前立腺がんの診断のためのポリペプチドマーカー
試料が尿試料または精液試料である、分子量および泳動時間について下記の値によって特徴づけられるポリペプチドマーカーがマーカー１ないし４４および５２ないし７８（頻度マーカー）から選択される、試料中の少なくとも３種類のポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定する段階を含み、またはマーカー４５ないし５１および７９ないし１１５（振幅マーカー）から選択される少なくとも一つのポリペプチドマーカーの振幅を測定する段階を含む、前立腺がんの診断のための方法：
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺がん（ＰＣＡ）の診断のための被験者由来の試料中の一種類以上のペプチドマーカーの存在または非存在の使用および、一または複数のペプチドマーカーの存在または非存在が前立腺がんの存在を示す前立腺がんの診断のための方法に関する。
【０００２】
前立腺のがんは男性において最も一般的ながんの一つである。愁訴は疾患の進行した段階でのみ起こるため、前立腺がんは早期段階では、早期発見のための定期スクリーニング検査（デジタル直腸検査および血中ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）値）によってのみ診断されうる。疑い診断を確認するために、組織標本が細針生検によって採取される。
【０００３】
治療のためには、腫瘍の種類および段階に応じた、および患者の個別の必要性に応じたいくつかの可能性がある。初期段階では、小線源挿入（ヨウ素−１２５放射線源の前立腺内への、侵襲が最小限の導入）または腫瘍の外科的除去および体外からの照射が利用可能である。
【０００４】
診断時に、他臓器への転移が患者の三分の一で既に起こっている；この時、本疾患はもはや治癒困難である。しかし、放射線療法、化学療法またはホルモン療法（併用が可能である）は、がんのさらなる拡散を遅らせることができる。前立腺が単独で冒されている、すなわち、転移がまだ起こっていない場合、予後は良好である。
【０００５】
前立腺の良性腫瘍（腺腫）である良性前立腺過形成（ＢＰＨ）は、前立腺がんよりもはるかに高頻度で起こる。先行技術によると、ＰＳＡ値を用いて悪性がんからＢＰＨは非常に低い信頼性でしか識別できない。この場合にもまた、明確な診断を行うことができるためには生検を実施しなければならない。
【０００６】
上記の通り、前立腺がんの非侵襲的なおよび信頼性の高い早期検出法は存在しない。現在まで、明確な診断は、生検のような侵襲的操作を伴っている。したがって、可能な限り侵襲性が低く、迅速でおよび安価な前立腺がんの診断のための過程および方法を見出す必要性がある。
【０００７】
ＷＯ ０３／０７２７１０は、前立腺がん細胞とＢＰＨを識別するためのタンパク質バイオマーカーを記載する。該出願は高い不確実性（(０．５％を上回る範囲の）を有するマーカーを記載する。不正確な情報のために、この範囲内の多数の分子から個々のマーカーへの割り当ては事実上不可能である。前立腺上皮細胞の細胞溶解物が好ましくは試料材料として用いられ、これは複雑な試料採取手順を必要とする。定義に含まれるタンパク質の数が多いことおよび試料採取の困難のため、その方法はほとんど適切でない。
【０００８】
ＷＯ ０１／２５７９１は、マーカーを用いる前立腺がんの診断のための方法を記載する。前述のマーカーはタンパク質セミノジェリンＩに由来する。示される質量は(０．５％だけの確実性で定義される。試験は上記のマーカー画布適当であることを示す。
【０００９】
驚くべきことに、被験者に由来する試料中の特定のペプチドマーカーが、前立腺がんの診断に、および前立腺がんと良性前立腺過形成（ＢＰＨ）を識別するための鑑別診断に使用されうることが現在見出されている。特に、試料は、非侵襲的に採取される、尿または精液試料でありうる。
【００１０】
そのため、本発明は、被験者に由来する試料中の少なくとも３種類のポリペプチドマーカーの存在または非存在の、前立腺がんの診断のための使用に関し、前記ポリペプチドマーカーは表１に示す通り分子量および泳動時間によって特徴づけられるポリペプチドマーカー１ないし１１５から選択される。
【表１】
【００１１】
本発明を用いて、前立腺がんを非常に早期に診断することが可能である。したがって、本疾患は公知の方法によって早期に治療されうる。本発明はさらに、一部非侵襲的な、または最小限に侵襲的な操作だけで、低い費用で迅速なおよび信頼性の高い診断を可能にする。
【００１２】
本発明はさらに、前立腺がんとＢＰＨを識別するための鑑別診断に関する。鑑別診断は、被験者に由来する試料中の少なくとも３種類のポリペプチドマーカーの存在または非存在を用いることによって達成でき、前記ポリペプチドマーカーは表２に示す通り分子量および泳動時間によって特徴づけられるポリペプチドマーカー５２ないし７８から選択される。好ましくは、より多数のマーカーが用いられる。
【表２】
【００１３】
泳動時間は、たとえば、実施例に項目２として示される通り、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって測定される。この実施例では、長さ９０ｃｍおよび内径（ＩＤ）５０μｍおよび外径（ＯＤ）３６０μｍのガラスキャピラリーが付加電圧３０ｋＶにて操作される。移動相溶媒として３０％メタノール、０．５％ギ酸を含む水が使用される。
【００１４】
ＣＥ泳動時間は変動しうることが知られている。にもかかわらず、ポリペプチドマーカーが溶出される順序は典型的には使用される任意のＣＥ系について記載の条件下で同一である。泳動時間にそれにもかかわらず起こりうる何らかの差のバランスを取るために、系は泳動時間が正確に知られている標準物質を用いて正規化されうる。これらの標準物質は、たとえば、実施例に記載されるポリペプチドでありうる（実施例の項目３を参照）。
【００１５】
表１から２に示されるポリペプチドの特徴づけは、たとえばノイホフ（Ｎｅｕｈｏｆｆ）ら（Ｒａｐｉｄ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２００４，Ｖｏｌ．２０，ｐａｇｅｓ １４９−１５６）によって詳細に記載されている方法である、キャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）を用いて測定された。各測定間または異なる質量分析計間の分子量の変動は、較正が正確である場合には相対的に小さく、典型的には(０．０３％の範囲内、好ましくは(０．０１％の範囲内である。
【００１６】
本発明に記載のポリペプチドマーカーは、タンパク質またはペプチド、またはタンパク質またはペプチドの分解産物である。それらは、たとえば、グリコシル化、リン酸化、アルキル化またはジスルフィド架橋といった翻訳後修飾によって、または、たとえば分解の範囲内の他の反応によって、化学的に修飾されうる。加えて、ポリペプチドマーカーはまた、試料の精製中に化学的に変化、たとえば、酸化されうる。
【００１７】
ポリペプチドマーカーを決定するパラメーター（分子量および泳動時間）から進んで、対応するポリペプチドの配列を同定することが先行技術で公知の方法によって可能である。
【００１８】
本発明に記載のポリペプチド（表１から５を参照）が、前立腺がんを診断するのに用いられる。「診断」とは、症状または現象を疾患または傷害に割り当てることによって知識を得る過程を意味する。この場合には、前立腺がんの存在が特定のポリペプチドマーカーの存在または非存在から結論される。このように、本発明に記載のポリペプチドマーカーが被験者由来の試料において測定され、頻度マーカーの場合にはその存在または非存在が、前立腺がんの存在を結論することを可能にする。ポリペプチドマーカーの存在または非存在は、先行技術で公知である任意の方法によって測定されうる。使用されうる方法が下記に例示される。
【００１９】
ポリペプチドマーカーは、その測定値が少なくともその閾値と同じ高さであるならば、存在するとみなされる。測定値がより低いならば、ポリペプチドマーカーは存在しないとみなされる。閾値は測定法の感度（検出限界）によって決定されうるかまたは経験的に定義されうる。
【００２０】
本発明に関連して、好ましくはある分子量について試料の測定値がブランク試料（たとえば、緩衝液または溶媒のみ）の測定値より少なくとも２倍高いならば、閾値を超えるとみなされる。
【００２１】
一または複数のポリペプチドマーカーが、その存在または非存在が測定される方法で用いられ、存在または非存在が前立腺がんを示す（頻度マーカー）。このように、ポリペプチドマーカー番号１から１１といった、典型的には前立腺がんを有する患者（疾患）に存在するが、前立腺がんの無い被験者（対照）には存在しないポリペプチドマーカーがある。加えて、前立腺がんの無い被験者に存在するが、前立腺がんを有する被験者にはより低頻度に存在するかまたは全く存在しない、たとえば、番号１２から４４（表３）のようなポリペプチドマーカーがある。
【表３】
【００２２】
頻度マーカー（存在または非存在の測定）に加えてまたは代替的に、表４に記載の振幅マーカーもまた前立腺がんの診断に使用されうる（番号４５−５１、７９−１１５）。振幅マーカーは、存在または非存在が決定的でなく、シグナルの高さ（振幅）がそのシグナルが両方の群で存在するかどうかを決定するような方法で使用される。表５では、対応するシグナル（質量および泳動時間によって特徴づけられる）の、測定されたすべての試料にわたって平均された平均振幅が示される。別々に濃縮された試料または異なる測定方法間の適合性を達成するために、試料のすべてのペプチドシグナルは総振幅１００万カウントに対して正規化される。したがって、各マーカーそれぞれの平均振幅は百万分率（ｐｐｍ）として示される。使用したすべての群は、信頼性のある平均振幅を得るために、少なくとも２０の個別の患者または対照試料から成る。診断についての決定（ＰＣＡまたはそうでない）は、ＰＣＡ群の対照群における平均振幅と比較して患者試料中の各ポリペプチドマーカーの振幅がどのくらい高いかの関数として行われる。振幅がＰＣＡ群の平均振幅により対応すれば、ＰＣＡの存在が考慮されるべきであり、および振幅が対照群の平均振幅により対応すれば、ＰＣＡの非存在が考慮されるべきである。より正確な定義は、マーカー番号４８（表４）によって与えられる。本マーカーの平均振幅はＰＣＡにおいて顕著に上昇する（２６００ｐｐｍに対し対照群では１６００ｐｐｍ）。ここで、患者試料中のこのマーカーについての値が０ないし１６００ｐｐｍであるかまたはこの範囲を最大２０％超える、すなわち、０ないし１９２０ｐｐｍであるならば、この試料は対照群に属する。その値が２６００ｐｐｍまたは最大２０％下回るまたはより高い、すなわち、２０８０ないし非常に高値であるならば、ＰＣＡの存在が考慮されるべきである。
【００２３】
対照群とＰＣＡ群の振幅間の隔たりが小さいほど、その二つの参照値の間にある値は参照値のうちの一方に近くなければならない。
【００２４】
一つの可能性は、平均振幅間の範囲を３つの部分へさらに分割することである。値が下側３分の１内にあるならば、これは低値を示す；値が上側３分の１内にあるならば、これは高値を示す。値が中央３分の１内にあるならば、このマーカーについて明確な陳述は不可能である。
【表４】
【００２５】
ＰＣＡとＢＰＨの鑑別診断について、表５はマーカー番号５２から５８といった、前立腺がんを有する患者に典型的には存在するがＢＰＨを有する被験者には存在しないかまたはほとんど存在しないポリペプチドマーカーを示す。さらに、たとえばポリペプチドマーカー番号５９から７８のような、ＢＰＨを有する被験者に存在するがＰＣＡを有する被験者ではより低頻度に存在するかまたは全く存在しないポリペプチドマーカーがある。
【表５】
【００２６】
一種類以上のポリペプチドマーカーの存在または非存在または振幅が測定される試料が由来する被験者は、前立腺がんにかかることのできる任意の対象、たとえば、動物またはヒトでありうる。好ましくは、被験者はイヌまたはウマといった哺乳類であり、および非常に好ましくは、被験者はヒトである。
【００２７】
本発明の適用のために、一つのポリペプチドマーカーだけでなく、マーカーの組み合わせが前立腺がんを診断するのに用いられ、前立腺がんの存在がそれらの存在または非存在および／または振幅の高さから結論される。複数のポリペプチドマーカーを比較することによって、患者または対照における典型的な存在確率からのいくつかの個別の変動から生じる全体結果の偏りが低減または回避されうる。
【００２８】
本発明に記載の一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在が測定される試料は、被験者の体から得られる任意の試料でありうる。試料は、被験者の状態についての情報（前立腺がんまたはそうでない）を提供するのに適したポリペプチド組成を有する試料である。たとえば、試料は尿、精子、精液（精虫を含まない精液）でありうる。好ましくは、試料は液体試料である。
【００２９】
好ましい一実施形態では、試料は尿試料である。
【００３０】
尿試料は先行技術で公知の通り採取されうる。好ましくは、中間尿試料が本発明に関連して用いられる。たとえば、尿試料はカテーテルによって、またはＷＯ ０１／７４２７５に記載の排尿器具によってもまた、採取されうる。
【００３１】
試料中のポリペプチドマーカーの存在または非存在は、ポリペプチドマーカーの測定に適した先行技術で公知の任意の方法によって測定されうる。そのような方法は当業者に公知である。原則的に、ポリペプチドマーカーの存在または非存在は、質量分析のような直接的方法、または、たとえばリガンドを用いるような間接的方法によって測定されうる。
【００３２】
必要であればまたは望ましければ、被験者由来の試料、たとえば尿試料は、任意の適当な方法で前処理することができ、および、一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在が測定される前にたとえば精製または分離されうる。処理は、たとえば、精製、分離、希釈または濃縮を含みうる。方法は、たとえば、遠心分離、ろ過、限外ろ過、透析、沈澱、または、アフィニティ分離またはイオン交換クロマトグラフィーによる分離といったクロマトグラフィー法、または電気泳動分離でありうる。その具体例は、ゲル電気泳動、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、金属アフィニティクロマトグラフィー、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、レクチンを用いるアフィニティクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、順相および逆相ＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび表面への選択的結合である。これらの方法のすべてが当業者に公知であり、および当業者はその方法を、使用する試料および一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定するための方法の関数として選択することができる。
【００３３】
本発明の一実施形態では、試料は、測定される前に、キャピラリー電気泳動によって分離され、超遠心分離によって精製されおよび／または限外ろ過によって特定の分子サイズのポリペプチドマーカーを含む画分へと分割される。
【００３４】
好ましくは、ポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定するために質量分析法が用いられ、試料の精製または分離がその方法の上流で実施されうる。現在用いられている方法と比較して、質量分析は、試料の多数の（＞１００）ポリペプチドが単一の分析によって測定されうるという長所を有する。任意の種類の質量分析計が使用されうる。質量分析によって、１０ｆｍｏｌのポリペプチドマーカー、すなわち、０．１ｎｇの１０ｋＤａタンパク質を、複雑な混合物中で約(０．０１％の測定精度でルーチンとして測定することが可能である。質量分析計では、イオン生成部が適当な分析装置と連結されている。たとえば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェイスは主に液体試料中のイオンを測定するのに用いられ、一方、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）法はマトリクスと結晶化した試料由来のイオンを測定するのに用いられる。生成したイオンを分析するためには、四重極、イオントラップまたは飛行時間（ＴＯＦ）分析器が使用されうる。
【００３５】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）では、溶液中に存在する分子は、特に高電圧（たとえば、１〜８ｋＶ）の影響下で噴霧され、荷電した小滴を形成し、小滴は溶媒の蒸発からさらに小さくなる。最後に、いわゆるクーロン爆発が遊離イオンの形成を引き起こし、遊離イオンはその後分析および検出されうる。
【００３６】
ＴＯＦによるイオンの分析では、イオンに等量の運動エネルギーを与える一定の加速電圧が加えられる。その後、各イオンが肥厚チューブを通じて特定の漂流距離を移動するのに要する時間が非常に正確に測定される。等量の運動エネルギーでは、イオンの速度は質量に依存するため、したがって質量が測定されうる。ＴＯＦ分析器は非常に高いスキャン速度を有し、およびしたがって非常に高い分解能に達する。
【００３７】
ポリペプチドマーカーの存在および非存在の測定のための好ましい方法は、気相イオンスペクトル法、たとえばレーザー脱離／イオン化質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（表面増強レーザー脱離／イオン化）、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）、２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＳおよびキャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）を含む。上記のすべての方法が当業者に公知である。
【００３８】
特に好ましい方法が、キャピラリー電気泳動が質量分析と組み合わされるＣＥ−ＭＳである。この方法は、たとえば、独国特許出願ＤＥ １００２１７３７に、Ｋａｉｓｅｒら（Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ，２００３，Ｖｏｌ．１０１３： １５７−１７１，および Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００４，２５： ２０４４−２０５５）に、およびウィトケ（Ｗｉｔｔｋｅ）ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２００３，１０１３： １７３−１８１）にある程度詳細に記載されている。ＣＥ−ＭＳ技術は、試料の数百のポリペプチドマーカーの存在を同時に短時間内におよび少量で高感度で測定することを可能にする。試料が測定された後、測定されたポリペプチドマーカーのパターンが作成される。このパターンは、患者または健常者の参照パターンと比較されうる。大部分の場合で、限られた数のポリペプチドマーカーを使用するのが前立腺がんの診断および前立腺がんとＢＰＨの鑑別診断には十分である。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ装置にオンラインで連結されたＣＥを含むＣＥ−ＭＳ法がさらに好ましい。
【００３９】
ＣＥ−ＭＳのためには、揮発性溶媒の使用が好ましく、および本質的に塩を含まない条件下で最も良く働く。適した溶媒の例は、アセトニトリル、メタノールなどを含む。溶媒は、水で希釈されうるかまたは、分析物、好ましくはポリペプチドをプロトン化するために弱酸（たとえば、０．１％ないし１％ギ酸）と混合されうる。
【００４０】
キャピラリー電気泳動を用いて、分子を電荷およびサイズによって分離することが可能である。中性粒子は電流を加える際に電気浸透流動の速度で泳動し、一方で陽イオンは正極に向かって加速し、および陰イオンは遅延する。電気泳動におけるキャピラリーの長所は、体積に対する表面の比が有利なことにあり、これは電流フローの間に生じるジュール熱の良好な損失を可能にする。これは今度は高電圧（通常は最大３０ｋＶ）の適用を可能にし、およびそのようにして高い分離性能および短い分析時間を可能にする。
【００４１】
キャピラリー電気泳動では、典型的には５０ないし７５μｍの内径を有するシリカガラスキャピラリーが通常用いられる。使用される長さは３０ないし１００ｃｍである。加えて、キャピラリーは通常はプラスチック被覆シリカガラス製である。キャピラリーは、未処理、すなわち内表面上の親水基を曝露しているか、または内表面が被覆されているかの両方でありうる。疎水性コーティングは分解能を改善するために使用されうる。電圧に加えて、圧力もまた加えることができ、圧力は典型的には０ないし１ｐｓｉの範囲内である。圧力もまた、実施中にのみ加えることができるか、または途中で変化させることができる。
【００４２】
ポリペプチドマーカーの測定のための好ましい方法では、試料のマーカーはキャピラリー電気泳動を用いて分離され、次いで直接にイオン化され、および検出のために連結された質量分析計へオンラインで移送される。
【００４３】
本発明に記載の方法では、前立腺がんの診断のためにいくつかのポリペプチドマーカーを使用することが有利である。特に、たとえば、マーカー１、２および３；１、２および４；などといった、少なくとも３種類のポリペプチドマーカーが使用されうる。
【００４４】
より好ましいのは、少なくとも４、５または６種類のマーカーの使用である。
【００４５】
さらにより好ましいのは、少なくとも１１種類のマーカー、たとえば、マーカー１から１１の使用である。
【００４６】
非常に好ましいのは、表１または３に列記されたすべてのマーカーの使用である。
【００４７】
いくつかのマーカーはまた、ＰＣＡとＢＰＨの鑑別診断に使用されうる。特に、たとえば、マーカー４５、４６および４７；４５、４６および４８；などといった、少なくとも３種類のポリペプチドマーカーが使用されうる。
【００４８】
より好ましいのは、少なくとも４、５または６種類のマーカーの使用である。
【００４９】
さらにより好ましいのは、少なくとも７種類のマーカー、たとえば、マーカー１から７の使用である。
【００５０】
非常に好ましいのは、表２または４に列記された２７マーカーすべての使用である。
【００５１】
いくつかのマーカーが用いられる場合に前立腺がんの存在の確率を測定するためには、当業者に公知である統計的手法が使用されうる。たとえば、ワイシンガー（Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ）らによって記載されたランダムフォレスト法（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，２００４，６５： ２４２６−２４３４）が、Ｓ−プラスといったコンピュータープログラムを用いることによって使用されうる。
【実施例】
【００５２】
１．試料調製
前立腺がんに関するポリペプチドマーカーを検出するために、尿を用いた。尿は健常者（対照群）から、および前立腺がんまたはＢＰＨに罹患した患者から採取された。
【００５３】
以降のＣＥ−ＭＳ測定のために、アルブミンおよび免疫グロブリンといった、より高濃度で患者の尿に含まれるタンパク質は限外ろ過によって分離除去されなければならなかった。したがって、尿５００μｌを取り、および２ｍｌのろ過緩衝液（４Ｍ 尿素、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ アンモニア）と混合した。この２．５ｍｌの試料量を限外ろ過した（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）３０ｋＤａ、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）米国ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ））。限外ろ過は３０００ｒｐｍにて遠心分離機中で、限外ろ液２ｍｌが得られるまで実施された。
【００５４】
得られたろ液２ｍｌを、尿素、塩類および他の妨害成分を除去するためにファルマシアＣ−２カラム（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、スウェーデン、ウプサラ）に加えた。結合したポリペプチドを次いでＣ−２カラムから、５０％アセトニトリル、０．５％ギ酸を含む水で溶出し、および凍結乾燥した。ＣＥ−ＭＳ測定のために、ポリペプチドを次いで水２０μｌの水（ＨＰＬＣグレード、メルク社（Ｍｅｒｃｋ））に再懸濁した。
【００５５】
２．ＣＥ−ＭＳ 測定
ＣＥ−ＭＳ測定は、ベックマン・コールター社のキャピラリー電気泳動システム（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱシステム；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．，米国フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ））およびブルカーＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計（ｍｉｃｒｏ−ＴＯＦＭＳ、ブルカー・ダルトニクス社（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）、ドイツ、ブレーメン）を用いて実施された。
【００５６】
ＣＥキャピラリーはベックマン・コールター社から調達され、およびＩＤ／ＯＤ５０／３６０μｍおよび長さ９０ｃｍであった。ＣＥ分離のための移動相は、３０％メタノールおよび０．５％ギ酸を含む水から成った。ＭＳでの「シース流」用には、０．５％ギ酸を含む３０％イソプロパノールが流速２μｌ／分にて用いられた。ＣＥおよびＭＳの連結はＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳスプレイヤー・キット（アジレント・テクノロジーズ社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ドイツ、ワルドブロン（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ））によって実現された。
【００５７】
試料を注入するには、１ないし最大６ｐｓｉの圧力が加えられ、および注入の持続時間は９９秒であった。これらのパラメーターを用いて、試料約１５０ｎｌがキャピラリーに注入され、これは、キャピラリー体積の約１０％に相当する。キャピラリー中の試料を濃縮するためにスタッキング法が用いられた。このように、試料が注入される前に、１ＭＮＨ3溶液が７秒間（１ｐｓｉにて）注入され、および試料が注入された後に、２Ｍギ酸溶液が５秒間注入された。分離電圧（３０ｋＶ）が加えられた後、分析物はこれらの溶液の間で自動的に濃縮された。
【００５８】
以降のＣＥ分離は圧力法を用いて実施された：０ｐｓｉにて４０分、次いで０．１ｐｓｉにて２分、０．２ｐｓｉにて２分、０．３ｐｓｉにて２分、０．４ｐｓｉにて２分、および最後に０．５ｐｓｉにて３２分。分離実行の合計時間はしたがって８０分であった。
【００５９】
ＭＳの側で可能な限り良好なシグナル強度を得るために、ネブライザーガスは可能な最低値に設定された。エレクトロスプレーを生じるためにスプレーニードルに加えられた電圧は３７００〜４１００Ｖであった。質量分析計でのその他の設定は、取扱説明書に従ってペプチド検出用に最適化された。スペクトルは質量範囲ｍ／ｚ４００からｍ／ｚ３０００に渡って記録され、および３秒毎に蓄積された。
【００６０】
３．ＣＥ測定用標準
ＣＥ測定を点検および較正するために、選択された条件下での記載のＣＥ泳動時間によって特徴づけられる下記のタンパク質またはポリペプチドが用いられた：
【００６１】
タンパク質／ポリペプチドはそれぞれ１０ｐｍｏｌ／μｌ水の濃度にて使用された。"ＲＥＶ"、"ＥＬＭ、"ＫＩＮＣＯＮ"および"ＧＩＶＬＹ"は合成ペプチドである。
【００６２】
ペプチドの分子量およびＭＳで見られる各荷電状態のｍ／ｚ比を下記の表に列記する：
【００６３】
実施例４．ＷＯ ０１／２５７９１に記載のマーカーの性能
ＷＯ ０１／２５７９１は１１種類のマーカーに言及し（その請求項２を参照）、および質量測定の精度は０．５％と述べられている。これらがセミノジェリンＩの断片だけと考えるならば、セミノジェリンの可能な断片の下記の数が得られる：
【００６４】
さらに、ＷＯ ０１／２５７９１は前立腺がんの存在を否定するマーカーを開示する。可能な断片の数が下記の表に含まれる：
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】図１は、例証的に一つの質量について、この重量範囲で可能な多数の配列を示す。 次の段階で、前立腺がんまたはＢＰＨを有する患者に由来する尿試料中の対応するタンパク質を分析することが試みられた。６種類のマーカーだけを見つけることができた。
【図１Ｂ】図１は、例証的に一つの質量について、この重量範囲で可能な多数の配列を示す。 次の段階で、前立腺がんまたはＢＰＨを有する患者に由来する尿試料中の対応するタンパク質を分析することが試みられた。６種類のマーカーだけを見つけることができた。
【図２】図２はこの方法で見出された６種類のマーカーの振幅の測定を示す。前立腺がん患者と対照群との間に有意差は無いことが見出された。その後、バイオマーカーの識別値はＲＯＣ（受診者動作特性曲線）分析によって試験された。
【図３Ａ】図３ＡはＷＯ ０１／２５７９１に記載されおよび尿試料中に見出すことのできた６種類のマーカーについて対応する分析を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは本特許明細書の番号１から７８の本発明に記載のバイオマーカーの対応するＲＯＣ試験を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは本発明に記載のマーカーの部分群（１６マーカー）のＲＯＣ分析を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄはその有意性は本発明に記載の３種類のバイオマーカーすなわちマーカー２４、４１および４６のみが使用された場合でさえＷＯ ０１／２５７９１ の有意性よりも明らかに高いことを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺がん（ＰＣＡ）の診断のための被験者由来の試料中の一種類以上のペプチドマーカーの存在または非存在の使用および、一または複数のペプチドマーカーの存在または非存在が前立腺がんの存在を示す前立腺がんの診断のための方法に関する。
【０００２】
前立腺のがんは男性において最も一般的ながんの一つである。愁訴は疾患の進行した段階でのみ起こるため、前立腺がんは早期段階では、早期発見のための定期スクリーニング検査（デジタル直腸検査および血中ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）値）によってのみ診断されうる。疑い診断を確認するために、組織標本が細針生検によって採取される。
【０００３】
治療のためには、腫瘍の種類および段階に応じた、および患者の個別の必要性に応じたいくつかの可能性がある。初期段階では、小線源挿入（ヨウ素−１２５放射線源の前立腺内への、侵襲が最小限の導入）または腫瘍の外科的除去および体外からの照射が利用可能である。
【０００４】
診断時に、他臓器への転移が患者の三分の一で既に起こっている；この時、本疾患はもはや治癒困難である。しかし、放射線療法、化学療法またはホルモン療法（併用が可能である）は、がんのさらなる拡散を遅らせることができる。前立腺が単独で冒されている、すなわち、転移がまだ起こっていない場合、予後は良好である。
【０００５】
前立腺の良性腫瘍（腺腫）である良性前立腺過形成（ＢＰＨ）は、前立腺がんよりもはるかに高頻度で起こる。先行技術によると、ＰＳＡ値を用いて悪性がんからＢＰＨは非常に低い信頼性でしか識別できない。この場合にもまた、明確な診断を行うことができるためには生検を実施しなければならない。
【０００６】
上記の通り、前立腺がんの非侵襲的なおよび信頼性の高い早期検出法は存在しない。現在まで、明確な診断は、生検のような侵襲的操作を伴っている。したがって、可能な限り侵襲性が低く、迅速でおよび安価な前立腺がんの診断のための過程および方法を見出す必要性がある。
【０００７】
ＷＯ ０３／０７２７１０は、前立腺がん細胞とＢＰＨを識別するためのタンパク質バイオマーカーを記載する。該出願は高い不確実性（(０．５％を上回る範囲の）を有するマーカーを記載する。不正確な情報のために、この範囲内の多数の分子から個々のマーカーへの割り当ては事実上不可能である。前立腺上皮細胞の細胞溶解物が好ましくは試料材料として用いられ、これは複雑な試料採取手順を必要とする。定義に含まれるタンパク質の数が多いことおよび試料採取の困難のため、その方法はほとんど適切でない。
【０００８】
ＷＯ ０１／２５７９１は、マーカーを用いる前立腺がんの診断のための方法を記載する。前述のマーカーはタンパク質セミノジェリンＩに由来する。示される質量は(０．５％だけの確実性で定義される。試験は上記のマーカー画布適当であることを示す。
【０００９】
驚くべきことに、被験者に由来する試料中の特定のペプチドマーカーが、前立腺がんの診断に、および前立腺がんと良性前立腺過形成（ＢＰＨ）を識別するための鑑別診断に使用されうることが現在見出されている。特に、試料は、非侵襲的に採取される、尿または精液試料でありうる。
【００１０】
そのため、本発明は、被験者に由来する試料中の少なくとも３種類のポリペプチドマーカーの存在または非存在の、前立腺がんの診断のための使用に関し、前記ポリペプチドマーカーは表１に示す通り分子量および泳動時間によって特徴づけられるポリペプチドマーカー１ないし１１５から選択される。
【表１】
【００１１】
本発明を用いて、前立腺がんを非常に早期に診断することが可能である。したがって、本疾患は公知の方法によって早期に治療されうる。本発明はさらに、一部非侵襲的な、または最小限に侵襲的な操作だけで、低い費用で迅速なおよび信頼性の高い診断を可能にする。
【００１２】
本発明はさらに、前立腺がんとＢＰＨを識別するための鑑別診断に関する。鑑別診断は、被験者に由来する試料中の少なくとも３種類のポリペプチドマーカーの存在または非存在を用いることによって達成でき、前記ポリペプチドマーカーは表２に示す通り分子量および泳動時間によって特徴づけられるポリペプチドマーカー５２ないし７８から選択される。好ましくは、より多数のマーカーが用いられる。
【表２】
【００１３】
泳動時間は、たとえば、実施例に項目２として示される通り、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって測定される。この実施例では、長さ９０ｃｍおよび内径（ＩＤ）５０μｍおよび外径（ＯＤ）３６０μｍのガラスキャピラリーが付加電圧３０ｋＶにて操作される。移動相溶媒として３０％メタノール、０．５％ギ酸を含む水が使用される。
【００１４】
ＣＥ泳動時間は変動しうることが知られている。にもかかわらず、ポリペプチドマーカーが溶出される順序は典型的には使用される任意のＣＥ系について記載の条件下で同一である。泳動時間にそれにもかかわらず起こりうる何らかの差のバランスを取るために、系は泳動時間が正確に知られている標準物質を用いて正規化されうる。これらの標準物質は、たとえば、実施例に記載されるポリペプチドでありうる（実施例の項目３を参照）。
【００１５】
表１から２に示されるポリペプチドの特徴づけは、たとえばノイホフ（Ｎｅｕｈｏｆｆ）ら（Ｒａｐｉｄ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２００４，Ｖｏｌ．２０，ｐａｇｅｓ １４９−１５６）によって詳細に記載されている方法である、キャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）を用いて測定された。各測定間または異なる質量分析計間の分子量の変動は、較正が正確である場合には相対的に小さく、典型的には(０．０３％の範囲内、好ましくは(０．０１％の範囲内である。
【００１６】
本発明に記載のポリペプチドマーカーは、タンパク質またはペプチド、またはタンパク質またはペプチドの分解産物である。それらは、たとえば、グリコシル化、リン酸化、アルキル化またはジスルフィド架橋といった翻訳後修飾によって、または、たとえば分解の範囲内の他の反応によって、化学的に修飾されうる。加えて、ポリペプチドマーカーはまた、試料の精製中に化学的に変化、たとえば、酸化されうる。
【００１７】
ポリペプチドマーカーを決定するパラメーター（分子量および泳動時間）から進んで、対応するポリペプチドの配列を同定することが先行技術で公知の方法によって可能である。
【００１８】
本発明に記載のポリペプチド（表１から５を参照）が、前立腺がんを診断するのに用いられる。「診断」とは、症状または現象を疾患または傷害に割り当てることによって知識を得る過程を意味する。この場合には、前立腺がんの存在が特定のポリペプチドマーカーの存在または非存在から結論される。このように、本発明に記載のポリペプチドマーカーが被験者由来の試料において測定され、頻度マーカーの場合にはその存在または非存在が、前立腺がんの存在を結論することを可能にする。ポリペプチドマーカーの存在または非存在は、先行技術で公知である任意の方法によって測定されうる。使用されうる方法が下記に例示される。
【００１９】
ポリペプチドマーカーは、その測定値が少なくともその閾値と同じ高さであるならば、存在するとみなされる。測定値がより低いならば、ポリペプチドマーカーは存在しないとみなされる。閾値は測定法の感度（検出限界）によって決定されうるかまたは経験的に定義されうる。
【００２０】
本発明に関連して、好ましくはある分子量について試料の測定値がブランク試料（たとえば、緩衝液または溶媒のみ）の測定値より少なくとも２倍高いならば、閾値を超えるとみなされる。
【００２１】
一または複数のポリペプチドマーカーが、その存在または非存在が測定される方法で用いられ、存在または非存在が前立腺がんを示す（頻度マーカー）。このように、ポリペプチドマーカー番号１から１１といった、典型的には前立腺がんを有する患者（疾患）に存在するが、前立腺がんの無い被験者（対照）には存在しないポリペプチドマーカーがある。加えて、前立腺がんの無い被験者に存在するが、前立腺がんを有する被験者にはより低頻度に存在するかまたは全く存在しない、たとえば、番号１２から４４（表３）のようなポリペプチドマーカーがある。
【表３】
【００２２】
頻度マーカー（存在または非存在の測定）に加えてまたは代替的に、表４に記載の振幅マーカーもまた前立腺がんの診断に使用されうる（番号４５−５１、７９−１１５）。振幅マーカーは、存在または非存在が決定的でなく、シグナルの高さ（振幅）がそのシグナルが両方の群で存在するかどうかを決定するような方法で使用される。表５では、対応するシグナル（質量および泳動時間によって特徴づけられる）の、測定されたすべての試料にわたって平均された平均振幅が示される。別々に濃縮された試料または異なる測定方法間の適合性を達成するために、試料のすべてのペプチドシグナルは総振幅１００万カウントに対して正規化される。したがって、各マーカーそれぞれの平均振幅は百万分率（ｐｐｍ）として示される。使用したすべての群は、信頼性のある平均振幅を得るために、少なくとも２０の個別の患者または対照試料から成る。診断についての決定（ＰＣＡまたはそうでない）は、ＰＣＡ群の対照群における平均振幅と比較して患者試料中の各ポリペプチドマーカーの振幅がどのくらい高いかの関数として行われる。振幅がＰＣＡ群の平均振幅により対応すれば、ＰＣＡの存在が考慮されるべきであり、および振幅が対照群の平均振幅により対応すれば、ＰＣＡの非存在が考慮されるべきである。より正確な定義は、マーカー番号４８（表４）によって与えられる。本マーカーの平均振幅はＰＣＡにおいて顕著に上昇する（２６００ｐｐｍに対し対照群では１６００ｐｐｍ）。ここで、患者試料中のこのマーカーについての値が０ないし１６００ｐｐｍであるかまたはこの範囲を最大２０％超える、すなわち、０ないし１９２０ｐｐｍであるならば、この試料は対照群に属する。その値が２６００ｐｐｍまたは最大２０％下回るまたはより高い、すなわち、２０８０ないし非常に高値であるならば、ＰＣＡの存在が考慮されるべきである。
【００２３】
対照群とＰＣＡ群の振幅間の隔たりが小さいほど、その二つの参照値の間にある値は参照値のうちの一方に近くなければならない。
【００２４】
一つの可能性は、平均振幅間の範囲を３つの部分へさらに分割することである。値が下側３分の１内にあるならば、これは低値を示す；値が上側３分の１内にあるならば、これは高値を示す。値が中央３分の１内にあるならば、このマーカーについて明確な陳述は不可能である。
【表４】
【００２５】
ＰＣＡとＢＰＨの鑑別診断について、表５はマーカー番号５２から５８といった、前立腺がんを有する患者に典型的には存在するがＢＰＨを有する被験者には存在しないかまたはほとんど存在しないポリペプチドマーカーを示す。さらに、たとえばポリペプチドマーカー番号５９から７８のような、ＢＰＨを有する被験者に存在するがＰＣＡを有する被験者ではより低頻度に存在するかまたは全く存在しないポリペプチドマーカーがある。
【表５】
【００２６】
一種類以上のポリペプチドマーカーの存在または非存在または振幅が測定される試料が由来する被験者は、前立腺がんにかかることのできる任意の対象、たとえば、動物またはヒトでありうる。好ましくは、被験者はイヌまたはウマといった哺乳類であり、および非常に好ましくは、被験者はヒトである。
【００２７】
本発明の適用のために、一つのポリペプチドマーカーだけでなく、マーカーの組み合わせが前立腺がんを診断するのに用いられ、前立腺がんの存在がそれらの存在または非存在および／または振幅の高さから結論される。複数のポリペプチドマーカーを比較することによって、患者または対照における典型的な存在確率からのいくつかの個別の変動から生じる全体結果の偏りが低減または回避されうる。
【００２８】
本発明に記載の一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在が測定される試料は、被験者の体から得られる任意の試料でありうる。試料は、被験者の状態についての情報（前立腺がんまたはそうでない）を提供するのに適したポリペプチド組成を有する試料である。たとえば、試料は尿、精子、精液（精虫を含まない精液）でありうる。好ましくは、試料は液体試料である。
【００２９】
好ましい一実施形態では、試料は尿試料である。
【００３０】
尿試料は先行技術で公知の通り採取されうる。好ましくは、中間尿試料が本発明に関連して用いられる。たとえば、尿試料はカテーテルによって、またはＷＯ ０１／７４２７５に記載の排尿器具によってもまた、採取されうる。
【００３１】
試料中のポリペプチドマーカーの存在または非存在は、ポリペプチドマーカーの測定に適した先行技術で公知の任意の方法によって測定されうる。そのような方法は当業者に公知である。原則的に、ポリペプチドマーカーの存在または非存在は、質量分析のような直接的方法、または、たとえばリガンドを用いるような間接的方法によって測定されうる。
【００３２】
必要であればまたは望ましければ、被験者由来の試料、たとえば尿試料は、任意の適当な方法で前処理することができ、および、一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在が測定される前にたとえば精製または分離されうる。処理は、たとえば、精製、分離、希釈または濃縮を含みうる。方法は、たとえば、遠心分離、ろ過、限外ろ過、透析、沈澱、または、アフィニティ分離またはイオン交換クロマトグラフィーによる分離といったクロマトグラフィー法、または電気泳動分離でありうる。その具体例は、ゲル電気泳動、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、金属アフィニティクロマトグラフィー、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、レクチンを用いるアフィニティクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、順相および逆相ＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび表面への選択的結合である。これらの方法のすべてが当業者に公知であり、および当業者はその方法を、使用する試料および一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定するための方法の関数として選択することができる。
【００３３】
本発明の一実施形態では、試料は、測定される前に、キャピラリー電気泳動によって分離され、超遠心分離によって精製されおよび／または限外ろ過によって特定の分子サイズのポリペプチドマーカーを含む画分へと分割される。
【００３４】
好ましくは、ポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定するために質量分析法が用いられ、試料の精製または分離がその方法の上流で実施されうる。現在用いられている方法と比較して、質量分析は、試料の多数の（＞１００）ポリペプチドが単一の分析によって測定されうるという長所を有する。任意の種類の質量分析計が使用されうる。質量分析によって、１０ｆｍｏｌのポリペプチドマーカー、すなわち、０．１ｎｇの１０ｋＤａタンパク質を、複雑な混合物中で約(０．０１％の測定精度でルーチンとして測定することが可能である。質量分析計では、イオン生成部が適当な分析装置と連結されている。たとえば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェイスは主に液体試料中のイオンを測定するのに用いられ、一方、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）法はマトリクスと結晶化した試料由来のイオンを測定するのに用いられる。生成したイオンを分析するためには、四重極、イオントラップまたは飛行時間（ＴＯＦ）分析器が使用されうる。
【００３５】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）では、溶液中に存在する分子は、特に高電圧（たとえば、１〜８ｋＶ）の影響下で噴霧され、荷電した小滴を形成し、小滴は溶媒の蒸発からさらに小さくなる。最後に、いわゆるクーロン爆発が遊離イオンの形成を引き起こし、遊離イオンはその後分析および検出されうる。
【００３６】
ＴＯＦによるイオンの分析では、イオンに等量の運動エネルギーを与える一定の加速電圧が加えられる。その後、各イオンが肥厚チューブを通じて特定の漂流距離を移動するのに要する時間が非常に正確に測定される。等量の運動エネルギーでは、イオンの速度は質量に依存するため、したがって質量が測定されうる。ＴＯＦ分析器は非常に高いスキャン速度を有し、およびしたがって非常に高い分解能に達する。
【００３７】
ポリペプチドマーカーの存在および非存在の測定のための好ましい方法は、気相イオンスペクトル法、たとえばレーザー脱離／イオン化質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（表面増強レーザー脱離／イオン化）、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）、２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＳおよびキャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）を含む。上記のすべての方法が当業者に公知である。
【００３８】
特に好ましい方法が、キャピラリー電気泳動が質量分析と組み合わされるＣＥ−ＭＳである。この方法は、たとえば、独国特許出願ＤＥ １００２１７３７に、Ｋａｉｓｅｒら（Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ，２００３，Ｖｏｌ．１０１３： １５７−１７１，および Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００４，２５： ２０４４−２０５５）に、およびウィトケ（Ｗｉｔｔｋｅ）ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２００３，１０１３： １７３−１８１）にある程度詳細に記載されている。ＣＥ−ＭＳ技術は、試料の数百のポリペプチドマーカーの存在を同時に短時間内におよび少量で高感度で測定することを可能にする。試料が測定された後、測定されたポリペプチドマーカーのパターンが作成される。このパターンは、患者または健常者の参照パターンと比較されうる。大部分の場合で、限られた数のポリペプチドマーカーを使用するのが前立腺がんの診断および前立腺がんとＢＰＨの鑑別診断には十分である。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ装置にオンラインで連結されたＣＥを含むＣＥ−ＭＳ法がさらに好ましい。
【００３９】
ＣＥ−ＭＳのためには、揮発性溶媒の使用が好ましく、および本質的に塩を含まない条件下で最も良く働く。適した溶媒の例は、アセトニトリル、メタノールなどを含む。溶媒は、水で希釈されうるかまたは、分析物、好ましくはポリペプチドをプロトン化するために弱酸（たとえば、０．１％ないし１％ギ酸）と混合されうる。
【００４０】
キャピラリー電気泳動を用いて、分子を電荷およびサイズによって分離することが可能である。中性粒子は電流を加える際に電気浸透流動の速度で泳動し、一方で陽イオンは正極に向かって加速し、および陰イオンは遅延する。電気泳動におけるキャピラリーの長所は、体積に対する表面の比が有利なことにあり、これは電流フローの間に生じるジュール熱の良好な損失を可能にする。これは今度は高電圧（通常は最大３０ｋＶ）の適用を可能にし、およびそのようにして高い分離性能および短い分析時間を可能にする。
【００４１】
キャピラリー電気泳動では、典型的には５０ないし７５μｍの内径を有するシリカガラスキャピラリーが通常用いられる。使用される長さは３０ないし１００ｃｍである。加えて、キャピラリーは通常はプラスチック被覆シリカガラス製である。キャピラリーは、未処理、すなわち内表面上の親水基を曝露しているか、または内表面が被覆されているかの両方でありうる。疎水性コーティングは分解能を改善するために使用されうる。電圧に加えて、圧力もまた加えることができ、圧力は典型的には０ないし１ｐｓｉの範囲内である。圧力もまた、実施中にのみ加えることができるか、または途中で変化させることができる。
【００４２】
ポリペプチドマーカーの測定のための好ましい方法では、試料のマーカーはキャピラリー電気泳動を用いて分離され、次いで直接にイオン化され、および検出のために連結された質量分析計へオンラインで移送される。
【００４３】
本発明に記載の方法では、前立腺がんの診断のためにいくつかのポリペプチドマーカーを使用することが有利である。特に、たとえば、マーカー１、２および３；１、２および４；などといった、少なくとも３種類のポリペプチドマーカーが使用されうる。
【００４４】
より好ましいのは、少なくとも４、５または６種類のマーカーの使用である。
【００４５】
さらにより好ましいのは、少なくとも１１種類のマーカー、たとえば、マーカー１から１１の使用である。
【００４６】
非常に好ましいのは、表１または３に列記されたすべてのマーカーの使用である。
【００４７】
いくつかのマーカーはまた、ＰＣＡとＢＰＨの鑑別診断に使用されうる。特に、たとえば、マーカー４５、４６および４７；４５、４６および４８；などといった、少なくとも３種類のポリペプチドマーカーが使用されうる。
【００４８】
より好ましいのは、少なくとも４、５または６種類のマーカーの使用である。
【００４９】
さらにより好ましいのは、少なくとも７種類のマーカー、たとえば、マーカー１から７の使用である。
【００５０】
非常に好ましいのは、表２または４に列記された２７マーカーすべての使用である。
【００５１】
いくつかのマーカーが用いられる場合に前立腺がんの存在の確率を測定するためには、当業者に公知である統計的手法が使用されうる。たとえば、ワイシンガー（Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ）らによって記載されたランダムフォレスト法（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，２００４，６５： ２４２６−２４３４）が、Ｓ−プラスといったコンピュータープログラムを用いることによって使用されうる。
【実施例】
【００５２】
１．試料調製
前立腺がんに関するポリペプチドマーカーを検出するために、尿を用いた。尿は健常者（対照群）から、および前立腺がんまたはＢＰＨに罹患した患者から採取された。
【００５３】
以降のＣＥ−ＭＳ測定のために、アルブミンおよび免疫グロブリンといった、より高濃度で患者の尿に含まれるタンパク質は限外ろ過によって分離除去されなければならなかった。したがって、尿５００μｌを取り、および２ｍｌのろ過緩衝液（４Ｍ 尿素、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ アンモニア）と混合した。この２．５ｍｌの試料量を限外ろ過した（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）３０ｋＤａ、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）米国ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ））。限外ろ過は３０００ｒｐｍにて遠心分離機中で、限外ろ液２ｍｌが得られるまで実施された。
【００５４】
得られたろ液２ｍｌを、尿素、塩類および他の妨害成分を除去するためにファルマシアＣ−２カラム（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、スウェーデン、ウプサラ）に加えた。結合したポリペプチドを次いでＣ−２カラムから、５０％アセトニトリル、０．５％ギ酸を含む水で溶出し、および凍結乾燥した。ＣＥ−ＭＳ測定のために、ポリペプチドを次いで水２０μｌの水（ＨＰＬＣグレード、メルク社（Ｍｅｒｃｋ））に再懸濁した。
【００５５】
２．ＣＥ−ＭＳ 測定
ＣＥ−ＭＳ測定は、ベックマン・コールター社のキャピラリー電気泳動システム（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱシステム；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．，米国フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ））およびブルカーＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計（ｍｉｃｒｏ−ＴＯＦＭＳ、ブルカー・ダルトニクス社（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）、ドイツ、ブレーメン）を用いて実施された。
【００５６】
ＣＥキャピラリーはベックマン・コールター社から調達され、およびＩＤ／ＯＤ５０／３６０μｍおよび長さ９０ｃｍであった。ＣＥ分離のための移動相は、３０％メタノールおよび０．５％ギ酸を含む水から成った。ＭＳでの「シース流」用には、０．５％ギ酸を含む３０％イソプロパノールが流速２μｌ／分にて用いられた。ＣＥおよびＭＳの連結はＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳスプレイヤー・キット（アジレント・テクノロジーズ社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ドイツ、ワルドブロン（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ））によって実現された。
【００５７】
試料を注入するには、１ないし最大６ｐｓｉの圧力が加えられ、および注入の持続時間は９９秒であった。これらのパラメーターを用いて、試料約１５０ｎｌがキャピラリーに注入され、これは、キャピラリー体積の約１０％に相当する。キャピラリー中の試料を濃縮するためにスタッキング法が用いられた。このように、試料が注入される前に、１ＭＮＨ3溶液が７秒間（１ｐｓｉにて）注入され、および試料が注入された後に、２Ｍギ酸溶液が５秒間注入された。分離電圧（３０ｋＶ）が加えられた後、分析物はこれらの溶液の間で自動的に濃縮された。
【００５８】
以降のＣＥ分離は圧力法を用いて実施された：０ｐｓｉにて４０分、次いで０．１ｐｓｉにて２分、０．２ｐｓｉにて２分、０．３ｐｓｉにて２分、０．４ｐｓｉにて２分、および最後に０．５ｐｓｉにて３２分。分離実行の合計時間はしたがって８０分であった。
【００５９】
ＭＳの側で可能な限り良好なシグナル強度を得るために、ネブライザーガスは可能な最低値に設定された。エレクトロスプレーを生じるためにスプレーニードルに加えられた電圧は３７００〜４１００Ｖであった。質量分析計でのその他の設定は、取扱説明書に従ってペプチド検出用に最適化された。スペクトルは質量範囲ｍ／ｚ４００からｍ／ｚ３０００に渡って記録され、および３秒毎に蓄積された。
【００６０】
３．ＣＥ測定用標準
ＣＥ測定を点検および較正するために、選択された条件下での記載のＣＥ泳動時間によって特徴づけられる下記のタンパク質またはポリペプチドが用いられた：
【００６１】
タンパク質／ポリペプチドはそれぞれ１０ｐｍｏｌ／μｌ水の濃度にて使用された。"ＲＥＶ"、"ＥＬＭ、"ＫＩＮＣＯＮ"および"ＧＩＶＬＹ"は合成ペプチドである。
【００６２】
ペプチドの分子量およびＭＳで見られる各荷電状態のｍ／ｚ比を下記の表に列記する：
【００６３】
実施例４．ＷＯ ０１／２５７９１に記載のマーカーの性能
ＷＯ ０１／２５７９１は１１種類のマーカーに言及し（その請求項２を参照）、および質量測定の精度は０．５％と述べられている。これらがセミノジェリンＩの断片だけと考えるならば、セミノジェリンの可能な断片の下記の数が得られる：
【００６４】
さらに、ＷＯ ０１／２５７９１は前立腺がんの存在を否定するマーカーを開示する。可能な断片の数が下記の表に含まれる：
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】図１は、例証的に一つの質量について、この重量範囲で可能な多数の配列を示す。 次の段階で、前立腺がんまたはＢＰＨを有する患者に由来する尿試料中の対応するタンパク質を分析することが試みられた。６種類のマーカーだけを見つけることができた。
【図１Ｂ】図１は、例証的に一つの質量について、この重量範囲で可能な多数の配列を示す。 次の段階で、前立腺がんまたはＢＰＨを有する患者に由来する尿試料中の対応するタンパク質を分析することが試みられた。６種類のマーカーだけを見つけることができた。
【図２】図２はこの方法で見出された６種類のマーカーの振幅の測定を示す。前立腺がん患者と対照群との間に有意差は無いことが見出された。その後、バイオマーカーの識別値はＲＯＣ（受診者動作特性曲線）分析によって試験された。
【図３Ａ】図３ＡはＷＯ ０１／２５７９１に記載されおよび尿試料中に見出すことのできた６種類のマーカーについて対応する分析を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは本特許明細書の番号１から７８の本発明に記載のバイオマーカーの対応するＲＯＣ試験を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは本発明に記載のマーカーの部分群（１６マーカー）のＲＯＣ分析を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄはその有意性は本発明に記載の３種類のバイオマーカーすなわちマーカー２４、４１および４６のみが使用された場合でさえＷＯ ０１／２５７９１ の有意性よりも明らかに高いことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドマーカーがマーカー１ないし４４および５２ないし７８（頻度マーカー）から選択される、試料中の少なくとも３種類のポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定する段階を含み、またはマーカー４５ないし５１および７９ないし１１５（振幅マーカー）から選択される少なくとも一つのポリペプチドマーカーの振幅を測定する段階を含み、分子量および泳動時間について下記の値によって特徴づけられ、試料が尿試料または精液試料である、前立腺がんの診断のための方法：
【請求項２】
マーカー１から４４および５２から７８の測定された存在または非存在の評価が下記の参照値を用いて実施される、請求項１に記載の方法：
【請求項３】
マーカー４５から５１および７９から１１５の振幅の評価が下記の参照値を用い て実施される、請求項１に記載の方法：
【請求項４】
少なくとも４種類または５種類の、請求項１で定義されるポリペプチドマーカーが用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１０種類またはすべての、請求項１で定義されるポリペプチドマーカーが用いられる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
試料中の少なくとも３種類のポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定する段階を含み、前記ポリペプチドマーカーが分子量および泳動時間について下記の値によって特徴づけられるマーカー５２ないし７８から選択され、前記試料が尿試料または精液試料である、前立腺がんと良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の鑑別診断のための方法：
【請求項７】
測定された存在または非存在の評価が下記の参照値を用いることによって実施される、請求項６に記載の方法：
【請求項８】
請求項６で定義される少なくとも３種類または少なくとも４種類または少なくとも５種類または少なくとも１０種類またはすべてのポリペプチドマーカーが使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
キャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣ、気相イオンスペクトル法および／または質量分析が、一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在を検出するのに用いられる、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
キャピラリー電気泳動が、ポリペプチドマーカーの分子量が測定される前に実施される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
質量分析が、一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在を検出するのに用いられる、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前立腺がんの診断のための、マーカー番号１ないし１１５から選択されおよび分子量および泳動時間について下記の値によって特徴づけられる少なくとも一つのポリペプチドマーカーの使用：
【請求項１３】
前立腺がんと良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の鑑別診断のための、マーカー番号５２ないし７８から選択されおよび分子量および泳動時間について下記の値によって特徴づけられる少なくとも一つのポリペプチドマーカーの使用：
【請求項１４】
少なくとも３種類のマーカーが診断に用いられる、請求項１２または１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１】
ポリペプチドマーカーがマーカー１ないし４４および５２ないし７８（頻度マーカー）から選択される、試料中の少なくとも３種類のポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定する段階を含み、またはマーカー４５ないし５１および７９ないし１１５（振幅マーカー）から選択される少なくとも一つのポリペプチドマーカーの振幅を測定する段階を含み、分子量および泳動時間について下記の値によって特徴づけられ、試料が尿試料または精液試料である、前立腺がんの診断のための方法：
【請求項２】
マーカー１から４４および５２から７８の測定された存在または非存在の評価が下記の参照値を用いて実施される、請求項１に記載の方法：
【請求項３】
マーカー４５から５１および７９から１１５の振幅の評価が下記の参照値を用い て実施される、請求項１に記載の方法：
【請求項４】
少なくとも４種類または５種類の、請求項１で定義されるポリペプチドマーカーが用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１０種類またはすべての、請求項１で定義されるポリペプチドマーカーが用いられる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
試料中の少なくとも３種類のポリペプチドマーカーの存在または非存在を測定する段階を含み、前記ポリペプチドマーカーが分子量および泳動時間について下記の値によって特徴づけられるマーカー５２ないし７８から選択され、前記試料が尿試料または精液試料である、前立腺がんと良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の鑑別診断のための方法：
【請求項７】
測定された存在または非存在の評価が下記の参照値を用いることによって実施される、請求項６に記載の方法：
【請求項８】
請求項６で定義される少なくとも３種類または少なくとも４種類または少なくとも５種類または少なくとも１０種類またはすべてのポリペプチドマーカーが使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
キャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣ、気相イオンスペクトル法および／または質量分析が、一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在を検出するのに用いられる、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
キャピラリー電気泳動が、ポリペプチドマーカーの分子量が測定される前に実施される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
質量分析が、一または複数のポリペプチドマーカーの存在または非存在を検出するのに用いられる、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前立腺がんの診断のための、マーカー番号１ないし１１５から選択されおよび分子量および泳動時間について下記の値によって特徴づけられる少なくとも一つのポリペプチドマーカーの使用：
【請求項１３】
前立腺がんと良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の鑑別診断のための、マーカー番号５２ないし７８から選択されおよび分子量および泳動時間について下記の値によって特徴づけられる少なくとも一つのポリペプチドマーカーの使用：
【請求項１４】
少なくとも３種類のマーカーが診断に用いられる、請求項１２または１３のいずれかに記載の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【公表番号】特表２００８−５３７１１２（Ｐ２００８−５３７１１２Ａ）
【公表日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０４７６９（Ｐ２００８−５０４７６９）
【出願日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６１３７４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０６１２９
【国際公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【出願人】（５０６０７４８０８）モザイクヴェス ディアグノシュティクス アンド テラポイティクス アクチェン ゲゼルシャフト (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６１３７４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０６１２９
【国際公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【出願人】（５０６０７４８０８）モザイクヴェス ディアグノシュティクス アンド テラポイティクス アクチェン ゲゼルシャフト (6)
【Ｆターム（参考）】
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