光合成微生物からの、油および他の有用な産物の製造のための連続−バッチ・ハイブリッド法
連続培養のための閉鎖系およびバッチ培養のための開放系を含む光合成微生物を培養するための方法であって、（ａ）閉鎖系面積が培養施設の総陸地面積の２０％以下を占め；（ｂ）前記開放系の収容能力の５％以上の細胞バイオマスを含有する閉鎖系由来の接種材料で開放系におけるバッチ培養を開始し；（ｃ）前記光合成微生物の倍増速度が１６時間ごとに１回以上であり；そして（ｄ）前記開放系におけるバッチ培養の滞留時間が５日間以下である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光合成微生物から、油および他の有用な産物を製造するための方法に関する。該方法は、好ましくは、化石燃料（石炭、石油およびガス）燃焼発電所からの煙道ガス（stack gas）などの工業的または資源抽出実施によって引き起こされる二酸化炭素の大きな点源を利用し、かくしてその二酸化炭素の放出を減少させる。該方法は、再生可能な燃料−例えば、直接、バイオディーゼルなどの液体輸送燃料とすることも可能な植物油−を含む、有用な産物を製造する。
【０００２】
該方法は、潜在的に、二酸化炭素の地球規模放出を減少させ、かつ、現在は主に地質的石油（geopetroleum）から作製される燃料および他の有用な産物を製造する出発材料としてのバイオマス原料を生産するために、非常に重要である。第一に、化石燃料燃焼発電所は、現在、世界の二酸化炭素放出の約１／３を占めている。二酸化炭素は、地球温暖化の主な原因であると科学者らに考えられている、いわゆる「温室効果ガス」である。二酸化炭素廃棄物の主な点源には、（ｉ）化学薬品の製造、ならびに油およびガスの精製などの、多様な工業的実施に由来する煙道ガス、ならびに（ｉｉ）油および天然ガスの地質学的採取によって生じる付随的放出が含まれる。第二に、本明細書に記載する方法は、燃料を燃焼させることによって生じるのとまさに同じ二酸化炭素廃棄物を、微小植物を用いて直接使用してさらにさらなる燃料を生成するか、または化学薬品製造によって生じる二酸化炭素廃棄物を用いてさらにさらなる化学薬品を生成する。最も重要なことには、この方法における微小植物の使用は、煙道ガスが大気内に放出される前に煙道ガスを使用することを可能にし（これは陸生植物によっては達成不能な偉業である）、かくして大気放出を減少させる。
【０００３】
バイオ燃料および生物学系化学的製品の原料の供給源として、光合成微生物が陸生植物より勝る１つの大きな理由は、これらが、単位面積あたり、およそ１０倍の生産性を有することである。陸生植物の低い生産性は、バイオ燃料の製造において大きなボトルネックである。これは、輸送のみによって消費される燃料の量が生産されるバイオ燃料の量を容易に超えうるほどの遠い距離に渡って、原料物質をバイオプロセスプラントに輸送しなければならず、バイオプロセスプラントの経済的に実用的なサイズが制限されるためである。約１０倍高い生産性を有する光合成微生物を用いることによって、バイオマス原料（微生物）を輸送する費用および燃料消費が減少するため、バイオプロセスプラントは、約１０倍高い能力を有しうる。
【０００４】
発電所煙道ガスは、油または石炭を燃焼しているかどうかに応じて、それぞれ、典型的には、５％〜１５％の範囲の二酸化炭素を含有する。工業製造プロセスからの煙道ガス廃棄物は、比較的多量の二酸化炭素を含有し、そして資源抽出中に生じる廃棄物流は、ほぼ純粋な二酸化炭素からなることもありうる。すべての植物は二酸化炭素を用い、そして微小植物は水媒体中に生存し、そして（しばしば必要とされることだが）５％以上の二酸化炭素濃度に耐えることも可能である。一方、陸生植物は、現在は約０．０３５％の濃度の二酸化炭素を有するガス性媒体（地球の大気）に生存するが、煙道ガス中に見られる百倍以上高い濃度には耐えられない。
【０００５】
具体的には、本発明は、光合成微生物（細菌、シアノバクテリア、および藻類を含む単細胞生物）の水性培養を、閉鎖フォトバイオリアクター中、栄養分が十分な条件下で連続指数関数的増殖状態に維持し、ここから一部を定期的に取り除いて、開放培養系中のバッチ培養に接種する、２段階培養法、すなわち「連続−バッチ・ハイブリッド法」に関し、該開放培養系では、最初の高い光強度および栄養分濃度の条件により連続した指数関数的増殖が短期間維持されるが、細胞の増殖のため、栄養分がすぐに枯渇し、光が制限要因となる（この条件は油生合成を支持し、より高い細胞性油含量を生じさせる）。「栄養分」は、本明細書に定義する際、一般的に多量に供給され増殖のための主な食物となる窒素およびリンの化合物であるいわゆる「多量栄養素」と、一般的に非常に少量で供給されるビタミンや鉄またはマグネシウムのような微量金属含有化合物を含む「微量栄養素」とで構成される。全体的に見て、連続−バッチ・ハイブリッド法は、連続またはバッチいずれかの単一段階法によって得られるものよりも、高い油生産性を生じる。さらに、本発明は、閉鎖系に比べて操作時にほとんど技術や経験を必要としないが他の点では大規模培養への信頼性はないと認められている開放培養系の、信頼性のある使用のための方法論を提供する。
【０００６】
光合成微生物は単細胞植物であり、多細胞（独立には生存不能である分化細胞）陸生植物と同様にバイオマスを生産し、このバイオマスは、現在はほぼ再生不能な化石燃料のみから得られている燃料や他の有用な産物へと変換することができる。実際、これらの光合成微生物の化石化した祖先は、石炭、石油およびガスの今日の地質学的埋蔵物の主な供給源である。今日の光合成微生物のバイオマスは、限定されるわけではないが、油、潤滑剤、プラスチック、石油化学製品、および燃料を含む、多様な産物についての再生可能な原料に相当する。光合成微生物は、より高い光合成効率を有し、約１０倍の速さで増殖し、したがって単位面積あたりより多くのバイオマスを生産するため、潜在的に、陸生植物よりはるかに優れた、これら産物の供給源である。
【０００７】
光合成植物の油含量は、一般的に、低い増殖速度となる条件下で最大となる。高い増殖速度となる条件と最高の油含量となる条件とは、互いに排他的である。最短の時間で高い増殖速度と高い油含量の両方を生じうる任意の方法は、明らかに、油生産全体の速度の最高速度を生じるであろう。しかし、高い増殖速度となる条件は、一般的に、タンパク質含量を最高の含量とする。
【背景技術】
【０００８】
数千種の光合成微生物が、実験室で比較的小規模に、数ミリリットルから数百リットルの容量の範囲で、培養容器において、日常的に培養されている。しかし、商業的製造に一般に必要とされるより大規模での培養への試みは、半世紀間にも渡り数十億ドルを費やしてきた世界規模の努力にも関わらず、１０種未満でしか成功が証明されていない。
【０００９】
商業的規模で光合成微生物を培養しようとする努力の中で使用されてきた培養容器には、２つの基本的な種類がある：（１）フォトバイオリアクター（閉鎖系）、および（２）開放系である。
【００１０】
（１）閉鎖系は、主に、大気へのアクセスを制御する手段の提供によって特徴付けられる。大気とのガス交換は、制御可能な条件下で生じさせられる。二酸化炭素は増殖のための燃料として培養容器に入れられ、そして光合成のガス廃棄物である酸素は培養容器から逃がされる。（炭素は植物バイオマス内に同化し、「二酸化物」（酸素）は除かれる。）しかし、ろ過機構を介してガス交換が起こり、このろ過機構は、容器中で優先的に培養されているもの以外の光合成微生物のいかなる種も培養容器内へ進入しないように設計されている。
【００１１】
閉鎖系はまた、通常、他の環境条件の制御も可能とするように設計されている。温度、ｐＨ、栄養分濃度、および光などの環境的変数の制御の提供によって、陸生植物と同様にこうした変数の独特な組み合わせをそれぞれ好む、異なる種の微生物植物について、増殖条件を最適にすることができる。
【００１２】
所定の環境条件のセットに関して、光合成微生物のすべての種は、狭い範囲の細胞濃度内で、最大速度で増殖する。したがって、いくつかの閉鎖系は、「タービドスタット（turbidostat）」として稼働するよう設計され、そこでは、細胞濃度の関数である濁度（不透明さ）の光学的特性が、培地の光学密度を測定するプログラム可能なセンサーによってモニターされる。オペレーターは、低い値から高い値まで、許容可能な細胞濃度の所望の範囲を特定することができる。低い値は特定の低い光学密度（「低セットポイント」）に直接対応し、そして高い値は特定の高い光学密度（「高セットポイント」）に直接対応する。次いで、光学密度センサーを適宜プログラムする。光学密度が、指定された上限セットポイントを超える値に達した際、タービドスタットは、制御機構を働かせ、培養の一部を取り除いて（採取して）細胞を含まない栄養培地と交換することにより細胞濃度を希釈し、指定の下限セットポイントに適合する光学密度の値を生じさせる。次いで、細胞が増殖し、光学密度が再び上限セットポイントを超える値に達するまで、濃度が増加する。この周期が反復される。
【００１３】
好ましくは、培養容器は、光合成に活性がある照射光（可視光）の透過は可能とするがその他については培地を大気から隔離させる、ガラスまたはプラスチックのような透明な材料で主に構築される。培養容器は、多くの異なる形状を取ることもできるが、これらはすべて１つの空間的次元を共有しており、それは、その性能を制限しており、また、それは入射光の強度に関連する深さである。この特徴は、光合成の基本的特性、すなわち、光合成速度が光強度によって制限されることから生じる。したがって、任意の所定の光強度において、細胞培養の光合成速度は、照射領域の関数、すなわち光に曝露されている培地領域の関数（表面領域は培養容器の光に曝露されていない領域を含み得るので、必ずしも表面領域の関数ではない）として最大化される。戸外にあり日光に曝露されている２つの培養容器を考慮されたい。１つは固い側部および底部を有する長方形の池の形状であり、そして第二のものは地上に水平に置かれた透明な筒の形状である。長方形の池に関しては、表面領域には、池の上部、底部および側部が含まれるが、培養培地の上部領域のみが日光に曝露される。その結果、こうした戸外の池に関しては、照射面積は、表面積の半分未満に等しい。比較すると、透明な筒に関しては、表面領域は筒の全表面であり、そして日中のどの時点であるかに関わらず、表面積の半分は、常に、日光に照射されるであろう。したがって、筒に関しては、照射面積は表面積の半分に等しい。
【００１４】
光合成と光との間の関係に影響を及ぼす第二の要因は、培地中の細胞濃度である。培地内の細胞濃度が高ければ高いほど、光が浸透できる深さは浅くなる。これは、光の浸透が、細胞濃度に応じてほぼ指数関数的に減少するためである。言い換えると、細胞濃度が一定の速さで増加するならば、光はより速く消失する。したがって、細胞培養中のある程度の深さでは、光は実質的にゼロにまで減少するだろう。
【００１５】
現実的な問題として、完全な日光に曝露された光合成微生物の最適な培養深度は、一般に、１０〜２０センチメートルの範囲である。単位照射面積あたりの細胞濃度は同じであり、そしてより深いところにいる細胞は十分な光を受け取らないから、培養深度をより深くしても利点を得ることはできない。したがって、最適深度は、照射面積に関わらず、培養系の通常の稼働能力に制限を与える。この現象は、培養系の設計において、決定的に重要な特徴である。容積がより大きければ、より多くの材料が必要となり、より高い費用がかかるが、ある時点では、容積を増加させても、単位照射面積あたりの生産性が増加しない。
【００１６】
光合成微生物の培養は、培地中の細胞の均質な分布を維持するために、一般的に、攪拌または混合を必要とする。静水中の光合成微生物の自然の傾向は、密集した集合を形成することであり、集合内部では、培地の特性が培養物に有害であるよう変化する。微小規模において、集合内部では、光の利用性ならびに栄養分およびガスの濃度が、残りの培地とは非常に異なるようになり、増殖が制限される。いくつかの種は、繊毛または鞭毛として知られる付属器を有し、泳ぐことができる；こうした運動性種（「動く」種）は、能動的に集合を形成する。大部分の非運動性種は、水より重いので沈み、底部に受動的な集合を形成するであろう。こうした集合を防止するため、閉鎖系は、エアリフトまたはポンプなどの装置を用いる乱流を生成するための手段を提供しなければならない。
【００１７】
（２）開放系は、１つの決定的な特徴、すなわち大気に対して開放されている点で、閉鎖系とは異なる。この特徴は、いくつかの点で、構築および稼働の両方に対して好都合である。第一に、開放系の照射領域は、日光に直接曝露されるため、培養容器を構築するために透明な材料を用いる必要がない。これは材料の選択に広い自由度を与える。第二に、開放系の照射領域を覆うために用いられる材料がないため、材料の量および費用が約半分に減少する。第三に、開放系は、一般的に、閉鎖系よりも浄化するのがより容易である。時間が経つと、培養容器の内部表面は微生物増殖のフィルムが集積されるだろう。閉鎖系では、照射領域上のそのようなフィルムの集積は光を吸収し、その結果、光強度が減少して生産性が減少する。開放系および閉鎖系両方において、培養容器表面は、所望の種の増殖および生産に有害となり得る望ましくない種の微生物フィルムを集積させうる。どちらの場合でも、培養容器表面は、ときどき、浄化する必要があるであろう。現実問題として、開放系は、より広い浄化方法の選択が可能である。例えば、人間や、ホース、圧洗浄装置、およびスクラバーのような大きな機械的洗浄装置は、閉鎖系の限られた空間には入れないが、開放系には容易に入ることができる。
【００１８】
開放系の主要な不利点は、大気に開放されていることにより、望ましくない種に汚染されやすいことである。所望の１種のみの光合成微生物で開放系培養の稼働を始めることはできる。しかし、大気輸送や他の手段により、望ましくない種が不可避的に導入されるだろう。同じ環境条件において所望の種より迅速に増殖するような望ましくない種は、時間が経つにつれ所望の種を打ち負かし、最終的には培養物の中心となるだろう。
【００１９】
要約すると、閉鎖系は、所望の種の連続培養を開放系に比べてより長期間行なえるように、望ましくない種の汚染を防止するように具体的に設計される。しかし、閉鎖系は、構築および稼働がより複雑である。開放系は、構築用の材料のより広い選択を可能とし、そしてまた、浄化方法のより広い選択も可能とする。閉鎖系は、流体移送中の滅菌技術の使用のようなさらなる操作の実践を必要とし、これはオペレーターにより長い時間と経験とを要求する。
【００２０】
閉鎖系と開放系との理論的な相違が、実際に、明らかになってきている。１００年より少し前、最初の光合成微生物が天然から単離され、純粋な培養中で培養されたが、１９３０年代後半になるまで、単一種を化学分析が可能となるほど十分に大きい容量で培養することはできなかった。１９４０年代には、約２５リットルの実験室培養中で多様な種が培養されており、いくつかの種は、培養の環境条件を変化させることによって、油含量やタンパク質含量を細胞の総重量の６０％を超えるようにすることができることが見出された。
【００２１】
食物および動物飼料のための安価なタンパク質源としての光合成微生物への広い関心により刺激され、大規模培養の最初の試みが１９５０年代に始まった。ドイツで構築された最初の開放系は、浅く、細長い再循環水路（recirculating raceways）の形状を取り、外輪デバイス（paddlewheel device）によって流れが提供された。国が出資した事業が迅速に世界中に発展し、すべてがドイツの「開放池（open pond）」設計にしたがった。最初の開放池は、ほんの数千リットルの容量しかなかった。１９５０年代後期までには、ほぼ１００，０００リットルの容量に達し、そして１９６０年代後期までには、ほぼ１，０００，０００リットルの容量に達した。こうした容量の増加は、規模の経済をもたらした。
【００２２】
１９６０年代および１９７０年代の間、実験室にて数百種を試験し、最も優れたタンパク質生産種を開放池に増殖させる試みがなされた。数種のみが、持続培養に適することが判明した。スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）およびデュナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）などのこれらの数種は、数百エーカーを覆う開放池系において商業的製造の基礎となった。成功した商業的種は、異常に高いｐＨや塩分条件下でよく育つ「極限微生物（extremophiles）」であることが判明した。大部分の種は、多くの種が同時によく育つような天然に広がる条件を好む。２０年間の間、開放池で非極限微生物の単一種を培養するすべての試みは、同じ環境条件下でよく育つ他の種に汚染されるために、数ヶ月も経たずに失敗した。
【００２３】
光合成微生物由来の油を原料として用いて再生可能なバイオ燃料を製造する見込みが出来たことにより、１９８０年代および１９９０年代に大規模培養の新たな関心が刺激された。この期間中、例えば、米国および日本政府は、こうした努力におよそ１億５０００万ドルを出資した。こうした計画は２つの目的を共有した：まず、高濃度の油を生産する光合成微生物種を収集、同定し、次いでこれらが高濃度の油を生産する環境条件を決定すること；第二に、実験室で開発された種を用いて、バイオ燃料原料の生産のための大規模培養系の作動を設計、実施することである。どちらの計画も最初の目的では成功したが、二番目で失敗した。
【００２４】
実験室研究は、初期の発見を定量化した。数百種のカルチャー・コレクションが蓄積された。多くの株（strain）に関する研究は、一般的に、窒素が十分であると（窒素はタンパク質合成に必要である）高い増殖速度および低い油含量が促進されるが、窒素が不足すると低い増殖速度および高い油含量が生じることを立証した。いくつかの種に関しては、高い光強度または非常に高い温度などの要因によって引き起こされるストレスにより、タンパク質合成から油合成へとシフトするように種を誘導することができることが注目されている。大規模製造試験のために、最適な油生産が可能な種（最高の増殖速度で最高の油含量となる種）が選択された。
【００２５】
１９８０年代後期および１９９０年代初期に、開放池系を用いて、大規模製造が再び試みられた。稼働結果は、先の３０年間に得られた結果と同様であった。有望な油生産種をコレクションから選択し、培養物を池内に接種した。しかし、先の経験におけるように、単一種の培養を数週間または数ヶ月間を超えて維持することはできなかった。米国の計画の最終報告は、この現象を「種の性質の制御達成の不確実さ」と称した。
【００２６】
１９９０年代までに、大規模培養の状態は、１９６０年代に達成された点以上に進行しなかった。３種類の微細藻類（スピルリナ属（Spirulina）、デュナリエラ属（Dunaliella）およびクロレラ属（Chlorella））が、１００エーカーを超える広さの開放池系を用いる施設で培養されていた。多数の他の種が世界中で試みられていたが、すべて失敗に終わっていた。特に、バイオ燃料計画は、実験室外でのいかなる規模でも、所望の種を増殖させることができなかった。さらに、バイオ燃料計画は、実験室での研究から低い油含量となることが知られる条件である栄養分が十分な条件下で、可能性のある最高のバイオマス生産率を実証する試みに焦点を当てていた。大規模下で油生産を最大化する試みはなされなかった。
【００２７】
１９９０年代の初期、大気に曝露されたほとんどの種の培養は維持が不可能であることが明らかになると、大規模での閉鎖系技術がかなりの注目を受け始めた。この時点では、それまでに用いられた最大の閉鎖系は、数千リットル以下の容量であった。過去１０年の進歩によって、反応装置の容量を、約１０倍である約３０，０００リットルまで増加させることに成功している。しかしこれは、同じく１０年間（１９５０年代から１９６０年代）のうちに開放系の容量に関して達成された１，０００倍という増加割合には及ばない。
【００２８】
閉鎖系の容量の上限は、大部分が、設計に必要とされる固有の条件の直接の結果である。今日用いられるすべての基本的な閉鎖系の設計は、１９５０年代に最初に開発され、次のように分類することができる：（１）垂直なバッグ、チューブ、またはタワー；（２）平面反応装置；および（３）水平なチューブ。垂直な系は、高さの限界により制限される。完全な日光に曝露されている場合であっても、ほとんどの培養では、照射領域から１５〜２０ｃｍよりも離れた距離でも光がほぼ完全に吸収されるような高い細胞密度が達成される。この制約は、培養容器の直径を３０または４０ｃｍ以下へと制限する。例えば、１０，０００リットルを超える容量を達成するためには、４０ｃｍの直径の垂直な系では、高さは８０メートル（２６０フィート）より高くなければならない。こうした寸法は、構造工業技術において明らかな難問を提示し、たとえ達成可能であるとしても系の容積が大きくなればなるほど複雑さは増す。明らかな解決法の１つは、反応装置内に照射系を導入することであるが、経験により、これは他の問題を引き起こすことが示されており、このうち、生物付着（biofouling）は最大の問題となりうる。比較的短期間のうちに光源の表面は微生物フィルムで覆われ始める傾向があり、これは光強度を急激に減少させ、かくして光源の目的を無効にする。培養を取り除き、容器を浄化することが１つの選択肢であるが、持続した稼働が目的であるならば、あまり望ましくない。付着に抗する別の一般的な選択肢は、光源の表面を微生物に対して毒性にすることであるが、これは明らかに望ましくない。一般的に、内部照射の使用は、系をより複雑にする。
【００２９】
平面反応装置や水平チューブなどの水平な系は、垂直な系に要求される構造工業技術の必要性を排除する。構造支持体に地表を用いると、こうした系の潜在的な最大容量は無制限となるように思える。しかし、水平な系の容量は、一般的に、適切な混合を維持したり、培養容器を充填し空にするのに用いられる乱流（turbulence）の必要性によって制限される。
【００３０】
パイプまたはチャネル中の乱流はレイノルズ数によって表され、レイノルズ数は、流体の速度にパイプまたはチャネルの「特性長さ（characteristic length）」を乗じて、そして流体の粘度で割ったものとして定義される。レイノルズ数は、インチまたはポンドのようないかなる単位も有さず、したがって「１／２」や「２／３」というように、「無次元（dimensionless）」である。流体充填パイプの特性長さはその直径であり、広いチャネルの特性長さは深さである。一定の粘度の流体に関しては、流れの速度が増加するにつれて、流れはますます乱流となるだろう。乱流はまた、特性長さに比例しても増加する。これは、パイプやチャネル表面が「粘着性（sticky）」であるために起こる。表面は、流れを遅める摩擦を引き起こす。流速は表面近くではほぼゼロであり、表面から距離が離れるにつれて増加する。したがって、特性長さが小さいパイプまたはチャネルでは、表面摩擦は、平均流れに対して大きな影響を与えるだろう。対照的に、特性長さが大きいパイプまたはチャネルでは、表面摩擦は平均流れにほとんど影響せず、乱流はより大きくなるだろう。
【００３１】
表面摩擦はまた、距離に応じても加算される。ポンプによって水が推進される非常に長いパイプを想像されたい。ポンプに近い起点部では流れは乱流である。流体がパイプを移動すればするほど、流体が曝露される表面はより多くなり、流体が曝露される表面がより多くなればなるほど、流れは摩擦によって遅くなる。起点からのある点において、集積した摩擦は非常に多くのエネルギーを流体流から取り除くため、流れは乱流ではなくなる。これは、レイノルズ数が約２０００未満になったときに起こり、流れは、次いで、「層流（laminar）」と呼ばれる。
【００３２】
層流の条件では細胞が沈むかまたは泳ぐかして集合する傾向があるため、細胞培養においては層流は望ましくない。乱流は、こうした集合を妨げる。例えば、静かな池では砂粒子が迅速に底に沈むが、大きな砕波または迅速に移動する流水中では砂粒子が沈まない様子を想像されたい。
【００３３】
したがって要約すると、乱流は、非常に低い流体速度、非常に小さい特性長さ、および非常に長いチャネルを回避することによって維持される。平面反応装置または水平なチューブなどの水平な閉鎖系の特性長さは、培養の深度であり、これは先に説明したように、約２０ｃｍの実際的な上限を有する。ポンプまたはエアリフトなどの任意の数の装置を用いて、平面反応装置または水平なチューブに乱流を生じさせることができる。しかし、流れの起点からの距離が増加するにつれて、乱流エネルギーは摩擦によって失われ、ある有限の距離で流れは層流になる。層流条件において、大部分の光合成微生物の細胞は反応装置の底に沈むであろう。これは、多くの理由のために望ましくなく、少なくとも細胞の採取に問題が生じる。１つの解決法は、供給源でより多くの乱流エネルギーを提供することであるが、これは、機械的剪断が細胞自体を損傷する上限までしか許容しえない。さらに別の解決法は、例えば反応装置全体で、多数のポンプを提供することであるが、このアプローチは、構造および操作の両方にさらなる複雑さを導入する。
【００３４】
事実上、垂直な閉鎖系は、約１，０００リットル未満の容量に限定され、そして水平な閉鎖系は、約５０，０００リットル未満の容量に限定されるようである。光合成微生物の大規模培養のため、閉鎖系は、開放系よりも、構築および稼働にはるかにより費用がかかり、そして複雑である。これは、各独立系が、それぞれ独立した基礎構造、すなわち、乱流の混合、培地の導入・除去、およびｐＨや温度などの変数の監視と制御を提供するための装置または機構のセット、を要求するからである。所与の面積の陸地を開放系で覆うよりも、同じ面積の陸地を閉鎖系で覆う方が、少なくとも１０倍多い基礎構造が必要であり、閉鎖系培養ははるかに複雑となる。
【００３５】
実際に、光合成微生物のすべての培養系は、何らかの規模で、開放系と閉鎖系の両方の組み合わせを含む。すべての培養系は、規模に関わらず、究極的には、細胞の最初の接種のために世界中で日常的に維持されているカルチャー・コレクション（culture collection）に依存する。すべてのカルチャー・コレクションは、その細胞培養をペトリ皿、試験管、または滅菌フラスコ中に排他的に維持しており、これらはすべて厳密に言うと閉鎖系である。開放系から「純粋に」なると考えることができる大規模製造系であっても、最初の接種材料を供給するには、究極的に、閉鎖系に頼らなければならない。
【００３６】
光合成微生物の生産のための主要な技術的な難問は、開放系技術が、経済的であり比較的操作が容易である大きな規模に進歩してきているが、所望の微生物の持続可能な生産を提供することができないことである。対照的に、閉鎖系は、所望の微生物の持続可能な生産を提供するが、最大規模の場合であっても、費用が高くまた操作が複雑である。
【００３７】
したがって、汚染の可能性を減少させることにより持続可能な生産を提供し、それでもなお構築または操作の複雑さやコストを実質的に増加させない生産方法についての必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
したがって、本発明の目的は、容易に構築でき、構築または操作の複雑さやコストを増加させない、光合成微生物を持続可能に大規模で生産するための有効な方法を提供することである。
【００３９】
光合成微生物からの油および他の有用な産物の生産を最適にするのに特に適した生産方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。油および他の有用な産物は、次いで、集合したバイオマスから、多様な化学的方法により抽出及び精製することができる。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
発明の概要
これらおよび他の目的は、連続生産の第一段階を閉鎖系で行いバッチ生産の第二段階を開放系で行なう２段階の連続−バッチ生産方法によって達成される。最初に、光と栄養分とが適切な条件下で十分な二酸化炭素を供給した場合に１６時間ごとに少なくとも倍となる速さで増殖することができる微生物を、選択（例えば遺伝子修飾による生成を含む）しなければならない。こうした遺伝子修飾は、例えば、R. Leon-Nanares、
D.Gonzalez-Ballester、A. Galvan、及びE. Fernandezによる“Transgenic microalgae as green cell-fractories”（Trends in Biotechnology, Volume 22(1), pp. 45-52, 2004）に開示されており、これは本明細書に組み込まれる。例えば、今のところ、以下の種および／または株を用いて、本発明を実施することが好ましい：（ｉ）テトラセルミス・スエシカ（Tetraselmis suecica）、ハワイ大学カルチャー・コレクションの「ＴＥＴＲＡ１」株；イソクリシス・ガルバナ（Isochrysis galbana）、ハワイ大学カルチャー・コレクションの「ＩＳＯＣＨ１」株；（ｉｉｉ）ファエオダクチルム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）、ハワイ大学カルチャー・コレクションの「ＰＨＡＥＯ１」または「ＰＨＡＥＯ２」株；あるいは（ｉｖ）ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属、特に、“The cell composition of Nannochloropsis sp. changes under different irradiances in semicontinuous culture,”World Journal of Microbiology and Biotechnology, Vol. 20, pp. 31-35, 2004に報告されFabregasらに用いられたＡ．スケニク（A. Sukenik）株。ハワイ大学カルチャー・コレクションには、特に光合成微生物からバイオ燃料を製造する目的で米国天然再生可能エネルギー研究所（ＮＲＥＬ）により１９８０年代および１９９０年代に蓄積された数百の種および株の全カルチャー・コレクションが含まれる。使用可能なさらなる種には、デュナリエラ・プリモレクタ（Dunaliella primolecta）およびニツシア・クロステリウム（Nitzschia closterium）が含まれる。特に、閉鎖系は、培養の総陸地面積の２０％を超える培養物を含むべきではなく、すなわち、総面積は、閉鎖系領域に加えて開放系領域によって占められる。さらに、光合成微生物のすべての種が所定の環境条件のセット下で単位照射面積あたり最大のバイオマス（「収容能力（carrying capacity）」）に達することを考えるならば、開放系培養を開始するまたは該培養に「接種する」閉鎖系により提供されるバイオマスの量は、開放系の収容能力の５％を超えるようにすべきである。開放系培養の収容能力を最大にするためには、栄養分ではなく光が収容能力を制限するように、開放系培養には十分な栄養分が与えられなければならない。さらに、開放系のいかなるバッチ培養も、５日間を超える期間（「滞留時間（residence time）」）持続させるべきではない。
【００４１】
閉鎖系領域により占められる総陸地面積の２０％の制限は、全生産施設の構築および操作の複雑さの最小化を確保させる。最小のバイオマス接種量および最大の滞留時間の提供は、望まれない種による開放系培養の汚染リスクを取るに足らない程度にまで減少させることを保証する。この方法は、上記の増殖速度要求を満たす任意の光合成微生物種に使用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
好ましい態様の説明
生産施設での活性培養中の総陸地面積が、２０％以下の閉鎖系領域および８０％以上の開放系領域で構成されることが好ましい。この目的の開放系領域の計算は、生産施設中のすべての開放系が培地を含有すると仮定した際は、開放系中の培地の照射面積のみを意味する。しかし、閉鎖系領域の計算には、反応装置によって覆われる「計画的領域（plan area）」と、隣接する反応装置容器間のあらゆる「不活性領域（inert area）」の両方が含まれる。例えば、一連の水平なチューブ状閉鎖系によって占められる陸地の面積を想像されたい。計画的領域は反応装置自体によって覆われ（例えば、直径１フィートで長さ１０フィートのチューブは１０平方フィートの領域を覆う）、そして培地の照射面積に等しい。しかし、反応装置によって覆われていない隣接するチューブ間のさらなる不活性領域も存在しうる。閉鎖系によって必要とされる陸地の総面積、すなわち閉鎖系領域は、不活性領域を加えた計画的領域である。例えるならば、文章を書くにはこのページの全領域が必要であるが、書かれたもの自体はページの総面積の一部しか占めない。
【００４３】
２０％の閉鎖系領域および８０％の開放系領域の提供により、完全に閉鎖系で構成される施設に比較して生産施設の構築および稼働の全体の複雑さが実質的に減少するため、より高い効率が確実となる。
【００４４】
（１）閉鎖系により提供される開放系に接種するためのバイオマスの量が、開放系総計の収容能力の５％を超えるものに等しく；（２）培養されている種の増殖速度が、１日あたりほぼ１．５倍となるよりも大きく（すなわち、細胞バイオマスが、ほぼ１６時間ごとに倍増する）；そして（３）いかなる培養も、開放系において５日間より長い期間維持されない、ことが好ましい。これらの３つの限定の組み合わせにより、いかなる状況下でも、培養が、５日間以下のうちに収容能力の少なくとも約９０％に等しい所望微生物のバイオマスに達することが確実となる。これは、いくつかの理由で重要である。第一に、比較的高い細胞濃度（すなわち収容能力の５％より高い）で接種される培養は、不注意に導入される可能性がある望まれない細胞に対して、培地中で優位となるだろう。第二に、多くの種は１６時間ごとに１回倍増する（１日あたり１．５倍）よりも実質的に低い速度で増殖するため、この迅速に増殖できる種は、ほとんどの潜在的な競合相手に打ち勝つであろう。第三に、大量の接種材料（収容能力の５％より多い）および高い増殖速度（１６時間ごとに倍増より多い）の組み合わせは、総バイオマスを、５日間以内に、収容能力に非常に近づけることを確実とする。これらの条件は、（１）汚染のリスクを減少させ、（２）総バイオマスの生産、あるいは油の生合成または生産を促進するのに重要である。第一に、潜在的な汚染物質は多量の接種量を有する必要があり、所望の種より迅速に増殖して５日間以内に培地中で優位を占める必要があるだろう。第二に、培養が収容能力の５０％を超えると、増殖のための資源が制限されてくるため、収容能力に近い培養では特に油生産が優位となる。増殖を支える資源が制限されることによって、一般的に、油の生合成が刺激される。
【００４５】
二酸化炭素を培地中に溶解させるような方法で、細胞培養に気体状二酸化炭素を供給することが好ましい。この方法は、増殖に必要な炭素の安定した供給源を提供するだけでなく、二酸化炭素が除去されるにつれて培地のｐＨは増加する傾向があり増殖に好ましくない状態となるが、そのようなことなく培地のｐＨを多かれ少なかれ安定して維持する効果も有する。最適には、この方法のため、二酸化炭素は、資源抽出法（油またはガスのための掘削など）あるいは工業製造法または化石燃料燃焼発電所（これらはすべて、二酸化炭素が豊富なガスの廃棄物流を含む）からの点源放出によって提供される。本明細書に記載する方法は、二酸化炭素廃棄物を大気内に放出することを回避し、その代わりに、二酸化炭素廃棄物を潜在的に有用なバイオマスに変換する。
【００４６】
好ましい条件について改善をしてもよい。最適には、１日以内に開放系総計の収容能力に近づけてもよく、これはさらに汚染の可能性を減少させるであろう。これは、１日あたり６回の倍増（細胞バイオマスが約４時間ごとに倍増するのに等しい）より高い増殖速度を持つ種について、最初の接種量を開放系収容能力総計の１５％用いることによって達成できる。この例では、種は閉鎖系と開放系の両方において同じ速度で増殖し、また、この種は閉鎖系と開放系の両方において単位面積あたり同じ濃度のバイオマスに達することを想像されたい。ここで、閉鎖系が総陸地面積の２０％を占めるならば、開放系の１５％の接種は、閉鎖系培養の７５％を取り除くことによって得られるであろう（すなわち７５％ｘ ２０％ ＝ １５％）。開放系において１５％の接種材料を用いると、細胞バイオマスは最初の４時間で３０％に倍増し、次の４時間で６０％に倍増し、そして次の４時間未満で１００％（すなわち、その収容能力）に達しうる。閉鎖系は、ほぼ同じ時間内に、接種前のバイオマスまで回復するであろう。閉鎖系は、接種材料が取り除かれた後、元のバイオマスの２５％しか含有せず、最初の４時間で元のバイオマスの５０％へと倍増し、次の４時間で再び倍増し、この時点で元のバイオマスの１００％になる。この例では、開放系の収容能力は１日以内に達成され、そして同じ日のうちに、閉鎖系のバイオマスが最初の値まで回復する。光合成微生物に関して記録された最も高い指数関数的増殖速度は、１日あたり約８回未満の倍増（約３時間ごとに倍増するのに等しい）であり、最初の接種材料をより多い量用いると、より短い時間でさらにすぐれた結果を得ることができる。
【００４７】
１日あたり約１．５回の倍増より高い増殖速度を持つ種を用い、収容能力の少なくとも５％のバイオマスを開放系に接種し、そして接種から５日以内に培養を採取する好ましい方法は、比較的高い油含量を確実とする。これはまた、開放系培養が望ましくない種に汚染されるようになるには通常５日より長く（通常数週間）かかることが数十年の経験により示されているので、開放系培養が有意に汚染されないことも確実とする。
【００４８】
好ましい方法を実施するため、開放系の収容能力をまず決定する必要がある。乱流環境中で過剰な栄養分を提供されたほとんどの種の収容能力は、一般的に、照射面積の平方メートルあたり約１００〜５００グラムの乾燥重量の範囲である。この範囲内の変動は、主に、制限要因としての光強度、より具体的には、太陽の１日の総光エネルギーに依存するであろう。例えば、晴れた日の総「照射量（irradiance）」（太陽の光エネルギー）は、曇った日の約２倍程度である。収容能力における対応する相違は、ほぼ同じ、すなわちほぼ２倍であろう。さらに、平均照射量は熱帯で最高となり、より高い緯度では減少する。例えば、熱帯のホノルルでの平均照射量は、ニューヨークにおけるより約４０％高く、そして北部アラスカにおけるより約２倍高い。したがって、アラスカにおける平均収容能力は、ハワイの半分でしかない。１年で最大の照射量は、１年で最も昼が長いときに生じる。熱帯の北または南では、これは夏の最初の日（夏至）に起こる。赤道では、最大の１日照射量は春の最初の日（春分）そして再び秋の最初の日（秋分）の年２回生じ、このとき太陽は真上を通過する。熱帯ではいずれでも最大の１日照射量が年２回生じ、それは春分と秋分との間のいずれかの時点である。
【００４９】
光合成微生物の所望の種に関する系の収容能力は、以下のように実験的に決定すべきである。生産施設中の開放系が異なる寸法を有する場合は、収容能力の計算は異なる寸法を有する系の各セットについて決定すべきである。好ましくは、収容能力の決定は、１日照射量が１年の最大である時点の約１５日間以内に行うべきである。開放系は、閉鎖系により提供される培養をある容量で接種すべきであり、そして開放系を、ほぼ標準的な稼働能力となるまで、栄養培地で満たすべきである。主要栄養素（すなわち無機窒素およびリン）濃度は過剰に提供すべきであり、これは、開放系のバイオマスが最大に達してもなお主要栄養素が測定可能な濃度で存在する（微生物がすべての食物を食べつくさない）ことを実証することにより定義される。接種後、開放系のバイオマスの測定を、バイオマスが増加しなくなる時点まで、少なくとも１日に数回うべきである。増加が停止した時点のバイオマスが、その収容能力である。測定は、指定された期間中少なくとも数回反復して行なうべきであり、これらの測定の平均を計算して最大収容能力を定義すべきである。
【００５０】
本発明を、本明細書に記載される現在好ましい態様に関して開示してきたが、当業者は、本発明の精神および範囲内に属する他の態様がありうることを認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に記載するものに限定されず、請求項によってのみ限定される。例えば、本発明は、異なる種類の開放系および閉鎖系を用いて行なわれてもよい。さらに、本発明は、非常に多様な増殖速度および収容能力を持つ光合成微生物を用いて行ってもよく、また、本発明は、その油分のために培養されている種に限定されず、また、種がバイオマス生産の最大速度に達しているかあるいは増殖を停止しているかどうかに関わらず、バッチ培養で他の価値ある産物を蓄積する種もまた含むことができる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
産業適用性 本発明は、望ましくない種による実質的な汚染を回避しつつ、開放系において光合成微生物の任意の特定の種を生産することが望ましい場合にはいつでも用いることができる。光合成微生物からこうして生産されるバイオマスは、現在は炭素の化石鉱床から得られている原料、すなわち石炭、石油、およびガス、にほぼ排他的に頼っている製品を製造するための再生可能な原料として用いることができる。例えば、光合成微生物の油部分を抽出し、バイオディーゼルなどの輸送燃料や潤滑剤へと化学的に変換してもよい。あるいは、バイオマス燃料を、流動床ガス化、熱分解、または噴流床ガス化などのプロセスに用いてもよく、続いて、ここから生じた材料を、バイオディーゼルやジメチルエーテルなどの輸送燃料、あるいはメタノールや混合アルコールなどのバルク化学薬品、また、出発材料または原料として化石燃料を用いる任意の製品を製造するために用いてもよい。さらに、上記プロセスのいずれから生じる炭素含有廃棄物は、嫌気性消化をしてメタン（天然ガス）を生じさせるなどの方法や、または電気を生じる発電所において他の可燃性燃料と同時に燃焼するなどの方法によって、さらにエネルギーを生じさせることもできるだろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光合成微生物から、油および他の有用な産物を製造するための方法に関する。該方法は、好ましくは、化石燃料（石炭、石油およびガス）燃焼発電所からの煙道ガス（stack gas）などの工業的または資源抽出実施によって引き起こされる二酸化炭素の大きな点源を利用し、かくしてその二酸化炭素の放出を減少させる。該方法は、再生可能な燃料−例えば、直接、バイオディーゼルなどの液体輸送燃料とすることも可能な植物油−を含む、有用な産物を製造する。
【０００２】
該方法は、潜在的に、二酸化炭素の地球規模放出を減少させ、かつ、現在は主に地質的石油（geopetroleum）から作製される燃料および他の有用な産物を製造する出発材料としてのバイオマス原料を生産するために、非常に重要である。第一に、化石燃料燃焼発電所は、現在、世界の二酸化炭素放出の約１／３を占めている。二酸化炭素は、地球温暖化の主な原因であると科学者らに考えられている、いわゆる「温室効果ガス」である。二酸化炭素廃棄物の主な点源には、（ｉ）化学薬品の製造、ならびに油およびガスの精製などの、多様な工業的実施に由来する煙道ガス、ならびに（ｉｉ）油および天然ガスの地質学的採取によって生じる付随的放出が含まれる。第二に、本明細書に記載する方法は、燃料を燃焼させることによって生じるのとまさに同じ二酸化炭素廃棄物を、微小植物を用いて直接使用してさらにさらなる燃料を生成するか、または化学薬品製造によって生じる二酸化炭素廃棄物を用いてさらにさらなる化学薬品を生成する。最も重要なことには、この方法における微小植物の使用は、煙道ガスが大気内に放出される前に煙道ガスを使用することを可能にし（これは陸生植物によっては達成不能な偉業である）、かくして大気放出を減少させる。
【０００３】
バイオ燃料および生物学系化学的製品の原料の供給源として、光合成微生物が陸生植物より勝る１つの大きな理由は、これらが、単位面積あたり、およそ１０倍の生産性を有することである。陸生植物の低い生産性は、バイオ燃料の製造において大きなボトルネックである。これは、輸送のみによって消費される燃料の量が生産されるバイオ燃料の量を容易に超えうるほどの遠い距離に渡って、原料物質をバイオプロセスプラントに輸送しなければならず、バイオプロセスプラントの経済的に実用的なサイズが制限されるためである。約１０倍高い生産性を有する光合成微生物を用いることによって、バイオマス原料（微生物）を輸送する費用および燃料消費が減少するため、バイオプロセスプラントは、約１０倍高い能力を有しうる。
【０００４】
発電所煙道ガスは、油または石炭を燃焼しているかどうかに応じて、それぞれ、典型的には、５％〜１５％の範囲の二酸化炭素を含有する。工業製造プロセスからの煙道ガス廃棄物は、比較的多量の二酸化炭素を含有し、そして資源抽出中に生じる廃棄物流は、ほぼ純粋な二酸化炭素からなることもありうる。すべての植物は二酸化炭素を用い、そして微小植物は水媒体中に生存し、そして（しばしば必要とされることだが）５％以上の二酸化炭素濃度に耐えることも可能である。一方、陸生植物は、現在は約０．０３５％の濃度の二酸化炭素を有するガス性媒体（地球の大気）に生存するが、煙道ガス中に見られる百倍以上高い濃度には耐えられない。
【０００５】
具体的には、本発明は、光合成微生物（細菌、シアノバクテリア、および藻類を含む単細胞生物）の水性培養を、閉鎖フォトバイオリアクター中、栄養分が十分な条件下で連続指数関数的増殖状態に維持し、ここから一部を定期的に取り除いて、開放培養系中のバッチ培養に接種する、２段階培養法、すなわち「連続−バッチ・ハイブリッド法」に関し、該開放培養系では、最初の高い光強度および栄養分濃度の条件により連続した指数関数的増殖が短期間維持されるが、細胞の増殖のため、栄養分がすぐに枯渇し、光が制限要因となる（この条件は油生合成を支持し、より高い細胞性油含量を生じさせる）。「栄養分」は、本明細書に定義する際、一般的に多量に供給され増殖のための主な食物となる窒素およびリンの化合物であるいわゆる「多量栄養素」と、一般的に非常に少量で供給されるビタミンや鉄またはマグネシウムのような微量金属含有化合物を含む「微量栄養素」とで構成される。全体的に見て、連続−バッチ・ハイブリッド法は、連続またはバッチいずれかの単一段階法によって得られるものよりも、高い油生産性を生じる。さらに、本発明は、閉鎖系に比べて操作時にほとんど技術や経験を必要としないが他の点では大規模培養への信頼性はないと認められている開放培養系の、信頼性のある使用のための方法論を提供する。
【０００６】
光合成微生物は単細胞植物であり、多細胞（独立には生存不能である分化細胞）陸生植物と同様にバイオマスを生産し、このバイオマスは、現在はほぼ再生不能な化石燃料のみから得られている燃料や他の有用な産物へと変換することができる。実際、これらの光合成微生物の化石化した祖先は、石炭、石油およびガスの今日の地質学的埋蔵物の主な供給源である。今日の光合成微生物のバイオマスは、限定されるわけではないが、油、潤滑剤、プラスチック、石油化学製品、および燃料を含む、多様な産物についての再生可能な原料に相当する。光合成微生物は、より高い光合成効率を有し、約１０倍の速さで増殖し、したがって単位面積あたりより多くのバイオマスを生産するため、潜在的に、陸生植物よりはるかに優れた、これら産物の供給源である。
【０００７】
光合成植物の油含量は、一般的に、低い増殖速度となる条件下で最大となる。高い増殖速度となる条件と最高の油含量となる条件とは、互いに排他的である。最短の時間で高い増殖速度と高い油含量の両方を生じうる任意の方法は、明らかに、油生産全体の速度の最高速度を生じるであろう。しかし、高い増殖速度となる条件は、一般的に、タンパク質含量を最高の含量とする。
【背景技術】
【０００８】
数千種の光合成微生物が、実験室で比較的小規模に、数ミリリットルから数百リットルの容量の範囲で、培養容器において、日常的に培養されている。しかし、商業的製造に一般に必要とされるより大規模での培養への試みは、半世紀間にも渡り数十億ドルを費やしてきた世界規模の努力にも関わらず、１０種未満でしか成功が証明されていない。
【０００９】
商業的規模で光合成微生物を培養しようとする努力の中で使用されてきた培養容器には、２つの基本的な種類がある：（１）フォトバイオリアクター（閉鎖系）、および（２）開放系である。
【００１０】
（１）閉鎖系は、主に、大気へのアクセスを制御する手段の提供によって特徴付けられる。大気とのガス交換は、制御可能な条件下で生じさせられる。二酸化炭素は増殖のための燃料として培養容器に入れられ、そして光合成のガス廃棄物である酸素は培養容器から逃がされる。（炭素は植物バイオマス内に同化し、「二酸化物」（酸素）は除かれる。）しかし、ろ過機構を介してガス交換が起こり、このろ過機構は、容器中で優先的に培養されているもの以外の光合成微生物のいかなる種も培養容器内へ進入しないように設計されている。
【００１１】
閉鎖系はまた、通常、他の環境条件の制御も可能とするように設計されている。温度、ｐＨ、栄養分濃度、および光などの環境的変数の制御の提供によって、陸生植物と同様にこうした変数の独特な組み合わせをそれぞれ好む、異なる種の微生物植物について、増殖条件を最適にすることができる。
【００１２】
所定の環境条件のセットに関して、光合成微生物のすべての種は、狭い範囲の細胞濃度内で、最大速度で増殖する。したがって、いくつかの閉鎖系は、「タービドスタット（turbidostat）」として稼働するよう設計され、そこでは、細胞濃度の関数である濁度（不透明さ）の光学的特性が、培地の光学密度を測定するプログラム可能なセンサーによってモニターされる。オペレーターは、低い値から高い値まで、許容可能な細胞濃度の所望の範囲を特定することができる。低い値は特定の低い光学密度（「低セットポイント」）に直接対応し、そして高い値は特定の高い光学密度（「高セットポイント」）に直接対応する。次いで、光学密度センサーを適宜プログラムする。光学密度が、指定された上限セットポイントを超える値に達した際、タービドスタットは、制御機構を働かせ、培養の一部を取り除いて（採取して）細胞を含まない栄養培地と交換することにより細胞濃度を希釈し、指定の下限セットポイントに適合する光学密度の値を生じさせる。次いで、細胞が増殖し、光学密度が再び上限セットポイントを超える値に達するまで、濃度が増加する。この周期が反復される。
【００１３】
好ましくは、培養容器は、光合成に活性がある照射光（可視光）の透過は可能とするがその他については培地を大気から隔離させる、ガラスまたはプラスチックのような透明な材料で主に構築される。培養容器は、多くの異なる形状を取ることもできるが、これらはすべて１つの空間的次元を共有しており、それは、その性能を制限しており、また、それは入射光の強度に関連する深さである。この特徴は、光合成の基本的特性、すなわち、光合成速度が光強度によって制限されることから生じる。したがって、任意の所定の光強度において、細胞培養の光合成速度は、照射領域の関数、すなわち光に曝露されている培地領域の関数（表面領域は培養容器の光に曝露されていない領域を含み得るので、必ずしも表面領域の関数ではない）として最大化される。戸外にあり日光に曝露されている２つの培養容器を考慮されたい。１つは固い側部および底部を有する長方形の池の形状であり、そして第二のものは地上に水平に置かれた透明な筒の形状である。長方形の池に関しては、表面領域には、池の上部、底部および側部が含まれるが、培養培地の上部領域のみが日光に曝露される。その結果、こうした戸外の池に関しては、照射面積は、表面積の半分未満に等しい。比較すると、透明な筒に関しては、表面領域は筒の全表面であり、そして日中のどの時点であるかに関わらず、表面積の半分は、常に、日光に照射されるであろう。したがって、筒に関しては、照射面積は表面積の半分に等しい。
【００１４】
光合成と光との間の関係に影響を及ぼす第二の要因は、培地中の細胞濃度である。培地内の細胞濃度が高ければ高いほど、光が浸透できる深さは浅くなる。これは、光の浸透が、細胞濃度に応じてほぼ指数関数的に減少するためである。言い換えると、細胞濃度が一定の速さで増加するならば、光はより速く消失する。したがって、細胞培養中のある程度の深さでは、光は実質的にゼロにまで減少するだろう。
【００１５】
現実的な問題として、完全な日光に曝露された光合成微生物の最適な培養深度は、一般に、１０〜２０センチメートルの範囲である。単位照射面積あたりの細胞濃度は同じであり、そしてより深いところにいる細胞は十分な光を受け取らないから、培養深度をより深くしても利点を得ることはできない。したがって、最適深度は、照射面積に関わらず、培養系の通常の稼働能力に制限を与える。この現象は、培養系の設計において、決定的に重要な特徴である。容積がより大きければ、より多くの材料が必要となり、より高い費用がかかるが、ある時点では、容積を増加させても、単位照射面積あたりの生産性が増加しない。
【００１６】
光合成微生物の培養は、培地中の細胞の均質な分布を維持するために、一般的に、攪拌または混合を必要とする。静水中の光合成微生物の自然の傾向は、密集した集合を形成することであり、集合内部では、培地の特性が培養物に有害であるよう変化する。微小規模において、集合内部では、光の利用性ならびに栄養分およびガスの濃度が、残りの培地とは非常に異なるようになり、増殖が制限される。いくつかの種は、繊毛または鞭毛として知られる付属器を有し、泳ぐことができる；こうした運動性種（「動く」種）は、能動的に集合を形成する。大部分の非運動性種は、水より重いので沈み、底部に受動的な集合を形成するであろう。こうした集合を防止するため、閉鎖系は、エアリフトまたはポンプなどの装置を用いる乱流を生成するための手段を提供しなければならない。
【００１７】
（２）開放系は、１つの決定的な特徴、すなわち大気に対して開放されている点で、閉鎖系とは異なる。この特徴は、いくつかの点で、構築および稼働の両方に対して好都合である。第一に、開放系の照射領域は、日光に直接曝露されるため、培養容器を構築するために透明な材料を用いる必要がない。これは材料の選択に広い自由度を与える。第二に、開放系の照射領域を覆うために用いられる材料がないため、材料の量および費用が約半分に減少する。第三に、開放系は、一般的に、閉鎖系よりも浄化するのがより容易である。時間が経つと、培養容器の内部表面は微生物増殖のフィルムが集積されるだろう。閉鎖系では、照射領域上のそのようなフィルムの集積は光を吸収し、その結果、光強度が減少して生産性が減少する。開放系および閉鎖系両方において、培養容器表面は、所望の種の増殖および生産に有害となり得る望ましくない種の微生物フィルムを集積させうる。どちらの場合でも、培養容器表面は、ときどき、浄化する必要があるであろう。現実問題として、開放系は、より広い浄化方法の選択が可能である。例えば、人間や、ホース、圧洗浄装置、およびスクラバーのような大きな機械的洗浄装置は、閉鎖系の限られた空間には入れないが、開放系には容易に入ることができる。
【００１８】
開放系の主要な不利点は、大気に開放されていることにより、望ましくない種に汚染されやすいことである。所望の１種のみの光合成微生物で開放系培養の稼働を始めることはできる。しかし、大気輸送や他の手段により、望ましくない種が不可避的に導入されるだろう。同じ環境条件において所望の種より迅速に増殖するような望ましくない種は、時間が経つにつれ所望の種を打ち負かし、最終的には培養物の中心となるだろう。
【００１９】
要約すると、閉鎖系は、所望の種の連続培養を開放系に比べてより長期間行なえるように、望ましくない種の汚染を防止するように具体的に設計される。しかし、閉鎖系は、構築および稼働がより複雑である。開放系は、構築用の材料のより広い選択を可能とし、そしてまた、浄化方法のより広い選択も可能とする。閉鎖系は、流体移送中の滅菌技術の使用のようなさらなる操作の実践を必要とし、これはオペレーターにより長い時間と経験とを要求する。
【００２０】
閉鎖系と開放系との理論的な相違が、実際に、明らかになってきている。１００年より少し前、最初の光合成微生物が天然から単離され、純粋な培養中で培養されたが、１９３０年代後半になるまで、単一種を化学分析が可能となるほど十分に大きい容量で培養することはできなかった。１９４０年代には、約２５リットルの実験室培養中で多様な種が培養されており、いくつかの種は、培養の環境条件を変化させることによって、油含量やタンパク質含量を細胞の総重量の６０％を超えるようにすることができることが見出された。
【００２１】
食物および動物飼料のための安価なタンパク質源としての光合成微生物への広い関心により刺激され、大規模培養の最初の試みが１９５０年代に始まった。ドイツで構築された最初の開放系は、浅く、細長い再循環水路（recirculating raceways）の形状を取り、外輪デバイス（paddlewheel device）によって流れが提供された。国が出資した事業が迅速に世界中に発展し、すべてがドイツの「開放池（open pond）」設計にしたがった。最初の開放池は、ほんの数千リットルの容量しかなかった。１９５０年代後期までには、ほぼ１００，０００リットルの容量に達し、そして１９６０年代後期までには、ほぼ１，０００，０００リットルの容量に達した。こうした容量の増加は、規模の経済をもたらした。
【００２２】
１９６０年代および１９７０年代の間、実験室にて数百種を試験し、最も優れたタンパク質生産種を開放池に増殖させる試みがなされた。数種のみが、持続培養に適することが判明した。スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）およびデュナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）などのこれらの数種は、数百エーカーを覆う開放池系において商業的製造の基礎となった。成功した商業的種は、異常に高いｐＨや塩分条件下でよく育つ「極限微生物（extremophiles）」であることが判明した。大部分の種は、多くの種が同時によく育つような天然に広がる条件を好む。２０年間の間、開放池で非極限微生物の単一種を培養するすべての試みは、同じ環境条件下でよく育つ他の種に汚染されるために、数ヶ月も経たずに失敗した。
【００２３】
光合成微生物由来の油を原料として用いて再生可能なバイオ燃料を製造する見込みが出来たことにより、１９８０年代および１９９０年代に大規模培養の新たな関心が刺激された。この期間中、例えば、米国および日本政府は、こうした努力におよそ１億５０００万ドルを出資した。こうした計画は２つの目的を共有した：まず、高濃度の油を生産する光合成微生物種を収集、同定し、次いでこれらが高濃度の油を生産する環境条件を決定すること；第二に、実験室で開発された種を用いて、バイオ燃料原料の生産のための大規模培養系の作動を設計、実施することである。どちらの計画も最初の目的では成功したが、二番目で失敗した。
【００２４】
実験室研究は、初期の発見を定量化した。数百種のカルチャー・コレクションが蓄積された。多くの株（strain）に関する研究は、一般的に、窒素が十分であると（窒素はタンパク質合成に必要である）高い増殖速度および低い油含量が促進されるが、窒素が不足すると低い増殖速度および高い油含量が生じることを立証した。いくつかの種に関しては、高い光強度または非常に高い温度などの要因によって引き起こされるストレスにより、タンパク質合成から油合成へとシフトするように種を誘導することができることが注目されている。大規模製造試験のために、最適な油生産が可能な種（最高の増殖速度で最高の油含量となる種）が選択された。
【００２５】
１９８０年代後期および１９９０年代初期に、開放池系を用いて、大規模製造が再び試みられた。稼働結果は、先の３０年間に得られた結果と同様であった。有望な油生産種をコレクションから選択し、培養物を池内に接種した。しかし、先の経験におけるように、単一種の培養を数週間または数ヶ月間を超えて維持することはできなかった。米国の計画の最終報告は、この現象を「種の性質の制御達成の不確実さ」と称した。
【００２６】
１９９０年代までに、大規模培養の状態は、１９６０年代に達成された点以上に進行しなかった。３種類の微細藻類（スピルリナ属（Spirulina）、デュナリエラ属（Dunaliella）およびクロレラ属（Chlorella））が、１００エーカーを超える広さの開放池系を用いる施設で培養されていた。多数の他の種が世界中で試みられていたが、すべて失敗に終わっていた。特に、バイオ燃料計画は、実験室外でのいかなる規模でも、所望の種を増殖させることができなかった。さらに、バイオ燃料計画は、実験室での研究から低い油含量となることが知られる条件である栄養分が十分な条件下で、可能性のある最高のバイオマス生産率を実証する試みに焦点を当てていた。大規模下で油生産を最大化する試みはなされなかった。
【００２７】
１９９０年代の初期、大気に曝露されたほとんどの種の培養は維持が不可能であることが明らかになると、大規模での閉鎖系技術がかなりの注目を受け始めた。この時点では、それまでに用いられた最大の閉鎖系は、数千リットル以下の容量であった。過去１０年の進歩によって、反応装置の容量を、約１０倍である約３０，０００リットルまで増加させることに成功している。しかしこれは、同じく１０年間（１９５０年代から１９６０年代）のうちに開放系の容量に関して達成された１，０００倍という増加割合には及ばない。
【００２８】
閉鎖系の容量の上限は、大部分が、設計に必要とされる固有の条件の直接の結果である。今日用いられるすべての基本的な閉鎖系の設計は、１９５０年代に最初に開発され、次のように分類することができる：（１）垂直なバッグ、チューブ、またはタワー；（２）平面反応装置；および（３）水平なチューブ。垂直な系は、高さの限界により制限される。完全な日光に曝露されている場合であっても、ほとんどの培養では、照射領域から１５〜２０ｃｍよりも離れた距離でも光がほぼ完全に吸収されるような高い細胞密度が達成される。この制約は、培養容器の直径を３０または４０ｃｍ以下へと制限する。例えば、１０，０００リットルを超える容量を達成するためには、４０ｃｍの直径の垂直な系では、高さは８０メートル（２６０フィート）より高くなければならない。こうした寸法は、構造工業技術において明らかな難問を提示し、たとえ達成可能であるとしても系の容積が大きくなればなるほど複雑さは増す。明らかな解決法の１つは、反応装置内に照射系を導入することであるが、経験により、これは他の問題を引き起こすことが示されており、このうち、生物付着（biofouling）は最大の問題となりうる。比較的短期間のうちに光源の表面は微生物フィルムで覆われ始める傾向があり、これは光強度を急激に減少させ、かくして光源の目的を無効にする。培養を取り除き、容器を浄化することが１つの選択肢であるが、持続した稼働が目的であるならば、あまり望ましくない。付着に抗する別の一般的な選択肢は、光源の表面を微生物に対して毒性にすることであるが、これは明らかに望ましくない。一般的に、内部照射の使用は、系をより複雑にする。
【００２９】
平面反応装置や水平チューブなどの水平な系は、垂直な系に要求される構造工業技術の必要性を排除する。構造支持体に地表を用いると、こうした系の潜在的な最大容量は無制限となるように思える。しかし、水平な系の容量は、一般的に、適切な混合を維持したり、培養容器を充填し空にするのに用いられる乱流（turbulence）の必要性によって制限される。
【００３０】
パイプまたはチャネル中の乱流はレイノルズ数によって表され、レイノルズ数は、流体の速度にパイプまたはチャネルの「特性長さ（characteristic length）」を乗じて、そして流体の粘度で割ったものとして定義される。レイノルズ数は、インチまたはポンドのようないかなる単位も有さず、したがって「１／２」や「２／３」というように、「無次元（dimensionless）」である。流体充填パイプの特性長さはその直径であり、広いチャネルの特性長さは深さである。一定の粘度の流体に関しては、流れの速度が増加するにつれて、流れはますます乱流となるだろう。乱流はまた、特性長さに比例しても増加する。これは、パイプやチャネル表面が「粘着性（sticky）」であるために起こる。表面は、流れを遅める摩擦を引き起こす。流速は表面近くではほぼゼロであり、表面から距離が離れるにつれて増加する。したがって、特性長さが小さいパイプまたはチャネルでは、表面摩擦は、平均流れに対して大きな影響を与えるだろう。対照的に、特性長さが大きいパイプまたはチャネルでは、表面摩擦は平均流れにほとんど影響せず、乱流はより大きくなるだろう。
【００３１】
表面摩擦はまた、距離に応じても加算される。ポンプによって水が推進される非常に長いパイプを想像されたい。ポンプに近い起点部では流れは乱流である。流体がパイプを移動すればするほど、流体が曝露される表面はより多くなり、流体が曝露される表面がより多くなればなるほど、流れは摩擦によって遅くなる。起点からのある点において、集積した摩擦は非常に多くのエネルギーを流体流から取り除くため、流れは乱流ではなくなる。これは、レイノルズ数が約２０００未満になったときに起こり、流れは、次いで、「層流（laminar）」と呼ばれる。
【００３２】
層流の条件では細胞が沈むかまたは泳ぐかして集合する傾向があるため、細胞培養においては層流は望ましくない。乱流は、こうした集合を妨げる。例えば、静かな池では砂粒子が迅速に底に沈むが、大きな砕波または迅速に移動する流水中では砂粒子が沈まない様子を想像されたい。
【００３３】
したがって要約すると、乱流は、非常に低い流体速度、非常に小さい特性長さ、および非常に長いチャネルを回避することによって維持される。平面反応装置または水平なチューブなどの水平な閉鎖系の特性長さは、培養の深度であり、これは先に説明したように、約２０ｃｍの実際的な上限を有する。ポンプまたはエアリフトなどの任意の数の装置を用いて、平面反応装置または水平なチューブに乱流を生じさせることができる。しかし、流れの起点からの距離が増加するにつれて、乱流エネルギーは摩擦によって失われ、ある有限の距離で流れは層流になる。層流条件において、大部分の光合成微生物の細胞は反応装置の底に沈むであろう。これは、多くの理由のために望ましくなく、少なくとも細胞の採取に問題が生じる。１つの解決法は、供給源でより多くの乱流エネルギーを提供することであるが、これは、機械的剪断が細胞自体を損傷する上限までしか許容しえない。さらに別の解決法は、例えば反応装置全体で、多数のポンプを提供することであるが、このアプローチは、構造および操作の両方にさらなる複雑さを導入する。
【００３４】
事実上、垂直な閉鎖系は、約１，０００リットル未満の容量に限定され、そして水平な閉鎖系は、約５０，０００リットル未満の容量に限定されるようである。光合成微生物の大規模培養のため、閉鎖系は、開放系よりも、構築および稼働にはるかにより費用がかかり、そして複雑である。これは、各独立系が、それぞれ独立した基礎構造、すなわち、乱流の混合、培地の導入・除去、およびｐＨや温度などの変数の監視と制御を提供するための装置または機構のセット、を要求するからである。所与の面積の陸地を開放系で覆うよりも、同じ面積の陸地を閉鎖系で覆う方が、少なくとも１０倍多い基礎構造が必要であり、閉鎖系培養ははるかに複雑となる。
【００３５】
実際に、光合成微生物のすべての培養系は、何らかの規模で、開放系と閉鎖系の両方の組み合わせを含む。すべての培養系は、規模に関わらず、究極的には、細胞の最初の接種のために世界中で日常的に維持されているカルチャー・コレクション（culture collection）に依存する。すべてのカルチャー・コレクションは、その細胞培養をペトリ皿、試験管、または滅菌フラスコ中に排他的に維持しており、これらはすべて厳密に言うと閉鎖系である。開放系から「純粋に」なると考えることができる大規模製造系であっても、最初の接種材料を供給するには、究極的に、閉鎖系に頼らなければならない。
【００３６】
光合成微生物の生産のための主要な技術的な難問は、開放系技術が、経済的であり比較的操作が容易である大きな規模に進歩してきているが、所望の微生物の持続可能な生産を提供することができないことである。対照的に、閉鎖系は、所望の微生物の持続可能な生産を提供するが、最大規模の場合であっても、費用が高くまた操作が複雑である。
【００３７】
したがって、汚染の可能性を減少させることにより持続可能な生産を提供し、それでもなお構築または操作の複雑さやコストを実質的に増加させない生産方法についての必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
したがって、本発明の目的は、容易に構築でき、構築または操作の複雑さやコストを増加させない、光合成微生物を持続可能に大規模で生産するための有効な方法を提供することである。
【００３９】
光合成微生物からの油および他の有用な産物の生産を最適にするのに特に適した生産方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。油および他の有用な産物は、次いで、集合したバイオマスから、多様な化学的方法により抽出及び精製することができる。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
発明の概要
これらおよび他の目的は、連続生産の第一段階を閉鎖系で行いバッチ生産の第二段階を開放系で行なう２段階の連続−バッチ生産方法によって達成される。最初に、光と栄養分とが適切な条件下で十分な二酸化炭素を供給した場合に１６時間ごとに少なくとも倍となる速さで増殖することができる微生物を、選択（例えば遺伝子修飾による生成を含む）しなければならない。こうした遺伝子修飾は、例えば、R. Leon-Nanares、
D.Gonzalez-Ballester、A. Galvan、及びE. Fernandezによる“Transgenic microalgae as green cell-fractories”（Trends in Biotechnology, Volume 22(1), pp. 45-52, 2004）に開示されており、これは本明細書に組み込まれる。例えば、今のところ、以下の種および／または株を用いて、本発明を実施することが好ましい：（ｉ）テトラセルミス・スエシカ（Tetraselmis suecica）、ハワイ大学カルチャー・コレクションの「ＴＥＴＲＡ１」株；イソクリシス・ガルバナ（Isochrysis galbana）、ハワイ大学カルチャー・コレクションの「ＩＳＯＣＨ１」株；（ｉｉｉ）ファエオダクチルム・トリコルヌツム（Phaeodactylum tricornutum）、ハワイ大学カルチャー・コレクションの「ＰＨＡＥＯ１」または「ＰＨＡＥＯ２」株；あるいは（ｉｖ）ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属、特に、“The cell composition of Nannochloropsis sp. changes under different irradiances in semicontinuous culture,”World Journal of Microbiology and Biotechnology, Vol. 20, pp. 31-35, 2004に報告されFabregasらに用いられたＡ．スケニク（A. Sukenik）株。ハワイ大学カルチャー・コレクションには、特に光合成微生物からバイオ燃料を製造する目的で米国天然再生可能エネルギー研究所（ＮＲＥＬ）により１９８０年代および１９９０年代に蓄積された数百の種および株の全カルチャー・コレクションが含まれる。使用可能なさらなる種には、デュナリエラ・プリモレクタ（Dunaliella primolecta）およびニツシア・クロステリウム（Nitzschia closterium）が含まれる。特に、閉鎖系は、培養の総陸地面積の２０％を超える培養物を含むべきではなく、すなわち、総面積は、閉鎖系領域に加えて開放系領域によって占められる。さらに、光合成微生物のすべての種が所定の環境条件のセット下で単位照射面積あたり最大のバイオマス（「収容能力（carrying capacity）」）に達することを考えるならば、開放系培養を開始するまたは該培養に「接種する」閉鎖系により提供されるバイオマスの量は、開放系の収容能力の５％を超えるようにすべきである。開放系培養の収容能力を最大にするためには、栄養分ではなく光が収容能力を制限するように、開放系培養には十分な栄養分が与えられなければならない。さらに、開放系のいかなるバッチ培養も、５日間を超える期間（「滞留時間（residence time）」）持続させるべきではない。
【００４１】
閉鎖系領域により占められる総陸地面積の２０％の制限は、全生産施設の構築および操作の複雑さの最小化を確保させる。最小のバイオマス接種量および最大の滞留時間の提供は、望まれない種による開放系培養の汚染リスクを取るに足らない程度にまで減少させることを保証する。この方法は、上記の増殖速度要求を満たす任意の光合成微生物種に使用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
好ましい態様の説明
生産施設での活性培養中の総陸地面積が、２０％以下の閉鎖系領域および８０％以上の開放系領域で構成されることが好ましい。この目的の開放系領域の計算は、生産施設中のすべての開放系が培地を含有すると仮定した際は、開放系中の培地の照射面積のみを意味する。しかし、閉鎖系領域の計算には、反応装置によって覆われる「計画的領域（plan area）」と、隣接する反応装置容器間のあらゆる「不活性領域（inert area）」の両方が含まれる。例えば、一連の水平なチューブ状閉鎖系によって占められる陸地の面積を想像されたい。計画的領域は反応装置自体によって覆われ（例えば、直径１フィートで長さ１０フィートのチューブは１０平方フィートの領域を覆う）、そして培地の照射面積に等しい。しかし、反応装置によって覆われていない隣接するチューブ間のさらなる不活性領域も存在しうる。閉鎖系によって必要とされる陸地の総面積、すなわち閉鎖系領域は、不活性領域を加えた計画的領域である。例えるならば、文章を書くにはこのページの全領域が必要であるが、書かれたもの自体はページの総面積の一部しか占めない。
【００４３】
２０％の閉鎖系領域および８０％の開放系領域の提供により、完全に閉鎖系で構成される施設に比較して生産施設の構築および稼働の全体の複雑さが実質的に減少するため、より高い効率が確実となる。
【００４４】
（１）閉鎖系により提供される開放系に接種するためのバイオマスの量が、開放系総計の収容能力の５％を超えるものに等しく；（２）培養されている種の増殖速度が、１日あたりほぼ１．５倍となるよりも大きく（すなわち、細胞バイオマスが、ほぼ１６時間ごとに倍増する）；そして（３）いかなる培養も、開放系において５日間より長い期間維持されない、ことが好ましい。これらの３つの限定の組み合わせにより、いかなる状況下でも、培養が、５日間以下のうちに収容能力の少なくとも約９０％に等しい所望微生物のバイオマスに達することが確実となる。これは、いくつかの理由で重要である。第一に、比較的高い細胞濃度（すなわち収容能力の５％より高い）で接種される培養は、不注意に導入される可能性がある望まれない細胞に対して、培地中で優位となるだろう。第二に、多くの種は１６時間ごとに１回倍増する（１日あたり１．５倍）よりも実質的に低い速度で増殖するため、この迅速に増殖できる種は、ほとんどの潜在的な競合相手に打ち勝つであろう。第三に、大量の接種材料（収容能力の５％より多い）および高い増殖速度（１６時間ごとに倍増より多い）の組み合わせは、総バイオマスを、５日間以内に、収容能力に非常に近づけることを確実とする。これらの条件は、（１）汚染のリスクを減少させ、（２）総バイオマスの生産、あるいは油の生合成または生産を促進するのに重要である。第一に、潜在的な汚染物質は多量の接種量を有する必要があり、所望の種より迅速に増殖して５日間以内に培地中で優位を占める必要があるだろう。第二に、培養が収容能力の５０％を超えると、増殖のための資源が制限されてくるため、収容能力に近い培養では特に油生産が優位となる。増殖を支える資源が制限されることによって、一般的に、油の生合成が刺激される。
【００４５】
二酸化炭素を培地中に溶解させるような方法で、細胞培養に気体状二酸化炭素を供給することが好ましい。この方法は、増殖に必要な炭素の安定した供給源を提供するだけでなく、二酸化炭素が除去されるにつれて培地のｐＨは増加する傾向があり増殖に好ましくない状態となるが、そのようなことなく培地のｐＨを多かれ少なかれ安定して維持する効果も有する。最適には、この方法のため、二酸化炭素は、資源抽出法（油またはガスのための掘削など）あるいは工業製造法または化石燃料燃焼発電所（これらはすべて、二酸化炭素が豊富なガスの廃棄物流を含む）からの点源放出によって提供される。本明細書に記載する方法は、二酸化炭素廃棄物を大気内に放出することを回避し、その代わりに、二酸化炭素廃棄物を潜在的に有用なバイオマスに変換する。
【００４６】
好ましい条件について改善をしてもよい。最適には、１日以内に開放系総計の収容能力に近づけてもよく、これはさらに汚染の可能性を減少させるであろう。これは、１日あたり６回の倍増（細胞バイオマスが約４時間ごとに倍増するのに等しい）より高い増殖速度を持つ種について、最初の接種量を開放系収容能力総計の１５％用いることによって達成できる。この例では、種は閉鎖系と開放系の両方において同じ速度で増殖し、また、この種は閉鎖系と開放系の両方において単位面積あたり同じ濃度のバイオマスに達することを想像されたい。ここで、閉鎖系が総陸地面積の２０％を占めるならば、開放系の１５％の接種は、閉鎖系培養の７５％を取り除くことによって得られるであろう（すなわち７５％ｘ ２０％ ＝ １５％）。開放系において１５％の接種材料を用いると、細胞バイオマスは最初の４時間で３０％に倍増し、次の４時間で６０％に倍増し、そして次の４時間未満で１００％（すなわち、その収容能力）に達しうる。閉鎖系は、ほぼ同じ時間内に、接種前のバイオマスまで回復するであろう。閉鎖系は、接種材料が取り除かれた後、元のバイオマスの２５％しか含有せず、最初の４時間で元のバイオマスの５０％へと倍増し、次の４時間で再び倍増し、この時点で元のバイオマスの１００％になる。この例では、開放系の収容能力は１日以内に達成され、そして同じ日のうちに、閉鎖系のバイオマスが最初の値まで回復する。光合成微生物に関して記録された最も高い指数関数的増殖速度は、１日あたり約８回未満の倍増（約３時間ごとに倍増するのに等しい）であり、最初の接種材料をより多い量用いると、より短い時間でさらにすぐれた結果を得ることができる。
【００４７】
１日あたり約１．５回の倍増より高い増殖速度を持つ種を用い、収容能力の少なくとも５％のバイオマスを開放系に接種し、そして接種から５日以内に培養を採取する好ましい方法は、比較的高い油含量を確実とする。これはまた、開放系培養が望ましくない種に汚染されるようになるには通常５日より長く（通常数週間）かかることが数十年の経験により示されているので、開放系培養が有意に汚染されないことも確実とする。
【００４８】
好ましい方法を実施するため、開放系の収容能力をまず決定する必要がある。乱流環境中で過剰な栄養分を提供されたほとんどの種の収容能力は、一般的に、照射面積の平方メートルあたり約１００〜５００グラムの乾燥重量の範囲である。この範囲内の変動は、主に、制限要因としての光強度、より具体的には、太陽の１日の総光エネルギーに依存するであろう。例えば、晴れた日の総「照射量（irradiance）」（太陽の光エネルギー）は、曇った日の約２倍程度である。収容能力における対応する相違は、ほぼ同じ、すなわちほぼ２倍であろう。さらに、平均照射量は熱帯で最高となり、より高い緯度では減少する。例えば、熱帯のホノルルでの平均照射量は、ニューヨークにおけるより約４０％高く、そして北部アラスカにおけるより約２倍高い。したがって、アラスカにおける平均収容能力は、ハワイの半分でしかない。１年で最大の照射量は、１年で最も昼が長いときに生じる。熱帯の北または南では、これは夏の最初の日（夏至）に起こる。赤道では、最大の１日照射量は春の最初の日（春分）そして再び秋の最初の日（秋分）の年２回生じ、このとき太陽は真上を通過する。熱帯ではいずれでも最大の１日照射量が年２回生じ、それは春分と秋分との間のいずれかの時点である。
【００４９】
光合成微生物の所望の種に関する系の収容能力は、以下のように実験的に決定すべきである。生産施設中の開放系が異なる寸法を有する場合は、収容能力の計算は異なる寸法を有する系の各セットについて決定すべきである。好ましくは、収容能力の決定は、１日照射量が１年の最大である時点の約１５日間以内に行うべきである。開放系は、閉鎖系により提供される培養をある容量で接種すべきであり、そして開放系を、ほぼ標準的な稼働能力となるまで、栄養培地で満たすべきである。主要栄養素（すなわち無機窒素およびリン）濃度は過剰に提供すべきであり、これは、開放系のバイオマスが最大に達してもなお主要栄養素が測定可能な濃度で存在する（微生物がすべての食物を食べつくさない）ことを実証することにより定義される。接種後、開放系のバイオマスの測定を、バイオマスが増加しなくなる時点まで、少なくとも１日に数回うべきである。増加が停止した時点のバイオマスが、その収容能力である。測定は、指定された期間中少なくとも数回反復して行なうべきであり、これらの測定の平均を計算して最大収容能力を定義すべきである。
【００５０】
本発明を、本明細書に記載される現在好ましい態様に関して開示してきたが、当業者は、本発明の精神および範囲内に属する他の態様がありうることを認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に記載するものに限定されず、請求項によってのみ限定される。例えば、本発明は、異なる種類の開放系および閉鎖系を用いて行なわれてもよい。さらに、本発明は、非常に多様な増殖速度および収容能力を持つ光合成微生物を用いて行ってもよく、また、本発明は、その油分のために培養されている種に限定されず、また、種がバイオマス生産の最大速度に達しているかあるいは増殖を停止しているかどうかに関わらず、バッチ培養で他の価値ある産物を蓄積する種もまた含むことができる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
産業適用性 本発明は、望ましくない種による実質的な汚染を回避しつつ、開放系において光合成微生物の任意の特定の種を生産することが望ましい場合にはいつでも用いることができる。光合成微生物からこうして生産されるバイオマスは、現在は炭素の化石鉱床から得られている原料、すなわち石炭、石油、およびガス、にほぼ排他的に頼っている製品を製造するための再生可能な原料として用いることができる。例えば、光合成微生物の油部分を抽出し、バイオディーゼルなどの輸送燃料や潤滑剤へと化学的に変換してもよい。あるいは、バイオマス燃料を、流動床ガス化、熱分解、または噴流床ガス化などのプロセスに用いてもよく、続いて、ここから生じた材料を、バイオディーゼルやジメチルエーテルなどの輸送燃料、あるいはメタノールや混合アルコールなどのバルク化学薬品、また、出発材料または原料として化石燃料を用いる任意の製品を製造するために用いてもよい。さらに、上記プロセスのいずれから生じる炭素含有廃棄物は、嫌気性消化をしてメタン（天然ガス）を生じさせるなどの方法や、または電気を生じる発電所において他の可燃性燃料と同時に燃焼するなどの方法によって、さらにエネルギーを生じさせることもできるだろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光合成微生物を培養する方法であって：
収容能力を有する開放系において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ１６時間以内にバイオマスを倍増させることができる光合成微生物種を選択し；
前記種を閉鎖系内に導入し；
前記種を前記閉鎖系内で前記開放系の収容能力の５％を超えるバイオマスまで増殖させ；
前記収容能力の５％以上である前記種の最初のバイオマスを前記閉鎖系から前記開放系内に接種し；
前記開放系に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記種を前記開放系内で５日間未満の期間維持してほぼ１６時間かそれ未満ごとにバイオマスを倍増させる、
ことを含む方法。
【請求項２】
前記光合成微生物が、細菌、シアノバクテリア、および藻類からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記種が、前記開放系において、１日あたりおよそ１．５回の倍増から１日あたりおよそ８回の倍増までの速度でバイオマスを倍増させる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記種が、前記開放系において、１６時間ごとに少なくとも１回から３時間ごとに１回までの速度でバイオマスを倍増させる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記接種工程から最大で５日後に、前記種の実質的にすべてを前記開放系から取り除くことをさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記維持工程を、前記種の増殖が二酸化炭素の利用可能性により制限されるように行う、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記維持工程を、前記種が前記収容能力のおよそ９０％に達する後まで行う、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記供給工程を、化石燃料の燃焼、化学薬品の工業製造、または化石燃料の地質学的鉱床からの化石燃料の採取からなる群より選択される供給源からの煙道ガスを用いて行う、請求項１記載の方法。
【請求項９】
油を合成する方法であって：
収容能力を有する開放系において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ１６時間以内にバイオマスを倍増させる光合成微生物種を選択し；
前記種を閉鎖系内に導入し；
前記種が前記開放系の収容能力の５％を超えるバイオマスまで増殖するまで前記種を前記閉鎖系内で培養して；
前記収容能力の５％以上である前記種の最初のバイオマスを前記閉鎖系から前記開放系内に接種し；
前記開放系に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記種を前記開放系内で維持して、前記種が前記収容能力のおよそ９０％に達するまで５日間未満の期間で、ほぼ１６時間かそれ未満ごとに倍増させる
ことを含む、前記方法。
【請求項１０】
光合成微生物を培養する方法であって：
収容能力を有する開放系において十分な二酸化炭素を供給したときに１６時間ごとに少なくともほぼ１回倍増する増殖速度を有する光合成微生物を選択し；
前記微生物を閉鎖系にて培養し；
前記収容能力のほぼ５％以上に等しい量の前記微生物を前記閉鎖系から開放系に接種し；
前記開放系に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；
前記微生物を前記開放系内で維持して少なくとも前記増殖速度で増殖させ；そして
前記接種工程後ほぼ５日間未満で前記開放系から前記微生物を採取する
ことを含む、前記方法。
【請求項１１】
前記微生物の増殖が、二酸化炭素の利用可能性により制限されるように前記開放系を維持する
ことをさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
バイオマス原料を生成する方法であって：
収容能力を有する開放系において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ１６時間かそれ未満のうちにバイオマスを倍増させる光合成微生物種を選択し；
前記種が前記収容能力の５％を超えるバイオマスまで増殖するまで前記種を閉鎖系内に導入し；
前記収容能力の５％以上である前記種の最初のバイオマスを前記閉鎖系から前記開放系内に接種し；
前記開放系に連続して二酸化炭素を供給して前記種に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記種によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記種を前記開放系内で５日間未満の期間維持し、ほぼ１６時間かそれ未満ごとに倍増させてバイオマス原料を生成する
ことを含む、前記方法。
【請求項１３】
煙道ガスを用いる方法であって：
収容能力を有する開放系において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ１６時間かそれ未満のうちにバイオマスを倍増させる光合成微生物種を選択し；
前記種を閉鎖系内に導入し；
前記煙道ガスを前記閉鎖系内に供給し；
前記種を前記閉鎖系内で増殖させ、そして前記煙道ガスを用いて前記開放系の収容能力の５％を超えるバイオマスまで増殖させ；
前記収容能力の５％以上である前記種の最初のバイオマスを前記閉鎖系から前記開放系内に接種し；
前記開放系に連続して前記煙道ガスを供給して前記種に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記種によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記種を前記開放系内で５日間未満の期間維持してほぼ１６時間かそれ未満ごとにバイオマスを倍増させる
ことを含む、前記方法。
【請求項１４】
油を合成する方法であって：
収容能力を有する開放池において、十分な二酸化炭素を供給した場合、ほぼ１６時間以下で、バイオマスを倍増させる光合成微生物を選択し；
少なくとも３．５％の二酸化炭素濃度を有し、化石燃料の燃焼、化学薬品の工業製造、油およびガスの精製、ならびに化石燃料の地質学的採取からなる供給源より選択される煙道ガスを、およそ２０センチメートルの最大培養深度を有するフォトバイオリアクター内に注入し；
前記微生物を前記フォトバイオリアクター内に導入し；
前記フォトバイオリアクター内で前記微生物に十分な栄養分を提供して栄養分が増殖の制限要因となることを回避し；
前記微生物を前記フォトバイオリアクター全体で乱流混合し、それにより前記フォトバイオリアクター内で前記微生物を連続指数関数的に増殖させ；
前記開放池の前記収容能力の５％以上である前記微生物の最初のバイオマスを前記閉鎖フォトバイオリアクターから前記開放池内に接種し；
前記開放系に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記微生物を前記開放池内で最大５日間高い栄養分濃度で維持して、それにより高い光強度および高い栄養分濃度の最初の条件により連続した指数関数的増殖が短期間支持されるが、タンパク質合成を阻害する窒素利用可能性によって増殖は制限されるようになり、それにより油含量が増加する
ことを含む、前記方法。
【請求項１５】
油の生合成方法であって：
収容能力を有する開放池において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ１６時間かそれ未満のうちにバイオマスを倍増させる光合成微生物を選択し；
少なくとも３．５％の二酸化炭素濃度を有し、化石燃料の燃焼、化学薬品の工業製造、化石燃料の精製、および化石燃料の地質学的採取からなる群より選択される供給源より選択される煙道ガスを、およそ２０センチメートルの最大培養深度を有するフォトバイオリアクター中に溶解し；
前記微生物を前記フォトバイオリアクター中の前記培地内に導入し；
前記培地において前記微生物に十分な栄養分を提供して栄養分が増殖の制限要因となることを回避し；
前記培地中の前記微生物を前記フォトバイオリアクター全体で乱流混合して前記培地中に前記微生物の実質的に均質な分布を提供し、それにより前記微生物が前記フォトバイオリアクターにおいて連続指数関数的に増殖し；
前記開放池の前記収容能力の５％以上である前記微生物の最初のバイオマスを前記閉鎖フォトバイオリアクターから前記開放池内に接種し；
少なくとも３．５％の二酸化炭素濃度を有し、化石燃料の燃焼、化学薬品の工業製造、化石燃料の精製、および化石燃料の地質学的採取からなる群より選択される供給源より選択される煙道ガスを前記開放池に連続して供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記微生物を前記開放池内で最大５日間高い栄養分濃度で維持して、それにより高い光強度および高い栄養分濃度の最初の条件により連続した指数関数的増殖が短期間支持されるが、タンパク質合成を阻害する窒素利用可能性によって増殖が制限されるようになり、それにより油含量が増加する
工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
陸地領域上でバイオマスを合成する方法であって：
収容能力を有する開放池において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ４時間かそれ未満のうちにバイオマスを倍増させる光合成微生物を選択し；
前記微生物を、およそ２０センチメートルの最大培養深度を有し、前記陸地面積の２０％未満を占めるフォトバイオリアクター内に導入し；
前記フォトバイオリアクターにおいて前記微生物に十分な栄養分を提供して栄養分が増殖の制限要因となることを回避し；
前記微生物を前記フォトバイオリアクター全体で乱流混合して、それにより前記微生物が前記フォトバイオリアクター内で連続指数関数的に増殖し；
前記収容能力の１５％以上である前記微生物の最初のバイオマスを、前記フォトバイオリアクターから、前記陸地面積の８０％より多くを占める前記開放池内に接種し；
前記開放池に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記微生物を前記開放池内で最大１日間高い栄養分濃度で維持し、それにより高い光強度および高い栄養分濃度の最初の条件により連続した指数関数的増殖を短期間支持させるが、細胞の増殖により光によって増殖が制限されるようになる
ことを含む、前記方法。
【請求項１７】
油の生合成方法であって：
収容能力を有する開放池において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ１６時間かそれ未満のうちにバイオマスを倍増させる光合成微生物を選択し；
少なくとも３．５％の二酸化炭素濃度を有し、化石燃料の燃焼、化学薬品の工業製造、化石燃料の精製、および化石燃料の地質学的採取からなる群より選択される供給源より選択される煙道ガスを、およそ２０センチメートルの最大培養深度を有するフォトバイオリアクター中に溶解し；
前記微生物を前記フォトバイオリアクター中の前記培地内に導入し；
前記培地において前記微生物に十分な栄養分を提供して栄養分が増殖の制限要因となることを回避し；
前記培地中の前記微生物を前記フォトバイオリアクター全体で乱流混合して、それにより前記微生物は前記フォトバイオリアクター内で連続指数関数的に増殖し；
前記開放池の前記収容能力の５％以上である前記微生物の最初のバイオマスを前記閉鎖フォトバイオリアクターから前記開放池内に接種し；
前記開放池に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記微生物を前記開放池中で最大５日間高い栄養分濃度で維持し、それにより高い光強度および高い栄養分濃度の最初の条件により連続した指数関数的増殖を短期間支持させるが、タンパク質合成を阻害する窒素利用可能性によって増殖が制限されるようになり、それにより油含量が増加する
ことを含む、前記方法。
【請求項１８】
バイオマス原料を合成する方法であって：
収容能力を有する開放池において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ４時間かそれ未満のうちにバイオマスを倍増させる光合成微生物を選択し；
少なくとも３．５％の二酸化炭素濃度を有し、化石燃料の燃焼、化学薬品の工業製造、化石燃料の精製、および化石燃料の地質学的採取からなる群より選択される供給源より選択される煙道ガスを、およそ２０センチメートルの最大培養深度を有するフォトバイオリアクター中に溶解し；
前記微生物を前記フォトバイオリアクター中の前記培地内に導入し；
前記培地において前記微生物に十分な栄養分を提供して栄養分が増殖の制限要因となることを回避し；
前記培地中の前記微生物を前記フォトバイオリアクター全体で乱流混合して、それにより前記微生物は前記フォトバイオリアクター内で連続指数関数的に増殖し；
前記開放池の前記収容能力の１５％以上である前記微生物の最初のバイオマスを前記閉鎖フォトバイオリアクターから前記開放池内に接種し；
前記開放池に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記微生物を前記開放池中で最大１日間高い栄養分濃度で維持して、それにより高い光強度および高い栄養分濃度の最初の条件により連続した指数関数的増殖を短期間支持させるが、細胞の増殖により光によって増殖が制限されるようになる
ことを含む、前記方法。
【請求項１９】
陸地領域上で光合成微生物を培養するための装置であって：
可視光を透過し、各々が最大４０センチメートルの培養深度を提供し、前記陸地領域の計画的領域を覆い、各々の容器間の前記陸地領域の一部は不活性領域を画定し、前記計画的領域および前記不活性領域は前記陸地領域の２０％以下を占める、１以上の培養容器；
前記培養容器各々の中の栄養培地；
機械的剪断により細胞に損傷が与えられないほど十分に低い乱流を前記各々の培養容器中の前記栄養培地全体に生成するための乱流手段、ここで前記培養容器、前記栄養培地、および前記乱流手段は１以上のフォトバイオリアクターを画定する；
各々が収容能力を有し、合わせて前記陸地領域の８０％以上を占める、１以上の開放池、
を含み、それにより前記開放池の各々について前記収容能力の少なくとも５％を含む微生物のバイオマスを、前記フォトバイオリアクターから前記開放池内に接種することができる、装置。
【請求項１】
光合成微生物を培養する方法であって：
収容能力を有する開放系において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ１６時間以内にバイオマスを倍増させることができる光合成微生物種を選択し；
前記種を閉鎖系内に導入し；
前記種を前記閉鎖系内で前記開放系の収容能力の５％を超えるバイオマスまで増殖させ；
前記収容能力の５％以上である前記種の最初のバイオマスを前記閉鎖系から前記開放系内に接種し；
前記開放系に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記種を前記開放系内で５日間未満の期間維持してほぼ１６時間かそれ未満ごとにバイオマスを倍増させる、
ことを含む方法。
【請求項２】
前記光合成微生物が、細菌、シアノバクテリア、および藻類からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記種が、前記開放系において、１日あたりおよそ１．５回の倍増から１日あたりおよそ８回の倍増までの速度でバイオマスを倍増させる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記種が、前記開放系において、１６時間ごとに少なくとも１回から３時間ごとに１回までの速度でバイオマスを倍増させる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記接種工程から最大で５日後に、前記種の実質的にすべてを前記開放系から取り除くことをさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記維持工程を、前記種の増殖が二酸化炭素の利用可能性により制限されるように行う、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記維持工程を、前記種が前記収容能力のおよそ９０％に達する後まで行う、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記供給工程を、化石燃料の燃焼、化学薬品の工業製造、または化石燃料の地質学的鉱床からの化石燃料の採取からなる群より選択される供給源からの煙道ガスを用いて行う、請求項１記載の方法。
【請求項９】
油を合成する方法であって：
収容能力を有する開放系において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ１６時間以内にバイオマスを倍増させる光合成微生物種を選択し；
前記種を閉鎖系内に導入し；
前記種が前記開放系の収容能力の５％を超えるバイオマスまで増殖するまで前記種を前記閉鎖系内で培養して；
前記収容能力の５％以上である前記種の最初のバイオマスを前記閉鎖系から前記開放系内に接種し；
前記開放系に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記種を前記開放系内で維持して、前記種が前記収容能力のおよそ９０％に達するまで５日間未満の期間で、ほぼ１６時間かそれ未満ごとに倍増させる
ことを含む、前記方法。
【請求項１０】
光合成微生物を培養する方法であって：
収容能力を有する開放系において十分な二酸化炭素を供給したときに１６時間ごとに少なくともほぼ１回倍増する増殖速度を有する光合成微生物を選択し；
前記微生物を閉鎖系にて培養し；
前記収容能力のほぼ５％以上に等しい量の前記微生物を前記閉鎖系から開放系に接種し；
前記開放系に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；
前記微生物を前記開放系内で維持して少なくとも前記増殖速度で増殖させ；そして
前記接種工程後ほぼ５日間未満で前記開放系から前記微生物を採取する
ことを含む、前記方法。
【請求項１１】
前記微生物の増殖が、二酸化炭素の利用可能性により制限されるように前記開放系を維持する
ことをさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
バイオマス原料を生成する方法であって：
収容能力を有する開放系において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ１６時間かそれ未満のうちにバイオマスを倍増させる光合成微生物種を選択し；
前記種が前記収容能力の５％を超えるバイオマスまで増殖するまで前記種を閉鎖系内に導入し；
前記収容能力の５％以上である前記種の最初のバイオマスを前記閉鎖系から前記開放系内に接種し；
前記開放系に連続して二酸化炭素を供給して前記種に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記種によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記種を前記開放系内で５日間未満の期間維持し、ほぼ１６時間かそれ未満ごとに倍増させてバイオマス原料を生成する
ことを含む、前記方法。
【請求項１３】
煙道ガスを用いる方法であって：
収容能力を有する開放系において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ１６時間かそれ未満のうちにバイオマスを倍増させる光合成微生物種を選択し；
前記種を閉鎖系内に導入し；
前記煙道ガスを前記閉鎖系内に供給し；
前記種を前記閉鎖系内で増殖させ、そして前記煙道ガスを用いて前記開放系の収容能力の５％を超えるバイオマスまで増殖させ；
前記収容能力の５％以上である前記種の最初のバイオマスを前記閉鎖系から前記開放系内に接種し；
前記開放系に連続して前記煙道ガスを供給して前記種に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記種によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記種を前記開放系内で５日間未満の期間維持してほぼ１６時間かそれ未満ごとにバイオマスを倍増させる
ことを含む、前記方法。
【請求項１４】
油を合成する方法であって：
収容能力を有する開放池において、十分な二酸化炭素を供給した場合、ほぼ１６時間以下で、バイオマスを倍増させる光合成微生物を選択し；
少なくとも３．５％の二酸化炭素濃度を有し、化石燃料の燃焼、化学薬品の工業製造、油およびガスの精製、ならびに化石燃料の地質学的採取からなる供給源より選択される煙道ガスを、およそ２０センチメートルの最大培養深度を有するフォトバイオリアクター内に注入し；
前記微生物を前記フォトバイオリアクター内に導入し；
前記フォトバイオリアクター内で前記微生物に十分な栄養分を提供して栄養分が増殖の制限要因となることを回避し；
前記微生物を前記フォトバイオリアクター全体で乱流混合し、それにより前記フォトバイオリアクター内で前記微生物を連続指数関数的に増殖させ；
前記開放池の前記収容能力の５％以上である前記微生物の最初のバイオマスを前記閉鎖フォトバイオリアクターから前記開放池内に接種し；
前記開放系に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記微生物を前記開放池内で最大５日間高い栄養分濃度で維持して、それにより高い光強度および高い栄養分濃度の最初の条件により連続した指数関数的増殖が短期間支持されるが、タンパク質合成を阻害する窒素利用可能性によって増殖は制限されるようになり、それにより油含量が増加する
ことを含む、前記方法。
【請求項１５】
油の生合成方法であって：
収容能力を有する開放池において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ１６時間かそれ未満のうちにバイオマスを倍増させる光合成微生物を選択し；
少なくとも３．５％の二酸化炭素濃度を有し、化石燃料の燃焼、化学薬品の工業製造、化石燃料の精製、および化石燃料の地質学的採取からなる群より選択される供給源より選択される煙道ガスを、およそ２０センチメートルの最大培養深度を有するフォトバイオリアクター中に溶解し；
前記微生物を前記フォトバイオリアクター中の前記培地内に導入し；
前記培地において前記微生物に十分な栄養分を提供して栄養分が増殖の制限要因となることを回避し；
前記培地中の前記微生物を前記フォトバイオリアクター全体で乱流混合して前記培地中に前記微生物の実質的に均質な分布を提供し、それにより前記微生物が前記フォトバイオリアクターにおいて連続指数関数的に増殖し；
前記開放池の前記収容能力の５％以上である前記微生物の最初のバイオマスを前記閉鎖フォトバイオリアクターから前記開放池内に接種し；
少なくとも３．５％の二酸化炭素濃度を有し、化石燃料の燃焼、化学薬品の工業製造、化石燃料の精製、および化石燃料の地質学的採取からなる群より選択される供給源より選択される煙道ガスを前記開放池に連続して供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記微生物を前記開放池内で最大５日間高い栄養分濃度で維持して、それにより高い光強度および高い栄養分濃度の最初の条件により連続した指数関数的増殖が短期間支持されるが、タンパク質合成を阻害する窒素利用可能性によって増殖が制限されるようになり、それにより油含量が増加する
工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
陸地領域上でバイオマスを合成する方法であって：
収容能力を有する開放池において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ４時間かそれ未満のうちにバイオマスを倍増させる光合成微生物を選択し；
前記微生物を、およそ２０センチメートルの最大培養深度を有し、前記陸地面積の２０％未満を占めるフォトバイオリアクター内に導入し；
前記フォトバイオリアクターにおいて前記微生物に十分な栄養分を提供して栄養分が増殖の制限要因となることを回避し；
前記微生物を前記フォトバイオリアクター全体で乱流混合して、それにより前記微生物が前記フォトバイオリアクター内で連続指数関数的に増殖し；
前記収容能力の１５％以上である前記微生物の最初のバイオマスを、前記フォトバイオリアクターから、前記陸地面積の８０％より多くを占める前記開放池内に接種し；
前記開放池に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記微生物を前記開放池内で最大１日間高い栄養分濃度で維持し、それにより高い光強度および高い栄養分濃度の最初の条件により連続した指数関数的増殖を短期間支持させるが、細胞の増殖により光によって増殖が制限されるようになる
ことを含む、前記方法。
【請求項１７】
油の生合成方法であって：
収容能力を有する開放池において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ１６時間かそれ未満のうちにバイオマスを倍増させる光合成微生物を選択し；
少なくとも３．５％の二酸化炭素濃度を有し、化石燃料の燃焼、化学薬品の工業製造、化石燃料の精製、および化石燃料の地質学的採取からなる群より選択される供給源より選択される煙道ガスを、およそ２０センチメートルの最大培養深度を有するフォトバイオリアクター中に溶解し；
前記微生物を前記フォトバイオリアクター中の前記培地内に導入し；
前記培地において前記微生物に十分な栄養分を提供して栄養分が増殖の制限要因となることを回避し；
前記培地中の前記微生物を前記フォトバイオリアクター全体で乱流混合して、それにより前記微生物は前記フォトバイオリアクター内で連続指数関数的に増殖し；
前記開放池の前記収容能力の５％以上である前記微生物の最初のバイオマスを前記閉鎖フォトバイオリアクターから前記開放池内に接種し；
前記開放池に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記微生物を前記開放池中で最大５日間高い栄養分濃度で維持し、それにより高い光強度および高い栄養分濃度の最初の条件により連続した指数関数的増殖を短期間支持させるが、タンパク質合成を阻害する窒素利用可能性によって増殖が制限されるようになり、それにより油含量が増加する
ことを含む、前記方法。
【請求項１８】
バイオマス原料を合成する方法であって：
収容能力を有する開放池において十分な二酸化炭素を供給したときにほぼ４時間かそれ未満のうちにバイオマスを倍増させる光合成微生物を選択し；
少なくとも３．５％の二酸化炭素濃度を有し、化石燃料の燃焼、化学薬品の工業製造、化石燃料の精製、および化石燃料の地質学的採取からなる群より選択される供給源より選択される煙道ガスを、およそ２０センチメートルの最大培養深度を有するフォトバイオリアクター中に溶解し；
前記微生物を前記フォトバイオリアクター中の前記培地内に導入し；
前記培地において前記微生物に十分な栄養分を提供して栄養分が増殖の制限要因となることを回避し；
前記培地中の前記微生物を前記フォトバイオリアクター全体で乱流混合して、それにより前記微生物は前記フォトバイオリアクター内で連続指数関数的に増殖し；
前記開放池の前記収容能力の１５％以上である前記微生物の最初のバイオマスを前記閉鎖フォトバイオリアクターから前記開放池内に接種し；
前記開放池に連続して二酸化炭素を供給して前記微生物に十分な二酸化炭素を供給し、そして前記微生物によって取り除かれた二酸化炭素を補充し；そして
前記微生物を前記開放池中で最大１日間高い栄養分濃度で維持して、それにより高い光強度および高い栄養分濃度の最初の条件により連続した指数関数的増殖を短期間支持させるが、細胞の増殖により光によって増殖が制限されるようになる
ことを含む、前記方法。
【請求項１９】
陸地領域上で光合成微生物を培養するための装置であって：
可視光を透過し、各々が最大４０センチメートルの培養深度を提供し、前記陸地領域の計画的領域を覆い、各々の容器間の前記陸地領域の一部は不活性領域を画定し、前記計画的領域および前記不活性領域は前記陸地領域の２０％以下を占める、１以上の培養容器；
前記培養容器各々の中の栄養培地；
機械的剪断により細胞に損傷が与えられないほど十分に低い乱流を前記各々の培養容器中の前記栄養培地全体に生成するための乱流手段、ここで前記培養容器、前記栄養培地、および前記乱流手段は１以上のフォトバイオリアクターを画定する；
各々が収容能力を有し、合わせて前記陸地領域の８０％以上を占める、１以上の開放池、
を含み、それにより前記開放池の各々について前記収容能力の少なくとも５％を含む微生物のバイオマスを、前記フォトバイオリアクターから前記開放池内に接種することができる、装置。
【公表番号】特表２００８−５４５４４１（Ｐ２００８−５４５４４１Ａ）
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１５９６０（Ｐ２００８−５１５９６０）
【出願日】平成１８年６月７日（２００６．６．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２４４３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１３８９９
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（５０７４０２４０６）エイチアール・バイオペトロリウム・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月７日（２００６．６．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２４４３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１３８９９
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（５０７４０２４０６）エイチアール・バイオペトロリウム・インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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