レビー小体型認知症における分子診断法および治療
本発明は、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼ Ｌ１（ＵＣＨ−Ｌ１）のレベルまたはそのユビキチン−リガーゼ活性の変化に関連した、α−シヌクレイン症、詳しくはレビー小体型認知症（ＤＬＢ）の分子診断法に関する。本発明はまた、ＵＣＨ−Ｌ１レベルまたはＵＣＨ−Ｌ１の酵素活性を変更することができる化合物の使用にも関する。本発明は、ＤＬＢに罹患している患者の診断および治療において適用される。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の目的
本発明は、レビー小体型認知症として知られる疾患、その純粋型および通常型の両方の分子診断法および治療に関し、それらは前記認知症の診断基準としてだけでなく、それらの予防および治療においても使用することができる。
【０００２】
発明の背景
先進諸国では、人口の高齢化により認知症に罹患している患者の数が増加している。これらの患者の多くは、アルツハイマー病（ＡＤ）を患っている。非ＡＤ性認知症の中でも、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）は罹患率(prevelance)が高い。ＤＬＢとは、皮質および皮質下にレビー小体が様々な度合いで存在することと関連した認知症の臨床病理症候群（びまん性レビー小体病、レビー小体型老年性認知症、さらにアルツハイマー病のレビー小体変異など）を表す。レビー小体型認知症（ＤＬＢ）と呼ばれるこの機能障害の臨床病理分類（McKeith IG, Galasko D, Kosaka K, et al. レビー小体型認知症（ＤＬＢ）の臨床病理診断の総合指針(Consensus guidelines for the clinical and pathological diagnosis of Dementia with Lewy bodies (DLB))：ＤＬＢ国際ワークショップコンソーシアム(Consortium on DLB International Workshop)での報告 Neurology 1996; 47: 1113-24. 2000; 54: 1050-8）では、ＡＤやパーキンソン病（ＰＤ）の特徴との共通項も考慮に入れられる。全体として、疾患の臨床データによりびまん性レビー小体病と診断されるが、この疾患についての確定的な診断学的検査はない。神経病理学的検査では、特徴、局在性および疾患に固有の分布により特徴的な変化が示されることから、この神経病理学的検査が、現在のところ、唯一の診断形式である。
【０００３】
診断での神経学的判定基準では、症状または核の徴候を考慮に入れる。よって、レビー小体型認知症の評価においては、注意、実行機能および視覚空間の欠陥が最も重症であり、短期記憶はＡＤの場合より比較的重症度は低いと見なされることが多い。認知変動(fluctuating cognition)の評価においては、注意および意識水準の変化や日没症候群の欠如についての様々なの時間的進行に遭遇する。別の重要な症状には、反復性幻視や精巧な幻視がある。一般に、このような幻視には、様々な侵攻度の「動きのある実体(animated subjets)」などがある。ＤＬＢにおいて、自発的錐体外路徴候は、硬直、運動緩徐(bradikynesia)および運動異常であり、安静時の震えはまれである。日ごとまたは週ごと（特に、初めに）起こる臨床変動がＤＬＢの診断を補足する様相である。診断感度を向上させるかもしれない１つの様相が、錐体外路運動徴候や幻視の中心の特徴の閾値および規模を定義するための判定基準となる。現行の判定基準のさらなる制限は、ＤＬＢの考えられるかまたは推定される性質を決定するのに利用されるアルゴリズムに、診断において示唆的な特徴が明確には含まれないということである。ＤＬＢの診断の精度をより高いものとするには、鑑別診断において示唆的な特徴の有用性と、睡眠の変化が及ぼすと考えられる影響度とを調査することが必要であろう（Kaufer DI. Dementia and Lewy bodies. Rev Neurol. 2003 JuI 16-31 ;37(2): 127-30. Review.）。
【０００４】
症例によっては、レビー神経突起、皮質の老人斑、タウ病変の徴候または海綿状変性が検出されるが、組織病理学的観点からのＤＬＢの診断における示唆的な徴候は、皮質および脳幹におけるレビー小体の存在にある（K.A. Jellinger, Morphological substrates of mental dysfunction in Lewy body disease. An update. J Neurol Transm Suppl 59 (2000), pp. 185-21）。上述のように、病変の特徴（レビー小体および神経突起）、その局在性（ニューロン神経突起内）およびその分布（脳幹、扁桃体、マイネルト基底核および大脳皮質に拡散する）はその疾患に特異的である。
最近の研究では、ＤＬＢの臨床発生率が年間１００，０００件に２６件であり、８０〜８４年に及んでは最高率の年間１００，０００件に６８．６件であると示している。この割合は、これまでの研究で年間１００，０００件に９３件確認されたＡＤより低いが、年間１００，０００件に１４件と推定される前頭側頭認知症（ＦＴＤ）の割合よりも高い。同研究で、文献に記載されているＤＬＢが男性優位であることを検出した。ＤＬＢとＡＤを有する男性の割合は６３．２％と２３．１％であった。この研究は患者の臨床サンプルに関する研究であり、一般集団のものではないことから、この研究ではいくつかの方法論的制限を考慮しなくてはならない。さらに、現行の臨床的判定基準の感度が足りないために実際の割合を過小評価する可能性があるということも考慮しなければならない。一般集団における発生率はわずかに高いかもしれない（S. Lopez-Pousa, J. Garre-Olmo, A. Turon-Estrada, E. Gelada-Batlle, M. Lozano-Gallego, M. Hernandez-Ferrandiz, V. Morante-Munoz, J. Peralta-Rodriguez, M. M. Cruz-Reina. Incidencia clinica de la demencia por cuerpos de Lewy. REV NEUROL 2003; 36 (8): 715-720）。
【０００５】
疾患の病因とその進行の分子機構はまだ解明されていない。しかし、この疾患の主要な組織病理学的特徴となるレビー小体の蓄積が最初の手掛かり、すなわち徴候の一部となった。レビー小体は、不溶性タンパク質沈着物によって主としてなるタンパク質沈着物であり、この不溶性タンパク質沈着物の主成分は、α−シヌクレイン、ユビキチンおよびユビキチン化タンパク質である。これらの総ては、欠陥があるかまたは過剰な細胞質タンパク質の生理学的分解を担うＵＰＳ系（ユビキチン−プロテアソーム）と呼ばれる細胞内系のメンバーである（Herschko A, Ciechanover A (1998) The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67: 425-479）。この系の機能低下は、ＡＤ、ＰＤ、ハンチントン病（ＨＤ）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの特定の神経変性疾患の発症または進行に関わる原因の１つとして記載されている（Petrucelli L & Dawson TM. Mechanism of neurodegenerative disease: role of the ubiquitin proteasome system. Ann Med. 2004; 36(4): 315-20）。（Tran PB, Miller RJ. Aggregates in neurodegenerative disease: crowds and power? Trends Neurosci 1999 May; 22(5): 194-7）。
【０００６】
欠陥のある細胞質タンパク質の生理学的分解を担うＵＰＳ系（ユビキチン−プロテアソーム）の構成要素の１つがＵＣＨ−Ｌ１（ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼ Ｌ１）、すなわち、ユビキチンのカルボキシ末端グリシンと結合したタンパク質複合体のペプチド結合の加水分解に関与するチオール−プロテアーゼである。このＵＣＨ−Ｌ１は、細胞質において過剰なタンパク質の破壊を調節し、排除すべき新たなタンパク質との結合に利用できる状態にあるユビキチンを放出させる。ＵＣＨ−Ｌ１とパーキンソン病との相関関係については、ＰＤの病歴を有する同父母の兄弟姉妹における優性突然変異の検出に関して記載されている（Leroy E, Boyer R, Auburger G, Leube B, Ulm G, Mezey E, Harta G, Brownstein MJ, Jonnalagada S, Chernova T, Dehejia A, Lavedan C, Gasser T, Steinbach PJ, Wilkinson KD, Polymeropoulos MH (1998) The ubiquitin pathway in Parkinson's disease. Nature 395: 451-452）。ＵＣＨ−Ｌ１欠損マウスは、野生型対応物よりも低いin vivo 神経細胞のユビキチンレベルを示す。培養細胞では、ＵＣＨ−Ｌ１の過剰発現によって遊離ユビキチンレベルの増加がもたらされる（Osaka H, Wang YL, Takada K, Takizawa S, Setsuie R, Li H, Sato Y, Nishikawa K, Sun YJ, Sakurai M, Harada T, Hara Y, Kimura I, Chiba S, Namikawa K, Kiyama H, Noda M, Aoki S, Wada K (2003) Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds to and stabilizes monoubiquitin in neurons (Hum Mol Genet 12: 1945-1958)。ＵＣＨ−Ｌ１が、ＵＰＳ系の他のタンパク質、例えば、ユビキチン化タンパク質、ＨＳＰ７０、γ−チュブリン、より少ない程度には、２０ＳプロテアソームやＢｉＰシャペロン、と共に局在化することが実証されている（Ardley HC, Scott GB, Rose SA, Tan NG, Robinson PA. UCH-L1 aggresome formation in response to proteasome impairment indicates a role in inclusion formation in Parkinson's disease. J Neurochem. 2004 Jul; 90(2): 379-91）。最近になって、散発性ＡＤおよびＰＤにおけるＵＣＨ−Ｌ１の酸化状態の変化についても記載された（Choi J, Levey AI Weintraub ST, Rees HD, Gearing M, Chin LS, Li L (2004) Oxidation and down-regulation of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1 associated with idiopatic Parkinson's and Alzheimer's disease. J Biol. Chem 279: 13256-13264.）。
【０００７】
ＵＰＳ系とそれに関与する異なるタンパク質のような、分解と細胞内タンパク質ホメオスタシスの経路にも関わらず、ＰＤまたはＡＤなどの疾患の進行における中心的存在として提示されている。これらの疾患は、ＤＬＢと数多くの症状を共有する。この認知症、すなわち、ＡＤに次いで２番目に最も多い認知症の進行の原因および様式はまだ解明されていない。
【０００８】
ＤＬＢ患者が利用できる治療法の選択肢は、残念なことに、ごく限られており、多くの場合、精神科的およびパーキンソン病様症状を抑える対症療法しかない。しかし、震えおよび運動喪失を回復（amelloration）させる抗パーキンソン病薬は、幻覚症状や精神病傾向を急性に著しく悪化させ、症例によっては致命的な結末を生むことが多い。また、精神科的症状に処方される神経弛緩薬療法も運動傾向を著しく悪化させる。患者が示す傾向によっては、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、ドーパミン作動薬、短時間作用型および中時間作用型ベンゾジアゼピンならびに抗鬱薬はあまり役に立たないかもしれない（Rampello L, Cerasa S, Alvano A, Butta V V, Raffaele R, Vecchio I, Cavallaro T, Cimino E, Incognito T, Nicoletti F. Dementia with lewy bodies: a review. Arch Gerontol Geriatr. 2004 Jul-Aug; 39(1): 1-14.）
【０００９】
よって、レビー小体型認知症に関与する新たな遺伝子ならびに／またはレビー小体型認知症に関わる突然変異および／もしくはマーカーの同定が必要である。
【００１０】
遺伝子を同定することによって、他の認知症に対する選択的分子診断が可能になるだろうし、一般的な臨床実践にその診断を含めることが可能にもなるであろう。
【００１１】
同時に、重度に活動不能にするこのような種類の認知症に関連した補償費および医療費のかなりの節約にもなるであろう。
【００１２】
また、疾患のパーキンソン病様の特徴が確立されている患者へのより厳しいおよび／または個別の療法の適用が許されるため、陽性患者における予後および治療方針の新たな判定基準の採用も可能になるであろう。
【００１３】
最後に、この／これらの遺伝子と、その／それらの遺伝子の発現を変更して、疾患の進行を遅延または停止するかもしれない候補化合物を同定することによって、他の認知症に対する選択的分子診断が可能になるだけでなく、それらの遺伝子を不活化することを目的とする選択療法の設計も可能になるであろう。
【００１４】
発明の説明
本発明は、認知症の発症が疑われる患者におけるレビー小体型認知症（ＤＬＢ）の診断法であって、患者から得られたサンプルを解析して、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼ Ｌ１（ＵＣＨ−Ｌ１）遺伝子の発現レベルまたはこの遺伝子によってコードされるタンパク質の酵素活性を決定することを含む診断法に関する。
【００１５】
特に、このサンプルは、ＲＮＡまたはタンパク質であってよく、神経組織の生検もしくはその他の抽出法、または他の組織のその他の抽出法によって得られた細胞から、あるいは体液（脳脊髄液、血清または尿など）から単離することができる。
【００１６】
本発明の診断法は、ＵＣＨ−Ｌ１転写レベルの定量を可能にするＤＮＡのＰＣＲ増幅、ＳＤＡ増幅またはその他の増幅法による検出をさらに含む。
【００１７】
場合により、検出は、いずれかの機構に寄託されているオリゴヌクレオチドを用いて作製したＤＮＡバイオチップ、フォトリソグラフィーまたはいずれかの他の機構によりin situ合成されたオリゴヌクレオチドを用いて作製したＤＮＡバイオチップ、により実施してもよい。
【００１８】
検出は、ウエスタンブロットによって示されるタンパク質の量の解析、ＵＣＨ−Ｌ１に対して特異的な抗体を用いる「タンパク質チップ」、または質量分析によるか、もしくはＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルの定量を可能にするいずれかの他の機構により得られるタンパク質プロフィール、による検出によっても実施することができる。
【００１９】
場合により、検出を、ＵＣＨ−Ｌ１のin vitroまたはin vivoでの酵素活性（ユビキチンのエステルおよびアミドの加水分解活性、ならびにユビキチン−リガーゼ活性を含む）の直接または間接解析により実施してもよい。
【００２０】
検出は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質またはその断片の直接解析および定量によっても実施することができる。
場合により、検出を、ＵＣＨ−Ｌ１リガーゼ活性による産物、すなわち、二量体または多量体型のポリユビキチンの存在についての直接または間接解析によって実施することができる。
一方で、本発明のさらなる目的は、このような種類の認知症の進行を停止または逆行させるためにＵＣＨ−Ｌ１レベルを増加させる化合物の能力に基づいて治療薬を同定するための化合物の解析方法を提供することである。化合物は、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子転写の特異的プロモーターまたはそのＵＣＨ−Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質の分解の特異的阻害剤であり得る。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、このような種類の認知症の進行を停止または逆行させるための、ＵＣＨ−Ｌ１酵素の加水分解活性を増加または増進させる化合物の使用である。これらの化合物は、ＵＣＨ−Ｌ１の最大率またはペプチジル−ユビキチンエステルまたはアミドに対する親和性に作用し得る。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、このような種類の認知症の進行を停止または逆行させるための、酵素ＵＣＨ−Ｌ１のリガーゼ活性を消失または低減させる化合物の使用である。そのような化合物は、遺伝子によってコードされるタンパク質のユビキチン−リガーゼ活性の特異的阻害剤として競合的または非競合的に作用し得る。
【００２３】
もう一方で、本発明のさらなる目的は、細胞培養物などのようなin vitro系におけるＵＣＨ−Ｌ１の加水分解活性の変化の解析に基づいて、レビー小体型認知症の治療的可能性を有する化合物を解析する方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、細胞培養物などのようなin vitro系におけるＵＣＨ−Ｌ１のユビキチン−リガーゼ活性の変化の解析に基づいて、レビー小体型認知症の治療的可能性を有する化合物を解析する方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、アンチセンスもしくはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、またはｍＲＮＡもしくはリガーゼ活性は与えるがタンパク質には翻訳されない対立遺伝子によって生じるｍＲＮＡの、不安定化および消失に基づく他のもの、などの配列情報に基づく医薬品を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子またはタンパク質配列（タンパク質と結合する際の親和性または最大率という意味においてその酵素活性を増加させる特異的抗体など）についての情報、あるいはアンチセンスもしくはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、またはｍＲＮＡもしくは正常な加水分解活性を有するその対立遺伝子に対して途中で干渉するかまたは減少させるがタンパク質には翻訳されない対立遺伝子によって生じるｍＲＮＡの、不安定化および消失に基づく他のもの、についての情報に基づく医薬品を提供することである。
【００２７】
本発明は、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）に罹患している一連の患者の大脳皮質組織において関心の高まっている６２７個の遺伝子についての、特異的オリゴヌクレオチドＤＮＡチップを用いたゲノム規模の遺伝子発現解析に端を発する。アルツハイマー病に見られるいくつかの症状も示すＤＬＢ（その純粋型または通常のものとして知られる型）に罹患している患者のサンプルを分析した。ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡレベルは、対照と比べて低いだけでなく、アルツハイマー病（ＡＤ）またはパーキンソン病（ＰＤ）に罹患している患者群と比べても低いものであった。データは、リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの定量などの独立した技術により確認した。こうしたｍＲＮＡレベルの低下の意義を、死後組織において種々のｍＲＮＡ種が関与する一般的かつ特異的な分解プロセスに関しても確認した。同じ死後サンプルを処理し、異なる時間の間、室温にしてあった組織からＲＮＡを得た試験では、ＵＣＨ−Ｌ１レベルが構成的、すなわち比較的不変の転写物（β−アクチンなど）と比べても依然として変わらないままであることが分かった。
【００２８】
抗ＵＣＨ−Ｌ１特異的抗体を用いたウエスタンブロットによる解析では、ＤＬＢの大脳皮質においてタンパク質レベルが低下するが、ＰＤの場合には低下しないということも確認された。
【００２９】
ＵＣＨ−Ｌ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの低下は、対照と比べて統計的に有意であり、純粋型ＤＬＢの場合の信頼水準は０．９９、通常型の場合には０．９５であった。
【００３０】
レビー小体型認知症（ＤＬＢ）は、アルツハイマー病（ＡＤ）に次いで２番目に最も多い認知症である。組織病理学的には、大脳路、脊髄および自律神経節の特定の核におけるヒアリン体（レビー小体）の蓄積によって特徴付けられる。レビー小体はＰＤで生成されるが、レビー小体にこのα−シヌクレインタンパク質が蓄積することから、両方とも（ＰＤおよびＤＬＢ）α−シヌクレイン症と考えられている。ＤＬＢはＰＤといくつか類似症状を示すが、これらの２つの疾患は全く異なる神経学的傾向を示し、脳病変(cerebral affectation)も異なる。よって、例えば、ＤＬＢは、ＰＤでは見られない皮質の病変(affectation)を示す。ＰＤでは神経学的傾向として幻覚は見られない。ＤＬＢ患者における抗ＰＤ症状の治療により、これらの患者の神経系疾患傾向が非常に重く悪化する。これらの２つの疾患が明らかに異なるという十分に確立された臨床的かつ神経学的コンセンサスがある。
【００３１】
ＵＣＨ−Ｌ１は、欠陥があるか、突然変異したか、または過剰な細胞質タンパク質の生理学的分解を担うＵＰＳ系（ユビキチン−プロテアソーム）に関与する酵素である。ＵＣＨ−Ｌ１は、ユビキチンのカルボキシ末端グリシンと結合したタンパク質複合体のペプチド結合の加水分解を触媒するチオール−プロテアーゼである。これは、標的タンパク質の分解を調節し、さらなるタンパク質標的と結合することができるユビキチンを放出させる。
【００３２】
ＤＢＬと共通するいくつかの症状を示すが、ＤＢＬとは違って皮質には少しも影響を与えないＰＤでは、ユビキチン系について考えられる重要性がすでに指摘されている。遺伝性ＰＤの一部の症例では、ユビキチンと相互に作用することが分かっているタンパク質であるパーキンが突然変異を受けている（McNaught KS, Olanow CW (2003) Proteolytic stress: a unifying concept for the etiopathogenesis of Parkinson's disease. Ann Neurol 53: S73.-84）。ＵＣＨ−Ｌ１は、ある程度の優性度で、疾患感受性を与える点突然変異（Ｉ９３Ｍ）が存在するということが判明した場合にＰＤとも関係があった（Leroy E, Boyer R, Auburger G, Leube B, UIm G, Mezey E, Harta G, Brownstein MJ, Jonnalagada S, Chernova T, Dehejia A, Lavedan C, Gasser T, Steinbach PJ, Wilkinson KD, Polymeropoulos MH (1998) The ubiquitin pathway in Parkinson's disease. Nature 395: 451-452）。共同研究では、当時、ＰＤ１９７０症例と、関連のない対照２２２４例で実施した１１の研究を解析し、Ｓ１８Ｙ対立遺伝子とパーキンソン病との間に統計的に有意な逆相関があることが分かり（オッズ比（ＯＲ）０．８４（９５％信頼区間［ＣＩ］，０．７３〜０．９５）、対立遺伝子多型のホモ接合体（Ｙ／ＹとＳ／Ｓに加えてＹ／Ｓ）はＯＲ ０．７１（９５％ＣＩ，０．５７〜０．８８）を示した。これによりＵＣＨ−Ｌ１がＰＤについての感受性遺伝子であることが確認された。（Maraganore, D. M.; Lesnick, T. G.; Elbaz, A.; Chartier-Harlin, M. -C; Gasser, T.; Kruger, R.; Hattori, N.; Mellick, G. D.; Quattrone, A.; Satoh, J.; Toda, T.; Wang, J.; loannidis, J. P. A.; of Andrade, M.; Rocca, W. A.; UCH-L1 Global Genetics Consortium: UCH-L1 is a Parkinson's disease susceptibility gene. Ann. Neurol. 55: 512-521, 2004）。最近になって、アルツハイマー病と特発性パーキンソン病ではＵＣＨ−Ｌ１レベルが低下し、特定の酸化修飾が存在するということも記載された（Choi J, Levey Al, Weintraub ST, Rees HD, Gearing M, Chin LS, Li L (2004) Oxidative modifications and down-regulation of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1 associated with idiopathic Parkinson's and Alzheimer's disease. J Biol Chem 279: 13256-13264）。
【００３３】
しかし、ＵＣＨ−Ｌ１レベルとレビー小体型認知症との間に考えられる関連については、これまでのところ記載されていない。本発明は、対照との比較により、ＤＬＢ患者における大脳皮質のＵＣＨ−Ｌ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの低下との間にある明らかな相関関係を示す。さらに、本発明の試験は、ＤＬＢに罹患している患者におけるＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルの低下と、ユビキチン−プロテアソーム複合体の他の重要なタンパク質（２０ＳＸおよび２０ＳＹサブユニット、１９Ｓ複合体ならびにＰＡ２８アクチベーターの１１Ｓαサブユニットなど）の低減は同時に起こらないということを非常に明確に示している。これにより、大脳皮質内のＤＬＢ病理的傾向におけるＵＣＨ−Ｌ１レベル抑制の特異的かつ選択的な役割が示される。
【００３４】
現在、ＤＬＢが疑われる患者は、神経学的基本技術により評価され、問題解決困難および視空間障害、ならびに認知機能の変動およびはっきりとした幻覚の出現などの初期症状により精神機能の低下を検出している。後には、運動症状の出現が他の認知症に対するＤＬＢの鑑別診断における主要な特徴となる（McKeith IG, Galasko D, Kosaka K, Perry EK, Dickson DW, Hansen LA, Salmon DP, Lowe J, Mirra SS, Byrne EJ, Lennox G, Quinn NP, Edwardson JA, Ince PG, Bergeron C, Burns A, Miller BL, Lovestone S, Collerton D, Jansen EN, Ballard C, of Vos RA, Wilcock GK, Jellinger KA, Perry RH (1996) レビー小体型認知症（ＤＬＢ）の臨床病理診断の総合指針(Consensus guidelines for the clinical and pathological diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB))：ＤＬＢ国際ワークショップコンソーシアム(consortium on DLB international workshop)での報告. Neurology 47: 1113-1124およびMcKeith IG, Ballard CG, Perry RH, Ince PG, O'Brien JT, Neill D, Lowery K, Jaros E, Barber R, Thompson P, Swann A, Fairbairn AF, Perry EK. Prospective validation of consensus criteria for the diagnosis of dementia with Lewy bodies. Neurology. 2000 Mar 14; 54(5): 1050-8）。早期に決定的な診断を下すと、疾患の進行を低減または停止させるには治療限界があるであろう。
【００３５】
本発明の診断法に従い、ＤＬＢの解析は以下のとおりである：認知症の発症が疑われる、家族に関する臨床評価を非確定的に受けている患者を微量生検とＵＣＨ−Ｌ１レベルの定量により診断する。
【００３６】
本発明のもう１つの実施形態は、特に、ＵＣＨ−Ｌ１ ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルの増加を通じて、またはＵＣＨ−Ｌ１の１以上の酵素活性の修飾を通じて、細胞内遊離ユビキチンプールを再生する能力を変更するための抗ＤＬＢ療法の利用である。
【００３７】
ＵＣＨ−Ｌ１の酵素活性、すなわち、ユビキチンを放出するヒドロラーゼ活性（Larsen CN, Krantz BA, Wilkinson KD. Substrate specificity of deubiquitinating enzymes: ubiquitin C-terminal hydrolases. Biochemistry. 1998; 37: 3358-68.およびLarsen CN, Price JS, Wilkinson KD. Substrate binding and catalysis by ubiquitin C-terminal hydrolases: identification of two active site residues. Biochemistry. 1996; 35: 6735-44）とユビキチン−リガーゼ活性（Liu Y, Fallon L, Lashuel HA, Liu Z, Lansbury PT (2002) The UCH-L1 gene encodes two opposing enzymatic activities that affect α-synuclein degradation and Parkinson's disease susceptibility. Cell 111 : 209-218）を知ることにより、化合物の解析のための方法を設計することが可能になり、所望のようにＵＣＨ−Ｌ１活性を抑制する分子の有効性を測定することが可能になる。
【００３８】
抗ＤＬＢ療法は、神経組織または脳脊髄液もしくは末梢液においてＵＣＨ−Ｌ１レベルが低下していることを見出すことから始まる。ＵＣＨ−Ｌ１欠損マウスでは、ニューロンにおける遊離ユビキチンレベルが低下していた。ＵＣＨ−ＬＩを過剰発現している培養細胞およびトランスジェニックマウスモデルでは、ユビキチンレベルの増加が示される（Osaka .H, Wang YL, Takada K, Takizawa S, Setsuie R, Li H, Sato Y, Nishikawa K, Sun YJ, Sakurai M, Harada T, ,Hara Y, Kimura I, Chiba S, Namikawa K, Kiyama H, Noda M, Aoki S, Wada K (2003) Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds to and stabilizes monoubiquitin in neuron. Hum Mol Genet 5 12: 1945-1958）。さらに、レビー小体およびレビー神経突起においてα-シヌクレインとユビキチンとが共に局在化すること（McNaught KS, Olanow CW (2003) Proteolytic stress: a unifying concept for the etiopathogenesis of Parkinson's disease. Ann Neurol 53: S73-84; McNaught KS, Mytilineou C, Jnobaptiste R, Yabut J, Shashidharan P, Jennert P, Olanow CW (2002) Impairment of the ubiquitin-proteasome system causes dopaminergic cell death and inclusion body formation in ventral mesencephalic cultures. J Neurochem 81: 301-306）、加えて、ＤＬＢでは、主としてＵＣＨ−Ｌ１活性の低下に起因して起こる、ＵＰＳ複合体の重要な成分の減少はないということを示す証拠から、ユビキチン−プロテアソーム系がＰＤおよびＤＬＢの発症機序に関与しているという極めて有望な仮説が成り立つ。
【００３９】
よって、ＵＣＨ−Ｌ１レベルとＤＬＢ疾患との間に明らかな相関関係が確立されることにより、活性酵素レベルを増加させ、ユビキチン−リガーゼ活性を不活化させ、またはヒドロラーゼ活性を活性化させるための技術および化合物の新規用途を考えることが可能になる。技術および／または活性化合物のこのような用途では、技術および／または活性化合物によって細胞質プール中の利用可能な遊離ユビキチンが増加することから、ニューロンでは排除すべきタンパク質が正確に異化されるため、疾患を遅らせ、かつ／または疾患を緩解させることができる。これにより、α−シヌクレインや、レビー小体に関与するその他のタンパク質の濃度が低下することになる。
【００４０】
ＵＣＨ−Ｌ１の過剰発現アプローチの一例は、ユビキチン−リガーゼ能力の低いＳ１８Ｙ型ＵＣＨ−Ｌ１をコードするカセットの、アデノウイルスまたはレトロウイルス発現ベクターもしくはその他の種類の発現ベクターへの挿入である。このベクターは、移植により発現ベクターを有する胚または成体起源（脳室下帯またはその他由来）の神経幹細胞に導入してもよい。同様のアプローチには、転写因子をコードする幹細胞の移植がある。最近になって、細胞周期のＧ１／Ｓ期遷移を調整する鳥類レトロウイルス癌遺伝子である、転写因子Ｂ−Ｍｙｂ（ｖ−Ｍｙｂとの類似性により同定された）（N. Nomura, M. Takahashi, M. Matsui et al., Isolation of human cDNA clones of myb-related genes, a-myb and b-myb. Nucleic Acids Res. 16 (1988), pp. 11075-11089（Nucleic Acids Res. 1989 February 11; 17(3): 1282に訂正を掲載））が、ラット肺におけるＵＣＨ−Ｌ１のin vitroおよびin vivo両方での発現を刺激する（Long EM, Long MA, Tsirigotis M, Gray DA. Stimulation of the murine UCH-L1 gene promoter by the B-Myb transcription factor. Lung Cancer. 2003 Oct; 42(1):9-21）ことが証明された。
【００４１】
この点についてのもう１つの例には、加水分解活性の高い突然変異型ＵＣＨ−Ｌ１の導入がある。
【００４２】
この効果の具体例は、ラット腹側中脳(ventral mesencephal)の神経細胞系統を用いて主張することができる。この神経細胞系統では、ＵＣＨ−Ｌ１を阻害することによってα-シヌクレイン凝集体が生成し、過剰発現させることによって遊離ユビキチンの量の増加が生じる。
【００４３】
もう１つの試験例がＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞系統で得られた。このＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞系統では、５〜１００μＭのＭＰＰ＋（ＭＰＴＰの活性代謝物である）で処置することで、処置後４日内にＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でアポトーシスが起こり、さらにＤＬＢに特有のレビー凝集体を形成するα−シヌクレインを過剰発現させることが分かった（Gomez-Santos C, Ferrer I, Reiriz J, Vinals F, Barrachina M, Ambrosio S. MPP+ increases alpha-synuclein expression, and ERK/MAP-kinase phosphorylation in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Brain Res. 2002 May 10; 935 (1-2): 32-9.）
【００４４】
ＵＣＨ−Ｌ１突然変異（german突然変異 Ｉ９３Ｍ）が加水分解活性の５０％低下を引き起こしているＰＤの一症例によって記載されているように、認知症のごく一部のもので、家系特有の性質をもつものもある（Lansbury PT, Brice A (2002) Genetics of Parkinson's disease and biochemical studies of implicated gene products. Curr Opin Genet Dev 13: 299-306.）。いくつかのＤＬＢのサブタイプは、ある程度に常染色体優性を示すように思われる（Harding AJ, Das A, Kril JJ, Brooks WS, Duffy D, Halliday GM. Identification of families with cortical Lewy body disease. Am J Med Genet. 2004 Jul 1; 128B(1): 118-22）。ＵＣＨ−Ｌ１の突然変異Ｉ９３Ｍは、その浸透度は完全ではないが、特定の優性度も示し、途中での対立遺伝子の補償現象が想定される（Liu Y, Fallon L, Lashuel HA, Liu Z, Lansbury PT (2002) The UCH-L1 gene encodes two opposing enzymatic activities that affect α-synuclein degradation and Parkinson's disease susceptibility. Cell 111: 209-218）
【００４５】
酵素活性の化学的および免疫学的阻害は、例えば、腫瘍学において、例えば、結腸直腸癌におけるβ−カテニンや慢性骨髄性白血病におけるＢＣＲ−ＡＢＬに対する適用が見られる。これらの観察から、特定の癌遺伝子が破壊を受けやすく、その破壊により腫瘍表現型となるか、または標準的な併用治療の有効性をもたらす可能性があることを示唆する。遺伝子破壊に利用可能な機構のうち、最も期待できるアプローチの１つが短い干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。ペチュニアで最初に見つかり（Napoli C, Lemieux C, and Jorgensen R. (1990) Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279-289）、その分子作用機構については記載されており（Hammond SM, Caudy AA, Hannon GJ. (2001) Post-transcriptional Gene Silencing by Double-stranded ARN. Nature Rev Gen 2: 110-119）、制癌目的でのその利用に大きな期待を与えた（Kittler R, Buchholz F. RNA interference: gene silencing in the fast lane. Semin Cancer Biol. 2003 Aug; 13(4): 259-65; Deveraux QL, Aza-Blanc P, Wagner KW, Bauerschlag D, Cooke MP, Hampton GM. Exposing oncogenic dependencies for cancer drug target discovery and validation using RNAi. Semin Cancer Biol. 2003 Aug; 13(4): 293-300; Bedford JS, Liber HL Applications of RNA interference for studies in DNA damage processing, genome stability, mutagenesis, and cancer. Semin Cancer Biol. 2003 Aug; 13(4): 301-8）。同様に、アンチセンスアプローチによっても、Ｉ９３Ｍ対立遺伝子または加水分解活性を低下させるその他のものによって生じるメッセンジャーのレベルが低下する可能性がある。
【００４６】
短い干渉ＲＮＡ（１９量体〜２２量体）による標的治療では、抗対立遺伝子Ｉ９３Ｍまたは同様の標的として使用するためにｃＤＮＡの特定の配列を選択しなければならない。Oryzon社によって開発されたオリゴヌクレオチド設計ソフトウェアＴｅｔｈｙｓにより、事前評価を実施して、ゲノムに存在する配列を発現する他のものと交差ハイブリダイゼーションする可能性がより低くいために、他の遺伝子の発現に影響を及ぼす可能性が低くなるオリゴヌクレオチドを同定した。また、Ｔｅｔｈｙｓを使用して、所望の対立遺伝子の発現を低下させる効果を最大にする、オリゴにおける特異的塩基の最も有利な位置も決定することができる。後に、Ｔｅｔｈｙｓを使用して、図６に示されるような標的配列に応じて最も有利なオリゴヌクレオチド長を評価する。
【００４７】
下表では、ＵＣＨ−Ｌ１ Ｉ９３ＭまたはＩ９３Ｍ 突然変異を含まないＵＣＨ−Ｌ１対立遺伝子の発現を低下させるための、ｃＤＮＡにおける標的候補のいくつかを例として示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
また、それも、レビー凝集体によって起こる神経損傷を予防することができる治療化合物および／または医薬組成物の解析にin vitro系を使用する本発明の一部である。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞系統などの細胞系統では、５〜１００μＭのＭＰＰ＋（ＭＰＴＰの活性代謝物）で処置することによって、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でアポトーシスが起こり、さらにＤＬＢに特有のレビー凝集体を形成するα−シヌクレインを過剰発現する(Gomez-Santos C, Ferrer I, Reiriz J, Vinals F, Barrachina M, Ambrosio S. MPP+ increases alpha-synuclein expression and ERK/MAP-kinase phosphorylation in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Brain Res. 2002 May 10; 935 (1-2): 32-9)。これらの細胞系統では、ＵＣＨ−Ｌ１レベル、その酵素活性、α−シヌクレイン沈着物および細胞のアポトーシスをモニタリングすることにより化合物の有効性を確認することができる。これらの治療化合物および／または医薬組成物は、ＵＣＨ−Ｌ１タンパク質と結合し、非競合的にユビキチン−リガーゼ活性を阻害し、通常のユビキチンを放出するその能力を回復させることができる。あるいは、これらの治療化合物および／または医薬組成物は、ＵＰＳ系の変化の影響によるタンパク質の過剰蓄積により、細胞シグナル伝達経路の発現を変更することができる。
【００５０】
好ましい実施形態の説明
以下、好ましい実施形態について記載するが、本発明を限定するものではない。
下表では、本シリーズで研究する症例を、対応する神経病理学的データとともにまとめる：パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症純粋型（ＤＬＢｐ）および通常型（ＤＬＢｃ）、ならびに対照。Ｍ：男性、Ｆ：女性。ＮＦＴ：神経原線維変化。ブラーク病期は、Braak および Braak (Braak H, Braak E (1999) Temporal sequence of Alzheimer's disease related pathology. In: Cerebral cortex, vol 14, Neurodegenerative and age-related changes in structure and function of cerebral cortex (Peters A, Morrison JH, eds), pp 475-512. New York, Boston, Dordrecht, London, Moscow: Kluwer Academic/Plenum Publishers.)が記載している、ＤＤＬＢを伴うアルツハイマー病（ＡＤ）の変化を示している。
【００５１】
【表２】
【００５２】
ＲＮＡおよびタンパク質サンプルは下記のような倫理的許諾を得た患者から単離した。
種々の患者および対照に由来する皮質領域８のサンプルからのｍＲＮＡの単離
ｍＲＮＡを二工程で単離した。ＴＲｉｚｏｌ試薬(Life Technologies)を用いて全ＲＮＡを得、次に、RNeasy Protect Mini Kit (Qiagen)を用い、トランスファーＲＮＡと５Ｓおよび５．８ＳリボソームＲＮＡを含まないｍＲＮＡを得た。冷凍ヒト脳組織をそのまま、組織１００ｍｇ当たり１ｍｌのＴＲｉｚｏｌ中でホモジナイズし、製造業者のプロトコールに従って全ＲＮＡを抽出した。精製した全ＲＮＡを１００μｌのＲＮアーゼフリー水に再懸濁し、RNeasy Protect Mini Kitに示されている明細に軽微な変更を加え（ゲノムＤＮＡはＴＲｉｚｏｌによる抽出の際に除去されたことから、ＤＮアーゼＩ処理は行わなかった）、ｍＲＮＡの精製を行った。各サンプルの濃度を２６０ｎｍでの吸光度により測定し、ＲＮＡの完全性をアガロース−ホルムアルデヒドゲル電気泳動により確認した。
【００５３】
ＤＮＡアレイ
トランスクリプトミクス分析のため、ＲＮＡサンプルを、断片サイズおよびサンプル濃度ならびに１６Ｓと２８ＳＲＮＡの間のシグナル比を算出するAgilent 2100 BioAnalyzerを用いてさらに分析した。総てのサンプルをKit MessageAmp RNA (Ambion)で標識した。第一鎖のｃＤＮＡ合成は、オリゴ−ｄＴプライマーを用いてプライミングした。標識ＲＮＡのサンプルを、特に着目する６２７個の遺伝子を表す（各々はＤＮＡ−チップの表面に無作為に分布した５つのオリゴ２組で表される）オリゴＤＮＡ−チップで分析した。これらのオリゴは、１つの機器内に総ての機能を組み込んだマイクロアレイプラットフォームである、FEBIT製のGeniom IベンチトップＤＮＡ−チップ合成装置を用いて合成した(Baum M, Bielau S, Rittner N, Schmid K, Eggelbusch K, Dahms M, Schlauersbach A, Tahedl H, Beier M, Guimil R, Scheffler M, Hermann C, Funk JM, Wixmerten A, Rebscher H, Honig M, Andreae C, Buchner D, Moschel E, Glathe A, Jager E, Thom M, Greil A, Bestvater F, Obermeier F, Burgmaier J, Thome K, Weichert S, Hein S, Binnewies T, Foitzik V, Muller M, Stahler CF, Stahler PF. Validation of a novel, fully integrated and flexible microarray benchtop facility for gene expression profiling. Nucleic Acids Res 2003;31:e151)。生データをLowessの非線形法を用いてノーマライズした(Workman C, Jensen LJ, Jarmer H, Berka R, Gautier L, Nielser HB, Saxild HH, Nielsen C, Brunak S, Knudsen S. A new non-linear normalization method for reducing variability in DNA microarray experiments. Genome Biol 2002;3:9)。
【００５４】
これらの試験において、本発明者らは、対照に対するＤＢＬのカットオフ変化倍率を、抑制遺伝子に関しては０．７５、過剰発現遺伝子には１．５に設定した。本発明者らは、１つの過剰発現遺伝子と１６の抑制遺伝子を得たが、それらのうちいくつかはＵＰＳ分解経路に関与するものであり、有意な程度でＵＣＨ−Ｌ１に関与するものであった。このバリエーションを確認するために相補的技術を用いた。
【００５５】
ｃＤＮＡの合成とＰＣＲ Ｔａｑｍａｎ
各１０μｌの逆転写反応液中、２００ｎｇのヒトＲＮＡ（水３．８５μｌ中）と、２．５μＭのオリゴ−ｄＴプライマー、１×ＲＴ ＴａｑＭａｎバッファー、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、０．０８ＵのＲＮアーゼ阻害剤ならびに０．３１Ｕの逆転写酵素MultiScribe (Applied Biosystems)とを混合した。プライマー−ＲＮＡ鋳型の結合を最大とするために２５℃で１０分間反応を行った後、４８℃で３０分間インキュベーションし、９５℃で５分間逆転写酵素を不活化した。ゲノムＤＮＡの混入がないことを確認するために、逆転写物酵素MultiScribeの不在下で並行反応を行った。ＴａｑＭａｎプローブ(Applied Biosystems)は、フォワードＰＣＲプライマーとリバースＰＣＲプライマーの間の鋳型ＤＮＡ鎖の１つにアニーリングする。ＴａｑＭａｎプローブは、Ｔａｑポリメラーゼがハイブリダイズする蛍光団を含み、遊離した蛍光団の量が、そのＰＣＲ反応において生じた産物の量に比例する。プライマーとヒトＵＣＨ−Ｌ１およびβ−アクチン遺伝子に特異的なプローブは、Applied Biosystemsからオンデマンドアッセイとして入手した。ヒトβ−アクチンを内部標準として用いた。
【００５６】
ＵＣＨ−Ｌ１および内部標準β−アクチンに対するＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイは、サーモサイクラーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム(PE Applied Biosystems)を用い、９６ウェルオプティカルプレート中のｃＤＮＡサンプルで３回行った。このプレートをオプティカルストリップ(Applied Biosystems)でカバーした。各２０μｌのＴａｑＭａｎ反応液中、９μｌのｃＤＮＡ（１／５０希釈、ＲＮＡ４ｎｇから得られたｃＤＮＡにほぼ相当する）と、１μｌの２０×ＴａｑＭａｎプローブおよび１０μｌの2xTaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)を混合した。対照およびノーマライゼーション目的で、各サンプルに関して、β−アクチンプライマーとプローブを用いて並行アッセイを行った。反応は次のようなインキュベーションにより行った：５０℃２分、９５℃１０分、および９５℃１５秒を４０サイクル、６０℃１分。ＵＣＨ−Ｌ１およびβ−アクチンに関する標準曲線は、対照ヒト脳由来ＲＮＡの一連の希釈物をｃＤＮＡに変換したものを用いて作製した。最後に、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲからのデータは総て、Sequence Detector Software (SDS version 1.9; Applied Biosystems)を用いて採取した。
【００５７】
電気泳動およびウエスタンブロット法
ＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルが低下したかどうかを確認するため、冷凍前頭皮質（１００ｍｇ）のサンプルをそのまま、１ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＤＴ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチン）中でホモジナイズし、音波処理を施した。溶解液を４℃にて５，０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、タンパク質濃度をＢＣＡ法(Pierce)によって測定した。５０μｇの全タンパク質を９５℃で３分加熱し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にＴｒｉｓ−グリシンバッファーを用いてロードした。mini-protean system (Bio-Rad)を用いたゲル電気泳動によりタンパク質を分離し、Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad)を用い、４０ｍＡで４５分、ニトロセルロースメンブレン(Bio-Rad)に移した。ニトロセルロースメンブレンを、５％脱脂乳を含有するTween 20 TBS (TBST)で３０分ブロッキングした。その後、メンブレンを、３％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴバッファーで調製した対応する一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。使用した抗体は、抗ＵＣＨ−Ｌ１（ＡＢ５９３７, Chemicon）、抗ＵＣＨ−Ｌ１（ＭＣＡ−２０８４, Serotec）、抗β−アクチン（クローンＡＣ−７４, Sigma）、抗１９Ｓ １βプロテオソーム（ＰＡ１−９７３, Affinity BioReagents）、抗１１Ｓαプロテオソームアクチベーター（ＰＡ１−９６０, Affinity BioReagents）、抗２０ＳＸプロテオソーム（ＰＡ１−９７７, Affinity BioReagents）および抗２０ＳＹプロテオソーム（ＰＡ１−９７８, Affinity BioReagents）であった。抗体は１：５００希釈で用いた。一次抗体とともにインキュベートした後、メンブレンを室温にて５分、ＴＢＳＴバッファーで３回洗浄し、その後、対応する二次抗体、すなわち、ペルオキシダーゼで標識されたＩｇＧ(Dako)の１：１，０００（β−アクチンの場合は１：５，０００）希釈液とともに室温で１時間インキュベートした。次に、メンブレンを室温にて５分、ＴＢＳＴバッファーで４回洗浄し、化学発光ＥＣＬウエスタンブロッティングシステム(Amersham/Pharmacia)で現像した後、オートラジオグラフィーフィルム(Hyperfilm ECL, Amersham)に露光した。ＵＣＨ−Ｌ１レベルの定量は、血清または脳脊髄液などの末梢組織で行ってもよい。図４に示されるように、内在ＵＣＨ−Ｌ１レベルはこれらの体液において検出することができる。
【００５８】
データの定量分析
ウエスタンブロットバンドの濃度測定的定量は、ＴｏｔａｌＬａｂ ｖ２．０１ソフトウェアを用いて行った。統計分析には、Statgraphics Plus v5ソフトウェアを用いた。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】Ａ）ヒト脳の皮質領域８由来ＲＮＡの一連の希釈物によるＵＣＨ−Ｌ１増幅のグラフ。横線は、手動調整した指数増殖期の閾値を表す。蛍光強度はＰＣＲサイクルとともに増す。蛍光強度が閾値ラインを越えるサイクル数を閾値ＣＴと定義し、定量はそれに基づいて行われる。Ｂ）異なる濃度の対照ヒト脳由来ＲＮＡから作成した、β−アクチンおよびＵＣＨ−Ｌ１に関する典型的な標準曲線。ＣＴ値（ｙ軸）は対照サンプルＲＮＡの異なる濃度の対数（ｘ軸）に対して逆線形相関を示す。
【図２】対照（Ｃ，ｎ＝６）、パーキンソン病（ＰＤ，ｎ＝６）、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症，純粋型（ＤＬＢｐ，ｎ＝７）および通常型（ＤＬＢｃ，ｎ＝６）の前頭皮質におけるＵＣＨ−Ｌ１遺伝子の相対的発現レベルを示す図である。（Ａ）β−アクチンを用いてノーマライズしたＵＣＨ−Ｌ１ ｍＲＮＡのレベル（平均±ＳＥＭ）。Ｂ）前頭皮質（領域８）の全ホモジネートのウエスタンブロットによって検出されたＵＣＨ−Ｌ１タンパク質のレベル（約２５ＫＤａの２つのバンド）。β−アクチン（４５ｋＤａ）をタンパク質ロードの対照として検出した。画像は、調査した、表１に示した総てのサンプルのものである。Ｃ）ＴｏｔａｌＬａｂ ｖ２．０１ソフトウェアを用いたＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルの濃度測定解析（平均±ＳＥＭ）。ＵＣＨ−Ｌ１のタンパク質レベルは、β−アクチンのものを用いてノーマライズした。対照サンプルとの比較により、値は＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１で統計的に有意であった（ＡＮＯＶＡと事後検定ＬＳＤ）。
【図３】個体サンプル（死後３時間）の前頭皮質の全ホモジネートのウエスタンブロットによって検出されたＵＣＨ−Ｌ１タンパク質のレベル（約２５ＫＤａの２つのバンド）の死後の安定性を示す図である。サンプルは、すぐに液体窒素（０時間）で凍結するか、または室温にて３時間、６時間もしくは２２時間放置した後に、液体窒素で凍結した。２２時間まで目立ったＵＣＨ−Ｌ１の分解は見られない。
【図４】対照被験体の血清でのウエスタンブロットによって検出されたＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルを示す図である。画像は、ＵＣＨ−Ｌ１の見かけの分子量に相当するバンドを示している。
【図５】対照（Ｃ，ｎ＝６）、パーキンソン病（ＰＤ，ｎ＝６）、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、純粋型（ＤＬＢｐ，ｎ＝７）および通常型（ＤＬＢｃ，ｎ＝６）の前頭皮質におけるプロテオソームサブユニット：２０Ｓ複合体のサブユニットβ、２０ＳＸおよび２０ＳＹ、１９Ｓ複合体、ならびに１１Ｓαアクチベーターのタンパク質レベルを示す図である。β−アクチンを対照として用いた。画像は、表１に示した総てのサンプルのものである。ＴｏｔａｌＬａｂ ｖ２．０１ソフトウェアを用いたプロテオソームサブユニットのタンパク質レベルの濃度測定解析（平均±ＳＥＭ）。ＵＣＨ−Ｌ１タンパク質値は、β−アクチンのものを用いてノーマライズした。対照と病的状態にある患者との間には統計的に有意な差は認められなかった。
【図６】特異的なＵＣＨ−Ｌ１対立遺伝子Ｉ９３Ｍを増幅するように特別設計されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション温度と交差ハイブリダイゼーション温度を、正常な対立遺伝子に相補的なオリゴの値との比較により示す図である。Ｔｍ：ＵＣＨ−Ｌ１ Ｉ９３Ｍ遺伝子に特異的なオリゴとその相補的オリゴとのハイブリダイゼーション温度。Ｔｍ交差：ＵＣＨ−Ｌ１ Ｉ９３Ｍ遺伝子に特異的なオリゴと野生型ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子に対して相補的なオリゴとのハイブリダイゼーション温度。デルタＴｍ：Ｔｍ−Ｔｍ交差
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の目的
本発明は、レビー小体型認知症として知られる疾患、その純粋型および通常型の両方の分子診断法および治療に関し、それらは前記認知症の診断基準としてだけでなく、それらの予防および治療においても使用することができる。
【０００２】
発明の背景
先進諸国では、人口の高齢化により認知症に罹患している患者の数が増加している。これらの患者の多くは、アルツハイマー病（ＡＤ）を患っている。非ＡＤ性認知症の中でも、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）は罹患率(prevelance)が高い。ＤＬＢとは、皮質および皮質下にレビー小体が様々な度合いで存在することと関連した認知症の臨床病理症候群（びまん性レビー小体病、レビー小体型老年性認知症、さらにアルツハイマー病のレビー小体変異など）を表す。レビー小体型認知症（ＤＬＢ）と呼ばれるこの機能障害の臨床病理分類（McKeith IG, Galasko D, Kosaka K, et al. レビー小体型認知症（ＤＬＢ）の臨床病理診断の総合指針(Consensus guidelines for the clinical and pathological diagnosis of Dementia with Lewy bodies (DLB))：ＤＬＢ国際ワークショップコンソーシアム(Consortium on DLB International Workshop)での報告 Neurology 1996; 47: 1113-24. 2000; 54: 1050-8）では、ＡＤやパーキンソン病（ＰＤ）の特徴との共通項も考慮に入れられる。全体として、疾患の臨床データによりびまん性レビー小体病と診断されるが、この疾患についての確定的な診断学的検査はない。神経病理学的検査では、特徴、局在性および疾患に固有の分布により特徴的な変化が示されることから、この神経病理学的検査が、現在のところ、唯一の診断形式である。
【０００３】
診断での神経学的判定基準では、症状または核の徴候を考慮に入れる。よって、レビー小体型認知症の評価においては、注意、実行機能および視覚空間の欠陥が最も重症であり、短期記憶はＡＤの場合より比較的重症度は低いと見なされることが多い。認知変動(fluctuating cognition)の評価においては、注意および意識水準の変化や日没症候群の欠如についての様々なの時間的進行に遭遇する。別の重要な症状には、反復性幻視や精巧な幻視がある。一般に、このような幻視には、様々な侵攻度の「動きのある実体(animated subjets)」などがある。ＤＬＢにおいて、自発的錐体外路徴候は、硬直、運動緩徐(bradikynesia)および運動異常であり、安静時の震えはまれである。日ごとまたは週ごと（特に、初めに）起こる臨床変動がＤＬＢの診断を補足する様相である。診断感度を向上させるかもしれない１つの様相が、錐体外路運動徴候や幻視の中心の特徴の閾値および規模を定義するための判定基準となる。現行の判定基準のさらなる制限は、ＤＬＢの考えられるかまたは推定される性質を決定するのに利用されるアルゴリズムに、診断において示唆的な特徴が明確には含まれないということである。ＤＬＢの診断の精度をより高いものとするには、鑑別診断において示唆的な特徴の有用性と、睡眠の変化が及ぼすと考えられる影響度とを調査することが必要であろう（Kaufer DI. Dementia and Lewy bodies. Rev Neurol. 2003 JuI 16-31 ;37(2): 127-30. Review.）。
【０００４】
症例によっては、レビー神経突起、皮質の老人斑、タウ病変の徴候または海綿状変性が検出されるが、組織病理学的観点からのＤＬＢの診断における示唆的な徴候は、皮質および脳幹におけるレビー小体の存在にある（K.A. Jellinger, Morphological substrates of mental dysfunction in Lewy body disease. An update. J Neurol Transm Suppl 59 (2000), pp. 185-21）。上述のように、病変の特徴（レビー小体および神経突起）、その局在性（ニューロン神経突起内）およびその分布（脳幹、扁桃体、マイネルト基底核および大脳皮質に拡散する）はその疾患に特異的である。
最近の研究では、ＤＬＢの臨床発生率が年間１００，０００件に２６件であり、８０〜８４年に及んでは最高率の年間１００，０００件に６８．６件であると示している。この割合は、これまでの研究で年間１００，０００件に９３件確認されたＡＤより低いが、年間１００，０００件に１４件と推定される前頭側頭認知症（ＦＴＤ）の割合よりも高い。同研究で、文献に記載されているＤＬＢが男性優位であることを検出した。ＤＬＢとＡＤを有する男性の割合は６３．２％と２３．１％であった。この研究は患者の臨床サンプルに関する研究であり、一般集団のものではないことから、この研究ではいくつかの方法論的制限を考慮しなくてはならない。さらに、現行の臨床的判定基準の感度が足りないために実際の割合を過小評価する可能性があるということも考慮しなければならない。一般集団における発生率はわずかに高いかもしれない（S. Lopez-Pousa, J. Garre-Olmo, A. Turon-Estrada, E. Gelada-Batlle, M. Lozano-Gallego, M. Hernandez-Ferrandiz, V. Morante-Munoz, J. Peralta-Rodriguez, M. M. Cruz-Reina. Incidencia clinica de la demencia por cuerpos de Lewy. REV NEUROL 2003; 36 (8): 715-720）。
【０００５】
疾患の病因とその進行の分子機構はまだ解明されていない。しかし、この疾患の主要な組織病理学的特徴となるレビー小体の蓄積が最初の手掛かり、すなわち徴候の一部となった。レビー小体は、不溶性タンパク質沈着物によって主としてなるタンパク質沈着物であり、この不溶性タンパク質沈着物の主成分は、α−シヌクレイン、ユビキチンおよびユビキチン化タンパク質である。これらの総ては、欠陥があるかまたは過剰な細胞質タンパク質の生理学的分解を担うＵＰＳ系（ユビキチン−プロテアソーム）と呼ばれる細胞内系のメンバーである（Herschko A, Ciechanover A (1998) The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67: 425-479）。この系の機能低下は、ＡＤ、ＰＤ、ハンチントン病（ＨＤ）または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの特定の神経変性疾患の発症または進行に関わる原因の１つとして記載されている（Petrucelli L & Dawson TM. Mechanism of neurodegenerative disease: role of the ubiquitin proteasome system. Ann Med. 2004; 36(4): 315-20）。（Tran PB, Miller RJ. Aggregates in neurodegenerative disease: crowds and power? Trends Neurosci 1999 May; 22(5): 194-7）。
【０００６】
欠陥のある細胞質タンパク質の生理学的分解を担うＵＰＳ系（ユビキチン−プロテアソーム）の構成要素の１つがＵＣＨ−Ｌ１（ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼ Ｌ１）、すなわち、ユビキチンのカルボキシ末端グリシンと結合したタンパク質複合体のペプチド結合の加水分解に関与するチオール−プロテアーゼである。このＵＣＨ−Ｌ１は、細胞質において過剰なタンパク質の破壊を調節し、排除すべき新たなタンパク質との結合に利用できる状態にあるユビキチンを放出させる。ＵＣＨ−Ｌ１とパーキンソン病との相関関係については、ＰＤの病歴を有する同父母の兄弟姉妹における優性突然変異の検出に関して記載されている（Leroy E, Boyer R, Auburger G, Leube B, Ulm G, Mezey E, Harta G, Brownstein MJ, Jonnalagada S, Chernova T, Dehejia A, Lavedan C, Gasser T, Steinbach PJ, Wilkinson KD, Polymeropoulos MH (1998) The ubiquitin pathway in Parkinson's disease. Nature 395: 451-452）。ＵＣＨ−Ｌ１欠損マウスは、野生型対応物よりも低いin vivo 神経細胞のユビキチンレベルを示す。培養細胞では、ＵＣＨ−Ｌ１の過剰発現によって遊離ユビキチンレベルの増加がもたらされる（Osaka H, Wang YL, Takada K, Takizawa S, Setsuie R, Li H, Sato Y, Nishikawa K, Sun YJ, Sakurai M, Harada T, Hara Y, Kimura I, Chiba S, Namikawa K, Kiyama H, Noda M, Aoki S, Wada K (2003) Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds to and stabilizes monoubiquitin in neurons (Hum Mol Genet 12: 1945-1958)。ＵＣＨ−Ｌ１が、ＵＰＳ系の他のタンパク質、例えば、ユビキチン化タンパク質、ＨＳＰ７０、γ−チュブリン、より少ない程度には、２０ＳプロテアソームやＢｉＰシャペロン、と共に局在化することが実証されている（Ardley HC, Scott GB, Rose SA, Tan NG, Robinson PA. UCH-L1 aggresome formation in response to proteasome impairment indicates a role in inclusion formation in Parkinson's disease. J Neurochem. 2004 Jul; 90(2): 379-91）。最近になって、散発性ＡＤおよびＰＤにおけるＵＣＨ−Ｌ１の酸化状態の変化についても記載された（Choi J, Levey AI Weintraub ST, Rees HD, Gearing M, Chin LS, Li L (2004) Oxidation and down-regulation of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1 associated with idiopatic Parkinson's and Alzheimer's disease. J Biol. Chem 279: 13256-13264.）。
【０００７】
ＵＰＳ系とそれに関与する異なるタンパク質のような、分解と細胞内タンパク質ホメオスタシスの経路にも関わらず、ＰＤまたはＡＤなどの疾患の進行における中心的存在として提示されている。これらの疾患は、ＤＬＢと数多くの症状を共有する。この認知症、すなわち、ＡＤに次いで２番目に最も多い認知症の進行の原因および様式はまだ解明されていない。
【０００８】
ＤＬＢ患者が利用できる治療法の選択肢は、残念なことに、ごく限られており、多くの場合、精神科的およびパーキンソン病様症状を抑える対症療法しかない。しかし、震えおよび運動喪失を回復（amelloration）させる抗パーキンソン病薬は、幻覚症状や精神病傾向を急性に著しく悪化させ、症例によっては致命的な結末を生むことが多い。また、精神科的症状に処方される神経弛緩薬療法も運動傾向を著しく悪化させる。患者が示す傾向によっては、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、ドーパミン作動薬、短時間作用型および中時間作用型ベンゾジアゼピンならびに抗鬱薬はあまり役に立たないかもしれない（Rampello L, Cerasa S, Alvano A, Butta V V, Raffaele R, Vecchio I, Cavallaro T, Cimino E, Incognito T, Nicoletti F. Dementia with lewy bodies: a review. Arch Gerontol Geriatr. 2004 Jul-Aug; 39(1): 1-14.）
【０００９】
よって、レビー小体型認知症に関与する新たな遺伝子ならびに／またはレビー小体型認知症に関わる突然変異および／もしくはマーカーの同定が必要である。
【００１０】
遺伝子を同定することによって、他の認知症に対する選択的分子診断が可能になるだろうし、一般的な臨床実践にその診断を含めることが可能にもなるであろう。
【００１１】
同時に、重度に活動不能にするこのような種類の認知症に関連した補償費および医療費のかなりの節約にもなるであろう。
【００１２】
また、疾患のパーキンソン病様の特徴が確立されている患者へのより厳しいおよび／または個別の療法の適用が許されるため、陽性患者における予後および治療方針の新たな判定基準の採用も可能になるであろう。
【００１３】
最後に、この／これらの遺伝子と、その／それらの遺伝子の発現を変更して、疾患の進行を遅延または停止するかもしれない候補化合物を同定することによって、他の認知症に対する選択的分子診断が可能になるだけでなく、それらの遺伝子を不活化することを目的とする選択療法の設計も可能になるであろう。
【００１４】
発明の説明
本発明は、認知症の発症が疑われる患者におけるレビー小体型認知症（ＤＬＢ）の診断法であって、患者から得られたサンプルを解析して、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼ Ｌ１（ＵＣＨ−Ｌ１）遺伝子の発現レベルまたはこの遺伝子によってコードされるタンパク質の酵素活性を決定することを含む診断法に関する。
【００１５】
特に、このサンプルは、ＲＮＡまたはタンパク質であってよく、神経組織の生検もしくはその他の抽出法、または他の組織のその他の抽出法によって得られた細胞から、あるいは体液（脳脊髄液、血清または尿など）から単離することができる。
【００１６】
本発明の診断法は、ＵＣＨ−Ｌ１転写レベルの定量を可能にするＤＮＡのＰＣＲ増幅、ＳＤＡ増幅またはその他の増幅法による検出をさらに含む。
【００１７】
場合により、検出は、いずれかの機構に寄託されているオリゴヌクレオチドを用いて作製したＤＮＡバイオチップ、フォトリソグラフィーまたはいずれかの他の機構によりin situ合成されたオリゴヌクレオチドを用いて作製したＤＮＡバイオチップ、により実施してもよい。
【００１８】
検出は、ウエスタンブロットによって示されるタンパク質の量の解析、ＵＣＨ−Ｌ１に対して特異的な抗体を用いる「タンパク質チップ」、または質量分析によるか、もしくはＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルの定量を可能にするいずれかの他の機構により得られるタンパク質プロフィール、による検出によっても実施することができる。
【００１９】
場合により、検出を、ＵＣＨ−Ｌ１のin vitroまたはin vivoでの酵素活性（ユビキチンのエステルおよびアミドの加水分解活性、ならびにユビキチン−リガーゼ活性を含む）の直接または間接解析により実施してもよい。
【００２０】
検出は、前記遺伝子によってコードされるタンパク質またはその断片の直接解析および定量によっても実施することができる。
場合により、検出を、ＵＣＨ−Ｌ１リガーゼ活性による産物、すなわち、二量体または多量体型のポリユビキチンの存在についての直接または間接解析によって実施することができる。
一方で、本発明のさらなる目的は、このような種類の認知症の進行を停止または逆行させるためにＵＣＨ−Ｌ１レベルを増加させる化合物の能力に基づいて治療薬を同定するための化合物の解析方法を提供することである。化合物は、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子転写の特異的プロモーターまたはそのＵＣＨ−Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質の分解の特異的阻害剤であり得る。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、このような種類の認知症の進行を停止または逆行させるための、ＵＣＨ−Ｌ１酵素の加水分解活性を増加または増進させる化合物の使用である。これらの化合物は、ＵＣＨ−Ｌ１の最大率またはペプチジル−ユビキチンエステルまたはアミドに対する親和性に作用し得る。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、このような種類の認知症の進行を停止または逆行させるための、酵素ＵＣＨ−Ｌ１のリガーゼ活性を消失または低減させる化合物の使用である。そのような化合物は、遺伝子によってコードされるタンパク質のユビキチン−リガーゼ活性の特異的阻害剤として競合的または非競合的に作用し得る。
【００２３】
もう一方で、本発明のさらなる目的は、細胞培養物などのようなin vitro系におけるＵＣＨ−Ｌ１の加水分解活性の変化の解析に基づいて、レビー小体型認知症の治療的可能性を有する化合物を解析する方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、細胞培養物などのようなin vitro系におけるＵＣＨ−Ｌ１のユビキチン−リガーゼ活性の変化の解析に基づいて、レビー小体型認知症の治療的可能性を有する化合物を解析する方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、アンチセンスもしくはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、またはｍＲＮＡもしくはリガーゼ活性は与えるがタンパク質には翻訳されない対立遺伝子によって生じるｍＲＮＡの、不安定化および消失に基づく他のもの、などの配列情報に基づく医薬品を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子またはタンパク質配列（タンパク質と結合する際の親和性または最大率という意味においてその酵素活性を増加させる特異的抗体など）についての情報、あるいはアンチセンスもしくはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、またはｍＲＮＡもしくは正常な加水分解活性を有するその対立遺伝子に対して途中で干渉するかまたは減少させるがタンパク質には翻訳されない対立遺伝子によって生じるｍＲＮＡの、不安定化および消失に基づく他のもの、についての情報に基づく医薬品を提供することである。
【００２７】
本発明は、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）に罹患している一連の患者の大脳皮質組織において関心の高まっている６２７個の遺伝子についての、特異的オリゴヌクレオチドＤＮＡチップを用いたゲノム規模の遺伝子発現解析に端を発する。アルツハイマー病に見られるいくつかの症状も示すＤＬＢ（その純粋型または通常のものとして知られる型）に罹患している患者のサンプルを分析した。ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子のｍＲＮＡレベルは、対照と比べて低いだけでなく、アルツハイマー病（ＡＤ）またはパーキンソン病（ＰＤ）に罹患している患者群と比べても低いものであった。データは、リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの定量などの独立した技術により確認した。こうしたｍＲＮＡレベルの低下の意義を、死後組織において種々のｍＲＮＡ種が関与する一般的かつ特異的な分解プロセスに関しても確認した。同じ死後サンプルを処理し、異なる時間の間、室温にしてあった組織からＲＮＡを得た試験では、ＵＣＨ−Ｌ１レベルが構成的、すなわち比較的不変の転写物（β−アクチンなど）と比べても依然として変わらないままであることが分かった。
【００２８】
抗ＵＣＨ−Ｌ１特異的抗体を用いたウエスタンブロットによる解析では、ＤＬＢの大脳皮質においてタンパク質レベルが低下するが、ＰＤの場合には低下しないということも確認された。
【００２９】
ＵＣＨ−Ｌ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの低下は、対照と比べて統計的に有意であり、純粋型ＤＬＢの場合の信頼水準は０．９９、通常型の場合には０．９５であった。
【００３０】
レビー小体型認知症（ＤＬＢ）は、アルツハイマー病（ＡＤ）に次いで２番目に最も多い認知症である。組織病理学的には、大脳路、脊髄および自律神経節の特定の核におけるヒアリン体（レビー小体）の蓄積によって特徴付けられる。レビー小体はＰＤで生成されるが、レビー小体にこのα−シヌクレインタンパク質が蓄積することから、両方とも（ＰＤおよびＤＬＢ）α−シヌクレイン症と考えられている。ＤＬＢはＰＤといくつか類似症状を示すが、これらの２つの疾患は全く異なる神経学的傾向を示し、脳病変(cerebral affectation)も異なる。よって、例えば、ＤＬＢは、ＰＤでは見られない皮質の病変(affectation)を示す。ＰＤでは神経学的傾向として幻覚は見られない。ＤＬＢ患者における抗ＰＤ症状の治療により、これらの患者の神経系疾患傾向が非常に重く悪化する。これらの２つの疾患が明らかに異なるという十分に確立された臨床的かつ神経学的コンセンサスがある。
【００３１】
ＵＣＨ−Ｌ１は、欠陥があるか、突然変異したか、または過剰な細胞質タンパク質の生理学的分解を担うＵＰＳ系（ユビキチン−プロテアソーム）に関与する酵素である。ＵＣＨ−Ｌ１は、ユビキチンのカルボキシ末端グリシンと結合したタンパク質複合体のペプチド結合の加水分解を触媒するチオール−プロテアーゼである。これは、標的タンパク質の分解を調節し、さらなるタンパク質標的と結合することができるユビキチンを放出させる。
【００３２】
ＤＢＬと共通するいくつかの症状を示すが、ＤＢＬとは違って皮質には少しも影響を与えないＰＤでは、ユビキチン系について考えられる重要性がすでに指摘されている。遺伝性ＰＤの一部の症例では、ユビキチンと相互に作用することが分かっているタンパク質であるパーキンが突然変異を受けている（McNaught KS, Olanow CW (2003) Proteolytic stress: a unifying concept for the etiopathogenesis of Parkinson's disease. Ann Neurol 53: S73.-84）。ＵＣＨ−Ｌ１は、ある程度の優性度で、疾患感受性を与える点突然変異（Ｉ９３Ｍ）が存在するということが判明した場合にＰＤとも関係があった（Leroy E, Boyer R, Auburger G, Leube B, UIm G, Mezey E, Harta G, Brownstein MJ, Jonnalagada S, Chernova T, Dehejia A, Lavedan C, Gasser T, Steinbach PJ, Wilkinson KD, Polymeropoulos MH (1998) The ubiquitin pathway in Parkinson's disease. Nature 395: 451-452）。共同研究では、当時、ＰＤ１９７０症例と、関連のない対照２２２４例で実施した１１の研究を解析し、Ｓ１８Ｙ対立遺伝子とパーキンソン病との間に統計的に有意な逆相関があることが分かり（オッズ比（ＯＲ）０．８４（９５％信頼区間［ＣＩ］，０．７３〜０．９５）、対立遺伝子多型のホモ接合体（Ｙ／ＹとＳ／Ｓに加えてＹ／Ｓ）はＯＲ ０．７１（９５％ＣＩ，０．５７〜０．８８）を示した。これによりＵＣＨ−Ｌ１がＰＤについての感受性遺伝子であることが確認された。（Maraganore, D. M.; Lesnick, T. G.; Elbaz, A.; Chartier-Harlin, M. -C; Gasser, T.; Kruger, R.; Hattori, N.; Mellick, G. D.; Quattrone, A.; Satoh, J.; Toda, T.; Wang, J.; loannidis, J. P. A.; of Andrade, M.; Rocca, W. A.; UCH-L1 Global Genetics Consortium: UCH-L1 is a Parkinson's disease susceptibility gene. Ann. Neurol. 55: 512-521, 2004）。最近になって、アルツハイマー病と特発性パーキンソン病ではＵＣＨ−Ｌ１レベルが低下し、特定の酸化修飾が存在するということも記載された（Choi J, Levey Al, Weintraub ST, Rees HD, Gearing M, Chin LS, Li L (2004) Oxidative modifications and down-regulation of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1 associated with idiopathic Parkinson's and Alzheimer's disease. J Biol Chem 279: 13256-13264）。
【００３３】
しかし、ＵＣＨ−Ｌ１レベルとレビー小体型認知症との間に考えられる関連については、これまでのところ記載されていない。本発明は、対照との比較により、ＤＬＢ患者における大脳皮質のＵＣＨ−Ｌ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの低下との間にある明らかな相関関係を示す。さらに、本発明の試験は、ＤＬＢに罹患している患者におけるＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルの低下と、ユビキチン−プロテアソーム複合体の他の重要なタンパク質（２０ＳＸおよび２０ＳＹサブユニット、１９Ｓ複合体ならびにＰＡ２８アクチベーターの１１Ｓαサブユニットなど）の低減は同時に起こらないということを非常に明確に示している。これにより、大脳皮質内のＤＬＢ病理的傾向におけるＵＣＨ−Ｌ１レベル抑制の特異的かつ選択的な役割が示される。
【００３４】
現在、ＤＬＢが疑われる患者は、神経学的基本技術により評価され、問題解決困難および視空間障害、ならびに認知機能の変動およびはっきりとした幻覚の出現などの初期症状により精神機能の低下を検出している。後には、運動症状の出現が他の認知症に対するＤＬＢの鑑別診断における主要な特徴となる（McKeith IG, Galasko D, Kosaka K, Perry EK, Dickson DW, Hansen LA, Salmon DP, Lowe J, Mirra SS, Byrne EJ, Lennox G, Quinn NP, Edwardson JA, Ince PG, Bergeron C, Burns A, Miller BL, Lovestone S, Collerton D, Jansen EN, Ballard C, of Vos RA, Wilcock GK, Jellinger KA, Perry RH (1996) レビー小体型認知症（ＤＬＢ）の臨床病理診断の総合指針(Consensus guidelines for the clinical and pathological diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB))：ＤＬＢ国際ワークショップコンソーシアム(consortium on DLB international workshop)での報告. Neurology 47: 1113-1124およびMcKeith IG, Ballard CG, Perry RH, Ince PG, O'Brien JT, Neill D, Lowery K, Jaros E, Barber R, Thompson P, Swann A, Fairbairn AF, Perry EK. Prospective validation of consensus criteria for the diagnosis of dementia with Lewy bodies. Neurology. 2000 Mar 14; 54(5): 1050-8）。早期に決定的な診断を下すと、疾患の進行を低減または停止させるには治療限界があるであろう。
【００３５】
本発明の診断法に従い、ＤＬＢの解析は以下のとおりである：認知症の発症が疑われる、家族に関する臨床評価を非確定的に受けている患者を微量生検とＵＣＨ−Ｌ１レベルの定量により診断する。
【００３６】
本発明のもう１つの実施形態は、特に、ＵＣＨ−Ｌ１ ｍＲＮＡもしくはタンパク質レベルの増加を通じて、またはＵＣＨ−Ｌ１の１以上の酵素活性の修飾を通じて、細胞内遊離ユビキチンプールを再生する能力を変更するための抗ＤＬＢ療法の利用である。
【００３７】
ＵＣＨ−Ｌ１の酵素活性、すなわち、ユビキチンを放出するヒドロラーゼ活性（Larsen CN, Krantz BA, Wilkinson KD. Substrate specificity of deubiquitinating enzymes: ubiquitin C-terminal hydrolases. Biochemistry. 1998; 37: 3358-68.およびLarsen CN, Price JS, Wilkinson KD. Substrate binding and catalysis by ubiquitin C-terminal hydrolases: identification of two active site residues. Biochemistry. 1996; 35: 6735-44）とユビキチン−リガーゼ活性（Liu Y, Fallon L, Lashuel HA, Liu Z, Lansbury PT (2002) The UCH-L1 gene encodes two opposing enzymatic activities that affect α-synuclein degradation and Parkinson's disease susceptibility. Cell 111 : 209-218）を知ることにより、化合物の解析のための方法を設計することが可能になり、所望のようにＵＣＨ−Ｌ１活性を抑制する分子の有効性を測定することが可能になる。
【００３８】
抗ＤＬＢ療法は、神経組織または脳脊髄液もしくは末梢液においてＵＣＨ−Ｌ１レベルが低下していることを見出すことから始まる。ＵＣＨ−Ｌ１欠損マウスでは、ニューロンにおける遊離ユビキチンレベルが低下していた。ＵＣＨ−ＬＩを過剰発現している培養細胞およびトランスジェニックマウスモデルでは、ユビキチンレベルの増加が示される（Osaka .H, Wang YL, Takada K, Takizawa S, Setsuie R, Li H, Sato Y, Nishikawa K, Sun YJ, Sakurai M, Harada T, ,Hara Y, Kimura I, Chiba S, Namikawa K, Kiyama H, Noda M, Aoki S, Wada K (2003) Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds to and stabilizes monoubiquitin in neuron. Hum Mol Genet 5 12: 1945-1958）。さらに、レビー小体およびレビー神経突起においてα-シヌクレインとユビキチンとが共に局在化すること（McNaught KS, Olanow CW (2003) Proteolytic stress: a unifying concept for the etiopathogenesis of Parkinson's disease. Ann Neurol 53: S73-84; McNaught KS, Mytilineou C, Jnobaptiste R, Yabut J, Shashidharan P, Jennert P, Olanow CW (2002) Impairment of the ubiquitin-proteasome system causes dopaminergic cell death and inclusion body formation in ventral mesencephalic cultures. J Neurochem 81: 301-306）、加えて、ＤＬＢでは、主としてＵＣＨ−Ｌ１活性の低下に起因して起こる、ＵＰＳ複合体の重要な成分の減少はないということを示す証拠から、ユビキチン−プロテアソーム系がＰＤおよびＤＬＢの発症機序に関与しているという極めて有望な仮説が成り立つ。
【００３９】
よって、ＵＣＨ−Ｌ１レベルとＤＬＢ疾患との間に明らかな相関関係が確立されることにより、活性酵素レベルを増加させ、ユビキチン−リガーゼ活性を不活化させ、またはヒドロラーゼ活性を活性化させるための技術および化合物の新規用途を考えることが可能になる。技術および／または活性化合物のこのような用途では、技術および／または活性化合物によって細胞質プール中の利用可能な遊離ユビキチンが増加することから、ニューロンでは排除すべきタンパク質が正確に異化されるため、疾患を遅らせ、かつ／または疾患を緩解させることができる。これにより、α−シヌクレインや、レビー小体に関与するその他のタンパク質の濃度が低下することになる。
【００４０】
ＵＣＨ−Ｌ１の過剰発現アプローチの一例は、ユビキチン−リガーゼ能力の低いＳ１８Ｙ型ＵＣＨ−Ｌ１をコードするカセットの、アデノウイルスまたはレトロウイルス発現ベクターもしくはその他の種類の発現ベクターへの挿入である。このベクターは、移植により発現ベクターを有する胚または成体起源（脳室下帯またはその他由来）の神経幹細胞に導入してもよい。同様のアプローチには、転写因子をコードする幹細胞の移植がある。最近になって、細胞周期のＧ１／Ｓ期遷移を調整する鳥類レトロウイルス癌遺伝子である、転写因子Ｂ−Ｍｙｂ（ｖ−Ｍｙｂとの類似性により同定された）（N. Nomura, M. Takahashi, M. Matsui et al., Isolation of human cDNA clones of myb-related genes, a-myb and b-myb. Nucleic Acids Res. 16 (1988), pp. 11075-11089（Nucleic Acids Res. 1989 February 11; 17(3): 1282に訂正を掲載））が、ラット肺におけるＵＣＨ−Ｌ１のin vitroおよびin vivo両方での発現を刺激する（Long EM, Long MA, Tsirigotis M, Gray DA. Stimulation of the murine UCH-L1 gene promoter by the B-Myb transcription factor. Lung Cancer. 2003 Oct; 42(1):9-21）ことが証明された。
【００４１】
この点についてのもう１つの例には、加水分解活性の高い突然変異型ＵＣＨ−Ｌ１の導入がある。
【００４２】
この効果の具体例は、ラット腹側中脳(ventral mesencephal)の神経細胞系統を用いて主張することができる。この神経細胞系統では、ＵＣＨ−Ｌ１を阻害することによってα-シヌクレイン凝集体が生成し、過剰発現させることによって遊離ユビキチンの量の増加が生じる。
【００４３】
もう１つの試験例がＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞系統で得られた。このＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞系統では、５〜１００μＭのＭＰＰ＋（ＭＰＴＰの活性代謝物である）で処置することで、処置後４日内にＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でアポトーシスが起こり、さらにＤＬＢに特有のレビー凝集体を形成するα−シヌクレインを過剰発現させることが分かった（Gomez-Santos C, Ferrer I, Reiriz J, Vinals F, Barrachina M, Ambrosio S. MPP+ increases alpha-synuclein expression, and ERK/MAP-kinase phosphorylation in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Brain Res. 2002 May 10; 935 (1-2): 32-9.）
【００４４】
ＵＣＨ−Ｌ１突然変異（german突然変異 Ｉ９３Ｍ）が加水分解活性の５０％低下を引き起こしているＰＤの一症例によって記載されているように、認知症のごく一部のもので、家系特有の性質をもつものもある（Lansbury PT, Brice A (2002) Genetics of Parkinson's disease and biochemical studies of implicated gene products. Curr Opin Genet Dev 13: 299-306.）。いくつかのＤＬＢのサブタイプは、ある程度に常染色体優性を示すように思われる（Harding AJ, Das A, Kril JJ, Brooks WS, Duffy D, Halliday GM. Identification of families with cortical Lewy body disease. Am J Med Genet. 2004 Jul 1; 128B(1): 118-22）。ＵＣＨ−Ｌ１の突然変異Ｉ９３Ｍは、その浸透度は完全ではないが、特定の優性度も示し、途中での対立遺伝子の補償現象が想定される（Liu Y, Fallon L, Lashuel HA, Liu Z, Lansbury PT (2002) The UCH-L1 gene encodes two opposing enzymatic activities that affect α-synuclein degradation and Parkinson's disease susceptibility. Cell 111: 209-218）
【００４５】
酵素活性の化学的および免疫学的阻害は、例えば、腫瘍学において、例えば、結腸直腸癌におけるβ−カテニンや慢性骨髄性白血病におけるＢＣＲ−ＡＢＬに対する適用が見られる。これらの観察から、特定の癌遺伝子が破壊を受けやすく、その破壊により腫瘍表現型となるか、または標準的な併用治療の有効性をもたらす可能性があることを示唆する。遺伝子破壊に利用可能な機構のうち、最も期待できるアプローチの１つが短い干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。ペチュニアで最初に見つかり（Napoli C, Lemieux C, and Jorgensen R. (1990) Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia results in reversible cosuppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279-289）、その分子作用機構については記載されており（Hammond SM, Caudy AA, Hannon GJ. (2001) Post-transcriptional Gene Silencing by Double-stranded ARN. Nature Rev Gen 2: 110-119）、制癌目的でのその利用に大きな期待を与えた（Kittler R, Buchholz F. RNA interference: gene silencing in the fast lane. Semin Cancer Biol. 2003 Aug; 13(4): 259-65; Deveraux QL, Aza-Blanc P, Wagner KW, Bauerschlag D, Cooke MP, Hampton GM. Exposing oncogenic dependencies for cancer drug target discovery and validation using RNAi. Semin Cancer Biol. 2003 Aug; 13(4): 293-300; Bedford JS, Liber HL Applications of RNA interference for studies in DNA damage processing, genome stability, mutagenesis, and cancer. Semin Cancer Biol. 2003 Aug; 13(4): 301-8）。同様に、アンチセンスアプローチによっても、Ｉ９３Ｍ対立遺伝子または加水分解活性を低下させるその他のものによって生じるメッセンジャーのレベルが低下する可能性がある。
【００４６】
短い干渉ＲＮＡ（１９量体〜２２量体）による標的治療では、抗対立遺伝子Ｉ９３Ｍまたは同様の標的として使用するためにｃＤＮＡの特定の配列を選択しなければならない。Oryzon社によって開発されたオリゴヌクレオチド設計ソフトウェアＴｅｔｈｙｓにより、事前評価を実施して、ゲノムに存在する配列を発現する他のものと交差ハイブリダイゼーションする可能性がより低くいために、他の遺伝子の発現に影響を及ぼす可能性が低くなるオリゴヌクレオチドを同定した。また、Ｔｅｔｈｙｓを使用して、所望の対立遺伝子の発現を低下させる効果を最大にする、オリゴにおける特異的塩基の最も有利な位置も決定することができる。後に、Ｔｅｔｈｙｓを使用して、図６に示されるような標的配列に応じて最も有利なオリゴヌクレオチド長を評価する。
【００４７】
下表では、ＵＣＨ−Ｌ１ Ｉ９３ＭまたはＩ９３Ｍ 突然変異を含まないＵＣＨ−Ｌ１対立遺伝子の発現を低下させるための、ｃＤＮＡにおける標的候補のいくつかを例として示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
また、それも、レビー凝集体によって起こる神経損傷を予防することができる治療化合物および／または医薬組成物の解析にin vitro系を使用する本発明の一部である。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞系統などの細胞系統では、５〜１００μＭのＭＰＰ＋（ＭＰＴＰの活性代謝物）で処置することによって、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でアポトーシスが起こり、さらにＤＬＢに特有のレビー凝集体を形成するα−シヌクレインを過剰発現する(Gomez-Santos C, Ferrer I, Reiriz J, Vinals F, Barrachina M, Ambrosio S. MPP+ increases alpha-synuclein expression and ERK/MAP-kinase phosphorylation in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Brain Res. 2002 May 10; 935 (1-2): 32-9)。これらの細胞系統では、ＵＣＨ−Ｌ１レベル、その酵素活性、α−シヌクレイン沈着物および細胞のアポトーシスをモニタリングすることにより化合物の有効性を確認することができる。これらの治療化合物および／または医薬組成物は、ＵＣＨ−Ｌ１タンパク質と結合し、非競合的にユビキチン−リガーゼ活性を阻害し、通常のユビキチンを放出するその能力を回復させることができる。あるいは、これらの治療化合物および／または医薬組成物は、ＵＰＳ系の変化の影響によるタンパク質の過剰蓄積により、細胞シグナル伝達経路の発現を変更することができる。
【００５０】
好ましい実施形態の説明
以下、好ましい実施形態について記載するが、本発明を限定するものではない。
下表では、本シリーズで研究する症例を、対応する神経病理学的データとともにまとめる：パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症純粋型（ＤＬＢｐ）および通常型（ＤＬＢｃ）、ならびに対照。Ｍ：男性、Ｆ：女性。ＮＦＴ：神経原線維変化。ブラーク病期は、Braak および Braak (Braak H, Braak E (1999) Temporal sequence of Alzheimer's disease related pathology. In: Cerebral cortex, vol 14, Neurodegenerative and age-related changes in structure and function of cerebral cortex (Peters A, Morrison JH, eds), pp 475-512. New York, Boston, Dordrecht, London, Moscow: Kluwer Academic/Plenum Publishers.)が記載している、ＤＤＬＢを伴うアルツハイマー病（ＡＤ）の変化を示している。
【００５１】
【表２】
【００５２】
ＲＮＡおよびタンパク質サンプルは下記のような倫理的許諾を得た患者から単離した。
種々の患者および対照に由来する皮質領域８のサンプルからのｍＲＮＡの単離
ｍＲＮＡを二工程で単離した。ＴＲｉｚｏｌ試薬(Life Technologies)を用いて全ＲＮＡを得、次に、RNeasy Protect Mini Kit (Qiagen)を用い、トランスファーＲＮＡと５Ｓおよび５．８ＳリボソームＲＮＡを含まないｍＲＮＡを得た。冷凍ヒト脳組織をそのまま、組織１００ｍｇ当たり１ｍｌのＴＲｉｚｏｌ中でホモジナイズし、製造業者のプロトコールに従って全ＲＮＡを抽出した。精製した全ＲＮＡを１００μｌのＲＮアーゼフリー水に再懸濁し、RNeasy Protect Mini Kitに示されている明細に軽微な変更を加え（ゲノムＤＮＡはＴＲｉｚｏｌによる抽出の際に除去されたことから、ＤＮアーゼＩ処理は行わなかった）、ｍＲＮＡの精製を行った。各サンプルの濃度を２６０ｎｍでの吸光度により測定し、ＲＮＡの完全性をアガロース−ホルムアルデヒドゲル電気泳動により確認した。
【００５３】
ＤＮＡアレイ
トランスクリプトミクス分析のため、ＲＮＡサンプルを、断片サイズおよびサンプル濃度ならびに１６Ｓと２８ＳＲＮＡの間のシグナル比を算出するAgilent 2100 BioAnalyzerを用いてさらに分析した。総てのサンプルをKit MessageAmp RNA (Ambion)で標識した。第一鎖のｃＤＮＡ合成は、オリゴ−ｄＴプライマーを用いてプライミングした。標識ＲＮＡのサンプルを、特に着目する６２７個の遺伝子を表す（各々はＤＮＡ−チップの表面に無作為に分布した５つのオリゴ２組で表される）オリゴＤＮＡ−チップで分析した。これらのオリゴは、１つの機器内に総ての機能を組み込んだマイクロアレイプラットフォームである、FEBIT製のGeniom IベンチトップＤＮＡ−チップ合成装置を用いて合成した(Baum M, Bielau S, Rittner N, Schmid K, Eggelbusch K, Dahms M, Schlauersbach A, Tahedl H, Beier M, Guimil R, Scheffler M, Hermann C, Funk JM, Wixmerten A, Rebscher H, Honig M, Andreae C, Buchner D, Moschel E, Glathe A, Jager E, Thom M, Greil A, Bestvater F, Obermeier F, Burgmaier J, Thome K, Weichert S, Hein S, Binnewies T, Foitzik V, Muller M, Stahler CF, Stahler PF. Validation of a novel, fully integrated and flexible microarray benchtop facility for gene expression profiling. Nucleic Acids Res 2003;31:e151)。生データをLowessの非線形法を用いてノーマライズした(Workman C, Jensen LJ, Jarmer H, Berka R, Gautier L, Nielser HB, Saxild HH, Nielsen C, Brunak S, Knudsen S. A new non-linear normalization method for reducing variability in DNA microarray experiments. Genome Biol 2002;3:9)。
【００５４】
これらの試験において、本発明者らは、対照に対するＤＢＬのカットオフ変化倍率を、抑制遺伝子に関しては０．７５、過剰発現遺伝子には１．５に設定した。本発明者らは、１つの過剰発現遺伝子と１６の抑制遺伝子を得たが、それらのうちいくつかはＵＰＳ分解経路に関与するものであり、有意な程度でＵＣＨ−Ｌ１に関与するものであった。このバリエーションを確認するために相補的技術を用いた。
【００５５】
ｃＤＮＡの合成とＰＣＲ Ｔａｑｍａｎ
各１０μｌの逆転写反応液中、２００ｎｇのヒトＲＮＡ（水３．８５μｌ中）と、２．５μＭのオリゴ−ｄＴプライマー、１×ＲＴ ＴａｑＭａｎバッファー、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、０．０８ＵのＲＮアーゼ阻害剤ならびに０．３１Ｕの逆転写酵素MultiScribe (Applied Biosystems)とを混合した。プライマー−ＲＮＡ鋳型の結合を最大とするために２５℃で１０分間反応を行った後、４８℃で３０分間インキュベーションし、９５℃で５分間逆転写酵素を不活化した。ゲノムＤＮＡの混入がないことを確認するために、逆転写物酵素MultiScribeの不在下で並行反応を行った。ＴａｑＭａｎプローブ(Applied Biosystems)は、フォワードＰＣＲプライマーとリバースＰＣＲプライマーの間の鋳型ＤＮＡ鎖の１つにアニーリングする。ＴａｑＭａｎプローブは、Ｔａｑポリメラーゼがハイブリダイズする蛍光団を含み、遊離した蛍光団の量が、そのＰＣＲ反応において生じた産物の量に比例する。プライマーとヒトＵＣＨ−Ｌ１およびβ−アクチン遺伝子に特異的なプローブは、Applied Biosystemsからオンデマンドアッセイとして入手した。ヒトβ−アクチンを内部標準として用いた。
【００５６】
ＵＣＨ−Ｌ１および内部標準β−アクチンに対するＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイは、サーモサイクラーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム(PE Applied Biosystems)を用い、９６ウェルオプティカルプレート中のｃＤＮＡサンプルで３回行った。このプレートをオプティカルストリップ(Applied Biosystems)でカバーした。各２０μｌのＴａｑＭａｎ反応液中、９μｌのｃＤＮＡ（１／５０希釈、ＲＮＡ４ｎｇから得られたｃＤＮＡにほぼ相当する）と、１μｌの２０×ＴａｑＭａｎプローブおよび１０μｌの2xTaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)を混合した。対照およびノーマライゼーション目的で、各サンプルに関して、β−アクチンプライマーとプローブを用いて並行アッセイを行った。反応は次のようなインキュベーションにより行った：５０℃２分、９５℃１０分、および９５℃１５秒を４０サイクル、６０℃１分。ＵＣＨ−Ｌ１およびβ−アクチンに関する標準曲線は、対照ヒト脳由来ＲＮＡの一連の希釈物をｃＤＮＡに変換したものを用いて作製した。最後に、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲからのデータは総て、Sequence Detector Software (SDS version 1.9; Applied Biosystems)を用いて採取した。
【００５７】
電気泳動およびウエスタンブロット法
ＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルが低下したかどうかを確認するため、冷凍前頭皮質（１００ｍｇ）のサンプルをそのまま、１ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＤＴ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチン）中でホモジナイズし、音波処理を施した。溶解液を４℃にて５，０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、タンパク質濃度をＢＣＡ法(Pierce)によって測定した。５０μｇの全タンパク質を９５℃で３分加熱し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にＴｒｉｓ−グリシンバッファーを用いてロードした。mini-protean system (Bio-Rad)を用いたゲル電気泳動によりタンパク質を分離し、Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad)を用い、４０ｍＡで４５分、ニトロセルロースメンブレン(Bio-Rad)に移した。ニトロセルロースメンブレンを、５％脱脂乳を含有するTween 20 TBS (TBST)で３０分ブロッキングした。その後、メンブレンを、３％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴバッファーで調製した対応する一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。使用した抗体は、抗ＵＣＨ−Ｌ１（ＡＢ５９３７, Chemicon）、抗ＵＣＨ−Ｌ１（ＭＣＡ−２０８４, Serotec）、抗β−アクチン（クローンＡＣ−７４, Sigma）、抗１９Ｓ １βプロテオソーム（ＰＡ１−９７３, Affinity BioReagents）、抗１１Ｓαプロテオソームアクチベーター（ＰＡ１−９６０, Affinity BioReagents）、抗２０ＳＸプロテオソーム（ＰＡ１−９７７, Affinity BioReagents）および抗２０ＳＹプロテオソーム（ＰＡ１−９７８, Affinity BioReagents）であった。抗体は１：５００希釈で用いた。一次抗体とともにインキュベートした後、メンブレンを室温にて５分、ＴＢＳＴバッファーで３回洗浄し、その後、対応する二次抗体、すなわち、ペルオキシダーゼで標識されたＩｇＧ(Dako)の１：１，０００（β−アクチンの場合は１：５，０００）希釈液とともに室温で１時間インキュベートした。次に、メンブレンを室温にて５分、ＴＢＳＴバッファーで４回洗浄し、化学発光ＥＣＬウエスタンブロッティングシステム(Amersham/Pharmacia)で現像した後、オートラジオグラフィーフィルム(Hyperfilm ECL, Amersham)に露光した。ＵＣＨ−Ｌ１レベルの定量は、血清または脳脊髄液などの末梢組織で行ってもよい。図４に示されるように、内在ＵＣＨ−Ｌ１レベルはこれらの体液において検出することができる。
【００５８】
データの定量分析
ウエスタンブロットバンドの濃度測定的定量は、ＴｏｔａｌＬａｂ ｖ２．０１ソフトウェアを用いて行った。統計分析には、Statgraphics Plus v5ソフトウェアを用いた。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】Ａ）ヒト脳の皮質領域８由来ＲＮＡの一連の希釈物によるＵＣＨ−Ｌ１増幅のグラフ。横線は、手動調整した指数増殖期の閾値を表す。蛍光強度はＰＣＲサイクルとともに増す。蛍光強度が閾値ラインを越えるサイクル数を閾値ＣＴと定義し、定量はそれに基づいて行われる。Ｂ）異なる濃度の対照ヒト脳由来ＲＮＡから作成した、β−アクチンおよびＵＣＨ−Ｌ１に関する典型的な標準曲線。ＣＴ値（ｙ軸）は対照サンプルＲＮＡの異なる濃度の対数（ｘ軸）に対して逆線形相関を示す。
【図２】対照（Ｃ，ｎ＝６）、パーキンソン病（ＰＤ，ｎ＝６）、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症，純粋型（ＤＬＢｐ，ｎ＝７）および通常型（ＤＬＢｃ，ｎ＝６）の前頭皮質におけるＵＣＨ−Ｌ１遺伝子の相対的発現レベルを示す図である。（Ａ）β−アクチンを用いてノーマライズしたＵＣＨ−Ｌ１ ｍＲＮＡのレベル（平均±ＳＥＭ）。Ｂ）前頭皮質（領域８）の全ホモジネートのウエスタンブロットによって検出されたＵＣＨ−Ｌ１タンパク質のレベル（約２５ＫＤａの２つのバンド）。β−アクチン（４５ｋＤａ）をタンパク質ロードの対照として検出した。画像は、調査した、表１に示した総てのサンプルのものである。Ｃ）ＴｏｔａｌＬａｂ ｖ２．０１ソフトウェアを用いたＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルの濃度測定解析（平均±ＳＥＭ）。ＵＣＨ−Ｌ１のタンパク質レベルは、β−アクチンのものを用いてノーマライズした。対照サンプルとの比較により、値は＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１で統計的に有意であった（ＡＮＯＶＡと事後検定ＬＳＤ）。
【図３】個体サンプル（死後３時間）の前頭皮質の全ホモジネートのウエスタンブロットによって検出されたＵＣＨ−Ｌ１タンパク質のレベル（約２５ＫＤａの２つのバンド）の死後の安定性を示す図である。サンプルは、すぐに液体窒素（０時間）で凍結するか、または室温にて３時間、６時間もしくは２２時間放置した後に、液体窒素で凍結した。２２時間まで目立ったＵＣＨ−Ｌ１の分解は見られない。
【図４】対照被験体の血清でのウエスタンブロットによって検出されたＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルを示す図である。画像は、ＵＣＨ−Ｌ１の見かけの分子量に相当するバンドを示している。
【図５】対照（Ｃ，ｎ＝６）、パーキンソン病（ＰＤ，ｎ＝６）、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、純粋型（ＤＬＢｐ，ｎ＝７）および通常型（ＤＬＢｃ，ｎ＝６）の前頭皮質におけるプロテオソームサブユニット：２０Ｓ複合体のサブユニットβ、２０ＳＸおよび２０ＳＹ、１９Ｓ複合体、ならびに１１Ｓαアクチベーターのタンパク質レベルを示す図である。β−アクチンを対照として用いた。画像は、表１に示した総てのサンプルのものである。ＴｏｔａｌＬａｂ ｖ２．０１ソフトウェアを用いたプロテオソームサブユニットのタンパク質レベルの濃度測定解析（平均±ＳＥＭ）。ＵＣＨ−Ｌ１タンパク質値は、β−アクチンのものを用いてノーマライズした。対照と病的状態にある患者との間には統計的に有意な差は認められなかった。
【図６】特異的なＵＣＨ−Ｌ１対立遺伝子Ｉ９３Ｍを増幅するように特別設計されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション温度と交差ハイブリダイゼーション温度を、正常な対立遺伝子に相補的なオリゴの値との比較により示す図である。Ｔｍ：ＵＣＨ−Ｌ１ Ｉ９３Ｍ遺伝子に特異的なオリゴとその相補的オリゴとのハイブリダイゼーション温度。Ｔｍ交差：ＵＣＨ−Ｌ１ Ｉ９３Ｍ遺伝子に特異的なオリゴと野生型ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子に対して相補的なオリゴとのハイブリダイゼーション温度。デルタＴｍ：Ｔｍ−Ｔｍ交差
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から得られたサンプルを解析して、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼ Ｌ１（ＵＣＨ−Ｌ１）遺伝子の発現レベルまたはこの遺伝子によってコードされるタンパク質の酵素活性を決定することを含んでなる、認知症の発症が疑われる患者におけるレビー小体型認知症（ＤＬＢ）の診断法。
【請求項２】
解析された前記サンプルが、ＲＮＡまたはタンパク質である、請求項１に記載の診断法。
【請求項３】
解析および定量された前記サンプルが、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質またはその断片である、請求項１または２に記載の診断法。
【請求項４】
前記サンプルが、生検またはその他の抽出法によって得られた神経組織の細胞から単離される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項５】
前記サンプルが、生検またはその他の抽出法によって得られた末梢神経内分泌細胞などのその他の組織の細胞から単離される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項６】
前記サンプルが、脳脊髄液、血清、または尿などの体液から単離される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項７】
検出が、ＵＣＨ−Ｌ１転写産物レベルの定量を可能にするｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、ＳＤＡ増幅、またはその他の増幅法によって実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項８】
検出が、いずれかの機構に寄託されているオリゴヌクレオチドを用いて作製されたＤＮＡバイオチップにより実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項９】
検出が、フォトリソグラフィーまたはその他の機構によりin situ合成されたオリゴヌクレオチドを用いて作製されたＤＮＡバイオチップにより実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項１０】
検出が、ウエスタンブロットによる存在するタンパク質の量の解析、ＵＣＨ−Ｌ１に対して特異的な抗体を用いる「タンパク質チップ」、または質量分析によるか、もしくはＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルの定量を可能にするその他の機構により得られるタンパク質プロフィールにより、実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項１１】
検出が、ＵＣＨ−Ｌ１のin vitroまたはin vivoでの酵素活性（ユビキチンのエステルおよびアミドの加水分解活性、ならびにユビキチン−リガーゼ活性を含む）の直接または間接解析により実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項１２】
解析および定量された前記サンプルが、ＵＣＨ−Ｌ１リガーゼ活性による産物である二量体または多量体型のポリユビキチニンである、請求項１１に記載の診断法。
【請求項１３】
解析および定量された前記サンプルが、ＵＣＨ−Ｌ１ヒドロラーゼ活性による産物である遊離型のモノユビキチニンである、請求項１１に記載の診断法。
【請求項１４】
ＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルを増大させるレビー小体型認知症の進行を停止または逆行させるための、化合物の使用。
【請求項１５】
前記化合物が、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子転写の特異的プロモーターである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記化合物が、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質の分解の特異的阻害剤である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
レビー小体型認知症の進行を停止または逆行させるための、酵素ＵＣＨ−Ｌ１のリガーゼ活性を消失または低減させる化合物の使用。
【請求項１８】
前記化合物が、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質のユビキチン−リガーゼ活性の競合的または非競合的な特異的阻害剤である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
細胞培養物などのようなin vitro系におけるＵＣＨ−Ｌ１のユビキチン−リガーゼ活性の変化の解析に基づいて、レビー小体型認知症の治療的可能性を有する化合物を解析する方法。
【請求項２０】
前記化合物が、アンチセンスもしくはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、またはｍＲＮＡもしくは、リガーゼ活性は与えるがタンパク質には翻訳されない対立遺伝子によって生じるｍＲＮＡの、不安定化および消失に基づく他のもの、などの配列情報に従って作製される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
レビー小体型認知症の進行を停止または逆行させるための、ＵＣＨ−Ｌ１酵素の加水分解活性を増加させる化合物の使用。
【請求項２２】
前記化合物が、ウィルス発現ベクターまたは他のタイプの発現ベクターに挿入され、適当なプロモーターの制御下で、ＵＣＨ−Ｌ１酵素に加水分解活性を付与してレビー小体型認知症の進行を停止かまたは逆行させるｍＲＮＡの過剰発現または過剰安定化を引き起こす、遺伝子または機能のコード単位等の配列情報に従って作製される、請求項２１に記載の化合物の使用。
【請求項２３】
前記化合物が、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質の加水分解活性を増加または増進させるのに特異的である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
細胞培養物などのようなin vitro系におけるＵＣＨ−Ｌ１の加水分解活性の変化の解析に基づいて、レビー小体型認知症の治療的可能性を有する化合物を解析する方法。
【請求項２５】
前記化合物が、タンパク質と結合する際の親和性または最大率という意味においてその酵素活性を増加させる特異的抗体などについての配列情報に従って作製される、請求項２３記載の使用。
【請求項２６】
前記化合物が、アンチセンスもしくはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、またはｍＲＮＡもしくは、正常な加水分解活性を有するその対立遺伝子に対して途中で干渉するかまたは減少させるが、タンパク質には翻訳されない対立遺伝子によって生じるｍＲＮＡの、不安定化および消失に基づく他のもの、についての配列情報に従って作製される、請求項２２記載の使用。
【請求項１】
患者から得られたサンプルを解析して、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼ Ｌ１（ＵＣＨ−Ｌ１）遺伝子の発現レベルまたはこの遺伝子によってコードされるタンパク質の酵素活性を決定することを含んでなる、認知症の発症が疑われる患者におけるレビー小体型認知症（ＤＬＢ）の診断法。
【請求項２】
解析された前記サンプルが、ＲＮＡまたはタンパク質である、請求項１に記載の診断法。
【請求項３】
解析および定量された前記サンプルが、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質またはその断片である、請求項１または２に記載の診断法。
【請求項４】
前記サンプルが、生検またはその他の抽出法によって得られた神経組織の細胞から単離される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項５】
前記サンプルが、生検またはその他の抽出法によって得られた末梢神経内分泌細胞などのその他の組織の細胞から単離される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項６】
前記サンプルが、脳脊髄液、血清、または尿などの体液から単離される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項７】
検出が、ＵＣＨ−Ｌ１転写産物レベルの定量を可能にするｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、ＳＤＡ増幅、またはその他の増幅法によって実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項８】
検出が、いずれかの機構に寄託されているオリゴヌクレオチドを用いて作製されたＤＮＡバイオチップにより実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項９】
検出が、フォトリソグラフィーまたはその他の機構によりin situ合成されたオリゴヌクレオチドを用いて作製されたＤＮＡバイオチップにより実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項１０】
検出が、ウエスタンブロットによる存在するタンパク質の量の解析、ＵＣＨ−Ｌ１に対して特異的な抗体を用いる「タンパク質チップ」、または質量分析によるか、もしくはＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルの定量を可能にするその他の機構により得られるタンパク質プロフィールにより、実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項１１】
検出が、ＵＣＨ−Ｌ１のin vitroまたはin vivoでの酵素活性（ユビキチンのエステルおよびアミドの加水分解活性、ならびにユビキチン−リガーゼ活性を含む）の直接または間接解析により実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の診断法。
【請求項１２】
解析および定量された前記サンプルが、ＵＣＨ−Ｌ１リガーゼ活性による産物である二量体または多量体型のポリユビキチニンである、請求項１１に記載の診断法。
【請求項１３】
解析および定量された前記サンプルが、ＵＣＨ−Ｌ１ヒドロラーゼ活性による産物である遊離型のモノユビキチニンである、請求項１１に記載の診断法。
【請求項１４】
ＵＣＨ−Ｌ１タンパク質レベルを増大させるレビー小体型認知症の進行を停止または逆行させるための、化合物の使用。
【請求項１５】
前記化合物が、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子転写の特異的プロモーターである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記化合物が、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質の分解の特異的阻害剤である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
レビー小体型認知症の進行を停止または逆行させるための、酵素ＵＣＨ−Ｌ１のリガーゼ活性を消失または低減させる化合物の使用。
【請求項１８】
前記化合物が、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質のユビキチン−リガーゼ活性の競合的または非競合的な特異的阻害剤である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
細胞培養物などのようなin vitro系におけるＵＣＨ−Ｌ１のユビキチン−リガーゼ活性の変化の解析に基づいて、レビー小体型認知症の治療的可能性を有する化合物を解析する方法。
【請求項２０】
前記化合物が、アンチセンスもしくはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、またはｍＲＮＡもしくは、リガーゼ活性は与えるがタンパク質には翻訳されない対立遺伝子によって生じるｍＲＮＡの、不安定化および消失に基づく他のもの、などの配列情報に従って作製される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
レビー小体型認知症の進行を停止または逆行させるための、ＵＣＨ−Ｌ１酵素の加水分解活性を増加させる化合物の使用。
【請求項２２】
前記化合物が、ウィルス発現ベクターまたは他のタイプの発現ベクターに挿入され、適当なプロモーターの制御下で、ＵＣＨ−Ｌ１酵素に加水分解活性を付与してレビー小体型認知症の進行を停止かまたは逆行させるｍＲＮＡの過剰発現または過剰安定化を引き起こす、遺伝子または機能のコード単位等の配列情報に従って作製される、請求項２１に記載の化合物の使用。
【請求項２３】
前記化合物が、ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子によってコードされるタンパク質の加水分解活性を増加または増進させるのに特異的である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
細胞培養物などのようなin vitro系におけるＵＣＨ−Ｌ１の加水分解活性の変化の解析に基づいて、レビー小体型認知症の治療的可能性を有する化合物を解析する方法。
【請求項２５】
前記化合物が、タンパク質と結合する際の親和性または最大率という意味においてその酵素活性を増加させる特異的抗体などについての配列情報に従って作製される、請求項２３記載の使用。
【請求項２６】
前記化合物が、アンチセンスもしくはＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチド、またはｍＲＮＡもしくは、正常な加水分解活性を有するその対立遺伝子に対して途中で干渉するかまたは減少させるが、タンパク質には翻訳されない対立遺伝子によって生じるｍＲＮＡの、不安定化および消失に基づく他のもの、についての配列情報に従って作製される、請求項２２記載の使用。
【図１】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５０６４０６（Ｐ２００８−５０６４０６Ａ）
【公表日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２１８８０（Ｐ２００７−５２１８８０）
【出願日】平成１７年７月１８日（２００５．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００７８１３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００８１２４
【国際公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【出願人】（５０６３４６９２３）オリソン、ヘノミクス、ソシエダッド、アノニマ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＯＲＹＺＯＮ ＧＥＮＯＭＩＣＳ， Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１８日（２００５．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００７８１３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００８１２４
【国際公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【出願人】（５０６３４６９２３）オリソン、ヘノミクス、ソシエダッド、アノニマ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＯＲＹＺＯＮ ＧＥＮＯＭＩＣＳ， Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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