乳児向けシンバイオティック組成物
人工栄養保育され又は一部母乳で保育される乳児用の、ビフィドバクテリウムブレーベと難消化性炭水化物の混合物とを含む製剤、並びに人工栄養保育され又は一部母乳で保育される乳児の免疫障害を治療し又は予防するための、その使用が提供される。また本明細書では、ビフィドバクテリウム種を検出するための配列プライマー及びプローブ、並びにその診断キットも提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳児向けの、特に人工栄養保育される乳児向けの、プロバイオティック及びプレバイオティックを含む製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳児は、生まれたときには腸内細菌叢を持っていない。分娩中及びその後の授乳時に母親と接触する結果、腸内細菌叢が急速に発生し、増大する。腸内細菌叢は、その発生中は未成熟なままであり、その平衡状態は脆弱で、直ぐに変化し易く、したがって病原体の存在下、疾患及び障害を引き起こし易い。母乳で保育された乳児は、人工栄養保育された乳児よりも、感染症又は疾患に罹りにくいことがわかっている。そのため、母乳で保育された赤ちゃんは、人工栄養保育された乳児よりも、罹患率と持続期間との両方の観点から胃腸感染症に罹りにくく、アレルギーや湿疹、アレルギー誘発性喘息などのアトピー性疾患に罹りにくく、便秘にもなりにくい。
【０００３】
一般に、母乳で保育された乳児の腸内細菌叢は、主にビフィズス菌（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）と乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）とからなる。母乳には、乳児の腸内ビフィズス菌の成長因子である、人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）が含まれている。調合乳で保育された乳児の腸内細菌叢は、より多様であり、一般に、より多くのバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、及び腸内細菌種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐｅｃｉｅｓ）が含まれる。調合乳で保育された乳児は、母乳で保育された乳児のビフィズス菌の数の、約１０分の１からおおよそ３分の２を有する。ビフィズス菌は、十分バランスのとれた腸内微生物叢を維持するのに重要と考えられ、このビフィズス菌には、下痢及び腸内感染の予防及び／又は治療も含めたいくつかの健康増進効果があると見なされてきた。さらにビフィズス菌は、宿主の免疫系において、ある役割を演ずることが示されている。
【０００４】
乳児の腸内細菌叢は、プロバイオティックス又はプレバイオティックスの消費のように、食物の栄養の変化によって変わる可能性がある。プロバイオティックスによる手法の例として、ＥＰ−Ａ−０，９０４，７８４は、ビフィズス菌株（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ）も含めた微生物株の混合物を投与することについて記述している。しかしこれに関連する問題とは、微生物の混合物が、何らかの健康上の利点をもたらしはするが、その活動が広範にわたるので、人工栄養保育された乳児の依然として未成熟な腸内細菌叢に、悪影響を及ぼす可能性もあることである。さらに、多くのプロバイオティックサプリメントは、その保存期間が短く、そこに含有される生きている微生物の数が少なすぎて、期待されるプロバイオティック効果が得られない。
【０００５】
プレバイオティックスは、結腸内の１種又は複数の細菌の成長及び／又は活動を選択的に刺激し、それによって宿主に良い影響を及ぼす難消化性食品成分と定義される（Ｇｉｂｓｏｎ及びＲｏｂｅｒｆｒｏｉｄ、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５：１４０１−１４１２１９９５）。哺乳瓶で保育された赤ちゃんの腸内細菌叢を改善する好ましい方法は、特定の難消化性オリゴ糖によって、即ちプレバイオティックスによって、この哺乳瓶で保育された乳児の腸内に既に存在するビフィズス菌を、選択的に刺激することである。また、オリゴ糖と多糖との混合物も、例えばＷＯ００／０８９４８にプレバイオティックスとして提示されている。１つの例は、ガラクト−オリゴ糖とフルクト多糖との組合せである。これらのプレバイオティックスを含有する調合乳を与えられた乳児のビフィズス菌レベルは、標準的な調合乳の場合に比べて高くなることが示された（例えば、Ｍｏｒｏ他、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．３４：２９１−２９５、２００２参照）。
【０００６】
現在までの手法は、ビフィズス菌を全体的に、即ち属レベルで増進させることであった。ビフィドバクテリウム属（ｇｅｎｕｓ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、代謝、酵素活性、オリゴ−及び多糖の利用率、細胞壁の組成、宿主の免疫系との相互作用が異なる多くの様々な種からなる。したがって、乳児に対し、全てのビフィドバクテリウム種（ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が同じ機能上の効果を及ぼすとは限らないことが予測できる。様々なビフィドバクテリウム種の例は、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ビフィダム）、Ｂ．アニマリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、及びＢ．デンティウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）である。Ｂ．アドレセンティスは、成人の細菌叢においてより広く行き渡っており、健康な乳児及び赤ちゃんの大便においてはそれほど一般的ではない。Ｂ．アニマリス／Ｂ．ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）は、人の場合、自然に生ずるものではなく、Ｂ．デンティウムは病原菌である。健康な乳児では、ビフィズス菌叢が、主にビフィドバクテリウムインファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ブレーベ、及びＢ．ロンガムからなる。Ｋａｌｌｉｏｍａｋｉ他（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｆｅｂ；３（１）：１５−２０、及びそこに引用される参考文献）は、アレルギー体質の乳児が、成人に適したビフィズス菌叢の棲み家となるのに対し、典型的な乳児のビフィズス菌叢は、健康な乳児に見られ、ある特定のビフィズス菌種の出現とアレルギー発症の機会との間には相関関係が示されることを報告した。これらの結果は、赤ちゃんの結腸でのビフィドバクテリウム属の刺激が、十分とは考えられないことを示している。目標は、母乳で保育された赤ちゃんの菌叢と同じような、哺乳瓶で保育された乳児の菌叢を、種のレベルで実現することである。
【０００７】
本発明において、「母乳で保育された乳児」とは、ヒトの母乳だけで保育された乳児を指す。「人工栄養保育された、又は一部母乳で保育された乳児」とは、ヒトの母乳を与えていない乳児、又はヒトの母乳を与えるのに留まらない乳児を意味する。この定義は、１日当たり少なくとも１本の哺乳瓶の内容物、即ち１日当たり少なくとも８０ｍｌの調合乳が与えられ、存在する場合には残りの栄養素が、固体栄養素又は液体栄養素から提供され、例えば母乳などから提供される乳児、即ち一部母乳で保育された乳児を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
難消化性炭水化物の混合物を使用して、ビフィズス菌レベルを増大させることにより、ビフィズス菌集団は、より乳児に適した集団、即ちＢ．カテニュレイタム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、Ｂ．シュードカテニュレイタム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、及びＢ．アドレセンティスが低い集団に調節されるのに対し、標準的な調合乳で保育された乳児は、より成人に適した菌叢であってその大部分がＢ．カテニュレイタム、Ｂ．シュードカテニュレイタム、及びＢ．アドレセンティスであるものを示すこともわかった。また、そのようなプレバイオティックで保育された乳児のビフィズス菌集団は、依然としてある特定の微生物、即ちビフィドバクテリウムブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）に欠けていることもわかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明の一態様では、ビフィドバクテリウムブレーベと、難消化性炭水化物プレバイオティックスの混合物とを含む製剤が提供される。そのような製剤は、乳児の胃腸管内で、種のレベルでビフィズス菌集団を調節するのに有利であり、且つ非常に適していることがわかった。さらに驚くべきことに、そのような製剤によって十分調節されるので、Ｂ．ブレーベ種以外のビフィズス菌種を添加することは必ずしも必要でないことがわかった。
【００１０】
本発明の別の態様では、ビフィドバクテリウムブレーベと、難消化性炭水化物プレバイオティックスの混合物とを含む製剤であって、この難消化性炭水化物の混合物が、少なくとも２種の異なる実質的に可溶性の炭水化物成分Ａ及びＢを含有しているものが提供される。
【００１１】
本発明の別の態様では、人工栄養保育される乳児又は一部母乳で保育される乳児のための製剤の使用が提供される。
【００１２】
本発明の他の態様では、人工栄養保育される乳児又は一部母乳で保育される乳児の胃腸管でビフィズス菌種集団の調節を行う組成物を製造するための、製剤の使用が提供される。
【００１３】
本発明の他の態様では、免疫状態の予防又は治療用の組成物を製造するための、製剤の使用が提供される。
【００１４】
本発明の他の態様では、人工栄養保育される乳児又は一部母乳で保育される乳児の胃腸管で、ビフィドバクテリウムカテニュレイタム、Ｂ．シュードカテニュレイタム、及び／又はビフィドバクテリウムアドレセンティスの集団を調節するための、炭水化物混合物の使用が提供される。
【００１５】
本発明のさらに別の態様では、ヒト、特にヒト乳児で見出されるビフィドバクテリウム属の種を、種特異的に検出し定量的にアッセイを行う方法、並びにビフィドバクテリウム種を診断し定量するためのキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（製剤）
１）ビフィドバクテリウムブレーベ
ビフィドバクテリウムブレーベは、本発明の本質的な要素である。この細菌は、人工栄養保育された乳児の場合に限られた量で存在することが、本出願人の検出方法によって見出された。したがって、この細菌を炭水化物混合物と共に投与することにより、母乳で保育された乳児の胃腸管に存在する場合と同等のレベルまで、ビフィドバクテリウム種集団を正常化することが可能になる。
【００１７】
好ましいビフィドバクテリウムブレーベ株は、健康な、母乳で保育された乳児の大便からの、分離株から選択されたものである。典型的な場合、これらは乳酸菌の生産者から市販されているが、大便から直接分離し、同定し、特徴付けし、生成することもできる。市販されているＢ．ブレーベの例は、ＲｈｏｄｉａからのＢ．ブレーベＢｂ−０３、森永からのＢ．ブレーベＭＶ−１６、及びＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｒｏｓｅｌｌ，ＬａｌｌｅｍａｎｄからのＢ．ブレーベであるが、Ｂ．ブレーベは、ＤＳＭ ２００９１やＬＭＧ １１６１３など、カルチャーコレクションから得ることもできる。
【００１８】
本発明の製剤中のＢ．ブレーベの量は、可溶性の難消化性炭水化物の総量を基にすることができ、これら炭水化物全体の１ｇ当たり、細菌が好ましくは１０７から１０１１ｃｆｕであり、より好ましくは１０８から１０１０ｃｆｕである。製剤をサプリメントとして使用する場合、ビフィドバクテリウムブレーベは、１×１０６から１．５×１０１１ｃｆｕ／ｇの量でサプリメント中に存在することが最も好ましく、３×１０７から５×１０１０ｃｆｕ／ｇであることが好ましく、５×１０８から１×１０１０ｃｆｕ／ｇであることがより好ましい。製剤を（完全）乳児栄養素として使用する場合、Ｂ．ブレーベは、１×１０４から１×１０１０ｃｆｕ／ｇの量で栄養素中に存在することが最も好ましく、５×１０６から３×１０９ｃｆｕ／ｇであることが好ましく、乳児栄養素１ｇ当たり１×１０７から５×１０８ｃｆｕであることがより好ましい。これらの濃度は、１日量が１×１０６から１．５×１０１１ｃｆｕ／ｇであり、好ましくは３×１０７から５×１０１０ｃｆｕ／ｇであり、より好ましくは５×１０８から１×１０１０ｃｆｕ／ｇになるような方法で選択される。
【００１９】
２）難消化性炭水化物プレバイオティックスの混合物
難消化性炭水化物プレバイオティックスの混合物も、本発明の本質的な要素である。「難消化性」とは、炭水化物が、胃腸管内消化されないままであり、吸収されずに大腸に到達することを意味する。
【００２０】
本発明では、難消化性炭水化物の混合物が、少なくとも２種の異なる、本質的に可溶性の炭水化物成分Ａ及びＢであって、胃腸管内で消化されないままであり且つ吸収されずに大腸に到達するものを含有する。本発明による炭水化物混合物は、これら２種の炭水化物成分Ａ及びＢのみからなるものでもよい。
【００２１】
少なくとも２種の難消化性可溶性炭水化物成分Ａ及びＢの混合物では、炭水化物成分Ａが、炭水化物成分Ａ及びＢの合計の５から９５重量％の量で存在する。さらに、成分Ａ及びＢの難消化性可溶性炭水化物全体の、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％は、二糖からエイコサ糖（２０個の単糖単位を有する多糖）の中から選択され、その残りは、難消化性単糖及び難消化性多糖であって、２０単位よりも長いものでよい。また、可溶性の難消化性炭水化物全体の、９５％を超える量、好ましくは９８％を超える量は、１００単位以下の鎖長を有することも好ましい。パーセンテージ及び平均について、この記述の中で述べる場合は、別の基準を指すことが明らかでない限り、又は他に特に指定しない限り、重量に基づくパーセンテージ及び平均であることを意味する。
【００２２】
各成分の炭水化物は、下記の３つの点で異なると考えられる。
（ｉ）炭水化物の単糖単位の（平均）数であり、成分Ａは、その平均鎖長が、成分Ｂの鎖長よりも少なくとも５単糖単位だけ少ない；これは、Ａ及びＢの炭水化物が同じ構造単位を有する場合、即ち鎖長のみ異なる同族体の混合物を形成する場合、この同族体の分布は２つの最大値を持たねばならず、１つの最大値は７よりも下であり、且つ１つは７よりも上であり、これら２つの最大値は、少なくとも５単位離れていることを意味し；６単位までの炭水化物（六糖）は成分Ａの一部であり、７単位から先の炭水化物（七糖）は成分Ｂの一部である。
（ｉｉ）炭水化物の単糖単位の構造であり、成分Ａは、成分Ｂとは異なる構造単位から構成され；Ａ及び／又はＢが、異なる単糖単位を繰り返した組合せから構成される場合、例えばガラクトマンナン及びアラビノガラクタンの場合、２成分の単糖単位の少なくとも５０％は、異なるべきである（上記の例では、どちらか又は両方が、５０％未満の無水ガラクトースを有するべきである）。
（ｉｉｉ）両方、即ち成分Ａ及びＢは、その（平均）鎖長と構造に差があり、この実施形態が好ましい。
【００２３】
成分Ａは、同じ炭水化物構造の、消化しにくい単糖から六糖までの中から選択することが好ましく、成分Ｂは、同じ炭水化物構造の七糖以上の多糖から選択することが好ましい。よって炭水化物成分Ａは、少なくとも１種の難消化性単糖又は少なくとも１種の難消化性オリゴ糖からなる。オリゴ糖の場合、これは２個から６個までが含まれる単糖単位を含むことが理解される。炭水化物成分Ａは、前述の糖の２種以上により形成してもよく、またそのようにすることが好ましい。したがって、そのような種類の、即ち同じ構造の、任意の数の様々な単糖及び／又はオリゴ糖からなるものでよい。
【００２４】
この好ましい実施形態によれば、炭水化物成分Ｂは、７個以上の単糖単位を含んだ少なくとも１種の多糖からなる。多糖の場合、六糖から始まるものが理解される（例えば七糖、八糖、九糖、十糖など）。多糖の鎖長には、特定の上限が無く、単糖単位が数百個又は何千個にもなった長さのものでよい。しかし、１００個を超える（約１６ｋＤ）鎖長、特に７００個（約１００ｋＤ）を超えるものは、本発明によればそれほど好ましくない。成分Ｂは、１００個を超える単糖単位を有する同族体を、５％よりも多く、又は２％以下で含有しないことが好ましい。炭水化物成分Ｂは、そのような種類のたった１つの多糖、又は好ましくは、そのような種類の、即ち同じ構造の、長さの異なる２種以上の多糖からなるものでもよい。
【００２５】
炭水化物成分Ａは、炭水化物成分Ａと炭水化物成分Ｂの合計（Ａ＋Ｂ＝１００重量％）の９５重量％までを占める。炭水化物成分Ｂは、炭水化物成分Ａと炭水化物成分Ｂの合計の、５から９５重量％を占める。好ましい実施形態によれば、成分Ａは、Ａ＋Ｂ＝１００重量％である存在する炭水化物全体の、９５から６０重量％を構成し、より好ましくは９５から８０重量％を構成し、特に９５から９０重量％を構成し、成分Ｂは、５から４０重量％、より好ましくは５から２０重量％、特に５から１０重量％を構成する。
【００２６】
本発明における可溶性炭水化物としては、Ｌ．Ｐｒｏｓｋｙ他によるＪ．Ａｓｓｏｃ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ ７１：１０１７−１０２３、１９８８に記載される方法によれば、少なくとも５０％が可溶性であるものが理解される。
【００２７】
それによって、炭水化物成分Ａ及びＢの合計の、少なくとも８０重量％の炭水化物又は糖が、プレバイオティック効果を発揮する。炭水化物成分Ａに属する炭水化物の少なくとも８０重量％と、炭水化物成分Ｂに属するものの少なくとも８０重量％も、プレバイオティック効果を発揮することが好ましい。言い換えれば、炭水化物成分Ａ及びＢのうち少なくとも８０重量％の炭水化物又は糖のそれぞれは、消化されないように大腸に到達する（したがって小腸で吸収されない）ことを目的とすることが好ましい。言い換えれば、胃腸管内の炭水化物成分Ａ及びＢのこれら炭水化物又は糖は、胃にも小腸にも吸収されず且つ消化もされず、したがって大腸に到達する。
【００２８】
本発明による、プレバイオティックとして活性な炭水化物では、消化されずに大腸に到達する（したがって小腸に吸収されない）炭水化物が理解され、これは腸内の細菌種の１つ又はその限られた数のものの成長及び／又は活性を選択的に促し、その結果、健康を増進させる。そのような炭水化物のこのプレバイオティック効果とその特定のメカニズムは、明らかな参照がなされ且つその開示を本明細書の文中に含める「Ｇ．Ｆ．Ｇｉｂｓｏｎ＆Ｍ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１９９５；１２５：１４０１−１４１２」に、記載されている。
【００２９】
それに加えて、炭水化物成分Ａ及びＢの、プレバイオティックとして活性ではない炭水化物又は糖の割合は、最大で２０重量％に達する。これらの炭水化物又は糖は、実際に可溶性であるが、消化されない形で排出することができるものを指す。これらの炭水化物は、例えば大便の量をふやし、又は水の吸着を促すという点で、物理的な影響を及ぼすことができる。
【００３０】
食事又は医薬品中の炭水化物成分Ａ及びＢを決定する割合の評価では、以下のステップを実施する。第１の段階では、全ての可溶性炭水化物を、水を用いて生成物から抽出する。この抽出物から、脂肪及びタンパク質を除去する。第２の段階では、可溶性炭水化物又は抽出物をそれぞれ、ヒト酵素、例えばヒトアミラーゼやヒト膵液、又は小腸線毛縁製剤を用いて消化する。難消化性炭水化物（この生体外実験で得られた生体内吸収性単糖を除く）の収量は、２種の炭水化物成分Ａ及びＢを構成する。その８０％は、プレバイオティックとして活性であることが示唆される。
【００３１】
したがって、本発明の製剤で使用される炭水化物混合物は、上述の意味で可溶性であり消化されない炭水化物が、本明細書で特定した基準を満たし且つ炭水化物成分Ａ及びＢを構成するものである。
【００３２】
炭水化物成分Ａは、例えば以下の炭水化物、即ちβ−ガラクト−オリゴ糖、α−ガラクト−オリゴ糖、フルクト−オリゴ糖、イヌロ−オリゴ糖、フコ−オリゴ糖、マンノ−オリゴ糖、キシロ−オリゴ糖、シアリル−オリゴ糖、Ｎ−糖タンパクオリゴ糖、Ｏ−糖タンパクオリゴ糖、糖脂質オリゴ糖、セロ−オリゴ糖、キトサン−オリゴ糖、キチン−オリゴ糖、ガラクツロノ−オリゴ糖、グルクロノ−オリゴ糖、β−グルカン（例えば１，３−）オリゴ糖、アラビノキシロ−オリゴ糖、アラビノガラクト−オリゴ糖、キシログルコ−オリゴ糖、ガラクトマンノ−オリゴ糖、ラムノ−オリゴ糖、大豆オリゴ糖（スタキオース、ラフィノース、ベルバスコース）、及びラクト−Ｎ−ネオテトラオースの１種又は複数からなるものでよく、或いは炭水化物成分Ｂは、例えば以下の炭水化物又は糖、即ちイヌリンを含めたフルクタン（フルクトサン）、ガラクタン、フコイダン、アラビナン、キシラン、キサンタン、β−グルカン、消化しにくいポリデキストロース、消化しにくいマルトデキストリン、ガラクツロナン、Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キシログルカン、アラビノガラクタン、アラビアガム、アルギネート、カラゲナン、ガラクトマンナン、グルコマンナン、アラビノキシラン、糖脂質グリカン、糖タンパクグリカン、プロテオグリカン、大豆多糖の１種又は複数から形成することができる。消化性炭水化物は、成分Ａ及びＢの一部では無いことに留意されたい。したがって、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、及びマルトデキストリンは、例えばガラクト−多糖やフルクト−多糖（イヌリン）などの低級同族体である場合であっても、これらの成分に含めて考えない。本発明の難消化性炭水化物は、原則としてデンプン誘導体のように、α１，４及び／又はα１，６位に結合しているグルコース単位を高い割合で含んでおらず、したがって炭水化物は消化性になる。しかし、あるデンプンタイプの多糖及びマルトデキストリンは、物理的に又は酵素によって、難消化性又は「耐性」にされ、そのようなオリゴ糖及び多糖は、十分可溶性である限り本発明に含められる。
【００３３】
オリゴ糖と多糖との選択的組合せ、即ちその結果として炭水化物成分Ａ及びＢが同時に存在することにより、大腸内の健康増進微生物を活性化することができ、且つ／又は病原微生物を、前記炭水化物成分の１種のみの場合に考えられるよりも本質的に高い効率によって、抑制することができる。したがって、炭水化物の組合せを投与することにより、正常な大腸内細菌叢の非常に素早い回復を実現することが可能であり、これを維持することが可能であり、又はストレス環境での腸内細菌叢の変化を予防的に防止することが可能であり、したがって、以前使用していた炭水化物の場合よりも効率的な方法で、大腸の細菌コロニー形成に影響を及ぼすことが可能である。
【００３４】
好ましい実施形態によれば、炭水化物成分Ａ並びに炭水化物成分Ｂの少なくとも８０重量％は、ビフィズス菌産生性であり且つ／又は乳酸菌を増進させる炭水化物からなる。そのような前記性質を有するオリゴ糖と多糖との組合せにより、オリゴ糖又は多糖のいずれかのみの場合に考えられるよりも本質的に強力な方法で、乳酸菌の成長を驚くほど促進させることができる。それによって、腸内に生来存在する乳酸菌が活性化するだけではなく、外から導入された乳酸菌の成長も、任意選択で選択的な手法であっても促進する。
【００３５】
有機酸（酢酸や乳酸など）や、ｐＨ効果、コロノザイトの刺激など、細菌そのもの及びその代謝産物を介したこの間接的な動作の他に、蠕動運動や水分、大便の質、腸粘膜への機械的動作など、直接的な物理作用にも同様に、ポジティブな影響を及ぼす。
【００３６】
したがって、炭水化物混合物は、栄養効果だけではなく、広範な活性も決定する。上述の生物学的効果の他に、下記の事項、即ち生来のミクロフローラの安定化、毒素やウイルス、細菌、真菌、形質転換細胞、及び寄生虫などの病原物質／生物が付着しないようにすること、毒素、ウイルス、細菌、真菌、及びその他の内在細胞を有する病原体の複合体の分解、並びにそれらの身体からの排除、及び創傷治癒の加速も、本発明の混合物によって実現することができる。
【００３７】
したがってこの混合物は、例えば前述の物質及び生物が、上皮細胞又はその他の内在細胞に結合し又はその細胞に付着する結果、支障をきたした腸内細菌叢と併せて生ずる症状又は疾患の、予防及び／又は治療に適している。
【００３８】
炭水化物混合物は、炭水化物成分Ａが炭水化物成分Ｂとは異なる構造を有するときに、特に効果的であることがわかった。この異なる構造は、例えば一方でフルクタンを使用し、他方でガラクタンを使用する場合、例えば単糖組成物に関するものである可能性がある。この異なる構造は、同様に、グリコシド結合に関する可能性もある（例えば、α−ガラクトオリゴ糖対β−ガラクトオリゴ糖、又はα−グルカン（デンプン）対β−グルカン（セルロース））。モノマー組成物、並びにグリコシド結合は、化学的挙動（例えば溶解性）又は生理学的挙動（例えば消化性）に影響を与える可能性がある。
【００３９】
同じ構造の炭水化物は、鎖長が異なる可能性があるが同じ単糖単位又は単糖単位の組合せからなる同族体であることが、理解される。一般に、隣の同族体は、前の同族体に存在する単糖単位の１つを加えることによって、前の同族体とは異なることになる。それにも関わらず、１つの単位、通常は末端にあるものは、例えばグルコース単位で終わる（無水）フルクトース単位の鎖を含有するある特定のフルクタンのように、異なる可能性がある。
【００４０】
成分Ｂの多糖の鎖長、又は多糖混合物の場合の重量平均鎖長は、少なくとも３単位であることが好ましく、成分Ａのオリゴ糖の鎖長又はオリゴ糖混合物の重量平均鎖長よりも、少なくとも５単位長いことが好ましい。オリゴ糖Ａの平均鎖長は、２から６単位の間であり、多糖Ｂの平均鎖長は７から３０単位の間であることが好ましく、８から２０単位の間であることがより好ましい。同じ構造のオリゴ糖と多糖が共に存在する場合、この構造の炭水化物は、重量平均鎖長が６．５よりも短い場合に成分Ａと見なし、７以上の鎖長を有する個々のメンバーは成分Ａに含めて考えず、一方、重量平均鎖長が６．５を超えた場合に成分Ｂと見なし、６以下の鎖長を有する個々のメンバーは、成分Ｂに含めて考えない。別の構造の糖が存在しない状態で、同じ構造のオリゴ糖と多糖が共に存在する場合、７単位の両端に２つの最大値があるべきであり、そうでない場合には、上述のように、２種の異なる炭水化物成分の要件が満たされない。
【００４１】
とりわけ混合物の中心は、その炭水化物中に見ることができる。異なるサイズ及び／又は異なる「種類」又は「構造」の炭水化物の混合物を投与すると、個別の物質群Ａ及びＢのプレバイオティック効果に対して相乗効果をもたらすことができる。
【００４２】
成分Ａの炭水化物は、１つの物質の種類にのみ属するものでよいが、いくつかの種類（例えばＡ：ガラクト−オリゴ糖及びフコ−オリゴ糖）から形成することができ、一方、成分Ｂの炭水化物は、同様に１つの物質の種類に由来するものでよく、いくつかの物質の種類に由来するものでもよい（例えばＢ：イヌリン及びキシラン）。
【００４３】
好ましい炭水化物混合物は、ガラクト−オリゴ糖とインリンからなる。特に効果的な混合物は、炭水化物成分Ａの少なくとも６０重量％、好ましくは８０から１００重量％がガラクト−オリゴ糖の群に属するものである。炭水化物成分Ｂの少なくとも６０重量％、好ましくは８０から１００重量％がフルクト−多糖の群に属する混合物も好ましい。炭水化物混合物の生成では、現在知られており且つ食物又は食品の製造に特に使用される炭水化物及び炭水化物混合物を、使用することができる。技術的な方法で予め変性させた原材料を、使用することも可能である。それによって、混合物の調製を、対応して選択された炭水化物又はオリゴ糖と多糖又は炭水化物混合物との単なるブレンドによって、引き続き行うことができる。それによって、初期成分は、パラメータが完成された混合物に関係するように、互いに混合しなければならない。
【００４４】
原材料を使用することができるので、貯蔵炭水化物（フルクタン、豆果からのガラクト−オリゴ糖、フコイダン、α−グルカン、ラミナリン、カラゲナン、マンナン、ガラクトマンナン、寒天）、天然ガム、糖タンパク質のＮ−グリコシド結合炭水化物、糖タンパク質のＯ−グリコシド結合炭水化物、糖脂質のグリカン、酵素により調製された炭水化物（ガラクト−オリゴ糖、グルコ−オリゴ糖、フルクト−オリゴ糖、キシロ−オリゴ糖）、細菌性炭水化物（キサンタンなど）、並びにオリゴ糖（ガラクト−オリゴ糖、グルコ−オリゴ糖（α１−２及びα１−３グルコース残基）、キシロ−オリゴ糖）、並びにセルロースやヘミセルロース（アラビナン、ガラクタン）、ペクチン、及びキチンなどの骨格炭水化物を使用することができる。これらの物質は、好ましくは食品級であるべきである（食品中の複合炭水化物（Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ Ｆｏｏｄｓ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ；Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９０参照）。
【００４５】
原材料及び生成物の、加水分解酵素（例えばグリコシダーゼ、トランスグリコシダーゼ、及びリパーゼ）、転移酵素、異性化酵素（例えば、アルドラーゼ、及びケトラーゼ）、酸化還元酵素（例えばオキシダーゼ）、及び還元酵素（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ）、脱離酵素（例えば、多糖リアーゼ）、及びリガーゼを用いて、原材料の酵素修飾を実施することも可能である。さらに、原材料及び生成物の、技術的変性を行うことが可能であり、即ち圧力（例えば押出し）、温度（例えばカラメル化）、有機合成、有機修飾（例えば、カルボキシメチル化及びパーアセチル化）、酸及び／又はアルカリ加水分解、及び分画（例えば、サイズ及び／又は物理化学的パラメータであって、電荷や疎水性などによる）、又は変性の組合せによって行うことが可能である。
【００４６】
それによって炭水化物混合物は、本質的に、以下に列挙する単糖からなり、またその単糖からなるオリゴ糖及び多糖からなる：即ち、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−アロース、Ｄ−タロース、Ｌ−イドース、Ｄ−リボーズ、並びにカルボキシル基を含む単糖であって、例えばＤ−ガラクツロン酸やＤ−グルクロン酸、Ｄ−マンヌロン酸、及び／又はこれらがメチル化した形のものであって、例えばＮ−アセチルノイラミン酸やＮ−グリコリルノイラミン酸、及び／又はこれらがＯ−アセチル化した形などである。さらに、これらのモノマー及びそれをベースにした高級単位は、−ＯＳＯ３Ｈ基及び／又は−ＯＰＯ３Ｈ基を用いて変性させることができる。
【００４７】
本発明による難消化性炭水化物は、典型的な場合、１日量を０．５から３０ｇ、好ましくは２から１５ｇ、より好ましくは３から９ｇとして投与する。製剤の、１つの好ましい投与形態は、サプリメントである。サプリメントは、人工栄養保育され又は一部母乳で保育される未熟児、及び人口栄養保育され又は一部母乳で保育される成熟児も含め、人工栄養保育され又は一部母乳で保育される乳児に適している。
【００４８】
製剤は、乳児栄養として使用してもよい。この場合、本発明の乳児栄養はさらに、消化性炭水化物、脂質源、タンパク源、及びこれらの混合物から選択された１種又は複数の成分を含む。
【００４９】
３）その他の成分
炭水化物成分Ａ及びＢの他に、その他の炭水化物も同様に存在してよい。その中には、１）上述のように消化性のある消化性炭水化物、及び２）吸収性／消化性があり、又は吸収性／消化性も無い不溶性炭水化物がある。乳児栄養サプリメントに使用される、典型的な不溶性の難消化性炭水化物は、大豆多糖であり、抵抗性デンプン、セルロース、及びヘミセルロースであり、より好ましくは、この炭水化物は大豆多糖及び抵抗性デンプンから選択される。
【００５０】
乳児栄養サプリメントに使用される、典型的な可溶性及び消化性炭水化物は、マルトデキストリン、デンプン、ラクトース、マルトース、グルコース、フルクトース、及びスクロースと、その他の単糖及び二糖から選択され、より好ましくは、マルトデキストリン、ラクトース、マルトース、グルコース、フルクトース、スクロース、及びこれらの混合物から選択される。
【００５１】
炭水化物成分Ａ及びＢの他に、１）及び２）の下で列挙されたこれらの炭水化物は、それ自体が任意の量で存在することができ、どの場合も、所望の最終生成物に応じて様々になる。不溶性炭水化物は、炭水化物混合物の０から１０重量％を構成することが好ましい。
【００５２】
乳児栄養サプリメント中に使用される、脂質源として使用される典型的な成分は、乳児用調合乳での使用に適した任意の脂質又は脂肪でよい。好ましい脂質源には、乳脂肪、サフラワー油、卵黄脂質、カノーラ油、オリーブ油、ココナツ油、パーム油、パーム核油、パームオレイン、大豆油、ヒマワリ油、魚油、及び長鎖ポリ不飽和脂肪酸を含有する微生物発酵油が含まれる。これらの油は、高級オレインヒマワリ油や高級オレインサフラワー油などの、高級オレイン形態をとることができる。脂質源は、パームオレインや中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）、アラキドン酸やリノール酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ドコサヘキサエン酸、リノレン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸、カプロン酸のような脂肪酸のエステルなど、これらの油から得られた画分の形をとってもよい。
【００５３】
未熟児用調合乳の場合、脂質源は、中鎖トリグリセリドを、好ましくはこの脂質源の１５重量％から３５重量％の量で含有することが好ましい。
【００５４】
脂質源は、ｎ−６脂肪酸とｎ−３脂肪酸とのモル比が５：１から１５：１、好ましくは８：１から１０：１であることが好ましい。
【００５５】
存在する場合、脂質は、組成物の２０重量％から４０重量％のレベルで存在すること、又は乳児用調合乳において０．８から１．５ｇ／１００ｋＪとして存在することが好ましい。
【００５６】
本発明の栄養製品で利用することのできるタンパク質には、ヒトの消費に適した任意のタンパク質又は窒素源が含まれる。乳児用調合乳に使用される適切なタンパク源の例には、典型的な場合、カゼイン、乳清、脱脂練乳、脱脂乳、大豆、エンドウ豆、米、トウモロコシ、加水分解タンパク質、遊離アミノ酸、タンパク質と共にコロイド懸濁液中にカルシウムを含有するタンパク源、及びこれらの混合物が含まれる。本明細書で使用するには、タンパク質が加水分解物の形をとることが好ましく、それによって、上述のような乳児でのアレルギーの危険性が低下する。商用のタンパク源は、容易に入手可能であり、当業者に知られている。
【００５７】
典型的な場合、ミルクをベースにした乳児用調合乳の加水分解物には、牛乳からの１００％加水分解した乳清タンパク質が存在する。その他のミルクをベースにした乳児用調合乳では、カゼイン／乳清の比が、典型的な場合は１．８：０．３〜３〜０である。
【００５８】
存在する場合、タンパク源は、組成物の９重量％から１９重量％のレベルで存在することが好ましい。乳児用調合乳として使用するときは、タンパク源が、０．４５から１．０ｇ／１００ｋＪの量で存在することが好ましい。
【００５９】
栄養的に完全な調合乳は、日々の食事に重要であると理解される全てのビタミン及びミネラルを、栄養的に有意な量で含有することが好ましい。最低限の要件が、ある特定のビタミン及びミネラルに関して確立されている。乳児用調合乳中に任意選択で存在するミネラル、ビタミン、及びその他の栄養素の例には、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、葉酸、イノシトール、ナイアシン、ビオチン、パントテン酸、コリン、カルシウム、リンヨウ素、鉄、マグネシウム、銅、亜鉛、マンガン、塩化物、カリウム、ナトリウムセレン、クロム、モリブデン、タウリン、及びＬ−カルニチンが含まれる。ミネラルは、通常、塩の形で添加される。特定のミネラル及びその他のビタミンの、存在及び量は、目的とする乳児集団に応じて変わることになる。
【００６０】
必要に応じて、乳児用調合乳は、大豆レシチンやクエン酸、モノグリセリド及びジグリセリドのエステルなど、乳化剤及び安定剤を含有することができる。これは、調合乳を液体の形で提供する場合に特に準備される。
【００６１】
乳児用調合乳は、（非炭水化物）繊維やラクトフェリン、免疫グロブリン、ヌクレオチド、ヌクレオシドなど、有益な効果を発揮することができるその他の物質を、任意選択で含有することができる。
【００６２】
（適用例）
本発明による製剤は、人工栄養保育され又は一部母乳で保育される乳児、特に未熟児、成熟児として生まれた赤ちゃん、並びに固形食物への適応期間にある乳児の胃腸管において、「標準」と見なされる母乳で保育される乳児での種の分布に従って、ビフィズス菌集団を正常化するのに特に有用であることがわかった。本発明の製剤は、母乳での保育から哺乳瓶での保育に変わる乳児にも適している。
【００６３】
このように、人工栄養保育され又は一部母乳で保育される乳児の胃腸管で、ビフィドバクテリウム種を正常化する組成物を製造するために、本発明の製剤又は組成物の使用が提供される。本発明の製剤は、免疫状態の予防又は治療に特に有用であることもわかった。この免疫状態は、母乳で保育される乳児と比較した場合、これら人工栄養保育され又は一部母乳で保育された乳児の胃腸管内のビフィドバクテリウム種の組成物が、異なる結果と考えられる。典型的な場合、そのような免疫状態には、アレルギー、アトピー性皮膚炎、湿疹、喘息、アトピー、アレルギー性鼻炎、食物過敏症、おむつかぶれ、下痢、及びこれらを混合したものから選択された状態が含まれる。
【００６４】
したがって本発明は、好ましくはアレルギー、アトピー性皮膚炎、湿疹、喘息、及びおむつかぶれから選択された、１つ又は複数の免疫状態を予防し又は治療するための、製剤の使用を提供する。また、（細菌性）下痢、特にウイルス性下痢を、本発明の製剤で治療することもできる。本明細書では、エネルギー吸収不良の予防及び／又は治療のための、製剤の使用も提供する。製剤は、アレルギー病変部への好酸球、好中球、及び単核細胞の浸潤を阻害し、且つ／又はＴｈ２型免疫応答を阻害し、且つ／又はＴｈ１媒介型免疫応答を刺激するのに有益であることが見出されたことは、有利である。このように、アレルギー病変部への好酸球、好中球、及び単核細胞の浸潤を阻害し、Ｔｈ２型免疫応答を阻害し、且つ／又はＴｈ１媒介型免疫応答を刺激する組成物を製造するために、本明細書で定義した本発明の製剤又は組成物の使用が提供される。
【００６５】
また本発明は、Ｂ．ブレーベ以外のある特定のビフィドバクテリウム種の集団を調節するために、特にビフィドバクテリウムカテニュレイタム、Ｂ．シュードカテニュレイタム、及び／又はＢ．アドレセンティスの相対量を低下させるために、上述の炭水化物混合物の使用も提供する。
【００６６】
（プローブの開発及び診断キット）
本明細書では、種特異的オリゴヌクレオチドプライム及びプローブを使用して、ビフィドバクテリウム種、特にヒトに見られるもの、即ちビフィドバクテリウムカテニュレイタム及びＢ．シュードカテニュレイタム、Ｂ．アドレセンティス、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．ロンガム、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．アンギュレイタム（Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｕｍ）、Ｂ．インファンティス、及びＢ．デンティウムを定量する方法も提供する。
【００６７】
これらのプライマー及びプローブは、ＦＩＳＨ、ＰＣＲ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥ、ドットブロットハイブリダイゼーション、及びリアルタイムＰＣＲ法を介して、ビフィズス菌及びビフィズス菌種を同定するのに使用することができる。これら技法の全てには、ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションステップを含むという共通点がある。その目的は、特に、リアルタイムＰＣＲによってビフィズス菌の種の量を決定することである。
【００６８】
以下に記述する配列のそれぞれは、プローブとして機能する限り、その５’−又は３’−末端に結合した追加の塩基を有することができる。
【００６９】
これらのオリゴヌクレオチドは、化学合成のための従来の手段によって、例えば自動化ＤＮＡ合成器によって調製することができる。上述の配列を含有するＤＮＡ断片は、対応するビフィドバクテリウム種からの遺伝子の酵素切断によって調製することができる。
【００７０】
本発明において、５’ヌクレアーゼアッセイで使用されるビフィズス菌種に特異的なプライマー及びプローブの開発は、下記の通りであった。
【００７１】
全てのビフィズス菌に関して、ビフィドバクテリウムアドレセンティス、Ｂ．アンギュレイタム、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．カテニュレイタム、Ｂ．デンティウム、Ｂ．ロンガム、及びＢ．インファンティスに対する二重５’ヌクレアーゼアッセイを開発した。本発明者等は、通常なら系統発生分析及び細菌の特異的検出に使用される１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の代わりに１６Ｓ−２３Ｓ ｒＤＮＡの遺伝子間スペーサに対する５’ヌクレアーゼアッセイを開発した。遺伝子間スペーサに何を選択するかは、１６Ｓ ｒＤＮＡを使用する場合、汚染及び感受性の問題がリアルタイムＰＣＲに関して記述されるという事実に大きく左右される。さらに、異なるビフィドバクテリウム種の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列間の大きな類似性が示されており（Ｌｅｂｌｏｎｄ−Ｂｏｕｒｇｅｔ他、１９９６）、これは、異なるビフィドバクテリウム種に特異的なプライマーとプローブとのセットの開発を、ほとんど不可能にする。驚くべきことに、これらの問題は、遺伝子間スペーサ領域を使用することによって回避することができた。
【００７２】
プライマー及びプローブの開発では、異なるビフィドバクテリウム種の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサ領域の異なる配列（Ｂ．アドレセンティス［Ｕ０９５１１ Ｕ０９５１２（１）、Ｕ０９５１３（１）及びＵ０９５１４（１）］ａ、Ｂ．アンギュレイタム［Ｕ０９５１５（１）］ａ、Ｂ．アニマリス［ＡＹ２２５１３２（２）、Ｌ３６９６７（１）及びＵ０９８５８（１）］ａ、Ｂ．アステロイデス（Ｂ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）［Ｕ０９５１６（１）］ａ、Ｂ．ブレーベ［ＡＪ２４５８５０（３）、Ｕ０９５１８（１）、Ｕ０９５１９（１）、Ｕ０９５２０（１）及びＵ０９５２１（１）］ａ、Ｂ．ビフィダム［Ｕ０９５１７（１）、Ｕ０９８３１（１）］ａ、Ｂ．カテニュレイタム［Ｕ０９５２２（１）］ａ、Ｂ．コエリナム（Ｂ．ｃｈｏｅｒｉｎｕｍ）［Ｌ３６９６８（１）］ａ、Ｂ．コリネフォルメ（Ｂ．ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｅ）［Ｕ０９５２３（１）］ａ、Ｂ．クニクリ（Ｂ．ｃｕｎｉｃｕｌｉ）［Ｕ０９７９０（１）］ａ、Ｂ．デンティウム［Ｕ１０４３４（１）］ａ、Ｂ．インディカム（Ｂ．ｉｎｄｉｃｕｍ）［Ｕ０９７９１（１）］ａ、Ｂ．インファンティス［ＡＪ２４５８５１（３）、Ｕ０９５２５（１）、Ｕ０９５２７（１）、及びＵ０９７９２（１）］ａ、Ｂ．ロンガム［ＡＪ２４５８４９（３）、Ｕ０９８３２（１）］ａ、Ｂ．シュードロンガム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）［Ｕ０９５２４（１）、Ｕ０９８７９（１）］ａ、Ｂ．マグナム（Ｂ．ｍａｇｎｕｍ）［Ｕ０９８７８（１）］ａ、Ｂ．サーモフィラム（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）［Ｕ０９５２８（１）］ａ）を、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、及びＤＤＢＪデータベースから検索した。検索した全ての配列について、ＤＮＡＳＩＳ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｖ２．５（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｗｅｍｂｌｅｙ，ＵＫ）を使用して位置合わせを行った（ａ＝受入れコード、１＝Ｌｅｂｌｏｎｄ−Ｂｏｕｒｇｅｔ，Ｎ．，Ｈ．Ｐｈｉｌｉｐｐｅ，Ｉ．Ｍａｎｇｉｎ，Ｂ．Ｄｅｃａｒｉｓ．１９９６．１６Ｓ ｒＲＮＡ及び１６Ｓから２３Ｓの内部転写スペーサ配列分析は、種間及び種内ビフィズス菌系統発生を明らかにする。Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４６：１０２−１１１、２＝Ｖｅｎｔｕｒａ，Ｍ．，及びＲ．Ｚｉｎｋ．２００２。「ビフィドバクテリウムラクティスの、迅速な同定、分化、及び提案された新しい分類学的分類（Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｎｅｗ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：６４２９−６４３４．、３＝Ｂｒｉｇｉｄｉ，Ｐ．，Ｂ．Ｖｉｔａｌｉ，Ｅ．Ｓｗｅｎｎｅｎ，Ｌ．Ａｌｔｏｍａｒｅ，Ｍ．Ｒｏｓｓｉ及びＤ．Ｍａｔｔｅｒｕｚｚｉ．２０００「ポリメラーゼ連鎖反応による薬用プロバイオティック製品及びヒトの便の中のビフィズス菌株の特異的検出（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｅｃｅｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：３９１−３９９）。これら配列の保存領域全体を使用して、全てのビフィズス菌種に対するプライマー及びプローブを設計した。異なる種類の亜種の配列中の保存領域は、その他の種との類似性をほんのわずかしか示さないものであり、これを使用して、Ｂ．アドレセンティス、Ｂ．アンギュレイタム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．カテニュレイタム（Ｂ．シュードカテニュレイタムを含む）、Ｂ．デンティウム、Ｂ．インファンティス、及びＢ．ロンガム（Ｂ．シュードロンガムを含むが、これら２つの種の間には、その配列に大きな類似性があるからである）のそれぞれに対するプライマー及びプローブを設計した。
【００７３】
プライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブを、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ １．５ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｉｅｕｗｅｒｋｅｒｋ ａ／ｄ ＩＪｓｓｅｌ，ＮＬ）の助けを借りて設計した。本発明者等は、以下の基準を適用した：プローブ及びプライマーは、ＧＣ含量を３０〜８０％であるとし、同一のヌクレオチド（特にグアニン（Ｇ）に関する）が３個よりも多く続くことを避けるものとする。プローブの融解温度（Ｔｍ）は６８℃から７０℃の間であるとするのに対し、プライマーの融解温度は、プローブの融解温度よりも１０℃低いものとする。さらに、プローブの５’末端にはＧが存在しないものとし、Ｇよりもシトシン（Ｃ）を多く含む鎖を選択した。プライマーの３’末端の最後の５個のヌクレオチドは、２個以下のＧ及び／又はＣ塩基を有するものとする。最後に、単位複製配列の長さは、１５０塩基対未満とする。設計されたプライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブを表１に示し、これらの特異性について、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を使用して試験した。
【００７４】
全てのビフィズス菌の検出用に設計されたプローブは、５’レポーター色素ＶＩＣ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＬ）及び３’クエンチャーＮＦＱ−ＭＧＢ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＬ）を有するオリゴヌクレオチドからなり、異なるビフィドバクテリウム種に対するプローブは、５’レポーター色素６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ（商標））及び３’クエンチャーＮＦＱ−ＭＧＢ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＬ）を有するオリゴヌクレオチドからなる。全細菌負荷を決定するには、広域（ユニバーサル）なプローブとプライマーとのセットを使用するが、これについては、Ｎａｄｋａｒｎｉ，Ｍ．Ａ．，Ｆ．Ｅ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｎ．Ａ．Ｊａｃｑｕｅｓ，及びＮ．Ｈｕｎｔｅｒの「広域（ユニバーサル）なプローブとプライマーとのセットを使用したリアルタイムＰＣＲによる細菌負荷の決定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｏａｄ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ａ ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ｐｒｏｂｅ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４８：２５７−２６６（２００２）に記述されている。ユニバーサルプローブは、５’レポーター色素６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ（商標））及び３’クエンチャー色素６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ（商標））を有するオリゴヌクレオチドからなる。設計されたプローブを、表１に示す。
【００７５】
【表１−１】
【表１−２】
【００７６】
ａこれらの場合、適切なプライマーとプローブとのセットを見出す指針に適合するように、いくらか調節を行った（３個を超えて連続するヌクレオチド、又は１５０ｂｐよりも長い単位複製配列）。
【００７７】
標識された製剤は、従来の手段によって、検出可能なマーカーでオリゴヌクレオチドを標識することにより調製した。使用することができる標識マーカーには、放射性同位元素、蛍光物質、酵素、ビオチン、及びヘプテンが含まれる。
【００７８】
標識された製剤とサンプルとのハイブリダイゼーションは、ドットブロットハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼーションなど、既知の技法に従って行うことができる。形成されるハイブリッドは、例えば放射性同位元素を使用するオートラジオグラフィや、酵素又はビオチンを使用する酵素標識抗体技法などの既知の手段によって、標識された製剤を検出することにより確認することができる。
【００７９】
さらに、これらのオリゴヌクレオチドの中で、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６からそれぞれ選択された配列番号によって表されるＤＮＡ断片を、種の同定を行うためのＰＣＲ法でのプライマーとして使用することができる。より具体的には、同定すべき微生物細胞を溶菌させ、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５からそれぞれ選択された配列番号と、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６からそれぞれ選択された配列番号とのＤＮＡ断片のいずれかを、プライマーとしてそこに加え、その後、ＤＮＡポリメラーゼで処理する。電気泳動などによってＤＮＡ増幅が観察される場合、これは細胞が、使用したＤＮＡ断片に対応する遺伝子部分を有することを意味し、即ち細胞は、ＤＮＡ断片プライマーの開始点と同じ種のものであることが確認される。
【００８０】
したがって、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６から選択された配列番号と、これに相補的な配列とを含むオリゴヌクレオチドが提供される。
【００８１】
また本明細書では、ビフィドバクテリウム属の種に特有の核酸標的配列を検出するための、オリゴヌクレオチドプローブも提供され、前記プローブは、
１）配列番号３又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムアドレセンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
２）配列番号６又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムアンギュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
３）配列番号９又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムビフダムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
４）配列番号１２又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムブレーベＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
５）配列番号１５又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムカテニュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
６）配列番号１８又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムデンティウムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
７）配列番号２１又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムインファンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
８）配列番号２４又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムロンガムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
９）配列番号２７又はこれに相補的な配列によって表される、全てのビフィズス菌ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド
から選択される。
【００８２】
さらに本明細書では、ヒト、特にヒト乳児に見られるビフィドバクテリウム属の種を、種特異的に検出する方法が提供され、この方法は、
（Ａ）サンプルとオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズ溶液中で接触させるステップであって、前記プローブが、
１）配列番号３又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムアドレセンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
２）配列番号６又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムアンギュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
３）配列番号９又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムビフィダムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
４）配列番号１２又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムブレーベＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
５）配列番号１５又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムカテニュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
６）配列番号１８又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムデンティウムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
７）配列番号２１又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムインファンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
８）配列番号２４又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムロンガムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
９）配列番号２７又はこれに相補的な配列によって表される、全てのビフィズス菌ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド
からなる群から選択されるものであるステップと、
（Ｂ）前記属の前記種が前記サンプル中に存在するか否か検出されるように、前記プローブが前記サンプル中の核酸とハイブリダイズするか否かを決定するステップと
を含む。
【００８３】
本発明は、ヒト、特にヒト乳児に見られるビフィドバクテリウム属の種を、種特異的に検出する方法であって、
ａ）配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５から選択された配列番号のオリゴヌクレオチドプライマーを、それぞれ配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６から選択された配列番号のオリゴヌクレオチドプライマーと共に含むプライマーのセットを使用して、核酸配列増幅手順を実施するステップと、
ｂ）上述のオリゴヌクレオチドプローブが核酸標的配列とハイブリダイズするか否かを決定するステップと
を含む方法も包含する。
【００８４】
本発明の方法は、診断キットの製造に有利である。したがって本明細書では、少なくとも上述のＤＮＡプローブ、並びに変性液やハイブリダイゼーション液、洗浄液、固体担体、ハイブリダイゼーション容器、及び標識検出手段などのハイブリダイゼーション分析に必要な１種又は複数の他の手段を含み、ハイブリダイゼーション分析を用いてビフィドバクテリウムアドレセンティス、Ｂ．アンギュレイタム、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．カテニュレイタム、Ｂ．デンティウム、Ｂ．インファンティス、及びＢ．ロンガムから選択されたビフィドバクテリウム種をサンプル中で検出するための、診断キットが提供される。
【００８５】
また本明細書では、上述のＤＮＡプライマー、並びにＰＣＲ分析に必要な１種又は複数の手段であって、例えばポリメラーゼや重合液、オイルオーバーレイ、反応容器、及び増幅ＤＮＡを検出する手段などのセットを含み、ＰＣＲ分析を用いて上述のビフィドバクテリウム種をサンプル中で検出するための、診断キットも提供する。
【実施例】
【００８６】
（実施例１）
ビフィズス菌用に開発されたプローブ及びプライマーの確認
種々のビフィドバクテリウム種の相対量に関するアッセイを、確認するのに使用される細菌株を、表２に列挙する。
【００８７】
【表２】
【００８８】
ＡＴＣＣ：米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）；ＤＳＭ：ドイツ微生物培養細胞コレクションセンター（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）、ドイツ；ＬＭＧ：微生物学研究室（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ヘント大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｔ）、ベルギー；ＮＣＩＭＢ：英国菌株保存機関（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ）、英国。
【００８９】
全てのビフィズス菌株を、３７℃のＭａｎｎ Ｒｏｇｏｓａ Ｓｈａｒｐ（ＭＲＳ）ブロス（Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、英国）培地中で２４時間、嫌気性条件下で培養した。オーバーナイト培養物を、さら処理するまで−２０℃で保存した。
【００９０】
５ｍｌの凍結させたオーバーナイト培養物を氷水中で解凍することにより、ＤＮＡを細菌培養物から抽出した。その後、培養物を、４０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離して（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ７、Ｄｕ Ｐｏｎｔ、Ｓｔｅｖｅｎａｇｅ、英国）、細菌細胞をペレット化した。ペレットを、１ｍｌのＴＥＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、その後、４０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。上澄みを除去し、ペレットを、ＴＨＭＳ（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５％（ｗ／ｖ）スクロース）１ｍｌ中に再懸濁した。この懸濁液を、２ｍｌのエッペンドルフチューブに移した後、２００μｌのリゾチーム（０．１ｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ＤＥ）及び４０μｌのムタノリシン（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ、ＤＥ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。引き続き、溶液を、１００００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した（Ｓｉｇｍａ １−１５、Ｓｉｇｍａ Ｌａｂｏｒｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｏｓｔｅｒｏｄｅ ａｍ Ｈａｒｚ、ＤＥ）。上澄みを除去し、ペレットを、１００μｌのＴＨＭＳ中に再懸濁し、そこに、４００μｌのＴＥＳ（０．５％のＳＤＳを含む）及びプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＤＥ）７．５μｌを添加した。この混合物を撹拌し、６５℃で３０分間インキュベートした。引き続き、標準フェノール／クロロホルム抽出を行い、その後、２．５μｌのＲＮａｓｅ Ａ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＤＥ）で、３７℃で３０分間処理した。引き続き、２体積の氷冷エタノール（９６％）及び３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）０．１体積を添加した後に、少なくとも３０分間、−２０℃で保存することによって、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿した溶液を、１３０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離し、その上澄みを、５００μｌの７０％エタノールで洗浄し、その後、１３０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを室温で空気乾燥した。ＤＮＡを、１００μｌの滅菌ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）中に再懸濁し、−２０℃で保存した。
【００９１】
第１に、各二重５’ヌクレアーゼアッセイの特異性について、種々の株（表２参照）の２５μｌ増幅を行うことによって試験した。これらの２５μｌ ＰＣＲ反応を、２．５μｌのＤＮＡテンプレート、１２．５μｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、各プライマー９００ｎＭ、及び各プローブ２００ｎＭを使用して実施し、その後、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｐｒｏｆｉｌｅ、即ち５０℃で２分、９５℃で１０分経た後に、９５℃で１５秒、６０℃で１分間の４５サイクルからなるプロフィルを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｉｅｕｗｅｒｋｅｒｋ ａ／ｄ ＩＪｓｓｅｌ、ＮＬ）上で実行した。そのために開発された５’ヌクレアーゼのアッセイの全ては、ビフィドバクテリウム種に特異的であり、ビフィズス菌の総量を決定するための５’ヌクレアーゼアッセイは、プロピオン酸菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又は乳酸杆菌などの株以外の、試験をした全てのビフィドバクテリウム種を検出した。Ｂ．カテニュレイタムに関する５’ヌクレアーゼアッセイも、Ｂ．シュードカテニュレイタムを検出することに留意すべきである。さらに、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅで処理したサンプルについて試験をし、汚染されたＲＮＡがアッセイ中に検出されないことを確かめた。
【００９２】
第２に、Ｂ．アドレセンティス、Ｂ．アンギュレイタム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．カテニュレイタム、Ｂ．デンティウム、Ｂ．インファンティス、及びＢ．ロンガムからの個体培養混合物を調製して、この混合物全体が確実に約１００％になるようにした。この場合、テンプレートとしての役割を果たす種々のビフィドバクテリウム種同士の競合は、除外することができる。これは確かに、図１からわかるように、混合物中の各ビフィドバクテリウム種について決定された量、並びに混合物中のビフィドバクテリウム種の総量を示すケースである。
【００９３】
異なる種類の５’ヌクレアーゼアッセイに関する再現性及び反復性に関するＣＶ値を決定し、これらを表３に見ることができる。
【００９４】
【表３】
【００９５】
ａ５’ヌクレアーゼアッセイが、「従来の」ＰＣＲよりも感受性を有する回数。
ｂ再現性は、個体培養物（１００％）１０個について試験を行い、得られた結果に基づいてＣＶ（％）を計算することによって決定する。
ｃ反復性は、個体培養物（１００％）４個についてそれぞれ３回試験を行い、得られた結果に基づいてＣＶ（％）を計算することによって決定する。
【００９６】
開発された５’ヌクレアーゼアッセイを、従来の定性種特異的ＰＣＲ（Ｍａｔｓｕｋｉ，Ｔ．，Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｒ．Ｔａｎａｋａ，Ｍ．Ｆｕｋｕｄａ，及びＨ．Ｏｙａｉｚｕ．１９９９．１６Ｓ ｒＲＮＡ−遺伝子−標的種特異的プライマーで試験をしたヒト腸管微生物叢におけるビフィドバクテリウム種の分布（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｗｉｔｈ １６Ｓ ｒＲＮＡ−ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：４５０６−４５１２）によって記述されるプライマーを使用する）と比較して、種々のアッセイの感受性を決定すると共に、偽陽性結果であるか又は偽陰性結果であるかチェックした。表３は、従来の種特異的ＰＣＲに対し、５’ヌクレアーゼアッセイが異なる感受性であることを示す。表４は、二重５’ヌクレアーゼアッセイで使用される、最終の最適なプライマー及びプローブ濃度を示す。
【００９７】
【表４】
【００９８】
（実施例２）
臨床試験
この研究は、２つの介入群に関する二重盲検プラセボ対照多施設治験であった。生後２８日から９０日の、完全に調合乳で保育した乳児を、ドイツの４カ所の病院から採用した。乳児を、その出生時体重が２６００ｇから４５００ｇの間にある場合には研究に組み入れ、少なくとも４週間完全に調合乳で保育し、その後、介入期間を開始した。先天性異常のある乳児、或いは牛乳アレルギーが確認され又は疑われる乳児、多子出産によって生まれた乳児、この研究の開始前に抗生物質を２週間未満与えた乳児、及びこの研究の開始前に任意のプロバイオティック又はプレバイオティック調合乳で１カ月未満保育された乳児は、この研究から除外した。登録後、乳児を無作為に、２つの治療群の一方に、即ち０．８ｇ／１００ｍｌのガラクト−オリゴ糖及びフルクト−多糖が補われた乳児用調合乳を与えた群（ＧＦＳＦ群）と、標準的な乳児用調合乳を与えた群（ＳＦ群）との一方に割り当てた。この調合乳の多量養素組成を、表５に示す。
【００９９】
【表５】
【０１００】
母乳で保育した乳児の群は、参照群（ＢＦ群）として組み入れた。研究期間の開始後３日以内、４週間後、及び研究期間の終了時（６週間）に、便のサンプルを収集した。この研究は、４つの病院の医学倫理委員会により承認済みであった。説明承諾書は、研究開始前に両親から得た。
【０１０１】
便のサンプルを氷水中で解凍することによって、核酸を便から単離し、その後、ＰＢＳ（０．３７Ｍ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４［ｐＨ７．４］）中に１０×（ｗ／ｖ）希釈し、ストマッカー（ＩＵＬ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，スペイン）を使用して１０分間均質化した。均質化した便を、実際のＤＮＡ単離前に、−２０℃で保存した。抽出は、均質化した便のサンプル１ｍｌを氷水中で解凍することによって開始し、その後、１１００ｒｐｍで１分間遠心分離して、細片及び大きい粒子を除去した。上澄みを新しい試験管に移し、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。引き続き、ペレットを、１ｍｌのＴＮ１５０（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、０．３ｇのジルコニウムビーズ（直径０．１ｍｍ、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＵＳ）が入っている滅菌した試験管内に移した。これらの懸濁液に、ＴＥ緩衝フェノール（ｐＨ±７．５）１５０μｌを添加し、サンプルを、５０００ｒｐｍで３分間、ミニビーズビーター（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＵＳ）に入れた。ビーズによる叩出しの後、サンプルを即座に氷上で冷却し、その後、１５０μｌのクロロホルムを添加した。サンプルを短時間撹拌し、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上相を、清浄な２ｍｌのエッペンドルフ管に移し、フェノール／クロロホルム抽出を開始した。フェノール−クロロホルム抽出の後、１ｍｌの氷冷エタノール（９６％）及び５０μｌの３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を添加した後に、サンプルを−２０℃で少なくとも３０分間置くことにより、ＤＮＡの沈殿を行った。引き続いてこのサンプルを、１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、５００μｌの７０％エタノールで洗浄した。１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄みを廃棄し、ペレットを室温で空気乾燥した。ＤＮＡを、１００μｌの滅菌ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）に再懸濁し、−２０℃で保存した。
【０１０２】
便のサンプル中の、種々のビフィドバクテリウム種の相対的な定量を行うため、二重５’ヌクレアーゼアッセイを使用する。それぞれの種の相対量は、Ｌｉｕ他、２００２に従って計算する。簡単に言うと、各増幅曲線の効率は、式Ｅ＝（閾値Ａ／閾値Ｂ）−（Ｃｔ，Ａ−Ｃｔ，Ｂ）−１によって別々に計算した。計算された効率の助けを借りて、ＤＮＡの初期量（Ｒ０）を、Ｒ０＝閾値／（１＋Ｅ）Ｃｔによって計算する。次いでビフィドバクテリウム種のＤＮＡの初期量を、全てのビフィドバクテリウム種のＤＮＡの初期量で割ることができる。その後、得られた比を、１００％に設定された個体培養の比の助けを借りて正規化する。
【０１０３】
ビフィズス菌の総量も、初めに述べたようにＦＩＳＨの助けを借りて決定した（Ｌａｎｇｅｎｄｉｊｋ，Ｆ．Ｓｃｈｕｔ，Ｇ．Ｊ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｇ．Ｃ．Ｒａａｎｇｓ，Ｇ．Ｒ．Ｋａｍｐｈｕｉｓ，Ｍ．Ｈ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＧ．Ｗ．Ｗｅｌｌｉｎｇ「属特異的１６Ｓ ｒＲＮＡ標的プローブによるビフィドバクテリウム種の定量蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及びその便サンプルへの適用（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．ｗｉｔｈ ｇｅｎｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ １６Ｓ ｒＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｅｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ）」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（８）：３０６９−７５（１９９５））。
【０１０４】
全細菌のパーセンテージとしてのビフィドバクテリウム属のパーセンテージは、ＢＦ、ＳＦ、及びＧＦＳＦ群でそれぞれ７５、４７、及び６８％であり、これは、難消化性炭水化物の混合物で保育されたＧＦＳＦ群が、ＳＦ群の場合よりも、ＢＦ群の場合と同様により多くのビフィズス菌性叢を有することを実証している。
【０１０５】
表６に、研究開始時並びに研究終了時での、種々の群におけるそれぞれの種の蔓延率を示す。表７には、ビフィズス菌の総量に対するビフィドバクテリア種のパーセンテージを示す。
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
【表７】
【０１０８】
多種類のビフィドバクテリウム種が、３つの異なる群に存在する。さらに、標準調合乳を与えた乳児とは対照的に、母乳で保育された乳児とＧＦＳＦを与えた乳児とに、Ｂ．アドレセンティスの蔓延率及び量の著しい低下が見られる。保育から６週間後、Ｂ．アドレセンティスの蔓延率及びパーセンテージは、ＧＦＳＦ又は母乳で保育した赤ちゃんの場合よりも、ＳＦで保育した赤ちゃんの場合のほうが非常に高い。ＧＦＳＦ乳児の便サンプルの分析は、母乳で保育した乳児と同様の多種類のビフィズス菌叢を示しており、１種のみ又は２〜３種の刺激は観察されない。Ｂ．アドレセンティスに対する影響の他、母乳で保育した乳児及びＧＦＳＦを与えた乳児のプロフィルは、標準調合乳を与えた乳児のプロフィルよりも少ないＢ．カテニュレイタム（＋Ｂ．シュードカテニュレイタム）であることも示した。Ｂ．インファンティス及びＢ．ロンガムは、母乳で保育された乳児、並びに標準調合乳（ＳＦ）又はプレバイオティックス（ＧＦＳＦ）が補われた標準調合乳を与えた乳児において、大部分を占めるようである。また、Ｂ．ブレーベは、３つの群全てで優勢であるが、母乳を与えた群では、全ビフィズス菌の％としてのＢ．ブレーベが、ＳＦ（４．９％）群及びＧＦＳＦ（５．４％）群の場合よりも高かった。
【０１０９】
（実施例３）
アレルギーに関する動物実験
特定の病原体を持たないオスＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、オランダ）から得た。食品及び水を随意に与え、そのマウスが６〜９週齢になったときに使用した。全ての実験は、ユトレヒト大学（オランダ）の動物倫理委員会により承認済みであった。
【０１１０】
卵白アルブミン（グレードＶ）及び塩化アセチル−β−メチルコリン（メタコリン）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。水酸化アルミニウム（ＡｌｕｍＩｍｊｅｃｔ）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１１１】
マウスを、第０日と第７日目に、２回の腹腔内注射により、１００μｌの生理食塩水中２．２５ｍｇの水酸化アルミニウムに吸着させた１０μｇの卵白アルブミンで、又は生理食塩水単独で感作した。マウスに対し、第３５日、３８日、及び４１日目に、プレキシグラス曝露チャンバ内で卵白アルブミンエアロゾルの吸入を２０分間行った。エアロゾルは、Ｐａｒｉ ＬＣ Ｓｔａｒネブライザ（Ｐａｒｉ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）を使用して、生理食塩水に溶かした卵白溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を噴霧することによって生成した。
【０１１２】
マウスを、１×１０ｅ９（ＣＦＵ）のビフィドバクテリウムブレーベと、ガラクトオリゴ糖及びフルクト多糖の混合物（９：１）２５ｍｇとで、胃管栄養法（０．２ｍｌの生理食塩水）により経口的に、第２８日目から実験終了時（即ち第４２日目）まで毎日処理した。対照として、０．２ｍｌの生理食塩水を、胃管栄養法によって投与した。
【０１１３】
吸入された噴霧化メタコリンに対する気道応答性を、全身プレチスモグラフィ（ＢＵＸＣＯ、ＥＭＫＡ、Ｐａｒｉｓ、フランス）を使用して、意識のある抑制されていないマウスに最終エアロゾル曝露を行った後２４時間で決定した。気道応答は、呼吸抵抗指数（ＰｅｎＨ）として表した。
【０１１４】
統計分析：メタコリンに対する気道応答曲線を、一般線形モデル又は反復測定によって統計的に分析し、その後、群同士の事後比較を行った。細胞計数を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用して統計的に分析した（Ｓｉｅｇｅｌ，Ｓ．，Ｃａｓｔｅｌｌａｎ Ｊｒ．Ｎ Ｊ，１９９８「行動科学に関するノンパラメトリック統計（Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」第２版、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）。全てのその他の分析は、ステューデントｔ検定を使用して行った（Ａｂｒａｍｏｗｉｔｚ，Ｍ．，Ｓｔｅｇｕｍ，Ｉ．Ａ．，１９７２、「数学関数の手引き（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）Ｄｏｖｅｒ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ」。確率の値がｐ＜０．０５であるときに、統計的に有意であると見なした。
【０１１５】
気道応答性亢進に関する結果：気道応答性亢進に関する測定値は、対照に比べ、Ｂ．ブレーベ＋ガラクロオリゴ糖及びフルクト多糖の混合物を与えたマウスのほうが、統計的に低下した気道応答性亢進を示すことを示しており、これは喘息反応が低下したことを示すものである。
【０１１６】
図２では、Ｂ．Ｂｒｅｖｅ＋ＧＯＳ／ＦＯＳの混合物の組合せを与えたマウスと、代わりに生理食塩水を与えたマウスの対照群とに関し、その気道応答性亢進を、メタコリン濃度に対する相対ＰｅｎＨ（呼吸抵抗指数）としてプロットする。プロットされた相対ＰｅｎＨの値は、卵白アルブミンで感作されていないマウスに関して得られたブランク値を差し引き、メタコリンが最高濃度であるときに、対照群に関して得られた値に正規化した後に得られた。
【０１１７】
下記の全ての実施例の組成物はさらに、当技術分野で知られているように、且つ国際的指針に従って、ミネラル、微量の元素、及びビタミン、コリン、タウリン、カルニチン、及び／又はミオイノシトール、或いはこれらの混合物を含有することができる。さらに、有機酸、香料、及び／又は着色剤を含んでも含まなくてもよい。
【０１１８】
（実施例４）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１３．１ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
８エネルギー％タンパク質 １．４ｇ（カゼイン乳清混合物）
４５エネルギー％消化性炭水化物 ７．５ｇ
４７エネルギー％脂肪 ３．５ｇ
ＧＯＳ（９０％ガラクト−オリゴ糖、Ｂｏｒｃｕｌｏ Ｄｏｍｏ ＮＬ）／ポリフルクトース（１０％イヌリン、Ｒａｆｔｉｌｉｎ ＨＰ、Ｏｒａｆｔｉ ＢＥ） ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ：１．３×１０８ｃｆｕ
【０１１９】
（実施例５）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１４ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質 １．８ｇ（カゼイン乳清混合物）
４６エネルギー％消化性炭水化物 ８．０ｇ
４４エネルギー％脂肪 ３．４ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース（実施例４参照） ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ １．４×１０８ｃｆｕ
【０１２０】
（実施例６）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１６．１ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質 １．９ｇ（カゼイン乳清混合物）
５１エネルギー％消化性炭水化物 ９．９ｇ
３９エネルギー％脂肪 ３．３ｇ
ＦＯＳ（Ｒａｆｔｉｌｉｎ、Ｏｒａｆｔｉ）／ガラクトマンナン ９／１ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ １．６×１０８ｃｆｕ
【０１２１】
（実施例７）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１３ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質当量 １．６ｇ（加水分解した乳清タンパク質）
４２エネルギー％消化性炭水化物 ７．１ｇ
４８エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
シアリルオリゴ糖、消化性マルトデキストリン ９／１ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ ６．５×１０８ｃｆｕ／ｇ
【０１２２】
（実施例８）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質当量 １．８ｇ（加水分解した乳清タンパク質）
４２エネルギー％消化性炭水化物 ８．６ｇ
４４エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
フコ−オリゴ糖（藻類フコイダンから）、ガラクトマンナン ８／２ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ ７．５×１０８ｃｆｕ
【０１２３】
（実施例９）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５．１ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質当量 １．８ｇ（加水分解した乳清タンパク質）
４２エネルギー％消化性炭水化物 ８．６ｇ
４４エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
マンノ−オリゴ糖、アラビノガラクタン ９／１ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ １．５×１０８ｃｆｕ
【０１２４】
（実施例１０）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５．２ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質 １．７ｇ（加水分解した乳清タンパク質）
４８エネルギー％消化性炭水化物 ８．４ｇ
４２エネルギー％脂肪 ３．３ｇ
ＧＯＳ／ガラクトルオン酸オリゴ−糖／／ポリフルクトース ７／２／１ １．０ｇ
Ｂ．ブレーベ ７．５×１０８ｃｆｕ
【０１２５】
（実施例１１）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５．８ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１１エネルギー％タンパク質 １．９ｇ（加水分解した乳清タンパク質）
４８エネルギー％消化性炭水化物 ８．７ｇ
４１エネルギー％脂肪 ３．３ｇ
キシロオリゴ糖／ガラクタン ９／１ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ ８×１０８ｃｆｕ
【０１２６】
（実施例１２）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質 １．７ｇ（カゼイン乳清混合物）
４８エネルギー％消化性炭水化物 ８．１ｇ
４２エネルギー％脂肪 ３．１ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ９／１ ０．８ｇ
ガラクトマンナン ０．４２
Ｂ．ブレーベ １．５×１０８ｃｆｕ
【０１２７】
（実施例１３）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５．９ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１３エネルギー％タンパク質 ２．２ｇ（カゼイン乳清混合物）
４９エネルギー％消化性炭水化物 ８．６ｇ
３７エネルギー％脂肪 ３．０ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ９／１ ０．８ｇ
ガラクトマンナン ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ １．６×１０８ｃｆｕ
【０１２８】
（実施例１４）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１３．５ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
９エネルギー％タンパク質当量 １．５ｇ（加水分解した乳清タンパク質）
４２エネルギー％消化性炭水化物 ６．９ｇ
４９エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース／シアリルラクトース ７／２／１ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ １．４×１０８ｃｆｕ
【０１２９】
（実施例１５）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１３．７ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
９エネルギー％タンパク質当量 １．４ｇ（遊離アミノ酸）
４４エネルギー％消化性炭水化物 ７．１ｇ
４７エネルギー％脂肪 ３．４ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ６／４ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ １．４×１０８ｃｆｕ
【０１３０】
（実施例１６）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１３．５ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１１エネルギー％タンパク質 １．８ｇ（大豆タンパク質）
４０エネルギー％消化性炭水化物 ６．７ｇ
４９エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
ＧＯＳ／ガラクト−オリゴ糖／ポリフルクトース ８／１／１ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ １．４×１０８ｃｆｕ
【０１３１】
（実施例１７）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５．１ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１２エネルギー％タンパク質 ２．２ｇ（大豆タンパク質）
４３エネルギー％消化性炭水化物 ７．７ｇ
４５エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
ＦＯＳ／ガラクタン ９／１ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ １．５×１０８ｃｆｕ
【０１３２】
（実施例１８）
１００ｍｌ当たり（粉末１６．５ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１３エネルギー％タンパク質 ２．０ｇ（加水分解した乳清）
５７エネルギー％消化性炭水化物 ８．６ｇ
３０エネルギー％脂肪 ２．０ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ９／１ １．０
大豆多糖 ０．５
Ｂ．ブレーベ １．５×１０９ｃｆｕ
【０１３３】
（実施例１９）
１００ｍｌ当たり、下記の成分を含有する乳製品
１４エネルギー％タンパク質 ２．５ｇ（牛乳タンパク質）
４３エネルギー％消化性炭水化物 ７．５ｇ
４３エネルギー％脂肪 ３．４ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ７／３ １．５ｇ
Ｂ．ブレーベ ３×１０８ｃｆｕ
【０１３４】
（実施例２０）
１００ｍｌ当たり（粉末１５．４ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１１エネルギー％タンパク質 ２．０ｇ（加水分解したコラーゲン及び大豆タンパク質）
４６エネルギー％消化性炭水化物 ８．６ｇ
４３エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ３／１ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ ６×１０８ｃｆｕ
【０１３５】
（実施例２１）
サプリメント：３ｇの粉末を１００ｍｌの乳に添加したもので、下記の成分を含有する
２８エネルギー％タンパク質 ０．７ｇ（カゼイン乳清混合物）
７２エネルギー％消化性炭水化物 ２．０ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ６５／３５ ０．３ｇ
Ｂ．ブレーベ ３×１０９ｃｆｕ
【０１３６】
（実施例２２）
１ｇ当たり、下記の成分を含有するサプリメントであって、０．４〜０．８ｇを１００ｍｌの乳に添加したもの
０．２６ｇ ガラクトマンナン
０．４４ｇ 消化性炭水化物
０．３ｇ ＧＯＳ／ポリフルクトース ８５／１５
１．０×１０９ｃｆｕ Ｂ．ブレーベ
【０１３７】
（実施例２３）
１００ｍｌ当たり下記の成分を含有するサプリメント
１００エネルギー％ 消化性炭水化物 ２．２ｇ
ミネラル：Ｋ、Ｎａ、Ｃｌ
浸透圧モル濃度 ２６１ｍＯｓｍ／ｌ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ５５／４５ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ １×１０９ｃｆｕ
【０１３８】
（実施例２４）
１００ｇ当たり下記の成分を含有する乳児用調合乳（８５ｇを２４０ｍｌの乳に添加した）
４エネルギー％タンパク質 ４．７ｇ（牛乳タンパク質）
５３エネルギー％消化性炭水化物 ６８ｇ
４３エネルギー％脂肪 ２４．６ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ９／１ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ １．２×１０９ｃｆｕ
【０１３９】
（実施例２５）
１００ｍｌ当たりの乳児栄養素（経管栄養）
９エネルギー％タンパク質 ３．４ｇ（カゼイン）
５０エネルギー％炭水化物 １８．８ｇ
４１エネルギー％脂肪 ８ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ７／３ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ ５×１０８ｃｆｕ
【０１４０】
（実施例２６）
製品１００ｍｌ当たり、下記の成分を含有する乳児栄養素
１１エネルギー％タンパク質 ２．８ｇ（カゼイン）
４９エネルギー％炭水化物 １２．３ｇ
４０エネルギー％脂肪 ４．４ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ８５／１５ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ ５×１０８ｃｆｕ
【０１４１】
（実施例２７）
乾燥製品１００ｇ当たり、下記の成分を含有する、米粉からなる乳児栄養素（スプーン４〜７杯分を、２００ｍｌの温めた乳児用調合乳、フォローアップミルク、幼児向けミルク、又は牛乳に添加した）
７．４ｇ タンパク質（植物性）
８３ｇ 炭水化物
０．５ｇ 脂肪
３ｇ １．５ｇのＧＯＳ／ポリフルクトース ９／１を含む食物繊維
１×１０１０ｃｆｕ Ｂ．ブレーベ
【０１４２】
（実施例２８）
乾燥製品１００ｇ当たり、下記の成分を含有する、予備調理されたフレーク（小麦、ライ麦、米、大麦、トウモロコシ、オート麦、ソバ）からなる乳児栄養素（スプーン５〜７杯分を、２５０ｍｌの温めた調合乳、フォローアップミルク、幼児向けミルク、又は牛乳に添加した）
９．５ｇ タンパク質（植物性）
７４ｇ 炭水化物
２．０ｇ 脂肪
３ｇ １．５ｇのＧＯＳ／ポリフルクトース ８／２を含む食物繊維
２×１０１０ｃｆｕ Ｂ．ブレーベ
【０１４３】
（実施例２９）
１００ｍｌ当たり下記の成分を含有する、均質化した野菜又は果物からなる乳児栄養素
ＧＯＳ／ポリフルクトース ７５／２５ ２．０ｇ
Ｂ．ブレーベ ２×１０９ｃｆｕ
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】
【図２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳児向けの、特に人工栄養保育される乳児向けの、プロバイオティック及びプレバイオティックを含む製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳児は、生まれたときには腸内細菌叢を持っていない。分娩中及びその後の授乳時に母親と接触する結果、腸内細菌叢が急速に発生し、増大する。腸内細菌叢は、その発生中は未成熟なままであり、その平衡状態は脆弱で、直ぐに変化し易く、したがって病原体の存在下、疾患及び障害を引き起こし易い。母乳で保育された乳児は、人工栄養保育された乳児よりも、感染症又は疾患に罹りにくいことがわかっている。そのため、母乳で保育された赤ちゃんは、人工栄養保育された乳児よりも、罹患率と持続期間との両方の観点から胃腸感染症に罹りにくく、アレルギーや湿疹、アレルギー誘発性喘息などのアトピー性疾患に罹りにくく、便秘にもなりにくい。
【０００３】
一般に、母乳で保育された乳児の腸内細菌叢は、主にビフィズス菌（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）と乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）とからなる。母乳には、乳児の腸内ビフィズス菌の成長因子である、人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）が含まれている。調合乳で保育された乳児の腸内細菌叢は、より多様であり、一般に、より多くのバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、及び腸内細菌種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐｅｃｉｅｓ）が含まれる。調合乳で保育された乳児は、母乳で保育された乳児のビフィズス菌の数の、約１０分の１からおおよそ３分の２を有する。ビフィズス菌は、十分バランスのとれた腸内微生物叢を維持するのに重要と考えられ、このビフィズス菌には、下痢及び腸内感染の予防及び／又は治療も含めたいくつかの健康増進効果があると見なされてきた。さらにビフィズス菌は、宿主の免疫系において、ある役割を演ずることが示されている。
【０００４】
乳児の腸内細菌叢は、プロバイオティックス又はプレバイオティックスの消費のように、食物の栄養の変化によって変わる可能性がある。プロバイオティックスによる手法の例として、ＥＰ−Ａ−０，９０４，７８４は、ビフィズス菌株（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ）も含めた微生物株の混合物を投与することについて記述している。しかしこれに関連する問題とは、微生物の混合物が、何らかの健康上の利点をもたらしはするが、その活動が広範にわたるので、人工栄養保育された乳児の依然として未成熟な腸内細菌叢に、悪影響を及ぼす可能性もあることである。さらに、多くのプロバイオティックサプリメントは、その保存期間が短く、そこに含有される生きている微生物の数が少なすぎて、期待されるプロバイオティック効果が得られない。
【０００５】
プレバイオティックスは、結腸内の１種又は複数の細菌の成長及び／又は活動を選択的に刺激し、それによって宿主に良い影響を及ぼす難消化性食品成分と定義される（Ｇｉｂｓｏｎ及びＲｏｂｅｒｆｒｏｉｄ、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５：１４０１−１４１２１９９５）。哺乳瓶で保育された赤ちゃんの腸内細菌叢を改善する好ましい方法は、特定の難消化性オリゴ糖によって、即ちプレバイオティックスによって、この哺乳瓶で保育された乳児の腸内に既に存在するビフィズス菌を、選択的に刺激することである。また、オリゴ糖と多糖との混合物も、例えばＷＯ００／０８９４８にプレバイオティックスとして提示されている。１つの例は、ガラクト−オリゴ糖とフルクト多糖との組合せである。これらのプレバイオティックスを含有する調合乳を与えられた乳児のビフィズス菌レベルは、標準的な調合乳の場合に比べて高くなることが示された（例えば、Ｍｏｒｏ他、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．３４：２９１−２９５、２００２参照）。
【０００６】
現在までの手法は、ビフィズス菌を全体的に、即ち属レベルで増進させることであった。ビフィドバクテリウム属（ｇｅｎｕｓ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、代謝、酵素活性、オリゴ−及び多糖の利用率、細胞壁の組成、宿主の免疫系との相互作用が異なる多くの様々な種からなる。したがって、乳児に対し、全てのビフィドバクテリウム種（ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が同じ機能上の効果を及ぼすとは限らないことが予測できる。様々なビフィドバクテリウム種の例は、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ビフィダム）、Ｂ．アニマリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、及びＢ．デンティウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）である。Ｂ．アドレセンティスは、成人の細菌叢においてより広く行き渡っており、健康な乳児及び赤ちゃんの大便においてはそれほど一般的ではない。Ｂ．アニマリス／Ｂ．ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）は、人の場合、自然に生ずるものではなく、Ｂ．デンティウムは病原菌である。健康な乳児では、ビフィズス菌叢が、主にビフィドバクテリウムインファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ブレーベ、及びＢ．ロンガムからなる。Ｋａｌｌｉｏｍａｋｉ他（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｆｅｂ；３（１）：１５−２０、及びそこに引用される参考文献）は、アレルギー体質の乳児が、成人に適したビフィズス菌叢の棲み家となるのに対し、典型的な乳児のビフィズス菌叢は、健康な乳児に見られ、ある特定のビフィズス菌種の出現とアレルギー発症の機会との間には相関関係が示されることを報告した。これらの結果は、赤ちゃんの結腸でのビフィドバクテリウム属の刺激が、十分とは考えられないことを示している。目標は、母乳で保育された赤ちゃんの菌叢と同じような、哺乳瓶で保育された乳児の菌叢を、種のレベルで実現することである。
【０００７】
本発明において、「母乳で保育された乳児」とは、ヒトの母乳だけで保育された乳児を指す。「人工栄養保育された、又は一部母乳で保育された乳児」とは、ヒトの母乳を与えていない乳児、又はヒトの母乳を与えるのに留まらない乳児を意味する。この定義は、１日当たり少なくとも１本の哺乳瓶の内容物、即ち１日当たり少なくとも８０ｍｌの調合乳が与えられ、存在する場合には残りの栄養素が、固体栄養素又は液体栄養素から提供され、例えば母乳などから提供される乳児、即ち一部母乳で保育された乳児を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
難消化性炭水化物の混合物を使用して、ビフィズス菌レベルを増大させることにより、ビフィズス菌集団は、より乳児に適した集団、即ちＢ．カテニュレイタム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、Ｂ．シュードカテニュレイタム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、及びＢ．アドレセンティスが低い集団に調節されるのに対し、標準的な調合乳で保育された乳児は、より成人に適した菌叢であってその大部分がＢ．カテニュレイタム、Ｂ．シュードカテニュレイタム、及びＢ．アドレセンティスであるものを示すこともわかった。また、そのようなプレバイオティックで保育された乳児のビフィズス菌集団は、依然としてある特定の微生物、即ちビフィドバクテリウムブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）に欠けていることもわかった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明の一態様では、ビフィドバクテリウムブレーベと、難消化性炭水化物プレバイオティックスの混合物とを含む製剤が提供される。そのような製剤は、乳児の胃腸管内で、種のレベルでビフィズス菌集団を調節するのに有利であり、且つ非常に適していることがわかった。さらに驚くべきことに、そのような製剤によって十分調節されるので、Ｂ．ブレーベ種以外のビフィズス菌種を添加することは必ずしも必要でないことがわかった。
【００１０】
本発明の別の態様では、ビフィドバクテリウムブレーベと、難消化性炭水化物プレバイオティックスの混合物とを含む製剤であって、この難消化性炭水化物の混合物が、少なくとも２種の異なる実質的に可溶性の炭水化物成分Ａ及びＢを含有しているものが提供される。
【００１１】
本発明の別の態様では、人工栄養保育される乳児又は一部母乳で保育される乳児のための製剤の使用が提供される。
【００１２】
本発明の他の態様では、人工栄養保育される乳児又は一部母乳で保育される乳児の胃腸管でビフィズス菌種集団の調節を行う組成物を製造するための、製剤の使用が提供される。
【００１３】
本発明の他の態様では、免疫状態の予防又は治療用の組成物を製造するための、製剤の使用が提供される。
【００１４】
本発明の他の態様では、人工栄養保育される乳児又は一部母乳で保育される乳児の胃腸管で、ビフィドバクテリウムカテニュレイタム、Ｂ．シュードカテニュレイタム、及び／又はビフィドバクテリウムアドレセンティスの集団を調節するための、炭水化物混合物の使用が提供される。
【００１５】
本発明のさらに別の態様では、ヒト、特にヒト乳児で見出されるビフィドバクテリウム属の種を、種特異的に検出し定量的にアッセイを行う方法、並びにビフィドバクテリウム種を診断し定量するためのキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（製剤）
１）ビフィドバクテリウムブレーベ
ビフィドバクテリウムブレーベは、本発明の本質的な要素である。この細菌は、人工栄養保育された乳児の場合に限られた量で存在することが、本出願人の検出方法によって見出された。したがって、この細菌を炭水化物混合物と共に投与することにより、母乳で保育された乳児の胃腸管に存在する場合と同等のレベルまで、ビフィドバクテリウム種集団を正常化することが可能になる。
【００１７】
好ましいビフィドバクテリウムブレーベ株は、健康な、母乳で保育された乳児の大便からの、分離株から選択されたものである。典型的な場合、これらは乳酸菌の生産者から市販されているが、大便から直接分離し、同定し、特徴付けし、生成することもできる。市販されているＢ．ブレーベの例は、ＲｈｏｄｉａからのＢ．ブレーベＢｂ−０３、森永からのＢ．ブレーベＭＶ−１６、及びＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｒｏｓｅｌｌ，ＬａｌｌｅｍａｎｄからのＢ．ブレーベであるが、Ｂ．ブレーベは、ＤＳＭ ２００９１やＬＭＧ １１６１３など、カルチャーコレクションから得ることもできる。
【００１８】
本発明の製剤中のＢ．ブレーベの量は、可溶性の難消化性炭水化物の総量を基にすることができ、これら炭水化物全体の１ｇ当たり、細菌が好ましくは１０７から１０１１ｃｆｕであり、より好ましくは１０８から１０１０ｃｆｕである。製剤をサプリメントとして使用する場合、ビフィドバクテリウムブレーベは、１×１０６から１．５×１０１１ｃｆｕ／ｇの量でサプリメント中に存在することが最も好ましく、３×１０７から５×１０１０ｃｆｕ／ｇであることが好ましく、５×１０８から１×１０１０ｃｆｕ／ｇであることがより好ましい。製剤を（完全）乳児栄養素として使用する場合、Ｂ．ブレーベは、１×１０４から１×１０１０ｃｆｕ／ｇの量で栄養素中に存在することが最も好ましく、５×１０６から３×１０９ｃｆｕ／ｇであることが好ましく、乳児栄養素１ｇ当たり１×１０７から５×１０８ｃｆｕであることがより好ましい。これらの濃度は、１日量が１×１０６から１．５×１０１１ｃｆｕ／ｇであり、好ましくは３×１０７から５×１０１０ｃｆｕ／ｇであり、より好ましくは５×１０８から１×１０１０ｃｆｕ／ｇになるような方法で選択される。
【００１９】
２）難消化性炭水化物プレバイオティックスの混合物
難消化性炭水化物プレバイオティックスの混合物も、本発明の本質的な要素である。「難消化性」とは、炭水化物が、胃腸管内消化されないままであり、吸収されずに大腸に到達することを意味する。
【００２０】
本発明では、難消化性炭水化物の混合物が、少なくとも２種の異なる、本質的に可溶性の炭水化物成分Ａ及びＢであって、胃腸管内で消化されないままであり且つ吸収されずに大腸に到達するものを含有する。本発明による炭水化物混合物は、これら２種の炭水化物成分Ａ及びＢのみからなるものでもよい。
【００２１】
少なくとも２種の難消化性可溶性炭水化物成分Ａ及びＢの混合物では、炭水化物成分Ａが、炭水化物成分Ａ及びＢの合計の５から９５重量％の量で存在する。さらに、成分Ａ及びＢの難消化性可溶性炭水化物全体の、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％は、二糖からエイコサ糖（２０個の単糖単位を有する多糖）の中から選択され、その残りは、難消化性単糖及び難消化性多糖であって、２０単位よりも長いものでよい。また、可溶性の難消化性炭水化物全体の、９５％を超える量、好ましくは９８％を超える量は、１００単位以下の鎖長を有することも好ましい。パーセンテージ及び平均について、この記述の中で述べる場合は、別の基準を指すことが明らかでない限り、又は他に特に指定しない限り、重量に基づくパーセンテージ及び平均であることを意味する。
【００２２】
各成分の炭水化物は、下記の３つの点で異なると考えられる。
（ｉ）炭水化物の単糖単位の（平均）数であり、成分Ａは、その平均鎖長が、成分Ｂの鎖長よりも少なくとも５単糖単位だけ少ない；これは、Ａ及びＢの炭水化物が同じ構造単位を有する場合、即ち鎖長のみ異なる同族体の混合物を形成する場合、この同族体の分布は２つの最大値を持たねばならず、１つの最大値は７よりも下であり、且つ１つは７よりも上であり、これら２つの最大値は、少なくとも５単位離れていることを意味し；６単位までの炭水化物（六糖）は成分Ａの一部であり、７単位から先の炭水化物（七糖）は成分Ｂの一部である。
（ｉｉ）炭水化物の単糖単位の構造であり、成分Ａは、成分Ｂとは異なる構造単位から構成され；Ａ及び／又はＢが、異なる単糖単位を繰り返した組合せから構成される場合、例えばガラクトマンナン及びアラビノガラクタンの場合、２成分の単糖単位の少なくとも５０％は、異なるべきである（上記の例では、どちらか又は両方が、５０％未満の無水ガラクトースを有するべきである）。
（ｉｉｉ）両方、即ち成分Ａ及びＢは、その（平均）鎖長と構造に差があり、この実施形態が好ましい。
【００２３】
成分Ａは、同じ炭水化物構造の、消化しにくい単糖から六糖までの中から選択することが好ましく、成分Ｂは、同じ炭水化物構造の七糖以上の多糖から選択することが好ましい。よって炭水化物成分Ａは、少なくとも１種の難消化性単糖又は少なくとも１種の難消化性オリゴ糖からなる。オリゴ糖の場合、これは２個から６個までが含まれる単糖単位を含むことが理解される。炭水化物成分Ａは、前述の糖の２種以上により形成してもよく、またそのようにすることが好ましい。したがって、そのような種類の、即ち同じ構造の、任意の数の様々な単糖及び／又はオリゴ糖からなるものでよい。
【００２４】
この好ましい実施形態によれば、炭水化物成分Ｂは、７個以上の単糖単位を含んだ少なくとも１種の多糖からなる。多糖の場合、六糖から始まるものが理解される（例えば七糖、八糖、九糖、十糖など）。多糖の鎖長には、特定の上限が無く、単糖単位が数百個又は何千個にもなった長さのものでよい。しかし、１００個を超える（約１６ｋＤ）鎖長、特に７００個（約１００ｋＤ）を超えるものは、本発明によればそれほど好ましくない。成分Ｂは、１００個を超える単糖単位を有する同族体を、５％よりも多く、又は２％以下で含有しないことが好ましい。炭水化物成分Ｂは、そのような種類のたった１つの多糖、又は好ましくは、そのような種類の、即ち同じ構造の、長さの異なる２種以上の多糖からなるものでもよい。
【００２５】
炭水化物成分Ａは、炭水化物成分Ａと炭水化物成分Ｂの合計（Ａ＋Ｂ＝１００重量％）の９５重量％までを占める。炭水化物成分Ｂは、炭水化物成分Ａと炭水化物成分Ｂの合計の、５から９５重量％を占める。好ましい実施形態によれば、成分Ａは、Ａ＋Ｂ＝１００重量％である存在する炭水化物全体の、９５から６０重量％を構成し、より好ましくは９５から８０重量％を構成し、特に９５から９０重量％を構成し、成分Ｂは、５から４０重量％、より好ましくは５から２０重量％、特に５から１０重量％を構成する。
【００２６】
本発明における可溶性炭水化物としては、Ｌ．Ｐｒｏｓｋｙ他によるＪ．Ａｓｓｏｃ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ ７１：１０１７−１０２３、１９８８に記載される方法によれば、少なくとも５０％が可溶性であるものが理解される。
【００２７】
それによって、炭水化物成分Ａ及びＢの合計の、少なくとも８０重量％の炭水化物又は糖が、プレバイオティック効果を発揮する。炭水化物成分Ａに属する炭水化物の少なくとも８０重量％と、炭水化物成分Ｂに属するものの少なくとも８０重量％も、プレバイオティック効果を発揮することが好ましい。言い換えれば、炭水化物成分Ａ及びＢのうち少なくとも８０重量％の炭水化物又は糖のそれぞれは、消化されないように大腸に到達する（したがって小腸で吸収されない）ことを目的とすることが好ましい。言い換えれば、胃腸管内の炭水化物成分Ａ及びＢのこれら炭水化物又は糖は、胃にも小腸にも吸収されず且つ消化もされず、したがって大腸に到達する。
【００２８】
本発明による、プレバイオティックとして活性な炭水化物では、消化されずに大腸に到達する（したがって小腸に吸収されない）炭水化物が理解され、これは腸内の細菌種の１つ又はその限られた数のものの成長及び／又は活性を選択的に促し、その結果、健康を増進させる。そのような炭水化物のこのプレバイオティック効果とその特定のメカニズムは、明らかな参照がなされ且つその開示を本明細書の文中に含める「Ｇ．Ｆ．Ｇｉｂｓｏｎ＆Ｍ．Ｂ．Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１９９５；１２５：１４０１−１４１２」に、記載されている。
【００２９】
それに加えて、炭水化物成分Ａ及びＢの、プレバイオティックとして活性ではない炭水化物又は糖の割合は、最大で２０重量％に達する。これらの炭水化物又は糖は、実際に可溶性であるが、消化されない形で排出することができるものを指す。これらの炭水化物は、例えば大便の量をふやし、又は水の吸着を促すという点で、物理的な影響を及ぼすことができる。
【００３０】
食事又は医薬品中の炭水化物成分Ａ及びＢを決定する割合の評価では、以下のステップを実施する。第１の段階では、全ての可溶性炭水化物を、水を用いて生成物から抽出する。この抽出物から、脂肪及びタンパク質を除去する。第２の段階では、可溶性炭水化物又は抽出物をそれぞれ、ヒト酵素、例えばヒトアミラーゼやヒト膵液、又は小腸線毛縁製剤を用いて消化する。難消化性炭水化物（この生体外実験で得られた生体内吸収性単糖を除く）の収量は、２種の炭水化物成分Ａ及びＢを構成する。その８０％は、プレバイオティックとして活性であることが示唆される。
【００３１】
したがって、本発明の製剤で使用される炭水化物混合物は、上述の意味で可溶性であり消化されない炭水化物が、本明細書で特定した基準を満たし且つ炭水化物成分Ａ及びＢを構成するものである。
【００３２】
炭水化物成分Ａは、例えば以下の炭水化物、即ちβ−ガラクト−オリゴ糖、α−ガラクト−オリゴ糖、フルクト−オリゴ糖、イヌロ−オリゴ糖、フコ−オリゴ糖、マンノ−オリゴ糖、キシロ−オリゴ糖、シアリル−オリゴ糖、Ｎ−糖タンパクオリゴ糖、Ｏ−糖タンパクオリゴ糖、糖脂質オリゴ糖、セロ−オリゴ糖、キトサン−オリゴ糖、キチン−オリゴ糖、ガラクツロノ−オリゴ糖、グルクロノ−オリゴ糖、β−グルカン（例えば１，３−）オリゴ糖、アラビノキシロ−オリゴ糖、アラビノガラクト−オリゴ糖、キシログルコ−オリゴ糖、ガラクトマンノ−オリゴ糖、ラムノ−オリゴ糖、大豆オリゴ糖（スタキオース、ラフィノース、ベルバスコース）、及びラクト−Ｎ−ネオテトラオースの１種又は複数からなるものでよく、或いは炭水化物成分Ｂは、例えば以下の炭水化物又は糖、即ちイヌリンを含めたフルクタン（フルクトサン）、ガラクタン、フコイダン、アラビナン、キシラン、キサンタン、β−グルカン、消化しにくいポリデキストロース、消化しにくいマルトデキストリン、ガラクツロナン、Ｎ−グリカン、Ｏ−グリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キシログルカン、アラビノガラクタン、アラビアガム、アルギネート、カラゲナン、ガラクトマンナン、グルコマンナン、アラビノキシラン、糖脂質グリカン、糖タンパクグリカン、プロテオグリカン、大豆多糖の１種又は複数から形成することができる。消化性炭水化物は、成分Ａ及びＢの一部では無いことに留意されたい。したがって、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、及びマルトデキストリンは、例えばガラクト−多糖やフルクト−多糖（イヌリン）などの低級同族体である場合であっても、これらの成分に含めて考えない。本発明の難消化性炭水化物は、原則としてデンプン誘導体のように、α１，４及び／又はα１，６位に結合しているグルコース単位を高い割合で含んでおらず、したがって炭水化物は消化性になる。しかし、あるデンプンタイプの多糖及びマルトデキストリンは、物理的に又は酵素によって、難消化性又は「耐性」にされ、そのようなオリゴ糖及び多糖は、十分可溶性である限り本発明に含められる。
【００３３】
オリゴ糖と多糖との選択的組合せ、即ちその結果として炭水化物成分Ａ及びＢが同時に存在することにより、大腸内の健康増進微生物を活性化することができ、且つ／又は病原微生物を、前記炭水化物成分の１種のみの場合に考えられるよりも本質的に高い効率によって、抑制することができる。したがって、炭水化物の組合せを投与することにより、正常な大腸内細菌叢の非常に素早い回復を実現することが可能であり、これを維持することが可能であり、又はストレス環境での腸内細菌叢の変化を予防的に防止することが可能であり、したがって、以前使用していた炭水化物の場合よりも効率的な方法で、大腸の細菌コロニー形成に影響を及ぼすことが可能である。
【００３４】
好ましい実施形態によれば、炭水化物成分Ａ並びに炭水化物成分Ｂの少なくとも８０重量％は、ビフィズス菌産生性であり且つ／又は乳酸菌を増進させる炭水化物からなる。そのような前記性質を有するオリゴ糖と多糖との組合せにより、オリゴ糖又は多糖のいずれかのみの場合に考えられるよりも本質的に強力な方法で、乳酸菌の成長を驚くほど促進させることができる。それによって、腸内に生来存在する乳酸菌が活性化するだけではなく、外から導入された乳酸菌の成長も、任意選択で選択的な手法であっても促進する。
【００３５】
有機酸（酢酸や乳酸など）や、ｐＨ効果、コロノザイトの刺激など、細菌そのもの及びその代謝産物を介したこの間接的な動作の他に、蠕動運動や水分、大便の質、腸粘膜への機械的動作など、直接的な物理作用にも同様に、ポジティブな影響を及ぼす。
【００３６】
したがって、炭水化物混合物は、栄養効果だけではなく、広範な活性も決定する。上述の生物学的効果の他に、下記の事項、即ち生来のミクロフローラの安定化、毒素やウイルス、細菌、真菌、形質転換細胞、及び寄生虫などの病原物質／生物が付着しないようにすること、毒素、ウイルス、細菌、真菌、及びその他の内在細胞を有する病原体の複合体の分解、並びにそれらの身体からの排除、及び創傷治癒の加速も、本発明の混合物によって実現することができる。
【００３７】
したがってこの混合物は、例えば前述の物質及び生物が、上皮細胞又はその他の内在細胞に結合し又はその細胞に付着する結果、支障をきたした腸内細菌叢と併せて生ずる症状又は疾患の、予防及び／又は治療に適している。
【００３８】
炭水化物混合物は、炭水化物成分Ａが炭水化物成分Ｂとは異なる構造を有するときに、特に効果的であることがわかった。この異なる構造は、例えば一方でフルクタンを使用し、他方でガラクタンを使用する場合、例えば単糖組成物に関するものである可能性がある。この異なる構造は、同様に、グリコシド結合に関する可能性もある（例えば、α−ガラクトオリゴ糖対β−ガラクトオリゴ糖、又はα−グルカン（デンプン）対β−グルカン（セルロース））。モノマー組成物、並びにグリコシド結合は、化学的挙動（例えば溶解性）又は生理学的挙動（例えば消化性）に影響を与える可能性がある。
【００３９】
同じ構造の炭水化物は、鎖長が異なる可能性があるが同じ単糖単位又は単糖単位の組合せからなる同族体であることが、理解される。一般に、隣の同族体は、前の同族体に存在する単糖単位の１つを加えることによって、前の同族体とは異なることになる。それにも関わらず、１つの単位、通常は末端にあるものは、例えばグルコース単位で終わる（無水）フルクトース単位の鎖を含有するある特定のフルクタンのように、異なる可能性がある。
【００４０】
成分Ｂの多糖の鎖長、又は多糖混合物の場合の重量平均鎖長は、少なくとも３単位であることが好ましく、成分Ａのオリゴ糖の鎖長又はオリゴ糖混合物の重量平均鎖長よりも、少なくとも５単位長いことが好ましい。オリゴ糖Ａの平均鎖長は、２から６単位の間であり、多糖Ｂの平均鎖長は７から３０単位の間であることが好ましく、８から２０単位の間であることがより好ましい。同じ構造のオリゴ糖と多糖が共に存在する場合、この構造の炭水化物は、重量平均鎖長が６．５よりも短い場合に成分Ａと見なし、７以上の鎖長を有する個々のメンバーは成分Ａに含めて考えず、一方、重量平均鎖長が６．５を超えた場合に成分Ｂと見なし、６以下の鎖長を有する個々のメンバーは、成分Ｂに含めて考えない。別の構造の糖が存在しない状態で、同じ構造のオリゴ糖と多糖が共に存在する場合、７単位の両端に２つの最大値があるべきであり、そうでない場合には、上述のように、２種の異なる炭水化物成分の要件が満たされない。
【００４１】
とりわけ混合物の中心は、その炭水化物中に見ることができる。異なるサイズ及び／又は異なる「種類」又は「構造」の炭水化物の混合物を投与すると、個別の物質群Ａ及びＢのプレバイオティック効果に対して相乗効果をもたらすことができる。
【００４２】
成分Ａの炭水化物は、１つの物質の種類にのみ属するものでよいが、いくつかの種類（例えばＡ：ガラクト−オリゴ糖及びフコ−オリゴ糖）から形成することができ、一方、成分Ｂの炭水化物は、同様に１つの物質の種類に由来するものでよく、いくつかの物質の種類に由来するものでもよい（例えばＢ：イヌリン及びキシラン）。
【００４３】
好ましい炭水化物混合物は、ガラクト−オリゴ糖とインリンからなる。特に効果的な混合物は、炭水化物成分Ａの少なくとも６０重量％、好ましくは８０から１００重量％がガラクト−オリゴ糖の群に属するものである。炭水化物成分Ｂの少なくとも６０重量％、好ましくは８０から１００重量％がフルクト−多糖の群に属する混合物も好ましい。炭水化物混合物の生成では、現在知られており且つ食物又は食品の製造に特に使用される炭水化物及び炭水化物混合物を、使用することができる。技術的な方法で予め変性させた原材料を、使用することも可能である。それによって、混合物の調製を、対応して選択された炭水化物又はオリゴ糖と多糖又は炭水化物混合物との単なるブレンドによって、引き続き行うことができる。それによって、初期成分は、パラメータが完成された混合物に関係するように、互いに混合しなければならない。
【００４４】
原材料を使用することができるので、貯蔵炭水化物（フルクタン、豆果からのガラクト−オリゴ糖、フコイダン、α−グルカン、ラミナリン、カラゲナン、マンナン、ガラクトマンナン、寒天）、天然ガム、糖タンパク質のＮ−グリコシド結合炭水化物、糖タンパク質のＯ−グリコシド結合炭水化物、糖脂質のグリカン、酵素により調製された炭水化物（ガラクト−オリゴ糖、グルコ−オリゴ糖、フルクト−オリゴ糖、キシロ−オリゴ糖）、細菌性炭水化物（キサンタンなど）、並びにオリゴ糖（ガラクト−オリゴ糖、グルコ−オリゴ糖（α１−２及びα１−３グルコース残基）、キシロ−オリゴ糖）、並びにセルロースやヘミセルロース（アラビナン、ガラクタン）、ペクチン、及びキチンなどの骨格炭水化物を使用することができる。これらの物質は、好ましくは食品級であるべきである（食品中の複合炭水化物（Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ Ｆｏｏｄｓ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ；Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９０参照）。
【００４５】
原材料及び生成物の、加水分解酵素（例えばグリコシダーゼ、トランスグリコシダーゼ、及びリパーゼ）、転移酵素、異性化酵素（例えば、アルドラーゼ、及びケトラーゼ）、酸化還元酵素（例えばオキシダーゼ）、及び還元酵素（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ）、脱離酵素（例えば、多糖リアーゼ）、及びリガーゼを用いて、原材料の酵素修飾を実施することも可能である。さらに、原材料及び生成物の、技術的変性を行うことが可能であり、即ち圧力（例えば押出し）、温度（例えばカラメル化）、有機合成、有機修飾（例えば、カルボキシメチル化及びパーアセチル化）、酸及び／又はアルカリ加水分解、及び分画（例えば、サイズ及び／又は物理化学的パラメータであって、電荷や疎水性などによる）、又は変性の組合せによって行うことが可能である。
【００４６】
それによって炭水化物混合物は、本質的に、以下に列挙する単糖からなり、またその単糖からなるオリゴ糖及び多糖からなる：即ち、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコース、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｄ−キシロース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−アロース、Ｄ−タロース、Ｌ−イドース、Ｄ−リボーズ、並びにカルボキシル基を含む単糖であって、例えばＤ−ガラクツロン酸やＤ−グルクロン酸、Ｄ−マンヌロン酸、及び／又はこれらがメチル化した形のものであって、例えばＮ−アセチルノイラミン酸やＮ−グリコリルノイラミン酸、及び／又はこれらがＯ−アセチル化した形などである。さらに、これらのモノマー及びそれをベースにした高級単位は、−ＯＳＯ３Ｈ基及び／又は−ＯＰＯ３Ｈ基を用いて変性させることができる。
【００４７】
本発明による難消化性炭水化物は、典型的な場合、１日量を０．５から３０ｇ、好ましくは２から１５ｇ、より好ましくは３から９ｇとして投与する。製剤の、１つの好ましい投与形態は、サプリメントである。サプリメントは、人工栄養保育され又は一部母乳で保育される未熟児、及び人口栄養保育され又は一部母乳で保育される成熟児も含め、人工栄養保育され又は一部母乳で保育される乳児に適している。
【００４８】
製剤は、乳児栄養として使用してもよい。この場合、本発明の乳児栄養はさらに、消化性炭水化物、脂質源、タンパク源、及びこれらの混合物から選択された１種又は複数の成分を含む。
【００４９】
３）その他の成分
炭水化物成分Ａ及びＢの他に、その他の炭水化物も同様に存在してよい。その中には、１）上述のように消化性のある消化性炭水化物、及び２）吸収性／消化性があり、又は吸収性／消化性も無い不溶性炭水化物がある。乳児栄養サプリメントに使用される、典型的な不溶性の難消化性炭水化物は、大豆多糖であり、抵抗性デンプン、セルロース、及びヘミセルロースであり、より好ましくは、この炭水化物は大豆多糖及び抵抗性デンプンから選択される。
【００５０】
乳児栄養サプリメントに使用される、典型的な可溶性及び消化性炭水化物は、マルトデキストリン、デンプン、ラクトース、マルトース、グルコース、フルクトース、及びスクロースと、その他の単糖及び二糖から選択され、より好ましくは、マルトデキストリン、ラクトース、マルトース、グルコース、フルクトース、スクロース、及びこれらの混合物から選択される。
【００５１】
炭水化物成分Ａ及びＢの他に、１）及び２）の下で列挙されたこれらの炭水化物は、それ自体が任意の量で存在することができ、どの場合も、所望の最終生成物に応じて様々になる。不溶性炭水化物は、炭水化物混合物の０から１０重量％を構成することが好ましい。
【００５２】
乳児栄養サプリメント中に使用される、脂質源として使用される典型的な成分は、乳児用調合乳での使用に適した任意の脂質又は脂肪でよい。好ましい脂質源には、乳脂肪、サフラワー油、卵黄脂質、カノーラ油、オリーブ油、ココナツ油、パーム油、パーム核油、パームオレイン、大豆油、ヒマワリ油、魚油、及び長鎖ポリ不飽和脂肪酸を含有する微生物発酵油が含まれる。これらの油は、高級オレインヒマワリ油や高級オレインサフラワー油などの、高級オレイン形態をとることができる。脂質源は、パームオレインや中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）、アラキドン酸やリノール酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ドコサヘキサエン酸、リノレン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸、カプロン酸のような脂肪酸のエステルなど、これらの油から得られた画分の形をとってもよい。
【００５３】
未熟児用調合乳の場合、脂質源は、中鎖トリグリセリドを、好ましくはこの脂質源の１５重量％から３５重量％の量で含有することが好ましい。
【００５４】
脂質源は、ｎ−６脂肪酸とｎ−３脂肪酸とのモル比が５：１から１５：１、好ましくは８：１から１０：１であることが好ましい。
【００５５】
存在する場合、脂質は、組成物の２０重量％から４０重量％のレベルで存在すること、又は乳児用調合乳において０．８から１．５ｇ／１００ｋＪとして存在することが好ましい。
【００５６】
本発明の栄養製品で利用することのできるタンパク質には、ヒトの消費に適した任意のタンパク質又は窒素源が含まれる。乳児用調合乳に使用される適切なタンパク源の例には、典型的な場合、カゼイン、乳清、脱脂練乳、脱脂乳、大豆、エンドウ豆、米、トウモロコシ、加水分解タンパク質、遊離アミノ酸、タンパク質と共にコロイド懸濁液中にカルシウムを含有するタンパク源、及びこれらの混合物が含まれる。本明細書で使用するには、タンパク質が加水分解物の形をとることが好ましく、それによって、上述のような乳児でのアレルギーの危険性が低下する。商用のタンパク源は、容易に入手可能であり、当業者に知られている。
【００５７】
典型的な場合、ミルクをベースにした乳児用調合乳の加水分解物には、牛乳からの１００％加水分解した乳清タンパク質が存在する。その他のミルクをベースにした乳児用調合乳では、カゼイン／乳清の比が、典型的な場合は１．８：０．３〜３〜０である。
【００５８】
存在する場合、タンパク源は、組成物の９重量％から１９重量％のレベルで存在することが好ましい。乳児用調合乳として使用するときは、タンパク源が、０．４５から１．０ｇ／１００ｋＪの量で存在することが好ましい。
【００５９】
栄養的に完全な調合乳は、日々の食事に重要であると理解される全てのビタミン及びミネラルを、栄養的に有意な量で含有することが好ましい。最低限の要件が、ある特定のビタミン及びミネラルに関して確立されている。乳児用調合乳中に任意選択で存在するミネラル、ビタミン、及びその他の栄養素の例には、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、葉酸、イノシトール、ナイアシン、ビオチン、パントテン酸、コリン、カルシウム、リンヨウ素、鉄、マグネシウム、銅、亜鉛、マンガン、塩化物、カリウム、ナトリウムセレン、クロム、モリブデン、タウリン、及びＬ−カルニチンが含まれる。ミネラルは、通常、塩の形で添加される。特定のミネラル及びその他のビタミンの、存在及び量は、目的とする乳児集団に応じて変わることになる。
【００６０】
必要に応じて、乳児用調合乳は、大豆レシチンやクエン酸、モノグリセリド及びジグリセリドのエステルなど、乳化剤及び安定剤を含有することができる。これは、調合乳を液体の形で提供する場合に特に準備される。
【００６１】
乳児用調合乳は、（非炭水化物）繊維やラクトフェリン、免疫グロブリン、ヌクレオチド、ヌクレオシドなど、有益な効果を発揮することができるその他の物質を、任意選択で含有することができる。
【００６２】
（適用例）
本発明による製剤は、人工栄養保育され又は一部母乳で保育される乳児、特に未熟児、成熟児として生まれた赤ちゃん、並びに固形食物への適応期間にある乳児の胃腸管において、「標準」と見なされる母乳で保育される乳児での種の分布に従って、ビフィズス菌集団を正常化するのに特に有用であることがわかった。本発明の製剤は、母乳での保育から哺乳瓶での保育に変わる乳児にも適している。
【００６３】
このように、人工栄養保育され又は一部母乳で保育される乳児の胃腸管で、ビフィドバクテリウム種を正常化する組成物を製造するために、本発明の製剤又は組成物の使用が提供される。本発明の製剤は、免疫状態の予防又は治療に特に有用であることもわかった。この免疫状態は、母乳で保育される乳児と比較した場合、これら人工栄養保育され又は一部母乳で保育された乳児の胃腸管内のビフィドバクテリウム種の組成物が、異なる結果と考えられる。典型的な場合、そのような免疫状態には、アレルギー、アトピー性皮膚炎、湿疹、喘息、アトピー、アレルギー性鼻炎、食物過敏症、おむつかぶれ、下痢、及びこれらを混合したものから選択された状態が含まれる。
【００６４】
したがって本発明は、好ましくはアレルギー、アトピー性皮膚炎、湿疹、喘息、及びおむつかぶれから選択された、１つ又は複数の免疫状態を予防し又は治療するための、製剤の使用を提供する。また、（細菌性）下痢、特にウイルス性下痢を、本発明の製剤で治療することもできる。本明細書では、エネルギー吸収不良の予防及び／又は治療のための、製剤の使用も提供する。製剤は、アレルギー病変部への好酸球、好中球、及び単核細胞の浸潤を阻害し、且つ／又はＴｈ２型免疫応答を阻害し、且つ／又はＴｈ１媒介型免疫応答を刺激するのに有益であることが見出されたことは、有利である。このように、アレルギー病変部への好酸球、好中球、及び単核細胞の浸潤を阻害し、Ｔｈ２型免疫応答を阻害し、且つ／又はＴｈ１媒介型免疫応答を刺激する組成物を製造するために、本明細書で定義した本発明の製剤又は組成物の使用が提供される。
【００６５】
また本発明は、Ｂ．ブレーベ以外のある特定のビフィドバクテリウム種の集団を調節するために、特にビフィドバクテリウムカテニュレイタム、Ｂ．シュードカテニュレイタム、及び／又はＢ．アドレセンティスの相対量を低下させるために、上述の炭水化物混合物の使用も提供する。
【００６６】
（プローブの開発及び診断キット）
本明細書では、種特異的オリゴヌクレオチドプライム及びプローブを使用して、ビフィドバクテリウム種、特にヒトに見られるもの、即ちビフィドバクテリウムカテニュレイタム及びＢ．シュードカテニュレイタム、Ｂ．アドレセンティス、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．ロンガム、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．アンギュレイタム（Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｕｍ）、Ｂ．インファンティス、及びＢ．デンティウムを定量する方法も提供する。
【００６７】
これらのプライマー及びプローブは、ＦＩＳＨ、ＰＣＲ、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥ、ドットブロットハイブリダイゼーション、及びリアルタイムＰＣＲ法を介して、ビフィズス菌及びビフィズス菌種を同定するのに使用することができる。これら技法の全てには、ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションステップを含むという共通点がある。その目的は、特に、リアルタイムＰＣＲによってビフィズス菌の種の量を決定することである。
【００６８】
以下に記述する配列のそれぞれは、プローブとして機能する限り、その５’−又は３’−末端に結合した追加の塩基を有することができる。
【００６９】
これらのオリゴヌクレオチドは、化学合成のための従来の手段によって、例えば自動化ＤＮＡ合成器によって調製することができる。上述の配列を含有するＤＮＡ断片は、対応するビフィドバクテリウム種からの遺伝子の酵素切断によって調製することができる。
【００７０】
本発明において、５’ヌクレアーゼアッセイで使用されるビフィズス菌種に特異的なプライマー及びプローブの開発は、下記の通りであった。
【００７１】
全てのビフィズス菌に関して、ビフィドバクテリウムアドレセンティス、Ｂ．アンギュレイタム、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．カテニュレイタム、Ｂ．デンティウム、Ｂ．ロンガム、及びＢ．インファンティスに対する二重５’ヌクレアーゼアッセイを開発した。本発明者等は、通常なら系統発生分析及び細菌の特異的検出に使用される１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の代わりに１６Ｓ−２３Ｓ ｒＤＮＡの遺伝子間スペーサに対する５’ヌクレアーゼアッセイを開発した。遺伝子間スペーサに何を選択するかは、１６Ｓ ｒＤＮＡを使用する場合、汚染及び感受性の問題がリアルタイムＰＣＲに関して記述されるという事実に大きく左右される。さらに、異なるビフィドバクテリウム種の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列間の大きな類似性が示されており（Ｌｅｂｌｏｎｄ−Ｂｏｕｒｇｅｔ他、１９９６）、これは、異なるビフィドバクテリウム種に特異的なプライマーとプローブとのセットの開発を、ほとんど不可能にする。驚くべきことに、これらの問題は、遺伝子間スペーサ領域を使用することによって回避することができた。
【００７２】
プライマー及びプローブの開発では、異なるビフィドバクテリウム種の１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間スペーサ領域の異なる配列（Ｂ．アドレセンティス［Ｕ０９５１１ Ｕ０９５１２（１）、Ｕ０９５１３（１）及びＵ０９５１４（１）］ａ、Ｂ．アンギュレイタム［Ｕ０９５１５（１）］ａ、Ｂ．アニマリス［ＡＹ２２５１３２（２）、Ｌ３６９６７（１）及びＵ０９８５８（１）］ａ、Ｂ．アステロイデス（Ｂ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）［Ｕ０９５１６（１）］ａ、Ｂ．ブレーベ［ＡＪ２４５８５０（３）、Ｕ０９５１８（１）、Ｕ０９５１９（１）、Ｕ０９５２０（１）及びＵ０９５２１（１）］ａ、Ｂ．ビフィダム［Ｕ０９５１７（１）、Ｕ０９８３１（１）］ａ、Ｂ．カテニュレイタム［Ｕ０９５２２（１）］ａ、Ｂ．コエリナム（Ｂ．ｃｈｏｅｒｉｎｕｍ）［Ｌ３６９６８（１）］ａ、Ｂ．コリネフォルメ（Ｂ．ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｅ）［Ｕ０９５２３（１）］ａ、Ｂ．クニクリ（Ｂ．ｃｕｎｉｃｕｌｉ）［Ｕ０９７９０（１）］ａ、Ｂ．デンティウム［Ｕ１０４３４（１）］ａ、Ｂ．インディカム（Ｂ．ｉｎｄｉｃｕｍ）［Ｕ０９７９１（１）］ａ、Ｂ．インファンティス［ＡＪ２４５８５１（３）、Ｕ０９５２５（１）、Ｕ０９５２７（１）、及びＵ０９７９２（１）］ａ、Ｂ．ロンガム［ＡＪ２４５８４９（３）、Ｕ０９８３２（１）］ａ、Ｂ．シュードロンガム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ）［Ｕ０９５２４（１）、Ｕ０９８７９（１）］ａ、Ｂ．マグナム（Ｂ．ｍａｇｎｕｍ）［Ｕ０９８７８（１）］ａ、Ｂ．サーモフィラム（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）［Ｕ０９５２８（１）］ａ）を、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、及びＤＤＢＪデータベースから検索した。検索した全ての配列について、ＤＮＡＳＩＳ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）Ｖ２．５（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｗｅｍｂｌｅｙ，ＵＫ）を使用して位置合わせを行った（ａ＝受入れコード、１＝Ｌｅｂｌｏｎｄ−Ｂｏｕｒｇｅｔ，Ｎ．，Ｈ．Ｐｈｉｌｉｐｐｅ，Ｉ．Ｍａｎｇｉｎ，Ｂ．Ｄｅｃａｒｉｓ．１９９６．１６Ｓ ｒＲＮＡ及び１６Ｓから２３Ｓの内部転写スペーサ配列分析は、種間及び種内ビフィズス菌系統発生を明らかにする。Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４６：１０２−１１１、２＝Ｖｅｎｔｕｒａ，Ｍ．，及びＲ．Ｚｉｎｋ．２００２。「ビフィドバクテリウムラクティスの、迅速な同定、分化、及び提案された新しい分類学的分類（Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｎｅｗ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：６４２９−６４３４．、３＝Ｂｒｉｇｉｄｉ，Ｐ．，Ｂ．Ｖｉｔａｌｉ，Ｅ．Ｓｗｅｎｎｅｎ，Ｌ．Ａｌｔｏｍａｒｅ，Ｍ．Ｒｏｓｓｉ及びＤ．Ｍａｔｔｅｒｕｚｚｉ．２０００「ポリメラーゼ連鎖反応による薬用プロバイオティック製品及びヒトの便の中のビフィズス菌株の特異的検出（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｅｃｅｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：３９１−３９９）。これら配列の保存領域全体を使用して、全てのビフィズス菌種に対するプライマー及びプローブを設計した。異なる種類の亜種の配列中の保存領域は、その他の種との類似性をほんのわずかしか示さないものであり、これを使用して、Ｂ．アドレセンティス、Ｂ．アンギュレイタム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．カテニュレイタム（Ｂ．シュードカテニュレイタムを含む）、Ｂ．デンティウム、Ｂ．インファンティス、及びＢ．ロンガム（Ｂ．シュードロンガムを含むが、これら２つの種の間には、その配列に大きな類似性があるからである）のそれぞれに対するプライマー及びプローブを設計した。
【００７３】
プライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブを、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ １．５ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｉｅｕｗｅｒｋｅｒｋ ａ／ｄ ＩＪｓｓｅｌ，ＮＬ）の助けを借りて設計した。本発明者等は、以下の基準を適用した：プローブ及びプライマーは、ＧＣ含量を３０〜８０％であるとし、同一のヌクレオチド（特にグアニン（Ｇ）に関する）が３個よりも多く続くことを避けるものとする。プローブの融解温度（Ｔｍ）は６８℃から７０℃の間であるとするのに対し、プライマーの融解温度は、プローブの融解温度よりも１０℃低いものとする。さらに、プローブの５’末端にはＧが存在しないものとし、Ｇよりもシトシン（Ｃ）を多く含む鎖を選択した。プライマーの３’末端の最後の５個のヌクレオチドは、２個以下のＧ及び／又はＣ塩基を有するものとする。最後に、単位複製配列の長さは、１５０塩基対未満とする。設計されたプライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブを表１に示し、これらの特異性について、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を使用して試験した。
【００７４】
全てのビフィズス菌の検出用に設計されたプローブは、５’レポーター色素ＶＩＣ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＬ）及び３’クエンチャーＮＦＱ−ＭＧＢ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＬ）を有するオリゴヌクレオチドからなり、異なるビフィドバクテリウム種に対するプローブは、５’レポーター色素６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ（商標））及び３’クエンチャーＮＦＱ−ＭＧＢ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＬ）を有するオリゴヌクレオチドからなる。全細菌負荷を決定するには、広域（ユニバーサル）なプローブとプライマーとのセットを使用するが、これについては、Ｎａｄｋａｒｎｉ，Ｍ．Ａ．，Ｆ．Ｅ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｎ．Ａ．Ｊａｃｑｕｅｓ，及びＮ．Ｈｕｎｔｅｒの「広域（ユニバーサル）なプローブとプライマーとのセットを使用したリアルタイムＰＣＲによる細菌負荷の決定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｏａｄ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ａ ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ｐｒｏｂｅ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ）」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４８：２５７−２６６（２００２）に記述されている。ユニバーサルプローブは、５’レポーター色素６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ（商標））及び３’クエンチャー色素６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ（商標））を有するオリゴヌクレオチドからなる。設計されたプローブを、表１に示す。
【００７５】
【表１−１】
【表１−２】
【００７６】
ａこれらの場合、適切なプライマーとプローブとのセットを見出す指針に適合するように、いくらか調節を行った（３個を超えて連続するヌクレオチド、又は１５０ｂｐよりも長い単位複製配列）。
【００７７】
標識された製剤は、従来の手段によって、検出可能なマーカーでオリゴヌクレオチドを標識することにより調製した。使用することができる標識マーカーには、放射性同位元素、蛍光物質、酵素、ビオチン、及びヘプテンが含まれる。
【００７８】
標識された製剤とサンプルとのハイブリダイゼーションは、ドットブロットハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼーションなど、既知の技法に従って行うことができる。形成されるハイブリッドは、例えば放射性同位元素を使用するオートラジオグラフィや、酵素又はビオチンを使用する酵素標識抗体技法などの既知の手段によって、標識された製剤を検出することにより確認することができる。
【００７９】
さらに、これらのオリゴヌクレオチドの中で、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６からそれぞれ選択された配列番号によって表されるＤＮＡ断片を、種の同定を行うためのＰＣＲ法でのプライマーとして使用することができる。より具体的には、同定すべき微生物細胞を溶菌させ、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５からそれぞれ選択された配列番号と、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６からそれぞれ選択された配列番号とのＤＮＡ断片のいずれかを、プライマーとしてそこに加え、その後、ＤＮＡポリメラーゼで処理する。電気泳動などによってＤＮＡ増幅が観察される場合、これは細胞が、使用したＤＮＡ断片に対応する遺伝子部分を有することを意味し、即ち細胞は、ＤＮＡ断片プライマーの開始点と同じ種のものであることが確認される。
【００８０】
したがって、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６から選択された配列番号と、これに相補的な配列とを含むオリゴヌクレオチドが提供される。
【００８１】
また本明細書では、ビフィドバクテリウム属の種に特有の核酸標的配列を検出するための、オリゴヌクレオチドプローブも提供され、前記プローブは、
１）配列番号３又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムアドレセンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
２）配列番号６又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムアンギュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
３）配列番号９又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムビフダムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
４）配列番号１２又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムブレーベＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
５）配列番号１５又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムカテニュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
６）配列番号１８又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムデンティウムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
７）配列番号２１又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムインファンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
８）配列番号２４又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムロンガムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
９）配列番号２７又はこれに相補的な配列によって表される、全てのビフィズス菌ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド
から選択される。
【００８２】
さらに本明細書では、ヒト、特にヒト乳児に見られるビフィドバクテリウム属の種を、種特異的に検出する方法が提供され、この方法は、
（Ａ）サンプルとオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズ溶液中で接触させるステップであって、前記プローブが、
１）配列番号３又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムアドレセンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
２）配列番号６又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムアンギュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
３）配列番号９又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムビフィダムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
４）配列番号１２又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムブレーベＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
５）配列番号１５又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムカテニュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
６）配列番号１８又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムデンティウムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
７）配列番号２１又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムインファンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
８）配列番号２４又はこれに相補的な配列によって表される、ビフィドバクテリウムロンガムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
９）配列番号２７又はこれに相補的な配列によって表される、全てのビフィズス菌ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド
からなる群から選択されるものであるステップと、
（Ｂ）前記属の前記種が前記サンプル中に存在するか否か検出されるように、前記プローブが前記サンプル中の核酸とハイブリダイズするか否かを決定するステップと
を含む。
【００８３】
本発明は、ヒト、特にヒト乳児に見られるビフィドバクテリウム属の種を、種特異的に検出する方法であって、
ａ）配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５から選択された配列番号のオリゴヌクレオチドプライマーを、それぞれ配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６から選択された配列番号のオリゴヌクレオチドプライマーと共に含むプライマーのセットを使用して、核酸配列増幅手順を実施するステップと、
ｂ）上述のオリゴヌクレオチドプローブが核酸標的配列とハイブリダイズするか否かを決定するステップと
を含む方法も包含する。
【００８４】
本発明の方法は、診断キットの製造に有利である。したがって本明細書では、少なくとも上述のＤＮＡプローブ、並びに変性液やハイブリダイゼーション液、洗浄液、固体担体、ハイブリダイゼーション容器、及び標識検出手段などのハイブリダイゼーション分析に必要な１種又は複数の他の手段を含み、ハイブリダイゼーション分析を用いてビフィドバクテリウムアドレセンティス、Ｂ．アンギュレイタム、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．カテニュレイタム、Ｂ．デンティウム、Ｂ．インファンティス、及びＢ．ロンガムから選択されたビフィドバクテリウム種をサンプル中で検出するための、診断キットが提供される。
【００８５】
また本明細書では、上述のＤＮＡプライマー、並びにＰＣＲ分析に必要な１種又は複数の手段であって、例えばポリメラーゼや重合液、オイルオーバーレイ、反応容器、及び増幅ＤＮＡを検出する手段などのセットを含み、ＰＣＲ分析を用いて上述のビフィドバクテリウム種をサンプル中で検出するための、診断キットも提供する。
【実施例】
【００８６】
（実施例１）
ビフィズス菌用に開発されたプローブ及びプライマーの確認
種々のビフィドバクテリウム種の相対量に関するアッセイを、確認するのに使用される細菌株を、表２に列挙する。
【００８７】
【表２】
【００８８】
ＡＴＣＣ：米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）；ＤＳＭ：ドイツ微生物培養細胞コレクションセンター（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）、ドイツ；ＬＭＧ：微生物学研究室（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ヘント大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｔ）、ベルギー；ＮＣＩＭＢ：英国菌株保存機関（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ）、英国。
【００８９】
全てのビフィズス菌株を、３７℃のＭａｎｎ Ｒｏｇｏｓａ Ｓｈａｒｐ（ＭＲＳ）ブロス（Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、英国）培地中で２４時間、嫌気性条件下で培養した。オーバーナイト培養物を、さら処理するまで−２０℃で保存した。
【００９０】
５ｍｌの凍結させたオーバーナイト培養物を氷水中で解凍することにより、ＤＮＡを細菌培養物から抽出した。その後、培養物を、４０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離して（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ７、Ｄｕ Ｐｏｎｔ、Ｓｔｅｖｅｎａｇｅ、英国）、細菌細胞をペレット化した。ペレットを、１ｍｌのＴＥＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、その後、４０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。上澄みを除去し、ペレットを、ＴＨＭＳ（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５％（ｗ／ｖ）スクロース）１ｍｌ中に再懸濁した。この懸濁液を、２ｍｌのエッペンドルフチューブに移した後、２００μｌのリゾチーム（０．１ｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ＤＥ）及び４０μｌのムタノリシン（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ、ＤＥ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。引き続き、溶液を、１００００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した（Ｓｉｇｍａ １−１５、Ｓｉｇｍａ Ｌａｂｏｒｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｏｓｔｅｒｏｄｅ ａｍ Ｈａｒｚ、ＤＥ）。上澄みを除去し、ペレットを、１００μｌのＴＨＭＳ中に再懸濁し、そこに、４００μｌのＴＥＳ（０．５％のＳＤＳを含む）及びプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＤＥ）７．５μｌを添加した。この混合物を撹拌し、６５℃で３０分間インキュベートした。引き続き、標準フェノール／クロロホルム抽出を行い、その後、２．５μｌのＲＮａｓｅ Ａ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＤＥ）で、３７℃で３０分間処理した。引き続き、２体積の氷冷エタノール（９６％）及び３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）０．１体積を添加した後に、少なくとも３０分間、−２０℃で保存することによって、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿した溶液を、１３０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離し、その上澄みを、５００μｌの７０％エタノールで洗浄し、その後、１３０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを室温で空気乾燥した。ＤＮＡを、１００μｌの滅菌ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）中に再懸濁し、−２０℃で保存した。
【００９１】
第１に、各二重５’ヌクレアーゼアッセイの特異性について、種々の株（表２参照）の２５μｌ増幅を行うことによって試験した。これらの２５μｌ ＰＣＲ反応を、２．５μｌのＤＮＡテンプレート、１２．５μｌのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、各プライマー９００ｎＭ、及び各プローブ２００ｎＭを使用して実施し、その後、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｐｒｏｆｉｌｅ、即ち５０℃で２分、９５℃で１０分経た後に、９５℃で１５秒、６０℃で１分間の４５サイクルからなるプロフィルを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｉｅｕｗｅｒｋｅｒｋ ａ／ｄ ＩＪｓｓｅｌ、ＮＬ）上で実行した。そのために開発された５’ヌクレアーゼのアッセイの全ては、ビフィドバクテリウム種に特異的であり、ビフィズス菌の総量を決定するための５’ヌクレアーゼアッセイは、プロピオン酸菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又は乳酸杆菌などの株以外の、試験をした全てのビフィドバクテリウム種を検出した。Ｂ．カテニュレイタムに関する５’ヌクレアーゼアッセイも、Ｂ．シュードカテニュレイタムを検出することに留意すべきである。さらに、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅで処理したサンプルについて試験をし、汚染されたＲＮＡがアッセイ中に検出されないことを確かめた。
【００９２】
第２に、Ｂ．アドレセンティス、Ｂ．アンギュレイタム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．カテニュレイタム、Ｂ．デンティウム、Ｂ．インファンティス、及びＢ．ロンガムからの個体培養混合物を調製して、この混合物全体が確実に約１００％になるようにした。この場合、テンプレートとしての役割を果たす種々のビフィドバクテリウム種同士の競合は、除外することができる。これは確かに、図１からわかるように、混合物中の各ビフィドバクテリウム種について決定された量、並びに混合物中のビフィドバクテリウム種の総量を示すケースである。
【００９３】
異なる種類の５’ヌクレアーゼアッセイに関する再現性及び反復性に関するＣＶ値を決定し、これらを表３に見ることができる。
【００９４】
【表３】
【００９５】
ａ５’ヌクレアーゼアッセイが、「従来の」ＰＣＲよりも感受性を有する回数。
ｂ再現性は、個体培養物（１００％）１０個について試験を行い、得られた結果に基づいてＣＶ（％）を計算することによって決定する。
ｃ反復性は、個体培養物（１００％）４個についてそれぞれ３回試験を行い、得られた結果に基づいてＣＶ（％）を計算することによって決定する。
【００９６】
開発された５’ヌクレアーゼアッセイを、従来の定性種特異的ＰＣＲ（Ｍａｔｓｕｋｉ，Ｔ．，Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｒ．Ｔａｎａｋａ，Ｍ．Ｆｕｋｕｄａ，及びＨ．Ｏｙａｉｚｕ．１９９９．１６Ｓ ｒＲＮＡ−遺伝子−標的種特異的プライマーで試験をしたヒト腸管微生物叢におけるビフィドバクテリウム種の分布（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｗｉｔｈ １６Ｓ ｒＲＮＡ−ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：４５０６−４５１２）によって記述されるプライマーを使用する）と比較して、種々のアッセイの感受性を決定すると共に、偽陽性結果であるか又は偽陰性結果であるかチェックした。表３は、従来の種特異的ＰＣＲに対し、５’ヌクレアーゼアッセイが異なる感受性であることを示す。表４は、二重５’ヌクレアーゼアッセイで使用される、最終の最適なプライマー及びプローブ濃度を示す。
【００９７】
【表４】
【００９８】
（実施例２）
臨床試験
この研究は、２つの介入群に関する二重盲検プラセボ対照多施設治験であった。生後２８日から９０日の、完全に調合乳で保育した乳児を、ドイツの４カ所の病院から採用した。乳児を、その出生時体重が２６００ｇから４５００ｇの間にある場合には研究に組み入れ、少なくとも４週間完全に調合乳で保育し、その後、介入期間を開始した。先天性異常のある乳児、或いは牛乳アレルギーが確認され又は疑われる乳児、多子出産によって生まれた乳児、この研究の開始前に抗生物質を２週間未満与えた乳児、及びこの研究の開始前に任意のプロバイオティック又はプレバイオティック調合乳で１カ月未満保育された乳児は、この研究から除外した。登録後、乳児を無作為に、２つの治療群の一方に、即ち０．８ｇ／１００ｍｌのガラクト−オリゴ糖及びフルクト−多糖が補われた乳児用調合乳を与えた群（ＧＦＳＦ群）と、標準的な乳児用調合乳を与えた群（ＳＦ群）との一方に割り当てた。この調合乳の多量養素組成を、表５に示す。
【００９９】
【表５】
【０１００】
母乳で保育した乳児の群は、参照群（ＢＦ群）として組み入れた。研究期間の開始後３日以内、４週間後、及び研究期間の終了時（６週間）に、便のサンプルを収集した。この研究は、４つの病院の医学倫理委員会により承認済みであった。説明承諾書は、研究開始前に両親から得た。
【０１０１】
便のサンプルを氷水中で解凍することによって、核酸を便から単離し、その後、ＰＢＳ（０．３７Ｍ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４［ｐＨ７．４］）中に１０×（ｗ／ｖ）希釈し、ストマッカー（ＩＵＬ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，スペイン）を使用して１０分間均質化した。均質化した便を、実際のＤＮＡ単離前に、−２０℃で保存した。抽出は、均質化した便のサンプル１ｍｌを氷水中で解凍することによって開始し、その後、１１００ｒｐｍで１分間遠心分離して、細片及び大きい粒子を除去した。上澄みを新しい試験管に移し、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。引き続き、ペレットを、１ｍｌのＴＮ１５０（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、０．３ｇのジルコニウムビーズ（直径０．１ｍｍ、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＵＳ）が入っている滅菌した試験管内に移した。これらの懸濁液に、ＴＥ緩衝フェノール（ｐＨ±７．５）１５０μｌを添加し、サンプルを、５０００ｒｐｍで３分間、ミニビーズビーター（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＵＳ）に入れた。ビーズによる叩出しの後、サンプルを即座に氷上で冷却し、その後、１５０μｌのクロロホルムを添加した。サンプルを短時間撹拌し、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上相を、清浄な２ｍｌのエッペンドルフ管に移し、フェノール／クロロホルム抽出を開始した。フェノール−クロロホルム抽出の後、１ｍｌの氷冷エタノール（９６％）及び５０μｌの３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を添加した後に、サンプルを−２０℃で少なくとも３０分間置くことにより、ＤＮＡの沈殿を行った。引き続いてこのサンプルを、１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、５００μｌの７０％エタノールで洗浄した。１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄みを廃棄し、ペレットを室温で空気乾燥した。ＤＮＡを、１００μｌの滅菌ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）に再懸濁し、−２０℃で保存した。
【０１０２】
便のサンプル中の、種々のビフィドバクテリウム種の相対的な定量を行うため、二重５’ヌクレアーゼアッセイを使用する。それぞれの種の相対量は、Ｌｉｕ他、２００２に従って計算する。簡単に言うと、各増幅曲線の効率は、式Ｅ＝（閾値Ａ／閾値Ｂ）−（Ｃｔ，Ａ−Ｃｔ，Ｂ）−１によって別々に計算した。計算された効率の助けを借りて、ＤＮＡの初期量（Ｒ０）を、Ｒ０＝閾値／（１＋Ｅ）Ｃｔによって計算する。次いでビフィドバクテリウム種のＤＮＡの初期量を、全てのビフィドバクテリウム種のＤＮＡの初期量で割ることができる。その後、得られた比を、１００％に設定された個体培養の比の助けを借りて正規化する。
【０１０３】
ビフィズス菌の総量も、初めに述べたようにＦＩＳＨの助けを借りて決定した（Ｌａｎｇｅｎｄｉｊｋ，Ｆ．Ｓｃｈｕｔ，Ｇ．Ｊ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｇ．Ｃ．Ｒａａｎｇｓ，Ｇ．Ｒ．Ｋａｍｐｈｕｉｓ，Ｍ．Ｈ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＧ．Ｗ．Ｗｅｌｌｉｎｇ「属特異的１６Ｓ ｒＲＮＡ標的プローブによるビフィドバクテリウム種の定量蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及びその便サンプルへの適用（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．ｗｉｔｈ ｇｅｎｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ １６Ｓ ｒＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｅｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ）」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（８）：３０６９−７５（１９９５））。
【０１０４】
全細菌のパーセンテージとしてのビフィドバクテリウム属のパーセンテージは、ＢＦ、ＳＦ、及びＧＦＳＦ群でそれぞれ７５、４７、及び６８％であり、これは、難消化性炭水化物の混合物で保育されたＧＦＳＦ群が、ＳＦ群の場合よりも、ＢＦ群の場合と同様により多くのビフィズス菌性叢を有することを実証している。
【０１０５】
表６に、研究開始時並びに研究終了時での、種々の群におけるそれぞれの種の蔓延率を示す。表７には、ビフィズス菌の総量に対するビフィドバクテリア種のパーセンテージを示す。
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
【表７】
【０１０８】
多種類のビフィドバクテリウム種が、３つの異なる群に存在する。さらに、標準調合乳を与えた乳児とは対照的に、母乳で保育された乳児とＧＦＳＦを与えた乳児とに、Ｂ．アドレセンティスの蔓延率及び量の著しい低下が見られる。保育から６週間後、Ｂ．アドレセンティスの蔓延率及びパーセンテージは、ＧＦＳＦ又は母乳で保育した赤ちゃんの場合よりも、ＳＦで保育した赤ちゃんの場合のほうが非常に高い。ＧＦＳＦ乳児の便サンプルの分析は、母乳で保育した乳児と同様の多種類のビフィズス菌叢を示しており、１種のみ又は２〜３種の刺激は観察されない。Ｂ．アドレセンティスに対する影響の他、母乳で保育した乳児及びＧＦＳＦを与えた乳児のプロフィルは、標準調合乳を与えた乳児のプロフィルよりも少ないＢ．カテニュレイタム（＋Ｂ．シュードカテニュレイタム）であることも示した。Ｂ．インファンティス及びＢ．ロンガムは、母乳で保育された乳児、並びに標準調合乳（ＳＦ）又はプレバイオティックス（ＧＦＳＦ）が補われた標準調合乳を与えた乳児において、大部分を占めるようである。また、Ｂ．ブレーベは、３つの群全てで優勢であるが、母乳を与えた群では、全ビフィズス菌の％としてのＢ．ブレーベが、ＳＦ（４．９％）群及びＧＦＳＦ（５．４％）群の場合よりも高かった。
【０１０９】
（実施例３）
アレルギーに関する動物実験
特定の病原体を持たないオスＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、オランダ）から得た。食品及び水を随意に与え、そのマウスが６〜９週齢になったときに使用した。全ての実験は、ユトレヒト大学（オランダ）の動物倫理委員会により承認済みであった。
【０１１０】
卵白アルブミン（グレードＶ）及び塩化アセチル−β−メチルコリン（メタコリン）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。水酸化アルミニウム（ＡｌｕｍＩｍｊｅｃｔ）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１１１】
マウスを、第０日と第７日目に、２回の腹腔内注射により、１００μｌの生理食塩水中２．２５ｍｇの水酸化アルミニウムに吸着させた１０μｇの卵白アルブミンで、又は生理食塩水単独で感作した。マウスに対し、第３５日、３８日、及び４１日目に、プレキシグラス曝露チャンバ内で卵白アルブミンエアロゾルの吸入を２０分間行った。エアロゾルは、Ｐａｒｉ ＬＣ Ｓｔａｒネブライザ（Ｐａｒｉ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ、ＵＳＡ）を使用して、生理食塩水に溶かした卵白溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を噴霧することによって生成した。
【０１１２】
マウスを、１×１０ｅ９（ＣＦＵ）のビフィドバクテリウムブレーベと、ガラクトオリゴ糖及びフルクト多糖の混合物（９：１）２５ｍｇとで、胃管栄養法（０．２ｍｌの生理食塩水）により経口的に、第２８日目から実験終了時（即ち第４２日目）まで毎日処理した。対照として、０．２ｍｌの生理食塩水を、胃管栄養法によって投与した。
【０１１３】
吸入された噴霧化メタコリンに対する気道応答性を、全身プレチスモグラフィ（ＢＵＸＣＯ、ＥＭＫＡ、Ｐａｒｉｓ、フランス）を使用して、意識のある抑制されていないマウスに最終エアロゾル曝露を行った後２４時間で決定した。気道応答は、呼吸抵抗指数（ＰｅｎＨ）として表した。
【０１１４】
統計分析：メタコリンに対する気道応答曲線を、一般線形モデル又は反復測定によって統計的に分析し、その後、群同士の事後比較を行った。細胞計数を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用して統計的に分析した（Ｓｉｅｇｅｌ，Ｓ．，Ｃａｓｔｅｌｌａｎ Ｊｒ．Ｎ Ｊ，１９９８「行動科学に関するノンパラメトリック統計（Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」第２版、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）。全てのその他の分析は、ステューデントｔ検定を使用して行った（Ａｂｒａｍｏｗｉｔｚ，Ｍ．，Ｓｔｅｇｕｍ，Ｉ．Ａ．，１９７２、「数学関数の手引き（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）Ｄｏｖｅｒ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ」。確率の値がｐ＜０．０５であるときに、統計的に有意であると見なした。
【０１１５】
気道応答性亢進に関する結果：気道応答性亢進に関する測定値は、対照に比べ、Ｂ．ブレーベ＋ガラクロオリゴ糖及びフルクト多糖の混合物を与えたマウスのほうが、統計的に低下した気道応答性亢進を示すことを示しており、これは喘息反応が低下したことを示すものである。
【０１１６】
図２では、Ｂ．Ｂｒｅｖｅ＋ＧＯＳ／ＦＯＳの混合物の組合せを与えたマウスと、代わりに生理食塩水を与えたマウスの対照群とに関し、その気道応答性亢進を、メタコリン濃度に対する相対ＰｅｎＨ（呼吸抵抗指数）としてプロットする。プロットされた相対ＰｅｎＨの値は、卵白アルブミンで感作されていないマウスに関して得られたブランク値を差し引き、メタコリンが最高濃度であるときに、対照群に関して得られた値に正規化した後に得られた。
【０１１７】
下記の全ての実施例の組成物はさらに、当技術分野で知られているように、且つ国際的指針に従って、ミネラル、微量の元素、及びビタミン、コリン、タウリン、カルニチン、及び／又はミオイノシトール、或いはこれらの混合物を含有することができる。さらに、有機酸、香料、及び／又は着色剤を含んでも含まなくてもよい。
【０１１８】
（実施例４）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１３．１ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
８エネルギー％タンパク質 １．４ｇ（カゼイン乳清混合物）
４５エネルギー％消化性炭水化物 ７．５ｇ
４７エネルギー％脂肪 ３．５ｇ
ＧＯＳ（９０％ガラクト−オリゴ糖、Ｂｏｒｃｕｌｏ Ｄｏｍｏ ＮＬ）／ポリフルクトース（１０％イヌリン、Ｒａｆｔｉｌｉｎ ＨＰ、Ｏｒａｆｔｉ ＢＥ） ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ：１．３×１０８ｃｆｕ
【０１１９】
（実施例５）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１４ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質 １．８ｇ（カゼイン乳清混合物）
４６エネルギー％消化性炭水化物 ８．０ｇ
４４エネルギー％脂肪 ３．４ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース（実施例４参照） ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ １．４×１０８ｃｆｕ
【０１２０】
（実施例６）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１６．１ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質 １．９ｇ（カゼイン乳清混合物）
５１エネルギー％消化性炭水化物 ９．９ｇ
３９エネルギー％脂肪 ３．３ｇ
ＦＯＳ（Ｒａｆｔｉｌｉｎ、Ｏｒａｆｔｉ）／ガラクトマンナン ９／１ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ １．６×１０８ｃｆｕ
【０１２１】
（実施例７）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１３ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質当量 １．６ｇ（加水分解した乳清タンパク質）
４２エネルギー％消化性炭水化物 ７．１ｇ
４８エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
シアリルオリゴ糖、消化性マルトデキストリン ９／１ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ ６．５×１０８ｃｆｕ／ｇ
【０１２２】
（実施例８）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質当量 １．８ｇ（加水分解した乳清タンパク質）
４２エネルギー％消化性炭水化物 ８．６ｇ
４４エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
フコ−オリゴ糖（藻類フコイダンから）、ガラクトマンナン ８／２ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ ７．５×１０８ｃｆｕ
【０１２３】
（実施例９）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５．１ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質当量 １．８ｇ（加水分解した乳清タンパク質）
４２エネルギー％消化性炭水化物 ８．６ｇ
４４エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
マンノ−オリゴ糖、アラビノガラクタン ９／１ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ １．５×１０８ｃｆｕ
【０１２４】
（実施例１０）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５．２ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質 １．７ｇ（加水分解した乳清タンパク質）
４８エネルギー％消化性炭水化物 ８．４ｇ
４２エネルギー％脂肪 ３．３ｇ
ＧＯＳ／ガラクトルオン酸オリゴ−糖／／ポリフルクトース ７／２／１ １．０ｇ
Ｂ．ブレーベ ７．５×１０８ｃｆｕ
【０１２５】
（実施例１１）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５．８ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１１エネルギー％タンパク質 １．９ｇ（加水分解した乳清タンパク質）
４８エネルギー％消化性炭水化物 ８．７ｇ
４１エネルギー％脂肪 ３．３ｇ
キシロオリゴ糖／ガラクタン ９／１ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ ８×１０８ｃｆｕ
【０１２６】
（実施例１２）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１０エネルギー％タンパク質 １．７ｇ（カゼイン乳清混合物）
４８エネルギー％消化性炭水化物 ８．１ｇ
４２エネルギー％脂肪 ３．１ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ９／１ ０．８ｇ
ガラクトマンナン ０．４２
Ｂ．ブレーベ １．５×１０８ｃｆｕ
【０１２７】
（実施例１３）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５．９ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１３エネルギー％タンパク質 ２．２ｇ（カゼイン乳清混合物）
４９エネルギー％消化性炭水化物 ８．６ｇ
３７エネルギー％脂肪 ３．０ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ９／１ ０．８ｇ
ガラクトマンナン ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ １．６×１０８ｃｆｕ
【０１２８】
（実施例１４）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１３．５ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
９エネルギー％タンパク質当量 １．５ｇ（加水分解した乳清タンパク質）
４２エネルギー％消化性炭水化物 ６．９ｇ
４９エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース／シアリルラクトース ７／２／１ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ １．４×１０８ｃｆｕ
【０１２９】
（実施例１５）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１３．７ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
９エネルギー％タンパク質当量 １．４ｇ（遊離アミノ酸）
４４エネルギー％消化性炭水化物 ７．１ｇ
４７エネルギー％脂肪 ３．４ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ６／４ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ １．４×１０８ｃｆｕ
【０１３０】
（実施例１６）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１３．５ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１１エネルギー％タンパク質 １．８ｇ（大豆タンパク質）
４０エネルギー％消化性炭水化物 ６．７ｇ
４９エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
ＧＯＳ／ガラクト−オリゴ糖／ポリフルクトース ８／１／１ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ １．４×１０８ｃｆｕ
【０１３１】
（実施例１７）
最終製品１００ｍｌ当たり（粉末１５．１ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１２エネルギー％タンパク質 ２．２ｇ（大豆タンパク質）
４３エネルギー％消化性炭水化物 ７．７ｇ
４５エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
ＦＯＳ／ガラクタン ９／１ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ １．５×１０８ｃｆｕ
【０１３２】
（実施例１８）
１００ｍｌ当たり（粉末１６．５ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１３エネルギー％タンパク質 ２．０ｇ（加水分解した乳清）
５７エネルギー％消化性炭水化物 ８．６ｇ
３０エネルギー％脂肪 ２．０ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ９／１ １．０
大豆多糖 ０．５
Ｂ．ブレーベ １．５×１０９ｃｆｕ
【０１３３】
（実施例１９）
１００ｍｌ当たり、下記の成分を含有する乳製品
１４エネルギー％タンパク質 ２．５ｇ（牛乳タンパク質）
４３エネルギー％消化性炭水化物 ７．５ｇ
４３エネルギー％脂肪 ３．４ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ７／３ １．５ｇ
Ｂ．ブレーベ ３×１０８ｃｆｕ
【０１３４】
（実施例２０）
１００ｍｌ当たり（粉末１５．４ｇ当たり）、下記の成分を含有する乳児用調合乳
１１エネルギー％タンパク質 ２．０ｇ（加水分解したコラーゲン及び大豆タンパク質）
４６エネルギー％消化性炭水化物 ８．６ｇ
４３エネルギー％脂肪 ３．６ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ３／１ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ ６×１０８ｃｆｕ
【０１３５】
（実施例２１）
サプリメント：３ｇの粉末を１００ｍｌの乳に添加したもので、下記の成分を含有する
２８エネルギー％タンパク質 ０．７ｇ（カゼイン乳清混合物）
７２エネルギー％消化性炭水化物 ２．０ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ６５／３５ ０．３ｇ
Ｂ．ブレーベ ３×１０９ｃｆｕ
【０１３６】
（実施例２２）
１ｇ当たり、下記の成分を含有するサプリメントであって、０．４〜０．８ｇを１００ｍｌの乳に添加したもの
０．２６ｇ ガラクトマンナン
０．４４ｇ 消化性炭水化物
０．３ｇ ＧＯＳ／ポリフルクトース ８５／１５
１．０×１０９ｃｆｕ Ｂ．ブレーベ
【０１３７】
（実施例２３）
１００ｍｌ当たり下記の成分を含有するサプリメント
１００エネルギー％ 消化性炭水化物 ２．２ｇ
ミネラル：Ｋ、Ｎａ、Ｃｌ
浸透圧モル濃度 ２６１ｍＯｓｍ／ｌ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ５５／４５ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ １×１０９ｃｆｕ
【０１３８】
（実施例２４）
１００ｇ当たり下記の成分を含有する乳児用調合乳（８５ｇを２４０ｍｌの乳に添加した）
４エネルギー％タンパク質 ４．７ｇ（牛乳タンパク質）
５３エネルギー％消化性炭水化物 ６８ｇ
４３エネルギー％脂肪 ２４．６ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ９／１ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ １．２×１０９ｃｆｕ
【０１３９】
（実施例２５）
１００ｍｌ当たりの乳児栄養素（経管栄養）
９エネルギー％タンパク質 ３．４ｇ（カゼイン）
５０エネルギー％炭水化物 １８．８ｇ
４１エネルギー％脂肪 ８ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ７／３ ０．４ｇ
Ｂ．ブレーベ ５×１０８ｃｆｕ
【０１４０】
（実施例２６）
製品１００ｍｌ当たり、下記の成分を含有する乳児栄養素
１１エネルギー％タンパク質 ２．８ｇ（カゼイン）
４９エネルギー％炭水化物 １２．３ｇ
４０エネルギー％脂肪 ４．４ｇ
ＧＯＳ／ポリフルクトース ８５／１５ ０．８ｇ
Ｂ．ブレーベ ５×１０８ｃｆｕ
【０１４１】
（実施例２７）
乾燥製品１００ｇ当たり、下記の成分を含有する、米粉からなる乳児栄養素（スプーン４〜７杯分を、２００ｍｌの温めた乳児用調合乳、フォローアップミルク、幼児向けミルク、又は牛乳に添加した）
７．４ｇ タンパク質（植物性）
８３ｇ 炭水化物
０．５ｇ 脂肪
３ｇ １．５ｇのＧＯＳ／ポリフルクトース ９／１を含む食物繊維
１×１０１０ｃｆｕ Ｂ．ブレーベ
【０１４２】
（実施例２８）
乾燥製品１００ｇ当たり、下記の成分を含有する、予備調理されたフレーク（小麦、ライ麦、米、大麦、トウモロコシ、オート麦、ソバ）からなる乳児栄養素（スプーン５〜７杯分を、２５０ｍｌの温めた調合乳、フォローアップミルク、幼児向けミルク、又は牛乳に添加した）
９．５ｇ タンパク質（植物性）
７４ｇ 炭水化物
２．０ｇ 脂肪
３ｇ １．５ｇのＧＯＳ／ポリフルクトース ８／２を含む食物繊維
２×１０１０ｃｆｕ Ｂ．ブレーベ
【０１４３】
（実施例２９）
１００ｍｌ当たり下記の成分を含有する、均質化した野菜又は果物からなる乳児栄養素
ＧＯＳ／ポリフルクトース ７５／２５ ２．０ｇ
Ｂ．ブレーベ ２×１０９ｃｆｕ
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウムブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）と、少なくとも２種の難消化性可溶性炭水化物成分Ａ及びＢの混合物とを含み、前記炭水化物成分Ａは、炭水化物成分Ａ及びＢの合計の５〜９５重量％の量で存在し、前記難消化性可溶性炭水化物全体の少なくとも５０％は、二糖からエイコサ糖までの中から選択され、成分Ａ及びＢは、
（ｉ）炭水化物の単糖単位の（平均）数が異なっており、成分Ａの平均鎖長が成分Ｂの平均鎖長よりも少なくとも５単糖単位少ないものであり、又は
（ｉｉ）炭水化物の単糖単位の構造が異なっており、又は
（ｉｉｉ）上記（ｉ）と（ｉｉ）の両方である製剤。
【請求項２】
前記炭水化物成分Ａが、前記炭水化物成分Ｂとは異なる構造を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記炭水化物成分Ａ及びＢの、単糖単位の（平均）数が異なっており、成分Ａは、同じ炭水化物構造の不消化性単糖から六糖までの中から選択され、成分Ｂは、同じ炭水化物構造の不消化性七糖及びそれ以上の多糖から選択される、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
前記炭水化物成分Ａが９５〜６０重量％を構成し、前記炭水化物Ｂが５〜４０重量％を構成し、Ａ＋Ｂ＝１００重量％になる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
炭水化物成分Ａの少なくとも６０重量％、好ましくは８０〜１００重量％が、ガラクト−オリゴ糖の群に属する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
炭水化物成分Ｂの少なくとも６０重量％、好ましくは８０〜１００重量％が、イヌリンを含むフルクト−多糖の群に属する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
難消化性可溶性炭水化物１ｇ当たり、ビフィドバクテリウムブレーベを１０７〜１０１１ｃｆｕ、好ましくは１０８〜１０１０ｃｆｕ含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
プロバイオティックビフィドバクテリウムブレーベが、サプリメントを基にして計算したときに１×１０６〜１．５×１０１１ｃｆｕ／ｇ、好ましくは３×１０７〜５×１０１０ｃｆｕ／ｇ、より好ましくは５×１０８〜１×１０１０ｃｆｕ／ｇの量でサプリメント中に存在する、サプリメントとして使用される請求項１から７までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
ビフィドバクテリウムブレーベが、乳児用サプリメントに対して１×１０４〜１×１０１０ｃｆｕ／ｇ、好ましくは５×１０６〜３×１０９ｃｆｕ／ｇ、より好ましくは１×１０７〜５×１０８ｃｆｕ／ｇの量でサプリメント中に存在する、乳児栄養食として使用される請求項１から７までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
請求項１から８までのいずれか一項に記載の製剤を含み、消化性炭水化物、脂質源、タンパク源、又はこれらの混合物をさらに含む、乳児栄養サプリメント。
【請求項１１】
請求項１から７まで及び９のいずれか一項に記載の製剤を含み、消化性炭水化物、脂質源、及びタンパク源をさらに含む、乳児栄養食。
【請求項１２】
人工栄養保育され又は一部母乳で保育される乳児の胃腸管内のビフィドバクテリウム種組成物を、母乳で保育される乳児における組成物にまで正常化する組成物を製造するための、請求項１から９までのいずれか一項に記載の製剤の使用。
【請求項１３】
１つ又は複数の免疫障害を予防し又は治療する組成物を製造するための、請求項１から９までのいずれか一項に記載の製剤の使用。
【請求項１４】
前記免疫障害が、アレルギー、アトピー、アレルギー性鼻炎、食物過敏症、アトピー性皮膚炎、湿疹、及び喘息から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記免疫障害が、下痢及びウイルス性下痢から選択される、請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
エネルギー吸収不良を予防し且つ／又は治療する組成物を製造するための、請求項１から９までのいずれか一項に記載の製剤の使用。
【請求項１７】
アレルギー病変部での好酸球、好中球、及び単核細胞の浸潤を阻害し、Ｔｈ２型免疫応答を阻害し、且つ／又はＴｈ１媒介免疫応答を刺激する組成物を製造するための、請求項１から９までのいずれか一項に記載の製剤の使用。
【請求項１８】
人工栄養保育され又は一部母乳で保育される乳児の胃腸管内の、ビフィドバクテリウムカテニュレイタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｔｅｎｌａｔｕｍ）、Ｂ．シュードカテニュレイタム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、及び／又はＢ．アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）の相対量を低下させるための、少なくとも２種の難消化性可溶性炭水化物成分Ａ及びＢの混合物の使用であって、前記炭水化物成分Ａが、炭水化物成分Ａ及びＢの合計の５〜９５重量％の量で存在し、前記難消化性可溶性炭水化物全体の少なくとも５０％が、二糖からエイコサ糖までの中から選択され、成分Ａ及びＢは、炭水化物の単糖単位の（平均）数が異なっており、又は炭水化物の単糖単位の構造が異なっており、又はその両方である混合物の使用。
【請求項１９】
配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、及びこれらに相補的な配列から選択された配列番号を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
ビフィドバクテリウム属の種に特有の核酸標的配列を検出するための、オリゴヌクレオチドプローブであって、
１）配列番号３又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．アドレセンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
２）配列番号６又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．アンギュレイタム（Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｕｍ）ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
３）配列番号９又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
４）配列番号１２又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．ブレーベＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
５）配列番号１５又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．カテニュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
６）配列番号１８又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．デンティウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
７）配列番号２１又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
８）配列番号２４又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
９）配列番号２７又はこれに相補的な配列によって表される、全てのビフィズス菌ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド
から選択される、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２１】
ヒト、特にヒト乳児に見られるビフィドバクテリウム属の種を、種特異的に検出する方法であって、
（Ａ）サンプルとオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズ溶液中で接触させるステップであって、前記プローブが、
１）配列番号３又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．アドレセンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
２）配列番号６又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．アンギュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
３）配列番号９又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．ビフィダムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
４）配列番号１２又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．ブレーベＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
５）配列番号１５又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．カテニュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
６）配列番号１８又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．デンティウムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
７）配列番号２１又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．インファンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
８）配列番号２４又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．ロンガムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
９）配列番号２７又はこれに相補的な配列によって表される、全てのビフィズス菌ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド
からなる群から選択されるものであるステップと、
（Ｂ）前記属の前記種が前記サンプル中に存在するか否かが検出されるように、前記プローブが前記サンプル中の核酸とハイブリダイズするか否かを決定するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記請求項２１に記載の、ヒト、特にヒトの便に見られるビフィドバクテリウム属の検出された種を、種特異的に定量する方法であって、前記定量方法が、リアルタイムＰＣＲである方法。
【請求項２３】
ヒト、特にヒト乳児に見られるビフィドバクテリウム属の種を、種特異的に検出する方法であって、
ａ）請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドプライマー、好ましくは配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５から選択された配列番号のオリゴヌクレオチドプライマーを、それぞれ配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６から選択された配列番号のオリゴヌクレオチドプライマーと共に含むプライマーのセットを使用して、核酸配列増幅手順を実施するステップと、
ｂ）上述のオリゴヌクレオチドプローブが核酸標的配列とハイブリダイズするか否かを決定するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
少なくとも請求項２０に記載のＤＮＡプローブ、並びに変性液やハイブリダイゼーション液、洗浄液、固体担体、ハイブリダイゼーション容器、及び標識検出手段などのハイブリダイゼーション分析に必要な１種又は複数の他の手段を含み、ハイブリダイゼーション分析を用いてビフィドバクテリウムアドレセンティス、Ｂ．アンギュレイタム、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．カテニュレイタム、Ｂ．デンティウム、Ｂ．インファンティス、及びＢ．ロンガムから選択されたビフィドバクテリウム種をサンプル中で検出するための、診断キット。
【請求項２５】
請求項１９に記載のＤＮＡプライマー、並びにＰＣＲ分析に必要な１種又は複数の別の手段であって、例えばポリメラーゼや重合液、オイルオーバーレイ、反応容器、及び増幅ＤＮＡを検出する手段などのセットを含み、ＰＣＲ分析を用いてビフィドバクテリウムアドレセンティス、Ｂ．アンギュレイタム、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．カテニュレイタム、Ｂ．デンティウム、Ｂ．インファンティス、及びＢ．ロンガムから選択されたビフィドバクテリウム種をサンプル中で検出するための、診断キット。
【請求項１】
ビフィドバクテリウムブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）と、少なくとも２種の難消化性可溶性炭水化物成分Ａ及びＢの混合物とを含み、前記炭水化物成分Ａは、炭水化物成分Ａ及びＢの合計の５〜９５重量％の量で存在し、前記難消化性可溶性炭水化物全体の少なくとも５０％は、二糖からエイコサ糖までの中から選択され、成分Ａ及びＢは、
（ｉ）炭水化物の単糖単位の（平均）数が異なっており、成分Ａの平均鎖長が成分Ｂの平均鎖長よりも少なくとも５単糖単位少ないものであり、又は
（ｉｉ）炭水化物の単糖単位の構造が異なっており、又は
（ｉｉｉ）上記（ｉ）と（ｉｉ）の両方である製剤。
【請求項２】
前記炭水化物成分Ａが、前記炭水化物成分Ｂとは異なる構造を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記炭水化物成分Ａ及びＢの、単糖単位の（平均）数が異なっており、成分Ａは、同じ炭水化物構造の不消化性単糖から六糖までの中から選択され、成分Ｂは、同じ炭水化物構造の不消化性七糖及びそれ以上の多糖から選択される、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
前記炭水化物成分Ａが９５〜６０重量％を構成し、前記炭水化物Ｂが５〜４０重量％を構成し、Ａ＋Ｂ＝１００重量％になる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
炭水化物成分Ａの少なくとも６０重量％、好ましくは８０〜１００重量％が、ガラクト−オリゴ糖の群に属する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
炭水化物成分Ｂの少なくとも６０重量％、好ましくは８０〜１００重量％が、イヌリンを含むフルクト−多糖の群に属する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
難消化性可溶性炭水化物１ｇ当たり、ビフィドバクテリウムブレーベを１０７〜１０１１ｃｆｕ、好ましくは１０８〜１０１０ｃｆｕ含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
プロバイオティックビフィドバクテリウムブレーベが、サプリメントを基にして計算したときに１×１０６〜１．５×１０１１ｃｆｕ／ｇ、好ましくは３×１０７〜５×１０１０ｃｆｕ／ｇ、より好ましくは５×１０８〜１×１０１０ｃｆｕ／ｇの量でサプリメント中に存在する、サプリメントとして使用される請求項１から７までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
ビフィドバクテリウムブレーベが、乳児用サプリメントに対して１×１０４〜１×１０１０ｃｆｕ／ｇ、好ましくは５×１０６〜３×１０９ｃｆｕ／ｇ、より好ましくは１×１０７〜５×１０８ｃｆｕ／ｇの量でサプリメント中に存在する、乳児栄養食として使用される請求項１から７までのいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
請求項１から８までのいずれか一項に記載の製剤を含み、消化性炭水化物、脂質源、タンパク源、又はこれらの混合物をさらに含む、乳児栄養サプリメント。
【請求項１１】
請求項１から７まで及び９のいずれか一項に記載の製剤を含み、消化性炭水化物、脂質源、及びタンパク源をさらに含む、乳児栄養食。
【請求項１２】
人工栄養保育され又は一部母乳で保育される乳児の胃腸管内のビフィドバクテリウム種組成物を、母乳で保育される乳児における組成物にまで正常化する組成物を製造するための、請求項１から９までのいずれか一項に記載の製剤の使用。
【請求項１３】
１つ又は複数の免疫障害を予防し又は治療する組成物を製造するための、請求項１から９までのいずれか一項に記載の製剤の使用。
【請求項１４】
前記免疫障害が、アレルギー、アトピー、アレルギー性鼻炎、食物過敏症、アトピー性皮膚炎、湿疹、及び喘息から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記免疫障害が、下痢及びウイルス性下痢から選択される、請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
エネルギー吸収不良を予防し且つ／又は治療する組成物を製造するための、請求項１から９までのいずれか一項に記載の製剤の使用。
【請求項１７】
アレルギー病変部での好酸球、好中球、及び単核細胞の浸潤を阻害し、Ｔｈ２型免疫応答を阻害し、且つ／又はＴｈ１媒介免疫応答を刺激する組成物を製造するための、請求項１から９までのいずれか一項に記載の製剤の使用。
【請求項１８】
人工栄養保育され又は一部母乳で保育される乳児の胃腸管内の、ビフィドバクテリウムカテニュレイタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｔｅｎｌａｔｕｍ）、Ｂ．シュードカテニュレイタム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、及び／又はＢ．アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）の相対量を低下させるための、少なくとも２種の難消化性可溶性炭水化物成分Ａ及びＢの混合物の使用であって、前記炭水化物成分Ａが、炭水化物成分Ａ及びＢの合計の５〜９５重量％の量で存在し、前記難消化性可溶性炭水化物全体の少なくとも５０％が、二糖からエイコサ糖までの中から選択され、成分Ａ及びＢは、炭水化物の単糖単位の（平均）数が異なっており、又は炭水化物の単糖単位の構造が異なっており、又はその両方である混合物の使用。
【請求項１９】
配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、及びこれらに相補的な配列から選択された配列番号を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
ビフィドバクテリウム属の種に特有の核酸標的配列を検出するための、オリゴヌクレオチドプローブであって、
１）配列番号３又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．アドレセンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
２）配列番号６又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．アンギュレイタム（Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｕｍ）ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
３）配列番号９又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
４）配列番号１２又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．ブレーベＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
５）配列番号１５又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．カテニュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
６）配列番号１８又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．デンティウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
７）配列番号２１又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
８）配列番号２４又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
９）配列番号２７又はこれに相補的な配列によって表される、全てのビフィズス菌ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド
から選択される、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２１】
ヒト、特にヒト乳児に見られるビフィドバクテリウム属の種を、種特異的に検出する方法であって、
（Ａ）サンプルとオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズ溶液中で接触させるステップであって、前記プローブが、
１）配列番号３又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．アドレセンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
２）配列番号６又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．アンギュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
３）配列番号９又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．ビフィダムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
４）配列番号１２又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．ブレーベＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
５）配列番号１５又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．カテニュレイタムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
６）配列番号１８又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．デンティウムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
７）配列番号２１又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．インファンティスＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
８）配列番号２４又はこれに相補的な配列によって表される、Ｂ．ロンガムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド、
９）配列番号２７又はこれに相補的な配列によって表される、全てのビフィズス菌ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチド
からなる群から選択されるものであるステップと、
（Ｂ）前記属の前記種が前記サンプル中に存在するか否かが検出されるように、前記プローブが前記サンプル中の核酸とハイブリダイズするか否かを決定するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記請求項２１に記載の、ヒト、特にヒトの便に見られるビフィドバクテリウム属の検出された種を、種特異的に定量する方法であって、前記定量方法が、リアルタイムＰＣＲである方法。
【請求項２３】
ヒト、特にヒト乳児に見られるビフィドバクテリウム属の種を、種特異的に検出する方法であって、
ａ）請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドプライマー、好ましくは配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５から選択された配列番号のオリゴヌクレオチドプライマーを、それぞれ配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６から選択された配列番号のオリゴヌクレオチドプライマーと共に含むプライマーのセットを使用して、核酸配列増幅手順を実施するステップと、
ｂ）上述のオリゴヌクレオチドプローブが核酸標的配列とハイブリダイズするか否かを決定するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
少なくとも請求項２０に記載のＤＮＡプローブ、並びに変性液やハイブリダイゼーション液、洗浄液、固体担体、ハイブリダイゼーション容器、及び標識検出手段などのハイブリダイゼーション分析に必要な１種又は複数の他の手段を含み、ハイブリダイゼーション分析を用いてビフィドバクテリウムアドレセンティス、Ｂ．アンギュレイタム、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．カテニュレイタム、Ｂ．デンティウム、Ｂ．インファンティス、及びＢ．ロンガムから選択されたビフィドバクテリウム種をサンプル中で検出するための、診断キット。
【請求項２５】
請求項１９に記載のＤＮＡプライマー、並びにＰＣＲ分析に必要な１種又は複数の別の手段であって、例えばポリメラーゼや重合液、オイルオーバーレイ、反応容器、及び増幅ＤＮＡを検出する手段などのセットを含み、ＰＣＲ分析を用いてビフィドバクテリウムアドレセンティス、Ｂ．アンギュレイタム、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．カテニュレイタム、Ｂ．デンティウム、Ｂ．インファンティス、及びＢ．ロンガムから選択されたビフィドバクテリウム種をサンプル中で検出するための、診断キット。
【公表番号】特表２００７−５０８８３８（Ｐ２００７−５０８８３８Ａ）
【公表日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３６４６８（Ｐ２００６−５３６４６８）
【出願日】平成１６年１０月２５日（２００４．１０．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００４／０００７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３９３１９
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【出願人】（５０２２９０９１２）ナムローゼ フェンノートシャップ ニュートリシア (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２５日（２００４．１０．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００４／０００７４８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３９３１９
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【出願人】（５０２２９０９１２）ナムローゼ フェンノートシャップ ニュートリシア (4)
【Ｆターム（参考）】
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