時点で調製したＰＢＭＣサンプル、および収集した細胞生成物から採取した、培養の終了時に収集したＣＤ８＋ Ｔ細胞から単離したＤＮＡ調製物の分析により決定する。ＤＮＡサンプルのＰＣＲ分析は、Ｇｅｎｏｖｉｓｉｏｎにより提供されるＨＬＡ特異的プライマーオリゴを用いて実施する。最終生成物の規格は第０日サンプルとの同一性である。
【００９３】
細胞数：注入のための所望の細胞用量は１０１０ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。最終生成物の注入限界は１０１０細胞である。生成される細胞の総数は患者依存性である。細胞用量は、該細胞を同一のｅｘ ｖｉｖｏプロトコルで生成した以前の試験で平均９×１０９であった。最終細胞計数は生存細胞の数を決定することにより行う。
【００９４】
生存率：最終細胞用量の生存率は＞７０％である。生存細胞の数は、トリパンブルー色素を排除する細胞を顕微鏡で計数することにより確立する。
【００９５】
マイコプラスマ試験：マイコプラスマについての細胞の試験は、細胞を患者に投与して陰性のマイコプラスマ検出を確認する前に実施する。ＥＬＩＳＡアッセイもまた包含するＲｏｃｈｅのＰＣＲキットを使用する。加えて、Ｔ細胞培養物のサンプルを、２８日培養手順を満たすために最初のサイトカイン供給時（第６日）に収集しかつＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅに送る。培養の結果はＴ細胞注入後に受領する。
【００９６】
エンドトキシン試験：最終細胞生成物のエンドトキシン試験は、カブトガニ変形細胞ライセート（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）アッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、メリーランド州ウォーカーズビル）を使用して実施する。エンドトキシン濃度限界は患者に注入される１ｋｇあたり５ＥＵを超えない。最終細胞生成物の規格は＜１ＥＵ／ｍＬである。
【００９７】
工程内生成物無菌試験：無菌性の工程内試験はＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ装置を使用して実施する。サンプルを培地交換の時間に採取する。最終用量からのサンプルもまたＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ装置により試験し、そして最終生成物の規格は増殖の非存在である。
【００９８】
ショウジョウバエＤＮＡおよび昆虫ウイルスＲＮＡ検出：ＤＮＡを最終ＣＤ８＋ Ｔ細胞生成物から単離し、そして、組換えショウジョウバエＡＰＣを調製するのに使用した昆虫ベクターに特異的なプライマーを使用するショウジョウバエＤＮＡ ＰＣＲアッセイの鋳型として使用する。このサンプルを、陰性対照として作用するナイーブなＣＤ８＋サンプルと比較し、また、ショウジョウバエ細胞ＤＮＡを陽性対照として使用する。全ＲＮＡもまた同一のＣＤ８＋ Ｔ細胞サンプルから単離し、そして、３種の異なる既知の昆虫ウイルスＲＮＡウイルスのｃＤＮＡ１μｇあたり２０コピーを検出し得る定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施する。双方のアッセイについての生成物の規格は、昆虫ゲノムおよびウイルス核酸の陰性検出である。
【００９９】
溶解活性：溶解活性は、抗ペプチド活性を測定するためにペプチドを負荷したＴ２細胞標的、ならびに、黒色腫特異的死滅を評価するために樹立若しくは自己黒色腫細胞ＨＬＡ−Ａ２標的ならびにドナーをマッチさせた腫瘍および非腫瘍株（Ｍａｌｍｅ ３およびＭａｌｍｅ ３Ｍ）の双方でのクロム放出アッセイにより、最終的なＣＤ８＋ Ｔ細胞について評価する。生成物の規格は標的細胞の特異的死滅である。
【０１００】
また、モニターすることを容易にするため、上述された放出試験に加えて以下の試験もまた実施しうる。
【０１０１】
四量体染色：ナイーブな白血球除去由来サンプルのＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＣＴＬをｅｘ ｖｉｖｏで生成するのに使用したペプチドエピトープに対する特異性をもつＴ細胞を数え上げるように設計した四量体分子を用いて、抗原特異的Ｔ細胞の存在について評価する。これは、処置後の抗原特異的Ｔ細胞のモニタリングを可能にする。
【０１０２】
末梢血サンプル中の黒色腫腫瘍細胞：感受性の定量的リアルタイムＰＣＲアッセイは、薬物処置前、間および後の患者血液サンプル中の循環黒色腫細胞のモニタリングを見込む。全部のステージＩＩＩ／ＩＶ黒色腫患者が循環腫瘍細胞を示すわけではない一方、これらの細胞の検出を、治療に対する応答の代理マーカーとして使用し得る。
【０１０３】
上述されたとおり調製したＣＴＬ生成物は、以下の実施例で記述される好ましい態様により具体的に説明されるところの本発明の併用療法処置レジメンで使用しうる。
２−ＣｄＡ若しくはＤＡＢ ＩＬ−２の投与を伴うおよび伴わない、黒色腫関連ペプチド（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼ）を負荷したショウジョウバエ細胞でｅｘ ｖｉｖｏで刺激した自己ＣＤ８＋リンパ球ならびにＩＦＮα−２ｂおよびＩＬ−２を使用する転移性黒色腫を伴う患者の処置。
【０１０４】
これらの実施例は、クラドリビンおよびＤＡＢ ＩＬ２から選択される１種のリンパ球枯渇剤、ならびにサイトカインＩＬ−２およびＩＦＮ−α−２ｂと組合せの黒色腫関連抗原由来のペプチドエピトープに特異的である自己細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の投与を含んでなる処置、ならびに対照処置を具体的に説明する。ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼ由来の抗原性ペプチドを負荷したショウジョウバエｘＡＰＣを接触させることによりＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼを発現する黒色腫細胞をそれらが特異的に標的とするような、活性化した自己ＣＴＬを含んでなる細胞治療剤を、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼを発現する黒色腫細胞の患者の免疫ターゲッティングを高めかつ維持するよう設計する。免疫調節物質ＩＦＮ−α−２ｂおよびＩＬ−２の添加はＣＴＬの応答を増強するために包含する。非骨髄破壊的しかしリンパ球を枯渇させる調製的レジメン（クラドリビン）若しくは特異的Ｔ細胞サブセット枯渇デニロイキンジフリトクス（ＤＡＢ ＩＬ−２）を、ＣＴＬの生着を高めるため、ＣＴＬ注入前に投与する。該処置は、黒色腫特異的ＣＴＬの持続により腫瘍退縮および臨床的有益性を生じさせるように設計されている。
【０１０５】
より具体的には、ＨＬＡ−Ａ２陽性である進行悪性黒色腫を伴う臨床患者に、クラドリビン（０．１２ｍｇ／ｋｇ／日×５日）若しくはＤＡＢ ＩＬ−２（１８μｇ／ｋｇの単回注入）いずれかよりなる非骨髄破壊的しかしリンパ球を枯渇させる調製的レジメンを投与する。加えて、インターフェロン−α−２ｂ（ＩＦＮ−α−２ｂ；１０ＭＩＵ／ｍ２）の付随するレジメンを、ＣＴＬ注入前に皮下注入により連続５日間連日投与する。その後、患者は、ＣＴＬ表現型を表示するｅｘ ｖｉｖｏで生成したショウジョウバエｘＡＰＣで刺激した自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞の単回投与を受領する。細胞注入に直ちに２８日間の低用量（例えば３ＭＩＵ）ＩＬ−２の皮下連日投与、次いで腫瘍評価が続く。低用量（例えば３ＭＩＵ）ＩＬ−２の皮下連日投与を、疾患進行の証拠を伴わない患者で継続する。
【０１０６】
ＣＴＬは、精製したナイーブなＣＤ８＋ Ｔ細胞をヒトＭＨＣクラスＩ拘束の情況で６種の異なる黒色腫関連Ｔ細胞ペプチドエピトープを提示するショウジョウバエｘＡＰＣで刺激して、培養およそ３４日後にＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００およびチロシナーゼに対する複数の特異性を表すＣＴＬをもたらす方法により、生成する。
【０１０７】
患者を試験に適格にするためのスクリーニングで血液を収集し、また、調製的白血球除去手順が第０日若しくは第１日に起こる。患者は、細胞治療剤を製造するために必要とされる十分な白血球を得るために、標準的な、血液容量の２．０〜３．０倍の白血球除去を受ける。示される時点で、分析のための末梢血液細胞を得るため付加的な白血球除去処置（最初のＣＤ８サンプルを得るのに使用した量の１／３の以下）を実施する。これらのサンプルを使用して、抗原特異的Ｔ細胞および可能な循環黒色腫腫瘍細胞の存在をモニターする。血漿および血液細胞は、処置前および後サンプルの保管に対する異種移植要件に合致するようにもまた収集する。白血球除去生成物は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離する施設に輸送し、刺激し、そしておよそ３４日間培養する。
【０１０８】
測定可能病変の評価はＣＴＬ注入後４および８週双方に実施する。該試験の一目的は、Ｔ細胞注入前のかつ確立された免疫増強サイトカインレジメンとともにの完全な非骨髄破壊的なリンパ球を枯渇する（クラドリビン）若しくは選択的Ｔ細胞サブセット枯渇（ＤＡＢ ＩＬ−２）の投与が、付随する客観的腫瘍退縮を伴う抗原特異的Ｔ細胞持続をもたらすことができるかどうかを決定することである。
【０１０９】
細胞傷害性リンパ球の調製
抗ＣＤ８抗体での陽性選択により白血球除去サンプルから単離したＣＤ８＋細胞を、ヒトクラスＩおよび共刺激分子（ＨＬＡ−Ａ２．１、β２ミクログロブリン、Ｂ７．１、ＣＤ７０、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３）を発現するショウジョウバエｘＡＰＣにより提示されるヒト黒色腫関連抗原ペプチド（チロシナーゼ３６９−３７７（ｎａｔｉｖｅ）、チロシナーゼ３６９−３７７（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄ３７１）、ＭＡＲＴ−１２７−３５、ｇｐ１００１５４−１６３、ｇｐ１００２０９−２１７およびｇｐ１００２８０−２８８）で刺激する。これら同一ＣＤ８＋細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下で、２回の自己のペプチドパルスした単核細胞により再刺激する。抗ＣＤ３ ｍＡｂ（ＯＫＴ３）を用いる非特異的増殖段階もまた細胞の総数を増大させる（すなわち一般に第二の再刺激段階の終了時に得られるものの２５倍以上）ために包含する。細胞傷害性Ｔ細胞活性をペプチド負荷したＴ２細胞および一団のＡ２＋黒色腫細胞に対し測定する一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激したＣＤ８＋ Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリーにより評価する。加えて、抗原特異的刺激およびペプチド特異的四量体分析に応答してのインターフェロン−γ産生は、生成されるＣＴＬのそれぞれエフェクター機能および特異性を確認する。
【０１１０】
黒色腫癌患者から単離したナイーブなＣＤ８＋ Ｔ細胞から生成したＣＴＬの効力
末梢血サンプルから単離した抗原特異的ＣＴＬが、ＴＣＲが向けられる特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する低から高までのアビディティーの範囲にわたる細胞の不均一集団の一部であることが、黒色腫患者で示されている。しかしながら、これらのＣＴＬの大多数は低アビディティーのものであり、そして高アビディティーをもつＣＴＬのみが有意の腫瘍細胞溶解を示す２１。加えて、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が黒色腫を伴う患者の腫瘍塊から単離された。高用量ＩＬ−２の存在下でのこれらのＴＩＬのｅｘ ｖｉｖｏ増殖は黒色腫患者における客観的応答をもたらしたが；しかしながら、これらの応答は、短期間、かつ、いかなる完全奏功も生成することに失敗したＴＩＬから発する高度に反応性のクローン化Ｔ細胞のものであった１６。
【０１１１】
対照的に、ショウジョウバエｘＡＰＣを用いてｅｘ ｖｉｖｏで生成したＣＴＬは、ペプチド特異的溶解（例えば図１を参照されたい）および強い黒色腫腫瘍細胞死滅が可能な強力な高アビディティーの抗原特異的Ｔ細胞である。腫瘍細胞に対する強い細胞溶解活性をもつＣＴＬの再現可能な生成は数種の寄与因子に帰されると考えられる。第一に、ペプチド特異的抗ＣＤ８モノクローナル抗体でのＣＤ８＋精製はＣＤ８の高密度を伴う細胞について選択した一方、特異的ペプチドの存在下での抗体放出はＴ細胞の非特異的刺激を回避した。第二に、高度に精製したＣＤ８＋ Ｔ細胞（表Ｉ）を、高密度の抗原提示が強力な一次Ｔ細胞免疫応答をもたらすＭＨＣ分子の情況で、特異的Ｔ細胞エピトープを提示するｘＡＰＣで刺激する。ＡＰＣ上の複数の共刺激分子の包含はＴ細胞刺激を最適化する。第三に、再刺激段階は、一次刺激で使用される同一の黒色腫関連Ｔ細胞エピトープを負荷された自己の単核細胞を取り込み、そして増殖するＴ細胞に増強を提供する。最後に、ＯＫＴ３、自己支持細胞および低用量ＩＬ−２を用いる単一の非特異的増殖段階は、Ｔ細胞の総数を約２５倍増大させる一方で、第二の再刺激段階の終了時に記録される抗原特異的Ｔ細胞の同一比率を維持する。
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
このｅｘ ｖｉｖｏ ｘＡＰＣ ＣＤ８＋ Ｔ細胞刺激プロトコルは、ペプチド特異的四量体分子、特異的抗原刺激に応答してのインターフェロン−γ放出および特異的腫瘍溶解での列挙により評価されるとおり、強力な腫瘍細胞溶解、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する高アビディティー、および抗原特異性をもたらした。
【０１１４】
以前の研究からの悪性転移性黒色腫におけるＣＴＬ治療の評価
ステージＩＩＩ若しくはステージＩＶ黒色腫を伴う合計５５例の被験体を伴った２件のフェーズＩ試験および１件のフェーズＩＩ試験が実施された。試験１、「ショウジョウバエ抗原提示細胞、インターロイキン−２、インターロイキン−７、その後接着性単球およびチロシナーゼペプチドとともにｅｘ ｖｉｖｏで連続培養した自己細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）」は、１０例のステージＩＶ黒色腫患者でのオープンラベル試験であった。臨床エンドポイントは、１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化後の再注入した自己ＣＴＬの安全性および忍容性；２）制限希釈分析による全身循環中の注入されたＣＴＬのキネティクスの測定；３）放射シンチグラフィーによる１１１インジウム標識ＣＴＬの全身配置；４）免疫組織化学分析による生検小結節の細胞組成（ＣＴＬ、ＴＨ、ＮＫ、Ｂ細胞）ならびに５）測定可能病変の退縮および２か月にわたる応答持続期間であった２２。
【０１１５】
試験２、「進行黒色腫の処置のためのショウジョウバエ細胞で刺激した自己ＣＤ８＋リンパ球の注入を伴う皮下インターフェロン−αのパイロット試験」において、合計１５例のステージＩＩＩ／ＩＶ黒色腫患者に、ＩＦＮα−２ｂでのバックグラウンド維持療法上で自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞を注入した。ＣＴＬ療法を、１）再注入したＣＴＬの安全性および耐性（ｔｏｌｅｒａｔｉｏｎ）をモニターすること；２）生検小結節の細胞組成；３）
測定可能病変の退縮、ならびに４）３か月にわたる応答持続期間により評価した。経過観察評価（最初の注入後４週）で安定な疾患を有したか若しくは臨床応答を示した被験体に第２サイクルの処置を提供した。１５例の被験体のうち８例が第２サイクルのＣＴＬ療法を受け、４例の被験体が第３のサイクルに進入し、そして１例の被験体は４サイクルのＴ細胞療法で処置した２３。
【０１１６】
試験３、「進行黒色腫の処置のためのショウジョウバエ細胞で刺激した自己ＣＤ８リンパ球の注入を伴う若しくは伴わない皮下インターフェロン−α−２ｂ（ＩＦＮ）およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）の無作為化フェーズＩＩ試験」において、合計３０例のステージＩＩＩ／ＩＶ黒色腫患者を、サイトカイン単独（ＩＦＮαおよびＩＬ−２）若しくはサイトカインおよびＴ細胞で処置した。それは、患者がサイトカインのみアーム（アームＡ）若しくはサイトカインおよびＴ細胞アーム（アームＢ）に進入した無作為化試験であった。アームＡに進入しかつそこで進行した患者に、サイトカインおよびＴ細胞アーム（アームＣ）にクロスオーバーする機会を提供した。本試験の一次エンドポイントは、２群（アームＡ対アームＢ）間の疾患の無増悪期間（ＴＴＰ）を比較することであった。統計学的有意性は、アームＡに進入する患者に対するアームＢに進入する者のＴＴＰで達せられた（図１１）。アームＡからアームＣにクロスオーバーした患者で、ＴＴＰの統計学的有意性はＴ細胞を受領する患者でもまた検出された。用量および処方されたスケジュールでのＩＦＮαおよびＩＬ−２の安全性および耐性もまたモニターした２４。
【０１１７】
インターフェロン−α−２ｂ（ＩＦＮ−α−２ｂ）の使用の理論的根拠
インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）は、多様な悪性病変において広範な免疫調節および抗増殖効果を有する。ＩＦＮ−αの１作用機序は黒色腫細胞上での腫瘍抗原発現の上方制御であると考えられている。それは腫瘍の表面上の免疫学的に重要な分子の発現を高める能力を有する。これらは、ＭＨＣ抗原、アクセサリー分子、ならびに腫瘍関連抗原を包含する２５−２７。これらの免疫調節効果は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を認識かつ攻撃する抗体およびリンパ球双方を包含する免疫系の活性を改善しうる。能動的特異的免疫療法は播種性黒色腫の処置において有意の臨床応答を示した。上で論考された免疫機能研究の結果は、黒色腫ワクチン処置が抗黒色腫ＣＴＬの頻度を増大させることを示した。免疫療法のこれら２種の様式が相乗的に作用しうると考えられる。５日クールのＩＦＮ−α（１０ＭＵ／ｍ２；皮下で）が試験２に包含され、また、組織のＩＨＣ染色の結果は、該タイミングおよび用量が、指定される時間枠で単一患者から得た連続生検サンプル中のクラスＩおよび黒色腫関連抗原双方の発現を上方制御するのに十分であったことを示した。臨床試験での同一の５日クールを試験３で包含した。
【０１１８】
インターロイキン−２の使用の理論的根拠
ヒト組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）は、組換えＤＮＡ技術により製造されるリンホカインであり、多様な生物学的活性を表すことが示されている。ＩＬ−２は、標的細胞の表面上の特定の受容体への結合後に免疫系を刺激しかつその生物学的効果を発揮する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、それはＴ細胞増殖およびリンパ球の細胞傷害性を高め、リンホカイン活性化およびナチュラル双方のキラー細胞のキラー活性を誘導し、そしてインターフェロン−γ産生を誘導することが示されている。２８３例の患者への高用量ＩＬ−２の投与は、９例の完全奏功を伴う７％の寛解率を生じ、そして該患者は９から９１か月以上まで無病のままであった２８。高用量ＩＬ−２は低用量連続注入より有効であるようであったとは言え、高用量のＩＬ−２はまたより毒性でもある。最も一般的な副作用は流感様症状であった。最も重篤な副作用は、低血圧、毛細管漏出症候群および低下された臓器灌流であった。養子移入した自己Ｔ細胞のレベルを高めかつ維持するために、低用量ＩＬ−２（３ＭＩＵ／日で×２８日）の皮下投与を試験３の一部で使用した。それは、抗原特異的Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで維持するための試みにおいてリンパ球有糸分裂誘発、リンパ球細胞傷害性およびインターフェロン−γ産生を高めるため、短い１クールのＩＦＮ−αの後およびＣＴＬ注入直後に追加した。
【０１１９】
非骨髄破壊的免疫抑制性化学療法レジメン後のリンパ球の養子移入
マウスの研究は、Ｔ細胞の投与前の化学療法での免疫抑制の誘導が、リンパ球の養子移入が最大の腫瘍退縮を媒介することを可能にするために不可欠であったことを示した２９，３０。これらの研究に基づき、非骨髄破壊的化学療法レジメンの適用後のリンパ球の養子移入を用いて患者を処置するための臨床プロトコルを開始した１６，３１。非骨髄破壊的調製的レジメンを使用して、同種骨髄移植片を受領する患者を処置し、そして、これらのレジメンは、養子移入したＴリンパ球の効果を高めうる一過性免疫抑制を誘導するのに理想的に適するようである。ＨＬＡを一致させた同種移植片を受領する腎細胞癌患者で元は使用されたシクロホスファミドおよびフルダラビンのレジメン３２が、転移性黒色腫患者で最近使用されている１６，３１。Ｔ細胞の養子移入前のリンパ球枯渇レジメンの組み込みの理論的根拠は、制御性細胞をおそらく破壊する、恒常性Ｔ細胞制御を破壊する（「空間を作成する」）、若しくは移入されたＴ細胞の生着を潜在的に高め得る他の正常の免疫寛容誘発機構を廃止することであった。処置関連の死亡は観察されず、そして従って、抗腫瘍リンパ球および高用量ＩＬ−２と組合せの非骨髄破壊的化学療法は安全であるはずである。非骨髄破壊はフルダラビン（２５ｍｇ／ｍ２）およびシクロホスファミド（６０ｍｇ／ｋｇ）で誘導され、そしてリンパ球注入および高用量ＩＬ−２（７２０，０００ＩＵ／ｋｇ）が続いた。
【０１２０】
化学療法剤シクロホスファミドおよびフルダラビンの投与は、完全には骨髄破壊的でない一方で、骨髄抑制的であることが示され、好中球、リンパ球、血小板および赤血球に影響を及ぼす。化学療法の開始後第１０日に最下点まで下落した好中球レベルは６／ｍｍ３で記録され、そしてフィルグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ）の支持で第１４日に５００／ｍｍ３より上に回復した。リンパ球レベルは６／ｍｍ３の最下点を有し、そして同一期間に２００／ｍｍ３より上に回復した。患者は通常、化学療法の開始２〜３週後に５００／ｍｍ３より上の好中球数および２０，０００／ｍｍ３より上の血小板数を表した。骨髄機能を救出するための幹細胞注入を必要とした患者はなく、そして従って処置全体は安全であるようであった。しかしながら、ＣＤ４数は持続して低いままであり（およそ第２００日の平均ＣＤ４数は４６／ｍｍ３と３２０／ｍｍ３の間の範囲を伴い１５６／ｍｍ３であった）、これはフルダラビンで誘導される免疫抑制の既知の副作用である。日和見感染の発症が起こり（すなわち一過性帯状疱疹の突然の発生）、それは処置の終了後に解消した。
【０１２１】
フルダラビンに類似のプリンアナログ、クラドリビン（２−ＣｄＡ、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（Ｒ））は、ヘアリーセル白血病の処置での使用に承認され、そして自己反応性Ｔリンパ球を減少させる試みにおいて多発性硬化症（ＭＳ）患者でもまた評価された。ＭＳ患者で、Ｔ細胞サブセットの特異的減少が、クラドリビンの異なる用量と相関した３３−３５。それは、長期間持続するリンパ球減少を誘発する一方で、他のリンパ球溶解薬に関して非常に好都合な毒性プロファイルを有する。リンパ球レベルは、４か月クールの間投与される場合、クラドリビンの最初の注入直後に低下し、５か月で最下点に達し、そして６か月までに回復することを開始する３３，３４。リンパ球減少は全患者で観察され、また、感染性合併症は重大な問題でなかった。該薬物は、局所刺激を引き起こすことなくかつＩＶ経路に完全に同等のようである薬物動態および治療結果を伴い、便宜的皮下経路により与えうる。
【０１２２】
ワクチンの状況で制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を免疫抑制性と同定するヒトでの最近の研究は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＧＩＴＲと一緒にＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ｈｉ表現型を表すＴｒｅｇサブセットの枯渇後に、高められた抗腫瘍免疫応答を示した３８。このＴ細胞サブセットは、デニロイキンジフチチクス（ＤＡＢ３８９ＩＬ−２、ＯＮＴＡＫ（Ｒ））の単回投与後に選択的に枯渇され得る（およそ３週）。単回投与４日後に、Ｔｒｅｇ細胞の３７〜７７％枯渇が８例の腎細胞癌患者で示された。Ｔ細胞枯渇後、ＲＮＡ−ＤＣワクチンを投与し、そして、ワクチン抗原に対する免疫応答の１０倍増強が、ワクチン単独に対しＤＡＢ ＩＬ−２およびワクチン双方を受領する患者で示された。従って、抗原特異的ＣＴＬの養子移入前６日の同一用量（１８μｇ／ｋｇ）が、本発明のレジメンでの使用のための好ましい用量である。
【０１２３】
患者選択
試験の被験体は、ＨＬＡ−Ａ２陽性である、転移性黒色腫と診断されたヒト患者である。モノクローナル抗体（ＢＢ７．２）をＦＡＣＳ分析によりＰＢＭＣサンプルを分析するのに使用し、そして、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１サブタイプを決定するためのＯｌｅｒｕｐ ＳＳＰＴＭ ＰＣＲ試験（ＧｅｎｏＶｉｓｉｏｎ）を使用してさらなる分析を実施する。
【０１２４】
処置スキーム
図２は下により詳細に記述される処置レジメンを描く。患者を各コホートに１０例を含み被験体の３コホートに分割する。リンパ球枯渇レジメンの対照、コホートＡレジメンではＣＴＬおよびサイトカインを投与する。本発明の好ましい一態様であるコホートＢレジメンでは、患者はクラドリビン（第０〜４日）およびＣＴＬ（第３６日）およびサイトカインを受領する。本発明の別の好ましい態様であるコホートＢレジメンでは、患者はＤＡＢ ＩＬ−２（第３０日）およびＣＴＬ（第３６日）およびサイトカインを受領する。実験レジメンを下により詳細に記述する。
【０１２５】
黒色腫関連抗原に特異的なＣＴＬ
悪性黒色腫の細胞傷害性Ｔリンパ球療法は、黒色腫関連抗原エピトープを有する黒色腫細胞を破壊するのに自己のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を利用する。ＣＴＬは臨床の場で生成した白血球除去サンプルから調製し、そして、ＧＭＰガイドラインのもとでＣＴＬを生成する施設に輸送し、そして注入のため戻す。
【０１２６】
第０日に、転移性黒色腫を伴う患者が白血球除去を受ける（患者の体重および状態に依存しておよそ１０〜１５リットルの運転）。得られた細胞を、ＧＭＰ製造施設での処理のため室温で翌日配達で発送する。適切な時点で白血球除去を実施して分析のための末梢血リンパ球を得る。これらのサンプルを使用して、抗原特異的Ｔ細胞の存在および循環黒色腫腫瘍細胞の存在をモニターする。モニタリング白血球除去処置は、臨床の場でおよそ５リットルの末梢血（若しくは、その後の注入のためのＣＤ８細胞を得るため初回白血球除去で収集した容量の１／３）を処理し、そしてＧＭＰ製造施設に発送する。ＰＣＲアッセイを使用して、治療後の循環黒色腫細胞のレベルの低下を測定する。循環黒色腫細胞の検出は、感受性の定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにより測定し得る３９−４１。抗原特異的Ｔ細胞の存在を、ペプチド特異的／ＨＬＡ−Ａ２四量体を用いて評価する。
【０１２７】
注入のための最終ＣＴＬ調製物は、７６％（ｖ／ｖ）乳糖リンゲル液、４％（ｖ／ｖ）Ｄ５ＮＳおよび２０％（ｖ／ｖ）の２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に含有される３００ｍＬ中に１×１０１０自己ＣＴＬを含有する。ＣＴＬ生成物を氷上で保持した注入に適する滅菌袋中で調製し、そして調製４２時間以内に３０分にわたり注入する。
【０１２８】
注入前に、ＣＴＬを溶解活性（ペプチド負荷した標的細胞および黒色腫腫瘍細胞双方の溶解）、生存率、ならびにＦＡＣＳ分析による純度についてモニターする。ショウジョウバエ細胞ＤＮＡおよび昆虫ウイルスＲＮＡ双方の非存在を、感受性の定量的リアルタイムＰＣＲアッセイで確認する。無菌性は、ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ（Ｒ）分析、マイコプラスマ試験およびグラム染色分析により決定する。
【０１２９】
患者は、ＣＴＬが向けられている抗原をｉｎ ｖｉｖｏで発現する細胞を標的とすることが可能な細胞傷害性Ｔリンパ球になるようにｅｘ ｖｉｖｏで刺激かつ増殖したおよそ１０１０自己Ｔ細胞のＣＴＬ注入を受領する。細胞はＩＦＮ−α処置後の終了後に注入し、そしてＩＬ−２レジメンの開始にすぐ先行する。
【０１３０】
サイトカイン
インターロイキン−２（ＩＬ−２）はＣｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州エメリービル）から得る。それはおよそ０．１７ｍｇの第一および０．８９ｍｇの第二リン酸ナトリウムで７．５（範囲７．２ないし７．８）のｐＨに緩衝した、５０ｍｇマンニトールおよび０．１８ｍｇドデシル硫酸ナトリウムを含む無菌の白色ないし灰白色凍結乾燥ケーキとして２２百万ＩＵ（約１．３ｍｇ）のＩＬ−２を含有する単回使用バイアルとして供給される。該粉末を１．２ｍＬの米国薬局方注射用滅菌水で再構成し、そして生じる濃度は１８百万ＩＵ／ｍｌすなわち１．１ｍｇ／ｍＬである。無傷のバイアルは冷蔵庫（２°〜８℃）中で保存しかつ光から保護する。再構成したＩＬ−２を、２．４ｍＬのＤ５％水でさらに希釈する。該最終濃度（６ＭＵ／ｍＬ）は、プラスチック製シリンジに一旦吸い込まれれば、２〜８℃で冷蔵保存される場合に再構成後１４日間十分である。ＩＬ−２の最終希釈を、ＣＴＬ注入直後に開始しかつ疾患の進行まで毎日、３百万単位（３ＭＩＵ）の用量で皮下に外来で自己投与する。
【０１３１】
ＩＮＴＲＯＮ−Ａ（Ｒ）はＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州ケニルワース）から得る。このＩＦＮ−α−２ｂ製品は、凍結乾燥粉末若しくは注入のための溶液いずれかとして滅菌５ｍｌバイアル中で供給される。１バイアルはおよそ３×１０６Ｕ若しくは１８×１０６ＵのＩＦＮを含有する。凍結乾燥粉末は、静菌剤が包含されていないため、好ましくは使用直前に再構成し；未使用の凍結乾燥粉末は冷蔵庫若しくは冷凍庫（−４℃ないし−２０℃）で保存する。該剤が注入可能な溶液として供給される場合はそれを冷蔵庫に保存する（２°〜８℃すなわち３６°〜４６°Ｆ）。ＩＦＮ−□の最終希釈を、皮下注入として第３１〜３５日に１０ＭＵ／ｍ２で外来で自己投与する。
【０１３２】
ＤＡＢ３８９ＩＬ−２
ＤＡＢ３８９ＩＬ−２（デニロイキンジフチトクス、ＯＮＴＡＫ（Ｒ））は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現される、ジフテリア毒素フラグメントＡおよびＢのアミノ酸配列、次いでインターロイキン２の配列から構成される、組換えＤＮＡ由来の細胞傷害性タンパク質である。それは標的を定められた薬物であり、それらの表面上にＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ）を発現する細胞に結合する。それは悪性若しくは正常の制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の表面上の高アフィニティーＩＬ−２受容体と相互作用して細胞内タンパク質合成を阻害し、迅速に細胞死に至る。ＤＡＢ３８９ＩＬ−２は、静脈内（ＩＶ）投与に意図している無菌の凍結溶液として単回使用バイアル中で供給される。ＯＮＴＡＫの各２ｍＬバイアルは、米国薬局方注射用水中クエン酸（２０ｎＭ）、ＥＤＴＡ（０．０５ｍＭ）およびポリソルベート２０（＜１％）の無菌溶液中に３００ｍｃｇの組換えＤＡＢ−ＩＬ２を含有する。該溶液は６．９〜７．２のｐＨを有する。無傷のバイアルは凍結すなわち−１０℃で保存するがしかし再凍結しない。該物質は、冷蔵庫中で２４時間を超えない間若しくは室温（２５℃すなわち７７°Ｆ）で１〜２時間融解することにより用量を調製する前に室温にもたらし、そしてＮＳで≧１５ｍｃｇ／ｍＬの濃度に希釈する。ＤＡＢ３８９ＩＬ−２は静脈内注入、好ましくは最低１５分にわたる注入により投与する。コホートＣに割り当てられた患者は第３０日（ＩＦＮ−□の開始１日前かつＣＴＬの注入６日前である）にＤＡＢ ＩＬ−２の単回皮下注入を受領する。該用量は１８μｇ／ｋｇである。
【０１３３】
クラドリビン
Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（Ｒ）（２−クロロ−２’デオキシ−□−Ｄ−アデノシン）は合成抗腫瘍剤である。それはアデノシンデアミナーゼの作用に抵抗性のプリンヌクレオシドアナログであり、優先的なリンパ球傷害性をもたらす。デオキシヌクレオチダーゼに対するデオキシシチジンキナーゼの高い比を伴う細胞（例えばリンパ球および単球）で、クラドリビンは活性の三リン酸デオキシヌクレオチド２−ＣｄＡＴＰにリン酸化され、蓄積して細胞代謝の破壊、ＤＮＡ損傷およびその後の細胞死を引き起こす。該薬物はクラドリビン１０ｍｇ（１ｍｇ／ｍＬ）を含有する単回使用バイアル中で供給される、澄明無色の無菌の保存剤を含まない等張溶液である。クラドリビンの各ｍＬは、１ｍｇの有効成分、および不活性成分として９ｍｇ（０．１５ｍＥｑ）の塩化ナトリウムを含有する。該溶液は５．５ないし８．０のｐＨ範囲を有する。リン酸および／若しくは第二リン酸ナトリウムを添加して６．３±０．３にｐＨを調節してもよい。無傷のバイアルは冷蔵保存（２〜８℃）する。コホートＢのクラドリビンの用量は合計５日間０．１２ｍｇ／ｋｇ／日であり、最大３．０ｃｃを単一部位に投与する３〜４部位に細分する。総クラドリビン用量は０．６ｍｇ／ｋｇである。（この同一スケジュール（連続５日）および０．１４ｍｇ／ｋｇ／日の用量（総用量＝０．７ｍｇ／ｋｇ）で皮下投与されるクラドリビンは、ヘアリーセル白血病患者で安全であることが報告された３７。加えて、６０例の患者にこのスケジュールおよび用量で投与したクラドリビンは、単一サイクル後に臨床上同一の骨髄抑制を伴いおよそ７０％のリンパ球枯渇を生じた。標準化における変化の結果として、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎは、実験室で合成したクラドリビンストックと比較して、以前の臨床研究で報告されたより１２％より高いことが見出された。０．１ｍｇ／ｋｇであると報告された用量は現在、実際にわずか０．０８７ｍｇ／ｋｇであったことが推定されている３３。２〜３部位に細分したＬｅｕｓｔａｔｉｎ（Ｒ）製剤での皮下投与の安全性に関して、再発−寛解型多発性硬化症患者での研究は、２．１ｍｇ／ｋｇの総累積用量に月１回６か月間０．０７ｍｇ／ｋｇ／日×５日を使用した３６。合計２７例の患者を処置薬物アームに無作為化した。感染症は、２例のクラドリビン処置患者およびプラセボを受領する１例の患者で発生した軽度の部分的帯状疱疹のエピソードに制限された。重大な血小板減少症、貧血顆粒球減少症若しくは全身骨髄抑制の個別症例は存在しなかった。）
【０１３４】
任意の支持療法
患者は処置の間およびその後、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−２毒性を排除するため、以下、すなわちアセトアミノフェン（６５０ｍｇ ＰＯ 必要に応じ４時間ごと）、ジフェンヒドラミン（５０ｍｇ ＩＭ若しくはＰＯ 必要に応じ４時間ごと）、インドメタシン（２５ｍｇ ＰＯ １日３回若しくは７５ｍｇ徐放１日１回）、プロクロルペラジン（１０ｍｇ ＩＶ若しくはＰＯ 必要に応じ４時間ごと、吐き気）、Ｚａｎｔａｃ（Ｒ）（１５０ｍｇ １日２回、胃炎）のいずれかを受領しうる。とりわけ処方されない他の抗炎症剤および制吐剤を上の支持薬物のいずれの代わりに用いてもよい。
【０１３５】
本発明は具体的に説明する実施例および好ましい態様に関して上に詳述されたとは言え、当業者は、本発明の範囲が前述の記述により定義されず、しかし、特許法の原理のもとで適正に解釈されるとおり付随する請求の範囲により定義されることを理解するであろう。
【０１３６】
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３１． Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．，Ｊ．Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｊ．Ｃ．Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｎｏｎ−ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２５：２４３−２５１，２００２．
３２． Ｃｈｉｌｄｓ，．，Ｃｈｅｒｎｏｆｆ，Ａ．，Ｃｏｎｔｅｎｔｉｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｒｅｎａｌ−ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｆｔｅｒ ｎｏｎｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ−ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＮＥＪＭ ３４３：７５０−７５８，２０００．
３３． Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｒｒｏｗ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ．Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９１：１０−１５，１９９４．
３４． Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９３：１７１６−１７２０，１９９６．
３５． Ｒｉｃｅ，ＧＰＡ ｅｔ ａｌ．Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ＭＳ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ＭＲＩ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５４：１１４５−１１５５，２０００．
３６． Ｒｏｍｉｎｅ，ＪＳ，Ｓｉｐｅ，ＪＣ，Ｋｏｚｉｏｌ，ＪＡ ｅｔ ａｌ．Ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｒｅａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ａｓｓｏｃ Ａｍｅｒ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １１１：３５−４４，１９９９．
３７． ｖｏｎ Ｒｏｈｒ，Ａ，Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｓ−ＦＨ，Ｔｉｃｈｅｌｌｉ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈａｉｒｙ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｗｉｔｈ ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ（２−ｃｈｌｏｒｏｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）ｂｙ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｂｏｌｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：ａ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １３：１６４１−１６４９，２００２．
３８． Ｖｉｅｗ，Ｊ，Ｓｕ，Ｚ，ａｎｄ Ｄａｎｎｕｌｌ，Ｊ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ＡＳＣＯ Ａｂｓｔ ２５０６，２００４．
３９． Ｋｅｉｌｈｏｌｚ，Ｕ．，Ｇｏｌｄｉｎ−Ｌａｎｇ，Ｐ，Ｂｅｃｈｒａｋｉｓ，ＮＥ ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｏｃｕｌａｒ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０：１６０５−１６１２，２００４．
４０． Ｈｏｏｎ，ＤＳＢ，Ｂｏｓｔｉｃｋ，Ｐ，Ｋｕｏ，Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｓ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：２２５３−２２５７，２０００．
４１． Ｇｏｙｄｏｓ，ＪＳ ａｎｄ Ｒｅｉｎｔｇｅｎ，ＤＳ．Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｕｓｅｆｕｌ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｃｕｌｔ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｉｎ：Ｂ．Ｊ．Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ（ｅｄ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ ６１：Ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．３０１−３２０．
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】ペプチド負荷した標的細胞に向けられた、ｅｘ ｖｉｖｏで生成したＣＴＬの細胞溶解活性を具体的に説明する。黒色腫患者から単離したＣＤ８＋ Ｔ細胞を、５種の異なる黒色腫関連ペプチドエピトープを負荷したショウジョウバエＡＰＣでｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した。活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、黒色腫特異的ＣＴＬを選択的に増殖させるため、ＩＬ−２およびＩＬ−７を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。活性は、各ペプチドを個別に負荷した５１Ｃｒ標識Ｔ２標的細胞の特異的溶解として評価した（ＨＬＡ−Ａ２対照ペプチドを負荷したＴ２細胞に対するＴｙｒ−１６８９、Ｔｙｒ−２７９２、ｇｐ１００−１８１７、ｇｐ１００−２８５３若しくはＭＡＲＴ−１８１９）。
【図２】対照レジメンと一緒の本発明の処置レジメンの２種の好ましい態様の図解を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被験体からナイーブなＣＤ８＋ Ｔ細胞を得ること；
（ｂ）１種若しくはそれ以上のペプチド抗原を負荷した異種抗原提示細胞と該ナイーブなＣＤ８＋ Ｔ細胞を接触させて、それにより、前記１種若しくはそれ以上のペプチド抗原を発現する細胞を標的とする活性化ＣＴＬを生成すること；
（ｃ）該活性化ＣＴＬを該被験体に投与すること；
（ｄ）ＣＴＬ持続性を遂げる最低２種のサイトカインを該被験体に投与すること；ならびに
（ｅ）クラドリビンおよびデニロイキンジフチトクスよりなる群から選択される白血球枯渇剤を該被験体に投与すること
を含んでなる、癌の処置の必要な被験体の処置方法。
【請求項２】
前記最低２種のサイトカインがインターフェロン−α−２ｂおよびインターロイキン−２を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１種若しくはそれ以上のペプチド抗原が、ｇｐ１００、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１から選択されるタンパク質由来のアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１種若しくはそれ以上のペプチド抗原が、ヒトｇｐ１００、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１タンパク質由来のペプチド抗原よりなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１種若しくはそれ以上のペプチド抗原のそれぞれが、ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号１）、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号２）、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号３）、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号４）、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（配列番号５）およびＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号６）よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が黒色腫である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
リンパ球枯渇剤の投与が活性化ＣＴＬの投与前に開始する、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）被験体からナイーブなＣＤ８＋ Ｔ細胞を得ること；
（ｂ）１種若しくはそれ以上のペプチド抗原を負荷した異種抗原提示細胞と該ナイーブなＣＤ８＋ Ｔ細胞を接触させて、それにより、前記１種若しくはそれ以上のペプチド抗原を発現する細胞を標的とする活性化ＣＴＬを生成すること；
（ｃ）該活性化ＣＴＬを該被験体に投与すること；
（ｄ）ＣＴＬ持続性を遂げる最低２種のサイトカインを該被験体に投与すること；ならびに
（ｅ）クラドリビンおよびデニロイキンジフチトクスよりなる群から選択される白血球枯渇剤を該被験体に投与すること
を含んでなる、癌の処置の必要な被験体の処置方法。
【請求項２】
前記最低２種のサイトカインがインターフェロン−α−２ｂおよびインターロイキン−２を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１種若しくはそれ以上のペプチド抗原が、ｇｐ１００、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１から選択されるタンパク質由来のアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１種若しくはそれ以上のペプチド抗原が、ヒトｇｐ１００、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１タンパク質由来のペプチド抗原よりなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１種若しくはそれ以上のペプチド抗原のそれぞれが、ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ（配列番号１）、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号２）、ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号３）、ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ（配列番号４）、ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（配列番号５）およびＫＴＷＧＱＹＷＱＶ（配列番号６）よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が黒色腫である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
リンパ球枯渇剤の投与が活性化ＣＴＬの投与前に開始する、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００９−５３１３０３（Ｐ２００９−５３１３０３Ａ）
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５７３１４（Ｐ２００８−５５７３１４）
【出願日】平成１９年２月２３日（２００７．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００４８４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０３００９
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（３９００３３００８）ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ (616)
【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ ＮＡＡＭＬＯＺＥ ＶＥＮＮＯＯＴＳＣＨＡＰ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２３日（２００７．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００４８４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０３００９
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（３９００３３００８）ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ (616)
【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ ＮＡＡＭＬＯＺＥ ＶＥＮＮＯＯＴＳＣＨＡＰ
【Ｆターム（参考）】
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