並列記録能力を有するマルチネットワーク神経細胞分析プラットフォーム
交互に並んでいる記録ウェルおよび増幅ウェルの列を有する、神経回路網解析プレート。各記録ウェルは、神経細胞回路網、およびニューロンからの活動電位信号を記録するための一連の電極を含む。各電極は、隣接する増幅ウェル内の増幅器に接続されている。これらの増幅器は近接していることが理想である。というのも、それにより、複数の異なる活動神経細胞回路網からの活動電位信号を並列に非多重化して記録することが可能になるからである。次いで、増幅ウェル内の各増幅器は、外部の増幅装置に接続することができる。神経回路網解析プレートは、市販されている単一の２４または９６ウェル・プレート内に収容してもよい。神経回路網解析プレートは、生体外で、１つまたは複数の作用物質に対する神経細胞の薬理反応および毒性反応を検出し定量化するのに使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年９月１８日出願の「Ｍｕｌｔｉｎｅｔｗｏｒｋ Ｎｅｒｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｗｉｔｈ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ Ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ」と題する、米国特許仮出願第６０／８４５，３９９号の優先権を主張し、その内容全体を参考として本明細書に援用する。
【０００２】
米国政府は、ＤＡＲＰＡからの認可番号Ｎ６６００１−００−Ｃ−８０２４（ＳＰＡＷＡＲ／ＯＮＲ）に基づいて、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、神経回路網に関し、詳細には、活動電位信号を完全に並列に非多重化して記録することができる、マルチネットワークのマルチ電極分析装置に関する。
【背景技術】
【０００４】
過去１０年間で、薬理学的研究プラットフォームとしての初代神経細胞培養（ｐｒｉｍａｒｙ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）の妥当性検証において、多くの重要な進展があった。培養下の回路網は自発的に活動し、それらの環境の物理的および化学的／薬理学的な変動に応答して、予測可能および再生可能な形で変化する活動電位（ＡＰ）のパターンを生成する。こうした回路網を、基板集積微小電極のアレイ上に成長させることにより（Ｇｒｏｓｓら１９７７年、Ｇｒｏｓｓ、１９９４年）、各電極との密接な接触を実現することができ、高い信号対雑音比、長期安定性、および数カ月の稼働寿命が可能になる。すべてのデータ分析は、単一のニューロンではなく神経細胞グループに基づくので、こうした回路網内の多くの神経細胞を監視することにより、豊富な時空的パターン（ｓｐａｔｉｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ ｐａｔｔｅｒｎｓ）、微妙な部分群集応答（ｓｕｐ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）、および全体的な障害許容性が得られる。毒物学、薬理学、および薬剤開発の分野への現実的な適用例が出現している（Ｇｒｏｓｓら１９９７年、Ｍｏｒｅｆｉｅｌｄら２０００年、Ｇｒａｍｏｗｓｋｉら２０００年、Ｋｅｅｆｅｒら２００１年ａ、ｂ、ＧｒｏｓｓおよびＧｏｐａｌ、２００６年）。
【０００５】
このような回路網は、神経システムの正常機能を改変することができるどんな化合物にも応答し、触れる作用物質（ａｇｅｎｔ）の演繹的知識（ａ−ｐｒｉｏｒｙ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ）（または「フィンガー・プリント」）［ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｉｎｔｓ］を必要としないので、バイオセンサとして働くことも示されている（Ｇｒｏｓｓら１９９７年、ＧｒｏｓｓおよびＰａｎｃｒａｚｉｏ、２００６年）。このような回路網は、軍隊および国家防衛にとって興味深い「広帯域」バイオセンサを意味する。独立型の自動化されたセンサ端末のプロトタイプが、海軍研究試験所（ＤＡＲＰＡ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍの下でのＮＲＬ／ＵＮＴの共同）にはすでに存在している。複雑で自発的に活動するシステムとして、回路網はまた、パターンの生成、処理、および記憶の謎を具体化し、それらにより情報処理の最初のステップおよび方策を実施する。
【０００６】
次に、２つの別々の回路網（それぞれ３２個の電極）から同時に記録するための２つの回路網アレイが、選ばれた施設で日常的に使用される。しかし、この手法は、回路網の変化のパターン（ｄｙｎａｍｉｃｓ）の効率的な探求および用途に必要となるものからは依然として遠い。培養間の再現性（ｉｎｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ）、多剤および順次濃縮用途の統計的な評価、ならびに毒性応答の時間的進展の統計的な評価は、現在の産業上の要求および研究上の要求に対してさえ、時間がかかり、はるかに遅い。
【発明の要約】
【０００７】
薬剤開発および毒性アセスメントに関連して、時間的および財務的に重荷となっている主要なものは、神経刺激性／神経毒性の応答についての迅速で定量的なデータを提供するための、生化学者と動物実験または人体実験との間に位置する生理分析プラットフォームの欠落である。当技術分野において欠けているものは、薬理反応および毒性反応を判定するための、（何百もの神経細胞からの活動電位を同時記録することによって提供される）複雑で感応性の高い神経生理学的な回路網の変化のパターンを使用するプラットフォームである。自動化されたロボット・システムにおいて多くの回路網を並列に使用することにより、これらの領域での研究を大幅に加速し、現在の試験手順および評価手順に必要な動物の数を劇的に低減させることになる、化合物を非常に効率的にスクリーニングする方法を開発することが、非常に望ましいはずである。１匹（通常は１０〜１２匹）の妊娠しているマウスの胚からの中枢神経系の組織により、１０００を超える回路網の接種を可能にする細胞プールを生成することができる。このことは、組織利用において非常に効率がよいことを意味する。
【０００８】
本発明は、一般に神経回路網の分野に関する。具体的には、本発明は、細胞培養および記録回路用の交互に並んでいるカラム（ｃｏｌｕｍｎ）を有する、マルチネットワークのマルチウェル分析プレート（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅｓ）に関する。これらの分析プレートにより、数多くの活動神経細胞回路網からの活動電位信号を同時に、並列に非多重化して記録することが可能になる。
【０００９】
一般に、本発明は、非常に感度の高い神経生理学的回路網の変化のパターンを利用して、生体外で様々な薬理反応および毒性反応を検出し定量化する装置を提供する。マルチウェル・マルチ電極の分析装置は、プレート毎に最低限少なくとも２つの別々の神経回路網を有し、これらの回路網にはそれぞれ、回路網の活動パターンにおける大きな変化を統計的に説明できるようにするのに十分な、いくつかの微小電極が設けられている。回路網のサイズに応じて、この数は、１０から数百の範囲にわたることがある。例として、直径３ｍｍの平面の回路網は、３２個の微小電極で効果的に監視することができる。２つ以上の複数のこうした回路網は、ロボットが扱えるように、所与のシステム内に縦列に、並列に、または直列に配置してもよい。１つまたは複数の記録端末は、好ましくは、数多くの回路網を薬剤にさらす前とさらしている間に、それら回路網から同時に記録することを可能にする、ロボット液体ハンドリング・システムの試料プラットフォーム内に含まれてもよい。
【００１０】
各微小電極で集められた信号はまず、「挿入」ＶＳＬＩまたは小型化された前置増幅器に送られる。前置増幅器または第１段の前置増幅回路は、電極に近いほどよい。これにより、雑音が低減し、マイクロボルトの記録に最適である。実施形態によっては、マルチネットワーク・プレートの片側または両側に前置増幅器を追加して、細胞外で各電極から記録された活動電位データを得ることができる。本発明では、ＶＬＳＩ演算増幅器に結合された、試験済みかつ証明済みの受動薄膜微小電極のリードを利用する。他のソリューションでは、動作することが証明されておらず、操作手順に固有のデータ喪失の原因となる、不連続なレーザ走査法を使用する。
【００１１】
本発明は、単一の分析プレート内で、細胞培養ならびに記録回路および増幅回路用の交互に並んでいるウェルのカラムを利用するので、特に有利である。培養された細胞を含むプレート内のウェルの各カラムは、それぞれの記録回路を含むウェルのカラムのすぐ近くに隣接している。したがって、前置増幅器回路は、各記録電極から１０〜２０ｍｍの範囲内にある。工業標準化された２４または９６ウェル・プレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）を使用することは、４８個までの活動神経細胞回路網から並列に非多重化して記録することを可能にするので、理想的である。このことはまた、これらのプレートを得ることが容易なので、好都合である。所望のどんな数の神経細胞回路網についても、標準化されたどんなウェル・プレートも使用することができる。ガラス・プレートおよび透明なインジウム・スズ酸化物（「ＩＴＯ」）導体を使用することにより、位相差顕微鏡法を用い、蛍光技術を使用して、回路網の健康状態を光学的に評価することも可能になる。受動導体を有するが、プレート上に集積増幅回路を有しないガラス・プレートを使用することにより、製造コストが劇的に低減し、高圧蒸気殺菌法による殺菌が可能になる。この方法は、本質的に、成熟神経細胞回路網（細胞を最初に接種した後３〜４週間で得られる）を必要とする。したがって、こうした多くのマルチアレイ・プレートは、日常的な分析および解析のための回路網を連続的に供給するために使用しなければならない。これらのプレートを、可能な限り簡略に、厳格に、また安価に作製することが不可欠である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】一実施形態である、市販の９６ウェル分析プレートを利用する４８回路網解析プレートの上面図である。
【図２Ａ】増幅ウェルに隣接する記録ウェルの一実施形態の上面図である。
【図２Ｂ】増幅ウェルに隣接し、２つのウェルの間を通る相互接続線を有する記録ウェルの一実施形態の上面図である。
【図２Ｃ】「挿入」ＶＬＳＩ前置増幅器を有する増幅ウェルの一実施形態の側面図である。
【図３Ａ】一実施形態である、市販の２４ウェル分析プレートを利用する例示的な寸法を示した１６回路網解析プレートの上面図である。
【図３Ｂ】例示的な寸法を示した回路網解析プレートの一実施形態の側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、生体外で薬理反応および毒性反応を検出し定量化するのに有用な神経回路網に関する。具体的には、本発明は、適合された市販の９６ウェル形式の増幅回路を有する４８回路網解析プレートに関する。
【００１４】
本発明の一態様は、市販の２４または９６ウェル分析プレートを利用する神経回路網解析プレートである。回路網解析プレートは、（ａ）細胞培養および記録、または（ｂ）接続および増幅のいずれかに専用の、交互に並んでいるウェルの列を備える。例示的な９６ウェル・プレートでは、細胞培養専用で各電極および記録装置を含む８個のウェルの各列は、それぞれ接続装置および増幅装置を含む８個のウェルの列のすぐ近くに隣接している。各増幅ウェル内に含まれる増幅装置は、２つのＶＬＳＩ増幅器を備えることが好ましい。したがって、第１段の信号増幅は、電極記録クレータ（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｃｒａｔｅｒ）の８〜１０ｍｍ内で行われる。８個のウェルの母線は、各増幅ウェルの上部に接触し、増幅された信号を第２段の増幅のためにコネクタまで運ぶ。
【００１５】
図１では、回路網解析プレート１０の一実施形態が示してある。回路網解析プレート１０は、標準の９６ウェル分析プレート１５を利用する。回路網解析プレート１０は、交互に並んでいる記録ウェル２０および増幅ウェル３０の列を含む。増幅ウェル３０は、増幅された信号をコネクタ４０に運ぶ母線３５に接触している。次いで、コネクタ４０は、増幅された信号を第２段の増幅装置に運ぶ。
【００１６】
記録ウェル２０は、生存可能な神経細胞回路網を含む。神経細胞回路網自体は、熟練した細胞培養研究室で準備して、実験で使用するために最終場所に運ぶことができる。最初に、回路網は、形態評価および電気生理学的評価を含む品質管理チェックを受けなければならない。後者の評価は、識別された活動ユニットの位置、それらの信号対雑音比、および回路網の発火パターンを含む設定ファイルを提供することになる。このファイルは、運んだ後に製品を直ちに評価するため、目的地で開くことができる。オープン・ウェル内の神経細胞回路網は、浸透圧モル濃度の維持、栄養補給、培養液交換、ならびに試験化合物の添加に関与するロボット・プラットフォームによって維持されることが好ましい。神経回路網の活動は、一連の電極によって監視される。記録ウェル２０内に含まれる神経細胞回路網では、３２個の電極が使用されることが好ましい。
【００１７】
図２Ａを参照すると、記録ウェル２０が、増幅ウェル３０に隣接している状態が示してある。記録ウェル２０内には神経細胞回路網２２があり、活動電位信号を記録するための電極とともに点在している。増幅ウェル３０内には、３２個の金パッド２７があり、接点の役割を果たしている。図２Ｂを参照すると、神経細胞回路網２２からの各電極を増幅ウェル３０内の金パッド２７のそれぞれに接続する、３２ラインの相互接続線２５が示してある。図２Ｃを参照すると、増幅ウェル３０が、２つのＶＬＳＩ増幅器３２を有している状態が示してある。増幅ウェル３０の底部にある金パッド２７は、ＶＬＳＩ増幅器３２と接触しており、次いで、ＶＬＳＩ増幅器３２は、上部接触パッド３４と接触している。次いで、上部接触パッド３４は、図１に示した母線３５と接触している。前述の通り、図１に示すように、母線３５は、増幅された信号をコネクタ４０に運び、次いで、コネクタ４０は、増幅された信号を任意の好ましい第２段の増幅装置に運ぶ。
【００１８】
図２に示したＶＬＳＩ増幅器３２は、１６チャネルのＶＬＳＩ増幅器であり、直径が６ｍｍで高さが１０ｍｍの円筒形のウェルにはめ込むことができることが好ましい。
【００１９】
図３Ａには、構成部品間の例示的な寸法とともに、回路網解析プレート１００の一代替実施形態が示してある。回路網解析プレート１００は、１６個の回路網プラットフォームを有する標準の２４ウェル分析プレート１０５を利用する。回路網解析プレート１００は、交互に並んでいる記録ウェル１２０および増幅ウェル１３０の列を含む。増幅ウェル１３０は、母線またはバス・ライン１３５に接触しており、これらのラインは、１２８チャネルであり、電力を有することが好ましい。バス・ライン１３５は、増幅された信号をコネクタ１４０に運ぶ。図３Ａに示す、バス・ライン１３５に重ね合わされた矢印は、各信号がコネクタ１４０に向けて通る方向を示す。記録ウェル１２０は、生存可能な神経細胞回路網を含む。回路網記録領域１２５は、記録ウェル１２０の中心にあることが好ましい。１組の３２枚の薄膜導体１５０は、回路網記録領域１２５内の各電極を増幅ウェル１３０に接続する。増幅ウェル１３０は、２つのアナログ前置増幅器１５５をそれぞれ含むように示してある。
【００２０】
図３Ａは、標準の２４ウェル分析プレート１０５を利用する、回路網解析プレートの一実施形態の側面図を示している。特に記録ウェル１２０に関して、例示的な寸法が示してある。
【００２１】
本発明の好ましい一実施形態は、複数の記録列で構成されている複数の記録ウェルを備える神経回路網解析プレートである。各記録ウェルは、神経細胞回路網、およびこの神経細胞回路網からの信号を記録するための複数の電極を含む。神経回路網解析プレートはまた、複数の増幅列で構成されている複数の増幅ウェルを備える。各増幅ウェルは、各記録ウェルからの記録信号を増幅するための、１つまたは複数の増幅器を含む。これら複数の記録列および複数の増幅列は、各記録ウェルが、対応する増幅ウェルに隣接するように交互に並んでいる。神経回路網解析プレートはまた、複数の相互接続線を備える。各相互接続線は、記録ウェルの各電極を対応する増幅ウェルの各増幅器と接続する。
【００２２】
さらなる好ましい実施形態では、神経回路網解析プレート内の複数の記録ウェルは、６つの記録列で構成される４８個の記録ウェルを備えることができ、複数の増幅ウェルは、６つの増幅列で構成される４８個の増幅ウェルを備えることができる。別法として、神経回路網解析プレートは、８個のウェルそれぞれが１２列を有する標準の９６ウェル・プレートの各ウェルを利用する。神経回路網解析プレートはまた、４つの記録列で構成されている１６個の記録ウェル、および２つの増幅列で構成されている８個の増幅ウェルを備えることができる。この神経回路網解析プレートは、４個のウェルそれぞれが６列を有する標準の２４ウェル・プレートの各ウェルを利用してもよい。さらなる好ましい実施形態では、神経回路網解析プレートは、増幅ウェル内の各増幅器と接触している複数の母線をさらに備える。母線はコネクタに接続することができ、コネクタは２次増幅装置に接続することができる。神経回路網解析プレートはまた、プレートと相互作用して、ウェル内の浸透圧モル濃度を維持し、神経細胞回路網を維持するために記録ウェル内の培養液に栄養を補給し、その培養液を交換し、任意の試験化合物を添加することができるロボット液体ハンドリング・システムをさらに備えることができる。
【００２３】
さらなる好ましい実施形態は、１つまたは複数の作用物質にさらされている活動神経細胞回路網からの活動電位信号を並列に非多重化して記録するための方法である。この方法は、まず神経回路網解析プレートの一実施形態を準備するステップ、次いでこの神経回路網解析プレートの記録ウェルを作用物質にさらすステップ、および最後に神経回路網解析プレートの増幅ウェルで増幅された信号を記録するステップを含む。別法として、２次増幅装置を使用する場合、最終ステップは、この２次増幅装置で増幅された信号を記録するステップを含むことができる。作用物質は、薬剤または任意の試験化合物とすることができる。
【００２４】
さらなる好ましい実施形態は、生体外で、１つまたは複数の作用物質に対する神経細胞の薬理反応および毒性反応を検出し定量化するための方法である。この方法は、まず神経回路網解析プレートの一実施形態を準備するステップ、次いでこの神経回路網解析プレートの記録ウェルを作用物質にさらすステップ、および最後に神経回路網解析プレートの増幅ウェルで増幅された信号を記録するステップを含む。別法として、２次増幅装置を使用する場合、最終ステップは、この２次増幅装置で増幅された信号を記録するステップを含むことができる。また、最終ステップは、記録された信号の解析を含むことができ、これによりユーザは、１つまたは複数の作用物質に対する神経細胞の薬理反応および毒性反応を定量化することができるようになる。様々な作用物質に対する神経細胞回路網の薬理反応および毒性反応をよりよく理解するために、記録された活動電位信号をどのように解析し比較すべきかが、当業者であれば理解されよう。作用物質は、薬剤または任意の試験化合物とすることができる。
引用文献
以下の米国特許文献および公報を参考として本明細書に援用する。
他の文献
Gramowski, Schiffmann and Gross,
"Quantification of acute neurotoxic effects of trimethyltin using neuronal
networks cultured on microelectrode arrays," NeuroToxicology, 21:331-42,
2000.
Gross and Gopal, Emerging histiotypic
properties of cultured neuronal networks. In: M. Taketani and M. Baudry
(eds) Advances in Network Electrophysiology using Multi-Electrode Arrays.
Springer, pp 193-214. 2006.
Gross and Pancrazio Neuronal Network
Biosensors. In: Smart Biosensor Technology (G. K. Knopf and A. S. Bassi,
eds), Taylor and Francis Publishers, CRC Press.pp 177-201, 2006.
Gross, Rieske, Kreutzberg and Meyer,
"A new fixed-array multimicroelectrode system designed for longterm
monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro,"
Neurosci. Lett., 6:101-05, 1977.
Gross, "Internal dynamics of
randomized mammalian neuronal networks in culture," In:Enabling
Technologies for Cultured Neural Networks, Stenger and McKenna (Eds.), Academic
Press, NY, pp. 277-317, 1994.
Gross, Harsch, Rhoades and Gopel,
"Odor, drug, and toxin analysis with neuronal networks in vitro:
extracellular array recording of network responses," Biosensors and
Bioelectronics, 12:373-93, 1997.
Keefer, Gramowski and Gross, "NMDA
receptor dependent periodic oscillations in cultured spinal cord
networks," J. Neurophysiol, 86:3030-3042, 2001a.
Keefer, Gramowski, Stenger, Pancrazio and
Gross, "Characterization of acute neurotoxic effects of trimethylolpropane
phosphate via neuronal network biosensors," Biosensors and Bioelectronics
16: 513-52, 2001b.
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年９月１８日出願の「Ｍｕｌｔｉｎｅｔｗｏｒｋ Ｎｅｒｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｓｓａｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｗｉｔｈ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ Ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ」と題する、米国特許仮出願第６０／８４５，３９９号の優先権を主張し、その内容全体を参考として本明細書に援用する。
【０００２】
米国政府は、ＤＡＲＰＡからの認可番号Ｎ６６００１−００−Ｃ−８０２４（ＳＰＡＷＡＲ／ＯＮＲ）に基づいて、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、神経回路網に関し、詳細には、活動電位信号を完全に並列に非多重化して記録することができる、マルチネットワークのマルチ電極分析装置に関する。
【背景技術】
【０００４】
過去１０年間で、薬理学的研究プラットフォームとしての初代神経細胞培養（ｐｒｉｍａｒｙ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）の妥当性検証において、多くの重要な進展があった。培養下の回路網は自発的に活動し、それらの環境の物理的および化学的／薬理学的な変動に応答して、予測可能および再生可能な形で変化する活動電位（ＡＰ）のパターンを生成する。こうした回路網を、基板集積微小電極のアレイ上に成長させることにより（Ｇｒｏｓｓら１９７７年、Ｇｒｏｓｓ、１９９４年）、各電極との密接な接触を実現することができ、高い信号対雑音比、長期安定性、および数カ月の稼働寿命が可能になる。すべてのデータ分析は、単一のニューロンではなく神経細胞グループに基づくので、こうした回路網内の多くの神経細胞を監視することにより、豊富な時空的パターン（ｓｐａｔｉｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ ｐａｔｔｅｒｎｓ）、微妙な部分群集応答（ｓｕｐ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）、および全体的な障害許容性が得られる。毒物学、薬理学、および薬剤開発の分野への現実的な適用例が出現している（Ｇｒｏｓｓら１９９７年、Ｍｏｒｅｆｉｅｌｄら２０００年、Ｇｒａｍｏｗｓｋｉら２０００年、Ｋｅｅｆｅｒら２００１年ａ、ｂ、ＧｒｏｓｓおよびＧｏｐａｌ、２００６年）。
【０００５】
このような回路網は、神経システムの正常機能を改変することができるどんな化合物にも応答し、触れる作用物質（ａｇｅｎｔ）の演繹的知識（ａ−ｐｒｉｏｒｙ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ）（または「フィンガー・プリント」）［ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｉｎｔｓ］を必要としないので、バイオセンサとして働くことも示されている（Ｇｒｏｓｓら１９９７年、ＧｒｏｓｓおよびＰａｎｃｒａｚｉｏ、２００６年）。このような回路網は、軍隊および国家防衛にとって興味深い「広帯域」バイオセンサを意味する。独立型の自動化されたセンサ端末のプロトタイプが、海軍研究試験所（ＤＡＲＰＡ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍの下でのＮＲＬ／ＵＮＴの共同）にはすでに存在している。複雑で自発的に活動するシステムとして、回路網はまた、パターンの生成、処理、および記憶の謎を具体化し、それらにより情報処理の最初のステップおよび方策を実施する。
【０００６】
次に、２つの別々の回路網（それぞれ３２個の電極）から同時に記録するための２つの回路網アレイが、選ばれた施設で日常的に使用される。しかし、この手法は、回路網の変化のパターン（ｄｙｎａｍｉｃｓ）の効率的な探求および用途に必要となるものからは依然として遠い。培養間の再現性（ｉｎｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ）、多剤および順次濃縮用途の統計的な評価、ならびに毒性応答の時間的進展の統計的な評価は、現在の産業上の要求および研究上の要求に対してさえ、時間がかかり、はるかに遅い。
【発明の要約】
【０００７】
薬剤開発および毒性アセスメントに関連して、時間的および財務的に重荷となっている主要なものは、神経刺激性／神経毒性の応答についての迅速で定量的なデータを提供するための、生化学者と動物実験または人体実験との間に位置する生理分析プラットフォームの欠落である。当技術分野において欠けているものは、薬理反応および毒性反応を判定するための、（何百もの神経細胞からの活動電位を同時記録することによって提供される）複雑で感応性の高い神経生理学的な回路網の変化のパターンを使用するプラットフォームである。自動化されたロボット・システムにおいて多くの回路網を並列に使用することにより、これらの領域での研究を大幅に加速し、現在の試験手順および評価手順に必要な動物の数を劇的に低減させることになる、化合物を非常に効率的にスクリーニングする方法を開発することが、非常に望ましいはずである。１匹（通常は１０〜１２匹）の妊娠しているマウスの胚からの中枢神経系の組織により、１０００を超える回路網の接種を可能にする細胞プールを生成することができる。このことは、組織利用において非常に効率がよいことを意味する。
【０００８】
本発明は、一般に神経回路網の分野に関する。具体的には、本発明は、細胞培養および記録回路用の交互に並んでいるカラム（ｃｏｌｕｍｎ）を有する、マルチネットワークのマルチウェル分析プレート（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅｓ）に関する。これらの分析プレートにより、数多くの活動神経細胞回路網からの活動電位信号を同時に、並列に非多重化して記録することが可能になる。
【０００９】
一般に、本発明は、非常に感度の高い神経生理学的回路網の変化のパターンを利用して、生体外で様々な薬理反応および毒性反応を検出し定量化する装置を提供する。マルチウェル・マルチ電極の分析装置は、プレート毎に最低限少なくとも２つの別々の神経回路網を有し、これらの回路網にはそれぞれ、回路網の活動パターンにおける大きな変化を統計的に説明できるようにするのに十分な、いくつかの微小電極が設けられている。回路網のサイズに応じて、この数は、１０から数百の範囲にわたることがある。例として、直径３ｍｍの平面の回路網は、３２個の微小電極で効果的に監視することができる。２つ以上の複数のこうした回路網は、ロボットが扱えるように、所与のシステム内に縦列に、並列に、または直列に配置してもよい。１つまたは複数の記録端末は、好ましくは、数多くの回路網を薬剤にさらす前とさらしている間に、それら回路網から同時に記録することを可能にする、ロボット液体ハンドリング・システムの試料プラットフォーム内に含まれてもよい。
【００１０】
各微小電極で集められた信号はまず、「挿入」ＶＳＬＩまたは小型化された前置増幅器に送られる。前置増幅器または第１段の前置増幅回路は、電極に近いほどよい。これにより、雑音が低減し、マイクロボルトの記録に最適である。実施形態によっては、マルチネットワーク・プレートの片側または両側に前置増幅器を追加して、細胞外で各電極から記録された活動電位データを得ることができる。本発明では、ＶＬＳＩ演算増幅器に結合された、試験済みかつ証明済みの受動薄膜微小電極のリードを利用する。他のソリューションでは、動作することが証明されておらず、操作手順に固有のデータ喪失の原因となる、不連続なレーザ走査法を使用する。
【００１１】
本発明は、単一の分析プレート内で、細胞培養ならびに記録回路および増幅回路用の交互に並んでいるウェルのカラムを利用するので、特に有利である。培養された細胞を含むプレート内のウェルの各カラムは、それぞれの記録回路を含むウェルのカラムのすぐ近くに隣接している。したがって、前置増幅器回路は、各記録電極から１０〜２０ｍｍの範囲内にある。工業標準化された２４または９６ウェル・プレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）を使用することは、４８個までの活動神経細胞回路網から並列に非多重化して記録することを可能にするので、理想的である。このことはまた、これらのプレートを得ることが容易なので、好都合である。所望のどんな数の神経細胞回路網についても、標準化されたどんなウェル・プレートも使用することができる。ガラス・プレートおよび透明なインジウム・スズ酸化物（「ＩＴＯ」）導体を使用することにより、位相差顕微鏡法を用い、蛍光技術を使用して、回路網の健康状態を光学的に評価することも可能になる。受動導体を有するが、プレート上に集積増幅回路を有しないガラス・プレートを使用することにより、製造コストが劇的に低減し、高圧蒸気殺菌法による殺菌が可能になる。この方法は、本質的に、成熟神経細胞回路網（細胞を最初に接種した後３〜４週間で得られる）を必要とする。したがって、こうした多くのマルチアレイ・プレートは、日常的な分析および解析のための回路網を連続的に供給するために使用しなければならない。これらのプレートを、可能な限り簡略に、厳格に、また安価に作製することが不可欠である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】一実施形態である、市販の９６ウェル分析プレートを利用する４８回路網解析プレートの上面図である。
【図２Ａ】増幅ウェルに隣接する記録ウェルの一実施形態の上面図である。
【図２Ｂ】増幅ウェルに隣接し、２つのウェルの間を通る相互接続線を有する記録ウェルの一実施形態の上面図である。
【図２Ｃ】「挿入」ＶＬＳＩ前置増幅器を有する増幅ウェルの一実施形態の側面図である。
【図３Ａ】一実施形態である、市販の２４ウェル分析プレートを利用する例示的な寸法を示した１６回路網解析プレートの上面図である。
【図３Ｂ】例示的な寸法を示した回路網解析プレートの一実施形態の側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、生体外で薬理反応および毒性反応を検出し定量化するのに有用な神経回路網に関する。具体的には、本発明は、適合された市販の９６ウェル形式の増幅回路を有する４８回路網解析プレートに関する。
【００１４】
本発明の一態様は、市販の２４または９６ウェル分析プレートを利用する神経回路網解析プレートである。回路網解析プレートは、（ａ）細胞培養および記録、または（ｂ）接続および増幅のいずれかに専用の、交互に並んでいるウェルの列を備える。例示的な９６ウェル・プレートでは、細胞培養専用で各電極および記録装置を含む８個のウェルの各列は、それぞれ接続装置および増幅装置を含む８個のウェルの列のすぐ近くに隣接している。各増幅ウェル内に含まれる増幅装置は、２つのＶＬＳＩ増幅器を備えることが好ましい。したがって、第１段の信号増幅は、電極記録クレータ（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｃｒａｔｅｒ）の８〜１０ｍｍ内で行われる。８個のウェルの母線は、各増幅ウェルの上部に接触し、増幅された信号を第２段の増幅のためにコネクタまで運ぶ。
【００１５】
図１では、回路網解析プレート１０の一実施形態が示してある。回路網解析プレート１０は、標準の９６ウェル分析プレート１５を利用する。回路網解析プレート１０は、交互に並んでいる記録ウェル２０および増幅ウェル３０の列を含む。増幅ウェル３０は、増幅された信号をコネクタ４０に運ぶ母線３５に接触している。次いで、コネクタ４０は、増幅された信号を第２段の増幅装置に運ぶ。
【００１６】
記録ウェル２０は、生存可能な神経細胞回路網を含む。神経細胞回路網自体は、熟練した細胞培養研究室で準備して、実験で使用するために最終場所に運ぶことができる。最初に、回路網は、形態評価および電気生理学的評価を含む品質管理チェックを受けなければならない。後者の評価は、識別された活動ユニットの位置、それらの信号対雑音比、および回路網の発火パターンを含む設定ファイルを提供することになる。このファイルは、運んだ後に製品を直ちに評価するため、目的地で開くことができる。オープン・ウェル内の神経細胞回路網は、浸透圧モル濃度の維持、栄養補給、培養液交換、ならびに試験化合物の添加に関与するロボット・プラットフォームによって維持されることが好ましい。神経回路網の活動は、一連の電極によって監視される。記録ウェル２０内に含まれる神経細胞回路網では、３２個の電極が使用されることが好ましい。
【００１７】
図２Ａを参照すると、記録ウェル２０が、増幅ウェル３０に隣接している状態が示してある。記録ウェル２０内には神経細胞回路網２２があり、活動電位信号を記録するための電極とともに点在している。増幅ウェル３０内には、３２個の金パッド２７があり、接点の役割を果たしている。図２Ｂを参照すると、神経細胞回路網２２からの各電極を増幅ウェル３０内の金パッド２７のそれぞれに接続する、３２ラインの相互接続線２５が示してある。図２Ｃを参照すると、増幅ウェル３０が、２つのＶＬＳＩ増幅器３２を有している状態が示してある。増幅ウェル３０の底部にある金パッド２７は、ＶＬＳＩ増幅器３２と接触しており、次いで、ＶＬＳＩ増幅器３２は、上部接触パッド３４と接触している。次いで、上部接触パッド３４は、図１に示した母線３５と接触している。前述の通り、図１に示すように、母線３５は、増幅された信号をコネクタ４０に運び、次いで、コネクタ４０は、増幅された信号を任意の好ましい第２段の増幅装置に運ぶ。
【００１８】
図２に示したＶＬＳＩ増幅器３２は、１６チャネルのＶＬＳＩ増幅器であり、直径が６ｍｍで高さが１０ｍｍの円筒形のウェルにはめ込むことができることが好ましい。
【００１９】
図３Ａには、構成部品間の例示的な寸法とともに、回路網解析プレート１００の一代替実施形態が示してある。回路網解析プレート１００は、１６個の回路網プラットフォームを有する標準の２４ウェル分析プレート１０５を利用する。回路網解析プレート１００は、交互に並んでいる記録ウェル１２０および増幅ウェル１３０の列を含む。増幅ウェル１３０は、母線またはバス・ライン１３５に接触しており、これらのラインは、１２８チャネルであり、電力を有することが好ましい。バス・ライン１３５は、増幅された信号をコネクタ１４０に運ぶ。図３Ａに示す、バス・ライン１３５に重ね合わされた矢印は、各信号がコネクタ１４０に向けて通る方向を示す。記録ウェル１２０は、生存可能な神経細胞回路網を含む。回路網記録領域１２５は、記録ウェル１２０の中心にあることが好ましい。１組の３２枚の薄膜導体１５０は、回路網記録領域１２５内の各電極を増幅ウェル１３０に接続する。増幅ウェル１３０は、２つのアナログ前置増幅器１５５をそれぞれ含むように示してある。
【００２０】
図３Ａは、標準の２４ウェル分析プレート１０５を利用する、回路網解析プレートの一実施形態の側面図を示している。特に記録ウェル１２０に関して、例示的な寸法が示してある。
【００２１】
本発明の好ましい一実施形態は、複数の記録列で構成されている複数の記録ウェルを備える神経回路網解析プレートである。各記録ウェルは、神経細胞回路網、およびこの神経細胞回路網からの信号を記録するための複数の電極を含む。神経回路網解析プレートはまた、複数の増幅列で構成されている複数の増幅ウェルを備える。各増幅ウェルは、各記録ウェルからの記録信号を増幅するための、１つまたは複数の増幅器を含む。これら複数の記録列および複数の増幅列は、各記録ウェルが、対応する増幅ウェルに隣接するように交互に並んでいる。神経回路網解析プレートはまた、複数の相互接続線を備える。各相互接続線は、記録ウェルの各電極を対応する増幅ウェルの各増幅器と接続する。
【００２２】
さらなる好ましい実施形態では、神経回路網解析プレート内の複数の記録ウェルは、６つの記録列で構成される４８個の記録ウェルを備えることができ、複数の増幅ウェルは、６つの増幅列で構成される４８個の増幅ウェルを備えることができる。別法として、神経回路網解析プレートは、８個のウェルそれぞれが１２列を有する標準の９６ウェル・プレートの各ウェルを利用する。神経回路網解析プレートはまた、４つの記録列で構成されている１６個の記録ウェル、および２つの増幅列で構成されている８個の増幅ウェルを備えることができる。この神経回路網解析プレートは、４個のウェルそれぞれが６列を有する標準の２４ウェル・プレートの各ウェルを利用してもよい。さらなる好ましい実施形態では、神経回路網解析プレートは、増幅ウェル内の各増幅器と接触している複数の母線をさらに備える。母線はコネクタに接続することができ、コネクタは２次増幅装置に接続することができる。神経回路網解析プレートはまた、プレートと相互作用して、ウェル内の浸透圧モル濃度を維持し、神経細胞回路網を維持するために記録ウェル内の培養液に栄養を補給し、その培養液を交換し、任意の試験化合物を添加することができるロボット液体ハンドリング・システムをさらに備えることができる。
【００２３】
さらなる好ましい実施形態は、１つまたは複数の作用物質にさらされている活動神経細胞回路網からの活動電位信号を並列に非多重化して記録するための方法である。この方法は、まず神経回路網解析プレートの一実施形態を準備するステップ、次いでこの神経回路網解析プレートの記録ウェルを作用物質にさらすステップ、および最後に神経回路網解析プレートの増幅ウェルで増幅された信号を記録するステップを含む。別法として、２次増幅装置を使用する場合、最終ステップは、この２次増幅装置で増幅された信号を記録するステップを含むことができる。作用物質は、薬剤または任意の試験化合物とすることができる。
【００２４】
さらなる好ましい実施形態は、生体外で、１つまたは複数の作用物質に対する神経細胞の薬理反応および毒性反応を検出し定量化するための方法である。この方法は、まず神経回路網解析プレートの一実施形態を準備するステップ、次いでこの神経回路網解析プレートの記録ウェルを作用物質にさらすステップ、および最後に神経回路網解析プレートの増幅ウェルで増幅された信号を記録するステップを含む。別法として、２次増幅装置を使用する場合、最終ステップは、この２次増幅装置で増幅された信号を記録するステップを含むことができる。また、最終ステップは、記録された信号の解析を含むことができ、これによりユーザは、１つまたは複数の作用物質に対する神経細胞の薬理反応および毒性反応を定量化することができるようになる。様々な作用物質に対する神経細胞回路網の薬理反応および毒性反応をよりよく理解するために、記録された活動電位信号をどのように解析し比較すべきかが、当業者であれば理解されよう。作用物質は、薬剤または任意の試験化合物とすることができる。
引用文献
以下の米国特許文献および公報を参考として本明細書に援用する。
他の文献
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phosphate via neuronal network biosensors," Biosensors and Bioelectronics
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の記録列で構成される複数の記録ウェルであって、各記録ウェルは、神経細胞回路網、および前記神経細胞回路網からの信号を記録するための複数の電極を含む、複数の記録ウェルと、
複数の増幅列で構成される複数の増幅ウェルであって、各増幅ウェルは、前記記録ウェルからの記録信号を増幅するための１つまたは複数の増幅器を含み、前記複数の記録列および前記複数の増幅列は、各記録ウェルが対応する増幅ウェルに隣接するように交互に並んでいる、複数の増幅ウェルと、
各相互接続線が、記録ウェルの前記電極を対応する増幅ウェルの前記増幅器と接続する、複数の相互接続線とを備える神経回路網解析プレート。
【請求項２】
前記複数の記録ウェルは、６つの記録列で構成される４８個の記録ウェルを備え、前記複数の増幅ウェルは、６つの増幅列で構成される４８個の増幅ウェルを備える、請求項１に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項３】
前記神経回路網解析プレートは、８個のウェルそれぞれが１２列を有する標準の９６ウェル・プレートの各ウェルを利用する、請求項２に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項４】
前記複数の記録ウェルは、４つの記録列で構成される１６個の記録ウェルを備え、前記複数の増幅ウェルは、２つの増幅列で構成される８個の増幅ウェルを備える、請求項１に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項５】
前記神経回路網解析プレートは、４個のウェルそれぞれが６つの列を有する標準の２４ウェル・プレートの各ウェルを利用する、請求項４に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項６】
前記増幅ウェル内の前記増幅器と接触している複数の母線をさらに備える、請求項１に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項７】
前記母線はコネクタに接続され、前記コネクタは２次増幅装置に接続される、請求項６に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項８】
ロボット液体ハンドリング・システムをさらに備える、請求項１に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項９】
１つまたは複数の作用物質にさらされている活動神経細胞回路網からの活動電位信号を、並列に非多重化して記録するための方法であって、
請求項１の神経回路網解析プレートを準備するステップと、
前記神経回路網解析プレートの記録ウェルを、前記１つまたは複数の作用物質にさらすステップと、
前記神経回路網解析プレートの増幅ウェルによって増幅された信号を記録するステップとを含む方法。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の作用物質は、１つまたは複数の薬剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
１つまたは複数の作用物質にさらされている活動神経細胞回路網からの活動電位信号を、並列に非多重化して記録するための方法であって、
請求項７の神経回路網解析プレートを準備するステップと、
前記神経回路網解析プレートの記録ウェルを、前記１つまたは複数の作用物質にさらすステップと、
２次増幅装置によって増幅された信号を記録するステップとを含む方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の作用物質は、１つまたは複数の薬剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生体外で、１つまたは複数の作用物質に対する神経細胞の薬理反応および毒性反応を検出し定量化するための方法であって、
請求項１の神経回路網解析プレートを準備するステップと、
前記神経回路網解析プレートの記録ウェルを、前記１つまたは複数の作用物質にさらすステップと、
前記神経回路網解析プレートの増幅ウェルによって増幅された信号を記録するステップとを含む方法。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の作用物質は、１つまたは複数の薬剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記記録された信号を解析して、前記１つまたは複数の作用物質に対する前記神経細胞の前記薬理反応および毒性反応を定量化するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
生体外で、１つまたは複数の作用物質に対する神経細胞の薬理反応および毒性反応を検出し定量化するための方法であって、
請求項５の神経回路網解析プレートを準備するステップと、
前記神経回路網解析プレートの記録ウェルを、前記１つまたは複数の作用物質にさらすステップと、
２次増幅装置によって増幅された信号を記録するステップとを含む方法。
【請求項１７】
前記１つまたは複数の作用物質は、１つまたは複数の薬剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記記録された信号を解析して、前記１つまたは複数の作用物質に対する前記神経細胞の前記薬理反応および毒性反応を定量化するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
複数の記録列で構成される複数の記録ウェルであって、各記録ウェルは、神経細胞回路網、および前記神経細胞回路網からの信号を記録するための複数の電極を含む、複数の記録ウェルと、
複数の増幅列で構成される複数の増幅ウェルであって、各増幅ウェルは、前記記録ウェルからの記録信号を増幅するための１つまたは複数の増幅器を含み、前記複数の記録列および前記複数の増幅列は、各記録ウェルが対応する増幅ウェルに隣接するように交互に並んでいる、複数の増幅ウェルと、
各相互接続線が、記録ウェルの前記電極を対応する増幅ウェルの前記増幅器と接続する、複数の相互接続線とを備える神経回路網解析プレート。
【請求項２】
前記複数の記録ウェルは、６つの記録列で構成される４８個の記録ウェルを備え、前記複数の増幅ウェルは、６つの増幅列で構成される４８個の増幅ウェルを備える、請求項１に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項３】
前記神経回路網解析プレートは、８個のウェルそれぞれが１２列を有する標準の９６ウェル・プレートの各ウェルを利用する、請求項２に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項４】
前記複数の記録ウェルは、４つの記録列で構成される１６個の記録ウェルを備え、前記複数の増幅ウェルは、２つの増幅列で構成される８個の増幅ウェルを備える、請求項１に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項５】
前記神経回路網解析プレートは、４個のウェルそれぞれが６つの列を有する標準の２４ウェル・プレートの各ウェルを利用する、請求項４に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項６】
前記増幅ウェル内の前記増幅器と接触している複数の母線をさらに備える、請求項１に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項７】
前記母線はコネクタに接続され、前記コネクタは２次増幅装置に接続される、請求項６に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項８】
ロボット液体ハンドリング・システムをさらに備える、請求項１に記載の神経回路網解析プレート。
【請求項９】
１つまたは複数の作用物質にさらされている活動神経細胞回路網からの活動電位信号を、並列に非多重化して記録するための方法であって、
請求項１の神経回路網解析プレートを準備するステップと、
前記神経回路網解析プレートの記録ウェルを、前記１つまたは複数の作用物質にさらすステップと、
前記神経回路網解析プレートの増幅ウェルによって増幅された信号を記録するステップとを含む方法。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の作用物質は、１つまたは複数の薬剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
１つまたは複数の作用物質にさらされている活動神経細胞回路網からの活動電位信号を、並列に非多重化して記録するための方法であって、
請求項７の神経回路網解析プレートを準備するステップと、
前記神経回路網解析プレートの記録ウェルを、前記１つまたは複数の作用物質にさらすステップと、
２次増幅装置によって増幅された信号を記録するステップとを含む方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の作用物質は、１つまたは複数の薬剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生体外で、１つまたは複数の作用物質に対する神経細胞の薬理反応および毒性反応を検出し定量化するための方法であって、
請求項１の神経回路網解析プレートを準備するステップと、
前記神経回路網解析プレートの記録ウェルを、前記１つまたは複数の作用物質にさらすステップと、
前記神経回路網解析プレートの増幅ウェルによって増幅された信号を記録するステップとを含む方法。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の作用物質は、１つまたは複数の薬剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記記録された信号を解析して、前記１つまたは複数の作用物質に対する前記神経細胞の前記薬理反応および毒性反応を定量化するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
生体外で、１つまたは複数の作用物質に対する神経細胞の薬理反応および毒性反応を検出し定量化するための方法であって、
請求項５の神経回路網解析プレートを準備するステップと、
前記神経回路網解析プレートの記録ウェルを、前記１つまたは複数の作用物質にさらすステップと、
２次増幅装置によって増幅された信号を記録するステップとを含む方法。
【請求項１７】
前記１つまたは複数の作用物質は、１つまたは複数の薬剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記記録された信号を解析して、前記１つまたは複数の作用物質に対する前記神経細胞の前記薬理反応および毒性反応を定量化するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５１８８８５（Ｐ２０１０−５１８８８５Ａ）
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２８２６５（Ｐ２００９−５２８２６５）
【出願日】平成１９年９月１２日（２００７．９．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１９７８０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１００２８７
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（３１００１０５０８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１２日（２００７．９．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１９７８０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１００２８７
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（３１００１０５０８）
【Ｆターム（参考）】
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