光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラム
【課題】 埃等の影響を抑制することが可能な光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムを提供する。
【解決手段】 マイクロプレート２０などの試料保持部材によって保持された状態の試料からの蛍光を測定する蛍光測定装置１を、試料から放出される蛍光による２次元の蛍光画像を取得する画像取得部４０と、蛍光画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析装置５０とを備えて構成する。そして、蛍光画像について設定される測定領域に対して、所定条件下で取得された参照画像の測定領域内での光強度分布を光強度閾値と比較することで測定除外領域を抽出し、測定領域から測定除外領域を除いた領域を解析領域に設定して、蛍光画像の解析処理を行う。
【解決手段】 マイクロプレート２０などの試料保持部材によって保持された状態の試料からの蛍光を測定する蛍光測定装置１を、試料から放出される蛍光による２次元の蛍光画像を取得する画像取得部４０と、蛍光画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析装置５０とを備えて構成する。そして、蛍光画像について設定される測定領域に対して、所定条件下で取得された参照画像の測定領域内での光強度分布を光強度閾値と比較することで測定除外領域を抽出し、測定領域から測定除外領域を除いた領域を解析領域に設定して、蛍光画像の解析処理を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料から放出される蛍光や燐光、発光などの光を測定する光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
創薬分野等において細胞などの試料からの蛍光を測定する方法として、マイクロプレートを利用した蛍光測定方法が用いられている（例えば、文献１：特開２００１−１８８０４４号公報参照）。マイクロプレートは、それぞれ試料を保持可能な複数のウェル（テストホール）が設けられた板状の試料保持部材であり、各ウェル内に保持された試料から放出される蛍光を測定することで、試料の評価や必要な蛍光解析を効率的に行うことが可能である。
【特許文献１】特開２００１−１８８０４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記文献１に記載された蛍光測定装置では、試料から放出される蛍光を透過するように底面が形成されたマイクロプレートによって試料を保持し、その下方に設置された光検出手段によって蛍光を検出している。このようなマイクロプレートを用いた試料の蛍光測定においては、マイクロプレートの底面、あるいは試料が保持されるウェル内に埃やゴミ、汚れ等がある場合、その埃で発生する自家蛍光の影響が問題となる。また、このような埃等から放出される自家蛍光の影響以外にも、埃等による光の吸収、散乱の影響も問題となる。このような埃等の影響の問題は、マイクロプレート以外の試料保持部材を用いた場合にも同様に生じる。また、埃等に起因する上記の問題は、蛍光測定以外にも、燐光や発光など、試料からの光を測定する場合に一般に生じるものである。
【０００４】
本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、光測定における埃やゴミ、汚れ等の影響、例えば自家蛍光や光の吸収、散乱の影響、を抑制することが可能な光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このような目的を達成するために、本発明による光測定装置は、試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの光を測定する光測定装置であって、（１）試料から放出される光を含む２次元の光検出画像を取得する画像取得手段と、（２）光検出画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析手段とを備え、データ解析手段は、（３）画像取得手段によって取得された光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定手段と、（４）画像取得手段によって所定条件下で取得された参照画像を用い、参照画像の測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出手段と、（５）測定領域から測定除外領域を除くことによって光検出画像に対する解析領域を設定し、解析領域内での光強度を解析データとして、試料についての解析処理を行う解析処理手段とを有することを特徴とする。
【０００６】
また、本発明による光測定方法は、試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの光を測定する光測定方法であって、（１）試料から放出される光を含む２次元の光検出画像を取得する画像取得ステップと、（２）光検出画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析ステップとを備え、データ解析ステップは、（３）画像取得ステップによって取得された光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定ステップと、（４）画像取得ステップによって所定条件下で取得された参照画像を用い、参照画像の測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出ステップと、（５）測定領域から測定除外領域を除くことによって光検出画像に対する解析領域を設定し、解析領域内での光強度を解析データとして、試料についての解析処理を行う解析処理ステップとを含むことを特徴とする。
【０００７】
また、本発明による光測定プログラムは、試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの光を測定する光測定をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、（ａ）画像取得手段によって取得された、試料から放出される光を含む２次元の光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定処理と、（ｂ）画像取得手段によって所定条件下で取得された参照画像を用い、参照画像の測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出処理と、（ｃ）測定領域から測定除外領域を除くことによって光検出画像に対する解析領域を設定し、解析領域内での光強度を解析データとして、試料についての解析処理を行う解析処理とを含むデータ解析処理をコンピュータに実行させることを特徴とする。
【０００８】
上記した光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムにおいては、試料からの蛍光や燐光、発光などの光を検出する光検出手段として、２次元の光検出画像（例えば蛍光画像、燐光画像、発光画像）を取得可能な画像取得手段を用いるとともに、埃等の影響についての参照画像として、所定条件下で２次元の参照画像を取得する。そして、この参照画像に対して光強度閾値を適用して埃に対応する測定除外領域を抽出し、通常の測定領域から測定除外領域を除いた領域を解析領域として、光検出画像を用いた試料についての解析処理を行っている。
【０００９】
このような構成によれば、試料を保持するマイクロプレートなどの試料保持部材において測定領域内に埃等が存在する場合であっても、自家蛍光や光の吸収、散乱などによる埃等の影響を効果的に除去、抑制することが可能である。したがって、このような光測定装置及び光測定方法を用いることにより、光検出画像を用いた試料の評価等を、充分な精度で確実に行うことが可能となる。
【００１０】
除外領域の抽出においては、具体的には、画像取得手段によって所定条件下で取得された参照画像を用い、参照画像の測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較し、光強度分布中で光強度閾値を超える光強度を有する領域を抽出して測定除外領域とすることが好ましい。このような方法は、埃等の自家蛍光の影響が問題となる場合に有効である。あるいは、光強度分布中で光強度閾値より低い光強度を有する領域を抽出して測定除外領域とすることが好ましい。このような方法は、埃等による光の吸収、散乱の影響が問題となる場合に有効である。
【００１１】
ここで、光測定装置において、解析処理手段は、解析処理として解析領域内での光強度分布における平均光強度を算出する処理を行う平均光強度算出手段を有することが好ましい。同様に、光測定方法において、解析処理ステップは、解析処理として解析領域内での光強度分布における平均光強度を算出する処理を行う平均光強度算出ステップを含むことが好ましい。同様に、光測定プログラムにおいて、解析処理は、解析処理として解析領域内での光強度分布における平均光強度を算出する処理を行う平均光強度算出処理を含むことが好ましい。このように、解析領域内での２次元の光強度分布から平均光強度を求める方法で蛍光解析処理などの解析処理を行うことにより、その解析領域において測定された光の光強度を用いた試料の評価等を、好適かつ簡便な方法で行うことができる。
【００１２】
また、光測定装置のデータ解析手段は、除外領域抽出手段における測定除外領域の抽出に用いられる光強度閾値を設定する閾値設定手段を有することが好ましい。同様に、光測定方法のデータ解析ステップは、除外領域抽出ステップにおける測定除外領域の抽出に用いられる光強度閾値を設定する閾値設定ステップを含むことが好ましい。同様に、光測定プログラムのデータ解析処理は、除外領域抽出処理における測定除外領域の抽出に用いられる光強度閾値を設定する閾値設定処理を含むことが好ましい。あるいは、このような光強度閾値としては、あらかじめ設定された閾値を用いても良い。
【００１３】
また、光測定装置の除外領域抽出手段は、測定領域に対して測定除外領域を抽出するか否かを選択可能に構成されていることが好ましい。同様に、光測定方法の除外領域抽出ステップは、測定領域に対して測定除外領域を抽出するか否かを選択可能に構成されていることが好ましい。同様に、光測定プログラムの除外領域抽出処理は、測定領域に対して測定除外領域を抽出するか否かを選択可能に構成されていることが好ましい。このような構成によれば、必要に応じて測定除外領域の抽出のＯＮ／ＯＦＦを切り換えて試料についての解析処理を行うことが可能となる。
【００１４】
測定除外領域の抽出に用いられる参照画像については、光測定装置の除外領域抽出手段は、参照画像として、試料が試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像（例えば蛍光画像）を用いる構成とすることができる。同様に、光測定方法の除外領域抽出ステップは、参照画像として、試料が試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いる構成とすることができる。同様に、光測定プログラムの除外領域抽出処理は、参照画像として、試料が試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いる構成とすることができる。
【００１５】
あるいは、光測定装置の除外領域抽出手段は、参照画像として、試料とは別の参照用試料が試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像（例えば蛍光画像）を用いる構成とすることができる。同様に、光測定方法の除外領域抽出ステップは、参照画像として、試料とは別の参照用試料が試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いる構成とすることができる。同様に、光測定プログラムの除外領域抽出処理は、参照画像として、試料とは別の参照用試料が試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いる構成とすることができる。
【００１６】
また、光測定装置では、試料保持部材が、それぞれ試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートであり、データ解析手段において、測定領域、及び解析領域を、マイクロプレートでの複数のウェルのそれぞれに対して設定することとしても良い。同様に、光測定方法では、試料保持部材が、それぞれ試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートであり、データ解析ステップにおいて、測定領域、及び解析領域を、マイクロプレートでの複数のウェルのそれぞれに対して設定することとしても良い。同様に、光測定プログラムでは、試料保持部材として、それぞれ試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートを用い、データ解析処理において、測定領域、及び解析領域を、マイクロプレートでの複数のウェルのそれぞれに対して設定することとしても良い。このような構成によれば、マイクロプレートを用いた光測定、及びそれによる試料の評価等を好適に行うことが可能となる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムによれば、所定条件下で取得された埃等の影響を含む２次元の参照画像に対し、光強度閾値を適用して埃等に対応する測定除外領域を抽出し、通常の測定領域から測定除外領域を除いた領域を解析領域として光検出画像を用いた試料についての解析処理を行うことにより、自家蛍光や光の吸収、散乱などによる埃等の影響を抑制することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、図面とともに本発明による光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムの好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。
【００１９】
図１は、本発明による光測定装置の一例である蛍光測定装置の一実施形態を模式的に示す構成図である。また、図２は、マイクロプレートの構成の一例を示す斜視図である。また、図３は、図２に示したマイクロプレートの断面構造を示す側面断面図である。本実施形態による蛍光測定装置１は、試料保持部材としてマイクロプレート２０を用い、マイクロプレート２０によって保持された状態で測定位置Ｐに配置された試料Ｓ（図３参照）からの蛍光を測定するための装置である。
【００２０】
なお、試料Ｓについては、蛍光測定の対象となるものであれば特に限定されないが、細胞や抗体などの生体試料が例として挙げられる。また、本発明による光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムは、蛍光測定以外にも、例えば燐光や発光など、試料からの光を測定する光測定に一般に適用可能であるが、以下においては、主として、その一例である蛍光測定装置、蛍光測定方法、及び蛍光測定プログラムについて説明する。以下、本蛍光測定装置１の構成について説明する。
【００２１】
図１に示す蛍光測定装置１は、データ取得装置１０、励起光源３０、及びデータ解析装置５０を備えて構成されている。データ取得装置１０は、蛍光測定の対象となる試料Ｓを保持したマイクロプレート２０が内部に収容される暗箱１５と、暗箱１５の内部に設置されて測定位置Ｐに配置された試料Ｓからの蛍光の測定に用いられる画像取得部４０とを有している。
【００２２】
本実施形態において試料保持部材として用いられているマイクロプレート２０は、図２及び図３に示すように、複数のウェル（テストホール）２１が２次元アレイ状に配置された板状部材であり、その複数のウェル２１のそれぞれにおいて、試料Ｓを保持可能な構成となっている。図２に示した構成例では、複数のウェル２１として、８×１２＝９６個のウェル２１が２次元アレイ状に配置されている。また、このマイクロプレート２０の底面２２は、試料Ｓに照射される蛍光測定用の励起光、及び試料Ｓから放出される蛍光を透過可能な材質によって形成されている。
【００２３】
暗箱１５内においては、マイクロプレート２０は、蛍光観察用の開口を有するマイクロプレートホルダ１１によって保持されている。また、これらのマイクロプレート２０及びホルダ１１に対して、暗箱１５内で所定の方向を搬送方向（図１中においては、右側から左側へと向かう方向）とするマイクロプレート搬送機構１２が設置されている。
【００２４】
搬送機構１２でのマイクロプレート２０の搬送方向に対して搬入側となる暗箱１５の一方側には、試料Ｓが保持された測定前のマイクロプレート２０を所定枚数（例えば、２５枚）ストックしておくための搬入側マイクロプレートストッカー１３が設置されている。また、マイクロプレート２０の搬送方向に対して搬出側となる暗箱１５の他方側には、測定後のマイクロプレート２０をストックしておくための搬出側マイクロプレートストッカー１４が設置されている。
【００２５】
このような構成において、搬入側マイクロプレートストッカー１３から暗箱１５内へと搬入されたマイクロプレート２０は、マイクロプレートホルダ１１によって保持されるとともに搬送機構１２によって搬送される。そして、マイクロプレート２０は測定位置Ｐで一旦停止させられ、この状態で、マイクロプレート２０によって保持された試料Ｓに対して必要な光測定、本測定装置１においては蛍光測定、が行われる。測定完了後、マイクロプレート２０は再び搬送機構１２によって搬送され、搬出側マイクロプレートストッカー１４へと搬出される。なお、図１においては、搬送機構１２、及びストッカー１３、１４については、マイクロプレート２０を搬入、搬送、搬出するための具体的な構成の図示を省略している。
【００２６】
蛍光測定の実行時にマイクロプレート２０、及びそれに保持された試料Ｓが配置される測定位置Ｐに対し、測定位置Ｐの上方には、マイクロプレート２０の各ウェル２１内に試薬等を注入するための分注装置１６が設置されている。また、測定位置Ｐの下方には、ウェル２１内に収容された試料Ｓからマイクロプレート２０の底面２２を介して放出される蛍光の測定に用いられる画像取得部４０が設置されている。
【００２７】
本実施形態においては、画像取得部４０は、試料Ｓから放出される蛍光による２次元の光検出画像である蛍光画像を取得可能な２次元ＣＣＤなどの撮像装置４５を有している。一般には、光測定装置での画像取得部は、試料Ｓから放出される蛍光や燐光、発光などの光を含む２次元の光検出画像を取得可能に構成される。また、マイクロプレート２０が配置される測定位置Ｐと、撮像装置４５との間には、導光光学系４１が設置されている。
【００２８】
この導光光学系４１は、複数のウェル２１のそれぞれに試料Ｓが保持されたマイクロプレート２０を底面２２側からみた２次元光像を撮像装置４５へと導く光学系である。導光光学系４１の具体的な構成については、マイクロプレート２０及び撮像装置４５の構成等に応じ、必要な機能（例えば集光機能、光像縮小機能等）を実現可能な光学素子によって適宜構成すれば良い。文献１：特開２００１−１８８０４４号公報においては、そのような導光光学系として、テーパファイバを用いる構成を例示している。
【００２９】
また、図１においては、さらに、導光光学系４１と撮像装置４５との間に、必要に応じて蛍光の導光光路上への光学フィルタの配置、切換等を行うことが可能な光学フィルタ部４２が設置されている。ただし、このような光学フィルタ部４２については、不要であれば設けなくても良い。
【００３０】
また、マイクロプレート２０のウェル２１内の試料Ｓに対し、蛍光画像を取得するための画像取得部４０に加えて、励起光源３０が設置されている。この励起光源３０は、試料Ｓに対して蛍光測定用の励起光を供給するための励起光供給手段である。励起光源３０の具体的な構成としては、蛍光測定の対象となる試料Ｓの種類、試料Ｓに照射する励起光の波長等に応じて適宜構成すれば良いが、例えば、光を供給する照明光源と、励起光の波長の選択、切換を行うための光学フィルタ部とによって構成することができる。また、試料Ｓに対して行われる光測定の種類により、励起光の供給が不要な場合には、励起光源３０を設けない構成としても良い。
【００３１】
本実施形態においては、励起光源３０は図１に示すように暗箱１５に対して外側に配置されており、励起光源３０から供給される励起光は、励起光供給用ライトガイド３１及び導光光学系４１を介して試料Ｓへと照射される構成となっている。このような構成では、導光光学系４１は、マイクロプレート２０及び試料Ｓからの２次元光像を撮像装置４５へと導くとともに、励起光源３０からの励起光を試料Ｓへと導くことが可能な光学系として構成される。このような光学系は、例えば、マイクロプレート２０からの蛍光を通過させるとともに、励起光源３０からの励起光を反射させるダイクロイックミラー等を用いて構成することができる。なお、図１においては、導光光学系４１における蛍光及び励起光の光路を、それぞれ実線及び破線によって模式的に示している。
【００３２】
これらの画像取得部４０を含むデータ取得装置１０、及び励起光源３０に対し、データ解析装置５０が設けられている。このデータ解析装置５０は、画像取得部４０によって光検出画像として取得された蛍光画像を含む測定データに対して、解析処理を行う解析手段である。また、データ解析装置５０は、データ取得装置１０及び励起光源３０の各部の動作を制御することによって、本蛍光測定装置１における試料Ｓに対する蛍光測定を制御する。また、図１においては、データ解析装置５０に対して、測定結果等を表示する表示装置７１と、データの入力や蛍光測定に必要な指示の入力等に用いられる入力装置７２とが接続されている。
【００３３】
以上の構成において、マイクロプレート２０のウェル２１内に保持され、暗箱１５内で測定位置Ｐに配置された試料Ｓに対し、ライトガイド３１及び導光光学系４１を介して、励起光源３０から供給された蛍光測定用の励起光が照射される（励起光供給ステップ）。そして、試料Ｓから放出された蛍光を含む２次元光像は、導光光学系４１を介して撮像装置４５へと導かれ、撮像装置４５によって２次元の蛍光画像が取得される（画像取得ステップ）。画像取得部４０によって取得された蛍光画像を含む測定データは、データ解析装置５０へと送られる。そして、データ解析装置５０は、入力された測定データに対して、試料Ｓの評価等に必要な解析処理を行う（データ解析ステップ）。
【００３４】
次に、本実施形態の蛍光測定装置１におけるデータ解析装置５０の具体的な構成、及びデータ解析方法について説明する。図４は、図１に示した蛍光測定装置１に用いられるデータ解析装置５０の構成の一例を示すブロック図である。本データ解析装置５０は、解析処理部５１と、測定領域設定部５６と、除外領域抽出部５７と、閾値設定部５８とを有して構成されている。
【００３５】
解析処理部５１は、データ取得装置１０の画像取得部４０によって取得された試料Ｓの光検出画像である蛍光画像に対して設定された解析領域に基づき、解析領域内での光強度を解析データとして、試料Ｓについての蛍光解析処理を行う解析処理手段である。本構成例においては、解析処理部５１は、平均光強度算出部５２と、解析データ選択部５３とを有している。
【００３６】
解析データ選択部５３は、データ取得装置１０から入力された測定データの蛍光画像に対して、蛍光解析処理に用いられる解析領域を設定する。そして、蛍光画像の画像データから解析領域に基づいて必要なデータを選択して解析データとする。また、平均光強度算出部５２は、解析データ選択部５３によって選択された解析データを用い、試料Ｓについての蛍光解析処理として、解析領域内での光強度分布における平均光強度を算出する処理を行う（解析処理ステップ、平均光強度算出ステップ）。
【００３７】
また、図４に示す解析処理部５１においては、データ取得装置１０から入力される蛍光画像などの測定データに対して、測定データ補正部５４が設けられている。測定データ補正部５４は、画像取得部４０によって取得された蛍光画像に対するダーク補正、自家蛍光補正、シェーディング補正など、測定データに対して必要な補正（後述）を行う。
【００３８】
解析処理部５１において蛍光画像に対して適用される解析領域は、測定領域設定部５６によって設定される測定領域と、除外領域抽出部５７によって抽出される測定除外領域とに基づいて設定される。測定領域設定部５６は、画像取得部４０によって取得された蛍光画像に対して、試料Ｓについての蛍光測定に用いる測定領域を設定する（測定領域設定ステップ）。この測定領域は、例えば、マイクロプレート２０において試料Ｓが保持されているウェル２１の画像取得部４０側からみた円形状の平面形状など、試料Ｓが存在する領域の形状等に基づいて設定される。
【００３９】
除外領域抽出部５７は、画像取得部４０によって所定条件下で取得されたマイクロプレート２０の２次元画像を参照画像とし、その参照画像を用いて、蛍光解析処理から除かれる測定除外領域を抽出する（除外領域抽出ステップ）。この測定除外領域は、後述するように、マイクロプレート２０での埃等の影響を除去するためのものである。
【００４０】
具体的には、除外領域抽出部５７は、参照画像の測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較する。そして、その光強度分布中で光強度閾値を超える光強度を有する領域を抽出して測定除外領域とする。あるいは、除去しようとする埃等の影響に応じ、光強度分布中で光強度閾値より低い光強度を有する領域を抽出して測定除外領域とする。また、図４においては、この除外領域抽出部５７に対して、閾値設定部５８が設けられている。閾値設定部５８は、上記のように測定除外領域の抽出に用いられる光強度閾値を所定の方法で設定する（閾値設定ステップ）。
【００４１】
解析処理部５１で蛍光画像の解析処理に用いられる解析領域は、解析データ選択部５３において、測定領域設定部５６で設定された測定領域から、除外領域抽出部５７で抽出された測定除外領域を除いた領域によって設定される。なお、光強度分布を光強度閾値と比較した結果、測定除外領域が抽出されなかった場合には、測定領域がそのまま解析領域に設定される。また、光検出画像に対する測定領域の設定方法、測定除外領域の抽出方法、測定除外領域の抽出に用いられる参照画像等については、具体的には後述する。
【００４２】
また、図４に示すデータ解析装置５０においては、データ記憶手段として、測定データ記憶部６１、閾値データ記憶部６２、及び補正データ記憶部６３が設けられている。測定データ記憶部６１は、データ取得装置１０から入力された測定データ、あるいは測定データ補正部５４によって補正された測定データ等の格納に用いられる。また、閾値データ記憶部６２は、閾値設定部５８で設定される閾値に関するデータ等の格納に用いられる。また、補正データ記憶部６３は、測定データ補正部５４で測定データの補正を行う際に必要な補正データ等の格納に用いられる。
【００４３】
図５は、図４に示したデータ解析装置５０のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。本構成例におけるデータ解析装置５０は、バス８０と、バス８０に接続されたＣＰＵなどの演算部８１とを有している。また、バス８０には、画像メモリ８２、外部装置接続用のインターフェース８３、プログラム記憶部８４、及びデータ記憶部８５が接続されており、これによってデータ解析装置５０が構成されている。
【００４４】
画像メモリ８２は、データ取得装置１０の画像取得部４０で取得された蛍光画像などの画像データの入力等に用いられる。インターフェース８３は、データ取得装置１０、励起光源３０などの蛍光測定装置１を構成する外部装置を接続するために用いられる。プログラム記憶部８４は、データ取得装置１０の動作、データ取得装置１０で取得された測定データの解析等に必要なプログラムが格納され、また、必要に応じて作業領域、パラメータ領域等が設けられる。データ記憶部８５は、例えば、図４に示した構成におけるデータ記憶部６１、６２、６３に対応している。
【００４５】
また、このデータ取得装置５０のバス８０には、表示装置７１として用いられるモニタ７３、及び入力装置７２として用いられるキーボード７４、マウス７５等が接続されている。また、必要に応じて、ハードディスクなどの外部記憶装置をさらに接続しても良い。
【００４６】
本実施形態による蛍光測定装置１、及び蛍光測定方法の効果について説明する。
【００４７】
図１〜図５に示した蛍光測定装置１、及び蛍光測定方法においては、試料Ｓからの蛍光を検出する光検出手段として、２次元の蛍光画像を取得可能な撮像装置４５を含む画像取得部４０を用いるとともに、この画像取得部４０によって所定条件下で２次元の参照画像を取得する。そして、この参照画像に対して所定の光強度閾値を適用して測定除外領域を抽出し、通常の測定領域から測定除外領域を除いた領域を解析領域として、蛍光画像を用いた試料Ｓについての蛍光解析処理を行っている。
【００４８】
ここで、上記のように試料Ｓがマイクロプレート２０のウェル２１内に保持された状態で蛍光測定を行う構成では、試料保持部材であるマイクロプレート２０において、その底面２２、あるいはウェル２１内などに埃やゴミ、汚れ等（以下、これらを総称して埃という）が存在する場合がある。そして、このような場合には、その埃で発生する自家蛍光や光の吸収、散乱などの現象が、試料Ｓに対して行われる蛍光測定の結果に影響し、蛍光の測定精度、試料の評価精度等が劣化することが問題となる。これに対して、上記実施形態の蛍光測定装置１では、所定条件下で埃等の影響についての２次元の参照画像を取得し、この参照画像に対して光強度閾値を適用することによって、埃に対応する領域として測定除外領域を抽出している。
【００４９】
すなわち、画像取得部４０によって取得されるマイクロプレート２０の２次元光像による参照画像では、埃が存在する部位において、その自家蛍光によって他の部位よりも検出される光強度が大きくなる。これに対して、参照画像から得られる測定領域内での光強度分布に対して適切な光強度閾値を設定しておき、例えば閾値を超える光強度を有する領域を抽出して測定除外領域とするなどの方法を用いることにより、埃に対応する領域を蛍光解析処理から除くことが可能である。また、埃による光の吸収、散乱が問題になる場合、埃が存在する部位において、それによる光の吸収、散乱によって他の部位よりも検出される光強度が小さくなる。これに対して、例えば閾値より低い光強度を有する領域を抽出して測定除外領域とするなどの方法を用いることにより、埃に対応する領域を蛍光解析処理から除くことが可能である。
【００５０】
このような方法を用いることにより、試料Ｓを保持するマイクロプレート２０などの試料保持部材において測定領域内に埃が存在する場合であっても、埃等の影響を効果的に除去、抑制することができ、蛍光画像を用いた試料の評価等を充分に高い精度で確実に行うことが可能となる。なお、具体的な光強度閾値の適用方法については、上記したように、問題となる埃等の影響に応じて設定することが好ましい。また、このような方法は、蛍光画像に対する解析処理以外にも、試料から放出される光を含む２次元の光検出画像に対する解析処理において一般に適用可能である。
【００５１】
また、データ解析装置５０の解析処理部５１で行われる蛍光解析処理などの解析処理については、図４に示した構成例では、平均光強度算出部５２によって解析領域内での２次元の光強度分布における平均光強度を算出する方法を用いている。このように、解析領域での平均光強度を求める方法で試料についての解析処理を行うことにより、その解析領域において測定された蛍光などの光の光強度を用いた試料Ｓの評価等を、好適かつ簡便な方法で行うことができる。また、光検出画像に対する解析処理としては、解析領域内での光強度の平均値を求める方法以外にも、例えば、光強度のメディアン値を求める方法、２次元の光強度分布を直接用いる方法など、様々な方法を用いて良い。
【００５２】
また、除外領域抽出部５７において測定除外領域の抽出に用いられる光強度閾値については、図４に示した構成例では、閾値設定部５８において設定された閾値を用いることとしている。この場合の光強度閾値の設定方法としては、例えば、参照画像などの測定データから閾値を求める方法、操作者による入力装置７２からの入力データによって閾値を設定する方法などを用いることができる。あるいは、あらかじめ設定された閾値を用いる構成としても良い。
【００５３】
なお、画像取得部４０によって取得される２次元画像における光強度分布は、実際には２次元画像を構成する各画素（撮像装置４５の２次元画素構造に対応）での輝度値の分布データとして取得される。したがって、このような場合には、上記した光強度閾値を画像データでの輝度値に対する閾値として設定しておくことが好ましい。これにより、２次元の参照画像の各画素での輝度値と、閾値とを比較することによって、測定除外領域を好適に抽出することができる。
【００５４】
また、除外領域抽出部５７での領域抽出処理については、それぞれの測定領域に対して測定除外領域を抽出するか否かを選択可能（切換可能）としても良い。このような構成によれば、例えば、埃が存在してもその自家蛍光や光の吸収、散乱などの影響が無視できるような場合に測定除外領域の抽出をＯＦＦにするなど、必要に応じて測定除外領域の抽出処理のＯＮ／ＯＦＦを切り換えることが可能となる。これにより、データ解析装置５０において行われる解析処理の効率が向上される。また、このようなＯＮ／ＯＦＦの選択、切換については、例えば操作者による入力装置７２からの指示に基づいて行う構成とすることが好ましい。
【００５５】
また、図１に示した蛍光測定装置１においては、試料Ｓを保持する試料保持部材として複数のウェル２１を有するマイクロプレート２０を用いている。このようにマイクロプレート２０が用いられる場合には、データ解析装置５０において、画像取得部４０によって取得される蛍光画像などの光検出画像に対する測定領域、解析領域、及び必要があれば測定除外領域を、複数のウェル２１のそれぞれに対して設定することが好ましい。
【００５６】
このように、マイクロプレート２０での複数のウェル２１に対応するように、データ解析装置５０において複数の解析領域等を設定して試料についての解析処理を行うことにより、複数のウェル２１に収容された試料Ｓのそれぞれに対して、光測定による試料Ｓの評価等を個別かつ同時に実行することが可能となる。
【００５７】
例えば、図２に示したように８×１２＝９６個のウェル２１を有するマイクロプレート２０を用いた場合、画像取得部４０によって取得される２次元の光検出画像は、図６にその一例を示すように、８×１２＝９６個でそれぞれが円形状のウェル像（試料像）を含む画像となる。この場合、図７に示すように、マイクロプレート２０の構成に対応して９６個の円形状の測定領域を設定することにより、９６個のウェル２１に収容された試料Ｓのそれぞれに対して、必要な解析処理を実行することができる。なお、この図７に示したような測定領域については、例えば、光測定装置において用いられるマイクロプレート２０のウェル構造に対応させて、あらかじめプレートマップデータとして用意しておくことが好ましい。あるいは、マイクロプレート２０の画像を取得した上で、その画像を参照してプレートマップデータを作成しても良い。
【００５８】
また、上記した蛍光測定装置１において実行される蛍光測定方法、特にデータ解析装置５０において実行されるデータ解析方法に対応する処理は、試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの蛍光を測定する蛍光測定をコンピュータに実行させるための蛍光測定プログラムによって実現可能である。また、一般に蛍光や燐光、発光などの試料からの光を対象とした光測定装置についても、光測定装置において実行される光測定方法、特にデータ解析方法に対応する処理は、試料からの光を測定する光測定をコンピュータに実行させるための光測定プログラムによって実現可能である。
【００５９】
例えば、蛍光測定装置１のデータ解析装置５０は、図５に例示したようにデータ解析処理に必要な各ソフトウェアプログラムなどが記憶させるＲＯＭと、プログラム実行中に一時的にデータが記憶されるＲＡＭとが接続されたＣＰＵによって構成することができる。このような構成において、ＣＰＵによって所定の光測定プログラムである蛍光測定プログラムを実行することにより、データ解析装置５０、及びそれを含む蛍光測定装置１を実現することができる。
【００６０】
このような光測定プログラムとしては、例えば、画像取得手段によって取得された、試料から放出される光を含む２次元の光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定処理と、画像取得手段によって所定条件下で取得された参照画像を用い、参照画像の測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出処理と、測定領域から測定除外領域を除くことによって光検出画像に対する解析領域を設定し、解析領域内での光強度を解析データとして、試料についての解析処理を行う解析処理とを含むデータ解析処理をコンピュータに実行させるように構成されたプログラムを用いることが好ましい。
【００６１】
また、光測定のための各処理をＣＰＵに実行させるための上記したプログラムは、コンピュータ読取可能な記録媒体に記録して頒布することが可能である。このような記録媒体には、例えば、ハードディスク及びフレキシブルディスクなどの磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ及びＤＶＤ−ＲＯＭなどの光学媒体、フロプティカルディスクなどの磁気光学媒体、あるいは、プログラム命令を実行または格納するように特別に配置された、例えばＲＡＭ、ＲＯＭ、及び半導体不揮発性メモリなどのハードウェアデバイスなどが含まれる。
【００６２】
試料Ｓの光測定における埃等の影響、光検出画像での測定領域に対する測定除外領域の抽出、及びそれによる効果について、さらに具体的に説明する。なお、ここでは、試料Ｓの蛍光測定を例として、主に埃の自家蛍光の影響について検討する。また、以下においては、マイクロプレート２０における単一のウェル２１に着目し、ウェル２１に対して取得される画像、設定される領域等を用いて具体的な蛍光測定方法、解析方法について説明する。マイクロプレート２０に含まれる複数のウェル２１の全体に対して蛍光測定を行う場合には、それぞれのウェル２１に対して同様の処理を行えば良い。
【００６３】
図８は、マイクロプレート２０の単一のウェル２１に対応する蛍光画像、測定領域、測定除外領域、及び解析領域の例を示す図である。図８（ａ）は、ウェルに埃が存在しない場合の蛍光画像の一例を示している。このような蛍光画像に対して、図８（ｂ）に示すように、ウェルの平面形状に対応した円形状の測定領域Ｒ１が設定される。また、この例では、埃が存在しないため、この測定領域Ｒ１がそのまま解析領域Ｒ３となる。
【００６４】
一方、図８（ｃ）は、ウェルに埃が存在する場合の蛍光画像の一例を示している。この画像では、埃の形状に対応して光強度が大きい領域（埃の像）が生成されている。このような蛍光画像を参照画像として考え、適当な光強度閾値を適用して測定除外領域の抽出を行うと、図８（ｄ）に示すように、円形状の測定領域Ｒ１内において、埃の像に対応する形状の測定除外領域Ｒ２が抽出される。そして、測定領域Ｒ１から測定除外領域Ｒ２を除いた領域（図中で斜線を付した領域）を解析領域Ｒ３とすることにより、蛍光解析処理における埃の自家蛍光の影響を抑制することができる。
【００６５】
図８に示した蛍光画像に対する解析処理について、さらに具体的に説明すると、埃が存在しない図８（ａ）の蛍光画像では、測定領域Ｒ１と一致している解析領域Ｒ３内での光強度分布について、その平均光強度Ａｖが求められる。そして、この平均光強度Ａｖに対して補正係数α、βを用いてダーク補正等の必要なデータ補正を行うことにより、光強度データＤが
Ｄ＝（Ａｖ＋α）×β
によって求められる。
【００６６】
一方、埃が存在する図８（ｃ）の蛍光画像では、測定領域Ｒ１をそのまま解析領域とした場合、求められる平均光強度は埃の自家蛍光によるオフセットγが加わってＡｖ＋γとなる。また、この平均光強度Ａｖ＋γに対してデータ補正を行うと、光強度データＤは
Ｄ＝（Ａｖ＋γ＋α）×β
となり、データＤが埃の自家蛍光によるオフセットγの影響を受けることとなる。
【００６７】
これに対して、図８（ｄ）に示したように、光強度閾値に基づいて抽出された測定除外領域Ｒ２を測定領域Ｒ１から除いて解析領域Ｒ３を設定することにより、埃の自家蛍光の影響が除去された解析領域Ｒ３内での光強度分布を用いることとなるので、本来の平均光強度Ａｖ、及び光強度データＤを求めることが可能となる。また、埃の自家蛍光の影響が残った場合でも、測定領域Ｒ１をそのまま解析領域とした場合に比べて、その影響を充分に抑制することができる。
【００６８】
また、図８（ｃ）に示したような蛍光画像を参照画像とする場合、測定除外領域Ｒ２の抽出に適用する光強度閾値については、上記したようにあらかじめ設定された閾値を用いることができる。あるいは、各参照画像に応じて確実に測定除外領域Ｒ２の抽出を行う上では、参照画像から閾値を設定する方法を用いることが好ましい。そのような設定方法の具体例としては、測定領域Ｒ１の全体での平均光強度を求め、得られた平均光強度に対して所定の閾値設定係数を掛け合わせた値を光強度閾値とする方法が挙げられる。
【００６９】
また、通常の測定領域Ｒ１についてマイクロプレート２０に対応するプレートマップデータが作成されている場合には、測定除外領域Ｒ２の抽出結果に基づいてプレートマップデータを修正し、埃の影響が除去された解析領域Ｒ３のプレートマップデータを作成して蛍光解析処理に用いることが好ましい。
【００７０】
ここで、試料Ｓの評価等のための蛍光測定は、例えば試料Ｓを刺激した際の光強度の時間変化を測定することによって行われるが、その具体的な解析方法としては、蛍光強度の絶対値を用いる方法、及び蛍光強度の変化量を示す比（レシオ）を用いる方法がある。測定除外領域を抽出して解析を行う上記の手法は、絶対値解析及びレシオ解析のいずれの解析方法が適用される場合でも効果があるが、特に、レシオ解析を行う場合に有効である。
【００７１】
図９は、蛍光画像から得られる光強度の時間変化の例を示す図である。図９（ａ）は、蛍光画像に対して絶対値解析を行って得られる光強度の時間変化のグラフであり、横軸は時間ｔを示し、縦軸は各時刻ｔでの光強度データＤ（ｔ）を示している。また、グラフ中において、実線は埃なしでの光強度データを示し、破線は埃ありでの光強度データを示している。このグラフに示すように、絶対値解析による光強度の時間変化では、埃からの自家蛍光による光強度のオフセットがあるが、試料Ｓからの蛍光による時間変化量は埃の有無にかかわらず同じとなる。
【００７２】
一方、図９（ｂ）は、蛍光画像に対してレシオ解析を行って得られる強度比の時間変化のグラフであり、横軸は時間ｔを示し、縦軸は時刻ｔ＝０を基準とした各時刻ｔでの光強度データの強度比Ｄ（ｔ）／Ｄ（０）を示している。また、グラフ中において、実線は埃なしでの強度比データを示し、破線は埃ありでの強度比データを示している。このグラフに示すように、レシオ解析で得られる強度比の時間変化では、上記した光強度のオフセットによって時刻０での光強度Ｄ（０）と、時刻ｔでの光強度Ｄ（ｔ）との比が変化してしまい、試料Ｓからの蛍光による時間変化量が埃ありの場合に小さくなってしまう。これに対して、上記方法によって埃の自家蛍光の影響が除去される解析処理を行えば、埃によって強度比の時間変化量が小さくなることが防止され、その測定精度が向上される。
【００７３】
なお、上記のように強度比を用いるレシオ解析法は、光強度をそのまま用いる絶対値解析法に比べていくつかの利点を持っている。まず、光強度データＤ（ｔ）のベースラインについては、埃によるオフセット以外にも様々な要因で変動する場合があるが、強度比を用いることにより、ベースラインを簡単に揃えることができる。また、ベースラインが揃うことにより、蛍光による光強度の変化量の評価が容易である。また、光強度の比をとることにより、試料Ｓの濃度ばらつき等の影響を相殺することができる。
【００７４】
次に、測定除外領域の抽出に用いられる参照画像について説明する。このような参照画像としては、例えば、試料Ｓがマイクロプレート２０によって保持された状態で取得された蛍光画像や発光画像等の光検出画像を用いることができる。この場合の光検出画像としては、光解析に用いられる本測定での測定データを用いることができる。あるいは、試料Ｓを配置した状態で本測定に先立って行われる較正測定での較正データを用いても良い。
【００７５】
また、参照画像として、試料Ｓとは別の参照用試料がマイクロプレート２０によって保持された状態で取得された光検出画像を用いることができる。特に、参照用試料を用いて蛍光画像を取得する場合、参照用試料として蛍光物質を実質的に含まない試料（コントロールサンプル）を用いることが好ましい。このような参照用試料としては、例えば純水が挙げられる。
【００７６】
純水などの参照用試料に対して取得された蛍光画像を参照画像とする場合、埃が存在する部位以外では、参照用試料が蛍光物質を含まないために光強度が充分に小さい。このため、測定領域内での光強度分布による埃の識別、及び光強度閾値を用いた測定除外領域の抽出を容易かつ確実に実行可能である。蛍光物質を含まない参照用試料に対して得られる参照画像のデータは、下記に詳述する自家蛍光補正において、自家蛍光補正データとして好適に使用することができる。
【００７７】
その他の参照用試料としては、蛍光物質が挙げられる。所定濃度の蛍光物質をマイクロプレートに均一に入れた状態で取得された蛍光画像を参照画像とする場合、得られる参照画像のデータは、下記に詳述するシェーディング補正において、シェーディング補正データとして好適に使用することができる。このような参照用試料を用いた参照画像は、例えば、試料Ｓに対する蛍光測定前で、補正データを作成するための予備的測定時に取得することができる。
【００７８】
次に、光検出画像から得られる光強度データ等に対して行われる補正、及び補正に用いられる補正データの取得等について説明する。蛍光画像などの光検出画像に対する補正としては、具体的には（１）ダーク補正、（２）自家蛍光補正、及び（３）シェーディング補正の３つの補正がある。これらの各補正は、それぞれの蛍光測定装置１などの光測定装置の構成や要求される測定精度などを考慮して、必要に応じて適宜行われる。また、これらの補正に用いられる補正データは、通常、試料Ｓに対する本測定に先立って、それぞれ所定の条件下で予備的測定を行うことで取得される。
【００７９】
ダーク補正は、光検出画像の取得に用いられる撮像装置４５（図１参照）についての補正である。ＣＣＤカメラなどの撮像装置４５では、通常、暗中でもある程度の出力（輝度値）を持っている。ダーク補正では、暗中で励起光を照射しない条件下で撮像装置４５によって画像を取得し、得られた画像データをダーク補正データとする。そして、測定データ取得時に補正データを差し引くことにより、ダーク補正を行う。
【００８０】
自家蛍光補正は、試料Ｓを保持するマイクロプレート２０等に起因する蛍光についての補正である。上記のように、マイクロプレート２０の底面２２やウェル２１内に埃がある場合、埃に起因する自家蛍光が問題になるが、埃が存在しない場合でもマイクロプレート２０の材質自体で、ある程度の自家蛍光が発生する。このようなマイクロプレート２０自体の自家蛍光の影響が問題になる場合には、水やバッファなどの自家蛍光参照用の試料がマイクロプレート２０によって保持された状態で参照画像となる蛍光画像を取得し、得られた画像データを自家蛍光補正データとする。そして、測定データ取得時に補正データを差し引くことにより、自家蛍光補正を行う。
【００８１】
図１０は、自家蛍光補正データの導出方法の一例を示すフローチャートである。この方法では、まず、上記したように暗中の条件下でダーク補正用の画像を取得し（ステップＳ１０１）、ダーク補正データＤ１１を求める。次に、純水などの参照用試料をマイクロプレート２０に入れて、励起光を照射して自家蛍光補正用の画像を取得する（Ｓ１０２）。そして、得られた蛍光測定データＤ１０に対して、ダーク補正データＤ１１を差し引くダーク補正を行う（Ｓ１０３）ことにより、自家蛍光補正データＤ１２
Ｄ１２＝Ｄ１０−Ｄ１１
が導出される。
【００８２】
シェーディング補正は、撮像装置４５や導光光学系４１を含む光学系に起因するデータばらつきについての補正である。シェーディング補正では、例えば蛍光測定においては、蛍光試料をマイクロプレート２０に均一に入れた状態で参照画像の光検出画像となる蛍光画像を取得し、得られた画像データをシェーディング補正データとする。そして、測定データ取得時に補正データを用いて、シェーディング補正を行う。
【００８３】
図１１は、シェーディング補正データの導出方法の一例を示すフローチャートである。この方法では、まず、上記したように暗中の条件下でダーク補正用の画像を取得し（ステップＳ２０１）、ダーク補正データＤ２１を求める。次に、均一な蛍光試料をマイクロプレート２０に入れて、励起光を照射してシェーディング補正用の画像を取得する（Ｓ２０２）。そして、得られた蛍光測定データＤ２０に対して、ダーク補正データＤ２１を差し引くダーク補正を行い（Ｓ２０３）、さらにあらかじめ取得された自家蛍光補正データＤ２２を差し引く自家蛍光補正を行う（Ｓ２０４）ことにより、シェーディング補正データＤ２３
Ｄ２３＝Ｄ２０−Ｄ２１−Ｄ２２
が導出される。
【００８４】
これらの補正データを取得後に試料Ｓに対して本測定を行う場合、本測定で得られた測定データに対する補正（図４に示した解析処理部５１の測定データ補正部５４参照）は、例えば以下のように行われる。
【００８５】
図１２は、補正された光測定データの導出方法の一例を示すフローチャートである。この方法では、まず、上記したように暗中の条件下でダーク補正用の画像を取得し（ステップＳ３０１）、ダーク補正データＤ３１を求める。次に、測定対象となる試料Ｓをマイクロプレート２０に入れて、励起光を照射して本測定の光検出画像である蛍光画像を取得する（Ｓ３０２）。そして、得られた蛍光測定データＤ３０に対して、ダーク補正データＤ３１を差し引くダーク補正を行い（Ｓ３０３）、さらにあらかじめ取得された自家蛍光補正データＤ３２を差し引く自家蛍光補正（Ｄ３０４）、及びシェーディング補正データＤ３３によって補正するシェーディング補正を行う（Ｄ３０５）ことにより、補正された蛍光測定データＤ３５
Ｄ３５＝（Ｄ３０−Ｄ３１−Ｄ３２）／Ｄ３３×（Ｄ３３の平均値）
が導出される。
【００８６】
ここで、測定除外領域の抽出に用いる参照画像に関して上記した純水などの参照用試料を用いた参照画像は、これらの補正データ取得用の予備的測定のうちの自家蛍光補正用の予備的測定、あるいはシェーディング補正用の予備的測定などにおいて取得することができる。また、この測定除外領域については、補正データ取得時にも本測定と同様に適用することが好ましい。すなわち、補正データ取得用の予備的測定では、通常は本測定よりも全体の光強度が小さく、埃等の影響を受けやすい。このように、埃等の影響を受けた状態で補正データを取得すると、その補正データを用いて行われる本測定の測定精度が低下してしまう。
【００８７】
これに対して、補正データ取得時、特に自家蛍光補正データ取得時において、測定除外領域を適用して解析処理を行うことにより、補正データの精度、及びそれを用いた本測定での測定精度を向上することができる。なお、自家蛍光補正データについては、マイクロプレート２０が有する自家蛍光特性が製造メーカ毎に揃っているような場合には、製造メーカに対応した補正データをあらかじめ用意しておき、必要に応じて補正データを読み出して用いる構成としても良い。
【００８８】
本発明による光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムは、上記した実施形態及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、試料Ｓを保持する試料保持部材については、それぞれ試料Ｓを保持可能な複数のウェル２１を有するマイクロプレート２０を例示したが、これに限らず、例えば単一の試料Ｓのみを保持可能な試料保持部材など、様々な部材を用いて良い。また、マイクロプレート２０としては、９６ウェルのマイクロプレートに限られるものではなく、３８４ウェル、あるいは１５３６ウェルのプレートを用いても良い。また、光測定装置の具体的な構成については、図１に示した蛍光測定装置１は、試料保持部材としてマイクロプレート２０を用いた場合の構成の一例を示すものであり、一般には、試料保持部材の種類や光測定の条件等に応じて、様々な構成を用いて良い。
【００８９】
また、上記実施形態では、本発明による光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムの一例として、主に蛍光測定装置、蛍光測定方法、及び蛍光測定プログラムについて説明したが、本発明は、上記したように、蛍光測定以外にも、例えば燐光や発光など、試料からの光を測定する光測定に一般に適用可能である。この場合、例えば発光測定では、図１に示した構成において励起光源３０等は不要である。また、この場合に測定対象となる試料Ｓからの発光現象としては、試料Ｓに試薬を注入したときに生じる発光が例として挙げられる。また、光測定装置の具体的な構成については、図１に示した蛍光測定装置１はその構成の一例を示すものであり、一般には、試料からの光の測定条件、光学系の構成等に応じて、様々な構成を用いて良い。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、埃等の自家蛍光や光の吸収、散乱などの影響を抑制することが可能な光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムとして利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】蛍光測定装置の一実施形態を模式的に示す構成図である。
【図２】マイクロプレートの構成の一例を示す斜視図である。
【図３】図２に示したマイクロプレートの断面構造を示す側面断面図である。
【図４】データ解析装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図５】図４に示したデータ解析装置のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。
【図６】画像取得部によって取得される蛍光画像の一例を示す図である。
【図７】図６に示した蛍光画像に対する測定領域の設定の一例を示す図である。
【図８】マイクロプレートの単一のウェルに対応する蛍光画像、測定領域、測定除外領域、及び解析領域の例を示す図である。
【図９】蛍光画像から得られる光強度の時間変化の例を示す図である。
【図１０】自家蛍光補正データの導出方法の一例を示す図である。
【図１１】シェーディング補正データの導出方法の一例を示す図である。
【図１２】補正された蛍光測定データの導出方法の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００９２】
１…蛍光測定装置、１０…データ取得装置、１１…マイクロプレートホルダ、１２…搬送機構、１３…搬入側マイクロプレートストッカー、１４…搬出側マイクロプレートストッカー、１５…暗箱、１６…分注装置、２０…マイクロプレート、２１…ウェル、２２…底面、３０…励起光源、３１…励起光供給用ライトガイド、４０…画像取得部、４１…導光光学系、４２…光学フィルタ部、４５…撮像装置、
５０…データ解析装置、５１…解析処理部、５２…平均光強度算出部、５３…解析データ選択部、５４…測定データ補正部、５６…測定領域設定部、５７…除外領域抽出部、５８…閾値設定部、６１…測定データ記憶部、６２…閾値データ記憶部、６３…補正データ記憶部、７１…表示装置、７２…入力装置、７３…モニタ、７４…キーボード、７５…マウス、８０…バス、８１…演算部、８２…画像メモリ、８３…インターフェース、８４…プログラム記憶部、８５…データ記憶部。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料から放出される蛍光や燐光、発光などの光を測定する光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
創薬分野等において細胞などの試料からの蛍光を測定する方法として、マイクロプレートを利用した蛍光測定方法が用いられている（例えば、文献１：特開２００１−１８８０４４号公報参照）。マイクロプレートは、それぞれ試料を保持可能な複数のウェル（テストホール）が設けられた板状の試料保持部材であり、各ウェル内に保持された試料から放出される蛍光を測定することで、試料の評価や必要な蛍光解析を効率的に行うことが可能である。
【特許文献１】特開２００１−１８８０４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記文献１に記載された蛍光測定装置では、試料から放出される蛍光を透過するように底面が形成されたマイクロプレートによって試料を保持し、その下方に設置された光検出手段によって蛍光を検出している。このようなマイクロプレートを用いた試料の蛍光測定においては、マイクロプレートの底面、あるいは試料が保持されるウェル内に埃やゴミ、汚れ等がある場合、その埃で発生する自家蛍光の影響が問題となる。また、このような埃等から放出される自家蛍光の影響以外にも、埃等による光の吸収、散乱の影響も問題となる。このような埃等の影響の問題は、マイクロプレート以外の試料保持部材を用いた場合にも同様に生じる。また、埃等に起因する上記の問題は、蛍光測定以外にも、燐光や発光など、試料からの光を測定する場合に一般に生じるものである。
【０００４】
本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、光測定における埃やゴミ、汚れ等の影響、例えば自家蛍光や光の吸収、散乱の影響、を抑制することが可能な光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このような目的を達成するために、本発明による光測定装置は、試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの光を測定する光測定装置であって、（１）試料から放出される光を含む２次元の光検出画像を取得する画像取得手段と、（２）光検出画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析手段とを備え、データ解析手段は、（３）画像取得手段によって取得された光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定手段と、（４）画像取得手段によって所定条件下で取得された参照画像を用い、参照画像の測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出手段と、（５）測定領域から測定除外領域を除くことによって光検出画像に対する解析領域を設定し、解析領域内での光強度を解析データとして、試料についての解析処理を行う解析処理手段とを有することを特徴とする。
【０００６】
また、本発明による光測定方法は、試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの光を測定する光測定方法であって、（１）試料から放出される光を含む２次元の光検出画像を取得する画像取得ステップと、（２）光検出画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析ステップとを備え、データ解析ステップは、（３）画像取得ステップによって取得された光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定ステップと、（４）画像取得ステップによって所定条件下で取得された参照画像を用い、参照画像の測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出ステップと、（５）測定領域から測定除外領域を除くことによって光検出画像に対する解析領域を設定し、解析領域内での光強度を解析データとして、試料についての解析処理を行う解析処理ステップとを含むことを特徴とする。
【０００７】
また、本発明による光測定プログラムは、試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの光を測定する光測定をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、（ａ）画像取得手段によって取得された、試料から放出される光を含む２次元の光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定処理と、（ｂ）画像取得手段によって所定条件下で取得された参照画像を用い、参照画像の測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出処理と、（ｃ）測定領域から測定除外領域を除くことによって光検出画像に対する解析領域を設定し、解析領域内での光強度を解析データとして、試料についての解析処理を行う解析処理とを含むデータ解析処理をコンピュータに実行させることを特徴とする。
【０００８】
上記した光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムにおいては、試料からの蛍光や燐光、発光などの光を検出する光検出手段として、２次元の光検出画像（例えば蛍光画像、燐光画像、発光画像）を取得可能な画像取得手段を用いるとともに、埃等の影響についての参照画像として、所定条件下で２次元の参照画像を取得する。そして、この参照画像に対して光強度閾値を適用して埃に対応する測定除外領域を抽出し、通常の測定領域から測定除外領域を除いた領域を解析領域として、光検出画像を用いた試料についての解析処理を行っている。
【０００９】
このような構成によれば、試料を保持するマイクロプレートなどの試料保持部材において測定領域内に埃等が存在する場合であっても、自家蛍光や光の吸収、散乱などによる埃等の影響を効果的に除去、抑制することが可能である。したがって、このような光測定装置及び光測定方法を用いることにより、光検出画像を用いた試料の評価等を、充分な精度で確実に行うことが可能となる。
【００１０】
除外領域の抽出においては、具体的には、画像取得手段によって所定条件下で取得された参照画像を用い、参照画像の測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較し、光強度分布中で光強度閾値を超える光強度を有する領域を抽出して測定除外領域とすることが好ましい。このような方法は、埃等の自家蛍光の影響が問題となる場合に有効である。あるいは、光強度分布中で光強度閾値より低い光強度を有する領域を抽出して測定除外領域とすることが好ましい。このような方法は、埃等による光の吸収、散乱の影響が問題となる場合に有効である。
【００１１】
ここで、光測定装置において、解析処理手段は、解析処理として解析領域内での光強度分布における平均光強度を算出する処理を行う平均光強度算出手段を有することが好ましい。同様に、光測定方法において、解析処理ステップは、解析処理として解析領域内での光強度分布における平均光強度を算出する処理を行う平均光強度算出ステップを含むことが好ましい。同様に、光測定プログラムにおいて、解析処理は、解析処理として解析領域内での光強度分布における平均光強度を算出する処理を行う平均光強度算出処理を含むことが好ましい。このように、解析領域内での２次元の光強度分布から平均光強度を求める方法で蛍光解析処理などの解析処理を行うことにより、その解析領域において測定された光の光強度を用いた試料の評価等を、好適かつ簡便な方法で行うことができる。
【００１２】
また、光測定装置のデータ解析手段は、除外領域抽出手段における測定除外領域の抽出に用いられる光強度閾値を設定する閾値設定手段を有することが好ましい。同様に、光測定方法のデータ解析ステップは、除外領域抽出ステップにおける測定除外領域の抽出に用いられる光強度閾値を設定する閾値設定ステップを含むことが好ましい。同様に、光測定プログラムのデータ解析処理は、除外領域抽出処理における測定除外領域の抽出に用いられる光強度閾値を設定する閾値設定処理を含むことが好ましい。あるいは、このような光強度閾値としては、あらかじめ設定された閾値を用いても良い。
【００１３】
また、光測定装置の除外領域抽出手段は、測定領域に対して測定除外領域を抽出するか否かを選択可能に構成されていることが好ましい。同様に、光測定方法の除外領域抽出ステップは、測定領域に対して測定除外領域を抽出するか否かを選択可能に構成されていることが好ましい。同様に、光測定プログラムの除外領域抽出処理は、測定領域に対して測定除外領域を抽出するか否かを選択可能に構成されていることが好ましい。このような構成によれば、必要に応じて測定除外領域の抽出のＯＮ／ＯＦＦを切り換えて試料についての解析処理を行うことが可能となる。
【００１４】
測定除外領域の抽出に用いられる参照画像については、光測定装置の除外領域抽出手段は、参照画像として、試料が試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像（例えば蛍光画像）を用いる構成とすることができる。同様に、光測定方法の除外領域抽出ステップは、参照画像として、試料が試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いる構成とすることができる。同様に、光測定プログラムの除外領域抽出処理は、参照画像として、試料が試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いる構成とすることができる。
【００１５】
あるいは、光測定装置の除外領域抽出手段は、参照画像として、試料とは別の参照用試料が試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像（例えば蛍光画像）を用いる構成とすることができる。同様に、光測定方法の除外領域抽出ステップは、参照画像として、試料とは別の参照用試料が試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いる構成とすることができる。同様に、光測定プログラムの除外領域抽出処理は、参照画像として、試料とは別の参照用試料が試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いる構成とすることができる。
【００１６】
また、光測定装置では、試料保持部材が、それぞれ試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートであり、データ解析手段において、測定領域、及び解析領域を、マイクロプレートでの複数のウェルのそれぞれに対して設定することとしても良い。同様に、光測定方法では、試料保持部材が、それぞれ試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートであり、データ解析ステップにおいて、測定領域、及び解析領域を、マイクロプレートでの複数のウェルのそれぞれに対して設定することとしても良い。同様に、光測定プログラムでは、試料保持部材として、それぞれ試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートを用い、データ解析処理において、測定領域、及び解析領域を、マイクロプレートでの複数のウェルのそれぞれに対して設定することとしても良い。このような構成によれば、マイクロプレートを用いた光測定、及びそれによる試料の評価等を好適に行うことが可能となる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムによれば、所定条件下で取得された埃等の影響を含む２次元の参照画像に対し、光強度閾値を適用して埃等に対応する測定除外領域を抽出し、通常の測定領域から測定除外領域を除いた領域を解析領域として光検出画像を用いた試料についての解析処理を行うことにより、自家蛍光や光の吸収、散乱などによる埃等の影響を抑制することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、図面とともに本発明による光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムの好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。
【００１９】
図１は、本発明による光測定装置の一例である蛍光測定装置の一実施形態を模式的に示す構成図である。また、図２は、マイクロプレートの構成の一例を示す斜視図である。また、図３は、図２に示したマイクロプレートの断面構造を示す側面断面図である。本実施形態による蛍光測定装置１は、試料保持部材としてマイクロプレート２０を用い、マイクロプレート２０によって保持された状態で測定位置Ｐに配置された試料Ｓ（図３参照）からの蛍光を測定するための装置である。
【００２０】
なお、試料Ｓについては、蛍光測定の対象となるものであれば特に限定されないが、細胞や抗体などの生体試料が例として挙げられる。また、本発明による光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムは、蛍光測定以外にも、例えば燐光や発光など、試料からの光を測定する光測定に一般に適用可能であるが、以下においては、主として、その一例である蛍光測定装置、蛍光測定方法、及び蛍光測定プログラムについて説明する。以下、本蛍光測定装置１の構成について説明する。
【００２１】
図１に示す蛍光測定装置１は、データ取得装置１０、励起光源３０、及びデータ解析装置５０を備えて構成されている。データ取得装置１０は、蛍光測定の対象となる試料Ｓを保持したマイクロプレート２０が内部に収容される暗箱１５と、暗箱１５の内部に設置されて測定位置Ｐに配置された試料Ｓからの蛍光の測定に用いられる画像取得部４０とを有している。
【００２２】
本実施形態において試料保持部材として用いられているマイクロプレート２０は、図２及び図３に示すように、複数のウェル（テストホール）２１が２次元アレイ状に配置された板状部材であり、その複数のウェル２１のそれぞれにおいて、試料Ｓを保持可能な構成となっている。図２に示した構成例では、複数のウェル２１として、８×１２＝９６個のウェル２１が２次元アレイ状に配置されている。また、このマイクロプレート２０の底面２２は、試料Ｓに照射される蛍光測定用の励起光、及び試料Ｓから放出される蛍光を透過可能な材質によって形成されている。
【００２３】
暗箱１５内においては、マイクロプレート２０は、蛍光観察用の開口を有するマイクロプレートホルダ１１によって保持されている。また、これらのマイクロプレート２０及びホルダ１１に対して、暗箱１５内で所定の方向を搬送方向（図１中においては、右側から左側へと向かう方向）とするマイクロプレート搬送機構１２が設置されている。
【００２４】
搬送機構１２でのマイクロプレート２０の搬送方向に対して搬入側となる暗箱１５の一方側には、試料Ｓが保持された測定前のマイクロプレート２０を所定枚数（例えば、２５枚）ストックしておくための搬入側マイクロプレートストッカー１３が設置されている。また、マイクロプレート２０の搬送方向に対して搬出側となる暗箱１５の他方側には、測定後のマイクロプレート２０をストックしておくための搬出側マイクロプレートストッカー１４が設置されている。
【００２５】
このような構成において、搬入側マイクロプレートストッカー１３から暗箱１５内へと搬入されたマイクロプレート２０は、マイクロプレートホルダ１１によって保持されるとともに搬送機構１２によって搬送される。そして、マイクロプレート２０は測定位置Ｐで一旦停止させられ、この状態で、マイクロプレート２０によって保持された試料Ｓに対して必要な光測定、本測定装置１においては蛍光測定、が行われる。測定完了後、マイクロプレート２０は再び搬送機構１２によって搬送され、搬出側マイクロプレートストッカー１４へと搬出される。なお、図１においては、搬送機構１２、及びストッカー１３、１４については、マイクロプレート２０を搬入、搬送、搬出するための具体的な構成の図示を省略している。
【００２６】
蛍光測定の実行時にマイクロプレート２０、及びそれに保持された試料Ｓが配置される測定位置Ｐに対し、測定位置Ｐの上方には、マイクロプレート２０の各ウェル２１内に試薬等を注入するための分注装置１６が設置されている。また、測定位置Ｐの下方には、ウェル２１内に収容された試料Ｓからマイクロプレート２０の底面２２を介して放出される蛍光の測定に用いられる画像取得部４０が設置されている。
【００２７】
本実施形態においては、画像取得部４０は、試料Ｓから放出される蛍光による２次元の光検出画像である蛍光画像を取得可能な２次元ＣＣＤなどの撮像装置４５を有している。一般には、光測定装置での画像取得部は、試料Ｓから放出される蛍光や燐光、発光などの光を含む２次元の光検出画像を取得可能に構成される。また、マイクロプレート２０が配置される測定位置Ｐと、撮像装置４５との間には、導光光学系４１が設置されている。
【００２８】
この導光光学系４１は、複数のウェル２１のそれぞれに試料Ｓが保持されたマイクロプレート２０を底面２２側からみた２次元光像を撮像装置４５へと導く光学系である。導光光学系４１の具体的な構成については、マイクロプレート２０及び撮像装置４５の構成等に応じ、必要な機能（例えば集光機能、光像縮小機能等）を実現可能な光学素子によって適宜構成すれば良い。文献１：特開２００１−１８８０４４号公報においては、そのような導光光学系として、テーパファイバを用いる構成を例示している。
【００２９】
また、図１においては、さらに、導光光学系４１と撮像装置４５との間に、必要に応じて蛍光の導光光路上への光学フィルタの配置、切換等を行うことが可能な光学フィルタ部４２が設置されている。ただし、このような光学フィルタ部４２については、不要であれば設けなくても良い。
【００３０】
また、マイクロプレート２０のウェル２１内の試料Ｓに対し、蛍光画像を取得するための画像取得部４０に加えて、励起光源３０が設置されている。この励起光源３０は、試料Ｓに対して蛍光測定用の励起光を供給するための励起光供給手段である。励起光源３０の具体的な構成としては、蛍光測定の対象となる試料Ｓの種類、試料Ｓに照射する励起光の波長等に応じて適宜構成すれば良いが、例えば、光を供給する照明光源と、励起光の波長の選択、切換を行うための光学フィルタ部とによって構成することができる。また、試料Ｓに対して行われる光測定の種類により、励起光の供給が不要な場合には、励起光源３０を設けない構成としても良い。
【００３１】
本実施形態においては、励起光源３０は図１に示すように暗箱１５に対して外側に配置されており、励起光源３０から供給される励起光は、励起光供給用ライトガイド３１及び導光光学系４１を介して試料Ｓへと照射される構成となっている。このような構成では、導光光学系４１は、マイクロプレート２０及び試料Ｓからの２次元光像を撮像装置４５へと導くとともに、励起光源３０からの励起光を試料Ｓへと導くことが可能な光学系として構成される。このような光学系は、例えば、マイクロプレート２０からの蛍光を通過させるとともに、励起光源３０からの励起光を反射させるダイクロイックミラー等を用いて構成することができる。なお、図１においては、導光光学系４１における蛍光及び励起光の光路を、それぞれ実線及び破線によって模式的に示している。
【００３２】
これらの画像取得部４０を含むデータ取得装置１０、及び励起光源３０に対し、データ解析装置５０が設けられている。このデータ解析装置５０は、画像取得部４０によって光検出画像として取得された蛍光画像を含む測定データに対して、解析処理を行う解析手段である。また、データ解析装置５０は、データ取得装置１０及び励起光源３０の各部の動作を制御することによって、本蛍光測定装置１における試料Ｓに対する蛍光測定を制御する。また、図１においては、データ解析装置５０に対して、測定結果等を表示する表示装置７１と、データの入力や蛍光測定に必要な指示の入力等に用いられる入力装置７２とが接続されている。
【００３３】
以上の構成において、マイクロプレート２０のウェル２１内に保持され、暗箱１５内で測定位置Ｐに配置された試料Ｓに対し、ライトガイド３１及び導光光学系４１を介して、励起光源３０から供給された蛍光測定用の励起光が照射される（励起光供給ステップ）。そして、試料Ｓから放出された蛍光を含む２次元光像は、導光光学系４１を介して撮像装置４５へと導かれ、撮像装置４５によって２次元の蛍光画像が取得される（画像取得ステップ）。画像取得部４０によって取得された蛍光画像を含む測定データは、データ解析装置５０へと送られる。そして、データ解析装置５０は、入力された測定データに対して、試料Ｓの評価等に必要な解析処理を行う（データ解析ステップ）。
【００３４】
次に、本実施形態の蛍光測定装置１におけるデータ解析装置５０の具体的な構成、及びデータ解析方法について説明する。図４は、図１に示した蛍光測定装置１に用いられるデータ解析装置５０の構成の一例を示すブロック図である。本データ解析装置５０は、解析処理部５１と、測定領域設定部５６と、除外領域抽出部５７と、閾値設定部５８とを有して構成されている。
【００３５】
解析処理部５１は、データ取得装置１０の画像取得部４０によって取得された試料Ｓの光検出画像である蛍光画像に対して設定された解析領域に基づき、解析領域内での光強度を解析データとして、試料Ｓについての蛍光解析処理を行う解析処理手段である。本構成例においては、解析処理部５１は、平均光強度算出部５２と、解析データ選択部５３とを有している。
【００３６】
解析データ選択部５３は、データ取得装置１０から入力された測定データの蛍光画像に対して、蛍光解析処理に用いられる解析領域を設定する。そして、蛍光画像の画像データから解析領域に基づいて必要なデータを選択して解析データとする。また、平均光強度算出部５２は、解析データ選択部５３によって選択された解析データを用い、試料Ｓについての蛍光解析処理として、解析領域内での光強度分布における平均光強度を算出する処理を行う（解析処理ステップ、平均光強度算出ステップ）。
【００３７】
また、図４に示す解析処理部５１においては、データ取得装置１０から入力される蛍光画像などの測定データに対して、測定データ補正部５４が設けられている。測定データ補正部５４は、画像取得部４０によって取得された蛍光画像に対するダーク補正、自家蛍光補正、シェーディング補正など、測定データに対して必要な補正（後述）を行う。
【００３８】
解析処理部５１において蛍光画像に対して適用される解析領域は、測定領域設定部５６によって設定される測定領域と、除外領域抽出部５７によって抽出される測定除外領域とに基づいて設定される。測定領域設定部５６は、画像取得部４０によって取得された蛍光画像に対して、試料Ｓについての蛍光測定に用いる測定領域を設定する（測定領域設定ステップ）。この測定領域は、例えば、マイクロプレート２０において試料Ｓが保持されているウェル２１の画像取得部４０側からみた円形状の平面形状など、試料Ｓが存在する領域の形状等に基づいて設定される。
【００３９】
除外領域抽出部５７は、画像取得部４０によって所定条件下で取得されたマイクロプレート２０の２次元画像を参照画像とし、その参照画像を用いて、蛍光解析処理から除かれる測定除外領域を抽出する（除外領域抽出ステップ）。この測定除外領域は、後述するように、マイクロプレート２０での埃等の影響を除去するためのものである。
【００４０】
具体的には、除外領域抽出部５７は、参照画像の測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較する。そして、その光強度分布中で光強度閾値を超える光強度を有する領域を抽出して測定除外領域とする。あるいは、除去しようとする埃等の影響に応じ、光強度分布中で光強度閾値より低い光強度を有する領域を抽出して測定除外領域とする。また、図４においては、この除外領域抽出部５７に対して、閾値設定部５８が設けられている。閾値設定部５８は、上記のように測定除外領域の抽出に用いられる光強度閾値を所定の方法で設定する（閾値設定ステップ）。
【００４１】
解析処理部５１で蛍光画像の解析処理に用いられる解析領域は、解析データ選択部５３において、測定領域設定部５６で設定された測定領域から、除外領域抽出部５７で抽出された測定除外領域を除いた領域によって設定される。なお、光強度分布を光強度閾値と比較した結果、測定除外領域が抽出されなかった場合には、測定領域がそのまま解析領域に設定される。また、光検出画像に対する測定領域の設定方法、測定除外領域の抽出方法、測定除外領域の抽出に用いられる参照画像等については、具体的には後述する。
【００４２】
また、図４に示すデータ解析装置５０においては、データ記憶手段として、測定データ記憶部６１、閾値データ記憶部６２、及び補正データ記憶部６３が設けられている。測定データ記憶部６１は、データ取得装置１０から入力された測定データ、あるいは測定データ補正部５４によって補正された測定データ等の格納に用いられる。また、閾値データ記憶部６２は、閾値設定部５８で設定される閾値に関するデータ等の格納に用いられる。また、補正データ記憶部６３は、測定データ補正部５４で測定データの補正を行う際に必要な補正データ等の格納に用いられる。
【００４３】
図５は、図４に示したデータ解析装置５０のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。本構成例におけるデータ解析装置５０は、バス８０と、バス８０に接続されたＣＰＵなどの演算部８１とを有している。また、バス８０には、画像メモリ８２、外部装置接続用のインターフェース８３、プログラム記憶部８４、及びデータ記憶部８５が接続されており、これによってデータ解析装置５０が構成されている。
【００４４】
画像メモリ８２は、データ取得装置１０の画像取得部４０で取得された蛍光画像などの画像データの入力等に用いられる。インターフェース８３は、データ取得装置１０、励起光源３０などの蛍光測定装置１を構成する外部装置を接続するために用いられる。プログラム記憶部８４は、データ取得装置１０の動作、データ取得装置１０で取得された測定データの解析等に必要なプログラムが格納され、また、必要に応じて作業領域、パラメータ領域等が設けられる。データ記憶部８５は、例えば、図４に示した構成におけるデータ記憶部６１、６２、６３に対応している。
【００４５】
また、このデータ取得装置５０のバス８０には、表示装置７１として用いられるモニタ７３、及び入力装置７２として用いられるキーボード７４、マウス７５等が接続されている。また、必要に応じて、ハードディスクなどの外部記憶装置をさらに接続しても良い。
【００４６】
本実施形態による蛍光測定装置１、及び蛍光測定方法の効果について説明する。
【００４７】
図１〜図５に示した蛍光測定装置１、及び蛍光測定方法においては、試料Ｓからの蛍光を検出する光検出手段として、２次元の蛍光画像を取得可能な撮像装置４５を含む画像取得部４０を用いるとともに、この画像取得部４０によって所定条件下で２次元の参照画像を取得する。そして、この参照画像に対して所定の光強度閾値を適用して測定除外領域を抽出し、通常の測定領域から測定除外領域を除いた領域を解析領域として、蛍光画像を用いた試料Ｓについての蛍光解析処理を行っている。
【００４８】
ここで、上記のように試料Ｓがマイクロプレート２０のウェル２１内に保持された状態で蛍光測定を行う構成では、試料保持部材であるマイクロプレート２０において、その底面２２、あるいはウェル２１内などに埃やゴミ、汚れ等（以下、これらを総称して埃という）が存在する場合がある。そして、このような場合には、その埃で発生する自家蛍光や光の吸収、散乱などの現象が、試料Ｓに対して行われる蛍光測定の結果に影響し、蛍光の測定精度、試料の評価精度等が劣化することが問題となる。これに対して、上記実施形態の蛍光測定装置１では、所定条件下で埃等の影響についての２次元の参照画像を取得し、この参照画像に対して光強度閾値を適用することによって、埃に対応する領域として測定除外領域を抽出している。
【００４９】
すなわち、画像取得部４０によって取得されるマイクロプレート２０の２次元光像による参照画像では、埃が存在する部位において、その自家蛍光によって他の部位よりも検出される光強度が大きくなる。これに対して、参照画像から得られる測定領域内での光強度分布に対して適切な光強度閾値を設定しておき、例えば閾値を超える光強度を有する領域を抽出して測定除外領域とするなどの方法を用いることにより、埃に対応する領域を蛍光解析処理から除くことが可能である。また、埃による光の吸収、散乱が問題になる場合、埃が存在する部位において、それによる光の吸収、散乱によって他の部位よりも検出される光強度が小さくなる。これに対して、例えば閾値より低い光強度を有する領域を抽出して測定除外領域とするなどの方法を用いることにより、埃に対応する領域を蛍光解析処理から除くことが可能である。
【００５０】
このような方法を用いることにより、試料Ｓを保持するマイクロプレート２０などの試料保持部材において測定領域内に埃が存在する場合であっても、埃等の影響を効果的に除去、抑制することができ、蛍光画像を用いた試料の評価等を充分に高い精度で確実に行うことが可能となる。なお、具体的な光強度閾値の適用方法については、上記したように、問題となる埃等の影響に応じて設定することが好ましい。また、このような方法は、蛍光画像に対する解析処理以外にも、試料から放出される光を含む２次元の光検出画像に対する解析処理において一般に適用可能である。
【００５１】
また、データ解析装置５０の解析処理部５１で行われる蛍光解析処理などの解析処理については、図４に示した構成例では、平均光強度算出部５２によって解析領域内での２次元の光強度分布における平均光強度を算出する方法を用いている。このように、解析領域での平均光強度を求める方法で試料についての解析処理を行うことにより、その解析領域において測定された蛍光などの光の光強度を用いた試料Ｓの評価等を、好適かつ簡便な方法で行うことができる。また、光検出画像に対する解析処理としては、解析領域内での光強度の平均値を求める方法以外にも、例えば、光強度のメディアン値を求める方法、２次元の光強度分布を直接用いる方法など、様々な方法を用いて良い。
【００５２】
また、除外領域抽出部５７において測定除外領域の抽出に用いられる光強度閾値については、図４に示した構成例では、閾値設定部５８において設定された閾値を用いることとしている。この場合の光強度閾値の設定方法としては、例えば、参照画像などの測定データから閾値を求める方法、操作者による入力装置７２からの入力データによって閾値を設定する方法などを用いることができる。あるいは、あらかじめ設定された閾値を用いる構成としても良い。
【００５３】
なお、画像取得部４０によって取得される２次元画像における光強度分布は、実際には２次元画像を構成する各画素（撮像装置４５の２次元画素構造に対応）での輝度値の分布データとして取得される。したがって、このような場合には、上記した光強度閾値を画像データでの輝度値に対する閾値として設定しておくことが好ましい。これにより、２次元の参照画像の各画素での輝度値と、閾値とを比較することによって、測定除外領域を好適に抽出することができる。
【００５４】
また、除外領域抽出部５７での領域抽出処理については、それぞれの測定領域に対して測定除外領域を抽出するか否かを選択可能（切換可能）としても良い。このような構成によれば、例えば、埃が存在してもその自家蛍光や光の吸収、散乱などの影響が無視できるような場合に測定除外領域の抽出をＯＦＦにするなど、必要に応じて測定除外領域の抽出処理のＯＮ／ＯＦＦを切り換えることが可能となる。これにより、データ解析装置５０において行われる解析処理の効率が向上される。また、このようなＯＮ／ＯＦＦの選択、切換については、例えば操作者による入力装置７２からの指示に基づいて行う構成とすることが好ましい。
【００５５】
また、図１に示した蛍光測定装置１においては、試料Ｓを保持する試料保持部材として複数のウェル２１を有するマイクロプレート２０を用いている。このようにマイクロプレート２０が用いられる場合には、データ解析装置５０において、画像取得部４０によって取得される蛍光画像などの光検出画像に対する測定領域、解析領域、及び必要があれば測定除外領域を、複数のウェル２１のそれぞれに対して設定することが好ましい。
【００５６】
このように、マイクロプレート２０での複数のウェル２１に対応するように、データ解析装置５０において複数の解析領域等を設定して試料についての解析処理を行うことにより、複数のウェル２１に収容された試料Ｓのそれぞれに対して、光測定による試料Ｓの評価等を個別かつ同時に実行することが可能となる。
【００５７】
例えば、図２に示したように８×１２＝９６個のウェル２１を有するマイクロプレート２０を用いた場合、画像取得部４０によって取得される２次元の光検出画像は、図６にその一例を示すように、８×１２＝９６個でそれぞれが円形状のウェル像（試料像）を含む画像となる。この場合、図７に示すように、マイクロプレート２０の構成に対応して９６個の円形状の測定領域を設定することにより、９６個のウェル２１に収容された試料Ｓのそれぞれに対して、必要な解析処理を実行することができる。なお、この図７に示したような測定領域については、例えば、光測定装置において用いられるマイクロプレート２０のウェル構造に対応させて、あらかじめプレートマップデータとして用意しておくことが好ましい。あるいは、マイクロプレート２０の画像を取得した上で、その画像を参照してプレートマップデータを作成しても良い。
【００５８】
また、上記した蛍光測定装置１において実行される蛍光測定方法、特にデータ解析装置５０において実行されるデータ解析方法に対応する処理は、試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの蛍光を測定する蛍光測定をコンピュータに実行させるための蛍光測定プログラムによって実現可能である。また、一般に蛍光や燐光、発光などの試料からの光を対象とした光測定装置についても、光測定装置において実行される光測定方法、特にデータ解析方法に対応する処理は、試料からの光を測定する光測定をコンピュータに実行させるための光測定プログラムによって実現可能である。
【００５９】
例えば、蛍光測定装置１のデータ解析装置５０は、図５に例示したようにデータ解析処理に必要な各ソフトウェアプログラムなどが記憶させるＲＯＭと、プログラム実行中に一時的にデータが記憶されるＲＡＭとが接続されたＣＰＵによって構成することができる。このような構成において、ＣＰＵによって所定の光測定プログラムである蛍光測定プログラムを実行することにより、データ解析装置５０、及びそれを含む蛍光測定装置１を実現することができる。
【００６０】
このような光測定プログラムとしては、例えば、画像取得手段によって取得された、試料から放出される光を含む２次元の光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定処理と、画像取得手段によって所定条件下で取得された参照画像を用い、参照画像の測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出処理と、測定領域から測定除外領域を除くことによって光検出画像に対する解析領域を設定し、解析領域内での光強度を解析データとして、試料についての解析処理を行う解析処理とを含むデータ解析処理をコンピュータに実行させるように構成されたプログラムを用いることが好ましい。
【００６１】
また、光測定のための各処理をＣＰＵに実行させるための上記したプログラムは、コンピュータ読取可能な記録媒体に記録して頒布することが可能である。このような記録媒体には、例えば、ハードディスク及びフレキシブルディスクなどの磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ及びＤＶＤ−ＲＯＭなどの光学媒体、フロプティカルディスクなどの磁気光学媒体、あるいは、プログラム命令を実行または格納するように特別に配置された、例えばＲＡＭ、ＲＯＭ、及び半導体不揮発性メモリなどのハードウェアデバイスなどが含まれる。
【００６２】
試料Ｓの光測定における埃等の影響、光検出画像での測定領域に対する測定除外領域の抽出、及びそれによる効果について、さらに具体的に説明する。なお、ここでは、試料Ｓの蛍光測定を例として、主に埃の自家蛍光の影響について検討する。また、以下においては、マイクロプレート２０における単一のウェル２１に着目し、ウェル２１に対して取得される画像、設定される領域等を用いて具体的な蛍光測定方法、解析方法について説明する。マイクロプレート２０に含まれる複数のウェル２１の全体に対して蛍光測定を行う場合には、それぞれのウェル２１に対して同様の処理を行えば良い。
【００６３】
図８は、マイクロプレート２０の単一のウェル２１に対応する蛍光画像、測定領域、測定除外領域、及び解析領域の例を示す図である。図８（ａ）は、ウェルに埃が存在しない場合の蛍光画像の一例を示している。このような蛍光画像に対して、図８（ｂ）に示すように、ウェルの平面形状に対応した円形状の測定領域Ｒ１が設定される。また、この例では、埃が存在しないため、この測定領域Ｒ１がそのまま解析領域Ｒ３となる。
【００６４】
一方、図８（ｃ）は、ウェルに埃が存在する場合の蛍光画像の一例を示している。この画像では、埃の形状に対応して光強度が大きい領域（埃の像）が生成されている。このような蛍光画像を参照画像として考え、適当な光強度閾値を適用して測定除外領域の抽出を行うと、図８（ｄ）に示すように、円形状の測定領域Ｒ１内において、埃の像に対応する形状の測定除外領域Ｒ２が抽出される。そして、測定領域Ｒ１から測定除外領域Ｒ２を除いた領域（図中で斜線を付した領域）を解析領域Ｒ３とすることにより、蛍光解析処理における埃の自家蛍光の影響を抑制することができる。
【００６５】
図８に示した蛍光画像に対する解析処理について、さらに具体的に説明すると、埃が存在しない図８（ａ）の蛍光画像では、測定領域Ｒ１と一致している解析領域Ｒ３内での光強度分布について、その平均光強度Ａｖが求められる。そして、この平均光強度Ａｖに対して補正係数α、βを用いてダーク補正等の必要なデータ補正を行うことにより、光強度データＤが
Ｄ＝（Ａｖ＋α）×β
によって求められる。
【００６６】
一方、埃が存在する図８（ｃ）の蛍光画像では、測定領域Ｒ１をそのまま解析領域とした場合、求められる平均光強度は埃の自家蛍光によるオフセットγが加わってＡｖ＋γとなる。また、この平均光強度Ａｖ＋γに対してデータ補正を行うと、光強度データＤは
Ｄ＝（Ａｖ＋γ＋α）×β
となり、データＤが埃の自家蛍光によるオフセットγの影響を受けることとなる。
【００６７】
これに対して、図８（ｄ）に示したように、光強度閾値に基づいて抽出された測定除外領域Ｒ２を測定領域Ｒ１から除いて解析領域Ｒ３を設定することにより、埃の自家蛍光の影響が除去された解析領域Ｒ３内での光強度分布を用いることとなるので、本来の平均光強度Ａｖ、及び光強度データＤを求めることが可能となる。また、埃の自家蛍光の影響が残った場合でも、測定領域Ｒ１をそのまま解析領域とした場合に比べて、その影響を充分に抑制することができる。
【００６８】
また、図８（ｃ）に示したような蛍光画像を参照画像とする場合、測定除外領域Ｒ２の抽出に適用する光強度閾値については、上記したようにあらかじめ設定された閾値を用いることができる。あるいは、各参照画像に応じて確実に測定除外領域Ｒ２の抽出を行う上では、参照画像から閾値を設定する方法を用いることが好ましい。そのような設定方法の具体例としては、測定領域Ｒ１の全体での平均光強度を求め、得られた平均光強度に対して所定の閾値設定係数を掛け合わせた値を光強度閾値とする方法が挙げられる。
【００６９】
また、通常の測定領域Ｒ１についてマイクロプレート２０に対応するプレートマップデータが作成されている場合には、測定除外領域Ｒ２の抽出結果に基づいてプレートマップデータを修正し、埃の影響が除去された解析領域Ｒ３のプレートマップデータを作成して蛍光解析処理に用いることが好ましい。
【００７０】
ここで、試料Ｓの評価等のための蛍光測定は、例えば試料Ｓを刺激した際の光強度の時間変化を測定することによって行われるが、その具体的な解析方法としては、蛍光強度の絶対値を用いる方法、及び蛍光強度の変化量を示す比（レシオ）を用いる方法がある。測定除外領域を抽出して解析を行う上記の手法は、絶対値解析及びレシオ解析のいずれの解析方法が適用される場合でも効果があるが、特に、レシオ解析を行う場合に有効である。
【００７１】
図９は、蛍光画像から得られる光強度の時間変化の例を示す図である。図９（ａ）は、蛍光画像に対して絶対値解析を行って得られる光強度の時間変化のグラフであり、横軸は時間ｔを示し、縦軸は各時刻ｔでの光強度データＤ（ｔ）を示している。また、グラフ中において、実線は埃なしでの光強度データを示し、破線は埃ありでの光強度データを示している。このグラフに示すように、絶対値解析による光強度の時間変化では、埃からの自家蛍光による光強度のオフセットがあるが、試料Ｓからの蛍光による時間変化量は埃の有無にかかわらず同じとなる。
【００７２】
一方、図９（ｂ）は、蛍光画像に対してレシオ解析を行って得られる強度比の時間変化のグラフであり、横軸は時間ｔを示し、縦軸は時刻ｔ＝０を基準とした各時刻ｔでの光強度データの強度比Ｄ（ｔ）／Ｄ（０）を示している。また、グラフ中において、実線は埃なしでの強度比データを示し、破線は埃ありでの強度比データを示している。このグラフに示すように、レシオ解析で得られる強度比の時間変化では、上記した光強度のオフセットによって時刻０での光強度Ｄ（０）と、時刻ｔでの光強度Ｄ（ｔ）との比が変化してしまい、試料Ｓからの蛍光による時間変化量が埃ありの場合に小さくなってしまう。これに対して、上記方法によって埃の自家蛍光の影響が除去される解析処理を行えば、埃によって強度比の時間変化量が小さくなることが防止され、その測定精度が向上される。
【００７３】
なお、上記のように強度比を用いるレシオ解析法は、光強度をそのまま用いる絶対値解析法に比べていくつかの利点を持っている。まず、光強度データＤ（ｔ）のベースラインについては、埃によるオフセット以外にも様々な要因で変動する場合があるが、強度比を用いることにより、ベースラインを簡単に揃えることができる。また、ベースラインが揃うことにより、蛍光による光強度の変化量の評価が容易である。また、光強度の比をとることにより、試料Ｓの濃度ばらつき等の影響を相殺することができる。
【００７４】
次に、測定除外領域の抽出に用いられる参照画像について説明する。このような参照画像としては、例えば、試料Ｓがマイクロプレート２０によって保持された状態で取得された蛍光画像や発光画像等の光検出画像を用いることができる。この場合の光検出画像としては、光解析に用いられる本測定での測定データを用いることができる。あるいは、試料Ｓを配置した状態で本測定に先立って行われる較正測定での較正データを用いても良い。
【００７５】
また、参照画像として、試料Ｓとは別の参照用試料がマイクロプレート２０によって保持された状態で取得された光検出画像を用いることができる。特に、参照用試料を用いて蛍光画像を取得する場合、参照用試料として蛍光物質を実質的に含まない試料（コントロールサンプル）を用いることが好ましい。このような参照用試料としては、例えば純水が挙げられる。
【００７６】
純水などの参照用試料に対して取得された蛍光画像を参照画像とする場合、埃が存在する部位以外では、参照用試料が蛍光物質を含まないために光強度が充分に小さい。このため、測定領域内での光強度分布による埃の識別、及び光強度閾値を用いた測定除外領域の抽出を容易かつ確実に実行可能である。蛍光物質を含まない参照用試料に対して得られる参照画像のデータは、下記に詳述する自家蛍光補正において、自家蛍光補正データとして好適に使用することができる。
【００７７】
その他の参照用試料としては、蛍光物質が挙げられる。所定濃度の蛍光物質をマイクロプレートに均一に入れた状態で取得された蛍光画像を参照画像とする場合、得られる参照画像のデータは、下記に詳述するシェーディング補正において、シェーディング補正データとして好適に使用することができる。このような参照用試料を用いた参照画像は、例えば、試料Ｓに対する蛍光測定前で、補正データを作成するための予備的測定時に取得することができる。
【００７８】
次に、光検出画像から得られる光強度データ等に対して行われる補正、及び補正に用いられる補正データの取得等について説明する。蛍光画像などの光検出画像に対する補正としては、具体的には（１）ダーク補正、（２）自家蛍光補正、及び（３）シェーディング補正の３つの補正がある。これらの各補正は、それぞれの蛍光測定装置１などの光測定装置の構成や要求される測定精度などを考慮して、必要に応じて適宜行われる。また、これらの補正に用いられる補正データは、通常、試料Ｓに対する本測定に先立って、それぞれ所定の条件下で予備的測定を行うことで取得される。
【００７９】
ダーク補正は、光検出画像の取得に用いられる撮像装置４５（図１参照）についての補正である。ＣＣＤカメラなどの撮像装置４５では、通常、暗中でもある程度の出力（輝度値）を持っている。ダーク補正では、暗中で励起光を照射しない条件下で撮像装置４５によって画像を取得し、得られた画像データをダーク補正データとする。そして、測定データ取得時に補正データを差し引くことにより、ダーク補正を行う。
【００８０】
自家蛍光補正は、試料Ｓを保持するマイクロプレート２０等に起因する蛍光についての補正である。上記のように、マイクロプレート２０の底面２２やウェル２１内に埃がある場合、埃に起因する自家蛍光が問題になるが、埃が存在しない場合でもマイクロプレート２０の材質自体で、ある程度の自家蛍光が発生する。このようなマイクロプレート２０自体の自家蛍光の影響が問題になる場合には、水やバッファなどの自家蛍光参照用の試料がマイクロプレート２０によって保持された状態で参照画像となる蛍光画像を取得し、得られた画像データを自家蛍光補正データとする。そして、測定データ取得時に補正データを差し引くことにより、自家蛍光補正を行う。
【００８１】
図１０は、自家蛍光補正データの導出方法の一例を示すフローチャートである。この方法では、まず、上記したように暗中の条件下でダーク補正用の画像を取得し（ステップＳ１０１）、ダーク補正データＤ１１を求める。次に、純水などの参照用試料をマイクロプレート２０に入れて、励起光を照射して自家蛍光補正用の画像を取得する（Ｓ１０２）。そして、得られた蛍光測定データＤ１０に対して、ダーク補正データＤ１１を差し引くダーク補正を行う（Ｓ１０３）ことにより、自家蛍光補正データＤ１２
Ｄ１２＝Ｄ１０−Ｄ１１
が導出される。
【００８２】
シェーディング補正は、撮像装置４５や導光光学系４１を含む光学系に起因するデータばらつきについての補正である。シェーディング補正では、例えば蛍光測定においては、蛍光試料をマイクロプレート２０に均一に入れた状態で参照画像の光検出画像となる蛍光画像を取得し、得られた画像データをシェーディング補正データとする。そして、測定データ取得時に補正データを用いて、シェーディング補正を行う。
【００８３】
図１１は、シェーディング補正データの導出方法の一例を示すフローチャートである。この方法では、まず、上記したように暗中の条件下でダーク補正用の画像を取得し（ステップＳ２０１）、ダーク補正データＤ２１を求める。次に、均一な蛍光試料をマイクロプレート２０に入れて、励起光を照射してシェーディング補正用の画像を取得する（Ｓ２０２）。そして、得られた蛍光測定データＤ２０に対して、ダーク補正データＤ２１を差し引くダーク補正を行い（Ｓ２０３）、さらにあらかじめ取得された自家蛍光補正データＤ２２を差し引く自家蛍光補正を行う（Ｓ２０４）ことにより、シェーディング補正データＤ２３
Ｄ２３＝Ｄ２０−Ｄ２１−Ｄ２２
が導出される。
【００８４】
これらの補正データを取得後に試料Ｓに対して本測定を行う場合、本測定で得られた測定データに対する補正（図４に示した解析処理部５１の測定データ補正部５４参照）は、例えば以下のように行われる。
【００８５】
図１２は、補正された光測定データの導出方法の一例を示すフローチャートである。この方法では、まず、上記したように暗中の条件下でダーク補正用の画像を取得し（ステップＳ３０１）、ダーク補正データＤ３１を求める。次に、測定対象となる試料Ｓをマイクロプレート２０に入れて、励起光を照射して本測定の光検出画像である蛍光画像を取得する（Ｓ３０２）。そして、得られた蛍光測定データＤ３０に対して、ダーク補正データＤ３１を差し引くダーク補正を行い（Ｓ３０３）、さらにあらかじめ取得された自家蛍光補正データＤ３２を差し引く自家蛍光補正（Ｄ３０４）、及びシェーディング補正データＤ３３によって補正するシェーディング補正を行う（Ｄ３０５）ことにより、補正された蛍光測定データＤ３５
Ｄ３５＝（Ｄ３０−Ｄ３１−Ｄ３２）／Ｄ３３×（Ｄ３３の平均値）
が導出される。
【００８６】
ここで、測定除外領域の抽出に用いる参照画像に関して上記した純水などの参照用試料を用いた参照画像は、これらの補正データ取得用の予備的測定のうちの自家蛍光補正用の予備的測定、あるいはシェーディング補正用の予備的測定などにおいて取得することができる。また、この測定除外領域については、補正データ取得時にも本測定と同様に適用することが好ましい。すなわち、補正データ取得用の予備的測定では、通常は本測定よりも全体の光強度が小さく、埃等の影響を受けやすい。このように、埃等の影響を受けた状態で補正データを取得すると、その補正データを用いて行われる本測定の測定精度が低下してしまう。
【００８７】
これに対して、補正データ取得時、特に自家蛍光補正データ取得時において、測定除外領域を適用して解析処理を行うことにより、補正データの精度、及びそれを用いた本測定での測定精度を向上することができる。なお、自家蛍光補正データについては、マイクロプレート２０が有する自家蛍光特性が製造メーカ毎に揃っているような場合には、製造メーカに対応した補正データをあらかじめ用意しておき、必要に応じて補正データを読み出して用いる構成としても良い。
【００８８】
本発明による光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムは、上記した実施形態及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、試料Ｓを保持する試料保持部材については、それぞれ試料Ｓを保持可能な複数のウェル２１を有するマイクロプレート２０を例示したが、これに限らず、例えば単一の試料Ｓのみを保持可能な試料保持部材など、様々な部材を用いて良い。また、マイクロプレート２０としては、９６ウェルのマイクロプレートに限られるものではなく、３８４ウェル、あるいは１５３６ウェルのプレートを用いても良い。また、光測定装置の具体的な構成については、図１に示した蛍光測定装置１は、試料保持部材としてマイクロプレート２０を用いた場合の構成の一例を示すものであり、一般には、試料保持部材の種類や光測定の条件等に応じて、様々な構成を用いて良い。
【００８９】
また、上記実施形態では、本発明による光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムの一例として、主に蛍光測定装置、蛍光測定方法、及び蛍光測定プログラムについて説明したが、本発明は、上記したように、蛍光測定以外にも、例えば燐光や発光など、試料からの光を測定する光測定に一般に適用可能である。この場合、例えば発光測定では、図１に示した構成において励起光源３０等は不要である。また、この場合に測定対象となる試料Ｓからの発光現象としては、試料Ｓに試薬を注入したときに生じる発光が例として挙げられる。また、光測定装置の具体的な構成については、図１に示した蛍光測定装置１はその構成の一例を示すものであり、一般には、試料からの光の測定条件、光学系の構成等に応じて、様々な構成を用いて良い。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、埃等の自家蛍光や光の吸収、散乱などの影響を抑制することが可能な光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラムとして利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】蛍光測定装置の一実施形態を模式的に示す構成図である。
【図２】マイクロプレートの構成の一例を示す斜視図である。
【図３】図２に示したマイクロプレートの断面構造を示す側面断面図である。
【図４】データ解析装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図５】図４に示したデータ解析装置のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。
【図６】画像取得部によって取得される蛍光画像の一例を示す図である。
【図７】図６に示した蛍光画像に対する測定領域の設定の一例を示す図である。
【図８】マイクロプレートの単一のウェルに対応する蛍光画像、測定領域、測定除外領域、及び解析領域の例を示す図である。
【図９】蛍光画像から得られる光強度の時間変化の例を示す図である。
【図１０】自家蛍光補正データの導出方法の一例を示す図である。
【図１１】シェーディング補正データの導出方法の一例を示す図である。
【図１２】補正された蛍光測定データの導出方法の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００９２】
１…蛍光測定装置、１０…データ取得装置、１１…マイクロプレートホルダ、１２…搬送機構、１３…搬入側マイクロプレートストッカー、１４…搬出側マイクロプレートストッカー、１５…暗箱、１６…分注装置、２０…マイクロプレート、２１…ウェル、２２…底面、３０…励起光源、３１…励起光供給用ライトガイド、４０…画像取得部、４１…導光光学系、４２…光学フィルタ部、４５…撮像装置、
５０…データ解析装置、５１…解析処理部、５２…平均光強度算出部、５３…解析データ選択部、５４…測定データ補正部、５６…測定領域設定部、５７…除外領域抽出部、５８…閾値設定部、６１…測定データ記憶部、６２…閾値データ記憶部、６３…補正データ記憶部、７１…表示装置、７２…入力装置、７３…モニタ、７４…キーボード、７５…マウス、８０…バス、８１…演算部、８２…画像メモリ、８３…インターフェース、８４…プログラム記憶部、８５…データ記憶部。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの光を測定する光測定装置であって、
試料から放出される光を含む２次元の光検出画像を取得する画像取得手段と、
前記光検出画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析手段とを備え、
前記データ解析手段は、
前記画像取得手段によって取得された前記光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定手段と、
前記画像取得手段によって所定条件下で取得された参照画像を用い、前記参照画像の前記測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出手段と、
前記測定領域から前記測定除外領域を除くことによって前記光検出画像に対する解析領域を設定し、前記解析領域内での光強度を解析データとして、前記試料についての解析処理を行う解析処理手段と
を有することを特徴とする光測定装置。
【請求項２】
前記解析処理手段は、前記解析処理として前記解析領域内での光強度分布における平均光強度を算出する処理を行う平均光強度算出手段を有することを特徴とする請求項１記載の光測定装置。
【請求項３】
前記データ解析手段は、前記除外領域抽出手段における前記測定除外領域の抽出に用いられる前記光強度閾値を設定する閾値設定手段を有することを特徴とする請求項１または２記載の光測定装置。
【請求項４】
前記除外領域抽出手段は、前記測定領域に対して前記測定除外領域を抽出するか否かを選択可能に構成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の光測定装置。
【請求項５】
前記除外領域抽出手段は、前記参照画像として、前記試料が前記試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の光測定装置。
【請求項６】
前記除外領域抽出手段は、前記参照画像として、前記試料とは別の参照用試料が前記試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の光測定装置。
【請求項７】
前記試料保持部材は、それぞれ前記試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートであり、
前記データ解析手段において、前記測定領域、及び前記解析領域を、前記マイクロプレートでの前記複数のウェルのそれぞれに対して設定することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記載の光測定装置。
【請求項８】
前記除外領域抽出手段は、前記光強度分布中で前記光強度閾値を超える光強度を有する領域を抽出して前記測定除外領域とすることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記載の光測定装置。
【請求項９】
試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの光を測定する光測定方法であって、
試料から放出される光を含む２次元の光検出画像を取得する画像取得ステップと、
前記光検出画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析ステップとを備え、
前記データ解析ステップは、
前記画像取得ステップによって取得された前記光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定ステップと、
前記画像取得ステップによって所定条件下で取得された参照画像を用い、前記参照画像の前記測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出ステップと、
前記測定領域から前記測定除外領域を除くことによって前記光検出画像に対する解析領域を設定し、前記解析領域内での光強度を解析データとして、前記試料についての解析処理を行う解析処理ステップと
を含むことを特徴とする光測定方法。
【請求項１０】
前記解析処理ステップは、前記解析処理として前記解析領域内での光強度分布における平均光強度を算出する処理を行う平均光強度算出ステップを含むことを特徴とする請求項９記載の光測定方法。
【請求項１１】
前記データ解析ステップは、前記除外領域抽出ステップにおける前記測定除外領域の抽出に用いられる前記光強度閾値を設定する閾値設定ステップを含むことを特徴とする請求項９または１０記載の光測定方法。
【請求項１２】
前記除外領域抽出ステップは、前記測定領域に対して前記測定除外領域を抽出するか否かを選択可能に構成されていることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項記載の光測定方法。
【請求項１３】
前記除外領域抽出ステップは、前記参照画像として、前記試料が前記試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか一項記載の光測定方法。
【請求項１４】
前記除外領域抽出ステップは、前記参照画像として、前記試料とは別の参照用試料が前記試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか一項記載の光測定方法。
【請求項１５】
前記試料保持部材は、それぞれ前記試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートであり、
前記データ解析ステップにおいて、前記測定領域、及び前記解析領域を、前記マイクロプレートでの前記複数のウェルのそれぞれに対して設定することを特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項記載の光測定方法。
【請求項１６】
前記除外領域抽出ステップは、前記光強度分布中で前記光強度閾値を超える光強度を有する領域を抽出して前記測定除外領域とすることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか一項記載の光測定方法。
【請求項１７】
試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの光を測定する光測定をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、
画像取得手段によって取得された、試料から放出される光を含む２次元の光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定処理と、
前記画像取得手段によって所定条件下で取得された参照画像を用い、前記参照画像の前記測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出処理と、
前記測定領域から前記測定除外領域を除くことによって前記光検出画像に対する解析領域を設定し、前記解析領域内での光強度を解析データとして、前記試料についての解析処理を行う解析処理と
を含むデータ解析処理をコンピュータに実行させるための光測定プログラム。
【請求項１】
試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの光を測定する光測定装置であって、
試料から放出される光を含む２次元の光検出画像を取得する画像取得手段と、
前記光検出画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析手段とを備え、
前記データ解析手段は、
前記画像取得手段によって取得された前記光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定手段と、
前記画像取得手段によって所定条件下で取得された参照画像を用い、前記参照画像の前記測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出手段と、
前記測定領域から前記測定除外領域を除くことによって前記光検出画像に対する解析領域を設定し、前記解析領域内での光強度を解析データとして、前記試料についての解析処理を行う解析処理手段と
を有することを特徴とする光測定装置。
【請求項２】
前記解析処理手段は、前記解析処理として前記解析領域内での光強度分布における平均光強度を算出する処理を行う平均光強度算出手段を有することを特徴とする請求項１記載の光測定装置。
【請求項３】
前記データ解析手段は、前記除外領域抽出手段における前記測定除外領域の抽出に用いられる前記光強度閾値を設定する閾値設定手段を有することを特徴とする請求項１または２記載の光測定装置。
【請求項４】
前記除外領域抽出手段は、前記測定領域に対して前記測定除外領域を抽出するか否かを選択可能に構成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の光測定装置。
【請求項５】
前記除外領域抽出手段は、前記参照画像として、前記試料が前記試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の光測定装置。
【請求項６】
前記除外領域抽出手段は、前記参照画像として、前記試料とは別の参照用試料が前記試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の光測定装置。
【請求項７】
前記試料保持部材は、それぞれ前記試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートであり、
前記データ解析手段において、前記測定領域、及び前記解析領域を、前記マイクロプレートでの前記複数のウェルのそれぞれに対して設定することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記載の光測定装置。
【請求項８】
前記除外領域抽出手段は、前記光強度分布中で前記光強度閾値を超える光強度を有する領域を抽出して前記測定除外領域とすることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記載の光測定装置。
【請求項９】
試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの光を測定する光測定方法であって、
試料から放出される光を含む２次元の光検出画像を取得する画像取得ステップと、
前記光検出画像を含む測定データに対して解析処理を行うデータ解析ステップとを備え、
前記データ解析ステップは、
前記画像取得ステップによって取得された前記光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定ステップと、
前記画像取得ステップによって所定条件下で取得された参照画像を用い、前記参照画像の前記測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出ステップと、
前記測定領域から前記測定除外領域を除くことによって前記光検出画像に対する解析領域を設定し、前記解析領域内での光強度を解析データとして、前記試料についての解析処理を行う解析処理ステップと
を含むことを特徴とする光測定方法。
【請求項１０】
前記解析処理ステップは、前記解析処理として前記解析領域内での光強度分布における平均光強度を算出する処理を行う平均光強度算出ステップを含むことを特徴とする請求項９記載の光測定方法。
【請求項１１】
前記データ解析ステップは、前記除外領域抽出ステップにおける前記測定除外領域の抽出に用いられる前記光強度閾値を設定する閾値設定ステップを含むことを特徴とする請求項９または１０記載の光測定方法。
【請求項１２】
前記除外領域抽出ステップは、前記測定領域に対して前記測定除外領域を抽出するか否かを選択可能に構成されていることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項記載の光測定方法。
【請求項１３】
前記除外領域抽出ステップは、前記参照画像として、前記試料が前記試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか一項記載の光測定方法。
【請求項１４】
前記除外領域抽出ステップは、前記参照画像として、前記試料とは別の参照用試料が前記試料保持部材によって保持された状態で取得された光検出画像を用いることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか一項記載の光測定方法。
【請求項１５】
前記試料保持部材は、それぞれ前記試料を保持可能な複数のウェルが２次元アレイ状に配置されたマイクロプレートであり、
前記データ解析ステップにおいて、前記測定領域、及び前記解析領域を、前記マイクロプレートでの前記複数のウェルのそれぞれに対して設定することを特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項記載の光測定方法。
【請求項１６】
前記除外領域抽出ステップは、前記光強度分布中で前記光強度閾値を超える光強度を有する領域を抽出して前記測定除外領域とすることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか一項記載の光測定方法。
【請求項１７】
試料保持部材によって保持された状態で測定位置に配置された試料からの光を測定する光測定をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、
画像取得手段によって取得された、試料から放出される光を含む２次元の光検出画像に対して光測定に用いる測定領域を設定する測定領域設定処理と、
前記画像取得手段によって所定条件下で取得された参照画像を用い、前記参照画像の前記測定領域内での２次元の光強度分布を所定の光強度閾値と比較して測定除外領域を抽出する除外領域抽出処理と、
前記測定領域から前記測定除外領域を除くことによって前記光検出画像に対する解析領域を設定し、前記解析領域内での光強度を解析データとして、前記試料についての解析処理を行う解析処理と
を含むデータ解析処理をコンピュータに実行させるための光測定プログラム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００７−２７８９８４（Ｐ２００７−２７８９８４Ａ）
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１０８８３８（Ｐ２００６−１０８８３８）
【出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
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