切断可能な対応付け分子およびそれを用いるスクリーニング方法
核酸ライブラリーから、標的物質と相互作用するタンパク質をコードする核酸をスクリーニングする方法であって、前記核酸ライブラリーから、タンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結されている対応付け分子のライブラリーを製造する工程、前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、標的物質に結合した対応付け分子を分離する工程、選択された対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させる工程、および、遊離した核酸を回収する工程を含む前記方法。この方法により、標的物質に特異的に結合した対応付け分子を高効率でスクリーニングできる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、対応付け分子およびそれを用いるスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
進化分子工学やゲノム機能解析において、タンパク質、核酸、その他の生体分子と相互作用する未知のタンパク質をコードする核酸を、種々の生物や組織に由来する核酸ライブラリーや人工的に合成された核酸ライブラリーの中から効率的に選択するために、タンパク質の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）選択の応用が期待されている。タンパク質の試験管内選択を実現するために、タンパク質（表現型）とそれをコードする核酸（遺伝子型）とを連結した分子を用いる方法が提案されている。この分子は、タンパク質とそれをコードする核酸との連結により表現型と遺伝子型が対応付けられているため、対応付け分子と呼ばれる。対応付け分子としては、ＳＴＡＢＬＥ法（特許文献１、非特許文献１）によるもの、試験管内ウイルス法（特許文献２、非特許文献２、特許文献３）によるものが知られている。
生体分子等の標的物質と相互作用するタンパク質の試験管内での選択は、固相に固定化した標的物質にタンパク質を結合させた後、結合したタンパク質を回収することによって行われている。この選択方法においては、固相または標的物質に非特異的に結合したタンパク質の存在が選択効率に大きく影響するため、非特異的な結合による夾雑分子を減少させる方法が提案されている。例えば、標的物質がタンパク質の場合、標的タンパク質のＣ末端側に、カルモジュリン結合タンパク質、配列特異的なプロテアーゼの切断部位、および、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン（ＺＺドメイン）を融合させた融合タンパク質を用い、１段目のスクリーニングでは、融合タンパク質のＺＺドメインをＩｇＧ結合ビーズに吸着結合させることにより固相化し、配列特異的なプロテアーゼの切断により標的タンパク質とそれに結合するタンパク質とを含む複合体を溶出し、２段目のスクリーニングでは、融合タンパク質のカルモジュリン結合タンパク質をカルモジュリン固定化ビーズに結合させることにより固相化し、ＥＤＴＡ等のカルシウムキレート剤により標的タンパク質とそれに結合するタンパク質とを含む複合体を溶出するタンデムアフィニティー精製法が知られている（非特許文献３）。
【非特許文献１】 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４５７，２２７（１９９９）
【特許文献１】 特開２００１−１２８６９０
【特許文献２】 国際公開第ＷＯ ９８／１６６３６号パンフレット
【非特許文献２】 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４１４，４０５（１９９７）
【特許文献３】 国際公開第ＷＯ ０２／４８３４７号パンフレット
【非特許文献３】 Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７，１０３０（１９９９）
【発明の開示】
スクリーニングされる物質が対応付け分子である場合、タンパク質に核酸が結合しているため、タンパク質と標的物質との相互作用の他に、核酸と固相や標的物質との間の非特異的な結合によって、標的物質に特異的に結合しない対応付け分子もスクリーニングされることがある。そのため、対応付け分子を用いる場合には、従来の方法とは異なる原理に基づく、非特異的な夾雑分子を減少させる方法の提供が望まれる。
従って、本発明の課題は、固相や標的物質に対して非特異的に結合した対応付け分子の夾雑を減少させ、標的物質に特異的に結合した対応付け分子を高効率でスクリーニングできる、対応付け分子のスクリーニング方法を提供することである。
本発明者らは、対応付け分子が進化分子工学やゲノム機能解析においてスクリーニングされる場合、核酸の部分が次の工程に使用されることに着目し、研究を行った結果、タンパク質とそれをコードする核酸とを特定のリンカーを介して連結させ、そのリンカーの切断により核酸のみを遊離させることで、対応付け分子のスクリーニングに伴う上記の課題が解決できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のものを提供する。
（１）タンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結されている対応付け分子。
（２）前記リンカーが、長波長紫外線により切断可能なリンカーである（１）の対応付け分子。
（３）（１）または（２）の対応付け分子からなるライブラリー。
（４）タンパク質をコードする核酸を転写および／または翻訳したときに翻訳されたタンパク質と前記核酸とが連結されるように構築された前記核酸を準備し、準備した核酸を無細胞タンパク質合成系または生細胞を用いて転写および／または翻訳することにより、前記タンパク質と前記核酸とを連結する対応付け分子の製造方法において、
前記核酸を転写および／または翻訳したときに、前記タンパク質と前記核酸とが、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結されるように前記核酸が構築されている、（１）の対応付け分子の製造方法。
（５）核酸ライブラリーを構成する各核酸から（４）の製造方法により対応付け分子を製造することを含む、対応付け分子のライブラリーの製造方法。
（６）核酸ライブラリーから、標的物質と相互作用するタンパク質をコードする核酸をスクリーニングする方法であって、
前記核酸ライブラリーから、（５）の製造方法により対応付け分子のライブラリーを製造する工程、
前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、
標的物質に結合した対応付け分子を分離する工程、
分離した対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させる工程、および、
遊離した核酸を回収する工程
を含む前記方法。
【図面の簡単な説明】
図１は、開裂型リンカーを含む対応付け分子を用いたスクリーニング方法の説明図である。
図２は、長波長紫外線（励起ピーク：３６５ｎｍ）の照射による対応付け分子からの遺伝子型分子の遊離方法の説明図である。
図３は、長波長紫外線の照射による対応付け分子からの遺伝子型分子の遊離実験の結果を示す図（電気泳動写真）である。レーン１〜６はフルオレセインおよびＰＣＢラベル化したＤＮＡを用いた場合である。レーン７〜１２はフルオレセインおよびビオチンラベル化したＤＮＡを用いた場合である。
図４は、無細胞転写・翻訳系におけるＰＣＢラベル化したＤＮＡの対応付け分子の形成を電気泳動により確認した結果を示す図（電気泳動写真）である。レーン１は対応付け分子を形成させた場合である。レーン２はタンパク質合成を阻害し、対応付け分子を形成させなかった場合である。
図５は、ｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞とＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ対応付け分子を結合させ、長波長紫外線の照射により遺伝子型分子であるｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡを溶出した実験結果を示す図（電気泳動写真）である。レーン１、３はｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた場合、レーン２、４はＭｏｃｋ／Ｃｈｏ−Ｋ１細胞を用いた場合である。また、レーン５は結合操作前のサンプルＡである。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、本明細書において引用した全ての文献の記載は本明細書の一部を構成するものである。
＜１＞本発明の対応付け分子
本発明の対応付け分子は、タンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカー（本明細書では「開裂型リンカー」ともいう）を介して連結されていることを特徴とする。本発明の対応付け分子は、開裂型リンカーを介してタンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが連結されている他は、通常の対応付け分子の構成と同様でよい。
対応付け分子のライブラリーも同様である。すなわち、対応付け分子として本発明の対応付け分子を用いることの他は、通常の対応付け分子からなるライブラリーの作成方法に従って作成することができる。例えば、進化分子工学では、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１，１１−１５）、Ｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１０７４７−１０７５１）、ＤＮＡシャッフリング、変異ライブラリー（柳川弘志、辻 融，「変異ＤＮＡライブラリーの構築方法」、ＷＯ ０２／２６９６４）などの方法を使って構築したライブラリーなどを、ゲノム機能解析では、ランダムプライミングやｄＴプライミングにより構築したｃＤＮＡライブラリーなどを鋳型として用いることにより対応付け分子のライブラリーを作成することができる。
＜１−１＞対応付け分子における開裂型リンカーの他の構成
核酸は、対応付け分子の態様に応じてＤＮＡおよびＲＮＡのいずれでもよい。また、タンパク質は、対応付け分子の態様に応じて融合タンパク質とされていてもよい。
タンパク質と核酸とが連結されているとは、タンパク質と核酸とが、その他の分子を介して連結されていることも包含し、また、それらの相互間の結合は、共有結合、生体分子が持つ親和力による結合等の非共有結合のいずれでもよい。生体分子が持つ親和力による結合の例としては、抗原と抗体との結合、ホルモンと受容体との結合、ＤＮＡとＤＮＡ結合蛋白質との結合等が挙げられる。
対応付け分子の例としては、ＳＴＡＢＬＥ法（特許文献１、非特許文献１）によるもの、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ウイルス法（特許文献２、非特許文献２、ＷＯ ０３／０６２４１７、ＷＯ ９８／３１７００）によるものが挙げられる。以下、具体例を説明する。
（ａ）ＳＴＡＢＬＥ法による対応付け分子
ＳＴＡＢＬＥ法による対応付け分子は、機能解析、機能改変等の対象となるタンパク質（被標的タンパク質）とアダプタータンパク質との融合タンパク質と、該融合タンパク質をコードし、かつリガンドが結合したＤＮＡとが、該アダプタータンパク質と該リガンドとの結合を介して連結されることによって構成されている。
被標的タンパク質は、天然タンパク質またはその変異体、及び人工タンパク質またはその変異体の何れでもよい。天然タンパク質としては、種々の生物の器官、組織または細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーから転写翻訳される多様性を有するタンパク質のライブラリーを含むものである。人工タンパク質としては、天然タンパク質の全てもしくは部分配列を組み合わせた配列、またはランダムなアミノ酸配列を含むものである。
アダプタータンパク質とは、ある分子（リガンド）と特異的に結合する能力を有するタンパク質を意味し、これらの中には、結合タンパク質、受容体を構成する受容体タンパク質、抗体等も含まれる。リガンドとは、アダプタータンパク質に特異的に結合する分子を意味する。アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合蛋白質／ビオチン、マルトース結合蛋白質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルまたはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、またはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール等の各種受容体タンパク質／そのリガンド等が挙げられる。
これらの中で、アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルまたはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）等が好ましく、特に、ストレプトアビジン／ビオチンが最も好ましい。
この態様で用いる融合タンパク質をコードするＤＮＡにおいては、通常、その一方の末端にリガンドが結合している。該ＤＮＡの末端に結合したリガンドと該ＤＮＡにより発現される融合タンパク質中のアダプタータンパク質部分との結合を介して、融合タンパク質とＤＮＡとが物理的に連結される。
この態様の対応付け分子は、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡを、無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することにより製造できる。好ましくは、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡのライブラリーを、該ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡが、一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することにより製造される。
（ｂ）試験管内ウイルス法による対応付け分子
試験管内ウイルス法による対応付け分子は、機能解析、機能改変等の対象となるタンパク質を含む表現型分子と、該タンパク質をコードする核酸を含む遺伝子型分子とが結合してなる。遺伝子型分子は、タンパク質をコードする領域を、その領域の塩基配列が翻訳され得るような形態で有するコード分子と、スペーサー分子とが結合してなる。
この態様におけるスペーサー分子は、核酸の３’末端に結合できるドナー領域と、ドナー領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域と、ＰＥＧ領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを含む。ＰＥＧ領域はなくてもよい。
核酸の３’末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。
ドナー領域の５’末端の配列は、ライゲーション効率を左右する。コード分子とスペーサー分子をライゲーションさせるためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）または２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（ＵまたはＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
ＰＥＧ領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、ＰＥＧ領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が２０塩基以下、または、ポリエチレングリコールの平均分子量が４００以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が１０塩基以下、または、ポリエチレングリコールの平均分子量が１０００以上であることを意味する。
ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、４００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜８，０００である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約４００より低いと、このスペーサー分子に由来するスペーサー部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Ｌｉｕ，Ｒ．，Ｂａｒｒｉｃｋ，Ｅ．，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３１８，２６８−２９３）、分子量１０００以上、より好ましくは２０００以上のＰＥＧを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量１０００以上で良好であり、分子量４００以下ではＤＮＡスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドまたはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、または、ピューロマイシンもしくはその誘導体と１残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とはタンパク質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、ＰＡＮＳ−アミノ酸、ＡＡＮＳ−アミノ酸などが挙げられる。
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、５’側に１残基以上のＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ，Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ ２２３，３７４−３７７）が適当である。塩基の種類としては、Ｃ＞（ＵまたはＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
スペーサー分子は、ドナー領域とＰＥＧ領域との間に、少なくとも１つの機能付与ユニットを含むことが好ましい。機能付与ユニットは、好ましくは、少なくとも１残基のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの塩基に機能修飾を施したものである。例えば、機能修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、またはＨｉｓ−ｔａｇなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。
この態様におけるコード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、タンパタ質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列及びその５’側に制限酵素ＸｈｏＩが認識する配列を含む３’末端領域を含む核酸である。
コード分子は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＲＮＡの場合、５’末端にＣａｐ構造があってもなくても良い。また、コード分子は任意のベクターやプラスミドに組み込まれたものとしてもよい。
３’末端領域は、ＸｈｏＩ配列とその下流にポリＡ配列を含む。スペーサー分子とコード分子とのライゲーション効率に影響を与える要素としては３’末端領域のポリＡ配列が重要であり、ポリＡ配列は、少なくとも２残基以上のｄＡおよび／またはｒＡの混合または単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリＡ連続鎖である。
コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる５’非翻訳領域、および、ポリＡ配列を含む３’末端領域の組み合わせがある。３’末端領域のポリＡ配列の効果は通常には１０残基以下で発揮される。５’非翻訳領域の転写プロモーターはＴ７／Ｔ３またはＳＰ６などが利用でき、特に制限はない。好ましくはＳＰ６であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はＳＰ６を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、ＴＭＶのオメガ配列の一部（Ｏ２９；Ｇａｌｌｉｅ Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８、および、ＷＯ ０２／４８３４７の図３参照）を含んだものが好ましい。
また、翻訳効率に関し、３’末端領域においては、ＸｈｏＩ配列とポリＡ配列の組み合わせが重要となる。また、ＯＲＦ領域の下流部分、すなわちＸｈｏＩ配列の上流に親和性タグがついたものとポリＡ配列の組み合わせも重要となる。親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列である。ポリＡ配列効果としては、Ｆｌａｇ−ｔａｇ等の親和性タグにＸｈｏＩ配列がついたものとそこへさらにポリＡ配列がついたものの翻訳効率が上昇する。この翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。
ＯＲＦ領域については、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、または、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。また、コード分子の５’非翻訳領域をＳＰ６＋Ｏ２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’非翻訳領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、５’非翻訳領域と３’末端領域をもったコード分子を簡単に作成できる。コード分子において、翻訳はＯＲＦ領域を超えてされてもよい。すなわち、ＯＲＦ領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
この態様におけるコード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列を含む３’末端領域を含む核酸である。
遺伝子型分子を構成するコード分子は、ＸｈｏＩ配列を有することが好ましい。
遺伝子型分子は、上記コード分子を、必要により、タンパク質をコードする領域の塩基配列が翻訳され得るような形態に変換した後（例えば、転写した後）、コード分子の３’末端と、スペーサー分子のドナー領域を、通常のリガーゼ反応により結合させることにより製造できる。反応条件としては、通常、４〜２５℃で４〜４８時間の条件が挙げられ、ＰＥＧ領域を含むスペーサー分子のＰＥＧ領域内のポリエチレングリコールと同じ分子量のポリエチレングリコールを反応系に添加する場合には、１５℃で０．５〜４時間に短縮することも可能である。
スペーサー分子とコード分子の組み合わせはライゲーション効率に重要な効果をもたらす。アクセプターにあたるコード分子の３’末端領域において、少なくとも２残基以上、好ましくは３残基以上、さらに好ましくは６〜８残基以上のＤＮＡおよび／またはＲＮＡのポリＡ配列があること、さらに、５’非翻訳領域の翻訳エンハンサーとしては、オメガ配列の部分配列（Ｏ２９）が好ましく、スペーサー分子のドナー領域としては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）または２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。このことによって、ＲＮＡリガーゼを用いることでＤＮＡリガーゼのもつ問題点を回避し、かつ効率を６０〜８０％に保つことができる。
（ａ）転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列を含む３’末端領域を含むＲＮＡであるコード分子の３’末端と、（ｂ）上記スペーサー分子のドナー領域であってＲＮＡからなるものとを、スペーサー分子内のＰＥＧ領域を構成するポリエチレングリコールと同じ分子量をもつ遊離のポリエチレングリコールの存在下で、ＲＮＡリガーゼにより結合させることが好ましい。
ライゲーション反応時に、ＰＥＧ領域を含むスペーサー分子のＰＥＧ領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することによって、スペーサー分子のポリエチレングリコールの分子量によらずライゲーション効率が８０〜９０％以上に向上し、反応後の分離工程も省略することができる。
この態様の対応付け分子は、上記の遺伝子型分子を無細胞翻訳系で翻訳することにより、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のＯＲＦ領域によりコードされたタンパク質である表現型分子と連結することができる。無細胞翻訳系は、好ましくは、小麦胚芽またはウサギ網状赤血球のものである。翻訳の条件は通常に採用される条件でよい。例えば、２５〜３７℃で１５〜２４０分の条件が挙げられる。
＜１−２＞開裂型リンカー
本発明の対応付け分子に用いられる開裂型リンカーは、前記コード分子中の核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーである。核酸の塩基配列が変化しないとは、核酸が切断されたり、その塩基が改変されたりすることがなく、遊離したコード分子中の核酸の塩基配列が、その対応付け分子の表現型分子であるタンパク質をコードする塩基配列を保持することを意味する。
このような開裂型リンカーの例を表１に示す。なお、表中の括弧内にその切断方法を示す。
このようなリンカー自体およびその切断方法は、当業者に知られているので、対応付け分子に使用したときに、コード分子中の核酸の塩基配列を変化させない切断条件を設定し、その条件で切断できるものを選択することは当業者であれば容易である。例えば、光開裂型リンカーの場合には、核酸は短波長の紫外線の照射により損傷を受けるため、核酸に損傷を与えない長波長紫外線の照射により切断できるものが選択される。また、ＤＮＡ型リンカー、ＲＮＡ型リンカーおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド型リンカーの場合には、タンパク質をコードする核酸が分解されないようにヌクレアーゼの種類および反応条件を選択する。
本発明において、開裂型リンカーは、好ましくは、光開裂型リンカーである。上述のように、光開裂型リンカーは、長波長紫外線の照射により切断することができるものであればよい。ここで長波長紫外線とは、照射したときに、コード分子中の核酸の塩基配列を変化させない波長の紫外線を意味し、通常には３００〜４００ｎｍ、好ましくは３１０〜３６０ｎｍの波長の紫外線である。光開裂リンカーは、タンパク質と標的物質との特異的結合および標的物質や固相と核酸との非特異的結合を含めて、結合に影響を与える可能性が低いので、特異的に結合した対応付け分子の、コード分子中の核酸だけを遊離させる可能性が高いため、特に好ましい。
長波長紫外線で切断できる光開裂型リンカーとして、具体的には、例えば、α−置換−２−ニトロベンジル基の構造を持つもの等が挙げられる。α置換基として、（ｉ）水酸基と反応するホスホアミダイト、（ｉｉ）アミノ基と反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドカルボネート、（ｉｉｉ）チオール基と反応するハロゲン等が挙げられる。上記（ｉ）に記載の光開裂型リンカーとしては、ＰＣビオチンホスホアミダイト、ＰＣアミノ修飾ホスホアミダイト、ＰＣスペーサーホスホアミダイト（いずれも商品名、グレンリサーチ社製）等が挙げられる。
対応付け分子における開裂型リンカーの位置は、タンパク質とコード分子中の核酸との間であって、切断が可能な限り、特に制限されず、対応付け分子の態様および開裂型リンカーの種類に応じて適宜選択される。例えば、ＳＴＡＢＬＥ法による対応付け分子の場合には、融合タンパク質をコードするＤＮＡとリガンドとの間に開裂型リンカーを位置させることができる。また、試験管内ウイルス法による対応付け分子の場合には、開裂型リンカーをスペーサー分子の構成要素として含ませたり、スペーサー分子とコード分子との間に位置させたりすることができる。
開裂型リンカーが核酸からなる場合には、タンパク質をコードする核酸と一体とされていてもよく、また、開裂型リンカーがペプチドからなる場合には表現型分子としてのタンパク質のＣ末端に融合させていてもよい。
＜２＞本発明の製造方法
本発明の対応付け分子は、タンパク質をコードする核酸からタンパク質を合成したとき、すなわち、コード分子である核酸を転写および／または翻訳したときに、表現型分子としてのタンパク質と遺伝子型分子としての核酸とが開裂型リンカーを介して連結されるように構築された遺伝子型分子である核酸を準備し、準備した核酸を無細胞タンパク質合成系または生細胞を用いて転写および／または翻訳することにより、表現型分子としてのタンパク質と遺伝子型分子としての核酸とを連結して製造される。
無細胞タンパク質合成系は、無細胞翻訳系であっても、無細胞転写翻訳系であってもよく、対応付け分子を構成する核酸の種類に応じて適宜選択される。
例えば、ＳＴＡＢＬＥ法の場合には、上記の少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質をコードする領域を有するＤＮＡに、開裂型リンカーを介してリガンドが結合したＤＮＡを準備し、そのＤＮＡから無細胞転写翻訳系でタンパク質を合成することにより製造される。あるいは、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質をコードする領域を有するＤＮＡに、開裂型リンカーを介してリガンドが結合したＤＮＡのライブラリーを準備し、該ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡから、一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系でタンパク質を合成する。
また、試験管内ウイルス法による対応付け分子の場合には、開裂型リンカーを含むスペーサー分子を用いたり、スペーサー分子とコード分子を開裂型リンカーを介して結合させたり、ＯＲＦの３’末端に開裂型リンカーをコードする配列をコーディング枠が合うように連結させたりすることにより遺伝子型分子を準備すればよい。
遺伝子型分子の製造方法としては、例えば、コード分子のＯＲＦの３’末端側またはスペーサー分子のいずれかに開裂型リンカーを含むように化学合成した後に、＜１−１＞（ｂ）に記載の方法を行うことが挙げられる。化学合成方法は、それ自体既知の方法を適宜選択して用いることができる。
開裂型リンカーを含むコード分子およびスペーサ分子の合成法として、具体的には、例えば、開裂型リンカーとしてα−置換−２−ニトロベンジル基の構造を持つものであって、α置換基として、水酸基と反応するホスホアミダイトを用いる場合には、該リンカーをホスホアミダイトＤＮＡ合成法によりコード分子のＯＲＦの３’末端側またはスペーサー分子のいずれかに導入する方法等が挙げられる。また、α−置換−２−ニトロベンジル基の構造を持つものであって、α置換基として、アミノ基と反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドカルボネートを開裂型リンカーとして用いる場合には、該リンカーをホスホアミダイトＤＮＡ合成法によりコード分子のＯＲＦの３’末端側またはスペーサー分子のいずれかに導入した後、活性エステルで修飾する方法等が用いられる。さらに、α−置換−２−ニトロベンジル基の構造を持つものであって、α置換基として、チオール基と反応するハロゲンを開裂型リンカーとして用いる場合には、該リンカーをホスホアミダイトＤＮＡ合成法によりコード分子のＯＲＦの３’末端側またはスペーサー分子のいずれかに導入する方法等が挙げられる。
また、ＤＮＡ型リンカーを用いる場合には、ヌクレアーゼまたは制限酵素により認識される塩基配列を有する核酸であるＤＮＡ型リンカーを、コード分子のＯＲＦの３’末端側またはスペーサー分子のいずれかに挿入して合成することにより製造することができる。ここで、制限酵素により切断されるＤＮＡは、２本鎖である必要があるため、該ＤＮＡリンカーの塩基配列を有する核酸は、１本鎖ずつ合成してアニーリングさせることにより製造することができる。
また、プロテアーゼで切断されるペプチド型リンカーを用いる場合には、例えば、チオエステル法を用いることで、簡単に、目的のペプチドをコード分子のＯＲＦの３’末端側またはスペーサー分子のいずれかに導入して合成することによりコード分子、スペーサー分子を作製することができる。
生細胞としては、原核または真核生物例えば大腸菌の細胞などが使用できる。
タンパク質をコードする核酸を転写および／または翻訳したときに、タンパク質と核酸とが開裂型リンカーを介して連結されるように構築された核酸は、無細胞タンパク質合成系で核酸を転写および／または翻訳したとき、タンパク質と核酸とが開裂型リンカーを介して連結されるように構築されたものであることが好ましい。無細胞タンパク質合成系でタンパク質をコードする核酸を転写および／または翻訳したときに、タンパク質と核酸とが開裂型リンカーを介して連結されるように構築された核酸は、生細胞を用いた場合でも無細胞タンパク質合成系を用いた場合と同様に転写および／または翻訳されると考えられる。
無細胞タンパク質合成系または生細胞を用いて転写および／または翻訳することにより得られた対応付け分子は、必要により精製してもよい。
本発明の対応付け分子のライブラリーは、核酸ライブラリーの核酸の集合体に対し、すなわち、核酸ライブラリーの各核酸に対し、上記の本発明の製造方法を適用することにより製造することができる。
＜３＞本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、核酸ライブラリーから、標的物質と相互作用するタンパク質をコードする核酸をスクリーニングする方法であって、前記核酸ライブラリーから、本発明の製造方法により対応付け分子のライブラリーを製造する工程、前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、標的物質に結合した対応付け分子を分離する工程、分離した対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させる工程、および、遊離した核酸を回収する工程を含む。
標的物質としては、タンパク質（ペプチド、抗体などを含む）、ヌクレオチドなどが挙げられる。相互作用の測定は、標的物質の種類に適合した方法により行うことができる（例えば、Ｒｉｇａｕｔ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，１０３０−１０３２）。
対応付け分子のライブラリーと標的物質との混合は、対応付け分子の被標的タンパク質が標的物質と相互作用する条件で混合すればよい。この条件は、検出しようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。
標的物質に結合した対応付け分子の分離は、標的物質に結合した対応付け分子と、標的物質に結合しない対応付け分子を分離する工程であり、通常には、標的物質を固相に固定化しておくことによって、対応付け分子と混合後の標的分子を固定化した固相を洗浄することにより分離を行うことができる。洗浄の条件は、検出しようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。ここで固相に固定化するとは、対応付け分子と標的物質との結合体が非結合の分子から分離可能になっていることを意味し、例えば、標的物質が膜タンパク質の場合、細胞の細胞膜等に発現した膜タンパク質や人工膜中に埋め込まれたタンパク質も、固相に固定化された標的物質に包含される。
分離した対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させることは、上記に例示したような開裂型リンカーを用い、それに応じた条件で行うことができる。標的物質が固相に固定化されている場合、核酸を遊離させることは、溶出とも呼ばれる。本発明において「遊離」とは「溶出」も包含する意味で用いる。また、遊離される核酸は、核酸の塩基配列が解析可能な限り、改変されたものであってよい。
遊離した核酸の回収は、通常の方法によって行うことができる。例えば、電気泳動により回収する方法、遊離した核酸以外の成分を沈殿させて上清を回収する方法などが挙げられる。
回収された核酸は、機能解析、進化工学などの目的に応じて増幅や配列の解析が行われる。
以下、スクリーニングの例を図１を参照して説明する。この例では、標的分子としてＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、対応付け分子としてＳＴＡＢＬＥ法によるもの（リガンドがビオチン、アダプタータンパク質がストレプトアビジン）が用いられている。
まず、ランダムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどのＤＮＡライブラリーを構成するＤＮＡに対し、ストレプトアビジン遺伝子を、ストレプトアビジンと前記ＤＮＡにコードされるタンパク質とが融合タンパク質として発現されるように連結し、さらに開裂型リンカーを介してビオチンを連結して、前記ＤＮＡから無細胞転写翻訳系で前記タンパク質を合成したときに前記タンパク質と前記ＤＮＡとが開裂型リンカーを介して連結されるように改変されたＤＮＡを準備する。
改変されたＤＮＡを、一ミセルにほぼ一分子のＤＮＡが含まれるように調製した水／油型エマルジョンとした無細胞転写翻訳系で転写翻訳し、融合タンパク質を合成する。そうすると、融合タンパク質の構成要素のストレプトアビジンと、改変ＤＮＡを構成要素のビオチンが結合し、対応付け分子が生成する。
エマルジョンから、対応付け分子を回収し、対応付け分子のライブラリーを得る。対応付け分子を、ＧＰＣＲを細胞膜に発現した細胞と混合する。リンカーを切断することにより、ＤＮＡを遊離させ回収する。
目的に応じて、回収されたＤＮＡの配列解析を行ったり、ＰＣＲにより増幅して再度ビオチンを開裂型リンカーを介して連結し、上記の工程を繰り返したりすることができる。
次に、図２を参照して開裂型リンカーの切断の例を説明する。この例では、図１に示した例において、開裂型リンカーとして長波長紫外線で切断可能な光開裂型リンカーが使用されている。
図２の上図は、対応付け分子が標的物質であるＧＰＣＲに結合した状態を示す。ＧＰＣＲに結合した対応付け分子に、光開裂型リンカーを切断する長波長紫外線を照射すると、図２の下図に示すようにＤＮＡが遊離する。
【実施例】
以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
実施例１ 光開裂型リンカーを含む対応付け分子の紫外線による切断
光開裂型リンカーを介してＤＮＡとタンパク質が連結した分子を形成させた後、長波長紫外線の照射によりＤＮＡとタンパク質が切断・分離されることを確認した。本実施例で用いたＤＮＡとタンパク質とが連結した分子には、ＤＮＡのコードするタンパク質が含まれていないが、紫外線による切断については対応付け分子と同じ挙動を示すと考えられるので、本実施例では、説明の便宜のため、対応付け分子と呼ぶ。
（１）光開裂型リンカーを介してビオチンラベル化したＤＮＡの調製
光開裂型リンカーが結合したビオチン（Ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｂｉｏｔｉｎ：以下、ＰＣＢと略す）はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入した。ストレプトアビジン遺伝子の下流にアンジオテンシンＩＩ遺伝子が融合したｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡ（配列番号１）を鋳型ＤＮＡとして調製した。０．５ｎＭの鋳型ＤＮＡ（配列番号１）、５’末端がＰＣＢラベル化された１μＭのプライマーＴ７Ｆ（配列番号２）、５’末端がフルオレセイン・ラベル化された１μＭのプライマーＴ７Ｒ（配列番号３）、１×Ｅｘ Ｔａｑバッファー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、および１．２５ＵのＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）を含む反応液５０μｌを用いてＰＣＲ（９５℃：１分間→（９８℃：２０秒間、６２℃：３０秒間、７２℃：３０秒間）×２５サイクル→７２℃：１分間→４℃）を行なった。これによりフルオレセインおよびＰＣＢラベル化されたＤＮＡ（以下、ＰＣＢラベル化ＤＮＡと略す）を得た。同様に、ネガティブコントロールとして、５’末端がビオチンラベル化されたプライマーＴ７Ｆを用いて、光開裂型リンカーを含まないフルオレセインおよびビオチンラベル化されたＤＮＡ（以下、ビオチンラベル化ＤＮＡと略す）も調製した。
（２）対応付け分子の形成および長波長紫外線の照射による切断
上記ＰＣＢまたはビオチンラベル化ＤＮＡ（３０ｎＭ）とストレプトアビジン（１μｇ／μｌ；プロメガ社）を等量ずつ混合し、室温で６０分間インキュベートして結合させ、タンパク質とＤＮＡとが連結した対応付け分子を形成させた。紫外線灯（ハンディーランプＸＸ−１５ＢＬＢ；Ｕｌｔｒａ−Ｖｉｏｌｅｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて１５ｃｍの距離から長波長紫外線を２．５分間、５分間、１０分間、および１５分間照射したサンプルを３％シーケムゴールドアガロースゲルにより泳動分離し、イメージアナライザーを用いてフルオレセインの蛍光を検出した。結果を図３に示す。ＰＣＢラベル化されたＤＮＡを用いた場合、高分子量の対応付け分子として検出されていたバンド（図中の「対応付け分子→」で示されている位置）が、長波長紫外線の照射時間に依存して低分子量のバンド（図中の「ＤＮＡ→」で示されている位置）に移行した（レーン１〜５）。一方、光開裂型リンカーを含まないビオチンラベル化ＤＮＡを用いた場合では、高分子量から低分子量への移行は全くみられなかった（レーン７〜１１）。このことから、対応付け分子の中の光開裂型リンカーが長波長紫外線により切断され、対応付け分子から遺伝子型分子であるＤＮＡが遊離されることが確認できた。
実施例２ ＧＰＣＲリガンドペプチドを用いた対応付け分子の無細胞転写・翻訳系における合成
ＧＰＣＲのリガンドとして知られているアンジオテンシンＩＩを用いて、対応付け分子の形成を行なった。９ｎＭの、フルオレセインおよびＰＣＢでラベル化されたｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡ（実施例１で調製したもの）をウサギ網状赤血球由来の無細胞転写・翻訳系（プロメガ社）に加え３０℃で９０分間反応させることによりストレプトアビジン・アンジオテンシンＩＩ融合タンパク質（以下、ＳＴＡ−ＡＴ ＩＩと略す）を合成し、このタンパク質とｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡがストレプトアビジンとビオチンの結合を介して連結した対応付け分子を形成させた。このサンプルを３％シーケムゴールドアガロースゲルにより泳動分離し、イメージアナライザーを用いてフルオレセインの蛍光を検出した。また、タンパク質合成阻害剤である０．２％ヘパリンを加えたコントロール実験を行なった。
図４に、無細胞転写・翻訳系により合成されたＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ対応付け分子の検出結果を示す。タンパク質合成阻害剤であるヘパリンを加えた場合、ストレプトアビジン・アンジオテンシンＩＩ融合タンパク質は合成されないため、フルオレセインおよびＰＣＢラベル化されたｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡのバンド（図中の「ＤＮＡ→」で示されている位置）のみが検出される（レーン２）。一方、ヘパリンを加えていない場合、合成されたストレプトアビジン・アンジオテンシンＩＩ融合タンパク質がＰＣＢラベル化されたｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡに結合するため、高分子量側にシフトしているバンド（図中の「対応付け分子→」で示されている位置）が検出された（レーン１）。この結果から、ＰＣＢラベル化されたＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして無細胞転写・翻訳系でタンパク質を合成することにより、対応付け分子の形成が確認できた。対応付け効率（無細胞転写・翻訳系に加えた全ＤＮＡに対する対応付け分子を形成したＤＮＡの割合）は約８０％であった。
実施例３ ＧＰＣＲ発現細胞を用いたリガンド濃縮実験
ヒト・アンジオテンシンＩＩタイプ１受容体（以下、ｈＡＴ１Ｒと略す）を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、ｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞と略す）を用いて、ＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ対応付け分子の濃縮実験を行なった。
（１）光開裂型リンカーを介してビオチンラベル化したＤＮＡの調製
実施例１と同様の方法で、ＰＣＢラベル化されたｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡ（全長６７０ｂｐ）を得た。また、ネガティブコントロールとして、アンジオテンシンＩＩの代わりに、ｈＡＴ１Ｒとは結合しないバソプレッシンをコードする鋳型ＤＮＡ（配列番号４）を用いて同様にＰＣＲを行ない、ＰＣＢラベル化されたｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡ（全長６０４ｂｐ）を得た。
（２）対応付け分子の形成
１０ｎＭの、ＰＣＢラベル化されたｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡをウサギ網状赤血球由来の無細胞転写・翻訳系に加え３０℃で９０分間反応させることによりストレプトアビジン・アンジオテンシンＩＩ融合タンパク質を合成し、ＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ対応付け分子を形成させた。同様にして、１０ｎＭの、ＰＣＢラベル化されたｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡを鋳型としてストレプトアビジン・バソプレッシン融合タンパク質（以下、ＳＴＡ−ＡＶＰと略す）を合成し、このタンパク質とｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡからなる対応付け分子を形成させた。これらの対応付け分子が含まれる無細胞転写・翻訳系に２０μＭビオチンを等量加えて１５分間反応させ、余分なビオチン結合部位をブロッキングした後、ＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ：ＳＴＡ−ＡＶＰ＝２．４×１０８個：１．２×１０９個＝１：５となるように混合して、下記（４）の濃縮実験に用いた。
（３）ｈＡＴ１Ｒを安定に発現する細胞株の樹立
ｈＡＴ１Ｒ遺伝子をクローニングするため、ヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリー（慶應大・井上純一郎教授より供与）０．０５μｌを、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μｌ、１０μＭのＡＴＦプライマー（配列番号５）２．５μｌ、１０μＭのＡＴＲプライマー（配列番号６）２．５μｌ、５Ｕ／μｌ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．２５μｌと混合し、滅菌水により総容量５０μｌに調整後、ＰＣＲ（９５℃：１分間→（９８℃：２０秒間、５５℃：１分間、７２℃：４分間）×３５サイクル→４℃）を行ない、ｈＡＴ１Ｒ遺伝子断片を得た。このｈＡＴ１Ｒ遺伝子断片をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにより制限酵素処理し、同様に処理したｐＥＦ１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にライゲーションし、ｐＥＦ１−ｈＡＴ１Ｒ−ＭｙｃＨｉｓ（ネオマイシン耐性）を得た。このｐＥＦ１−ｈＡＴ１Ｒ−ＭｙｃＨｉｓをＣＨＯ−Ｋ１細胞へトランスフェクションし、４００μｇ／μｌ Ｇ４１８を加えた培地により選択を行ない、Ｍｙｃエピトープ抗体を用いたウェスタンブロッティングによりｈＡＴ１Ｒを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞を得た。
（４）細胞を用いた結合・濃縮実験
まず、細胞表面に非特異的に吸着する対応付け分子を除去するために、以下の前処理を行なった。受容体を発現していないＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、Ｍｏｃｋ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞と略す）をコンフルエントまで培養した６ｃｍディッシュ内の完全培地を吸引除去し、Ｈａｎｋの平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（以下、ＨＢＳＳと略す）２ｍｌを加えてディッシュ内を洗浄した。結合バッファー（１００μＭ ＧＲＧＤＳ（配列番号７）、１ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子（Ｓｏｎｉｃａｔｅｄ Ｓａｌｍｏｎ Ｓｐｅｒｍ）ＤＮＡ、１％ ＢＳＡ／基本バッファー）１ｍｌを加えて、室温で１５分間シェーカーにより振とう（５０ｒｐｍ）してブロッキングを行なった。基本バッファーの組成は１％プロテアーゼインヒビターカクテル、０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、ＨＢＳＳである。結合バッファーを吸引除去後、上記（２）で調製した対応付け分子ＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ：ＳＴＡ−ＡＶＰ＝２．４×１０８個：１．２×１０９個およびウサギ網状赤血球由来の転写・翻訳系４０μｌを結合バッファーに加えたサンプルＡ １ｍｌをＭｏｃｋ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加えて、室温で６０分間シェーカーにより振とう（５０ｒｐｍ）して前処理を行なった。
前処理後のサンプルＡを１．５ｍｌチューブに移し、２，０００ｒｐｍで１分間遠心した上清１ｍｌを、同様にブロッキングを行なったｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加えた。結合のため、室温で６０分間シェーカーにより振とう（５０ｒｐｍ）後、サンプルＡを吸引除去した。洗浄のため、洗浄バッファー（４５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０μＭ ＧＲＧＤＳ（配列番号７）、１００μｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ／基本バッファー）３ｍｌを加えて洗浄、吸引除去後、この洗浄操作を６回行った。溶出のため、溶出バッファー（１００μＭ ＧＲＧＤＳ（配列番号７）、０．５μｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ／基本バッファー）１ｍｌを加えて、ディッシュのふたをはずして氷上に置き、長波長紫外線を実施例１と同じ条件で５分間照射した。上清を１．５ｍｌチューブに回収し、この溶出操作を２回行った。溶出後の溶液についてエタノール沈澱を行い、乾燥させたペレットを純水（ミリＱ水）２５μｌに溶解した。この溶出サンプル１μｌ、１００μＭのプライマーＴ７ＦおよびＴ７Ｒを０．２５μｌずつ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー２．５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ２μｌ、および５Ｕ／μｌ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．１２５μｌを混合し、滅菌水により総容量２５μｌに調整後、ＰＣＲ（９５℃：１分間→（９８℃：２０秒間、６２℃：３０秒間、７２℃：３０秒間）×３０サイクル→７２℃：１分間→４℃）を行なった。ＰＣＲ終了後、２％アガロースゲルにより電気泳動し、ＤＮＡを検出した。ポジティブコントロールとしてサンプルＡの１０，０００倍希釈液を鋳型としてＰＣＲを行ない、同様にＤＮＡを検出した。また、ネガティブコントロールとしてｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞と同様の操作をＭｏｃｋ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞でも行ない、ＤＮＡを検出した。
図５に結果を示す。ｈＡＴ１ＲとＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ対応付け分子とが結合している場合、長波長紫外線を照射すると光開裂によりｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡが遊離するので６７０ｂｐのバンド（図中の「ｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡ→」で示されている位置）が検出される。ｈＡＴ１Ｒと結合しないＳＴＡ−ＡＶＰ対応付け分子が非特異的に吸着し溶出した場合、ｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡのバンド（全長６０４ｂｐ。図中の「ｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡ→」で示されている位置）が検出される。サンプルＡには対応付け分子がＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ：ＳＴＡ−ＡＶＰ＝１：５の比率で含まれており、これを鋳型としてＰＣＲを行なった場合、ｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡとｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡが１：５の比率で検出された（レーン５）。ｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて実験操作を行ない、紫外線照射・光開裂による１回目の溶出および２回目の溶出を行なった場合、ｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡとｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡは１０：１および４：１の比率で検出された（レーン１および３）。検出された各バンドの強度を測定し、算出した濃縮効率は約５０倍であった。一方、Ｍｏｃｋ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて実験操作を行い、紫外線を照射・光開裂による１回目の溶出および２回目の溶出を行なっても、ｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡとｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡは予想通り検出されなかった（レーン２および４）。以上の結果から、ｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて、長波長紫外線を照射した光開裂による溶出方法によりＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ対応付け分子からのｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡが特異的に高効率で回収できることが示された。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、標的物質に特異的に結合する対応付け分子を高効率でスクリーニングすることができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
本発明は、対応付け分子およびそれを用いるスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
進化分子工学やゲノム機能解析において、タンパク質、核酸、その他の生体分子と相互作用する未知のタンパク質をコードする核酸を、種々の生物や組織に由来する核酸ライブラリーや人工的に合成された核酸ライブラリーの中から効率的に選択するために、タンパク質の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）選択の応用が期待されている。タンパク質の試験管内選択を実現するために、タンパク質（表現型）とそれをコードする核酸（遺伝子型）とを連結した分子を用いる方法が提案されている。この分子は、タンパク質とそれをコードする核酸との連結により表現型と遺伝子型が対応付けられているため、対応付け分子と呼ばれる。対応付け分子としては、ＳＴＡＢＬＥ法（特許文献１、非特許文献１）によるもの、試験管内ウイルス法（特許文献２、非特許文献２、特許文献３）によるものが知られている。
生体分子等の標的物質と相互作用するタンパク質の試験管内での選択は、固相に固定化した標的物質にタンパク質を結合させた後、結合したタンパク質を回収することによって行われている。この選択方法においては、固相または標的物質に非特異的に結合したタンパク質の存在が選択効率に大きく影響するため、非特異的な結合による夾雑分子を減少させる方法が提案されている。例えば、標的物質がタンパク質の場合、標的タンパク質のＣ末端側に、カルモジュリン結合タンパク質、配列特異的なプロテアーゼの切断部位、および、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン（ＺＺドメイン）を融合させた融合タンパク質を用い、１段目のスクリーニングでは、融合タンパク質のＺＺドメインをＩｇＧ結合ビーズに吸着結合させることにより固相化し、配列特異的なプロテアーゼの切断により標的タンパク質とそれに結合するタンパク質とを含む複合体を溶出し、２段目のスクリーニングでは、融合タンパク質のカルモジュリン結合タンパク質をカルモジュリン固定化ビーズに結合させることにより固相化し、ＥＤＴＡ等のカルシウムキレート剤により標的タンパク質とそれに結合するタンパク質とを含む複合体を溶出するタンデムアフィニティー精製法が知られている（非特許文献３）。
【非特許文献１】 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４５７，２２７（１９９９）
【特許文献１】 特開２００１−１２８６９０
【特許文献２】 国際公開第ＷＯ ９８／１６６３６号パンフレット
【非特許文献２】 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４１４，４０５（１９９７）
【特許文献３】 国際公開第ＷＯ ０２／４８３４７号パンフレット
【非特許文献３】 Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７，１０３０（１９９９）
【発明の開示】
スクリーニングされる物質が対応付け分子である場合、タンパク質に核酸が結合しているため、タンパク質と標的物質との相互作用の他に、核酸と固相や標的物質との間の非特異的な結合によって、標的物質に特異的に結合しない対応付け分子もスクリーニングされることがある。そのため、対応付け分子を用いる場合には、従来の方法とは異なる原理に基づく、非特異的な夾雑分子を減少させる方法の提供が望まれる。
従って、本発明の課題は、固相や標的物質に対して非特異的に結合した対応付け分子の夾雑を減少させ、標的物質に特異的に結合した対応付け分子を高効率でスクリーニングできる、対応付け分子のスクリーニング方法を提供することである。
本発明者らは、対応付け分子が進化分子工学やゲノム機能解析においてスクリーニングされる場合、核酸の部分が次の工程に使用されることに着目し、研究を行った結果、タンパク質とそれをコードする核酸とを特定のリンカーを介して連結させ、そのリンカーの切断により核酸のみを遊離させることで、対応付け分子のスクリーニングに伴う上記の課題が解決できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のものを提供する。
（１）タンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結されている対応付け分子。
（２）前記リンカーが、長波長紫外線により切断可能なリンカーである（１）の対応付け分子。
（３）（１）または（２）の対応付け分子からなるライブラリー。
（４）タンパク質をコードする核酸を転写および／または翻訳したときに翻訳されたタンパク質と前記核酸とが連結されるように構築された前記核酸を準備し、準備した核酸を無細胞タンパク質合成系または生細胞を用いて転写および／または翻訳することにより、前記タンパク質と前記核酸とを連結する対応付け分子の製造方法において、
前記核酸を転写および／または翻訳したときに、前記タンパク質と前記核酸とが、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結されるように前記核酸が構築されている、（１）の対応付け分子の製造方法。
（５）核酸ライブラリーを構成する各核酸から（４）の製造方法により対応付け分子を製造することを含む、対応付け分子のライブラリーの製造方法。
（６）核酸ライブラリーから、標的物質と相互作用するタンパク質をコードする核酸をスクリーニングする方法であって、
前記核酸ライブラリーから、（５）の製造方法により対応付け分子のライブラリーを製造する工程、
前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、
標的物質に結合した対応付け分子を分離する工程、
分離した対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させる工程、および、
遊離した核酸を回収する工程
を含む前記方法。
【図面の簡単な説明】
図１は、開裂型リンカーを含む対応付け分子を用いたスクリーニング方法の説明図である。
図２は、長波長紫外線（励起ピーク：３６５ｎｍ）の照射による対応付け分子からの遺伝子型分子の遊離方法の説明図である。
図３は、長波長紫外線の照射による対応付け分子からの遺伝子型分子の遊離実験の結果を示す図（電気泳動写真）である。レーン１〜６はフルオレセインおよびＰＣＢラベル化したＤＮＡを用いた場合である。レーン７〜１２はフルオレセインおよびビオチンラベル化したＤＮＡを用いた場合である。
図４は、無細胞転写・翻訳系におけるＰＣＢラベル化したＤＮＡの対応付け分子の形成を電気泳動により確認した結果を示す図（電気泳動写真）である。レーン１は対応付け分子を形成させた場合である。レーン２はタンパク質合成を阻害し、対応付け分子を形成させなかった場合である。
図５は、ｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞とＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ対応付け分子を結合させ、長波長紫外線の照射により遺伝子型分子であるｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡを溶出した実験結果を示す図（電気泳動写真）である。レーン１、３はｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた場合、レーン２、４はＭｏｃｋ／Ｃｈｏ−Ｋ１細胞を用いた場合である。また、レーン５は結合操作前のサンプルＡである。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、本明細書において引用した全ての文献の記載は本明細書の一部を構成するものである。
＜１＞本発明の対応付け分子
本発明の対応付け分子は、タンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカー（本明細書では「開裂型リンカー」ともいう）を介して連結されていることを特徴とする。本発明の対応付け分子は、開裂型リンカーを介してタンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが連結されている他は、通常の対応付け分子の構成と同様でよい。
対応付け分子のライブラリーも同様である。すなわち、対応付け分子として本発明の対応付け分子を用いることの他は、通常の対応付け分子からなるライブラリーの作成方法に従って作成することができる。例えば、進化分子工学では、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１，１１−１５）、Ｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，１０７４７−１０７５１）、ＤＮＡシャッフリング、変異ライブラリー（柳川弘志、辻 融，「変異ＤＮＡライブラリーの構築方法」、ＷＯ ０２／２６９６４）などの方法を使って構築したライブラリーなどを、ゲノム機能解析では、ランダムプライミングやｄＴプライミングにより構築したｃＤＮＡライブラリーなどを鋳型として用いることにより対応付け分子のライブラリーを作成することができる。
＜１−１＞対応付け分子における開裂型リンカーの他の構成
核酸は、対応付け分子の態様に応じてＤＮＡおよびＲＮＡのいずれでもよい。また、タンパク質は、対応付け分子の態様に応じて融合タンパク質とされていてもよい。
タンパク質と核酸とが連結されているとは、タンパク質と核酸とが、その他の分子を介して連結されていることも包含し、また、それらの相互間の結合は、共有結合、生体分子が持つ親和力による結合等の非共有結合のいずれでもよい。生体分子が持つ親和力による結合の例としては、抗原と抗体との結合、ホルモンと受容体との結合、ＤＮＡとＤＮＡ結合蛋白質との結合等が挙げられる。
対応付け分子の例としては、ＳＴＡＢＬＥ法（特許文献１、非特許文献１）によるもの、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ウイルス法（特許文献２、非特許文献２、ＷＯ ０３／０６２４１７、ＷＯ ９８／３１７００）によるものが挙げられる。以下、具体例を説明する。
（ａ）ＳＴＡＢＬＥ法による対応付け分子
ＳＴＡＢＬＥ法による対応付け分子は、機能解析、機能改変等の対象となるタンパク質（被標的タンパク質）とアダプタータンパク質との融合タンパク質と、該融合タンパク質をコードし、かつリガンドが結合したＤＮＡとが、該アダプタータンパク質と該リガンドとの結合を介して連結されることによって構成されている。
被標的タンパク質は、天然タンパク質またはその変異体、及び人工タンパク質またはその変異体の何れでもよい。天然タンパク質としては、種々の生物の器官、組織または細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーから転写翻訳される多様性を有するタンパク質のライブラリーを含むものである。人工タンパク質としては、天然タンパク質の全てもしくは部分配列を組み合わせた配列、またはランダムなアミノ酸配列を含むものである。
アダプタータンパク質とは、ある分子（リガンド）と特異的に結合する能力を有するタンパク質を意味し、これらの中には、結合タンパク質、受容体を構成する受容体タンパク質、抗体等も含まれる。リガンドとは、アダプタータンパク質に特異的に結合する分子を意味する。アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合蛋白質／ビオチン、マルトース結合蛋白質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルまたはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、またはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール等の各種受容体タンパク質／そのリガンド等が挙げられる。
これらの中で、アダプタータンパク質／リガンドの組み合わせとしては、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルまたはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）等が好ましく、特に、ストレプトアビジン／ビオチンが最も好ましい。
この態様で用いる融合タンパク質をコードするＤＮＡにおいては、通常、その一方の末端にリガンドが結合している。該ＤＮＡの末端に結合したリガンドと該ＤＮＡにより発現される融合タンパク質中のアダプタータンパク質部分との結合を介して、融合タンパク質とＤＮＡとが物理的に連結される。
この態様の対応付け分子は、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡを、無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することにより製造できる。好ましくは、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質をコードする領域を有し、かつリガンドが結合したＤＮＡのライブラリーを、該ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡが、一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成することにより製造される。
（ｂ）試験管内ウイルス法による対応付け分子
試験管内ウイルス法による対応付け分子は、機能解析、機能改変等の対象となるタンパク質を含む表現型分子と、該タンパク質をコードする核酸を含む遺伝子型分子とが結合してなる。遺伝子型分子は、タンパク質をコードする領域を、その領域の塩基配列が翻訳され得るような形態で有するコード分子と、スペーサー分子とが結合してなる。
この態様におけるスペーサー分子は、核酸の３’末端に結合できるドナー領域と、ドナー領域に結合した、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域と、ＰＥＧ領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを含む。ＰＥＧ領域はなくてもよい。
核酸の３’末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。
ドナー領域の５’末端の配列は、ライゲーション効率を左右する。コード分子とスペーサー分子をライゲーションさせるためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）または２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（ＵまたはＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
ＰＥＧ領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、ＰＥＧ領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が２０塩基以下、または、ポリエチレングリコールの平均分子量が４００以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が１０塩基以下、または、ポリエチレングリコールの平均分子量が１０００以上であることを意味する。
ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、４００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜８，０００である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約４００より低いと、このスペーサー分子に由来するスペーサー部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Ｌｉｕ，Ｒ．，Ｂａｒｒｉｃｋ，Ｅ．，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３１８，２６８−２９３）、分子量１０００以上、より好ましくは２０００以上のＰＥＧを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量１０００以上で良好であり、分子量４００以下ではＤＮＡスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシドまたはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、または、ピューロマイシンもしくはその誘導体と１残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とはタンパク質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、ＰＡＮＳ−アミノ酸、ＡＡＮＳ−アミノ酸などが挙げられる。
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、５’側に１残基以上のＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ，Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ ２２３，３７４−３７７）が適当である。塩基の種類としては、Ｃ＞（ＵまたはＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
スペーサー分子は、ドナー領域とＰＥＧ領域との間に、少なくとも１つの機能付与ユニットを含むことが好ましい。機能付与ユニットは、好ましくは、少なくとも１残基のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの塩基に機能修飾を施したものである。例えば、機能修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、またはＨｉｓ−ｔａｇなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。
この態様におけるコード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、タンパタ質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列及びその５’側に制限酵素ＸｈｏＩが認識する配列を含む３’末端領域を含む核酸である。
コード分子は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＲＮＡの場合、５’末端にＣａｐ構造があってもなくても良い。また、コード分子は任意のベクターやプラスミドに組み込まれたものとしてもよい。
３’末端領域は、ＸｈｏＩ配列とその下流にポリＡ配列を含む。スペーサー分子とコード分子とのライゲーション効率に影響を与える要素としては３’末端領域のポリＡ配列が重要であり、ポリＡ配列は、少なくとも２残基以上のｄＡおよび／またはｒＡの混合または単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリＡ連続鎖である。
コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる５’非翻訳領域、および、ポリＡ配列を含む３’末端領域の組み合わせがある。３’末端領域のポリＡ配列の効果は通常には１０残基以下で発揮される。５’非翻訳領域の転写プロモーターはＴ７／Ｔ３またはＳＰ６などが利用でき、特に制限はない。好ましくはＳＰ６であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はＳＰ６を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、ＴＭＶのオメガ配列の一部（Ｏ２９；Ｇａｌｌｉｅ Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８、および、ＷＯ ０２／４８３４７の図３参照）を含んだものが好ましい。
また、翻訳効率に関し、３’末端領域においては、ＸｈｏＩ配列とポリＡ配列の組み合わせが重要となる。また、ＯＲＦ領域の下流部分、すなわちＸｈｏＩ配列の上流に親和性タグがついたものとポリＡ配列の組み合わせも重要となる。親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列である。ポリＡ配列効果としては、Ｆｌａｇ−ｔａｇ等の親和性タグにＸｈｏＩ配列がついたものとそこへさらにポリＡ配列がついたものの翻訳効率が上昇する。この翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。
ＯＲＦ領域については、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、または、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。また、コード分子の５’非翻訳領域をＳＰ６＋Ｏ２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’非翻訳領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、５’非翻訳領域と３’末端領域をもったコード分子を簡単に作成できる。コード分子において、翻訳はＯＲＦ領域を超えてされてもよい。すなわち、ＯＲＦ領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
この態様におけるコード分子は、転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列を含む３’末端領域を含む核酸である。
遺伝子型分子を構成するコード分子は、ＸｈｏＩ配列を有することが好ましい。
遺伝子型分子は、上記コード分子を、必要により、タンパク質をコードする領域の塩基配列が翻訳され得るような形態に変換した後（例えば、転写した後）、コード分子の３’末端と、スペーサー分子のドナー領域を、通常のリガーゼ反応により結合させることにより製造できる。反応条件としては、通常、４〜２５℃で４〜４８時間の条件が挙げられ、ＰＥＧ領域を含むスペーサー分子のＰＥＧ領域内のポリエチレングリコールと同じ分子量のポリエチレングリコールを反応系に添加する場合には、１５℃で０．５〜４時間に短縮することも可能である。
スペーサー分子とコード分子の組み合わせはライゲーション効率に重要な効果をもたらす。アクセプターにあたるコード分子の３’末端領域において、少なくとも２残基以上、好ましくは３残基以上、さらに好ましくは６〜８残基以上のＤＮＡおよび／またはＲＮＡのポリＡ配列があること、さらに、５’非翻訳領域の翻訳エンハンサーとしては、オメガ配列の部分配列（Ｏ２９）が好ましく、スペーサー分子のドナー領域としては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）または２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。このことによって、ＲＮＡリガーゼを用いることでＤＮＡリガーゼのもつ問題点を回避し、かつ効率を６０〜８０％に保つことができる。
（ａ）転写プロモーターおよび翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、タンパク質をコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列を含む３’末端領域を含むＲＮＡであるコード分子の３’末端と、（ｂ）上記スペーサー分子のドナー領域であってＲＮＡからなるものとを、スペーサー分子内のＰＥＧ領域を構成するポリエチレングリコールと同じ分子量をもつ遊離のポリエチレングリコールの存在下で、ＲＮＡリガーゼにより結合させることが好ましい。
ライゲーション反応時に、ＰＥＧ領域を含むスペーサー分子のＰＥＧ領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することによって、スペーサー分子のポリエチレングリコールの分子量によらずライゲーション効率が８０〜９０％以上に向上し、反応後の分離工程も省略することができる。
この態様の対応付け分子は、上記の遺伝子型分子を無細胞翻訳系で翻訳することにより、ペプチド転移反応で、遺伝子型分子内のＯＲＦ領域によりコードされたタンパク質である表現型分子と連結することができる。無細胞翻訳系は、好ましくは、小麦胚芽またはウサギ網状赤血球のものである。翻訳の条件は通常に採用される条件でよい。例えば、２５〜３７℃で１５〜２４０分の条件が挙げられる。
＜１−２＞開裂型リンカー
本発明の対応付け分子に用いられる開裂型リンカーは、前記コード分子中の核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーである。核酸の塩基配列が変化しないとは、核酸が切断されたり、その塩基が改変されたりすることがなく、遊離したコード分子中の核酸の塩基配列が、その対応付け分子の表現型分子であるタンパク質をコードする塩基配列を保持することを意味する。
このような開裂型リンカーの例を表１に示す。なお、表中の括弧内にその切断方法を示す。
このようなリンカー自体およびその切断方法は、当業者に知られているので、対応付け分子に使用したときに、コード分子中の核酸の塩基配列を変化させない切断条件を設定し、その条件で切断できるものを選択することは当業者であれば容易である。例えば、光開裂型リンカーの場合には、核酸は短波長の紫外線の照射により損傷を受けるため、核酸に損傷を与えない長波長紫外線の照射により切断できるものが選択される。また、ＤＮＡ型リンカー、ＲＮＡ型リンカーおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド型リンカーの場合には、タンパク質をコードする核酸が分解されないようにヌクレアーゼの種類および反応条件を選択する。
本発明において、開裂型リンカーは、好ましくは、光開裂型リンカーである。上述のように、光開裂型リンカーは、長波長紫外線の照射により切断することができるものであればよい。ここで長波長紫外線とは、照射したときに、コード分子中の核酸の塩基配列を変化させない波長の紫外線を意味し、通常には３００〜４００ｎｍ、好ましくは３１０〜３６０ｎｍの波長の紫外線である。光開裂リンカーは、タンパク質と標的物質との特異的結合および標的物質や固相と核酸との非特異的結合を含めて、結合に影響を与える可能性が低いので、特異的に結合した対応付け分子の、コード分子中の核酸だけを遊離させる可能性が高いため、特に好ましい。
長波長紫外線で切断できる光開裂型リンカーとして、具体的には、例えば、α−置換−２−ニトロベンジル基の構造を持つもの等が挙げられる。α置換基として、（ｉ）水酸基と反応するホスホアミダイト、（ｉｉ）アミノ基と反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドカルボネート、（ｉｉｉ）チオール基と反応するハロゲン等が挙げられる。上記（ｉ）に記載の光開裂型リンカーとしては、ＰＣビオチンホスホアミダイト、ＰＣアミノ修飾ホスホアミダイト、ＰＣスペーサーホスホアミダイト（いずれも商品名、グレンリサーチ社製）等が挙げられる。
対応付け分子における開裂型リンカーの位置は、タンパク質とコード分子中の核酸との間であって、切断が可能な限り、特に制限されず、対応付け分子の態様および開裂型リンカーの種類に応じて適宜選択される。例えば、ＳＴＡＢＬＥ法による対応付け分子の場合には、融合タンパク質をコードするＤＮＡとリガンドとの間に開裂型リンカーを位置させることができる。また、試験管内ウイルス法による対応付け分子の場合には、開裂型リンカーをスペーサー分子の構成要素として含ませたり、スペーサー分子とコード分子との間に位置させたりすることができる。
開裂型リンカーが核酸からなる場合には、タンパク質をコードする核酸と一体とされていてもよく、また、開裂型リンカーがペプチドからなる場合には表現型分子としてのタンパク質のＣ末端に融合させていてもよい。
＜２＞本発明の製造方法
本発明の対応付け分子は、タンパク質をコードする核酸からタンパク質を合成したとき、すなわち、コード分子である核酸を転写および／または翻訳したときに、表現型分子としてのタンパク質と遺伝子型分子としての核酸とが開裂型リンカーを介して連結されるように構築された遺伝子型分子である核酸を準備し、準備した核酸を無細胞タンパク質合成系または生細胞を用いて転写および／または翻訳することにより、表現型分子としてのタンパク質と遺伝子型分子としての核酸とを連結して製造される。
無細胞タンパク質合成系は、無細胞翻訳系であっても、無細胞転写翻訳系であってもよく、対応付け分子を構成する核酸の種類に応じて適宜選択される。
例えば、ＳＴＡＢＬＥ法の場合には、上記の少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質をコードする領域を有するＤＮＡに、開裂型リンカーを介してリガンドが結合したＤＮＡを準備し、そのＤＮＡから無細胞転写翻訳系でタンパク質を合成することにより製造される。あるいは、少なくとも転写翻訳開始領域、被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質をコードする領域を有するＤＮＡに、開裂型リンカーを介してリガンドが結合したＤＮＡのライブラリーを準備し、該ＤＮＡのライブラリー内のＤＮＡから、一種類もしくは１分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系でタンパク質を合成する。
また、試験管内ウイルス法による対応付け分子の場合には、開裂型リンカーを含むスペーサー分子を用いたり、スペーサー分子とコード分子を開裂型リンカーを介して結合させたり、ＯＲＦの３’末端に開裂型リンカーをコードする配列をコーディング枠が合うように連結させたりすることにより遺伝子型分子を準備すればよい。
遺伝子型分子の製造方法としては、例えば、コード分子のＯＲＦの３’末端側またはスペーサー分子のいずれかに開裂型リンカーを含むように化学合成した後に、＜１−１＞（ｂ）に記載の方法を行うことが挙げられる。化学合成方法は、それ自体既知の方法を適宜選択して用いることができる。
開裂型リンカーを含むコード分子およびスペーサ分子の合成法として、具体的には、例えば、開裂型リンカーとしてα−置換−２−ニトロベンジル基の構造を持つものであって、α置換基として、水酸基と反応するホスホアミダイトを用いる場合には、該リンカーをホスホアミダイトＤＮＡ合成法によりコード分子のＯＲＦの３’末端側またはスペーサー分子のいずれかに導入する方法等が挙げられる。また、α−置換−２−ニトロベンジル基の構造を持つものであって、α置換基として、アミノ基と反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドカルボネートを開裂型リンカーとして用いる場合には、該リンカーをホスホアミダイトＤＮＡ合成法によりコード分子のＯＲＦの３’末端側またはスペーサー分子のいずれかに導入した後、活性エステルで修飾する方法等が用いられる。さらに、α−置換−２−ニトロベンジル基の構造を持つものであって、α置換基として、チオール基と反応するハロゲンを開裂型リンカーとして用いる場合には、該リンカーをホスホアミダイトＤＮＡ合成法によりコード分子のＯＲＦの３’末端側またはスペーサー分子のいずれかに導入する方法等が挙げられる。
また、ＤＮＡ型リンカーを用いる場合には、ヌクレアーゼまたは制限酵素により認識される塩基配列を有する核酸であるＤＮＡ型リンカーを、コード分子のＯＲＦの３’末端側またはスペーサー分子のいずれかに挿入して合成することにより製造することができる。ここで、制限酵素により切断されるＤＮＡは、２本鎖である必要があるため、該ＤＮＡリンカーの塩基配列を有する核酸は、１本鎖ずつ合成してアニーリングさせることにより製造することができる。
また、プロテアーゼで切断されるペプチド型リンカーを用いる場合には、例えば、チオエステル法を用いることで、簡単に、目的のペプチドをコード分子のＯＲＦの３’末端側またはスペーサー分子のいずれかに導入して合成することによりコード分子、スペーサー分子を作製することができる。
生細胞としては、原核または真核生物例えば大腸菌の細胞などが使用できる。
タンパク質をコードする核酸を転写および／または翻訳したときに、タンパク質と核酸とが開裂型リンカーを介して連結されるように構築された核酸は、無細胞タンパク質合成系で核酸を転写および／または翻訳したとき、タンパク質と核酸とが開裂型リンカーを介して連結されるように構築されたものであることが好ましい。無細胞タンパク質合成系でタンパク質をコードする核酸を転写および／または翻訳したときに、タンパク質と核酸とが開裂型リンカーを介して連結されるように構築された核酸は、生細胞を用いた場合でも無細胞タンパク質合成系を用いた場合と同様に転写および／または翻訳されると考えられる。
無細胞タンパク質合成系または生細胞を用いて転写および／または翻訳することにより得られた対応付け分子は、必要により精製してもよい。
本発明の対応付け分子のライブラリーは、核酸ライブラリーの核酸の集合体に対し、すなわち、核酸ライブラリーの各核酸に対し、上記の本発明の製造方法を適用することにより製造することができる。
＜３＞本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、核酸ライブラリーから、標的物質と相互作用するタンパク質をコードする核酸をスクリーニングする方法であって、前記核酸ライブラリーから、本発明の製造方法により対応付け分子のライブラリーを製造する工程、前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、標的物質に結合した対応付け分子を分離する工程、分離した対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させる工程、および、遊離した核酸を回収する工程を含む。
標的物質としては、タンパク質（ペプチド、抗体などを含む）、ヌクレオチドなどが挙げられる。相互作用の測定は、標的物質の種類に適合した方法により行うことができる（例えば、Ｒｉｇａｕｔ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，１０３０−１０３２）。
対応付け分子のライブラリーと標的物質との混合は、対応付け分子の被標的タンパク質が標的物質と相互作用する条件で混合すればよい。この条件は、検出しようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。
標的物質に結合した対応付け分子の分離は、標的物質に結合した対応付け分子と、標的物質に結合しない対応付け分子を分離する工程であり、通常には、標的物質を固相に固定化しておくことによって、対応付け分子と混合後の標的分子を固定化した固相を洗浄することにより分離を行うことができる。洗浄の条件は、検出しようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。ここで固相に固定化するとは、対応付け分子と標的物質との結合体が非結合の分子から分離可能になっていることを意味し、例えば、標的物質が膜タンパク質の場合、細胞の細胞膜等に発現した膜タンパク質や人工膜中に埋め込まれたタンパク質も、固相に固定化された標的物質に包含される。
分離した対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させることは、上記に例示したような開裂型リンカーを用い、それに応じた条件で行うことができる。標的物質が固相に固定化されている場合、核酸を遊離させることは、溶出とも呼ばれる。本発明において「遊離」とは「溶出」も包含する意味で用いる。また、遊離される核酸は、核酸の塩基配列が解析可能な限り、改変されたものであってよい。
遊離した核酸の回収は、通常の方法によって行うことができる。例えば、電気泳動により回収する方法、遊離した核酸以外の成分を沈殿させて上清を回収する方法などが挙げられる。
回収された核酸は、機能解析、進化工学などの目的に応じて増幅や配列の解析が行われる。
以下、スクリーニングの例を図１を参照して説明する。この例では、標的分子としてＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、対応付け分子としてＳＴＡＢＬＥ法によるもの（リガンドがビオチン、アダプタータンパク質がストレプトアビジン）が用いられている。
まず、ランダムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどのＤＮＡライブラリーを構成するＤＮＡに対し、ストレプトアビジン遺伝子を、ストレプトアビジンと前記ＤＮＡにコードされるタンパク質とが融合タンパク質として発現されるように連結し、さらに開裂型リンカーを介してビオチンを連結して、前記ＤＮＡから無細胞転写翻訳系で前記タンパク質を合成したときに前記タンパク質と前記ＤＮＡとが開裂型リンカーを介して連結されるように改変されたＤＮＡを準備する。
改変されたＤＮＡを、一ミセルにほぼ一分子のＤＮＡが含まれるように調製した水／油型エマルジョンとした無細胞転写翻訳系で転写翻訳し、融合タンパク質を合成する。そうすると、融合タンパク質の構成要素のストレプトアビジンと、改変ＤＮＡを構成要素のビオチンが結合し、対応付け分子が生成する。
エマルジョンから、対応付け分子を回収し、対応付け分子のライブラリーを得る。対応付け分子を、ＧＰＣＲを細胞膜に発現した細胞と混合する。リンカーを切断することにより、ＤＮＡを遊離させ回収する。
目的に応じて、回収されたＤＮＡの配列解析を行ったり、ＰＣＲにより増幅して再度ビオチンを開裂型リンカーを介して連結し、上記の工程を繰り返したりすることができる。
次に、図２を参照して開裂型リンカーの切断の例を説明する。この例では、図１に示した例において、開裂型リンカーとして長波長紫外線で切断可能な光開裂型リンカーが使用されている。
図２の上図は、対応付け分子が標的物質であるＧＰＣＲに結合した状態を示す。ＧＰＣＲに結合した対応付け分子に、光開裂型リンカーを切断する長波長紫外線を照射すると、図２の下図に示すようにＤＮＡが遊離する。
【実施例】
以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
実施例１ 光開裂型リンカーを含む対応付け分子の紫外線による切断
光開裂型リンカーを介してＤＮＡとタンパク質が連結した分子を形成させた後、長波長紫外線の照射によりＤＮＡとタンパク質が切断・分離されることを確認した。本実施例で用いたＤＮＡとタンパク質とが連結した分子には、ＤＮＡのコードするタンパク質が含まれていないが、紫外線による切断については対応付け分子と同じ挙動を示すと考えられるので、本実施例では、説明の便宜のため、対応付け分子と呼ぶ。
（１）光開裂型リンカーを介してビオチンラベル化したＤＮＡの調製
光開裂型リンカーが結合したビオチン（Ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｂｉｏｔｉｎ：以下、ＰＣＢと略す）はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入した。ストレプトアビジン遺伝子の下流にアンジオテンシンＩＩ遺伝子が融合したｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡ（配列番号１）を鋳型ＤＮＡとして調製した。０．５ｎＭの鋳型ＤＮＡ（配列番号１）、５’末端がＰＣＢラベル化された１μＭのプライマーＴ７Ｆ（配列番号２）、５’末端がフルオレセイン・ラベル化された１μＭのプライマーＴ７Ｒ（配列番号３）、１×Ｅｘ Ｔａｑバッファー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、および１．２５ＵのＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）を含む反応液５０μｌを用いてＰＣＲ（９５℃：１分間→（９８℃：２０秒間、６２℃：３０秒間、７２℃：３０秒間）×２５サイクル→７２℃：１分間→４℃）を行なった。これによりフルオレセインおよびＰＣＢラベル化されたＤＮＡ（以下、ＰＣＢラベル化ＤＮＡと略す）を得た。同様に、ネガティブコントロールとして、５’末端がビオチンラベル化されたプライマーＴ７Ｆを用いて、光開裂型リンカーを含まないフルオレセインおよびビオチンラベル化されたＤＮＡ（以下、ビオチンラベル化ＤＮＡと略す）も調製した。
（２）対応付け分子の形成および長波長紫外線の照射による切断
上記ＰＣＢまたはビオチンラベル化ＤＮＡ（３０ｎＭ）とストレプトアビジン（１μｇ／μｌ；プロメガ社）を等量ずつ混合し、室温で６０分間インキュベートして結合させ、タンパク質とＤＮＡとが連結した対応付け分子を形成させた。紫外線灯（ハンディーランプＸＸ−１５ＢＬＢ；Ｕｌｔｒａ−Ｖｉｏｌｅｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて１５ｃｍの距離から長波長紫外線を２．５分間、５分間、１０分間、および１５分間照射したサンプルを３％シーケムゴールドアガロースゲルにより泳動分離し、イメージアナライザーを用いてフルオレセインの蛍光を検出した。結果を図３に示す。ＰＣＢラベル化されたＤＮＡを用いた場合、高分子量の対応付け分子として検出されていたバンド（図中の「対応付け分子→」で示されている位置）が、長波長紫外線の照射時間に依存して低分子量のバンド（図中の「ＤＮＡ→」で示されている位置）に移行した（レーン１〜５）。一方、光開裂型リンカーを含まないビオチンラベル化ＤＮＡを用いた場合では、高分子量から低分子量への移行は全くみられなかった（レーン７〜１１）。このことから、対応付け分子の中の光開裂型リンカーが長波長紫外線により切断され、対応付け分子から遺伝子型分子であるＤＮＡが遊離されることが確認できた。
実施例２ ＧＰＣＲリガンドペプチドを用いた対応付け分子の無細胞転写・翻訳系における合成
ＧＰＣＲのリガンドとして知られているアンジオテンシンＩＩを用いて、対応付け分子の形成を行なった。９ｎＭの、フルオレセインおよびＰＣＢでラベル化されたｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡ（実施例１で調製したもの）をウサギ網状赤血球由来の無細胞転写・翻訳系（プロメガ社）に加え３０℃で９０分間反応させることによりストレプトアビジン・アンジオテンシンＩＩ融合タンパク質（以下、ＳＴＡ−ＡＴ ＩＩと略す）を合成し、このタンパク質とｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡがストレプトアビジンとビオチンの結合を介して連結した対応付け分子を形成させた。このサンプルを３％シーケムゴールドアガロースゲルにより泳動分離し、イメージアナライザーを用いてフルオレセインの蛍光を検出した。また、タンパク質合成阻害剤である０．２％ヘパリンを加えたコントロール実験を行なった。
図４に、無細胞転写・翻訳系により合成されたＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ対応付け分子の検出結果を示す。タンパク質合成阻害剤であるヘパリンを加えた場合、ストレプトアビジン・アンジオテンシンＩＩ融合タンパク質は合成されないため、フルオレセインおよびＰＣＢラベル化されたｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡのバンド（図中の「ＤＮＡ→」で示されている位置）のみが検出される（レーン２）。一方、ヘパリンを加えていない場合、合成されたストレプトアビジン・アンジオテンシンＩＩ融合タンパク質がＰＣＢラベル化されたｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡに結合するため、高分子量側にシフトしているバンド（図中の「対応付け分子→」で示されている位置）が検出された（レーン１）。この結果から、ＰＣＢラベル化されたＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして無細胞転写・翻訳系でタンパク質を合成することにより、対応付け分子の形成が確認できた。対応付け効率（無細胞転写・翻訳系に加えた全ＤＮＡに対する対応付け分子を形成したＤＮＡの割合）は約８０％であった。
実施例３ ＧＰＣＲ発現細胞を用いたリガンド濃縮実験
ヒト・アンジオテンシンＩＩタイプ１受容体（以下、ｈＡＴ１Ｒと略す）を発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、ｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞と略す）を用いて、ＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ対応付け分子の濃縮実験を行なった。
（１）光開裂型リンカーを介してビオチンラベル化したＤＮＡの調製
実施例１と同様の方法で、ＰＣＢラベル化されたｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡ（全長６７０ｂｐ）を得た。また、ネガティブコントロールとして、アンジオテンシンＩＩの代わりに、ｈＡＴ１Ｒとは結合しないバソプレッシンをコードする鋳型ＤＮＡ（配列番号４）を用いて同様にＰＣＲを行ない、ＰＣＢラベル化されたｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡ（全長６０４ｂｐ）を得た。
（２）対応付け分子の形成
１０ｎＭの、ＰＣＢラベル化されたｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡをウサギ網状赤血球由来の無細胞転写・翻訳系に加え３０℃で９０分間反応させることによりストレプトアビジン・アンジオテンシンＩＩ融合タンパク質を合成し、ＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ対応付け分子を形成させた。同様にして、１０ｎＭの、ＰＣＢラベル化されたｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡを鋳型としてストレプトアビジン・バソプレッシン融合タンパク質（以下、ＳＴＡ−ＡＶＰと略す）を合成し、このタンパク質とｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡからなる対応付け分子を形成させた。これらの対応付け分子が含まれる無細胞転写・翻訳系に２０μＭビオチンを等量加えて１５分間反応させ、余分なビオチン結合部位をブロッキングした後、ＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ：ＳＴＡ−ＡＶＰ＝２．４×１０８個：１．２×１０９個＝１：５となるように混合して、下記（４）の濃縮実験に用いた。
（３）ｈＡＴ１Ｒを安定に発現する細胞株の樹立
ｈＡＴ１Ｒ遺伝子をクローニングするため、ヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリー（慶應大・井上純一郎教授より供与）０．０５μｌを、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μｌ、１０μＭのＡＴＦプライマー（配列番号５）２．５μｌ、１０μＭのＡＴＲプライマー（配列番号６）２．５μｌ、５Ｕ／μｌ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．２５μｌと混合し、滅菌水により総容量５０μｌに調整後、ＰＣＲ（９５℃：１分間→（９８℃：２０秒間、５５℃：１分間、７２℃：４分間）×３５サイクル→４℃）を行ない、ｈＡＴ１Ｒ遺伝子断片を得た。このｈＡＴ１Ｒ遺伝子断片をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにより制限酵素処理し、同様に処理したｐＥＦ１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にライゲーションし、ｐＥＦ１−ｈＡＴ１Ｒ−ＭｙｃＨｉｓ（ネオマイシン耐性）を得た。このｐＥＦ１−ｈＡＴ１Ｒ−ＭｙｃＨｉｓをＣＨＯ−Ｋ１細胞へトランスフェクションし、４００μｇ／μｌ Ｇ４１８を加えた培地により選択を行ない、Ｍｙｃエピトープ抗体を用いたウェスタンブロッティングによりｈＡＴ１Ｒを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞を得た。
（４）細胞を用いた結合・濃縮実験
まず、細胞表面に非特異的に吸着する対応付け分子を除去するために、以下の前処理を行なった。受容体を発現していないＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、Ｍｏｃｋ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞と略す）をコンフルエントまで培養した６ｃｍディッシュ内の完全培地を吸引除去し、Ｈａｎｋの平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（以下、ＨＢＳＳと略す）２ｍｌを加えてディッシュ内を洗浄した。結合バッファー（１００μＭ ＧＲＧＤＳ（配列番号７）、１ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子（Ｓｏｎｉｃａｔｅｄ Ｓａｌｍｏｎ Ｓｐｅｒｍ）ＤＮＡ、１％ ＢＳＡ／基本バッファー）１ｍｌを加えて、室温で１５分間シェーカーにより振とう（５０ｒｐｍ）してブロッキングを行なった。基本バッファーの組成は１％プロテアーゼインヒビターカクテル、０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、ＨＢＳＳである。結合バッファーを吸引除去後、上記（２）で調製した対応付け分子ＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ：ＳＴＡ−ＡＶＰ＝２．４×１０８個：１．２×１０９個およびウサギ網状赤血球由来の転写・翻訳系４０μｌを結合バッファーに加えたサンプルＡ １ｍｌをＭｏｃｋ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加えて、室温で６０分間シェーカーにより振とう（５０ｒｐｍ）して前処理を行なった。
前処理後のサンプルＡを１．５ｍｌチューブに移し、２，０００ｒｐｍで１分間遠心した上清１ｍｌを、同様にブロッキングを行なったｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞に加えた。結合のため、室温で６０分間シェーカーにより振とう（５０ｒｐｍ）後、サンプルＡを吸引除去した。洗浄のため、洗浄バッファー（４５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０μＭ ＧＲＧＤＳ（配列番号７）、１００μｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ／基本バッファー）３ｍｌを加えて洗浄、吸引除去後、この洗浄操作を６回行った。溶出のため、溶出バッファー（１００μＭ ＧＲＧＤＳ（配列番号７）、０．５μｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ／基本バッファー）１ｍｌを加えて、ディッシュのふたをはずして氷上に置き、長波長紫外線を実施例１と同じ条件で５分間照射した。上清を１．５ｍｌチューブに回収し、この溶出操作を２回行った。溶出後の溶液についてエタノール沈澱を行い、乾燥させたペレットを純水（ミリＱ水）２５μｌに溶解した。この溶出サンプル１μｌ、１００μＭのプライマーＴ７ＦおよびＴ７Ｒを０．２５μｌずつ、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー２．５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ２μｌ、および５Ｕ／μｌ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．１２５μｌを混合し、滅菌水により総容量２５μｌに調整後、ＰＣＲ（９５℃：１分間→（９８℃：２０秒間、６２℃：３０秒間、７２℃：３０秒間）×３０サイクル→７２℃：１分間→４℃）を行なった。ＰＣＲ終了後、２％アガロースゲルにより電気泳動し、ＤＮＡを検出した。ポジティブコントロールとしてサンプルＡの１０，０００倍希釈液を鋳型としてＰＣＲを行ない、同様にＤＮＡを検出した。また、ネガティブコントロールとしてｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞と同様の操作をＭｏｃｋ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞でも行ない、ＤＮＡを検出した。
図５に結果を示す。ｈＡＴ１ＲとＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ対応付け分子とが結合している場合、長波長紫外線を照射すると光開裂によりｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡが遊離するので６７０ｂｐのバンド（図中の「ｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡ→」で示されている位置）が検出される。ｈＡＴ１Ｒと結合しないＳＴＡ−ＡＶＰ対応付け分子が非特異的に吸着し溶出した場合、ｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡのバンド（全長６０４ｂｐ。図中の「ｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡ→」で示されている位置）が検出される。サンプルＡには対応付け分子がＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ：ＳＴＡ−ＡＶＰ＝１：５の比率で含まれており、これを鋳型としてＰＣＲを行なった場合、ｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡとｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡが１：５の比率で検出された（レーン５）。ｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて実験操作を行ない、紫外線照射・光開裂による１回目の溶出および２回目の溶出を行なった場合、ｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡとｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡは１０：１および４：１の比率で検出された（レーン１および３）。検出された各バンドの強度を測定し、算出した濃縮効率は約５０倍であった。一方、Ｍｏｃｋ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて実験操作を行い、紫外線を照射・光開裂による１回目の溶出および２回目の溶出を行なっても、ｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡとｓｔａ−ａｖｐ ＤＮＡは予想通り検出されなかった（レーン２および４）。以上の結果から、ｈＡＴ１Ｒ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて、長波長紫外線を照射した光開裂による溶出方法によりＳＴＡ−ＡＴ ＩＩ対応付け分子からのｓｔａ−ａｔｉｉ ＤＮＡが特異的に高効率で回収できることが示された。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、標的物質に特異的に結合する対応付け分子を高効率でスクリーニングすることができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結されている対応付け分子。
【請求項２】
前記リンカーが、長波長紫外線により切断可能なリンカーである請求項１記載の対応付け分子。
【請求項３】
請求項１または２記載の対応付け分子からなるライブラリー。
【請求項４】
タンパク質をコードする核酸を転写および／または翻訳したときに前記タンパク質と前記核酸とが連結されるように構築された前記核酸を準備し、準備した核酸を無細胞タンパク質合成系または生細胞を用いて転写および／または翻訳することにより、前記タンパク質と前記核酸とを連結する対応付け分子の製造方法において、
前記核酸を転写および／または翻訳したときに、前記タンパク質と前記核酸とが、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結されるように前記核酸が構築されている、請求項１記載の対応付け分子の製造方法。
【請求項５】
核酸ライブラリーを構成する各核酸から請求項４記載の製造方法により対応付け分子を製造することを含む、対応付け分子のライブラリーの製造方法。
【請求項６】
核酸ライブラリーから、標的物質と相互作用するタンパク質をコードする核酸をスクリーニングする方法であって、
前記核酸ライブラリーから、請求項５記載の製造方法により対応付け分子のライブラリーを製造する工程、
前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、
標的物質に結合した対応付け分子を分離する工程、
分離した対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させる工程、および、
遊離した核酸を回収する工程
を含む前記方法。
【請求項１】
タンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結されている対応付け分子。
【請求項２】
前記リンカーが、長波長紫外線により切断可能なリンカーである請求項１記載の対応付け分子。
【請求項３】
請求項１または２記載の対応付け分子からなるライブラリー。
【請求項４】
タンパク質をコードする核酸を転写および／または翻訳したときに前記タンパク質と前記核酸とが連結されるように構築された前記核酸を準備し、準備した核酸を無細胞タンパク質合成系または生細胞を用いて転写および／または翻訳することにより、前記タンパク質と前記核酸とを連結する対応付け分子の製造方法において、
前記核酸を転写および／または翻訳したときに、前記タンパク質と前記核酸とが、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結されるように前記核酸が構築されている、請求項１記載の対応付け分子の製造方法。
【請求項５】
核酸ライブラリーを構成する各核酸から請求項４記載の製造方法により対応付け分子を製造することを含む、対応付け分子のライブラリーの製造方法。
【請求項６】
核酸ライブラリーから、標的物質と相互作用するタンパク質をコードする核酸をスクリーニングする方法であって、
前記核酸ライブラリーから、請求項５記載の製造方法により対応付け分子のライブラリーを製造する工程、
前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、
標的物質に結合した対応付け分子を分離する工程、
分離した対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させる工程、および、
遊離した核酸を回収する工程
を含む前記方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６７７４２
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４７８８（Ｐ２００５−５０４７８８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１００４
【国際出願日】平成１６年２月２日（２００４．２．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１００４
【国際出願日】平成１６年２月２日（２００４．２．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
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