分子プローブとしての４，７−ジクロロフルオレセイン染料
【課題】長波長の狭い発光バンド幅のフルオレセイン染料が、空間的に重なっている標的物質を検出するために提供すること。
【解決手段】長波長の狭い発光バンド幅のフルオレセイン染料が、空間的に重なっている標的物質を検出するために提供される。この染料は４，７−ジクロロフルオレセイン、および特に２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインから成る。この染料をＤＮＡ分析に使用するための方法およびキットが提供される。
【解決手段】長波長の狭い発光バンド幅のフルオレセイン染料が、空間的に重なっている標的物質を検出するために提供される。この染料は４，７−ジクロロフルオレセイン、および特に２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインから成る。この染料をＤＮＡ分析に使用するための方法およびキットが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は一般に蛍光標識技術に関し、そしてさらに特に、同じ試料中の多数の標的物質を検出するための４，７−ジクロロフルオレセインの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多くの診断上および分析上の技術は同じ試料中の多数の標的物質を区別できる蛍光タグで標識を付けることを必要としている、例えばラニールら、ジャーナル・イムノロジイ、第１３２巻、第１５１〜１５６頁（１９８４）（フローサイトメトリー）；グレイら、クロモソマ、第７３巻、第９〜２７頁（１９７９）（フローシステム核型）；フングら、米国特許４，８５５，２２５号（ＤＮＡ配列決定）；およびマリイランドら、アプライド・アンド・セオリティカル・エレクトロフォレシス、第３巻、第１〜１１頁（１９９２）（電気泳動により分離したポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）生成物の分析）。この要請は、最も自動化された配列決定アプローチにおいて少なくとも４種のスペクトルにより分解できる色素が必要であるＤＮＡ配列決定分析で満足させることは特に難しい。
【０００３】
現在、ＤＮＡ配列決定には２つの基本的なアプローチがある：ジデオキシ・チェイン・ターミネーター法、例えばサンガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁（１９７７）；および化学分解方法、例えばマキサムら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第７４巻、第５６０〜５６４頁（１９７７）。チェイン・ターミネーター法は幾つかの方法で改良され、あらゆる一般に入手できる自動化ＤＮＡ配列決定機器のための基礎として役に立っている、例えばサンガーら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第１４３巻、第１６１〜１７８頁（１９８０）；シュライヤーら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第１２９巻、第１６９〜１７２頁（１９７９）；スミスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１３巻、第２３９９〜２４１２ 頁（１９８５）；スミスら、ネイチャー、第３２１巻、第６７４〜６７９真（１９８７）；プロパーら、サイエンス、第２３８巻、第３３６〜３４１頁（１９８７）、セクションＩＩ、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第１５５巻、第５１〜３３４頁（１９８７）；チャーチら、サイエンス、第２４０巻、第 １８５〜１８８真（１９８８）；およびコンネルら、バイオテクニクス、第５巻、第３４２〜３４８頁（１９８７）。
【０００４】
鎖末端および化学分解方法は共に１またはそれ以上のセットの標識を付したＤＮΛフラグメントの世代を必要とし、各々は共通の起源をもち各々は既知の塩基を末端とする。次にフラグメントの単数または複数のセットは大きさによって分離され配列情報が得られる。両者の方法において、ＤＮＡフラグメントは高分解能ゲル電気泳動によって分離される。最も自動化されたＤＮＡ配列決定機器では、異なる末端塩基を有するフラグメントは異なる蛍光染料を用いて標識を付され、プライマーに結合するか、例えばスミスら（１９８７、上記）、あるいは末端ジデオキシヌクレオチドの塩基に結合する、例えばプロパーら（上記）。標識フラグメントは一緒にされて電気泳動分離のための同じゲルカラムに装填される。フラグメントが分離過程の間に静置検出器を通過するときフラグメントによって放出される蛍光信号を分析することによって塩基配列は決定される。
【０００５】
異なるフラグメントを標識するための一組の染料を入手することはこのようなＤＮＡ配列決定システムでは主要な難点である。
【０００６】
第１に、有機蛍光染料に対する代表的な発光バンド半幅は約４０〜８０ナノメートル（ｎｍ）であり可視スペクトルは約３５０〜４００ｎｍに過ぎないので、有意に重なる発光バンドを持たない３種またはそれ以上の染料を見出すことは困難である。第２に、重ならない発光バンドをもつ染料を見出したとしても、そのセットはそれぞれの蛍光効率が低すぎる場合ＤＮＡ配列決定のために未だ不適であるかも知れない。例えば、プリングルら、ＤＮＡ・コア・ファシリティス・ニュースレター、第１巻、１５〜２１頁（１９８８）には、増大したゲル荷重が低い蛍光効率を補償できないことを示すデータがある。第３に、幾つかの蛍光染料を同時に使用する場合、染料の吸収バンドが広く分離することが多いので励起が難しくなる。最も有効な励起は各染料をその吸収バンドの最高値に相当する波長で発光する場合に生じる。幾つかの染料を使用する場合、検出システムの感度と各染料に対する別々の励起源を与えるコスト増加との間にトレードオフを行うように強いられることが多い。第４に、ゲルの単一カラム中の異なる大きさに分類されたフラグメントの数が数百よりも大きい場合、染料の物理化学的性質、およびフラグメントに連結される手段が臨界的に重要になる。染料およびリンカーの電荷、分子量およびコンホメーションは接近した大きさに分類されたフラグメントの電気泳動による移動度に、広範囲なバンドの広がりが起こるようにあるいはゲル上のバンドの位置が逆になり、これによってバンドの順序および配列を決定するための核酸中の塩基の順序との間の一致を壊すように、不利に影響してはならない。最後に、蛍光染料はフラグメントを造りまたは操作するために用いられる化学物質と相溶性がなければならない。例えば、鎖末端方法においてプライマーに標識を付けるために用いられる染料および／またはジデオキシ・チェイン・ターミネーターは使用したポリメラーゼまたは逆転写酵素の活性を妨げてはならない。
【０００７】
これらのきびしい制約のために、数組の蛍光染料だけが、自動化ＤＮＡ配列決定にまた診断および分析の技術に使用できることが見出された、例えばスミスら（１９８５、上記）；プロパーら（上記）；フードら、ヨーロッパ特許出願８５００９６０号；およびコンネルら（上記）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の観点では、ＤＮＡ配列決定のような、多くの分析および診断の技術は、（１）容易に入手できる染料に物理化学的に類似のもの、（２）ゲル上の密に配置されたＤＮＡバンドのような空間的に重なっている標的物質の検出ができるもの、（３）自動化ＤＮＡ配列決定の最近の方法によって単一ゲルカラム上で決定することができる塩基の数を広げるもの、および（４）広範囲の予備および手先のテクニックを用いての使用において影響を受けやすいもの、である新しい蛍光染料の入手容易性によって有意に促進されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、次式を有する化合物であって：
【００１０】
【化１−２】
【００１１】
式中、
Ａ’は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、または連結官能体に変換できる基であり；
Ｂ’はフルオロ、クロロ、または酸性アニオン基であり；
Ｘ’は水素、フルオロまたはクロロであり；
Ｚ３およびＺ４は別々に水素、ハロ、連結官能体、または連結官能体に変換できる基であり；そして
Ａ’、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも１個は連結官能体または連結官能体に変換できる基である、化合物、である。
【００１２】
好適な実施形態においては、Ａ’は、カルボキシル、スルホニル、イソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、ホスホルアミダイト、またはアミノであり；Ｂ’はカルボキシルまたはスルホニルであり；Ｘ’は水素であり；Ｚ３およびＺ４は別々に水素、ハロ、カルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノである。
【００１３】
好適な実施形態においては、Ａ’、Ｚ３、およびＺ４の１個のみがカルボキシル、スルホニル、メチルアミノ、またはアミノである。
【００１４】
好適な実施形態においては、Ｚ３がメチルアミノである。
【００１５】
好適な実施形態においては、Ｚ３がメチルアミノである。
【００１６】
好適な実施形態においては、Ｚ３がフルオロである。
【００１７】
好適な実施形態においては、Ｚ３がクロロである。
【００１８】
好適な実施形態においては、Ａ’が水素である。
【００１９】
好適な実施形態においては、Ａ’がフルオロである。
【００２０】
好適な実施形態においては、Ａ’がクロロである。
【００２１】
好適な実施形態においては、Ａ’がイソチオシアネートである。
【００２２】
好適な実施形態においては、Ａ’がスクシンイミジルカルボキシレートである。
【００２３】
好適な実施形態においては、Ａ’がホスホルアミダイトである。
【００２４】
好適な実施形態においては、Ａ’がカルボキシルである。
【００２５】
好適な実施形態においては、Ａ’がスルホニルである。
【００２６】
好適な実施形態においては、Ａ’がアミノである。
【００２７】
好適な実施形態においては、Ｂ’がカルボキシルまたはスルホニルである。
【００２８】
好適な実施形態においては、Ｂ’がカルボキシルである。
【００２９】
好適な実施形態においては、Ｂ’がスルホニルである。
【００３０】
好適な実施形態においては、上記化合物が、式２’，７’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインまたは２’，７’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインを有する。
【００３１】
好適な実施形態においては、上記化合物が、式２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、または２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインである。
【００３２】
本発明はまた、上記化合物を含むジデオキシヌクレオチドである。
【００３３】
本発明はまた、上記化合物を含むポリヌクレオチドである。
【００３４】
（発明の概要）
本発明は４，７−ジクロロフルオレセイン染料を使用して空間的に重なる標的物質を同時に検出する方法、そして特に、４，７−ジクロロフルオレセイン染料を用いるＤＮＡ配列決定の方法にある。本発明はまた式１によって定義される２’，７’−ジクロロ−５（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインを含む。
【００３５】
【化２】
【００３６】
式中、Ａ’は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはアミノであり；好ましくはＡ’は連結官能体または連結官能体に変換できる基であり；
Ｘ’は水素、フルオロまたはクロロであり、Ａ’が６個の炭素原子の置換基であるときは必ずＸ’は５個の炭素原子の置換基であり、そしてＡ’が５個の炭素原子の置換基であるときは必ずＸ’は６個の炭素原子の置換基であり；好ましくはＸ’は水素であり；
Ｚ３水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり；好ましくはＺ３は水素またはクロロであり；
Ｚ４は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり；好ましくはＺ４は水素またはクロロであり；
Ｂ’はフルオロ、クロロ、または酸性アニオン基；好ましくはＢ’はカルボキシルまたはスルホニル、および最も好ましくはＢ’はカルボキシルであり；
そしてＡ’、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも１個は連結官能体または連結官能体に変換できる基である。好ましくはＡ’、Ｚ３、およびＺ４の１個のみは連結官能体または連結官能体に変換できる基である。
【００３７】
本発明はまた本発明の方法を実施するためのキットを含む。一般に、キットはＤＮＡフラグメントの電気泳動により分離された複数のクラスを検出するために提供される。特に、キットはプライマー伸長生成物の少なくとも１つのクラスに４，７−ジクロロフルオレセイン染料で蛍光による標識を付けるＤＮＡ配列決定を行うためのものを含む。このようなＤＮＡ配列決定キットは染料で標識を付けたプライマーをもつキットを含み、より好ましいものとしては染料で標識を付けたターミネーターをもつキットを含む。
全体にわたり、カラー・インデックス（アソシエーション・オブ・テキスタイル・ケミスツ、第２版、１９７１）炭素ナンバリング図式を使用する、すなわちプライムを付した数字はキサンテン構造の炭素を指し、プライムを付していない数字は９’−フェニルの炭素を指す。
【００３８】
本発明は、４，７−クロロ−５（および６−）カルボキシフルオレセインおよび関連する染料の蛍光性が分子プローブとしての使用に非常に有利であることを発見したことに一部は基づいている。これらの発光バンド幅は４，７−ジクロロ誘導体を欠く類似体よりも一般に２０〜３０パーセント狭く、これらの発光および吸収の最大値は４，７−ジクロロ誘導体を欠く類似体よりも一般に約１０〜３０ｎｍ高く、そしてこれらの蛍光効率は高く、いくつかの場合には４，７−ジクロロ誘導体を欠く類似体のそれのほぼ３倍である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（発明の詳細な説明）
上述のように、本発明は通常長い波長、狭い発光バンド幅および他の有利な蛍光性にて最大の吸収および発光を示すある種のフルオレセイン染料の発見に一部は基づくものである。さらに、本発明はこの種の染料の種類として式Ｉによって定義される新規のフルオレセイン類似体を含む。これらの染料はスペクトルにより分解できる、自動化ＤＮＡ配列決定分析に特に利用できる物理化学的に類似の染料の新規なセットのアセンブリを可能にする。
【００４０】
ここで使用される染料のセットに関係する語「スペクトルにより分解できる」
は、染料の蛍光発光バンドが充分に明確であり、すなわち充分に重なっておらず、各染料が結合している標的物質、例えばポリヌクレオチドを、例えばバンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシステムを用いる標準光検出システムまたはその類似のシステムによって各染料によって発生した蛍光信号に基づいて区別することができることを意味し、前記システムは米国特許４，２３０，５５８号、４，８１１，２１８号等、またはホイーレスら、フロー・シトメトリイ：インストルメンテージョン・アンド・データ・アナリシス（アカデミック・プレス・ニューヨーク、１９８５）の２１〜７６頁に記載されたようなシステムが挙げられる。
【００４１】
ここで直接にまたはエーテルと関連して使用される「低級アルキル」の語は、１〜６個の炭素原子を含む直鎖および／または分技鎖アルキル基を示し、例えばこの語はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル等を含む。さらに好ましくは、この「低級アルキル」の語は、１〜３個の炭素原子をもつアルキルを示す。
【００４２】
ここで使用される「ハロ」はハロゲン原子、弗素、塩素、臭素、および沃素を示し；さらに好ましくは、この語は弗素または塩素を示し；そして最も好ましくは、この語は塩素を示す。
【００４３】
好ましくは、本発明の４，７−ジクロロ−５（および６−）カルボキシフルオレセイン染料は式ＩＩによって定義されるものを含む。
【００４４】
【化３】
【００４５】
式中、 Ａ’、Ｂ’およびＸ’は上記と同じであり；
Ｚ１は水素または、Ｚ２と共にとるときは、ベンゾであり；
Ｚ２は、単独でとるときは、水素、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、または活性連結官能体に変換できる基、例えば、カルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり、またはＺ１と共にとるときは、Ｚ２は活性連結官能体に変換できるメチルアミノであり、またはＺ５と共にとるときは、Ｚ６はベンゾであり、好ましくは、単独でとるときは、Ｚ６は水素、メチル、エチル、フルオロ、クロロ、メトキシ、またはエトキシであり；そしてＡ、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、およびＺ５の少なくとも１個は連結官能体に変換できる基である。好ましくは、Ａ、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、およびＺ５の１個のみが活性連結官能体に変換できる基である。
【００４６】
本発明に使用するための多くの染料は市販品として入手できるかまたはこの分野で知られている技術によって合成できる、例えば、ガタクら、ジャーナル・オブ・ザ・インディアン・ケミカル・ソサイアティ、第６巻、第４６５−４７１真（１９２９）；およびカンナら、米国特許４，４３９，３５６号。あるいは、フルオレセイン類似体、即ち、Ａ＝Ｂ＝カルボキシルは、実施例に示されるように、置換したレゾルシノールを置換したベンゾフェノンと、または置換したトリメリット酸と、プロピオン酸の存在下に反応させて合成することができる。スルホニルフルオレセイン、即ちＡまたはＢがスルホニルは、リーら、サイトメトリー、第１０巻、第１５１−１６４頁（１９８９）によって開示された方法に従って合成され、適当な反応体を置換することにより改変して５−または６−カルボキシル−またはスルホニルフルオレセイン生成物を与える。好ましくは、ＤＮＡ配列決定においてポリヌクレオチドに標識を付けるとき、一般に異性体の混合物を使用する場合バンドの幅が広がるようになる僅かに異なる電気泳動移動性をもつので、染料の５−または６−異性体を別々に使用する。染料の５−または６−異性体は逆相ＨＰＬＣによって容易に分離される、例えばエドムンドソンら、モレキュラー・イムノロジー、第２１巻、第５６１頁（１９８４）。一般に、最初の溶出ピークは６−異性体および第二の溶出ピークは５−異性体であると信じられている。
【００４７】
本発明の染料はこの分野で良く知られている種々の手段によって標的物質に結合することができる。例えば、ハウグランド、ハンドブック・オブ・フルオレセント・プローブス・アンド・リサーチ・ケミカルス（モレキュラー・プローブス，インコーポレイテッド、ユージーン、１９８９）は標的物質に染料を結合するための手段のガイドと例を提供する。置換体Ａは、連結基を形成するように標的物質上で相補的官能体と反応できる連結官能体に変換される。次表はＡがカルボキシル、スルホニルまたはアミンであるときは必ず形成できる例示の連結官能体、適当な相補的官能体、および本発明に使用するために適している得られた連結基を列挙している。
【００４８】
【化４−１】
【００４９】
【化４−２】
【００５０】
好ましくは連結官能体は、相補的官能体がアミンであるときは必ずイソチオシアネート、塩化スルホニル、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、またはスクシンイミジルカルボキシレートである。そして好ましくは連結官能体は相補的官能体がスルフヒドリルであるときは必ずマレイミド、またはヨードアセトアミドである。例えばカンナら、米国特許４，３１８，８４６号の実施例６および８、およびカサイら、アナリチカル・ケミストリー、第４７巻、第３４〜３７頁（１９７５）に示されているように、スクシンイミジルカルボキシレートは、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用して上記染料の５−および／または６−カルボキシルをＮ−ヒドロキシスクシンイミドと縮合して形成することができる。従って、これらの文献は参考にここに組み込まれる。染料ホスホルアミダイトはスタインら、ジーン、７２巻、３３３〜３４１頁（１９８８）；フングら、米国特許４，７５７，１４１号；１９８９年９月１３日に出願されたヨーロッパ特許出願 ８９１１６９４６．８号；および１９８８年８月２６日に出願されたヨーロッパ特許出願８８３０７９３４．５号によって教示されているように生成される。例えばビューケージら、テトラヘドロン、第４８巻、第２２２３〜２３１１頁（１９９２）；カルーサースら、ナラング著、ＤＮＡとＲＮＡの合成と応用（アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９８７）第４７〜９４頁等によって教示されるように、置換基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は種々の形態をとることができる。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、別々にとるときは、メチル、エチル、またはイソプロピルであり、そしてＲ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と共にとるときは、４ないし８個の炭素原子、および窒素、酸素、および硫黄からなる群から選ばれる１ないし２個のヘテロ原子を有する複素環である。さらに好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と共にとるときはモルホリノである。好ましくは、Ｒ３はメチル、クロロフェニル、β−シアノエチル、メチルスルホニルエチル、およびニトロフェニルエチルからなる群から選ばれる。
【００５１】
好ましくは、例えばビューケージら（上記）；ステクら、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０１０１０；ビューケージら、米国特許５，００３，０９７号等によって教示されているように、ホスホルアミダイト−誘導連結基は酸化されてリン（Ｖ）連鎮を形成する。
本発明の染料はＤＮＡ配列決定のためのジデオキシヌクレオチドに標識を付けるために使用されるとき、好ましくはこれらはピリミジン塩基の５番目の炭素および７−デアザプリン塩基の７番目の炭素に連結される。例えば、いくつかの適当な塩基標識化方法が本発明と共に使用できることが報告された、例えば、ギブソンら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１５巻、第６４５５〜６４６７頁（９１８７）；ゲベイエフら、ヌクレイソク・アシッズ・リサーチ、第１５巻、第４５１３〜４５３５頁（１９８７）；ハララムビジスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１５巻、第４８５６〜４８７６頁（１９８７）等。好ましくは、染料と塩基の間の連結基はジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ−誘導化塩基と本発明の染料のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を反応させて形成される。好ましくは連結基は３−カルボキシアミノ−１−プロピニルである。このようなアルキニルアミノ−誘導化ジデオキシヌクレオチドの合成は、ここに参考文献として組み込まれるホッブスらのヨーロッパ特許出願番号８７３０５８４４．０号および米国特許 ５，０４７，５１９号によって教示されている。簡単に述べると、アルキニルアミノ−誘導化ジデオキシヌクレオチドは、適当なハロジデオキシヌクレオシド（ホッブスら（上記）によって教示されているように通常は５−ヨードピリミジンおよび７−ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシド）およびＣｕ（Ｉ）をフラスコに入れ、空気を除くようにＡｒを吹き込み、乾燥ＤＭＦを添加し、続いてアルキニルアミン、トリエチルアミンおよびＰｄ（Ｏ）を添加して生成される。反応混合物は数時間、または薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオソドの消費を示すまで攪拌することできる。保護されていないアルキニルアミンを使用するときは、アルギニルアミノ−ヌクレオシドは反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生成したハイドロハライドを中和するように水酸化アンモニウムを含む溶出溶媒を使用してシリカゲルのクロマトグラフィーにかけることによって単離することができる。保護されたアルキニルアミンを使用するときは、メタノール／塩化メチレンを反応混合物に続いて強塩基性アニオン交換樹脂で重炭酸塩を形成させることができる。次にスラリーを約４５時間攬拌し、濾過し、そして樹脂を追加のメタノール／塩化メチレンを用いて洗うことできる。一緒に合わせた濾液を濃縮し、メタノール−塩化メチレングラディエントを用いてシリカゲルのフラッシュ−クロマトグラフィーで精製することができる。トリホスフェートが標準技術によって得られる。
【００５２】
本発明の標的物質は本発明の染料が結合できるものであれば事実上何でもよい。好ましくは染料は標的物質に共有結合される。標的物質は蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、ポリヌクレオチド、脂質、およびこれらの組合せおよび集合体、例えば染色体、細胞核、生細胞、例えばバクテリア、他の微生物、および哺乳類細胞、組織等を含む。ここに使用されるように「ポリヌクレオチド」の語は、長さが数塩基から数千塩基の大きさの範囲、例えば６から数十ないし数百または数千までの塩基の長さ（一重鎖の場合）、または長さが数塩基対ないし数千塩基対の大きさの範囲、例えば６から数十ないし数百までまたは数千までの塩基対の長さ（二重鎖の場合）でのＤＮＡまたはＲＮＡの一重鎖または二重鎮を意味する。
【００５３】
多数の相補的官能体を合成オリゴヌクレオチドおよびボリヌクレオチドの５’または３’末端に、例えばアミノ基、フングら、米国特許４，７５７，１４１号およびミヨシら、米国特許４，６０５，７３５号；またはスルフヒドリル基、コノリイ、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１３巻、第４４８５〜４５０２頁（１９８５）、およびスボートら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１５巻、４８３７〜４８４８頁（１９８７）、を結合することができる。
【００５４】
本発明の染料は、類似の物理化学的な性質、例えば大きさ、配座、電荷、疎水性等を有する標的物質の一連のバンドまたはスポットが線状または二次元の配置に存在する、ゲル電気泳動のような、生物化学的分離方法に委ねられたポリヌクレオチドの種類を同定するために特に良く適している。ここで使用されるように、「バンド」の語は類似のまたは同一の物理化学的性質に基づいた標的物質の空間的配置または凝集を含む。通常のバンドは電気泳動、特にゲル電気泳動によって染料−ポリヌクレオチドの共役体を分離する際に生じる。
【００５５】
ポリヌクレオチドの種類は種々の関係において生じることができる。例えば、それらは制限酵素消化の生成物として、またはポリメラーゼまたはリガーゼ反応の伸長生成物として生じることができる。好ましくは、本発明に従って同定される種類は、対応が４種の可能な末端塩基と１組のスペクトルにより分析できる染料の部分との間に確立されるように末端ヌクレオチドの語において定義される。
【００５６】
このような組は、市版品として入手できる分光光度計を用いて発光と吸収のバンド幅を測定して、本発明の染料から容易に集められる。さらに好ましくは、それらの種類はＤＮＡ配列の化学的またはチェイン・ターミネーター法の関係において生じ、最も好ましくはチェイン・ターミネーター法の関係において生じる。何れかの方法において染料−ポリヌクレオチドの共役体は標準のゲル電気泳動方法によって分離される、例えばゴールドおよびマシューズ、上述；リックウッドおよびハメス著、核酸のゲル電気泳動：実際のアプローチ（ＩＲＬプレス・リミテッド、ロンドン、１９８１）；またはオスターマン、プロテインと核酸の研究方法、第１巻（スプリンガー−ベルラク、ベルリン、１９８４）。好ましくはゲルのタイプは約２〜２０パーセントの間の濃度（重量対容量）を有するポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、ポリアクリルアミドゲル濃度が約４〜８パーセントの間にある。好ましくはゲルはストランド分離または変性剤を含む。このようなゲルを構成するための詳細な方法はマニアチスら、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第６５巻、第２９９〜３０５頁（１９８０）の「９８％ホルムアミドまたは７Ｍ尿素を含有するポリアクリルアミドゲルにおける低分子量ＤＮＡおよびＲＮＡの分別」；マニアチスら、バイオケミストリー、第１４巻、第３７８７〜３７９４頁（１９７５）の「ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動による小さい二重鎖および一重鎖ＤＮΛ分子の鎖長決定」；およびマニアチスら、モレキュラー・クローニング：実験室手法（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリイ、ニューヨーク、１９８２）１７９〜１８５頁によって与えられる。従ってこれらの参照文献は参考のため挙げられる。特別な分離に用いられる最適ゲル濃度、ｐＨ、温度、変性剤の濃度等は、分離すべき核酸の大きさの範囲、それらの塩基組成；それらが一重鎖かまたは二重鎖か、情報を電気泳動によって捜すための種類の性質を含めて、多くのファクターに依存する。従って本発明の応用は特定の分離のための条件を最適にするための標準の予備試験を必要とするかも知れない。例として、約２０〜３００塩基の間の範囲の大きさを有するポリヌクレオチドを分離し、次に示すゲル中で本発明に従って検出する：１９部対１部のアクリルアミドとビスアクリルアミドから作られ、４８パーセント（重量／容量）尿素を用いて、ｐＨ８．３（２５℃ で測定した）にてトリス−ボレートＥＤＴＡ緩衝液に形成した６パーセントポリアクリルアミド。このゲルは約５０℃にて実施された。
【００５７】
ゲル上の染料−ポリヌクレオチド共役体は標準手段、例えば高光度水銀蒸気ランプ、レーザー等によって発光される。好ましくは、ゲル上の染料−ポリヌクレオチドはアルゴンイオンレーザーによって発生したレーザー光、特に、アルゴンイオンレーザーの４８８および５１４ｎｍの発光ラインによって発光される。これらのラインで同時にレーザー光を発する幾つかのアルゴンイオンレーザーは市販品として入手できる、例えばシオニクス社（サニイベール、ＣＡ）モデル ２００１等。
【００５８】
チェイン・ターミネーター法において、本発明の染料はプライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかに結合することができる。染料は、例えばここに参考文献として組み込まれるフングらの米国特許４，７５７，１４１号の教示に従って、プライマーの５’末端の；例えばワードらの米国特許第４，７１１，９５５号の教示に従って、プライマーの塩基の相補的官能基に；ホスホルアミダイト結合官能基を介して５’−ヒドロキシルに直接；またはジデオキシヌクレオチドの塩基に、例えばここに参考文献として組み込まれるホッブスらのヨーロッパ特許出願８７３０５８４４．０号によって開示されているアルキルアミノ結合基を介して、結合することができる。
【００５９】
本発明のキットは種々の形をとることができるが、通常大きさにより分離される多重ＤＮＡの蛍光性の検出のための手段を提供する。キットは、ＤＮＡ配列決定のために、（例えば電気泳動によって）大きさにより分離される増幅核酸を検出するため等に用いられる。一般に、キットは、４，７−ジクロロフルオレセイン染料で標識を付けたオリゴヌクレオチド、あるいはＤＮＡ配列決定キットの具体例において少なくとも１個の染料−ターミネーターに４，７−ジクロロフルオレセイン染料で標識を付けた染料−ターミネーター混合物のいずれかを含む。通常、染料−ターミネーターは、上記のように、蛍光染料で標識を付けたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートである。
【００６０】
増幅核酸を検出するためのキットは、４，７−ジクロロフルオレセイン染料で標識を付けた少なくとも１個のオリゴヌクレオチド、核酸ポリメラーゼおよび核酸リガーゼからなる群から選ばれる酵素、および反応緩衝液から成る。キットがＤＮＡポリメラーゼを含む場合は必ず、さらにヌクレオシドトリホスフェート混合物、例えば特定の応用、例えば増幅、配列決定等のために適当な濃度のヌクレオシドトリホスフェートを含有するＥＤＴＡの５０ｍＭ水溶液を含む。キットがＤＮＡ配列決定のためにヌクレオシドトリホスフェート混合物を提供する場合、このようなトリホスフェートは、例えばリーらのヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第２０巻、第２４７１〜２４８３頁（１９９２）によって教示されているようなヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）のような類似体を含むと解される。核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素等を含む。好ましくは、キットがＰＣＲ増幅用である場合、核酸ポリメラーゼは、例えばゲルファンドらの米国特許 ４，８８９，８１８号によって開示されているようなＴａｑポリメラーゼである。特定の具体例のためのＰＣＲ反応緩衝液およびヌクレオシドトリホスフェート混合物を選択するための手引はインニスら著、ＰＣＲプロトコル：ア・ガイド・トゥ・メソッズ・アンド・アプリケイションズ（アカデミック・プレス・ニューヨーク、１９９０）に見ることができる。代表的な１０Ｘ ＰＣＲ 反応緩衝液は１５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｍＭのＫＣｌ、およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３から成る。
【００６１】
好ましくは、キットが、例えばランデグレンらの米国特許４，９３８，６１７号等によって開示されているようなリガーゼに基づく増幅反応を可能にする場合は必ず、核酸リガーゼは、バラニイのプロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第８８巻、第１８９〜１９３頁（１９９１）によって開示されているような熱安定性リガーゼである。リガーゼに基づく反応緩衝液を選択するための手引はランデグレンら（上記）、ウら、ゲノミクス、第４巻、第５６０〜５６９頁（１９８９）；バラニイ（上記）、およびニッカーソンら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第８７巻、第８９２３〜８９２７頁（１９９０）に見出すことができる。代表的な連結反応緩衝液は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ７．６；５０ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのＮＡＤ＋、および１０ｍＭのジチオトレイトールから成る。
【００６２】
キットの染色−標識オリゴヌクレオチドは広範囲の長さをもつことができるが、好ましくはそれらの長さは６ないし６０個のヌクレオチドの範囲である。さらに好ましくは、連結キット用のオリゴヌクレオチドは６ないし３０個のヌクレオチドの長さの範囲であり、最も好ましくは、連結キット用のオリゴヌクレオチドは１６ないし２５個のヌクレオチドの長さの範囲である。オリゴヌクレオチドの特定のヌクレオチド配列は勿論、増幅されるように探索される標的配列によって指図される。ＰＣＲ増幅のための具体例において、ＰＣＲプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドの選択は当該分野では、例えばインニスら（上記）、ヒリアーおよびグリーン、ＰＣＲメソッズ・アンド・アプリケーションズ、第１巻、第１２４〜１２８頁（１９９１）等によって良く知られている。
【００６３】
好ましくは、染色−ターミネーターを提供するＤＮＡ配列決定用キットでは、各ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、５−および６−カルボキシフルオレセイン、５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインから成る組から選ばれる染料を用いて別々に標識を付けられる。さらに好ましくは、ジデオキシチミジントリホスフェートは６−カルボキシフルオレセイン（“６−ＦＡＭ”）を用いて標識を付けられ、ジデオキシシチジントリホスフェートは２’，４’，５’．７−テトラクロロ−５−カルボキシフルオレセイン（“５−ＺＯＥ”を用いて標識を付けられ、ジデオキシアデノシントリホスフェートは２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロ−５−カルボキシフルオレセイン（“５−ＨＥＸ”）を用いて標識を付けられ、そしてジデオキシグアノシントリホスフェートは１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４，７−ジクロロ−５−カルボキシフルオレセイン（“５−ＮＡＮ”）を用いて標識を付けられる。ジデオキシアデノシンは２’，３’−ジデオキシ−７−デアザアデノシンを含み、そしてジデオキシグアノシンは２’，３’−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２’，３’−ジデオキシ−７−デアザイノシンを含み、そしてジデオキシチミジンは２’，３’−ジデオキシウリジンを含むと解される。通常、ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートは連結基によって標識を付けられる。好ましくは、連結基は２’，３’−ジデオキシシチジンまたは２’，３’−ジデオキシウリジンの５番目の炭素を染料の５または６番目の炭素に連結し、そして連結基は２’，３’−ジデオキシ−７−デアザアデノシンまたは２’，３’−ジデオキシ−７−グアノシン−または２’，３’−ジデオキシ−７−デアザイノシンの７番目の炭素を染料の５または６番目の炭素に結合する。好ましくは、連結基はカルボキシアミノアルキニルであり、そして最も好ましくは、連結基は３−カルボキシアミノ−１−プロビニルである。
【００６４】
好ましくは、染料−ターミネーターを提供するＤＮＡ配列決定用キットにおいて、核酸ポリメラーゼはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）である。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
（４．７−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセイン（“ＡＬＦ”））
０．５８ｇの３，６−ジクロロトリメリット酸、０．７２ｇのレゾルシノール、０．５ｍｌの儂硫酸、および３ｍｌのプロピオン酸をアルゴン下に１２時間還流した。反応混合物を１５０ｍｌの水に注入し、沈澱物を乾燥し、３ｍｌのビリジンに入れ、２ｍｌの無水酢酸塩で１時間アセチル化した。アセチル化混合物は１００ｍｌの酢酸エチルに入れ、１Ｎの塩酸、水で洗浄し、蒸発乾固した。残渣を１５ｇのシリカゲルに置き、５０ｍｌの酢酸エチルで、次いで４：１の酢酸エチル：メタノールで溶出した。約０．２のＲｆ（４：１の酢酸エチル：メタノール／シリカゲル）でＵＶ活性物質を含有する画分を蒸発乾燥させた。この残渣を１０ｍｌのメタノールに溶解し、次いで１ｍｌの４Ｎ水酸化ナトリウムを添加した。１０分後、反応混合物を２００ｍｌに水で希釈し、次いで０．５ｍｌの濃塩酸を添加した。全混合物を２００ｍｌの酢酸エチルで抽出し、その後酢酸エチルを硫酸ナトリウムで乾燥させ蒸発乾固させて１０２ｍｇの黄緑色の固体を得た。
【００６６】
（実施例２）
（４，７−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）） エステル
実施例１からの１３．７ｍｇのフルオレセイン、３．３ｍｇのＮＨＳ、６．４ｍｇのＤＣＣ、および１ｍｌの酢酸エチルを０．５時間攬拌した。固体を濾過し、そして上澄液を３回１：１のブライン：水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させて１５ｍｇのＮＨＳエステルを得た。
【００６７】
（実施例３）
（４，７−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドの結合）
実施例２からの５ｍｇのＮＨＳエステルを２０μｌのＤＭＳＯに溶解した；３μｌのこの溶液を２０μｌの１．０ｍｎの５’−アミノヘキシルホスフェートオリゴヌクレオチド（１８量体）水溶液および１０μｌの１Ｍ重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０から成る溶液に添加した。暗所で１時間後、溶液を１０ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５（ｍｅｄｉｕｍ）カラムに０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液、ｐＨ７．０を用いて通過させた。排除容量で溶出する着色物質のバンドを収集した。逆相ＨＰＬＣは、ＤＮＡに結合した染料の５−および６−異性体に対応する２本の主要な蛍光ピークを示した。このビークを集め、ｐＨ８．０での５０％尿素における蛍光スペクトルは５２８ｎｍでの発光最大値と３４ｎｍのハーフマックスでの全幅を示した。
【００６８】
（実施例４）
（２’，７’−ジメトキシ−５−（および６−）カルボキシ４，７−ジクロロフルオレセイン（“ＢＵＢ”））
次の物質および分量に変えた以外は実施例１の方法に従った：１．４７ｇの４−メトギシレゾルシノール、０．６０ｇの３，６−ジクロロトリメリット酸、０．２ｍｌの濃硫酸、および４ｍｌのプロピオン酸。この方法は０．１８０ｇの４，７−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインを生成した。
【００６９】
（実施例５）
（２’，７’−ジメトキシ−５−（および６−）カルボキシ４，７−ジクロロフルオレセインＮＨＳエステル）
１８ｍｇのこの染料ＮＨＳエステルは実施例４からの１８ｍｇの染料、３．５ｍｇのＮＨＳ、６．４ｍｇのＤＣＣ、および２ｍｌの酢酸エチルを用いて実施例２と同様に調製した。
【００７０】
（実施例６）
（４，７−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドとの結合）
実施例５の染料ＮＨＳエステルを用いて実施例３の方法に従った。逆相ＨＰＬＣの間に集められた２本のピークの蛍光スペクトルはｐＨ８．２での５０％尿素において５４４ｎｍでの発光最大値と３７ｎｍのハーフマックスでの全幅を示した。
【００７１】
（実施例７）
（２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“ＬＯＵ”））
この染料は実施例４の染料および水性水酸化ナトリウムの次亜塩素酸ナトリウム溶液から調製された。
【００７２】
（実施例８）
（４，７−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインＮＨＳエステル）
１．１ｍｇのこの染料ＮＨＳエステルを実施例７からの０．７ｍｇの染料、０．４５ｍｇのＮＨＳ，０．７ｍｇのＤＣＣ、および０．２ｍｌの酢酸エチルから実施例２のように調製した。
【００７３】
（実施例９）
（４，７−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドとの結合）
この実施例の染料オリゴヌクレオチド結合体を実施例８からの染料ＮＨＳエステルを用いて実施例３と同様に調製した。逆相ＨＰＬＣの間に集められた２本のピークの蛍光スペクトルはｐＨ８．２での５０％尿素において５５８ｎｍでの発光最大値と３８ｎｍのハーフマックスでの全幅を示した。
【００７４】
（実施例１０）
（１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“ＮＡＮ”））
まず、３，６−ジクロロトリメトリット酸トリクロリドを調製した：０．５ｇの３，６−ジクロロトリメリット酸と１．３ｇの五塩化リンの混合物を１３０℃で４０分間加熱した。混合物を室温まで冷却し氷に注いだ。次いで混合物を４０ｍｌのエーテルで抽出し、有機画分を２回１５ｍｌの水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、透明油（０．７ｇ）まで濃縮した。酸トリクロリドをさらに精製しないで使用した。ＮＡＮを次のように調製した：２．７ｇの１，３−ジヒドロキシナフタレン、２．８４ｇの３，６−ジクロロトリメリット酸トリクロリド、および８ｍｌのプロピオン酸の混合物を２時間還流した。水（５０ｍｌ）および酢酸エチル（５０ｍｌ）を添加した。相を分離して、有機相を３回５０ｍｌの１ＭのＮａＨＣＯ３で抽出した。水溶液を沸点まで加熱して濃ＨＣｌで酸性にした。得られた赤色固体（０．２ｇ）を濾過し乾燥した。
【００７５】
（実施例１１）
（１’，２’，７’，８−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“ＤＥＢ”））
２０ｍｇのＮＡＮ、水酸化ナトリウム（１５％溶液３４μｌ）、水（１ｍｌ）、および次亜塩素酸ナトリウム（５％溶液１７０μｌ）を一緒にした。逆相ＨＰＬＣは９２％の反応を示した。溶液をＨＣｌで酸性にして、２０ｍｌの酢酸エチルで抽出し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、２０ｍｇまで濃縮した。固体をシリカゲルカラム（径１“×高さ２”）のクロマトグラフィーによって６００：６０：１６の塩化メチレン：メタノール：酢酸で溶出して精製した。染料溶液を濃縮し、希ＨＣｌおよび酢酸エチルを添加した。有機相を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、２０ｍｇのＤＥＢまで濃縮した。
【００７６】
（実施例１２）
（１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインＮＨＳエステルの生成）
ＮＡＮ（１０ｍｇ）を２ｍｌの酢酸エチルに溶解し、ＮＨＳ（１０ｍｇ）とＤＣＣ（５ｍｇ）を添加した。２０分後、溶液は暗赤色になり、結晶固体が現れた。６００：６０：１６の塩化メチレン：メタノール：酢酸を用いたシリカゲルの薄層クロマトグラフィーはＮＨＳエステルに完全に転換したことを示した。酢酸エチル溶液を希ＨＣｌで洗浄し、乾燥（ＮａＳＯ４）して赤色固体（１５ｍｇ）まで濃縮した。
【００７７】
（実施例１３）
（ＤＮＡ配列分析において染料標識プライマーとしてＡＬＦ−、ＢＵＢ−、ＬＯＵ−、およびＮＡＮ−オリゴヌクレオチ）
結合体を使用 染料の全フルオレセインセットを使用してアプライド・バイオシステムズ（フォスター・シテイ、ＣＡ）モデル３７０Ａ自動化ＤＮＡシーケンサーを用いてチェイン・ターミネーター法でＤＮＡフラグメントに標識を付けた。製造業者のプロトコル（参考文献として組み込まれるユーザー・ブレタン・ＤＮＡシーケンサーモデル３７０、発行第２号、１９８７年８月２日）に従って、Ｍ１３中の未知のＤＮＡを増幅してゲル電気泳動分離のための別々に標識を付けたＤＮＡフラグメントを調製した。染料標識プライマーは上記実施例に記載されたように調製した。即ち、各染料のＮＨＳエステルを調製し、５’−アミノヘキシル誘導化Ｍ１３ユニバーサルプライマー（５’−ＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ−３’（配列番号１））と反応させ４つに分かれるジデオキシ反応混合物に対する染色標識プライマーを生成した。次の変更は標準プロトコルでなされた：ジデオキシシチジン反応においてプライマーに標識を付けた５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、ジデオキシアデノシン反応においてプライマーに標識を付けた２’，７’−ジメトキシ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、ジデオキシグアノシン反応においてプライマーに標識を付けた２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、ジデオキシチミジン反応においてプライマーに標識を付けた１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、各反応からの標識を付けたＤＮＡフラグメントをゲルに装填するために次のモル比で一緒にした：１：４：２ｄｄＣ反応：ｄｄＡ反応：ｄｄＧ反応：ｄｄＴ反応、そして検出は５３５、５５０、５６５、および５８０ｎｍに中心がある１０−ｎｍバンドパスフィルターを用い改良フィルターホイールで行った。
【００７８】
（実施例１４）
（ＤＮＡ配列分析において染料−標識プライマーとしてＡＬＦ−、ＢＵＢ−、ＤＥＢ−、およびＮＡＮ−オリゴヌクレオチド結合を使用）
次のことを除いて、実施例１３に記載したと同様の方法に従った：（ｉ）ジデオキシグアノシン反応においてプライマーに標識を付けた１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、（ｉｉ）各反応からの標識を付けたＤＮＡフラグメントをゲルに装填するために次のモル比で一緒にした：１：１：２：１５ｄｄＣ反応：ｄｄＡ反応：ｄｄＧ反応：ｄｄＴ反応、そして（ｉｉｉ）５ｎｍバンドパスフィルターは５４０、５６０、５８０、および６１０ｎｍに中心があった。
【００７９】
（実施例１５）
（２’，７’−ジクロロ−５−（および６）−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“５−（および６−）ＴＥＴ”））
４−クロロレゾルシノール（１０ｇ）、４，７−ジクロロトリメリット酸（１０ｇ）、およびメタンスルホン酸（３０ｍｌ）の混合物を一緒にして２時間１４０〜１５０℃まで加熱した。赤色混合物を水（１００ｍｌ）に注ぎ酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出した。有機相を２回希塩酸で洗浄し、金褐色固体（１９ｇ）に濃縮した。ピリジン（４０ｍｌ）と無水酢酸（１０ｍｌ）を固体に添加し混合物を０．５時間還流した。溶液を１時間４℃で冷却させた。
【００８０】
結晶を濾過して分離し、白色固体（５．４ｇ）を生成した。少部分の加水分解（０．０２ｍｌの０．１Ｎ ＮａＣｌおよび０．０２ｍｌのエタノールを２ｍｇの固体に添加）続いて逆相ＨＰＬＣの分析で固体は９２：８の比の異性体（６−カルボキシＴＥＴ：５−カルボキシＴＥＴ）を含有することを示した。２回目の再結晶はジアセテート（９９：１比）としてほぼ純粋な異性体染料を与えた。５−ＴＥＴは濾液からの５−ＴＥＴのジアセテートの加水分解、次にアセトニトリルからの再結晶によって回収された。
【００８１】
水酸化ナトリウム（３ｇ）と水（１０ｍｌ）を６−ＴＥＴジアセテート（８．６ｇ）（ＨＰＬＣカラムから２本のピークの最初のものとして得られた）に添加した。追加の水（５０ｍｌ）を溶液が均質になるまで添加した。暗赤色溶液に濃ＨＣｌ（１５ｍｌ）を添加した。黄色の沈澱が形成された。混合物を酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出した。有機相を淡黄色のほぼ無色の固体（７．４ｇの６−ＴＥＴ）に濃縮した。
【００８２】
（実施例１６）
（２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“５−および６−ＨＥＸ”））
磁気攬拌棒を備えた１リットルのエルレンマイヤーフラスコに５−または６−ＴＥＴ（６．３ｇ）および１Ｍの炭酸塩／重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．４（６０ｍｌ）を添加した。家庭用漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム、５０ｍｌ）を２０分かけて滴下した。反応の進行を逆相ＨＰＬＣでモニターした。全部で６７ｍｌの漂白剤を添加した。濃ＨＣｌ（１５ｍｌ）で溶液を酸性にして酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出した。有機相を明黄色固体（７．３ｇ）まで儂縮した。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１（１Ｈ）；７．４（２Ｈ）。
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は一般に蛍光標識技術に関し、そしてさらに特に、同じ試料中の多数の標的物質を検出するための４，７−ジクロロフルオレセインの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多くの診断上および分析上の技術は同じ試料中の多数の標的物質を区別できる蛍光タグで標識を付けることを必要としている、例えばラニールら、ジャーナル・イムノロジイ、第１３２巻、第１５１〜１５６頁（１９８４）（フローサイトメトリー）；グレイら、クロモソマ、第７３巻、第９〜２７頁（１９７９）（フローシステム核型）；フングら、米国特許４，８５５，２２５号（ＤＮＡ配列決定）；およびマリイランドら、アプライド・アンド・セオリティカル・エレクトロフォレシス、第３巻、第１〜１１頁（１９９２）（電気泳動により分離したポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）生成物の分析）。この要請は、最も自動化された配列決定アプローチにおいて少なくとも４種のスペクトルにより分解できる色素が必要であるＤＮＡ配列決定分析で満足させることは特に難しい。
【０００３】
現在、ＤＮＡ配列決定には２つの基本的なアプローチがある：ジデオキシ・チェイン・ターミネーター法、例えばサンガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁（１９７７）；および化学分解方法、例えばマキサムら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第７４巻、第５６０〜５６４頁（１９７７）。チェイン・ターミネーター法は幾つかの方法で改良され、あらゆる一般に入手できる自動化ＤＮＡ配列決定機器のための基礎として役に立っている、例えばサンガーら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第１４３巻、第１６１〜１７８頁（１９８０）；シュライヤーら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第１２９巻、第１６９〜１７２頁（１９７９）；スミスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１３巻、第２３９９〜２４１２ 頁（１９８５）；スミスら、ネイチャー、第３２１巻、第６７４〜６７９真（１９８７）；プロパーら、サイエンス、第２３８巻、第３３６〜３４１頁（１９８７）、セクションＩＩ、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第１５５巻、第５１〜３３４頁（１９８７）；チャーチら、サイエンス、第２４０巻、第 １８５〜１８８真（１９８８）；およびコンネルら、バイオテクニクス、第５巻、第３４２〜３４８頁（１９８７）。
【０００４】
鎖末端および化学分解方法は共に１またはそれ以上のセットの標識を付したＤＮΛフラグメントの世代を必要とし、各々は共通の起源をもち各々は既知の塩基を末端とする。次にフラグメントの単数または複数のセットは大きさによって分離され配列情報が得られる。両者の方法において、ＤＮＡフラグメントは高分解能ゲル電気泳動によって分離される。最も自動化されたＤＮＡ配列決定機器では、異なる末端塩基を有するフラグメントは異なる蛍光染料を用いて標識を付され、プライマーに結合するか、例えばスミスら（１９８７、上記）、あるいは末端ジデオキシヌクレオチドの塩基に結合する、例えばプロパーら（上記）。標識フラグメントは一緒にされて電気泳動分離のための同じゲルカラムに装填される。フラグメントが分離過程の間に静置検出器を通過するときフラグメントによって放出される蛍光信号を分析することによって塩基配列は決定される。
【０００５】
異なるフラグメントを標識するための一組の染料を入手することはこのようなＤＮＡ配列決定システムでは主要な難点である。
【０００６】
第１に、有機蛍光染料に対する代表的な発光バンド半幅は約４０〜８０ナノメートル（ｎｍ）であり可視スペクトルは約３５０〜４００ｎｍに過ぎないので、有意に重なる発光バンドを持たない３種またはそれ以上の染料を見出すことは困難である。第２に、重ならない発光バンドをもつ染料を見出したとしても、そのセットはそれぞれの蛍光効率が低すぎる場合ＤＮＡ配列決定のために未だ不適であるかも知れない。例えば、プリングルら、ＤＮＡ・コア・ファシリティス・ニュースレター、第１巻、１５〜２１頁（１９８８）には、増大したゲル荷重が低い蛍光効率を補償できないことを示すデータがある。第３に、幾つかの蛍光染料を同時に使用する場合、染料の吸収バンドが広く分離することが多いので励起が難しくなる。最も有効な励起は各染料をその吸収バンドの最高値に相当する波長で発光する場合に生じる。幾つかの染料を使用する場合、検出システムの感度と各染料に対する別々の励起源を与えるコスト増加との間にトレードオフを行うように強いられることが多い。第４に、ゲルの単一カラム中の異なる大きさに分類されたフラグメントの数が数百よりも大きい場合、染料の物理化学的性質、およびフラグメントに連結される手段が臨界的に重要になる。染料およびリンカーの電荷、分子量およびコンホメーションは接近した大きさに分類されたフラグメントの電気泳動による移動度に、広範囲なバンドの広がりが起こるようにあるいはゲル上のバンドの位置が逆になり、これによってバンドの順序および配列を決定するための核酸中の塩基の順序との間の一致を壊すように、不利に影響してはならない。最後に、蛍光染料はフラグメントを造りまたは操作するために用いられる化学物質と相溶性がなければならない。例えば、鎖末端方法においてプライマーに標識を付けるために用いられる染料および／またはジデオキシ・チェイン・ターミネーターは使用したポリメラーゼまたは逆転写酵素の活性を妨げてはならない。
【０００７】
これらのきびしい制約のために、数組の蛍光染料だけが、自動化ＤＮＡ配列決定にまた診断および分析の技術に使用できることが見出された、例えばスミスら（１９８５、上記）；プロパーら（上記）；フードら、ヨーロッパ特許出願８５００９６０号；およびコンネルら（上記）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の観点では、ＤＮＡ配列決定のような、多くの分析および診断の技術は、（１）容易に入手できる染料に物理化学的に類似のもの、（２）ゲル上の密に配置されたＤＮＡバンドのような空間的に重なっている標的物質の検出ができるもの、（３）自動化ＤＮＡ配列決定の最近の方法によって単一ゲルカラム上で決定することができる塩基の数を広げるもの、および（４）広範囲の予備および手先のテクニックを用いての使用において影響を受けやすいもの、である新しい蛍光染料の入手容易性によって有意に促進されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、次式を有する化合物であって：
【００１０】
【化１−２】
【００１１】
式中、
Ａ’は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、または連結官能体に変換できる基であり；
Ｂ’はフルオロ、クロロ、または酸性アニオン基であり；
Ｘ’は水素、フルオロまたはクロロであり；
Ｚ３およびＺ４は別々に水素、ハロ、連結官能体、または連結官能体に変換できる基であり；そして
Ａ’、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも１個は連結官能体または連結官能体に変換できる基である、化合物、である。
【００１２】
好適な実施形態においては、Ａ’は、カルボキシル、スルホニル、イソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、ホスホルアミダイト、またはアミノであり；Ｂ’はカルボキシルまたはスルホニルであり；Ｘ’は水素であり；Ｚ３およびＺ４は別々に水素、ハロ、カルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノである。
【００１３】
好適な実施形態においては、Ａ’、Ｚ３、およびＺ４の１個のみがカルボキシル、スルホニル、メチルアミノ、またはアミノである。
【００１４】
好適な実施形態においては、Ｚ３がメチルアミノである。
【００１５】
好適な実施形態においては、Ｚ３がメチルアミノである。
【００１６】
好適な実施形態においては、Ｚ３がフルオロである。
【００１７】
好適な実施形態においては、Ｚ３がクロロである。
【００１８】
好適な実施形態においては、Ａ’が水素である。
【００１９】
好適な実施形態においては、Ａ’がフルオロである。
【００２０】
好適な実施形態においては、Ａ’がクロロである。
【００２１】
好適な実施形態においては、Ａ’がイソチオシアネートである。
【００２２】
好適な実施形態においては、Ａ’がスクシンイミジルカルボキシレートである。
【００２３】
好適な実施形態においては、Ａ’がホスホルアミダイトである。
【００２４】
好適な実施形態においては、Ａ’がカルボキシルである。
【００２５】
好適な実施形態においては、Ａ’がスルホニルである。
【００２６】
好適な実施形態においては、Ａ’がアミノである。
【００２７】
好適な実施形態においては、Ｂ’がカルボキシルまたはスルホニルである。
【００２８】
好適な実施形態においては、Ｂ’がカルボキシルである。
【００２９】
好適な実施形態においては、Ｂ’がスルホニルである。
【００３０】
好適な実施形態においては、上記化合物が、式２’，７’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインまたは２’，７’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインを有する。
【００３１】
好適な実施形態においては、上記化合物が、式２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、または２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインである。
【００３２】
本発明はまた、上記化合物を含むジデオキシヌクレオチドである。
【００３３】
本発明はまた、上記化合物を含むポリヌクレオチドである。
【００３４】
（発明の概要）
本発明は４，７−ジクロロフルオレセイン染料を使用して空間的に重なる標的物質を同時に検出する方法、そして特に、４，７−ジクロロフルオレセイン染料を用いるＤＮＡ配列決定の方法にある。本発明はまた式１によって定義される２’，７’−ジクロロ−５（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインを含む。
【００３５】
【化２】
【００３６】
式中、Ａ’は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはアミノであり；好ましくはＡ’は連結官能体または連結官能体に変換できる基であり；
Ｘ’は水素、フルオロまたはクロロであり、Ａ’が６個の炭素原子の置換基であるときは必ずＸ’は５個の炭素原子の置換基であり、そしてＡ’が５個の炭素原子の置換基であるときは必ずＸ’は６個の炭素原子の置換基であり；好ましくはＸ’は水素であり；
Ｚ３水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり；好ましくはＺ３は水素またはクロロであり；
Ｚ４は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり；好ましくはＺ４は水素またはクロロであり；
Ｂ’はフルオロ、クロロ、または酸性アニオン基；好ましくはＢ’はカルボキシルまたはスルホニル、および最も好ましくはＢ’はカルボキシルであり；
そしてＡ’、Ｚ３、およびＺ４の少なくとも１個は連結官能体または連結官能体に変換できる基である。好ましくはＡ’、Ｚ３、およびＺ４の１個のみは連結官能体または連結官能体に変換できる基である。
【００３７】
本発明はまた本発明の方法を実施するためのキットを含む。一般に、キットはＤＮＡフラグメントの電気泳動により分離された複数のクラスを検出するために提供される。特に、キットはプライマー伸長生成物の少なくとも１つのクラスに４，７−ジクロロフルオレセイン染料で蛍光による標識を付けるＤＮＡ配列決定を行うためのものを含む。このようなＤＮＡ配列決定キットは染料で標識を付けたプライマーをもつキットを含み、より好ましいものとしては染料で標識を付けたターミネーターをもつキットを含む。
全体にわたり、カラー・インデックス（アソシエーション・オブ・テキスタイル・ケミスツ、第２版、１９７１）炭素ナンバリング図式を使用する、すなわちプライムを付した数字はキサンテン構造の炭素を指し、プライムを付していない数字は９’−フェニルの炭素を指す。
【００３８】
本発明は、４，７−クロロ−５（および６−）カルボキシフルオレセインおよび関連する染料の蛍光性が分子プローブとしての使用に非常に有利であることを発見したことに一部は基づいている。これらの発光バンド幅は４，７−ジクロロ誘導体を欠く類似体よりも一般に２０〜３０パーセント狭く、これらの発光および吸収の最大値は４，７−ジクロロ誘導体を欠く類似体よりも一般に約１０〜３０ｎｍ高く、そしてこれらの蛍光効率は高く、いくつかの場合には４，７−ジクロロ誘導体を欠く類似体のそれのほぼ３倍である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（発明の詳細な説明）
上述のように、本発明は通常長い波長、狭い発光バンド幅および他の有利な蛍光性にて最大の吸収および発光を示すある種のフルオレセイン染料の発見に一部は基づくものである。さらに、本発明はこの種の染料の種類として式Ｉによって定義される新規のフルオレセイン類似体を含む。これらの染料はスペクトルにより分解できる、自動化ＤＮＡ配列決定分析に特に利用できる物理化学的に類似の染料の新規なセットのアセンブリを可能にする。
【００４０】
ここで使用される染料のセットに関係する語「スペクトルにより分解できる」
は、染料の蛍光発光バンドが充分に明確であり、すなわち充分に重なっておらず、各染料が結合している標的物質、例えばポリヌクレオチドを、例えばバンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシステムを用いる標準光検出システムまたはその類似のシステムによって各染料によって発生した蛍光信号に基づいて区別することができることを意味し、前記システムは米国特許４，２３０，５５８号、４，８１１，２１８号等、またはホイーレスら、フロー・シトメトリイ：インストルメンテージョン・アンド・データ・アナリシス（アカデミック・プレス・ニューヨーク、１９８５）の２１〜７６頁に記載されたようなシステムが挙げられる。
【００４１】
ここで直接にまたはエーテルと関連して使用される「低級アルキル」の語は、１〜６個の炭素原子を含む直鎖および／または分技鎖アルキル基を示し、例えばこの語はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル等を含む。さらに好ましくは、この「低級アルキル」の語は、１〜３個の炭素原子をもつアルキルを示す。
【００４２】
ここで使用される「ハロ」はハロゲン原子、弗素、塩素、臭素、および沃素を示し；さらに好ましくは、この語は弗素または塩素を示し；そして最も好ましくは、この語は塩素を示す。
【００４３】
好ましくは、本発明の４，７−ジクロロ−５（および６−）カルボキシフルオレセイン染料は式ＩＩによって定義されるものを含む。
【００４４】
【化３】
【００４５】
式中、 Ａ’、Ｂ’およびＸ’は上記と同じであり；
Ｚ１は水素または、Ｚ２と共にとるときは、ベンゾであり；
Ｚ２は、単独でとるときは、水素、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、または活性連結官能体に変換できる基、例えば、カルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり、またはＺ１と共にとるときは、Ｚ２は活性連結官能体に変換できるメチルアミノであり、またはＺ５と共にとるときは、Ｚ６はベンゾであり、好ましくは、単独でとるときは、Ｚ６は水素、メチル、エチル、フルオロ、クロロ、メトキシ、またはエトキシであり；そしてＡ、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、およびＺ５の少なくとも１個は連結官能体に変換できる基である。好ましくは、Ａ、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、およびＺ５の１個のみが活性連結官能体に変換できる基である。
【００４６】
本発明に使用するための多くの染料は市販品として入手できるかまたはこの分野で知られている技術によって合成できる、例えば、ガタクら、ジャーナル・オブ・ザ・インディアン・ケミカル・ソサイアティ、第６巻、第４６５−４７１真（１９２９）；およびカンナら、米国特許４，４３９，３５６号。あるいは、フルオレセイン類似体、即ち、Ａ＝Ｂ＝カルボキシルは、実施例に示されるように、置換したレゾルシノールを置換したベンゾフェノンと、または置換したトリメリット酸と、プロピオン酸の存在下に反応させて合成することができる。スルホニルフルオレセイン、即ちＡまたはＢがスルホニルは、リーら、サイトメトリー、第１０巻、第１５１−１６４頁（１９８９）によって開示された方法に従って合成され、適当な反応体を置換することにより改変して５−または６−カルボキシル−またはスルホニルフルオレセイン生成物を与える。好ましくは、ＤＮＡ配列決定においてポリヌクレオチドに標識を付けるとき、一般に異性体の混合物を使用する場合バンドの幅が広がるようになる僅かに異なる電気泳動移動性をもつので、染料の５−または６−異性体を別々に使用する。染料の５−または６−異性体は逆相ＨＰＬＣによって容易に分離される、例えばエドムンドソンら、モレキュラー・イムノロジー、第２１巻、第５６１頁（１９８４）。一般に、最初の溶出ピークは６−異性体および第二の溶出ピークは５−異性体であると信じられている。
【００４７】
本発明の染料はこの分野で良く知られている種々の手段によって標的物質に結合することができる。例えば、ハウグランド、ハンドブック・オブ・フルオレセント・プローブス・アンド・リサーチ・ケミカルス（モレキュラー・プローブス，インコーポレイテッド、ユージーン、１９８９）は標的物質に染料を結合するための手段のガイドと例を提供する。置換体Ａは、連結基を形成するように標的物質上で相補的官能体と反応できる連結官能体に変換される。次表はＡがカルボキシル、スルホニルまたはアミンであるときは必ず形成できる例示の連結官能体、適当な相補的官能体、および本発明に使用するために適している得られた連結基を列挙している。
【００４８】
【化４−１】
【００４９】
【化４−２】
【００５０】
好ましくは連結官能体は、相補的官能体がアミンであるときは必ずイソチオシアネート、塩化スルホニル、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、またはスクシンイミジルカルボキシレートである。そして好ましくは連結官能体は相補的官能体がスルフヒドリルであるときは必ずマレイミド、またはヨードアセトアミドである。例えばカンナら、米国特許４，３１８，８４６号の実施例６および８、およびカサイら、アナリチカル・ケミストリー、第４７巻、第３４〜３７頁（１９７５）に示されているように、スクシンイミジルカルボキシレートは、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用して上記染料の５−および／または６−カルボキシルをＮ−ヒドロキシスクシンイミドと縮合して形成することができる。従って、これらの文献は参考にここに組み込まれる。染料ホスホルアミダイトはスタインら、ジーン、７２巻、３３３〜３４１頁（１９８８）；フングら、米国特許４，７５７，１４１号；１９８９年９月１３日に出願されたヨーロッパ特許出願 ８９１１６９４６．８号；および１９８８年８月２６日に出願されたヨーロッパ特許出願８８３０７９３４．５号によって教示されているように生成される。例えばビューケージら、テトラヘドロン、第４８巻、第２２２３〜２３１１頁（１９９２）；カルーサースら、ナラング著、ＤＮＡとＲＮＡの合成と応用（アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９８７）第４７〜９４頁等によって教示されるように、置換基Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は種々の形態をとることができる。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、別々にとるときは、メチル、エチル、またはイソプロピルであり、そしてＲ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と共にとるときは、４ないし８個の炭素原子、および窒素、酸素、および硫黄からなる群から選ばれる１ないし２個のヘテロ原子を有する複素環である。さらに好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素と共にとるときはモルホリノである。好ましくは、Ｒ３はメチル、クロロフェニル、β−シアノエチル、メチルスルホニルエチル、およびニトロフェニルエチルからなる群から選ばれる。
【００５１】
好ましくは、例えばビューケージら（上記）；ステクら、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０１０１０；ビューケージら、米国特許５，００３，０９７号等によって教示されているように、ホスホルアミダイト−誘導連結基は酸化されてリン（Ｖ）連鎮を形成する。
本発明の染料はＤＮＡ配列決定のためのジデオキシヌクレオチドに標識を付けるために使用されるとき、好ましくはこれらはピリミジン塩基の５番目の炭素および７−デアザプリン塩基の７番目の炭素に連結される。例えば、いくつかの適当な塩基標識化方法が本発明と共に使用できることが報告された、例えば、ギブソンら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１５巻、第６４５５〜６４６７頁（９１８７）；ゲベイエフら、ヌクレイソク・アシッズ・リサーチ、第１５巻、第４５１３〜４５３５頁（１９８７）；ハララムビジスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１５巻、第４８５６〜４８７６頁（１９８７）等。好ましくは、染料と塩基の間の連結基はジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ−誘導化塩基と本発明の染料のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を反応させて形成される。好ましくは連結基は３−カルボキシアミノ−１−プロピニルである。このようなアルキニルアミノ−誘導化ジデオキシヌクレオチドの合成は、ここに参考文献として組み込まれるホッブスらのヨーロッパ特許出願番号８７３０５８４４．０号および米国特許 ５，０４７，５１９号によって教示されている。簡単に述べると、アルキニルアミノ−誘導化ジデオキシヌクレオチドは、適当なハロジデオキシヌクレオシド（ホッブスら（上記）によって教示されているように通常は５−ヨードピリミジンおよび７−ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシド）およびＣｕ（Ｉ）をフラスコに入れ、空気を除くようにＡｒを吹き込み、乾燥ＤＭＦを添加し、続いてアルキニルアミン、トリエチルアミンおよびＰｄ（Ｏ）を添加して生成される。反応混合物は数時間、または薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオソドの消費を示すまで攪拌することできる。保護されていないアルキニルアミンを使用するときは、アルギニルアミノ−ヌクレオシドは反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生成したハイドロハライドを中和するように水酸化アンモニウムを含む溶出溶媒を使用してシリカゲルのクロマトグラフィーにかけることによって単離することができる。保護されたアルキニルアミンを使用するときは、メタノール／塩化メチレンを反応混合物に続いて強塩基性アニオン交換樹脂で重炭酸塩を形成させることができる。次にスラリーを約４５時間攬拌し、濾過し、そして樹脂を追加のメタノール／塩化メチレンを用いて洗うことできる。一緒に合わせた濾液を濃縮し、メタノール−塩化メチレングラディエントを用いてシリカゲルのフラッシュ−クロマトグラフィーで精製することができる。トリホスフェートが標準技術によって得られる。
【００５２】
本発明の標的物質は本発明の染料が結合できるものであれば事実上何でもよい。好ましくは染料は標的物質に共有結合される。標的物質は蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、ポリヌクレオチド、脂質、およびこれらの組合せおよび集合体、例えば染色体、細胞核、生細胞、例えばバクテリア、他の微生物、および哺乳類細胞、組織等を含む。ここに使用されるように「ポリヌクレオチド」の語は、長さが数塩基から数千塩基の大きさの範囲、例えば６から数十ないし数百または数千までの塩基の長さ（一重鎖の場合）、または長さが数塩基対ないし数千塩基対の大きさの範囲、例えば６から数十ないし数百までまたは数千までの塩基対の長さ（二重鎖の場合）でのＤＮＡまたはＲＮＡの一重鎖または二重鎮を意味する。
【００５３】
多数の相補的官能体を合成オリゴヌクレオチドおよびボリヌクレオチドの５’または３’末端に、例えばアミノ基、フングら、米国特許４，７５７，１４１号およびミヨシら、米国特許４，６０５，７３５号；またはスルフヒドリル基、コノリイ、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１３巻、第４４８５〜４５０２頁（１９８５）、およびスボートら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１５巻、４８３７〜４８４８頁（１９８７）、を結合することができる。
【００５４】
本発明の染料は、類似の物理化学的な性質、例えば大きさ、配座、電荷、疎水性等を有する標的物質の一連のバンドまたはスポットが線状または二次元の配置に存在する、ゲル電気泳動のような、生物化学的分離方法に委ねられたポリヌクレオチドの種類を同定するために特に良く適している。ここで使用されるように、「バンド」の語は類似のまたは同一の物理化学的性質に基づいた標的物質の空間的配置または凝集を含む。通常のバンドは電気泳動、特にゲル電気泳動によって染料−ポリヌクレオチドの共役体を分離する際に生じる。
【００５５】
ポリヌクレオチドの種類は種々の関係において生じることができる。例えば、それらは制限酵素消化の生成物として、またはポリメラーゼまたはリガーゼ反応の伸長生成物として生じることができる。好ましくは、本発明に従って同定される種類は、対応が４種の可能な末端塩基と１組のスペクトルにより分析できる染料の部分との間に確立されるように末端ヌクレオチドの語において定義される。
【００５６】
このような組は、市版品として入手できる分光光度計を用いて発光と吸収のバンド幅を測定して、本発明の染料から容易に集められる。さらに好ましくは、それらの種類はＤＮＡ配列の化学的またはチェイン・ターミネーター法の関係において生じ、最も好ましくはチェイン・ターミネーター法の関係において生じる。何れかの方法において染料−ポリヌクレオチドの共役体は標準のゲル電気泳動方法によって分離される、例えばゴールドおよびマシューズ、上述；リックウッドおよびハメス著、核酸のゲル電気泳動：実際のアプローチ（ＩＲＬプレス・リミテッド、ロンドン、１９８１）；またはオスターマン、プロテインと核酸の研究方法、第１巻（スプリンガー−ベルラク、ベルリン、１９８４）。好ましくはゲルのタイプは約２〜２０パーセントの間の濃度（重量対容量）を有するポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、ポリアクリルアミドゲル濃度が約４〜８パーセントの間にある。好ましくはゲルはストランド分離または変性剤を含む。このようなゲルを構成するための詳細な方法はマニアチスら、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第６５巻、第２９９〜３０５頁（１９８０）の「９８％ホルムアミドまたは７Ｍ尿素を含有するポリアクリルアミドゲルにおける低分子量ＤＮＡおよびＲＮＡの分別」；マニアチスら、バイオケミストリー、第１４巻、第３７８７〜３７９４頁（１９７５）の「ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動による小さい二重鎖および一重鎖ＤＮΛ分子の鎖長決定」；およびマニアチスら、モレキュラー・クローニング：実験室手法（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリイ、ニューヨーク、１９８２）１７９〜１８５頁によって与えられる。従ってこれらの参照文献は参考のため挙げられる。特別な分離に用いられる最適ゲル濃度、ｐＨ、温度、変性剤の濃度等は、分離すべき核酸の大きさの範囲、それらの塩基組成；それらが一重鎖かまたは二重鎖か、情報を電気泳動によって捜すための種類の性質を含めて、多くのファクターに依存する。従って本発明の応用は特定の分離のための条件を最適にするための標準の予備試験を必要とするかも知れない。例として、約２０〜３００塩基の間の範囲の大きさを有するポリヌクレオチドを分離し、次に示すゲル中で本発明に従って検出する：１９部対１部のアクリルアミドとビスアクリルアミドから作られ、４８パーセント（重量／容量）尿素を用いて、ｐＨ８．３（２５℃ で測定した）にてトリス−ボレートＥＤＴＡ緩衝液に形成した６パーセントポリアクリルアミド。このゲルは約５０℃にて実施された。
【００５７】
ゲル上の染料−ポリヌクレオチド共役体は標準手段、例えば高光度水銀蒸気ランプ、レーザー等によって発光される。好ましくは、ゲル上の染料−ポリヌクレオチドはアルゴンイオンレーザーによって発生したレーザー光、特に、アルゴンイオンレーザーの４８８および５１４ｎｍの発光ラインによって発光される。これらのラインで同時にレーザー光を発する幾つかのアルゴンイオンレーザーは市販品として入手できる、例えばシオニクス社（サニイベール、ＣＡ）モデル ２００１等。
【００５８】
チェイン・ターミネーター法において、本発明の染料はプライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかに結合することができる。染料は、例えばここに参考文献として組み込まれるフングらの米国特許４，７５７，１４１号の教示に従って、プライマーの５’末端の；例えばワードらの米国特許第４，７１１，９５５号の教示に従って、プライマーの塩基の相補的官能基に；ホスホルアミダイト結合官能基を介して５’−ヒドロキシルに直接；またはジデオキシヌクレオチドの塩基に、例えばここに参考文献として組み込まれるホッブスらのヨーロッパ特許出願８７３０５８４４．０号によって開示されているアルキルアミノ結合基を介して、結合することができる。
【００５９】
本発明のキットは種々の形をとることができるが、通常大きさにより分離される多重ＤＮＡの蛍光性の検出のための手段を提供する。キットは、ＤＮＡ配列決定のために、（例えば電気泳動によって）大きさにより分離される増幅核酸を検出するため等に用いられる。一般に、キットは、４，７−ジクロロフルオレセイン染料で標識を付けたオリゴヌクレオチド、あるいはＤＮＡ配列決定キットの具体例において少なくとも１個の染料−ターミネーターに４，７−ジクロロフルオレセイン染料で標識を付けた染料−ターミネーター混合物のいずれかを含む。通常、染料−ターミネーターは、上記のように、蛍光染料で標識を付けたジデオキシヌクレオシドトリホスフェートである。
【００６０】
増幅核酸を検出するためのキットは、４，７−ジクロロフルオレセイン染料で標識を付けた少なくとも１個のオリゴヌクレオチド、核酸ポリメラーゼおよび核酸リガーゼからなる群から選ばれる酵素、および反応緩衝液から成る。キットがＤＮＡポリメラーゼを含む場合は必ず、さらにヌクレオシドトリホスフェート混合物、例えば特定の応用、例えば増幅、配列決定等のために適当な濃度のヌクレオシドトリホスフェートを含有するＥＤＴＡの５０ｍＭ水溶液を含む。キットがＤＮＡ配列決定のためにヌクレオシドトリホスフェート混合物を提供する場合、このようなトリホスフェートは、例えばリーらのヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第２０巻、第２４７１〜２４８３頁（１９９２）によって教示されているようなヌクレオシド−５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）のような類似体を含むと解される。核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素等を含む。好ましくは、キットがＰＣＲ増幅用である場合、核酸ポリメラーゼは、例えばゲルファンドらの米国特許 ４，８８９，８１８号によって開示されているようなＴａｑポリメラーゼである。特定の具体例のためのＰＣＲ反応緩衝液およびヌクレオシドトリホスフェート混合物を選択するための手引はインニスら著、ＰＣＲプロトコル：ア・ガイド・トゥ・メソッズ・アンド・アプリケイションズ（アカデミック・プレス・ニューヨーク、１９９０）に見ることができる。代表的な１０Ｘ ＰＣＲ 反応緩衝液は１５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｍＭのＫＣｌ、およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３から成る。
【００６１】
好ましくは、キットが、例えばランデグレンらの米国特許４，９３８，６１７号等によって開示されているようなリガーゼに基づく増幅反応を可能にする場合は必ず、核酸リガーゼは、バラニイのプロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第８８巻、第１８９〜１９３頁（１９９１）によって開示されているような熱安定性リガーゼである。リガーゼに基づく反応緩衝液を選択するための手引はランデグレンら（上記）、ウら、ゲノミクス、第４巻、第５６０〜５６９頁（１９８９）；バラニイ（上記）、およびニッカーソンら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ、第８７巻、第８９２３〜８９２７頁（１９９０）に見出すことができる。代表的な連結反応緩衝液は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ７．６；５０ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのＮＡＤ＋、および１０ｍＭのジチオトレイトールから成る。
【００６２】
キットの染色−標識オリゴヌクレオチドは広範囲の長さをもつことができるが、好ましくはそれらの長さは６ないし６０個のヌクレオチドの範囲である。さらに好ましくは、連結キット用のオリゴヌクレオチドは６ないし３０個のヌクレオチドの長さの範囲であり、最も好ましくは、連結キット用のオリゴヌクレオチドは１６ないし２５個のヌクレオチドの長さの範囲である。オリゴヌクレオチドの特定のヌクレオチド配列は勿論、増幅されるように探索される標的配列によって指図される。ＰＣＲ増幅のための具体例において、ＰＣＲプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドの選択は当該分野では、例えばインニスら（上記）、ヒリアーおよびグリーン、ＰＣＲメソッズ・アンド・アプリケーションズ、第１巻、第１２４〜１２８頁（１９９１）等によって良く知られている。
【００６３】
好ましくは、染色−ターミネーターを提供するＤＮＡ配列決定用キットでは、各ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、５−および６−カルボキシフルオレセイン、５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインから成る組から選ばれる染料を用いて別々に標識を付けられる。さらに好ましくは、ジデオキシチミジントリホスフェートは６−カルボキシフルオレセイン（“６−ＦＡＭ”）を用いて標識を付けられ、ジデオキシシチジントリホスフェートは２’，４’，５’．７−テトラクロロ−５−カルボキシフルオレセイン（“５−ＺＯＥ”を用いて標識を付けられ、ジデオキシアデノシントリホスフェートは２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロ−５−カルボキシフルオレセイン（“５−ＨＥＸ”）を用いて標識を付けられ、そしてジデオキシグアノシントリホスフェートは１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４，７−ジクロロ−５−カルボキシフルオレセイン（“５−ＮＡＮ”）を用いて標識を付けられる。ジデオキシアデノシンは２’，３’−ジデオキシ−７−デアザアデノシンを含み、そしてジデオキシグアノシンは２’，３’−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２’，３’−ジデオキシ−７−デアザイノシンを含み、そしてジデオキシチミジンは２’，３’−ジデオキシウリジンを含むと解される。通常、ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートは連結基によって標識を付けられる。好ましくは、連結基は２’，３’−ジデオキシシチジンまたは２’，３’−ジデオキシウリジンの５番目の炭素を染料の５または６番目の炭素に連結し、そして連結基は２’，３’−ジデオキシ−７−デアザアデノシンまたは２’，３’−ジデオキシ−７−グアノシン−または２’，３’−ジデオキシ−７−デアザイノシンの７番目の炭素を染料の５または６番目の炭素に結合する。好ましくは、連結基はカルボキシアミノアルキニルであり、そして最も好ましくは、連結基は３−カルボキシアミノ−１−プロビニルである。
【００６４】
好ましくは、染料−ターミネーターを提供するＤＮＡ配列決定用キットにおいて、核酸ポリメラーゼはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）である。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
（４．７−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセイン（“ＡＬＦ”））
０．５８ｇの３，６−ジクロロトリメリット酸、０．７２ｇのレゾルシノール、０．５ｍｌの儂硫酸、および３ｍｌのプロピオン酸をアルゴン下に１２時間還流した。反応混合物を１５０ｍｌの水に注入し、沈澱物を乾燥し、３ｍｌのビリジンに入れ、２ｍｌの無水酢酸塩で１時間アセチル化した。アセチル化混合物は１００ｍｌの酢酸エチルに入れ、１Ｎの塩酸、水で洗浄し、蒸発乾固した。残渣を１５ｇのシリカゲルに置き、５０ｍｌの酢酸エチルで、次いで４：１の酢酸エチル：メタノールで溶出した。約０．２のＲｆ（４：１の酢酸エチル：メタノール／シリカゲル）でＵＶ活性物質を含有する画分を蒸発乾燥させた。この残渣を１０ｍｌのメタノールに溶解し、次いで１ｍｌの４Ｎ水酸化ナトリウムを添加した。１０分後、反応混合物を２００ｍｌに水で希釈し、次いで０．５ｍｌの濃塩酸を添加した。全混合物を２００ｍｌの酢酸エチルで抽出し、その後酢酸エチルを硫酸ナトリウムで乾燥させ蒸発乾固させて１０２ｍｇの黄緑色の固体を得た。
【００６６】
（実施例２）
（４，７−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）） エステル
実施例１からの１３．７ｍｇのフルオレセイン、３．３ｍｇのＮＨＳ、６．４ｍｇのＤＣＣ、および１ｍｌの酢酸エチルを０．５時間攬拌した。固体を濾過し、そして上澄液を３回１：１のブライン：水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させて１５ｍｇのＮＨＳエステルを得た。
【００６７】
（実施例３）
（４，７−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドの結合）
実施例２からの５ｍｇのＮＨＳエステルを２０μｌのＤＭＳＯに溶解した；３μｌのこの溶液を２０μｌの１．０ｍｎの５’−アミノヘキシルホスフェートオリゴヌクレオチド（１８量体）水溶液および１０μｌの１Ｍ重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０から成る溶液に添加した。暗所で１時間後、溶液を１０ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５（ｍｅｄｉｕｍ）カラムに０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液、ｐＨ７．０を用いて通過させた。排除容量で溶出する着色物質のバンドを収集した。逆相ＨＰＬＣは、ＤＮＡに結合した染料の５−および６−異性体に対応する２本の主要な蛍光ピークを示した。このビークを集め、ｐＨ８．０での５０％尿素における蛍光スペクトルは５２８ｎｍでの発光最大値と３４ｎｍのハーフマックスでの全幅を示した。
【００６８】
（実施例４）
（２’，７’−ジメトキシ−５−（および６−）カルボキシ４，７−ジクロロフルオレセイン（“ＢＵＢ”））
次の物質および分量に変えた以外は実施例１の方法に従った：１．４７ｇの４−メトギシレゾルシノール、０．６０ｇの３，６−ジクロロトリメリット酸、０．２ｍｌの濃硫酸、および４ｍｌのプロピオン酸。この方法は０．１８０ｇの４，７−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインを生成した。
【００６９】
（実施例５）
（２’，７’−ジメトキシ−５−（および６−）カルボキシ４，７−ジクロロフルオレセインＮＨＳエステル）
１８ｍｇのこの染料ＮＨＳエステルは実施例４からの１８ｍｇの染料、３．５ｍｇのＮＨＳ、６．４ｍｇのＤＣＣ、および２ｍｌの酢酸エチルを用いて実施例２と同様に調製した。
【００７０】
（実施例６）
（４，７−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドとの結合）
実施例５の染料ＮＨＳエステルを用いて実施例３の方法に従った。逆相ＨＰＬＣの間に集められた２本のピークの蛍光スペクトルはｐＨ８．２での５０％尿素において５４４ｎｍでの発光最大値と３７ｎｍのハーフマックスでの全幅を示した。
【００７１】
（実施例７）
（２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“ＬＯＵ”））
この染料は実施例４の染料および水性水酸化ナトリウムの次亜塩素酸ナトリウム溶液から調製された。
【００７２】
（実施例８）
（４，７−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインＮＨＳエステル）
１．１ｍｇのこの染料ＮＨＳエステルを実施例７からの０．７ｍｇの染料、０．４５ｍｇのＮＨＳ，０．７ｍｇのＤＣＣ、および０．２ｍｌの酢酸エチルから実施例２のように調製した。
【００７３】
（実施例９）
（４，７−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドとの結合）
この実施例の染料オリゴヌクレオチド結合体を実施例８からの染料ＮＨＳエステルを用いて実施例３と同様に調製した。逆相ＨＰＬＣの間に集められた２本のピークの蛍光スペクトルはｐＨ８．２での５０％尿素において５５８ｎｍでの発光最大値と３８ｎｍのハーフマックスでの全幅を示した。
【００７４】
（実施例１０）
（１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“ＮＡＮ”））
まず、３，６−ジクロロトリメトリット酸トリクロリドを調製した：０．５ｇの３，６−ジクロロトリメリット酸と１．３ｇの五塩化リンの混合物を１３０℃で４０分間加熱した。混合物を室温まで冷却し氷に注いだ。次いで混合物を４０ｍｌのエーテルで抽出し、有機画分を２回１５ｍｌの水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、透明油（０．７ｇ）まで濃縮した。酸トリクロリドをさらに精製しないで使用した。ＮＡＮを次のように調製した：２．７ｇの１，３−ジヒドロキシナフタレン、２．８４ｇの３，６−ジクロロトリメリット酸トリクロリド、および８ｍｌのプロピオン酸の混合物を２時間還流した。水（５０ｍｌ）および酢酸エチル（５０ｍｌ）を添加した。相を分離して、有機相を３回５０ｍｌの１ＭのＮａＨＣＯ３で抽出した。水溶液を沸点まで加熱して濃ＨＣｌで酸性にした。得られた赤色固体（０．２ｇ）を濾過し乾燥した。
【００７５】
（実施例１１）
（１’，２’，７’，８−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“ＤＥＢ”））
２０ｍｇのＮＡＮ、水酸化ナトリウム（１５％溶液３４μｌ）、水（１ｍｌ）、および次亜塩素酸ナトリウム（５％溶液１７０μｌ）を一緒にした。逆相ＨＰＬＣは９２％の反応を示した。溶液をＨＣｌで酸性にして、２０ｍｌの酢酸エチルで抽出し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、２０ｍｇまで濃縮した。固体をシリカゲルカラム（径１“×高さ２”）のクロマトグラフィーによって６００：６０：１６の塩化メチレン：メタノール：酢酸で溶出して精製した。染料溶液を濃縮し、希ＨＣｌおよび酢酸エチルを添加した。有機相を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、２０ｍｇのＤＥＢまで濃縮した。
【００７６】
（実施例１２）
（１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインＮＨＳエステルの生成）
ＮＡＮ（１０ｍｇ）を２ｍｌの酢酸エチルに溶解し、ＮＨＳ（１０ｍｇ）とＤＣＣ（５ｍｇ）を添加した。２０分後、溶液は暗赤色になり、結晶固体が現れた。６００：６０：１６の塩化メチレン：メタノール：酢酸を用いたシリカゲルの薄層クロマトグラフィーはＮＨＳエステルに完全に転換したことを示した。酢酸エチル溶液を希ＨＣｌで洗浄し、乾燥（ＮａＳＯ４）して赤色固体（１５ｍｇ）まで濃縮した。
【００７７】
（実施例１３）
（ＤＮＡ配列分析において染料標識プライマーとしてＡＬＦ−、ＢＵＢ−、ＬＯＵ−、およびＮＡＮ−オリゴヌクレオチ）
結合体を使用 染料の全フルオレセインセットを使用してアプライド・バイオシステムズ（フォスター・シテイ、ＣＡ）モデル３７０Ａ自動化ＤＮＡシーケンサーを用いてチェイン・ターミネーター法でＤＮＡフラグメントに標識を付けた。製造業者のプロトコル（参考文献として組み込まれるユーザー・ブレタン・ＤＮＡシーケンサーモデル３７０、発行第２号、１９８７年８月２日）に従って、Ｍ１３中の未知のＤＮＡを増幅してゲル電気泳動分離のための別々に標識を付けたＤＮＡフラグメントを調製した。染料標識プライマーは上記実施例に記載されたように調製した。即ち、各染料のＮＨＳエステルを調製し、５’−アミノヘキシル誘導化Ｍ１３ユニバーサルプライマー（５’−ＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ−３’（配列番号１））と反応させ４つに分かれるジデオキシ反応混合物に対する染色標識プライマーを生成した。次の変更は標準プロトコルでなされた：ジデオキシシチジン反応においてプライマーに標識を付けた５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、ジデオキシアデノシン反応においてプライマーに標識を付けた２’，７’−ジメトキシ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、ジデオキシグアノシン反応においてプライマーに標識を付けた２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、ジデオキシチミジン反応においてプライマーに標識を付けた１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、各反応からの標識を付けたＤＮＡフラグメントをゲルに装填するために次のモル比で一緒にした：１：４：２ｄｄＣ反応：ｄｄＡ反応：ｄｄＧ反応：ｄｄＴ反応、そして検出は５３５、５５０、５６５、および５８０ｎｍに中心がある１０−ｎｍバンドパスフィルターを用い改良フィルターホイールで行った。
【００７８】
（実施例１４）
（ＤＮＡ配列分析において染料−標識プライマーとしてＡＬＦ−、ＢＵＢ−、ＤＥＢ−、およびＮＡＮ−オリゴヌクレオチド結合を使用）
次のことを除いて、実施例１３に記載したと同様の方法に従った：（ｉ）ジデオキシグアノシン反応においてプライマーに標識を付けた１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、（ｉｉ）各反応からの標識を付けたＤＮＡフラグメントをゲルに装填するために次のモル比で一緒にした：１：１：２：１５ｄｄＣ反応：ｄｄＡ反応：ｄｄＧ反応：ｄｄＴ反応、そして（ｉｉｉ）５ｎｍバンドパスフィルターは５４０、５６０、５８０、および６１０ｎｍに中心があった。
【００７９】
（実施例１５）
（２’，７’−ジクロロ−５−（および６）−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“５−（および６−）ＴＥＴ”））
４−クロロレゾルシノール（１０ｇ）、４，７−ジクロロトリメリット酸（１０ｇ）、およびメタンスルホン酸（３０ｍｌ）の混合物を一緒にして２時間１４０〜１５０℃まで加熱した。赤色混合物を水（１００ｍｌ）に注ぎ酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出した。有機相を２回希塩酸で洗浄し、金褐色固体（１９ｇ）に濃縮した。ピリジン（４０ｍｌ）と無水酢酸（１０ｍｌ）を固体に添加し混合物を０．５時間還流した。溶液を１時間４℃で冷却させた。
【００８０】
結晶を濾過して分離し、白色固体（５．４ｇ）を生成した。少部分の加水分解（０．０２ｍｌの０．１Ｎ ＮａＣｌおよび０．０２ｍｌのエタノールを２ｍｇの固体に添加）続いて逆相ＨＰＬＣの分析で固体は９２：８の比の異性体（６−カルボキシＴＥＴ：５−カルボキシＴＥＴ）を含有することを示した。２回目の再結晶はジアセテート（９９：１比）としてほぼ純粋な異性体染料を与えた。５−ＴＥＴは濾液からの５−ＴＥＴのジアセテートの加水分解、次にアセトニトリルからの再結晶によって回収された。
【００８１】
水酸化ナトリウム（３ｇ）と水（１０ｍｌ）を６−ＴＥＴジアセテート（８．６ｇ）（ＨＰＬＣカラムから２本のピークの最初のものとして得られた）に添加した。追加の水（５０ｍｌ）を溶液が均質になるまで添加した。暗赤色溶液に濃ＨＣｌ（１５ｍｌ）を添加した。黄色の沈澱が形成された。混合物を酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出した。有機相を淡黄色のほぼ無色の固体（７．４ｇの６−ＴＥＴ）に濃縮した。
【００８２】
（実施例１６）
（２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（“５−および６−ＨＥＸ”））
磁気攬拌棒を備えた１リットルのエルレンマイヤーフラスコに５−または６−ＴＥＴ（６．３ｇ）および１Ｍの炭酸塩／重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．４（６０ｍｌ）を添加した。家庭用漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム、５０ｍｌ）を２０分かけて滴下した。反応の進行を逆相ＨＰＬＣでモニターした。全部で６７ｍｌの漂白剤を添加した。濃ＨＣｌ（１５ｍｌ）で溶液を酸性にして酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出した。有機相を明黄色固体（７．３ｇ）まで儂縮した。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１（１Ｈ）；７．４（２Ｈ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【公開番号】特開２０１１−１６２５４８（Ｐ２０１１−１６２５４８Ａ）
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４８４０（Ｐ２０１１−５４８４０）
【出願日】平成２３年３月１１日（２０１１．３．１１）
【分割の表示】特願２００８−１７７２５３（Ｐ２００８−１７７２５３）の分割
【原出願日】平成５年９月１日（１９９３．９．１）
【出願人】（３１０００９７７５）アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー (19)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１１日（２０１１．３．１１）
【分割の表示】特願２００８−１７７２５３（Ｐ２００８−１７７２５３）の分割
【原出願日】平成５年９月１日（１９９３．９．１）
【出願人】（３１０００９７７５）アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー (19)
【Ｆターム（参考）】
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