両性リポソームにおけるまたはそれに関する改善
活性因子をカプセル化して、リポソームを形成することが可能な脂質の血清中で安定な混合物であって、前記混合物は、約０．５〜約８の範囲の比でホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる。この混合物が両性であって、ｐＨ７．４では負に荷電するかまたは中性であり、そしてｐＨ４では正に荷電するように、この混合物はまた、ｐＨ感受性アニオン性およびカチオン性両親媒性物質を含み得る。かかる混合物を含んでなる両性リポソームは、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプラスミドなどの核酸治療薬をカプセル化するために使用され得る。薬物／脂質比は、リポソームを特定の器官または身体における他の部位に標的化するために調整され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両性リポソームに関し、特に、ヒトまたは動物血清において改善された安定性を有するかかるリポソームについて言及する。本発明はまた、例えば、リポソームおよびかかるリポソームを含んでなる薬学的組成物を形成するための薬物などの活性因子または成分をカプセル化することが可能な脂質の混合物を含む。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、タンパク質発現を極めて特異的にダウンレギュレートまたは妨害することができる新規のクラスの薬物を表す。かかるオリゴヌクレオチドとして、アンチセンス、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（モルホリノ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および多様な化学の転写因子デコイが挙げられる。かかるオリゴヌクレオチド治療薬の異なる作用機序の詳細な説明については、文献（例えば、非特許文献１；および非特許文献２）において見出すことができる。
【０００３】
遺伝子修復アプリケーション（例えば、非特許文献３を参照のこと）およびマイクロＲＮＡのためのオリゴヌクレオチドの使用は、この迅速に成長している分野の他の例である。
【０００４】
核酸治療薬は、それらの実際の化学的起源とは関係なく、体液におけるそれらの不安定性のためもしくは細胞への非効率な取り込みの故、または両方により治療効力を欠き得ることが当該技術分野において公知である。上記の変種を含むかかるオリゴヌクレオチドの化学修飾、ならびにリガンドまたはポリマーとのコンジュゲートの形成は、かかる実際の限界を克服するための１つのストラテジーを表す。
【０００５】
第２の組のストラテジーは、細胞への増強された取り込みを保護し、標的化し、そして付与するためのキャリアシステム、特に、リポソームの使用に関与する。リポソームは、水性コアを有し、そして疎水性および親水性成分の両方を有する両親媒性分子（両親媒性物質）から形成される人工シグナル、オリゴまたは多重層小胞である。カーゴは、リポソームのコアにおいてトラップされ得、膜層または膜表面に配置される。かかるキャリアシステムは、次の基準の至適スコアに一致すべきである：高いカプセル化効率および経済的製造、コロイド安定性、細胞への増強された取り込みならびにもちろん、低い毒性および免疫原性。
【０００６】
キャリアと環境との間で凝集が生じないため、アニオン性または中性リポソームは、しばしば、コロイド安定性に関して優秀である。従って、それらの生体内分布は優秀であり、そして刺激および細胞障害性の可能性は低い。しかし、かかるキャリアはカプセル化効率を欠き、そして細胞へのさらなる取り込みを容易にするエンドソーム分解シグナルを提供しない（非特許文献４）。
【０００７】
極めて多くの刊行物がカチオン性リポソームシステムを取り扱っている；例えば、非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７を参照のこと。カチオン性システムは高い充填効率を提供するが、それらは、特に、体液との接触後、コロイド安定性を欠く。タンパク質および／または他のバイオポリマーとのイオン相互作用は、細胞外マトリックスまたは細胞表面とのインサイチュでの凝集体形成をもたらす。カチオン性脂質は、しばしば、毒性であることが見出されており、非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０によって示されている。
【０００８】
これらの制限は、立体的安定化をキャリアに提供する成分の添加によって克服された。例えば、体液におけるカチオン性成分の使用に関連する凝集の問題を排除する多様な鎖長のポリエチレングリコールが公知であり、そしてＰＥＧ化カチオン性リポソームは、インビボで増強された循環時間を示す（非特許文献１１）。しかし、ＰＥＧの使用は、カチオン性脂質に関連する固有の毒性の問題を解決していない。ＰＥＧは、実質的に、細胞へのかかるリポソームの生産的侵入またはそれらの細胞内送達を阻害することもまた公知である（非特許文献１２）。かなり最近、（非特許文献１３）は、インビボでｓｉＲＮＡを肝臓細胞にトランスファーすることが可能であるカチオン性ベクターのための拡散性ＰＥＧ−脂質について記載した。しかし、かかる解決に対する多大な要求および臨床開発の所定の損耗率は、概念的に独立する解決のための開発の動機をさらに与える。
【０００９】
両性リポソームは、ｐＨ７．５でアニオン性または中性電荷およびｐＨ４でカチオン性電荷を有するリポソームの最近記載されたクラスを表す。特許文献１、特許文献２および特許文献３（すべてＰａｎｚｎｅｒらによるものであり、本明細書において参考として援用される）は、両性リポソームおよびそれらに適切な脂質の詳細な説明を与える。さらなる開示は、特許文献４および特許文献５（これらもまたＰａｎｚｎｅｒらによるものであり、本明細書において参考として援用される）において行われ、かかる両性リポソームの製造のためのさらにｐＨ感受性脂質について記載している。
【００１０】
両性リポソームは優秀な生体内分布を有し、動物において極めて良好に忍容される。それらは、高い効率で核酸分子をカプセル化することができる。
【００１１】
哺乳動物における異なる病態または疾患の防止もしくは処置のための薬物のキャリアとしての両性リポソームの使用には、血中へのそれらの注入後のリポソームの安定性が必要である。特に、全身適用では、標的組織または細胞における究極的取り込みまで薬物は、リポソームにおいて安定にカプセル化されなければならない。ＦＤＡの指針は、リポソーム処方を含んでなる薬物の特定の前臨床試験を規定する（非特許文献１４）。例えば、血流における循環時間中におけるカプセル化された薬物対遊離の薬物の比が、決定されなければならない。
【００１２】
リポソームの血流への注入後、血清成分はリポソームと相互作用し、そしてリポソーム膜の透過化をもたらし得る。しかし、リポソームによってカプセル化される薬物の放出はまた、薬物の分子ディメンションにも依存する。これは、数千の塩基対のサイズを伴うプラスミド薬物が、例えば、より小さなオリゴヌクレオチドまたは他の小分子よりかなり緩徐に放出され得ることを意味する。薬物のリポソーム送達では、リポソームの循環中薬物の放出は、可能な限り低いことが必須である。
【特許文献１】ＷＯ０２／０６６４９０
【特許文献２】ＷＯ０２／０６６０１２
【特許文献３】ＷＯ０３／０７０７３５
【特許文献４】ＷＯ０３／０７０２２０
【特許文献５】ＷＯ０３／０７０７３５
【非特許文献１】Ｃｒｏｏｋｅ ｉｎ ＢＢＡ（１９９９），１４８９（１），３１−４４；Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｃｅｌｌ（２００４），１１７（１），１−３
【非特許文献２】Ｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，（２０００），１０６（９），１０７１−５
【非特許文献３】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２００２），２０，１０５−１１８
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０００），２９２，４８０−４８８ ｂｙ Ｋｌｉｍｕｋ，ｅｔ ａｌ．
【非特許文献５】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９），１６，１２９−１４０ ｂｙ Ｍａｕｒｅｒ，ｅｔ ａｌ．
【非特許文献６】ＢＢＡ（２０００）１４６４，２５１−２６１ ｂｙ Ｍｅｉｄａｎ，ｅｔ ａｌ．
【非特許文献７】Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１），１（２），２７−３３ ｂｙ Ｆｉｓｅｔ ＆ Ｇｏｕｎｎｉ
【非特許文献８】Ｆｉｌｉｏｎ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ ＢＢＡ（１９９７），１３２９（２），３４５−３５６
【非特許文献９】Ｄａｓｓ ｉｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００２），５４（５），５９３−６０１
【非特許文献１０】Ｈｉｒｋｏ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１０（１４），１１８５−１１９３
【非特許文献１１】ＢＢＡ（２００１）１５１０，１５２−１６６ ｂｙ Ｓｅｍｐｌｅ，ｅｔ ａｌ．
【非特許文献１２】Ｓｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ ＢＢＡ（２００２），１５５８（１），１−１３
【非特許文献１３】Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３（８），１００２−１００７）
【非特許文献１４】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｇｕｉｄａｎｃｅ／２１９１ｄｆｔ．ｐｄｆ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、ヒトまたは動物血清との接触時に改善された安定性を有するリポソームおよびかかるリポソームを形成することが可能な脂質の混合物を提供することである。
【００１４】
特に、本発明の目的は、かかる改善された血清安定性を有する両性リポソームを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、核酸薬物、例えば、オリゴヌクレオチドおよびプラスミドなどの薬物を含む活性因子または成分の標的化された送達のためのキャリアとしてのかかるリポソームを含んでなる薬学的組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の特定の目的は、ヒトまたは非ヒト動物の炎症、免疫もしくは自己免疫障害の処置あるいは予防のためのかかる薬学的組成物を提供することである。
【００１７】
なお本発明の別の目的は、ヒトまたは非ヒト動物の処置のための方法であって、活性因子を含んでなる薬学的組成物が１つ以上の特定の器官、腫瘍あるいは感染または炎症の部位に標的化される、上記方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
従って、本発明の１つの態様に従えば、活性因子をカプセル化して、リポソームを形成することが可能な脂質の混合物が提供され、前記混合物は、約０．５〜約８の範囲のホスファチジルエタノールアミン対ホスファチジルコリンの比でホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含んでなる。
【００１９】
適切には、前記比は、約０．７５〜約５、好ましくは、約１〜約４の範囲である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、前記ホスファチジルコリンは、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣもしくはＤＯＰＣから、または例えば、ダイズＰＣおよび卵ＰＣなどの天然の供給源由来のホスファチジルコリン類から選択され得る。
【００２１】
前記ホスファチジルエタノールアミン類は、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥから選択され得る。
【００２２】
好適な中性脂質として、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＣ、ダイズＰＣおよび卵ＰＣが挙げられる。
【００２３】
コレステロールは、血清の攻撃に対してホスファチジルコリン二分子層を安定化し得ることが公知である。しかし、ＰＯＰＣもＤＯＰＥもまたいずれもそれ自体では、血清中で安定な構造を形成しない。驚くべきことに、ＤＯＰＥおよびＰＯＰＣの混合物は、血清中で安定なリポソームを形成し得ることが見出されている。
【００２４】
従って、本発明の特定の態様では、前記脂質の混合物は中性であってもよい。いくつかの実施形態では、前記混合物は、上記の範囲の比でホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンよりなるか、または本質的になり得る。
【００２５】
本発明の別の態様では、本発明に従う脂質の混合物を含んでなる中性リポソームが提供される。かかるリポソームは、血清中で安定な賦形剤または薬物などの活性因子のキャリアとして使用され得る。
【００２６】
しかし、本発明の異なる態様では、前記混合物は、１つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質をさらに含んでなり得る。
【００２７】
好ましくは、前記１つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質は両性であって、ｐＨ７．４では負に荷電するかまたは中性であり、そしてｐＨ４では正に荷電する。
【００２８】
本明細書における「両性」とは、アニオン性およびカチオン性の両方の特徴の荷電した基を含んでなる物質、物質の混合物または上掲の分子複合体（例えば、リポソーム）を意味し、
（ｉ）荷電した基の少なくとも１つは４〜８の間のｐＫを有し、
（ｉｉ）カチオン性の電荷はｐＨ４において認められ、そして
（ｉｉｉ）アニオン性の電荷はｐＨ８において認められ、
ｐＨ４〜ｐＨ８の間の正味の電荷の等電点を生じる。両性イオンは上記範囲のｐＫを有さないため、両性特徴は、両性イオンの特徴とは異なるこのような規定による。結果として、両性イオンは、ｐＨ値の範囲にわたって本質的に中性に荷電しており；ホスファチジルコリン類およびホスファチジルエタノールアミン類は、両性イオン特徴を伴う中性脂質である。
【００２９】
従って適切には、前記混合物は、互いに組合わせることで両性特徴を有する複数の荷電した両親媒性物質を含んでなり得る。好ましくは、前記１つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質は、ｐＨ感受性アニオン性脂質およびｐＨ感受性カチオン性脂質を含んでなる。本明細書において、荷電性カチオンおよび荷電性アニオンのかかる組合わせは、「両性ＩＩ」脂質対と称される。前記荷電性カチオンは、約４〜約８の間、好ましくは、約５．０または５．５〜約７．０または７．５の間のｐＫ値を有し得る。前記荷電性アニオンは、約３．５〜約７の間、好ましくは、約４または４．５〜約６．０または６．５の間のｐＫ値を有し得る。例として、ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ、ＤＰＩＭ／ＣＨＥＭＳおよびＤＰＩＭ／ＤＧＳｕｃｃが挙げられる。
【００３０】
「両性Ｉ」脂質対は、安定なカチオン（例えば、ＤＤＡＢ／ＣＨＥＭＳ、ＤＯＴＡＰ／ＣＨＥＭＳおよびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＳ）ならびに荷電性アニオンを含んでなる一方、「両性ＩＩＩ」脂質対は、安定なアニオンならびに荷電性カチオン（例えば、ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＰＧおよびＭｏＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ−ＳＯ４）を含んでなる。
【００３１】
もちろん、本発明の範囲内において、例えば、両親媒性ジカルボン酸、ホスファチジン酸、両親媒性ピペラジン誘導体などのような複数の電荷を伴う両親媒性物質を使用することも可能である。かかる複数の荷電した両親媒性物質は、ｐＨ感受性両親媒性物質であってもまたは安定なアニオンもしくはカチオンであり得、あるいはそれらは「混合型の」特徴を有し得る。
【００３２】
適切には、前記アニオン性脂質は、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＰＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＰＧＳｕｃｃおよびＣＨＥＭＳから選択され得る。
【００３３】
前記カチオン性脂質は、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌおよびＣＨＩＭから選択され得る。
【００３４】
本発明のなお別の態様では、上記の範囲の比のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン、ｐＨ感受性アニオン性脂質ならびにｐＨ感受性カチオン性脂質を含んでなる両性リポソームが提供される。
【００３５】
前記両性リポソームは、ｐＨ７．４では負または中性に荷電し、そしてｐＨ４ではカチオン性であり得る。
【００３６】
本発明の別の特定の態様では、前記リポソームは、少なくとも１つの活性因子をカプセル化する。前記活性因子は薬物を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、前記活性因子は、脊椎動物細胞において１つもしくはそれ以上のＲＮＡに転写されることが可能である例えば、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡプラスミドなどの核酸を含んでなり得、前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムであり、前記ｍＲＮＡは１つもしくはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【００３７】
前記オリゴヌクレオチドまたは他の核酸に基づく薬物は、前記両性リポソームにカプセル化され得る。前記オリゴヌクレオチドの実質的部分またはすべては、両性リポソームに物理的にトラップされ得る。血清中で安定な両性リポソーム処方は、薬物の細胞内送達のためか、あるいは哺乳動物または哺乳動物の部分、特にヒトまたはそれらの器官における病態および／または疾患の防止もしくは処置のために使用することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、ＣＤ４０をコードする核酸を標的化し、それによって哺乳動物細胞におけるＣＤ４０の発現を調整（ｍｏｄｕｌａｔｅ）するために適応され得る。適切には、前記オリゴヌクレオチドは、ＣＤ４０のｍＲＮＡに対して指向され得る。
【００３９】
なお本発明の別の態様では、本発明に従う活性因子充填両性リポソームおよびそれらのための薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなる薬学的組成物が提供される。
【００４０】
前記組成物は、高または低脂質用量について処方され得、従って、適切には、薬物／脂質比は、所望の脂質濃度に調整され得る。いくつかの実施形態では、前記組成物は、前記薬物／脂質比を減少するために空のリポソームをさらに含んでな得、前記空のリポソームは、前記活性因子充填リポソームと同じまたは類似のサイズおよび組成を有する。前記空のリポソームは、本発明に従う脂質の混合物を含んでなり得る。
【００４１】
なお別の態様では、本発明は、ヒトあるいは非ヒト動物の炎症、免疫または自己免疫障害の防止もしくは処置のための本発明に従う薬学的組成物の使用を含み、前記組成物は、哺乳動物細胞においてＣＤ４０の発現を調整するためのＣＤ４０をコードする核酸を標的化するために適応されるオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【００４２】
前記組成物は、全身または局所投与のために処方され得る。系統的に使用される場合、本発明は、特に、移植片拒絶、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬または甲状腺炎の防止もしくは処置のための前記組成物の使用を含んでなる。
【００４３】
局所適用のために処方される場合、本発明は、特に、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、喘息、クローン病または大腸炎の防止もしくは処置のための前記組成物の使用を含んでなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
上記のように、本発明の両性リポソームは、アニオン性およびカチオン性成分を含んでなり得、両方の成分はｐＨ感受性であり、ＷＯ０２／０６６０１２（その内容は本明細書において参考として援用される）において開示されている。
【００４５】
ｐＨに感受性であるカチオン性脂質は、ＷＯ０２／０６６４８９およびＷＯ０３／０７０２２０、ならびにそれに掲載の参考文献、特に、Ｂｕｄｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（６）：７６０−４（それらのすべての内容は本明細書において参考として援用される）において開示されている。
【００４６】
好適なカチオン成分はＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌおよびＣＨＩＭ、特に、ＭｏＣｈｏｌである。
【００４７】
好適なアニオン性脂質は：ＤＯＧＳｕｃｃ、ＰＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＰＧＳｕｃｃおよびＣＨＥＭＳ、特に、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃおよびＣＨＥＭＳを含んでなる群から選択される。
【００４８】
脂質については以下の略称が本明細書において使用されるが、該略称の大部分は文献における標準的用途内にある：
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
カチオン性およびアニオン性脂質の間の比（荷電比）は、等電点を決定するだけでなく、組成物の血清安定性に影響を及ぼし得ることが見出されている。従って、前記荷電比は、４：１から１：４まで、好ましくは、３：１〜１：３（カチオン：アニオン）の間で変動し得る。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態では、カチオンはアニオンより多く存在し得る。好ましくは、前記荷電比は３：１〜２：１の間である。荷電した脂質の全量は、脂質混合物の５から９５ｍｏｌ％まで、好ましくは、３０から８０ｍｏｌ％まで、およびより好ましくは、４５または５０ｍｏｌ％から７５ｍｏｌ％まで変動し得、残りの脂質は中性リン脂質ＰＣおよびＰＥから形成される。
【００５３】
あるいは、カチオンおよびアニオンは、実質的に同じ量で存在し得る。荷電した脂質の全量は、脂質混合物の５から７５ｍｏｌ％まで、好ましくは、２０から６５ｍｏｌ％まで変動し得、残りの脂質は中性リン脂質ＰＣおよびＰＥから形成される。
【００５４】
別の代替物では、アニオンは、カチオンより多く存在し得る。前記荷電比は、１：３〜１：２、好ましくは、約１：２（カチオン：アニオン）の間で存在し得る。荷電した脂質の全量は、脂質混合物の４０ｍｏｌ％から７５または８０ｍｏｌ％まで、好ましくは、４５または５０ｍｏｌ％から７０または７５ｍｏｌ％まで、およびより好ましくは、５５から６５ｍｏｌ％まで変動し得、残りの脂質は中性リン脂質ＰＣおよびＰＥから形成される。
【００５５】
カチオンおよびアニオンの異なる多くの組合わせが、上記の適切な成分のリストから選択され得る。有利なことに、本発明は、荷電性カチオンとしてＭｏＣｈｏｌまたはＣＨＩＭおよび荷電性アニオンとしてＣＨＥＭＳ、ＤＭＧＳｕｃｃまたはＤＯＧＳｕｃｃを使用して、実行され得る。
【００５６】
現在好適なリポソームは、１：１〜１：４の間の比のＰＯＰＣおよびＤＯＰＥならびに３：１〜１：１の間の比のＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳ、ＭｏＣｈｏｌおよびＤＭＧＳｕｃｃ、ＭｏＣｈｏｌおよびＤＯＧＳｕｃｃ、ＣＨＩＭおよびＣＨＥＭＳ、ならびにＣＨＩＭおよびＤＭＧＳｕｃｃから選択される両性脂質対を含んでなる脂質の混合物から作製され、荷電した脂質の量は、脂質混合物の３０〜８０ｍｏｌ％の間である。
【００５７】
本発明に従うかかるリポソームの具体例として、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
【００５８】
【表３】
【００５９】
さらに現在好適なリポソームは、１：１〜１：４の間の比のＰＯＰＣおよびＤＯＰＥ、ＤＭＧＳｕｃｃまたはＤＯＧＳｕｃｃ、ならびにＭｏＣｈｏｌを含んでなる脂質の混合物を含んでなり、ＤＭＧＳｕｃｃまたはＤＯＧＳｕｃｃのモル量はＭｏＣｈｏｌのモル量を超え、そして荷電した脂質の量は３０〜８０ｍｏｌ％の間である。好ましくは、荷電比は１：２〜１：３の間であり、そして荷電した成分は、脂質混合物の４５または５０ｍｏｌ％〜７０または７５ｍｏｌ％の間の構成分をなす。
【００６０】
かかるさらなるリポソームの具体例として、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
【００６１】
【表４】
【００６２】
かかる使用に限定されなければ、本発明に記載の材料は、例えば、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプラスミドなどの核酸に基づく薬物のキャリアとしての使用に良好に適合される。これらの薬物は、タンパク質、ポリペプチドまたはＲＮＡに対する１つもしくはそれ以上の特異的配列をコードする核酸、およびタンパク質発現レベルを特異的にレギュレートするかまたは特に、スプライシングへの干渉および人工的トランケーションを介してタンパク質構造に影響を及ぼすことができるオリゴヌクレオチドに分類される。
【００６３】
従って、本発明のいくつかの実施形態では、核酸に基づく治療薬は、脊椎動物細胞において１つもしくはそれ以上のＲＮＡに転写されることが可能である核酸を含んでなり得、該ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムであり得、かかるｍＲＮＡは１つもしくはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードする。かかる核酸治療薬は、環状ＤＮＡプラスミド、ＷＯ９８／２１３２２もしくはＤＥ１９７５３１８２において開示されているようなＭＩＤＧＥベクター（Ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）と同様な線状ＤＮＡ構築物、または翻訳のために具備されるｍＲＮＡ（例えば、ＥＰ１３９２３４１）であってもよい。
【００６４】
本発明の別の実施形態では、存在する細胞内核酸またはタンパク質を標的化することができるオリゴヌクレオチドを使用してもよい。前記オリゴヌクレオチドは、転写を減弱もしくは調整する、転写物のプロセシングを改変するまたはそうでなければタンパク質の発現を干渉するために適応されるように、前記核酸は特定の遺伝子をコードし得る。用語「標的核酸」は、特定の遺伝子をコードするＤＮＡ、ならびにプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡであるかかるＤＮＡから誘導されるすべてのＲＮＡを包含する。標的核酸とかかる配列に対して指向される１つもしくはそれ以上のオリゴヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションは、タンパク質発現の阻害またはモジュレーションを生じ得る。かかる特異的ターゲティングを達成するために、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の配列に実質的に相補的であるヌクレオチドの連続ストレッチを適切に含んでなるべきである。
【００６５】
上記の基準を満たすオリゴヌクレオチドは、異なる多くの化学およびトポロジーにより構成され得る。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよい。
【００６６】
オリゴヌクレオチドの作用機作は変動し得、そして特に、スプライシング、転写、核−細胞質間輸送および翻訳に対する効果を含んでなり得る。
【００６７】
本発明の好適な実施形態では、一般にアンチセンスオリゴヌクレオチドとして公知であるＤＮＡに基づくオリゴヌクレオチド、モルホリノ核酸、２’−修飾オリゴヌクレオチドなどを含むがそれらに限定されない一本鎖オリゴヌクレオチドを使用してもよい。骨格または塩基または糖修飾としては、ホスホチオエートＤＮＡ（ＰＴＯ）、２’Ｏ−メチルＲＮＡ（２’Ｏｍｅ）、２’Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホアミデート（ＮＰ）、２’フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、モルホリンホスホアミデート（モルホリノ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）などが挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、混合された化学は当該技術分野において公知であり、コポリマー、ブロック−コポリマーもしくはギャップマーなどの１を超えるヌクレオチド種からまたは他の配列で構築される。上記のオリゴヌクレオチドに加えて、タンパク質発現はまた、相補配列モチーフを含有する二本鎖ＲＮＡ分子を使用して、阻害することができる。かかるＲＮＡ分子は、当該技術分野においてｓｉＲＮＡ分子として公知である（例えば、ＷＯ９９／３２６１９またはＷＯ０２／０５５６９３）。さらに、多様な化学が、このクラスのオリゴヌクレオチドに適応された。また、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドシステムも当該技術分野において公知である。
【００６８】
本発明の別の実施形態では、デコイオリゴヌクレオチドを使用することができる。従って、これらの二本鎖ＤＮＡ分子および化学修飾は、核酸を標的化するが、転写因子を標的化しない。これは、デコイオリゴヌクレオチドが配列特異的ＤＮＡ結合性タンパク質に結合し、そして転写を干渉することを意味する（例えば、Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９９９）。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態では、生理学的条件下で遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズすることによって、転写に影響を及ぼし得るオリゴヌクレオチドを使用し得る。さらに、多様な化学がこのクラスのオリゴヌクレオチドに順応し得る。
【００７０】
なお本発明のさらなる代替物では、ＤＮＡザイムを使用してもよい。ＤＮＡザイムは、酵素活性を伴う一本鎖オリゴヌクレオチドおよびその化学修飾である。「１０〜２３」モデルとして公知の典型的なＤＮＡザイムは、生理学的条件下で特異的部位において一本鎖ＲＮＡを切断することが可能である。ＤＮＡザイムの１０〜２３モデルは、ＲＮＡ上の標的配列に相補的な２基質認識ドメインによって隣接される１５の高度に保存されたデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。標的ｍＲＮＡの切断は、それらの破壊を生じ得、ＤＮＡザイムは再循環し、そして複数の基質を切断する。
【００７１】
本発明のなお別の実施形態では、リボザイムを使用することができる。リボザイムは、酵素活性を伴う一本鎖オリゴリボヌクレオチドおよびその化学修飾である。それらは、２つの成分、触媒コアを形成する保存されたステム−ループ構造および所定のＲＮＡ転写物において標的部位を囲む配列に逆相補的であるフランキング配列に作動可能に分割することができる。フランキング配列は特異性を付与し得、そして一般的に、合計で１４〜１６ｎｔを構成し得、選択される標的部位の両方部位上に延在する。
【００７２】
本発明のなおさらなる実施形態では、タンパク質を標的化するためにアプタマーを使用してもよい。アプタマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸、および特異的分子標的に緊密に結合するその化学修飾からなる高分子であり、そして典型的に１５〜６０ｎｔ長である。ヌクレオチドの鎖は、分子を複雑な３次元の形状に折り畳む分子内相互作用を形成し得る。アプタマーの形状は、それが、酸性タンパク質、塩基性タンパク質、膜タンパク質、転写因子および酵素を含んでなるがそれらに限定されないその標的分子の表面に対して緊密に結合することを可能にする。アプタマー分子の結合は、標的分子の機能に影響を及ぼし得る。
【００７３】
上記のオリゴヌクレオチドのすべては、短くて１０、好ましくは１５およびさらにより好ましくは１８〜５０、好ましくは３０およびより好ましくは２５ヌクレオチドの間の長さで変動し得る。オリゴヌクレオチドと標的配列との間の適合は、オリゴヌクレオチドの各塩基と好ましくは完全であり、上記の数のオリゴヌクレオチドの連続ストレッチにわたる標的核酸上のその相補的塩基と塩基対を形成する。これはそれほど好適ではないが、配列の対は、塩基対の前記連続ストレッチ内に１つもしくはそれ以上のミスマッチを含有してもよい。一般に、かかる核酸のタイプおよび化学組成は、それがインビボであってもまたはインビトロであってもビヒクルとしての本発明のリポソームの性能にほとんど影響を及ぼさず、そして当業者は、本発明のリポソームとの組合わせに適切な他のタイプのオリゴヌクレオチドまたは核酸を見出し得る。
【００７４】
しかし、本発明の好適な実施形態では、ＣＤ４０遺伝子、そのセンスもしくはアンチセンス鎖、その任意のエキソンもしくはイントロンまたは非翻訳領域をコードする核酸を標的化するために適応され、それによって、哺乳動物細胞におけるＣＤ４０の発現を調整するオリゴヌクレオチドを使用してもよい。
【００７５】
本発明の別の好適な実施形態では、前記オリゴヌクレオチドはＣＤ４０の任意のｍＲＮＡに対して指向され得、かかるｍＲＮＡはプレｍＲＮＡおよびそれらのその後の成熟した形態を含む。
【００７６】
タンパク質発現は、例えば、アンチセンス、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（モルホリノ）および多様な化学の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのオリゴヌクレオチドを使用して、特異的にダウンレギュレートさせることができる。
【００７７】
ＣＤ４０については、Ｐａｕｌｉ，ｅｔ ａｌ．１９８４（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １７：１７３−１７９）によって最初に記載された。タンパク質は、主に、樹状細胞、内皮細胞およびＢ細胞において発現され、そしてＴ細胞上のそのリガンド（ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ１５４）と相互作用する。ＣＤ４０とＣＤ１５４との間のシグナル伝達は、体液免疫応答の発達に極めて重要である。経路の過剰刺激は、移植片拒絶、移植片対宿主病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬および甲状腺炎を含む多様な免疫関連障害をもたらし得る。ＣＤ４０過剰発現はまた、腫瘍増殖に関与し得（Ｇｒｕｓｓ，ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２４（５−６）：３９３−４２２）、そしてＣＤ４０の増強されたレベルの可溶性形態はアルツハイマー病に関連することが報告された（Ｍｏｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３９（１０）：１５５５−６１。ＣＤ４０はＮＦ−κＢ経路にシグナル伝達し、結果的に、転写因子の活性化ならびにＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＩＦＮγなどのサイトカインの究極的な放出をもたらし、次いで、他の細胞を活性化し、従って、ポジティブフィードバック機構を使用して炎症を促進する。
【００７８】
上記の経路における早期の事象の阻害は、免疫障害または炎症プロセスを阻害するのに有効なストラテジーとして提唱されている。例として、抗体を使用するＴＮＦαの競合結合、ＴＮＦα−受容体に対する抗体を使用する受容体遮断およびＮＦ−κＢ結合の競合阻害が挙げられる。ＣＤ４０は、三量体リガンド、ＣＤ１５４とのその相互作用を介してシグナル伝達するため、小分子インヒビターによるシグナル伝達事象の阻害は起こりそうになく、従って、治療薬開発ではブロッキング抗体の使用が注目されている。より具体的には、Ｈｏｌｓｔａｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．２０００（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５３９２−１５３９８）またはＢａｃｃａｍ＆Ｂｉｓｈｏｐ１９９９（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：３８５５−３８６６）によって記載のように、ＣＤ４０／ＣＤ１５４相互作用を、成分の１つに対して標的化される抗体を使用して阻止してもよい。しかし、開発中のＣＤ４０抗体は副反応を生じ、従って、このポイントでの炎症フィードバックループを切断する代替的手段の必要性が存在する。
【００７９】
これまでのところ、ＣＤ４０ ｍＲＮＡに対して標的化される多くのオリゴヌクレオチド配列が、インビトロで確証されている。例えば、ＵＳ２００４／０１８６０７１およびＵＳ６１９７５８４（両方ともＢｅｎｎｅｔｔらによる）には、アンチセンス機構に基づくかかるオリゴヌクレオチドについての詳細な説明がある。Ｐｌｕｖｉｎｅｔ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｂｌｏｏｄ，２００４は、ヒト標的に対するｓｉＲＮＡを使用するＣＤ４０のダウンレギュレーションについて最初に記載した。さらに、ＭａｎｏｈａｒａｎによるＷＯ２００４／０９０１０８は、ＣＤ４０タンパク質の発現を阻害する新規オリゴヌクレオチドの適用性について記載している。ＣＤ４０発現をダウンレギュレートするための間接的手段については、ＨｅｃｋｅｒおよびＷａｇｎｅｒによるＤＥ１００４９５４９に記載されており、転写因子ＩＦＲ−１の阻害を使用している。ＣＤ４０の発現を調整するための適切な特異的核酸については、以下の実施例１１に記載する。
【００８０】
従って、本発明の特定の態様では、活性因子としてＣＤ４０に対して指向されるオリゴヌクレオチドおよび賦形剤として本発明の両性リポソームを含んでなる薬学的組成物が提供される。かかる処方は、炎症および自己免疫障害の処置において治療上有効であることが見出されており、従って、本発明は、移植片拒絶、移植片対宿主病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、気管支喘息、炎症性腸疾患、乾癬、甲状腺炎、クローン病（Ｍｏｒｂｕｓ Ｃｒｏｈｎ）、潰瘍性大腸炎、ＣＯＰＤおよびアトピー性皮膚炎を含む炎症、免疫または自己免疫障害の防止もしくは処置のための本発明の組成物の使用をさらに含む。
【００８１】
本発明の薬学的組成物はまた、局所的処置、例えば、炎症のある粘膜の処置のために使用してもよい。特に、本発明の組成物は、炎症性腸疾患または移植片拒絶の処置もしくは予防のために使用してもよい。本発明の組成物はまた、皮膚または肺への局所投与のために適応してもよい。
【００８２】
リポソームは、カプセル化された薬物の薬物動態学的および生体内分布プロファイルをインビボで改変するために広範に使用されている。本発明のリポソームは、それらのカーゴと共に、肝臓によって迅速かつ大きな程度で浄化され得る。しかし、薬物動態学的パラメータならびに生体内分布パターンは、以下の実施例において例示されるように、リポソームのサイズおよび／または脂質用量を調整することによって、制御され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明のリポソームは約１５０ｎｍを超えるサイズを有し得る。かかるリポソームは、低い脂質用量で投与され得る。前記リポソームは、単層、オリゴ層または多重層であってもよい。かかる投与スキームは、肝臓への効果的滑迅速な標的化を可能にし、そして脾臓などの他の器官におけるリポソームおよび薬物の蓄積を回避する。
【００８４】
あるいは、約１５０ｎｍを超えるサイズを有するかかるリポソームは、高い脂質用量で投与され得、肝臓での飽和状態ならびに脾臓および感染もしくは炎症または腫瘍の部位などの循環におけるより遠位の部位におけるリポソームの蓄積の生体内分布パターンの変更をもたらす。身体のこれらの領域は、リポソームをろ過して取り出し得る有窓性または不完全な毛細管を有する。さらに加えて、脾臓ならびに感染または炎症および多くの腫瘍のかかる他の領域は、しばしば、循環からリポソームを取り出すことができる高含有量のマクロファージを有することが公知である。
【００８５】
本発明に従う前記薬学的組成物は、異なる方法により高い脂質用量で提供され得る。いくつかの実施形態では、所望の脂質濃度を達成するために組成物の薬物／脂質比を低くすることができる。あるいは、薬物充填リポソームに匹敵する組成およびサイズの空のリポソームを添加することによって、薬学的組成物の脂質濃度を制御してもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本発明に従うリポソームは約１５０ｎｍ未満のサイズを有し得る。前記リポソームは、単層、オリゴ層または多重層であってもよい。脾臓は、所望されない赤血球および血液由来の粒子を取り出すフィルターとして作用する。大きなリポソームはまた、同じ方法で細網フィルターによって保持される。しかし、小さなリポソームは漏出し得、従って脾臓に蓄積しない。従って、１５０ｎｍ未満のサイズを有する本発明に従うリポソームは、器官としての脾臓を迂回し得る。
【００８７】
肝臓細胞を標的化するために、１５０ｎｍ未満のサイズを有するかかるリポソームを、低い脂質用量で投与してもよい。かかるリポソームは、肝臓全体に十分に浸透し、そして肝細胞などの肝臓の実質細胞の実質的な部分に到達するように特に良好に適応される。
【００８８】
あるいは、感染もしくは炎症または固形腫瘍の領域などの循環におけるより遠位の部位を標的化し、同時に脾臓を迂回するために、１５０ｎｍ未満のサイズを有する前記リポソームを高い脂質用量で投与してもよい。
【００８９】
一般に、本発明のリポソームの薬物動態学的プロファイルおよび生体内分布は、多くの因子に依存し得る。リポソームの脂質組成の次に、サイズおよび脂質用量は、リポソームのインビボでの運命を決定する。本発明のリポソームは、それらのサイズにかかわらず、単層、オリゴ層または多重層であってもよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明のリポソームは、ヒトまたは非ヒト動物患者に対し、全身投与によって炎症のある肺を標的化するために使用し得る。
【００９１】
本明細書において提示されるデータから開始して初めて、当業者は、他の種、特に、他の哺乳動物またはヒトのための適切な投与レジメンを確立することが可能である。具体的には、別の種（例えば、ヒト）における脂質用量が「低い」かまたは「高い」かは、薬物動態学的データによって決定することができる。リポソームの薬物動態学は、２コンパートメントモデルに従う。上記のように、高い脂質用量は、肝臓での飽和および生体内分布パターンの変更をもたらす。これは、薬物動態学的曲線の端部における増強されたＣｍａｘ値をもたらす。
【００９２】
本発明の薬学的組成物は、適切な薬学的に許容可能なビヒクルにおけるコロイドとしての使用のために処方され得る。水、食塩、リン酸緩衝食塩水などのようなビヒクルは、この目的のために当業者に周知である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、約７〜約８の間の生理学的ｐＨで投与され得る。この目的のために、活性因子、賦形剤およびビヒクルを含んでなる組成物は、この範囲のｐＨを有するように処方され得る。
【００９４】
リポソームを製造するための方法は、当業者に公知である。それらは、規定されたポアサイズの膜を介する押出し、カーゴを含有する水へのエタノール中脂質溶液の注入または高圧ホモジナイゼーションを含むがそれらに限定されない。
【００９５】
また、核酸治療薬を、中性のｐＨで脂質と接触させることができ、核酸を含有する溶液の所定の百分率の容積包含（ｖｏｌｕｍｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）を生じることが当該技術分野において公知である。５０ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲の高濃度の脂質が、薬物の実質的なカプセル化を達成するのに好適である。
【００９６】
かかる標準的な手順とは対照的に、両性リポソームは、それらの等電点またはそれ未満において、核酸に結合する個別の利点を付与し、それによって、リポソーム表面における薬物を濃縮する。かかるプロセスは、ＷＯ０２／０６６０１２においてより詳細に記載されている。リポソームのｐＨを生理学的ｐＨ（約ｐＨ７．４）にまで上昇する時、負に荷電した核酸は、リポソーム膜から解離する。実際の生成プロセスとは関係なく、カプセル化されていない有効な薬物は、初期の生成工程後、リポソームから取り出すことができ、リポソームは密封容器として形成される。さらに、技術文献およびここに含まれる参考文献は、かかる方法論について詳細に記載し、そして適切なプロセス工程は、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降、透析、限外ろ過、透析ろ過などを含み得るが、これらに限定されない。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態では、８０ｗｔ％を超える薬物が前記リポソームの内側に配置され得る。
【００９８】
しかし、カプセル化されていない材料のかかる取り出しは義務的ではなく、そしていくつかの実施形態では、組成物は、トラップされたならびに遊離の薬物を含んでなり得る。
【００９９】
リポソームの粒度は５０〜５００ｎｍの間、好ましくは、５０〜３００ｎｍの間であり得る。
【０１００】
以下は、本発明の実施形態の添付の図面を参照するあくまでも例示による説明である。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：両性ＩＩ脂質ＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳによるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）充填リポソームの調製
クロロホルム中脂質のストック溶液を混合し、最終的に減圧下で乾燥状態まで丸底フラスコにおいてエバポレートした。脂質フィルムを、ＰＢＳ ｐＨ７．５において１００ｍＭ ＣＦとハイブリダイズさせた。得られた脂質濃度は２０ｍＭであった。懸濁液を、４５分間、水浴において室温で水和させ、５分間、音波処理し、続いて、−７０℃で３回の凍結／融解サイクルを行った。融解後、リポソーム懸濁液を、１００ｎｍのポアサイズを伴うポリカーボネート膜を介して１５回押出した。カプセル化されていないＣＦをゲルろ過によって取り出す一方、リポソームを３倍希釈した。脂質の回収率および濃度を、有機リン酸アッセイによって分析した。粒度を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳＡ上で動的光散乱により測定した。
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
実施例２：両性ＩＩ脂質ＭｏＣｈｏｌおよびＤＭＧＳｕｃｃによるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）充填リポソームの調製
リポソームを、実施例１に記載のとおりに調製した。
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
実施例３：両性ＩＩ脂質ＭｏＣｈｏｌおよびＤＯＧＳｕｃｃによるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）充填リポソームの調製
リポソームを、実施例１に記載のとおりに調製した。
【０１１０】
【表１１】
【０１１１】
実施例４：両性ＩＩ脂質ＣＨＩＭおよびＣＨＥＭＳによるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）充填リポソームの調製
リポソームを、実施例１に記載のとおりに調製した。
【０１１２】
【表１２】
【０１１３】
実施例５：両性ＩＩ脂質ＣＨＩＭおよびＤＭＧＳｕｃｃによるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）充填リポソームの調製
リポソームを、実施例１に記載のとおりに調製した。
【０１１４】
【表１３】
【０１１５】
実施例６：実施例１および２のＣＦ充填両性リポソームの血清安定性試験
カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）をモデル薬物として使用し、両性リポソームの血清安定性を決定した。オリゴヌクレオチドと同様に、ＣＦは負に荷電している。
【０１１６】
２５μｌのＣＦ充填リポソームを、１００μｌの予め加温した完全ヒト血清またはＰＢＳとそれぞれ混合し、３７℃でインキュベートした。規定された時間ポイントで５μｌのサンプルを、９６ウェルマイクロタイタープレートへ２０μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．５または２０μｌの２０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に対して移した。最後に、２７５μｌのＰＢＳを各ウェルに添加し、４７５／５３０ｎｍで蛍光強度を測定した。
【０１１７】
蛍光測定を介してリポソームからのＣＦの放出を決定することによって、４時間にわたって血清安定性を観察した。ＣＦの放出量（％で）を、規定された時間ポイントならびに界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）によるリポソームの処置後に測定し、１００％放出値を得た。
【０１１８】
結果：
ＰＯＰＣおよびＤＯＰＥの混合物は、血清において安定である。ＰＯＰＣ自体は、血清からの攻撃に耐えるリポソームを形成しない。さらに、ＤＯＰＥはリポソームを全く形成しない。かなり驚くべきことに、両方の成分からの混合物は、極めて安定であり、血清攻撃に対して耐性であることを見出した。本実施例において、０．７５〜５のＤＯＰＥ／ＰＯＰＣ比は、１．５〜５の間の広範な至適条件を伴う安定な構造を形成することを見出した（図１および２もまた参照のこと）。
【０１１９】
荷電した成分および中性脂質は、独立変数である。ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳｕｃｃ両方の１：１の比に対する血清感受性は低い〜極めて低く、広範な混合物にわたって安定な粒子が形成される。全体で荷電した成分の少なくとも６０または７０ｍｏｌ％が、二分子層の安定性に有意な影響を及ぼすのに必要であった。
【０１２０】
７０％の荷電した成分を含有する脂質混合物（表２および５を参照のこと）の血清安定性を図３に示す。一般に、過剰のＭｏＣｈｏｌは安定化効果を有する。
【０１２１】
血清安定性について試験した表３および６の処方は、２：１または４：１のいずれか一方の比でＤＯＰＥおよびＰＯＰＣを有する。荷電した脂質の全量を、８０％から５０％まで降順に滴定した。結果を図４に示す。
【０１２２】
実施例７：血清中で安定な両性リポソームの生体内分布
クロロホルム中脂質（＋／−１％１４Ｃ−ＤＰＰＣ）のストック溶液を混合し、最終的に減圧下で乾燥状態まで丸底フラスコにおいてエバポレートした。脂質フィルムを、１．５ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．５中３Ｈ−イヌリンまたは５ｍｌのＰＢＳ単独で水和した。得られた脂質濃度は１００ｍＭであった。懸濁液を、４５分間、水浴において室温で水和させ、３０分間、音波処理し、続いて、−７０℃で３回の凍結／融解サイクルを行った。融解後、リポソーム懸濁液を、適切なポアサイズを伴うポリカーボネート膜を介して１５回押出した。リポソームを、超遠心分離によって、カプセル化されていない３Ｈ−イヌリンから分離した（２回）。
【０１２３】
脂質の回収率および濃度を有機リン酸アッセイによって分析し、放射性標識粒子の場合、液体シンチレーションによってカプセル化効率を測定した。粒度を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳＡ上で動的光散乱により測定した。得られた非標識および放射性標識調製物を混合し、ＰＢＳで最終脂質濃度まで希釈した。
【０１２４】
【表１４】
【０１２５】
生体内分布研究
３９匹の雄性ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を５つのグループに分け、尾静脈を介して静脈内注入した。特定の時間ポイントで、血液サンプル（ＰＫについて）および／または組織サンプル（ＢＤについて）を回収し、高温下での触媒的酸化により分析した。サンプル間のキャリーオーバーの百分率を決定し、データの組の分析に含めた。
【０１２６】
【表１５】
【０１２７】
生体内分布研究の結果を図５〜６に示し、肝臓および脾臓における異なるリポソーム処方の生体内分布を示す。他の器官におけるリポソームの蓄積は５％を超えなかったため、従って、示していない。図５は、低い脂質用量で投与される場合、サイズ＞１５０ｎｍを有する本発明の両性リポソームは、単独で肝臓に蓄積することを明らかに実証する。対照的に、高脂質用量で同じリポソーム処方を投与することによって、生体内分布パターンが変化することが示され得る。肝臓に次いで、サイズ＞１５０ｎｍを伴うリポソームは脾臓にも蓄積する。
【０１２８】
図６は、サイズ＜１５０ｎｍで調製された本発明の両性リポソームの生体内分布を示す。低い脂質用量で投与されるこれらのリポソームの生体内分布は、サイズ＞１５０ｎｍを伴うリポソームとは異ならない一方、高い脂質用量のサイズ＜１５０ｎｍを有するリポソームの投与は、脾臓における蓄積をもたらさないことが実証され得る。
【０１２９】
実施例８：コラーゲン誘導性関節炎マウスにおけるＣｙ５．５標識ＣＤ４０アンチセンスをカプセル化した両性リポソームの生体内分布
クロロホルム中脂質のストック溶液を混合し、最終的に減圧下で乾燥状態まで丸底フラスコにおいてエバポレートした。脂質フィルムを、１０ｍＭ ＮａＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５中Ｃｙ５．５標識ＣＤ４０アンチセンスで水和した。得られた脂質濃度は２０ｍＭであった。懸濁液を、４５分間、水浴において５０℃で水和させ、５分間、音波処理し、続いて、−７０℃で凍結／融解サイクルを行った。融解後、２００ｎｍポリカーボネート膜を介して、リポソーム懸濁液を１９回押出した。押出しプロセス後、１／１０容積の１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８を添加することによって、リポソーム懸濁液のｐＨをｐＨ７．５に移した。カプセル化されていないＣｙ５．５標識ＣＤ４０アンチセンスを、高速沈降（２回）および上清を廃棄することによって取り出した。
【０１３０】
脂質の回収率および濃度を、有機リン酸アッセイによって分析した。カプセル化効率を、蛍光分光学によって測定した。粒度を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳＡ上で動的光散乱により測定した。
【０１３１】
空のリポソームを、１０Ｖｏｌ％のエタノール性脂質溶液（１５ｍｏｌ％ＰＯＰＣ、４５ｍｏｌ％ＤＯＰＥ、２０ｍｏｌ％ＭｏＣｈｏｌおよび２０ｍｏｌ％ＣＨＥＭＳの混合物）を１０ｍＭ ＮａＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５に注入することによって、生成した。得られた脂質濃度は２ｍＭであった。１／１０容積の１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８でこの溶液のｐＨを直ちに移した。希釈されたリポソームを濃縮するために、懸濁液を透析ろ過した。
【０１３２】
【表１６】
【０１３３】
マウスにおける生体内分布研究では、充填されたおよび空のリポソームを、以下のとおり混合した：
２００μｌのＣｙ５．５リポソームおよび４１μｌの空のリポソーム
ＤＢＡ／１系マウスを、完全フロイントアジュバントにおいて乳化したＩＩ型コラーゲン（２００μｇ／マウス）の皮下注入によって免疫した。マウスに、関節炎誘導の１日目（ＩＩ型コラーゲンによる単回免疫後の約２１日目）にリポソーム懸濁液（２４１μｌ）により静脈内注入した。１日目を、炎症が著明であった（少なくとも２のＲ．Ｏ．Ｗｉｌｌｉａｍｓに従う臨床スコア）日として規定した。
【０１３４】
マウスを、リポソーム懸濁液の注入の１０時間後に屠殺した。器官および足を取り出し、直ちに液体窒素中に凍結した。リポソームにカプセル化されたＣｙ５．５標識ＣＤ４０アンチセンスの生体内分布をＮＩＲ画像化によって評価し、非処置マウスの組織サンプルと比較した。活動期の疾患を伴うマウスの炎症のある足に、特定の増強が見出された。より具体的には、両性リポソームの蓄積は、個々の足または足指もしくは指における疾患の高度に活動期の部位と一致する（図７を参照のこと）。
【０１３５】
実施例９：高度充填手順によるＣＤ４０−ＯＤＮ含有リポソームの調製
リポソームを、１０Ｖｏｌ％のエタノール性脂質溶液（１５ｍｏｌ％ＰＯＰＣ、４５ｍｏｌ％ＤＯＰＥ、２０ｍｏｌ％ＭｏＣｈｏｌおよび２０ｍｏｌ％ＣＨＥＭＳの混合物）を、ＣＤ４０に対する６０μｇ／ｍｌの１８ｂｐアンチセンスを含有する１０ｍＭ ＮａＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５に注入することによって、生成した。
【０１３６】
得られた脂質濃度は２ｍＭであった。１／１０容積の１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８でこの溶液のｐＨを直ちに移した。希釈されたリポソームを濃縮するために、懸濁液を、Ｔ８６５ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｕｌｔｒａ Ｐｒｏ８０）において、２時間５分間、６５，０００ｒｐｍ、２０℃で沈降させた。その後、処方を０．４５μｍを介して滅菌ろ過した。
【０１３７】
【表１７】
【０１３８】
カプセル化されたＯＤＮの量を、２６０ｎｍにより光学密度（ＯＤ）を確認することによって、測定した。以下の量のＯＤＮをＳｍａｒｔｉｃｌｅ処方にカプセル化した。
【０１３９】
【表１８】
【０１４０】
実施例１０：関節炎における治療効力
ＤＢＡ／１系マウスを、完全フロイントアジュバントにおいて乳化したＩＩ型コラーゲン（２００μｇ／マウス）の皮下注入によって免疫した。Ｓｍａｒｔｉｃｌｅまたはコントロールによる処置を、関節炎誘導の１日目（ＩＩ型コラーゲンによる単回免疫後の約２１日目）に開始し、３および５日目に反復した。１日目を、炎症が著明であった（少なくとも２のＲ．Ｏ．Ｗｉｌｌｉａｍｓに従う臨床スコア）日として規定した。
【０１４１】
処置研究について、リポソームＣＤ４０−ＯＤＮを、確立された炎症を伴うラットの尾静脈に静脈内注入した。それぞれの用量は、体重１Ｋｇあたり４ｍｇのＣＤ４０−ＯＤＮ（カプセル化されたＣＤ４０−ＯＤＮ）を含有した。
【０１４２】
実験中、足の浮腫が観察され、臨床関節炎スコアを決定した。
【０１４３】
図８および９により明示されるように、両性リポソームにおいてカプセル化されたＣＤ４０−ＯＤＮによる処置後、足の浮腫の有意な減少が認められた。また、臨床スコアは、かかるリポソームにおいてカプセル化されたＣＤ４０−ＯＤＮによる処置後に有意に減少した。
【０１４４】
実施例１１：材料
本実施例は、ＣＤ４０の発現を調整し、本発明に従う組成物の使用に適切であるオリゴヌクレオチドによって標的化され得るＣＤ４０ヌクレオチド配列の非制限的例を提供する。
【０１４５】
ヒトＣＤ４０ ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６０５９２）
本発明に従う標的化のためのヒトＣＤ４０ ｍＲＮＡ配列を配列番号１に提示する。関連する配列情報は、Ｂｅｎｎｅｔｔらによるｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＵＳ２００４／０１８６０７１（即ち、配列番号８５）およびＢｅｎｎｅｔｔらによるＵＳ ｐａｔｅｎｔ ｎｏ．６１９７５８４（即ち、配列番号８５）ならびにＰｌｕｖｉｎｅｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００４，１０４（１２），３６４２−３６４６（それらの内容は、本明細書において参考として援用される）において見出される。
【０１４６】
【表１９】
【０１４７】
ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＣＤ４０ ｍＲＮＡ
本発明に従う標的化のためのネズミＣＤ４０ ｍＲＮＡ配列を配列番号２に提示する。関連する配列情報は、Ｂｅｎｎｅｔｔらによるｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＵＳ２００４／０１８６０７１（即ち、配列番号１３２）（その内容は、本明細書において参考として援用される）において見出される。
【０１４８】
【表２０】
【０１４９】
ラットＣＤ４０ ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ ２４１２３１）
本発明に従う標的化のためのラットＣＤ４０ ｍＲＮＡ配列を配列番号３に提示する（Ｇａｏ，Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ２００３を参照のこと）。
【０１５０】
【表２１】
【０１５１】
ブタＣＤ４０ｃＤＮＡ
本発明に従う標的化のためのブタＣＤ４０ ｃＤＮＡ配列を配列番号４に提示する（図１０）。関連する配列情報は、Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００２，７３（４），６３５−６４２（その内容は、本明細書において参考として援用される）において見出される。
【０１５２】
さらに、以下は、本発明における使用に適切であるアンチＣＤ４０オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスＣＤ４０核酸配列の非制限的例を提供する：
【０１５３】
ヒトＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ヒトアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を以下に提示する。さらなる配列情報は、Ｂｅｎｎｅｔｔらによるｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＵＳ２００４／０１８６０７１およびＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６１９７５８４（それらの内容は、本明細書において参考として提供される）において見出される。Ｂｅｎｎｅｔｔらにより言及された配列番号を右側に提供する。
【０１５４】
【表２２】
【０１５５】
【表２３】
【０１５６】
以下のｓｉＲＮＡ配列は、本発明における使用に適切である。（例えば、Ｐｌｕｖｉｎｅｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００４，１０４（１２），３６４２−３６４６を参照のこと）、その内容は、本明細書において参考として援用される。
【０１５７】
【表２４】
【０１５８】
すべてのｓｉＲＮＡは、３’末端に２ヌクレオチド突出部を含有する。
【０１５９】
ネズミＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ネズミアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を以下に提示する。さらなる配列情報は、Ｂｅｎｎｅｔｔらによるｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＵＳ２００４／０１８６０７１（その内容は、本明細書において参考として援用される）において見出される。Ｂｅｎｎｅｔｔらにより言及された配列番号を右側に提供する。
【０１６０】
【表２５】
【０１６１】
ラットＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ラットアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を以下に提示する（Ｇａｏ，Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，２００３，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙを参照のこと）。
【０１６２】
【表２６】
【０１６３】
ブタＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ブタアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を以下に提示する。Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００２，７３（４），６３５−６４２を参照のこと（その内容は、本明細書において参考として援用される）。
【０１６４】
【表２７】
【０１６５】
従って、本発明は、哺乳動物血清との接触時にカプセル化された薬物をそれほどまたは全く放出しない改善された安定性を示す両性リポソームの処方を提供する。かかるリポソーム処方は、血流への全身投与後の薬物の送達に有用であり得る。かかる使用に対して制限されなければ、本発明は、オリゴヌクレオチド、現在開発中の新たなクラスの薬物、およびＤＮＡプラスミドの送達に特に適する。かかる化合物の大部分は、細胞内に作用部位を有する。搬送システムは、かかる物質の乏しい取り込みを克服するために使用され、しばしば、必要不可欠な前提条件である。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】図１は、完全なヒト血清における４時間のインキュベーション後の以下の表１のＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ処方からのカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）放出のグラフである。ＣＦ放出を、消光したＣＦシグナルの％として表す。Ｘ軸は、ＭｏＣｈｏｌとＣＨＥＭＳとの間の１：１の比で荷電した脂質の全量を示す。
【図２】図２は、完全なヒト血清における４時間のインキュベーション後の以下の表４のＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳｕｃｃ処方からのＣＦ放出のグラフである。ＣＦ放出を、消光したＣＦシグナルの％として表す。Ｘ軸は、ＭｏＣｈｏｌとＤＭＧＳｕｃｃとの間の１：１の比で荷電した脂質の全量を示す。
【図３】図３は、完全なヒト血清における３７℃でのインキュベーション後のＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳｕｃｃを含有するリポソームからのＣＦ放出のグラフである。ＣＦ放出を、消光したＣＦシグナルの％として表す。過度のカチオンは、血清の攻撃に対してリポソームを安定にする。ＤＭＧＳｕｃｃは、ＣＨＥＭＳ対等物よりかなり安定である。
【図４】図４は、完全なヒト血清における３７℃でのインキュベーション後の以下の表３および６のＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳおよびＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳｕｃｃ処方からのＣＦ放出のグラフである。処方は、２および４のＤＯＰＥ／ＰＯＰＣ比を有し、カチオン性対アニオン性脂質比は１未満である。放出を、消光したＣＦシグナルの％として表す。
【図５】図５は、低および高脂質用量でラット肝臓および脾臓に投与される場合、サイズ＞１５０ｎｍを有する処方ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ １５：４５：２０：２０の生体内分布を示す棒グラフである（以下の実施例７を参照のこと）。
【図６】図６は、低および高脂質用量でラット肝臓および脾臓に投与される場合、サイズ＜１５０ｎｍを有する処方ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ １５：４５：２０：２０の生体内分布を示す棒グラフである（以下の実施例７を参照のこと）。
【図７】図７は、ＮＩＲ画像化によって得られる屠殺されたコラーゲン誘導性関節炎マウスの肢の写真であり、Ｃｙ５．５標識ＣＤ４０アンチセンスをカプセル化する両性リポソームの生体内分布を示す（以下の実施例８を参照のこと）。
【図８】図８は、炎症マウスの足浮腫に対するＣＤ４０アンチセンスを含有する両性リポソームによる処置の効果を示すグラフである。
【図９】図９は、ＣＤ４０アンチセンスを含有する両性リポソームで処置したマウスの評価された臨床スコアのグラフである。
【図１０】図１０は、本発明に従って標的化するためのブタＣＤ４０ｃＤＮＡ配列（配列番号４）である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両性リポソームに関し、特に、ヒトまたは動物血清において改善された安定性を有するかかるリポソームについて言及する。本発明はまた、例えば、リポソームおよびかかるリポソームを含んでなる薬学的組成物を形成するための薬物などの活性因子または成分をカプセル化することが可能な脂質の混合物を含む。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、タンパク質発現を極めて特異的にダウンレギュレートまたは妨害することができる新規のクラスの薬物を表す。かかるオリゴヌクレオチドとして、アンチセンス、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（モルホリノ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および多様な化学の転写因子デコイが挙げられる。かかるオリゴヌクレオチド治療薬の異なる作用機序の詳細な説明については、文献（例えば、非特許文献１；および非特許文献２）において見出すことができる。
【０００３】
遺伝子修復アプリケーション（例えば、非特許文献３を参照のこと）およびマイクロＲＮＡのためのオリゴヌクレオチドの使用は、この迅速に成長している分野の他の例である。
【０００４】
核酸治療薬は、それらの実際の化学的起源とは関係なく、体液におけるそれらの不安定性のためもしくは細胞への非効率な取り込みの故、または両方により治療効力を欠き得ることが当該技術分野において公知である。上記の変種を含むかかるオリゴヌクレオチドの化学修飾、ならびにリガンドまたはポリマーとのコンジュゲートの形成は、かかる実際の限界を克服するための１つのストラテジーを表す。
【０００５】
第２の組のストラテジーは、細胞への増強された取り込みを保護し、標的化し、そして付与するためのキャリアシステム、特に、リポソームの使用に関与する。リポソームは、水性コアを有し、そして疎水性および親水性成分の両方を有する両親媒性分子（両親媒性物質）から形成される人工シグナル、オリゴまたは多重層小胞である。カーゴは、リポソームのコアにおいてトラップされ得、膜層または膜表面に配置される。かかるキャリアシステムは、次の基準の至適スコアに一致すべきである：高いカプセル化効率および経済的製造、コロイド安定性、細胞への増強された取り込みならびにもちろん、低い毒性および免疫原性。
【０００６】
キャリアと環境との間で凝集が生じないため、アニオン性または中性リポソームは、しばしば、コロイド安定性に関して優秀である。従って、それらの生体内分布は優秀であり、そして刺激および細胞障害性の可能性は低い。しかし、かかるキャリアはカプセル化効率を欠き、そして細胞へのさらなる取り込みを容易にするエンドソーム分解シグナルを提供しない（非特許文献４）。
【０００７】
極めて多くの刊行物がカチオン性リポソームシステムを取り扱っている；例えば、非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７を参照のこと。カチオン性システムは高い充填効率を提供するが、それらは、特に、体液との接触後、コロイド安定性を欠く。タンパク質および／または他のバイオポリマーとのイオン相互作用は、細胞外マトリックスまたは細胞表面とのインサイチュでの凝集体形成をもたらす。カチオン性脂質は、しばしば、毒性であることが見出されており、非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０によって示されている。
【０００８】
これらの制限は、立体的安定化をキャリアに提供する成分の添加によって克服された。例えば、体液におけるカチオン性成分の使用に関連する凝集の問題を排除する多様な鎖長のポリエチレングリコールが公知であり、そしてＰＥＧ化カチオン性リポソームは、インビボで増強された循環時間を示す（非特許文献１１）。しかし、ＰＥＧの使用は、カチオン性脂質に関連する固有の毒性の問題を解決していない。ＰＥＧは、実質的に、細胞へのかかるリポソームの生産的侵入またはそれらの細胞内送達を阻害することもまた公知である（非特許文献１２）。かなり最近、（非特許文献１３）は、インビボでｓｉＲＮＡを肝臓細胞にトランスファーすることが可能であるカチオン性ベクターのための拡散性ＰＥＧ−脂質について記載した。しかし、かかる解決に対する多大な要求および臨床開発の所定の損耗率は、概念的に独立する解決のための開発の動機をさらに与える。
【０００９】
両性リポソームは、ｐＨ７．５でアニオン性または中性電荷およびｐＨ４でカチオン性電荷を有するリポソームの最近記載されたクラスを表す。特許文献１、特許文献２および特許文献３（すべてＰａｎｚｎｅｒらによるものであり、本明細書において参考として援用される）は、両性リポソームおよびそれらに適切な脂質の詳細な説明を与える。さらなる開示は、特許文献４および特許文献５（これらもまたＰａｎｚｎｅｒらによるものであり、本明細書において参考として援用される）において行われ、かかる両性リポソームの製造のためのさらにｐＨ感受性脂質について記載している。
【００１０】
両性リポソームは優秀な生体内分布を有し、動物において極めて良好に忍容される。それらは、高い効率で核酸分子をカプセル化することができる。
【００１１】
哺乳動物における異なる病態または疾患の防止もしくは処置のための薬物のキャリアとしての両性リポソームの使用には、血中へのそれらの注入後のリポソームの安定性が必要である。特に、全身適用では、標的組織または細胞における究極的取り込みまで薬物は、リポソームにおいて安定にカプセル化されなければならない。ＦＤＡの指針は、リポソーム処方を含んでなる薬物の特定の前臨床試験を規定する（非特許文献１４）。例えば、血流における循環時間中におけるカプセル化された薬物対遊離の薬物の比が、決定されなければならない。
【００１２】
リポソームの血流への注入後、血清成分はリポソームと相互作用し、そしてリポソーム膜の透過化をもたらし得る。しかし、リポソームによってカプセル化される薬物の放出はまた、薬物の分子ディメンションにも依存する。これは、数千の塩基対のサイズを伴うプラスミド薬物が、例えば、より小さなオリゴヌクレオチドまたは他の小分子よりかなり緩徐に放出され得ることを意味する。薬物のリポソーム送達では、リポソームの循環中薬物の放出は、可能な限り低いことが必須である。
【特許文献１】ＷＯ０２／０６６４９０
【特許文献２】ＷＯ０２／０６６０１２
【特許文献３】ＷＯ０３／０７０７３５
【特許文献４】ＷＯ０３／０７０２２０
【特許文献５】ＷＯ０３／０７０７３５
【非特許文献１】Ｃｒｏｏｋｅ ｉｎ ＢＢＡ（１９９９），１４８９（１），３１−４４；Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｃｅｌｌ（２００４），１１７（１），１−３
【非特許文献２】Ｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，（２０００），１０６（９），１０７１−５
【非特許文献３】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２００２），２０，１０５−１１８
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０００），２９２，４８０−４８８ ｂｙ Ｋｌｉｍｕｋ，ｅｔ ａｌ．
【非特許文献５】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９），１６，１２９−１４０ ｂｙ Ｍａｕｒｅｒ，ｅｔ ａｌ．
【非特許文献６】ＢＢＡ（２０００）１４６４，２５１−２６１ ｂｙ Ｍｅｉｄａｎ，ｅｔ ａｌ．
【非特許文献７】Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１），１（２），２７−３３ ｂｙ Ｆｉｓｅｔ ＆ Ｇｏｕｎｎｉ
【非特許文献８】Ｆｉｌｉｏｎ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ ＢＢＡ（１９９７），１３２９（２），３４５−３５６
【非特許文献９】Ｄａｓｓ ｉｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００２），５４（５），５９３−６０１
【非特許文献１０】Ｈｉｒｋｏ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１０（１４），１１８５−１１９３
【非特許文献１１】ＢＢＡ（２００１）１５１０，１５２−１６６ ｂｙ Ｓｅｍｐｌｅ，ｅｔ ａｌ．
【非特許文献１２】Ｓｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ ＢＢＡ（２００２），１５５８（１），１−１３
【非特許文献１３】Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３（８），１００２−１００７）
【非特許文献１４】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｇｕｉｄａｎｃｅ／２１９１ｄｆｔ．ｐｄｆ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、ヒトまたは動物血清との接触時に改善された安定性を有するリポソームおよびかかるリポソームを形成することが可能な脂質の混合物を提供することである。
【００１４】
特に、本発明の目的は、かかる改善された血清安定性を有する両性リポソームを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、核酸薬物、例えば、オリゴヌクレオチドおよびプラスミドなどの薬物を含む活性因子または成分の標的化された送達のためのキャリアとしてのかかるリポソームを含んでなる薬学的組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の特定の目的は、ヒトまたは非ヒト動物の炎症、免疫もしくは自己免疫障害の処置あるいは予防のためのかかる薬学的組成物を提供することである。
【００１７】
なお本発明の別の目的は、ヒトまたは非ヒト動物の処置のための方法であって、活性因子を含んでなる薬学的組成物が１つ以上の特定の器官、腫瘍あるいは感染または炎症の部位に標的化される、上記方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
従って、本発明の１つの態様に従えば、活性因子をカプセル化して、リポソームを形成することが可能な脂質の混合物が提供され、前記混合物は、約０．５〜約８の範囲のホスファチジルエタノールアミン対ホスファチジルコリンの比でホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含んでなる。
【００１９】
適切には、前記比は、約０．７５〜約５、好ましくは、約１〜約４の範囲である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、前記ホスファチジルコリンは、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣもしくはＤＯＰＣから、または例えば、ダイズＰＣおよび卵ＰＣなどの天然の供給源由来のホスファチジルコリン類から選択され得る。
【００２１】
前記ホスファチジルエタノールアミン類は、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥから選択され得る。
【００２２】
好適な中性脂質として、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＣ、ダイズＰＣおよび卵ＰＣが挙げられる。
【００２３】
コレステロールは、血清の攻撃に対してホスファチジルコリン二分子層を安定化し得ることが公知である。しかし、ＰＯＰＣもＤＯＰＥもまたいずれもそれ自体では、血清中で安定な構造を形成しない。驚くべきことに、ＤＯＰＥおよびＰＯＰＣの混合物は、血清中で安定なリポソームを形成し得ることが見出されている。
【００２４】
従って、本発明の特定の態様では、前記脂質の混合物は中性であってもよい。いくつかの実施形態では、前記混合物は、上記の範囲の比でホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンよりなるか、または本質的になり得る。
【００２５】
本発明の別の態様では、本発明に従う脂質の混合物を含んでなる中性リポソームが提供される。かかるリポソームは、血清中で安定な賦形剤または薬物などの活性因子のキャリアとして使用され得る。
【００２６】
しかし、本発明の異なる態様では、前記混合物は、１つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質をさらに含んでなり得る。
【００２７】
好ましくは、前記１つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質は両性であって、ｐＨ７．４では負に荷電するかまたは中性であり、そしてｐＨ４では正に荷電する。
【００２８】
本明細書における「両性」とは、アニオン性およびカチオン性の両方の特徴の荷電した基を含んでなる物質、物質の混合物または上掲の分子複合体（例えば、リポソーム）を意味し、
（ｉ）荷電した基の少なくとも１つは４〜８の間のｐＫを有し、
（ｉｉ）カチオン性の電荷はｐＨ４において認められ、そして
（ｉｉｉ）アニオン性の電荷はｐＨ８において認められ、
ｐＨ４〜ｐＨ８の間の正味の電荷の等電点を生じる。両性イオンは上記範囲のｐＫを有さないため、両性特徴は、両性イオンの特徴とは異なるこのような規定による。結果として、両性イオンは、ｐＨ値の範囲にわたって本質的に中性に荷電しており；ホスファチジルコリン類およびホスファチジルエタノールアミン類は、両性イオン特徴を伴う中性脂質である。
【００２９】
従って適切には、前記混合物は、互いに組合わせることで両性特徴を有する複数の荷電した両親媒性物質を含んでなり得る。好ましくは、前記１つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質は、ｐＨ感受性アニオン性脂質およびｐＨ感受性カチオン性脂質を含んでなる。本明細書において、荷電性カチオンおよび荷電性アニオンのかかる組合わせは、「両性ＩＩ」脂質対と称される。前記荷電性カチオンは、約４〜約８の間、好ましくは、約５．０または５．５〜約７．０または７．５の間のｐＫ値を有し得る。前記荷電性アニオンは、約３．５〜約７の間、好ましくは、約４または４．５〜約６．０または６．５の間のｐＫ値を有し得る。例として、ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ、ＤＰＩＭ／ＣＨＥＭＳおよびＤＰＩＭ／ＤＧＳｕｃｃが挙げられる。
【００３０】
「両性Ｉ」脂質対は、安定なカチオン（例えば、ＤＤＡＢ／ＣＨＥＭＳ、ＤＯＴＡＰ／ＣＨＥＭＳおよびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＳ）ならびに荷電性アニオンを含んでなる一方、「両性ＩＩＩ」脂質対は、安定なアニオンならびに荷電性カチオン（例えば、ＭｏＣｈｏｌ／ＤＯＰＧおよびＭｏＣｈｏｌ／Ｃｈｏｌ−ＳＯ４）を含んでなる。
【００３１】
もちろん、本発明の範囲内において、例えば、両親媒性ジカルボン酸、ホスファチジン酸、両親媒性ピペラジン誘導体などのような複数の電荷を伴う両親媒性物質を使用することも可能である。かかる複数の荷電した両親媒性物質は、ｐＨ感受性両親媒性物質であってもまたは安定なアニオンもしくはカチオンであり得、あるいはそれらは「混合型の」特徴を有し得る。
【００３２】
適切には、前記アニオン性脂質は、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＰＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＰＧＳｕｃｃおよびＣＨＥＭＳから選択され得る。
【００３３】
前記カチオン性脂質は、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌおよびＣＨＩＭから選択され得る。
【００３４】
本発明のなお別の態様では、上記の範囲の比のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン、ｐＨ感受性アニオン性脂質ならびにｐＨ感受性カチオン性脂質を含んでなる両性リポソームが提供される。
【００３５】
前記両性リポソームは、ｐＨ７．４では負または中性に荷電し、そしてｐＨ４ではカチオン性であり得る。
【００３６】
本発明の別の特定の態様では、前記リポソームは、少なくとも１つの活性因子をカプセル化する。前記活性因子は薬物を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、前記活性因子は、脊椎動物細胞において１つもしくはそれ以上のＲＮＡに転写されることが可能である例えば、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡプラスミドなどの核酸を含んでなり得、前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムであり、前記ｍＲＮＡは１つもしくはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【００３７】
前記オリゴヌクレオチドまたは他の核酸に基づく薬物は、前記両性リポソームにカプセル化され得る。前記オリゴヌクレオチドの実質的部分またはすべては、両性リポソームに物理的にトラップされ得る。血清中で安定な両性リポソーム処方は、薬物の細胞内送達のためか、あるいは哺乳動物または哺乳動物の部分、特にヒトまたはそれらの器官における病態および／または疾患の防止もしくは処置のために使用することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、ＣＤ４０をコードする核酸を標的化し、それによって哺乳動物細胞におけるＣＤ４０の発現を調整（ｍｏｄｕｌａｔｅ）するために適応され得る。適切には、前記オリゴヌクレオチドは、ＣＤ４０のｍＲＮＡに対して指向され得る。
【００３９】
なお本発明の別の態様では、本発明に従う活性因子充填両性リポソームおよびそれらのための薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなる薬学的組成物が提供される。
【００４０】
前記組成物は、高または低脂質用量について処方され得、従って、適切には、薬物／脂質比は、所望の脂質濃度に調整され得る。いくつかの実施形態では、前記組成物は、前記薬物／脂質比を減少するために空のリポソームをさらに含んでな得、前記空のリポソームは、前記活性因子充填リポソームと同じまたは類似のサイズおよび組成を有する。前記空のリポソームは、本発明に従う脂質の混合物を含んでなり得る。
【００４１】
なお別の態様では、本発明は、ヒトあるいは非ヒト動物の炎症、免疫または自己免疫障害の防止もしくは処置のための本発明に従う薬学的組成物の使用を含み、前記組成物は、哺乳動物細胞においてＣＤ４０の発現を調整するためのＣＤ４０をコードする核酸を標的化するために適応されるオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【００４２】
前記組成物は、全身または局所投与のために処方され得る。系統的に使用される場合、本発明は、特に、移植片拒絶、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬または甲状腺炎の防止もしくは処置のための前記組成物の使用を含んでなる。
【００４３】
局所適用のために処方される場合、本発明は、特に、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、喘息、クローン病または大腸炎の防止もしくは処置のための前記組成物の使用を含んでなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
上記のように、本発明の両性リポソームは、アニオン性およびカチオン性成分を含んでなり得、両方の成分はｐＨ感受性であり、ＷＯ０２／０６６０１２（その内容は本明細書において参考として援用される）において開示されている。
【００４５】
ｐＨに感受性であるカチオン性脂質は、ＷＯ０２／０６６４８９およびＷＯ０３／０７０２２０、ならびにそれに掲載の参考文献、特に、Ｂｕｄｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（６）：７６０−４（それらのすべての内容は本明細書において参考として援用される）において開示されている。
【００４６】
好適なカチオン成分はＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌおよびＣＨＩＭ、特に、ＭｏＣｈｏｌである。
【００４７】
好適なアニオン性脂質は：ＤＯＧＳｕｃｃ、ＰＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＰＧＳｕｃｃおよびＣＨＥＭＳ、特に、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃおよびＣＨＥＭＳを含んでなる群から選択される。
【００４８】
脂質については以下の略称が本明細書において使用されるが、該略称の大部分は文献における標準的用途内にある：
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】
カチオン性およびアニオン性脂質の間の比（荷電比）は、等電点を決定するだけでなく、組成物の血清安定性に影響を及ぼし得ることが見出されている。従って、前記荷電比は、４：１から１：４まで、好ましくは、３：１〜１：３（カチオン：アニオン）の間で変動し得る。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態では、カチオンはアニオンより多く存在し得る。好ましくは、前記荷電比は３：１〜２：１の間である。荷電した脂質の全量は、脂質混合物の５から９５ｍｏｌ％まで、好ましくは、３０から８０ｍｏｌ％まで、およびより好ましくは、４５または５０ｍｏｌ％から７５ｍｏｌ％まで変動し得、残りの脂質は中性リン脂質ＰＣおよびＰＥから形成される。
【００５３】
あるいは、カチオンおよびアニオンは、実質的に同じ量で存在し得る。荷電した脂質の全量は、脂質混合物の５から７５ｍｏｌ％まで、好ましくは、２０から６５ｍｏｌ％まで変動し得、残りの脂質は中性リン脂質ＰＣおよびＰＥから形成される。
【００５４】
別の代替物では、アニオンは、カチオンより多く存在し得る。前記荷電比は、１：３〜１：２、好ましくは、約１：２（カチオン：アニオン）の間で存在し得る。荷電した脂質の全量は、脂質混合物の４０ｍｏｌ％から７５または８０ｍｏｌ％まで、好ましくは、４５または５０ｍｏｌ％から７０または７５ｍｏｌ％まで、およびより好ましくは、５５から６５ｍｏｌ％まで変動し得、残りの脂質は中性リン脂質ＰＣおよびＰＥから形成される。
【００５５】
カチオンおよびアニオンの異なる多くの組合わせが、上記の適切な成分のリストから選択され得る。有利なことに、本発明は、荷電性カチオンとしてＭｏＣｈｏｌまたはＣＨＩＭおよび荷電性アニオンとしてＣＨＥＭＳ、ＤＭＧＳｕｃｃまたはＤＯＧＳｕｃｃを使用して、実行され得る。
【００５６】
現在好適なリポソームは、１：１〜１：４の間の比のＰＯＰＣおよびＤＯＰＥならびに３：１〜１：１の間の比のＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳ、ＭｏＣｈｏｌおよびＤＭＧＳｕｃｃ、ＭｏＣｈｏｌおよびＤＯＧＳｕｃｃ、ＣＨＩＭおよびＣＨＥＭＳ、ならびにＣＨＩＭおよびＤＭＧＳｕｃｃから選択される両性脂質対を含んでなる脂質の混合物から作製され、荷電した脂質の量は、脂質混合物の３０〜８０ｍｏｌ％の間である。
【００５７】
本発明に従うかかるリポソームの具体例として、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
【００５８】
【表３】
【００５９】
さらに現在好適なリポソームは、１：１〜１：４の間の比のＰＯＰＣおよびＤＯＰＥ、ＤＭＧＳｕｃｃまたはＤＯＧＳｕｃｃ、ならびにＭｏＣｈｏｌを含んでなる脂質の混合物を含んでなり、ＤＭＧＳｕｃｃまたはＤＯＧＳｕｃｃのモル量はＭｏＣｈｏｌのモル量を超え、そして荷電した脂質の量は３０〜８０ｍｏｌ％の間である。好ましくは、荷電比は１：２〜１：３の間であり、そして荷電した成分は、脂質混合物の４５または５０ｍｏｌ％〜７０または７５ｍｏｌ％の間の構成分をなす。
【００６０】
かかるさらなるリポソームの具体例として、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
【００６１】
【表４】
【００６２】
かかる使用に限定されなければ、本発明に記載の材料は、例えば、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプラスミドなどの核酸に基づく薬物のキャリアとしての使用に良好に適合される。これらの薬物は、タンパク質、ポリペプチドまたはＲＮＡに対する１つもしくはそれ以上の特異的配列をコードする核酸、およびタンパク質発現レベルを特異的にレギュレートするかまたは特に、スプライシングへの干渉および人工的トランケーションを介してタンパク質構造に影響を及ぼすことができるオリゴヌクレオチドに分類される。
【００６３】
従って、本発明のいくつかの実施形態では、核酸に基づく治療薬は、脊椎動物細胞において１つもしくはそれ以上のＲＮＡに転写されることが可能である核酸を含んでなり得、該ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムであり得、かかるｍＲＮＡは１つもしくはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードする。かかる核酸治療薬は、環状ＤＮＡプラスミド、ＷＯ９８／２１３２２もしくはＤＥ１９７５３１８２において開示されているようなＭＩＤＧＥベクター（Ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）と同様な線状ＤＮＡ構築物、または翻訳のために具備されるｍＲＮＡ（例えば、ＥＰ１３９２３４１）であってもよい。
【００６４】
本発明の別の実施形態では、存在する細胞内核酸またはタンパク質を標的化することができるオリゴヌクレオチドを使用してもよい。前記オリゴヌクレオチドは、転写を減弱もしくは調整する、転写物のプロセシングを改変するまたはそうでなければタンパク質の発現を干渉するために適応されるように、前記核酸は特定の遺伝子をコードし得る。用語「標的核酸」は、特定の遺伝子をコードするＤＮＡ、ならびにプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡであるかかるＤＮＡから誘導されるすべてのＲＮＡを包含する。標的核酸とかかる配列に対して指向される１つもしくはそれ以上のオリゴヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションは、タンパク質発現の阻害またはモジュレーションを生じ得る。かかる特異的ターゲティングを達成するために、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の配列に実質的に相補的であるヌクレオチドの連続ストレッチを適切に含んでなるべきである。
【００６５】
上記の基準を満たすオリゴヌクレオチドは、異なる多くの化学およびトポロジーにより構成され得る。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよい。
【００６６】
オリゴヌクレオチドの作用機作は変動し得、そして特に、スプライシング、転写、核−細胞質間輸送および翻訳に対する効果を含んでなり得る。
【００６７】
本発明の好適な実施形態では、一般にアンチセンスオリゴヌクレオチドとして公知であるＤＮＡに基づくオリゴヌクレオチド、モルホリノ核酸、２’−修飾オリゴヌクレオチドなどを含むがそれらに限定されない一本鎖オリゴヌクレオチドを使用してもよい。骨格または塩基または糖修飾としては、ホスホチオエートＤＮＡ（ＰＴＯ）、２’Ｏ−メチルＲＮＡ（２’Ｏｍｅ）、２’Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホアミデート（ＮＰ）、２’フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、モルホリンホスホアミデート（モルホリノ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）などが挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、混合された化学は当該技術分野において公知であり、コポリマー、ブロック−コポリマーもしくはギャップマーなどの１を超えるヌクレオチド種からまたは他の配列で構築される。上記のオリゴヌクレオチドに加えて、タンパク質発現はまた、相補配列モチーフを含有する二本鎖ＲＮＡ分子を使用して、阻害することができる。かかるＲＮＡ分子は、当該技術分野においてｓｉＲＮＡ分子として公知である（例えば、ＷＯ９９／３２６１９またはＷＯ０２／０５５６９３）。さらに、多様な化学が、このクラスのオリゴヌクレオチドに適応された。また、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドシステムも当該技術分野において公知である。
【００６８】
本発明の別の実施形態では、デコイオリゴヌクレオチドを使用することができる。従って、これらの二本鎖ＤＮＡ分子および化学修飾は、核酸を標的化するが、転写因子を標的化しない。これは、デコイオリゴヌクレオチドが配列特異的ＤＮＡ結合性タンパク質に結合し、そして転写を干渉することを意味する（例えば、Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９９９）。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態では、生理学的条件下で遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズすることによって、転写に影響を及ぼし得るオリゴヌクレオチドを使用し得る。さらに、多様な化学がこのクラスのオリゴヌクレオチドに順応し得る。
【００７０】
なお本発明のさらなる代替物では、ＤＮＡザイムを使用してもよい。ＤＮＡザイムは、酵素活性を伴う一本鎖オリゴヌクレオチドおよびその化学修飾である。「１０〜２３」モデルとして公知の典型的なＤＮＡザイムは、生理学的条件下で特異的部位において一本鎖ＲＮＡを切断することが可能である。ＤＮＡザイムの１０〜２３モデルは、ＲＮＡ上の標的配列に相補的な２基質認識ドメインによって隣接される１５の高度に保存されたデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。標的ｍＲＮＡの切断は、それらの破壊を生じ得、ＤＮＡザイムは再循環し、そして複数の基質を切断する。
【００７１】
本発明のなお別の実施形態では、リボザイムを使用することができる。リボザイムは、酵素活性を伴う一本鎖オリゴリボヌクレオチドおよびその化学修飾である。それらは、２つの成分、触媒コアを形成する保存されたステム−ループ構造および所定のＲＮＡ転写物において標的部位を囲む配列に逆相補的であるフランキング配列に作動可能に分割することができる。フランキング配列は特異性を付与し得、そして一般的に、合計で１４〜１６ｎｔを構成し得、選択される標的部位の両方部位上に延在する。
【００７２】
本発明のなおさらなる実施形態では、タンパク質を標的化するためにアプタマーを使用してもよい。アプタマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸、および特異的分子標的に緊密に結合するその化学修飾からなる高分子であり、そして典型的に１５〜６０ｎｔ長である。ヌクレオチドの鎖は、分子を複雑な３次元の形状に折り畳む分子内相互作用を形成し得る。アプタマーの形状は、それが、酸性タンパク質、塩基性タンパク質、膜タンパク質、転写因子および酵素を含んでなるがそれらに限定されないその標的分子の表面に対して緊密に結合することを可能にする。アプタマー分子の結合は、標的分子の機能に影響を及ぼし得る。
【００７３】
上記のオリゴヌクレオチドのすべては、短くて１０、好ましくは１５およびさらにより好ましくは１８〜５０、好ましくは３０およびより好ましくは２５ヌクレオチドの間の長さで変動し得る。オリゴヌクレオチドと標的配列との間の適合は、オリゴヌクレオチドの各塩基と好ましくは完全であり、上記の数のオリゴヌクレオチドの連続ストレッチにわたる標的核酸上のその相補的塩基と塩基対を形成する。これはそれほど好適ではないが、配列の対は、塩基対の前記連続ストレッチ内に１つもしくはそれ以上のミスマッチを含有してもよい。一般に、かかる核酸のタイプおよび化学組成は、それがインビボであってもまたはインビトロであってもビヒクルとしての本発明のリポソームの性能にほとんど影響を及ぼさず、そして当業者は、本発明のリポソームとの組合わせに適切な他のタイプのオリゴヌクレオチドまたは核酸を見出し得る。
【００７４】
しかし、本発明の好適な実施形態では、ＣＤ４０遺伝子、そのセンスもしくはアンチセンス鎖、その任意のエキソンもしくはイントロンまたは非翻訳領域をコードする核酸を標的化するために適応され、それによって、哺乳動物細胞におけるＣＤ４０の発現を調整するオリゴヌクレオチドを使用してもよい。
【００７５】
本発明の別の好適な実施形態では、前記オリゴヌクレオチドはＣＤ４０の任意のｍＲＮＡに対して指向され得、かかるｍＲＮＡはプレｍＲＮＡおよびそれらのその後の成熟した形態を含む。
【００７６】
タンパク質発現は、例えば、アンチセンス、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（モルホリノ）および多様な化学の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのオリゴヌクレオチドを使用して、特異的にダウンレギュレートさせることができる。
【００７７】
ＣＤ４０については、Ｐａｕｌｉ，ｅｔ ａｌ．１９８４（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １７：１７３−１７９）によって最初に記載された。タンパク質は、主に、樹状細胞、内皮細胞およびＢ細胞において発現され、そしてＴ細胞上のそのリガンド（ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ１５４）と相互作用する。ＣＤ４０とＣＤ１５４との間のシグナル伝達は、体液免疫応答の発達に極めて重要である。経路の過剰刺激は、移植片拒絶、移植片対宿主病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬および甲状腺炎を含む多様な免疫関連障害をもたらし得る。ＣＤ４０過剰発現はまた、腫瘍増殖に関与し得（Ｇｒｕｓｓ，ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ．２４（５−６）：３９３−４２２）、そしてＣＤ４０の増強されたレベルの可溶性形態はアルツハイマー病に関連することが報告された（Ｍｏｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３９（１０）：１５５５−６１。ＣＤ４０はＮＦ−κＢ経路にシグナル伝達し、結果的に、転写因子の活性化ならびにＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＩＦＮγなどのサイトカインの究極的な放出をもたらし、次いで、他の細胞を活性化し、従って、ポジティブフィードバック機構を使用して炎症を促進する。
【００７８】
上記の経路における早期の事象の阻害は、免疫障害または炎症プロセスを阻害するのに有効なストラテジーとして提唱されている。例として、抗体を使用するＴＮＦαの競合結合、ＴＮＦα−受容体に対する抗体を使用する受容体遮断およびＮＦ−κＢ結合の競合阻害が挙げられる。ＣＤ４０は、三量体リガンド、ＣＤ１５４とのその相互作用を介してシグナル伝達するため、小分子インヒビターによるシグナル伝達事象の阻害は起こりそうになく、従って、治療薬開発ではブロッキング抗体の使用が注目されている。より具体的には、Ｈｏｌｓｔａｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．２０００（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５３９２−１５３９８）またはＢａｃｃａｍ＆Ｂｉｓｈｏｐ１９９９（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：３８５５−３８６６）によって記載のように、ＣＤ４０／ＣＤ１５４相互作用を、成分の１つに対して標的化される抗体を使用して阻止してもよい。しかし、開発中のＣＤ４０抗体は副反応を生じ、従って、このポイントでの炎症フィードバックループを切断する代替的手段の必要性が存在する。
【００７９】
これまでのところ、ＣＤ４０ ｍＲＮＡに対して標的化される多くのオリゴヌクレオチド配列が、インビトロで確証されている。例えば、ＵＳ２００４／０１８６０７１およびＵＳ６１９７５８４（両方ともＢｅｎｎｅｔｔらによる）には、アンチセンス機構に基づくかかるオリゴヌクレオチドについての詳細な説明がある。Ｐｌｕｖｉｎｅｔ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｂｌｏｏｄ，２００４は、ヒト標的に対するｓｉＲＮＡを使用するＣＤ４０のダウンレギュレーションについて最初に記載した。さらに、ＭａｎｏｈａｒａｎによるＷＯ２００４／０９０１０８は、ＣＤ４０タンパク質の発現を阻害する新規オリゴヌクレオチドの適用性について記載している。ＣＤ４０発現をダウンレギュレートするための間接的手段については、ＨｅｃｋｅｒおよびＷａｇｎｅｒによるＤＥ１００４９５４９に記載されており、転写因子ＩＦＲ−１の阻害を使用している。ＣＤ４０の発現を調整するための適切な特異的核酸については、以下の実施例１１に記載する。
【００８０】
従って、本発明の特定の態様では、活性因子としてＣＤ４０に対して指向されるオリゴヌクレオチドおよび賦形剤として本発明の両性リポソームを含んでなる薬学的組成物が提供される。かかる処方は、炎症および自己免疫障害の処置において治療上有効であることが見出されており、従って、本発明は、移植片拒絶、移植片対宿主病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、気管支喘息、炎症性腸疾患、乾癬、甲状腺炎、クローン病（Ｍｏｒｂｕｓ Ｃｒｏｈｎ）、潰瘍性大腸炎、ＣＯＰＤおよびアトピー性皮膚炎を含む炎症、免疫または自己免疫障害の防止もしくは処置のための本発明の組成物の使用をさらに含む。
【００８１】
本発明の薬学的組成物はまた、局所的処置、例えば、炎症のある粘膜の処置のために使用してもよい。特に、本発明の組成物は、炎症性腸疾患または移植片拒絶の処置もしくは予防のために使用してもよい。本発明の組成物はまた、皮膚または肺への局所投与のために適応してもよい。
【００８２】
リポソームは、カプセル化された薬物の薬物動態学的および生体内分布プロファイルをインビボで改変するために広範に使用されている。本発明のリポソームは、それらのカーゴと共に、肝臓によって迅速かつ大きな程度で浄化され得る。しかし、薬物動態学的パラメータならびに生体内分布パターンは、以下の実施例において例示されるように、リポソームのサイズおよび／または脂質用量を調整することによって、制御され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明のリポソームは約１５０ｎｍを超えるサイズを有し得る。かかるリポソームは、低い脂質用量で投与され得る。前記リポソームは、単層、オリゴ層または多重層であってもよい。かかる投与スキームは、肝臓への効果的滑迅速な標的化を可能にし、そして脾臓などの他の器官におけるリポソームおよび薬物の蓄積を回避する。
【００８４】
あるいは、約１５０ｎｍを超えるサイズを有するかかるリポソームは、高い脂質用量で投与され得、肝臓での飽和状態ならびに脾臓および感染もしくは炎症または腫瘍の部位などの循環におけるより遠位の部位におけるリポソームの蓄積の生体内分布パターンの変更をもたらす。身体のこれらの領域は、リポソームをろ過して取り出し得る有窓性または不完全な毛細管を有する。さらに加えて、脾臓ならびに感染または炎症および多くの腫瘍のかかる他の領域は、しばしば、循環からリポソームを取り出すことができる高含有量のマクロファージを有することが公知である。
【００８５】
本発明に従う前記薬学的組成物は、異なる方法により高い脂質用量で提供され得る。いくつかの実施形態では、所望の脂質濃度を達成するために組成物の薬物／脂質比を低くすることができる。あるいは、薬物充填リポソームに匹敵する組成およびサイズの空のリポソームを添加することによって、薬学的組成物の脂質濃度を制御してもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本発明に従うリポソームは約１５０ｎｍ未満のサイズを有し得る。前記リポソームは、単層、オリゴ層または多重層であってもよい。脾臓は、所望されない赤血球および血液由来の粒子を取り出すフィルターとして作用する。大きなリポソームはまた、同じ方法で細網フィルターによって保持される。しかし、小さなリポソームは漏出し得、従って脾臓に蓄積しない。従って、１５０ｎｍ未満のサイズを有する本発明に従うリポソームは、器官としての脾臓を迂回し得る。
【００８７】
肝臓細胞を標的化するために、１５０ｎｍ未満のサイズを有するかかるリポソームを、低い脂質用量で投与してもよい。かかるリポソームは、肝臓全体に十分に浸透し、そして肝細胞などの肝臓の実質細胞の実質的な部分に到達するように特に良好に適応される。
【００８８】
あるいは、感染もしくは炎症または固形腫瘍の領域などの循環におけるより遠位の部位を標的化し、同時に脾臓を迂回するために、１５０ｎｍ未満のサイズを有する前記リポソームを高い脂質用量で投与してもよい。
【００８９】
一般に、本発明のリポソームの薬物動態学的プロファイルおよび生体内分布は、多くの因子に依存し得る。リポソームの脂質組成の次に、サイズおよび脂質用量は、リポソームのインビボでの運命を決定する。本発明のリポソームは、それらのサイズにかかわらず、単層、オリゴ層または多重層であってもよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明のリポソームは、ヒトまたは非ヒト動物患者に対し、全身投与によって炎症のある肺を標的化するために使用し得る。
【００９１】
本明細書において提示されるデータから開始して初めて、当業者は、他の種、特に、他の哺乳動物またはヒトのための適切な投与レジメンを確立することが可能である。具体的には、別の種（例えば、ヒト）における脂質用量が「低い」かまたは「高い」かは、薬物動態学的データによって決定することができる。リポソームの薬物動態学は、２コンパートメントモデルに従う。上記のように、高い脂質用量は、肝臓での飽和および生体内分布パターンの変更をもたらす。これは、薬物動態学的曲線の端部における増強されたＣｍａｘ値をもたらす。
【００９２】
本発明の薬学的組成物は、適切な薬学的に許容可能なビヒクルにおけるコロイドとしての使用のために処方され得る。水、食塩、リン酸緩衝食塩水などのようなビヒクルは、この目的のために当業者に周知である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、約７〜約８の間の生理学的ｐＨで投与され得る。この目的のために、活性因子、賦形剤およびビヒクルを含んでなる組成物は、この範囲のｐＨを有するように処方され得る。
【００９４】
リポソームを製造するための方法は、当業者に公知である。それらは、規定されたポアサイズの膜を介する押出し、カーゴを含有する水へのエタノール中脂質溶液の注入または高圧ホモジナイゼーションを含むがそれらに限定されない。
【００９５】
また、核酸治療薬を、中性のｐＨで脂質と接触させることができ、核酸を含有する溶液の所定の百分率の容積包含（ｖｏｌｕｍｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）を生じることが当該技術分野において公知である。５０ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲の高濃度の脂質が、薬物の実質的なカプセル化を達成するのに好適である。
【００９６】
かかる標準的な手順とは対照的に、両性リポソームは、それらの等電点またはそれ未満において、核酸に結合する個別の利点を付与し、それによって、リポソーム表面における薬物を濃縮する。かかるプロセスは、ＷＯ０２／０６６０１２においてより詳細に記載されている。リポソームのｐＨを生理学的ｐＨ（約ｐＨ７．４）にまで上昇する時、負に荷電した核酸は、リポソーム膜から解離する。実際の生成プロセスとは関係なく、カプセル化されていない有効な薬物は、初期の生成工程後、リポソームから取り出すことができ、リポソームは密封容器として形成される。さらに、技術文献およびここに含まれる参考文献は、かかる方法論について詳細に記載し、そして適切なプロセス工程は、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降、透析、限外ろ過、透析ろ過などを含み得るが、これらに限定されない。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態では、８０ｗｔ％を超える薬物が前記リポソームの内側に配置され得る。
【００９８】
しかし、カプセル化されていない材料のかかる取り出しは義務的ではなく、そしていくつかの実施形態では、組成物は、トラップされたならびに遊離の薬物を含んでなり得る。
【００９９】
リポソームの粒度は５０〜５００ｎｍの間、好ましくは、５０〜３００ｎｍの間であり得る。
【０１００】
以下は、本発明の実施形態の添付の図面を参照するあくまでも例示による説明である。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：両性ＩＩ脂質ＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳによるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）充填リポソームの調製
クロロホルム中脂質のストック溶液を混合し、最終的に減圧下で乾燥状態まで丸底フラスコにおいてエバポレートした。脂質フィルムを、ＰＢＳ ｐＨ７．５において１００ｍＭ ＣＦとハイブリダイズさせた。得られた脂質濃度は２０ｍＭであった。懸濁液を、４５分間、水浴において室温で水和させ、５分間、音波処理し、続いて、−７０℃で３回の凍結／融解サイクルを行った。融解後、リポソーム懸濁液を、１００ｎｍのポアサイズを伴うポリカーボネート膜を介して１５回押出した。カプセル化されていないＣＦをゲルろ過によって取り出す一方、リポソームを３倍希釈した。脂質の回収率および濃度を、有機リン酸アッセイによって分析した。粒度を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳＡ上で動的光散乱により測定した。
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
実施例２：両性ＩＩ脂質ＭｏＣｈｏｌおよびＤＭＧＳｕｃｃによるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）充填リポソームの調製
リポソームを、実施例１に記載のとおりに調製した。
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
【表９】
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
実施例３：両性ＩＩ脂質ＭｏＣｈｏｌおよびＤＯＧＳｕｃｃによるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）充填リポソームの調製
リポソームを、実施例１に記載のとおりに調製した。
【０１１０】
【表１１】
【０１１１】
実施例４：両性ＩＩ脂質ＣＨＩＭおよびＣＨＥＭＳによるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）充填リポソームの調製
リポソームを、実施例１に記載のとおりに調製した。
【０１１２】
【表１２】
【０１１３】
実施例５：両性ＩＩ脂質ＣＨＩＭおよびＤＭＧＳｕｃｃによるカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）充填リポソームの調製
リポソームを、実施例１に記載のとおりに調製した。
【０１１４】
【表１３】
【０１１５】
実施例６：実施例１および２のＣＦ充填両性リポソームの血清安定性試験
カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）をモデル薬物として使用し、両性リポソームの血清安定性を決定した。オリゴヌクレオチドと同様に、ＣＦは負に荷電している。
【０１１６】
２５μｌのＣＦ充填リポソームを、１００μｌの予め加温した完全ヒト血清またはＰＢＳとそれぞれ混合し、３７℃でインキュベートした。規定された時間ポイントで５μｌのサンプルを、９６ウェルマイクロタイタープレートへ２０μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．５または２０μｌの２０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に対して移した。最後に、２７５μｌのＰＢＳを各ウェルに添加し、４７５／５３０ｎｍで蛍光強度を測定した。
【０１１７】
蛍光測定を介してリポソームからのＣＦの放出を決定することによって、４時間にわたって血清安定性を観察した。ＣＦの放出量（％で）を、規定された時間ポイントならびに界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）によるリポソームの処置後に測定し、１００％放出値を得た。
【０１１８】
結果：
ＰＯＰＣおよびＤＯＰＥの混合物は、血清において安定である。ＰＯＰＣ自体は、血清からの攻撃に耐えるリポソームを形成しない。さらに、ＤＯＰＥはリポソームを全く形成しない。かなり驚くべきことに、両方の成分からの混合物は、極めて安定であり、血清攻撃に対して耐性であることを見出した。本実施例において、０．７５〜５のＤＯＰＥ／ＰＯＰＣ比は、１．５〜５の間の広範な至適条件を伴う安定な構造を形成することを見出した（図１および２もまた参照のこと）。
【０１１９】
荷電した成分および中性脂質は、独立変数である。ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳｕｃｃ両方の１：１の比に対する血清感受性は低い〜極めて低く、広範な混合物にわたって安定な粒子が形成される。全体で荷電した成分の少なくとも６０または７０ｍｏｌ％が、二分子層の安定性に有意な影響を及ぼすのに必要であった。
【０１２０】
７０％の荷電した成分を含有する脂質混合物（表２および５を参照のこと）の血清安定性を図３に示す。一般に、過剰のＭｏＣｈｏｌは安定化効果を有する。
【０１２１】
血清安定性について試験した表３および６の処方は、２：１または４：１のいずれか一方の比でＤＯＰＥおよびＰＯＰＣを有する。荷電した脂質の全量を、８０％から５０％まで降順に滴定した。結果を図４に示す。
【０１２２】
実施例７：血清中で安定な両性リポソームの生体内分布
クロロホルム中脂質（＋／−１％１４Ｃ−ＤＰＰＣ）のストック溶液を混合し、最終的に減圧下で乾燥状態まで丸底フラスコにおいてエバポレートした。脂質フィルムを、１．５ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．５中３Ｈ−イヌリンまたは５ｍｌのＰＢＳ単独で水和した。得られた脂質濃度は１００ｍＭであった。懸濁液を、４５分間、水浴において室温で水和させ、３０分間、音波処理し、続いて、−７０℃で３回の凍結／融解サイクルを行った。融解後、リポソーム懸濁液を、適切なポアサイズを伴うポリカーボネート膜を介して１５回押出した。リポソームを、超遠心分離によって、カプセル化されていない３Ｈ−イヌリンから分離した（２回）。
【０１２３】
脂質の回収率および濃度を有機リン酸アッセイによって分析し、放射性標識粒子の場合、液体シンチレーションによってカプセル化効率を測定した。粒度を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳＡ上で動的光散乱により測定した。得られた非標識および放射性標識調製物を混合し、ＰＢＳで最終脂質濃度まで希釈した。
【０１２４】
【表１４】
【０１２５】
生体内分布研究
３９匹の雄性ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を５つのグループに分け、尾静脈を介して静脈内注入した。特定の時間ポイントで、血液サンプル（ＰＫについて）および／または組織サンプル（ＢＤについて）を回収し、高温下での触媒的酸化により分析した。サンプル間のキャリーオーバーの百分率を決定し、データの組の分析に含めた。
【０１２６】
【表１５】
【０１２７】
生体内分布研究の結果を図５〜６に示し、肝臓および脾臓における異なるリポソーム処方の生体内分布を示す。他の器官におけるリポソームの蓄積は５％を超えなかったため、従って、示していない。図５は、低い脂質用量で投与される場合、サイズ＞１５０ｎｍを有する本発明の両性リポソームは、単独で肝臓に蓄積することを明らかに実証する。対照的に、高脂質用量で同じリポソーム処方を投与することによって、生体内分布パターンが変化することが示され得る。肝臓に次いで、サイズ＞１５０ｎｍを伴うリポソームは脾臓にも蓄積する。
【０１２８】
図６は、サイズ＜１５０ｎｍで調製された本発明の両性リポソームの生体内分布を示す。低い脂質用量で投与されるこれらのリポソームの生体内分布は、サイズ＞１５０ｎｍを伴うリポソームとは異ならない一方、高い脂質用量のサイズ＜１５０ｎｍを有するリポソームの投与は、脾臓における蓄積をもたらさないことが実証され得る。
【０１２９】
実施例８：コラーゲン誘導性関節炎マウスにおけるＣｙ５．５標識ＣＤ４０アンチセンスをカプセル化した両性リポソームの生体内分布
クロロホルム中脂質のストック溶液を混合し、最終的に減圧下で乾燥状態まで丸底フラスコにおいてエバポレートした。脂質フィルムを、１０ｍＭ ＮａＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５中Ｃｙ５．５標識ＣＤ４０アンチセンスで水和した。得られた脂質濃度は２０ｍＭであった。懸濁液を、４５分間、水浴において５０℃で水和させ、５分間、音波処理し、続いて、−７０℃で凍結／融解サイクルを行った。融解後、２００ｎｍポリカーボネート膜を介して、リポソーム懸濁液を１９回押出した。押出しプロセス後、１／１０容積の１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８を添加することによって、リポソーム懸濁液のｐＨをｐＨ７．５に移した。カプセル化されていないＣｙ５．５標識ＣＤ４０アンチセンスを、高速沈降（２回）および上清を廃棄することによって取り出した。
【０１３０】
脂質の回収率および濃度を、有機リン酸アッセイによって分析した。カプセル化効率を、蛍光分光学によって測定した。粒度を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳＡ上で動的光散乱により測定した。
【０１３１】
空のリポソームを、１０Ｖｏｌ％のエタノール性脂質溶液（１５ｍｏｌ％ＰＯＰＣ、４５ｍｏｌ％ＤＯＰＥ、２０ｍｏｌ％ＭｏＣｈｏｌおよび２０ｍｏｌ％ＣＨＥＭＳの混合物）を１０ｍＭ ＮａＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５に注入することによって、生成した。得られた脂質濃度は２ｍＭであった。１／１０容積の１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８でこの溶液のｐＨを直ちに移した。希釈されたリポソームを濃縮するために、懸濁液を透析ろ過した。
【０１３２】
【表１６】
【０１３３】
マウスにおける生体内分布研究では、充填されたおよび空のリポソームを、以下のとおり混合した：
２００μｌのＣｙ５．５リポソームおよび４１μｌの空のリポソーム
ＤＢＡ／１系マウスを、完全フロイントアジュバントにおいて乳化したＩＩ型コラーゲン（２００μｇ／マウス）の皮下注入によって免疫した。マウスに、関節炎誘導の１日目（ＩＩ型コラーゲンによる単回免疫後の約２１日目）にリポソーム懸濁液（２４１μｌ）により静脈内注入した。１日目を、炎症が著明であった（少なくとも２のＲ．Ｏ．Ｗｉｌｌｉａｍｓに従う臨床スコア）日として規定した。
【０１３４】
マウスを、リポソーム懸濁液の注入の１０時間後に屠殺した。器官および足を取り出し、直ちに液体窒素中に凍結した。リポソームにカプセル化されたＣｙ５．５標識ＣＤ４０アンチセンスの生体内分布をＮＩＲ画像化によって評価し、非処置マウスの組織サンプルと比較した。活動期の疾患を伴うマウスの炎症のある足に、特定の増強が見出された。より具体的には、両性リポソームの蓄積は、個々の足または足指もしくは指における疾患の高度に活動期の部位と一致する（図７を参照のこと）。
【０１３５】
実施例９：高度充填手順によるＣＤ４０−ＯＤＮ含有リポソームの調製
リポソームを、１０Ｖｏｌ％のエタノール性脂質溶液（１５ｍｏｌ％ＰＯＰＣ、４５ｍｏｌ％ＤＯＰＥ、２０ｍｏｌ％ＭｏＣｈｏｌおよび２０ｍｏｌ％ＣＨＥＭＳの混合物）を、ＣＤ４０に対する６０μｇ／ｍｌの１８ｂｐアンチセンスを含有する１０ｍＭ ＮａＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５に注入することによって、生成した。
【０１３６】
得られた脂質濃度は２ｍＭであった。１／１０容積の１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８でこの溶液のｐＨを直ちに移した。希釈されたリポソームを濃縮するために、懸濁液を、Ｔ８６５ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｕｌｔｒａ Ｐｒｏ８０）において、２時間５分間、６５，０００ｒｐｍ、２０℃で沈降させた。その後、処方を０．４５μｍを介して滅菌ろ過した。
【０１３７】
【表１７】
【０１３８】
カプセル化されたＯＤＮの量を、２６０ｎｍにより光学密度（ＯＤ）を確認することによって、測定した。以下の量のＯＤＮをＳｍａｒｔｉｃｌｅ処方にカプセル化した。
【０１３９】
【表１８】
【０１４０】
実施例１０：関節炎における治療効力
ＤＢＡ／１系マウスを、完全フロイントアジュバントにおいて乳化したＩＩ型コラーゲン（２００μｇ／マウス）の皮下注入によって免疫した。Ｓｍａｒｔｉｃｌｅまたはコントロールによる処置を、関節炎誘導の１日目（ＩＩ型コラーゲンによる単回免疫後の約２１日目）に開始し、３および５日目に反復した。１日目を、炎症が著明であった（少なくとも２のＲ．Ｏ．Ｗｉｌｌｉａｍｓに従う臨床スコア）日として規定した。
【０１４１】
処置研究について、リポソームＣＤ４０−ＯＤＮを、確立された炎症を伴うラットの尾静脈に静脈内注入した。それぞれの用量は、体重１Ｋｇあたり４ｍｇのＣＤ４０−ＯＤＮ（カプセル化されたＣＤ４０−ＯＤＮ）を含有した。
【０１４２】
実験中、足の浮腫が観察され、臨床関節炎スコアを決定した。
【０１４３】
図８および９により明示されるように、両性リポソームにおいてカプセル化されたＣＤ４０−ＯＤＮによる処置後、足の浮腫の有意な減少が認められた。また、臨床スコアは、かかるリポソームにおいてカプセル化されたＣＤ４０−ＯＤＮによる処置後に有意に減少した。
【０１４４】
実施例１１：材料
本実施例は、ＣＤ４０の発現を調整し、本発明に従う組成物の使用に適切であるオリゴヌクレオチドによって標的化され得るＣＤ４０ヌクレオチド配列の非制限的例を提供する。
【０１４５】
ヒトＣＤ４０ ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６０５９２）
本発明に従う標的化のためのヒトＣＤ４０ ｍＲＮＡ配列を配列番号１に提示する。関連する配列情報は、Ｂｅｎｎｅｔｔらによるｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＵＳ２００４／０１８６０７１（即ち、配列番号８５）およびＢｅｎｎｅｔｔらによるＵＳ ｐａｔｅｎｔ ｎｏ．６１９７５８４（即ち、配列番号８５）ならびにＰｌｕｖｉｎｅｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００４，１０４（１２），３６４２−３６４６（それらの内容は、本明細書において参考として援用される）において見出される。
【０１４６】
【表１９】
【０１４７】
ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＣＤ４０ ｍＲＮＡ
本発明に従う標的化のためのネズミＣＤ４０ ｍＲＮＡ配列を配列番号２に提示する。関連する配列情報は、Ｂｅｎｎｅｔｔらによるｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＵＳ２００４／０１８６０７１（即ち、配列番号１３２）（その内容は、本明細書において参考として援用される）において見出される。
【０１４８】
【表２０】
【０１４９】
ラットＣＤ４０ ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ ２４１２３１）
本発明に従う標的化のためのラットＣＤ４０ ｍＲＮＡ配列を配列番号３に提示する（Ｇａｏ，Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ２００３を参照のこと）。
【０１５０】
【表２１】
【０１５１】
ブタＣＤ４０ｃＤＮＡ
本発明に従う標的化のためのブタＣＤ４０ ｃＤＮＡ配列を配列番号４に提示する（図１０）。関連する配列情報は、Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００２，７３（４），６３５−６４２（その内容は、本明細書において参考として援用される）において見出される。
【０１５２】
さらに、以下は、本発明における使用に適切であるアンチＣＤ４０オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスＣＤ４０核酸配列の非制限的例を提供する：
【０１５３】
ヒトＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ヒトアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を以下に提示する。さらなる配列情報は、Ｂｅｎｎｅｔｔらによるｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＵＳ２００４／０１８６０７１およびＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６１９７５８４（それらの内容は、本明細書において参考として提供される）において見出される。Ｂｅｎｎｅｔｔらにより言及された配列番号を右側に提供する。
【０１５４】
【表２２】
【０１５５】
【表２３】
【０１５６】
以下のｓｉＲＮＡ配列は、本発明における使用に適切である。（例えば、Ｐｌｕｖｉｎｅｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００４，１０４（１２），３６４２−３６４６を参照のこと）、その内容は、本明細書において参考として援用される。
【０１５７】
【表２４】
【０１５８】
すべてのｓｉＲＮＡは、３’末端に２ヌクレオチド突出部を含有する。
【０１５９】
ネズミＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ネズミアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を以下に提示する。さらなる配列情報は、Ｂｅｎｎｅｔｔらによるｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＵＳ２００４／０１８６０７１（その内容は、本明細書において参考として援用される）において見出される。Ｂｅｎｎｅｔｔらにより言及された配列番号を右側に提供する。
【０１６０】
【表２５】
【０１６１】
ラットＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ラットアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を以下に提示する（Ｇａｏ，Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，２００３，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙを参照のこと）。
【０１６２】
【表２６】
【０１６３】
ブタＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ブタアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を以下に提示する。Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００２，７３（４），６３５−６４２を参照のこと（その内容は、本明細書において参考として援用される）。
【０１６４】
【表２７】
【０１６５】
従って、本発明は、哺乳動物血清との接触時にカプセル化された薬物をそれほどまたは全く放出しない改善された安定性を示す両性リポソームの処方を提供する。かかるリポソーム処方は、血流への全身投与後の薬物の送達に有用であり得る。かかる使用に対して制限されなければ、本発明は、オリゴヌクレオチド、現在開発中の新たなクラスの薬物、およびＤＮＡプラスミドの送達に特に適する。かかる化合物の大部分は、細胞内に作用部位を有する。搬送システムは、かかる物質の乏しい取り込みを克服するために使用され、しばしば、必要不可欠な前提条件である。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】図１は、完全なヒト血清における４時間のインキュベーション後の以下の表１のＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ処方からのカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）放出のグラフである。ＣＦ放出を、消光したＣＦシグナルの％として表す。Ｘ軸は、ＭｏＣｈｏｌとＣＨＥＭＳとの間の１：１の比で荷電した脂質の全量を示す。
【図２】図２は、完全なヒト血清における４時間のインキュベーション後の以下の表４のＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳｕｃｃ処方からのＣＦ放出のグラフである。ＣＦ放出を、消光したＣＦシグナルの％として表す。Ｘ軸は、ＭｏＣｈｏｌとＤＭＧＳｕｃｃとの間の１：１の比で荷電した脂質の全量を示す。
【図３】図３は、完全なヒト血清における３７℃でのインキュベーション後のＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳまたはＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳｕｃｃを含有するリポソームからのＣＦ放出のグラフである。ＣＦ放出を、消光したＣＦシグナルの％として表す。過度のカチオンは、血清の攻撃に対してリポソームを安定にする。ＤＭＧＳｕｃｃは、ＣＨＥＭＳ対等物よりかなり安定である。
【図４】図４は、完全なヒト血清における３７℃でのインキュベーション後の以下の表３および６のＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳおよびＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳｕｃｃ処方からのＣＦ放出のグラフである。処方は、２および４のＤＯＰＥ／ＰＯＰＣ比を有し、カチオン性対アニオン性脂質比は１未満である。放出を、消光したＣＦシグナルの％として表す。
【図５】図５は、低および高脂質用量でラット肝臓および脾臓に投与される場合、サイズ＞１５０ｎｍを有する処方ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ １５：４５：２０：２０の生体内分布を示す棒グラフである（以下の実施例７を参照のこと）。
【図６】図６は、低および高脂質用量でラット肝臓および脾臓に投与される場合、サイズ＜１５０ｎｍを有する処方ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ １５：４５：２０：２０の生体内分布を示す棒グラフである（以下の実施例７を参照のこと）。
【図７】図７は、ＮＩＲ画像化によって得られる屠殺されたコラーゲン誘導性関節炎マウスの肢の写真であり、Ｃｙ５．５標識ＣＤ４０アンチセンスをカプセル化する両性リポソームの生体内分布を示す（以下の実施例８を参照のこと）。
【図８】図８は、炎症マウスの足浮腫に対するＣＤ４０アンチセンスを含有する両性リポソームによる処置の効果を示すグラフである。
【図９】図９は、ＣＤ４０アンチセンスを含有する両性リポソームで処置したマウスの評価された臨床スコアのグラフである。
【図１０】図１０は、本発明に従って標的化するためのブタＣＤ４０ｃＤＮＡ配列（配列番号４）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性因子をカプセル化して、リポソームを形成することが可能な脂質の混合物であって、約０．５〜約８の範囲のホスファチジルエタノールアミン対ホスファチジルコリンの比でホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる、混合物。
【請求項２】
前記比が約０．７５〜約５の範囲にある、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
前記比が約１〜約４の範囲にある、請求項１に記載の混合物。
【請求項４】
前記ホスファチジルコリンが、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ、ダイズＰＣまたは卵ＰＣから選択される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項５】
前記ホスファチジルエタノールアミンは、ＤＯＰＥまたはＤＭＰＥまたはＤＰＰＥから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項６】
前記混合物が中性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の混合物を含んでなる中性リポソーム。
【請求項８】
１つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質をさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項９】
前記１つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質が両性であって、ｐＨ７．４では負に荷電するかまたは中性であり、そしてｐＨ４では正に荷電する、請求項８に記載の混合物。
【請求項１０】
前記混合物は、互いに組合わせることで両性の特徴を有する、複数の荷電した両親媒性物質を含んでなる、請求項９に記載の混合物。
【請求項１１】
前記１つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質が少なくとも１つのｐＨ感受性アニオン性脂質および少なくとも１つのｐＨ感受性カチオン性脂質を含んでなる、請求項１０に記載の混合物。
【請求項１２】
前記アニオン性脂質が、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＰＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＰＧＳｕｃｃおよびＣＨＥＭＳから選択される、請求項１１に記載の混合物。
【請求項１３】
前記カチオン性脂質が、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌおよびＣＨＩＭから選択される、請求項１１または１２に記載の混合物。
【請求項１４】
カチオン性およびアニオン性脂質の間の比（電荷比）が４：１〜１：４の範囲にある、請求項１１、１２または１３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１５】
カチオン性脂質対アニオン性脂質の比が３：１〜２：１の範囲にあり、そして前記混合物が、５〜９５ｍｏｌ％の荷電した脂質ならびに９５〜５ｍｏｌ％のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１６】
カチオン性脂質対アニオン性脂質の比が約１：１であり、そして前記混合物が、５〜７５ｍｏｌ％の荷電した脂質ならびに９５〜２５ｍｏｌ％のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１７】
カチオン性脂質対アニオン性脂質の比が１：３〜１：２の範囲にあり、そして前記混合物が、４０〜７５ｍｏｌ％の荷電した脂質ならびに６０〜２５ｍｏｌ％のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１８】
前記混合物が、
１：１〜１：４の範囲の比の７０〜２０ｍｏｌ％のＰＯＰＣおよびＤＯＰＥ；ならびに
３０および８０ｍｏｌ％の両性対の荷電した脂質（前記対は、ＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳ、ＭｏＣｈｏｌおよびＤＭＧＳｕｃｃ、ＭｏＣｈｏｌおよびＤＯＧＳｕｃｃ、ＣＨＩＭおよびＣＨＥＭＳまたはＣＨＩＭおよびＤＭＧＳｕｃｃから選択され、カチオン性対アニオン性脂質の比は３：１〜１：１の範囲にある）、
を含んでなる、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１９】
前記混合物が、
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 6:24:47:23 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 15:45:20:20 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 10:30:30:30 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 6:24:47:23 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 16:24:30:30 (mol.%)
から選択される処方よりなる、請求項１８に記載の混合物。
【請求項２０】
前記混合物が、
１：１〜１：４の範囲の比の７０〜２０ｍｏｌ％のＰＯＰＣおよびＤＯＰＥ；ならびに
３０および８０ｍｏｌ％のＭｏＣｈｏｌおよびＤＭＧＳｕｃｃまたはＤＯＧＳｕｃｃ（ここで、ＤＭＧＳｕｃｃまたはＤＯＧＳｕｃｃのモル量はＭｏＣｈｏｌのモル量を超える）、
を含んでなる、請求項１１〜１４または１７のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項２１】
カチオン性対アニオン性脂質の比が１：３〜１：２の範囲にあり、そして前記混合物が、３０〜５０ｍｏｌ％のＰＯＰＣおよびＤＯＰＥならびに７０〜５０ｍｏｌ％の荷電した脂質を含んでなる、請求項２０に記載の混合物。
【請求項２２】
前記混合物が、
ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳｕｃｃ ６：２４：２３：４７（ｍｏｌ％）
ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳｕｃｃ １０：３０：２０：４０（ｍｏｌ％）
から選択される処方よりなる、請求項２１に記載の混合物。
【請求項２３】
請求項９〜２２のいずれか一項に記載の脂質の混合物を含んでなる両性リポソーム。
【請求項２４】
前記リポソームが５０〜５００ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項２３に記載の両性リポソーム。
【請求項２５】
前記リポソームが少なくとも１つの活性因子をカプセル化する、請求項２３または２４に記載の両性リポソーム。
【請求項２６】
前記活性因子が、脊椎動物細胞において１つもしくはそれ以上のＲＮＡに転写されることが可能である核酸を含んでなり、前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムであり、前記ｍＲＮＡが１つもしくはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードする、請求項２５に記載の両性リポソーム。
【請求項２７】
前記核酸が環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ構築物またはｍＲＮＡである、請求項２６に記載の両性リポソーム。
【請求項２８】
前記活性因子がオリゴヌクレオチドである、請求項２５に記載の両性リポソーム。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが、デコイオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、転写に影響を及ぼす因子、スプライシングに影響を及ぼす因子、リボザイム、ＤＮＡザイムまたはアプタマーである、請求項２８に記載の両性リポソーム。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドが、それらのホスフェートまたはホスホチオエート型においてＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’Ｏ−メチルＲＮＡ（２’Ｏｍｅ）、２’Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（２’ＭＯＥ）などの修飾ヌクレオシドを含んでなる、請求項２８または２９に記載の両性リポソーム。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜３０塩基対長のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜３０塩基対長のｓｉＲＮＡである、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜３０塩基対長のデコイオリゴヌクレオチドである、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜３０塩基対長の転写に影響を及ぼす因子である、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドが２５〜５０塩基対長のＤＮＡザイムである、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドが２５〜５０塩基対長のリボザイムである、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜６０塩基対長のアプタマーである、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３８】
前記オリゴヌクレオチドが、ＣＤ４０遺伝子、そのセンスもしくはアンチセンス鎖、その任意のエキソンもしくはイントロンまたは非翻訳領域をコードする核酸を標的化するために適合され、それによって、哺乳動物細胞におけるＣＤ４０の発現を調節する、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドがＣＤ４０の任意のｍＲＮＡに対して指向され、かかるｍＲＮＡがプレｍＲＮＡおよびそれらのその後の成熟した形態を含む、請求項３８に記載の両性リポソーム。
【請求項４０】
前記脂質の混合物が、
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 6:24:47:23 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 15:45:20:20 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 10:30:30:30 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 6:24:47:23 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 16:24:30:30 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 6:24:23:47 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 10:30:20:40 (mol.%)
から選択される処方よりなる、請求項３８または３９に記載の両性リポソーム。
【請求項４１】
少なくとも８０ｗｔ％の前記オリゴヌクレオチドが前記リポソームの内部に配置される、請求項２８〜４０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項４２】
前記リポソームがカプセル化されていないオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項２８〜４１のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項４３】
請求項２５〜４２のいずれか一項に記載の活性因子充填両性リポソームおよびその薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなる薬学的組成物。
【請求項４４】
前記リポソームが約１５０ｎｍを超えるサイズを有する、請求項４３に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
前記リポソームが約１５０ｎｍ未満のサイズを有する、請求項４３に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
前記組成物が、前記活性因子充填両性リポソームに類似の組成およびサイズを有する空のリポソームをさらに含んでなる、請求項４３、４４または４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
ヒトまたは非ヒト動物の炎症性、免疫もしくは自己免疫障害の防止あるいは処置のための請求項３８、または請求項３８に従属する場合の請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の両性リポソームの使用。
【請求項４８】
移植片拒絶、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬もしくは甲状腺炎の防止または処置のための請求項３８、または請求項３８に従属する場合の請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の両性リポソームの使用であって、前記両性リポソームは全身投与のために処方される、使用。
【請求項４９】
移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、喘息、クローン病または大腸炎の防止または処置のための防止または処置のための請求項３８、または請求項３８に従属する場合の請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の両性リポソームの使用であって、前記両性リポソームは局所投与のために処方される、使用。
【請求項５０】
低脂質用量で請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれに全身投与することによってヒトまたは非ヒト動物を処置する方法であって、前記リポソームが１５０ｎｍを超えるサイズを有し、それによって、前記活性因子を肝臓に標的化する、方法。
【請求項５１】
高脂質用量で請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれに全身投与することによってヒトまたは非ヒト動物を処置する方法であって、前記リポソームが１５０ｎｍを超えるサイズを有し、それによって、前記活性因子を脾臓、感染および炎症の部位もしくは固形腫瘍に標的化する、方法。
【請求項５２】
低脂質用量で請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれに全身投与することによってヒトまたは非ヒト動物を処置する方法であって、前記リポソームが１５０ｎｍ未満のサイズを有し、それによって、活性因子を肝臓に標的化する、方法。
【請求項５３】
高脂質用量で請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれに全身投与することによってヒトまたは非ヒト動物を処置する方法であって、前記リポソームが１５０ｎｍ未満のサイズを有し、それによって、前記活性因子を脾臓を含まない感染および炎症の部位もしくは固形腫瘍に標的化する、方法。
【請求項５４】
薬物／脂質比を所望の脂質濃度に低下させることをさらに含んでなる、請求項５１または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物において、前記活性因子充填リポソームに類似のサイズおよび組成を有する空のリポソームを封入することをさらに含んでなる、請求項５１または５３に記載の方法。
【請求項１】
活性因子をカプセル化して、リポソームを形成することが可能な脂質の混合物であって、約０．５〜約８の範囲のホスファチジルエタノールアミン対ホスファチジルコリンの比でホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる、混合物。
【請求項２】
前記比が約０．７５〜約５の範囲にある、請求項１に記載の混合物。
【請求項３】
前記比が約１〜約４の範囲にある、請求項１に記載の混合物。
【請求項４】
前記ホスファチジルコリンが、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ、ダイズＰＣまたは卵ＰＣから選択される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項５】
前記ホスファチジルエタノールアミンは、ＤＯＰＥまたはＤＭＰＥまたはＤＰＰＥから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項６】
前記混合物が中性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の混合物を含んでなる中性リポソーム。
【請求項８】
１つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質をさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項９】
前記１つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質が両性であって、ｐＨ７．４では負に荷電するかまたは中性であり、そしてｐＨ４では正に荷電する、請求項８に記載の混合物。
【請求項１０】
前記混合物は、互いに組合わせることで両性の特徴を有する、複数の荷電した両親媒性物質を含んでなる、請求項９に記載の混合物。
【請求項１１】
前記１つもしくはそれ以上の荷電した両親媒性物質が少なくとも１つのｐＨ感受性アニオン性脂質および少なくとも１つのｐＨ感受性カチオン性脂質を含んでなる、請求項１０に記載の混合物。
【請求項１２】
前記アニオン性脂質が、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＰＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＰＧＳｕｃｃおよびＣＨＥＭＳから選択される、請求項１１に記載の混合物。
【請求項１３】
前記カチオン性脂質が、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌおよびＣＨＩＭから選択される、請求項１１または１２に記載の混合物。
【請求項１４】
カチオン性およびアニオン性脂質の間の比（電荷比）が４：１〜１：４の範囲にある、請求項１１、１２または１３のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１５】
カチオン性脂質対アニオン性脂質の比が３：１〜２：１の範囲にあり、そして前記混合物が、５〜９５ｍｏｌ％の荷電した脂質ならびに９５〜５ｍｏｌ％のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１６】
カチオン性脂質対アニオン性脂質の比が約１：１であり、そして前記混合物が、５〜７５ｍｏｌ％の荷電した脂質ならびに９５〜２５ｍｏｌ％のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１７】
カチオン性脂質対アニオン性脂質の比が１：３〜１：２の範囲にあり、そして前記混合物が、４０〜７５ｍｏｌ％の荷電した脂質ならびに６０〜２５ｍｏｌ％のホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含んでなる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１８】
前記混合物が、
１：１〜１：４の範囲の比の７０〜２０ｍｏｌ％のＰＯＰＣおよびＤＯＰＥ；ならびに
３０および８０ｍｏｌ％の両性対の荷電した脂質（前記対は、ＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳ、ＭｏＣｈｏｌおよびＤＭＧＳｕｃｃ、ＭｏＣｈｏｌおよびＤＯＧＳｕｃｃ、ＣＨＩＭおよびＣＨＥＭＳまたはＣＨＩＭおよびＤＭＧＳｕｃｃから選択され、カチオン性対アニオン性脂質の比は３：１〜１：１の範囲にある）、
を含んでなる、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項１９】
前記混合物が、
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 6:24:47:23 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 15:45:20:20 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 10:30:30:30 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 6:24:47:23 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 16:24:30:30 (mol.%)
から選択される処方よりなる、請求項１８に記載の混合物。
【請求項２０】
前記混合物が、
１：１〜１：４の範囲の比の７０〜２０ｍｏｌ％のＰＯＰＣおよびＤＯＰＥ；ならびに
３０および８０ｍｏｌ％のＭｏＣｈｏｌおよびＤＭＧＳｕｃｃまたはＤＯＧＳｕｃｃ（ここで、ＤＭＧＳｕｃｃまたはＤＯＧＳｕｃｃのモル量はＭｏＣｈｏｌのモル量を超える）、
を含んでなる、請求項１１〜１４または１７のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項２１】
カチオン性対アニオン性脂質の比が１：３〜１：２の範囲にあり、そして前記混合物が、３０〜５０ｍｏｌ％のＰＯＰＣおよびＤＯＰＥならびに７０〜５０ｍｏｌ％の荷電した脂質を含んでなる、請求項２０に記載の混合物。
【請求項２２】
前記混合物が、
ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳｕｃｃ ６：２４：２３：４７（ｍｏｌ％）
ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＭｏＣｈｏｌ／ＤＭＧＳｕｃｃ １０：３０：２０：４０（ｍｏｌ％）
から選択される処方よりなる、請求項２１に記載の混合物。
【請求項２３】
請求項９〜２２のいずれか一項に記載の脂質の混合物を含んでなる両性リポソーム。
【請求項２４】
前記リポソームが５０〜５００ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項２３に記載の両性リポソーム。
【請求項２５】
前記リポソームが少なくとも１つの活性因子をカプセル化する、請求項２３または２４に記載の両性リポソーム。
【請求項２６】
前記活性因子が、脊椎動物細胞において１つもしくはそれ以上のＲＮＡに転写されることが可能である核酸を含んでなり、前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムであり、前記ｍＲＮＡが１つもしくはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードする、請求項２５に記載の両性リポソーム。
【請求項２７】
前記核酸が環状ＤＮＡプラスミド、線状ＤＮＡ構築物またはｍＲＮＡである、請求項２６に記載の両性リポソーム。
【請求項２８】
前記活性因子がオリゴヌクレオチドである、請求項２５に記載の両性リポソーム。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが、デコイオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、転写に影響を及ぼす因子、スプライシングに影響を及ぼす因子、リボザイム、ＤＮＡザイムまたはアプタマーである、請求項２８に記載の両性リポソーム。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドが、それらのホスフェートまたはホスホチオエート型においてＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’Ｏ−メチルＲＮＡ（２’Ｏｍｅ）、２’Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（２’ＭＯＥ）などの修飾ヌクレオシドを含んでなる、請求項２８または２９に記載の両性リポソーム。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜３０塩基対長のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜３０塩基対長のｓｉＲＮＡである、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜３０塩基対長のデコイオリゴヌクレオチドである、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜３０塩基対長の転写に影響を及ぼす因子である、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドが２５〜５０塩基対長のＤＮＡザイムである、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドが２５〜５０塩基対長のリボザイムである、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜６０塩基対長のアプタマーである、請求項２８、２９または３０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３８】
前記オリゴヌクレオチドが、ＣＤ４０遺伝子、そのセンスもしくはアンチセンス鎖、その任意のエキソンもしくはイントロンまたは非翻訳領域をコードする核酸を標的化するために適合され、それによって、哺乳動物細胞におけるＣＤ４０の発現を調節する、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドがＣＤ４０の任意のｍＲＮＡに対して指向され、かかるｍＲＮＡがプレｍＲＮＡおよびそれらのその後の成熟した形態を含む、請求項３８に記載の両性リポソーム。
【請求項４０】
前記脂質の混合物が、
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 6:24:47:23 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 15:45:20:20 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/CHEMS 10:30:30:30 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 6:24:47:23 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 16:24:30:30 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 6:24:23:47 (mol.%)
POPC/DOPE/MoChol/DMGSucc 10:30:20:40 (mol.%)
から選択される処方よりなる、請求項３８または３９に記載の両性リポソーム。
【請求項４１】
少なくとも８０ｗｔ％の前記オリゴヌクレオチドが前記リポソームの内部に配置される、請求項２８〜４０のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項４２】
前記リポソームがカプセル化されていないオリゴヌクレオチドを含んでなる、請求項２８〜４１のいずれか一項に記載の両性リポソーム。
【請求項４３】
請求項２５〜４２のいずれか一項に記載の活性因子充填両性リポソームおよびその薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなる薬学的組成物。
【請求項４４】
前記リポソームが約１５０ｎｍを超えるサイズを有する、請求項４３に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
前記リポソームが約１５０ｎｍ未満のサイズを有する、請求項４３に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
前記組成物が、前記活性因子充填両性リポソームに類似の組成およびサイズを有する空のリポソームをさらに含んでなる、請求項４３、４４または４５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
ヒトまたは非ヒト動物の炎症性、免疫もしくは自己免疫障害の防止あるいは処置のための請求項３８、または請求項３８に従属する場合の請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の両性リポソームの使用。
【請求項４８】
移植片拒絶、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、乾癬もしくは甲状腺炎の防止または処置のための請求項３８、または請求項３８に従属する場合の請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の両性リポソームの使用であって、前記両性リポソームは全身投与のために処方される、使用。
【請求項４９】
移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、喘息、クローン病または大腸炎の防止または処置のための防止または処置のための請求項３８、または請求項３８に従属する場合の請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の両性リポソームの使用であって、前記両性リポソームは局所投与のために処方される、使用。
【請求項５０】
低脂質用量で請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれに全身投与することによってヒトまたは非ヒト動物を処置する方法であって、前記リポソームが１５０ｎｍを超えるサイズを有し、それによって、前記活性因子を肝臓に標的化する、方法。
【請求項５１】
高脂質用量で請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれに全身投与することによってヒトまたは非ヒト動物を処置する方法であって、前記リポソームが１５０ｎｍを超えるサイズを有し、それによって、前記活性因子を脾臓、感染および炎症の部位もしくは固形腫瘍に標的化する、方法。
【請求項５２】
低脂質用量で請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれに全身投与することによってヒトまたは非ヒト動物を処置する方法であって、前記リポソームが１５０ｎｍ未満のサイズを有し、それによって、活性因子を肝臓に標的化する、方法。
【請求項５３】
高脂質用量で請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれに全身投与することによってヒトまたは非ヒト動物を処置する方法であって、前記リポソームが１５０ｎｍ未満のサイズを有し、それによって、前記活性因子を脾臓を含まない感染および炎症の部位もしくは固形腫瘍に標的化する、方法。
【請求項５４】
薬物／脂質比を所望の脂質濃度に低下させることをさらに含んでなる、請求項５１または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物において、前記活性因子充填リポソームに類似のサイズおよび組成を有する空のリポソームを封入することをさらに含んでなる、請求項５１または５３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００９−５０７８７６（Ｐ２００９−５０７８７６Ａ）
【公表日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３０４２６（Ｐ２００８−５３０４２６）
【出願日】平成１８年９月１５日（２００６．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９０１３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３１３３３
【国際公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（５０３３００３０６）ノヴォソム アクチェンゲゼルシャフト (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１５日（２００６．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９０１３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３１３３３
【国際公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（５０３３００３０６）ノヴォソム アクチェンゲゼルシャフト (8)
【Ｆターム（参考）】
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