レインを含むヒアルロン酸のエステル、その製造方法、およびそれを含んでなる組成物
【課題】レイン（ｒｈｅｉｎ）は、抗炎症特性および組織保護特性を有するセンナに由来する物質で、主に関節の炎症を処置する際に用いられるが、緩下作用を有するという欠点を示し、かつ水に溶解しないため、非経口または関節内経路で投与することによってこの副作用を未然に防ぐことができない。このことから、レインの副作用を防止できる化合物、および該化合物による医薬組成物を提供する。
【解決手段】ヒアルロン酸のアルコール基がレインでエステル化されている化合物、前記エステル化合物の製造方法、および前記エステル化合物を含んでなる医薬組成物。
【解決手段】ヒアルロン酸のアルコール基がレインでエステル化されている化合物、前記エステル化合物の製造方法、および前記エステル化合物を含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、レインを含むヒアルロン酸（ＨＡ）のエステル、より詳しくはヒアルロン酸のアルコール基がレインでエステル化されている、ヒアルロン酸に基づく化合物、前記化合物の製造方法、および前記化合物を含んでなる医薬組成物に関する。
【従来の技術】
【０００２】
レイン（ｒｈｅｉｎ）は、抗炎症特性および組織保護特性を有するセンナに由来するアルカロイドである。
【０００３】
レインは、化学名が４，５−ジヒドロキシ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸であって、以下の一般式（Ｉ）
【化１】
（式中、ＲはＨである）
を有する。
【０００４】
この物質は、通常、Ｒ基のそれぞれがアセチル基である上記一般式（Ｉ）の誘導体ジアセチルレインとして経口経路より投与され、バイオアベイラビリティが高く、主に関節の炎症を処置する際に用いられる。
【０００５】
しかし、レインとジアセチルレインの双方ともに相当な緩下作用を有するという欠点を示し、下痢さえ引き起こすこともあるので、高齢または衰弱した患者にはその使用を勧められない。
【０００６】
さらに、レインおよびジアセチルレインが水に溶解しないため、これらの有効成分を非経口または関節内経路によって投与することによってこの副作用を未然に防ぐことができない。
【０００７】
ヒアルロン酸は、１３×１０６ダルトンまでの分子量を有する直鎖を形成する以下の一般式
【化２】
に示されるようなＤ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンからなる交互単位から形成される天然のムコ多糖である。
【０００８】
ヒアルロン酸は、生物のあらゆる軟組織および多くの生理液、例えば、関節の滑液および眼の硝子体液など、に存在する。
ヒアルロン酸は、その酸性形態または塩形態で多くの臨床応用に用いられている。
【０００９】
特に、ヒアルロン酸は関節の炎症での使用に優れた効果がある。ヒアルロン酸は関節内へ直接浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により投与され、二重の機構、つまり、一方では関節の炎症を低下させ、他方では滑液の粘度を増加させること、によって作用する。その結果軟骨はいっそう滑らかになり、軟骨に有益となる。
【００１０】
ヒアルロン酸は、眼科にも適用可能であり、その保護特性および抗炎症特性のために、また軟骨および皮膚での同化−再構成作用によって組織修復のために用いられている。
しかし、ヒアルロン酸は分解されやすいことが知られている。
【００１１】
ヒアルロン酸の分解は、ｐＨ条件および陽イオン濃度にもよるが、加水分解によって引き起こされることが報告されている［例えば、Uchiyama H. et al. J. Biol. Chem. 1990; 265: 7753-7759; Tokita Y. and Okamoto A., Polymer Degr. and Stab. 1995; 48: 269-273; Hawkins C. L. and Davies M. J. Free Rad. Biol. Med. 1998; 24: 1396-1410; Schiller J. et al. Current Med. Chem. 2003; 10: 2123-2145参照]。
【００１２】
広範囲な研究の後、本発明者らは、レインでエステル化されたアルコール基を有するヒアルロン酸が、ヒアルロン酸よりも驚くほど高い安定性を有すること、およびさらに用いられたヒアルロン酸とレインに関して別々に観察されたものに比べて改善された薬理活性を有することを見出した。
【００１３】
さらに、本発明者らは、レインでエステル化されたアルコール基を有するヒアルロン酸は局所投与によって有利に用いることができること、その結果レインの経口投与に付随する欠点を回避することができることを見出した。
本発明はこれらの結果を基にして達成された。
【発明の概要】
【００１４】
第一の態様によれば、本発明は、ヒアルロン酸のアルコール基がレインそれ自体または誘導体形でエステル化されており、ヒアルロン酸よりも安定性が高いだけでなく、用いられるヒアルロン酸とレインに関して別々に観察されたものと比べて薬理活性の改善された、さらに局所投与に使用できるためレインの経口投与に付随する欠点を回避することのできる、ヒアルロン酸に基づく化合物またはその塩に関する。
【００１５】
第二の態様によれば、本発明は、レインの酸塩化物をそれ自体または誘導体形でヒアルロン酸と反応させることを含んでなる、第１の態様の化合物またはその塩を製造するための方法に関する。
【００１６】
第三の態様によれば、本発明は、第１の態様の化合物またはその塩を、好適な賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて含んでなる医薬組成物に関する。
もう１つの態様によれば、本発明は、第３の態様の組成物によって形成されるヒト用または獣医学用の医薬品または医療機器に関し、また、炎症性疾患を処置するため、または組織修復のための医薬を製造するため、あるいは生体材料を製造するための、第１の態様の化合物またはその塩の使用に関する。
本発明のその他の利点は以下の詳細な説明で明らかとなる。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明は、ヒアルロン酸のアルコール基がレインそれ自体または誘導体形でエステル化されているヒアルロン酸に基づく化合物またはその塩を提供する。
本明細書において、本発明の化合物は「ＨＡ−Ｒｅ化合物」とも表される。
【００１８】
本明細書および特許請求の範囲において、「レイン」とは、レインそれ自体または誘導体形を意味することに留意すべきである。
本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物の塩は、薬学上許容される塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、または他の通常の薬学上許容される塩、を含むのが好ましく、ナトリウム塩がいっそう好ましい。
【００１９】
本発明によれば、レインの「誘導体形」には、イン・ビボで薬理学的に活性であり、そこでレインの酸性基がヒアルロン酸のヒドロキシル基とのエステル結合の形成に利用可能であるいずれのレイン誘導体も含まれる。
前記アントラキノンをイン・ビボで利用可能とするレインの誘導体が好ましい。
【００２０】
本発明による誘導体形のレインの例としては、次式
【化３】
（式中、Ｒは独立に任意の適当なヒドロキシ保護基、好ましくはアシル基、例えばアセチル、プロピオニル、ブチリルまたはピバロイル基であるが、これらに限定されるものではない）
で表されるレインが挙げられる。
本発明の好ましい実施形態では、レインは誘導体形であり、より好ましくは、ジアセチルレインである。
【００２１】
本発明によれば、レインは、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の少なくとも５％をエステル化するのが好ましく、５〜５０％の間がいっそう好ましく、５〜２０％の間がさらにいっそう好ましい。
【００２２】
特に好ましいものとしては、レインが、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の１０％をエステル化する化合物である。
前記ＨＡ−Ｒｅ化合物は、本発明による方法によって製造でき、この方法は、好ましくはレインの酸塩化物のｍｍｏｌとヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール単位のｍｅｑ．との間の百分率比が５％より大きい、いっそう好ましくは５％〜５０％の間、さらにいっそう好ましくは５％〜２０％の間、ならびに特に好ましい実施形態に従って１０％であるような量で、レインの酸塩化物とヒアルロン酸とを反応させることを含んでなる。
【００２３】
選択された方法は、残留溶媒の許容性に応じて溶媒の選択を十分に考慮したものである（ＩＣＨ−日・米・ＥＵ医薬品規制調和国際会議(International Conference of Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)）。
【００２４】
好ましくは、上述の本発明による方法は、以下の工程：
ａ）非プロトン性非極性溶媒中、ヒアルロン酸の懸濁液を調製する工程、
ｂ）最少量の非プロトン性非極性溶媒中に溶解したレインの酸塩化物および水素イオンアクセプターを添加する工程、
ｃ）エステル化反応が行われるのに十分な時間、還流下で混合物を攪拌させておく工程、および
ｄ）溶媒を蒸発除去する工程、
を含んでなる。
【００２５】
工程ａ）において使用できる非プロトン性非極性溶媒の例としては、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、トルエン、ジクロロメタン、ｎ−ヘキサンが挙げられ、シクロヘキサンがより好ましい。
【００２６】
レインの酸塩化物を溶解させるために用いてよい非プロトン性非極性溶媒は、限定されるものではないが、好ましくは、工程ａ）において用いたものと同じものを選択するのが好ましい。
【００２７】
工程ｂ）において添加してよい水素イオンアクセプターの例としては、ピリジン、トリエチルアミンが挙げられ、Ｅｔ３Ｎがより好ましい。
反応を還流下で放置しておく時間は、限定されるものではないが、少なくとも２０時間が好ましい。
【００２８】
本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物を製造するために用いられるヒアルロン酸は、分子量５００，０００〜３，０００，０００Ｄａが好ましく、約６００，０００ Ｄａがより好ましい。
ヒアルロン酸の分子量は、従来の方法に従って、例えばゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定できる。
【００２９】
本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物を製造するために用いられるヒアルロン酸は、市販のものであってもよいし（例えばＦｉｄｉａ Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ ＳｐＡ−Ａｂａｎｏ Ｔ．ＰＤ提供）、または例えば、鶏冠からの抽出によるか、ムチン層を有する細菌の発酵によるか、または他の従来の方法によって製造することもできる［Proteoglycan Protocols, Humana Press, R. V. lozzo Ed. Totowa, 2001参照］。
【００３０】
本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物を製造するための方法に用いてよいレインの酸塩化物は、以下の工程：
ａ’）非プロトン性非極性溶媒中、レインの懸濁液を調製する工程；
ｂ’）ＳＯＣｌ２とレインとの間のモル比が１０より大きくなるような量のＳＯＣｌ２を添加する工程；
ｃ’）不活性雰囲気下でレイン酸塩化物が形成されるのに十分な時間、還流下で反応を攪拌させておく工程；および
ｄ’）溶媒および過剰な未反応のＳＯＣｌ２を蒸留によって除去する工程
を含んでなる方法によって得ることができる。
【００３１】
工程ａ’）において使用できる非プロトン性非極性溶媒の例としては、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、トルエン、ジクロロメタン、ｎ−ヘキサンが挙げられ、塩化物溶媒が好ましく、ＣＨ２Ｃｌ２がより好ましい。
工程ｃ’）において還流下で反応を放置する時間は限定されるものではないが、少なくとも３時間が好ましい。
【００３２】
工程ａ’）においてレインの酸塩化物を製造するために用いてよい、レインそれ自体または誘導体形は、市販のものであってもよいし（例えばＡｌｄｒｉｃｈ製）または従来法に従って合成してもよい［Nawa H et al. J. Org. Chem. 1961; 26: 979-981および、本明細書中で報告されている参考文献； Smith C. W. et al. Tetrahedron Lett. 1993; 34: 7447-7450; Gallagher P. T. et al. Tetrahedron Lett. 1994; 35: 289-292参照］。
【００３３】
特に好ましい一適用によれば、本発明による方法を用いて得られた本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物は精製される。
この精製は、透析膜を用いて行われるのが好ましい。
この場合、後に続く実施例に記載されるように、優先されるのは、「Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ ３．５Ｋ」（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ ＵＳＡ）という商標名で市販されている透析膜を製造者の説明書に従って用いることである。
【００３４】
上記ですでに述べたように、本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物は有利な高い安定性を有し、例えばイタリア薬局方第１１版(Official Italian Pharmacopoeia, XI edition)に従って調製されたリン酸緩衝生理食塩水溶液など、好ましくはｐＨ７．４で緩衝されている水溶液中で、４℃±０．５℃の温度で少なくとも３６ヶ月間安定している。
【００３５】
本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物は、皮膚および軟骨のための抗炎症特性、治癒特性、再構成特性およびタンパク同化特性を有する。
従って、本発明はまた、本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物を、好適な賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて含んでなる医薬組成物に関する。
特に、本発明による医薬組成物は、ヒト用および獣医学用の医療機器および／または医薬品でありうる。
【００３６】
本発明による医薬組成物は、局所領域的な投与に好適な処方物を有するのが好ましい。
特に好ましい本発明による医薬組成物は、関節内への浸潤による、眼への投与、例えば点眼剤および眼軟膏、による、ならびに局所投与による使用に好適な組成物である。
【００３７】
好ましくは、本発明の組成物は水分散液の形態である。
前記分散液は、生理的なｐＨを有する緩衝溶液中にあるのが好ましく、ｐＨ７．４の緩衝溶液、例えばイタリア薬局方第１１版に従って調製されたリン酸緩衝生理食塩水溶液中、にあるのがいっそう好ましい。
【００３８】
特に好ましい一適用によれば、本発明の医薬組成物において、本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物またはその塩は０．５％〜２％ｗ／ｖの範囲の濃度、好ましくは濃度１％ｗ／ｖで存在する。
【００３９】
本発明のもう１つの目的は、好ましくは、関節の炎症性疾患をはじめとする炎症性疾患、特に変形性関節症および慢性関節リウマチを処置するための医薬を製造するための本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物またはその塩の使用である。
また、本発明のさらなる目的は、組織修復のための医薬を製造するための本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物またはその塩の使用であり、前記組織は軟骨または皮膚である。
【００４０】
さらに、本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物またはその塩は、生体材料、例えば創傷または火傷を処置するためのガーゼ、ならびに火傷の処置およびインプラント学で用いられる細胞増殖のためのマトリックスを製造するために使用することができる。
以下、実施例ならびに図によって本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００４１】
実施例１
レインの酸塩化物の製造
レイン（Ａｌｄｒｉｃｈから供給）（２１．５ｍｇ；０．０７５ｍｍｏｌ）を、５０ｍｌ丸底フラスコに入れ、そこへＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍｌ）を加えた。この懸濁液は橙色に変化した。次に、ＳＯＣｌ２（０．５ｍｌ；６．９ｍｍｏｌ）を懸濁液へ加えた。反応を、不活性雰囲気中（Ｎ２）で還流下（５０℃）で攪拌しながら行った。反応混合物を還流下で３時間放置したところ、溶液は透明な橙黄色に変化した。ＣＨ２Ｃｌ２および過剰な未反応のＳＯＣｌ２を除去するため、トルエン（約５ｍｌ）を添加し、混合物を６．６×１０４Ｐａに相当する５００ｍｍＨｇで少なくとも４回蒸留して、レインの粗酸塩化物２３ｍｇを得た（収量：定量的）。生成物をＴＬＣ（酢酸エチル）により同定した。
【００４２】
実施例２
ＨＡ−Ｒｅ化合物の製造
ヒアルロン酸（Ｆｉｄｉａ Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ ＳｐＡ−Ａｂａｎｏ Ｔ．ＰＤ提供；平均分子量約６００，０００Ｄａ）（２７７．３ｍｇ；４．６×１０−４ｍｍｏｌ；０．７５ｍｅｑ．のエステル化可能な第一級アルコール単位に相当）を、シクロヘキサン（２０ｍｌ）中に懸濁した。最少量のＣＨ２Ｃｌ２に溶解した、実施例１に記載されるように製造したレインの酸塩化物（２１．５ｍｇ；０．０７５ｍｍｏｌ）を加えた。次に、Ｅｔ３Ｎ（３ｍｌ）を加えた。懸濁液は赤色に変化した。不活性雰囲気中（Ｎ２）で還流下で（７０℃）攪拌しながら反応を行った。短時間の後、懸濁液は赤橙色に変化し、約３時間後に褐変した。２０時間後、反応を停止し、溶媒を減圧下（６５０ｍｍＨｇ、８．７×１０４Ｐａに相当）で蒸発乾固し、透明な黄色の沈殿物の形でＨＡ−Ｒｅ化合物を得た。
【００４３】
実施例３
ＨＡ−Ｒｅ化合物の精製
ａ）サンプルの調製
ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水溶液（５ｍｌ）を、実施例２に記載されるように得たＨＡ−Ｒｅ化合物（０．１０１９ｇ）に加えた。２相の系が得られ、溶液は橙黄色に変化し、一方、残りの部分はゼラチン状の粘度を有する（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）黄褐色塊を呈した。少なくとも２４時間待った後、褐色の粘稠なコロイド状の系を得た。
【００４４】
ｂ）精製
透析膜「Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）３．５Ｋ」（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ ＵＳＡ）を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いて適当な方法で水和させた。製造者の説明書に従って、精製する好適な量のＨＡ−Ｒｅ化合物を導入した。透析をｐＨ７．４のリン酸緩衝液で２時間行った（わずか２０分後、緩衝溶液はわずかに黄色く見えた）。この操作を、緩衝溶液が無色を維持するまで少なくとも３回繰り返し、可視スペクトルで吸収のないことを確認した。精製したＨＡ−Ｒｅ化合物を透析によって膜から回収した。このようにして得られたＨＡ−Ｒｅ化合物の純度は９９．８％であった。
【００４５】
実施例４
得られた本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の分析
１）ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を用いる試験
実施例３に記載されるようにして得た精製されたＨＡ−Ｒｅ化合物中のレインの濃度を、１０−５〜１０−３の範囲での「ロバスト(robust)」較正に基づいて４３０ｎｍで分光光度を読み取ることによって評価した（Ｒ２＝０．９９９９）。この波長を選択したのは、レインの定量的測定を困難にするＵＶ域でのヒアルロン酸の吸収がないためである。分光光度の測定値を基にすると、レインに基づくエステル化反応の収率は５８％であることが分かった。
実施例２を考慮して、最高１０％のヒアルロン酸のエステル化可能な一次アルコール基をエステル化するために、この反応で用いたレインの量を選択した。レインに基づくエステル化反応の収率が５８％であることが分かったことから、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の５．８％がエステル化されたと推定できる。
【００４６】
２）１Ｈ−ＮＭＲ分析
実施例２で得たＨＡ−Ｒｅ化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ ＶＲＸ３００分光計を用いて重水素化緩衝溶液中で行った。しかし、このスペクトルの解釈時に問題に突き当たった。ヒアルロン酸と反応するレインの割合では、芳香環を同定することができなかった。水性環境中でレインの溶解性が乏しいことを考慮し、エステル化が可逆反応であることを考えて、ＨＡ−Ｒｅ化合物からレインを得ることのできるように、鹸化、すなわち塩基性加水分解を行った。得られた鹸化化合物を沈殿させた。このようにして得た鹸化化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ ＶＲＸ３００分光計を用いてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で行った。得られたスペクトルを図１に示すが、これはレインのものと完全に一致した。
【００４７】
３）Ｉ．Ｒ分析
Ｉ．Ｒ．スペクトルをＮｕｊｏｌ法で本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の鹸化から得た化合物について実行した（スペクトルＢＸ ＦＴ−ＩＲシステム、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒを使用）。図２に示されるように、得られたスペクトルは純粋なレインのものと一致する。
【００４８】
４）ＨＰＬＣ−ＭＳ
ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を、本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の鹸化により得られた化合物について流速０．８ｍｌ／分にて２．５％ギ酸を含有するメタノール／水 ８０：２０混合物を移動相として用いて行った（アジレント１１００シリーズＬＣ／ＭＳＤ装置を使用）。図３に示すように、化合物の質量はレインの質量に一致する。
【００４９】
実施例５
本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の技術的特性の評価
１）加水分解安定性の評価
実施例２で得たような、透析によって精製されていない本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物を、周囲温度（２２℃）の暗所で、バイアル中、乾燥状態で６ヶ月を超えて保存した。次に、このサンプルを実施例３に記載のように透析によって精製し、レインの濃度をＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を用いて評価した。濃度は、合成した生成物で直ちに得たものと等しいことが見出された。従って、この実験結果から、乾燥した状態では分解が見られないことが示された。さらに、実施例２に記載のように製造され、実施例３に記載のように透析によって精製された本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物を、温度４℃の暗所で、バイアル中、ｐＨ７．４の２％リン酸緩衝液溶液中で６ヶ月間保存した。非滅菌材料の使用、および防腐剤を用いていないという事実のため、異物の存在がサンプル中に見られた。サンプルを、実施例３に記載のものと同じ方法を用いて再度透析に付し、それを少なくとも４日間透析した。ＵＶ−ＶＩＳ試験によって、透析に用いられた種々の緩衝溶液中に遊離したレインを見出すことはできなかった。従ってこの場合も、ＨＡ−Ｒｅ化合物から、少なくとも現在の分析技術を用いて明確に実証できる、いかなるレインの遊離も見出されなかったので、この化合物は化学的に安定であることが示された。従って、溶液中でさえも加水分解は全く観察されなかった。
【００５０】
得られた結果から、本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物は水溶液中で冷蔵条件下（４℃±０．５℃）で少なくとも２４ヶ月間安定しているということができる。このことは、注目される加水分解が起こらないことから導かれたものである。
【００５１】
さらに、レインとのエステル化反応中にヒアルロン酸の加水分解が起こる可能性を除外するため、前記反応の空試験を行った。特に、レインとヒアルロン酸とを結合する反応と同じ条件を用いたが、但し前記レインの不在下で用いた。詳細には、ヒアルロン酸（１００ｍｇ）を、シクロヘキサン（１０ｍｌ）、ジクロロメタン（１ｍｌ）およびトリエチルアミン（１ｍｌ）の混合物中へ加え、不活性雰囲気中（Ｎ２）で還流下（７０℃）で２４時間反応を行った。そしてこの時間を経過するとすぐに、反応溶媒を窒素雰囲気下で除去した。得られた化合物は、自然な状態でヒアルロン酸よりもずっと水に溶けにくく、２４時間の分散の後に粘度が測定できないことを特徴とする。これは水溶性となり、従って粘度が低下したことから、解重合を除外できることを意味する。
【００５２】
最後に、実施例３で得たように精製された本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の加水分解安定性を滅菌の点から確認した。上述のように、非滅菌材料の使用および防腐剤が用いられていない事実が、結果として本発明の化合物のサンプル中の異物の存在につながったことが分かっている。詳細には、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水溶液中、透析膜を用いて精製された本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の１％溶液を調製した。ヒアルロン酸が熱感受性分子であることを示した実験に基づく証拠を得たので(Biomaterials 23(2002) 4503-4513)、このようにして得たサンプルを、加圧飽和蒸気を用いてオートクレーブ中で１２１℃で２０分間滅菌した。次に、透析された液体中のレインの存在を評価するため、サンプルを再度透析膜での透析に付したが、レインの痕跡は見られなかった。これらの結果から、サンプルが熱殺菌に関して加水分解的に安定しているという結論が導き出せる。
【００５３】
２）流体力学的特性およびシリンジアビリティ(syringeability)の分析
本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物のシリンジアビリティを高分子量および低分子量双方のヒアルロン酸のものと比較して分析した。
【００５４】
特に、以下の３種類のサンプルを調製した。
ａ）リン酸緩衝生理食塩水溶液、ｐＨ７．４中の高分子量ヒアルロン酸の１％ｗ／ｖ溶液（平均分子量約１，２００，０００）
ｂ）リン酸緩衝生理食塩水溶液、ｐＨ７．４中の低分子量ヒアルロン酸の１％ｗ／ｖ溶液（平均分子量約６００，０００）
ｃ）リン酸緩衝生理食塩水溶液、ｐＨ７．４中の本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の１％ｗ／ｖ溶液
次に、サンプルの粘度をＶＩＳＣＯＭＡＴＥモデルＶＭ−１０Ａを用いて測定し（ガラス製バイアル：３ｍｌ；攪拌条件なし；温度２０±０．２℃）、以下の数値：
ａ）η＝７８．４ｍＰａ・ｓ
ｂ）η＝６４．８ｍＰａ・ｓ
ｃ）η＝４７．９ｍＰａ・ｓ
を得た。
【００５５】
得られた結果は、本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物が自然な状態で高分子量と低分子量の双方のヒアルロン酸よりも優れたシリンジアビリティを有することを示す。これは、本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の１％ｗ／ｖ溶液が低分子量ヒアルロン酸の１％ｗ／ｖ溶液よりも低い粘度を有し、それは順に高分子量ヒアルロン酸の１％ｗ／ｖ溶液よりも低い粘度を有するためである。
【００５６】
観察された粘度の低下は、エステル化反応後にヒアルロン酸の解重合反応が存在しないことを証明するもので、レインとヒアルロン酸との間の共有結合相互作用によるものでありうる。
【００５７】
実施例６
本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物のイン・ビトロ薬理活性の評価
正常の軟骨組織生検を、外傷性骨折の結果としての臀部または大腿骨手術中に５名の個体（男性３名および女性２名、平均年齢：５９．３±５．１歳）から得た。この研究に選択された被験者は炎症性疾患または関節疾患の生化学的または臨床的徴候を示さず、肉眼レベルでも顕微鏡レベルでも正常な軟骨を提示した。軟骨を滅菌状態で回収し、直ちに軟骨細胞単離の処理を行った。サンプルは、最初に付着した筋肉組織、結合組織、または肋軟骨下骨組織を取り除き、次に１〜３ｍｍ３断片へ刻み、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）中ですすいだ。次に、３７℃にて６０〜７５分の０．２５％トリプシン、４００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩ、１０００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩＩおよび１ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼでの反復酵素消化により単一の軟骨細胞が遊離した。この細胞をプールし、ＰＢＳ中で十分に洗浄し、３５ｍｍプレートに高密度で播種した（４５×１０３細胞／ｃｍ２）。培地は、１０％ＦＣＳを添加したクーンの改変ハムＦ１２培地であった（Ｍａｓｃｉａ Ｂｒｕｎｅｌｌｉ， Ｍｉｌａｎｏ， Ｉｔａｌｙ）。軟骨細胞表現型の維持を、培養上清のペプシン消化後のＩＩ型コラーゲンの検出により推定した。細胞生存度をトリパンブルー排除試験により評価した。細胞の複製を、規則的な間隔での培養物のトリプシン処理および細胞数の定量により判定した。初代培養が密集に達した時に刺激実験を行った（継代数０）。次に、細胞をアスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）の存在下で２日間培養し、その後、種々の濃度のヒアルロン酸（ＨＡ）、本発明の化合物（ＨＡ−Ｒｅ）またはレインを添加して、または添加せずに、（ｒｈ）ＩＬ−１β（５ｎｇ／ｍｔ）の存在下または不在下で２０時間インキュベートした。
【００５８】
ヒアルロン酸とレインの双方ともに、軟骨の異化作用に関与するメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の活性を阻害するそれらの能力のため、変形性関節症において有益な効果を有することが報告されている。
【００５９】
ヒト軟骨細胞におけるＭＭＰ発現への種々の化合物の効果を調査するため、本発明者らはリアルタイム−ＰＣＲ検定を行った。全ＲＮＡを、トリゾール（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を製造者の説明書に従って用い、培養されたヒト軟骨細胞から抽出した。ｃＤＮＡのストランドを、１μｇの全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて合成した。プライマーは以下の通りであった。
ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ）センス：５’−ＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＣ−３’
アンチセンス：５’−ＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＣＣＧＡＧ−３（断片サイズ４２８ｂｐ）；
ＭＭＰ−３（ストロメリシン）センス：５’−ＣＣＴＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＡＴＴＧＡ−３’、
アンチセンス：５’−ＧＡＡＡＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＧＴ−３’（断片サイズ４４０ｂｐ）；
グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、
センス：５’−ＣＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’；
アンチセンス：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡ（断片サイズ５９８ｂｐ）
【００６０】
ｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）において６０〜６４℃で４５サイクル増幅を行い、データをｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ Ｏｐｔｉｃａｌシステムソフトウエアを用いて分析した。各サンプルにおける相対発現を、対照としてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ効率に基づく数学的方法により計算した。全てのサンプルを３回ずつ検定した。４５増幅サイクルの後、閾値サイクル値を自動計算し、４桁の範囲にわたる標準曲線から出発ｃＤＮＡのフェムトグラムを計算した。ＭＭＰとＧＡＰＤＨの双方の標準曲線は反応２５μｌあたり１〜１０００フェムトグラムの範囲であった。ＧＡＰＤＨ出発量に対するＭＭＰの比を計算した。種々の実験の変数と当該対照との間の結果の統計上の差をスチューデントのｔ検定を用いて分析した。
【００６１】
図４および５は、ＲＴ−ＰＣＲ実験で得られた結果を示したものである。
サンプルは総て３回ずつ検定した。各実験において、ＭＭＰ ｍＲＮＡ発現の変化を未処理細胞のものと比較した増加倍率で表した。３回の実験の平均および標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定を用いて種々の処置の効果の有意性を判断した。また、処置群と対照群の統計上の差は、
＊＝ｐ＜０．０１； ＊＊＝ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）
でも表す。
【００６２】
ＩＬ−１処置は、ＭＭＰ−１とＭＭＰ−３双方の発現に劇的な増加をもたらし、これは文献のデータに一致した。図４に報告される実験において、本発明者らは文献中で一般に報告される薬理学的濃度（１ｍｇ／ｍｌ）でのＨＡの効果を同じ濃度（１ｍｇ／ｍｌ）でのＨＡ−Ｒｅ（本発明の化合物）の効果と比較した。０．１〜１．５ＨＡ濃度範囲で同様の結果が得られた。ヒト軟骨細胞を薬理学的用量（１ｍｇ／ｍｌ）でＨＡに曝露すると、ＩＬ１によるＭＭＰ１およびＭＭＰ２の誘導を有意に阻害することができた（図４ＡおよびＢ）。驚くべきことに、同等用量の本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物が、さらにいっそう劇的な保護効果をもたらし、ＩＬ１の曝露にもかかわらずＭＭＰ発現を定常レベルにまで戻った。図５は、薬理学的用量（１０μＭ）でのレインの効果を同等用量のＨＡ−Ｒｅの効果と比較した実験の結果を示したものである。やはりＨＡ−Ｒｅ（本発明の化合物）は、ＩＬ１に誘導されるＭＭＰ発現のダウンレギュレーションの実現にＲｅ単独よりもいっそう強力であると思われる。
【００６３】
実施例７
本発明によるＨＡ−Ｒｅのさらなる合成は、レインおよびヒアルロン酸の第一級アルコール基に基づくヒアルロン酸の化学量的濃度に相当する、２０ｍｇのヒアルロン酸および２３ｍｇのレインの酸塩化物を用いたこと以外は、実施例２のようにして行った。
【００６４】
図６はこのようにして得た本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。エステル官能基に特有の１７５ｐｐｍでの特徴的なピークが明確に現れている。
【００６５】
図７はこのようにして得た本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。レインの芳香環に特有の７〜８ｐｐｍの間での特徴的なピークが明確に現れている。
【００６６】
従って、本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物におけるこれら２つのＮＭＲスペクトルからレインがヒアルロン酸のアルコール基をエステル化することが明確に現れている。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の鹸化により得られたレインの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の鹸化により得られたレインのＩ．Ｒ．スペクトルを示す。
【図３】本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の鹸化により得られたレインのＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。
【図４】薬理学的濃度でのヒアルロン酸の効果を、同じ濃度での本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の効果と比較したＲＴ−ＰＣＲ実験で得られた結果を示す。
【図５】薬理学的用量でのレインの効果を、同等用量の本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の効果と比較したＲＴ−ＰＣＲ実験の結果を示す。
【図６】本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図７】本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、レインを含むヒアルロン酸（ＨＡ）のエステル、より詳しくはヒアルロン酸のアルコール基がレインでエステル化されている、ヒアルロン酸に基づく化合物、前記化合物の製造方法、および前記化合物を含んでなる医薬組成物に関する。
【従来の技術】
【０００２】
レイン（ｒｈｅｉｎ）は、抗炎症特性および組織保護特性を有するセンナに由来するアルカロイドである。
【０００３】
レインは、化学名が４，５−ジヒドロキシ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸であって、以下の一般式（Ｉ）
【化１】
（式中、ＲはＨである）
を有する。
【０００４】
この物質は、通常、Ｒ基のそれぞれがアセチル基である上記一般式（Ｉ）の誘導体ジアセチルレインとして経口経路より投与され、バイオアベイラビリティが高く、主に関節の炎症を処置する際に用いられる。
【０００５】
しかし、レインとジアセチルレインの双方ともに相当な緩下作用を有するという欠点を示し、下痢さえ引き起こすこともあるので、高齢または衰弱した患者にはその使用を勧められない。
【０００６】
さらに、レインおよびジアセチルレインが水に溶解しないため、これらの有効成分を非経口または関節内経路によって投与することによってこの副作用を未然に防ぐことができない。
【０００７】
ヒアルロン酸は、１３×１０６ダルトンまでの分子量を有する直鎖を形成する以下の一般式
【化２】
に示されるようなＤ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンからなる交互単位から形成される天然のムコ多糖である。
【０００８】
ヒアルロン酸は、生物のあらゆる軟組織および多くの生理液、例えば、関節の滑液および眼の硝子体液など、に存在する。
ヒアルロン酸は、その酸性形態または塩形態で多くの臨床応用に用いられている。
【０００９】
特に、ヒアルロン酸は関節の炎症での使用に優れた効果がある。ヒアルロン酸は関節内へ直接浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により投与され、二重の機構、つまり、一方では関節の炎症を低下させ、他方では滑液の粘度を増加させること、によって作用する。その結果軟骨はいっそう滑らかになり、軟骨に有益となる。
【００１０】
ヒアルロン酸は、眼科にも適用可能であり、その保護特性および抗炎症特性のために、また軟骨および皮膚での同化−再構成作用によって組織修復のために用いられている。
しかし、ヒアルロン酸は分解されやすいことが知られている。
【００１１】
ヒアルロン酸の分解は、ｐＨ条件および陽イオン濃度にもよるが、加水分解によって引き起こされることが報告されている［例えば、Uchiyama H. et al. J. Biol. Chem. 1990; 265: 7753-7759; Tokita Y. and Okamoto A., Polymer Degr. and Stab. 1995; 48: 269-273; Hawkins C. L. and Davies M. J. Free Rad. Biol. Med. 1998; 24: 1396-1410; Schiller J. et al. Current Med. Chem. 2003; 10: 2123-2145参照]。
【００１２】
広範囲な研究の後、本発明者らは、レインでエステル化されたアルコール基を有するヒアルロン酸が、ヒアルロン酸よりも驚くほど高い安定性を有すること、およびさらに用いられたヒアルロン酸とレインに関して別々に観察されたものに比べて改善された薬理活性を有することを見出した。
【００１３】
さらに、本発明者らは、レインでエステル化されたアルコール基を有するヒアルロン酸は局所投与によって有利に用いることができること、その結果レインの経口投与に付随する欠点を回避することができることを見出した。
本発明はこれらの結果を基にして達成された。
【発明の概要】
【００１４】
第一の態様によれば、本発明は、ヒアルロン酸のアルコール基がレインそれ自体または誘導体形でエステル化されており、ヒアルロン酸よりも安定性が高いだけでなく、用いられるヒアルロン酸とレインに関して別々に観察されたものと比べて薬理活性の改善された、さらに局所投与に使用できるためレインの経口投与に付随する欠点を回避することのできる、ヒアルロン酸に基づく化合物またはその塩に関する。
【００１５】
第二の態様によれば、本発明は、レインの酸塩化物をそれ自体または誘導体形でヒアルロン酸と反応させることを含んでなる、第１の態様の化合物またはその塩を製造するための方法に関する。
【００１６】
第三の態様によれば、本発明は、第１の態様の化合物またはその塩を、好適な賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて含んでなる医薬組成物に関する。
もう１つの態様によれば、本発明は、第３の態様の組成物によって形成されるヒト用または獣医学用の医薬品または医療機器に関し、また、炎症性疾患を処置するため、または組織修復のための医薬を製造するため、あるいは生体材料を製造するための、第１の態様の化合物またはその塩の使用に関する。
本発明のその他の利点は以下の詳細な説明で明らかとなる。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明は、ヒアルロン酸のアルコール基がレインそれ自体または誘導体形でエステル化されているヒアルロン酸に基づく化合物またはその塩を提供する。
本明細書において、本発明の化合物は「ＨＡ−Ｒｅ化合物」とも表される。
【００１８】
本明細書および特許請求の範囲において、「レイン」とは、レインそれ自体または誘導体形を意味することに留意すべきである。
本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物の塩は、薬学上許容される塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、または他の通常の薬学上許容される塩、を含むのが好ましく、ナトリウム塩がいっそう好ましい。
【００１９】
本発明によれば、レインの「誘導体形」には、イン・ビボで薬理学的に活性であり、そこでレインの酸性基がヒアルロン酸のヒドロキシル基とのエステル結合の形成に利用可能であるいずれのレイン誘導体も含まれる。
前記アントラキノンをイン・ビボで利用可能とするレインの誘導体が好ましい。
【００２０】
本発明による誘導体形のレインの例としては、次式
【化３】
（式中、Ｒは独立に任意の適当なヒドロキシ保護基、好ましくはアシル基、例えばアセチル、プロピオニル、ブチリルまたはピバロイル基であるが、これらに限定されるものではない）
で表されるレインが挙げられる。
本発明の好ましい実施形態では、レインは誘導体形であり、より好ましくは、ジアセチルレインである。
【００２１】
本発明によれば、レインは、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の少なくとも５％をエステル化するのが好ましく、５〜５０％の間がいっそう好ましく、５〜２０％の間がさらにいっそう好ましい。
【００２２】
特に好ましいものとしては、レインが、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の１０％をエステル化する化合物である。
前記ＨＡ−Ｒｅ化合物は、本発明による方法によって製造でき、この方法は、好ましくはレインの酸塩化物のｍｍｏｌとヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール単位のｍｅｑ．との間の百分率比が５％より大きい、いっそう好ましくは５％〜５０％の間、さらにいっそう好ましくは５％〜２０％の間、ならびに特に好ましい実施形態に従って１０％であるような量で、レインの酸塩化物とヒアルロン酸とを反応させることを含んでなる。
【００２３】
選択された方法は、残留溶媒の許容性に応じて溶媒の選択を十分に考慮したものである（ＩＣＨ−日・米・ＥＵ医薬品規制調和国際会議(International Conference of Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)）。
【００２４】
好ましくは、上述の本発明による方法は、以下の工程：
ａ）非プロトン性非極性溶媒中、ヒアルロン酸の懸濁液を調製する工程、
ｂ）最少量の非プロトン性非極性溶媒中に溶解したレインの酸塩化物および水素イオンアクセプターを添加する工程、
ｃ）エステル化反応が行われるのに十分な時間、還流下で混合物を攪拌させておく工程、および
ｄ）溶媒を蒸発除去する工程、
を含んでなる。
【００２５】
工程ａ）において使用できる非プロトン性非極性溶媒の例としては、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、トルエン、ジクロロメタン、ｎ−ヘキサンが挙げられ、シクロヘキサンがより好ましい。
【００２６】
レインの酸塩化物を溶解させるために用いてよい非プロトン性非極性溶媒は、限定されるものではないが、好ましくは、工程ａ）において用いたものと同じものを選択するのが好ましい。
【００２７】
工程ｂ）において添加してよい水素イオンアクセプターの例としては、ピリジン、トリエチルアミンが挙げられ、Ｅｔ３Ｎがより好ましい。
反応を還流下で放置しておく時間は、限定されるものではないが、少なくとも２０時間が好ましい。
【００２８】
本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物を製造するために用いられるヒアルロン酸は、分子量５００，０００〜３，０００，０００Ｄａが好ましく、約６００，０００ Ｄａがより好ましい。
ヒアルロン酸の分子量は、従来の方法に従って、例えばゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定できる。
【００２９】
本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物を製造するために用いられるヒアルロン酸は、市販のものであってもよいし（例えばＦｉｄｉａ Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ ＳｐＡ−Ａｂａｎｏ Ｔ．ＰＤ提供）、または例えば、鶏冠からの抽出によるか、ムチン層を有する細菌の発酵によるか、または他の従来の方法によって製造することもできる［Proteoglycan Protocols, Humana Press, R. V. lozzo Ed. Totowa, 2001参照］。
【００３０】
本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物を製造するための方法に用いてよいレインの酸塩化物は、以下の工程：
ａ’）非プロトン性非極性溶媒中、レインの懸濁液を調製する工程；
ｂ’）ＳＯＣｌ２とレインとの間のモル比が１０より大きくなるような量のＳＯＣｌ２を添加する工程；
ｃ’）不活性雰囲気下でレイン酸塩化物が形成されるのに十分な時間、還流下で反応を攪拌させておく工程；および
ｄ’）溶媒および過剰な未反応のＳＯＣｌ２を蒸留によって除去する工程
を含んでなる方法によって得ることができる。
【００３１】
工程ａ’）において使用できる非プロトン性非極性溶媒の例としては、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、トルエン、ジクロロメタン、ｎ−ヘキサンが挙げられ、塩化物溶媒が好ましく、ＣＨ２Ｃｌ２がより好ましい。
工程ｃ’）において還流下で反応を放置する時間は限定されるものではないが、少なくとも３時間が好ましい。
【００３２】
工程ａ’）においてレインの酸塩化物を製造するために用いてよい、レインそれ自体または誘導体形は、市販のものであってもよいし（例えばＡｌｄｒｉｃｈ製）または従来法に従って合成してもよい［Nawa H et al. J. Org. Chem. 1961; 26: 979-981および、本明細書中で報告されている参考文献； Smith C. W. et al. Tetrahedron Lett. 1993; 34: 7447-7450; Gallagher P. T. et al. Tetrahedron Lett. 1994; 35: 289-292参照］。
【００３３】
特に好ましい一適用によれば、本発明による方法を用いて得られた本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物は精製される。
この精製は、透析膜を用いて行われるのが好ましい。
この場合、後に続く実施例に記載されるように、優先されるのは、「Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ ３．５Ｋ」（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ ＵＳＡ）という商標名で市販されている透析膜を製造者の説明書に従って用いることである。
【００３４】
上記ですでに述べたように、本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物は有利な高い安定性を有し、例えばイタリア薬局方第１１版(Official Italian Pharmacopoeia, XI edition)に従って調製されたリン酸緩衝生理食塩水溶液など、好ましくはｐＨ７．４で緩衝されている水溶液中で、４℃±０．５℃の温度で少なくとも３６ヶ月間安定している。
【００３５】
本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物は、皮膚および軟骨のための抗炎症特性、治癒特性、再構成特性およびタンパク同化特性を有する。
従って、本発明はまた、本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物を、好適な賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて含んでなる医薬組成物に関する。
特に、本発明による医薬組成物は、ヒト用および獣医学用の医療機器および／または医薬品でありうる。
【００３６】
本発明による医薬組成物は、局所領域的な投与に好適な処方物を有するのが好ましい。
特に好ましい本発明による医薬組成物は、関節内への浸潤による、眼への投与、例えば点眼剤および眼軟膏、による、ならびに局所投与による使用に好適な組成物である。
【００３７】
好ましくは、本発明の組成物は水分散液の形態である。
前記分散液は、生理的なｐＨを有する緩衝溶液中にあるのが好ましく、ｐＨ７．４の緩衝溶液、例えばイタリア薬局方第１１版に従って調製されたリン酸緩衝生理食塩水溶液中、にあるのがいっそう好ましい。
【００３８】
特に好ましい一適用によれば、本発明の医薬組成物において、本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物またはその塩は０．５％〜２％ｗ／ｖの範囲の濃度、好ましくは濃度１％ｗ／ｖで存在する。
【００３９】
本発明のもう１つの目的は、好ましくは、関節の炎症性疾患をはじめとする炎症性疾患、特に変形性関節症および慢性関節リウマチを処置するための医薬を製造するための本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物またはその塩の使用である。
また、本発明のさらなる目的は、組織修復のための医薬を製造するための本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物またはその塩の使用であり、前記組織は軟骨または皮膚である。
【００４０】
さらに、本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物またはその塩は、生体材料、例えば創傷または火傷を処置するためのガーゼ、ならびに火傷の処置およびインプラント学で用いられる細胞増殖のためのマトリックスを製造するために使用することができる。
以下、実施例ならびに図によって本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００４１】
実施例１
レインの酸塩化物の製造
レイン（Ａｌｄｒｉｃｈから供給）（２１．５ｍｇ；０．０７５ｍｍｏｌ）を、５０ｍｌ丸底フラスコに入れ、そこへＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍｌ）を加えた。この懸濁液は橙色に変化した。次に、ＳＯＣｌ２（０．５ｍｌ；６．９ｍｍｏｌ）を懸濁液へ加えた。反応を、不活性雰囲気中（Ｎ２）で還流下（５０℃）で攪拌しながら行った。反応混合物を還流下で３時間放置したところ、溶液は透明な橙黄色に変化した。ＣＨ２Ｃｌ２および過剰な未反応のＳＯＣｌ２を除去するため、トルエン（約５ｍｌ）を添加し、混合物を６．６×１０４Ｐａに相当する５００ｍｍＨｇで少なくとも４回蒸留して、レインの粗酸塩化物２３ｍｇを得た（収量：定量的）。生成物をＴＬＣ（酢酸エチル）により同定した。
【００４２】
実施例２
ＨＡ−Ｒｅ化合物の製造
ヒアルロン酸（Ｆｉｄｉａ Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ ＳｐＡ−Ａｂａｎｏ Ｔ．ＰＤ提供；平均分子量約６００，０００Ｄａ）（２７７．３ｍｇ；４．６×１０−４ｍｍｏｌ；０．７５ｍｅｑ．のエステル化可能な第一級アルコール単位に相当）を、シクロヘキサン（２０ｍｌ）中に懸濁した。最少量のＣＨ２Ｃｌ２に溶解した、実施例１に記載されるように製造したレインの酸塩化物（２１．５ｍｇ；０．０７５ｍｍｏｌ）を加えた。次に、Ｅｔ３Ｎ（３ｍｌ）を加えた。懸濁液は赤色に変化した。不活性雰囲気中（Ｎ２）で還流下で（７０℃）攪拌しながら反応を行った。短時間の後、懸濁液は赤橙色に変化し、約３時間後に褐変した。２０時間後、反応を停止し、溶媒を減圧下（６５０ｍｍＨｇ、８．７×１０４Ｐａに相当）で蒸発乾固し、透明な黄色の沈殿物の形でＨＡ−Ｒｅ化合物を得た。
【００４３】
実施例３
ＨＡ−Ｒｅ化合物の精製
ａ）サンプルの調製
ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水溶液（５ｍｌ）を、実施例２に記載されるように得たＨＡ−Ｒｅ化合物（０．１０１９ｇ）に加えた。２相の系が得られ、溶液は橙黄色に変化し、一方、残りの部分はゼラチン状の粘度を有する（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）黄褐色塊を呈した。少なくとも２４時間待った後、褐色の粘稠なコロイド状の系を得た。
【００４４】
ｂ）精製
透析膜「Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）３．５Ｋ」（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ ＵＳＡ）を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水溶液を用いて適当な方法で水和させた。製造者の説明書に従って、精製する好適な量のＨＡ−Ｒｅ化合物を導入した。透析をｐＨ７．４のリン酸緩衝液で２時間行った（わずか２０分後、緩衝溶液はわずかに黄色く見えた）。この操作を、緩衝溶液が無色を維持するまで少なくとも３回繰り返し、可視スペクトルで吸収のないことを確認した。精製したＨＡ−Ｒｅ化合物を透析によって膜から回収した。このようにして得られたＨＡ−Ｒｅ化合物の純度は９９．８％であった。
【００４５】
実施例４
得られた本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の分析
１）ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を用いる試験
実施例３に記載されるようにして得た精製されたＨＡ−Ｒｅ化合物中のレインの濃度を、１０−５〜１０−３の範囲での「ロバスト(robust)」較正に基づいて４３０ｎｍで分光光度を読み取ることによって評価した（Ｒ２＝０．９９９９）。この波長を選択したのは、レインの定量的測定を困難にするＵＶ域でのヒアルロン酸の吸収がないためである。分光光度の測定値を基にすると、レインに基づくエステル化反応の収率は５８％であることが分かった。
実施例２を考慮して、最高１０％のヒアルロン酸のエステル化可能な一次アルコール基をエステル化するために、この反応で用いたレインの量を選択した。レインに基づくエステル化反応の収率が５８％であることが分かったことから、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の５．８％がエステル化されたと推定できる。
【００４６】
２）１Ｈ−ＮＭＲ分析
実施例２で得たＨＡ−Ｒｅ化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ ＶＲＸ３００分光計を用いて重水素化緩衝溶液中で行った。しかし、このスペクトルの解釈時に問題に突き当たった。ヒアルロン酸と反応するレインの割合では、芳香環を同定することができなかった。水性環境中でレインの溶解性が乏しいことを考慮し、エステル化が可逆反応であることを考えて、ＨＡ−Ｒｅ化合物からレインを得ることのできるように、鹸化、すなわち塩基性加水分解を行った。得られた鹸化化合物を沈殿させた。このようにして得た鹸化化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ ＶＲＸ３００分光計を用いてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で行った。得られたスペクトルを図１に示すが、これはレインのものと完全に一致した。
【００４７】
３）Ｉ．Ｒ分析
Ｉ．Ｒ．スペクトルをＮｕｊｏｌ法で本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の鹸化から得た化合物について実行した（スペクトルＢＸ ＦＴ−ＩＲシステム、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒを使用）。図２に示されるように、得られたスペクトルは純粋なレインのものと一致する。
【００４８】
４）ＨＰＬＣ−ＭＳ
ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を、本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の鹸化により得られた化合物について流速０．８ｍｌ／分にて２．５％ギ酸を含有するメタノール／水 ８０：２０混合物を移動相として用いて行った（アジレント１１００シリーズＬＣ／ＭＳＤ装置を使用）。図３に示すように、化合物の質量はレインの質量に一致する。
【００４９】
実施例５
本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の技術的特性の評価
１）加水分解安定性の評価
実施例２で得たような、透析によって精製されていない本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物を、周囲温度（２２℃）の暗所で、バイアル中、乾燥状態で６ヶ月を超えて保存した。次に、このサンプルを実施例３に記載のように透析によって精製し、レインの濃度をＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を用いて評価した。濃度は、合成した生成物で直ちに得たものと等しいことが見出された。従って、この実験結果から、乾燥した状態では分解が見られないことが示された。さらに、実施例２に記載のように製造され、実施例３に記載のように透析によって精製された本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物を、温度４℃の暗所で、バイアル中、ｐＨ７．４の２％リン酸緩衝液溶液中で６ヶ月間保存した。非滅菌材料の使用、および防腐剤を用いていないという事実のため、異物の存在がサンプル中に見られた。サンプルを、実施例３に記載のものと同じ方法を用いて再度透析に付し、それを少なくとも４日間透析した。ＵＶ−ＶＩＳ試験によって、透析に用いられた種々の緩衝溶液中に遊離したレインを見出すことはできなかった。従ってこの場合も、ＨＡ−Ｒｅ化合物から、少なくとも現在の分析技術を用いて明確に実証できる、いかなるレインの遊離も見出されなかったので、この化合物は化学的に安定であることが示された。従って、溶液中でさえも加水分解は全く観察されなかった。
【００５０】
得られた結果から、本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物は水溶液中で冷蔵条件下（４℃±０．５℃）で少なくとも２４ヶ月間安定しているということができる。このことは、注目される加水分解が起こらないことから導かれたものである。
【００５１】
さらに、レインとのエステル化反応中にヒアルロン酸の加水分解が起こる可能性を除外するため、前記反応の空試験を行った。特に、レインとヒアルロン酸とを結合する反応と同じ条件を用いたが、但し前記レインの不在下で用いた。詳細には、ヒアルロン酸（１００ｍｇ）を、シクロヘキサン（１０ｍｌ）、ジクロロメタン（１ｍｌ）およびトリエチルアミン（１ｍｌ）の混合物中へ加え、不活性雰囲気中（Ｎ２）で還流下（７０℃）で２４時間反応を行った。そしてこの時間を経過するとすぐに、反応溶媒を窒素雰囲気下で除去した。得られた化合物は、自然な状態でヒアルロン酸よりもずっと水に溶けにくく、２４時間の分散の後に粘度が測定できないことを特徴とする。これは水溶性となり、従って粘度が低下したことから、解重合を除外できることを意味する。
【００５２】
最後に、実施例３で得たように精製された本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の加水分解安定性を滅菌の点から確認した。上述のように、非滅菌材料の使用および防腐剤が用いられていない事実が、結果として本発明の化合物のサンプル中の異物の存在につながったことが分かっている。詳細には、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水溶液中、透析膜を用いて精製された本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の１％溶液を調製した。ヒアルロン酸が熱感受性分子であることを示した実験に基づく証拠を得たので(Biomaterials 23(2002) 4503-4513)、このようにして得たサンプルを、加圧飽和蒸気を用いてオートクレーブ中で１２１℃で２０分間滅菌した。次に、透析された液体中のレインの存在を評価するため、サンプルを再度透析膜での透析に付したが、レインの痕跡は見られなかった。これらの結果から、サンプルが熱殺菌に関して加水分解的に安定しているという結論が導き出せる。
【００５３】
２）流体力学的特性およびシリンジアビリティ(syringeability)の分析
本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物のシリンジアビリティを高分子量および低分子量双方のヒアルロン酸のものと比較して分析した。
【００５４】
特に、以下の３種類のサンプルを調製した。
ａ）リン酸緩衝生理食塩水溶液、ｐＨ７．４中の高分子量ヒアルロン酸の１％ｗ／ｖ溶液（平均分子量約１，２００，０００）
ｂ）リン酸緩衝生理食塩水溶液、ｐＨ７．４中の低分子量ヒアルロン酸の１％ｗ／ｖ溶液（平均分子量約６００，０００）
ｃ）リン酸緩衝生理食塩水溶液、ｐＨ７．４中の本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の１％ｗ／ｖ溶液
次に、サンプルの粘度をＶＩＳＣＯＭＡＴＥモデルＶＭ−１０Ａを用いて測定し（ガラス製バイアル：３ｍｌ；攪拌条件なし；温度２０±０．２℃）、以下の数値：
ａ）η＝７８．４ｍＰａ・ｓ
ｂ）η＝６４．８ｍＰａ・ｓ
ｃ）η＝４７．９ｍＰａ・ｓ
を得た。
【００５５】
得られた結果は、本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物が自然な状態で高分子量と低分子量の双方のヒアルロン酸よりも優れたシリンジアビリティを有することを示す。これは、本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の１％ｗ／ｖ溶液が低分子量ヒアルロン酸の１％ｗ／ｖ溶液よりも低い粘度を有し、それは順に高分子量ヒアルロン酸の１％ｗ／ｖ溶液よりも低い粘度を有するためである。
【００５６】
観察された粘度の低下は、エステル化反応後にヒアルロン酸の解重合反応が存在しないことを証明するもので、レインとヒアルロン酸との間の共有結合相互作用によるものでありうる。
【００５７】
実施例６
本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物のイン・ビトロ薬理活性の評価
正常の軟骨組織生検を、外傷性骨折の結果としての臀部または大腿骨手術中に５名の個体（男性３名および女性２名、平均年齢：５９．３±５．１歳）から得た。この研究に選択された被験者は炎症性疾患または関節疾患の生化学的または臨床的徴候を示さず、肉眼レベルでも顕微鏡レベルでも正常な軟骨を提示した。軟骨を滅菌状態で回収し、直ちに軟骨細胞単離の処理を行った。サンプルは、最初に付着した筋肉組織、結合組織、または肋軟骨下骨組織を取り除き、次に１〜３ｍｍ３断片へ刻み、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）中ですすいだ。次に、３７℃にて６０〜７５分の０．２５％トリプシン、４００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩ、１０００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩＩおよび１ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼでの反復酵素消化により単一の軟骨細胞が遊離した。この細胞をプールし、ＰＢＳ中で十分に洗浄し、３５ｍｍプレートに高密度で播種した（４５×１０３細胞／ｃｍ２）。培地は、１０％ＦＣＳを添加したクーンの改変ハムＦ１２培地であった（Ｍａｓｃｉａ Ｂｒｕｎｅｌｌｉ， Ｍｉｌａｎｏ， Ｉｔａｌｙ）。軟骨細胞表現型の維持を、培養上清のペプシン消化後のＩＩ型コラーゲンの検出により推定した。細胞生存度をトリパンブルー排除試験により評価した。細胞の複製を、規則的な間隔での培養物のトリプシン処理および細胞数の定量により判定した。初代培養が密集に達した時に刺激実験を行った（継代数０）。次に、細胞をアスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）の存在下で２日間培養し、その後、種々の濃度のヒアルロン酸（ＨＡ）、本発明の化合物（ＨＡ−Ｒｅ）またはレインを添加して、または添加せずに、（ｒｈ）ＩＬ−１β（５ｎｇ／ｍｔ）の存在下または不在下で２０時間インキュベートした。
【００５８】
ヒアルロン酸とレインの双方ともに、軟骨の異化作用に関与するメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の活性を阻害するそれらの能力のため、変形性関節症において有益な効果を有することが報告されている。
【００５９】
ヒト軟骨細胞におけるＭＭＰ発現への種々の化合物の効果を調査するため、本発明者らはリアルタイム−ＰＣＲ検定を行った。全ＲＮＡを、トリゾール（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を製造者の説明書に従って用い、培養されたヒト軟骨細胞から抽出した。ｃＤＮＡのストランドを、１μｇの全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて合成した。プライマーは以下の通りであった。
ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ）センス：５’−ＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＣ−３’
アンチセンス：５’−ＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＣＣＧＡＧ−３（断片サイズ４２８ｂｐ）；
ＭＭＰ−３（ストロメリシン）センス：５’−ＣＣＴＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＧＡＡＴＴＧＡ−３’、
アンチセンス：５’−ＧＡＡＡＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＧＴ−３’（断片サイズ４４０ｂｐ）；
グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、
センス：５’−ＣＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’；
アンチセンス：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡ（断片サイズ５９８ｂｐ）
【００６０】
ｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）において６０〜６４℃で４５サイクル増幅を行い、データをｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ Ｏｐｔｉｃａｌシステムソフトウエアを用いて分析した。各サンプルにおける相対発現を、対照としてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ効率に基づく数学的方法により計算した。全てのサンプルを３回ずつ検定した。４５増幅サイクルの後、閾値サイクル値を自動計算し、４桁の範囲にわたる標準曲線から出発ｃＤＮＡのフェムトグラムを計算した。ＭＭＰとＧＡＰＤＨの双方の標準曲線は反応２５μｌあたり１〜１０００フェムトグラムの範囲であった。ＧＡＰＤＨ出発量に対するＭＭＰの比を計算した。種々の実験の変数と当該対照との間の結果の統計上の差をスチューデントのｔ検定を用いて分析した。
【００６１】
図４および５は、ＲＴ−ＰＣＲ実験で得られた結果を示したものである。
サンプルは総て３回ずつ検定した。各実験において、ＭＭＰ ｍＲＮＡ発現の変化を未処理細胞のものと比較した増加倍率で表した。３回の実験の平均および標準偏差を示す。スチューデントの両側ｔ検定を用いて種々の処置の効果の有意性を判断した。また、処置群と対照群の統計上の差は、
＊＝ｐ＜０．０１； ＊＊＝ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）
でも表す。
【００６２】
ＩＬ−１処置は、ＭＭＰ−１とＭＭＰ−３双方の発現に劇的な増加をもたらし、これは文献のデータに一致した。図４に報告される実験において、本発明者らは文献中で一般に報告される薬理学的濃度（１ｍｇ／ｍｌ）でのＨＡの効果を同じ濃度（１ｍｇ／ｍｌ）でのＨＡ−Ｒｅ（本発明の化合物）の効果と比較した。０．１〜１．５ＨＡ濃度範囲で同様の結果が得られた。ヒト軟骨細胞を薬理学的用量（１ｍｇ／ｍｌ）でＨＡに曝露すると、ＩＬ１によるＭＭＰ１およびＭＭＰ２の誘導を有意に阻害することができた（図４ＡおよびＢ）。驚くべきことに、同等用量の本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物が、さらにいっそう劇的な保護効果をもたらし、ＩＬ１の曝露にもかかわらずＭＭＰ発現を定常レベルにまで戻った。図５は、薬理学的用量（１０μＭ）でのレインの効果を同等用量のＨＡ−Ｒｅの効果と比較した実験の結果を示したものである。やはりＨＡ−Ｒｅ（本発明の化合物）は、ＩＬ１に誘導されるＭＭＰ発現のダウンレギュレーションの実現にＲｅ単独よりもいっそう強力であると思われる。
【００６３】
実施例７
本発明によるＨＡ−Ｒｅのさらなる合成は、レインおよびヒアルロン酸の第一級アルコール基に基づくヒアルロン酸の化学量的濃度に相当する、２０ｍｇのヒアルロン酸および２３ｍｇのレインの酸塩化物を用いたこと以外は、実施例２のようにして行った。
【００６４】
図６はこのようにして得た本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。エステル官能基に特有の１７５ｐｐｍでの特徴的なピークが明確に現れている。
【００６５】
図７はこのようにして得た本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。レインの芳香環に特有の７〜８ｐｐｍの間での特徴的なピークが明確に現れている。
【００６６】
従って、本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物におけるこれら２つのＮＭＲスペクトルからレインがヒアルロン酸のアルコール基をエステル化することが明確に現れている。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の鹸化により得られたレインの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の鹸化により得られたレインのＩ．Ｒ．スペクトルを示す。
【図３】本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の鹸化により得られたレインのＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。
【図４】薬理学的濃度でのヒアルロン酸の効果を、同じ濃度での本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の効果と比較したＲＴ−ＰＣＲ実験で得られた結果を示す。
【図５】薬理学的用量でのレインの効果を、同等用量の本発明のＨＡ−Ｒｅ化合物の効果と比較したＲＴ−ＰＣＲ実験の結果を示す。
【図６】本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図７】本発明によるＨＡ−Ｒｅ化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸のアルコール基が、レインそれ自体または誘導体形でエステル化されている、ヒアルロン酸に基づく化合物、またはその塩。
【請求項２】
レインが、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の少なくとも５％をエステル化する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
レインが、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の５％〜５０％をエステル化する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
レインが、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の５％〜２０％をエステル化する、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
レインが、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の１０％をエステル化する、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物のナトリウム塩。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を製造するための方法であって、レインそれ自体または誘導体形の酸塩化物とヒアルロン酸とを反応させることを含んでなる、方法。
【請求項８】
レインの酸塩化物およびヒアルロン酸が、レインの酸塩化物のｍｍｏｌとヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール単位のｍｅｑ．との間の百分率比が少なくとも５％であるような量である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記百分率比が、５％〜５０％の範囲である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記百分率比が、５％〜２０％の範囲である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記百分率比が、１０％である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程：
ａ）非プロトン性非極性溶媒中、ヒアルロン酸の懸濁液を調製する工程；
ｂ）非プロトン性非極性溶媒に溶解したレインの酸塩化物および水素イオンアクセプターを添加する工程；
ｃ）エステル化反応が行われるのに十分な時間、還流下で混合物を攪拌させておく工程；および
ｄ）溶媒を蒸発除去する工程、
を含んでなる、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程ａ）の非プロトン性非極性溶媒が、シクロヘキサンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｂ）において、前記水素イオンアクセプターが、ＮＥｔ３である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｃ）において、反応を還流下で少なくとも２０時間放置しておく、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
レインの酸塩化物を、以下の工程：
ａ’）非プロトン性非極性溶媒中、レインの懸濁液を調製する工程；
ｂ’）ＳＯＣｌ２とレインとの間のモル比が１０より大きくなるような量のＳＯＣｌ２を添加する工程；
ｃ’）不活性雰囲気下でレイン酸塩化物が形成されるのに十分な時間、還流下で反応物を攪拌させておく工程；および
ｄ’）溶媒および過剰な未反応のＳＯＣｌ２を蒸留によって除去する工程
を含んでなる方法によって得る、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程ａ'）の前記非プロトン性非極性溶媒が、塩化物溶媒である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記塩化物溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｃ’）において、反応物を少なくとも３時間還流下で放置する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
精製の最終工程をさらに含んでなる、請求項７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記精製工程が、透析膜を用いて行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を、好適な賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて含んでなる、医薬組成物。
【請求項２３】
局所領域的な投与に好適な処方物を有する、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
関節内浸潤による投与に好適である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
眼への投与に好適である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
局所投与に好適である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
水分散液の形態である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記分散液が、ｐＨ７．４の緩衝溶液中のものである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
化合物の濃度が、０．１％〜２％ｗ／ｖの範囲である、請求項２７または２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
化合物の濃度が、１％ｗ／ｖである、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物により形成される、ヒト用または獣医学用医薬品。
【請求項３２】
請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物により形成される、ヒト用または獣医学用医療機器。
【請求項３３】
炎症性疾患を処置するための医薬を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項３４】
前記炎症性疾患が、関節の炎症性疾患である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
組織（ここで、組織は、軟骨または皮膚である）修復のための医薬を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項３６】
生体材料を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項１】
ヒアルロン酸のアルコール基が、レインそれ自体または誘導体形でエステル化されている、ヒアルロン酸に基づく化合物、またはその塩。
【請求項２】
レインが、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の少なくとも５％をエステル化する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
レインが、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の５％〜５０％をエステル化する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
レインが、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の５％〜２０％をエステル化する、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
レインが、ヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール基の１０％をエステル化する、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物のナトリウム塩。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を製造するための方法であって、レインそれ自体または誘導体形の酸塩化物とヒアルロン酸とを反応させることを含んでなる、方法。
【請求項８】
レインの酸塩化物およびヒアルロン酸が、レインの酸塩化物のｍｍｏｌとヒアルロン酸のエステル化可能なアルコール単位のｍｅｑ．との間の百分率比が少なくとも５％であるような量である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記百分率比が、５％〜５０％の範囲である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記百分率比が、５％〜２０％の範囲である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記百分率比が、１０％である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程：
ａ）非プロトン性非極性溶媒中、ヒアルロン酸の懸濁液を調製する工程；
ｂ）非プロトン性非極性溶媒に溶解したレインの酸塩化物および水素イオンアクセプターを添加する工程；
ｃ）エステル化反応が行われるのに十分な時間、還流下で混合物を攪拌させておく工程；および
ｄ）溶媒を蒸発除去する工程、
を含んでなる、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程ａ）の非プロトン性非極性溶媒が、シクロヘキサンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｂ）において、前記水素イオンアクセプターが、ＮＥｔ３である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｃ）において、反応を還流下で少なくとも２０時間放置しておく、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
レインの酸塩化物を、以下の工程：
ａ’）非プロトン性非極性溶媒中、レインの懸濁液を調製する工程；
ｂ’）ＳＯＣｌ２とレインとの間のモル比が１０より大きくなるような量のＳＯＣｌ２を添加する工程；
ｃ’）不活性雰囲気下でレイン酸塩化物が形成されるのに十分な時間、還流下で反応物を攪拌させておく工程；および
ｄ’）溶媒および過剰な未反応のＳＯＣｌ２を蒸留によって除去する工程
を含んでなる方法によって得る、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程ａ'）の前記非プロトン性非極性溶媒が、塩化物溶媒である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記塩化物溶媒が、ＣＨ２Ｃｌ２である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｃ’）において、反応物を少なくとも３時間還流下で放置する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
精製の最終工程をさらに含んでなる、請求項７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記精製工程が、透析膜を用いて行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を、好適な賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて含んでなる、医薬組成物。
【請求項２３】
局所領域的な投与に好適な処方物を有する、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
関節内浸潤による投与に好適である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
眼への投与に好適である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
局所投与に好適である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
水分散液の形態である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記分散液が、ｐＨ７．４の緩衝溶液中のものである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
化合物の濃度が、０．１％〜２％ｗ／ｖの範囲である、請求項２７または２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
化合物の濃度が、１％ｗ／ｖである、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物により形成される、ヒト用または獣医学用医薬品。
【請求項３２】
請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物により形成される、ヒト用または獣医学用医療機器。
【請求項３３】
炎症性疾患を処置するための医薬を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項３４】
前記炎症性疾患が、関節の炎症性疾患である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
組織（ここで、組織は、軟骨または皮膚である）修復のための医薬を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項３６】
生体材料を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物またはその塩の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−２５２１５３（Ｐ２０１１−２５２１５３Ａ）
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１６００９１（Ｐ２０１１−１６００９１）
【出願日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【分割の表示】特願２００７−５００３１８（Ｐ２００７−５００３１８）の分割
【原出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【出願人】（５０１１４１２７５）
【氏名又は名称原語表記】ＬＡＢＯＲＡＴＯＩＲＥ ＭＥＤＩＤＯＭ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６００９１（Ｐ２０１１−１６００９１）
【出願日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【分割の表示】特願２００７−５００３１８（Ｐ２００７−５００３１８）の分割
【原出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【出願人】（５０１１４１２７５）
【氏名又は名称原語表記】ＬＡＢＯＲＡＴＯＩＲＥ ＭＥＤＩＤＯＭ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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